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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
“Análise de metabólitos secundários produzidos por
fungos endofíticos associados à Cupressus lusitanica”
Luciana da Silva Amaral*
Dissertação apresentada como
parte dos requisitos para
obtenção do título de MESTRE
EM QUÍMICA, área de
concentração: QUÍMICA
ORGÂNICA.
Orientador: Prof. Dr. Edson Rodrigues Filho
* bolsista FAPESP
São Carlos - SP
Fevereiro de 2009
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
A485am
Amaral, Luciana da Silva.
Análise de metabólitos secundários produzidos por
fungos endofíticos associados à Cupressus lusitanica /
Luciana da Silva Amaral. -- São Carlos : UFSCar, 2009.
164 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2009.
1. Fungos endofíticos. 2. Cupressus lusitanica. 3.
Sesquiterpenos eremofilanos. 4. Citocalasinas. I. Título.
CDD: 547 (20
a
)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
Centro de Ciências Exatas e de Tecnologia
Departamento de Química
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Curso de Mestrado
Assinaturas dos membros da banca examinadora que avaliaram e aprovaram
a defesa de dissertação de mestrado da candidata Luciana da Silva Amara!,
realizada em 12 defevereiro de 2009:
Prof Dr. I
ii
Agradecimentos
A Deus, pela dádiva da vida.
Ao professor Dr. Edson Rodrigues Filho, pela valiosa oportunidade, orientação,
ensinamentos e amizade.
Aos meus pais, Maria Helena e Arnaldo, por sempre me mostrarem a
importância de uma boa formação, pelo apoio e constante incentivo.
Aos meus irmãos Reginaldo e Juliana pela bela amizade e companheirismo.
Aos meus sobrinhos Bruno, Ísis e Danilo pela alegria transmitida em seus
lindos rostinhos.
Aos meus familiares, em especial meus avós, pelo constante carinho nesta
trajetória.
Ao meu amor, Fabio, pela paciência, apoio, incentivo e por tudo que nos
pertence.
Aos amigos Victor e José Vinícius pela preciosa colaboração neste trabalho.
Aos amigos do LaBioMMi, Diana, Amanda, Malu, Cíntia, Mariana, Thais,
Natália, Jucimar, Bianca, Heloisa, Marília, Angelo, Diego, Matiello, Enzo,
Gezimar, Rodrigo, Luis Fernando, Florim, pela convivência, amizade e diversão.
As amigas Lívia e Taicia, pelo companheirismo, amizade, cooperação e muitos
risos.
Ao QUARTETO QUI 03, Juliana, Maiara e Renata, pelos ótimos anos de
convivência, luta e acima de tudo AMIZADE.
iii
Aos professores Carmen Lúcia Cardoso e Ian Castro-Gamboa, pela
participação na banca examinadora.
Aos professores do Laboratório de Produtos Naturais.
Aos professores e colaboradores do Laboratório de Oncologia Experimental
(LOE) da Universidade Federal do Ceará, pela realização dos ensaios
citotóxicos.
Aos demais professores do DQ-UFSCar, pelos ensinamentos.
Ao corpo técnico do DQ-UFSCar, pelos serviços prestados durante a execução
deste trabalho.
À FAPESP pela bolsa concedida.
Ao CNPq e CAPES pelo suporte financeiro.
iv
PRINCIPAIS ABREVIAÇÕES
atm - Atmosfera
BDA - Batata, dextrose, ágar
BD - Batata, dextrose
CCD - Cromatografia em camada delgada
CG/EM - Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência
COSY - Correlation spectroscopy
d - Dubleto
Da - Dalton
dl - Dubleto largo
dd - Duplo dubleto
ddd - Duplo duplo dubleto
dt - Duplo tripleto
EFS - Extração em fase sólida
EM - Espectrometria de massas
ESI - ionização por Electrospray
HMBC - Heteronuclear multiple bond correlation
HSQC - Heteronuclear single Quantum coherence
Hz - Hertz
J - Constante de acoplamento
LaBioMMi - Laboratório de Bioquímica Micromolecular de Microorganismos
m - Multipleto
MHz - Mega-Hertz
m/z - Relação massa/carga
NOE - Nuclear Overhouser effect
ODS - Octadecilsilano
s - Singleto
sl - Singleto largo
t - Tripleto
TIC - Cromatograma de íons totais
RMN - Ressonância Magnética Nuclear
1
H RMN - Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio 1
13
C RMN - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
UV - Ultravioleta
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Representação de algumas variedades de fungos e estruturas reprodutivas...........1
Figura 1.2. Microrganismos capazes de penetrar e associar-se a plantas (AGRIOS, 1988).......4
Figura 1.3. Hipótese:o equilíbrio entre a virulência do endofítico e a resposta de defesa da
planta resulta em uma colonização assintomática........................................................................6
Figura 1.4. Método de penetração e invasão pelo fungo (AGRIOS, 1988)..................................7
Figura 1.5. Exemplos de alcalóides do ergot................................................................................9
Figura 1.6. Fórmula estrutural (A) Camptotecina, (B) Podofilotoxina, (C) Hipericina.................11
Figura 1.7. (A) Cupressus lusitanica localizada no campus da UFSCar, (B) ramo de C.
lusitanica com cones masculinos e femininos.............................................................................12
Figura 1.8. Diterpenos produzidos por C. lusitanica; (A) abietanos (B) labdanos e (C)
pimaranos....................................................................................................................................13
Figura 1.9. Estruturas moleculares das tropolonas glicosiladas (A) e (B) e a -tujaplicina (C)
produzidas por C.lusitanica.........................................................................................................14
Figura 1.10. Fórmula estrutural das lignanas arctigenina e matairesinol isoladas de C.
lusitanica......................................................................................................................................15
Figura 1.11. Fórmula estrutural dos biflavonóides isolados de C. lusitanica (A) Amentoflavona e
(B) Cupressoflavona....................................................................................................................16
Figura 1.12. (A) Folhas secas de C. lusitanica devido ao ataque de Seiridium unicorne, (B)
resina exsudada em decorrência da infecção.............................................................................17
Figura 1.13. Estruturas das fitotoxinas produzidas por espécies de Seiridium: (A) Seiridina, (B)
Isoseiridina, (C) 7-hidroxi seiridina, (D) 7-hidroxi isoseiridina, (E) Seiricuprolida, (F) Ácido
ciclopáldico, (G) Seiricardina A, (H) Seiricardina B, (I) Seiricardina C........................................17
Figura 1.14. Estrutura das spaheropsidinas A - F, respectivamente, produzidas por
S.sapinea.....................................................................................................................................18
Figura 3.1. Partes nas quais os galhos de Cupressus lusitanica foram divididos......................27
Figura 3.2. Ilustração do sistema reacional para obtenção de diazometano.............................31
Figura 3.3. Coluna SEPHADEX LH-20 utilizada na pré-purificação do extrato PECL...............42
Figura 3.4. Representação do procedimento adotado para realização do ensaio antifúngico
pelo método de dispersão em ágar. (A), (B) e (C) representam as concentrações das soluções
em DMSO dos extratos testados. (A) 5 mg/mL, (B) 2,50 mg/mL e (C) 1,25 mg/mL...................49
Figura 4.1.1. Fungos endofíticos isolados das folhas de Cupressus lusitanica.........................52
Figura 4.1.2. Placas de Petri que monitoraram a assepcia do processo de isolamento dos
microrganismos de C. lusitanica..................................................................................................53
Figura 4.1.3. Fungos endofíticos isolados de C. lusitanica e seus respectivos
códigos........................................................................................................................................53
Figura 4.2.1 Crescimento micelial de NICL1, NICL3, NICL4 e NICL5 após 20 dias de
cultivo..........................................................................................................................................55
vi
Figura 4.2.2. Características observadas: (A) NICL1 após 20 dias de cultivo e coloração
esverdeada do extrato PNICL1, (B) modificação na aparência de NICL4 em meios diferentes e
(C) estruturas delgadas e longas de NICL5................................................................................55
Figura 4.3.1.Cromatograma das fraões ricas nos diterpenos ácido abiético (AA), ácido
diidroabiético (ADA) e ácido diidro-isoestévico (ADIE) em 236 nm............................................56
Figura 4.3.2. Cromatogramas das frações PHCL (A-F) = 236 nm..........................................57
Figura 4.3.3. Cromatogramas das frações NICL1 (A-F), = 236 nm.........................................58
Figura 4.3.4. Cromatogramas das frações MNICL2 (A-F), = 236 nm.......................................59
Figura 4.3.5. Cromatogramas das frações PNICL2 (A-F), = 236 nm......................................59
Figura 4.3.6. Cromatogramas das frações MNICL3 (A-F), = 236 nm......................................60
Figura 4.3.7 Cromatogramas das frações PNICL3 (A-F), = 236 nm.......................................60
Figura 4.3.8 Cromatogramas das frações NICL4 (A-F), = 236 nm..........................................61
Figura 4.3.9. Cromatogramas das frações MNICL5 (A-F), = 236 nm......................................62
Figura 4.3.10. Cromatogramas das frações PNICL5 (A-F), = 236 nm....................................62
Figura 4.4.1. Cromatograma de íon totais do extrato botânico PHCL........................................64
Figura 4.4.2. Diterpenos propostos pela biblioteca do espectrômetro de massas.....................64
Figura 4.4.3. (A) espectros de massas referente à banda com tr = 29,00 min e (B) espectro da
de massas da biblioteca e (C) diterpeno abietato.......................................................................65
Figura 4.4.4. (A) Cromatograma de íon selecionados a m/z 286 e seus respectivos espectros
de massas...................................................................................................................................65
Figura 4.4.5. (A) Cromatograma de íons selecionados a m/z 328 (B) Espectros de massas de
CL5 e comparação com a biblioteca e (C) espectros de massas de CL6 e comparação com a
biblioteca.....................................................................................................................................66
Figura 4.4.6. Espectro de massas com tempo de retenção 34,08 min e (B) ácido
abiético.......................................................................................................................................67
Figura 4.4.7. Cromatograma de íon totais do extrato hexânico da folhas de Cupressus
lusitanica......................................................................................................................................68
Figura 4.4.8. Substâncias detectadas por CG/EM no extrato de C. lusitanica...........................68
Figura 4.4.9. (A) Espectro de massas de CL7, (B) comparação do espectro de CL7 com os
dados da biblioteca e (C) 3-careno.............................................................................................69
Figura 4.4.10. Espectro de massas de CL8, (B) Comparação com biblioteca e (C)
naftaleno......................................................................................................................................69
Figura 4.4.11. (A) Espectro de massas de CL9, (B) comparação do espectro de CL9 com os
dados da biblioteca e (C) calameneno........................................................................................70
Figura 4.4.12. Cromatograma de íons selecionados a m/z 316.................................................70
Figura 4.4.13. Espectros de massas de: (A) CL14 éster metílico do ácido pimárico e (B) CL15
éster metílico do ácido abiético...................................................................................................71
Figura 4.4.14. (A) Espectro de massas da substância com tr em 31,39 min, (B) comparação
com o espectro de massas da biblioteca, (C) ácido octadecanóico............................................72
vii
Figura 4.4.15. (A) Espectro de massas da substância com tr em 34,34 min, (B) comparação
com o espectro de massas da biblioteca, (C) estrutura do ácido dicarboxílico...........................72
Figura 4.4.16. (A) Espectro de massas da substância com tr em 34,59 min, (B) comparação
com o espectro de massas da biblioteca, (C) hidrocarboneto
tritetracontano..............................................................................................................................73
Figura 4.4.17. (A) Espectro de massas da substância com tr em 34,59 min, (B) comparação
com o espectro de massas da biblioteca, (C) z-9-octadecenoato de metila...............................74
Figura 4.4.18. (A) Espectro de massas da substância com tempo de retenção em 30,05 minuto,
(B) espectro de massas da biblioteca do espectrômetro e (C) 16-metil, heptadecanoato de
metila...........................................................................................................................................74
Figura 4.4.19. Cromatograma de íons totais derivados com diazometano : (A) extrato PNICL2 e
(B) MNICL2..................................................................................................................................75
Figura 4.4.20. (A) Espectro de massas da substância eluída em 22,74 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) 12-metil, tridecanoato de metila.........................................................75
Figura 4.4.21. (A) Espectro de massas da substância eluída em 26,54 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) 14-metil, pentadecanoato de metila...................................................75
Figura 4.4.22. (A) Espectro de massas da substância eluída em 30,03 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) 16-metil, heptadecanoato de metila...................................................76
Figura 4.4.23. (A) Espectro de massas da substância eluída em 33,27 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) eicosanoato de metila........................................................................76
Figura 4.4.24. (A) Espectro de massas, (B) comparação com a biblioteca e (C) 2-hidroxi fenil
etanol...........................................................................................................................................77
Figura 4.4.25. (A) Comparação dos espectros obtido do extrato MNICL3 e da biblioteca do
espectrômetro e (B) diterpeno eremofilano valenceno................................................................77
Figura 4.4.26. (A) Banda com tempo de retenção = 19,35 min do cromatograma de íons
selecionados a m/z 178 e seu respectivo espectro de massas (B). (C) comparação dos
espectros de massas e (D) estrutura molecular da meleína......................................................87
Figura 4.4.27. Espectros de massas com íon molecular m/z 192 (A) de PNICL3 com tr = 22,32
min e (B) MNICL3 22,23 min e (C) éster metílico da meleína.....................................................80
Figura 4.4.28. (A) Espectros de massas com íon molecular m/z 206 em PNICL3 (tr = 23,83
min) e (B) 5-formil meleína..........................................................................................................81
Figura 4.4.29. (A) Espectro de massas da substância com tr= 24,78 min, (B) espectro
relacionado a biblioteca e (C) tetradecanoato de metila.............................................................82
Figura 4.4.30. (A) Espectro de massas da substância com tr= 27,13 min, (B) espectro
relacionado a biblioteca e (C) 14-metil, pentadecanoato de metila............................................82
Figura 4.4.31. (A) Cromatogramas de íons totais de (A) MNICL4 e (B) PNICL4.......................83
Figura 4.4.32. (A) Espectro de massas da substância com tr = 30,03 min, (B) espectro da
biblioteca, (C) 16-metil, heptadecanoato de metila.....................................................................84
Figura 4.4.33. (A) Espectro de massas da substância com tr = 31,66 min, (B) espectro da
biblioteca, (C) nonadecanoato de metila.....................................................................................84
viii
Figura 4.4.34. (A) Espectro de massas da substância com tr = 33,31 min, (B) espectro da
biblioteca, (C) eicosanoato de metila..........................................................................................84
Figura 4.4.35. (A) espectro de massas da substância eluída em 22,25 min do extrato PNICL5
e (B) espectro de massas don éster metílico da meleína detectada no extrato
PNICL3........................................................................................................................................85
Figura 4.4.36. Ácido Pilifórmico..................................................................................................86
Figura 4.4.37. (A) e (C) banda cromatográfica e espectro de massas do éster metílico do ácido
pilifórmico, (B) e (D) detecção do referido éster no extrato PNICL5...........................................86
Figura 4.5.1. Espectro de
1
H RMN em 400 MHz da fração PNICL3B68 em CDCl
3
...................89
Figura 4.5.2. Espectro de COSY em 400 MHz da fração PNICL3B68 em CDCl
3
(A) região de
aromáticos e (B) correlação dos hidrogênios na região mais blindada do espectro...................89
Figura 4.5.3. Estrutura presente na fração PNICL3B68.............................................................89
Figura 4.5.4. Espectro de massas da fração PNICL3B68..........................................................90
Figura 4.5.5. Espectro de
1
H RMN de PNICL3C15 em CDCl
3
(400MHz)..................................91
Figura 4.5.6. Estrutura parcial proposta para PNICL3C15.........................................................91
Figura 4.5.7. Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
400MHz de PNICL3C28.....................................92
Figura 4.5.8. Espectro de
13
C RMN em CDCl
3
de PNICL3C28..................................................93
Figura 4.5.9. Espectro de DEPT 135 em CDCl
3
de PNICL3C28...............................................93
Figura 4.5.10. Espectro de COSY em CDCl
3
de PNICL3C28....................................................94
Figura 4.5.11. Espectro de HSQC de PNICL3C28.....................................................................94
Figura 4.5.12. Espectro de HMBC de PNICL3C28.....................................................................95
Figura 4.5.13. Estrutura parcial da substância PNICL3C28 e as correlações observadas no
COSY, HSQC e HMBC...............................................................................................................95
Figura 4.5.14. Grupo pertencente à fração PNICL3C28 e as correlações observadas no COSY
e HSQC.......................................................................................................................................96
Figura 4.5.15. Estrutura proposta para a substância da fração PNICL3C28 e as correlações
observadas no COSY, HSQC e HMBC.......................................................................................96
Figura 4.5.16. Estereoquímica proposta para a substância da fração PNICL3C28...................97
Figura 4.5.17. Espectro de NOE de PNICL3C28.......................................................................97
Figura 4.5.18. Espectro de Massas da molécula presente na fração PNICL3C28....................98
Figura 4.5.19. Espectro de íons produtos de m/z 265................................................................98
Figura 4.5.20. Espectro de
1
H RMN de PNICL3B37 em CDCl3 (200 MHz).............................100
Figura 4.5.21. Estrutura de PNICL3B37...................................................................................100
Figura 4.5.22. Espectro de
1
H RMN em 400MHz de PNICL3D11 em CDCl
3
...........................101
Figura 4.5.23. Espectro de COSY de PNICL3D11 em CDCl
3
..................................................102
Figura 4.5.24. Espectro de HSQC de PNICL3D11 em CDCl
3
..................................................102
Figura 4.5.25. Estrutura parcial proposta para a molécula PNICL3C11 através das correlações
de COSY...................................................................................................................................103
Figura 4.5.26. Espectro de HMBC de PNICL3D11 em CDCl
3
..................................................103
ix
Figura 4.5.27. Estrutura parcial proposta para a molécula PNICL3C11 através das correlações
de COSY e HMBC.....................................................................................................................104
Figura 4.5.28. Estrutura proposta para a molécula PNICL3C11..............................................104
Figura 4.5.29. Estereoquímica relativa proposta para a substância PNICL3D11....................105
Figura 4.6.1 Desenvolvimento do fungo NICL3 em diferentes meios de cultura; (A) arroz, (B)
milho, (C) extrato de soja e (D) Czapeck + 2% de extrato de levedura....................................106
Figura 4.6.2. Cromatogramas dos meios de cultura sem crescimento fúngico; (A) Arroz (= 225
nm), (B) Milho (= 285 nm), (C) Czapeck com 2% de extrato de levedura (= 287 nm) e (D)
Extrato de Soja (= 248 nm).....................................................................................................107
Figura 4.6.3. Cromatogramas ( = 225 nm) dos extratos obtidos a partir de EtOH dos
diferentes meios de cultivo de NICL3: (A) Arroz, (B) Milho, (C) Czapeck com 2% extrato de
levedura e (D) Extrato de soja...................................................................................................108
Figura 4.6.4. Cromatogramas ( = 225 nm) dos extratos obtidos a partir de AcOEt dos
diferentes meios de cultivo de NICL3: (A) Arroz, (B) Milho, (C) Czapeck com 2% extrato de
levedura e (D) Extrato de soja...................................................................................................108
Figura 4.7.1. (A) Cromatograma de íons totais (TIC) da fração PNICL5B e (B) Cromatogramas
de íons selecionados a m/z 508................................................................................................109
Figura 4.7.2. Espectros de massas full scan das substâncias presentes na fração PNICL5B: (A)
12,80 min, (B) 15,34 min e (C) 16,42 min.................................................................................110
Figura 4.7.3. Espectros de íons produtos de m/z 508 das substâncias presentes na fração
PNICL5B: (A) 12,80 min, (B) 15,34 min e (C) 16,42 min...........................................................110
Figura 4.7.4. Cromatograma da fração PNICL5B.....................................................................111
Figura 4.7.5. Espectro de
1
H RMN em 400MHz de PNICL5B1 em CDCl
3
...............................112
Figura 4.7.6. Espectro de COSY de PNICL5B1 em CDCl
3
......................................................112
Figura 4.7.7. Espectro de HSQC de PNICL5B1 em CDCl
3
......................................................113
Figura 4.7.8. Espectro de HMBC de PNICL5B1 em CDCl
3
......................................................114
Figura 4.7.9. Estrutura parcial da substância PNICL5B1.........................................................114
Figura 4.7.10. Estrutura molecular da citocalasina D..............................................................117
Figura 4.7.11 Estruturas químicas das citocalasinas C e Q....................................................119
Figura 4.7.12. Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
(400 MHz) da fração PNICL5B2.....................120
Figura 4.7.13. Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
(400 MHz) da fração PNICL5B3.....................120
Figura 4.7.14. Espectro de HSQC de PNICL5B3.....................................................................121
Figura 4.7.15. Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
(400 MHz) de MNICL5B16.............................122
Figura 4.7.16. Estrutura molecular do ergosterol.....................................................................122
Figura 4.7.17. Espectro de
1
H RMN de MNICL5F’ (D
2
O) em 400 MHz....................................123
Figura 4.7.18. Espectro de
13
C RMN de MNICL5F’ (D
2
O) em 200 MHz..................................123
Figura 4.7.19. Estrutura química do Sorbitol............................................................................123
Figura 4.8.1. Crescimento do fungo endofítico NICL5 em diferentes meios de cultura: (A) Arroz,
(B) Milho, (C) Extrato de Soja, (D) Czapeck + 2% extrato de levedura, (E) BD e (F) expansão
de (E); presença de corpos de frutificação no meio BD............................................................125
x
Figura 4.8.2. Perfil da produção de Citocalasina D em diferentes meios de cultura dos extratos
obtidos a partir de EtOH (cromatogramas monitorados em = 221 nm): (A) Citocalasina D em
22,26 min, (B) Arroz, (C) Milho, (D) Czapeck + 2% de extrato de levedura, (E) BD e (F) extrato
de soja.......................................................................................................................................126
Figura 4.8.3 Perfil da produção de Citocalasina D em diferentes meios de cultura dos extratos
obtidos a partir de AcOEt (cromatogramas monitorados em = 221 nm): (A) Citocalasina D em
22,26 min, (B) Arroz, (C) Milho, (D) Czapeck + 2% extrato de levedura, (E) BD e (F) Extrato de
Soja...........................................................................................................................................127
Figura 4.9.1. Citocalasinas de provenientes dos aminoácidos fenilalanina, triptofano e leucina,
respectivamente........................................................................................................................128
Figura 4.9.2. Crescimento do fungo NICL5 em diferentes meios de cultivo: (A) Czapeck, (B)
Czapeck com 2% de extrato de levedura, (C) Czapeck com alanina, (D) Czapeck com
fenilalanina, (E) Czapeck com tirosina e (F) Czapeck com triptofano.......................................129
Figura 4.9.3. Cromatograma de íons totais dos extratos provenientes dos diversos meios de
cultura........................................................................................................................................130
Figura 4.9.4. Cromatograma de íons selecionados a m/z 508.................................................131
Figura 4.9.5. Estruturas dos íons monitorados no experimento de íons precursores..............132
Figura 4.9.6. Cromatograma do experimento de íons precursores de m/z 120 e diferentes
meios de cultura: (A) Czapeck, (B) Czapeck com extrato de levedura, (C) Czapeck com alanina,
(D) Czapeck com fenilalanina, (E) Czapeck com tirosina e (F) Czapeck com
triptofano....................................................................................................................................133
Figura 4.9.7. Espectros de massas da substância em 21,01 min: (A) full scan, (B) íons produtos
de m/z 492 e (C) íons precursores de m/z 120.........................................................................134
Figura 4.9.8. Cromatograma do experimento de íons precursores de m/z 158 em diferentes
meios de cultura: (A) Czapeck, (B) Czapeck com extrato de levedura, (C) Czapeck com alanina,
(D) Czapeck com fenilalanina, (E) Czapeck com tirosina e (F) Czapeck com
triptofano....................................................................................................................................134
Figura 4.9.9. Espectros de massas da substância em 27,20 min do extrato Czapeck
enriquecido com triptofano: (A) full scan, (B) íons produtos de m/z 403 e (C) íons precursores
de m/z 185.................................................................................................................................135
Figura 4.9.10. (A) espectro de massas no full scan da banda cromatográfica com tr de 11,22
min e, (B) espectro de íons produtos de m/z 256 obtidos com 10 eV.......................................136
Figura 4.10.1. Cromatogramas das frações PECL116, PECL122, PECL132, PECL150 e
PECL168 obtidos no método polares 21, com detector a 320 nm............................................138
Figura 4.10.2. Cromatogramas das frações PECL116, PECL122, PECL132, PECL150 e
PECL168 obtidos no método apolares 2, com detector a 320 nm............................................139
Figura 4.10.3. Espectro de RMN
1
H de PECL170A (400 MHz-MeOD)....................................140
Figura 4.10.4. Cromatograma de íons selecionados m/z 537..................................................140
Figura 4.10.5. Espectros de full scan no modo negativo de PECL170A..................................141
xi
Figura 4.10.6. Espectros de íons produtos ampliados 8 e 10 vezes nos intervalos de massas
de 90 a 360 e 440 a 520 respectivamente................................................................................142
Figura 4.10.7. (A) Cromatograma de íons selecionados a m/z 551 e (B) seus respectivos
espectros de massas.................................................................................................................145
Figura 4.11.1. Cromatogramas a 323 nm e espectros no UV dos extratos de Araucaria
angustifolia................................................................................................................................147
Figura 4.11.2. Cromatogramas a 323 nm e espectros no UV dos extratos de C.
lusitanica....................................................................................................................................149
Figura 4.12.1. Ensaio antifúngico. Da esquerda para a direita: PHCL, PECL e Bifl................150
Figura 4.12.2. Ensaio de inibição bacteriana; (A) E. coli, (B) B. subtilis, (C) S. aureus, (D) M.
lutheus.......................................................................................................................................151
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1. Massa dos materiais vegetais das árvores em estudo............................................27
Tabela 3.2. Sistema de eluição para coluna filtrante..................................................................28
Tabela 3.3. Método cromatográfico terp_261007. Sistema de eluição dos extratos fúngicos e
extrato botânico PHCL................................................................................................................29
Tabela 3.4. Eluição gradiente utilizada nas análises do cultivo de NICL3 em diferentes meios
de cultura....................................................................................................................................34
Tabela 3.5. Condições de análise do espectrômetro de massas...............................................37
Tabela 3.6. Eluição gradiente empregada na análise de CLAE/EM...........................................37
Tabela 3.7. Método cromatográfica empregado na análise de comparação de meios de
cultura..........................................................................................................................................39
Tabela 3.8. Aminoácidos e suas respectivas massas adicionadas ao meio de cultura.............40
Tabela 3.9. Códigos dos extratos obtidos dos diferentes meios de cultura................................40
Tabela 3.10. Método cromatográfico utilizado nas análises para se verificar o efeito da adição
de aminoácidos no metabolismo de NICL5.................................................................................41
Tabela 3.11. Condições do Espectrômetro de Massas para se verificar o efeito da adição de
aminoácidos no metabolismo de NICL5......................................................................................42
Tabela 3.12. Métodos cromatográficos empregados nas análises das frações
PECL...........................................................................................................................................43
Tabela 3.13. Método cromatográfico para análise de PECL170A..............................................44
Tabela 3.14. Condições de análise do espectrômetro de massas para a análise de
PECL170A...................................................................................................................................44
Tabela 3.15. Método cromatográfico bf_ab_250907 utilizado no modo de extração AB...........47
Tabela 4.2.1. Massas dos extratos particionado e micelial.........................................................54
Tabela 4.5.1. Dados espectroscópicos de PNICL3C28..............................................................97
Tabela 4.5.2. Comparação dos dados de
1
H RMN de PNICL3B37 com os dados da literatura
(PÉREZ-CASTORENA, et al., 2007).........................................................................................100
xii
Tabela 4.5.3. Dados espectroscópicos de RMN.......................................................................105
Tabela 4.7.1. Dados espectroscópicos de PNICL5B1..............................................................116
Tabela 4.9.1. Citocalasinas detectadas no meio Czapeck enriquecido com extrato de
levedura.....................................................................................................................................132
Tabela 4.12.1. - Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três
linhagens tumorais. Valores são média ± DPM.........................................................................152
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 3.1.
Isolamento dos metabólitos secundários do extrato PNICL3..........................32
Fluxograma 3.2.
Isolamento dos metabólitos secundários do extrato PNICL5..........................35
Fluxograma 3.3.
Isolamento dos metabólitos secundários do extrato PNICL5..........................36
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 3.1. Procedimento de cultivo e extração dos fungos endofíticos...............................26
Esquema 4.4.1. Proposta de fragmentação para o diterpeno ácido abiético.............................67
Esquema 4.4.2. Proposta de fragmentação para a meleína......................................................79
Esquema 4.4.3. Proposta de fragmentação para a 5-formil meleína.........................................81
Esquema 4.4.4. Proposta de fragmentação do Ácido Pilifórmico metilado................................87
Esquema 4.5.1. Proposta de fragmentação da substância majoritária na fração
PNICL3B68..................................................................................................................................90
Esquema 4.5.2. Proposta de fragmentação do sesquiterpeno elucidado..................................99
Esquema 4.7.1. Proposta de fragmentação da Citocalasina D................................................118
Esquema 4.10.1. Proposta de fragmentação para a Amentoflavona.......................................143
Esquema 4.10.2. Proposta de fragmentação para a Cupressoflavona....................................144
xiii
RESUMO
“Análise de metabólitos secundários produzidos por fungos
endofíticos associados à Cupressus lusitanica”.
Alguns fungos
fitopatogênicos a Cupressus produzem fitotoxinas bastante agressivas à
hospedeira. Surpreendentemente, essas fitotoxinas são, em geral, de
estruturas diterpenoídicas, assim como vários metabólitos endógenos nas
espécies de Cupressus. Essa habilidade mostrada pelo fungo parece ser uma
estratégia bastante especializada de associação fungo-planta. Essas
observações motivaram o desenvolvimento do presente trabalho, o qual se
refere ao isolamento de microrganismos associados à espécie Cupressus
lusitanica, e o seu estudo visando uma correlação do perfil químico entre os
organismos envolvidos nessa associação. Durante duas coletas de material
vegetal a partir de um indivíduo encontrado no campus da UFSCar, foram
isolados cinco fungos endofíticos, denominados NICL1-5. Identificação
preliminar indicou que possivelmente quatro deles pertencem ao gênero Xylaria
e um ao gênero Guignardia (NICL4). Através de análises por CG-EM, detectou-
se três isocumarinas (meleína, éter metílico da meleína e 5-formil meleina),
bem como um sesquiterpeno eremofilano (valenceno) em extratos do fungo
NICL3. Dos extratos deste mesmo fungo, foram obtidos três sesquiterpenos
eremofilanos (sendo dois novos na literatura), usando metodologias clássicas
de cromatografia. Esses sesquiterpenos foram identificados usando uma série
de dados de RMN em 1D e 2D. Do estudo dos metabólitos secundários de
NICL5 foram obtidos o ergosterol, o sorbitol e três citocalasinas (citocalasina C,
citocalasina D e citocalasina Q). Foi estudado também o metabolismo de
NICL5 frente à adição de aminoácidos livres ao meio de cultura. Usando
análises por CLAE-EM, detectaram-se significantes alterações no metabolismo
de NICL5, como uma possível indução da biossíntese de uma nova
citocalasina, a partir do aminoácido triptofano. As análises do material vegetal
indicaram a presença de biflavonóides e vários diterpenos. Porém, esses
compostos não foram detectados nos extratos fúngicos, sendo identificados
apenas sesquiterpenos.
xiv
ABSTRACT
“Analysis of secondary metabolites produced by endophytic
fungi associated to Cupressus lusitanica”.
Some phytopatogenic
fungi found in Cupressus species produces phytotoxins very aggressive to the
host plant. Surprisingly, these toxins are diterpenoids structures, as well as
some endogenus metabolites in Cupressus species. This fungi ability appears
to be a specialized strategy in the association fungi-plant. These observations
motivated the development of the present work, which relates the isolation of
microorganisms associated to the species Cupressus lusitanica, and to its study,
aiming a correlation of the chemical profile among the organisms involved in
this association. During two collects of plant material from an exemplar found in
the campus of the UFSCar, five endophytic fungi had been isolated and called
NICL1-5. A preliminary identification indicated that possibly four of them belong
to the Xylaria genus, and one to the Guignardia genus (NICL4). The analysis
with GC-MS had detected three isocoumarins (mellein, mellein methyl ether, 5-
formylmellein), as well as an eremophilane sesquiterpene (valencene) in
extracts of NICL3 fungi. From the extracts of the same fungi, had been obtained
three eremophilanes sesquiterpenes (two news in literature) by the use of
classical methodologies of chromatography. These compounds had been
identified using a series of NMR data in 1D and 2D. From the study of the
secondary metabolites of NICL5 had been obtained ergosterol, sorbitol and
three cytochalasins (cytochalasin C, cytochalasin D and cytochalasin Q). The
metabolism if NICL5 had also been studied, when free amino acids were added
in the culture medium. By the analysis with HPLC-MS significant alterations in
the NICL5 metabolism had been detected, as a possible induction of the
biosynthesis of a new cytochalasin, from the amino acid tryptofane.
