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ANDRÉ MACEDO VALE
ESTUDOS SOBRE O IMPACTO DA LIMITAÇÃO
GENÉTICA DA DIVERSIDADE VDJ NO REPERTÓRIO
DE IMUNOGLOBULINAS NATURAIS
Orientador: Prof. Alberto Nóbrega
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Rio de Janeiro - RJ
Maio – 2009
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ii
ESTUDOS SOBRE O IMPACTO DA LIMITAÇÃO
GENÉTICA DA DIVERSIDADE VDJ NO REPERTÓRIO
DE IMUNOGLOBULINAS NATURAIS
ANDRÉ MACEDO VALE
Tese apresentada ao Departamento de
Imunologia do Instituto de Microbiologia
Professor Paulo de Góes, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Doutor em Ciências (microbiologia).
Orientador: Prof. Alberto Nóbrega
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iii
iv
Vale, André Macedo
Estudos sobre o impacto da limitação genética da diversidade VDJ no
repertório de imunoglobulinas naturais / André Macedo Vale - Rio de Janeiro,
IMPPG / UFRJ, 2009.
xii, 236f.:Il., 31 cm.
Orientador: Alberto Nóbrega
Tese (doutorado) - UFRJ / Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes /
Programa de Pós-graduação em Ciências (Microbiologia), 2009.
Referências bibliográficas: f. 172 - 185
1. Biologia dos linfócitos B 2.Repertório de Imunoglobulinas 3.Anticorpos
naturais. I. Nóbrega, Alberto. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto
de Microbiologia Prof. Paulo de Góes / Programa de Pós-graduação em Ciências
(Microbiologia). III - Título
v
“Eu quase que nada não sei. Mas desconfio de
muita coisa.”
"Natureza da gente não cabe em nenhuma certeza."
“(…) o real não está na saída nem na chegada: ele
se dispõe para a gente é no meio da travessia.”
Riobaldo (João Guimarães Rosa)
vi
À Euclídia e ao Marco Antônio (
in memoriam
)
Agradecimentos
Ao Prof. Alberto Nóbrega, por me receber em seu laboratório e pelas
facilidades concedidas ao longo desenvolvimento deste trabalho. Pela
idealização do trabalho, pela orientação, discussões, ensinamentos e apoio
incondicional. Pelo exemplo de dedicação à ciência e humildade.
Ao Dr. Harry Schroeder Jr, pela co-orientação e sugestões fundamentais para
o desenvolvimento do trabalho. Por me receber em seu laboratório durante o
estágio no exterior. Ao Dr John Kearney por disponibilizar seu laboratório e
pelas sugestões. Ao Dr. Schelonka pelas discussões e ao Dr. Yingxin pelos
ensinamentos. Ao Dr Peter Burrows por disponibilizar seu laboratório.
À Profa. Maria Bellio, pelas discussões e sugestões durante o desenvolvimento
do trabalho.
Ao Prof Nelson Vaz, Dr Juan Lafaille e Dr José Mengel, por participarem da
banca examinadora desta tese.
Aos professores Marcelo Bozza, Elvira Saraiva, Ligia Peçanha e Ulisses Lopes,
que disponibilizaram os respectivos laboratórios e facilidades para a realização
de parte dos experimentos.
A todos do Laboratório de Imunofisiologia: Elize, Luciana, Alessandra, Ana
Carolina, Sr Emílio, Wiliam e Márcio.
A todos da UAB, que de alguma forma me ajudaram no desenvolvimento desse
trabalho. Em especial à amiga Teresa Santiago, por tudo que fez e tem feito por
mim, e ao amigo e colaborador Jeremy Foote.
À Profa Wanda e à Dra. Letícia Nery do Instituto de Biofísica da UFRJ e ao
Prof Alfredo Góes e Dr. Bernardo Reis da UFMG pela inestimável ajuda nos
experimentos de proteômica.
Às pessoas que me apresentaram ao Prof Alberto Nóbrega e possibilitaram
minha vinda para o Laboratório de Imunofisiologia: Prof Nelson Vaz, Profa. Ana
viii
Maria Faria e Dr. Adolfo Silva Neto. Aos amigos Jones e Archimedes por me
manter “conectado” a essas pessoas.
À minha mãe, Euclídia, a quem eu dedico este trabalho. Pelo exemplo de
dedicação e por ter me concedido todas as condições necessárias para minha
formação acadêmica e pessoal. Pela ajuda direta na revisão do texto.
Em memória do meu pai Marco Antônio, que com toda certeza me acompanhou,
acompanha e sempre me acompanhará...
A todos meus familiares em especial meus irmãos e companheiros, Marco
Antônio Jr., Paulo Henrique (Rita) e Daniela (Fernando e Bia), pelo apoio,
compreensão e carinho.
À Renata Meireles, com quem pretendo começar uma nova etapa da minha vida,
pelo amor, companheirismo, dedicação e paciência. Também pelas discussões
científicas e ajuda em experimentos que possibilitaram a realização deste
trabalho. A toda sua família, em especial ao Dr. José Augusto Adler Pereira
pela contribuição com os extratos de bactérias.
A todos da família “Pimenta Marques Teixeira”, em especial à Telinha, por terem
me acolhido no Rio de Janeiro e possibilitarem o início e o desenvolvimento
dessa etapa da minha vida.
A todas pessoas, cujos nomes não foram citados aqui mas são sempre
lembrados, e que de alguma forma tornaram este trabalho possível.
Às agências de fomento CAPES e CNPq.
ix
SUMÁRIO
RESUMO..........................................................................................................................
xi
ABSTRACT......................................................................................................................
xii
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................
1
1.1. A geração da diversidade das imunoglobulinas..................................................
1
1.1.1. Os loci de cadeia pesada e leve das imunoglobulinas................................
2
1.1.2. A geração da diversidade das Igs através da recombinação V(D)J.........
4
1.2. A recombinação VDJ durante as etapas de desenvolvimento dos linfócitos B
8
1.3. A entrada das células recém formadas no “pool” periférico, a manutenção
da homeostase e a formação repertório......................................................................
12
1.3.1 A seleção do repertório de imunoglobulinas...............................................
17
1.3.2. A compartimentalização do repertório disponível....................................
20
1.4. Os linfócitos B1 e o repertório de imunoglobulinas naturais.............................
23
1.4.1. As imunoglobulinas naturais.......................................................................
25
1.4.2. A análise global do repertório de imunoglobulinas naturais....................
27
1.5. A restrição na diversidade do CDR-H3...............................................................
28
1.6. O modelo D
H
transgênico para o estudo da formação do repertório de Igs.....
33
2. OBJETIVOS.................................................................................................................
39
3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................
41
3.1. Animais, células e soros.........................................................................................
41
3.2. ELISA para detecção e dosagem de IgM............................................................
42
3.3. Análise do repertório de especificidades..............................................................
43
3.4. Isolamento de linfócitos B e expansão policlonal in vitro...................................
47
3.5. Análise do repertório genético de CDR-H3........................................................
49
3.6. Eletroforese bidimensional e proteômica............................................................
51
3.7. Método rápido e quantitativo para o estudo do repertório de Ig.....................
52
3.8. Análises estatísticas................................................................................................
56
4. RESULTADOS............................................................................................................
58
4.1. Impacto da limitação genética do CDR-H3 no repertório de especificidades
de imunoglobulinas naturais séricas...........................................................................
58
4.1.1. O repertório de Igs naturais se mantém substancialmente conservado
com poucas diferenças marcantes.........................................................................
59
4.1.2. Evidências da participação dos linfócitos B1 na produção das Igs
naturais que reconhecem uma proteína de 70kDa no extrato de cérebro.........
63
4.1.3. As IgM naturais que reagem com a proteína de 70kD no extrato de
cérebro, presente no soro de animais BALB/c WT são produzidas por
linfócitos B1a...........................................................................................................
67
4.1.4. As IgM naturais que reagem com a proteína de 70kD no extrato de
cérebro, são produzidas mesmo na ausência de microbiota autóctone.............
71
4.2. Obtenção da sequência de aminoácidos do autoantígeno dominante presente
no extrato de cérebro para o qual a reatividade de anticorpos naturais foi
alterada pela limitação genética do repertório...........................................................
73
4.3. Caracterização dos genes V(D)J de um clone de linfócitos B1a secretante da
IgM que reage com a HSC70 no imunoblot...............................................................
77
4.3.1 Nova metodologia para a descrição rápida e quantitativa do repertório
de imunoglobulinas.................................................................................................
78
x
4.3.1.1. A combinação de diferentes ligantes de Toll pode elevar a
frequência de clones respondedores a aproximadamente 100%,
independente do “background” genético do camundongo.........................
79
4.3.2. Determinação da frequência de clones de linfócitos B1a que
apresentam a reatividade com HSC70..................................................................
82
4.3.3. Culturas de clonagem de linfócitos B: a quantidade de IgM obtida da
expansão de um clone é suficiente para a determinação da especificidade.......
84
4.3.4. Culturas de clonagem e “one-step” RT-PCR são eficientes na obtenção
de transcritos de imunoglobulinas de plasmócitos originados de um único
clone de célula B......................................................................................................
86
4.3.5. Sequência completa dos genes V(D)J de cadeia pesada de Ig de um
clone de linfócito B1a que reconhece a proteína HSC70.....................................
89
4.4. O impacto da limitação genética no repertório disponível de
imunoglobulinas e as características do CDR-H3 nas subpopulações de
linfócitos B da cavidade peritoneal..............................................................................
91
4.4.1 O impacto da restrição genética do CDR-H3 no repertório de
especificidades das subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal........
92
4.4.1.1. Frequência de clones secretantes de IgM e padrão de resposta ao
estímulo por LPS in vitro das diferentes subpopulações de linfócitos B
da cavidade peritoneal....................................................................................
93
4.4.1.2. O repertório disponível de reatividades em imunoblot de extrato
autólogo de cérebro das subpopulações de linfócitos B da cavidade
peritoneal .........................................................................................................
97
4.4.2 Análise do repertório de CDR-H3 nas subpopulações de linfócitos B da
cavidade peritoneal.................................................................................................
104
4.4.2.1 A utilização dos genes VH nas populações B1a, B1b e B2 nos
diferentes grupos de camundongos................................................................
105
4.4.2.2 A utilização dos genes JH nas populações B1a, B1b e B2 nos
diferentes grupos de camundongos................................................................
111
4.4.2.3 A utilização dos genes D nas populações B1a, B1b e B2 dos
camundongos WT, o uso do D transgênico nos animais !D-DFL e !D-iD
e o quadro de leitura do D utilizado..............................................................
111
4.4.2.4 A utilização de aminoácidos no CDR-H3 nas populações B1a,
B1b e B2 dos camundongos WT, !D-DFL e !D-iD.....................................
116
4.4.2.5 O aparecimento de uma população hidrofóbica entre os linfócitos
B1a dos camundongos !D-iD.........................................................................
119
4.4.2.6 Comprimento do CDR-H3, perda de nucleotídeos “germline” e
inserção de nucleotídeos N nas junções VDJ nas diferentes populações
de linfócitos B dos animais WT, !D-DFL e !D-iD.......................................
122
5. DISCUSSÃO.................................................................................................................
129
6. CONSIDERÇÕES FINAIS.........................................................................................
164
7. CONCLUSÕES............................................................................................................
167
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................
172
9. APÊNDICES................................................................................................................
187
10. ANEXOS.....................................................................................................................
197
10.1 Anexo I - manuscrito 1: Fast and Quantitative Method for the Description
of Immunoglobulin Repertoires..................................................................................
198
10.2 Anexo II - manuscrito 2: Genetic Control of B Cell Response to LPS:
Differential Effects in Distinct B cell Subpopulations...............................................
217
xi
RESUMO
Para avaliar o impacto da limitação genética do rearranjo VDJ no repertório de
imunoglobulinas naturais (NAbs), analisamos o repertório de especificidades de IgM
sérica de camundongos !D-iD geneticamente modificados para a expressão de um
único segmento D
H
transgênico (DSP2.2 invertido inserido na posição do DFL16.1),
que codifica aminoácidos carregados no quadro de leitura principal (RF1). Como
controle nós utilizamos os camundongos !D-DFL (depletados para o locus D
H
, com
apenas um segmento gênico DFL16.1) e camundongos BALB/c (WT). Utilizando a
análise global do repertório por imunoblot com milhares de antígenos de órgãos
singênicos e de E. coli, nós observamos uma substancial homologia no perfil de
especificidades de IgM desses camundongos congênicos, sugerindo um papel da seleção
somática na conservação do repertório de NAbs. Entretanto, uma especificidade
particular no extrato de cérebro foi observada somente no perfil de IgM dos
camundongos WT. A reatividade com esse antígeno, identificado como HSC70 (uma
proteína do choque térmico de expressão constitutiva), estava ausente nos perfis de IgM
sérica dos camundongos transgênicos. Utilizando soros de quimeras RAG-/-
reconstituídas com medula óssea ou fígado fetal de camundongos WT e !D-iD, soros de
camundongos transgênicos e nocautes para TdT e ainda sobrenadantes de cultura das
subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal, nós mostramos que clones de
linfócitos B1a utilizando rearranjos sem sequências N são os produtores das IgM que se
ligam à HSC70 no imunoblot. Esses dados foram confirmados pelo sequenciamento da
IgH de um clone de linfócito B1a reativo à HSC70, o qual utiliza os genes V
H
Ox-1-
DQ52-J
H
2, sem a adição de nucleotídeos N. Em conjunto esses dados sugeriram a
existência de mecanismos operando para a “normalização” do repertório de NAbs
desses animais transgênicos, como a geração de rearranjos alternativos. Por outro lado,
a ausência da reatividade com a HSC70 nos animais transgênicos sugeriu que a seleção
somática não consegue operar no repertório B1a formado por células que expressam
rearranjos “germline” comprometidos pela mutação !D-iD. Para testar essas hipóteses
analisamos o repertório disponível de especificidades a partir de sobrenadantes de
culturas de linfócitos B1a, B1b e B2 no imunoblot de extrato de cérebro e analisamos
também o repertório de CDR-H3 dessas populações da cavidade peritoneal de cada
grupo de camundongo. Nossos estudos indicaram que as sequências codificadas pelo
RF1 do gene D, de uma forma geral, determinam o uso dos aminoácidos no CDR-H3
dos animais !D-iD e !D-DFL e apesar disso, o repertório disponível de especificidades
é substancialmente semelhante entre os diferentes grupos, apesar de apresentarem
algumas diferenças marcantes. De forma surpreendente, a reatividade com a HSC70
estava presente no repertório disponível de linfócitos B1a dos camundongos !D-iD, nós
então apresentamos uma possível explicação para a ausência dessa especificidade no
soro. Assim, nossos dados mostraram que o repertório de NAbs é mantido conservado
nos camundongos transgênicos, apesar do uso preferencial do CDR-H3 transgênico, e
que o impacto da limitação genética parece ter consequências diretas somente em uma
fração menor do repertório em que há uma exigência para determinados rearranjos
“germline” que somente podem ser gerados cedo na ontogenia dos linfócitos B em um
organismo que tenha a diversidade completa dos genes que codificam as regiões
variáveis de imunoglobulinas.
ABSTRACT
To evaluate the impact of the genetic restriction of the VDJ rearrangement on
the natural immunoglobulin repertoire (Nabs), we have analyzed serum IgM repertoire
of !D-iD mice, genetically engineered to homozygous expression of a single D segment
(inverted DSP2.2 inserted into DFL16.1), which encodes highly charged amino acid
sequence on the predominant reading frame RF1. We have used !D-DFL (depleted D
H
locus with single DFL16.1 gene segment) and wild type BALB/c mice (WT) as
controls. Using a binding assay based on an improvement of the immunoblot with
thousands of antigens of whole syngenic tissues and E. coli extracts, we have observed a
substantial IgM repertoire homology among these congenic mice, supporting a role for
antigen driven somatic selection of a conserved NAb repertoire in !D-iD mice.
However, a particular specificity in the brain extract was observed only in the serum
IgM profile from WT mice. That reactivity, later identified as HSC70 (an heat shock
constitutive protein 70kD), was absent in the serum IgM profiles from !D-iD and !D-
DFL mice. Analysing the immunoblot reactivity profiles of serum IgM from RAG-/-
bone marrow and fetal liver chimeras, sera from TdT transgenic and TdT knockout
mice, and also peritoneal B cell culture supernatants, we showed that B1a cells lacking
N-sequences are the responsible for the HSC70 reactivity. These data were confirmed
by the isolation of B1a clone anti-HSC70 and the IgH sequencing, revealing the V
H
Ox-
1-DQ52-J
H
2 genes usage, without N insertions. Together, those results may suggest that
selection for NAb secreting plasmocytes could rescue a population of B cell clones in
genetically engineered animals to generate NAbs. These clones secreting NAbs may
have altered the reading frame and gene sequence of germline encoded single D element
to produce a VDJ rearrangement more similar to wild type animals. On the other hand,
the absence of HSC70 reactivity on the transgenic mice profile indicates that somatic
selection is not able to select this specificity from B1a cells generated in !D-iD mice,
probably because these animals could not generate a germline encoded dominant
clonotype necessary for this specificity. To address this issue, we have analyzed the
available repertoire of IgM specificities on immunoblot brain extract, using B1a, B1b
and B2 culture supernatants, and also we analyzed the CDR-H3 sequences from those
peritoneal B cells in each mouse group. Our studies indicate, in general, that the
sequence of D
H
RF1 establishes CDR-H3 amino acid usage and despite that, the
available repertoires of specificities are substantially similar between the different
groups, but they had some differences. Strikingly, the HSC70 reactivity was present in
the available repertoire of B1a lymphocytes from "D-ID mice, and a possible
explanation for the lack of this specificity in the serum is proposed. Thus, our data
showed that the repertoire of natural antibodies is maintained essentially preserved in
the transgenic mice, despite the preferential use of the transgenic CDR-H3. In addition,
the impact of the D-limited gene usage seems to directly influence only a minor fraction
of the repertoire in which there is a requirement for certain germline rearrangements
that can only be generated early in B lymphocyte ontogeny in the organism.
1. INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
Os mecanismos que geram a diversidade de imunoglobulinas são mais bem
entendidos que os processos dinâmicos que criam e modulam o repertório funcional
de linfócitos B periféricos. Este repertório parece ser resultado de um processo que
opera durante a maturação e recrutamento destes linfócitos para os órgãos linfóides
periféricos, influenciado provavelmente, pela expressão de imunoglobulinas e outras
moléculas na superfície destes linfócitos assim como por ligantes endógenos ainda
não identificados. Alguns aspectos da geração da diversidade, do desenvolvimento
dos linfócitos B, bem como da formação do repertório periférico serão expostos
adiante para o melhor entendimento dos objetivos do presente trabalho
1.1. A geração da diversidade das imunoglobulinas
Os linfócitos B derivam de células-tronco hematopoiéticas, localizadas
primariamente nos tecidos hematopoiéticos - fígado fetal e medula óssea - por um
complexo conjunto de eventos de diferenciação que ainda são parcialmente
entendidos. As imunoglobulinas, receptores de células B (BCR), produzidas pelos
linfócitos B possuem duas cadeias polipeptídicas pesadas (H) e duas leves (L). Em
camundongos e humanos as cadeias IgH e dois tipos de cadeias IgL, ! e ", são
codificadas por múlitplos genes agrupados em famílias. Cada uma das cadeias é
constituída por um, três ou quatro domínios constantes (C) de aproximadamente 110
aminoácidos, que determinam as funções efetoras, e por um domínio variável (V), que
codifica o sítio de ligação de antígenos (Kirkham and Schroeder, 1994). Os domínios
carboxiterminais das IgH e IgL possuem sequências de aminoácidos conservadas e
são codificadas por sequências “gemline”, enquanto que a maior variabilidade na
2
sequência de aminoácidos está no domínio aminoterminal da região V, que é
codificada por segmentos gênicos descontínuos denominados V (variável), D
(diversidade) e J (junção), que são unidos por um processo conhecido por
recombinação V(D)J (Hozumi and Tonegawa, 1976; Tonegawa, 1983).
1.1.1. Os loci de cadeia pesada e leve das imunoglobulinas
Os loci de IgH, Ig! e Ig" estão localizados em diferentes cromossomos. Os
loci de imunoglobulinas de humanos e camundongos compartilham certas
semelhanças na organização geral, mas algumas diferenças significantes, que podem
ter ocorrido há mais de 70 milhões de anos ao longo da evolução exerceram efeitos
que podem ser observados na composição final do repertório expresso (Schroeder,
2006). A organização geral dos genes no locus de imunoglobulina de camundongos
(modelo do nosso trabalho) serão introduzidos aqui.
Entre as diferentes linhagens de camundongos, existe uma variação no número
e nas sequências dos segmentos gênicos de IgH. O locus de IgH dos camundongos
BALB/c é um dos mais bem caracterizados e está no cromossomo 12, contém mais de
150 segmentos agrupados em 15 famílias (Lefranc, 2003). Os membros das famílias
VH5 (7183) e VH2 (Q52) são os mais próximos aos segmentos D e J
H
, enquanto que
a família V
H
1 (J558) é a maior e mais distante dos segmentos D e é responsável por
mais de 50% do repertório ativo. O tamanho dessa família ainda não está
completamente definido, variando muito nas diferentes linhagens de camundongos. O
genoma dos camundongos BALB/c contém 13 segmentos gênicos D e quatro J
H
,
enquanto que os camundongos C57BL/6 contêm 101 V
H
, nove DH e quatro
segmentos JH (Schroeder, 2006). Os segmentos D dos camundongos BALB/c estão
agrupados em quatro famílias, DFL, que consiste nos genes DFL16.1 e DFL16.2; a
3
família DSP, que é constituída por 8 elementos, e as famílias DST e DQ52, que são
constituídas por apenas um único gene cada, o DST4 e o DQ52, respectivamente.
Apesar de os genes da família DSP serem os mais abundantes no repertório maduro, o
segmento gênico DFL16.1 é o gene individual mais utilizado, o mais longo com 23
nucleotídeos e é o mais distante dos genes J
H
, enquanto que o segmento DQ52 é o
menor, com apenas 11 nucleotídeos, e fica justaposto ao elemento J
H
1. Os genes de
cadeia pesada C#, C$, C%1,2a,2b,3; C& e C' estão localizados à 3’ dos segmentos
VDJ e formam respectivamente as cadeias pesadas IgM, IgD, IgG e subtipos; IgE e
IgA.
O locus V! dos camunongos está localizado no cromossomo 6 e contém até 93
segmentos gênicos que podem ser agrupados em 18 famílias (Lefranc, 2003). O locus
J! contém cinco membros, mas um deles, o J! não é funcional. O locus ! possui
apenas um elemento C!, que codifica a região constante !. O locus " do camundongo
está no cromossomo 16 e contém apenas três genes V" e dois segmentos C", cada um
associado a um elemento J". A menor contribuição do locus " para o repertório
“germline” é coerente com a redução em pelo menos oito vezes da prevalência de Ig"
no soro de camundongos em relação a Ig!. As cadeias IgH podem também formar
complexos com uma cadeia leve " não convencional, denominada cadeia leve
substituta ((LC). Esses genes apresentam grande homologia com as Ig"
convencionais, a região constante "5 é formada por elementos semelhantes ao J" e C"
e por uma extensão de aminoácidos “extra” à 5’. A região variável, denominada
VpreB, contém um segmento semelhante a V" e uma extensão de aminoácidos 3’
(Martensson et al, 2002). A combinação IgM- (LC é somente expressa nas células
pré-B, durante o desenvolvimento dos linfócitos B, e por isso é chamada de pré-BCR.
4
1.1.2. A geração da diversidade das imunoglobulinas através da recombinação
V(D)J
A diversidade é assimetricamente distribuída na região variável (V) das
imunoglobulinas (Kirkham et al, 1992; Schroeder et al, 1990). Cada região V das IgH
e IgL contém três intervalos de hipervariabilidade denominados: regiões
determinantes de complementaridade (CDR1, CDR2 e CDR3). Os CDRs são
separados entre si por intervalos de sequências conservadas, denominadas
“framework regions” (FWRs). Os quatro FWRs da cadeia pesada (CH) e os quatro da
cadeia leve (CL) se dobram para formar a estrutura base que permite que os seis
CDRs fiquem próximos formando o sítio de ligação do antígeno (Figura 1).
A
B
Figura 1: O CDR-H3 desempenha o papel chave na diversidade do sítio de ligação do antígeno.
A) Os domínios variáveis das cadeias H e L são criados pelo rearranjo V(D)J e pela adição de
nucleotídeos N. A formação da região V da cadeia H está ilustrada. Devido a inclusão dos segmentos
gênicos D, a possibilidade de adição de nucleotídeos N e a grande flexibilidade no comprimento e na
composição da sequência de nucleotídeos, o CDR-H3 é a porção mais diversificada do repertório pré-
imune B) Desenho do sítio de ligação do antígeno visto de frente. Devido a sua localização central, a
maioria dos antígenos interagem com o CDR-H3 quando se ligam a imunoglobulina. (Figura retirada
de Schroeder, 2006).
Comparando as sequências de Ig de diferentes espécies ao longo da evolução
observa-se que a estrutura tri-dimensional do domínio V representa um gradiente de
diversidade. Os FWR2 e FWR4, os quais formam o centro hidrofóbico do domínio V,
são altamente conservados entre os diferentes domínios V de um mesmo tipo de
cadeia (L ou H) (Kirkham & Schroeder, 1994). Os FWR1s, que também são muito
5
conservados, possuem três formas básicas que identificam evolutivamente o grupo
(clan) de origem e os FWR3s definem a família da região V (Kirkham et al, 1992). O
FWR3 margeia o sítio de ligação do antígeno, tanto servindo de suporte como
limitando a forma do CDR2 e CDR3 (Figura 1B).
A três regiões determinantes de complementaridade de cada cadeia H e L são
responsáveis pela variabilidade das imunoglobulinas (Kirkham & Schroeder, 1994;
Padlan, 1994). O CDR3 das cadeias leves e pesadas são criados de novo pelo processo
de rearranjo V
L
!J
L
e V
H
!D!J
H
(Tonegawa, 1983), diferentemente dos CDRs 1 e 2
que são inteiramente codificados por segmentos gênicos “germline” V
H
e V
L
, os quais
são relativamente conservados entre as diferentes espécies de vertebrados
(Marchalonis et al, 2006). O CDR-L3 forma a base do sitio de ligação do antígeno e o
CDR-H3 se posiciona no centro do sitio de ligação, exercendo um papel fundamental
no reconhecimento dos antígenos (Padlan, 1994).
A recombinação V(D)J gera a diversidade através de dois mecanismos
distintos: a diversidade combinatória e a diversidade juncional (Lewis, 1994). Em
geral, cada combinação entre os diferentes segmentos gênicos V, (D) e J, codifica
diferentes polipeptídios com contribuições distintas para a especificidade ao antígeno.
A diversidade juncional se deve às junções imprecisas desses segmentos gênicos que
permite perda de nucleotídeos, mediada por enzimas exonucleases (Kenter & Tredup,
1991), bem como, ganho de sequências palindrômicas (junções P) (Lafaille et al,
1989) e adição de nucleotídeos N nas sequências terminais de V
H
, D e J
H
(Alt &
Baltmore, 1982) (Figura 1A). A enzima transferase desoxinucleotidil terminal (TdT)
catalisa a inserção de nucleotídeos N nesses sítios de junção, permitindo a inclusão de
sequências “nongermline” no CDR3 da cadeia pesada (Desiderio et al, 1984). Juntos,
esses mecanismos criam um repertório de CDR-H3 que varia de sequências intactas
6
“germline” até rearranjos onde não é possível identificar o segmento D original. A
grande diversidade disponível no CDR-H3 tem consequências funcionais, já que ele
se localiza no centro do sítio de ligação com o antígeno (Kabat et al, 1991; Xu &
Davis, 2000).
Esse complexo processo de rearranjo gênico é mediado por enzimas que são
codificadas pelos genes ativadores de recombinação 1 e 2 (RAG 1 e 2) (Schatz et al,
1989). As endonucleases RAG 1/2 reconhecem determinadas sequências de DNA
denominadas sequências sinalizadoras de recombinação (RSS) localizadas à 3’ de
cada segmento gênico V, à 5’ de cada segmento J e no caso da cadeia pesada, em
ambos os lados de cada segmento D. As RSS consistem em heptameros altamente
conservados (CACTGTG e CACAGTG) que ficam adjacentes ao segmento gênico a
ser rearranjado e nonâmeros (GGTTTTTGT e ACAAAAAACC) separados por um
espaçador. Os espaçadores podem ser compostos por 12 ou 23 nucleotídeos não
conservados, uma ou duas voltas da hélice de DNA, respectivamente, e posicionam os
heptameros e nonâmeros de forma em que ambos fiquem acessíveis às endonucleases
RAG. O rearranjo de um segmento flanqueado por RSS utilizando espaçador de 12
nucleotídeos (12-RSS) com um outro segmento flanqueado por espaçador de 23
nucleotídeos (23-RSS) é altamente favorecido. Na cadeia leve ! os genes V! estão
flanqueados por 12-RSS e os segmentos J! estão flanqueados por 23-RSS, enquanto
que na cadeia leve " ocorre o contrário, onde os genes V" estão justapostos ao 23-
RSS e os segmentos J" estão flanqueados por 12-RSS assim, em ambos os casos, o
rearranjo VJ é favorecido. Na cadeia pesada, tanto o segmento V
H
quanto o J
H
estão
flanqueados por RSS com espaçadores de duas voltas na hélice de DNA (23-RSS),
enquanto que os genes D estão flanqueados em ambos os lados por RSS com
espaçadores de 12 nucleotídeos. Desta forma, cada gene D permite que a célula B em
7
desenvolvimento tenha acesso a seis quadros de leitura (RFs) de diferentes sequências
“germline”, dependendo do processo de rearranjo D!J
H
, se por deleção, o mais
comum, ou por inversão (Solbach and Wu, 1995). Os rearranjos por deleção gerariam
as sequências mais usadas dos diversos segmentos D em três diferentes quadros de
leitura (RF1, RF2 e RF3) e os rearranjos por inversão, bem menos frequentes,
gerariam sequências alternativas nos quadros de leituras invertidos (iRF1, iRF2 e
iRF3) (Meek et al, 1989; Solbach and Wu, 1995). Na prática, desde os peixes
cartilaginosos até os camundongos e humanos as sequências codificadas por RF1,
geradas por deleção, dominam o repertório de células B maduras (Ichihara et al, 1989;
Ivanov et al, 2002). O RF1, de acordo com a nomenclatura proposta por Ichihara et al
(1989), é o quadro de leitura mais usado, que é tipicamente enriquecido para códons
de tirosina e glicina. Juntos, esses dois aminoácidos contribuem com
aproximadamente 40% da alça de CDR-H3 (Ivanov et al, 2002).
Tanto no camundongo quanto no homem, o efeito multiplicativo da
diversidade combinatória da cadeia pesada e leve permite um potencial combinatório
do repertório de aproximadamente 10
7
especificidades. Enquanto a diversidade
juncional permite um ganho potencial de mais de 10
8
variações juncionais. Juntos,
esses mecanismos fornecem o potencial de criar 10
15
diferentes sequências no sítio de
ligação do (Schroeder, 2006). Na realidade este número é uma representação teórica
da diversidade de BCRs que o sistema imune pode apresentar, que não condiz com a
diversidade expressa pelos linfócitos B presentes nos órgãos linfóides. Entretanto, a
produção diária destas células pela medula óssea possibilita que grande parte desta
diversidade fique disponível para a incorporação de novas especificidades no
repertório periférico, ou seja, na população celular circulante de longa duração. Desta
forma, o “pool” periférico pode ser considerado como um compartimento mantido em
8
estado de equilíbrio dinâmico, determinado pela taxa de renovação, meia-vida da
população celular (Agenès, Rosado & Freitas, 2000) e pelos processos que moldam o
repertório.
1.2. A recombinação VDJ durante as etapas de desenvolvimento dos linfócitos B
A sequência de eventos que levam a maturação dos linfócitos B em
camundongos será descrita aqui de acordo com as etapas de rearranjo dos genes de
imunoglobulinas e a formação dos receptores linfócitos B, dando ênfase aos pontos
em que os linfócitos B estariam mais sujeitos às pressões seletivas pelo BCR ou pré-
BCR (“checkpoints”), ou seja, determinadas etapas na diferenciação onde a seleção
somática parece atuar de maneira a moldar o repertório de imunoglobulinas dentro de
uma determinada série de características que são conservadas.
O desenvolvimento das células B ocorre no fígado fetal durante a gestação e
na medula óssea (BM) após o nascimento, e continua ao longo da vida, embora em
uma taxa reduzida com o aumento da idade (Hardy & Hayakawa, 2001). Em
camundongos, o desenvolvimento dos linfócitos B convencionais, a partir de
progenitores na medula óssea ocorre em uma série de eventos de acordo com a
expressão dos genes Ig e de marcadores celulares (Figura 2). Embora grandes avanços
tenham sido feitos para a elucidação da origem e diferenciação dos linfócitos B1
(Montecino-Rodriguez et al, 2006; Esplin et al, 2009), nós descreveremos aqui os
eventos da diferenciação dos linfócitos B convencionais para ilustrar o
desenvolvimento dos linfócitos B em geral. As peculiaridades dos linfócitos B1 serão
tratadas mais adiante.
A divisão proposta por Hardy et al. (1991) distingue as populações de
linfócitos B na medula óssea em frações de A a F de acordo com o rarranjo das
9
cadeias de Ig e com a expressão na superfície de CD43, CD24 e BP1 das células
B220
+
da medula óssea. Outros grupos diferenciaram as populações de células B na
medula óssea pelo tamanho das células e a expressão na superfície de c-kit, CD25 e
cadeia leve substituta (Melchers, 1995). Essas duas abordagens estão sumarizadas na
Figura 2.
Figura 2: Etapas do desenvolvimento de células B murinas na medula óssea definidas por dois
métodos distintos. Os estágios de desenvolvimento podem ser distinguidos pelo tamanho celular,
expressão de c-kit, cadeia leve substituta e CD25, de células pró-B/pré-BI para pré-BII, imatura e então
célula B madura (Melchers, 1995). Alternativamente, os estágios de desenvolvimento podem ser
classificados em frações de A a F de acordo com as etapas do rearranjo dos genes de cadeia pesada e
leve e expressão na superfície de CD43, CD24 e BP1 (Hardy et al, 1991). Os “checkpoints” ocorrem
no receptor pré-B e no BCR e então passam por uma etapa de “seleção” das células que irão compor o
repertório periférico. (Figura modificada de Miosge and Goodnow, 2005)
A formação do BCR no desenvolvimento das células B começa com o
rearranjo do locus IgH (Burrows et al, 2002). O rearranjo dos genes D
H
-J
H
ocorre
primeiro, começando quando a expressão dos genes RAG se inicia nos progenitores
linfóides comuns. Por isso o rearranjo D
H
-J
H
não é restrito da linhagem B, e junções
D
H
J
H
podem ser identificadas também em timócitos (Alt, 1984). O início do rearranjo
D
H
-J
H
na cadeia pesada define as células pró-B, se o rearranjo ocorrer de forma
10
produtiva em um dos alelos a célula passa para a próxima etapa de maturação. Nessas
etapas a enzima TdT também é expressa nessas células. Na próxima etapa, rearranjos
V
H
-D
H
J
H
“in-frame” permitem a produção da cadeia # citoplasmática, definindo as
células pré-B precoces. A associação da cadeia # com a cadeia leve substituta ((LC)
e com as proteínas transmembrana Ig' e Ig), que compõem o complexo de
sinalização, leva ao “desligamento” termporário da expressão e transcrição dos genes
RAG 1 e RAG 2 e à expressão do pré-BCR na membrana.
Nessa etapa a célula passa pelo primeiro “checkpoint”, onde somente as
células que conseguiram associar a cadeia # endógena rearranjada com o VpreB-"5
((LC) seriam capazes de passar para o próximo estágio. Em camundongos #MT, que
não há expressão Ig# na superfície, o desenvolvimento dos linfócitos B não vai
adiante dessa etapa, sugerindo que a sinalização através do pré-BCR é importante
para a continuação do processo de amadurecimento (Kitamura et al, 1991; Melchers
et al, 2000). O BCR não possui sítios catalíticos e, portanto, não tem a capacidade de
sinalização citoplasmática, sendo necessária a formação de um complexo com os
transdutores de sinais Ig' e Ig). A importância da associação da cadeia Ig# com o
heterodímero catalítico Ig' e Ig) na formação do complexo pré-BCR foi demonstrada
em camundongos deficientes em Ig), em que o desenvolvimento das células B não
passa no “checkpoint” do pré-BCR. Aproximadamente 75% das células morrem
durante essa etapa (Osmond, 1991).
As células que expressam o pré-BCR sofrem uma série de mitoses que são
dependentes da integração do sinal gerado através do pré-BCR e dos receptores de IL-
7 (Rolink et al, 2000). A proliferação nesses estágios não ocorre com a mesma
eficiência para todos os clones, como pode ser evidenciado pela preferencial expansão
de células com pré-BCR contendo regiões V
H
mais distantes dos segmentos D-J
H
11
(Ten Boekel et al, 1997). Alguns trabalhos sugerem que essa preferência para certos
segmentos V
H
reflete o melhor pareamento com cadeia leve substituta e em última
análise, a maior eficiência da montagem do BCR (Martensson et al, 2002). Assim,
poderia se esperar que uma maior estabilidade na associação SLC e Ig# resultaria em
um pré-BCR capaz de gerar sinais mais eficientes para o desenvolvimento e
sobrevivência. Esta interpretação parece estar correta, visto que mutações no CDR3,
que geram Ig# variantes que pareiam mal com SLC levando a uma redução da
expressão do pré-BCR, resultam em uma diminuição desses representantes no pool
periférico (Wang & Clarke, 2007, Wang et al, 2001).
Esse estágio de desenvolvimento das células pré-B, que é marcado por
repetidas séries de replicação e a redução do tamanho das células filhas, é
correspondente à fração C’ de Hardy (Figura 2). Nas células pré-B tardias, ocorre a
reativação da expressão dos genes RAG 1 e RAG 2 que permite o rearranjo da cadeia
leve, com o rearranjo V!-J! precedendo o rearranjo V"-J". A associação bem
sucedida da cadeia leve com a cadeia # endógena previamente rearranjada leva a
expressão da IgM de superfície, o receptor de célula B (BCR), o que define o estágio
de célula B imatura.
Nesse momento, a célula passa pelo segundo “checkpoint”, onde a interação
de alta afinidade com antígenos nesse estágio pode resultar na edição do receptor por
rearranjos repetidos na cadeia leve (Tiegs et al, 1993) ou em substituição do gene V
da cadeia pesada (“V
H
replacement”) (Zhang et al, 2004), ou ainda podem resultar em
anergia e até mesmo morte celular. Todos estes processos podem ser utilizados para
moldar o repertório dentro de características conservadas (Schelonka et al, 2007). Por
outro lado, a interrupção do funcionamento normal do BCR, também leva à morte das
células B, de forma rápida (Lam et al, 1997), demonstrando que as células B
12
necessitam de sinais de sobrevivência via BCR, ou sinais constitutivos e/ou através de
interações com ligantes, ainda não conhecidos (Freitas & Rocha, 2000). Desta forma,
diferenças entre o uso de genes V nas células imaturas na BM quando comparadas as
células maduras na periferia sugerem a idéia de uma “seleção positiva” (Freitas et al,
1989; Gu et al, 1991; Levine et al, 2000), dirigida por interações de baixa afinidade
com autoantígenos, que moldam o repertório definindo características comuns entre
diferentes indivíduos.