The analysis of the plant material indicated the presence of biflavonoids and
some diterpenes. However, these compounds had not been detected in fungi
extracts, being identified only sesquiterpenes.
xv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................1
1.1 Fungos...........................................................................................................1
1.1.1 Fungos e sua importância econômica........................................................2
1.2 Interações entre planta-microrganismos........................................................3
1.2.1 Associação planta-fungo endofítico............................................................4
1.2.1.1 Resposta da planta em virtude ao ataque de patógenos – ativação da
enzima PAL (phenylalanine ammonia-lyase) e a conseqüente produção de
compostos fenólicos............................................................................................7
1.2.2. Metabólitos secundários e sua relevância.................................................8
1.3 Cupressus lusitanica....................................................................................11
1.3.1 Constituintes químicos de Cupressus lusitanica.......................................12
1.3.2 Cupressus e o cancro...............................................................................16
2. OBJETIVOS.........................................................................................20
3. PARTE EXPERIMENTAL....................................................................21
3.1 Materiais e equipamentos............................................................................21
3.1.1 Materiais utilizados para o isolamento, cultivo e conservação dos fungos
endofíticos..........................................................................................................21
3.1.2 Equipamentos utilizados para o isolamento, cultivo e conservação dos
fungos endofíticos..............................................................................................21
3.1.3 Equipamentos utilizados...........................................................................21
3.1.4 Material utilizado nos ensaios biológicos..................................................22
3.1.5 Suportes cromatográficos.........................................................................22
3.1.6 Solventes empregados.............................................................................23
3.2 Procedimento experimental.........................................................................23
3.2.1 Isolamento dos fungos endofíticos de Cupressus lusitanica....................23
3.2.1.1 Preparo do meio de cultura BDA...........................................................23
3.2.1.2 Isolamento dos endófitos de Cupressus lusitanica................................24
3.2.1.3 Conservação dos fungos endofíticos isolados de C. lusitanica.............24
3.2.2 Cultivo dos microrganismos......................................................................25
3.2.2.1 Cultivo dos microrganismos em meio líquido e obtenção dos
extratos..............................................................................................................25
xvi
3.2.3 Obtenção do material botânico.................................................................26
3.2.3.1 Coleta de material vegetal para obtenção dos extratos.........................26
3.2.4 Estudo dos extratos fúngicos e botânico..................................................28
3.2.4.1 Fracionamento dos extratos fúngicos “P” e “M” e botânico
“PHCL”.....................................................................................................28
3.2.5 Análise por CLAE/UV................................................................................29
3.2.5.1 Condições CLAE/UV para análise dos extratos fúngicos “P” e “M” e do
extrato botânico “PHCL”....................................................................................29
3.2.6 Análise por CG/EM..................................................................................30
3.2.6.1 Tratamento da amostra utilizando extração em fase sólida..................30
3.2.6.2 Tratamento da amostra utilizando derivação com diazometano...........30
3.2.7 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários do microrganismo
NICL3................................................................................................................31
3.2.8 Comparação do perfil metabólico de NICL3 em diferentes meios de
cultura................................................................................................................33
3.2.8.1 Preparo dos diferentes meios de cultura. ...................................33
3.2.8.2 Obtenção dos extratos..........................................................................34
3.2.8.3 Análise dos extratos por CLAE/UV.......................................................34
3.2.9 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários do microrganismo
NICL5.................................................................................................................35
3.2.9.1 Análise por CLAE/EM............................................................................36
3.2.10 Comparação do perfil metabólico de NICL5 em diferentes meios de
cultura................................................................................................................38
3.2.10.1 Preparo dos diferentes meios de cultura e obtenção dos
extratos..............................................................................................................38
3.2.10.2 Análise dos extratos por CLAE/UV......................................................38
3.2.11 Efeito da adição de aminoácidos no metabolismo do fungo NICL5.......39
3.2.11.1 Preparo dos meios de cultura e obtenção dos extratos de
NICL5.................................................................................................................39
3.2.11.2 Análise dos extratos por CLAE/EM......................................................41
3.2.12. Estudo da fração PECL.........................................................................42
3.2.12.1 Tratamento do extrato botânico “PECL” .............................................42
3.2.12.2 Condições CLAE/UV para análise das frações PECL.........................43
xvii
3.2.12.3 Separação das substâncias da fração PECL170................................43
3.2.12.4 Análise por CLAE/EM..........................................................................44
3.2.13 Detecção de biflavonóides nas folhas de Cupressus lusitanica e
Araucaria angustifolia........................................................................................45
3.2.14 Ensaios biológicos..................................................................................47
3.2.14.1 Ensaio de inibição bacteriana pelo método de difusão em ágar.........47
3.2.14.1.1 Preparo dos meios de cultura...........................................................47
3.2.14.1.2 Ativação das bactérias......................................................................47
3.2.14.1.3 Padronização das culturas................................................................48
3.2.14.1.4 Preparo das amostras.......................................................................48
3.2.14.1.5 Preparo do antibiótico controle.........................................................48
3.2.14.1.6 Ensaio antibacteriano contra as bactérias E. coli, B. subtilis, S.
aureus e M. Lutheus..........................................................................................48
3.2.14.2 Ensaio de inibição fúngica pelo método de difusão em ágar...............49
3.2.14.3 Ensaio de citotoxicidade in vitro em linhagens de células tumorais....50
3.2.14.3.1 Preparo das amostras.......................................................................50
3.2.14.3.2 Citotoxicidade in vitro..............................................................50
4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................52
4.1 Isolamento de fungos endofíticos de Cupressus lusitanica.........................52
4.2 Extratos fúngicos.........................................................................................54
4.3 Monitoramento dos extratos fracionados (fúngicos e vegetal) por
CLAE/UV ...........................................................................................................56
4.4 Monitoramento dos extratos por CG/EM.....................................................63
4.4.1 Monitoramento do extrato das folhas de C. lusitanica..............................63
4.4.2 Monitoramento dos extratos fúngicos.......................................................71
4.4.2.1 Análise dos extratos PNICL1 e MNICL1................................................71
4.4.2.2 Análises dos extratos PNICL2 e MNICL2..............................................74
4.4.2.3 Análise dos extratos PNICL3 e MNICL3................................................76
4.4.2.4 Análises dos extratos PNICL4 e MNICL4..............................................83
4.4.2.5 Análise dos extratos PNICL5 e MNICL5................................................85
4.5 Isolamento de metabólitos secundários produzido pelo microrganismo
NICL3.................................................................................................................88
4.5.1. Identificação da fração PNICL3B68.........................................................88
xviii
4.5.2 Identificação da fração PNICL3C15..........................................................91
4.5.3 Elucidação estrutural da fração PNICL3C28............................................92
4.5.4 Elucidação estrutural da fração PNICL3B37............................................99
4.5.5 Elucidação estrutural da fração PNICL3D11..........................................101
4.6 Comparação do perfil metabólico de NICL3 em diferentes meios de
cultura..............................................................................................................106
4.7 Isolamento de metabólitos secundários produzidos pelo fungo NICL5.....109
4.7.1. Isolamento das substâncias na fração PNICL5B...................................109
4.7.1.1 Identificação estrutural de PNICL5B1..................................................111
4.7.1.2 Identificação estrutural de PNICL5B2 e PNICL5B3.............................119
4.7.2 Identificação estrutural da fração MNICL5B16.......................................121
4.7.3 Identificação estrutural da fração MNICL5F’...........................................123
4.8 Comparação do perfil metabólico de NICL5 em diferentes meios de
cultura..............................................................................................................124
4.9 Efeito da adição de aminoácidos no metabolismo do fungo NICL5..........128
4.10 Caracterização e isolamento de biflavonóides de Cupressus
lusitanica..........................................................................................................136
4.11 Monitoramento de biflavonóides nos extratos de Cupressus lusitanica e
Araucaria angustifolia por CLAE/UV................................................................145
4.12 Ensaios Biológicos...................................................................................150
4.12.1 Ensaio de inibição fúngica....................................................................150
4.12.2 Ensaio para detecção de metabólitos secundários bioativos...............151
4.12.3 Ensaio Citotóxico..................................................................................152
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................153
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................155
___________________________________________________________Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Fungos
Os fungos possuem uma grande variedade de formas,
comportamentos e ciclos de vida (Figura 1.1) e por isso, segundo WEBSTER (1989),
são de difícil definição. Porém, algumas características lhes são intrínsecas. Os
fungos são organismos eucarióticos desprovidos de clorofila, ou seja, são
heterotróficos. Em geral, eles são filamentosos e ramificados. Os filamentos,
denominados hifas, apresentam paredes celulares constituídas por quitina,
resultando no micélio, o qual pode formar um tecido compacto (cogumelos) ou uma
rede frouxa. Naturalmente reproduzem-se, com algumas exceções, por meio de
esporos, os quais são dispersos pelo meio ambiente (PELCZAR, 1997, TORTORA
et al., 2006, WEBSTER ,1989).
A classificação dos fungos baseia-se nos seguintes critérios:
Características dos esporos sexuais e corpos de frutificação presentes
durante os estágios sexuais dos ciclos de vida.
Natureza dos ciclos de vida.
Características morfológicas do micélio ou células.
Figura 1.1.
Representação de algumas variedades de fungos e estruturas reprodutivas
Em uma grande variedade de fungos a produ
ção dos esporos sexuais
e corpos de frutificação, é dependente de determinadas condições ambientais. Os
que possuem todos os estágios sexuais são denominados fungos perfeitos,
enquanto que aqueles que não os possuem, são chamados de fungos imperfeitos.
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___________________________________________________________Introdução
2
Tanto a reprodução sexuada quanto a assexuada ocorre por meio de esporos. Estes
esporos podem sobreviver a períodos extensos em condições drásticas de
temperatura, radiação e também são resistentes a compostos tóxicos (PELCZAR,
1997, TORTORA et al., 2006, WAOLKEN et al., 2003).
Dentre os microrganismos, os fungos foram os primeiros habitantes do
planeta e estão presentes nos diversos ambientes sendo mundialmente distribuídos.
Os fungos são capazes de decompor e utilizar uma grande variedade
de substratos, sendo eficientes na conversão de nutrientes em material celular. Em
condições de excesso de nutrientes, os diversos produtos de decomposição podem
ser excretados ao meio ambiente, enquanto que substâncias de reserva como
carboidratos e lipídios, acumulam-se no micélio (PELCZAR, 1997).
1.1.1 Fungos e sua importância econômica
A compreensão dos mecanismos de ação dos fungos é de extrema
relevância para os diversos setores da sociedade, uma vez que estes estão
envolvidos direta ou indiretamente em muitos processos industrias e farmacêuticos,
no controle de pragas, decomposição de matéria orgânica, na produção de energia e
também no desenvolvimento de patologias em plantas e animais.
A levedura Saccharomyces cerevisiae é amplamente empregada em
escala industrial na produção de vinhos, cervejas e pães. O ácido cítrico, metabólito
do fungo Aspergillus niger, é produzido industrialmente utilizando melado como
substrato. A maturação dos queijos blue, Roquefort e Camembert deve-se ao fungo
Penicillium roquefort (PELCZAR, 1997).
Na indústria farmacêutica os fungos são de importância vital, pois a
síntese de muitos medicamentos requer várias etapas reacionais, as quais
inviabilizam economicamente a produção destes. A vitamina riboflavina é produzida
por fermentação principalmente pelo fungo Ashbya gossypii (PELCZAR, 1997). O
fungo Tolypocladium niveum foi fonte primária de Cyclosporin
®
, de fundamental
aplicabilidade em pacientes transplantados com a função de se evitar a rejeição de
órgãos (ADRIO et al, 2003). Muitos outros fungos são fontes de produtos
farmacêuticos, tais como a penicilina e o Mevacor
®
(SANTOS, 1999).
___________________________________________________________Introdução
3
Fungos dos gêneros Aspergillus, Penicillium, Mucor e Rhizopus
destacam-se na produção de enzimas de usos alimentícios e farmacêuticos
(PELCZAR, 1997, ADRIO et al., 2003).
A levedura S. cerevisiae é considerada segura para produção de
proteínas com finalidade farmacêutica, pois este microrganismo é largamente
empregado na indústria alimentícia. A vantagem de se trabalhar com esta levedura
está relacionada com seu rápido crescimento, alta densidade celular, secreção para
o meio extracelular de proteínas heterólogas e também pelo conhecimento de sua
genética, o qual é o mais avançado dentre os seres eucarióticos (ROMANOS, et al.,
1992). Genes humanos clonados são expressos em S. cerevisiae para a produção
de interferon humano (HITZEMAN et al., 1983), o fator de crescimento da epiderme
humana, e na produção de hemoglobina humana (STROHL, 1997). A aplicação
comercial, de maior importância, da levedura recombinante envolve a produção dos
genes que são responsáveis pela codificação de antígenos contra o vírus da
hepatite B, resultando na primeira forma segura de produção da vacina para o
combate desta doença (ADRIO et al.,2003) .
1.2 Interações entre planta-microrganismos
Os microrganismos apresentam uma rede de complexas relações com
outros microrganismos e com organismos maiores, como as plantas, as quais os
servem como hospedeiros (BLACK, 2002). Eles participam de diversos tipos de
associações, algumas neutras ou indiferentes, outras são benéficas ou positivas, ou
ainda prejudiciais ou negativas. No neutralismo os organismos envolvidos
desenvolvem-se sem qualquer efeito recíproco, pois as exigências de crescimento
são completamente distintas (PELCZAR, 1997, AGRIOS, 1988).
O mutualismo é uma forma simbiótica de associação, no qual cada
organismo recebe benefícios. A maneira pela qual se manifesta este benefício é
variada. Um exemplo clássico desta interação ocorre entre fungos e algas,
resultando nos liquens. O fungo obtém nutrientes, como glicose e álcoois poliídricos
das algas, e estas beneficiam-se pelas propriedades das paredes celulares dos
fungos, capazes de reter água. Nas interações comensalistas apenas um organismo
é favorecido enquanto o outro não é afetado (PELCZAR, 1997).
___________________________________________________________Introdução
4
As associações negativas são representadas por quatro interações. O
antagonismo baseia-se na inibição de uma espécie por outra, atingindo de modo
adverso o ambiente do outro organismo. Esta associação é de grande relevância,
pois certos microrganismos podem produzir antibióticos. Uma relação negativa entre
duas populações manifesta-se quando ambas são adversamente afetadas em
relação à sobrevivência e ao crescimento, esta associação é caracterizada pela
competição. O parasitismo é uma interação em que um organismo vive sobre ou
dentro do outro organismo. A predação é uma associação na qual um organismo
alimenta-se e digere outro organismo (PELCZAR, 1997, AGRIOS, 1988).
Uma interação planta-microrganismo não resulta necessariamente em
patologia, portanto, o estudo das associações e interações envolvendo os
microrganismos é de extrema importância para a manutenção do equilíbrio entre as
espécies, bem como para a preservação do meio ambiente (CAMPOS, 2005). Entre
os microrganismos (vírus, bactérias e fungos (Figura 1.2)), os fungos associam-se
com maior freqüência às plantas (ZOBERI, 1972).
Figura 1.2.
Microrganismos capazes de penetrar e associar-se a plantas (AGRIOS, 1988)
1.2.1 Associação planta-fungo endofítico
De forma literal a palavra endof
ítico significa “dentro da planta” (do
grego endon, no interior de; phyton, planta). O uso deste termo é tão vasto quanto
sua definição literal e aplica-se a bactérias (MORANDI, 1996, KOBAYASHI et al.,
2000), fungos (MORANDI, 1996, STONE et al., 2000) algas (PETERS, 1991) e
insetos (FELLER, 1995).
___________________________________________________________Introdução
5
O termo endofítico foi mencionado pela primeira vez por De BARRY
(1866), com a finalidade de distingui-los dos patógenos de plantas. Estudos mais
detalhados mostraram que determinados patógenos vivem de forma latente no
interior dos tecidos de seus hospedeiros e, esta observação, levou PETRINI (1991)
a expandir a definição de endofíticos para incluir todos aqueles organismos que,
durante determinando período de suas vidas, colonizam seus hospedeiros (plantas)
sem causar sintomas visíveis de doenças.
KULDAU e YATES (2000) defendem a hipótese de que a infecção
assintomática de um endofítico depende não somente de adaptações de um
hospedeiro em particular e, sim da capacidade de virulência do endofítico, da
resposta de defesa do hospedeiro e das condições ambientais. Por exemplo, o
inóculo de um endofítico (o qual não causa sintomas de patogenia) em hospedeiro
sob estresse ambiental, causará sintomas de doença. O grau de virulência não está
associado ao gênero ou a espécie, porém se o fungo for isolado como endofítico,
isso não exclui a possibilidade deste se tornar patogênico.
Os mecanismos de estabelecimento da associação são muito complexos e
desconhecidos, no entanto, SCHULZ e BOYLE (2005) defendem a hipótese de que,
a colonização assintomática é fruto de um balanço entre o hospederiro e o endofítico
(Figura 1.3). Endofíticos e patógenos possuem fatores de virulência idênticos. Os
endofíticos produzem exoenzimas capazes de infectar e colonizar o hospedeiro e a
maioria pode produzir micotoxinas. Do mesmo modo, a planta reage, induzindo a
produção de metabólitos de defesa, resposta mecânica, enfim, respostas de defesa
lentas e rápidas. O futuro da interação torna-se dependente da estratégia de
sobrevivência de ambas as partes. Em muitos casos alguns endofíticos são
especificamente adaptados aos seus hospedeiros, enquanto outros são oportunistas
incidentais. As interações com o hospedeiro podem ser balanceadas ou
antagonistas, refletindo a tolerância da coabitação.
___________________________________________________________Introdução
6
Figura 1.3.
Hipótese:o equilíbrio entre a virulência do endofítico e a resposta de defesa da planta
resulta em uma colonização assintomática
Vários esforços estão sendo realizados com o intuito de distinguir
infecções de plantas por microrganismos endofíticos e patógenos latentes (SCHULZ
et al., 1999). Essa distinção é dificultada pela ausência de sintomas no hospedeiro
durante a fase de estabelecimento de colônias e por dificuldades de encontrar
metodologias de isolamento que permita essa distinção. O possível papel de tais
estágios “latente” ou “endofítico” na história da interação de plantas com fungos,
recebeu pouca atenção com respeito aos seus potenciais relevantes para explicar as
estratégias de colonização e desenvolvimento das várias espécies fúngicas
(CHAPELA, 1989).
Fisiologicamente os fungos endofíticos utilizam as mesmas estratégias
de penetração ao hospedeiro que os patógenos. A planta responde a esta invasão
com suas “armas” de defesa e de reconhecimento, tornando as infecções endofíticas
geralmente localizadas, ou seja, o fungo desenvolve-se no local da inoculação,
atingindo raramente outras partes da planta (PETRINI et al.,1992, PASCHOALATI,
et al., 1998). A Figura 1.4 representa, de forma esquematizada, o mecanismo de
penetração. No entanto, existem poucos estudos realizados sobre a fisiologia das
interações planta-endofíticos referentes a métodos de penetração, produção de
enzimas e fitohormônios (CARROL e PETRINI,1983, HOWARD et al., 1991). Quanto
à taxonomia, as espécies de endofíticos identificadas são pertencentes à classe dos
Ascomicetos, Deuteromicetos, Basidiomicetos e poucos Oomicetos (PETRINI et al.,
1992).
fatores
ambientais
defesa
fatores de
virulência
fatores de
virulência
resposta de
defesa
ENDOFÍTICO
PATOGÊNICO
PLANTA
de
para
___________________________________________________________Introdução
7
Figura 1.4.
Método de penetração e invasão pelo fungo (AGRIOS, 1988)
1.2.1.1 Resposta da planta em virtude ao ataque de patógenos – ativação
da enzima PAL (phenylalanine ammonia-lyase) e a conseqüente
produção de compostos fenólicos
As plantas possuem um complexo e amplo mecanismo de defesa
contra o ataque de patógenos. A ativação desses mecanismos é iniciada pelo
reconhecimento de sinais (moléculas) codificados pelo patógeno chamados de
elicitores (ex.: proteínas microbianas, pequenos peptídeos, oligossacarídeos, etc.).
Os elicitores primários do patógeno podem ativar uma série de genes de defesa na
planta, cujos produtos incluem glutatione-S-transferase (GST), peroxidases,
proteínas da parede celular, inibidores de proteinase, enzimas hidrolíticas (quinases
e â-1,3-glucanases), e enzimas que biossintetizam fitoalexinas, tais como
fenilalanina amônia-liase (PAL), e chalcona sintase (MAGNANI, 2002). As
fitoalexinas possuem um importante papel mediante a invasão do patógeno, uma
vez que, essas substâncias são capazes de restringir o crescimento intracelular ou
até mesmo exterminar o invasor (SNYDER e NICHOLSON, 1990).
A enzima fenilalanina amônia-liase catalisa a conversão da fenilalanina
ao ácido trans cinâmico, que é o primeiro passo na biossíntese de fenilpropanóides,
os quais são precursores de um diverso grupo de metabólitos secundários de
plantas como as ligninas, fitoalexinas e flavonóides (KERVINEN et al., 1998).
Vários estudos demonstram que a enzima PAL está intimamente ligada
ao sistema de defesa contra o ataque de microrganismos. NIELSEN et al. (2004),
verificaram a produção dos compostos fenólicos, luteolinidina e apigeninidina, em
___________________________________________________________Introdução
8
Sorghum bicolor L. após 22 h do inóculo de Colletotrichum Graminicola e
Cochiobolus heterostrophus. Já MODAFAR et al. (2001) observaram um incremento
na atividade da enzima PAL em resposta ao inóculo de Fusarium oxysporum em
palmas de dois cultivares diferentes, ou seja, em cultivares resistente e suscetível
ao microrganismo. O cultivar resistente apresentou um aumento na atividade da PAL
sete vezes maior que o controle, após 96 horas da infecção pelo fungo, enquanto
que, o cultivar suscetível teve um aumento três vezes menor que o resistente no
mesmo intervalo de tempo.
1.2.2. Metabólitos secundários e sua relevância
Como fruto da interação mutualística, os fungos endofíticos podem
conferir determinadas vantagens à planta hospedeira. Eles são reconhecidos como
um armazém de novas substâncias, denominadas de metabólitos secundários, os
quais podem apresentar atividades biológicas relevantes (SURYANARAYANAN et
al., 1998). A produção de metabólitos secundários deve desempenhar algum papel
importante para o hospedeiro e (ou) uma função ecológica significante (BOYLE, et
al.,2001). Às gramíneas, por exemplo, eles podem conferir crescimento vigoroso,
resistência às intempéries, a nematóides, a herbivoria e a fitopatógenos (SOUZA,
2004), aumentar as defesas contra vertebrados e invertebrados (FAEH, 2002, CLAY,
1988; JARVIS & MILLER, 1996; D’MELLO & MACDONALD,1997).
Para muitos micologistas a produção de metabólitos secundários in
vivo é de grande importância na interação metabólica entre o fungo e a planta
hospedeira, tais como; sinalização, defesa e regulação da simbiose (SCHULZ e
BOYLE, 2005). TAN e ZOU (2001) demonstraram que a colonização endofítica
melhora a adaptação ecológica do hospedeiro devido ao aumento da tolerância ao
estresse e pela produção de metabólitos com atividade antimicrobiana contra
fitopatógenos e predadores.
DEMAIN (1980) sugeriu que, se um fungo pode produzir metabólitos in
vitro, este metabólito deve também possuir alguma função na natureza.
Os metabólitos secundários isolados de fungos endofíticos são
pertencentes a diversas classes de substâncias, tais como, esteróides, xantonas,
fenóis, isocumarinas, quinonas, furanodionas, terpenóides e citocalasinas (SCHULZ
et al., 2005).
___________________________________________________________Introdução
9
N
N
N
H
OH
O
H
H
H
N
N
N
H
O
H
H
H
N
O
N
O
R
1
OH
R
2
O
H
Ergonovina
Ergotamina R
1
= CH
3
R
2
= PhCH
2
Ergosina R1 = CH3 R2 = i-Bu
Ergovalina R1 = CH3 R2 = i-Pr
Os alcalóides produzidos por endofíticos parecem ser a base da
resistência aos insetos e toxicidade aos mamíferos. As evidências sugerem que os
próprios fungos são os responsáveis pela produção destas substâncias, pois as
plantas infectadas não as contêm. Todas as espécies de Balanciae examinadas
produzem alcalóides de ergot. A ação desses alcalóides sobre os mamíferos é
vasoconstritora e alguns deles possuem aplicação medicinal. A ergotamina (Fig. 1.5)
é utilizada no tratamento da enxaqueca, e compostos similares possuem potentes
efeitos alucinógenos (CLAY, 1988).
Figura 1.5.
Exemplos de alcalóides do ergot
É extensa a busca por novos antibióticos, agentes quimioterapêuticos
e produtos agroquímicos que sejam altamente eficientes, de baixa toxicidade, e que
causem reduzido impacto ambiental. Essas pesquisas são conduzidas pela
resistência adquirida de microrganismos (Estafilococus, Micobacteria e
Estreptococus), além da introdução, na população humana, de doenças como a
Aids, problemas respiratórios severos e outras patologias devido à baixa imunidade,
as quais requerem a descoberta e desenvolvimento de novas drogas para combatê-
las (STROBEL e DAYSE, 2003). Devido à falta de segurança e problemas
ambientais, muitos agentes agroquímicos sintéticos foram removidos do mercado;
isto criou a necessidade de se encontrar mecanismos alternativos de controle do
crescimento de pestes e patógenos na agricultura (DEMAIN, 2000). Novos produtos
naturais provenientes de microrganismos oferecem oportunidade de inovação na
descoberta de medicamentos e agroquímicos.
O n
úmero de fungos endofíticos é inestimável podendo existir algo em
torno de um milhão de espécies distribuídas em pelo menos 80% das plantas
vasculares. É relevante mencionar a hipótese de coevolução entre fungos e plantas,
___________________________________________________________Introdução
10
a qual seria responsável pela diversidade de metabólitos secundários produzidos
pelos endofíticos (STROBEL, 2004).
Os produtos naturais são fontes importantes de novos produtos
farmacêuticos (PROUDFOOT, 2002) e considerando-se que 6 dos 20 medicamentos
mais freqüentemente prescritos são de origem fúngica (ex: equinocandina,
mevilonina, mutasteína, ciclosporina, cefalosporina), e que apenas 5% dos fungos
foram descritos, estes organismos oferecem um enorme potencial para obtenção de
novos fármacos (GLOER, 1997, HAWKSWORTH, 1991, 2001).
Outro aspecto interessante a respeito da interação fungo endofítico -
planta também está relacionado à produção de metabólitos secundários, uma vez
que, alguns endofíticos adquiriram a habilidade de produzir as mesmas substâncias
produzidas pela planta. Este fenômeno é denominado “Transferência Genética
Horizontal”, a qual consiste na troca de material genético entre células ou genomas
não relacionados (BROWN, 2003).
O fungo Giberela fugikuroi associado à planta Cucumbita máxima
produz, assim como ela, derivados do ácido giberélico, um diterpeno com atividade
hormonal no crescimento de plantas (ALEXOPOULOS et al, 1996).
Foi descoberto que o fungo Taxomyces andrenae, isolado como
endofítico em Taxus brevifolia, produz o paclitaxel (Taxol
TM
). Este fato causou
grande impacto na comunidade científica devido às propriedades anticancerígenas
diferenciadas desse diterpeno. O rendimento do taxol em T. brevifolia é muito
pequeno, entre 0,0001% a 0,008% da planta seca, e devido a grande demanda
dessa substância o fungo apresenta-se como uma mina de ouro para a obtenção do
diterpeno (YUAN et al., 2006). Muitas outras espécies de fungos produtores de taxol,
em rendimentos relevantes, foram isolados de T. brevifolia (STIERLE e STROBEL,
1995) e também de outras espécies da Taxus (STROBEL, 1996, 1996a), além de
outras plantas como a Seimatoantlerium tepuiense (STROBEL, et al., 1999). Em
2000 a venda de taxol arrecadou montantes acima de um bilhão de dólares pela
companhia Bristol-Mayes-Squibb (ADRIO et al.,2003).
Outros exemplos mais recentes são a produção do inibidor da síntese
de RNA, a camptotecina (PURI et al., 2005), (Figura 1.6A) por um fungo
(Phycomycetes) associado à Nothapodytes foetida, do anticancerígeno
podofilotoxina (Figura 1.6B) por Phialocephada fortinii e P. hexandrum (EYBERGER
et al., 2006) e também a produção de hipericina (KUSARI, et al., 2008), com uma
___________________________________________________________Introdução
11
extensa variedade de atividades biológicas, por um fungo endofítico isolado de
Hypericum perforatum (Figura 1.6C).
Figura 1.6.
Fórmula estrutural (A) Camptotecina, (B) Podofilotoxina, (C) Hipericina
Substâncias de alta complexidade estrutural, inviáveis pela síntese
orgânica in vitro, podem ser obtidas cultivando-se fungos endofíticos em meios
artificiais. Além disso, a produção in vitro de enzimas codificadas por transferência
genética da planta para o fungo, pode ser uma ferramenta útil para biotransformação
de substratos levando à substâncias análogas e produtos naturais bioativos. Isso
seria muito importante para estudos de relação estrutura-atividade biológica de
substâncias de alta complexidade estrutural (SANTOS, 2003).
1.3 Cupressus lusitanica
A família Cupressaceae contém vários gêneros e diversas espécies,
nas quais se inserem os Ciprestes, Cedros e árvores similares. Merece destaque a
planta Cupressus lusitanica, objeto alvo deste estudo (Figura 1.7A).
Cupressus lusitanica é nativa da América Central e, é comumente
conhecida como “Cedro de Goa”, “Cipreste do México” e “Cedro de Portugal”. A sua
denominação como “Cedro de Portugal” deve-se ao fato da sua introdução neste
país no século XVIII, na mata do antigo convento de Bugaço. Foram estes
exemplares disseminados por toda a Europa e também para o Brasil (FARJON,
1993). Ela é uma árvore que alcança de 25-30 m de altura, apresenta muitas
ramificações e suas folhas são pequenas e escamiformes (Figura 1.7B) (REITZ,
1989) e, é cultivada em muitos países, em jardins ornamentais e em plantações
(C)
(B) (A)
N
N
O
O
O
O
O
O O
O
OH
O
O
OH O OH
OH
OH
OHOOH
___________________________________________________________Introdução
12
comerciais para exploração de madeira (REITZ, 1989, VIDAKOVIC, 1991, FARJON,
1993).
Há vários relatos na literatura do uso de Cupressus lusitanica no
tratamento de diversas enfermidades. As folhas desta planta são utilizadas em
muitas práticas indígenas para o tratamento de catarro e dores de cabeça. O óleo
essencial extraído das folhas é amplamente empregado contra reumatismo e tosse
(DUKE, 2004). A infusão das folhas é usada, na cura de doenças dermatológicas
(KUIATE et al., 2006) e, as folhas secas são empregadas na proteção de grãos
estocados contra infestação de insetos, uma vez que, estas emitem um forte e
persistente odor por longos períodos de tempo, indicando, dessa forma, a presença
de compostos voláteis (TAPONDJOU, et al., 2005).
Figura 1.7.
(A) Cupressus lusitanica localizada no campus da UFSCar, (B) ramo de C.
lusitanica com cones masculinos e femininos
1.3.1 Constituintes químicos de Cupressus lusitanica
A família Cupressaceae é constituída por várias classes de
substâncias, sendo o diterpenos os principais alvos de estudos relacionados à
constituição química e atividades biológicas dos representantes desta família.
Merecem destaque os diterpenos abietanos, labdanos e pimaranos (Figura 1.8).
A ampla utilização de Cupressus lusitanica no combate a diversas
doenças promoveu o interesse de pesquisadores na investigação de sua
constituição química. Análises químicas do óleo da planta proveniente de Portugal
(A) (B)
___________________________________________________________Introdução
13
mostraram que este contém monoterpenos, sesquiternos e diterpenos, com o
abietadieno como componente principal (ADAMS, 1997).
Figura 1.8. Diterpenos produzidos por C. lusitanica; (A) abietanos (B) labdanos e
(C) pimaranos
Com a finalidade de explicar o uso de Cupressus lusitanica no
tratamento de doenças de pele, como a dermatofitose, doença causada por
infestação fúngica, caracterizada pela infecção dos tecidos queratinizados dos
organismos humanos e de animais, KUIATE et al. (2006) investigaram, por CG/EM,
a composição química de frações voláteis do extrato hexânico das folhas da planta.
Foram detectados mais de 109 compostos, dentre os quais destacaram-se -pineno,
epi-zonareno, -himachaleno, ácido pimárico, ácido caurenóico, cis e trans totarol,
ferruginol, abietatrieno, entre outros. Foi verificado que as frações ricas em
diterpenos são as responsáveis pela atividade antidermatofítica. No entanto, estudos
(
C
)
(
B
)
(A)
HO
O
O
OH
O
O
OH
OH
OH
H
OH
H
HO
O
O
O
O
HO
O
H
O
HO
O
HO
O
H
HO
O
O
H
H
___________________________________________________________Introdução
14
posteriores devem ser realizados com a finalidade de identificar quais substâncias
desta classe promovem a referida atividade.
Pesquisadores como TANAKA et al. (2000), IWAMOTO et al., (2001)
dentre outros, conduzem pesquisas com os diterpenos do tipo labdano, extraídos de
plantas pertencentes à família Cupressaceae, focando esta classe de compostos
como agentes na prevenção de câncer.
Várias pesquisas apontam a família Cupressaceae como produtora de
cicloheptatrienonas, que são fitoalexinas. A principal tropolona é a -tujaplicina,
Figura 1.9C, (YAMAGUCHI et al., 1999, HARBORNE, 1999, ZHAO e SAKAE, 2003).
Esta fitoalexina apresenta atividades biológicas muito interessantes, como
antimicrobiana contra um vasto espectro de microrganismos desde bactérias a
fungos (YAMADA et al, 2002) e, é amplamente empregada como ingrediente em
loções capilares, cremes dentais e cosméticos (YAMAGUCHI et al., 1999). A -
tujaplicina também mostra atividade reguladora no fitocrescimento, efeitos
citotóxicos em células de mamíferos, atividade antioxidante, e inibição de algumas
enzimas incluindo tirosinase, catecol-O-metiltransferase e ATPase mitocondrial
(YAMAGUCHI et al., 1999).
Figura 1.9.
Estruturas moleculares das tropolonas glicosiladas (A) e (B) e a -tujaplicina (C)
produzidas por C. lusitanica
COWAN, et al. (2001) relatou, pela primeira vez, a ocorrência das
lignanas arctigenina e matairesinol (Fig. 1.10) em C. lusitanica, porém os autores
desconhecem a quimiotaxonomia e a importância ecológica destas substâncias para
o gênero Cupressus ou para a família Cupressaceae.
(A) (B) (C)
O
OGlc
O
OGlc
HO
O
OH
___________________________________________________________Introdução
15
O
O
O
OH
O
O
H
H
O
HO
O
OH
O
O
H
H
Arctigenina
Matairesinol
Figura 1.10.
Fórmula estrutural das lignanas arctigenina e matairesinol isoladas de C. lusitanica
Muitas gimnospermas, em contraste com as espécies de
angiospermas, são caracterizadas pela ocorrência de biflavonóides, juntamente com
outros tipos de flavonóides (BARANOWSKA et al., 2004). Os principais constituintes
químicos relacionados a quimiotaxonomia do gênero Cupressus são os
biflavonóides (ROMANI et al., 2002). Desde o primeiro relato do isolamento da
biflavona gingetin, mais de 100 biflavonóides, provenientes de plantas, foram
identificados. Uma extensa variedade de atividades biológicas foi atribuída a essas
moléculas, como, vasodilatadoras, hipoglicêmicas, antimicrobiana, dentre outras
atividades de maior especificidade, destacando-se a atividade antiviral contra HIV e
hepatite B (LIN, et al.,1997). Embora os biflavonóides possuam um leque de
propriedades importantes, esta classe de compostos fenólicos é pouco estudada.
Alguns estudos foram realizados com biflavonóides das espécies Ginkgo biloba e
Hypericum perforatum, devido à importância destes para a indústria farmacêutica,
entretanto, a pesquisa no gênero Cupressus é limitada. GADECK e QUINN (1985)
foram os primeiros a descrever a presença dos biflavonóides, derivados da
apigenina, amentoflavona e cupressoflavona (Figura 1.11) nas folhas de C.
sempervirens, C. lusitanica e C. glabra. Uma grande variedade de biflavonóides está
presente nos tecidos dos ciprestes, porém a identificação destes compostos ainda é
conflitante (ROMANI et al., 2002).
HEIMLER e PIERONI (1991) iniciaram estudos com a finalidade de
correlacionar à presença/ausência de biflavonóides a resistência ao cancro dos
ciprestes causado pelo ataque de fungos.
___________________________________________________________Introdução
16
Figura 1.11.
Fórmula estrutural dos biflavonóides isolados de C. lusitanica (A) Amentoflavona e (B)
Cupressoflavona
1.3.2 Cupressus e o cancro
Há relatos na literatura de que os ciprestes são acometidos por cancro
e, esta doença foi a responsável pela morte de muitos exemplares da família
Cupressaceae (GRANITI, 1998). Os fungos Seiridium cardinali e Seiridium unicorne
estão intimamente associados ao cancro (GRANITI, 1998, MUTHUCHELIAN et al.,
2005 e 2005a). As infecções causadas por fungos do gênero Seiridium ocorrem,
geralmente, a partir de lesões existentes no tronco ou nos ramos, tornando a copa
da árvore seca. Os ramos atacados tomam rapidamente uma coloração castanho-
avermelhada, destacando-se sobre o verde da vegetação não afetada, como pode
ser visto na Figura 1.12A. Observa-se também um grande fluxo de resina (Fig.
1.12B), que extravasa a partir de fissuras formadas pelo cancro. Anormalidades
histológicas e necrose de células da planta são fenômenos interpretados como
reações de defesa da planta, para limitar o avanço do patógeno (GRANITI, 1998).
Os sintomas aparentes, causados pela infecção de espécies de
Seiridium aos seus hospedeiros, estão relacionados à produção local de toxinas pelo
fungo, as quais são posteriormente difundidas aos tecidos adjacentes e às folhas
(GRANITI, 1998). S. cardinale produz várias fitotoxinas, como seiridinas,
seiricardinas, seiricuprolida e o ácido ciclopáldico dentre outros compostos (Figura
1.13). Os mecanismos de ação das fitotoxinas ainda não são claros, mas podem
afetar o funcionamento do floema, a translocação de carboidratos, bem como induzir
a inibição da fotossíntese (MUTHUCHELIAN et al, 2005, 2005a).
(A)
O
O
OH
HO
O
OH
OH OH
O
OH
O
OH
O
OH
OOH
HO
HO
OH O
(B)
___________________________________________________________Introdução
17
Figura 1.12.
(A) Folhas secas de C. lusitanica devido ao ataque de Seiridium unicorne, (B) resina
exsudada em decorrência da infecção
A incidência do cancro cortical e a disseminação de seus agentes
causais são particularmente graves quando as condições climáticas são favoráveis,
ou seja, em períodos chuvosos nos quais a umidade elevada propicia a reprodução
e propagação fúngica.
O cancro dos ciprestes não é exclusivamente decorrente dos fungos
Seiridium cardinali e Seiridium unicorne. Em estudos recentes, SPARAPANO et al.
(2004) e EVIDENTE et al. (2006) também reportam o fungo Sphaeropsis sapinea
como agente causador de cancros nos ciprestes.
Figura 1.13.
Estruturas das fitotoxinas produzidas por espécies de Seiridium: (A) Seiridina, (B)
Isoseiridina, (C) 7-hidroxi seiridina, (D) 7-hidroxi isoseiridina, (E) Seiricuprolida, (F) Ácido ciclopáldico,
(G) Seiricardina A, (H) Seiricardina B, (I) Seiricardina C
(E)
O
O
OH
O
O
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH OH
O
O
OH
O
OH
O
O
HO
HO
OH
O
H
OH
HO
H
O
OH
H
O
HO
(A) (B) (C)
(D)
(F)
(G) (H) (I)
(A) (B)
___________________________________________________________Introdução
18
O fungo Shaeropsis sapinea é um patógeno oportunista, de
distribuição cosmopolita, que se associa extensivamente às coníferas, causando-
lhes diversos danos, como cancro, ferrugem, doenças nas raízes, podridão, etc
(EVIDENTE et al., 2006).
A taxonomia de S. sapinea tem causado considerável confusão e
conflito (SWART et al., 1991). Inicialmente dois morfotipos, A e B, foram descritos
para S. sapinea e, foram definidos de acordo com a textura das paredes celulares
dos conídios e pela virulência (WANG et al., 1985, PALMER et al., 1987). A distinção
também foi confirmada empregando-se seqüências de DNA e de rRNA (WET et al.,
2000). Recentemente foi designado o morfotipo C baseado nas diferenças de
tamanho dos conídios (WET et al., 2000).
O isolamento e estudo dos metabólitos secundários podem contribuir
de modo significativo para melhor caracterizar a biologia, fisiologia e patogenicidade
dos morfotipos de S. sapinea, além de explicar a possibilidade de interações
específicas com os hospedeiros (EVIDENTE et al., 2006).
O fungo S. sapinea é produtor de vários metabólitos secundários,
dentre eles duas dimedonas metil éter (metabólitos fitotóxicos); sphaeropsidona e
epishaeropsidona (EVIDENTE et al., 1998) e dois metabólitos não tóxicos;
clorosphaeropsidona e a epiclorosphaeropsidona (EVIDENTE et al., 2000). Destaca-
se ainda a produção de sphaeropsidinas A – F (FIGURA 1.14), diterpenos
pimaranos tri e tetracíclicos (EVIDENTE et al., 1996, 1997, 2002, 2003).
Figura 1.14.
Estrutura das spaheropsidinas A - F, respectivamente, produzidas por S.sapinea
O
H
OH
O
OH
O
O
H
OH
OH
O
OH
H
O
OH
HO
O
O
H
O
H
O
O
H
O
O
H
H
O
H
H
O
O
H
H
O
H
O
H
O
H
O
H
___________________________________________________________Introdução
19
Pesquisas atuais demonstraram que as sphaeropsidinas A – C são
potentes fitotoxinas para seus hospedeiros (ciprestes) e não hospedeiros (tomate e
grãos). A sphaeropsidinas D apresenta fitotoxicidade apenas para Cupressus
macrocarpa, enquanto a sphaeropsidina F é moderadamente fitotóxica somente
para C. sempervirens (SPARAPANO et al., 2003). Este estudo exibiu um fato de
relevante curiosidade, a potente atividade antimicótica destas substâncias frente a S.
unicorne, indicando-as como agentes preventivos de infecções de fungos da espécie
Seiridium.
Observa-se um fato muito intrigante, dado que Shaeropsis sapinea
produz diterpenos pimaranos polifuncionalizados, cujos esqueletos básicos são
também produzidos por Cupressus lusitanica. Esta curiosa ocorrência pode estar
relacionada à transferência genética horizontal, na qual o microrganismo “aprendeu”
a produzir estas substâncias com a planta e, por um sistema enzimático oxidativo,
ele funcionaliza o esqueleto destes diterpenos, tornando-os tóxicos. Uma outra
hipótese relevante, que deve ser considerada, é que o fungo, estrategicamente, usa
os diterpenos já produzidos pela planta e os toxifica através da ação enzimática.
Esta observação foi a inspiração deste trabalho de mestrado.
__________________________________________________________Objetivos
20
2. OBJETIVOS
As principais metas do projeto foram relacionadas à descrição do perfil
químico de microrganismos associados à Cupressus lusitanica e, a comparação
desse perfil com aquele apresentado pela planta hospedeira, usando metodologias
analíticas rápidas.
Também como objetivos destaca-se o isolamento e identificação de
outros metabólitos secundários produzidos pelos microrganismos.
Além dos objetivos já mencionados foi realizada a avaliação do
potencial antibiótico dos extratos e substâncias obtidas usando metodologias já
implementadas no LaBioMMi.
Os objetivos específicos consistiram em:
· Isolar microorganismos associados à Cupressus lusitanica.
· Cultivar os microorganismos em diferentes meios de cultura com a finalidade de
aperfeiçoar a produção dos diterpenos.
· Estabelecer condições ótimas de extração e pré-purificação dos diterpenos.
· Estabelecer condições ótimas de resolução cromatográfica em Cromatografia à
Líquido.
· Estabelecer condições ótimas de análise por Cromatografia a Gás acoplada a
Espectrometria de Massas.
· Estudar a fragmentação dos diterpenos por electrospray (ESI) e decomposição
induzida por colisão (CID). Escolher a partir desses dados, os melhores
experimentos para a detecção seletiva dessas substâncias nos meios de cultura.
· Efetuar bioensaios visando à investigação do potencial antibiótico dos extratos e
substâncias isoladas.
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____________________________________________Parte Experimental
21
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 Materiais e equipamentos
3.1.1 Materiais utilizados para o isolamento, cultivo e conservação
dos fungos endofíticos
- Ágar bacteriológico SIGMA;
- Água destilada;
- Álcool 70%;
- Alça de platina;
- Batata inglesa;
- Bico de Bunsen;
- Dextrose Mallinckrodt;
- Lâminas de bisturi;
- Papel de filtro qualitativo (80g Ø=12,5 cm) SATELIT;
- Placas de Petri;
- Vidros de penicilina e suas respectivas tampas
3.1.2 Equipamentos utilizados para o isolamento, cultivo e
conservação dos fungos endofíticos
- Autoclave vertical Phoenix AV 75 e Soc. FABBE 103;
- Capela de fluxo laminar VECO VLFS -12M;
- Estufa de secagem e incubação FANEM 347 CD
3.1.3 Equipamentos utilizados
- Bomba LC10AD gradient pumps, SHIMADZU;
- Centr
ífuga Mobilispin VULCO TECHNOLOGIES
- CentriVap concentrador LABCONCO
- CentriVap cold trap LABCONCO
- Cromatógrafo a gás, GC 8000 series Fisons;
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____________________________________________Parte Experimental
22
- Detector de arranjo de diodos WATERS 2696;
- Detector de UV (PDA) para HPLC SHIMADZU SPD-10A UV-Vis;
- Espectrômetro de massas triplo quadrupolo ESI, QuattroLC – Micromass;
- Espectrômetro de massas VG Platform;
- Espectrômetros de Ressonância Magnética Nuclear ARX-200 e APX-400;
- HPLC SHIMATZU analítico e preparativo
- Injetor para HPLC SHIMADZU Auto Injector SIL-10ADVp;
- Microondas LG Smart Dial modelo MS 158DDA;
- Módulo de comunicação detector/computador em HPLC SHIMADZU CBM-10A
Communication BUS Module;
- Módulo de separação WATERS 2695;
- Moinho TEC 631 TECNAL;
- Rotavapor BÜCHI R-200 com banho de aquecimento BÜCHI B-490 e rotavapor
BÜCHI R-114 com banho de aquecimento BÜCHI B-480;
- Sonicador BRANDSON 1510.
3.1.4 Material utilizado nos ensaios biológicos
- Ágar Mueller Hinton – Acumedia
;
- Agitador de tubos AP56 PHOENIX
- BHI (Infuso Cérebro Coração) – Acumedia
;
- Caldo Mueller Hinton – Difco
;
- Dimetilsulfóxido – Sinth
;
- Padrão de sulfato de bário (escala de McFarland: 1,0 x 10
8
cel/mL);
- Tetraciclina – Bristol-Mayes-Squibb
3.1.5 Suportes cromatográficos
- Cromatografia em camada delgada analítica: Sílica gel em folhas sobre alumínio
(ALUGRAM
TM
SIL G/UV
254
– MACHEREY-NAGEL);
- Cromatografia em coluna : ODS (h = 13,5 cm e ñ = 2,5 cm);
- Cromatografia em coluna : Sephadex LH 20 (h = 1,15 m e ñ = 3,5 cm);
- Cromatografia em coluna: Sílica gel 230-400 mesh;
____________________________________________Parte Experimental
23
- Coluna cromatográfica em CLAE analítica: Synergi 4 Fusion _RP 80A (part nº
00G-4424-E0), tamanho: 250 X 4.60 mm, Phenomenex e Gemini 10 C18 110A
(part nº 00G-4436-E0), Phenomenex; Luna 5 Phenyl-Hexyl (part number 00G-4257-
E0);
- Coluna cromatográfica em CLAE preparativa: coluna ODS Shim pack (250 x
21,20mm)
- Coluna cromatográfica em CG: DB1-MS J & W Scientific, 30 m e 0,25 m de filme
de diâmetro interno.
3.1.6 Solventes empregados
- Solventes para cromatografia em bancada: destilados no DQ-UFSCar;
- Solventes grau HPLC: acetonitrila, isopropanol MALLINCKRODT
, metanol J. T.
Baker
, ácido trifluoroacético TEDIA
, H
2
O purificada Milli-Q
;
- Solventes deuterados: água, clorofórmio e metanol CAMBRIDGE ISOTOPE
LABORATORIES
, Inc.
3.2 Procedimento experimental
3.2.1 Isolamento dos fungos endofíticos de Cupressus lusitanica
3.2.1.1 Preparo do meio de cultura BDA
O meio de cultura BDA (Batata, Dextrose, Ágar) foi preparado
cozinhando-se 60 g de batata inglesa, descascada e cortada em cubos, por 15
minutos em forno de microondas (potência 60 W) com 150 mL de água destilada.
Em seguida, filtrou-se, com o auxílio de uma gaze, transferindo o caldo para um
Erlenmeyer. Acrescentou-se 6,0 g de dextrose e, após sua dissolução adicionou-se
4,5 g de ágar à mistura, homogeneizando-a e completando-se o volume para 300
mL de água destilada.
Ap
ós a esterilização do meio, em autoclave à 121 ºC e 1 atm,
adicionou-se uma suspensão do antibiótico terramicina, para evitar possíveis
contaminações bacterianas. Em seguida o meio foi transferido para placas de Petri,
previamente esterilizadas.
____________________________________________Parte Experimental
24
3.2.1.2 Isolamento dos endófitos de Cupressus lusitanica
Realizou-se, em setembro de 2006, um experimento preliminar, o qual
consistia no isolamento dos endófitos de Cupressus lusitanica. Para isso, foram
coletados galhos da planta localizada no campus da UFSCar.
O isolamento dos endófitos foi realizado de acordo com a metodologia
descrita por PETRINI et al. (1992). Após a lavagem das folhas em água corrente, toda
a micro população epifítica foi eliminada por meio de imersão de fragmentos da planta
em etanol 70% por 2 segundos, seguido da imersão em solução aquosa de hipoclorito
de sódio 11% durante 1-5 minutos, etanol 70% por 2 segundos, e por último, a
lavagem em água destilada para a remoção de resíduos dos agentes esterilizantes.
Os fragmentos do material vegetal foram depositados sob placa de Petri
contendo meio BDA acrescido de antibiótico e incubados a 25˚C e observados
diariamente.
A fim de purificar as colônias fúngicas, promoveu-se repiques sucessivos
nas placas em que houve crescimento de mais de uma colônia de microrganismo.
Em março de 2007 repetiu-se o processo de isolamento dos fungos
endofíticos, a fim de se confirmar a presença dos microrganismos já isolados. Para
isso, empregou-se procedimento idêntico ao mencionado anteriormente, porém,
durante todo o experimento, manteve-se uma placa de Petri, com meio BDA, aberta,
com o intuito de se verificar possíveis contaminações externas. Também para se
certificar sobre a eficácia do procedimento de isolamento inoculou-se gotas da última
água de lavagem.
Os microrganismos isolados foram catalogados na micoteca do
LaBioMMI e cada um deles recebeu o código de NICL (não identificado de
Cupressus lusitanica) seguido de um número para sua respectiva identificação .
3.2.1.3 Conservação dos fungos endofíticos isolados de C. lusitanica
Os fungos foram repicados em placas de Petri contendo o meio BDA e
incubados a 25ºC por um período de sete dias.
Decorrido o período de incubação dos fungos, realizou-se a
esterilização do material necessário para conserva. Inicialmente, transferiu-se 5 mL
de água destilada a vidros de penicilina, em seguida, estes foram vedados com
____________________________________________Parte Experimental
25
papel filme e papel alumínio. Os vidros de penicilina e suas respectivas tampas
foram esterilizados em autoclave a 121 ºC e 1 atm por 15 minutos.
Em capela de fluxo laminar asséptica, pequenos cubos do meio BDA
contendo o microrganismo foram cortados e transferidos aos vidros de penicilina, os
quais foram vedados e armazenados no LaBioMMi. O mesmo procedimento foi
realizado para os demais fungos isolados de C. lusitanica.
3.2.2 Cultivo dos microrganismos
3.2.2.1 Cultivo dos microrganismos em meio líquido e obtenção dos
extratos
Em um estudo preliminar os fungos endofíticos isolados de Cupressus
lusitanica, foram cultivados, em pequena escala, em meio líquido Czapeck
enriquecido com 2% de extrato de levedura, o qual é composto pelos seguintes
nutrientes:
- 4,8 g de NaNO
3
;
-1,6 g de K
2
HPO
4
;
- 0,8 g de MgSO
4
;
- 0,8 g de KCl;
- 0,016 g de FeSO
4
.
7H
2
O;
- 48 g de glicose;
- 32,0 de extrato de levedura;
- 1,6 L de H
2
O.
Dissolveram-se, sob agitação constante, os reagentes em água
destilada. Em seguida, adicionaram-se, separadamente, 100 mL do meio de cultura
em 16 Erlenmeyers de 250 mL, os quais foram autoclavados por 15 minutos, à
120˚C e 1 atm de pressão.
A seguir, os frascos contendo o meio de cultura foram transferidos à
capela de fluxo laminar, previamente limpa e, após o meio atingir a temperatura
ambiente, transferiram-se 3 fragmentos, com cerca de 0,5 cm cada, de um dos
microrganismos contido em placas de Petri com meio BDA para 3 Erlenmeyers,
mantendo-se 1 deles como controle de assepsia. Procedimento idêntico foi adotado
____________________________________________Parte Experimental
26
para os demais endófitos. Os frascos foram incubados durante 20 dias, a
temperatura de 25˚C e sob repouso.
Finalizado o período de incubação, os frascos com meio de cultivo
contendo o fungo, bem como o frasco contendo o branco, foram filtrados, a pressão
reduzida, em capela de fluxo laminar, resultando, no micélio e no filtrado. Ao micélio
adicionaram-se 250 mL de EtOH absoluto, triturando-o a seguir. Após 2 dias, este foi
filtrado e adicionaram-se, novamente, 250 mL de EtOH à massa micelial. O filtrado
etanólico foi concentrado em rotaevaporador, levando ao extrato micelial (M).
Particionou-se o filtrado com AcOEt na proporção de 1:1, por 3 vezes, o qual
produziu o extrato (P). Um resumo do procedimento descrito encontra-se no
Esquema 3.1.
Em estágio posterior, todos os microrganismos isolados foram
cultivados em larga escala, ou seja, em 6L de meio de cultura Czapecks com 2% de
extrato de levedura, divididos em 20 erlenmeyers de 1000 mL.
Esquema 3.1.
Procedimento de cultivo e extração dos fungos endofíticos
3.2.3 Obtenção do material botânico
3.2.3.1 Coleta de material vegetal para obtenção dos extratos
Foram coletados os galhos de Cupressus lusitanica de três árvores de
diferente localização dentro da universidade, sendo uma situada próxima ao
departamento de química (ÁRVORE 1) e as outras duas nas proximidades do
departamento de estatística (ÁRVORE 2 e ÁRVORE 3).
20 DIAS DE
CULTIVO
TRITURAÇÃO,
FILTRAÇÃO
ADIÇÃO
DE 500 mL
EtOH AO MICÉLIO
FILTRAÇÃO
ADIÇÃO DO
FUNGO
ENDOFÍTICO
FILTRADO
PARTIÇÃO
COM AcOEt
EXTRATO
(M)
EXTRATO
(P)
MEIO CZAPECK
____________________________________________Parte Experimental
27
Os ramos de C. lusitanica foram secos em estufa de circulação de ar à
temperatura de 45˚C durante 24 h. Em seguida, dividiu-se os ramos em 2 partes,
sendo estas denominadas de ramos lenhosos (RL) e folhas (F), de acordo com a
Figura 3.1. Após a separação do material vegetal, este foi moído.
A tabela a seguir apresenta as massas de folhas e dos ramos lenhosos
das árvores 1, 2 e 3.
Tabela 3.1
Massa dos materiais vegetais das árvores em estudo
Material vegetal
Massa (g)
ÁRVORE 1
Massa (g)
ÁRVORE 2
Massa (g)
ÁRVORE 3
Folhas 75,59 157,30 44,81
Ramos lenhosos 21,56 57,52 11,35
Após a moagem do material vegetal acrescentaram-se 400 mL de AcOEt
aos frascos de Erlenmeyer contendo as folhas e 250 mL do mesmo solvente aos
frascos contendo os ramos lenhosos.
O processo de extração foi realizado durante 5 dias em temperatura
ambiente e em repouso. Decorrido este período, separou-se o material vegetal do
extrato por meio de filtração a pressão reduzida. Os extratos de RL e F foram
concentrados, separadamente, em rotaevaporador. Prosseguiu-se a extração com
EtOH por mais 5 dias e realizou-se procedimento idêntico ao mencionado para a
obtenção do extrato alcoólico.
Figura 3.1. Partes nas quais os galhos de Cupressus lusitanica foram divididos
Analisaram-se, ambos os extratos (AcOEt e EtOH) RL e F das 3
árvores,
por CCD e estes apresentaram perfis cromatográficos idênticos; decidiu-se, então,
reunir todos os extratos, e realizou-se partição líquido-líquido com Hex:EtOH (1:1). A
FOLHAS
(F)
RAMOS
LENHOSOS
(RL)
____________________________________________Parte Experimental
28
fase hexânica forneceu o extrato denominado PHCL (particionado hexânico de
Cupressus lusitanica) com 11,5459 g e a fase etanólica resultou no extrato PECL
(particionado etanólico de Cupressus lusitanica) com 15,0063 g de massa.
A química do extrato hexânico de C. lusitanica foi explorada a partir de
análises por CG/EM e comparada com os extratos fúngicos.
3.2.4 Estudo dos extratos fúngicos e botânico
3.2.4.1 Fracionamento dos extratos fúngicos “P” e “M” e botânico
“PHCL”
Adotou-se o mesmo procedimento no pré-tratamento dos extratos fúngicos
(P e M) e botânico (PHCL).
Inicialmente, os extratos fúngicos e botânico foram monitorados por CCD,
com vários sistemas de eluição e, constatou-se uma satisfatória separação de
substâncias por polaridade.
Com a finalidade de se promover uma pré-limpeza e diferenciação pela
polaridade destes extratos, realizou-se, separadamente, cromatografia em coluna
com placa sinterizada (h = 4,5 cm e Ö = 3,7 cm), empregando-se o mesmo
sistema de eluição da análise por CCD. A Tabela 3.2 apresenta a ordem de
eluição utilizada.
As frações resultantes das colunas filtrantes foram monitoradas por
CLAE/UV.
Tabela 3.2 Sistema de eluição para coluna filtrante
Sistema de eluentes Proporção
Volume (mL)
Código das frações
Hex : CH
2
Cl
2
1:1 200 A
CH
2
Cl
2
: AcOEt 1:1
200
B
CH
2
Cl
2
: AcOEt 1:4
200
C
CH
2
Cl
2
: AcOEt: MeOH
1:4:10%
200
D
AcOEt : MeOH 1:1
200
E
MeOH 100%
200
F
____________________________________________Parte Experimental
29
3.2.5 Análise por CLAE/UV
3.2.5.1 Condições CLAE/UV para análise dos extratos fúngicos “P” e “M”
e do extrato botânico “PHCL”
Utilizou-se metanol (Bomba B) o qual foi filtrado em membrana de
nylon (45 ìm) e água (Bomba A) purificada em sistema Millipore Milli-Q. Os eluentes
foram sonicados por 30 minutos.
As análises foram realizadas utilizando-se coluna Phenomenex-Synergi
4 Fusion _RP 80A, com eluição gradiente e no modo reverso, de acordo com a
Tabela 3.3. Empregou-se vazão de 0,8 mL/min e o volume de injeção foi de 30 L .
As frações monitoradas foram comparadas com frações ricas em
diterpenos, previamente isolados pelo grupo, os quais foram submetidos às mesmas
condições analíticas das amostras.
Tabela 3.3 Método cromatográfico terp_261007. Sistema de eluição dos extratos fúngicos e extrato
botânico PHCL
Tempo (min) %B
0.01 70
10.00 85
25.00 85
25.01 90
30.00 90
40.00 100
50.00 100
50.01 70
60.00 70
____________________________________________Parte Experimental
30
3.2.6 Análise por CG/EM
3.2.6.1 Tratamento da amostra utilizando extração em fase sólida
Antes da inserção dos extratos no sistema de CG/EM foram adotados
procedimentos de pré-tratamento de amostra, os quais estão descritos nesta
sessão.
Foram pesados, separadamente, 100 mg de extrato bruto de cada um
dos fungos e também 100 mg de folhas de C. lusitanica seca e moída e, para a
dissolução destes, foram adicionados, separadamente, 3 mL de clorofórmio.
Com a finalidade de se analisar as substâncias apolares presentes nos
extratos, realizou-se extração em fase sólida (EFS), empregando cartuchos de sílica
(STRATA SI-1 sílica).
Inicialmente ativou-se o cartucho com hexano, em seguida, este foi
condicionado com clorofórmio. Então, aplicou-se a amostra, seguida da eluição com
clorofórmio.
Após a secagem do material eluído, este foi re-suspendido em 1,0 mL de
clorofórmio e injetado 2L no CG/EM.
3.2.6.2 Tratamento da amostra utilizando derivação com diazometano
Adotou-se um segundo procedimento de tratamento de amostra, a
metilação dos extratos com diazometano, uma vez que, não se conhecia a
polaridade dos compostos constituintes dos extratos fúngicos e, também para
impedir que os compostos mais polares ficassem aderidos à coluna cromatográfica.
Inicialmente, preparou-se o diazometano, dissolvendo-se 2,14 g de
Diazald (N-metil-N-nitroso-4-toluosulfoamida) em 30 mL de éter etílico, em seguida,
resfriou-se a mistura em banho de gelo por cinco minutos. Decorrido o tempo
determinado, transferiu-se a mistura a um sistema próprio para esta reação
(FIGURA 3.2) e, em seguida, acrescentou-se 0,4 g de KOH dissolvidos em 10 mL de
etanol absoluto. O sistema foi deixado em repouso por cinco minutos em banho de
gelo. Iniciou-se a reação com o aquecimento do sistema a 60 ºC. Coletou-se o
produto da reação, sob resfriamento através de banho de gelo.
____________________________________________Parte Experimental
31
Transferiram-se 50 ìL de diazometano a cada frasco contendo 5 mg
de extrato fúngico. Os frascos foram vigorosamente agitados, e uma alíquota de 3
ìL foi inserida no sistema de CG/EM.
As condições descritas, a seguir, foram empregadas na análise dos
extratos não derivados e derivados com diazometano. Antes da injeção da amostra
no equipamento, fixou-se a temperatura do injetor para 180
o
C e ajustou-se a rampa
de aquecimento, a qual variou da seguinte forma: temperatura fixa em 70
o
C por seis
minutos, elevação de 70
o
C para 250
o
C em uma velocidade de 6,0
o
C/min; e então
para 325
o
C a uma velocidade de 3
o
C/min.
Figura 3.2.
Ilustração do sistema reacional para obtenção de diazometano
3.2.7 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários do
microrganismo NICL3
O pré-tratamento do extrato PNICL3 em coluna cromatográfica com
placa sinterizada resultou em 6 frações (A-F). As frações PNICL3B, PNICL3C e
PNICL3D foram submetidas, separadamente, a cromatografia clássica de bancada. O
Fluxograma 3.1 ilustra os procedimentos cromatográficos aos quais a fração PNICL3
foi submetida.
____________________________________________Parte Experimental
32
Extrato
PNICL3
PNICL3A PNICL3B PNICL3C
PNICL3D
PNICL3E
PNICL3F
PNICL3C15
PNICL3D11
(a)
(b)
(c)
(d)
PNICL3B68
PNICL3B37
PNICL3C28
Fluxograma 3.1.
Isolamento dos metabólitos secundários do extrato PNICL3
(a) coluna cromatográfica com placa sinterizada
de dimensões h = 4,5 cm e Ö = 3,7 cm. Fase
estacionária: sílica comum. Fase móvel: eluição no modo gradiente conforme ilustra a tabela 3.2.
(b) cromatografia clássica de bancada empregando coluna de dimensões h = 16 cm e Ö = 2,5 cm.
Fase estacionária sílica gel 230-400 mesh. Fase móvel realizada no modo gradiente de eluição,
iniciando com 100% de Hex até AcOEt/MeOH 1:1. Foram obtidas 119 frações recolhidas em vidros
de 15 mL. As frações foram reunidas de acordo com o perfil cromatográfico observado em CCD.
(c) cromatografia clássica de bancada empregando coluna de dimensões h = 9,0 cm e Ö = 2,0 cm.
Fase estacionária sílica gel 230-400 mesh. Fase móvel realizada no modo gradiente de eluição,
iniciando com 100% de Hex até AcOEt/MeOH 1:1. Foram obtidas 44 frações recolhidas em vidros de
15 mL. As frações foram reunidas de acordo com o perfil cromatográfico observado em CCD.
(d) cromatografia clássica de bancada empregando coluna de dimensões h = 16 cm e Ö = 2,0 cm.
Fase estacionária sílica gel 230-400 mesh. Fase móvel realizada no modo gradiente de eluição,
iniciando com 100% de Hex até AcOEt/MeOH 1:1. Foram obtidas 90 frações recolhidas em vidros de
15 mL. As frações foram reunidas de acordo com o perfil cromatográfico observado em CCD.