As células com moléculas de IgM que se enquadram nessas características
procedem ao “splicing” alternativo do locus C#-C$ e começam a coexpressar IgD em
suas superfíces, o que marca o estágio de células B maduras. As células B maduras
extinguem permanentemente a expressão de vários genes que foram importantes
durante os estágios iniciais do desenvolvimento. Entre os genes silenciados estão o
VpreB, o "5, RAG1, RAG2 e TdT (Zhang et al, 2004). A falha no silenciamento
desse genes pode ter consequências indesejáveis para a homeostase do sistema imune.
1.3. A entrada das células recém formadas no “pool” periférico, a manutenção
da homeostase e a formação repertório
Em um camundongo jovem, dos 2 x 10
7
linfócitos B IgM
+
que deixam
diariamente a medula óssea (BM), aproximadamente 5 a 10% chegam aos órgãos
linfóides secundários (Melchers et al., 2000; Hardy et al., 2000). A grande maioria
morre in situ ou logo após deixar a medula (Goodnow et al., 1995) e somente 1 a 3%
entram como células maduras no “pool” periférico (Lortan et al., 1987). A estimativa
do número total de células B que compõem o pool periférico de um camundongo é em
torno de 1,5 x 10
8
células (Sprent et al, 1994). Dessa maneira, estabelece-se no
organismo um vasto repertório de imunoglobulinas, distribuído de forma clonal entre
13
os linfócitos B, que expressam essas Igs na membrana plasmática (BCR) e podem vir
a secretá-las em grandes quantidades, na condição de plasmócitos. O repertório de Igs
pode ser classificado em emergente, disponível e atual. O repertório emergente é
composto pelas Igs presentes na membrana plasmática dos clones de linfócitos B
recém formados nos órgãos linfóides primários (fígado fetal e medula óssea). As Igs
presentes na membrana plasmática dos clones de linfócitos B presentes nos órgãos e
tecidos linfóides periféricos, constituem o repertório disponível. Por fim, os
plasmócitos secretantes das Igs presentes no soro e outros fluidos corporais,
constituem o repertório atual (Vaz, Martinez & Coutinho, 1984; Grandien et al,
1994).
As células B imaturas que emergiram da medula óssea (BM) entram no baço
pela artéria central, passando por etapas de maturação onde são chamadas de células
B de transição (Loder et al, 1999), e então se desenvolvem em células B maduras. O
tamanho do compartimento de células B transicionais é variável, enquanto que o
tamanho do compartimento das células B maduras é estável (Forster & Rajewsky,
1990; Cyster et al, 1994; Agenes & Freitas, 1999). A imunização ou infecção aguda
pode reduzir muito o número de células transicionais e depois esse número volta ao
normal com um efeito rebote de produção acima do normal dessas células (revisto em
Meffre et al, 2001). Alguns autores sugerem que a homeostase é mantida pela
alteração do número de células transicionais que entram no compartimento de células
B maduras (Agenes & Freitas, 1999), possivelmente alterando os limiares de seleção
positiva e negativa (Gu et al, 1991; Levine et al, 2000). Os mecanismos que
governam a passagem de clones transicionais recém gerados para o compartimento de
células B maduras são pouco entendidos, mas a sinalização pelo BCR parece ser um
fator determinante dessa transição. A perda da expressão do BCR durante essas etapas
14
de transição impede o desenvolvimento do estágio transicional para célula B madura
(Lam et al, 1997). Além disso, várias mutações que alteram a sinalização do BCR
também interferem na a maturação dos linfócitos B transicionais (Loder et al, 1999;
Maritin & Kearney, 2000).
De acordo com Gaudin et al. (2004a), o número de células B na periferia não é
limitado pelas taxas de produção dessas células na BM, ao contrário, o tamanho do
pool periférico é limitado na própria periferia. Eles mostraram que cerca de um terço
do número normal de precursores de células B na BM é suficiente para reconstituir o
tamanho normal do pool periférico (Agenès, Rosado & Freitas, 1997). Esses
resultados demonstram que, em um camundongo normal há um excesso de produção
diária de linfócitos B. Devido ao número total de células B ser mantido sob constante
controle homeostático, o excesso de produção sugere que cada célula recém-gerada
teria de competir com outras células recém produzidas ou células residentes para se
estabelecer e sobreviver no pool periférico (Freitas & Rocha, 2000).
A regulação da homeostase do repertório atual (plasmocitos secretantes de Ig)
é autônoma e independente do repertório disponível (células B em repouso) e do
repertório emergente (células recém formadas na BM). Em quimeras reconstituídas
com misturas de BM de animais normais e de animais deficientes em células B, foi
mostrado que independentemente da fração de células pré-B normais presentes na BM
e do número de células B maduras, o número de células secretoras de IgM e os níveis
de IgM no soro são os mesmos e idênticos aos encontrados em camundongos normais
(Agenès, Rosado & Freitas, 1997). Da mesma forma, animais deficientes em "5, que
têm redução em 10 vezes do número de células B na periferia, apresentam níveis
normais de IgM no soro (Kitamura, 1992). Estes resultados indicam que a regulação
homeostática dos compartimentos de células B em repouso e células B ativadas é
15
autônoma e independente, o que sugere que essas duas populações pertencem a
diferentes “nichos” celulares. Primeiro o sistema imunitário enche o nicho de células
B ativadas e, em seguida, ele começa a preencher o nicho das células em repouso
(Gaudin et al, 2004a). Estes achados podem explicar porque é que em camundongos
que apresentam redução na produção de células B, as células B maduras não se
acumulam no pool periférico de células B em repouso (repertório disponível). Assim
que as células são formadas, elas são continuamente recrutadas para reconstituir o
conjunto de células que se diferenciarão em plasmócitos secretantes de Ig (Agenès &
Freitas, 1999), pois a maioria morre dentro de um período de tempo relativamente
curto (Freitas, Rocha & Coutinho, 1986). Esses mecanismos asseguram a manutenção
dos níveis normais de células secretantes de IgM naturais que atuariam na “imunidade
inata” (repertório atual), e ao mesmo tempo, o sistema constrói uma reserva de
diversidade no compartimento de células B em repouso (reprtório disponível) que
permite a resposta imune adaptativa a novos estímulos antigênicos (Gaudin et al,
2004a).
Freitas e colaboradores demonstraram que essa população de células B
ativadas secretantes de Ig, uma vez estabelecida, é resistente à substituição e persiste,
mesmo na presença de células B emergentes recém geradas na BM (Agenès & Freitas,
1999). Desta acordo com esses autores, é provável que, em camundongos adultos,
uma fração dos anticorpos naturais é proveniente de um pool de células B ativadas
que foram selecionadas no início da ontogenia (Hao & Rajewsky, 2001), que podem
resistir à substituição. Assim, a seleção das células B periféricas para o pool de
células B ativadas segue a regra “primeiro a chegar, primeiro a ser servido”, onde
células residentes apresentam vantagem competitiva sobre as populações recém
chegadas (Agenès & Freitas, 1999). Entretanto, eventualmente pode ocorrer a
16
substituição da população inicialmente selecionada baseado na diversidade das células
B e no ambiente antigênico (Mclean et al, 1997).
A sobrevivência a longo prazo de células T no pool periférico requer o
contínuo estímulo do receptor de células T (TCR) por moléculas MHC (Witherden et
al, 2000). Da mesma forma, a sobrevivência das células B na periferia parece
envolver o estímulo do BCR por ligantes ainda desconhecidos. Como discutido
anteriormente, foi demonstrado que a deficiência de sinalização pelo BCR leva à
rápida perda de células B maduras na periferia (Lam, Kühn & Rajewky, 1997). As
células B sem a região V do BCR apresentaram uma expectativa de vida muito curta
(Rosado & Freitas, 1998), sugerindo um papel da sinalização mediada por ligantes na
sobrevivência das células B periféricas. Diferenças no repertório de imunoglobulinas
expresso por células pré-B e células B periféricas também podem sugerir o
envolvimento da sinalização mediada pelo reconhecimento de ligantes na persistência
de células B na periferia (Gu et al, 1991; Freitas et al, 1991). Além disso, outros
trabalhos utilizando modelos de camundongos transgênicos para os genes de Ig
mostraram que linfócitos B incorporados ao repertório disponível apresentam
autoreatividade com afinidade intermediária (Gaudin et al, 2004b). Estes dados
sugerem que, de forma análoga ao que ocorre com linfócitos T, todo o repertório
disponível de linfócitos B é autoreativo, com afinidade moderada por antígenos
próprios (revisto em Buhl et al, 2000). Os linfócitos que compõem o repertório
disponível competem entre si pela ligação ao autoantígeno, e a ausência prolongada
de estimulação pelo BCR resulta em morte por apoptose do linfócito maduro (Gaudin
et al, 2004a). Sabe-se que entre 48 a 72 horas sem estímulo pelo BCR leva a apoptose
celular, de modo que somente persiste no organismo o linfócito que continua a ser
estimulado de forma sustentada ao longo do tempo, muito provavelmente por
17
autoantígenos, principalmente no caso de linfócitos B que expressam IgM e IgD, ditos
“naive”, e que constituem a maioria dos linfócitos B do repertório disponível (Kraus
et al, 2004).
1.3.1 A seleção do repertório de imunoglobulinas
O repertório dos linfócitos é moldado pelos eventos de seleção nas fases
iniciais do desenvolvimento das células B e T. No caso das células T, o seu destino é
determinado pela avidez de sua interação com seus ligantes apresentados no timo.
Interações de baixa avidez podem levar à seleção positiva, enquanto que interações de
alta avidez induz a morte celular (revisto em von Boehmer, 1990).
O repertório das células B também está sujeito aos eventos seletivos. Os
primeiros estudos que mostraram isto, utilizaram células B transgências para BCR de
alta afinidade específico anti-HEL (lisozima de ovo de galinha), em camundongos
transgênicos que expressam HEL como um autoantígeno (Goodnow et al, 1988). Os
estudos mostraram que a célula B anti-HEL se torna incapaz de proliferar e produzir
anticorpos se encontrar com o antígeno (HEL) na forma solúvel (Goodnow et al,
1988). Quando o HEL trangênico é expresso na membrana das células os linfócitos
específicos para HEL são então deletados (Hartley et al, 1991). Esses achados
sugerem que a deleção das células B dependem da ligação cruzada do BCR, a qual
pode ser induzida por autoantígenos de membrana, enquanto que o antígeno solúvel
não induz seleção positiva nem negativa, apenas anergia. Estudos de linfócitos B
expressando BCR específicos para MHC-1 confirmaram o papel dos antígenos de
membrana na deleção clonal dessas células, mostraram ainda que essa deleção de
linfócitos B autoreativos também pode ocorrer nos tecidos linfóides periféricos
(Nemazee & Buerki, 1989).
18
Ao contrário da seleção negativa, que é melhor definida, a seleção positiva
ainda não está completamente estabelecida para os linfócitos B, como para os
linfócitos T. As evidências mais consistentes da existência desse fenômeno surgiram
de experimentos feitos com linfócitos B1 da cavidade peritoneal e linfócitos B de
zona marginal do baço. Nos estudos de Hayakawa e colaboradores (1999), foi
demonstrado que células B trangênicas para BCR específico para Thy-1 se
diferenciaram em células B produtoras de anticorpos autoreativos anti-Thy-1, somente
em camundongos que eram transgênicos para a expressão de Thy-1, enquanto que
esses autoanticorpos não foram detectados em animais Thy-1 -/-. Diferenças no uso
dos genes V entre as populações imaturas na medula óssea e a população de linfócitos
B periféricos, também sustentam a idéia de seleção positiva moldando o repertório
das células B (Freitas et al, 1989; Gu et al, 1991; Levine et al, 2000).
Comparando a expressão de genes V em células do repertório emergente,
disponível e atual de camundongos C57BL/6 convencionais e camundongos
transgênicos para IgHa rearranjada, Grandien e colaboradores mostraram que apenas
5% das células da BM dos animais transgênicos expressavam Ig com genes V
H
endógenos e que 95% das células maduras da periferia utilizavam o gene V
H
J558
transgênico. Entretanto, analisando o repertório atual foi demonstrado que esses
animais transgênicos não imunizados diversificaram a utilização dos genes V
H
nas
células B secretantes de Ig, de forma que mais de 50% dessas células expressavam os
genes V
H
endógenos (Grandien, Coutinho & Andersson, 1990; Grandien et al, 1991).
Esses resultados demonstraram que o repertório atual é bem diferente do repertório
disponível sugerindo o poder da seleção positiva na formação do compartimento de
células B secretoras de imunoglobulinas naturais.
19
Outra evidência de seleção positiva são os anticorpos anti-fostatidilcolina
(PtC) que são frequentemente codificados por cadeias pesadas utilizando segmentos
gênicos V
H
11 a V
H
12 em combinação com cadeias leves que usam os segmentos V!9
e V!4, respectivamente (Hardy et al, 1989). Sobretudo, nos camundongos C57BL/6
mais de 80% das células B1 reativas à PtC expressam cadeia pesada utilizando V
H
11,
quase exclusivamente em associação com a cadeia V!9 (Seidl et al, 1997). O
segmento V
H
11 é predominantemente usado em rearranjos V
H
-D-J
H
durante o
desenvolvimento de células B no fígado fetal, e não na medula óssea adulta (Hardy &
Hayakawa, 1994). A adição de nucleotídeos N é raramente encontrada nas junções
V
H
-D e D-J
H
de cadeias IgH usando V
H
11 na células B1 anti-PtC (Arnold et al, 1993).
Estas características são coerentes com a origem fetal das células B1. Desta forma, é
amplamente aceito que a maior participação de células B1 com rearranjos utilizando
V
H
11 é uma consequência da seleção clonal dependente de antígenos. Em
contrapartida, em um estudo mais recente, foi demonstrado que a seleção da cadeia
pesada IgH, utilizando V
H
11, já é estabelecida nas células pré-B durante a ontogenia
dessas células no fígado fetal (Yoshikawa et al, 2008). Assim, permanece
contraditório o papel da sinalização via BCR na determinação do repertório de
linfócitos B.
Retomando os experimentos realizados com o modelo transgênico anti-HEL,
Freitas e colaboradores (Gaudin et al, 2004b) demonstraram que não só a afinidade da
ligação do BCR ao antígeno, mas também a quantidade do autoantígeno é importante
para os eventos de seleção positiva. Neste trabalho foi demonstrado que a ligação do
antígeno de membrana (HEL) ao BCR específico (anti-HEL) nem sempre resulta em
deleção clonal, a ligação do autoantígeno em baixas quantidades e com menor
20
afinidade foi capaz de selecionar positivamente e ativar células B convencionais
secretantes de Ig autoreativas (Gaudin et al, 2004b).
1.3.2. A compartimentalização do repertório disponível
O repertório disponível de imunoglobulinas consiste de clones de linfócitos B
distribuídos nos diversos orgãos e tecidos linfóides secundários, os quais abrigam
subpopulações de linfócitos B com diferentes funções biológicas na resposta
imunitária, a maioria destes linfócitos apresenta os isotipos IgM e IgD de membrana.
O baço possui as populações de células B transicionais e pelo menos 4 subpopulações
maduras que constituem o repertório disponível: linfócitos B da zona marginal,
linfócitos B foliculares e os linfócitos B1 (B1a e B1b) em menor proporção (Tung et
al, 2006; Casola, 2007). Os linfócitos B2 foliculares constituem o compartimento
mais numeroso, cerca de 80 %, parece corresponder á “reserva” de diversidade clonal
utilizada na resposta imunitária humoral dependente de linfócitos T. Acredita-se que
os linfócitos B da zona marginal (em torno de 5-10%) seriam utilizados na resposta
imunitária primária, podendo ser ativados e diferenciar em plasmócitos de maneira
rápida e independente do auxílio de linfócitos T; estas células parecem desempenhar
um papel essencial na resposta a infecções bacterianas e respondem muito
rapidamente à estimulação por ligantes dos receptores do tipo Toll (Martin &
Kearney, 2000). Os linfócitos B1 teriam papel primordial na produção de anticorpos
naturais, que estão presentes no organismo mesmo na ausência de estimulação por
antígenos exógenos, esse assunto será tratado em maiores detalhes adiante. Os
linfonodos periféricos abrigariam principalmente linfócitos do tipo B2 maduros
recirculantes, freqüentemente associados a linfócitos B de memória que participam
em respostas T dependentes. A cavidade peritoneal contém uma numerosa população
de linfócitos B1, subdividida em B1a e B1b, além de linfócitos B2. Os linfócitos B1a
21
teriam papel na produção de anticorpos naturais, como dito acima, porém a população
B1b parece estar envolvida na resposta a antígenos exógenos (Haas et al, 2005).
Ao longo da última década, trabalhos realizados com animais transgênicos
para expressão de Igs com diferentes idiotipos demonstraram que, antes mesmo de vir
a participar de uma resposta imunitária para antígenos exógenos, o clone de linfócito
B passa a integrar de forma seletiva um determinado órgão/estrutura linfóide
secundário, adquirindo um fenótipo celular característico de uma das subpopulações
acima mencionadas. Além disso, esta diferenciação depende essencialmente do
idiotipo do BCR expresso pelo linfócito, de tal forma que o linfócito se diferencia
para um dos subtipos, B1a ou B1b peritoneal, B2 da zona marginal, B2 folicular, em
função de seu idiotipo (Cancro & Kearney, 2004).
Evidências experimentais sugerem que a intensidade da sinalização pelo BCR,
determinada pela afinidade de ligação ao autoantígeno, sua abundância e localização,
sejam os fatores determinantes para esta diferenciação seletiva. Hayakawa e
colaboradores (Wen et al, 2005) mostraram que, em animais portando BCR
transgênico específico para o autoantígeno Thy-1, enquanto altos níveis de
autoantígenos solúveis levam a uma diferenciação para B1, baixas doses do mesmo
antígeno promoveriam a diferenciação para linfócitos B de zona marginal. Eles
observaram que a ausência do autoantígeno levaria ao desenvolimento de células
foliculares, sugerindo que a sinalização “basal” do BCR poderiam a princípio levar a
diferenciação para o campartimento B2 (Wen et al, 2005). Esses dados estão em
acordo com o trabalho de Gaudin et al. (2004b), onde a presença do antígeno em
baixíssimas doses levariam a diferenciação para células B convencionais.
Dois grupos recentemente mostraram de forma inequívoca a existência de
progenitores de células B independentes que dariam origem às células B1
22
(Montecino-Rodriguez et al, 2006) e células B2 (Tung et al, 2006). Desta forma,
parece que o pool de células transicionais consistem em dois tipos de células
derivadas de linhagens independentes, as quais respondem de maneiras diferentes ao
estímulo pelo BCR. Um determinado sinal irá promover a diferenciação das células
de uma das linhagens, enquanto que o desenvolvimento das células da outra linhagem
provavelmente será interrompido (Casola, 2007).
Trabalhos recentes demonstraram que a resposta imunitária fica seriamente
comprometida, na infecção experimental por pneumococos em camundongos, na falta
da população B1b da cavidade peritoneal. A ausência desta única subpopulação torna
o animal altamente suscetível ao pneumococo (Haas et al, 2005), muito embora
anticorpos anti-pneumococo possam ser produzidos pelas outras subpopulações de
linfócitos B. Estes estudos geraram um novo conceito no entendimento do processo
de seleção do repertório disponível de Igs, revelando uma insuspeitada complexidade
no acoplamento da resposta imunitária a antígenos exógenos, com a fisiologia do
sistema imunitário, baseada na auto-reatividade fisiológica. De acordo com este novo
paradigma, a eficácia da resposta imunitária numa infecção por microorganismos
dependeria da distribuição fisiológica do repertório de idiotipos entre as diversas
subpopulações de linfócitos B, distribuição esta que pré-existe no organismo e se
organiza de forma auto-reativa. Se os idiotipos utilizados na resposta imunitária se
encontrarem majoritariamente ausentes no repertório de uma determinada
subpopulação, como mostrado no modelo de infecção com pneumococos (Haas et al,
2005), a resposta imunitária não favorece a eliminação do microorganismo infeccioso.
Este acoplamento da resposta imunitária com a auto-reatividade fisiológica destaca a
necessidade de se aprofundar o entendimento dos processos de formação fisiológica
dos repertórios de Igs, que precede a resposta imunitária.
23
1.4. Os linfócitos B1 e o repertório de imunoglobulinas naturais
Os linfócitos B1 foram originalmente identificados como células CD5
+
(Ly1
+
)
que participavam na autoimunidade e apresentavam semelhanças com as células da
leucemia linfocítica crônica em humanos (Boumsell et al, 1978; Hayakawa et al,
1993). As células B1 somam aproximdamente 5% de todas as células B no
camundongo e são encontradas em vários tecidos e órgãos linfóides, incluindo baço,
cavidades peritoneal e pleural e também nas cavidades intestinais e apresentam
características de autorenovação (Kantor & Herzenberg, 1993). Fenotipicamente,
essas células se distinguem das outras células B, pela maior expressão de IgM e
menor expressão de IgD, quando comparadas as células B2; quando comparadas aos
linfócitos B de zona marginal, as células B1 não expressam CD21 na cavidade
peritoneal e expressam baixos níveis de CD21 no baço (Kantor & Herzenberg, 1993).
Os linfócitos B1 da cavidade peritoneal geralmente expressam CD11b (Mac-1 - parte
do receptor CR3 do complemento), mas recentemente foi demonstrado que uma
fração considerável das células B1 não expressão Mac-1 (Gohsn et al, 2008). As
células B1 da cavidade peritoneal são divididas em duas subpopulações, as células
B1a que expressam CD5 e são a maioria representantdo 60% da população de células
B1 e as células B1b que não expressam o marcador típico de linfócitos T, CD5 (Stall
et al, 1992). O CD5 é uma molécula de sinalização sabidamente capaz de suprimir a
sinalização tanto do TCR, quanto do BCR (Bondada et al, 2000; Bikah et al, 1996). A
presença de CD5 nas células B1 tem sido relacionada com a falha dessas células em
proliferar em resposta à ligação cruzada da IgM, que geralmente induz a ativação e
proliferação das células B2. (Bikah et al, 1996).
Trabalhos recentes demonstraram a existência de diferentes progenitores para
as células B1 e B2. Os progenitores específicos de linfócitos B1 (B1P), com o
24
fenótipo característico Lin
-
AA4.1
+
CD19
+
B220
lo/-
, teriam origem fetal se
desenvolvendo prinicpalemente em neonatos (Montecino-Rodriquez et al, 2006) e os
progenitores B2 (CD19
-
B220
+
) se desenvolveriam na medula óssea adulta (Tung et al,
2006). Mais recentemente, outro trabalho mostrou que pelo menos alguns
progenitores B1P poderiam ser produzidos na medula óssea adulta a partir de
precursores primitivos de B2 (Esplin et al, 2009).
Funcionalmente, as células B1 diferem das células B2 em muitos aspectos. O
repertório dos linfócitos B1 tende a ser menos diverso do que o repertório B2,
principalmente devido a origem fetal dos linfócitos B1 e a ausência de atividade da
enzima TdT durante o desenvolvimento fetal, o que leva à menor inserção de
nucleotídeos N nas junções VDJ do CDR-H3 dessas células (Feeney, 1991; Kantor et
al, 1997). Além disso, as células B2 participam da resposta imunitária adaptativa
sendo sujeitas à hipermutação somática, o que resulta na maturação da afinindade das
imunoglobulinas. Por outro lado, os linfócitos B1a e B1b estão mais envolvidos com a
imunidade inata e têm a capacidade de responder rápidamente a uma variedade de
antígenos T independentes (Baumgarth et al, 2005). Em experimentos analisando a
resposta dessas células ao estímulo por lipopolissacrídeos (LPS), foi demonstrado que
as células B1a da cavidade peritoneal respondem rapidamente, migrando para o baço,
onde sofrem divisão e se diferenciam em plasmócitos produtores de IgM, enquanto
que os linfócitos B1a residentes no baço se diferenciam imediatamente em
plasmócitos secretantes de IgM sem sofrer divisão celular (Yang et al, 2007).
Em experimentos realizados utilizando quimeras reconstituídas com
progenitores de linfócitos B2 do alótipo b (IgMb) e progenitores de linfócitos B1a do
alotipo a (IgMa), Baumgarth e colaboradores demonstraram que os linfócitos B1a são
os principais produtores de IgM naturais séricas (Baumgarth et al, 1999; 2002). Além
25
disso, foi demonstrado que os linfócitos B1a seriam os responsáveis pela resposta
inicial na proteção contra Streptococcus pneumoniae, e os linfócitos B1b seriam os
responsáveis pela proteção duradoura em animais preimunizados com o polissacrídeo
do pneumococo (Haas et al, 2005).
1.4.1. As imunoglobulinas naturais
O repertório atual é formado pelas formas moleculares secretadas de Igs nos
fluidos corporais; estas incluem imunoglobulinas produzidas por linfócitos B
estimulados tanto por antígenos endógenos quanto exógenos. As imunoglobulinas
formadas pelo organismo em condições sadias isentas de imunização prévia são
denominadas “imunoglobulinas naturais” ou “anticorpos naturais” (NAbs), em
oposição aos anticorpos formados na resposta imune a antígenos artificialmente
induzidos ou a infecções por microorganismos patogênicos de maior virulência. Os
Nabs têm sido descritos em virtualmente todas as espécies de vertebrados
mandibulados (Avrameas, 1991). O isotipo dominante é a IgM, embora as IgG e IgA
também contribuam, e mais recentemente foi descrita a participação de anticorpos
naturais do isotipo IgE (Mccoy et al, 2006).
A presença de Nabs em animais isentos de microorganismos e com dieta
essencialmente livre de antígenos exógenos (“antigen-free”) sugere que autoantígenos
estariam estimulando a formação de plasmócitos secretantes de NAbs (Hooijkaas et
al, 1982). A ausência de centros germinativos indica que pouca ou nenhuma expansão
clonal estaria associada à diferenciação do linfócito B em plasmócito. A seleção do
repertório não resultaria de extensa proliferação clonal de poucos clones, mas sim de
uma ampla seleção de diversidade com pouca expansão clonal de cada clone. Os Nabs
seriam imunoglobulinas multirreativas de baixa afinidade que se ligam
26
predominantemente a antígenos altamente conservados evolutivamente tanto próprios
(hormônios, ácidos nucléicos, fosfolipídios, proteínas do choque térmico, histonas,
entre outros) quanto externos (componentes de bactérias, vírus, protozoários, fungos)
encontrados em indivíduos ou animais normais não imunizados (Coutinho,
Kazatchkine & Avrameas, 1995). Não se conhecem os estímulos que levam a
produção dos NAbs.
As propriedades estruturais e características destes anticorpos naturais, tais
como multirreatividade, afinidade e conectividade parecem determinar em parte seu
comportamento e as suas possíveis funções biológicas (revisto em Avrameas &
Ternynck, 1993; Lacroix-Desmazes et al, 1998; Ochsenbein et al, 1999; Ochsenbein
& Zinkernagel; 2000): Entre elas podemos citar a participação na defesa natural
contra infecções como consequência da reatividade cruzada entre antígenos internos e
externos; o clareamento de produtos catabólicos, células senescentes, imuno-
complexos ou constituintes alterados do próprio organismo.
A multireatividade, a capacidade de interação com diferentes antígenos, está
relacionada com a auto-reatividade, que é a capacidade de interagir com ligantes
internos e essa característica dos Nabs seria moldada durante o desenvolvimento dos
linfócitos B. Grandien et al. (1994), demonstraram que linfócitos B expressando
imunoglobulinas multireativas seriam relativamente desfavorecidos nos eventos de
seleção durante o desenvolvimento. Desta forma, a multireatividade apresentada pelos
anticorpos naturais representa muito mais o que foi deixado após a seleção negativa
das multireatividades extremas do repertório emergente, do que propriamente uma
incorporação do repertório que foi positivamente selecionado.
Entretanto, uma das principais funções seria a conectividade que estaria
envolvida no controle da auto-reatividade e homeostase imune em indivíduos sadios
27
proposta por Jerne em sua Teoria da Rede Idiotípica (Jerne, 1974; 1984). Este
controle se daria pela participação de anticorpos auto-reativos nos processos de
seleção de células B e prevenção da expansão descontrolada de alguns clones auto-
reativos nos órgãos linfóides, assim como por interações, via região variável, a outras
moléculas e imunoglobulinas presentes no soro (Varela et al, 1991).
1.4.2. A análise global do repertório de imunoglobulinas naturais
Nóbrega e colaboradores desenvolveram um ensaio semiquantitativo como
modificação da técnica de imunoblot, que permite analisar “em bloco” a reatividade
das imunoglobulinas presentes no soro de indivíduos normais, contra misturas
complexas de proteínas, contendo milhares de antígenos, próprios e não próprios,
incluindo extratos antigênicos totais de microorganismos como bactérias (Nobrega et
al., 1993; Haury et al., 1994). Esta abordagem produz uma extensa matriz de
reatividades que permite classificar os repertórios utilizando métodos conceitualmente
semelhantes aos aplicados atualmente às matrizes de “chips” de DNA. A análise
global do repertório de anticorpos representa um progresso significativo na direção de
definir os parâmetros que determinam a produção dessas imunoglobulinas naturais.
Em uma série de estudos previamente realizados foi demonstrado que o
repertório de anticorpos naturais de isotipo IgM apresenta reatividade com um seleto
grupo de antígenos do extenso painel de antígenos próprios, e não próprios, utilizados
nos ensaios de imunoblot (Nobrega et al, 1993; Haury et al, 1994; Mouthon et al,
1995; Nobrega et al, 1998). Estes trabalhos demonstraram que o repertório de NAbs é
caracterizado por algumas autoreatividades principais, ignorando os demais
autoantígenos, definindo a noção do “humunculus imunitário” proposta por Cohen
(Cohen, 1992). O repertório de NAbs apresenta notável semelhança entre indivíduos
28
de uma mesma espécie, divergindo entre estas, embora um núcleo comum de
reatividades esteja presente.
Os perfis de IgM não são alterados por estimulação com antígenos da
microbiota autóctone ou da dieta, pois não se alteram em animais “antigen-free”,
sugerindo um papel fundamental dos autoantígenos na seleção dos NAbs (Haury et al,
1997). Foi demonstrado também que uma fração substancial das reatividades dos
NAbs aparecem nas primeiras semanas de vida e se conservam na idade adulta,
evidenciando uma estabilidade dinâmica (Mouthon et al, 1996); posteriormente foi
verificado que esta estabilidade está comprometida em quadros de autoimunidade
(Ferreira et al, 1997; Sundblad et al, 1997).
Experimentos utilizando camundongos cujo o sistema linfocitário foi
destruído por irradiação e em seguida regenerado com transplante de medula,
mostraram a restauração do repertório essencialmente equivalente ao dos animais
normais, sugerindo que mesmo em condições ambientais substancialmente diferentes
de sua ontogênese houve a regeneração dos Nabs (Nobrega et al, 2002). Para um
sistema biológico composto por milhões de clones e exposto ao estímulo por número
equivalente de antígenos, estes resultados revelam uma notável capacidade
regenerativa e surpreendente estabilidade. Estes resultados caracterizam a seleção do
repertório de NAbs como um sistema dinâmico com um robusto atrator associado ao
seu estado de equilíbrio (Nobrega et al, 2002).
1.5. A restrição na diversidade do CDR-H3
No fígado fetal de camundongos, a utilização dos genes V
H
é distribuída de
maneira não randômica, com a vasta maioria dos progenitores, utilizando membros
das famílias 7183 e Q52 (Yancopoulos et al, 1984; Perlmutter et al, 1985). Por outro
29
lado, os segmentos gênicos da família J558 contribuem pouco para o repertório fetal
mas representam mais da metade em frequência dos rearranjos de células B esplênicas
apenas uma semana após o nascimento (Yancopoulos et al, 1988; Malynn et al,
1990). As famílias 7183 e Q52 são as mais próximas dos genes J
H
, com o segmento
VH81X sendo o gene mais proximal e o mais utilizado no período fetal. Alguns
trabalhos sugerem que a proximidade a um “enhancer” J-C influencia essa frequência
de rearranjo. Mudanças na representação dos genes V
H
também refletem a seleção por
antígenos de células B menos comuns que usaram segmentos de genes V
H
alternativos. Por exemplo, células B emergentes da medula óssea já apresentam uma
diminuição na frequência de uso dos genes 7183 (Freitas, Burlen & Coutinho, 1988).
Camundongos “germfree” continuam a expressar genes da família 7183 em uma
frequência duas vezes maior do que animais normais, indicando que a exposição a
antígenos externos também pode desempenhar um papel no desenvolvimento do
repertório emergente (Freitas, 1991).
A composição do CDR-H3 é regulada durante o desenvolvimento no
camundongo. Progenitores de células B fetais não expressam TdT, limitando a
diversidade do CDR-H3 a sequências “germlines” (Gu, Förster & Rajewsky, 1990;
Feeney, 1990). A ausência de nucleotídeos N é associada à um comprimento de CDR-
H3 menos variável e mais curto, limitando assim, a diversidade da estrutura do sítio
de ligação do antígeno. Essas características comuns em sequência e estruturas
contribuem para a similaridade de idiotipos expressos por anticorpos derivados do
repertório perinatal (Vakil & Kearney, 1986).
A utilização dos segmentos V
H
em fetos humanos é limitada a um pequeno
número de sequências (Schroeder & Perlmutter, 1993). Da mesma forma que nos
camundongos, o segmento o V6-1 é o mais próximo dos segmentos J
H
, é usado com
30
muita frequência e geralmente gera anticorpos autoreativos (Schroeder, 2006). Por
outro lado, diferente dos camundongos, os segmentos gênicos V
H
mais utilizados
(V3-23, V3-30) são localizados mais ao centro do locus. Esses segmentos gênicos
continuam a serem usados com altas frequências nos adultos sugerindo que a
proximidade ao “enhancer” J-C não desempenha o papel mais importante na restrição
do repertório. Essas observações levam a uma hipótese alternativa, de que as
sequências dos anticorpos fetais codificam especificidades que seriam essenciais para
a composição do repertório. De acordo com essa hipótese, de que o repertório fetal é
moldado para expressar especificidades essenciais, está a forte conservação das
sequências entre alguns segmentos de genes V
H
utilizados no repertório fetal de
humanos e de camundongos (Schroeder, 2006). Por exemplo o gene V3-23 de
humano e o gene V
H
283 de camundongo são preferencialmente usados na vida fetal
(Yancopoulos et al, 1984; Schroeder & Perlmutter, 1993) e possuem 80% de
homologia. Assim, tanto o repertório dos camundongos, quanto o repertório dos
humanos incluem segmentos V
H
conservados filogeneticamente que parecem ser
capazes de gerar um repertório de anticorpos plástico e multireativo (Dighiero et al,
1983).
De forma interessante, esses mesmos genes V
H
utilizados na vida fetal, são
potencialmente usados em anticorpos anti-DNA (Schlomchik et al, 1990; Krishnan et
al, 1996). Uma característica desses anticorpos é o uso de aminoácidos carregados no
CDR-H3, como arginina. Essas argininas podem ser geradas pela adição de
nucleotídeos N, ou pelo uso de quadros de leituras alternativos dos segmentos D (uso
do RF3 ou RF1 invertido). Assim, o uso limitado de regiões N na vida fetal dos
camundongos pode funcionar como um mecanismo para reduzir a probabilidade de
31
formação de anticorpos patogênicos no organismo em desenvolvimento (Schroeder,
2006).
Embora os mecanismos usados para criar a diversidade de CDR-H3 pareçam
ser randômicos, estudos comparativos das imunoglobulinas em diferentes vertebrados
mandibulados têm mostrado que a composição de aminoácidos é bem semelhante
(Schroeder, 2006). A tirosina é dez vezes mais utilizada no CDR-H3 do que em
outros tipos de proteínas em geral, e a tirosina juntamente com a glicina são
responsáveis por 40-50% das sequências de CDR-H3 (Zemlin et al, 2003). Essa
preferência por aminoácidos faz com que o CDR-H3 mantenha, em geral, a média de
hidrofobicidade em uma faixa neutra na escala de hidrofobicidade de Kyte-Dollitle
(Kyte & Dolittle, 1982; Schroeder et al, 1998).
Existem possivelmente duas explicações para essa distribuição não randômica
de aminoácidos no CDR-H3. A primeira é a favor de que a sequência de CDR-H3
seria formada de maneira randômica e que a seleção somática durante os
“checkpoints” no desenvolvimento das células B moldaria o CDR-H3 em relação ao
uso dos aminoácidos, selecionando assim os clones com CDR-H3 com características
neutras (Silverstein, 2003). Uma segunda explicação seria que o repertório “germline”
funcional já teria sido pré-selecionado durante a evolução resultando no
enriquecimento de aminoácidos neutros e/ou evitando o uso de aminoácidos
carregados ou hidrofóbicos no CDR-H3 (Schlomchik, 1990; Raaphorst et al, 1997;
Schroeder et al, 1998). Nesse segundo ponto de vista, a seleção somática não
exerceria o papel principal e sim um “refinamento” na moldagem do repertório final.
Embora cada segmento D
H
tenha seis quadros de leituras (RFs) possíveis,
existe uma notável preferência para o uso do RF1 (Ichihara et al, 1989; Gu, Forster &
Rajewsky, 1990). Os mecanismos que favorecem o uso no RF1 nos camundongos são
32
bem determinados: -i- o rearranjo por deleção é favorecido ao rearranjo por inversão,
limitando o uso dos RFs invertidos (iRFs); -ii- sequências “germline” dos segmentos
D codificam códons de terminação no RF3; -iii- existe um códon de iniciação ATG
conservado no RF2 dos segmentos D mais utilizados. Transcritos utilizando
segmentos DH no quadro de leitura RF2 têm o potencial de gerar a proteína truncada
D# (DJC#), que pode desencadear exclusão alélica, impedindo o rearranjo V-DJ (Gu,
Kitamura & Rajewsky, 1991). Em todos vertebrados mandibulados, a sequência do
segmento gênico D é conservada de forma que em apenas um único RF existe o
enriquecimento para os aminoácidos neutros, tirosina e glicina (Ivanov et al, 2002).
Desta forma, os mecanismos citados acima que “forçam” o uso do RF1 são os
responsáveis pelo maior uso de tirosina e glicina no CDR-H3.
Três mecanismos principais foram propostos para explicar como a resposta
imune humoral pode ser desfavorecida pelo uso de sequências D alternativas. A
hipótese estrutural, sustenta que o uso de aminoácidos carregados ou hidrofóbicos
diminuiriam a estabilidade da cadeia IgH, limitando a associação com a cadeia leve
substituta ou com a cadeia leve convencional (Melchers, 1999). A hipótese do melhor
funcionamento propõe que o maior uso de glicina e tirosina no “loop” de CDR-H3
seria necessário pra criar anticorpos protetores mais eficientes (Schroeder et al, 1998).
De acordo com essa hipótese a redução do uso desses aminoácidos poderia resultar no
aumento de morbidade e mortalidade à patógenos. Devido às imunoglobulinas se
ligarem geralmente a epítopos de antígenos solúveis, que necessariamente tendem a
ser hidrofílicos, alguns autores especulam que a probabilidade de CDR-H3
hidrofóbicos formarem paratopos apropriados seria menor (Schroeder et al, 1998;
Raaphorst et al, 1997). Por último, a hipótese autoreativa, sustenta que o excesso de
aminoácidos alternativos aumenta a expressão de autoanticorpos (Schlomchik et al,
33
1990; Krishnan et al, 1996). Existem vários trabalhos mostrando que o uso de
aminoácidos carregados, como arginina, pode aumentar a probabilidade de gerar
anticorpos anti-DNA, aumentando a suscetibilidade para o desenvolvimento de
doenças autoimunes (Schlomchik et al, 1990).
1.6. O modelo D
H
transgênico para o estudo da formação do repertório de
imunoglobulinas
Para entender os mecanismos usados na regulação do repertório de
imunoglobulinas, e determinar em que momento durante o desenvolvimento dos
linfócitos B as características conservadas (citadas anteriormente) que compõem o
CDR-H3 são estabelecidas, Schroeder e colaboradores estabeleceram os padrões do
repertório de CDR-H3 (Figura 3A) durante o desenvolvimento das células B na
medula óssea de camundongos BALB/c (Ivanov et al, 2005). Nesse primeiro estudo,
foi demonstrado que a arquitetura essencial do repertório de CDR-H3 (incluindo o
uso dos genes (VDJ), o comprimento, os aminoácidos que compõem a estrutura e a
média de hidrofobicidade) é determinada cedo na ontogenia, bem antes da expressão
da IgM de membrana. Com o desenvolvimento dos linfócitos na medula óssea, muitas
dessas características vão sendo “refinadas” e o repertório de CDR-H3 vai se
moldando em uma faixa aparentemente ótima de comprimento, carga e uso de
aminoácidos (Ivanov et al, 2005).
Em uma segunda seção de experimentos, com o propósito de testar se a
presença de múltiplos segmentos gênicos DH é realmente necessária para o
desenvolvimento e a função dos linfócitos B, e para determinar se a sequência do
gene D pode influenciar no repertório de CDR-H3 das células B, o mesmo grupo
desenvolveu camundongos depletados para todos os segmentos gênicos do locus D,
34
com exceção de um, o DFL16.1. Esse camundongo foi denominado *D-DFL (Figura
3B). Foram feitas análise de transcritos de CDR-H3 das populações de linfócitos B na
medula óssea desses animais (Schelonka et al, 2005). Foi demonstrado que em
camundongos homozigotos *D-DFL, no “background” BALB/c, o uso de
aminoácidos e o comprimento médio do CDR-H3 nas células B maduras não
recapitula o repertório dos camundongos WT como um todo. Por outro lado, foi
demonstrado que o repertório dos animais transgênicos se assemelhou principalmente
às características do repertório WT, em que as células usavam o segmento gênico
DFL16.1. Apesar de faltar os componentes do repertório criados pelo uso dos outros
12 segmentos D, o repertório limitado ao segmento DFL16.1 se mostrou
suficientemente plástico para permitir o desenvolvimento do número normal de
células B maduras nos diferentes compartimentos periféricos, para atingir
concentrações normais de Ig no soro e para montar uma resposta imune robusta aos
antígenos T-dependentes e T-independentes (Schelonka et al, 2005).
Para avaliar o papel do RF1 em determinar o uso de aminoácidos no CDR-H3
e testar se camundongos limitados ao uso de um único D com a sequência “germline”
alterada poderia recriar o repertório de CDR-H3 de camundongos WT por
mecanismos somáticos, foi desenvolvido outro camundongo transgênico para
expressar um único segmento D (iD), esse camundongo foi denominado *D-iD. Este
segmento iD consiste na sequência invertida do segmento DSP2.2, inserido na
posição do segmento DFL16.1 (Figura 3B). Essa construção permitiu substituir os
códons centrais do DSP2.2 codificando tirosina e glicina no RF1 original por códons
que codificam aminoácidos carregados no RF1 invertido, arginina, histidina e
asparagina na posição do DFL16.1 (o segmento D mais distante dos genes J
H
)
deletando os genes D intervenientes. Os resultados mostraram que as células B da
35
medula óssea desses animais mantiveram a preferência pelo RF1 durante o
amadurecimento até as células B maduras. A consequência disso foi o uso três vezes
maior de aminoácidos carregados (arginina, histidina e asparagina) e o uso de tirosina
e glicina duas vezes menor quando comparados com animais WT (Ippoloto et al,
2006). Além disso, foi demonstrado que o uso de aminoácidos carregados teve
consequências funcionais. Quando comparados com os controles WT e *D-DFL, os
camundongos *D-iD homozigotos apresentaram uma redução no número total de
células B e uma redistribuição dessas células na periferia, com menores números de
células B2 foliculares e números mais elevados de linfócitos B de zona marginal no
baço. Na cavidade peritoneal esses animais apresentaram metade do número absoluto
de linfócitos B1a e uma diminuição em 25% do número de linfócitos B1b dos animais
WT. Ao contrário dos números absolutos de linfócitos B convencionais na medula
óssea e no baço, que se apresentaram diminuídos, as célula B2 da cavidade peritoneal
apresentaram um leve aumento, quando comparadas aos controles. Estes estudos
mostraram ainda que os níveis séricos de IgM e IgA foram os mesmos dos
camundongos controles, enquanto que a resposta imune humoral antígeno-específica
estava diminuída (Ippolito et al, 2006).
O nosso grupo vem desenvolvendo trabalhos sobre a seleção do repertório de
anticorpos naturais (Nóbrega et al., 1993; Nóbrega et al., 1998; Nóbrega et al., 2002)
e recentemente estabeleceu uma colaboração com o grupo do Dr. Harry Schroeder Jr
da “University of Alabama at Birmintham” para estudar o repertório desses animais
limitados a um único segmento D. No presente trabalho, nós analisamos o repertório
atual e disponível de imunoglobulinas nesses animais transgênicos *D-iD, sempre
comparando com os controles *D-DFL e camundongos BALB/c WT. Foram
abordados os aspectos da análise global do repertório de especificidades através do
36
imunoblot, descrito anteriormente, e a análise do repertório de CDR-H3 como
descrito acima nos experimentos desenvolvidos pelo grupo do Dr. Schroeder. A
Figura 3, esquematiza os parâmetros que serão analisados no CDR-H3 (Figura 3A) e
destaca as principais diferenças nas sequências de aminoácidos codificadas nos
animais transgênicos *D-DFL (Figura 3B) e *D-iD (Figura 3C).
Figura 3: Descronstrução do CDR-H3, geração do locus IgH contendo um único segmento D e
sequência de aminoácidos codificada pelos segmentos D. A) Exemplo de uma sequência contendo a
localização do CDR-H3, o loop e as regiões “frameworks” 3 e 4. O CDR-3 da cadeia pesada de
imunoglobulina foi definido como a região entre os resíduo de cisteína conservada (TGT) na posição
Kabat 92 (IMGT 104) do FR3 à 3’ do V
H
e o triptofano conservado (TGG) na posição Kabat 103
(IMGT 118) do FR4 à 5’ do J
H
; a média de hidrofobicidade do CDR-H3 foi calculada como descrito
previamente por Kyte and Dolittle (1982) (modificado de Ivanov et al, 2005). B) Geração do locus IgH
contendo um único segmento DFL16.1 usando o sistema Cre-loxP; comparação entre as sequências de
aminoácidos no RF prinicpal de todos os segmentos D, destacando as diferenças principais entre o
segmento DFL16.1 e os demais (para maiores informações ver Schelonka et al. (2005). C) Geração do
locus IgH contendo um único segmento iD (DSP2.2 invertido) usando o sistema Cre-loxP; as
sequências de aminoácidos no RF prinicpal perdidas e a sequência adicionada no locus iD pela
construção; destacando em vermelho os aminoácidos carregados; comparação das sequências de
aminoácidos nos diferentes quadros de leitura entre o segmento DFL16.1 e o segmento iD, a
hidrofobicidade média está mostrada entre parênteses (para maiores informações ver Ippolito et al,
2006)
37
Legenda na página anterior
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C
A
B
2. OBJETIVOS
39
2. OBJETIVOS
O objetivo geral do nosso trabalho é estudar o impacto da limitação genética
VDJ na formação do repertório de imunoglobulinas correlacionando o repertório de
especificidades antigênicas com o repertório genético de utilização de genes V
H
D e J
H
em subpopulações de linfócitos B. Para cumprir com o nosso objetivo geral nós
traçamos os seguintes objetivos específicos:
i) Analisar o impacto da limitação genética do CDR-H3 no repertório de especificidades
de IgM naturais séricas;
ii) Isolar e caracterizar um antígeno dominante para o qual a reatividade de anticorpos
naturais foi alterada pela limitação genética do repertório, analisado em ( i ), obtendo a
sequência de aminoácidos deste antígeno;
iii) Caracterizar a utilização dos genes V(D)J dos clones de linfócitos B que produzem
as imunoglobulinas que se ligam ao antígeno caracterizado em ( ii ), estimar a
frequência clonal para a especificidade;
iv) Analisar o impacto da limitação genética do CDR-H3 no repertório de
imunoglobulinas das subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal
correlacionando as características do CDR-H3 e o repertório de especificidades
antigênicas.
3. MATERIAL E MÉTODOS
41
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Animais, células e soros: Foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c
fêmeas com idade entre 8 a 10 semanas, a menos quando indicado no texto. WT:
camundongos BALB/c convencionais. BALB/c !D-DFL: camundongos depletados
para o locus D
H
com a inserção de um único segmento gênico DFL16.1 (Schelonka et
al., 2005; Figura 3B). BALB/c !D-iD: camundongos no “background” BALB/c
depletados para o locus D
H
com a inserção de um único segmento gênico DFL16.1
mutado, contendo a seqüência invertida do segmento gênico DSP2.2 (Ippolito et al.,
2006; Figura 3C). C.B-17: camundongos no “background” BALB/c que possuem o
locus de cadeia pesada de camundongos C57BL/6 (alotipo Igh-4
b
). BC8:
camundongos no “background” C57BL/6 que possuem o locus de cadeia pesada de
camundongos BALB/c (alotipo Igh-4
a
) (Liberman et al, 1976). Aliquotas de soros de
camundongos pertencentes a cada um dos grupos acima foram mantidas congeladas e
utilizadas para a análise global do repertório. Timócitos de ratos da raça Sprague–
Dawley com idade de 4 semanas foram utilizados como células alimentadoras em
culturas de diluição limitante (LDA), quando indicado no texto. Para a maioria dos
experimentos de LDA foram utilizadas como células alimentadoras a linhagem S17
(Collins & Dorshkind, 1987) de células estromais da medula óssea de camundongos
(gentilmente cedida pelo Dr. Christopher Clogh, University of Alabama at
Birmingham, USA).
Foram também utilizadas amostras de soro dos seguintes animais: wt ABM=>Rag-/-:
camundongos Rag nocaute, reconstituídos com medula óssea de BALB/c (WT)
adultos; wt NBL=>Rag-/-: camundongos Rag nocaute, reconstituídos com fígado
fetal de WT; !D-iD ABM=>Rag-/-: camundongos Rag nocautes, reconstituídos com
42
medula óssea de camundongos !D-iD adultos. !D-iD NBL=>Rag-/-: camundongos
Rag nocaute, reconstituídos com fígado fetal de camundongos !D-iD. TdT-/- (wt):
camundongos nocautes para a enzima TdT, com “background” BALB/c (WT). TdT-
/- (!D-iD): camundongos nocautes para a enzima TdT, no “background” !D-iD. TdT
Tg: camundongos transgênicos para a enzima TdT.
Os soros foram cedidos pelo Dr Harry Schroeder Jr (University of Alabama at
Birmingham, USA) e os soros dos camundongos TdT Tg, bem como os camundongos
C.B-17 e BC8 foram gentilmente cedidos pelo Dr John F. Kearney (University of
Alabama at Birmingham, USA).
3.2. ELISA para detecção e dosagem de IgM: A concentração de IgM nos soros de
cada animal e nos sobrenadantes de cultura foi medida por ELISA. Placas de 96
orifícios foram cobertas com 1"g/mL de anti-mouse IgM (Southern Biotechnolgy) e
incubadas a 4°C por 18h. Após a incubação, os poços foram bloqueados com tampão
PBS com 1% de gelatina (Calbiochem) por 2h a temperatura ambiente. Após lavagem
com PBS, as amostras de soro foram diluídas seriadamente em PBS 1% gelatina e
incubadas por 18hs a 4°C. Após 5 ciclos de lavagem com PBS, 0.5"g/mL de anti-IgM
secundária conjugada a peroxidase (Southern Biotechnology) diluída em PBS 1%
gelatina foi adicionada e incubada por 1.5h à temperatura ambiente. Após nova
lavagem como acima, as placas foram reveladas com o-phenylenediamine (SIGMA
FAST 0PD) e a leitura feita a 490nm. O cálculo da concentração de IgM foi feito
comparando se com a curva de IgM padrão (Southern Biotechnology).
43
3.3. Análise do repertório de especificidades
3.3.1. Preparo do extrato antigênico: Tecidos (fígado, cérebro, músculo estriado,
coração) de camundongo foram dissociados por lâminas em alta rotação (4000 rpm),
em tampão homogeneizante (0,125M de Tris/HCl pH6,8; 1.45M de 2!-
mercaptoetanol; SDS 4% p/v). Após 30 segundos em homogeneização, o extrato
obtido foi fervido por 10 min, e submetido a centrifugação a 10 000 g por 10 min. O
sobrenadante do centrifugado foi recolhido e filtrado em Millipore de 0.45!m e
utilizado como extrato antigênico dos tecidos. A concentração protéica de cada
extrato foi ajustada ajustada para 8 mg/ml. Procedimento semelhante foi realizado
para a obtenção de antígenos de cultura de E. coli. Neste caso, utilizando culturas de
bactérias em fase exponencial, gentilmente cedidas pelo Dr José Augusto Adler
Pereira da Universidade Estadual do Rio de Janeiro.
3.3.2. Eletroforese: Os extratos antigênicos foram submetidos a eletroforese em gel
de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE 10%). Composição do gel
de separação: tampão 0.375 M Tris/HCl pH 8.8; 10% peso/vol de acrylamida; 0.27%
peso/vol de bis-acrylamida; 0.1% peso/vol de SDS; 0.1% vol/vol TEMED
(N,N,N',N'-Tetra-metilethilendiamina); 0.25% peso/vol de persulfato de amônia.
Composição do gel de empilhamento ("stacking") : tampão 0.125 M Tris/HCl pH 6.8;
4 % peso/vol de acrylamida; 0.1% peso/vol de bis-acrylamida; 0.1% peso/vol de
SDS; 0.08% vol/vol TEMED; 0.05% peso/vol de persulfato de amônia. Quinhentos
microgramas do extrato antigênico em tampão de amostra foi aplicado por gel, sem
uso de pentes. Composição do tampão de amostra: 60 mM Tris/HCl pH 6.8, 100 mM
DTT, 1 ng/ml de Aprotinina (Boehringer),1 ng/ml de Pepstatina (Boehringer), 50
44
ng/ml de TLCK (N-a-tosil-L-lisina clorometil cetona, Boehringer), SDS 2 % peso/vol,
EDTA 1mM; glicerol 10 % vol/vol; azul de bromofenol 0.01 % peso/vol.
3.3.3. Imunoblot: Foi utilizada a técnica de imunoblot modificado como descrito por
Haury et al. (1994). Após a corrida eletroforética, as proteínas foram transferidas do
gel para membrana de nitrocelulose por um eletrotransferidor semi-seco (Semi-Dry
Electroblotter B) durante 75 min a 0.8 mA/cm2. Foi utilizado o sistema com três
tampões distintos. Nove camadas de papel absorvente (Whatman 3mm/Chr)
embebidos no Tampão 1 são colocadas diretamente no anodo, seguido de três
camadas de papel absorvente embebidos do Tampão 2. Acomoda-se a membrana de
nitrocelulose e o gel, e finalmente 9 camadas de papel absorvente embebido em
Tampão 3 em contato com o catodo. Composição do tampão 1: 0.3 M Tris/HCl pH
10.4 , metanol 20% vol/vol. Composição do tampão 2: 0.025 M Tris/HCl pH 10.4,
metanol 20% vol/vol. Composição do tampão 3: 0.025 M Tris/HCl pH 9.4 , metanol
20% vol/vol, 0.004 M ácido 6-amino-n-hexanoico (SIGMA). Após a transferência, a
membrana de nitrocelulose foi incubada com PBS/ Tween-20 (BioRad) a 0.2%
vol/vol por 18 horas em temperatura ambiente. A incubação da membrana de
nitrocelulose contendo os antígenos, com as diferentes amostras de soros e
sobrenadantes de cultura, foi realizada usando-se o Cassete Miniblot System
(Immunetics Inc.). Este sistema permite a incubação dos soros em canais paralelos
separados entre si por 3 milimetros. As amostras ficam confinadas nos respectivos
canais, de modo que as faixas de membrana intercaladas entre estes permanecem
livre de contato com as amostras. Nessas faixas intercalantes, é possível proceder a
coloração das proteínas com ouro coloidal. As faixas intercalantes estão separadas dos
canais de imunorreatividade adjacentes por 1.5 mm. Os soros diluídos 1:20 e os
45
sobrenadantes de cultura diluídos 1:2 foram incubados por 4 horas a temperatura
ambiente e sob agitação. Para evitar a evaporação das amostras nos canais de
incubação, coloca-se um filme plástico fino não poroso (SARAN) atrás da membrana
de nitrocelulose. Após a incubação, remove-se o excesso de soro com 3 lavagens por
10s, seguida por 3 lavagens por 5 min, usando-se PBS/Tween-20 a 0.1% vol/vol. A
detecção das reatividades foi feita com anticorpo secundário de coelho anti-IgM
murina conjugado a fosfatase alcalina (Jackson Immunoreserach). O anticorpo
secundário foi adicionado por 1 - 2 h à temperatura ambiente, em PBS/Tween-20
0.2% vol/vol. Após lavagem em PBS, as reatividades foram reveladas usando-se
como substrato NBT/BCIP (Promega) em tampão 100 mM Tris/HCl pH 9.5. A reação
é interrompida lavando-se abundantemente a membrana de nitrocelulose com água
destilada. Os perfis de imunorreatividade das diferentes amostras foram quantificados
por densitometria, e então submetidos a coloração das proteínas na membrana de
nitrocelulose, utilizando-se ouro coloidal AruoDye Forte (Amesrsham).
Posteriormente, os perfis de coloração protéica (ouro coloidal) foram também
quantificados por densitometria. A cada perfil de imunorreatividade associa-se o
respectivo perfil de proteína, obtido numa faixa intercalante adjacente.
3.3.4. Aquisição de imagens e dados: As imagens dos imunoblots foram adquiridas
por “scanning” (Silverscaner II, resolução de 600 dpi, 256 níveis de cinza), gerando
os arquivos computacionais correspondentes aos perfis de imunorreatividade e
protéicos (antes e após coloração protéica, respectivamente). A quantificação
densitométrica dos perfis foi realizada pelo programa NIH Image (software de
domínio público – NIH) na imagem original (não editada) dos imunoblots, e
46
armazenada em arquivos computacionais para posterior análise e processamento dos
dados.
3.3.5. Processamento dos Dados: Os arquivos contendo as imagens densitométricas
foram processados primeiramente com o programa NIH/Image (NIH), assim como
das colorações protéicas das faixas intercalantes adjacentes. A fim de corrigir as
eventuais distorções da migração eletroforética para permitir a comparação dos perfis
de reatividade das diferentes amostras, utilizou-se o programa IGOR (Wavemetrics)
para Macintosh (Apple Computer Inc.). O ajuste foi feito escolhendo-se um perfil
padrão para as proteínas numa faixa intercalante central do imunoblot, ajustando ao
perfil padrão os perfis protéicos à direita e à esquerda do mesmo da seguinte forma:
(1) identifica-se picos e depressões homólogos significativos presentes nos perfis
protéicos adjacentes; (2) uma vez identificados um número suficiente de
picos/depressões, passa-se a correção e superposição dos picos/depressões
identificados, usando-se o algoritmo de correção linear por partes, conforme descrito
em Haury et al. (1994). Findo esse processamento, pode-se comparar uma
determinada banda de reatividade entre amostras sabendo que estamos comparando
áreas de imuno-reatividade com proteínas de mesmo padrão de migração. Essa
comparação pode ser realizada internamente num mesmo imunoblot ou entre
imunoblots distintos.
3.3.6. Quantificação das reatividades: Calcula-se a área dos picos de reatividade dos
perfis densitométricos de cada amostra. Desse modo, cada perfil de reatividade é
codificado por uma série de valores, correspondendo às intensidades das suas
reatividades; estes valores reunidos formam um vetor de reatividades. A análise
47
comparativa desses dados é realizada com métodos de análise multivariada,
especificamente a Análise por Componentes Principais. Nesse método, o conjunto de
vetores de reatividade é aproximado por uma interpolação com um espaço
dimensional de no máximo 5 ou 6 dimensões, chamados eixos fatoriais. O eixos
fatoriais representam uma média ponderada de cada seção de reatividade, algumas
contribuindo mais que outras na definição de cada eixo. Esta ponderação é feita de
maneira a selecionar as seções que são mais significativas para diferenciarmos entre
as diversas amostras. O tratamento das amostras para submeter à análise estatística
multivariada das matrizes de reatividades obtidas pela metodologia de análise global
do repertório de anticorpos no imunoblot modificado foi realizada pelo método de
Análise de Componentes Principais (PCA). A PCA permite reduzir a
dimensionalidade das matrizes e descrever os dados em componentes principais, que
podem ser posteriormente analisados por uma análise estatística multivarida como a
“linear discriminant analysis”, utilizando o programa Mathematica (Wolfram
Research).
3.4. Isolamento de linfócitos B e expansão policlonal in vitro
3.4.1.Obtenção das subpopulações de linfócitos B: Foram realizados lavados
peritoneais injetando 10 mL de meio RPMI completo [RPMI 1640 (GIBGO)
suplementado com bicarbonato de sódio a 24mM, piruvato de sódio a 1mM,
estreptomicina a 100mg/mL e penicilina a 100U/mL, FBS a 10%, 2b-ME a 5 x 10
-
5
M] e recolhendo usualmente 9 mL de lavado. As subpopulações de linfócitos B
foram isoladas por citometria de fluxo (“cell sorter”) a partir desses lavados de
camundongos !D-iD, !D-DFL e WT com base na expressão de B220, Mac-1 e CD5.
Foram isoladas as três diferentes subpopulações da cavidade peritoneal: linfócitos
48
B1a (B220
lo
, Mac-1
+
e CD5
+
); B1b (B220
lo
, Mac-1
+
e CD5
-
) e B2 (B220
hi
, Mac-1
-
e
CD5
-
).
3.4.2. Cultura de linfócitos B: As células isoladas foram estimuladas in vitro com
lipopolissacarídeo (LPS - Salmonella typhimurium, Sigma-Aldrich) a 30 mg/mL, em
placas de cultura com 96 poços (Corning), em meio RPMI-1640 suplementado, na
presença de células alimentadoras: 3x10
3
S17/orifício ou 1,25 x 10
6
timócitos de rato
quando indicado no texto. A preparação das S17 foi feita de acordo com Collins and
Dorshkind, 1987, plaqueando as células no dia anterior e submetendo as placas a 3000
rad de irradiação gama antes de receber as células B purificadas. As culturas foram
mantidas a 37°C em estufa úmida com 5% de CO2
e ao final de 7-9 dias os
sobrenadantes foram recolhidos e testados para dosagem de IgM por ELISA. Como
controle foram utilizados sobrenadantes de culturas compostas somente por células
alimentadoras estimuladas com LPS. Posteriormente esses sobrenadantes foram
submetidos ao imunoblot para a análise global do repertório e cálculo da freqüência
de clones auto-reativos por análise de diluição limitante. Algumas culturas foram
realizadas utilizando-se outros ligantes de Toll como ativadores policlonais para a
comparação da eficiência de produção de IgM nas diferentes culturas, são eles: 1,5
!g/mL de CpG (ODN 1828, Invivogen), 1!g/mL de Pam3Cys (Invivogen) ou
combinações desses ligantes.
3.4.3. Cultura em diluição limitante e estimativa da freqüência de clones
secretantes de IgM e de clones auto-reativos: Foram feitas análises de diluição
limitante (LDA) de cada população celular para se estimar a freqüência de células
secretoras de IgM por célula B inicialmente em cultura. Para isso, as células foram
49
cultivadas diminuindo se o número de linfócitos B por cultura: 18, 6, 2 e 0,66 células
B por cultura, um total de 24 replicatas foram feitas para cada uma das concentrações
iniciais de células, e então foi verificada a presença ou ausência de IgM em cada
sobrenadante por ELISA. A freqüência de clones respondedores foi calculada pela
regra de Poisson (Andersson et al, 1977a; Taswell, 1981). Para o estudo do repertório
disponível de especificidades 10.000, 3.333, 1.111 e 370 células B purificadas foram
cultivadas nas mesmas condições descritas acima, a IgM foi dosada e então os
sobrenadantes foram submetidos ao imunoblot de extrato de cérebro de acordo com
Nóbrega e colaboradores 1998. A estimativa da freqüência clonal de linfócitos B que
secretam IgM reativas a determinados antígenos é realizada avaliando-se a ausência
ou presença de reatividade para o mesmo. Para cada concentração celular, conta-se o
número de vezes que cada seção apresenta reatividade com os sobrenadantes testados.
Esses dados são utilizados para se calcular a freqüência clonal de linfócitos B
reagindo com cada seção, fazendo uso do modelo teórico de Poisson para LDA, que
estabelece uma relação entre a freqüência de reatividade no imunoblot com cada
seção, com a freqüência clonal de linfócitos B reagindo com esta, como segue: Ln(1-
F) = -(1/f) x N, onde N é o número de células do sobrenadante, F é a freqüência de
reatividade com a respectiva seção no imunoblot, para sobrenadantes com N células, e
f é a freqüência de linfócitos B reagindo com seção analisada.
3.5. Análise do repertório genético de CDR-H3
3.5.1. RNA, RT-PCR, clonagem e seqüenciamento do CDR-H3: 1 a 2x10
4
células
B de cada subpopulação da cavidade peritoneal foram isoladas por “cell-sorting”
diretamente no tampão de lise RLT e o RNA total foi preparado usando QIAGEN
RNeasy mini-kit. Parte do RNA obtido foi submetido ao RT-PCR em um único passo,
50
usando QIAGEN One-Step RT-PCR Kit (Cat# 210212). Foram utilizadas as seguintes
condições para o “One-step RT-PCR”: 50
o
C por 30 minutos para a transcrição
reversa; 94
o
C por 15 minutos para a ativação da HotstarTaq polimerase; 50 ciclos de
94
o
C por 20 segundos para a desnaturação, 50
o
C por 30 segundos para o anelamento
e 72
o
C por 1 minuto para a extensão; e por fim, 72
o
C por 10 minutos de extensão
final. A análise de CDR-H3 foi feita a partir do cDNA amplificado entre a região V
H
e a região constante C! para isso nós utilizamos um pirmer degenerado para a região
V
H
, que já foi demonstrado ser capaz de amplificar genes V
H
de todas as 15 famílias
existentes MsVHE=5’-GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’ (Kantor et al, 1997)
e um primer para a região constante C!: C!1=5’-GACAGGGGGCTCTCG-3’. Os
produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1,5% com Brometo de
Etídio e as bandas referentes aos transcritos VDJ de 400bp foram visualizadas em UV
e cortadas do gel. O cDNA foi extraído do gel utilizando QIAquick Gel Extraction Kit
(Cat# 28704). Os produtos de PCR foram clonados usando o TOPO-TA Coning Kit
(Invitrogen), segundo protocolo do fabricante e seqüenciados usando o primer
degenerado MsVHE em uma “facility”: Heflin Center Sequencing Core at UAB.
3.5.2. Análise do seqüenciamento de CDR3: Os segmentos gênicos foram
identificados de acordo com as sequências germline de IgH publicadas no banco de
dados IMGT - ImMunoGeneTics (http://imgt.cines.fr:8104). O CDR-3 da cadeia
pesada de imunoglobulina foi definido como a região entre os resíduo de cisteína
conservada (TGT) na posição Kabat 92 (IMGT 104) do FR3 à 3’ do V
H
e o triptofano
conservado (TGG) na posição Kabat 103 (IMGT 118) do FR4 à 5’ do J
H
(Figura 3A)
A média de hidrofobicidade do CDR-H3 foi calculada como descrito previamente por
Kyte and Dolittle (1982).
51
3.6. Eletroforese bidimensional e proteômica:
3.6.1. Primeira dimensão – Isoeletrofocalizacão (IEF): Foram utilizadas
Immobiline DryStrips Gels (géis com gradientes de pH imobilizados) de 7cm, com o
intervalo de pH 3-10, e a corrida em um aparelho IPGphor II (Biotech Pharmacia).
Preparo das amostras: As amostras foram diluídas em 125 µl de tampão IEF
(isoeletrofocalizacão) e DTE (ditioeritreitol) 10 mg/ml. Como nosso extrato de
cérebro foi preparado com 4% de SDS, nós tivemos que fazer um pré-tratamento das
amostras antes de submetê-las a isoeletrofocalização. As amostras foram diluídas em
tampão IEF de maneira a conter relativamente 8 vezes mais ASB-14 do que SDS.
Após a diluição foi adicionado 1,25 µl de tampão IPG (anfólito) e as amostras foram
submetidas à agitação durante 1 hora em e, então centrifugadas por 10 minutos a
1500g à temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e utilizado para hidratar
as strips, foram utilizados 200 µg de proteína para a coloração por strip. Preparo da
Isoeletrofocalizacão: Após o preparo, as amostras foram pipetadas no centro dos
“cup loading” em volume de 125 µl, sendo o gel colocado em contato com a amostra.
Após 10 minutos de repouso, foram adicionados 750 µl de óleo mineral. Reidratação
das strips: Após a migração passiva durante 4 h (sem corrente) e ativa durante 12 h a
30 V, as strips foram reidratadas colocando-se, no anodo e no cátodo, dois pedacinhos
de papel de 3 mm de largura úmidos com água destilada, sendo retirado o excesso. A
migração foi feita a 20
o
C e 50 µA/strip, e com o acúmulo de 27.000 volts. Equilíbrio
das strips: As strips foram retiradas do sarcófago e colocadas em tubos de vidro para
serem equilibradas. Foram utilizados 5 ml de tampão de equilíbrio contendo 10 mg/ml
de DTT (Ditiotreitol), durante 10 min sob agitação horizontal. A solução foi retirada e
então adicionado 5ml de tampão de equilíbrio contendo 25 mg/ml de iodoacetamida
durante 10 min sob agitação horizontal.
52
3.6.2. Segunda dimensão - Gel SDS-PAGE: A migração protéica em segunda
dimensão foi feita em géis de SDS-PAGE a 10% de forma já descrita anteriormente
(4.3.2.). Foram corridos 4 géis em paralelo contendo os mesmos extratos, para serem
submetidos a coloração por Comassie Coloidal e outros dois géis foram submetidos
ao imunoblot. Posicionamento das strips e migração dos géis: Após lavar a strip no
tampão de migração, a strip foi posicionada com o lado plástico colocado contra a
placa de vidro, sendo o lado ácido à esquerda, do mesmo lado do marcador de peso
molecular. A strip foi então posicionada em contato com o gel evitando a formação de
bolhas. Os géis foram identificados e submetidos a segunda dimensão da eletroforese
a 50mA até o azul de bromofenol atingir 6cm de corrida. Coloração, Imunoblot e
recorte dos spots: As strips foram retiradas e os géis submetidos ao banho de
coloração com comassie coloidal ou submetidos ao imunoblot, como anteriormente
descrito. Após a coloração os géis foram escaneados e guardados para posterior
recorte das strips, os géis idênticos não corados foram transferidos para membranas de
nitrocelulose. Essas membranas de nitrocelulose foram submetidas ao imunoblot
utilizando-se como anticorpo primário sobrenadante de cultura de células B
pertitoneais ou esplênicos para a identificação do antígeno de interesse. Identificados
os spots na membrana de nitrocelulose, o respectivo spot foi então recortado do gel
corado com comassie coloidal submetidos a digesão triptica e análise pelo espectro de
massa MALDI-TOF.
3.7. Método rápido e quantitativo para o estudo do repertório de Ig: Abaixo estão
descritos de forma sucinta os principais pontos de uma metodologia desenvolvida
durante o doutoramento (Para maiores detalhes ver manuscrito no ANEXO I )
53
3.7.1. Isolamento das células e culturas a partir de um único clone de célula B
(Culturas de clonagem de linfócitos B): As células B1a provenientes da cavidade
peritoneal foram cultivadas de maneira a conter em média 0,66 células por cultura (72
culturas por placa de 96 poços de fundo redondo, 5-10 placas por experimento), sob
estimulação com 30!g/mL de LPS e sobre uma camada de 3 x 10
3
S17, usadas como
células alimentadoras. Para se assegurar a existência de culturas positivas, foram
colocadas na mesma placa 12 poços contendo 6 células B e como controle negativo
12 poços foram cultivados apenas com S17 e LPS. Nós decidimos utilizar somente
0,66 células por cultura, para se diminuir a probabilidade de culturas com duas ou
mais células, o que no momento do seqüenciamento poderia gerar seqüências duplas.
3.7.2. Identificação das culturas positivas para IgM: No quinto dia de cultura, uma
amostra do sobrenadante (25!l) de cada cultura foi retirado e testado em ELISA anti-
IgM como descrito anteriormente (utilizando placas “half area”) para se verificar a
existência de clones secretantes de IgM em cada cultura.
3.7.3. Obtenção e estocagem das células e sobrenadantes: No sexto dia de cultura,
após a identificação das culturas positivas para IgM por ELISA, foram retirados 20 !l
de células de cada cultura positiva e estocado em freezer -80
o
C com 10 unidades de
inibidor de RNase (RNAsin Promega N211A/N211B). Essas amostras foram
estocadas de maneira a preservar o RNA para a obtenção do cDNA para o
seqüenciamento dos segmentos V e J da cadeia leve ou V, D e J da cadeia pesada de
imunoglobulina. Alternativamente, pode-se retirar 5!l de cada cultura e transferir
diretamente para placas de PCR de 96 poços e submeter ao RT-PCR diretamente.
54
Paralelamente, os 200!l sobrenadantes restantes foram guardados e utilizados em
ensaios de ligação antígeno-anticorpo para se identificar a especificidade da
imunoglobulina derivada de um único clone.
3.7.4. Obtenção do cDNA e do ptoduto de PCR: O cDNA das células provenientes
das culturas de clonagem de linfócitos B foi obtido através do “One Step RT-PCR”,
usando se um kit comercialmente disponível. Para se obter o cDNA tivemos que
lançar mão de primers degenerados para a região V, para assegurar que todos os
clones seriam amplificados, independente dos genes V usados. Como primer reverso
nós utilizamos uma seqüência da região constante. Os primer degenerados para as
regiões VH, V" and V# foram desenhados de acordo com Kantor et al. (1997) e Seidl
et al. (1997): MsVHE=5’-GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’, MsV"M=5’-
GAT ATT GTG ATG ACC CAG TCT-3’, MsVM1=5’-CAG GCT GTT GTG ACT
CAG GAA TCT-3’, respectivamente. O primer respecífico C! foi desenhado por nós:
C!1=5’- GACAGGGGGCTCTCG-3’. Os primers específicos para as regiões
constantes C" e C# foram desenhados de acordo com Seidl et al. (1997) MsC"1=5’-
ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT-3’ and MsC#M1=5’-GCA GGA GAC
AAA CTC TTC TCC ACA-3’, respectivamente. Os detalhes das condições do PCR
estão descritas adiante.
3.7.5. “One step RT-PCR”: Para amplificar os genes da cadeia pesada e leve de
imunoglobulina, nós utilizamos o QIAGEN One-Step RT-PCR Kit (Cat# 210212)
comercialmente disponível. Para cada 5 !l de células estocadas a -80
o
C foram usados
20 !l de pré-mix.
O pré-mix foi preparado de acordo com o quadro abaixo:
55
1 reação
100 reações
5x QIAGEN One step RT-PCR buffer
5 !l
500 !l
1st Round primer mix*
0.05 !l
5 !l
dNTPs (10mM)
1 !l
100 !l
QIAGEN One step RT-PCR Enzyme Mix
1 !l
100 !l
RNAsin (40u/!l)
0.1 !l
10 !l
DEPC H
2
O
13 !l
1300 !l
*Foi utilizado um primer degenerado para a região V
H
e um primer para a região constante C!; em
paralelo outra reação foi feita para os genes de cadeia leve " e #, utilizando-se primers degenerados
para a região V e primer específico para as regiões C" e C#.
Foram utilizadas as seguintes condições para o “One-step RT-PCR”: 50
o
C por
30 minutos para a transcrição reversa; 94
o
C por 15 minutos para a ativação da
HotstarTaq polimerase; 50 ciclos de 94
o
C por 20 segundos para a desnaturação, 50
o
C
por 30 segundos para o anelamento e 72
o
C por 1 minuto para a extensão; e por fim,
72
o
C por 10 minutos de extensão final. Devido a nossa técnica utilizar células B
estimuladas com mitógenos e secretantes de IgM, nossas amostras estão muito
enriquecidas para transcritos de mRNA das imunoglobulinas, o que aumenta a
sensibilidade do método não sendo necessária, rotineiramente, a utilização de um
segundo round de PCR. Após obter o produto do RT-PCR, foi corrido um gel de
agarose, e as bandas contendo o cDNA foram cortadas do gel, e o cDNA purificado
de cada banda foi submetido ao seqüenciamento em uma “facility”: Heflin Center
Sequencing Core at UAB e nos experimentos realizados no Brasil o seqüenciamento
foi realizado no Instituto de Biofísica da UFRJ. A análise do seqüenciamento foi feita
da mesma forma já descrita em 4.5.2
56
3.8. Análises estatísticas: A análise de varância (ANOVA) foi realizada utilizando o
teste F de Fisher, como descrito em Methods of Multivariate Analysis / Alvin C.
Rencher, 1995. Os métodos usados para a análise global do repertório de
especificidades está descrita no tópico 3.3.6. Por conveniência, as demais análises
estatísticas utilizadas, bem como as diferenças significativas, estarão apresentadas nas
legendas das figuras.
4. RESULTADOS
58
4. RESULTADOS
4.1. Impacto da limitação genética do CDR-H3 no repertório de especificidades de
imunoglobulinas naturais séricas
De acordo com o objetivo especifico –i– nós analisamos o impacto da restrição
da diversidade genética V
H
DJ
H
no repertório de reatividades de anticorpos naturais em
camundongos BALB/c. Para esse fim, nós utilizamos um ensaio semiquantitativo, uma
modificação da técnica de imunoblot, que permite analisar “em bloco” as reatividades
das imunoglobulinas presentes no soro contra misturas complexas de proteínas,
contendo milhares de antígenos de órgãos inteiros (extrato de cérebro, fígado, músculo
e coração) e um extrato não autólogo de Escherichia coli. Para este ensaio foram
utilizadas amostras de soro de camundongos criados em condições livres de patógenos
específicos “Specific Pathogen Free” (SPF), não intencionalmente imunizados contra
qualquer antígeno exógeno. O foco principal da análise foram os camundongos !D-iD,
os quais foram construídos de maneira a utilizar um segmento D
H
inexistente no locus
D com características não usuais, como utilização de aminoácidos carregados na “loop”
do CDR-H3 (Ippolito et al, 2006). Como controle da restrição da diversidade de
segmentos D
H
foram utilizados camundongos BALB/c convencionais (WT) e, para
controlar o efeito da deleção de 12 dos 13 segmentos D
H
existentes no locus D, foram
utilizados camundongos !D-DFL os quais apresentam somente um único segmento D
H
,
DFL16.1, que é altamente freqüente em todas as populações de linfócitos B de
camundongos WT e gera CDR-H3 enriquecido por aminoácidos neutros no quadro de
leitura principal (RF1), (Ivanov et al, 2005; Schelonka et al, 2005). Os perfis de
reatividade de IgM natural sérica entre os diferentes camundongos congênicos foram
então comparados. A análise de IgM foi escolhida devido a esse isotipo ser o primeiro a
59
ser produzido e ser o mais abundante entre as imunoglobulinas naturais, que também
são constituídas pelos isotipos IgG, IgA e IgE (Avrameas, 1991; McCoy et al, 2006).