As substâncias PNICL3C15, PNICL3B37 foram analisadas por
1
H RMN,
PNICL3B68 por
1
H RMN, COSY e CG/EM. Para elucidação estrutural de PNICL3C28
foram empregadas análises de
1
H RMN uni e bidimensional,
13
C RMN, NOE, e
Espectrometria de Massas utilizando electrospray no modo positivo de ionização. Já
PNICL3D11 foi analisada por
1
H RMN uni e bidimensional.
____________________________________________Parte Experimental
33
3.2.8 Comparação do perfil metabólico de NICL3 em diferentes
meios de cultura
3.2.8.1 Preparo dos diferentes meios de cultura
Para verificar o comportamento do microrganismo e, possíveis
alterações na produção dos metabólitos, realizou-se o cultivo do fungo em quatro
meios de cultura diferentes. Além do meio Czapeck enriquecido com 2% de extrato
de levedura, foram preparados meios sólidos, arroz parboilizado e milho de canjica e
também o meio baseado em extrato de soja.
O meio Czapeck com 2% de extrato de levedura foi preparado como
descrito em 3.2.2.1. O preparo dos meios sólidos, arroz e milho, deu-se de forma
idêntica. Utilizou-se quatro Erlenmeyers de 1000 mL, contendo, previamente, 100 g
de arroz parboilizado Uncle bean’s
, aos quais foram adicionados, 84 mL de água
destilada em cada frasco. Em seguida, os frascos foram autoclavados duas vezes
(em dois dias consecutivos) por 40 minutos a temperatura de 121 ºC e 1 atm de
pressão.
O meio contendo extrato de soja foi preparado de acordo com o
descrito pelo fabricante do produto, ou seja, para cada 200 mL de água, 2 colheres
de sopa do substrato. Foram utilizados 4 frascos de Erlenmeyer contendo um
volume de 300 mL em cada frasco. O meio foi esterilizado em autoclave por 15
minutos, a temperatura de 121ºC e 1 atm.
Para esse experimento foram utilizados um total de 16 Erlenmeyrs de
1000 mL. Quatro frascos contendo 300 mL de meio Czapeck enriquecido com
extrato de levedura, quatro frascos com 300 mL de extrato de soja, quatro com 100
g de arroz parboilizado e quatro com 100 g de milho de canjica.
Após os meios atingirem a temperatura ambiente, 3 fragmentos do
microrganismo, contido em placas de Petri com meio BDA, foram transferidos
assepticamente para 3 frascos de cada meio de cultura. Um frasco de cada meio foi
mantido como controle de esterilidade. Os frascos de Erlenmeyers foram incubados,
em ambiente sem luz e de forma estática e, cultivados por um período de 20 dias.
____________________________________________Parte Experimental
34
3.2.8.2 Obtenção dos extratos
O extrato proveniente do meio líquido Czapeck com 2% de extrato de
levedura foi obtido de forma idêntica ao descrito no item 3.2.2.1.
O crescimento da massa fúngica nos meios de arroz, milho e extrato
de soja foi interrompido mediante adição de 500 mL de EtOH em cada um dos
frascos, os quais foram deixados em repouso por 24 horas. Em seguida, a massa
fúngica foi triturada e, posteriormente separada por filtração a pressão reduzida. O
filtrado foi concentrado em evaporador rotativo, obtendo-se, dessa forma, o extrato
etanólico. Após a filtração, foram adicionados 300 mL de AcOEt à massa fúngica e,
o processo de extração, filtração e concentração foi idêntico ao mencionado
anteriormente, resultando no extrato de acetato de etila.
3.2.8.3 Análise dos extratos por CLAE/UV
Os extratos referentes ao experimento de comparação de meios de
cultura foram analisados por CLAE/UV, empregando-se uma coluna Luna 5ì Phenyl
Hexyl e como fase móvel foi utilizada água e acetonitrila, com vazão de 0,7 mL/min.
Utilizou-se eluição gradiente como ilustra a Tabela 3.4. Os extratos foram
preparados na concentração de 2,5 mg/mL e injetados em um volume de 30ìL.
Tabela 3.4. Eluição gradiente utilizada nas análises do cultivo de NICL3 em diferentes meios de
cultura
Tempo Concentração de B% (acetonitrila)
0 20
40 100
45 100
47 15
60 15
____________________________________________Parte Experimental
35
Extrato
PNICL5
PNICL5A
P
NICL5B
PNIC5C
P
NICL5D
P
NICL5E
P
NICL5F
(a)
(b)
PNICL5B1
PNICL5B3
PNICL5B2
3.2.9 Isolamento e identificação dos metabólitos secundários do
microrganismo NICL5
Os extratos PNICL5 e MNICL5 sofreram um pré-tratamento utilizando-se
coluna cromatográfica com placa sinterizada, o qual resultou em 6 frações (A-F) de
cada extrato. O sistema de eluição empregado foi descrito na tabela 3.2 do item
3.2.4.1.
A fração PNICL5B foi analisada por CLAE/EM e posteriormente
submetida a métodos cromatográficos, empregando o equipamento de CLAE
preparativo. Para a separação dos compostos utilizou-se como fase estacionária
coluna ODS e fase móvel constituída por água e metanol na proporção de 4:6, no
modo isocrático de eluição. Foi utilizada vazão de 5 mL/min e monitorados os
comprimentos de onda em 240 e 290 nm. Foram obtidas três frações, PNICL5B1,
PNICL5B2 e PNICL5B3, as quais foram analisadas por CLAE/EM e por RMN. O
Fluxograma 3.2 mostra um resumo do procedimento descrito anteriormente.
Fluxograma 3.2.
Isolamento dos metabólitos secundários do extrato PNICL5
(a) coluna cromatográfica com placa sinterizada
de dimensões h = 4,5 cm e Ö = 3,7 cm. Fase
estacionária: sílica comum. Fase móvel: eluição no modo gradiente conforme ilustra a tabela 3.2. A
fração PNICL3B foi analisada por CLAE/EM.
(b) CLAE preparativa: fase estacion
ária Shim Pack de 250 x 21,20 mm; eluição isocrática
empregando a fase móvel H
2
O:MeOH (4:6); vazão de 5mL/min; monitorado em 240 e 290 nm
A fração MNICL5B foi submetida à cromatografia líquida de bancada e, a
fração MNICL5F foi lavada com diferentes solventes. O Fluxograma 3.3. mostra os
procedimentos adotados.
____________________________________________Parte Experimental
36
Extr
ato
MNICL5
MNICL5A
MNICL5B
MNIC5C
MNICL5D
MNICL5E
MNICL5F
(a)
(b)
MNICL5F’
MNICL5B
1
-
13
MNICL5B
30
-
45
MNICL5B
14
-
20
(c)
Fluxograma 3.3.
Isolamento dos metabólitos secundários do extrato PNICL5
(a) coluna cromatogr
áfica com placa sinterizada
de dimensões h = 4,5 cm e Ö = 3,7 cm. Fase
estacionária: sílica comum. Fase móvel: eluição no modo gradiente conforme ilustra a tabela 3.2.
(b) cromatografia clássica de bancada empregando coluna de dimensões h = 20 cm e Ö = 3 cm. Fase
estacionária sílica gel 230-400 mesh. Fase móvel realizada no modo gradiente de eluição,
Hex:CH
2
Cl
2
(1:1) até AcOEt/MeOH (1:1). Foram obtidas 50 frações recolhidas em vidros de 15 mL. As
frações foram reunidas de acordo com o perfil cromatográfico observado em CCD.
(c) lavagem da fração com os seguintes solventes: Hex, CH
2
Cl
2
, AcOEt.
As frações MNICL5B14-20 apresentaram o mesmo perfil
cromatográfico e, dessa forma, foram reunidas e analisadas por RMN
1
H. Já dentre
as frações MNICL5B21-50, destacaram-se as frações 30-45, pois apresentavam o
mesmo perfil cromatográfico, no entanto, o espectro de RMN de
1
H mostrou-se
muito parecido com os espectros das frações PNICL5B1-3 (Fluxograma 3.2) e não
serão discutidos neste trabalho.
3.2.9.1 Análise por CLAE/EM
A fração PNICL5B e as subfrações PNICL5B1, PNICL5B2 e PNICL5B
foram analisadas por EM empregando fonte de ionização electrospray (ESI) no
modo positivo. A Tabela 3.5 ilustra as condições do equipamento para realização
das análises.
As análises foram realizadas com coluna Luna 5ì Phenyl Hexyl,
eluição gradiente e no modo reverso, empregando água e acetonitrila como fase
móvel. O gradiente utilizado encontra-se descrito na Tabela 3.6.
____________________________________________Parte Experimental
37
O volume de injeção de amostra foi de 50 ìL e, a vazão foi de 1,0
mL/min, porém, necessitou-se de um divisor de fluxo para introdução de 0,3 mL da
amostra no espectrômetro de massas.
Tabela 3.5 Condições de análise do espectrômetro de massas
Experimento Full Scan
Fonte de ionização Electrospray positivo, (ESI(+))
Capilar 3,36 kV
Cone 20 V
Extrator 3 V
Lentes de Radiofreqüência 0,68 V
Temperatura da fonte 50 °C
Temperatura do probe 300 °C
Tabela 3.6.
Eluição gradiente empregada na análise de CLAE/EM
Tempo Concentração de B% (acetonitrila)
0 30
10 50
30 80
31 100
35 100
36 20
45 20
____________________________________________Parte Experimental
38
3.2.10 Comparação do perfil metabólico de NICL5 em diferentes
meios de cultura
3.2.10.1 Preparo dos diferentes meios de cultura e obtenção dos extratos
Assim como NICL3 foi cultivado em diferentes meios de cultura, para
se verificar seu comportamento frente à composição do meio e à produção de
metabólitos secundários, estudou-se também o efeito dessa alteração no
metabolismo do fungo NICL5.
Os procedimentos de preparo dos meios Czapeck enriquecido com 2%
de levedura, arroz, milho e extrato de soja foram idênticos aos descritos no item
3.2.8.1, no entanto, NICL5 foi, também, cultivado em meio BD (batata, dextrose). O
preparo do meio foi semelhante ao do meio BDA, descrito no item 3.2.1.1, porém
sem a adição do ágar.
Foram utilizados no total 20 Erlenmeyers, sendo o microrganismo
inoculado em 3 frascos de cada meio de cultura. Um frasco de cada substrato foi
mantido como controle de esterilidade.
O cultivo do microrganismo foi de 20 dias, de forma estática e ambiente
sem luz.
Os extratos provenientes do meio líquido Czapeck com 2% de extrato
de levedura e meio BD foram obtidos igualmente como descrito no item 3.2.2.1. Já a
obtenção dos extratos de arroz, milho e soja, foi realizada de forma idêntica ao
mencionado no item 3.2.8.2.
3.2.10.2 Análise dos extratos por CLAE/UV
Como fase estacionária foi empregada coluna Luna 5ì Phenyl-Hexyl e
fase móvel composta por água e acetonitrila, empregando modo gradiente de
eluição, conforme descrito na Tabela 3.7. Foi utilizada vazão de 1 mL/min.
Os extratos foram preparados na concentração de 10 mg/mL.
____________________________________________Parte Experimental
39
Tabela 3.7. Método cromatográfico empregado na análise de comparação de meios de cultura
Tempo Concentração de B% (acetonitrila)
0 15
15 40
30 80
31 0
35 0
36 30
45 30
3.2.11 Efeito da adição de aminoácidos no metabolismo do fungo
NICL5
3.2.11.1 Preparo dos meios de cultura e obtenção dos extratos de NICL5
Os microrganismos têm um grande poder de multiplicação e são
adaptáveis a variações nutricionais, dessa forma, investigou-se qual seria o
comportamento do fungo NICL5 mediante a adição de aminoácidos ao meio de
cultura.
Comparou-se o metabolismo do microrganismo, cultivando-o em meio
de cultura carente em aminoácidos (Czapeck), meio rico em diversos aminoácidos
(Czapeck enriquecido com 2% de extrato de levedura), meio enriquecido com
alanina (CzapecK com alanina), meio enriquecido com fenilalanina (Czapeck com
fenilalanina), meio enriquecido com tirosina (Czapeck com tirosina) e meio
enriquecido com triptofano (Czapeck com triptofano).
Prepararam-se 2700 mL de meio Czapeck, o qual foi dividido em
dezoito Erlenmeyers de 500 mL contendo 150 mL do meio. Como o experimento
envolveu seis meios de cultura de diferente composição, o cultivo do microrganismo
foi realizado em triplicata para cada meio. A quantidade de aminoácido livre
adicionado foi baseada na composição do extrato de levedura e, encontra-se
descrita na Tabela 3.8.
Os meios foram esterilizados e, ap
ós atingirem a temperatura
ambiente, o microrganismo foi inoculado e cultivado por 20 dias na ausência de luz.
____________________________________________Parte Experimental
40
Tabela 3.8. Aminoácidos e suas respectivas massas adicionadas ao meio de cultura
Aminoácido Massa (g)
Alanina 6,264
Fenilalanina 2,736
Tirosina 1,656
Triptofano 0,864
Decorrido esse período, o desenvolvimento do microrganismo foi
interrompido por meio de filtração a pressão reduzida. O filtrado foi particionado com
AcOEt (3x 100 mL) e a fase orgânica concentrada em rotaevaporador, obtendo-se, o
extrato P. Ao micélio foram adicionados 150 mL de EtOH e deixado em repouso por
24 h. Após esse período, triturou-se o micélio. Em seguida, a massa fúngica foi
filtrada e, o filtrado concentrado em rotaevaporador, obtendo-se o extrato M. Os
extratos foram nomeados conforme os códigos apresentados na Tabela 3.9.
Tabela 3.9. Códigos dos extratos obtidos dos diferentes meios de cultura
Meio de Cultura Código do extrato Conteúdo do extrato
PCza Fase orgânica do meio Czapeck
Czapeck
MCza Mic
élio do meio Czapeck
PLev
Fase org
ânica do meio com extrato de
levedura
Czapeck + 2% de
extrato de levedura
MLev Mic
élio do meio com extrato de levedura
PAla Fase orgânica do meio com alanina
Czapeck + Alanina
MAla Mic
élio do meio alanina
PFenil Fase org
ânica do meio com fenilalanina
Czapeck + Fenilalanina
MFenil Mic
élio do meio com fenilalanina
PTiro Fase orgânica do meio com tirosina
Czapeck + Tirosina
MTiro Mic
élio do meio com tirosina
PTrip Fase org
ânica do meio com triptofano
Czapeck + triptofano
MTrip Mic
élio do meio com triptofano
____________________________________________Parte Experimental
41
3.2.11.2 Análise dos extratos por CLAE/EM
Para verificar o efeito da adição de aminoácidos ao meio de cultivo de
NICL5 foram realizadas análises por CLAE/EM, empregando-se coluna Luna 5ì
Phenyl Hexyl, fase móvel composta por água e acetonitrila, ambos acidificados com
0,1% de TFA, utilizando-se eluição gradiente e no modo reverso e. O gradiente
utilizado encontra-se descrito na Tabela 3.10.
Os extratos foram analisados na concentração de 10 ìg/mL, o volume
de injeção de amostra foi de 50 ìL e, a vazão foi de 1,0 mL/min, porém, necessitou-
se de um divisor de fluxo para introdução de 0,3 mL da amostra no espectrômetro de
massas.
Tabela 3.10. Método cromatográfico utilizado nas análises para se verificar o efeito da adição de
aminoácidos no metabolismo de NICL5
Tempo (min) Concentração de B% (acetonitrila)
0 30
10 50
30 80
31 100
35 100
36 30
50 30
As análises dos extratos foram realizadas utilizando-se electrospray no
modo positivo. A Tabela 3.11 ilustra as condições de sintonia do Espectrômetro de
Massas.
____________________________________________Parte Experimental
42
Tabela 3.11. Condições do Espectrômetro de Massas para se verificar o efeito da adição de
aminoácidos no metabolismo de NICL5
Experimento Full Scan
Fonte de ionização Electrospray positivo, (ESI(+))
Capilar 3,36 kV
Cone 19 V
Extrator 4 V
Lentes de Radiofreqüência 0,7 V
3.2.12. Estudo da fração PECL
3.2.12.1 Tratamento do extrato botânico “PECL”
Para a pré-purificação do extrato PECL, foi utilizada coluna SEPHADEX
LH – 20 (h= 1,15 m e ñ = 3,5 cm), a qual foi condicionada em H
2
O: MeOH (2:8). Em
seguida, dissolveu-se o extrato no sistema inicial de eluição, o qual foi
posteriormente aplicado na fase estacionária. A Figura 3.3 representa o pré-
tratamento do extrato PECL na coluna SEPHADEX-LH 20.
Figura 3.3.
Coluna SEPHADEX LH-20 utilizada na pré-purificação do extrato PECL
____________________________________________Parte Experimental
43
Foram obtidas 240 frações as quais foram monitoradas por CCD. As
frações PECL116, PECL122, PECL132, PECL150 e PECL168 foram, também,
analisadas por CLAE/UV.
3.2.12.2 Condições CLAE/UV para análise das frações PECL
As análises foram conduzidas utilizando-se a fase estacionária Gemini 10
C18, com eluição gradiente e no modo reverso, contendo como fase móvel água e
metanol/acetonitrila 1:1, ambos acidificados com 0,1% de TFA. Nestas análises
foram monitorados os comprimentos de onda de 190 a 370 nm.
Aplicou-se dois métodos cromatográficos distintos, denominados polares
21 e apolares 2 representados na Tabela 3.12
Tabela 3.12 Métodos cromatográficos empregados nas análises das frações PECL
Polares 21 Apolares 2
Tempo (min) %B Tempo (min) %B
0,01 15 0,01 60
10 40 30 100
35 40 40 100
36 100 40,01 60
40 100 60 60
41 15
50 15
3.2.12.3 Separação das substâncias da fração PECL170
A análise por CCD da fração PECL170 (11,65 mg) indicou a presença de
duas substâncias. Para a separação dos constituintes químicos, foi realizada
cromatografia clássica de bancada, empregando uma coluna ODS (h = 17 cm e Ö =
2,5 cm) e eluição gradiente no modo reverso, empregando-se água e metanol na
proporção de 7:3 até 100% de metanol. Foram obtidas 20 subfrações, as quais
foram monitoradas por CCD e, agrupadas de acordo com o perfil cromatográfico. A
____________________________________________Parte Experimental
44
subfração denominada PECL170A (2,87 mg) foi analisada por
1
H RMN e por
Espectrometria de Massas, utilizando eletrospray como modo de ionização.
3.2.12.4 Análise por CLAE/EM
A análise de PECL170A foi executada empregando-se coluna Luna 5µ
C-18 e fase móvel composta por água, acetonitrila e metanol, com vazão de 0,7
mL/min. O método cromatográfico e as condições de sintonia do Espectrômetro de
Massas estão apresentados nas Tabelas 3.13 e 3.14 respectivamente.
Tabela 3.13. Método cromatográfico para análise de PECL170A
Tempo (min) %A (H
2
O) %B (MeOH) %C (AcCN)
0 80 20 -
8 80 20 -
15 60 20 -
25 40 30 -
40 30 30 -
41 - - 100
48 - - 100
48,01 60 - 40
49 85 15 -
60 85 15 -
Tabela 3.14.
Condições de análise do espectrômetro de massas para análise de PECL170A
Experimento
Full Scan
Fonte de ionização Electrospray negativo, (ESI-(-))
Capilar 3,74 kV
Cone 38 V
Extrator 5 V
Lentes de Radiofreqüência 0,80 V
Temperatura da fonte 50 °C
Temperatura do probe 350 °C
____________________________________________Parte Experimental
45
3.2.13 Detecção de biflavonóides nas folhas de Cupressus
lusitanica e Araucaria angustifolia
Como relatado na introdução deste trabalho, a planta C. lusitanica e outras
coníferas são produtoras de biflavonóides. Com a finalidade de se verificar a
produção desta classe de compostos, coletaram-se ramos de C. lusitanica e de A.
angustifolia localizadas no campus da UFSCar e, estes foram submetidos a três
modos de extração diferentes e posterior análise por CLAE/UV, empregando-se três
métodos cromatográficos distintos, a fim de se constatar o melhor modo de extração
destes compostos fenólicos.
Após a coleta dos ramos de C. lusitanica e A. angustifolia, estes foram
secos em estufa de circulação a 45
o
C durante 24 horas e, em seguida, moídos em
moinho de facas.
Para cada um dos três métodos de extração utilizou-se 100 mg de material
vegetal proveniente de cada planta.
Os métodos de extração e análises por CLAE estão descritos a seguir.
Método de extração A: Foram adicionados 2 mL de água e acetonitrila (1:1)
aos 100 mg de material vegetal (de cada planta separadamente), os quais foram
sonicados por 15 minutos. A mistura foi centrifugada durante 1 minuto, e
posteriormente o sobrenadante foi removido e reservado. O procedimento foi
repetido por mais uma vez.
Adicionaram-se 2 mL de CHCl
3
grau HPLC ao sobrenadante, em seguida,
a mistura foi agitada vigorosamente. Só então, esta foi centrifugada para separação
da fase orgânica, a qual foi concentrada em Centrivap.
Na análise por CLAE empregou-se fase estacionária Gemini 10 C18.
Utilizou-se modo reverso de eluição contendo como fase móvel metanol/acetonitrila
1:1 e H
2
O, ambos acidificados com 0,1% de TFA. A amostra foi re-suspendida na
fase móvel. O volume de injeção foi de 20 L e, a vazão de 0,5 mL/min. Empregou-
se o método cromatográfico, polares 21, descrito no item 3.2.12.2.
Monitoraram-se nestas análises os comprimentos de onda de 190 a 370
nm.
Método de extração B: Foram adicionados 2 mL de acetonitrila grau HPLC
aos 100 mg de material vegetal (de cada planta separadamente), os quais, em
seguida, foram sonicados por 15 minutos. A mistura foi centrifugada por 1 minuto,
____________________________________________Parte Experimental
46
seguida da separação do sobrenadante. O procedimento foi repetido por mais uma
vez.
A amostra antes de ser injetada no cromatógrafo passou por um processo
de pré-purificação, o qual consistiu na retirada de uma alíquota de 1 mL do
sobrenadante e adição de 4 mL de H
2
O milli-Q, seguida de agitação por 10
segundos em agitador de tubos. Logo após ativou-se um cartucho de C18 (1 mL)
com 2 mL de acetonitrila, seguido de condicionamento com 2 mL de H
2
O Milli-Q.
Injetou-se a amostra no cartucho e, os compostos de polaridade intermediária foram
eluídos com 2 mL de tetra hidrofurano. Empregaram-se as fases estacionária e
móvel mencionadas no modo de extração anterior. As amostras foram re-
suspendidas no sistema de eluição. Injetou-se 20 L de amostra e, utilizou-se vazão
de 0,8 mL/min. O método cromatográfico apolares 21 foi utilizado nas análises
destes extratos.
Método de extração AB (extração ácido/base): Foram adicionados 2 mL de
metanol, grau HPLC, aos 100 mg de material vegetal (de cada planta
separadamente). Em seguida, a mistura foi sonicada durante 2 minutos.
Transferiram-se 2 mL de solução de NH
4
OH (1,0 mol/L) à mistura, a qual foi
novamente sonicada por mais 5 minutos e, só então, centrifugada por 1 minuto,
seguida da remoção do sobrenadante. Foram adicionados mais 2 mL de NH
4
OH (1,0
mol/L) ao material vegetal residual, o qual foi novamente sonicado por mais 5
minutos. Após centrifugar a mistura, o sobrenadante foi removido.
Para a pré-purificação do extrato, adicionaram-se, ao sobrenadante, 2 mL
de éter etílico, o qual foi agitado e, em seguida, retirou-se a fase orgânica com uma
pipeta de Pasteur. Repetiu-se este procedimento mais uma vez. Adicionou-se ácido
clorídrico concentrado à fase orgânica até a obtenção de pH entre 3-4. Extraiu-se os
compostos fenólicos usando AcOEt (2 x 1 mL) e BuOH (2 x 1 mL). As amostras
foram concentradas em centri vap.
Empregaram-se as fases estacionária e móvel mencionada no modo de
extração A. Solubilizou-se as amostras no sistema de eluição. Injetou-se 20 L de
amostra e, vazão de 1,0 mL/min. O método cromatográfico, denominado
bf_ab_250907, encontra-se na Tabela 3.15.
____________________________________________Parte Experimental
47
Tabela 3.15. Método cromatográfico bf_ab_250907 utilizado no modo de extração AB
Tempo (min) % B (MeOH/AcCN 1:1 + 0,1% TFA)
0,01 25
35 100
40,0 100
40,01 25
45 25
3.2.14 Ensaios biológicos
3.2.14.1 Ensaio de inibição bacteriana pelo método de difusão em ágar
3.2.14.1.1 Preparo dos meios de cultura
Ágar Muller Hinton
Em 250 mL de água destilada, dissolveu-se 9,5 g de ágar Mueller Hinton.
Caldo Mueller Hinton
Dissolveu-se 10,5 g de caldo Mueller Hinton em 50 mL de água
destilada.
BHI (Infuso Cérebro Coração)
Preparou-se o meio dissolvendo-se 52,0 g de BHI para 1 L de água
destilada.
3.2.14.1.2 Ativação das bactérias
As bactérias foram ativadas em placas de Petri contendo ágar Mueller
Hinton, sendo incubadas por um período de 24 horas, a 33 °C. Após esse intervalo,
transferiu-se cerca de uma colônia de bactéria para um tubo contendo 3mL de caldo
Mueller Hinton, com o auxílio de uma alça de platina previamente esterilizada. Este
tubo, após ser homogeneizado, foi incubado por um período de 24 a 30 horas, a
uma temperatura de 33 °C.
____________________________________________Parte Experimental
48
3.2.14.1.3 Padronização das culturas
As bactérias submetidas aos ensaios antibacterianos foram
padronizadas mediante comparação com os padrões da escala de McFarland de
turbidez, tendo sido referida a concentração de 1x10
8
cel/mL.
Quando necessário, promoveu-se a diluição do tubo contendo a
bactéria utilizando solução salina 0,9%.
3.2.14.1.4 Preparo das amostras
Os extratos a serem testados foram preparados na concentração 3
mg/mL e a substância pura na concentração de 1mg/mL em DMSO.
3.2.14.1.5 Preparo do antibiótico controle
Pesaram-se 1,25 mg de tetraciclina, as quais, foram dissolvidas em 25
mL de DMSO, obtendo-se, dessa forma, uma solução de concentração 0,05 mg/mL.
3.2.14.1.6 Ensaio antibacteriano contra as bactérias Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Staphylococcus aureus e Micrococcus lutheus
Um volume de 25 ìL de cada bactéria a ser ensaiada foi transferido
para uma placa de Petri contendo meio BHI. Esse volume de células bacterianas foi
espalhado por toda a placa com o auxílio de uma alça. Após a secagem da placa
foram feitos poços, os quais, posteriormente, foram preenchidos com as soluções,
em DMSO, dos extratos e substância testados.
As placas de Petri foram incubadas por 24h em estufa a 33ºC.
O resultado foi obtido mediante a medida do halo de inibição do
crescimento bacteriano.
É importante ressaltar que para cada bactéria ensaiada o experimento
foi realizado em triplicata.
____________________________________________Parte Experimental
49
3.2.14.2 Ensaio de inibição fúngica pelo método de difusão em ágar
O ensaio de inibição fúngica foi realizado mediante protocolos bem
estabelecidos por nosso grupo de pesquisas.
Foram testadas as atividades dos extratos hexânico e etanólico de C.
lusitanica e uma fração rica em biflavonóides produzidos pela planta, frente aos
microrganismos NICL3, NICL4 e NICL5 isolados de C. lusitanica.
O meio de cultura utilizado no ensaio foi o BDA (batata, dextrose e
ágar), o qual depois de preparado e esterilizado em autoclave, foi vertido em placas
de Petri e, estas mantidas em capela de fluxo laminar até a solidificação.
Foram feitos quatro poços de 5 mm de diâmetro no meio de cultura
circundando a região central, na qual se inoculou o fungo. Nestes poços foram
adicionados 100 ìL das soluções preparadas em DMSO nas concentrações de 5,00
mg/mL, 2,50 mg/mL e 1,25 mg/mL, para cada extrato testado e DMSO utilizado
como controle (FIGURA 3.4). O desenvolvimento dos microrganismos foi observado
dia a dia e, o potencial antifúngico dos extratos foi avaliado através da inibição do
crescimento do microrganismo.
Figura 3.4.
Representação do procedimento adotado para realização do ensaio antifúngico pelo
método de dispersão em ágar. (A), (B) e (C) representam as concentrações das soluções em
DMSO dos extratos testados. (A) 5 mg/mL, (B) 2,50 mg/mL e (C) 1,25 mg/mL
Poços feitos
no meio BDA
Adição das
soluções
DMSO
C
B
A
Adição do
microrganismo
DMSO
C
B
A
Poços feitos
no meio BDA
Adição das
soluções
DMSO
C
B
A
Adição do
microrganismo
DMSO
C
B
A
____________________________________________Parte Experimental
50
3.2.14.3 Ensaio de citotoxicidade in vitro em linhagens de células
tumorais
O ensaio de citotoxicidade in vitro foi realizado no Laboratório de
Oncologia Experimental da Universidade Federal do Ceará (LOE UFC) com o
objetivo de se verificar a citotoxicidade in vitro dos extratos provenientes dos fungos
endofíticos de Cupressus lusitanica, dos extratos hexânico e etanólico da planta e
também de uma substância produzida pelo fungo NICL5, em três linhagens de
células tumorais humanas.
As linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435 (mama - humano), HCT-
8 (cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano), foram cedidas pelo Instituto
Nacional do Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640,
suplementados com 10 % de soro fetal bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em
estufa a 37 ºC e atmosfera contendo 5% de CO
2
.
3.2.14.3.1 Preparo das amostras
As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril. A substância pura foi
testada na concentração única de 5µg/mL e os extratos na concentração de 50µg/mL.
3.2.14.3.2 Citotoxicidade in vitro
Análise de citotoxicidade pelo método do MTT é um método rápido,
sensível e barato. É uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-
dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a
partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente
ativas.
As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 106 cél/mL
para as linhagens MDA/MB-435 e SF-295 e 0,7 x 105 cél/mL para a linhagem HCT-
8. As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO
2
a 37ºC. Ao
término deste, as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante, removido. Em
seguida, foram adicionados 150 ìL da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as
placas foram incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do
precipitado com 150 ìL de DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595nm.
____________________________________________Parte Experimental
51
Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão
da média (DPM) da porcentagem de inibição do crescimento celular usando o
programa GraphPad Prism.
___________________________________________Resultados e Discussão
52
4.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolamento de fungos endofíticos de Cupressus lusitanica
Após três dias do processo de isolamento dos microrganismos
endofíticos de C. lusitanica, verificou-se o desenvolvimento dos primeiros isolados. A
Figura 4.1.1 mostra o início do crescimento dos microrganismos a partir das
extremidades do material botânico, depositado sobre o meio BDA na placa de Petri.
Notou-se também que a placa controle, a qual permaneceu aberta
durante o processo de isolamento, e as placas inoculadas com a última água de
esterilização da superfície das folhas da planta, não apresentavam sinais de
contaminação, indicando, desse modo, a eficácia da metodologia aplicada, como
apresentado na Figura 4.1.2.
.
Figura 4.1.1.
Fungos endofíticos isolados das folhas de Cupressus lusitanica
Em setembro de 2006, em trabalho exploratório da micro população
endofítica de C. lusitanica, observou-se o crescimento de quatro fungos. Em 2007,
em trabalho incluso neste projeto de pesquisa, isolaram-se, das folhas de C.
lusitanica, cinco fungos endofíticos, dentre os quais quatro eram, aparentemente,
idênticos ao isolados em 2006. A identificação das espécies é de grande importância
para os estudos de biodiversidade e relação com o hospedeiro. Toda forma de vida
requer exigências nutritivas, em termos de substâncias químicas indispensáveis ao
seu crescimento e ao seu funcionamento normal. Alguns fungos, embora cresçam
bem em ágar, outros os fazem pobremente ou simplesmente não se desenvolvem,
id1456671 pdfMachine by Broadgun Software - a great PDF writer! - a great PDF creator! - http://www.pdfmachine.com http://www.broadgun.com
___________________________________________Resultados e Discussão
53
exigindo nutrientes específicos como vitaminas e outras substâncias estimulantes
(PELCZAR et al., 1997).
Figura 4.1.2.
Placas de Petri que monitoraram a assepcia do processo de isolamento dos
microrganismos de C. lusitanica
A Figura 4.1.3. ilustra os cinco fungos endofíticos isolados de C.
lusitanica com seus respectivos códigos de identificação do LaBioMMI.
Figura 4.1.3.
Fungos endofíticos isolados de C. lusitanica e seus respectivos códigos
Os microrganismos foram enviados para identificação na Universidade
Federal da Amazônia (UFAM) e, em uma identificação prévia os fungos NICL3 e
NICL5 foram relacionados ao gênero Xylaria, enquanto NICL4 foi identificado como
Guignardia mangifera.
O fungo NICL5 destacou-se em meio aos demais, pois se constatou a
formação de estruturas delgadas e alongadas que cresciam a partir da massa
micelial em direção a superfície. Esta observação impulsionou a busca de material
NICL1
NICL2
NICL3
NICL5
NICL4
___________________________________________Resultados e Discussão
54
bibliográfico e, LEE, et al. (2003), reportaram que espécies de Xylaria possuem a
característica de produzirem estroma alongado e ereto.
4.2 Extratos fúngicos
Ramos de Cupressus lusitanica com cones masculinos e femininos
foram depositados no herbário do Departamento de Botânica da UFSCar
(HUFSCAR) sob o número de 7281.
No experimento em pequena escala houve a necessidade de se juntar
os extratos P e M dos fungos NICL1 e NICL4 devido a pouca massa destes. A
coluna filtrante resultou nas frações NICL1 A-F e NICL4 A-F.
Verificou-se no experimento em larga escala, em meio de cultura
Czapeck enriquecido com 2% de extrato de levedura, que os microrganismos NICL1,
NICL3 e NICL5 desenvolveram uma densa massa micelial, enquanto que o fungo
NICL4 não apresentou um bom crescimento (Figura 4.2.1), já o fungo NICL2 cresceu
submerso ao meio de cultura.
No experimento em larga escala, para todos os microrganismos
cultivados, observou-se a baixa produção dos extratos P (partição AcOEt) em
relação aos extratos M (micelial), esta fato deve estar relacionado a produção
intracelular dos metabólitos, os quais podem ser excretados para o exterior. A
Tabela 4.2.1 mostra as massas destes extratos.
Tabela 4.2.1 Massas dos extratos particionado e micelial
Extrato Código do fungo Massa (g)
NICL1 2,7300
NICL2 0,6986
NICL3 0,6301
PARTIÇÃO
NICL4 0,8262
NICL5 12,5224
NICL1 20,5687
NICL2 3,4257
NICL3 20,5687
NICL4 22,0833
MICÉLIO
NICL5 22,3825
___________________________________________Resultados e Discussão
55
Figura 4.2.1
Crescimento micelial de NICL1, NICL3, NICL4 e NICL5 após 20 dias de cultivo
Durante o cultivo dos microrganismos alguns fatos interessantes foram
observados, dentre eles, a marcante coloração verde escuro do meio de cultura
Czapeck após 20 dias de cultivo do fungo NICL1. Mesmo após a partição com
AcOEt, verificou-se que o extrato obtido, permanecia com a cor mencionada (Figura
4.5A), a qual também foi verificada no extrato micelial.
Notou-se grande diferença na aparência do fungo NICL4, quando
cultivado em meios de cultura sólido (BDA) e líquido (Czapeck) (Figura 4.2.2B).
O fungo NICL5 mostrou-se bastante interessante de ser estudado não
apenas por apresentar uma estrutura morfológica diferenciada (Figura 4.2.2C), mas
também pelo fato de apresentar cristais bem definidos nos extratos brutos. Após a
pré-purificação por meio da coluna filtrante pode-se verificar a presença de cristais
nas frações PNICL5B, PNICL5C, MNICL5B, MNICL5C e MNICL5E.
Figura 4.2.2.
Características observadas: (A) NICL1 após 20 dias de cultivo e coloração esverdeada
do extrato PNICL1, (B) modificação na aparência de NICL4 em meios diferentes e
(C) estruturas delgadas e longas de NICL5
(C)
(B)
(A)
NICL1
NICL4
NICL3
NICL5
___________________________________________Resultados e Discussão
56
4.3 Monitoramento dos extratos fracionados (fúngicos e
vegetal) por CLAE/UV
Como o estudo da associação planta-fungo endofítico de Cupressus
lusitanica é pioneiro, não se conhecem os perfis dos metabólitos secundários fruto
desta interação.
Inicialmente, explorou-se o comportamento cromatográfico de frações
ricas em diterpenos, provenientes de trabalhos anteriores realizados no LaBioMMi.
Esta iniciativa teve a finalidade de se comparar o perfil cromatográfico destas
frações deterpênicas, com os extratos fúngicos e botânico, para verificar a presença
desta classe nestes extratos.
Foram monitoradas as frações ricas nos diterpenos ácido abiético (AA),
ácido diidroabiético (ADA) e ácido diidro-isoestévico (ADIE) no comprimento de onda
236 nm. A Figura 4.3.1 mostra os cromatogramas referentes às frações enriquecidas
nos referidos diterpenos.
Figura 4.3.1.
Cromatograma das fraões ricas nos diterpenos ácido abiético (AA), ácido diidroabiético
(ADA) e ácido diidro-isoestévico (ADIE) em 236 nm
O método cromatográfico (terp_261007, página 29) escolhido, foi aquele
que concentrou as bandas dos diterpenos padrões entre 15 a 20 minutos de corrida.
No entanto, como não se conhecia a constituição química dos extratos fúngicos,
Minutes
10 20 30 40
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50
75
(AA)
(A
D
A)
(A
DIE
)
___________________________________________Resultados e Discussão
57
sugeriu-se monitorar as bandas cromatográficas referente aos possíves diterpenos
no intervalo de 8 a 25 minutos, pois assim, substâncias com maior ou menor
afinidade pela fase estacionária poderiam ser observadas no cromatograma.
A Figura 4.3.2 mostra os cromatogramas processados em 236 nm,
adquiridos para as frações de PHCL de (A – F) provenientes dos material botânico.
Pode-se observar a complexidade destas frações, uma vez que há compostos que
eluem no início, no meio e final da corrida cromatográfica.
A fração PHCLA mostrou uma variedade considerável de compostos, com
destaque para substâncias de menor polaridade, o que é justificável , pois esta foi
obtida com solventes de baixa polaridade, Hex: CH
2
Cl
2
(1:1). Entre 13 e 17 minutos
verificou-se algumas bandas cromatográficas, as quais podem estar relacionadas à
classe dos diterpenos.
Figura 4.3.2.
Cromatogramas das frações PHCL (A-F) = 236 nm
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PHCLA PHCLB
PHCL
C
PHCLD
PHCLE PHCLF
___________________________________________Resultados e Discussão
58
A fração PHCLB destacou-se em relação as demais, pois apresentou uma
intensa banda cromatográfica com tempo de retenção próximo a 22,20 minutos, a
qual enquadrou-se na faixa determinada para os diterpenos.
A fração PHCLC mostrou-se composta de substâncias de maior
polaridade, no entanto, verificou-se uma banda com tempo de retenção próximo
13,00 minutos, a qual se enquadra no intervalo de retenção dos diterpenos . Os
perfis cromatográficos ds frações PHCL (D-E) mostraram-se bastante semelhantes,
podendo estas apresentarem a mesma constituição química. Na região de 8 a 20
minutos foram verificadas algumas bandas compreendidas na faixa de retenção
determinada para os diterpenos.
As frações fúngicas apresentaram perfis cromatográfico distintos
Os cromatogramas referentes as frações NICL1 (A-F), mostram-se muito
pobres em constiuintes químicos, uma vez que, apenas em NICL1D e NICL1E foram
observadas poucas bandas cromatográficas, porém nos intervalos de retenção
determinado para os ditepenos.
Figura 4.3.3.
Cromatogramas das frações NICL1 (A-F), = 236 nm
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NICL1A
NICL1
B
NICL1
C
NICL1
E
NICL1
F
NICL1D
___________________________________________Resultados e Discussão
59
As Figuras 4.3.4 e 4.3.5 ilustra os cromatogramas das frações
proveninetes de NICL2. Pôde-se constatar que somente as frações MNICL2 (B, D e
E) e PNICL2C apresentaram compostos com tempo de retenção na faixa
determinada para os diterpenos.
Figura 4.3.4. Cromatogramas das frações MNICL2 (A-F), = 236 nm
Figura 4.3.5.
Cromatogramas das frações PNICL2 (A-F), = 236 nm
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MNICL2A MNICL2B
MNICL2C MNICL2D
MNICL2E MNICL2F
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PNICL2A PNICL2B
PNICL2C
PNICL2D
PNICL2E
PNICL2F
___________________________________________Resultados e Discussão
60
Diferentemente dos demais extratos analisados anteriormente, as
frações de MNICL3 e PNICL3, apresentadas nas Figuras 4.3.6 e 4.3.7, mostraram
maior riqueza de constituintes químicos, pois, foi possível observar nos
cromatogramas bandas de baixa, média e alta polaridade. Foi notado também a
presença de várias bandas no intervalo de retenção determinado para os
diterpenos.
Figura 4.3.6.
Cromatogramas das frações MNICL3 (A-F), = 236 nm
Figura 4.3.7
Cromatogramas das frações PNICL3 (A-F), = 236 nm
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MNICL3A MNICL3B
MNICL3C MNICL3D
MNICL3E MNICL3F
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PNICL3A PNICL3B
PNICL3C PNICL3D
PNICL3E PNICL3F
___________________________________________Resultados e Discussão
61
Assim como na maioria das frações dos extratos fúngicos, as frações
NICL4 (A-F) apresentaram alguns constituintes químicos no intervalo de retenção
dos diterpenos, destacando-se a fração NICL4B, por apresentar maior número de
bandas no referido intervalo. A Figura 4.3.8 ilustra os cromatogramas das frações de
NICL4.
Figura 4.3.8
Cromatogramas das frações NICL4 (A-F), = 236 nm
As Figuras 4.3.9 e 4.3.10 representam os cromatogramas referentes às
frações dos extratos de NICL5, nos quais constatou-se a possibilidade da produção
de diterpenos pelo microrganismo. Notou-se no cromatograma de MNICL5A a
presença de várias bandas de baixa intensidade na região proposta para os
diterpenos. Já MNICL5B e MNICL5C apresentaram perfil cromatográfico muito
semelhante, diferindo apenas na intensidade das bandas com tempos de retenção
próximos a 7,5 e 9,5 minutos. Em MNICL5D observou-se um pequena banda em
18,5 minutos, a qual pode estar relacinada aos diterpenos.
As fra
ções PNICL5B, PNICL5D, PNICL5E e PNICL5F (Figura 4.3.10)
podem ser constituidas por diterpenos, uma vez que, algumas bandas, de fraca
intensidade, foram observadas no intervalo sugerido para estes compostos.
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NICL4A NICL4B
NICL4C NICL4D
NICL4E NICL4F
___________________________________________Resultados e Discussão
62
Figura 4.3.9.
Cromatogramas das frações MNICL5 (A-F), = 236 nm
Figura 4.3.10. Cromatogramas das frações PNICL5 (A-F), = 236 nm
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MNICL5A MNICL5B
MNICL5C MNICL5D
MNICL5E MNICL5F
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PNICL5A PNICL5B
PNICL5C PNICL5D
PNICL5E PNICL5F
___________________________________________Resultados e Discussão
63
De acordo com as análises por CLAE/UV, todos os extratos
apresentaram bandas no intervalo de retenção proposto para os diterpenos. Vale
ressaltar que a maioria destas bandas apresentaram fraca intensidade, indicando a
baixa concentração destes compostos. Destaram-se os extratos dos microrganismos
NICL3 e NICL5, pois apresentaram maior riqueza de constituintes químicos,
sugerindo, desse modo, que a química destes microrganismos deva ser estudada
com mais ênfase.
4.4 Monitoramento dos extratos fúngicos e botânico por
CG/EM
Também para se avaliar a constituição química dos extratos fúngicos e
botânico em busca de diterpenos, foram realizadas análises por CG/EM.
O pré-tratamento dos extratos fúngicos e do material botânico foi
realizado com a finalidade de extrair apenas os compostos de baixa polaridade,
permitindo, desse modo, a execução das análises por cromatografia a gás acoplada
a espectrometria de massas (CG/EM) com ionização por elétrons. Esta forma de
ionização tem como característica principal a produção de vários íons fragmentos,
consequentemente, fornecendo riqueza de informação estrutural.
As análises por CG/EM foram de extrema relevância para execução
deste trabalho, pois houve a detecção de importantes metabólitos, como alguns
diterpenos de C. lusitanica, bem como ésteres de cadeia longa e isocumarinas e um
sesquiterpeno nos extratos fúngicos.
Também através destas análises pôde-se confirmar a maior riqueza de
constituintes químicos dos extratos dos fungos NICL3 e NICL5, o que concordou
com o observado nas análises por CLAE/UV. Estas constatações foram
determinantes para a escolha dos microrganismos estudados.
4.4.1 Monitoramento do extrato das folhas de C. lusitanica
O cromatograma de
íons totais do extrato da planta mostrou uma série
de bandas, sugerindo uma mistura complexa de constituintes químicos, conforme
mostra a Figura 4.4.1.
___________________________________________Resultados e Discussão
64
Figura 4.4.1.
Cromatograma de íon totais do extrato botânico PHCL
Através da comparação do padrão de fragmentação com os espectros
de massas fornecido pela biblioteca (NIST) do espectrômetro, alguns diterpenos
foram detectados no extrato proveniente das folhas de Cupressus lusitanica. A
Figura 4.4.2 mostra as estruturas dos diterpenos identificados pela biblioteca.
Figura 4.4.2. Diterpenos propostos pela biblioteca do espectrômetro de massas
O espectro de massas relacionado à banda cromatográfica com tempo
de retenção em 29,00 minutos foi identificado por comparação com a biblioteca de
massas do equipamento. A estrutura detectada foi o diterpeno abietato, devido à
similaridade dos espectros. A Figura 4.4.3 mostra a comparação dos espectros de
massas e a estrutura do diterpeno.
CL1
C
20
H
32
(272 Da)
t
r
= 29,00 min
CL (2
–
4)
C
20
H
30
O (286 Da)
t
r
= 33,06 min
OH
CL6
C
21
H
2O
O
3
(328 Da)
t
r
= 35,99 min
O
O
O
O
O
O
CL5
C
21
H
2O
O
3
(328 Da)
t
r
= 35,22 min
___________________________________________Resultados e Discussão
65
Figura 4.4.3. (A) espectros de massas referente à banda com tr = 29,00 min e (B) espectro da de
massas da biblioteca e (C) diterpeno abietato
O cromatograma de íons selecionados a m/z 286 mostrou três bandas
intensas com tempos de retenção 32,38 min, 33,06 min e 33,28 min. Os espectros
de massas destas bandas mostraram-se muito semelhantes, diferindo apenas nas
intensidades dos íons. A comparação destes espectros com os dados da biblioteca,
relacionou-os com a mesma estrutura (CL2 Figura 4.4.2), indicando, desse modo, a
presença de isômeros, os quais podem possuir espectros de massas idênticos. A
Figura 4.4.4 mostra o cromatograma de íons selecionados a m/z 286 e seus
respectivos espectros de massas.
Figura 4.4.4.
(A) Cromatograma de íons selecionados a m/z 286 e seus respectivos espectros de
massas
Conforme mostra a Figura 4.4.5A, o cromatograma de íons
selecionados a m/z 328 apresentou duas bandas (35,22 min e 35,99 min), as quais
possuem espectros de massas muito semelhantes (Figura 4.4.5B/C), indicando a
(A)
(B)
(C)
(A) (B)
___________________________________________Resultados e Discussão
66
presença de isômeros. Verificou-se a diferenciação destes compostos pela
biblioteca, os quais foram identificados como CL5 e CL6 (Figura 4.4.2).
Figura 4.4.5.
(A) Cromatograma de íons selecionados a m/z 328 (B) Espectros de massas de CL5 e
comparação com a biblioteca e (C) espectros de massas de CL6 e comparação com a biblioteca
Vários outros metabólitos não tiveram suas estruturas estabelecidas.
Porém, conforme o perfil cromatográfico, o perfil do espectro de massas e alguns
dados da literatura, houve indícios da ocorrência de outros diterpenos. Dessa forma,
foi proposto que o espectro de massas relacionado a banda cromatográfica com
tempo de retenção 34,08 minutos pertence ao diterpeno ácido abiético, uma vez
que, a proposta de fragmentação deste, apresentada no esquema 4.4.1, justifica
alguns íons observados no espetro de massas da Figura 4.4.6.
No esquema 4.4.1 a ionização ocorreu na ligação dupla formando o íon
molecular de m/z 302, o qual sofreu a perda de uma metila radicalar, levando ao íon
de m/z 287. A saída de CO
2
H
2
, a partir do íon molecular, levou ao íon de m/z 256 e,
a perda metila radicalar conduziu ao íon de m/z 241. Através de mecanismos de
retro Diels Alder de m/z 241 foram formados os íons de m/z 173 e 133. O
mecanismo proposto apresentou alguns íons de relação massa carga idênticos
aqueles pertencentes ao espectro de massas da Figura 4.4.6. A partir destes dados
pode-se sugerir que, a estrutura proposta possui grandes chances de pertencer ao
extrato das folhas de C. lusitanica.
(A)
(B)
)
(C)
)
___________________________________________Resultados e Discussão
67
Figura 4.4.6.
Espectro de massas com tempo de retenção 34,08 min e (B) ácido abiético
Esquema 4.4.1.
Proposta de fragmentação do diterpeno ácido abiético
A derivação com diazometano possibilitou uma boa limpeza no extrato
das folhas de C. lusitanica, pois além dos compostos já mencionados, houve a
detecção de um monoterpeno, dois sesquiterpenos, dois diterpenos e também
quatro ésteres metílicos. A Figura 4.4.7 ilustra o cromatograma do extrato derivado.
(A)
(
B
)
OH
O
HO
O
H
OH
O
(b)
(b)
CH
3
(a)
m/z 302
(a)
HHO
O
m/z 256
m/z 287
CH
3
m/z 241
(c)
m/z 173
m/z 133
(d)
m/z 241
+
___________________________________________Resultados e Discussão
68
Figura 4.4.7. Cromatograma de íons totais do extrato hexânico da folhas de Cupressus lusitanica
A Figura 4.4.8 mostra os compostos detectados com seus respectivos
tempos de retenção, fórmula molecular, massa molecular e também os códigos.
Figura 4.4.8.
Substâncias detectadas por CG/EM no extrato de C. lusitanica
CL7
C
10
H
16
(136 Da)
t
r
= 14,34 min
CL8
C
15
H
24
(204 Da)
t
r
= 18,13 min
CL9
C
15
H
22
(202 Da)
t
r
= 18,64 min
O
(
9
)
O
CL10
C
15
H
30
O
2
(242 Da)
t
r
= 22,75 min
CL11
C
17
H
34
O
2
(270 Da)
t
r
= 26,56 min
CL13
C
17
H
34
O
2
(298 Da)
t 30,03 min
CL12
C
17
H
34
O
2
(320 Da)
t
r
= 29,61 min
O
O
O
O
CL15
C
21
H
32
O
2
(316 Da)
t
r
= 32,26 min
CL14
C
21
H
32
O
2
(316 Da)
t
r
= 31,76 min
O
O
( )
11
O
O
( )
5
O
O
( )
13
___________________________________________Resultados e Discussão
69
Na Figura 4.4.9A pôde-se verificar o espectro de massas de CL7
(banda cromatográfica em 14,34 min) e, também a comparação deste com os dados
da biblioteca (Figura 4.4.9B). Notou-se, claramente, uma boa similaridade entre
ambos, o que permitiu identificar CL7 como o monoterpeno 3-careno (Figura 4.4.9
C).
Figura 4.4.9. (A) Espectro de massas de CL7, (B) comparação do espectro de CL7 com os dados da
biblioteca e (C) 3-careno
As bandas cromatográficas com tempos de retenção 18,13 e
18,64 min são referentes à CL8 e CL9 respectivamente. Estas duas substâncias
foram identificadas através da comparação dos seus espectros de massas com os
dados da biblioteca e estão representadas nas Figuras 4.4.10 e 4.4.11.
Figura 4.4.10.
Espectro de massas de CL8, (B) Comparação com biblioteca e (C) naftaleno
(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
70
Figura 4.4.11.
(A) Espectro de massas de CL9, (B) comparação do espectro de CL9 com os dados
da biblioteca e (C) calameneno
Os espectros de massas de CL10, CL11 e CL13 apresentam
características espectrais muito semelhantes e, através da presença dos íons de m/z
74 e 87 estes foram identificados como ésteres metílicos.
O cromatograma de íons selecionados a m/z 316, ilustrado na Figura
4.4.12, apresentou duas bandas cromatográficas, as quais foram correlacionadas as
estruturas apresentadas na Figura 4.4.13A/B.
Figura 4.4.12.
Cromatograma de íons selecionados a m/z 316
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
71
Figura 4.4.13. Espectros de massas de: (A) CL14 éster metílico do ácido pimárico e (B) CL5 éster
metílico do ácido abiético
A detecção do éster metílico do ácido abiético confirmou a presença da
do ácido abiético nas folhas de Cupressus lusitanica, conforme proposto
anteriormente.
4.4.2 Monitoramento dos extratos fúngicos
4.4.2.1 Análise dos extratos PNICL1 e MNICL1
Não foram observadas semelhanças nos perfis cromatográficos dos
extratos MNICL1 e PNICL1. Além disso, a maioria das bandas não foi identificada,
pois a comparação com dados da biblioteca não forneceu similaridade entre os
espectros.
No extrato PNICL1 apenas três compostos foram identificados,
conforme pode ser visto nas Figuras 4.4.14 a 4.4.16.
(B)
O
O
(A)
O
O
___________________________________________Resultados e Discussão
72
A substância com tempo de retenção em 31,39 minutos foi identificada,
através da comparação dos espectros de massas, como sendo o ácido
octadecanóico.
Figura 4.4.14.
(A) Espectro de massas da substância com tr = 31,39 min, (B) comparação com o
espectro de massas da biblioteca, (C) ácido octadecanóico
Foi possível detectar um éster derivado de um ácido dicarboxílico com
tempo de retenção 34,34 minutos, pois a comparação dos espectros de massas
apresentou grande similaridade, como pode ser visto na Figura 4.4.15.
Figura 4.4.15.
(A) Espectro de massas da substância com tr = 34,34 min, (B) comparação com o
espectro de massas da biblioteca, (C) estrutura do ácido dicarboxílico
(A)
(B)
HO
O
(C)
HO
O
O
O
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
73
Embora não se tenha detectado o íon molecular, a comparação do
espectro de massas da substância com tempo de retenção em 34,59 minutos com
as informações da biblioteca do espectrômetro, indicou a presença de um
hidrocarboneto linear, saturado e de cadeia longa, conforme pode ser visto na Figura
4.4.16.
Figura 4.4.16.
(A) Espectro de massas da substância com tr = 29,97 min, (B) comparação com o
espectro de massas da biblioteca, (C) hidrocarboneto tritetracontano
As análises dos compostos provenientes do extrato micelial (MNICL1),
permitiram a identificação de somente um composto, com tempo de retenção de
29,97 minutos, pela comparação dos dados com a biblioteca de massas. A Figura
4.4.17 ilustra os espectros de massas que foram comparados e a estrutura
identificada como o z-9-octadecenoato de metila.
Figura 4.4.17.
(A) Espectro de massas da substância com tr = 34,59 min, (B) comparação com o
espectro de massas da biblioteca, (C) z-9-octadecenoato de metila
O
O
(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C)
( )
38
___________________________________________Resultados e Discussão
74
As análises dos extratos derivados com diazometano, não se
mostraram eficientes, visto que, foi possível identificar apenas um composto do
extrato PNICL1, o qual foi caracterizado como um éster metílico. A Figura 4.4.18
mostra a comparação dos espectros de massas e a estrutura deste éster.
Figura 4.4.18.
(A) Espectro de massas da substância com tempo de retenção = 30,05 min, (B)
espectro de massas da biblioteca do espectrômetro e (C) 16-metil, heptadecanoato de metila
4.4.2.2 Análises dos extratos PNICL2 e MNICL2
Não foi verificada similaridade espectral entre as bandas dos extratos
PNICL2 e MNICL2 com as informações da biblioteca do equipamento, dessa forma,
nenhum composto foi identificado.
Os extratos derivados com diazometano apresentaram um grande
número de bandas cromatográficas, conforme mostra a Figura 4.4.19. No entanto,
foi possível detectar quatro compostos no extrato MNICL2, sendo que dois deles
também faziam parte da constituição do extrato PNICL2. As Figuras 4.4.20 a 4.4.23
apresentam os espectros de massas das sustâncias identificadas e as suas
respectivas estruturas.
O
O
(B)
(A)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
75
Figura 4.4.19. Cromatograma de íons totais dos extratos derivados com diazometano: (A) PNICL2 e
(B) MNICL2
Figura 4.4.20.
(A) Espectro de massas da substância eluída em 22,74 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) 12-metil, tridecanoato de metila
Figura 4.4.21.
(A) Espectro de massas da substância eluída em 26,54 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) 14-metil, pentadecanoato de metila
(B)
(A)
O
O
(A)
(B)
(C)
(A)
(
B
)
O
O
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
76
Figura 4.4.22. (A) Espectro de massas da substância eluída em 30,03 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) 16-metil, heptadecanoato de metila
Figura 4.4.23. (A) Espectro de massas da substância eluída em 33,27 minutos, (B) espectro de
massas da biblioteca, (C) eicosanoato de metila
As estruturas apresentadas nas Figuras 4.4.22 e 4.4.23 foram
também detectadas no extrato PNICL2.
4.4.2.3 Análise dos extratos PNICL3 e MNICL3
Assim como nos demais extratos, os cromatogramas de íons totais dos
extratos de NICL3 apresentaram uma grande diversidade de bandas
cromatográficas.
O
O
(A)
(B)
(C)
O
O
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
77
O espectro de massas da substância eluída em 17,58 min (Figura
4.4.24A) apresentou íons característicos de aromáticos, devido à presença de m/z
77 e 91. Houve uma grande compatibilidade entre os espectros de massas da
substância e da biblioteca (Figura 4.4.24B), a qual permitiu identificá-lo como 2-
hidroxi fenil etanol (Figura 4.4.24C).
Figura 4.4.24.
(A) Espectro de massas, (B) comparação com a biblioteca e (C) 2-hidroxi fenil etanol
A biblioteca de massas identificou no extrato MNICL3 um sesquiterpeno
eremofilano, de fórmula molecular C
15
H
24
, cujo espectro de massas e fórmula
estrutural apresentam-se na Figura 4.4.25.
Figura 4.4.25.
(A) Comparação dos espectros obtido do extrato MNICL3 e da biblioteca do
espectrômetro e (B) diterpeno eremofilano valenceno
OH
OH
(B)
(A)
(C)
(B)
(A)
___________________________________________Resultados e Discussão
78
A detecção deste sesquiterpeno motivou a continuidade do estudo
químico do metabolismo do fungo NICL3, pois o microrganismo pode ser um hábil
produtor de terpenóides, inclusive aqueles apresentados na introdução deste
trabalho.
A banda em 19,35 minutos no cromatograma de íons selecionados a
m/z 178 (Figura 4.4.26A) foi identificada, pela comparação do seu espectro de
massas com os dados da biblioteca, como a substância de fórmula molecular
C
10
H
10
O
3
, a isocumarina meleína. A Figura 4.4.26 mostra a comparação do espectro
de massas da meleína com o espectro da biblioteca e, também, a estrutura da
isocumarina.
Figura 4.4.26.
(A) Banda com tempo de retenção = 19,35 min do cromatograma de íons
selecionados a m/z 178 e seu respectivo espectro de massas (B). (C) comparação dos espectros de
massas e (D) estrutura molecular da meleína
Foi proposto um mecanismo de fragmentação, apresentado no Esquema
4.4.2, com a finalidade de se justificar os principais íons observados.
O íon molecular de m/z 178 sofre um rearranjo de hidrogênio e
conseqüente abertura do anel, em seguida, é observado, novamente, um outro
rearranjo de hidrogênio resultando na perda de CO
2
e de C
3
H
4
, conduzindo ao íon
de m/z 94, o qual pela perda de
.
OH leva ao íon de m/z 77. O íon de m/z 160 é
formado a partir da desidratação do íon molecular.
(B)
O
OOH
(C)
(D)
(A)
___________________________________________Resultados e Discussão
79
A formação do íon de m/z 149 envolve um rearranjo de hidrogênio
resultando na abertura do anel da lactona, seguida da perda de
.
COH. Já o íon de
m/z 134, pico base do espectro, é obtido por uma retro Diels Alder.
Esquema 4.4.2.
Proposta de fragmentação para a meleína
O cromatograma de íons selecionados a m/z 192 apresentou uma
banda cromatográfica tanto em PNICL3 quanto em MNICL3, com tempos de
retenção muito próximos (22,32 min e 22,23 min, respectivamente) e espectros de
massas semelhantes (Figura 4.4.27), sugerindo, dessa forma, a presença da mesma
substância em ambos os extratos. Entretanto, a biblioteca de massas não os
identificou.
Em estudo anterior realizado em nosso laboratório, SANTOS (2006)
isolou diversas isocumarinas produzidas pelo fungo endofítico Xylaria sp, isolado de
Sapindus saponaria. Dentre as isocumarinas isoladas mereceu destaque o éter
metílico da meleína (Figura 4.4.27C), cujo espectro de massas é parecido com os
espectros representados na Figura 4.4.27A-B, indicando, dessa forma, a presença
OH
m/z 77
O
OOH
O
OOH
H
OH
m/z 94
CO
2
H
2
C C CH
2
O
OOH
H
m/z 178
O
OOH
O
OOH
H
O
O
m/z 178
m/z 160
H
2
O
O
OH O
H
H
OH O
O
O
OH
m/z 178
m/z 149
H
O
O
OOH
OH
C
O
m/z 178 m/z 134
H
O
___________________________________________Resultados e Discussão
80
desta substância nos extratos de NICL3. O mecanismo de fragmentação deste
composto não foi proposto, uma vez que, é muito parecido com o da meleína.
Figura 4.4.27. Espectros de massas com íon molecular m/z 192 (A) de PNICL3 com tr = 22,32 min e
(B) MNICL3 22,23 min e (C) éter metílico da meleína
Foi possível observar no extrato PNICL3 uma substância com t
r
= 23,83
min, cujo íon molecular correspondeu a m/z 206 (Figura 4.4.28). Mesmo a
substância apresentando características espectrais das isocumarinas, esta não foi
identificada pela biblioteca do espectrômetro. O estudo de SANTOS (2006) foi de
valiosa importância e contribuição para a caracterização dos compostos deste
trabalho, pois a comparação deste espectro com o espectro da 5-formil meleína
(Figura 4.4.28B) revelou considerável similaridade entre ambos.
Para se confirmar a presença da 5-formil meleína no extrato PNICL3,
foi proposto um mecanismo de fragmentação, conforme ilustra o Esquema 4.4.3. Os
íons fragmentos apresentados no esquema, estão de acordo com os íons
observados na Figura 4.4.28A, confirmando a produção da 5-formil meleína pelo
fungo NICL3.
O
O O
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
81
Figura 4.4.28.
(A) Espectros de massas com íon molecular m/z 206 em PNICL3 (tr = 23,83 min)
e (B) 5-formil meleína
Esquema 4.4.3.
Proposta de fragmentação para a 5-formil meleína
O
íon molecular de m/z 206 foi formado mediante a abstração de um
elétron do sistema aromático. Posteriormente verificou-se um rearranjo de
hidrogênio levando a uma espécie intermediária, a qual pela conjugação do par de
elétrons não ligante do oxigênio estabiliza a carga positiva do carbono do anel, em
seguida, verifica-se a perda de uma molécula de CO, levando ao íon de m/z 178 e,
O
OOH
O H
O
OOH
O
H
O
OOH
O
H
O
OOH
H
CO
m/z 206
m/z 178
O
OOH
O H
H
O
OOH
O H
m/z 191
CH
3
O
O
OH
O H
m/z 206
CO
m/z 163
O
OH
O H
O
O
O H
H
2
O
m/z 206
m/z 188
O
OOH
m/z 177
.
H
O
OH O
O H
(A)
(B)
___________________________________________Resultados e Discussão
82
este pela perda de hidrogênio radicalar leva ao íon de m/z 177, de maior
estabilidade devido ao retorno da aromaticidade.
O íon de m/z 206 através da perda de uma metila radicalar, levou a
formação do íon de m/z 191, o qual pela perda de CO produziu o íon de m/z 163. Já
a formação de m/z 188 foi decorrente da desidratação do íon molecular.
Constatou-se também a presença de um éster etílico e um éster
metílico no extrato micelial, conforme pode ser visto nas Figuras 4.4.29 e 4.4.30.
Figura 4.4.29. (A) Espectro de massas da substância com tr= 24,78 min, (B) espectro relacionado a
biblioteca e (C) tetradecanoato de etila
Figura 4.4.30. (A) Espectro de massas da substância com tr= 27,13 min, (B) espectro relacionado à
biblioteca e (C) 14-metil, pentadecanoato de metila
Nos extratos de NICL3 derivados com diazometano foram detectados
os mesmos compostos apresentados anteriormente.