4.1.1. O repertório de imunoglobulinas naturais se mantém substancialmente
conservado com poucas diferenças marcantes
Fazendo uma análise qualitativa dos perfis de reatividades de IgM em imunoblot
de extratos autólogos e não autólogo, nós observamos uma substancial homologia entre
os perfis de reatividade das linhagens congênicas de camundongos (!D-iD, !D-DFL e
WT), tanto quando comparadas as reatividades aos antígenos autólogos, quando
comparadas as reatividades no extrato de E. coli (Figura 4). Como pode ser melhor
observado na imagem do imunoblot da Figura 4A, não há grandes diferenças
qualitativas isto é, ausência de alguma banda específica de reatividade em um dos
grupos testados. Para o imunoblot de E. coli, nós adicionamos soros de camunodongos
“germfree”, mostrando que o repertório de especificidades é bem semelhante ao dos
animais BALB/c WT SPF (Figura 4A).
Por outro lado, foi também observada uma divergência clara, embora limitada,
entre os perfis de reatividade dos camundongos transgênicos e os camundongos
selvagens. Uma banda do extrato de cérebro, não identificada no perfil de reatividade
dos camundongos !D-iD e no controle !D-DFL, foi somente reconhecida pelos
camundongos WT (Figura 5A). Determinando seções de reatividade no perfil
densitométrico (Figura 5C) foi possível submeter os dados do imunoblot de extrato de
cérebero (Figura 5A) a uma análise de variância, realizada separadamente para cada
banda de reatividade.
60
Figura 4: Análise global do repertório de especificidades de IgM natural em Imunoblot de
diferentes extratos antigênicos autólogos e não autólogo. A) Perfil individual de reatividades de IgM
sérica e perfil densitométrico médio de reatividades de IgM sérica de camundongos WT e transgênicos,
!D-DFL e !D-iD, em Imunoblot de extrato de E. coli. B) Perfil densitométrico médio de reatividades de
IgM sérica de camundongos WT e !D-iD em Imunoblot de extrato de coração, músculo (C), fígado (D) e
cérebro (E). WT: camundongos BALB/c selvagens; !D-DFL: camundongos expressando um único gene
D
H
, DFL16.1; !D-iD: camundongos expressando um único gene D
H
, DSP2.2 invertido; “germfree”:
camundongos sem microbiota autóctone.
B
C
D
E
A
61
Como demonstrado na Figura 5C, não houve diferenças significativas entre 29
das 30 seções definidas, somente a seção 8 apresentou diferença estatisticamente
significativa (p<0.05) comparando os camundongos WT com os camundongos
transgênicos (Figura 5D). A seção 8 é exatamente a proteína de 70kD indicada pela seta
na Figura 5A.
Figura 5: Análise do repertório de especificidades de IgM natural em Imunoblot de extrato
antigênico de cérebro de camundongos BALB/c. A) Perfil individual de reatividade de IgM sérica no
Imunoblot. B) Perfil densitométrico médio de reatividades de IgM sérica de camundongos WT e !D-iD.
C) Definição das seções de reatividade no perfil densitométrico de uma amostra de soro de camundongo
WT. D) Análise de variância para cada seção pré-definida. !D-iD: camundongos expressando um único
gene D
H
, DSP2.2 invertido; WT: camundongos BALB/c selvagens; !D-DFL: camundongos expressando
um único gene D
H
, DFL16.1. As setas indicam a reatividade com um antígeno de 70kD que não está
presente no repertório natural dos animais transgênicos.
B
A
62
Figura 5 (continuação): a legenda está na página anterior
C
D
63
4.1.2. Evidências da participação dos linfócitos B1 na produção dos anticorpos
naturais que reconhecem uma proteína de 70kDa no extrato de cérebro
Tendo em vista o suposto papel dos linfócitos B1 na produção dos anticorpos
naturais e a maior quantidade dessas células na cavidade peritoneal (Lalor et al, 1989;
Baumgarth et al, 1999), decidimos comparar o repertório de especificidades de IgM
disponível neste compartimento com o repertório disponível no baço de camundongos
BALB/c, em especial para verificar a presença da reatividade com a proteína de 70 kD
presente no extrato de cérebro. Para isso, nós realizamos culturas de esplenócitos e de
células do lavado peritoneal estimuladas de forma policlonal com LPS, sobre uma
camada de timócitos de rato. Os sobrenadantes dessas culturas foram coletados após 7
dias e testados no imunoblot de extrato de cérebro. A análise comparativa do repertório
destes sobrenadantes revelou uma extensa semelhança entre esses dois compartimentos,
porém com uma diferença marcante, a reatividade com a proteína de 70kDa do extrato
de cérebro está fortemente presente nos sobrenadantes de cultura de células B obtidas da
cavidade peritoneal, mas fracamente observadas ou ausente nos sobrenadantes de
cultura de células B esplênicas, sugerindo o envolvimento das células B1 com a
reatividade (Figura 6).
64
Figura 6: Comparação entre os perfis de reatividade de IgM esplênica e peritoneal em immunoblot
de extrato de cérebro de camundongos BALB/c. Linfócitos B da cavidade peritoneal e linfócitos B
esplênicos de animais BALB/c foram cultivados in vitro por 7 dias, na presença de LPS (30!g/mL). Os
sobrenadantes destas culturas foram testados para reatividade de IgM com antígenos de cérebro
singênicos no ensaio de imunoblot. A) Perfil individual de reatividade de IgM de sobrenadantes de
cultura no Imunoblot. B) Perfil densitométrico médio de reatividades de IgM de sobrenadante de cultura
(splenic SN e peritoneal SN). A seta indica a reatividade com o antígeno de peso molecular aproximado
de 70 kDa.
65
Quimeras RAG-/- reconstituídas com medula óssea de animais adultos
regeneram completamente a população de linfócitos B convencionais ou linfócitos B2,
mas não regeneram completamente a população de linfócitos B1 da cavidade peritoneal
(Hayakawa and Hardy, 1991; Esplin et al, 2009), os quais derivam de um precursor
abundante no fígado fetal (Montecino-Rodriguez et al, 2006). Para verificar a origem
dos clones responsáveis pela reatividade com a proteína de 70kD no extrato de cérebro,
nós realizamos a análise do repertório de especificidades de anticorpos naturais de
quimeras RAG-/- reconstituídas com medula óssea adulta e fígado fetal de
camundongos BALB/c WT e camundongos !D-iD após 4 semanas de reconstituição.
Nós verificamos, na análise do perfil de reatividade de IgM sérica de quimeras de
medula óssea de !D-iD!RAG-/- e WT!RAG-/-, que a banda de reatividade perdida
no perfil !D-iD também estava ausente nas quimeras de medula óssea WT!RAG-/-.
Entretanto, essa reatividade estava presente na IgM sérica de quimeras RAG-/-
reconstituídas com células provenientes de fígado fetal de WT!RAG-/- (Figura 7),
reforçando as evidências do envolvimento de linfócitos B1 com a reatividade, uma vez
que é sabido que estas quimeras prontamente regeneram a população B1 peritoneal.
Além disso, ficou demonstrado que mesmo reconstituindo preferencialmente a
população de linfócitos B1a peritoneais nas quimeras de fígado fetal !D-iD a
reatividade com a proteína de 70kD no extrato de cérebro não reapareceu no repertório
de especificidades naturais dessas quimeras.
66
Figura 7: Perfil de reatividade de IgM de camundongos Rag -/- reconstituídos com medula óssea ou
fígado fetal de camunongos !D-iD ou WT em Imunoblot de extrato de cérebro. WT=>RAG-/-
(ABM): Rag-/- reconstituídos com medula óssea de WT; !DiD=>RAG-/-(ABM): Rag-/- reconstituídos
com medula óssea de !DiD; WT=>RAG-/-(NBL): Rag-/- reconstituídos com fígado fetal de WT;
!DiD=>RAG-/-(NBL): Rag-/- reconstituídos com fígado fetal de !DiD. !D-iD: controle negativo para a
banda de reatividade diferenciada; WT: controle postivo para a banda de reatividade. A seta indica a
reatividade com o antígeno de peso molecular aproximado de 70 kDa.
67
4.1.3. As IgM naturais que reagem com a proteína de 70kD no extrato de cérebro,
presente no soro de animais BALB/c WT são produzidas por linfócitos B1a
Tomados em conjunto, estes dados sugerem fortemente que a auto-reatividade
com a proteína de 70kD presente no extrato de cérebro, é produto fisiológico de
linfócitos B1 de origem fetal. Para confirmar de forma inequívoca qual subpopulação de
linfócitos B da cavidade peritoneal é responsável por esta auto-reatividade, nós
isolamos as subpopulações por citometria de fluxo (“cell sorting”) e fizemos culturas
dessas células in vitro. Foram isoladas as três diferentes subpopulações com base na
expressão de B220, Mac-1 e CD5: linfócitos B1a (B220
lo
, Mac-1
+
e CD5
+
); B1b
(B220
lo
, Mac-1
+
e CD5
-
) e B2 (B220
hi
, Mac-1
-
e CD5
-
), obtendo uma média de 97% de
pureza em cada população (Figura 8A). Essas células purificadas foram então
estimuladas para a produção de IgM de forma policlonal com LPS, sobre uma camada
de S17 como células alimentadoras, e os sobrenadantes dessas culturas foram testados
no imunoblot de extrato de cérebro. Foi utilizada a técnica de diluição limitante (LDA),
com culturas iniciadas com diferentes concentrações de células B por poço (10.000;
3.333; 1.111; 370). Eliminando a possibilidade de contaminação com outras
subpopulações de linfócitos B pela LDA foi possível demonstrar que os linfócitos B1a
são os produtores das imunoglobulinas naturais que reagem com o antígeno de 70kD no
extrato de cérebro (Figura 8B-D).
68
Figura 8: Isolamento das subpopulações de
linfócitos B da cavidade peritoneal por
citometria de fluxo e comparação entre os perfis
de reatividade de IgM provenientes de células
B1a, B1b e B2 em imunoblot de extrato de
cérebro. A) Regiões definidas para isolar os
linfócitos B da cavidade peritoneal: B1a, B1b e B2.
Os linfócitos B peritoneais de animais BALB/c
foram cultivados in vitro por 7 dias, na presença de
LPS (30!g/mL) e S17 como células alimentadoras.
Os sobrenadantes destas culturas foram testados
para reatividade de IgM com antígenos de cérebro
no ensaio de imunoblot. B) Perfil individual de
reatividade de IgM de sobrenadantes de cultura no
Imunoblot com 3.333 células B1a e B2 por cultura.
C) com 3.333 e 1.111 células B1b por cultura. D)
com 370 B1a e 370 B1b por cultura. A seta indica a
reatividade com o antígeno de peso molecular aproximado de 70 kDa. As linhas S17 são sobrenadantes de
cultura contendo somente S17 como controle negativo; a linha P é um pool de sobrenadantes de culturas
contendo 10000 linfócitos B1a por cultura
A
B
A
C
D
69
Uma das principais peculiaridades dos linfócitos B que são gerados durante a
vida fetal do camundongo é a ausência de nucleotídeos N nas junções V
H
!D e D!J
H
da cadeia pesada de imunoglobulina (Feeney, 1990). Isto se deve a ausência de
expressão da enzima desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) no período fetal e
neo-natal (Desiderio et al, 1984). Para se obter indícios do envolvimento de clones de
linfócitos B1a com rearranjos canônicos, ou sem inserção de nucleotídeos N, na
produção das IgM responsáveis pela reatividade com a proteína de 70kD, nós
obtivemos amostras de soros de animais deficientes para TdT, que apresentam um
repertório semelhante ao fetal, sem adição de nucleotídeos N (Gilfillan et al, 1993) e
também de animais transgênicos para TdT, que expressam esta enzima de forma
constitutiva, desde o período fetal, resultando em alteração do repertório das células
B1a, que passam a apresentar com maior freqüência a inserção de seqüências N
(Benedict & Kearney, 1999). Como demonstrado na Figura 9, camundongos TdT
nocautes apresentam a reatividade com a proteína de 70kD no soro, enquanto que os
animais que tiveram a sua diversidade juncional aumentada, os TdT transgênicos,
perderam essa reatividade sérica, sugerindo que o aumento do uso de nucleotídeos N
nas junções do CDR-H3 impede ou diminui a probabilidade da geração de clones B1a
com a especificidade para essa proteína no extrato de cérebro. Além disso,
camundongos TdT nocautes que apresentam concomitantemente a mutação !D-iD
também não apresentaram a reatividade no soro.
Esses dados, juntamente com os resultados obtidos com as quimeras
reconstituídas com fígado fetal, confirmam as evidências de que células B1a de origem
fetal com seqüências “germline”, desprovidas de seqüências N, são as prováveis
responsáveis pela reatividade com a proteína de 70kD no extrato de cérebro.
70
Figura 9: Perfil de reatividade de IgM sérica de camundongos TdT KO: nocautes para a enzima
transferase desoxinucleotidil terminal; TdT Tg: camundongos transgênicos para a enzima
transferase desoxinucleotidil terminal e TdT KO(!D-iD): camundongos TdT nocautes no
background D-iD. A) Perfil individual de reatividade de IgM sérica no Imunoblot de extrato de cérebro.
B) Perfil densitometrico de reatividades de Igm sérica de camundongos TdT KO, e um soro TdT
transgênico. A seta mostra a presença da reatividade com a proteína de 70kD no soro do animal TdT KO.
71
4.1.4. As IgM naturais que reagem com a proteína de 70kD no extrato de cérebro,
são produzidas mesmo na ausência de microbiota autóctone
Para verificar se as imunoglobulinas que reagem com o antígeno de 70kD no
extrato de cérebro estão presentes mesmo na ausência de microbiota autóctone, nós
estudamos o repertório de especificidades de IgM naturais de camundongos BALB/c
“germfree” e comparamos com o perfil de reatividade de camundongos BALB/c
convencionais. Como demonstrado na Figura 10A, as concentrações de IgM séricas é
bem semelhante entre os diferentes animais, enquanto que a concentração de IgG nos
animais convencionais é significantemente maior do que nos animais “gemfree”.
Quanto ao repertório de especificidades no imunoblot de extrato de cérebro (Figura
10B), o perfil de reatividades é semelhante entre os camundongos criados nas diferentes
condições, em especial para a reatividade a proteína de 70kD, sugerindo que essa
especificidade é independente de expansão clonal dirigida por estímulos externos,
característica marcante dos anticorpos naturais.
72
Figura 10: Concentração de IgM e IgG sérica e análise do repertório de especificidades de IgM
natural de camundongos BALB/c criados em condições “specific pathogen free” (SPF) e em
condições “germfree” (GF). A) Comparação da concentração de IgM sérica em camundongos SPF e GF
(p= 0.2742). B) Comparação da concentração de IgG sérica em camundongos SPF e GF (P<0.005). Foi
utilizado teste t não paramétrico (two tailed). C) Perfil individual de reatividade de IgM sérica no
Imunoblot de extrato antigênico de cérebro D) Perfil densitométrico médio de reatividades de IgM sérica.
As setas indicam a reatividade com um antígeno de 70kD que não está presente no repertório natural dos
animais transgênicos.
SPF
GF
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
A
SPF
GF
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
B
73
4.2. Obtenção da sequência de aminoácidos do autoantígeno dominante presente
no extrato de cérebro para o qual a reatividade de anticorpos naturais foi alterada
pela limitação genética do repertório
Os estudos realizados por Nóbrega e colaboradores vêm demonstrando que o
repertório de anticorpos naturais do isotipo IgM apresenta reatividade com um seleto
grupo de antígenos do extenso painel de antígenos próprios, e não próprios, utilizados
nos ensaios de imunoblot, anteriormente descrito. Estes trabalhos demonstraram que o
repertório de anticorpos naturais é caracterizado por algumas autoreatividades
principais, ignorando os demais autoantígenos, definindo uma noção de “humunculus
imunitário” (Haury et al, 1994; Nóbrega et al, 1993; Mouthon et al, 1995; Nóbrega et al,
1998). No presente trabalho identificamos uma autoreatividade que apesar de estar
presente no repertório de anticorpos naturais de camundongos BALB/c convencionais,
parece ser ignorada pelos camundongos com limitação genética dos segmentos D, a
despeito da homologia do repertório apresentada em todos os outros extratos analisados.
Desta forma, constituiu-se um dos objetivos desta tese a identificação e obtenção da
seqüência de aminoácidos dessa proteína de 70kD.
Para obter a sequência de aminoácidos da proteína de 70kD presente no extrato
de cérebro utilizamos métodos de proteômica, mas a maior dificuldade encontrada por
nós foi identificar e isolar uma única proteína de um extrato protéico entre centenas a
milhares de antígenos. Para isso nós tivemos que realizar eletroforese bi-dimensional
para separar as diferentes proteínas existentes em cada banda de reatividade em spots
com proteínas únicas. A primeira limitação foi padronizar as condições da primeira
dimensão (Isoeletrofocalização), pois os nossos extratos protéicos são preparados com
altas concentrações de SDS (4%) e é sabido que preparações antigênicas com SDS não
74
migram eficientemente em géis de isoeletrofocalização (Ames & Nikaido, 1976). Foram
realizados ensaios para diminuir a concentração do SDS no momento da extração sem
afetar a solubilização dos antígenos, principalmente da proteína de interesse de 70kD.
Nós verificamos que abaixo de 1% de SDS a proteína não é mais solubilizada e as
bandas de reatividade desaparecem no imunoblot (dados não mostrados). A solução
encontrada foi diluir o extrato em tampão de isoeletrofocalização (IEF) na razão de 1:8
de SDS:ASB14 ou NP40 (detergentes não iônicos) antes de se aplicar as amostras nas
imobilinas (Ames & Nikaido, 1976; Martins et al, 2007), dessa forma conseguimos
aumentar a eficiência de resolução dos spots no gel 2D sem perder solubilização da
proteína de interesse (Figura 11A).
Para identificar qual spot do gel seria referente à autoreatividade de interesse,
realizamos imunoblots em paralelo com géis de resolução idênticas entre si. Nós então
submetemos amostras de sobrenadante de cultura de linfócitos B peritoneais, que
reconhecem fortemente a reatividade no extrato de cérebro, ao imunoblot 2D com
extrato de cérebro. Paralelamente foram feitos imunoblots com sobrenadantes de cultura
de células B esplênicas que não reagem ou fracamente reagem com a proteína de 70kD.
A Figura 11 mostra um gel 2D corado com comassie coloidal para a visualização das
proteínas e uma réplica em membrana de nitrocelulose contendo as mesmas proteínas
reveladas no imunoblot 2D com IgM total de sobrenadante de cultura de células
peritoneais. O perfil total de reatividade com os spots no imunoblot 2D mostrou o que já
era observado no imunoblot convencional, a grande maioria dos antígenos são
ignorados pelas IgM, com algumas reatividades bem definidas. A proteína de interesse
de 70kD foi identificada por uma forte reatividade com o sobrenadante de cultura de
células B peritoneais, da mesma forma que foi observada anteriormente no imunoblot
convencional. O “spot” referente à proteína reconhecida pelas IgM peritoneais foi
75
retirado do gel e submetido à digestão tríptica e posterior análise de fragmentos
peptídicos por espectrofotemetria de massa. A Figura 12A mostra o espectro obtido
para essa proteína, o padrão obtido foi comparado com um banco de dados de
proteômica, resultando na identificação inequívoca de uma proteína da família HSP70
(Figura 12B), mais especificamente Hspa8, também conhecida como HSC70 que é uma
proteína de expressão constitutiva em tecido cerebral e em vários outros órgãos. A
seqüência primária de aminoácidos dessa proteína está mostrada na Figura 12C.
Figura 11: Identificação da auto-reatividade em imunoblot 2D de extrato de cérebro autólogo. A)
Eletroforese bi-dimensional de extrato de cérebro corado por comassie coloidal. B) Réplica do gel testado
em imunoblot com sobrenadantes de células peritoneais. A posição da proteína de 70kD está indicada por
uma seta. Note que à esquerda de cada gel está a corrida eletroforetica em primeira dimensão e o perfil de
reatividade no imunoblot convencional, mostrando a posição da imunoreatividade.
A
B
76
Figura 12: Análise proteômica da reatividade com o
antígeno de cérebro autólogo. A) Espectro de digestão
triptica da proteína de 70kD. O padrão obtido foi
comparado com o banco de dados de proteômica,
resultando na identificação inequívoca da molécula
HSC70 (Hspa8). B) Comparação do domínio
conservado da HSC70 com a família das HSP70,
mostrando uma intensa homologia. C) Sequência de
aminoácidos da proteína submetida (nossa amostra) e a
Hspa8, mostrando 100% de homologia.
A
B
C
77
4.3. Caracterização dos genes V(D)J de um clone de linfócitos B1a secretante da
IgM que reage com a HSC70 no imunoblot
Os dados de repertório demonstrados até aqui, sugerem que células B1a de
origem fetal com sequências “germline” são as prováveis responsáveis pela auto-
reatividade natural com a HSC70 no extrato de cérebro. A demonstração inequívoca
disso exige o isolamento do clone B1a que reage com a proteína, clonagem e
sequenciamento dos genes variáveis de imunoglobulina.
Estudos correlacionando o repertório de especificidades com o repertório
genético das regiões V normalmente dependem da geração de grandes quantidades de
hibridomas, clonagem e o posterior “screening” em ensaios de ligação a antígenos para
se identificar os hibridomas secretantes da especificidade de interesse e então proceder à
obtenção do cDNA e o sequenciamento dos clones. Esta técnica consagrada é eficiente
principalmente nos casos em que se deseja isolar um anticorpo monoclonal com uma
especificidade definida a uma determinada proteína para a qual pode-se proceder a
imunização e expansão do clone de interesse e posterior isolamento do clone.
Entretanto, para o estudo do repertório natural essa técnica é limitada, devido à baixa
freqüência de clones auto-reativos e à baixa eficiência de fusão, e acima de tudo por
introduzir distorções no tamanho clonal o que a torna incapaz de quantificar a
freqüência real de cada clone. Alguns trabalhos utilizando o isolamento de células por
citometria de fluxo e a tecnologia de PCR a partir de uma única célula (“single cell
PCR”), possibilitaram a quantificação real do repertório genético por meio do
sequenciamento dos genes de cadeia leve e pesada de um único clone (Kantor et al,
1997; Seidl et al, 1997; 1999), mas não possibilitam a análise do repertório de
78
especificidades, uma vez que as imunoglobulinas desses clones não podem ser obtidas
nesses ensaios. Trabalhos mais recentes utilizaram a mesma estratégia anterior, seguida
pela clonagem e transfecção dos genes de imunoglobulinas em células competentes que
secretam as imunoglobulinas, que a partir de então podem ser usadas em ensaios de
especificidade (Tiller et al, 2008). Embora essa última técnica possibilite a
quantificação do tamanho clonal e a obtenção tanto da imunoglobulina como dos genes
utilizados, ela é muito trabalhosa exigindo o isolamento, sequenciamento e transfecção
de centenas a milhares de células para então estimar a frequência clonal e obter
determinados clones de interesse em indivíduos não imunizados. Dessa forma, até hoje
não existe uma técnica rápida e eficiente de descrição do repertório de imunoglobulinas
que permita ao mesmo tempo a detecção da especificidade antigênica, a caracterização
dos genes V e a estimativa da freqüência real de cada clone.
4.3.1 Nova metodologia para a descrição rápida e quantitativa do repertório de
imunoglobulinas
Nós desenvolvemos uma nova técnica de descrição do repertório, capaz de
suprir as limitações citadas acima, e a utilizamos para caracterizar os genes V do clone
de linfócito B1a que reconhece a HSC70 no imunoblot de extrato de cérebro, de acordo
com o objetivo especifico –iii–. Descrevermos aqui os pontos principais de validação da
técnica, usando como exemplo a obtenção do clone auto-reativo a HSC70 (para maiores
detalhes ver Material e Métodos e manuscrito submetido para publicação - Anexo I): (i)
isolamento da população de linfócitos B de interesse; (ii) cultura dessas células em
números variáveis de linfócitos B por poço na presença de células alimentadoras e
mitógenos policlonais; (iii) estimativa da frequência de clones secretantes de IgM e da
frequência de clones que reconhecem HSC70 no imunoblot, utilizando LDA; (iv)
79
culturas de clonagem sob as mesmas condições anteriores, mas com 0,66 linfócitos B
por poço, o número de replicatas depende da frequência do clone determinada em –iii–;
(v) determinação dos poços positivos para IgM no dia 5 de cultura de clonagem; (vi) no
sexto dia de cultura, coleta das células do fundo de cada poço positivo para IgM e
estocagem de maneira a preservar o mRNA para posterior uso no RT-PCR; (vii)
realização do imunoblot de extrato de cérebro, utilizando os sobrenadantes positivos
para IgM para a detecção da reatividade com HSC70; (viii) obtenção do cDNA das
células estocadas em –vi– e que reconheceram a HSC70 em –vii–; (xix)
sequenciamento dos genes de cadeia pesada e leve.
4.3.1.1. A combinação de diferentes ligantes de Toll pode elevar a frequência de
clones respondedores a aproximadamente 100%, independente do “background”
genético do camundongo
Uma das maiores críticas a técnicas que utilizam linfócitos B previamente
estimulados com LPS para a análise do repertório genético se deve à reposta ao LPS
variar de acordo com o “background” genético do animal (Andersson et al, 1977b;
Rodo et al, 2006), sugerindo que a amostragem que é submetida a análise não
representaria o repertório real de genes V disponível no organismo (Kantor et al, 1997).
Para demonstrar que nossa análise é capaz de abranger uma amostragem real da
população de linfócitos B de forma não tendenciosa, e que a resposta ao LPS é inerente
ao “background” genético mas não depende do locus V
H
, nós realizamos experimentos
com animais congênicos para o locus V
H
. Foram realizadas LDA para estimar a
frequência de clones respondedores ao LPS com células peritoneais e esplênicas de
camundongos C.B-17, que possuem o locus de cadeia pesada de camundongos
C57BL/6 (alotipo Igh-4
b
) no “background” BALB/c e de camundongos BC8, que
80
possuem o locus de cadeia pesada de camundongos BALB/c (alotipo Igh-4
a
) no
“background” C57BL/6 (Liberman et al, 1976). A Figura 13A mostra a LDA
comparativa entre esses animais congênicos em culturas de células totais da cavidade
peritoneal e de células totais esplênicas. Os camundongos BC8 apresentaram frequência
de clones respondedores ao LPS em torno de 80 e 100% em células do baço e em
células peritoneais, respectivamente, enquanto que camundongos C.B-17 apresentaram
de 45 a 55% de células respondedoras provenientes da cavidade peritoneal e de 15 a
25% das células esplênicas responderam ao estímulo por LPS. Nossos resultados
mostraram que a resposta ao LPS está diretamente relacionada com o “background”
genético e não com o alotipo de cadeia pesada, uma vez que a freqüência de clones
respondedores ao LPS dos camundongos BC8 e C.B-17, em ambos os compartimentos,
é exatamente a mesma de camundongos C57BL/6 e BALB/c, respectivamente (Figura
13A-B, manuscrito submetido para publicação - Anexo II). Em experimentos
adicionais, nós demonstramos que a combinação de outros mitógenos ligantes de toll,
como CpG e Pam3Cys, aumenta eficientemente a freqüência de clones respondedores
em camundongos BALB/c. Os resultados apresentados na Figura 13C mostram que
utilizando a combinação de LPS e CpG em culturas de linfócitos B1a de BALB/c
isoladas por citometria de fluxo, a frequência de clones respondedores atinge 90%,
frequência semelhante à apresentada pelas células B de camundongos C57BL/6. Estes
dados, em conjunto, mostram que a nossa técnica garante uma análise não tendenciosa
do repertório disponível de imunoglobulinas.
81
Figura 13: Análise comparativa da frequência de células respondedores ao LPS em animais BC8
(IgH alotipo a) e C.B-17 (IgH alotipo b) e o aumento da frequência de clones de linfócitos B1a
provenientes de camundongos BALB/c secretantes de IgM em resposta a diferentes ligantes de Toll
. A) Análise por diluição limitante (LDA) para estimar a frequência de células B peritoneais (peritoneal
cells) e esplênicas (splenic cells) respondedoras ao LPS de camundongos C57BL/6 e BALB/c (figura
retirada do manuscrito submetido para publicação ANEXO II). B) Análise por diluição limitante (LDA)
para estimar a frequência de células B peritoneais (PerC) e esplênicas (Spl) respondedoras ao LPS; BC8,
camundongos no “background” C57BL/6 que possuem o locus de cadeia pesada de camundongos
BALB/c (alotipo Igh-4a); C.B-17, camundongos no “background” BALB/c possuem o locus de cadeia
pesada de camundongos C57BL/6 (alotipo Igh-4b). C) Análise por diluição limitante (LDA) para estimar
a frequência de células B1a de BALB/c respondedoras ao LPS (30!g/mL), Pam3Cys (1!g/mL), CpG
(1,5!g/mL) e combinações desses mitógenos.
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.01
0.1
1
0.37
PerC
22%
52%
C.B-17
Spl
Número de células B por cultura
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.01
0.1
1
0.37
PerC
84%
100%
BC8
Spl
Número de células B por cultura
C
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.01
0.1
1
0.37
LPS
53%
BALB/c
42%
Pam3Cys
CpG
26%
Número de células B1a por cultura
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0.01
0.1
1
0.37
LPS+CpG
52%
BALB/c
88%
LPS+Pam3Cys
Número de células B1a por cultura
A
82
4.3.2. Determinação da frequência de clones de linfócitos B1a que apresentam a
reatividade com HSC70
Antes de proceder as culturas de clonagem para o isolamento de clones
autoreativos à HSC70, realizamos culturas em LDA para estimar a frequência de
linfócitos B1a secretantes de IgM que reagem com a proteína no extrato de cérebro. A
Figura 14A-C mostra as imagens do imunoblot utilizando sobrenadantes de culturas
com variáveis números de células B1a por poço. A Figura 14D mostra a distribuição de
Poisson usada para estimar da frequência da reatividade com HSC70, os resultados
indicam que um em cada 125 (0,8%) linfócitos B1a da cavidade peritoneal reconhecem
a HSC70 no imunoblot.
83
Figura 14: Determinação da frequência de clones reativos à HSC70 no imunoblot de extrato de
cérebro. Reatividade de 24 sobrenadantes de culturas independentes de linfócitos B1a estimulados com
LPS, contendo 90 (A); 40 (B) e 20 (C) células B1a secretantes de IgM por poço. Foram usados como
controle, sobrenadantes de culturas contendo somente S17 e como controle positivo (P) pool de
sobrenadantes de culturas contendo 10.000 linfócitos B1a por cultura. D) Distribuição de Poisson dos
dados obtidos no imunoblot para estimar a frequência de células B1a secretantes de IgM que reconhecem
a proteína HSC70. A reatividade a HSC70 está indicada por uma seta.
A
B
D
100 200 300 400 500
0.01
0.1
1
0.37
0,8%
Número de células B1a
secretantes de IgM por cultura
C
84
4.3.3. Culturas de clonagem de linfócitos B: a quantidade de IgM obtida da
expansão de um clone é suficiente para a determinação da especificidade
Determinada a frequência dos clones reativos a HSC70, 720 replicatas de
culturas de clonagem foram feitas contendo 0,66 células B1a por poço estimuladas por
LPS. No quinto dia foram determinadas as culturas positivas para IgM, sendo
identificados ao todo 188 sobrenadantes de culturas positivos (Figura 15A) que foram
submetidos ao imunoblot. As culturas de clonagem produziram em média 18 ng/mL de
IgM, sendo essa concentração suficiente para detecção de clones secretantes de IgM que
reconhecem a proteína HSC70 no extrato de cérebro (Figura 15B). Dos 188
sobrenadantes de cultura de clonagem positivos para IgM, 93% não reconheceram
nenhum dos antígenos no imunoblot de extrato de cérebro, entre os sobrenadantes que
apresentaram reatividades, dois reconheceram especificamente a HSC70 no imunoblot.
A Figura 15C mostra um dos clones reativos à HSC70. Ao todo nesse experimento,
outros 13 sobrenadantes reconheceram diferentes autoantígenos (dados não mostrados),
inclusive demonstrando de forma inequívoca a presença de clones multireativos no
repertório disponível de linfócitos B1a (Figura 15D, clone MW5D6). Esses dados
mostram que nossa abordagem é extremamente eficiente para a identificação e
caracterização de clones reativos utilizando painéis antigênicos com centenas e milhares
de antígenos, que também poderiam ser caracterizados da mesma forma que a
reatividade anti-HSC70.
85
Figura 15: Identificação dos clones secretantes em culturas de clonagem, determinação da
concentração de IgM por clone e reatividade monoclonal dos sobrenadantes de culturas de
clonagem no imunoblot de extrato de cérebro. A) Identificação das culturas de clonagem positivas para
IgM através de ELISA anti-IgM. Em cada placa de cultura de 96 poços de fundo redondo foram feitas 72
culutras de clonagem com 0,66 células B por poço, 12 culturas contendo somente S17 como controle
negativo e 12 culturas contendo 18 células por poço como controle positivo. Para esse experimento foram
feitas 10 placas de cultura de clonagem. B) Determinação da concentração de IgM em cada cultura
positiva, a concentração média obtida foi de 18ng/mL. C) Reatividade de 24 sobrenadantes independentes
de culturas de clonagem de linfócitos B1a estimulados com LPS, a grande maioria das culturas não
reconhecem nenhum antígeno no imunoblot. Na linha MN3A está o clone reativo com HSC70, a
reatividade esta indicada pela seta. As linhas S17 são sobrenadantes de cultura contendo somente S17
como controle negativo; a linha P é um pool de sobrenadantes de culturas contendo 10000 linfócitos B1a
por cultura. As linhas sem identificação são sobrenadantes de cultura positivos para IgM mas que não
reconheceram nenhum antígeno no extrato de cérebro. D) Reatividade de 24 sobrenadantes independentes
de culturas de clonagem, como descrito em C. Foram usados os mesmos controles. Linha 5G2, representa
a reatividade do clone 5G2 seqüenciado (ver Fig16C) com uma proteína de 190kD no extrato de cérebro.
Linha MW5D6, identificação de um dos clones multireativos encontrados e o perfil de reatividade com
diversos antígenos. Linha NI, reatividade a um antígeno no extrato de cérebro por um clone não
identificado.
cut-off
18
0.66
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
cut-off
Numero de linfócitos B1a por cultura
0.66
1
10
100
Número de linfócitos B1a por cultura
A
B
D
C
86
4.3.4. Culturas de clonagem e “one-step” RT-PCR são eficientes na obtenção de
transcritos de Ig de plasmócitos originados de um único clone de linfócitos B
Uma vez identificados dois clones que secretaram IgM capaz de ligar a HSC70,
passamos para a etapa de RT-PCR, para isolamento e amplificação dos genes V
H
e V
L
utilizados por esses clones. Para determinar a eficiência da nossa técnica na obtenção de
transcritos de RNA a partir de culturas de clonagem de células B positivas para secreção
de IgM, diferentes experimentos foram feitos, totalizando 72 amostras. Nossa técnica
foi capaz de obter e amplificar até 70% dos transcritos de imunoglobulinas dos clones
individuais testados. A Figura 16A mostra o resultado de um PCR em que nós
amplificamos os transcritos de cadeia pesada de 7 do total de 11 células testadas nesse
experimento. É de extrema importância salientar que esses resultados foram obtidos em
culturas de clonagem, utilizando S17 como células alimentadoras. Nós realizamos os
mesmos experimentos, utilizando o protocolo clássico com timócitos de ratos jovens
como células alimentadoras, o que resulta também em uma alta eficiência de clones
respondedores ao LPS, mas em contrapartida não foi possível a obtenção de transcritos
de imunoglobulinas das células B (Figura 16B).
Desta forma, após a identificação dos sobrenadantes de culturas positivos para a
reatividade com o HSC70 no imunoblot, as respectivas células congeladas de maneira a
preservar o RNA foram então utilizadas no protocolo de “one-step” RT-PCR para a
obtenção dos transcritos de imunoglobulina e do produto de PCR em apenas um único
procedimento. A Figura 16C mostra uma painel contendo cinco sequências de CDR-H3,
com os genes V
H
, D e o J
H
utilizados e os respectivos genes da cadeia leve pareada (V
L
e J
L
) de cada clone. A sequência de CDR-H3 do clone que reconhece a HSC70 no
extrato de cérebro, denominado MN3A, está representada em negrito. As sequências de
CDR-H3 de 3 clones (10C3, 10F10 e 5G2) que reconheceram uma proteína de 190kD
87
no extrato de cérebro estão demonstradas, o clone 10C4 não apresentou reatividade no
extrato de cérebro. Infelizmente não conseguimos amplificar por RT-PCR o segundo
clone anti-HSC70. Acreditamos, que isto possa ser devido à má conservação do mRNA,
ou problemas de micromanipulação na coleta dos linfócitos secretantes localizados no
fundo do orifício.
88
Figura 16: Amplificação por RT-PCR dos transcritos de IgH de plasmócitos provenientes de
linfócitos B1a estimulados por LPS em culturas de clonagem e exemplos de sequências obtidas. A)
Produto de RT-PCR (400pb) de transcritos de cadeia pesada de imunoglobulinas de linfócitos B1a
estimulados por LPS na presença de S17 como células alimentadoras; (a) DNA “ladder”; (b) controle
negativo com S17 apenas. B) Culturas em paralelo foram feitas usando timócitos de rato como células
alimentadoras, mantendo as demais condições, as células foram submetidas ao RT-PCR como em (A),
não foram obtidas amplificações utilizando células B provenientes dessas culturas (resultados
representativos de 3 experimentos independentes). C) Desconstrução das sequências de CDR-H3 de cinco
diferentes clones com os respectivos genes de cadeia pesada e leve. O clone MN3A em negrito apresenta
reatividade com a HSC70. Clone ID, identificação do clone; VH Family a família do gene VH utilizada;
3’VH-Region, os nucleotídeos 3’ dos genes VH estão representados, incluindo o códon de cisteína (TGT)
conservada; P-N-P, inserção de nucleotídeos palindrômicos e N; D-region, componente DH do CDR-H3;
5’J-Region, nucleotídeos 5’ dos genes JH estão representados, os nucleotídeos do códon de triptofano
conservado (TGG) foram omitidos; JH, número do gene JH utilizado; DH name, nome do gene DH
utilizado; RF, o quadro de leitura dos genes DH utilizados; Light chain, os gens V! e J! utilizados na
cadeia leve pareada com a cadeia pesada de cada clone; ND, o J! do clone MN3A não foi determinado;
Os pontos (.) representam os nucleotídeos perdidos após o rearranjo em cada junção, comparados a
seqüência germline. Nucleotídeos sublinhados podem ter origem em ambos os genes justapostos.
A
B
C
A
B
89
4.3.5. Sequência completa dos genes V(D)J de cadeia pesada de imunoglobulina de
um clone de linfócito B1a que reconhece a proteína HSC70
A sequência de nucleotídeos obtida a partir de transcritos de IgH do clone
MN3A, responsável pela produção da IgM auto-reativa a HSC70 no extrato de cérebro,
foi analisada utilizando a ferramenta IMGT e revelou o uso do gene V
H
Ox-1,
pertencente à família VQ52 (V
H
2); o uso do menor segmento gênico D, o DQ52 e o uso
do gene J
H
2. A Figura 17 mostra o alinhamento da sequência do clone MN3A com as
sequências “germline” dos genes VOx-1, DQ52 e J
H
2 desde o “framework 1” (FWR1)
até o FWR4 da região variável, os genes DQ52 e J
H
2 estão representados somente na
região em que estão rearranjados no gene do clone MN3A.
Para a nossa análise, o CDR-H3 foi definido como demonstrado na Figura 3A,
consistindo da sequência de aminoácidos que é flanqueada pela cisteina conservada 104
(TGT) e o triptofano 118 (TGG) de acordo com o sistema IMGT e 92 e 103 de acordo
com Kabat, respectivamente. Como demonstrado na Figura 16C (em negrito) o CDR-
H3 do clone MN3A é composto por apenas 15 nucleotídeos, todos codificados por
seqüências “germline” identificáveis, ou seja, sem adição de nucleotídeos N. Esse dado
está em acordo com o esperado, uma vez que nós mostramos em experimentos
anteriores evidências do uso de rearranjos “germline”, sem adição de nucleotídeos N, e
evidências da origem fetal dos clones responsáveis pela reatividade com a HSC70.
Devido a extensa perda de nucleotídeos, principalmente nos genes DQ52 e J
H
2, a
tradução revelou uma sequência composta por apenas 5 aminoácidos (Alanina,
Arginina, Treonina, Asparagina e Tirosina) o que impossibilita a determinação do
“loop” de CDR-H3 (Shirai et al, 1999).
90
Figura 17: Alinhamento da sequência dos genes variáveis de cadeia pesada do clone de linfócitos
B1a secretante da IgM que reconhece HSC70. MN3A, sequência de cDNA do clone que apresenta
autoreatividade a HSC70; VOx-1, alinhamento da sequência germline do gene VOx-1 de camundongos
BALB/c, os pontos (.) representam homologia entre os nucleotídeos; DQ52-BALB/c, fragmento do DQ52
que apresenta homologia com o clone MN3A; JH2, alinhamento do segmento gênico JH2 com a
seqüência MN3A. Região, subdivide a sequência “germline” em 4 “frameworks” (FW’s) e em 3 CDR-
H’s, o CDR-H3 está em negrito; Tradução, sequência de aminoácidos do clone MN3A; Tradução VOx-1
(em vermelho), sequência de aminoácidos definidas somente na sequência VOx-1 “germline”; a
numeração dos nucleotídeos está de acordo com Kabat et al, 1987.
91
4.4. O impacto da limitação genética no repertório disponível de imunoglobulinas e
as características do CDR-H3 nas subpopulações de linfócitos B da cavidade
peritoneal
Apesar do segmento gênico iD inserido no locus D dos camundongos !D-iD
codificarem, a princípio, um CDR-H3 de imunoglobulinas enriquecido para
aminoácidos carregados (características distintas dos animais controles) (Ippolito et al,
2006), nós observamos poucas diferenças qualitativas no repertório de especificidades
de anticorpos naturais entre os camundongos !D-iD e os controles WT e !D-DFL.
Diante da substancial homologia apresentada entre o repertório de especificidades
desses camundongos, nossos resultados sugerem que provavelmente existem diferentes
mecanismos operando para a “normalização” do repertório de anticorpos naturais desses
animais transgênicos, mecanismos moleculares como geração de rearranjos alternativos
(maior adição de nucleotídeos N, diminuição da contribuição do gene iD no CDR-H3
por ação de exonucleases, uso de quadros de leituras alternativos) e mecanismos de
seleção somática, que atuariam nesses clones alternativos favorecendo o
desenvolvimento, maturação e migração para a periferia. Por outro lado, a ausência da
reatividade com a HSC70 indica que a seleção somática não consegue operar no
repertório B1a formado por células que expressam rearranjos “germline”
comprometidos pela mutação !D-iD, no qual provavelmente falta esse idiotipo.
Para testar essa hipótese, nós decidimos correlacionar o repertório de
especificidades de IgM disponível na cavidade peritoneal com o repertório genético do
CDR-H3 dessas populações celulares. Esta parte dos estudos foi realizada na
“University of Alabama at Birmingham, AL - USA”, durante o doutorado sanduíche de
92
9 meses sob a co-orientação do Dr. Harry W Schroeder Jr, que é o responsável pela
geração dos animais D
H
transgênicos (!D-iD e !D-DFL).
Para cumprir com o objetivo especifico–iv– nós traçamos duas estratégias
paralelas:
1) isolamento de linfócitos B1a, B1b e B2 da cavidade peritoneal dos camundongos
WT, !D-iD e !D-DFL e posterior estímulo policlonal in vitro para produção de IgM no
sobrenadante, como uma amostragem do repertório de IgM disponível, realização de
imunoblot de extrato de cérebro, como previamente descrito por Nóbrega e
colaboradores (1998).
2) isolamento de linfócitos B1a, B1b e B2 da cavidade peritoneal dos camundongos
WT, !D-iD e !D-DFL e posterior extração do mRNA, obtenção do cDNA, clonagem e
seqüenciamento da cadeia pesada de imunoglobulina como uma amostragem do
repertório genético de CDR-H3 disponível, como previamente descrito pelo grupo do
Dr. Schroeder (Ivanov et al, 2005; Schelonka et al, 2005; Ippolito et al, 2006).
4.4.1 O impacto da restrição genética do CDR-H3 no repertório de especificidades
das subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal
Para obtermos amostras de IgM policlonal a partir das células B em repouso
isoladas da cavidade peritoneal, nós coletamos sobrenadantes de culturas contendo
diferentes números de linfócitos B estimulados por LPS. Para comparar o repertório de
especificidades em cada subpopulação de linfócitos B da cavidade peritoneal entre os
diferentes grupos de camundongos, primeiramente realizamos experimentos para definir
os padrões de resposta ao LPS em cada grupo (seja dos diferentes camundongos ou as
diferentes populações de células B), isto é, nós realizamos um estudo comparativo para
definir a frequência de clones respondedores ao LPS, a cinética de produção de IgM e a
93
quantidade de IgM secretada por clone em cada subpopulação nos diferentes animais,
WT, !D-DFL e !D-iD.
4.4.1.1. Frequência de clones secretantes de IgM e padrão de resposta ao estímulo
por LPS in vitro das diferentes subpopulações de linfócitos B da cavidade
peritoneal
Todas as freqüências determinadas aqui foram feitas limitando-se o número de
células em cultura até 0,66 células B em média por cultura. De acordo com a
distribuição de Poisson, uma célula B secretante de IgM está presente em um
determinado número de células por cultura no qual 63% de todas culturas aparecem
positivas para produção de IgM no ensaio (Andersson et al, 1977a). A Figura 18A
mostra a freqüência de clones respondedores ao estímulo por LPS em cada uma das
subpopulações de linfócitos B estudadas. Os linfócitos B1 apresentaram uma maior
frequência de clones secretantes de IgM em resposta ao LPS em todos os grupos,
variando em torno de um clone respondedor em cada duas células colocadas em cultura.
Os linfócitos B2 ou convencionais apresentaram a freqüência de resposta
significativamente menor do que as duas subpopulações de linfócitos B1. Essa diferença
é ainda mais proeminente quando comparada dentro do grupo dos camundongos !D-
DFL, que apresentaram a maior eficiência de resposta ao LPS nas populações B1 e em
contrapartida tiveram apenas 11% dos linfócitos B2 secretando IgM em resposta ao
mitógeno.
Para determinar se existem diferenças entre as diferentes populações de lifócitos
B, no tempo de diferenciação em plasmócitos e secreção de imunoglobulinas em
resposta ao estímulo por LPS in vitro, nós realizamos experimentos de cinética de
produção de IgM para cada subpopulação de linfócito. De acordo com a Figura 18B, as
94
subpopulações de linfócitos B apresentam diferentes características de produção de IgM
ao longo do tempo, com os linfócitos B1 apresentando níveis consideráveis de IgM já
no segundo dia analisado, enquanto que as células B convencionais começam
tardiamente a produção de IgM. Esses dados estão de acordo com nossos resultados
preliminares obtidos com a população de linfócitos B do baço, onde os linfócitos B de
zona marginal, ditos “pré-ativados” assim como as células B1 (Oliver, Martin and
Kearney, 2001), apresentam níveis identificáveis de IgM desde o primeiro dia de cultura
e atingem o platô já no quarto dia, enquanto que os linfócitos B foliculares, ou
convencionais, apresentaram o mesmo perfil cinético das células B2 do peritônio (dados
não mostrados). Por outro lado, quando comparadas as subpopulações entre os
diferentes grupos de animais observamos que a cinética é exatamente a mesma em uma
determinada subpopulação nos diferentes animais WT, !D-DFL e !D-iD. Esses
experimentos nos ajudaram a definir o nono dia de cultura para a coleta do sobrenadante
para ser submetido à análise, período em que todas as subpopulações já teriam chegado
ao máximo de produção de IgM no nosso ensaio, evitando com isso, que determinados
clones que expandissem tardiamente ficassem de fora da nossa análise.
Para análise do repertório disponível, variáveis números de células (10000;
3333; 1111 e 370 células por cultura) foram estimuladas com LPS, sendo 24 replicatas
para cada uma das concentrações de células em cada experimento (do total de 4
experimentos independentes para os WT, 3 para os !D-iD e 2 para os !D-DFL). A
concentração de IgM nos respectivos sobrenadantes foi determinada por ELISA anti-
IgM, sobrenadantes de cultura contendo somente S17 foram utilizados como controles.
Como demonstrado na Figura 18C, os dados desses experimentos estão de acordo com
trabalhos prévios de Nóbrega e colaboradores (1998), com a concentração de IgM
aumentando de maneira dependente da concentração inicial de células, demonstrando a
95
linearidade desse processo (dentro dessa variação de números de células por cultura)
independente da subpopulação de linfócitos B analisada. A razão entre a concentração
de IgM pelo número de células respondedoras em cultura nas diferentes populações foi
semelhante entre as diferentes populações, variando de 10 a 20 ng/mL por clone,
mesma ordem de grandeza obtida por clones únicos em culturas de clonagem (Figura
15B). Esses sobrenadantes foram utilizados para a análise qualitativa das freqüências de
reatividade a cada antígeno no imunoblot de extrato de cérebro, de acordo com a
distribuição de Poisson.
96
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Figura 18: Padrão de resposta ao estímulo por LPS in vitro das diferentes subpopulações de
linfócitos B da cavidade peritoneal. A) Análise por diluição limitante (LDA) para se estimar o número
de células respondedoras ao LPS por célula em cultura (18, 6, 2 e 0,66 células/cultura). Perfil individual
de reatividade de IgM sérica no Imunoblot de extrato de cérebro. B) Cinética de produção de IgM durante
o 3-8 dia dosada por ELISA em sobrenadantes de cultura de 10,000 linfócitos B/cultura isolados por “cell
sorting”. Cada gráfico mostra a comparação da cinética de produção de IgM de uma dada subpopulação
de linfócitos B entre os animais !D-iD e !D-DFL. C) Níveis de IgM dosado por ELISA em
sobrenadantes de cultura de difentes números de linfócitos B isolados por “cell sorting” (10000, 3333,
1111 e 370 células/cultura). Todas as culturas foram realizadas na presença de 30"g/mL de LPS e 5 x 10
3
S17 como células alimentadoras.
3 6 9 12 15 18
0.01
0.1
1
0.37
B1a
42%
B1b
50%
B2
15%
WT
Number of B cell per culture
3 6 9 12 15 18
0.01
0.1
1
0.37
B1a
40%
B1b
40%
B2
16%
!D-iD
Number of B cell per culture
3 6 9 12 15 18
0.01
0.1
1
0.37
B1a
52%
B1b
55%
B2
11%
!D-DFL
Number of B cell per culture
A
3
4
5
6
7
8
9
0.01
0.1
1
10
100
!D-DFL
B1a
B1b
B2
Dias de cultura
3
4
5
6
7
8
9
0.01
0.1
1
10
100
WT
B1a
B1b
B2
Dias de cultura
3
4
5
6
7
8
9
0.01
0.1
1
10
100
!D-iD
B1a
B1b
B2
Dias de cultura
B
370 1111 3333 10000
0.1
1
10
100
B1a
B1b
B2
!D-DFL
Números de células por cultura
370 1111 3333 10000
0.1
1
10
100
B1a
B1b
B2
WT
Números de células por cultura
370 1111 3333 10000
0.1
1
10
100
B1a
B1b
B2
!D-iD
Números de células por cultura
C
97
4.4.1.2. O repertório disponível de reatividades em imunoblot de extrato autólogo
de cérebro das subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal
Assumindo que no geral em média 45% das células nas populações de linfócitos
B1 (B1a e B1b) responderam e somente 15% dos linfócitos B2 foram capazes de
secretar IgM em resposta ao estímulo por LPS in vitro, podemos acertar as
concentrações iniciais de células em cultura de acordo com a frequência de clones
respondedores. Para fins comparativos as culturas contendo 10000, 3333, 1111 e 370 de
linfócitos B1, representam respectivamente 4500, 1500, 500 e 167 células B1
secretantes de IgM por cultura e nas culturas de linfócitos B2 esse número cai para
1500, 500, 167 e 56 células B2 secretantes de IgM, respectivamente. Dessa forma, entre
as subpopulações B1 e B2, iremos comparar as culturas contendo, no dia zero, 3333,
1111 e 370 células B1 totais com as culturas contendo 10000, 3333 e 1111 linfócitos B2
totais.
A Figura 19 mostra os dados de imunoblot referente ao repertório de IgM
disponível em culturas de linfócitos B contendo 1500 clones secretantes no dia zero de
cultura. Nós optamos por mostrar apenas estes dados, pois eles são suficientes para a
descrição qualitativa do repertório de especificidades disponível como um todo, os
demais dados, isto é, utilizando 500 e 150 células, serão apenas citados quando
convenienente.
Comparando primeiramente cada subpopulação de linfócitos B entre os
diferentes grupos, nós podemos observar semelhanças de uma forma geral, mas também
podemos observar diferenças. De acordo com a Figura 19A, os sobrenadantes de
culturas, partindo de 1500 (clones respondedores ao LPS) linfócitos B1a dos diferentes
grupos, apresentaram reatividades com o extenso painel de antígenos no extrato de
cérebro de uma forma homogênea entre os diferentes sobrenadantes de um mesmo
98
grupo e também, entre os diferentes grupos. Nós observamos mesmo nas diluições
celulares menores, com 500 e 150 células B1a secretantes, que apesar de ter diminuído
a variedade de antígenos reconhecidos por cada sobrenadante, não existe diferenças
qualitativas nas freqüências individuais de cada antígeno no perfil geral no imunoblot
entre os diferentes grupos. A diferença marcante, novamente foi a HSC70, que está
claramente mais intensa nos sobrenadantes de cultura de linfócitos B1a provenientes
dos animais WT (Figura 19A, imunoblot). Surpreendentemente, os camundongos !D-
iD apresentaram a reatividade com HSC70 nas IgM secretadas pelos linfócitos B1a que
compunham o repertório disponível na cavidade peritoneal (Figura 19, imunoblot e
perfil densitométrico).
Utilizando os imunoblots realizados com os sobrenadantes das culturas em LDA
(500 e 150 células B1a secretantes de IgM), foi possível calcular a frequência dos
clones que secretam IgM que se ligam à HSC70 no imunoblot de extrato de cérebro. A
frequência dessa reatividade entre os animais WT foi estimada novamente em !1:130,
repetindo o resultado obtido na seção 4.3.2 (Figura 14), para os animais !D-iD a
frequência foi estimada em um em cada 460 linfócitos B1a secretantes de IgM. Apesar
de termos obtido alguns sobrenadantes provenientes de linfócitos B1a de camundongos
!D-DFL positivos para a reatividade com a HSC70, esses sobrenadantes não foram
suficientes para determinar a frequência dessa reatividade nesse grupo de camundongos.
A análise qualitativa do repertório disponível no compartimento B1b nos levou a
conclusões semelhantes ao que foi observado nos linfócitos B1a, com uma homologia
entre os diferentes sobrenadantes nos diferentes grupos, porém aqui, houve uma maior
variância entre os diferentes sobrenadantes, indicando que a frequência das reatividades
a cada antígeno deve ser menor entre os linfócitos B1b e os linfócitos B1a, mas não
entre os linfócitos B1b nos diferentes grupos (Figura 19B).
99
Figura 19: Análise do repertório disponível de especificidades de IgM em imunoblot de extrato
antigênico de cérebro de camundongos BALB/c. As subpopulações de linfócitos B peritoneais
purificadas de animais BALB/c foram cultivadas em diferentes concentrações in vitro por 9 dias, na
presença de LPS (30!g/mL) e S17 como células alimentadoras. Os sobrenadantes destas culturas foram
testados para reatividade de IgM com antígenos de cérebro no ensaio de imunoblot. A) Perfil individual
de reatividade de IgM nos sobrenadantes de cultura de 1500 células B1a secretantes de IgM de
camundongos WT (3-9), "D-DFL (10-12 e 15-18) e "D-iD (19-25), perfil densitométrico médio de
reatividades de IgM e análise multivariada (discriminante linear) dos dados do perfil densitométrico
individual de cada sobrenadante. B) Mesma descrição de (A), referente às culturas de 1500 células B1b
secretantes de IgM. C) Mesma descrição de (A), referente às culturas de 1500 células B2 secretantes de
IgM.As setas indicam a reatividade com a HSC70. As linhas 13 são sobrenadantes de cultura contendo
somente S17 como controle negativo; as linhas 14 é um pool de sobrenadantes de culturas contendo
10000 linfócitos B1a por cultura, exceto em A, onde foi colocado um pool de sobrenadante diluído 1:100.
A
B1a
B
B1b
C
B2
100
A freqüência de clones B2 reativos à maioria dos antígenos no imunoblot é bem
menor já na primeira diluição, referente à 1500 células por cultura nessa subpopulação,
quando comparadas ao perfil individual de reatividade apresentado pelas células B1
(B1a ou B1b) na mesma concentração (Figura 19C). Extrapolando ainda mais, o perfil
de reatividade de 1500 células B2 estaria mais próximo em número de reatividades
(número de bandas que aparecem no perfil de cada sobrenadante) ao perfil dos
sobrenadantes de cultura contendo 500 linfócitos B1 respondedores ao LPS, sugerindo
uma frequência pelo menos três vezes menor de cada reatividade no repertório
disponível dos linfócitos B2 quando comparados aos linfócitos B1. Claramente, o
repertório individual de cada sobrenadante se mostrou mais heterogêneo, demonstrando
um aumento da variância entre eles, reforçando a idéia da menor frequência de
imunoreatividade entre os linfócitos B2.
Nós submetemos os dados obtidos por densitometria de cada sobrenadante, a um
tratamento por PCA (análise de componentes principais), seguida pela estatística
mutilivariada por análise linear-discriminante “linear discriminant analysis”. O gráfico
no canto superior direito do perfil de densidade média dos linfócitos B1a (Figura 19A),
mostra que a análise multivariada foi capaz de agrupar os sobrenadantes pertencentes a
cada grupo de camundongos dentro de uma região particular. Esses dados mostram que
o repertório disponível de especificidades dos linfócitos B1a dos diferentes animais
transgênicos, embora muito semelhantes na análise qualitativa, são diferentes dos
animais WT, e variam de forma conservada, isto é, sobrenadantes de cultura de células
B1a de camundongos !D-DFL, que possuem apenas um gene DFL16.1, são agrupados
em uma região, enquanto que os sobrenadantes dos camundongos !D-iD se agrupam
em outra região. Essa observação não foi válida para todos os sobrenadantes dos
linfócitos B1b e principalmente para os linfócitos B2, em que a análise multivariada não
101
foi capaz de agrupar de forma clara os sobrenadantes de acordo com o grupo do
camundongo.
De forma interessante, a análise da média dos perfis densitométricos dos
sobrenadantes das diferentes populações de linfócitos B (B1a, B1b e B2), agora
comparados dentro de cada grupo de animal, mostrou uma diferença nítida entre os
perfis, sugerindo que cada compartimento de linfócito B possui o seu repertório de
especificidade característico (Figura 20), sendo o repertório dos linfócitos B1a
aparentemente mais conservado e o repertório de especificidades dos linfócitos B2 bem
mais variável, tanto entre os sobrenadantes de cultura de um mesmo animal, quanto
comparados os sobrenadantes de diferentes animais.
102
Figura 20: Perfil densitométrico médio de ratividade de IgM em imunoblot de extrato antigênico de
cérebro de camundongos BALB/c. As subpopulações de linfócitos B peritoneais purificadas de animais
BALB/c foram cultivadas em diferentes concentrações in vitro por 9 dias, na presença de LPS (30!g/mL)
e S17 como células alimentadoras. Os sobrenadantes destas culturas foram testados para reatividade de
IgM com antígenos de cérebro no ensaio de imunoblot. Perfis densitométricos médios de reatividades de
IgM nos sobrenadantes de cultura de 1500 células B1a, B1b e B2 secretantes de IgM de camundongos
WT (A); "D-DFL (B); e "D-iD (C). As setas indicam a reatividade com a HSC70.
A
B
C
103
Em geral, a análise comparativa do repertório de especificidades disponível
entre os diferentes grupos de animais (WT, !D-DFL e !D-iD), revelou que a
substancial homologia apresentada pelo repertório de anticorpos naturais séricos,
também é observada no repertório de especificidades de IgM disponível nas diferentes
subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal. Por outro lado, a análise
multivariada, nos mostrou diferenças que não foram possíveis de ser observadas pela
análise qualitativa das frequências de cada reatividade. Desta forma, nós realizamos
análise multivariada dos dados (previamente demonstrados na figura 5) de repertório de
anticorpos naturais séricos dos camundongos WT, !D-DFL e !D-iD. A Figura 21
mostra o perfil densitométrico médio para cada grupo de camunodongo e o gráfico com
a classificação feita pela análise muiltivariada. A análise demonstrou uma tendência ao
agrupamento da maioria das amostras de soro de acordo com a genética do animal.
Esses dados, sustentam que apesar da grande homologia do repertório de anticorpos
naturais, a manipulação genética influencia o repertório como um todo, e essas
influências podem ser detectadas no imunoblot e são identificadas como mudanças no
perfil geral que são conservadas entre os indivíduos de um mesmo grupo.
Figura 21: Análise multivariada dos dados do repertório de especificidade de anticorpos naturais
séricos no imunoblot de extrato de cérebro A) Perfil densitométrico médio de reatividades de IgM
sérica de camundongos WT, !D-DFL e !D-iD. B) Análise multivariada (discriminante linear) dos dados
do perfil densitométrico individual de cada soro. Os dados densitométricos individuais foram previamente
tratados pela análise de componentes principais (PCA).
A
B
104
4.4.2 Análise do repertório de CDR-H3 nas subpopulações de linfócitos B da
cavidade peritoneal
As células B da cavidade peritoneal foram obtidas de acordo com as regiões de
linfócitos demonstradas na Figura 8A. O RNA, foi extraído, obtivemos o cDNA,
clonamos, sequenciamos e desconstruímos o CDR-H3 dos transcritos sequenciados
como uma amostragem fiel do repertório de IgM, uma vez que nós utilizamos um
5’primer degenerado capaz de amplificar V
H
de todas as famílias (V
H
all) e um 3’primer
específico para a região constante C!. Analisamos o RNA mensageiro, por ser mais
representativo do que realmente é expresso e funcional no repertório disponível de
imunoglobulinas. Sequenciamos ao todo 504 transcritos, dos quais 489 (97%) foram
únicos e “in-frame”, somente esses foram considerados na análise (ver sequências nos
Apêndices). A distribuição dos transcritos por subpopulação de linfócitos B da cavidade
peritoneal em cada animal (WT, "D-DFL e "D-iD) está apresentada na Tabela 1.
Tabela 1: Distribuição de sequências únicas, “in-frame” por população de linfócito
B da cavidade peritoneal
Números de transcritos de V
H
allDJC! analisados. WT, sequências obtidas de
camundongos BALB/c “wild-type”; "D-DFL, sequências obtidas de camundongos "D-
DFL homozigotos. "D-iD, sequências obtidas de camundongos "D-iD homozigotos.
A sucessão de dados que serão mostrados aqui procura comparar as principais
características do repertório de CDR-H3 (uso de segmentos gênicos, composição de
População
WT
!D-DFL
!D-iD
Total
B1a
52
55
77
184
B1b
54
56
51
161
B2
43
48
53
144
Total
149
159
181
489
489
105
aminoácidos, hidrofobicidade do “loop” e comprimento do CDR-H3) entre as diferentes
subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de cada grupo de camundongo e
cada subpopulação de linfócitos B entre os diferentes grupos de camundongos. A
definição do CDR-H3 utilizada por nós, está representada na Figura 3A e explicada
detalhadamente em Materiais e Métodos.
4.4.2.1 A utilização dos genes V
H
nas populações B1a, B1b e B2 nos diferentes
grupos de camundongos
O número de segmentos gênicos, bem como a sequência dos genes V
H
variam
de acordo com a linhagem do camundongo. No camundongo BALB/c os genes V
H
estão no cromossomo 12 e contêm mais de 150 genes agrupados em 15 famílias
(Lefranc, 2003; Schroeder 2006). A utilização dos genes V
H
será apresentada pelo
número da família: J558 (V
H
1), Q52 (V
H
2), 3660 (V
H
3), X-24 (V
H
4), 7183 (V
H
5), J606
(V
H
6), S107 (V
H
7), 3609 (V
H
8), GAM3.8 (V
H
9), DNA4 (V
H
10), CP3 (V
H
11), CH27
(V
H
12), 3609N (V
H
13), SM7 (V
H
14) e V
H
15.
A Figura 22 mostra a frequência de distribuição dos genes V
H
comparando entre
as diferentes subpopulações, B1a, B1b e B2, em cada grupo de camundongo. No geral,
pode-se observar semelhanças e diferenças pontuais na distribuição da frequência de
uso das famílias V
H
entre as subpopulações nos três grupos de animais analisados. A
distribuição está diretamente correlacionada com a variedade de genes existentes em
cada família, isto é, as famílias com maior quantidade de elementos gênicos V
H
estão
mais representadas em todas as subpopulações. As famílias Q52 e 7183 são as mais
próximas aos segmentos J
H
enquanto que a família J558 é a mais distante e compreende
aproximadamente metade dos genes V
H
existentes e do repertório V
H
ativo (Kofler,
1992; Schroeder, 2006). Apesar da maior representação dos genes J558 no repertório
106
em geral, nossos dados mostram que nos animais WT, somente os linfócitos B2
apresentaram uma frequência maior de uso de genes da família J558 (30%), enquanto
que os linfócitos B1a e B1b usaram essa família em 18% dos transcritos analisados. Os
linfócitos B1 utilizaram mais frequentemente os genes da família Q52, com 37% em
B1a e 30% em B1b, enquanto que os linfócitos B2 utilizaram essa família em 19% dos
transcritos. Essa maior utilização dos genes V
H
Q52 na população B1a está em acordo
com Andrade et al. (1989).
O uso dos genes V
H
nos animais transgênicos como um todo, segue um padrão
de distribuição semelhante ao apresentado pelos animais WT, com os genes das famílias
J558 e Q52 sendo os mais abundantes em ambos os casos. Juntos essas duas famílias
contribuíram em media com 50 a 60% de todos os V
H
observados no nosso estudo,
independente do grupo do animal. Os camundongos !D-iD mostraram uma inversão na
distribuição dos genes J558 em relação aos animais WT, com os linfócitos B1
utilizando mais frequentemente esses genes do que os linfócitos B2. Já os camundongos
!D-DFL apresentaram os linfócitos B2 e B1b usando mais frequentemente os genes
J558, enquanto que os linfócitos B1a, utilizaram em torno de 20% dos transcritos,
semelhante aos WT.
Apesar da semelhança observada no perfil geral de utilização dos genes V
H
entre
as diferentes populações de linfócitos B, algumas diferenças importantes podem ser
observadas como, por exemplo, o uso de elementos da família V
H
11, que é
classicamente associada a clonotipos B1 específicos para fostatitlcolina (PtC)
(Mercolino et al, 1988; Seidl et al, 1997), foi somente observado em células B1 e não
nos linfócitos B convencionais, mesmo nos camundongos transgênicos. Por outro lado,
as células B2 apresentaram maior frequência de uso dos genes da família VH14 (SM7)
em todos os animais, seguido pelos linfócitos B1b dos animais WT e !D-DFL que
107
também utilizaram com freqüência essa família. Além disso, somente as células B2 e
B1b do WT e B1b do !D-iD apresentaram transcritos utilzando a família VH6. Os
linfócitos B1b em geral apresentaram-se mais diversos em termos de utilização dos
genes V
H
. Houve um claro aumento na utilização dos genes 7183 nos transcritos dos
camundongos !D-iD, principalmente entre as populações de linfócitos B2.
Para facilitar a análise, nós utilizamos os mesmos dados de utilização de genes
V
H
e J
H
e fizemos histogramas comparativos de cada populações entre os diferentes
grupos de animais, que estão apresentados na Figura 23. Entre os linfócitos B1a, o uso
dos genes V
H
parece apresentar semelhanças entre os três grupos de animais, mas existe
um aumento da utilização da família J558 e uma diminuição concomitante da
frequência dos genes Q52 nos animais !D-iD quando comparados com os animais WT
e o controle transgênico !D-DFL. Existe uma diminuição em três vezes dos clones B1a
que utilizam os genes VH10 nos animais !D-DFL, quando comparados com o !D-iD e
o WT, clones que utilizam essa família foram descritos como reativos ao DNA (Kofler,
1988). A família VH7 (S107), foi somente observada nas células B1 (B1a e B1b) dos
animais WT, não sendo observada nas células B2 e em nenhuma população de
linfócitos B dos camundongos trangênicos. Entre os linfócitos B1b o uso dos genes
J558 foi o mesmo entre os animais transgênicos mas com uma diminuição pela metade
nos animais WT, porém o uso da família Q52 foi o mesmo entre os três animais. A
diminuição no uso de J558 nos linfócitos B1b nos camundongos WT foi compensada
pelo maior uso dos genes da família 3660 e da família VH10, estes dados estão em
acordo com os dados de Kantor et al. (1997). Comparando as células B convencionais
nos diferentes animais, com exceção do menor uso dos genes J558 pelo !D-iD e um
aumento concomitante no uso dos genes da família 7183 nessa população desse animal,
o uso das famílias gênicas V
H
foi bem homogênea entre os animais congênicos.
108
Estudos anteriores demonstraram que o repertório fetal ou neonatal de células B
expressam preferencialmente famílias V
H
localizadas mais próximas aos genes J
H
(Yancopoulus et al, 1988; Freitas et al, 1991). Nesses estudos, os genes Q52 somados
com os genes 7183 constituem 50% do repertório. Uma particularidade no nosso estudo
é que apenas um transcrito de VH81X “inframe” foi sequenciado e exatamente entre as
células B1a do camundongo WT, que também apresentou outra peculiaridade, um
aumento da utilização dos genes Q52, em especial do gene VOx-1 que foi o segmento
gênico individual mais vezes sequenciado, entre todos os transcritos obtidos e
apresentou-se mais frequente entre os linfócitos B1a dos camundongos WT. A
reatividade anteriormente descrita contra a HSC70 no extrato de cérebro utiliza
exatamente esse gene V
H
, então não é de se surpreender que esta especificidade seja tão
frequente entre os linfócitos B1a de camundongos WT.
109
Figura 22: Análise comparativa da freqüência do uso de segmentos gênicos (famílias V
H
e elemento
J
H
) entre as populações B1a, B1b e B2 do peritônio de camundongos WT, !D-DFL e !D-iD. Os
histogramas representam os genes V
H
encontrados agrupados em suas respectivas famílias V
H
. O uso da
família V
H
e do elemento J
H
está representado como a percentagem de transcritos seqüenciados em cada
população de linfócitos da cavidade peritoneal, isolados de acordo com o fenótipo B1a (B220lo, Mac-1+
e CD5+); B1b (B220lo, Mac-1+ e CD5-) e B2 (B220hi, Mac-1- e CD5-). Os genes V
H
e J
H
estão
arranjados na mesma ordem em que estão posicionados no cromossomo 12 do camundongo (salva
exceções de genes da família VH, que possuem alguns genes espalhados pelo locus). O numero total de
transcritos seqüenciados para cada grupo de animal está mostrado no canto superior esquerdo. (Acima)
genes usados em camundongos WT (BALB/c IgM
a
) homozigotos; (meio) genes usados em camundongos
!D-DFL homozigotos; (abaixo) genes usados em camundongos ! D-iD homozigotos.
!D-iD
1
8
10
15
6
12
13
3
7
9
11
4
14
2
5
0
10
20
30
40
50
n=181
Vh Family Usage
1
2
3
4
0
10
20
30
40
50
B1a
B1b
B2
J
H
Usage
1
2
3
4
0
10
20
30
40
50
B1a
B1b
B2
!DFL
1
8
10
15
6
12
13
3
7
9
11
4
14
2
5
0
10
20
30
40
50
n=159
WT
1
8
10
15
6
12
13
3
7
9
11
4
14
2
5
0
10
20
30
40
50
n=149
1
2
3
4
0
10
20
30
40
50
B1a
B1b
B2
110
Figura 23: Análise comparativa da frequência do uso de segmentos gênicos (famílias V
H
e elemento
J
H
) em cada população de linfócitos entre os diferentes grupos de camundongos WT, !D-DFL e
!D-iD. Os histogramas representam os genes V
H
encontrados agrupados em suas respectivas famílias V
H
.
O uso da família V
H
e do elemento J
H
está representado como a percentagem de transcritos sequenciados
em cada população de linfócitos da cavidade peritoneal, isolados de acordo com o fenótipo B1a (B220lo,
Mac-1+ e CD5+); B1b (B220lo, Mac-1+ e CD5-) e B2 (B220hi, Mac-1- e CD5-). Os genes V
H
e J
H
estão
arranjados na mesma ordem em que estão posicionados no cromossomo 12 do camundongo (salva
exceções de genes da família VH, que possuem alguns genes espalhados pelo locus). O número total de
transcritos seqüenciados para cada grupo de animal está mostrado no canto superior esquerdo. (Acima)
genes usados por linfócitos B1a; (meio) genes usados por linfócitos B1b; (abaixo) genes usados por
linfócitos B2.
1
8
10
15
6
12
13
3
7
9
11
4
14
2
5
0
10
20
30
40
50
n=184
B1a
1
2
3
4
0
10
20
30
40
50
!DFL
!D-iD
WT
1
8
10
15
6
12
13
3
7
9
11
4
14
2
5
0
10
20
30
40
50
n=161
B1b
1
2
3
4
0
10
20
30
40
50
WT
!DFL
!D-iD
1
8
10
15
6
12
13
3
7
9
11
4
14
2
5
0
10
20
30
40
50
n=144
B2
V
H
Usage
1
2
3
4
0
10
20
30
40
50
WT
!DFL
!D-iD
J
H
Usage
B1a
B1b
B2
111
4.4.2.2 A utilização dos genes J
H
nas populações B1a, B1b e B2 nos diferentes
grupos de camundongos
Nos camundongos WT, todas as populações utilizam em menor frequência o
elemento J
H
1, em seguida o J
H
2 e sendo o J
H
4 o elemento mais frequente nos linfócitos
B1b e B2, enquanto que os linfócitos B1a utilizam mais freqüentemente o segmento
gênico J
H
3. Como pode ser observado na Figura 22 (WT), essa não é a única
peculiaridade das células B1a, quando comparada com as outras subpopulações
celulares essas células são as que mais utilizam o elemento J
H
1 (em 17% dos
transcritos) enquanto que as células B1b utilizaram em 10% e as B2 em 4%). Entre os
camundongos transgênicos, houve uma clara diminuição no uso dos elementos J
H
3 e
J
H
4 em comparação ao WT, essa mudança no uso dos genes J
H
está de acordo com as
populações de linfócitos B desses animais na medula óssea (Schelonka et al, 2005;
Ippolito et al, 2006).
4.4.2.3 A utilização dos genes D nas populações B1a, B1b e B2 dos camundongos
WT, o uso do D transgênico nos animais !D-DFL e !D-iD e o quadro de leitura do
D utilizado
Nos animais WT é possível o uso de 13 diferentes segmentos D na região D
“diversidade” do CDR-H3. Devido a construção dos animais transgênicos aqui
utilizados manter somente um segmento DFL16.1 no animal !D-DFL, introduzir um
DSP2.2 invertido no !D-iD, deletando os demais segmentos D nos dois animais (Figura
3B e C), não é possível a utilização de genes que não sejam os transgênicos nesses
animais, ficando então a “diversidade” gerada através da ação das exonucleases, da
inserção de nucleotídeos N e do uso de quadro de leituras alternativos. Portanto, nessa
seção, nós fizemos uma análise comparativa entre as populações de linfócitos B dentro
112
de cada grupo de camundongo, quanto ao possível uso desses mecanismos. Nos
camundongos WT foram analisados o uso das diferentes famílias D, nos camundongos
!D-DFL foi identificada a presença do gene DFL16.1 e nos camundongos !D-iD o uso
do elemento iD. Nós consideramos um gene D identificável desde que tenha o
alinhamento de cinco ou mais nucleotídeos com a sequência “germline”. Para a
identificação do quadro de leitura dos segmentos D, nós utilizamos a nomenclatura
proposta por Ichihara et al. (1989), desta forma nos transcritos obtidos a partir dos
camundongos WT, o quadro de leitura só foi determinado para os segmentos D
pertencentes às famílias DSP e DFL, o que fez com que o número de transcritos
analisados ficasse muito pequeno, limitando a nossa análise.
A Figura 24A mostra a frequência de uso das famílias D entre os transcritos das
diferentes populações dos camundongos WT, o padrão geral de distribuição foi
praticamente o mesmo entra as populações, com a família DSP sendo a mais utilizada,
devido ao maior número de segmentos gênicos, principalmente entre os linfócitos B
convencionais (50%) e o DFL16.1 sendo o segmento único mais utilizado em todas as
populações. Os linfócitos B1a foram os que mais apresentaram transcritos utilizando o
segmento DQ52 (17%), mesmo segmento utilizado pelo clonotipo (MN3A) responsável
pela reatividade com a HSC70. Por outro lado, as células B1a foram as únicas que não
apresentaram o elemento DST4, enquanto que nos linfócitos B1b e B2 o segmento
DST4 estava presente em quatro sequências de cada uma dessas subpopulações. O
número de transcritos com segmento D não identificados (noD) foi razoavelmente
grande, indicando uma ação intensa das exonucleases nessas populações de linfócitos B,
principalmente entre os linfócitos B1a. Os segmentos gênicos D podem ser traduzidos
em 6 quadros de leituras, os gerados por deleção RF1, RF2 e RF3 e os gerados por
inversão iRF1, iRF2, e iRF3, o quadro de leitura 1 é extremamente favorecido entre os
113
rearranjos funcionais (Ichihara et al, 1989; Gu et al, 1990). Entre os fatores envolvidos
nessa preferência por RF1 estão: a presença de ou dois códons de terminação “in-frame”
com o RF3 dos segmentos DFL e DSP e as junções D-J
H
com esses segmentos
utilizando o RF2 permitem a potencial formação da proteína truncada D! (Reth and Alt,
1984). Nós observamos uma forte preferência pelo RF1 em todas as subpopulações de
linfócitos B, principalmente entre os linfócitos B1 com 90% dos transcritos usando o
RF1, enquanto que os linfócitos B convencionais, apesar de usarem mais o RF1 (58%),
25% dos transcritos utilizaram o RF2, 5% utilizaram o RF3 e curiosamente, como
demonstrado na Figura 24A nós encontramos um transcrito de linfócitos B2 que pode
ter utilizado o quadro de leitura 2 invertido (iRF2) do segmento gênico DSP2.8.,
nenhuma rearranjo sugestivo de inversão foi observado entre as populações de
linfócitos B1.