O
O
(A)
(
B
)
(
C
)
O
O
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
83
4.4.2.4 Análises dos extratos PNICL4 e MNICL4
Foram detectados nos extratos PNICL4 e MNICL4 ésteres metílicos e
etílicos devido à presença, nos espectros de massas, dos íons de m/z 74 e 88,
respectivamente. Entretanto, estes não apresentaram compatibilidade com as
informações da biblioteca do equipamento e, consequentemente não foram
identificados.
Os perfis cromatográficos dos extratos de NICL4 derivados com
diazometano apresentaram uma diferença considerável, uma vez que, o
cromatograma de PNICL4 mostrou um número maior de bandas, quando comparado
ao cromatograma de MNICL4, conforme pode ser visto na Figura 4.4.31.
Figura 4.4.31. (A) Cromatogramas de íons totais de (A) PNICL4 e (B) MNICL4
Apesar dos diferentes perfis cromatográficos dos extratos, as
substâncias identificadas fazem parte da constituição de ambos. A comparação com
os dados da biblioteca do espectrômetro, permitiu a identificação de três ésteres
metílicos, os quais estão representados nas Figuras 4.4.32 a 4.4.34.
(B)
(A)
___________________________________________Resultados e Discussão
84
Figura 4.4.32. (A) Espectro de massas da substância com tr = 30,03 min, (B) espectro da biblioteca,
(C) 16-metil, heptadecanoato de metila
Figura 4.4.33. (A) Espectro de massas da substância com tr = 31,66 min, (B) espectro da biblioteca,
(C) nonadecanoato de metila
Figura 4.4.34.
(A) Espectro de massas da substância com tr = 33,31 min, (B) espectro da biblioteca,
(C) eicosanoato de metila
O
O
(A)
(B)
(C)
O
O
(A)
(B)
(C)
O
O
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
85
4.4.2.5 Análise dos extratos PNICL5 e MNICL5
Verificou-se, no extrato PNICL5, que o espectro de massas da banda
com tempo de retenção de 22,25 minutos, mostrou grande semelhança com aquele
observado para o éter metílico da meleína, apresentado no item 4.4.2.3, sugerindo
que o fungo NICL5 também seja produtor de isocumarinas. A Figura 4.4.35 ilustra o
espectro de massas da substância eluída em 22,25 min e o espectro do éter metílico
da meleína.
Figura 4.4.35.
(A) espectro de massas da substância eluída em 22,25 min do extrato PNICL5 e (B)
espectro de massas do éter metílico da meleína detectada no extrato PNICL3
Os espectros de massas das demais bandas cromatográficas não
apresentaram similaridade com as informações da biblioteca e, conseqüentemente,
não foram identificados.
Os extratos de NICL5 derivados com diazometano não tiveram
substâncias identificadas pela biblioteca do espectrômetro de massas.
Segundo MAGALESWARAM et al.(2000) o ácido pilifórmico é um
metabólito secundário comum de fungos endofíticos pertencentes a família
Xylariaceae.
Em seu estudo SANTOS (2006) isolou o ácido pilifórmico (Figura
4.4.36), dado que, o microrganismo pesquisado pertencia a referida família.
(B)
(A)
___________________________________________Resultados e Discussão
86
Uma alíquota do ácido, isolado por SANTOS, foi metilada com
diazometano e analisada por CG/EM. Dessa forma, foi possível fazer uma triagem
em busca desta substância nos extratos de NICL5, através de comparações dos
tempos de retenção e, também, dos espectros de massas. Foi verificado que no
extrato PNICL5 havia uma banda com tempo de retenção em 20,25 min, idêntico ao
do ácido metilado (Figura 4.4.37A-B). Foi constatada a produção do ácido pilifórmico
pelo fungo, uma vez que, os espectros de massas do ácido metilado e da referida
banda mostraram-se iguais, conforme mostra a Figura 4.4.37C-D.
Figura 4.4.36.
Ácido Pilifórmico
Figura 4.4.37.
(A) e (C) banda cromatográfica e espectro de massas do éster metílico do ácido
pilifórmico, (B) e (D) detecção do referido éster no extrato PNICL5
O Esquema 4.4.4 ilustra uma proposta de fragmentação para o ácido
pilifórmico metilado, justificando alguns íons observados no espectro de massas. A
partir do íon molecular de m/z 242 ocorreu a abstração do hidrogênio á a carboxila e
conseqüente eliminação de metanol, levando ao íon de m/z 210. Já a formação de
m/z 182 também ocorreu a partir do íon molecular, porém com a eliminação do
grupo C
2
O
2
H
4
.
HO
OH
O
O
(A)
(B)
(C)
(D)
___________________________________________Resultados e Discussão
87
Esquema 4.4.4.
Proposta de fragmentação do éster metílico do ácido pilifórmico
O
H
O
O
O
HOCH
3
m/z 242
O
O
O
O
H
O
O
O
O H
O
O
O
m/z 242
m/z 182
m/z 210
___________________________________________Resultados e Discussão
88
4.5 Isolamento de metabólitos secundários produzido pelo
microrganismo NICL3
4.5.1. Identificação da fração PNICL3B68
A fração PNICL3B68 mostrou-se como uma mistura de substâncias,
pois foram observadas duas bandas em CCD. Devido à baixa massa da fração, esta
não foi submetida a novos procedimentos de purificação. No entanto, foi possível
identificar, através de experimentos de RMN e Espectrometria de Massas, a
substância majoritária da mistura.
No espectro de
1
H RMN, mostrado na Figura 4.5.1, verificou-se na
região dos aromáticos a presença de dois sinais, um dubleto em 7,09 ppm, com
integração para dois hidrogênios e outro dubleto em 6,78 ppm, também com
integração para dois hidrogênios. Com base no espectro de COSY (Figura 4.5.2A)
os hidrogênios aromáticos correlacionam-se somente entre si, podendo-se concluir
que o anel é para dissubstituído. Verificou-se em 3,83 ppm um tripleto integrando
para dois hidrogênios, ou seja, um metileno fortemente desblindado, o qual deve
estar ligado diretamente a um centro retirador de elétrons. Em 2,80 ppm têm-se um
tripleto com integração para dois hidrogênios e pelo COSY (Figura 4.5.2B) observou-
se a correlação deste com o outro tripleto mencionado. A reunião das informações
descritas sugeriu a estrutura mostrada na Figura 4.5.3.
___________________________________________Resultados e Discussão
89
Figura 4.5.1. Espectro de
1
H RMN em 400 MHz da fração PNICL3B68 em CDCl
3
Figura 4.5.2. Espectro de COSY em 400 MHz da fração PNICL3B68 em CDCl
3
(A) região de
aromáticos e (B) correlação dos hidrogênios na região mais blindada do espectro
Figura 4.5.3.
Estrutura presente na fração PNICL3B68
R
1
R
2
(A)
(
B
)
___________________________________________Resultados e Discussão
90
Para determinação de R1 e R2 a fração PNICL3B68 foi analisada pela
técnica de CG/EM. Na Figura 4.5.4 pôde-se observar o íon molecular com m/z 138,
indicando, dessa forma, que R1 e R2 são iguais e correspondem ao grupo OH. A
substância caracterizada é conhecida como tirosol (4-hidroxi fenil etanol), é muito
encontrada em vinhos e azeite de oliva e exibe uma marcante propriedade
antioxidante (PUERTA et al.,1991 e GIOVANNINI, et al.,1999).
Figura 4.5.4.
Espectro de massas da fração PNICL3B68
O Esquema 4.5.1 apresenta uma proposta de fragmentação para o
tirosol, na qual a formação do pico base decorre da clivagem homolítica â ao anel
aromático levando ao íon de m/z 107, altamente estável devido ao retorno da
aromaticidade.
Esquema 4.5.1.
Proposta de fragmentação da substância majoritária na fração PNICL3B68
OH
OH
C
8
H
10
O
2
138.17
HO
OH
OH
H
2
COH
OH OH
m/z 138 m/z 107
___________________________________________Resultados e Discussão
91
4.5.2 Identificação da fração PNICL3C15
Notou-se no espectro de
1
H RMN de PNICL3C15, apresentado na
Figura 4.5.5, um singleto bastante desblindado em 11,92 ppm, com deslocamento
químico característico de hidrogênio quelado ou de grupo aldeído. Na região de
aromáticos foram observados dois dubletos, em 8,21 ppm (d, J = 8,4 Hz, 1H) e 6,97
ppm (d, J = 9,2 Hz, 1H) e, pela constante de acoplamento estes devem estar em
posição orto entre si. Um grupo retirador de elétrons deve estar ligado ao anel
aromático, justificando, assim, o deslocamento químico do hidrogênio em 8,21 ppm.
A análise do espectro indicou a presença de um hidrogênio carbinólico em 4,69 ppm
(m, 1H) e uma metila em 1,57 ppm (d, J = 6,8 Hz, 3H), a qual deve estar ligada ao
carbono carbinólico, devido ao valor do deslocamento químico. Foram observados
ainda dois duplos dubletos, cada um integrando para um hidrogênio, em 3,93 ppm
(dd, J= 4,4 e 18,4 Hz, 1H) e 3,06 ppm (dd, J = 10,8 e 18,4 Hz, 1H) e, de acordo com
as constantes de acoplamento de 18,4 Hz, estes devem ser hidrogênios geminais.
Figura 4.5.5. Espectro de
1
H RMN de PNICL3C15 em CDCl
3
(400MHz)
A junção dos dados espectrais mencionados no parágrafo anterior e a
ocorrência da detecção de isocumarinas nos extratos de NICL3, permitiu identificar a
substância PNICL3C15 com a estrutura ilustrada na Figura 4.5.6.
O
OOH
O R
Figura 4.5.6.
Estrutura parcial proposta para PNICL3C15
___________________________________________Resultados e Discussão
92
O grupo R, possivelmente, deve ser uma cadeia alquílica longa, pois
verificou-se um acúmulo de sinais na região compreendida entre 1,8 a 1,5 ppm. No
entanto, a análise do espectro de
1
H RMN indicou a presença de dois tripletos,
sendo que um deles deve ser um grupo metilênico adjacente a carbonila devido ao
valor do deslocamento químico em 2,36 ppm e o segundo referente a metila terminal
com deslocamento de 0,88 ppm.
Novos experimentos serão realizados para determinação do grupo R e
confirmação da estrutura proposta.
4.5.3 Elucidação estrutural da fração PNICL3C28
A substância, pertencente à fração PNICL3C28, foi isolada como um
sólido branco amorfo, com 5,2 mg de massa e, para sua elucidação estrutural foram
utilizados os experimentos de
1
H RMN uni e bidimensionais,
13
C RMN e
Espectrometria de Massas.
A integração no espectro de
1
H RMN (Figura 4.5.7) apresentou vinte
hidrogênios, enquanto que, no espectro de
13
C RMN (Figura 4.5.8) foram
observados quinze carbonos. No espectro de DEPT 135 (Figura 4.5.9) foi possível
verificar a presença de três metilas, três grupos metilenos e quatro grupos metínicos.
Figura 4.5.7.
Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
400MHz de PNICL3C28
___________________________________________Resultados e Discussão
93
Figura 4.5.8. Espectro de
13
C RMN em CDCl
3
de PNICL3C28
Figura 4.5.9. Espectro de DEPT 135 em CDCl
3
de PNICL3C28
Notou-se na Figura 4.5.7 um duplo duplo dubleto em 3,48 ppm (ddd,
1H), o qual é característico de hidrogênio carbinólico. Este, no espectro de COSY
(Figura 4.5.10), apresentou correlações com o sinal 2,44 ppm (ddd, J = 5; 10; 20 Hz,
1H) e com os multipletos em 1,81 ppm (m, 1H) e 1,89 ppm (m, 1H). Com base nos
espectros de
1
H e COSY, o sinal em 2,44 ppm acopla-se com o multipleto em 1,89
ppm (m, 1H) e com o dubleto em 3,06 ppm (d, J = 4 Hz, 1H). O multipleto em 1,81
ppm mostrou acoplamento com a metila em 0,96 ppm. O sinal em 3,06 ppm está
ligado a um carbono em 58,5 ppm (HSQC, Figura 4.4.11), deslocamento químico
___________________________________________Resultados e Discussão
94
característico de epóxido. Pelo HMBC (Figura 4.5.12) observou-se a correlação
deste hidrogênio com o carbono em 63,2 ppm, confirmando a presença do epóxido.
A junção de todos estes dados permitiu sugerir a estrutura parcial representada na
Figura 4.5.13.
Figura 4.5.10.
Espectro de COSY em CDCl
3
de PNICL3C28
Figura 4.5.11.
Espectro de HSQC de PNICL3C28
___________________________________________Resultados e Discussão
95
Figura 4.5.12.
Espectro de HMBC de PNICL3C28
HO
H
H
H
H
CH
3
H
O
R
R
R
3,48
2,44
1,89
1,81
0,96
3,06
67,4
33
40,7
58,5
63,2
COSY
HSQC
HMBC
Figura 4.5.13. Estrutura parcial da substância PNICL3C28 e as correlações observadas no
COSY, HSQC e HMBC
No experimento de HSQC foram observadas todas as correlações
para cada hidrogênio presente na molécula. A Tabela 4.5.1 apresenta estas
correlações.
O multipleto em 4,9 ppm, integrando para um hidrogênio, deve estar
adjacente a um oxigênio, devido ao deslocamento químico. Este hidrogênio está
diretamente ligado ao carbono em 78,3 ppm e correlaciona-se com os hidrogênios
em 1,82 ppm e 2,05 ppm.
No espectro de
13
C RMN pôde-se observar sinais característicos de
carboxila de éster em 174,6 ppm, e de dois carbonos sp
2
(159,5 e 122,3 ppm),
sendo que o mais blindado deve ser ligado ao carbono da carboxila. Com base
nestes dados propôs-se o grupo mostrado na Figura 4.5.14.
___________________________________________Resultados e Discussão
96
O
R
H
H
H
O
R
R
38
78,3
174,6
122,3
159,5
COSY
HSQC
4,9
38
Figura 4.5.14. Grupo pertencente à fração PNICL3C28 e as correlações observadas no COSY e
HSQC
O tripleto em 1,85 ppm, com integração para três hidrogênios, deve
estar ligado a um carbono sp
2
, por estar mais desblindado, o que foi confirmado pelo
HMBC. Pelo COSY observou-se o acoplamento homoalílico desta metila com o
dubleto em 2,23 ppm (d, J = 14 Hz, 1H) e com o multipleto em 4,9 ppm. O hidrogênio
em 2,76 ppm mostrou correlação com o dubleto em 0,83 ppm (d, J = 1Hz). Já o
dubleto (3H) em 0,83 ppm mostrou correlação com o carbono em 40,7 ppm. Através
das correlações observadas anteriormente, dos grupos já elucidados, dos dados da
literatura (PÉREZ-CASTORENA, et al., 2007) e também a estrutura do
sesquiterpeno eremofilano detectada por CG/EM no extrato de NICL3, foi proposta a
estrutura da Figura 4.5.15 para a molécula pertencente à fração PNICL3C28.
O
O
O
HO
H
H
H
1,85
4,9
2,23
2,76
35,1
40,7
0,83
COSY
HSQC
HMBC
Figura 4.5.15. Estrutura proposta para a substância da fração PNICL3C28 e as correlações
observadas no COSY, HSQC e HMBC
A estereoquímica relativa foi determinada através do NOE (Figura
4.5.17) e do COSY. A irradiação do multipleto em 3,48 ppm causou o efeito NOE
nos hidrogênios em 0,83 e 0,96 ppm. Já o espectro de COSY mostrou a correlação
dos hidrogênios da metila (H13) com os sinais em 2,23 ppm (H6b) e com o multipleto
em 4,90 ppm (H8), sugerindo um ângulo diedro de 90º entre H6b e H8 com o
carbono da dupla ligação em C11, indicando uma orientação á para H8. A Figura
4.5.16 apresenta a estrutura com a respectiva estereoquímica relativa.
___________________________________________Resultados e Discussão
97
O
HO
O
O
1
14
7
9
15
10
3 5
13
12
11
Figura 4.5.16. Estereoquímica proposta para a substância da fração PNICL3C28
Tabela 4.5.1. Dados espectroscópicos de PNICL3C28
Posição
1
H HSQC COSY HMBC
1 3,06 (d, 4 Hz) 58,5 H2a C2, C10
2a 2,44 (ddd, 20/10/5 Hz) 33,0 H1, H2b, H3 C3, C14
2b 1,89 (m) H2a, H3 C1, C10, C3
3 3,48 (m) 67,4 H2a, H2b, H4 C4, C15
4 1,81 (m) 40,7 H15, H3 C2, C3
5 - 39,1 - -
6a 2,76 (d, 14 Hz) 35,1 H6b C5, C7, C8, C10, C11, C14
6b 2,23 (dl, 14 Hz) H6a, H13,H14 C5, C7, C8, C10, C11, C14
7 - 159,5 n.d
8 4,90 (m) 78,3 H9a, H9b, H13 n.d.
9a 2,05 (m) 38,0 H9b, H8 C7, C8, C13
9b 1,82 (m) H9a, H8 C3, C5,C14, C15
10 - 63,2 - -
11 - 122,3 - -
12 - 174,6 - -
13 1,85 (t, 2 Hz) 8,1 H6b, H8, H15 C7, C11, C12, C15
14 0,83 (d, 1 Hz) 15,8 H6b C4, C5, C6, C10, C15
15 0,96 (d, 7 Hz) 10,1 H4 C3, C4, C5
* deslocamento químico em ppm
Figura 4.5.17.
Espectro de NOE de PNICL3C28
___________________________________________Resultados e Discussão
98
Para confirmação da estrutura proposta foram realizados experimentos
de Espectrometria de Massas no modo full scan e íons produtos. No espectro de
massas, com ionização por ESI(+) no modo full scan foi possível observar o íon
molecular protonado [M+H]
+
com m/z 265, confirmando a massa molecular da
estrutura proposta, conforme ilustra a Figura 4.5.18.
No espectro de íons produtos (Figura 4.5.19), obtido com energia de
colisão de 20 eV , pôde-se observar muitos fragmentos, dos quais os íons de m/z
265, 247, 229 e 201 foram justificados, conforme mostra o Esquema 4.5.2.
Figura 4.5.18.
Espectro de Massas da molécula presente na fração PNICL3C28
Figura 4.5.19.
Espectro de íons produtos de m/z 265
___________________________________________Resultados e Discussão
99
Esquema 4.5.2. Proposta de fragmentação do sesquiterpeno elucidado
Através do esquema proposto, verificou-se a protonação do oxigênio
do éster levando ao íon molecular protonado de m/z 265, este sofreu uma
desidratação, a qual levou ao íon de m/z 247. Em seguida, ocorreu a abertura da
lactona, assistida pelo par de elétrons não ligante do oxigênio da carboxila e, uma
segunda desidratação conduzindo ao íon de m/z 229, o qual pela perda de uma
molécula de CO, produziu o íon de m/z 201.
De acordo com pesquisa bibliográfica na base de dados Science
Finder a estrutura apresentada para PNICL3C28 é inédita na literatura.
4.5.4 Elucidação estrutural da fração PNICL3B37
O espectro de
1
H RMN de PNICL3B37 (Figura 4.5.20) apresentou uma
grande similaridade com o espectro de hidrogênio do sesquiterpeno eremofilano
elucidado no item anterior (Figura 4.5.7). No entanto, não foram observados os
sinais referentes ao hidrogênio carbinólico em 3,48 ppm (H3) e ao hidrogênio
diasterotópico em 2,44 ppm (H2a), evidenciando, dessa forma, a ausência da
hidroxila em C3. A falta deste grupo em C3 deve deslocar o sinal de H3 para a
região mais blindada do espectro, o que está de acordo com o observado na Figura
4.5.17, uma vez que, pôde-se verificar um multipleto em 1,27 ppm, o qual concorda
com os dados da literatura (PÉREZ-CASTORENA, et al., 2007). A estereoquímica
relativa da molécula foi determinada com base na estereoquímica proposta para
O
O
O
HO
H
H
O
O
O
H
H
2
O
O
OH
O
O
OH
O
H
O
O
H
2
O
O
CO
m/z 265 m/z 247
m/z 229m/z 201
___________________________________________Resultados e Discussão
100
PNICL3C28. A Figura 4.5.21 ilustra a estrutura de PNICL3B37 e, a comparação dos
dados de
1
H RMN que permitiram a identificação desta encontra-se na Tabela 4.5.2.
PPM
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
Figura 4.5.20. Espectro de
1
H RMN de PNICL3B37 em CDCl3 (200 MHz)
O
O
O
1
3
5
1111111111
15
14
12
13
7
9
10
Figura 4.5.21. Estrutura de PNICL3B37
Tabela 4.5.2 Comparação dos dados de
1
H RMN de PNICL3B37 com os dados da literatura (PÉREZ-
CASTORENA, et al., 2007)
Posição
1
H RMN PNICL3B37 (*)
1
H RMN literatura (*)
H1 3,07 (d, J = 3,4 Hz) 3,06 (d, J = 3,5Hz)
H3 1,27 (m) 1,26 (m)
H6a 2,78 (dl, J = 13,2 Hz) 2,76 (dl, J = 13,5 Hz)
H6b 2,23 (d, J = 13,2 Hz) 2,21 (d, J= 13,5 Hz)
H8 4,92 (m) 4,91 (ddl, J = 9; 9 Hz)
H13 1,86 (dd, J =1,2; 1,2 Hz) 1,85 (dd, J = 1,8; 1,2 Hz)
H14 0,83 (s) 0,82 (s)
H15 0,85 (d, J = 6,2 Hz) 0,83 (d, J = 7 Hz)
* deslocamento químico em ppm
___________________________________________Resultados e Discussão
101
4.5.5 Elucidação estrutural da fração PNICL3D11
A elucidação estrutural de PNICL3D11 baseou-se na análise das
informações obtidas por RMN. Foi possível observar características semelhantes ao
dos sesquiterpenos eremofilanos anteriormente elucidados, pois pelo espectro de
1
H
RMN (Figura 4.5.22) verificou-se dois sinais de hidrogênios olefínicos, três sinais de
hidrogênios carbinólicos e, pela integração foi possível atribuir à molécula duas
metilas.
Figura 4.5.22.
Espectro de
1
H RMN em 400MHz de PNICL3D11 em CDCl
3
Os sinais dos hidrogênios olefínicos em 5,26 ppm (d, J = 1Hz, 1H) e
5,12 ppm (sl, 1H) apresentaram correlação entre si pelo COSY (Figura 4.5.23), e
através do HSQC (Figura 4.5.24) verificou-se que estes são hidrogênios geminais.
Ainda pelo COSY notou-se que o dubleto em 5,26 ppm acopla com os hidrogênios
carbinólicos em 4,19 ppm (dd; J = 11; 1 Hz; 1H) e 4,16 ppm (dd; J = 11; 1 Hz). A
partir destas informações foi possível propor a estrutura parcial apresentada na
Figura 4.5.25
___________________________________________Resultados e Discussão
102
Figura 4.5.23.
Espectro de COSY de PNICL3D11 em CDCl
3
Figura 4.5.24.
Espectro de HSQC de PNICL3D11 em CDCl
3
___________________________________________Resultados e Discussão
103
HR
R
HH
OH
H
4,19
4,16
5,26
5,12
Figura 4.5.25. Estrutura parcial proposta para a molécula PNICL3C11 através das correlações de
COSY
Pelo deslocamento químico do multipleto em 2,43 ppm pôde-se inferir
que este deve estar nas vizinhanças de um centro retirador de elétrons. Esta
proposição foi confirmada, uma vez que, constatou-se, pelo COSY, a correlação
deste sinal com o hidrogênio carbinólico em 3,88 ppm (dt, J = 10; 4 Hz, 1H). Foi
possível notar também a correlação do multipleto com os sinais em 1,68 ppm (m;
1H) e 1,41 ppm (m, 1H), os quais pelo HSQC estão ligados ao carbono em 39,6 ppm
e pelo HMBC (Figura 4.5.26) apresentam acoplamento com uma metila em 1,02 ppm
(s, 3H). Já o hidrogênio carbinólico em 3,88 ppm apresentou correlação com os
hidrogênios diasterotópicos em 2,18 ppm (dd, J = 12,4; 9,6 Hz, 1H) e 1,38 ppm (m,
1H). A Figura 4.5.27 apresenta a estrutura parcial proposta de acordo com as
correlações mencionadas anteriormente.
Figura 4.5.26. Espectro de HMBC de PNICL3D11 em CDCl
3
___________________________________________Resultados e Discussão
104
OH
OH
H
H
R
H
H
H
R
H
3,88
1,68
1,41
1,38
2,18
1,02
COSY
HMBC
2,43
Figura 4.5.27. Estrutura parcial proposta para a molécula PNICL3C11 através das correlações de
COSY e HMBC
A análise do espectro de HSQC indicou que o dubleto em 2, 96 ppm
(d, J = 7 Hz) apresenta correlação com carbono característico de epóxido em 59,7
ppm e, através do COSY, observou-se o acoplamento em W com o duplo dubleto
2,18 ppm (dd, J= 9,6; 12,4 Hz, 1H) e com o hidrogênio em 1,91 ppm (m, 2H). As
análises do HSQC e do COSY indicaram que os hidrogênios do multipleto estão
ligados ao carbono em 22,1 ppm e aos hidrogênios em 1,21 ppm (m, 2H),
respectivamente.
Pôde-se inferir, através dos dados de COSY e HMBC, que os
hidrogênios em 1,21 ppm estão acoplados a um grupo metínico com hidrogênio em
1,71 ppm (m, 1H) e a metila em 0,71 ppm (dl, J = 5,6 Hz, 3H). A Tabela 4.5.3
apresenta todos os dados espectroscópicos de RMN da substância PNICL3D11.
Pela junção de todos dados mencionados anteriormente, foi possível
propor a estrutura da molécula em estudo, conforme ilustra a Figura 4.5.28.
O
OH
OH
1
12
13
11
14
7
9
15
10
3 5
Figura 4.5.28. Estrutura proposta para a substância PNICL3D11
A estrutura proposta está de acordo com todos os dados de RMN e
também concorda com o fato de o microrganismo NICL3 ser um hábil produtor de
sesquiterpenos eremofilanos, uma vez que, esta classe foi detectada por CG/EM e
também isolada em outras frações do extrato fúngico. No entanto, não foi possível
realizar experimentos a fim de se verificar a estereoquímica relativa, uma vez que, a
___________________________________________Resultados e Discussão
105
amostra degradou, dessa forma, foi sugerida a mesma estereoquímica observada
para o sesquiterpeno PNICL3C28 (Figura 4.5.16). A Figura 4.5.29 apresenta a
estrutura do sesquiterpeno elucidado e a estereoquímica relativa proposta. Não há
relatos deste sesquiterpeno na literatura, o que o caracteriza como uma substância
inédita.
O
OH
OH
1
12
13
11
14
7
9
15
10
3 5
Figura 4.5.29. Estereoquímica relativa proposta para a substância PNICL3D11
Tabela 4.5.3. Dados espectroscópicos de RMN
Posição 1H (*) HSQC (*) COSY HMBC
1 2,97 (d, J = 7 Hz, 1H) 59,7 H2a/b, H9a n.d.
2a/2b 1,91 (m, 2H) 22,1 H1, H3a/b n.d.
3a/3b 1,21 (m, 2H) 24,3 H2a/b, H4 C15
4 1,71 (m, 1H) 33,1 H3a/b, H15 n.d.
5 - 35,8 - C4, C15
6a 1,68 (m, 1H) H6b, H7 C7, C8
6b 1,41 (m, 1H)
39,6
H6a, H7, H8 C7, C8, C10
7 2,43 (ddd, J = 9,2; 20; 23,6 Hz, 1H) 45,4 H6a, H6b,H8, n.d.
8 3,88 (dt, J = 10; 4 Hz, 1H) 71,6 H6b, H7, H9a/b n.d.
9a 2,18 (dd, J = 9,6; 12,4 Hz, 1H) H1, H8, H9b C8
9b 1,38 (m, 1H)
38,5
H9a, C7, C8, C10
10 - 65,8 - -
11 - 150,1 - -
12a 5,26 (d, J = 1 Hz, 1H) 12b, H13a, H13b C7, C13
12b 5,12 (d, J = 1 Hz, 1H)
113,2
H12a C7, C13
13a 4,19 (dd, J = 11; 1 Hz, 1H) H12a C7, C11, C12
13b 4,16 (dd, J = 11; 1 Hz; 1H)
65,8
H12a C7, C11, C12
14 1,02 (s, 3H) 15,9 n.d. C4, C5, C6, 10
15 0,71 (d, J = 6 Hz, 3H) 14,8 H4 C3, C4, C5
* deslocamento químico em ppm
___________________________________________Resultados e Discussão
106
4.6 Comparação do perfil metabólico de NICL3 em diferentes
meios de cultura
Muitas pesquisas relatam que os microrganismos possuem um poder
muito grande de adaptação mediante o suprimento ou carência de nutrientes, desse
modo, o meio de cultura é um fator determinante na produção de metabólitos
secundários. Diante disso, o fungo NICL3 foi cultivado em diferentes meios de
cultura e os extratos analisados por CLAE/UV. De cada meio de cultivo foram
obtidos dois extratos, um extrato etanólico e um de acetato de etila.
Em uma análise puramente visual observou-se que, após vinte dias de
cultivo, o fungo NICL3 desenvolveu-se muito bem em todos os meios de cultura,
como pode ser observado na Figura 4.6.1.
Figura 4.6.1 Desenvolvimento do fungo NICL3 em diferentes meios de cultura; (A) arroz, (B) milho,
(C) extrato de soja e (D) Czapeck + 2% de extrato de levedura
Primeiramente, monitoraram-se os meios de cultura (BRANCOS) em
comprimentos de onda que apresentassem maior número de bandas
cromatográficas (Figura 4.6.2). Constatou-se que todos os meios apresentaram uma
boa quantidade de constituintes, uma vez que, são substratos compostos
basicamente por carboidratos, aminoácidos, dentre outros.
(A) (B)
(C) (D)
___________________________________________Resultados e Discussão
107
Figura 4.6.2. Cromatogramas dos meios de cultura sem crescimento fúngico; (A) Arroz (= 225 nm),
(B) Milho (= 285 nm), (C) Czapeck com 2% de extrato de levedura (= 287 nm) e (D) Extrato de Soja
(
= 248 nm)
Verificou-se que o microrganismo modificou consideravelmente o meio
de cultura, uma vez que, os extratos de cada meio apresentaram perfis
cromatográficos (Figura 4.6.3) distintos daqueles mostrados na Figura 4.6.2.
Também foi possível notar a diferença de um cromatograma para o outro,
confirmando a proposição de que o meio de cultura influencia significativamente na
produção de metabólitos secundários. Este resultado mostra a potencialidade e
importância do estudo da química de microrganismos, pois através de alterações no
meio de cultivo, os microrganismos podem produzir uma variedade de substâncias
diferentes e com diversas atividades biológicas. Este fato relaciona-se diretamente
com o interesse pela busca de novas substâncias com ações farmacológicas,
agroquímicas, dentre outras.
Observando-se as Figuras 4.6.3 e 4.6.4, foram constatadas pequenas
diferenças nos perfis cromatográficos dos extratos obtidos com EtOH e AcOEt. O
extrato proveniente do meio Czapeck com 2% de extrato de levedura particionado
com AcOEt, mostrou maior constituição química do que aquele obtido pela extração
com EtOH.
Minutes
10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
50
100
150
Minutes
10 20 30 40
mAU
0
100
200
300
Minutes
10 20 30 40
mAU
0
20
40
Minutes
10 20 30 40
mAU
0
100
200
300
(A) (B)
(C) (D)
___________________________________________Resultados e Discussão
108
Figura 4.6.3.
Cromatogramas ( = 225 nm) dos extratos obtidos a partir de EtOH dos diferentes
meios de cultivo de NICL3: (A) Arroz, (B) Milho, (C) Czapeck com 2% extrato de levedura e (D)
Extrato de soja
Figura 4.6.4.
Cromatogramas ( = 225 nm) dos extratos obtidos a partir de AcOEt dos diferentes
meios de cultivo de NICL3: (A) Arroz, (B) Milho , (C) Czapeck com 2% extrato de levedura e (D)
Extrato de soja
(A)
(B)
(C) (D)
Minutes
10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
200
400
Minutes
10 20 30 40
mAU
0
200
400
600
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10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
200
400
600
Minutes
10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
200
400
600
(A) (B)
(C) (D)
___________________________________________Resultados e Discussão
109
4.7 Isolamento de metabólitos secundários produzidos pelo
fungo NICL5
4.7.1. Isolamento das substâncias na fração PNICL5B
Após o pré-tratamento dos extratos brutos PNICL5 e MNICL5 por
cromatografia usando coluna com placa sinterizada, foram obtidas seis frações
referentes a cada extrato. As frações B e C de cada extrato apresentaram pequenos
cristais solúveis em solventes de média polaridade, enquanto que as frações F
continham cristais maiores, que eram solúveis somente em água.
Em um primeiro instante a fração PNICL5B foi analisada por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas
(CLAE/EM), utilizando as condições descritas no item 3.2.9.1.
Surpreendentemente verificou-se, no cromatograma de íons totais
(TIC), que a fração PNICL5B era composta basicamente por três substâncias (Figura
4.7.1A), as quais poderiam apresentar íons moleculares protonados ([M+H]
+
) iguais
a m/z 508, o que foi confirmado pela presença do aduto de sódio, [M+Na]
+
, em m/z
530 (Figura 4.7.2) e também pelo cromatograma de íons selecionados a m/z 508
(Figura 4.7.1B). Na Figura 4.7.2 pôde-se observar nos espectros em full scan a
presença dos íons de m/z 490, 448 e 430, que foram gerados na fonte de ionização.
A fim de se obter maiores informações estruturais, foram realizados
experimentos de íons produtos de m/z 508, os quais pelos espectros de massas
(Figura 4.7.3) foram praticamente idênticos, diferindo na intensidade dos íons.
Figura 4.7.1. (A) Cromatograma de íons totais (TIC) da fração PNICL5B e (B) Cromatogramas de
íons selecionados a m/z 508
(A)
(B)
___________________________________________Resultados e Discussão
110
Figura 4.7.2.
Espectros de massas full scan das substâncias presentes na fração PNICL5B:
(A) 12,80 min, (B) 15,34 min e (C) 16,42 min
Figura 4.7.3.
Espectros de íons produtos de m/z 508 das substâncias presentes na fração PNICL5B:
(A) 12,80 min, (B) 15,34 min e (C) 16,42 min
Para a separação destas substâncias foi empregada CLAE
preparativa, conforme as condições descritas no item 3.2.9. A Figura 4.7.4 mostra o
cromatograma, monitorado a 240 e 290 nm, no qual foi possível observar uma boa
separação dos constituintes da fração PNICL5B.
(A)
(B)
(C)
(A)
(
B
)
(C
)
[M+H]
+
[M+Na]
+
___________________________________________Resultados e Discussão
111
Figura 4.7.4. Cromatograma da fração PNICL5B
As substâncias eluídas apresentaram pequenos cristais de coloração
branca e aciculiformes e, receberam a denominação de PNICL5B1, PNICL5B2 e
PNICL5B3. Estas substâncias foram analisadas por
1
H RMN e novamente por
CLAE/EM. Apesar da boa separação cromatográfica visualizada na Figura 4.7.4 as
análises por RMN mostraram que frações PNICL5B2 e PNICL5B3 estavam em
mistura.
4.7.1.1 Identificação estrutural de PNICL5B1
A comparação dos dados espectroscópicos de RMN e Espectrometria
de Massas e os dados da literatura (FUJI, et al., 2000) permitiram a identificação da
substância PNCL5B1 como sendo a Citocalasina D.
A análise do espectro de
1
H RMN de PNICL5B1, mostrado na Figura
4.7.5, indicou a presença de um anel aromático monossubstituído, seis sinais de
hidrogênios olefínicos e dois sinais de hidrogênios carbinólicos.
Pelo COSY (Figura 4.7.6) o sinal (hidrogênio carbinólico) em 3,81 ppm
(d, J = 10,4 Hz) com integração para um hidrogênio, mostrou correlação apenas com
o multipleto em 2,83 ppm, indicando a possibilidade de estar ligado a um carbono
quaternário. Já o multipleto em 2,83 ppm correlacionou-se com o sinal característico
de hidrogênio olefínico, com integração para um hidrogênio, em 5,70 ppm (dd, J = 10
e 16 Hz). O hidrogênio em 5,70 ppm correlacionou-se com o duplo duplo dubleto em
5,34 ppm (ddd, J= 5,6; 10,4 e 16 Hz) e, a geometria da dupla ligação, através do
valor da constante de acoplamento, de 16 Hz, foi determinada como E. Com base no
Minutes
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
mAbs
0
2
4
6
8
10
Detector A - 1 (240nm)
extratoPNICL5_26082008a
EXTRATOPNICL5_26082008A.DAT
Detector A - 2 (290nm)
extratoPNICL5_26082008a
EXTRATOPNICL5_26082008A.DAT
___________________________________________Resultados e Discussão
112
COSY o sinal em 5,34 ppm indicou acoplamento com os hidrogênios em 2,02 ppm e
2,51 ppm, ambos multipletos integrando para um hidrogênio, os quais pelo HSQC
(Figura 4.7.7) estão ligados ao carbono em 37,8 ppm.
Figura 4.7.5.
Espectro de
1
H RMN em 400MHz de PNICL5B1 em CDCl
3
Figura 4.7.6.
Espectro de COSY de PNICL5B1 em CDCl
3
___________________________________________Resultados e Discussão
113
Figura 4.7.7.
Espectro de HSQC de PNICL5B1 em CDCl
3
No HMBC (Figura 4.7.8) foi observado o acoplamento do multipleto em
2,75 ppm com o carbono sp
2
em 130,9 ppm e pelo COSY foi verificada a correlação
com o hidrogênio em 2,51 ppm e com a metila em 1,20 ppm (d, J=6,8 Hz). Pelo
HMBC, foi possível notar os acoplamentos da metila com um carbono com
deslocamento químico característico de carbonila de cetona, em 210,2 ppm e,
também com o carbono quaternário em 19,5 ppm. Através da comparação com os
dados da literatura (FUJI, et al., 2000) e da reunião de todos os dados descritos,
sugeriu-se a estrutura parcial representada na Figura 4.7.9.
___________________________________________Resultados e Discussão
114
Figura 4.7.8.
Espectro de HMBC de PNICL5B1 em CDCl
3
R
R OH
O
R
R
R
Figura 4.7.9. Estrutura parcial da substância PNICL5B1
O singleto, com integração para três hidrogênios, em 1,51 ppm não
apresentou correlação no COSY, indicando, dessa forma, que deve estar ligado a
um carbono quaternário. No entanto, por HMBC foi possível observar o acoplamento
do carbono deste sinal com o hidrogênio olefínico em 5,14 ppm (dd, J = 2,4; 15,6
Hz).
A presen
ça da dupla ligação foi confirmada através do COSY, uma vez
que, o dd em 5,14 ppm mostrou correlação com o sinal em 6,11 ppm (dd, J = 2,8 e
15,6 HZ) e, pela constante de acoplamento, pode-se inferir que a geometria da dupla
___________________________________________Resultados e Discussão
115
ligação foi E. Pelo HMBC verificou-se o acoplamento do carbono sp
2
ligado ao
hidrogênio olefínico em 5,14 ppm com o carbono carbinólico em 77 ppm. Ainda pelo
HMBC foi possível notar o acoplamento do hidrogênio carbinólico em 5,64 ppm (dd,
J = 2,4; 2,7 Hz) com o carbono em 171 ppm, que pelo deslocamento químico deve
ser uma carboxila de éster. O singleto (3H) em 2,27 ppm foi relacionado à metila de
um grupo acetato.
Outros dois carbonos olefínicos foram observados, sendo um deles
carbono quaternário enquanto que o outro, pelo HSQC, apresentou correlações com
os hidrogênios em 5,09 ppm (s) e 5,30 ppm (s). Através do HMBC foi possível
verificar acoplamentos dos hidrogênios olefínicos com o carbono carbinólico em 70
ppm e com o carbono em 32,9 ppm. Pelo HSQC notou-se o acoplamento do
carbono em 32,9 ppm com o multipleto em 2,75 ppm e, com base no COSY este
multipleto correlacionou-se com a metila em 0,96 ppm (d, J=8 Hz) e com o duplo
dubleto em 2,15 ppm (dd, J=2,8 e 4,8 Hz). Já o dd em 2,15 ppm, pelo COSY,
apresentou também correlação com o multipleto, com integração para um
hidrogênio, em 3,23 ppm.
Foi possível observar pelo HMBC e pelo COSY o acoplamento do
multipleto em 3,23 ppm com o carbono em 32,9 ppm, com o carbono quaternário em
53,1 ppm e o hidrogênio em 2,69 ppm (m, 1H). A análise do COSY indicou a
correlação do multipleto em 2,69 ppm com o sinal em 2,80 ppm (m, 1H), os quais se
correlacionam com o carbono em 45,8 ppm (HSQC). Estes no HMBC acoplam com
um carbono característico de sistema aromático em 128,8 ppm.
Através da integração verificou-se a presença de cinco hidrogênios
aromáticos, constituindo um sistema monossubstituído.
Foi possível verificar no HMBC a presença de uma carboxila de amida,
a qual mostrou acoplamento com o hidrogênio em 2,86 ppm.
A partir da união das informações descritas e também pelos dados
espectrais de RMN da literatura pôde-a atribuir a substância PNICL5B1 como sendo
a citocalasina D, apresentada na Figura 4.7.10. A Tabela 4.7.1 ilustra os dados
espectroscópicos de RMN da substância PNICL5B1.
Não há relatos na literatura dos dados Ressonância Magnética Nuclear
da citocalasina D em clorofórmio deuterado. Por isso, a comparação dos dados
espectrais da substância identificada foi realizada com os dados espectroscópicos
___________________________________________Resultados e Discussão
116
da zigosporina D (com grupo OH em C21) e de um derivado da zitocalasina D, com
grupo acetato em C7 e C21.
Tabela 4.7.1 Dados espectroscópicos de PNICL5B1
Posição
1
H (*) HSQC (*) COSY HMBC
1 - 174 - -
2 5,46 (s, 1H) - - -
3 3,23 (m, 1H) 53 H10a, H4 C5, C4, C9
4 2,15 (dd, 2,8; 4,8 Hz, 1H) 50 H3, H5 C5, C9
5 2,75 (m) 32,9 H4, H11 C9
6 - 147,4 - -
7 3,81 (d, 10,4 Hz, 1H) 70 H8 n.d.
8 2,86 (m) 46 H7, H13 C1, C14, C21
9 - 53,1 - -
10a 2,69 (m, 1H) C3’, C5
10b 2,80 (m, 1H)
45,8 H10a/b, H3
C3’, C5’
11 0,96 (d, 6,8 Hz, 3H) 13,9 H5 C4, C5, C6
12a 5,09 (s, 1H) n.d. C5, C7
12b 5,30 (s, 1H)
114,5
n.d C5, C7
13 5,70 (dd, 10; 16 Hz, 1H) 130,9 H14, H8 C15
14 5,34 (ddd, 5,6; 10,4; 16 Hz, 1H) 134,2 H13, H15a/b C8
15a 2,51 (m, 1H) H15b, H16 C13, C21,
C22
15b 2,02 (m, 1H)
37,8
H15a -
16 2,75 (m, 1H) 42,3 H22, H15a
17 - 210,2 - -
18 - 78 - -
19 5,14 (dd, 2,4; 15,6 Hz, 1H) 127,6 H20, H23 C21
20 6,11 (dd, 2,8; 15,6 Hz, 1H) 132,5 H19, H21 C18
21 5,64 (dd, 2,4; 2,8 Hz, 1H) 77 H19, H20 C15, 21-OAc
22 1,20 (d, 6,8 Hz, 1H) 19,5 H16 C15, C16,
C17, C18
23 1,51 (s, 3H) 24,5 - C17, C19
21 OC - 170 - -
21-OAc 2,27 (s, 3H) 21,8 n.d. 21OC, C18
1’ - 140 - C2’
2’ e 6’ 7,31 (m, 2H) 128,5 H3’, H4, H5’ C1’
3’ e 5’ 7,13 (dd, 1,6; 6,8 Hz, 2H) 128,8 H2’, H4’, H6’ C2’, C4’
4’ 7,24 (m, 1H) 126 C3’
* deslocamento químico em ppm
___________________________________________Resultados e Discussão
117
Figura 4.7.10. Estrutura molecular da citocalasina D
Para a confirmação da estrutura proposta foram realizados
experimentos de Espectrometria de Massas no modo full scan para a determinação
da massa molecular, e íons produtos para informação estrutural.
Conforme visto na Figura 4.7.2A, a substância PNICL5B1 (tr = 12,80
min) apresentou como pico base o íon molecular protonado ([M+H]
+
) com m/z 508, o
qual foi confirmado pela presença do aduto de sódio, [M+Na]
+
, com m/z 530, dessa
forma, o composto deve apresentar massa molecular de 507 Da.
O espectro de íons produtos obtido com energia de colisão de 20 eV
ilustrado na Figura 4.7.3A apresentou pico base o íon de m/z 430. O Esquema 4.7.1
mostra uma proposta de fragmentação que justifica a maioria dos íons observados.
A proposta de fragmentação para a citocalasina D, no modo positivo de
ionização, baseou-se na protonação do nitrogênio da amida. Em seguida, ocorreu
uma desidratação levando ao íon de m/z 490. O pico base do espectro de íons
produtos foi formado pela perda de ácido acético.
As citocalasinas são substâncias de origem biossintética mista, a qual
envolve um aminoácido e uma cadeia policetídica. O íon de m/z 120 caracteriza as
citocalasinas provenientes do aminoácido fenilalanina. A formação desse íon,
segundo o Esquema 4.7.1, envolve a abertura do anel de cinco membros assistida
pelo par de elétrons não ligante do oxigênio da carboxila e conseqüente
estabilização da carga positiva no átomo de nitrogênio. Em seguida, através da
conjugação do par de elétrons não ligante do nitrogênio ocorreram as perdas
simultâneas de uma molécula de CO e da porção policetídica, levando ao íon de m/z
120.
HN
OH
O
OAc
OH
O
1
3
5 7
9
10
11
12
13
15
1719
23
21
1'
3'
5'
22
___________________________________________Resultados e Discussão
118
Esquema 4.7.1
Proposta de fragmentação da Citocalasina D
HN
OH
O
O
OH
O
H
H
O
HN
OH
O
O
O
H
O
H
m/z 508
m/z 490
HN
OH
O
O
H
H
m/z 430
(b)
HO
O
HN
OH
O
O
H
OH
m/z 448
(a)
H
2
O
HN
O
O
H
m/z 412
HN
OH
O
O
OH
O
H
O
H
+
HN
OH
O
O
OH
O
H
H
O
H
(b)
(a)
m/z 508
H
2
O
HO
O
HN
OH
O
OAc
OH
O
H
NH
2
O
NH
2
m/z 508
m/z 120
CO
OH
O
OAc
OH
___________________________________________Resultados e Discussão
119
4.7.1.2 Identificação estrutural de PNICL5B2 e PNICL5B3
Como dito no item 4.7.1 a fração PNICL5B apresentou, no experimento
de CLAE/EM, três bandas cromatográficas, as quais possuíam o íon molecular
protonado de m/z 508 e espectros de íons produtos praticamente idênticos,
indicando a presença de isômeros. Um desses isômeros foi identificado como sendo
a citocalasina D.
Através de pesquisa bibliográfica na base de dados Science Finder, foi
possível verificar que somente as citocalasinas C e Q são isômeros da citocalasina
D. Conforme mostrado na Figura 4.7.11, estas apresentam uma grande similaridade
estrutural, sendo que a diferença entre elas reside nas posições 5, 6 e 7. A
Citocalasina C apresenta uma dupla ligação entre C5 e C6 enquanto a citocalasina
D apresenta dupla ligação entre C6 e C12. Já a citocalasina Q possui um epóxido
entre C6 e C7.
Figura 4.7.11
Estruturas químicas das citocalasinas C e Q
As análises dos espectros de
1
H RMN da fração PNICL5B2 e
PNICL5B3 (Figuras 4.7.12 e 4.7.13) mostraram uma grande complexidade de sinais,
indicando a presença de mistura. No espectro de
1
H RMN de PNICL5B2 foi possível
notar além dos sinais da Citocalasina D, um singleto em 1,25 ppm, com
deslocamento químico característico de metila. Este singleto forneceu indícios da
presença da Citocalasina C, pois esta possui uma metila ligada a C6. Já o espectro
de HSQC (Figura 4.7.14) de PNICL5B3 mostrou correlação do hidrogênio H7 com o
carbono com deslocamento químico característico de epóxido em 60 ppm.
Com base nos dados experimentais observados anteriormente, os
experimentos de Espectrometria de Massas e a busca bibliográfica realizada, pôde-
HN
OH
O
OAc
OH
O
1
3
5 7
9
10
11
12
13
15
1719
21
1'
3'
22
5'
HN
O
OAc
OH
O
O
1
3
5 7
9
10
11
12
13
15
1719
21
1'
22
5'
Citocalasina C Citocalasina Q
___________________________________________Resultados e Discussão
120
se inferir que as frações PNICL5B2 e PNICL5B3 correspondem às citocalasinas C e
Q, respectivamente.
Figura 4.7.12.
Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
(400 MHz) da fração PNICL5B2
Figura 4.7.13.
Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
(400 MHz) da fração PNICL5B3
___________________________________________Resultados e Discussão
121
Figura 4.7.14.
Espectro de HSQC de PNICL5B3
4.7.2 Identificação estrutural da fração MNICL5B16
A fração MNICL5B16 de massa 3,2 mg apresentou cristais brancos
que foram analisados por
1
H RMN em clorofórmio deuterado.
A Figura 4.7.15 representa o espectro de
1
H RMN da substância
isolada, na qual se observou um multipleto com deslocamento químico de hidrogênio
carbinólico em 3,66 ppm, e três sinais característicos de hidrogênios olefínicos entre
5,7 e 5,2 ppm. Pela integração pôde-se verificar a presença de 6 metilas. Estes
sinais caracterizam uma substância com esqueleto esteroidal.
O esteróide mais frequentemente isolado de fungos, é o Ergosterol e,
para se confirmar que MNICL5B16 era o referido esteróide, realizou-se CCD de
ponto misto. Foi aplicado o padrão de Ergosterol juntamente com a substância a ser
identificada em um mesmo ponto da placa. Verificou-se que ambos apresentavam o
___________________________________________Resultados e Discussão
122
mesmo fator de retenção, o que caracterizou a substância MNICL5B16 como o
Ergosterol. A Figura 4.7.16 apresenta a estrutura molecular do ergosterol.
Figura 4.7.15.
Espectro de
1
H RMN em CDCl
3
(400 MHz) de MNICL5B16
Os sinais que caracterizam o Ergosterol são os multipletos em 5,57
ppm e 5,38 ppm atribuídos aos hidrogênios olefínicos H6 e H7, além dos sinais dos
hidrogênios da dupla ligação da cadeia lateral, H22 e H23 em 5,2 ppm, do
hidrogênio carbinólico em 3,66 ppm (m) atribuído a H7. Já os sinais das metilas
encontram-se na região mais desblindada do espectro. As metilas 18 e 19 são
caracterizadas pelos singletos em 0,63 ppm (s, 3H) e 0,95 ppm s, 3H). Os dubletos
em 1,02 ppm (d, J = 6,6 Hz, 3H) , 0,92 ppm (d, 6,8 Hz, 3H), 0,85 ppm (d, J = 3,0 Hz,
3H) e 0,82 ppm (d, J = 3,0 Hz, 3H) foram atribuídos aos hidrogênios H21, H26, H27
e H28.
HO
1
6
5
8
3
28
27
26
25
24
23
22
21
20
19
18
17
15
1311
10
Figura 4.7.16.
Estrutura molecular do ergosterol
___________________________________________Resultados e Discussão
123
88.0 84.0 80.0 76.0 72.0 68.0 64.0 60.0 56.0 52.0 48.0 44.0 40.0
4.7.3 Identificação estrutural da fração MNICL5F’
A substância MNICL5F’ apresentou grandes cristais incolores, de alta
polaridade, sendo solúveis somente em água. Esta substância foi analisada por
1
H
RMN e
13
C RMN, e baseados nos dados espectroscópicos pôde-se identificá-la com
o poliol sorbitol. A Figura 4.7.17 representa o espectro de
1
H RMN da substância
isolada.
Observou-se no espectro de
1
H RMN sinais característicos do sorbitol
(Figura 4.7.19) os multipletos na região entre 3.68 ppm e 3.90 ppm são atribuídos
aos hidrogênios carbinólicos. Já o espectro de
13
C RMN (Figura 4.7.18) apresentou
somente três sinais de carbonos em 63,1; 69,4 e 71 ppm, referentes aos carbonos
carbinólicos. A existência de apenas três sinais de
13
C decorre da existência de um
centro de simetria.
Figura 4.7.17.
Espectro de
1
H RMN de MNICL5F’ (D
2
O) em 400 MHz
Figura 4.7.18.
Espectro de
13
C RMN de MNICL5F’ (D
2
O) em 200 MHz
HO
OH
OH
OH
OH
OH
Figura 4.7.19. Estrutura química do sorbitol
___________________________________________Resultados e Discussão
124
4.8 Comparação do perfil metabólico de NICL5 em diferentes
meios de cultura
Desde a descoberta das citocalasinas na década de 70, verificou-se
um crescimento extraordinário no estudo desta classe de substâncias, pois elas se
tornaram um potente instrumento na biologia molecular e na medicina, devido ao
grande número de atividade biológica que lhes são pertinentes (SCHÜMANN e
HERTWECK, 2007, EVIDENTE et al., 2003). Podem-se enumerar as atividades: no
transporte de glicose, na secreção dos hormônios da paratireóide,
imunossupressora, inibição da polimerização da actina, antibiótica, antiviral,
antifúngica, herbicida (PRASAIN et al., 2002, OVERY et al., 2003, MATESIC et al.,
2006, MILLS et al., 2000, FOISSNER et al., 2007). Algumas citocalasinas são
conhecidas pela intrínseca capacidade de interromper o crescimento celular, sendo,
por tanto, uma poderosa ferramenta contra o desenvolvimento de tumores
(VEDERAS, et al., 1975, YWANAMOTO, et al., LIU, et al., 2006, SCHÜMANN e
HERTWECK, 2007).
Nesse contexto a compreensão da química de microrganismos e a
otimização da produção de metabólitos secundários se mostram mais uma vez
indispensáveis. No sentido de contribuir para o entendimento da química de
microrganismos e a conseqüente produção de metabólitos secundários, avaliou-se,
por CLAE/UV, a produção da Citocalasina D em diferentes meios de cultura, como
arroz, milho de canjica, Czapeck enriquecido com 2% de extrato de levedura, extrato
de soja e BD.
Após o inóculo do microrganismo NICL5 acompanhou-se, dia a dia, o
crescimento fúngico. O microrganismo apresentou um bom crescimento da massa
micelial em todos os meios de cultivo destacando-se o meio BD, pois houve o
crescimento de corpos de frutificação, como pode ser visto na Figura 4.8.1.
___________________________________________Resultados e Discussão
125
Figura 4.8.1.
Crescimento do fungo endofítico NICL5 em diferentes meios de cultura: (A) Arroz, (B)
Milho, (C) Extrato de Soja, (D) Czapeck + 2% extrato de levedura, (E) BD e
(F) corpos de frutificação produzidos no meio BD
Inicialmente foi estudado o perfil cromatográfico da Citocalasina D e,
em seguida, compararam-se os perfis cromatográficos dos extratos com a
substância de interesse. Através da Figura 4.8.2A pôde-se verificar que a
Citocalasina D apresentou tempo de retenção de 22,26 min e, o espectro de
absorção no ultravioleta mostrou o máximo de absorção em 221 e 285 nm.
A comparação dos cromatogramas da Citocalasina D e dos extratos
obtidos a partir de EtOH dos diferentes meios de cultivo, indicou a presença da
desta substância somente nos meios arroz, milho e Czapeck. Embora não se tenha
constatado a presença da Citocalasina D nos meios de soja e BD, não se pode
afirmar, que o fungo NICL5 não a produziu, uma vez que, em baixíssimas
concentrações esta não seria detectada pelo detector de ultravioleta.
Já os extratos obtidos a partir de AcOEt apresentaram o mesmo
comportamento dos extratos obtidos com EtOH, ou seja, a detecção da Citocalasina
D ocorreu somente nos meios de cultivo arroz, milho e Czapeck enriquecido com
extrato de levedura, conforme ilustra a Figura 4.8.3.
Infelizmente não foi possível verificar quantitativamente qual dos meios
de cultivo estudados seria o melhor produtor de Citocalasina D. Este fato deverá ser
analisado em trabalho posterior.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
___________________________________________Resultados e Discussão
126
Figura 4.8.2.
Perfil da produção de Citocalasina D em diferentes meios de cultura dos extratos
obtidos a partir de EtOH (cromatogramas monitorados em = 221 nm): (A) Citocalasina D em 22,26
min, (B) Arroz, (C) Milho, (D) Czapeck + 2% de extrato de levedura, (E) BD e (F) extrato de soja
Minutes
5 10 15 20 25 30
mAU
0
1000
2000
3000
Spectrum at time 22.26 min.
nm
250 300 350 400
22.26 min / Smth
Minutes
10 15 20 25 30
mAU
0
500
1000
Spectrum at time 22.66 min.
nm
200 250 300 350 400
22.66 min / Smth
Minutes
10 15 20 25 30
mAU
0
500
1000
Spectrum at time 22.52 min.
nm
250 300 350 400
22.52 min / Smth
Minutes
5 10 15 20 25 30
mAU
0
500
1000
Spectrum at time 22.83 min.
nm
200 250 300 350 400
22.83 min / Smth
Minutes
5 10 15 20 25 30
mAU
0
250
500
750
Minutes
10 15 20 25 30
mAU
0
250
500
750
(A)
(B)
(C)
(D)
(E) (F)
___________________________________________Resultados e Discussão
127
Figura 4.8.3 Perfil da produção de Citocalasina D em diferentes meios de cultura dos extratos obtidos
a partir de AcOEt (cromatogramas monitorados em = 221 nm): (A) Citocalasina D em 22,26 min, (B)
Arroz, (C) Milho, (D) Czapeck + 2% extrato de levedura, (E) BD e (F) Extrato de Soja
Minutes
5 10 15 20 25 30
mAU
0
1000
2000
3000
Spectrum at time 22.26 min.
nm
250 300 350 400
22.26 min / Smth
Minutes
10 15 20 25 30
mAU
0
250
500
750
Spectrum at time 22.73 min.
nm
200 250 300 350 400
22.73 min / Smth
Minutes
10 15 20 25 30
mAU
0
250
500
750
Spectrum at time 22.51 min.
nm
250 300 350 400
22.51 min / Smth
Minutes
10 15 20 25 30
mAU
0
500
1000
1500
Spectrum at time 22.76 min.
nm
200 250 300 350 400
22.76 min / Smth
Minutes
10 15 20 25 30
mAU
0
250
500
750
Minutes
5 10 15 20 25 30
mAU
0
250
500
750
(B)
(C)
(D)
(E) (F)
(A)
___________________________________________Resultados e Discussão
128
4.9 Efeito da adição de aminoácidos no metabolismo do fungo
NICL5
As citocalasinas são substâncias de origem biossintética mista, a qual
envolve uma unidade de aminoácido (fenilalanina, ou triptofano, ou leucina) e uma
cadeia policetídica. As substâncias provenientes do aminoácido fenilalanina são
denominadas citocalasinas e zigosporinas, já aquelas que envolvem o aminoácido
triptofano são conhecidas como citocalasinas e caetoglobosinas e as oriundas do
aminoácido leucina são as aspocalasinas. A Figura 4.9.1 ilustra algumas
citocalasinas de origem biossintética diferentes.
HN
O
O
O
O
OH
CITOCALASINA A
HN
O
O
O
O
HN
N
O
H
O
OHO
O
CAETOGLOBOSINA A
ASPOCALASINA A
Figura 4.9.1. Citocalasinas provenientes dos aminoácidos fenilalanina, triptofano e leucina,
respectivamente
Como já mencionado neste trabalho, a composição do meio de cultura
afeta diretamente a produção de metabólitos secundários. Poucos estudos relatam o
efeito da adição de aminoácidos livres ao meio de cultura. No entanto, FILL (2007)
verificou a indução da biossíntese de metabólitos secundários através da
suplementação de aminoácidos ao meio de cultivo. De acordo com GRAF et al., e
VEDERAS et al. (1974, 1975, 1976, respectivamente) as citocalasinas (Citocalasinas
D, C e Q), isoladas nesse trabalho, possuem origem biossintética baseada no
aminoácido fenilalanina.
___________________________________________Resultados e Discussão
129
O primeiro experimento envolvendo o microrganismo NICL5 e a
conseqüente produção de citocalasinas consistiu no cultivo do fungo em meio
Czapeck enriquecido com extrato de levedura. Com base em informações do
fabricante desse suplemento, constatou-se que, este é composto basicamente por
aminoácidos, inclusive os aminoácidos precursores das citocalasinas.
Com a finalidade de se investigar o comportamento do metabolismo do
microrganismo frente à adição de aminoácidos, foi realizado um estudo empregando
o meio Czapeck como base e variando-se o aminoácido. Dessa forma, o fungo foi
cultivado em seis diferentes meios de cultura, os quais foram:
- Czapeck;
- Czape4ck enriquecido com 2% de extrato de levedura;
- Czapeck com alanina;
- Czapeck com fenilalanina;
- Czapeck com tirosina;
- Czapeck com triptofano.
O primeiro resultado desse estudo foi o intrigante desenvolvimento do
microrganismo, pois, somente no meio Czapeck enriquecido com 2% de extrato de
levedura o microrganismo apresentou um bom crescimento micelial. Nos demais
meios o desenvolvimento da massa fúngica foi muito restrito, conforme pode ser
visualizado na Figura 4.9.2.
Figura 4.9.2. Crescimento do fungo NICL5 em diferentes meios de cultivo: (A) Czapeck, (B) Czapeck
com 2% de extrato de levedura, (C) Czapeck com alanina, (D) Czapeck com fenilalanina, (E) Czapeck
com tirosina e (F) Czapeck com triptofano
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
___________________________________________Resultados e Discussão
130
Após 20 dias de cultivo foram obtidos os extratos, os quais foram
analisados por CLAE/EM. Surpreendentemente, a análise dos cromatogramas de
íons totais apresentou uma série de bandas cromatográficas em todos os extratos
provenientes dos diferentes meios de cultura, como pode ser observado na Figura
4.9.3.
O extrato obtido a partir do meio Czapeck enriquecido com extrato de
levedura foi considerado como experimento padrão, dado que foi através dele que
as Citocalasinas C, D e Q foram isoladas.
Figura 4.9.3. Cromatograma de íons totais dos extratos provenientes dos diversos meios de cultura
Czapeck
Czapeck
+
ext. levedura
Czapeck
+
alanina
Czapeck
+
fenilalanina
Czapeck
+
tirosina
Czapeck
+
triptofano
___________________________________________Resultados e Discussão
131
Primeiramente foi analisada a capacidade de o microrganismo produzir
as Citocalasinas de m/z 508 (Citocalasinas C, D, E) nos meios de cultura estudados.
Através do cromatograma de íons selecionados a m/z 508, Figura 4.9.4, pôde-se
constatar a produção da Citocalasina D (tr = 12,83 min) em todos os extratos. O
mesmo não foi observado para a Citocalasina com tempo de retenção em 16,73 min
no extrato suplementado com o aminoácido tirosina, indicando uma provável
inibição da biossíntese desta substância.
Figura 4.9.4. Cromatograma de íons selecionados a m/z 508
O estudo da fragmentação da Citocalasina D, realizado no item 4.7.1.1
mostrou que a porção referente ao aminoácido fenilalanina possuía íon
característico de m/z 120. Aplicando o mesmo raciocínio para as demais
citocalasinas provenientes de outros aminoácidos e com base no trabalho de
PRASAIN et al., foram monitorados os íons de m/z 44, 86, 120, 150, 185; para
verificar se ocorreu a produção de citocalasinas originada da alanina, leucina,
fenilalanina, tirosina e triptofano, respectivamente. A Figura 4.9.5 mostra as
estruturas dos íons monitorados.
Czapeck
Czapeck +
ext. levedura
Czapeck +
alanina
Czapeck +
fenilalanina
Czapeck +
tirosina
Czapeck +
triptofano
___________________________________________Resultados e Discussão
132
HO
NH
2
NH
2
NH
2
NH
2
N
HN
O
H
m/z 44 m/z 86
m/z 185m/z 136
m/z 120
Figura 4.9.5.
Estruturas dos íons monitorados no experimento de íons precursores
As citocalasinas isoladas, neste trabalho, foram provenientes do cultivo
do microrganismo NICL5 em meio Czapeck enriquecido com extrato de levedura.
Dessa forma, foi verificado se houve a produção de outras citocalasinas
biossintetizadas a partir do aminoácido fenilalanina no referido meio. Para isso,
foram processadas, uma a uma, as bandas cromatográficas do TIC (do extrato
Czapeck com extrato de levedura) e, através deste monitoramento foram detectadas
outras seis substâncias. Estas foram correlacionadas à classe das citocalasinas uma
vez que apresentaram o íon de m/z 120 nos respectivos espectros de íons produtos,
e confirmadas através do experimento de íons precursores de m/z 120. A Tabela
4.9.1 apresenta informações das substâncias detectadas.
Tabela 4.9.1 Citocalasinas detectadas no meio Czapeck enriquecido com extrato de levedura
Tempo de retenção (min)
m/z [M+H]
+
m/z [M+Na]
+
7,95
8,84
9,61
11,56
12,20
13,82
482
524
482
466
524
466
504
546
504
488
546
488
De acordo com pesquisa realizada na base de dados Science Finder
foram encontradas cinco citocalasinas com massa molecular de 465 Da (desacetil
Citocalasina C, Citocalasina Z7, Citocalasina Z8, Citocalasina Z9 e Zigosporina D),
uma citocalasina de massa molecular 481 Da (desatil 19,20 Citocalasina D) e três
com massa molecular 523 Da (19,20 Epoxicitocalasina C, Citocalasina N e
Citocalasina R).