De acordo com a Figura 24B, entre os camundongos transgênicos "D-DFL,
90% dos transcritos continham no CDR-H3 o segmento DFL16.1 e em apenas 10% dos
transcritos não foi possível identificar o segmento D, esses dados estão de acordo com
os dados obtidos de células maduras da medula óssea desses animais, onde o segmento
DFL16.1 foi identificado em 95% dos transcritos (Schelonka et al, 2005). Da mesma
forma que as células B1 do WT os linfócitos B1a e B1b dos camundongos "D-DFL
usaram o RF1 em 84 e 80% dos transcritos, respectivamente. Os linfócitos B2 apesar do
uso mais frequente do RF1 (76%) em relação à B2 do WT, também utilizaram o RF2
em 22% e apenas um transcrito usava o RF3. Não foram observadas inversões nos
transcritos de CDR-H3 de camundongos "D-DFL.
Nós observamos nos camundongos "D-iD uma maior heterogeneidade entre as
populações B1a, B1b e B2 quando comparados aos controles "D-DFL e uma menor
frequência de transcritos utilizando o D transgênico. Como demonstrado na Figura 24C,
114
a população B1a utilizou o gene iD em 74% dos transcritos, os linfócitos B1b utilizaram
em 65% e as células B2 em 79%, esses resultados diferem dos dados obtidos de células
maduras da medula óssea desses animais que apresentaram 95% de transcritos iD
identificáveis (Ippolito et al, 2006). Surpreendentemente, 13% dos linfócitos B1a, 12%
dos B1b e 6% dos linfócitos B2 dos camundongos !D-iD foram gerados por inversão.
Além disso, houve uma significativa diminuição do uso do RF1 na população de
linfócitos B1a desses camundongos quando comparados aos controles B1a !D-DFL e
WT, com apenas 55% dos transcritos utilizando esse quadro de leitura. O uso menos
frequente do RF1 foi também observado na população de linfócitos B1b dos
camundongos !D-iD, com 62% dos transcritos. Por outro lado, a população B2 utilizou
o RF1 com a mesma frequência que as células B2 dos camundongos !D-DFL, em torno
de 73%. A menor utilização do RF1 pelos linfócitos B1a parece que foi compensada por
um aumento no uso do RF2, com 30%, ainda não observada para essa população em
nenhum dos outros grupos de animais (somente 6% das B1a WT e 10% das B1a !D-
DFL utilizaram o RF2). Enquanto que o uso do RF2 por 18% nas células B1b é
exatamente a mesma freqüência desse quadro de leitura para os linfócitos B1b !D-DFL.
Os linfócitos B2 dos camundongos !D-iD apresentaram a mesma freqüência de uso do
RF2 que as células B2 do controle transgênico !D-DFL.
115
Figura 24: Análise comparativa da frequência do uso de famílias de segmentos gênicos D nas
populações B1a, B1b e B2 de camundongos WT, o uso do DFL16.1 no !D-DFL, o uso do iD
transgênico no !D-iD e o quadro de leitura utilizado. A) Os histogramas representam os genes D
encontrados agrupados em suas respectivas famílias D
H
nos camundongos WT; noD, não foi identificado
um gene D com 5 ou mais nucleotídeos de homologia. B) Os histogramas representam a freqüência de
uso do gene DFL16.1 nos camundongos !D-DFL; inv-DFL uso da seqüência DFL16.1 invertida. C) Os
histogramas representam a freqüência de uso do gene iD nos camundongos !D-iD; inv-iD, percentagem
de uso do iD invertido. Os histogramas a direita represntam as freqüências dos 6 quadros de leituras
possíveis para cada gene D (RF1, 2 e 3 gerados por deleção e iRF1,2 e 3 gerados por inversão).
DFL
DSP
DQ52
DST
No-D
0
10
20
30
40
50
WT
n=149
Família D
H
1
2
3
i -1
i -2
i -3
0
20
40
60
80
100
n=93
B1a
B1b
B2
Quadro de Leitura D
H
1
2
3
i -1
i -2
i -3
0
20
40
60
80
100
n=143
B1a
B1b
B2
Quadro de Leitura D
H
DFL16.1
invDFL
noD
0
20
40
60
80
100
n=159
!D-DFL
Uso do D
H
iD
inv iD
noD
0
20
40
60
80
100
n=181
!D-DiD
Uso do D
H
1
2
3
i -1
i -2
i -3
0
20
40
60
80
100
n=151
B1a
B1b
B2
Quadro de Leitura D
H
A
B
C
116
4.4.2.4 A utilização de aminoácidos no CDR-H3 nas populações B1a, B1b e B2 dos
camundongos WT, !D-DFL e !D-iD
Tanto nos camundongos WT, quanto nos camundongos !D-DFL o “loop” do
CDR-H3 é enriquecido para tirosina e glicina, e nas células maduras da medula óssea
esses aminoácidos neutros contribuem com 40% do total de aminoácidos no CDR-H3
(Ivanov et al, 2005; Schelonka et al, 2005). O “loop” do CDR-H3 dos camundongos
!D-iD é enriquecido para aminoácidos carregados como, arginina, asparagina e
histidina, devido aos códons inseridos na construção do animal. Trabalhos anteriores
realizados pelo grupo do Schroeder mostraram que durante o desenvolvimento dos
linfócitos desses animais na medula óssea, a seleção somática não consegue operar de
maneira eficiente para retornar o repertório do CDR-H3 para a neutralidade, ou seja,
esses animais possuem um repertório de células B maduras na medula óssea
enriquecido para aminoácidos carregados (Ippolito, 2006). Desta forma, um terço do
CDR-H3 dos linfócitos maduros da medula óssea desses animais é composto por
arginina, asparagina e histidina, enquanto que o uso tirosina e glicina é diminuído pela
metade. Para verificar se esse padrão de uso de aminoácidos também ocorre nos
linfócitos B peritoneais, que são compostos por populações de linfócitos de origem fetal
e de origem na medula óssea adulta sujeitas a diferentes pressões seletivas, analisamos a
distribuição dos aminoácidos no “loop” de CDR-H3 das populações B1a, B1b e B2
desses animais e comparamos com os animais WT e !D-DFL.
Como demonstrado na Figura 25, o padrão de distribuição dos aminoácidos no
“loop” de CDR-H3 entre as diferentes populações de linfócitos B é muito semelhante
no animal WT. Esse padrão se conserva no animal controle transgênico !D-DFL, essa
semelhança é ainda mais evidente no uso de tirosina e glicina. Os aminoácidos serina,
ácido aspártico, asparagina e alanina parecem apresentar um diferente padrão de
117
distribuição no camundongos !D-DFL em relação ao WT. Os camundongos !D-iD
apresentaram um perfil um pouco mais heterogêneo de distribuição de aminoácidos
entre as diferentes populações. Houve um enriquecimento para arginina, asparagina e
histidina nas populações da cavidade peritoneal, por exemplo, os linfócitos B1b e B2
apresentaram 15% de freqüência de uso de arginina e uma menor extensão para os
linfócitos B1a que apresentaram arginina em 10% dos transcritos. No geral, os
linfócitos B1a tiveram uma leve diminuição no uso dos aminoácidos carregados,
arginina, asparagina e histidina quando comparados com os linfócitos B1b e B2.
Simultaneamente o uso de aminoácidos hidrofóbicos, como valina, isoleucina e
fenilalanina aumentou claramente na população de linfócitos B1a dos camundongos
!D-iD.
118
Figura 25: Distribuição dos aminoácidos no “loop” de CDR-H3 de transcritos VDJC! isolados de
linfócitos B1a, B1b e B2 de camundongos WT, DFL16.1 e " D-DFL. Os histogramas representam a
freqüência de uso de cada aminoácido no “loop” de CDR-H3. Os aminoácidos estão arranjados de acordo
com a hidrofobicidade relativa, de acordo com a escala normalizada de Kyte-Dolittle (Kyte and Dolittle,
1982; Eisenberg, 1984). De R à H (aminoácidos carregados) de P à G (aminoácidos neutros) de A à I
(aminoácidos hidrofóbicos). O número total de “loops” de transcritos seqüenciados para cada grupo de
animal está mostrado no canto superior esquerdo e o número de aminoácidos analisados para cada
população está em parênteses. (Acima) aminoácidos usados no “loop” de CDR-H3 em camundongos WT
(BALB/c IgM
a
) homozigotos; (meio) em camundongos !D-DFL homozigotos; (abaixo) em
camundongos ! D-iD homozigotos. O “loop” foi definido como descrito em Materiais e Métodos.
R
K
N
D
Q
E
H
P
Y
W
S
T
G
A
M
C
F
L
V
I
0
10
20
30
40
n=179 Loop
!D-iD
B1a (n=620aa)
B1b (n=383aa)
B2 (n=471aa)
Amino Acid
R
K
N
D
Q
E
H
P
Y
W
S
T
G
A
M
C
F
L
V
I
0
10
20
30
40
n=159 Loop
!D-DFL
B1a (n=396aa)
B1b (n=375aa)
B2 (n=372aa)
R
K
N
D
Q
E
H
P
Y
W
S
T
G
A
M
C
F
L
V
I
0
10
20
30
40
n=141 Loop
WT
B1a (n=280aa)
B1b (n=281aa)
B2 (n=282aa)
119
4.4.2.5 O aparecimento de uma população hidrofóbica entre os linfócitos B1a dos
camundongos !D-iD
A utilização dos aminoácidos no “loop” do CDR-H3 determina o índice de
hidrofobicidade do CDR-H3 em uma escala normalizada (Kyte and Dolitte, 1983). O
valor médio de hidrofobicidade do CDR-H3 é determinado, utilizando o índice de
hidrofobicidade previamente estabelecido para cada aminoácido. Essa escala varia de
carregado (-1.3) à hidrofóbico (+1.7), na nossa representação estão mostrado somente
os valores de -1 à +1. Os linfócitos maduros da medula óssea de animais normais WT e
animais !D-DFL apresentam uma distribuição normal, dentro da neutralidade nessa
escala, variando entre -0.6 e +0.6. Os linfócitos maduros da medula óssea (fração F) de
animais !D-iD apresentam uma mudança dessa distribuição para a esquerda, ou seja,
para a faixa mais hidrofílica da escala (Ippolito et al, 2006). Como demonstrado na
figura 26, nós observamos a mesma distribuição normal na faixa da neutralidade entre
os animais WT e !D-DFL nas populações de linfócitos B da cavidade peritoneal.
Entretanto, nas subpopulações de linfócitos B dos camundongos !D-iD, apesar de ter
sido observada um deslocamento para a esquerda, devido ao uso de aminoácidos
carregados, essa mudança não foi tão acentuada quanto nos linfócitos B maduros da
medula óssea, principalmente para os linfócitos B1. Surpreendentemente, os linfócitos
B1a dos camundongos !D-iD apresentaram de forma clara uma outra população dentro
da faixa hidrofóbica da escala Kyte-Dolittle. Esses resultados foram confirmados pela
análise de transcritos de VH7183DJC" de CDR-H3 das mesmas populações de
linfócitos da cavidade peritoneal. A Figura 27 mostra os índices de hidrofobicidade para
as populações da cavidade peritoneal comparando os transcritos utilizando somente a
família VH7183 com os transcritos VH7183DJC" da fração F da medula óssea desses
animais (Ippolito et al, 2006).
120
Figura 26: Perfiis de distribuição da hidrofobicidade média do “loop” de CDR-H3 de transcritos
VDJC! isolados de linfócitos B1a, B1b e B2 de camundongos WT, DFL16.1 e " D-DFL. Os
histogramas representam a distribuição da média de hidrofobicidade dos transcritos VDJC! nas diferentes
populações de linfócitos B (B1a, acima; B1b, meio e B2, abaixo) dos diferentes grupos de animais (WT,
esquerda; "D—DFL, meio e "D-iD, direita). A escala normalizada de Kyte-Dolittle (Kyte and Dolittle,
1982; Eisenberg, 1984) foi utilizada para calcular a hidrofobicidade. A prevalência é mostrada como a
percentagem do loop de CDR-H3 de seqüências únicas, in-frame. Como referencia as duas linhas
verticais em cada histograma representa a faixa de hidrofobicidade media demonstrada para os linfócitos
B maduros da medula óssea de animais WT (Ivanov et al, 2005).
0
10
20
30
40
n=48
B1a
WT B1a
0
10
20
30
40
n=54
!DFL B1a
0
10
20
30
40
n=
48
!D-DFL B2
CDR-H3 Loop
Average Hydrophobicity
0
10
20
30
40
n=
76
!D-iD B1a
0
10
20
30
40
n=
53
!D-iD B2
CDR-H3 Loop
Average Hydrophobicity
0
10
20
30
40
n=
50
!D-iD B1b
0
10
20
30
40
n=
55
!D-DFL B1b
0
10
20
30
40
n=48
WT B2
CDR-H3 Loop
Average Hydrophobicity
0
10
20
30
40
n=48
WT B1b
121
Figura 27: Perfiis de distribuição da hidrofobicidade média do “loop” de CDR-H3 de transcritos
V7183DJC! e VDJC! isolados de linfócitos B1a, B1b e B2 de camundongos "D-iD. Os histogramas
representam a distribuição da média de hidrofobicidade dos transcritos VDJC! nas diferentes populações
de linfócitos B (B1a, acima; B1b, meio superior e B2, meio inferios e Fração F da medula óssea, abaixo)
dos animais "D-iD. Os dois histogramas abaixo representam os mesmos resultados e são refeerentes à
distribuição da hidrofobicidade média em linfócitos B maduros da medula óssea de animais "D-iD, estes
dados foram retirados da referência Ippolito et al, 2006 e foram incluídos para fins comparativos. A
escala normalizada de Kyte-Dolittle (Kyte and Dolittle, 1982; Eisenberg, 1984) foi utilizada para calcular
a hidrofobicidade. A prevalência é mostrada como a percentagem do loop de CDR-H3 de seqüências
únicas, in-frame. Como referencia as duas linhas verticais em cada histograma representa a faixa de
hidrofobicidade media demonstrada para os linfócitos B maduros da medula óssea de animais WT
(Ivanov et al, 2005).
0
10
20
30
40
n=
29
!D-iD B1a
B1a
0
10
20
30
40
n=
60
!D-iD B1b
Transcritos V
H
7183
D
H
J
H
0
10
20
30
40
n=
27
!D-iD B2
CDR-H3 Loop
Average Hydrophobicity
0
10
20
30
40
n=
76
!D-iD B1a
0
10
20
30
40
n=
53
!D-iD B2
CDR-H3 Loop
Average Hydrophobicity
0
10
20
30
40
n=
50
!D-iD B1b
Dados retirados
de
Ippolito et al, 2006
Transcritos de V
H
All
D
H
J
H
122
4.4.2.6 Comprimento do CDR-H3, perda de nucleotídeos “germline” e inserção de
nucleotídeos N nas junções VDJ nas diferentes populações de linfócitos B dos
animais WT, !D-DFL e !D-iD
As células B1 dos camundongos !D-iD apresentaram um maior número de
transcritos em que não é possível identificar o segmento gênico D em relação aos !D-
DFL (Figura 24C). Uma possível maneira dos camundongos !D-iD recriarem o
repertório WT entre os transcritos contendo o segmento iD identificável, seria a seleção
dos clones que diminuíram a contribuição relativa dos nucleotídeos “germline”, ou seja,
os clones que codificam transcritos que sofreram maior perda dos nucleotídeos
codificados pelo iD e/ou maior inserção de nucleotídeos N. Para verificar isso, nós
analisamos o comprimento do CDR-H3, a perda dos nucleotídeos iD por ação das
exonucleases e a inserção de nucleotídeos N nos transcritos de B1a, B1b e B2 dos
camundongos WT, !D-DFL e !D-iD.
Como o segmento iD “germline” inserido nos camundongos !D-iD possui 26
aminoácidos (Figura3C), não é possível fazer uma análise comparativa direta do
comprimento de CDR-H3 com os camundongos WT, onde a contribuição “germline”
do segmento D varia muito. O maior segmento, DFL16.1, contribui com 23
nucleotídeos, o menor segmento D com 11 nucleotídeos (DQ52), o DST4 possui 16 e a
grande maioria dos segmentos, que são os pertencentes à família DSP e o segmento
DFL16.2 podem contribuir com até 17 nucleotídeos. Portanto, os camundongos !D-
DFL, por utilizarem somente um único segmento D (DFL16.1) constituem o melhor
controle para essa análise.
A Figura 28 mostra o perfil de distribuição do comprimento de CDR-H3 nas
diferentes populações celulares. Entre os camundongos WT, observamos um
deslocamento do perfil para a esquerda nas populações de linfócitos B1, evidenciando
123
uma maior tendência de uso de CDR-H3 mais curtos, quando comparados com os
linfócitos B2. Os transcritos codificando apenas 5 ou 6 aminoácidos foram mais
freqüentes entre as células B1a (14%), enquanto que 8% dos linfócitos B1b e 5% dos
linfócitos B2 apresentaram CDR-H3 com 5 ou 6 aminoácidos. O clone MN3A (descrito
na seção 4.3) reativo à HSC70 se encontra exatamente nesta faixa de comprimento de
CDR-H3, com 5 aminoácidos apenas sendo codificados pelo CDR-H3.
As células B dos camundongos !D-DFL não apresentaram diferenças relevantes
no comprimento de CDR-H3 em relação aos transcritos obtidos de células WT que
utilizaram o segmento DFL16.1 (dados não mostrados). O aparente deslocamento do
perfil dos camundongos !D-DFL para direita em relação ao WT, na Figura 28, se deve
ao uso exclusivo do gene DFL16.1 nos animais !D-DFL, que é o gene mais longo.
Entre as diferentes populações da cavidade peritoneal desse animal, aparentemente as
células B1 apresentaram transcritos com CDR-H3 mais curtos do que as células B2.
Comparando os perfis de distribuição de comprimento de CDR-H3 entre as
populações de células B dos animais !D-iD com !D-DFL, nós observamos uma maior
variância do comprimento nas células dos camundongos !D-iD, com um aumento do
uso de CDR-H3 mais longos. Isso não parece ser apenas devido ao segmento iD
“germline” apresentar um códon a mais do que o DFL16.1, pois o aumento foi de dois
ou três códons, sugerindo outros mecanismos como o maior uso de nucleotídeos N nos
transcritos de células B dos animais !D-iD. Entre as diferentes subpopulações celulares
do camundongo !D-iD observamos novamente uma leve tendência ao uso de CDR-H3
mais curtos nas células B1, com 8% dos transcritos das células B1a e B1b codificando 5
ou 6 aminoácidos e apenas 2% dos transcritos de B2.
124
Figura 28: Perfiis de distribuição do comprimento de CDR-H3 de transcritos de VDJC! isolados de
linfócitos B1a, B1b e B2 de camundongos WT, "D-DFL e "D-iD. Os histogramas representam a
distribuição do comprimento de CDR-H3 em número de nucleotídeos dos transcritos VDJC! nas
diferentes populações de linfócitos B (B1a, acima; B1b, meio e B2, abaixo) dos diferentes grupos de
animais (WT, esquerda; "D—DFL, meio e "D-iD, direita). A prevalência é mostrada como a
percentagem de seqüências únicas, in-frame. Como referência as duas linhas verticais em cada
histograma representam a faixa de comprimento de CDR-H3 medio para os linfócitos B maduros da
medula óssea de animais WT (Ivanov et al, 2005).
Como mencionado anteriormente, já é bem descrito na literatura que a adição de
nucleotídeos N é rara em linfócitos B fetais e conseqüentemente diminuída em células
B1a adultas (Feeney, 1990; Tornberg, 1995). Em nossos estudos, analisando a inserção
de nucleotídeos N em transcritos de CDR-H3 dos camundongos WT nós obtivemos os
mesmos resultados. Como pode-se observar na Figura 29 os linfócitos B1a apresentam
uma menor freqüência de regiões N em ambas as junções V-D e D-J, do que as células
B1b e B2. De modo geral, 46% dos linfócitos B1a não apresentaram adição de
nucleotídeos N em ambas as junções, 28% dos linfócitos B1b e apenas 2% das células
B2.
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
0
10
20
30
n=
76
!D-iD
B1a (n=77)
5
6
7
8
9
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16
17
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20
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0
10
20
30
n=48
WT
B1a (n=52)
5
6
7
8
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15
16
17
18
19
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0
10
20
30
n=54
!D-DFL
B1a (n=55)
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
0
10
20
30
n=
51
!D-iD
B1b (n=51)
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
0
10
20
30
n=
51
!D-iD
B2 (n=53)
CDR-H3 Length
5
6
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8
9
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11
12
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15
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22
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20
30
n=
56
!D-DFL
B1b (n=56)
5
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0
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20
30
n=
48
!D-DFL
B2 (n=48)
CDR-H3 Length
5
6
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8
9
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11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
0
10
20
30
n=
56
WT
B1b (n=54)
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
0
10
20
30
n=
48
WT
B2 (n=43)
CDR-H3 Length
125
Apesar do perfil geral de adição de nucleotídeos N dos animais !D-DFL ser
bem semelhante ao do WT, como demonstrado na Figura 29A, nós observamos algumas
diferenças importantes de serem mencionadas. A frequência de inserção de nucleotídeos
N entre as três populações celulares dos camundongos !D-DFL foi menos variável,
com as células B1a e B1b apresentando a mesma frequência de inserção de nucleotídeos
N, em torno de 30%, e as células B2 apresentando um maior número de transcritos sem
a adição de nucleotídeos N, em relação ao controle WT, com 15%.
A Figura 29A mostra o perfil de distribuição da freqüência de transcritos com
um determinado número de nucleotídeos N inseridos. De acordo com essa análise não
parece haver um aumento de inserção de nucleotídeos N nos animais !D-iD, como um
mecanismo para aumentar a diversidade e/ou diminuir a contribuição relativa do
segmento iD na composição do CDR-H3. Na verdade houve um leve aumento no
número de transcritos sem a adição de nucleotídeos N nas células B1a dos
camundongos !D-iD em relação as células B1a dos controles, com 53% dos transcritos
sem regiões N, entre os linfócitos B1b, 30% não tinham nucleotídeos N. Por outro lado,
da mesma forma que os linfócitos B2 dos camundongos !D-DFL, os linfócitos B2 dos
camundongos !D-iD também continham menos transcritos enriquecidos para
nucleotídeos N.
126
Figura 29: Perfis de distribuição da frequência de inserção de nucleotídeos no CDR-H3 de
transcritos VDJC! isolados de linfócitos B1a, B1b e B2 de camundongos WT, "D-DFL e "D-iD. A)
Os histogramas representam a distribuição da frequência de transcritos VDJC! contendo a adição de
determinada quantidade de nucleotídeos N, na junção V-D e D-J, nas diferentes populações de linfócitos
B (B1a, B1b e B2) dos diferentes grupos de animais (WT, acima; "D—DFL, meio e "D-iD, abaixo). A
prevalência é mostrada como a percentagem de CDR-H3 de seqüências únicas, in-frame. B) Painéis
representativos da presença ou ausência de nucleotídeos N, considerando as junções V-D e D-J
simultaneamente. V-D N addition, adição ou não de nucleotídeos N na junção VH-DH; D-J N addition,
adição ou não de nucleotídeos N na junção DH-JH.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
>10
0
25
50
75
100
n=149
WT
B1a (n=52)
B1b (n=54)
B2 (n=43)
Número de nucleotídeos N adicionados
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
>10
0
25
50
75
100
n=159
!D-DFL
B1a (n=55)
B1b (n=56)
B2 (n=48)
Número de nucleotídeos N adicionados
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
>10
0
25
50
75
100
n=181
!D-iD
B1a (n=77)
B1b (n=51)
B2 (n=53)
Número de nucleotídeos N adicionados
A
B
127
Para a nossa última análise, nós verificamos se entre os transcritos que
continham segmentos D identificáveis haveria uma maior perda de nucleotídeos D nos
animais !D-iD, como um mecanismo para diminuir a contribuição do segmento iD na
formação do CDR-H3. Para essa análise, no caso de homologia, os nucleotídeos à 5’DH
ou 3’DH que formaram a região de microhomologia entre os segmentos V-D e D-J,
respectivamente, foram considerados como pertencentes aos segmentos V
H
e J
H
justapostos. Como pode ser observado na Figura 30, nós não observamos uma maior
perda de nucleotídeos “germline” dos segmentos D nas células B dos animais !D-iD
em relação aos animais !D-DFL.
Figura 30: Perfis de distribuição da freqüência de perda de nucleotídeos nos segmentos gênicos DH
de transcritos VDJC! isolados de linfócitos B1a, B1b e B2 de camundongos WT, "D-DFL e "D-iD.
Os histogramas representam a distribuição da freqüência de transcritos VDJC" que perderam
determinada quantidade de nucleotídeos à 5’ e à 3’ do segmento DH, nas diferentes populações de
linfócitos B (B1a, acima; B1b, meio e B2, abaixo) dos diferentes grupos de animais (WT, esquerda;
!D—DFL, meio e !D-iD, direita). A prevalência é mostrada como a percentagem de CDR-H3 de
seqüências únicas, in-frame.
0
1
2
3
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5
6
7
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0
10
20
30
n=40
WT
B1a
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2
3
4
5
6
7
8
9
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11
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21
22
0
10
20
30
n=50
!D-DFL
B1a
0
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2
3
4
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6
7
8
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20
30
n=39
!D-iD
B1b
Total D
H
Loss
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2
3
4
5
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0
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20
30
n=67
!D-iD
B1a
0
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2
3
4
5
6
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22
0
10
20
30
n=45
!D-iD
B2
Total D
H
Loss
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
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22
0
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20
30
n=42
!D-DFL
B2
Total D
H
Loss
0
1
2
3
4
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0
10
20
30
n=51
!D-DFL
B1b
Total D
H
Loss
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
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15
16
17
18
19
20
21
22
0
10
20
30
n=43
WT
B1b
Total D
H
Loss
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
0
10
20
30
n=37
WT
B2
Total D
H
Loss
5. DISCUSSÃO
129
5. DISCUSSÃO
Para avaliar a força dos processos de seleção somática na normalização de um
repertório geneticamente alterado, o grupo liderado pelo Dr. Harry Schroeder Jr.
desenvolveu camundongos com limitações genéticas da diversidade do CDR-H3,
denominados !D-DFL e !D-iD. Os camundongos !D-DFL apresentam um único
segmento gênico D, o segmento DFL16.1 que codifica aminoácidos neutros no RF1,
resultando em CDR-H3 enriquecidos para tirosina e glicina. Quanto aos camundongos
!D-iD, principal alvo do presente trabalho, são geneticamente modificados para
expressar um único segmento D não usual (iD). Este segmento iD consiste na sequência
invertida do segmento DSP2.2, inserido na posição do segmento DFL16.1. Essa
transformação codifica sequências de aminoácidos positivamente carregados no quadro
de leitura principal RF1 (arginina, histidina e asparagina), diferentemente dos códons
originais que geram tirosina e glicina no RF1. É sabido que CDR-H3 enriquecidos por
aminoácidos carregados estão envolvidos em autoreatividade anti-DNA e também
correlacionados com doenças autoimunes (Schlomchik et al, 1990; Krishnan et al,
1996). Esses camundongos foram criados com o intuito de avaliar o papel da sequência
“germline” de nucleotídeos no quadro de leitura principal em determinar os
aminoácidos usados na CDR-H3 e para testar se um camundongo com a sequência
“germline” alterada pode recriar o repertório CDR-H3 típico de um camundongo
selvagem utilizando mecanismos somáticos (Ippolito et al., 2006).
Em estudos recentes, o repertório de BCR das subpopulações de células B na
medula óssea dos camundongos !D-iD foi caracterizado através das sequências de
aminoácidos usadas no CDR-H3. Foi demonstrado que todas as subpopulações,
incluindo as células B maduras na medula óssea (Fração F), expressam
preferencialmente a sequência de aminoácidos codificada pelo RF1 iD (DSP2.2
130
invertido), evidenciando um poder limitado da seleção somática em recriar o repertório
“emergente” de BCR dos camundongos WT (Ippolito et al., 2006). Porém, esse estudo
não avaliou o repertório “atual” desses animais, devido a impossibilidade de se obter os
genes dos plasmócitos secretantes das IgM naturais. Desta forma, uma maneira
alternativa de estudar o repertório atual desses animais foi utilizando a análise global do
repertório de especificidades de anticorpos naturais (Nóbrega et al, 1993; Haury et al,
1994).
Na primeira parte do nosso trabalho, nós analisamos o impacto da limitação
genética dos genes D no repertório de anticorpos naturais séricos desses animais
transgênicos. Os perfis de reatividade de IgM natural no imunoblot de diferentes
extratos antigênicos foram comparados. Foi observada uma substancial homologia entre
os perfis, tanto quando comparadas as reatividades aos antígenos autólogos, quando
comparadas as reatividades no extrato de E. coli (Figura 4), marcada principalmente
pelo aparecimento de praticamente todas as reatividades presentes no repertório WT e
pela ausência de reatividades novas nos animais transgênicos. Considerando a diferença
predominante nas sequências de aminoácidos no CDR-H3 das células maduras da
medula óssea entre os animais !D-iD e os animais controles WT e !D-DFL (Schelonka
et al, 2005; Ippolito et al, 2006), esse resultado nos sugere um papel da seleção
somática, provavelmente dependente de ligantes de BCR, na formação do repertório de
células B secretantes de IgM o que resultou na conservação do repertório de anticorpos
naturais nesse modelo de camundongos transgênicos.
Apesar de não atingirem diferenças estatisticamente significativas por análise de
variância, as divergências de intensidade encontradas nos perfis densitométricos médios
para cada seção de reatividade, entre os diferentes grupos, provavelmente refletem as
variações na frequência de clones secretantes de IgM que reconhecem cada
131
especificidade. Uma vez que os animais transgênicos não possuem a mesma diversidade
de segmentos gênicos D, não seria mesmo esperado que todos os clones responsáveis
por cada uma das especificidades pudessem ser gerados por mecanismos de
recombinação gênica nos animais transgênicos. Desta forma, o que parece estar
acontecendo é a geração de alguns clones com características de CDR-H3 bem
semelhantes aos clones gerados nos animais WT e, possivelmente, outros poucos que
seriam exatamente iguais aos gerados por mecanismos alternativos de rearranjo ou, no
caso do controle !D-DFL, clones que usariam o segmento DFL16.1 nos animais WT.
A diferença mais marcante foi observada no extrato de cérebro, em que uma
banda de reatividade com uma proteína de aproximadamente 70kD, mais tarde
identificada como sendo a HSC70 (uma proteína da família do choque térmico de
expressão constitutiva), foi somente reconhecida pelos anticorpos naturais dos
camundongos WT não sendo identificada no perfil de reatividade dos camundongos
!D-iD e no controle !D-DFL (Figura 5A). A análise de variância de cada uma das
seções de reatividade do extrato de cérebro não mostrou diferenças significativas, a não
ser para a seção referente à HSC70 (Figura 5D). A ausência dessa reatividade não pode
ser atribuída ao CDR-H3 alternativo dos animais !D-iD, caracterizado por aminoácidos
carregados, uma vez que o controle !D-DFL, possui apenas o gene DFL16.1, que é o
mais comumente utilizado no repertório de animais WT, também não apresentou a
reatividade. De maneira interessante, nenhuma outra reatividade do extrato de cérebro
apresentou diferença na análise de variância (Figura 5D).
Embora ainda controversas, existem evidencias convincentes na literatura
sugerindo a participação majoritária de linfócitos do tipo B1 na produção dos anticorpos
naturais (Forster & Rajewsky, 1987; Lalor et al, 1989; Baumgarth et al, 1999) em
especial os linfócitos B1a (Haas et al, 2005). Os linfócitos B1 possuem um padrão de
132
desenvolvimento peculiar, onde a seleção por autoantígenos parece desempenhar um
papel essencial para moldar o repertório, assegurando a produção de anticorpos naturais
auto-reativos (revisto em Hardy, Wei & Hayakawa, 2004). Acredita-se que estas
especificidades seriam evolutivamente importantes e necessárias na composição da
estrutura do sistema imunitário “inato” do indivíduo (Baumgarth, Tung & Herzenberg,
2005). Para determinar se os clones produtores das imunoglobulinas naturais que
reagem com o autoantígeno de cérebro (HSC70) estavam de certa forma
compartimentalizados nessa subpopulação específica, nós realizamos uma série de
experimentos que nos forneceram evidências da participação dos linfócitos B1a na
produção dessa imunoglobulina natural.
Primeiramente nós demonstramos que a reatividade à HSC70 está fortemente
presente nos sobrenadantes de cultura de células B obtidas da cavidade peritoneal, por
outro lado, a reatividade está praticamente ausente nos sobrenadantes de cultura de
células B esplênicas (Figura 6). Os linfócitos B1 são a maioria na cavidade peritoneal,
enquanto que no baço eles compõem apenas uma pequena fração do repertório
disponível, nesse sentido, nosso resultado sugeriu o envolvimento das células B1 com a
reatividade no extrato de cérebro.
A análise do repertório de anticorpos naturais séricos de quimeras reconstituídas
com medula óssea ou fígado fetal de camundongos !D-iD!RAG-/- e WT!RAG-/-,
nos mostrou que a banda de reatividade estava ausente nos soros de ambas as quimeras
de medula óssea e nas quimeras reconstituídas com fígado fetal de camundongos !D-
iD. Entretanto, essa reatividade estava presente nas IgM séricas de quimeras Rag-/-
reconstituídas com células provenientes de fígado fetal de WT!RAG-/- (Figura 7).
Sabe-se que quimeras Rag-/- reconstituídas com medula óssea de animais
adultos regeneram eficientemente a população de linfócitos B convencionais ou
133
linfócitos B2, mas não regeneram completamente a população de linfócitos B1 da
cavidade peritoneal (Hayakawa and Hardy, 1991; Esplin et al, 2009). Recentemente foi
descrito pelo grupo do Dr. Dorshkind (Montecino-Rodriguez et al, 2006) um precursor
específico para os linfócitos B1 (B1P), caracterizado pelo fenótipo CD45R
lo/neg
CD19
+
,
que seriam os primeiros precursores de linhagem B identificáveis no fígado fetal e na
medula óssea fetal. Neste trabalho foi demonstrado que isolando os precursores
CD45R
lo/neg
CD19
+
da medula óssea de camundongos adultos e injetando em
camundongos SCID, esses precursores prontamente reconstituíram a população de
linfócitos B1 peritoneais, mas não foram capazes de reconstituir a população de
linfócitos B convencionais da medula óssea e do baço. Nossos dados mostraram que a
reconstituição do compartimento B1 de camundongos RAG-/-, por meio do transplante
de células do fígado fetal de camundongos WT, foi suficiente para o aparecimento dos
clones no repertório atual responsáveis pela produção das imunoglobulinas naturais no
soro que reagem com a proteína HSC70 no extrato de cérebro.
Por outro lado, o grupo do Dr. Kincade (Esplin et al, 2009) em um trabalho
ainda mais recente demonstrou que os precursores B1P estariam presentes em pequenas
quantidades mesmo na medula óssea adulta e seriam potencialmente capazes de gerar
linfócitos B1, mas ainda não se sabe exatamente se essa diferenciação em linfócitos B1
dependeria da sinalização via BCR (Tung & Herzenberg, 2007). A ausência da
reatividade no soro das quimeras de medula óssea adulta, nos nossos experimentos,
pode sugerir que mesmo com a presença dos precursores B1 minoritários na BM
(Esplin et al, 2009), essa população provavelmente não foi capaz de se desenvolver em
linfócitos B1 maduros e entrar no pool periférico de plasmócitos secretantes de IgM.
Levando se em conta o período de quatro semanas pós reconstituição, a falta dos
clonotipos B1 no pool periférico secretante de IgM, das quimeras de BM, se deve muito
134
provavelmente à grande maioria dos precursores B2 presentes na BM adulta, e à falta
do ambiente fetal provavelmente necessário ao desenvolvimento e maturação dos clones
B1a produtores do anticorpo natural em questão. Segundo Agenès e Freitas (1999), o
pool de plasmócitos secretantes de IgM (repertório atual) é o primeiro a ser formado,
dessa forma a primeira população de linfócitos B a se estabelecer na periferia seria
recrutada para compor o repertório atual. Além disso, eles demonstraram que na
presença de uma população previamente estabelecida de células B ativadas produtoras
de IgM, ocorrerá uma diminuição da contribuição de IgM produzida pela população
subsequente de linfócitos B emergente, como num “feedback” negativo (Agenès &
Freitas, 1999). Dessa forma, a ausência da reatividade com a HSC70 no soro das
quimeras de medula óssea, sugere que os precursores de linfócitos B1 presentes nessas
quimeras, que seriam a minoria em relação aos precursores B2, não conseguem se
estabelecer frente aos linfócitos B2 no pool periférico de linfócitos secretantes de IgM.
A confirmação de que as imunoglobulinas naturais anti-HSC70 é produto
fisiológico de linfócitos B1a, veio com experimentos em que nós isolamos e cultivamos
as subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal (B1a, B1b e B2) sob condições
de diluição limitante (LDA) e submetemos os sobrenadantes dessas culturas ao
imunoblot para análise do repertório disponível. Utilizando a distribuição de Poisson
(Andersson et al, 1977a), nossos resultados mostraram uma frequência altíssima dessa
especificidade entre os linfócitos B1a, em torno de 1 em cada 130 linfócitos B1a, com
os primeiros poucos sobrenadantes negativos aparecendo somente quando nós
cultivamos 370 linfócitos B1a por cultura (Figura 8). A contribuição dos linfócitos B2
para essa reatividade natural pode ser considerada nula, pois a frequência estimada foi
de aproximadamente 1 em cada 20.000 células B2 colocadas em cultura. Quanto aos
linfócitos B1b a frequência foi de 1 em cada 5.300. Considerando que após o
135
isolamento das células por “cell sorter”, nós obtivemos uma pureza em torno de 97%, e
que a frequência dessa especificidade é de 1:130 entre os linfócitos B1a, é razoável
considerar que esses sobrenadantes positivos encontrados nas culturas das
subpopulações B1b e B2 sejam contaminações com células B1a nessas culturas mais do
que propriamente a menor representação desses clones nas populações B1b e
principalmente B2. A maior frequência da reatividade nas culturas de B1b em relação à
B2 é coerente com uma maior contaminação de linfócitos B1a nas culturas B1b, devido
à maior dificuldade de separação dessas duas populações fenotipicamente muito
semelhantes (Figura 8A).
Uma das principais peculiaridades dos linfócitos B que são gerados durante a
vida fetal do camundongo é a ausência de nucleotídeos N nas junções V
H
!D
H
e
D
H
!J
H
da cadeia pesada de imunoglobulina (Feeney, 1990). Isso se deve a ausência de
expressão da enzima desoxinucleotidil transferase terminal (TdT) no período fetal e
neonatal (Alt & Baltimore, 1982; Desiderio et al, 1984; Li et al, 1993). Dessa forma,
como a ontogenia dos linfócitos B1a está associada aos progenitores de origem fetal, as
células B1a apresentam reduzida inserção de nucleotídeos N se comparadas com os
linfócitos B1b e ainda mais reduzida comparando com os linfócitos B2 (Kantor et al,
1997; os resultados do presente trabalho, Seção 4.4.2).