___________________________________________Resultados e Discussão
133
Pelo experimento de íons precursores de m/z 120, monitoraram-se,
nos demais extratos, a produção das citocalasinas originadas a partir da fenilalanina,
conforme representa a Figura 4.9.6. A análise do cromatograma indicou que os
meios Czapeck com extrato de levedura e Czapeck com fenilalanina foram os meios
mais ricos em citocalasinas, pois houve maior detecção de precursores do íon de
m/z 120.
Um fato interessante que merece ser destacado foi a produção de uma
substância com tempo de retenção 21,04 minutos, que não havia sido detectada no
meio Czapeck enriquecido com extrato de levedura. Através do espectro de full scan
(Figura 4.9.7A) constatou-se que o pico base deve ser o íon molecular protonado,
[M+H]
+
, de m/z 492, devido a presença de [M+Na]
+
de m/z 514, desse modo, o
composto em questão deve apresentar massa molecular de 491 Da. Já no espectro
de íons produtos (Figura 4.9.7B), notou-se o fragmento característico da fenilalanina
de m/z 120. Pelo experimento de íons precursores ficou confirmado que o fragmento
pertence à substância estudada. Esta substância pode ser uma citocalasina inédita,
dado que, em pesquisa bibliográfica não se encontrou membros desta classe com a
massa molecular observada.
Figura 4.9.6.
Cromatograma do experimento de íons precursores de m/z 120 em diferentes meios de
cultura: (A) Czapeck, (B) Czapeck com extrato de levedura, (C) Czapeck com alanina, (D) Czapeck
com fenilalanina, (E) Czapeck com tirosina e (F) Czapeck com triptofano
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
___________________________________________Resultados e Discussão
134
Figura 4.9.7.
Espectros de massas da substância em 21,01 min: (A) full scan, (B) íons produtos de
m/z 492 e (C) íons precursores de m/z 120
Observou-se a possível indução da biossíntese de uma citocalasina
formada pelo triptofano, pois, através do experimento de íons precursores de m/z
185, íon característico da porção deste aminoácido, foi constatada uma banda em
27,20 minutos no meio de cultivo Czapeck enriquecido com triptofano, conforme
pode ser visto na Figura 4.9.8F.
Figura 4.9.8.
Cromatograma do experimento de íons precursores de m/z 185 em diferentes meios de
cultura: (A) Czapeck, (B) Czapeck com extrato de levedura, (C) Czapeck com alanina, (D) Czapeck
com fenilalanina, (E) Czapeck com tirosina e (F) Czapeck com triptofano
(A)
(B)
(C)
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
___________________________________________Resultados e Discussão
135
O espectro de massas, (Figura 4.9.9A) referente à banda em 27,20
min, apresentou pico base de m/z 403 e, devido à presença dos adutos de sódio e
potássio de m/z 425 e 441 respectivamente, pode-se atribuir o pico base como
sendo o íon molecular protonado. O espectro de íons produtos de m/z 403 e íons
precursores de m/z 185 (Figura 4.9.9B/C) mostraram claramente o íon característico
da porção do triptofano nas citocalasinas, indicando a possível incorporação do
deste aminoácido.
Figura 4.9.9. Espectros de massas da substância em 27,20 min do extrato Czapeck enriquecido com
triptofano: (A) full scan, (B) íons produtos de m/z 403 e (C) íons precursores de m/z 185
Com exceção do cromatograma de íons totais do extrato proveniente
do meio Czapeck enriquecido com extrato de levedura, foi observado, nos demais
cromatogramas, a presença de uma banda com tempo de retenção entre 11,22 min,
a qual não foi relacionada com a classe da citocalasina, dado que o seu espectro de
massas no full scan apresentou íon molecular protonado de m/z 256 (FIGURA
4.9.10A), uma relação massa carga muito inferior àquelas observadas para as
citocalasinas. Esta observação foi comprovada pelo experimento de íons produtos
de m/z 256, pois nenhum dos íons característicos da referida classe foi observado
(FIGURA 4.9.10B).
Para os demais extratos n
ão foram observados indícios da
incorporação dos aminoácidos alanina, tirosina.
(A)
(B)
(C)
___________________________________________Resultados e Discussão
136
Figura 4.9.10. (A) espectro de massas no full scan da banda cromatográfica com tr de 11,22 min e,
(B) espectro de íons produtos de m/z 256 obtidos com 10 eV
A espectrometria de massas se mostrou uma ferramenta fantástica na
detecção de citocalasinas em extratos sem nenhum tratamento prévio, permitiu a
observação da possível indução da biossíntese de outras citocalasinas de m/z 492,
derivada da fenilalanina e de m/z 403 originada a partir do triptofano.
4.10 Caracterização e isolamento de biflavonóides de
Cupressus lusitanica
No sentido de se contribuir com o estudo da química de C. lusitanica,
foi explorado o extrato etanólico de suas folhas. Inicialmente foi realizada
cromatografia clássica de bancada empregando coluna SEPHADEX LH-20.
Durante o monitoramento por CCD das frações provenientes da coluna
SEPHADEX LH-20, constatou-se que diversas frações apresentavam uma
característica interessante, uma banda de cor amarela.
As análises por CLAE/UV das frações PECL116, PECL122, PECL132,
PECL150 e PECL 68 sugeriram a presença de biflavonóides, devido à absorção
característica no espectro no ultravioleta.
O método apolares 2 apresentou melhores resultados analíticos, uma
vez que os compostos foram eluídos entre 8 e 20 minutos de corrida, já no método
(A)
(B)
___________________________________________Resultados e Discussão
137
polares 21 os compostos foram detectados no fim da análise, como pode ser
observado na Figura 4.10.1. Verificou-se para as frações PECL150 e PECL168 a má
separação das bandas cromatográficas, resultado este diretamente relacionado à
força da fase móvel. Salienta-se que o método apolares 2 apresentou melhor
resolução, pois observou-se bandas bem separadas e simétricas (Figura 4.10.1).
Deve-se ressaltar que, embora na placa de CCD tenha se observado
apenas uma banda de cor amarela, a ocorrência de mais de um biflavonóide, nas
folhas de C. lusitanica, foi confirmada, uma vez que, os cromatogramas das frações
PECL132, PECL150 e PECL168 apresentaram bandas com espectro de absorção
no ultravioleta idênticos, nos tempos de retenção 8,70 min, 11,17 min, 16, 30 e 20,04
min.
Para confirmação da presença de biflavonóides nas frações PECL,
submeteu-se a fração PECL170, por ter apresentado em CCD somente duas
bandas, a novo processo cromatográfico, utilizando-se cromatografia clássica de
bancada com fase estacionária ODS, na qual foi obtida uma substância de cor
amarela, denominada de PECL170A. Por CCD verificou-se a presença de uma única
banda indicando, dessa forma, uma boa separação. As análises por
1
H RMN e por
Espectrometria de Massas relacionaram a substância a classe dos biflavonóides.
___________________________________________Resultados e Discussão
138
Figura 4.10.1.
Cromatogramas das frações PECL116, PECL122, PECL132, PECL150 e PECL168
obtidos no método polares 21, com detector a 320 nm
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
500
1000
1500
2000
mAU
0
500
1000
1500
2000
Spectrum at time 45.89 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 46.48 min.
nm
225 250 275 300 32 5 350
Spectrum at time 47.60 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Sp ectrum at time 48 .53 min.
nm
22 5 25 0 2 75 30 0 32 5 35 0
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
250
500
750
1000
mAU
0
250
500
750
1000
Spectrum at time 46.05 min.
nm
225 250 275 300 325 350
PECL116
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
1000
2000
3000
4000
0
1000
2000
3000
4000
Spectrum at time 45.93 min.
nm
225 250 275 300 325 350
PECL122
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
1000
2000
3000
4000
mAU
0
1000
2000
3000
4000
Spectrum at time 45.93 min.
nm
225 250 275 300 32 5 350
Spectrum at time 48.50 min.
nm
225 250 275 300 325 350
PECL132
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
1000
2000
3000
4000
mAU
0
1000
2000
3000
4000
Spectrum at time 46.08 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 46.77 min.
nm
22 5 250 275 3 00 325 350
Spectrum at time 47.69 min.
nm
225 250 275 3 00 325 35 0
Spectrum at time 48.53 min.
nm
225 250 275 300 325 350
PECL150
PECL168
___________________________________________Resultados e Discussão
139
Figura 4.10.2.
Cromatogramas das frações PECL116, PECL122, PECL132, PECL150
e PECL168 obtidos no método apolares 2, com detector a 320 nm
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
200
400
600
mAU
0
200
400
600
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
500
1000
1500
2000
mAU
0
500
1000
1500
2000
Spectrum at time 3.46 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 8.70 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
500
1000
1500
0
500
1000
1500
Spectrum at time 3.46 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 8.70 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 19.83 min.
nm
225 250 275 300 32 5 350
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
1000
2000
3000
mAU
0
1000
2000
3000
Spectrum at time 8.81 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 11.17 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 3.46 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 16.30 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 20.04 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 3.46 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 8.70 min.
nm
225 250 275 300 325 350
PECL122
PECL1
50
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
250
500
750
1000
0
250
500
750
1000
Spectrum at time 8.59 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 10.63 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 14.06 min.
nm
225 250 275 300 325 350
PECL116
PECL132
Spectrum at time 3.25 min.
nm
225
250
275
300
325
350
___________________________________________Resultados e Discussão
140
O espectro de
1
H RMN, apresentado na Figura 4.10.3, forneceu
deslocamentos químicos característicos de hidrogênios aromáticos em 7,14 ppm
(2H, J= 8,8 Hz), 7,55 ppm (2H J= 8,8 Hz), 7,48 ppm (2H J= 9,2 Hz) e também
deslocamentos de hidrogênios ligados a carbono com hidridização sp
2
em 6,38 ppm
(s) e 6,47 ppm (s). Verificou-se também um singleto largo em 8,46 ppm. Embora
tenha se observado a existência de uma única banda em CCD, observou-se no
espectro de
1
H RMN uma mistura de substâncias.
Figura 4.10.3.
Espectro de RMN
1
H de PECL170A (400 MHz-MeOD)
A análise por CL/EM empregando fonte ionização por eletrospray no modo
negativo foi de grande importância na identificação dos biflavonóides, dado que, o
cromatograma de íons selecionados (m/z 537) da substância PECL170A,
apresentou duas bandas cromatográficas com tempos de retenção próximos a 30,0
e 33,0 minutos (Figura 4.10.4), indicando a presença dos isômeros Amentoflavona e
Cupressoflavona de massa molecular 538 Da.
Figura 4.10.4. Cromatograma de íons selecionados m/z 537
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
8.0
7.5 7.0 6.5
Bi-flavonoide
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
45.00
50.00
55.00
60.00
%
0
LSA_1_LC_FSN Sm (Mn, 4x2) 1: Scan ES-
537 0.10Da
5.01e7
30.11
___________________________________________Resultados e Discussão
141
Notou-se, pelos espectros de full scan dos isômeros, que o método
analítico adotado foi de grande eficiência, uma vez, que foram detectados somente
os íons moleculares protonados, como observado na Figura 4.10.5.
Figura 4.10.5. Espectros de full scan no modo negativo de PECL170A
Moléculas de mesma massa molecular podem exibir o mesmo espectro
de massas no full scan, contudo a diferenciação destas pode ser realizada com o
experimento de íons produtos, uma vez que, este fornece maiores informações
estruturais.
Os espectros de íons produtos foram obtidos empregando-se energia
de colisão de 25 eV.
O simples estudo dos espectros de íons produtos não foi
suficiente para identificar os compostos fenólicos, amentoflavona e cupressoflavona,
devido a grande semelhança dos íons fragmentos produzidos. No entanto, quando
ampliou-se os espectros, constatou-se, claramente, diferenças relevantes, as quais
forneceram informações estruturais capazes de identificar estes biflavonóides. A
Figura 4.10.6 mostra os espectros de íons produtos ampliados 8 e 10 vezes nos
intervalos de 90 a 360 e 440 a 520 respectivamente.
Bi-flavon oide
m /z
150
175
200
225
25 0
275
300
325
35 0
375
40 0
425
450
475
50 0
525
550
575
600
%
0
100
%
0
100
LS A_ 1_LC _F SN 12 86 (3 2.98 5) Sm (M n , 4 x1.00); C m (1255:1 304-(1323 :13 51+1 208:12 35)) 1 : S can E S-
6.31e6
53 7.3
LS A_ 1_LC _F SN 11 72 (3 0.06 1) Sm (M n , 4 x1.00); C m (1159:1 185-(1203 :12 35+1 099:11 38)) 1 : S can E S-
2.05e7
53 7.3
___________________________________________Resultados e Discussão
142
Figura 4.10.6.
Espectros de íons produtos ampliados 8 e 10 vezes nos intervalos de massas de 90 a
360 e 440 a 520 respectivamente
Ambos os espectros de íons produtos apresentaram o mesmo pico base
com m/z 375 e muitos outros fragmentos idênticos, no entanto, no espectro (A)
verificou-se a presença de íons de relação massa/carga que não foram observados
em (B).
Com base nos espectros de íons produtos e do conhecimento das
estruturas dos biflavonóides, foram propostos esquemas de fragmentações
(Esquema 4.10.1 e Esquema 4.10.2). A partir de reações de retro Diels-Alder dos
íons moleculares deprotonados dos compostos fenólicos, justificou-se alguns
fragmentos que permitiram, em um primeiro momento, relacionar os espectros (A) e
(B) aos biflavonóides cupressoflavona e amentoflavona respectivamente. Ressalta-
se, porém, que o estudo ainda não foi concluído e, que outros experimentos devem
ser implementados a fim de se conhecer o mecanismo de fragmentação destes
compostos.
Extrato - Acetato
m/z
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
%
0
100
%
0
100
LSA_2_LC_DIcc 39 (32.688) Sm (Mn, 4x1.10); Cm (5:64-69:79) 5: Daughters of 537ES-
1.80e5
x8 x10375.3
331.2
117.2
93.3
159.2
151.2
203.1
161.2
307.3
333.3
374.4
343.1
417.3
399.3
401.3
443.3
451.1
537.2
LSA_2_LC_DIbb 38 (30.162) Sm (Mn, 4x1.10); Cm (28:61-9:18) 8: Daughters of 537ES-
8.06e5
x8 x10375.2
117.1
93.1
331.2
159.0
257.1
203.1
161.0
255.1
213.0
307.2
281.1
279.2
299.2
333.2
374.3
347.2
417.2
399.2
401.2
443.2
537.2
451.3
(A)
(B)
___________________________________________Resultados e Discussão
143
Esquema 4.10.1.
Proposta de fragmentação para a Amentoflavona
m/z 537
O
O
HO
OH O
OH
OH
O
HO OH
OHO
OH O
OH
HO OH
m/z 375
OH
O
O
m/z 537
O
O
HO
OH O
OH
OH
O
HO OH
OHO
OH O
OH
HO OH
m/z 161
OH
O
O
m/z 537
O
O
HO
OH O
OH
OH
O
HO OH
m/z 151
O
O
OH
HO
O
OH
OH
OH OH
O
m/z 537
O
O
HO
OH O
OH
OH
O
HO OH
m/z 117
OH
O
O
HO
OH O
OH
HO O H
O
___________________________________________Resultados e Discussão
144
Esquema 4.10.2.
Proposta de fragmentação para a Cupressoflavona
O
O
OH
HO
HO
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
OH
HO
HO
OH O
OH
m/z 375
m/z 537
O
O
OH
HO
HO
OH
O
O
OH
OH
m/z 213
m/z 537
OH
HO
HO
OH
OH
O
O
2
O
O
OH
HO
HO
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
OH
HO
HO
OH O
OH
m/z 161
m/z 537
O
O
OH
HO
HO
OH
O
O
OH
OH
OH
m/z 117
O
O
OH
HO
HO
OH
O
OH
O
m/z 537
O
O
OH
HO
HO
OH
O
O
OH
OH
m/z 257
m/z 537
O
O
OH
HO
HO
OH
OH
OH
O
O
___________________________________________Resultados e Discussão
145
A espectrometria de massas mostrou-se uma ferramenta fundamental
neste trabalho, pois esta detectou não apenas os biflavonóides amentoflavona e
cupressoflavona, mas também seus derivados metilados observados no
cromatograma de íons selecionados a m/z 551 e nos espectros de massas
processados para este íon (Figura 4.10.7). A detecção destes compostos corrobora
com o verificado nos espectros de UV dos cromatogramas das frações PECL 132,
PECL150 e PECL 168.
Figura 4.10.7.
(A) Cromatograma de íons selecionados a m/z 551 e (B) seus respectivos espectros
de massas.
4.11 Monitoramento de biflavonóides nos extratos de
Cupressus lusitanica e Araucaria angustifolia por CLAE/UV
É muito bem estabelecida a função protetora dos flavonóides e
biflavonóides nas interações entre plantas e insetos, no entanto, nas interações
Extrato - Acetato
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00
%
0
LSA_2_LC_FSNa Sm (Mn, 4x2) 1: Scan ES-
551 0.10Da
3.71e6
36.46
LSA_2_LC_FSNa Sm (Mn, 4x2)
1: Scan ES-
E xtra to - Ac eta to
m /z
15 0
17 5
20 0
22 5
25 0
27 5
30 0
32 5
35 0
37 5
40 0
42 5
45 0
47 5
50 0
52 5
55 0
57 5
60 0
%
0
10 0
%
0
10 0
LS A _2 _L C_ F SNa 1 4 97 (3 8.1 64 ) S m (M n , 4 x1 .00 ); Cm (14 91 :152 0-(1 53 3:1 56 5+ 14 5 7:1 48 1)) 1 : S ca n E S -
1.04 e 655 1 .3
1 5 7 . 0
2 4 9 .2
LS A _2 _L C_ F SNa 1 4 31 (3 6.4 82 ) S m (M n , 4 x1 .00 ); Cm (14 18 :145 1-(1 46 6:1 48 6+ 13 3 3:1 40 5)) 1 : S ca n E S -
1.29 e 6
55 1 .3
3 3 5 .4
(A)
(B)
___________________________________________Resultados e Discussão
146
planta e fungos alguns estudos apontam os biflavonóides e flavonóides como sendo
fungicidas naturais (PIRRONI e HEIMLER, 1991), o que vem de encontro com a
produção de composto fenólicos através do caminho biossintético que usa a enzima
fenilalanina amônia-liase (PAL, do inglês “phenylalanine ammonia-lyase”), cuja
estimulação é frequentemente apontada como conseqüência da interação com
fitopatógenos (GUNATILAKA, 2006).
Assim como observado em Cupressus lusitanica, há relatos da
amarelidão e ressecamento das folhas de Araucaria angustifolia e, estes sintomas
podem estar relacionados com a infestação de microrganismos. Em trabalho iniciado
em nosso grupo de pesquisas, foram isolados fungos desta conífera e estes
aparentemente são semelhantes com aqueles isolados de Cupressus lusitanica.
Os extratos botânicos de Cupressus lusitanica e Araucaria angustifolia
obtidos pelos modos de extração A, B e AB foram denominados CLA, CLB e CLAB e
AA, AB e AAB, respectivamente. A partir das análises dos extratos pôde-se
constatar a presença de biflavonóides tanto nos extratos de Cupressus lusitanica
como nos extratos de Araucaria angustifolia e, também, escolher o melhor método
de extração e monitoramento dos biflavonóides.
Baseando-se nos dados da literatura (INNOCENTI et. al., 2007), de
que os biflavonóides possuem absorção característica no ultravioleta entre 330 nm,
foi possível constatar a presença desta classe de compostos nos extratos das folhas
de Cupressus lusitanica e de Araucaria angustifolia, pois mais de uma banda
cromatográfica apresentou absorção neste comprimento de onda. As Figuras 4.11.1
e 4.11.2 mostram os cromatogramas referentes aos extratos foliares de ambas as
plantas.
A Figura 4.11.1 mostra os cromatogramas obtidos para os três
métodos de extração. O método B mostrou-se eficaz na extração dos compostos
fenólicos da Araucária, uma vez que, o cromatograma a 323 nm apresentou diversas
bandas com espectros no UV muito semelhante aos dos biflavonóides
amentoflavona e cupressoflavona (
máx
272, 328 nm e 269, 338 nm respectivamente
(INNOCENTI et. al., 2007)) . O método AB mostrou-se satisfatório, embora a
quantidade de bandas cromatográficas relacionadas aos biflavonóides seja menor
quando comparadas àquelas do método B. Já o método A não foi adequado, uma
vez que, apenas um espectro no UV mostrou-se similar ao dos biflavonóides de
referência.
___________________________________________Resultados e Discussão
147
Figura 4.11.1. Cromatogramas a 323 nm e espectros no UV dos extratos de Araucaria angustifolia
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
20
40
60
80
100
mAU
0
20
40
60
80
100
Spectrum at time 9.29 min.
nm
225 250 275 300 325 350
9.29 min
Spectrum at time 15.87 min.
nm
225 250 275 300 325 350
15.87 min
Spectrum at time 16.68 min.
nm
225 250 275 300 325 350
16.68 min
Spectrum at time 17.94 min.
nm
225 250 275 300 325 350
17.94 min
Spectrum at time 19.08 min.
nm
225 250 275 300 325 350
19.08 min
Spectrum at time 48.26 min.
nm
225 250 275 300 325 350
48.26 min
A
A
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
50
100
150
200
250
mAU
0
50
100
150
200
250
Spectrum at time 8.25 min.
nm
225 250 27 5 300 325 350
8.25 min
Spectrum at time 10.19 min.
nm
225 250 275 300 325 350
10.19 min
Spectrum at time 11.33 min.
nm
225 250 275 300 325 350
11.33 min
Spectrum at time 12.74 min.
nm
225 250 275 300 325 350
12.74 min
Spectrum at time 15.25 min.
nm
225 250 275 300 325 350
15.25 min
Spectrum at time 16.84 min.
nm
225 250 275 300 325 350
16.84 min
AB
Spectrum at time 13.65 min.
nm
225 250 275 300 325 350
13.65 min
Spectrum at time 17.87 min.
nm
225 250 275 300 325 350
17.87 min
Spectrum at time 18.53 min.
nm
225 250 275 3 00 325 350
18.53 min
Spectrum at time 3.72 min.
nm
225 250 275 300 325 350
Spectrum at time 22.08 min.
nm
200 225 250 275 300 325 350
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
50
100
150
0
50
100
150
Spectrum at time 24.32 min.
nm
200 2 25 250 275 300 325 350
Spectrum at time 39.07 min.
nm
280 300 320 340 360
AAB
___________________________________________Resultados e Discussão
148
Observou-se na Figura 4.11.2, para o extrato das folhas de C. lusitanica,
que o cromatograma referente ao método de extração B, apresentou apenas 2
bandas cromatográficas com tempos de retenção e espectro de absorção no
ultravioleta semelhante aos biflavonóides cupressoflavona e amentoflavona. Já o
cromatograma referente ao método AB mostrou maior quantidade de bandas
cromatográficas e espectros no UV característicos dos biflavonóides, indicando a
possibilidade da presença de outros contituintes fenólicos. Apesar da existência de
várias bandas cromatográficas no cromatograma relacionado ao método A, os seus
respectivos espectros no UV não correspondem às absorções características dos
biflavonóides.
A fim de se verificar a existência de novos biflavonóides e suas
respectivas elucidações estruturais, foram enviados ao Instituto Max Plank, na
Alemanha, extratos das folhas de C. lusitanica e de Araucária angustifolia, bem
como alíquotas das frações PECL116, PECL122, PECL132, PECL150 e PECL168,
os quais deveriam ser analisados por CLAE/RMN. Até o presente momento
nenhuma informação a respeito destas análises foi obtida.
___________________________________________Resultados e Discussão
149
Figura 4.11.2. Cromatogramas a 323 nm e espectros no UV dos extratos de C. lusitanica
Minutes
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
50
100
0
50
100
Spectrum at time 24.31 min.
nm
260 280 300 320 340 360
Spectrum at time 25.09 min.
nm
260 280 300 320 340 360
Spectrum at time 26.28 min.
nm
260 280 300 320 340 360
Spectrum at time 27.01 min.
nm
260 280 300 320 340 360
Spectrum at time 29.07 min.
nm
260 280 300 320 340 360
Spectrum at time 29.80 min.
nm
280 300 320 340 360
Sp ectrum at tim e 30.2 5 m in.
nm
2 6 0 28 0 30 0 320 34 0 3 60
CLAB
Minute s
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
200
400
600
800
mAU
0
200
400
600
800
Spectrum at time 8.13 min.
nm
225 250 275 300 3 25 350
8.13 min
Spectrum at time 9.33 min.
nm
225 250 275 300 325 3 50
9.33 min
Spectrum at time 16.34 min.
nm
225 250 275 300 325 350
16.34 min
Spectrum at time 17.07 min.
nm
225 250 275 300 325 3 50
17.07 min
Spectrum at time 19.33 min.
nm
225 250 275 300 3 25 350
19.33 min
Spectrum at time 20.58 min.
nm
225 250 275 300 325 350
20.58 min
Minute s
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
mAU
0
200
400
600
800
mAU
0
200
400
600
800
Spectrum at time 8.67 min.
nm
200 225 250 275 300 325 350
8.67 min
Spectrum at time 10.61 min.
nm
200 225 250 275 300 325 350
10.61 min
CLB
CLA
___________________________________________Resultados e Discussão
150
4.12 Ensaios Biológicos
4.12.1 Ensaio de inibição fúngica
De acordo com as pesquisas reportadas na literatura, a interações
entre plantas e fungos endofíticos nem sempre são simbiônticas, pois estes podem
ser patógenos em estado de latência (referencia na introdução).
Baseando no fato de que os compostos fenólicos muitas vezes são
produzidos para atuarem no mecanismo de defesa das plantas, estudou-se o efeito
dos extratos hexânico, etanólico e de uma fração rica em biflavonóides, todos
provenientes de Cupressus lusitanica contra os fungos endofíticos NICL3, NICL4 e
NICL5, também isolados de C. lusitanica.
O experimento foi acompanhado dia a dia. Contudo, não se observou
inibição do crescimento fúngico frente aos constituintes químicos de C. lusitanica,
como pode ser observado na Figura 4.12.1.
Figura 4.12.1.
Ensaio antifúngico. Da esquerda para a direita: PHCL, PECL e Bifl
NICL4
NICL5
NICL3
___________________________________________Resultados e Discussão
151
4.12.2 Ensaio para detecção de metabólitos secundários bioativos
Como os fungos endofíticos são potentes fontes de metabólitos
bioativos, foram realizados ensaios biológicos, visando a inibição do
desenvolvimento bacteriano.
As bactérias ensaiadas foram Bacillus subtilis, bactéria gram positiva
que não patogênica, porém, similar a Bacillus cereus, que é responsável por
diarréias, náuseas e vômitos e, contra às bactérias gram negativas Escherichia coli,
Staphylococus aureus e Micrococus lutheus.
Os extratos etanólico (extratos M) e particionado com acetato de etila
(extratos P) de todos os microrganismos endofíticos, isolados de Cupressus
lusitanica, bem como uma fração rica em Citocalasina D foram ensaiados, contudo,
estes não tiveram nenhum efeito antagônico contras as bactérias, como pode ser
observado na Figura 4.12.2.
Figura 4.12.2. Ensaio de inibição bacteriana; (A) E. coli, (B) B. subtilis, (C) S. aureus, (D) M. lutheus
(A/2)
(
M/A
)
(P/A
)
(P/B
)
(M/B
)
(P/C)
(M/C)
CC
(P/D
)
(M/D
)
___________________________________________Resultados e Discussão
152
4.12.3 Ensaio Citotóxico
As linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435 (mama - humano), HCT-
8 (cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano), foram cedidas pelo Instituto
Nacional do Câncer (EUA).
Os experimentos foram analisados segundo a média ± desvio padrão
da média (DPM) da porcentagem de inibição do crescimento celular usando o
programa GraphPad Prism.
A Tabela 4.12.1 apresenta a atividade citotóxica das amostras com
seus respectivos percentuais de inibição. Apenas as substâncias que apresentarem
valores de inibição ≥ 90 % em pelo menos duas linhagens tumorais são escolhidas
para avaliações subseqüentes, valor esse considerado como cut-off para o
screening de novas substâncias com potencial antitumoral.
Tabela 4.12.1. - Percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três linhagens
tumorais. Valores são média ± DPM.
Amostras SF-295 HCT-8 MDA/MB-435
Média DPM Média DPM Média DPM
PNICL1 33,42 6,68 12,94 3,94 17,29 4,44
PNICL2 33,12 1,32 11,65 0,68 9,67 15,65
PNICL3 23,00 0,24 25,45 4,32 9,46 0,84
PNICL4 35,65 0,00 20,75 3,71 7,21 10,99
PNICL5 76,68 1,26 88,92 0,15 9,46 0,84
PECL 41,73 0,18 52,45 12,96 19,51 0,52
PHCL 13,23 4,94 13,85 2,72 18,87 21,36
MNICL5B45 70,23 0,36 75,37 0,07 24,69 19,03
Doxorubicina 88,13 1,74 93,09 0,37 87,41 0,31
Pela Tabela 4.12.1 somente o extrato PNICL5 e a fração MNICL5B45,
rica em Citocalasina D, apresentaram atividade citotóxica, no entanto, os valores das
respectivas atividades mostraram-se inferiores ao do controle. Este fato não foi bem
compreendido, dado que as citocalasinas, inclusive a Citocalasina D, são providas
de uma marcante atividade citotóxica.
__________________________________________________Considerações Finais
153
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Foram isolados cinco microrganismos endofíticos das folhas de
Cupressus lusitanica, sendo que os dois microrganismos estudados são
pertencentes ao gênero Xylaria (NICL3 e NICL5).
A técnica de CG/EM mostrou-se relevante, pois permitiu a detecção de
isocumarinas e de um sesquiterpeno eremofilano nos extratos de NICL3 e também
do ácido pilifórmico nos extratos de NICL5. A detecção destes compostos está de
acordo com o descrito na literatura, pois estes metabólitos são característicos de
microrganismos do gênero Xylaria.
O fungo endofítico NICL3 mostrou-se um hábil produtor de
sesquiterpenos eremofilanos. Destacando-se duas estruturas inéditas na literatura.
O microrganismo NICL5 apresentou peculiaridades morfológicas muito
interessantes, o desenvolvimento de corpos de frutificação. Além desta
peculiaridade, foi constatada uma inerente capacidade de produção de citocalasinas,
dentre as quais as Citocalasinas C, D e Q, que foram isoladas por CLAE preparativa
e identificadas por RMN e EM.
A técnica de CLAE/UV foi responsável pela detecção da Citocalasina D
nos meios de cultivo Czapeck enriquecido com 2% de extrato de levedura, Arroz e
Milho, porém a determinação do melhor meio produtor desta substância deverá ser
implementada em trabalhos futuros.
O emprego da técnica de CLAE/EM foi de fundamental importância no
desenvolvimento deste trabalho, pois permitiu a detecção de outras citocalasinas
nos extratos provenientes do meio Czapeck com extrato de levedura, além de
detectar uma possível indução da biossíntese de uma citocalasina originada a partir
do aminoácido triptofano.
Os microrganismos estudados não apresentaram, segundo a
identificação preliminar, correlação com aqueles que são patógenos a Cupressus
lusitanica. Embora nenhum deles tenha produzido, em meio artificial, os diterpenos
que são tóxicos à planta, não se exclui a possibilidade de o microrganismo utilizar
estrategicamente os diterpenos produzidos pela planta e toxificá-los através de um
sistema enzimático oxidativo, dado que o fungo NICL3 produziu metabólitos
bastante oxigenados.
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__________________________________________________Considerações Finais
154
Foram obtidos extratos hexânico e etanólico das folhas de C.
lusitanica. Através de análises por CG/EM foram detectados vários diterpenos no
extrato hexânico. Já o extrato etanólico, em análises preliminares, mostrou-se rico
em compostos fenólicos, destacando-se as biflavonas amentoflavona e
cupressoflavona e seus respectivos análogos metilados. A presença destes
compostos possivelmente é uma resposta da planta contra a infestação de
fitopatógenos, pois estes são produzidos pelo caminho biossintético que usa a
enzima fenilalanina amonialiase (PAL) cuja estimulação é freqüentemente apontada
como conseqüência da interação com fitopatógenos.
Assim como em C. lusitanica, observou-se que Araucaria angustifolia
também apresenta amarelidão e ressecamento das folhas e, as análises por
CLAE/UV mostraram a presença de biflavonóides, indicando, desse modo, a
possibilidade de ambas as plantas serem infectadas por fitopatógenos semelhantes.
Neste primeiro trabalho envolvendo os microrganismos endofíticos de
C. lusitanica, não foram constatadas atividades biológicas relevantes nos extratos
fúngicos, porém tal fato não desmerece o estudo da química destes microrganismos.
_____________________________________Referências Bibliográficas
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