Para obter indícios do envolvimento de clones de linfócitos B1a com rearranjos
“germline”, ou sem inserção de nucleotídeos N, na produção das IgM responsáveis pela
reatividade à HSC70, nós analisamos o repertório de especificidades de amostras de
soros de animais deficientes para TdT, que apresentam um repertório semelhante ao
fetal, sem adição de nucleotídeos N (Gilfillan et al, 1993). Nossos dados mostraram que
os camundongos TdT nocautes apresentaram a reatividade com a HSC70, e portanto
136
sugerem fortemente o uso de rearranjos “germline” sem adição de nucleotídeos N na
composição desse clonotipo.
Existem vários exemplos de anticorpos naturais utilizando rearranjos canônicos
envolvidos na imunidade independente de células T, reconhecendo antígenos associados
à patógenos como fosforilcolina (PC) (Feeney, 1991), !1-3 dextran (Stohrer & Kearney,
1984) e 3-fucosillactosamina (Kimura et al, 1989), e a origem das células produtoras
desses anticorpos canônicos é provavelmente fetal ou neonatal (Vakil & Kearney,
1991). Camundongos normais imunizados com Streptococcus pneumoniae produzem
altos níveis de anticorpos anti-PC utilizando o idiotipo T15, que são codificados por
sequências “germline” (Briles et al, 1981b; Kearney et al, 1981). Benedict & Kearney
(1999), para verificar se o aumento da diversidade juncional durante o desenvolvimento
fetal era capaz de impedir a formação do idiotipo protetor, desenvolveram
camundongos transgênicos para a enzima TdT, que expressam essa enzima de forma
constitutiva, inserindo nucleotídeos N nas junções VDJ desde o período fetal. Eles
mostraram, que apesar de os camundongos produzirem outros clonotipos, mas não o
T15, que reconheciam PC, esses clonotipos não conferiram proteção contra o desafio
por S. peneumoniae, exatamente devido à exigência de um determinado idiotipo que só
é gerado por rearranjos canônicos.
Para verificar se a indução da expressão constitutiva da enzima TdT era capaz de
impedir a formação do clone anti-HSC70, nós testamos soros de camundongos TdT
transgênicos contra extrato de cérebro e demonstramos que esses animais não
apresentam essa reatividade no soro. Esses dados, juntamente com os resultados obtidos
com as quimeras reconstituídas com fígado fetal, confirmam as evidências de que
células B1a de origem fetal com sequências “germline”, desprovidas de sequências N,
são as prováveis responsáveis pela reatividade com a HSC70 no soro.
137
Os dados de Ippolito et al. (2006) demonstraram que na cavidade peritoneal, os
números absolutos de linfócitos B1a e B1b dos camundongos !D-iD estão reduzidos
em relação aos controles WT e !D-DFL. Este efeito é ainda mais pronunciado para a
população B1a, que como discutido anteriormente é enriquecida para sequências
derivadas de progenitores perinatais que tendem a ser mais influenciadas por sequências
“germline” como um resultado da ausência de inserção de nucleotídeos N. A população
de linfócitos B2 da cavidade peritoneal, que é derivada do mesmo pool de células B
convencionais circulantes no sangue, no baço e na medula (Hardy & Hayakawa, 2000),
atingem um leve aumento do número absoluto nos camundongos !D-iD, quando
comparado com os camundongos controles. Ainda não está claro se esse aumento
representa um efeito compensatório da maior disponibilidade de espaço fisiológico, em
razão da baixa de linfócitos B1, ou se o repertório genético alterado facilitaria a
ocupação da cavidade peritoneal por essas células B convencionais (Ippolito et al,
2006). O interessante é que apesar dessa diminuição no número de células B1a nos
animais !D-iD nossos dados demonstraram que de uma forma geral o repertório de
especificidades de anticorpos naturais é bem semelhante ao repertório dos camundongos
WT e também dos animais !D-DFL, que por sua vez possuem números de células B
semelhante ao WT.
A resposta imune humoral desses animais também foi previamente estudada
(Ippolito et al, 2006) e, embora os camundongos !D-iD homozigotos expressem níveis
normais de IgM e IgA sérica, os níveis dos quatro subtipos de IgG estão diminuídos em
relação ao controle, indicando que a capacidade desses camundongos !D-iD em
responder a uma variedade de antígenos pode estar comprometida. Estudos de
imunização mostraram que nesses animais os títulos de IgM anti-DEX e IgG anti-NP
(nitrofenil) e TT (toxóide tetânico) estavam significantemente diminuídos em relação ao
138
controle, indicando que a resposta imune de células B tanto T-independente quanto T-
dependente estava diminuída nesses animais transgênicos (Ippolito et al, 2006). Uma
possível explicação para isso seria a incapacidade desses animais em recapitular
completamente o repertório WT, enriquecido para tirosina e glicina no CDR-H3, que
seriam necessários para produção de sítios de ligação mais eficientes a esses antígenos
exógenos (Schroeder et al, 1998). Esses dados, já demonstravam anteriormente que os
níveis de IgM naturais séricas não estavam abalados pelo uso forçado de aminoácidos
carregados no CDR-H3 e sugeriam que provavelmente, a construção !D-iD estaria
impedindo a produção de um repertório completo de anticorpos com especificidades
para certos antígenos exógenos em resposta a imunizações, porém esses estudos não
avaliaram o repertório de especificidades naturais a autoantígenos, sendo o nosso
trabalho, o primeiro a abordar esse assunto.
Há muitos anos se sabe que os níveis de IgM sérica de camundongos criados em
condições especiais e isentos de microbiota autóctone (“germfree”) são semelhantes ao
de camundongos convencionais ou criados em condições SPF (Hashimoto et al, 1978;
Hooijkaas et al, 1984 e Figura 10A). Por outro lado, os níveis de IgG sérica e de IgA na
mucosa são claramente reduzidos, indicando que a secreção de IgM natural é em geral
induzida independente da estimulação antigênica externa, enquanto que a secreção de
IgG e IgA são pelo menos em parte dependentes de estímulos exógenos (revisto em Vaz
et al, 2003). A resposta “antígeno-específica” de IgM, bem como dos outros isotipos
IgG, IgA e IgE, é também induzida em resposta a estímulo antigênico, sugerindo que a
regulação da produção constitutiva de IgM natural é diferente da IgM induzida por
antígenos. Nós então realizamos experimentos para comparar o repertório de
especificidades de anticorpos naturais de animais “germfree” e animais criados em
condições SPF, para verificar se as IgM presentes no soro dos animais WT, que se
139
ligavam à HSC70 no extrato de cérebro, estariam presentes mesmo na ausência de
microbiota autóctone. Primeiramente nós medimos a concentração de IgM e IgG nos
soros desses animais e verificamos uma equivalência nos níveis de IgM, enquanto que
os níveis de IgG estavam significativamente maiores nos animais SPF quando
comparado com os animais “germfree”. Além disso, nós observamos que o perfil de
reatividade no extrato de cérebro é essencialmente o mesmo entre os camundongos
BALB/c criados em diferentes condições, especialmente em relação à proteína HSC70.
Esses dados estão de acordo com os experimentos prévios realizados utilizando a
mesma técnica, onde o perfil de reatividade de IgM natural em diferentes extratos se
mostrou semelhante em animais convencionais, “antigen-free” de “germfree”,
sugerindo que o repertório de especificidades naturais não é dependente de contato com
antígenos externos (Haury et al, 1997).
Os perfis de reatividades do repertório de anticorpos naturais são estabelecidos
cedo na ontogenia e são conservados entre os diferentes indivíduos de uma mesma
espécie e também ao longo da vida saudável de cada indivíduo (Mouthon et al, 1995;
Haury et al, 1997). Mudanças nos perfis de reatividades podem ser influenciadas por
mudanças em genes importantes na atividade imunológica, como MHC e os genes
variáveis de imunoglobulinas (Vasconcellos et al, 1998; revisto em Vaz et al, 2006). No
nosso modelo de animais transgênicos nós observamos a falta de uma reatividade no
perfil de especificidades no extrato de cérebro. Nós obtivemos por proteômica a
sequência de aminoácidos e identificamos que a reatividade ausente nos camundongos
transgênicos era com a proteína Hspa8 (também conhecida como HSC70 - “heat shock
constitutive protein 70kD”), que ao contrário da HSP70 que é induzida por estresse, é
uma proteína de expressão constitutiva que é altamente conservada ao longo da
filogenia (Goldfarb et al, 2006).
140
A identificação de uma reatividade natural com uma proteína de expressão
constitutiva altamente conservada entre as diferentes espécies, e a perda dessa auto-
reatividade por uma violação dos mecanismos genéticos que geram o repertório
“germline” é no mínimo intrigante do ponto de vista do acoplamento da formação do
repertório natural com a auto-reatividade fisiológica. É interessante associar a
conservação do repertório natural, com a conservação dos autoantígenos que na nossa
maneira de ver estariam participando na moldagem do repertório, garantindo a
conservação de um repertório filogeneticamente estável, selecionado por antígenos do
próprio organismo e não por antígenos exógenos, que na verdade pouco participariam
na formação do repertório natural.
A identificação dessa “heat shock protein” 70 nos remeteu às interpretações de
Irun Cohen, que propõe a existência de um “homúnculo imunológico”, em uma
analogia ao homúnculo neurológico. O “homúnculo imunológico” seria a imagem
interna do “self”, ou clones que reagem como um conjunto de auto-antígenos
hierarquicamente importantes na atividade imunológica (Cohen, 1992). Desta forma, a
atividade imunológica é estruturada por um núcleo de clones linfocitários auto-reativos
com determinados componentes ubíquos no organismo, como por exemplo as proteínas
de choque-térmico (Vaz, 2006).
A existência de um período fetal em que não há a inserção de nucleotídeos N,
implica claramente na predominância da expressão de especificidades codificadas por
rearranjos “germline”, e isso sugere que, não só os autoantígenos conservados mas
também as interações idiotípicas em uma rede codificada por rearranjos “germline”
pode desempenhar um papel relevante no desenvolvimento do repertório de anticorpos
cedo na ontogenia (Jerne, 1974; Vakil & Kearney, 1986; Coutinho et al, 1989;
Holmberg et al, 1989).
141
Nossos dados sugerem a existência de um clone majoritário conservado entre os
diferentes camundongos BALB/c, gerado no período fetal com sequência “germline”
que reage com um autoantígeno, também altamente conservado. A alteração genética
dos genes variáveis de Ig impede a formação ou a seleção desse clone para compor o
repertório atual. Se realmente existe um processo de seleção envolvido na conservação
das reatividades naturais em especial para essa reatividade com a HSC70, quem seria o
fator selecionador? Seria o antígeno HSC70? Seria outros idiotipos presentes no
repertório normal? Seria um segundo antígeno não relacionado? Ou por outro lado,
existe mesmo um fenômeno de seleção operando? Se sim, que grau de seleção houve?
Vale lembrar que estas hipóteses não são mutuamente excludentes. Algumas dessas
perguntas poderiam ser respondidas com experimentos mais sofisticados, variando no
animal a expressão da proteína constitutiva HSC70, ou alterando a conformação dos
epitopos dessa proteína em sua forma nativa.
Tanto para verificar o papel da HSC70 na seleção, quanto para verificar à
influência das interações idiotípicas, um bom começo seria a identificação do clone, ou
dos clones que produzem as imunoglobulinas presentes no soro que reagem com a
HSC70 no imunoblot. A demonstração inequívoca de que pelo menos um clone
responsável pela reatividade com a HSC70 é gerado por células B1a de origem fetal
com sequências “germline”, foi obtida pelo isolamento de linfócitos B1a da cavidade
peritoneal, posterior cultura, identificação da reatividade a HSC70 e sequenciamento
dos genes de imunoglobulina. Devido a inexistência de uma técnica rápida e eficiente
de descrição do repertório de imunoglobulinas naturais que nos permita ao mesmo
tempo a detecção da especificidade antigênica, a caracterização dos genes V e a
estimativa da freqüência real de cada clone, nós desenvolvemos uma nova metodologia,
cujo os detalhes estão descritos no manuscrito - Anexo I.
142
Nós primeiramente isolamos o clone, e após a expansão do mesmo nós testamos
para a reatividade com HSC70, sendo então o clone anti-HSC70 denominado de
MN3A. A sequência de nucleotídeos obtida a partir de transcritos de IgH do clone
MN3A, responsável pela produção da IgM auto-reativa a HSC70 no extrato de cérebro,
foi analisada utilizando a ferramenta IMGT e revelou o uso do gene V
H
Ox-1,
pertencente à família VQ52 (V
H
2); o uso do menor segmento gênico D, o DQ52 e o uso
do gene J
H
2. Nosso critério para a definição de um “gene D identificável” na análise dos
sequenciamentos foi a identificação de pelo menos cinco nucleotídeos de homologia
com o segmento D “germline”. Nós assumimos o uso do segmento DQ52 para o clone
MN3A pois somando os nucleotídeos centrais TC com os nucleotídeos a 5’A e a 3’TG,
que possivelmente formaram uma região de microhomologia V
H
-D e D-J
H
,
respectivamente, nós obtivemos cinco nucleotídeos homólogos ao segmento DQ52
“germline” (Figura 17). Essas regiões de microhomologia são classicamente descritas
na literatura (Gu, Forster & Rajewsky, 1990) e acontecem na ausência de nucleotídeos
N. Foi demonstrado que essas micro homologias acontecem mais frequentemente entre
os linfócitos B1a, quando comparados com linfócitos B1b e B2 e estão associadas ao
uso preferencial de genes J
H
, sendo mais comuns entre os rearranjos que utilizam os
genes J
H
1 e J
H
2 (Gu, Forster & Rajewsky, 1990; Kantor et al, 1997). Em um
experimento anterior independente utilizando a mesma técnica de isolamento de
linfócitos e sequenciamento, nós já havíamos sequenciado exatamente a mesma cadeia
pesada de Ig identificada no clone MN3A. Além disso, em experimentos posteriores de
sequenciamento em “bulk” de cada subpopulação B1a, B1b e B2 nós sequenciamos
dentro da população B1a dos camundongos WT novamente o mesmo CDR-H3. Esses
dados em conjunto evidenciam que esse rearranjo “germline” V
H
Ox-1-DQ52-J
H
2 é
relativamente frequente durante o desenvolvimento fetal e que devido aos linfócitos
143
B1a terem características de auto-renovação e vida longa, clones contendo esse
rearranjo são majoritários na cavidade peritoneal.
Em uma série de experimentos anteriores realizados por nós utilizando soros e
culturas de células de camundongos C57BL/6 no imunoblot de extrato de cérebro
(dados não mostrados), nós verificamos que os camundongos C57BL/6 não
apresentavam a reatividade com a HSC70. Primeiramente analisando o repertório de
IgM natural sérica desses camundongos nós observamos um perfil de reatividade bem
semelhante ao encontrado no soro de camundongos BALB/c, com exceção à reatividade
com a proteína HSC70 que não aparece no perfil de reatividades dos camundongos
C57BL/6. Em estudos adicionais nós isolamos os linfócitos B1a, B1b e B2 da cavidade
peritoneal desses animais, realizamos culturas com estímulo policlonal e verificamos
que, mesmo no repertório disponível de clones secretantes de IgM, essa reatividade não
estava presente (dados não mostrados). A identificação do clone MN3A e a
demonstração do uso do gene V
H
Ox-1, veio de certa forma explicar a ausência dessa
reatividade a HSC70 nos camundongos C57Bl/6 no imunoblot. Kaartinen e
colaboradores (1989) demonstraram que enquanto o gene V
H
Ox-1 é utilizado por
camundongos BALB/c na resposta primária à oxazolona (Ox), que é dominada pelo
idiotipo CRI
OX-1
, os camundongos C57BL são completamente depletados desse
idiotipo. Eles mostraram também que os 12 diferentes anticorpos anti-Ox de
camundongos C57BL não usam o segmento gênico apropriado, V
H
Ox-1, necessário
para a expressão do idiotipo CRI
OX-1
.
A explicação provável para isto, segundo os
próprios autores na época, seria a ausência do gene V
H
Ox-1 no genoma dos
camundongos C57BL.
Mais tarde, outro grupo descreveu que o idiotipo CRI
Xmp-1,
que domina a
resposta primária ao ftalato (Xmp) em camundongos BALB/c, está ausente na resposta
144
anti-Xmp de camundongos C57BL/6 (Luo et al, 1992). Os anticorpos anti-Xmp
CRI
Xmp-1
Id
+
foram sequenciados e continuamente o mesmo clonotipo era identificado,
usando a combinação do V
H
Ox-1, DFL16.2 e diferentes genes J
H
. Os autores
demonstraram que um polimorfismo genético era responsável pela regulação da
expressão do idiotipo CRI
Xmp-1
restrito ao locus IgHa (Winter et al, 1995).
Esses trabalhos demonstraram que os camundongos C57BL/6 possuem o alelo
do gene V
H
Ox-1, que é 99% idêntico ao gene V
H
Ox-1 de camundongos BALB/c e é
funcionalmente rearranjado e expresso. Foi demonstrado que a falta da reatividade ao
ftalato está ligada à duas de quatro mudanças no alelo do gene V
H
Ox-1 nos
camundongos C57BL/6. Mais precisamente, a mudança de dois diferentes aminoácidos
no CDR-H1 (posição 35) e no CDR-H2 (posição 53) é exclusiva do gene V
H
Ox-1 dos
camundongos C57BL/6 e pode explicar a falta da utilização do gene V
H
Ox-1, na
resposta anti-ftalato em camundongos C57BL/6 (Winter et al, 1995), mas pode também
estar envolvida na ausência da reatividade a HSC70 nessa linhagem de camundongo.
Com relação ao nosso modelo, é importante observar que os camundongos WT, !D-
DFL e !D-iD, possuem todos o mesmo gene V
H
Ox-1, portanto as diferenças relevantes
que impedem a formação desse clonotipo estão ligadas ao CDR-H3. Cabe aqui ressaltar,
que existem outras duas mudanças no gene V
H
Ox-1 dos camundongos C57BL/6 em
relação ao BALB/c, uma mudança silenciosa no códon 61 e uma mudança de arginina
para lisina no códon 94, exatamente no CDR-H3, que provavelmente está relacionada
com a perda da reatividade natural a HSC70 observada nos camundongos C57BL/6 no
nosso modelo (dados não mostrados).
Os resultados obtidos com a clonagem e identificação do clonotipo MN3A
confirmam de forma bastante extraordinária, todos os nossos resultados obtidos
anteriormente utilizando apenas o imunoblot, como a participação de clones com
145
rearranjos canônicos, de origem fetal, a participação de linfócitos B1a e por fim, a
provável ausência de um clonotipo correlacionado nos camundongos C57BL/6, os quais
estão rigorosamente em acordo com as características dos genes variáveis de cadeia
pesada utilizada pelo clonotipo MN3A. Esses dados, reafirmam que o imunoblot é uma
ferramenta potente para o estudo do repertório de anticorpos naturais (Haury et al,
1994), mesmo analisando as reatividades de maneira isolada.
Nossos resultados mostraram que a inserção de um segmento gênico iD no locus
D dos camundongos !D-iD codificando, a princípio, um CDR-H3 de imunoglobulinas
enriquecido para aminoácidos carregados, não modificou de forma radical o repertório
de especificidades de anticorpos naturais quando comparados aos controles WT e !D-
DFL. Esses dados, de certa forma, contrastam com os experimentos conduzidos por Xu
e Davis (2000). Esses autores, utilizaram animais transgênicos expressando um único
gene V
H
, mantendo a diversidade juncional do CDR-H3, ou seja, enquanto esses
camundongos V
H
transgênicos mantiveram invariáveis os CDR-H1 e CDR-H2, o CDR-
H3 se manteve com a diversidade praticamente indistinguível dos animais WT. Foi
demonstrado que a imunização desses animais com uma variedade de proteínas e
haptenos levou a respostas primárias de IgM antígeno-específicas em que os clones se
diferenciaram apenas no CDR-H3 do domínio V
H
e que o desafio secundário com esses
antígenos levou a uma maturação da afinidade semelhante à observada em animais WT.
Os únicos clonotipos que parecem ter sido afetados pela falta de diversidade do locus
V
H
foram os que são responsáveis pela imunidade humoral a polissacarídeos
bacterianos (Xu & Davis, 2000). Esse dados estão de acordo com achados que sugerem
que nas imunoglobulinas, tanto o CDR1, quanto o CDR2 de ambas cadeias leve e
pesada possuem apenas poucas conformações canônicas e que apenas o “loop” de
CDR3 da cadeia pesada tem uma enorme margem de variação tanto no comprimento
146
quanto na forma (Chothia et al, 1989). Esses resultados indicam que um repertório V
H
extensamente diversificado (tanto V
H
, quanto V
L
) não é necessário para a produção de
anticorpos específicos para a maioria dos antígenos, e que o CDR-H3 desempenha um
papel crucial e diferenciado na formação do sítio de ligação do antígeno em relação as
sequências “germline” codificadas pelo CDR1 e CDR2 (Xu & Davis, 2000) sendo o
principal determinante da especificidade do reconhecimento antigênico, pelo menos no
repertório primário (Davis et al, 1998).
No nosso ensaio, comparamos o repertório natural de animais em que a
diversidade do CDR-H1 e CDR-H2 foi mantida a princípio intacta, e a diversidade do
CDR-H3 foi limitada ao uso de um único gene D, DFL16.1, ou limitada a um único
segmento D não existente na natureza (iD) codificando aminoácidos carregados,
camundongos !D-DFL e !D-iD, respectivamente. A substancial homologia apresentada
entre o repertório de especificidades dos diferentes camundongos, sugere que
provavelmente existem diferentes mecanismos operando para a normalização do
repertório de CDR-H3 dos principais clones que compõem o repertório de anticorpos
naturais desses animais transgênicos. Uma possível explicação para essa
“normalização” do repertório seria o uso de mecanismos moleculares, como geração de
rearranjos alternativos (maior adição de nucleotídeos N, diminuição da contribuição do
gene iD no CDR-H3 por ação de exonucleases, uso de quadros de leituras alternativos)
atuando de forma orquestrada com os mecanismos de seleção somática, que atuariam
nesses clones alternativos favorecendo o desenvolvimento, maturação e migração para a
periferia (Gaudin & Freitas, 2004a). Por outro lado, a ausência da reatividade com a
HSC70 indica que a seleção somática não consegue operar em uma fração do repertório
B1a em que existe a exigência de clones formados por células com determinados
147
rearranjos “germline” que foram comprometidos pela mutação !D-iD, e também pela
deleção de 12 dos 13 segmentos gênicos D, como no caso dos camundongos !D-DFL.
Nós então correlacionamos o repertório de especificidades de IgM disponível
nas células B1a, B1b e B2 da cavidade peritoneal com o repertório genético do CDR-
H3 dessas populações celulares, para verificar se de uma maneira geral o repertório
transgênico seria capaz de recapitular o repertório WT. Essas populações celulares
foram escolhidas para o nosso estudo devido aos linfócitos B1 serem considerados os
maiores responsáveis pelos anticorpos naturais séricos e as células B2 por
representarem as células B convencionais na cavidade peritoneal (Forster & Rajewsky,
1987; Kawahara et al, 2003; Thurnheer et al, 2003).
A substancial homologia apresentada pelo repertório de anticorpos naturais
séricos foi também observada no repertório de especificidades de IgM disponível nas
diferentes subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal, mas de maneira menos
proeminente. Comparando de maneira qualitativa o repertório de especificidades
disponível no compartimento B1a especificamente, a frequência da reatividade com a
HSC70 é muito alta (!1:130), quando comparada com as demais reatividades nos
animais WT, confirmando nossos achados anteriores (Figura 14). De forma
surpreendente, os sobrenadantes de cultura dos linfócitos B1a dos animais !D-iD
apresentaram a reatividade com a proteína HSC70 no extrato de cérebro. A frequência
da reatividade a HSC70 presente no sobrenadante de linfócitos B1a de !D-iD foi
calculada em torno de 1 em cada 460 clones de linfócitos B1a secretantes de IgM.
Apesar de termos obtido alguns sobrenadantes provenientes de linfócitos B1a de
camundongos !D-DFL positivos para a reatividade com a HSC70, esses sobrenadantes
não foram suficientes para determinar a frequência dessa reatividade nesse grupo de
camundongos, de forma estatisticamente significativa.
148
A análise semi-quantitativa das reatividades revela que a reatividade à HSC70
nos sobrenadantes dos animais !D-iD é bem menos intensa e menos definida (Figura
19A), sugerindo, além da menor frequência, uma menor afinidade entre as moléculas de
IgM presentes nesses sobrenadantes do que nas reatividades com os sobrenadantes de
cultura de linfócitos B1a dos camundongos WT. Esses dados em conjunto com a
informação da sequência do clonotipo responsável pela reatividade com a HSC70
(MN3A), sugerem que os camundongos !D-iD apresentam essa reatividade, mas
provavelmente não apresentam o mesmo clonotipo presente nos linfócitos B1a dos
camundongos WT. Sendo então clonotipos alternativos rearranjados com VOx-1 e J
H
2,
mas que provavelmente perderam totalmente o segmento iD e conseguiram montar,
através de perdas de nucleotídeos e inserção de nucleotídeos N um CDR-H3 com
características semelhantes ao CDR-H3 envolvido na reatividade à HSC70, descrita
anteriormente. Este cenário seria perfeitamente possível devido à micro homologia
apresentada entre as regiões VH-D e D-JH no clonotipo MN3A, o que seria necessário
apenas a inserção de dois nucleotídeos N TC em um rearranjo do gene VOx-1 com o
gene JH2 em que todo o gene iD tivesse sido perdido. De fato um rearranjo semelhante
ocorreu. Em experimentos de sequenciamento em “bulk”, um clone proveniente de
linfócitos B1a de camundongos !D-iD foi sequenciado, utilizando rearranjo com o
segmento gênico VOx-1 e J
H
2, e com extensa perda dos nucleotídeos iD, o que resultou
em um CDR-H3, com a seguinte sequência GCCAGAGTTGACTAC. Comparando com
o CDR-H3 do clonotipo MN3A (GCCAGAACTGACTAC, Figura 17), esse clone !D-iD
possui apenas um códon de diferença que provoca a mudança do aminoácido treonina
central no clonotipo MN3A para uma valina no clonotipo alternativo !D-iD (Apêndice
III e Figura 17). Estas são apenas especulações, a prova de que rearranjos alternativos
estariam envolvidos na formação de clones idênticos aos encontrados nos camundongos
149
WT exigiria a utilização da técnica desenvolvida por nós para isolar clones únicos dos
camundongos transgênicos que reagem com a HSC70 no imunoblot e posterior
sequenciamento desses clones.
A principal diferença observada no repertório de especificidades disponível do
compartimento B1a entre os diferentes grupos de camundongos foi a reatividade com a
proteína HSC70, e esta reatividade estava praticamente ausente no repertório de B1b e
B2 em todos os camundongos. Para esses experimentos foram testados ao todo 21
sobrenadantes de cultura contendo cada concentração de cada tipo celular de cada um
dos grupos analisados. Nós observamos maiores diferenças, comparando os perfis
médios de reatividade, entre os repertórios dos diferentes grupos de animais no
compartimento B1b e principalmente no compartimento B2 (Figura 19). Isso se deve
principalmente ao fato de que significativas variações no perfil de reatividade estão
presentes entre os diferentes sobrenadantes pertencentes a cada um desses tipos
celulares de um mesmo camundongo. A variância apresentada entre os sobrenadantes
de culturas de células B1b e B2 nos diferentes camundongos foi também observada
entre os 21 diferentes sobrenadantes de cada um dessas subpopulações no WT, no !D-
DFL ou nos !D-iD. De acordo com a variação esperada pela lei de Poisson, isso se deve
muito provavelmente, à menor frequência de cada uma das reatividades nas populações
de linfócitos B1b e principalmente nas populações de linfócitos B2 analisadas.
Estudos realizados por Nóbrega e colaboradores (1998), analisando o repertório
disponível de maneira qualitativa revelaram que a distribuição clonal de linfócitos B
esplênicos em repouso reagem com antígenos de fígado de camundongos de forma bi-
modal, consistindo em um pequeno grupo de antígenos que são reconhecidos com alta
frequência (1:220 a 1:1.000) e um grande número de antígenos que seriam reconhecidos
com baixa frequência (1:5.000 a 1:100.000). No nosso estudo para os linfócitos B2, que
150
seriam correspondentes às células B esplênicas em repouso analisadas por Nóbrega e
colaboradores (1998), tanto essa distribuição bi-modal quanto essas freqüências seriam
praticamente as mesmas. Porém, para os linfócitos B1b no nosso estudo, parece que a
grande maioria dos antígenos estariam sendo reconhecidos com frequências
intermediárias em torno de 1:1.000 e 1:10.000, enquanto que alguns poucos antígenos
seriam reconhecidos em altas frequências (entre 1:100 a 1:1.000) e outros poucos
antígenos seriam reconhecidos menos frequentemente (freqüências acima de 1:10.000).
Por outro lado, entre os linfócitos B1a esta distribuição bi-modal parece estar
acontecendo no nosso estudo, mas a distribuição das frequências se invertem
completamente, com a grande maioria dos antígenos sendo reconhecidos com
relativamente baixas frequências em torno de 1:100 a 1:2.000, enquanto que alguns
poucos antígenos estariam sendo reconhecidos com frequências acima de 1:5.000. Isto
pode ser um reflexo da multireatividade característica dos linfócitos B1a, que são
semelhantes ao repertório fetal, que também apresenta extensa multireatividade (REF).
A análise comparativa da média dos perfis densitométricos das diferentes
populações de linfócitos B dentro de cada grupo de animal mostrou uma diferença
consistente entre os perfis, sugerindo que cada compartimento de linfócito B possui o
seu repertório de especificidade característico. A análise multivariada foi capaz de
agrupar os sobrenadantes dos linfócitos B1a pertencentes a cada grupo de camundongos
dentro de uma região particular do gráfico, sugerindo que o repertório de
especificidades varia de forma conservada. Devido à grande variância apresentada pelos
sobrenadantes de culturas de células B1b e B2 dentro de um mesmo grupo, a análise
multivariada não foi capaz de agrupar de forma clara os sobrenadantes de acordo com o
grupo do camundongo, mesmo assim, observando as imagens de imunoblot nós
podemos observar determinadas bandas de reatividades que estão nitidamente
151
associadas a determinados compartimentos, como uma forte banda de reatividade de
aproximadamente 50kD presente em praticamente todos sobrenadantes de linfócitos
B1b, independente do grupo do camundongo (Figura 19B).
Diante dessas características comuns apresentadas por cada população nos
diferentes camundongos, como distribuição característica da frequência clonal e
presença ou ausência de determinada reatividade, parece existir uma forte conservação
no repertório de especificidades dentro de cada subpopulação, independente do grupo
de camundongo, sugerindo um processo robusto na compartimentalização do repertório
disponível. Essa compartimentalização parece ser consequência tanto da origem dos
progenitores desses linfócitos (Förster & Rajewsky, 1987), quanto da sinalização pelo
BCR, que determinaria o “destino” dessas células, embora esses eventos ainda não
estejam completamente esclarecidos (Martin & Kearney, 2000).
Em paralelo à obtenção das imunoglobulinas e análise do repertório disponível
de especificidades nós avaliamos a partir do RNA mensageiro as sequências de CDR-
H3 nesses transcritos, procurando comparar as principais características do repertório de
CDR-H3 (uso de segmentos gênicos, composição de aminoácidos, hidrofobicidade do
“loop” e comprimento do CDR-H3) entre as diferentes subpopulações de linfócitos B de
cada grupo de camundongo e cada subpopulação de linfócitos B entre os diferentes
grupos de camundongos.
Os resultados prévios obtidos pelo grupo do Schroeder demonstraram que os
animais !D-iD, utilizam os genes D transgênicos na maior parte dos transcritos
analisados, desde os precursores até os linfócitos B maduros na medula óssea. Segundo
os autores a seleção somática teve um papel muito modesto, apenas restringindo o
repertório dentro das características impostas pelo gene iD (Ippolito et al, 2006). De
forma semelhante os animais !D-DFL criaram o seu próprio repertório, mas com
152
características muito semelhantes ao repertório WT, principalmente, à fração do
repertório WT que utiliza o segmento gênico DFL16.1 (Ivanov et al, 2005; Schelonka et
al, 2005).
Analisando o uso dos genes V
H
nas populações de linfócitos B da cavidade
peritoneal dos animais transgênicos como um todo, parece que o padrão de distribuição
é semelhante ao apresentado pelos animais WT, com os genes das famílias J558 e Q52
sendo os mais abundantes em ambos os casos, seguidos pelos genes 7183,
acompanhando a complexidade dos genes existentes em cada família.
No fígado fetal de camundongos WT, a grande maioria dos progenitores,
utilizam membros das famílias 7183 e Q52 (Yancopoulos et al, 1984; Perlmutter et al,
1985), que são genes V
H
mais próximos dos genes D (Freitas, Lembezat & Coutinho,
1989; Schroeder, 2006). Por outro lado, os segmentos gênicos da família J558
contribuem pouco para o repertório fetal mas representam mais da metade em
frequência dos rearranjos de células B esplênicas maduras (Yancopoulos et al, 1988;
Malynn et al, 1990). Nos experimentos que realizamos, o uso dos genes Q52, estava
claramente aumentado no repertório B1a dos camundongos WT, enquanto que os genes
J558 estavam mais representados entre os linfócitos B convencionais. Esses dados estão
em acordo com Andrade et al. (1989) e são coerentes com a origem fetal das células
B1a (Montecino-Rodriguez et al, 2006). Curiosamente, entre os animais !D-iD houve
uma inversão na distribuição dos genes J558 em relação aos animais WT, com os
linfócitos B1a utilizando mais frequentemente esses genes do que os linfócitos B2. Por
outro lado, os linfócitos B2 utilizaram com mais frequência os genes 7183, que é o gene
V
H
mais próximo dos genes D. A perda dessa característica marcante do repertório fetal
nos linfócitos B1a dos !D-iD, isto é, o aumento do uso dos genes J558 em relação ao
uso dos genes Q52, pode ser o reflexo da alteração forçada no repertório de CDR-H3
153
transgênico. Ou seja, o uso do gene iD determina modificações estruturais mais amplas
no repertório de CDR-H3 levando a alteração do uso de outros segmentos gênicos. Nos
camundongos controles !D-DFL a distribuição dos genes J558 e dos genes Q52 nas
células B1a e B2 é bem semelhante quando comparadas aos camundongos WT. Isso
sugere que o uso forçado de um gene D usual (DFL16.1), ou seja, de uso frequente no
repertório WT resultou em modificações estruturais menos pronunciadas com menor
consequências na frequencia de uso de genes V
H
.
O uso de elementos da família V
H
11, é classicamente associado a clonotipos B1
que produzem anticorpos naturais com especificidade para fosfatidilcolina (PtC), um
fosfolipídio de membrana que é ubiquamente encontrado tanto em células de mamíferos
quanto em bactérias (Mercolino et al, 1989; Seidl et al, 1997). Em nossos experimentos,
os genes V
H
11 foram observados nas células B1 e não nos linfócitos B2, independente
do grupo de camundongos analisados, sugerindo que o uso forçado de um único gene D
não afetou a frequência dos clonotipos B1 que usam os genes V
H
11, mesmo sendo esse
gene D, um gene não existente na natureza, como é o caso dos camundongos !D-iD.
Em contrapartida, o uso dos genes pertencentes à família T15, família VH7
(S107), foi somente observado nas células B1 (B1a e B1b) dos animais WT. Clonotipos
utilizando genes pertencentes a esta família, em especial o clonotipo T15 que utiliza o
VS107.1 em rearranjos canônicos, estão envolvidos na reatividade à fosforilcolina (PC)
após imunização ou na infecção por S pneumoniae (Briles et al, 1981). A presença do
idiotipo T15 parece ser dependente do desenvolvimento dos linfócitos B no período
fetal em que existe uma janela de diversidade limitada, caracterizada por
especificidades codificadas por rearranjos “germline” (Benedict & Kearney, 1999).
Apesar do número relativamente pequeno de sequências analisadas no nosso estudo não
permitir conclusões definitivas, a ausência de transcritos utilizando genes da família
154
VS107 nos sugere a falta, ou menor frequência do clonotipo T15 nesses animais
transgênicos. A ausência desse clonotipo nos camundongos !D-iD pode ser melhor
compreendida devido ao uso forçado de um gene D não existente nesses animais, mas
devido ao uso do gene DFL16.1 no clonotipo T15 nos animais WT (Benedict &
Kearney, 1999), foi surpreendente a ausência de rearranjos usando genes VS107 nos
camundongos !D-DFL. Esses dados novamente nos sugere que modificações no uso
dos genes D determina modificações estruturais além daquelas diretamente relacionadas
à falta de 12 dos 13 segmentos D no CDR-H3, levando a alteração do uso dos
segmentos gênicos V
H
.
O uso preferencial do elemento J
H
1 é classicamente relacionado com o
repertório neonatal, dessa forma, é natural a maior frequência de utilização do gene J
H
1
entre os linfócitos B1a de camundongos WT (Gu, Forster & Rajewsky, 1990). Por outro
lado, quanto à utilização dos genes J
H
entre os camundongos transgênicos, houve uma
clara diminuição no uso dos elementos J
H
3 e J
H
4 em comparação ao WT, essa mudança
no uso dos genes J
H
está de acordo com o que foi descrito nas populações de linfócitos
B na medula óssea desses animais (Schelonka et al, 2005; Ippolito et al, 2006) e não
está relacionada com o uso de um D não usual como o iD no !D-iD, ou o uso restrito do
DFL16.1 no !D-DFL. O menor uso dos genes J
H
3 e J
H
4 foi previamente demonstrado
em camundongos que não possuem o gene DQ52, e está relacionada à perda de regiões
de acessibilidade dos genes J
H
que seriam eliminadas na deleção do gene DQ52, que
impedem a célula prosseguir à rearranjos secundários dos genes J
H
(Nitschke et al,
2001).
Nos camundongos BALB/c é possível a utilização de 13 diferentes segmentos
gênicos D, e como discutido anteriormente o segmento gênico D pode ser traduzidos em
6 quadros de leituras, os gerados por deleção RF1, RF2 e RF3 e os gerados por inversão
155
iRF1, iRF2, e iRF3. O quadro de leitura 1 é extremamente favorecido entre os
rearranjos funcionais (Ichihara et al, 1989; Gu et al, 1990). Pelo menos três fatores
estão envolvidos nessa preferência por RF1: os rearranjos por deleção predominam
sobre os rearranjos por inversão (Schroeder, 2006), os genes DFL e DSP possuem um
ou dois códons de terminação “in-frame” com o RF3 e as junções D-J
H
utilizando o RF2
com esses segmentos DFL e DSP possuem um códon de iniciação de tradução ATG
“in-frame”, que permitem a potencial formação da proteína truncada D!, que pode
induzir exclusão alélica impedindo o posterior rearranjo V-DJ
H
(Reth & Alt, 1984; Gu,
Kitamura & Rajewsky, 1991). Rearranjos utilizando RF1 são caracterizados por
codificar aminoácidos neutros a levemente hidrofílicos no CDR-H3 e rearranjos
utilizando o RF2 ou RF3 são caracterizados por aminoácidos hidrofóbicos, enquanto
que rearranjos usando RF1 invertido gerariam aminoácidos carregados (Ippolito et al,
2006). Devido a essa limitação no uso de quadros de leitura, alguns autores consideram
os genes D como “delimitadores” da diversidade e não como genes D de “diversidade”
(Ippolito et al, 2006; Cohn, 2008).!
A maior preferência pelo RF1 foi observada em todas as subpopulações
celulares independente do grupo de camundongos testado. Entre os animais WT, nós
observamos uma forte preferência pelo RF1 principalmente entre os linfócitos B1
(90%), enquanto que os linfócitos B convencionais, apesar de usarem mais
frequentemente o RF1, 25% dos transcritos utilizaram o RF2. Curiosamente, nós
encontramos um transcrito de linfócitos B2 que utilizou o quadro de leitura 2 invertido
(iRF2) do segmento gênico DSP2.8, mas nenhuma inversão foi observada entre as
populações de linfócitos B1 dos camundongos WT.
A construção dos animais "D-DFL e "D-iD não permite a utilização de genes
que não sejam o segmento DFL16.1 no animal "D-DFL e o DSP2.2 invertido no "D-
156
iD, ficando então a “diversidade” gerada através da ação das exonucleases para diminuir
a contribuição do gene D transgênico no CDR-H3, da inserção de nucleotídeos N e do
uso de quadro de leituras alternativos.
Entre os camundongos !D-DFL, em apenas 10% dos transcritos não foi possível
identificar o segmento D, nossos dados de células peritoneais estão de acordo com as
células maduras da medula óssea desses animais, onde o segmento DFL16.1 foi
identificado em 95% dos transcritos (Schelonka et al, 2005). Da mesma forma que para
os animais WT em torno de 80% dos transcritos de CDR-H3 utilizaram o RF1 nos
camundongos !D-DFL. Esses dados sugerem que pouca pressão seletiva moldou o
repertório desses animais durante a passagem dessas células para a periferia, o que seria
o esperado, segundo a interpretação da existência de segmentos D, como
“delimitadores” da diversidade, uma vez que, a diversidade gerada nesses animais
limitados ao uso do gene DFL16.1 na medula óssea, já é pré-estabelecida (ou pré-
“delimitada”) dentro dos limites de normalidade para o qual o repertório WT é
geralmente moldado (Schelonka et al, 2007).
Por outro lado, nós observamos nos linfócitos B da cavidade peritoneal de
camundongos !D-iD uma menor frequência de transcritos utilizando o segmento D
transgênico quando comparado com o uso do gene iD nas células maduras da medula
óssea (Ippolito et al, 2006). Levando-se em consideração que essa construção do
DSP2.2 invertido no RF1 gera aminoácidos carregados no CDR-H3 das células
transgênicas e que essas células são altamente sujeitas a deleção, parece que a seleção
somática opera nos clones alternativos que não utilizaram o iD transgênico resgatando
essas células para compor o repertório na periferia. A maior evidência disso foi a
surpreendente frequência de clones gerados por inversão encontrada entre as populações
B1a, com 13%, B1b com 12% e B2 com 6% de inversão do segmento iD. Esses clones
157
iD invertidos codificam aminoácidos que seriam gerados por clones que utilizam o
segmento gênico DSP2.2 nos WT, sugerindo uma tendência de recapitulação do
repertório WT. Nesse sentido, em outros experimentos nós demonstramos que
camundongos !D-iD mais velhos, com 17 semanas de idade, apresentaram 45% de
inversão do segmento gênico iD entre os linfócitos B1a (dados não mostrados). Esses
dados sugerem que essas células seriam de alguma forma favorecidas no “pool”
periférico de células B1a auto-renováveis e de vida longa. Ainda em favor da nossa
hipótese está a significativa diminuição do uso do RF1 na população de linfócitos B1a
dos camundongos !D-iD quando comparados aos controles B1a !D-DFL e WT, com
apenas 55% dos transcritos utilizando esse quadro de leitura, diminuindo a contribuição
dos aminoácidos carregados para o repertório final.
Como resultado do uso preferencial do RF1 nos camundongos WT e !D-DFL,
houve um enriquecimento do “loop” do CDR-H3 para aminoácidos neutros, como
tirosina e glicina. Esses dados estão de acordo com os transcritos de CDR-H3 de células
maduras da medula nesses animais (Ivanov et al, 2005; Schelonka et al, 2005). Como
esperado, os camundongos !D-DFL recapitulam essencialmente a fração do repertório
WT formado pelos clones que utilizam o segmento gênico DFL16.1. Com essa
diversidade “limitada” esses animais são capazes de reconstituir todos os
compartimentos de linfócitos B iguais em números absolutos aos animais WT e
conseguem montar resposta imune humoral em níveis pelo menos em parte
comparáveis aos animais WT (Schelonka et al, 2005).
Um terço do CDR-H3 dos linfócitos maduros da medula óssea dos
camundongos !D-iD é composto por arginina, asparagina e histidina, enquanto que o
uso tirosina e glicina é diminuído pela metade (Ippolito et al, 2006). Comparados com
os dados da população madura da medula óssea, o enriquecimento para arginina,
158
asparagina e histidina ainda se manteve nas populações da cavidade peritoneal, na
mesma extensão para os linfócitos B1b e B2, e em uma menor extensão para os
linfócitos B1a. Os linfócitos B1a ainda apresentaram um considerável aumento na
relação tirosina/arginina, com 1.7, do que os linfócitos B1b e B2 (1 e 0.9,
respectivamente).
O uso do quadro de leitura 2 (RF2) na maioria dos genes D de camundongos
WT gera aminoácidos hidrofóbicos no CDR-H3, e isso também é verdade para
segmento iD transgênico (Figura 3C). Gu e colaboradores demonstraram em animais
normais que 30% dos precursores fetais dos linfócitos B1a utilizam o RF2, e que
durante a ontogenia desses linfócitos a pressão dos eventos que moldam o repertório,
resultam na redução do uso do RF2 para menos de 10% na periferia, com o uso
preferencial do RF1 (Gu, Forster & Rajewsky, 1990). Essa redução não foi observada
nos camundongos !D-iD, que apresentaram o RF2 em 30% dos transcritos de linfócitos
B1a na periferia, gerando de forma surpreendente uma “nova” população, com
características hidrofóbicas, completamente distintas do CDR-H3 imposto pelo gene
DSP2.2 invertido. Devido ao RF1 dos animais transgênicos !D-iD ser enriquecido para
aminoácidos carregados, que sabidamente geram anticorpos potencialmente autoimunes
com reatividade para DNA (Krishnan & Marion, 1993; Krishnan, Jou & Marion, 1996),
nos sugerimos que esses clones RF1 seriam desfavorecidos em relação aos clones que
utilizam o RF2, durante os eventos que moldam o repertório no desenvolvimento fetal.
Desta forma, podemos especular que a redução do uso do RF2 não foi observada nos
camundongos !D-iD, pois os clones que utilizam o RF2, que representariam 30% nos
precursores fetais, seriam selecionados para a periferia devido a ausência de competição
com os clones RF1, resultando em uma frequência idêntica do uso do RF2 entre os
linfócitos B1a maduros na periferia e os precursores fetais.
159
Esses dados sugerem que as populações B1a estão muito mais sujeitas às
pressões seletivas do que as outras subpopulações de linfócitos B, e que a
impossibilidade da geração de aminoácidos neutros no CDR-H3 nos camundongos !D-
iD foi de certa forma, compensada pela geração de uma população utilizando CDR-H3
com características hidrofóbicas. Porém, essa mudança na característica do repertório
desses animais não foi capaz de evitar uma diminuição dos números absolutos de
células B1a desses animais e a redução da produção de anticorpos em resposta à
estímulos T-independentes e T-dependentes em relação aos controles (Ippolito et al,
2006; Nguyen et al, 2007).
A aquisição de sequências N no curso da ontogenia dos linfócitos B1a é um
processo lento e gradual e devido a essas células adultas serem auto-renováveis e de
vida longa, a inserção de nucleotídeos N pode ser correlacionada com o período em que
as células foram geradas (Gu, Forster & Rjewsky, 1990). Resumidamente, durante os
estágios iniciais no período fetal, não há inserção de nucleotídeos N, a partir do período
perinatal ou neonatal já começam a aparecer transcritos com inserção desses
nucleotídeos, principalmente nas junções V
H
-D, enquanto que somente os linfócitos
gerados semanas após o nascimento apresentariam inserção de nucleotídeos N em
ambas as junções V
H
-D e D-J
H
. Dessa forma, os linfócitos B1a gerados já na fase adulta
apresentariam frequências de inserção de nucleotídeos N semelhante aos linfócitos B
convencionais. Assim, a inserção de nucleotídeos N é também observada durante a
ontogenia do compartimento B1a, mas esse processo é mais lento do que para o
compartimento B2 (Gu, Forster & Rjewsky, 1990) e esses dados estão em acordo com a
persistência do precursor fetal de linfócitos B1 na medula óssea adulta (Esplin et al,
2009).
160
Nós realizamos uma análise comparativa da inserção de nucleotídeos N em
ambas as junções nas diferentes subpopulações celulares (Figura 29B). Nós observamos
que a distribuição das freqüências é bem semelhante entre cada subpopulação entre os
diferentes grupos de camundongos, indicando que de uma forma geral, as características
essenciais herdadas por esses clones relacionadas ao momento em que são criados
durante a ontogenia são mantidas. Por outro lado, foram observadas diferenças
principalmente entre os linfócitos B1a e B2. Em relação aos linfócitos B2, nos animais
transgênicos, !D-DFL e !D-iD, houve uma maior fração dessas células em que não
havia inserção de nucleotídeos N em ambas as junções, quando comparadas à mesma
população dos camundongos WT. Os linfócitos B1a dos camundongos !D-iD
apresentaram a maior frequência de células que não utilizaram inserções de
nucleotídeos N em ambas as junções (53%), indicando que uma fração maior dessas
células foram geradas cedo na ontogenia do que a mesma fração dos animais !D-DFL
(31%). Esses dados estão em acordo com o maior uso do RF2 na população B1a dos
camundongos !D-iD e favorecem a especulação de que essas células estão presentes na
periferia como um resultado de mecanismos seletivos que operaram na período do
desenvolvimento fetal dessas células.
Nossos resultados indicam que as sequências codificadas pelo RF1, de uma
forma geral, determinam o uso dos aminoácidos no CDR-H3 dos animais !D-iD,
sugerindo um papel limitado da seleção somática em recriar o repertório genético WT
disponível nos linfócitos B da cavidade peritoneal. Por outro lado, nós também
observamos que os mecanismos de seleção somática parecem ter operado em uma
fração das células dos camundongos !D-iD, de forma a favorecer o desenvolvimento,
maturação e estabelecimento na periferia de determinados clones que foram gerados,
por mecanismos de rearranjos alternativos, resultando em uma população com
161
características de CDR-H3 não comumente utilizadas nos animais WT ou até mesmo
resultando em clones capazes de recapitular pelo menos alguns clonotipos WT. Apesar
dessa limitação na reconstrução do repertório genético WT, o repertório de
especificidades de IgM natural séricas dos camundongos !D-iD foi substancialmente
semelhante ao repertório dos animais controles. Em contrapartida, a ausência da
reatividade com a HSC70 indica que em uma certa fração do repertório há a exigência
absoluta de clones formados por células com determinados rearranjos “germline” que
são de certa forma comprometidos pela mutação !D-iD e também !D-DFL.
Como discutido anteriormente, o repertório atual de plasmócitos secretantes de
IgM naturais é formado cedo na ontogenia e, principalmente, é formado pelo “pool” de
células que primeiro se estabeleceram na periferia. Dessa forma, a despeito da
quantidade de células que emergem dos órgãos linfóides primários (fetal ou adulto), isto
é, mesmo números pequenos, há um preenchimento preferencial do “pool” de células
secretantes de IgM, levando à manutenção dos níveis normais de IgM séricas (Agenès
& Freitas, 1999). Uma vez estabelecida, essa população de linfócitos B ativados são
resistentes à substituição e persistem mesmo na presença de células recém emigradas da
medula óssea. Nossos dados mostram que a reatividade com HSC70, ausente no perfil
de reatividade de IgM naturais séricas dos camundongos !D-iD, estava presente no
repertório disponível de linfócitos B1a da cavidade peritoneal desses animais. Desta
forma, à luz das interpretações de Agenès & Freitas (1999), nós propomos que a
ausência da reatividade com a proteína HSC70 no soro dos animais !D-iD se deve à
geração tardia dos clones B1a capazes de se ligar ao antígeno no imunoblot de extrato
de cérebro. Como a geração desses clones nos animais !D-iD não seria um rearranjo
“canônico” eles seriam gerados mais tarde na ontogenia, após o início da expressão da
enzima TdT, não sendo mais capazes de se estabelecerem no repertório atual de
162
plasmócitos secretantes de IgM, que provavelmente já está preenchido no momento em
que essas células emergem do órgão linfóide primário. Assim, esses clones se
estabeleceriam na cavidade peritoneal compondo o repertório disponível de células B1a
auto-renováveis e de vida longa.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
164
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
No trabalho aqui apresentado nós identificamos uma reatividade com uma
proteína da família do choque térmico (HSC70) presente somente no repertório de
anticorpos naturais séricos de animais que não possuem limitações genéticas do
rearranjo VDJ. Até o momento, somente um único clonotipo B1a reativo com a HSC70
foi seqüenciado (clone MN3A). No presente trabalho, nós desenvolvemos um novo
método rápido e quantitativo para a descrição do repertório de imunoglobulinas. Nós
utilizaremos essa nova metodologia para o isolamento e sequenciamento de outros
clonotipos reativos com a HSC70. Baseado na natureza do gene V
H
Ox-1, utilizado pelo
clone MN3A, e do que foi discutido com relação a este gene, acreditamos que os futuros
clonotipos que iremos sequenciar apresentarão os mesmos genes de cadeia pesada.
Outros sistemas experimentais analisaram o impacto da limitação genética na
geração de anticorpos frente à imunização com diferentes antígenos, os resultados
obtidos nesses trabalhos sustentam a hipótese de que, na ausência de um determinado
clonotipo, outros clones são recrutados para a produção de anticorpos específicos. Esta
hipótese está de acordo com o princípio fundamental da teoria da seleção clonal,
baseada na imensa diversidade de clonotipos ofertados pelo sistema imunitário. Neste
contexto, nossos experimentos apontam para uma incongruência na aplicação desse
princípio explicativo aos nossos resultados, nos quais nenhum outro clonotipo foi capaz
de substituir uma reatividade que é dominante no repertório de anticorpos naturais em
animais não manipulados.
Por outro lado, cabe ressaltar que este fenômeno observado para a HSC70 foi
exclusivo para este antígeno e que, de uma forma geral, para todas as outras
reatividades de anticorpos naturais o impacto da limitação genética foi modesto. O fato
165
do clonotipo MN3A apresentar um rearranjo “germline” e ser reativo com um
autoantígeno altamente conservado na filogenia, torna esses achados ainda mais
relevantes.
Finalmente, da mesma forma que a presença de anticorpos naturais anti-PC e
anti-PtC são utilizados como marcadores de resposta imune humoral T-independente, a
presença dos anticorpos naturais que se ligam à HSC70 poderiam ser considerados
como um dos marcadores do repertório natural e da atividade fisiológica dos linfócitos
B1a.
7. CONCLUSÕES
167
7. CONCLUSÕES
1. A análise do repertório atual mostrou que o perfil de especificidades de anticorpos
naturais séricos de camundongos com limitações genéticas do rearranjo VDJ de
imunoglobulinas é substancialmente semelhante ao perfil de camundongos normais,
sugerindo um papel fundamental da seleção somática na reconstrução de um repertório
geneticamente alterado.
2. O impacto da limitação genética somente pode ser observado em especificidades
peculiares que exigem imunoglobulinas secretadas por clonotipos utilizando rearranjos
VDJ com características que não poderiam ser criadas utilizando mecanismos alternativos.
3. A reatividade contra HSC70 está presente apenas no soro de camundongos BALB/c não
manipulados geneticamente, que possuem repertório VDJ com as características fetais e o
compartimento dos linfócitos B1a intactos:
• A violação da diversidade VDJ, com a retirada de 12 dos 13 segmentos D
impede o aparecimento de um importante anticorpo natural no soro de ambos os
camundongos transgênicos, !D-DFL e !D-iD.
• A introdução forçada de nucleotídeos N nas junções VDJ, pela expressão da
enzima TdT de forma constitutiva, impossibilita o rearranjo canônico e impede a
formação do clonotipo secretante do anticorpo natural anti-HSC70. Por outro lado,
soros de animais TdT nocautes apresentam essa reatividade natural no soro.
• A imunoglobulina natural anti-HSC70 não está presente no soro de quimeras
reconstituídas com medula óssea adulta, mas quimeras reconstituídas com células
168
de fígado fetal de camundongos WT apresentam a reatividade, sugerindo a
participação dos linfócitos B1 de origem fetal ou neonatal na produção desses
anticorpos naturais.
• Apenas culturas de linfócitos B1a secretam as imunoglobulinas que
reconhecem a HSC70 no extrato de cérebro.
4. As imunoglobulinas naturais anti-HSC70 estão presentes no soro de animais “germfree”,
sugerindo que a seleção dessa especificidade natural não é dependente do contato com a
microbiota autóctone, característica marcante da conservação do repertório de anticorpos
naturais.
5. A identificação e seqüenciamento dos genes VDJ do clonotipo anti-HSC70, foi possível
somente com o desenvolvimento de uma nova abordagem para o estudo do repertório de
imunoglobulinas, que permite obter simultaneamente, as imunoglobulinas secretadas, os
genes dessas imunoglobulinas e a estimativa da frequência clonal para cada reatividade
6. O clone anti-HSC70 utiliza o gene V
H
Ox-1, o segmento DQ52 e o elemento J
H
2 no
rearranjo da cadeia pesada, sem a adição de nucleotídeos N entre as junções V-D e D-J. O
gene VHOx-1 é predominantemente usado por linfócitos B1a. Esses dados confirmaram
todos os nossos achados anteriores utilizando soros de quimeras e de animais transgênicos e
nocautes no imunoblot.
7. O repertório disponível de especificidades das subpopulações de linfócitos B da cavidade
peritoneal apresentou substancial semelhança nas subpopulações B1 com uma maior
169
divergência no repertório B2 entre os diferentes animais. Estes dados suportam a noção de
que a limitação genética por deleções de genes D teve impacto moderado na formação do
repertório disponível.
8. Parece existir uma forte conservação no repertório dentro de cada subpopulação B1a,
B1b e B2, independente do grupo de camundongo, sugerindo um controle robusto da
compartimentalização do repertório disponível. Essa compartimentalização poderia ser
consequência tanto da origem dos progenitores desses linfócitos (fetal ou vida adulta),
quanto da sinalização pelo BCR, que determinaria o “destino” dessas células.
9. O repertório genético disponível das subpopulações de linfócitos B da cavidade
peritoneal apresentou resultados análogos ao da análise do repertório de especificidades
disponível, apresentando substancias semelhanças e algumas diferenças marcantes.
• Não houve diferenças marcantes entre os animais WT e !D-DFL quanto às
principais características do CDR-H3 (hidrofobicidade, uso de genes VH, uso de
aminoácidos), sugerindo que um único segmento DFL16.1 é suficiente para
reconstruir o repertório genético de linfócitos B disponível, provavelmente devido à
significativa contribuição que os genes DFL16.1 têm sobre o repertório WT.
• De uma forma geral, não houve um aumento do uso de nucleotídeos N,
aumento da atividade de exonucleases nos transcritos de CDR-H3 dos
camundongos !D-iD, em uma tentativa de diminuir a contribuição do DH
transgênico.
170
• Foram observadas inversões dos genes iD nas populações de linfócitos B dos
camundongos !D-iD, principalmente entre os linfócitos B1, sugerindo uma possível
recapitulação do repertório WT
• Os linfócitos B1a dos camundongos !D-iD utilizaram quadros de leituras
alternativos dos genes D transgênicos gerando uma “nova” população, com
características hidrofóbicas, completamente distinta do CDR-H3 imposto pelo gene
D invertido.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. APÊNDICES
!
"#$!
9. APÊNDICES
Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal
(B1a, B1b e B2). As células foram isoladas em citômetro de fluxo, cerca de 1x10
4
-
2x10
4
células por cada subpopulação de dois diferentes camundongos por grupo. O
RNA foi extraído e o cDNA obtido por RT-PCR utilizando primer específico para a
cadeia pesada C! e primer degenerado para a região variável da cadeia pesada (ver
material e métodos). As sequências de CDR-H3 foram desconstruídas de acordo com
a figura 3A e estão mostradas nas tabelas a seguir. Clone ID, identificação do
transcrito. Mouse, grupo do camundongo (WT, "D-DFL ou "D-iD). População,
subpopulação de linfócitos B da cavidade peritoneal (B1a, B1b e B2), o número em
frente representa o camundongo de onde as células foram isoladas. Família V
H
,
representa a família gênica V
H
de acordo com IMGT (ver material e métodos). Região
V
H
3’, representa os nucleotídeos V
H
à 3’ da cisteína conservada (TGT), o códon foi
omitido. P, sequências palindrômicas. N, nucleotídeos N inseridos, em caso em que o
gene D não foi identificado, os nucleotídeos foram colocados na coluna N1. Região
D, sequência do gene D que compõe o CDR-H3. Região J
H
5’, representa os
nucleotídeos J
H
à 5’ do triptofano conservado (TGG), o códon foi omitido. J
H
, número
do elemento J
H
utilizado. Família D, família do segmento gênico D utililzado. RF,
quadro de leitura do segmento D utilizado, somente foi definido para os segmentos
gênicos pertencentes às famílias DFL e DSP de acordo com (Ichihara et al, 1989). Os
pontos representam perdas de nucleotídeos nas sequências, quando comparadas às
sequências “germline”.
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B1a_13-01 WT B1a-1 1 gcaaga cacga ag ctaactggg actactttgactac 2 DQ52
B1a_13-02 WT B1a-1 3 gcaag. ttactacggtagtag .ctactttgactac 2 DFL 1
B1a_13-03 WT B1a-1 14 gcta.. a .ctggtttgcttac 3 NoD
B1a_13-04 WT B1a-1 2 gccagaaa ggcctcc gatggttactac g ggcgg ........gctatggactac 4 DSP 1
B1a_13-05 WT B1a-1 2 gcaag... gggg ggtaactac g ...ggtttgcttac 3 DSP 1
B1a_13-06 WT B1a-1 1 ggaag. gg attact t ....ctatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_13-07 WT B1a-1 2 gccag...
aactg
.........actac 2 DQ52
B1a_13-08 WT B1a-1 1 ggaaga ccccctg ...ggtttgcttac 3 NoD
B1a_13-10 WT B1a-1 2 gccag... .......tgcttac 3 NoD
B1a_13-11 WT B1a-1 2 gccaga.. a tttattactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_13-12 WT B1a-1 2 gccagag. ......ttgactac 2 NoD
B1a_13-13 WT B1a-1 2 gccagaa. gcct ....gttcgcttac 3 NoD
B1a_13-14 WT B1a-1 3 gcaaga tactatgattacg actactttgactac 2 DSP 1
B1a_13-15 WT B1a-1 2 gccagaga t g ...ggtttgcttac 3 NoD
B1a_13-17 WT B1a-1 1 gcaaga t gg ggtagtagc ctca attactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_13-18 WT B1a-1 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_13-21 WT B1a-1 5 gcaagaca gtatggtaact actactttgactac 2 DSP 1
B1a_13-22 WT B1a-1 1 gcaaga tacggtagtagct attactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_13-23 WT B1a-1 2 gccag... taggtacgac g t .ctggtttgcttac 3 DSP 1
B1a_14-25 WT B1a-2 2 gccagag. g .......tgactac 2 NoD
B1a_14-26 WT B1a-2 1 gcaa.. ctgggac gt actactttgactac 2 DQ52
B1a_14-27 WT B1a-2 2 gccagaga tc tttattactacggtagtag ....ctatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_14-28 WT B1a-2 2 gcca.... gcc tttattactacgg ctcct attactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_14-29 WT B1a-2 11 atgagata tggtaa ctactggtacttcgatgtc 1 DSP 1
B1a_14-30 WT B1a-2 2 gccaaac. tcc tttattactacggtagtagc gggggcc .........cttac 3 DFL 1
B1a_14-31 WT B1a-2 5 gcaaga gatcg tggttact cctggtttgcttac 3 DSP 1
B1a_14-32 WT B1a-2 11 atgagata tgatgg .ttactatgctatggactac 4 DSP 1
B1a_14-33 WT B1a-2 4 gcaagacc ggt ctatggttacg ..actggtacttcgatgtc 1 DSP 1
B1a_14-35 WT B1a-2 3 gcaaga gggac tggc g cctggtttgcttac 3 DQ52
B1a_14-36 WT B1a-2 2 gccaga.. ctgggac ...ggtttgcttac 3 DQ52
B1a_14-37 WT B1a-2 5 gcaaga ctaactggg ........gcttac 3 DQ52
B1a_14-39 WT B1a-2 11 atgagata cggta a ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_14-40 WT B1a-2 3 gcaag. gataa actacgg ...................c 4 DFL 1
B1a_14-41 WT B1a-2 4 gcaagacc ggt ctatggttacg ..actggtacttcgatgtc 1 DSP 1
B1a_14-42 WT B1a-2 2 gccagaga t gggg gatggttactac cctc ....ctatgctatggactac 4 DSP 3
B1a_14-43 WT B1a-2 1 ggaaga gtacc ag ...ggtttgcttac 3 NoD
B1a_14-44 WT B1a-2 7 gcaagagat ggta actactttgactac 2 DSP 1
B1a_14-45 WT B1a-2 14 gctaga tatggttac ........gcttac 3 DSP 1
B1a_14-46 WT B1a-2 1 gcaaga t ttactacggtagtagc .ttactatgctatggactac 4 DFL 2
B1a_14-47 WT B1a-2 5 gcaag... a tatgattac ........gactac 2 DSP 1
B1a_14-48 WT B1a-2 5 gcaagac. taactgggac .......tgcttac 3 DQ52
B1a_14-49 WT B1a-1 10 gtgaga.. cacac ctggg tca ..actggtacttcgatgtc 1 DQ52
B1a_14-50 WT B1a-1 2 gccagag. gtccc tttattactacggtagtag attactatgctatggactac 4 DFL 2
B1a_14-51 WT B1a-1 2 gccagag. cctactatggta actactttgactac 2 DSP 1
B1a_14-52 WT B1a-1 10 gtgagaga gagaagggg .ctactttgactac 2 NoD
B1a_14-54 WT B1a-1 11 atgagata tggtaa ctactggtacttcgatgtc 1 DSP 1
B1a_14-55_SemC
WT B1a-2 5 gcaaga.. ..tactttgactac 2 NoD
B1a_14-56 WT B1a-2 1 gcaag. ggaacttt actgggac ........gctatggactac 4 DQ52
B1a_14-57 WT B1a-2 2 gccagaga tc actacggtagtagc ..tactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_14-58 WT B1a-2 7 gcaagagat. cgag attactatgctatggactac 4 NoD
B1a_14-59 WT B1a-2 3 gcaggagac... ctc gatggttactac cac .....tttgcttac 3 DSP 1
B1a_14-60 WT B1a-2 10 gtgaga.. ctgggac .....ggtacttcgatgtc 1 DQ52
Apêndice I: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos WT (B1a)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B1b_15-01 WT B1b-1 2 gccagaga t tgg ag ........gcttac 3 NoD
B1b_15-02 WT B1b-1 3 gcaaga ggatc gtatggtaactac agggccc ......ttgactac 2 DSP 1
B1b_15-03 WT B1b-1 6 ac.... ggtagtagctac g ........gactac 2 DFL 2
B1b_15-04 WT B1b-1 3 gcaaga ggc aggtacgac tt at attactatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_15-05 WT B1b-1 14 gctaga tcggg gata .....tttgactac 2 DST
B1b_15-06 WT B1b-1 2 gccagag. ggagag ...actatgctatggactac 4 NoD
B1b_15-07 WT B1b-1 2 gccagaga tgattacg ..actggtacttcgatgtc 1 DSP 1
B1b_15-08 WT B1b-1 14 aatgc. ggg gg cctggtttgcttac 3 NoD
B1b_15-09 WT B1b-1 5 gcaaga tc gggc ggtaactac c .........ctcac 3 DSP 1
B1b_15-10 WT B1b-1 14 gcta.. a tctatgatggttact attactatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_15-12 WT B1b-1 10 gt...... cccg actgggac g g ...ggtttgcttac 3 DQ
B1b_15-13 WT B1b-1 2 gccagaga tcattactacggctac g ...ggtttgcttac 3 DFL 1
B1b_15-14 WT B1b-1 3 gcaagat. cgggg gatggttactac t g ctactggtacttcgatgtc 1 DSP 1
B1b_15-15 WT B1b-1 3 ...... tactacggtag .......tgctatggactac 4 DFL 1
B1b_15-16 WT B1b-1 1 gcaaga.. agggaagag aactgggac g ...ggtttgcttac 3 DQ
B1b_15-17 WT B1b-1 3 gcaag. ctactataggtac ..tactatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_15-18 WT B1b-1 2 gcca.... ca tatggtaa agg .......tgctatggactac 4 DSP 1
B1b_15-19 WT B1b-1 3 gcaaga ..tactatgctatggactac 4 NoD
B1b_15-20 WT B1b-1 10 gtgagaca cagt tataggtacgac tc gg cctggtttgcttac 3 DSP 1
B1b_15-21 WT B1b-1 1 gcaaga aggg actataggtacgac g gg .....tatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_15-23 WT B1b-1 1 acaa.. t tggga cctggtttgcttac 3 DQ
B1b_15-24 WT B1b-1 1 gcaag. cc tagtagctac ag ......atgctatggactac 4 DFL 1
B1b_15-25 WT B1b-1 14 gcta.. a .ctggtttgcttac 3 NoD
B1b_15-26 WT B1b-1 3 g..... gttacgac ........gcttac 3 DSP 1
B1b_15-27 WT B1b-1 14 aatgca tg c cattactacgg g .....tttgactac 2 DFL 1
B1b_15-28 WT B1b-1 7 gcaagagat a ctc ttcattactacg cctggtttgcttac 3 DFL 1
B1b_15-29 WT B1b-1 2 gccagaaa ctatggtaac ..tactatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_15-30 WT B1b-1 2 gccagag. gt tactatggtaa gggggg .ttactatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_16-31 WT B1b-2 3 gcaagat. gg aggtacga a ..tactttgactac 2 DSP 1
B1b_16-32 WT B1b-2 2 gccagag. gag ...ggtttgcttac 3 NoD
B1b_16-33 WT B1b-2 3 gcaaga tactatgatt actactttgactac 2 DSP 1
B1b_16-34 WT B1b-2 10 gtgaga.. c atgg g ........gctatggactac 4 DSP 1
B1b_16-36 WT B1b-2 2 gccagaaa ttactacggtagtagc ..tactatgctatggactac 4 DFL 1
B1b_16-37 WT B1b-2 5 gcaagaca t ctggc ctactatgattac cc ....ctatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_16-38 WT B1b-2 2 gccagag. ggg ...ggtttgcttac 3 NoD
B1b_16-39 WT B1b-2 1 gca... tactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_16-40 WT B1b-2 2 gccaaaca tg atga tactacggtagt ....ctttgactac 2 DFL 2
B1b_16-42 WT B1b-2 2 gccaga.. c atagg .....tatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_16-43 WT B1b-2 3 gcaag. gag gtatggtaa aggg t attactatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_16-45 WT B1b-2 4 gcaag. gct tag ctactggtacttcgatgtc 1 NoD
B1b_16-46 WT B1b-2 2 gccagag. gt tactatggtaa gggggg .ttactatgctatggactac 4 DSP 1
B1b_16-47 WT B1b-2 2 gccaaaca aggggg gacagctcgggctac c t actactttgactac 2 DST
B1b_16-48 WT B1b-2 3 gcaaga aaggaggtc ggtaactac c ............tggactac 4 DSP 1
B1b_16-49 WT B1b-2 5 gcaagac. taactgg .......tgcttac 3 DQ
B1b_16-50 WT B1b-2 7 gcaagagat at a cgggct ttt ...........tac 2 DST
B1b_16-51 WT B1b-2 14 gcta.. ctacggtag ......ttgactac 2 DFL 2
B1b_16-52 WT B1b-2 2 gccaaa.. g aactggga g cctggtttgcttac 3 DQ
B1b_16-53 WT B1b-2 1 gcaa.... ctg .....ggtacttcgatgtc 1 NoD
B1b_16-54 WT B1b-2 2 gccaga.. a ......atgctatggactac 4 NoD
B1b_16-55 WT B1b-2 10 gtgaga.. ctcgg .......tgctatggactac 4 DST
B1b_16-56 WT B1b-2 1 gcaaga gggggg .....tttgcctac 2 NoD
B1b_16-57 WT B1b-2 1 gcaaga c actggg cctggtttgcttac 3 DQ
B1b_16-58 WT B1b-2 5 gcaag... ggatc actacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_16-60 WT B1b-2 1 acaa.. actgg ........gcttac 3 DQ
Apêndice I: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos WT (B1b)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B2_17-01 WT B2-1 3 gcaaga attactacggtag accct ..tactttgactac 2 DFL 2
B2_17-02 WT B2-1 2 gccagaga t aacgg ttactacggtagtagctac ct at attactatgctatggactac 4 DFL 1
B2_17-03 WT B2-1 14 gctaga agctatagtc gtacgac g ac ....gtttgcttac 3 DSP 2
B2_17-04 WT B2-1 1 gcaaga cggg actgggac a attactatgctatggactac 4 DQ52
B2_17-05 WT B2-1 2 gcca.... tctat ccc ..tactatgctatggactac 4 DSP 1
B2_17-06 WT B2-1 5 gcaagaca ggga ggtaac ..tacgaagctatggactac 4 DSP 1
B2_17-07 WT B2-1 1 gcaaga tacaacggcctgtttcc ...ctggtacttcgatgtc 1 NoD
B2_17-09 WT B2-1 2 gccagaga t ag ctatggtaactac g gagggtatgggtt ..........tatggactac 4 DSP 1
B2_17-10 WT B2-1 14 aatg.. gat
accagg
cctggtttgcttac 3 NoD
B2_17-14 WT B2-1 14 gctaga ag ctacggtagtag .......tggctac 2 DFL 1
B2_17-15 WT B2-1 1 gca... c ctacggc ccgg ..tggtttgcttac 3 DFL 2
B2_17-17 WT B2-1 1 gcaaga g tggga a ...actatgctatggactac 4 DQ52
B2_17-18 WT B2-1 2 gccagaga t ga gttactac t ....ctatgctatggactac 4 DSP 3
B2_17-20 WT B2-1 10 gtgagag. g gggct ggg attactatgctatggactac 4 DST 1
B2_17-21 WT B2-1 14 aatgca t tgattacg ga ....gtttgcttac 3 DSP 2
B2_17-22 WT B2-1 3 g..... gg agtaactac g attactatgctatggactac 4 DSP 1
B2_17-23 WT B2-1 5 gcaagaca gg tttattactacggtagtagc ct ....ctttgactac 2 DFL 1
B2_17-25 WT B2-1 2 gccagaga t aaggg tacggtagtagct ct at attactatgctatggactac 4 DFL 2
B2_17-26 WT B2-1 5 gcaagaca tgt ga ctactatgattacgac gg ...actatgctatggactac 4 DSP 2
B2_17-27 WT B2-1 2 gccaaaca t agggg ctactatgattacg gcgagag gg cctggtttgcttac 3 DSP 1
B2_17-28 WT B2-1 1 gcaaga tc gc g cctagtatggt ct ..tactttgactac 2 DSP 3
B2_17-29 WT B2-1 1 gcaaga tatggt ggtta ctaccagtacttcgatgtc 1 DSP 2
B2_17-30 WT B2-1 1 gcaaga tc ccc ctatga gggaccacggcc ....ctttgactac 2 DSP 1
B2_18-31 WT B2-2 3 gcaaga g ctggga cctggtttgcttac 3 DQ52
B2_18-32 WT B2-2 2 gccaga.. aacc attactatgctatggactac 4 NoD
B2_18-33 WT B2-2 14 gctaga tc c tattactacggtagtagct ct t attactatgctatggactac 4 DFL 1
B2_18-34 WT B2-2 1 ggaaga gcgg atgattacgac ggagg gg cctggtttgcttac 3 DSP 1
B2_18-35 WT B2-2 14 gctaga tc gg gatta .....tttgcttac 3 DSP 3
B2_18-37 WT B2-2 5 gcaagac. cc ........gctatggactac 4 NoD
B2_18-38 WT B2-2 1 gcaaga tc accta ..................ac 4 NoD
B2_18-39 WT B2-2 10 gtgagaga aa actacggtagtag .ctgctttgcttac 3 DFL 1
B2_18-41 WT B2-2 3 gcaaga aaagg gtatggtaac ctt ..tggtttgcttac 3 DSP 1
B2_18-42 WT B2-2 6 accag. t .....tttacctac 2 NoD
B2_18-43 WT B2-2 4 gcaaga.. gggagg gattacg actactttgactac 2 DSP 1
B2_18-46 WT B2-2 10 gtgag... tc actatgattacgac g ggtt ....gtttgcttac 3 DSP 1
B2_18-48 WT B2-2 2 gccagaaa gatg atactagg ggcct .........ctatggactac 4 DSP i2
B2_18-49 WT B2-2 1 gcaaga tc aaggg agac .ctactttgactac 2 DST
B2_18-51 WT B2-2 14 aatgc. gg cagctcgggct tcc ........gactac 2 DST
B2_18-54 WT B2-2 1 gcaaga gcc acggtagtagct t attactatgctatggactac 4 DFL 2
B2_18-55 WT B2-2 14 aatgca ggg gatggttac ........gaatac 2 DSP 1
B2_18-56 WT B2-2 14 aa.... gggg gcccgagctg cca attactatgctatggactac 4 DST
B2_18-57 WT B2-2 1 gcaaga atgattacgac g ...........atggactac 4 DSP 2
B2_18-59 WT B2-2 5 gcaaga at ctatgg cct ....ctatgctatggactac 4 DSP 1
Apêndice I: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos WT (B2)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B1a_7-01 !D-DFL B1a-1 2 gtaagaga agctac taccgtagtaa actggtacttcgatgtc 1 DFL 2
B1a_7-02 !D-DFL B1a-1 5 gcaagaca tg ga tactacggtagtagctac tttgcttac 3 DFL 1
B1a_7-03 !D-DFL B1a-1 5 gcaagaga cgg tgcttac 3 NoD
B1a_7-04 !D-DFL B1a-1 3 gcaaga tactacggtagtagct ctgg ctttgactac 2 DFL 1
B1a_7-05 !D-DFL B1a-1 2 gccag... ggg ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-06 !D-DFL B1a-1 3 gcaagata ta gaggg tactacggtagtag gcc ctttgactac 2 DFL 1
B1a_7-07 !D-DFL B1a-1 10 gtgaga.. actgcg ttacta tactggtacttcgatgtc 1 DFL 3
B1a_7-09 !D-DFL B1a-1 2 gccaaa.. a tttattactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1a_7-10 !D-DFL B1a-1 2 gccagag. gg tactacggta cctc ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-11 !D-DFL B1a-1 1 gcaaga ggca attactacggtagtagct tc g cctggtttgcttac 3 DFL 1
B1a_7-12 !D-DFL B1a-1 2 gccagag. c cgatgtc 1 NoD
B1a_7-13 !D-DFL B1a-1 5 gcaagaca tg ga tactacggtagtagctac tttgcttac 3 DFL 1
B1a_7-14 !D-DFL B1a-1 3 gcaaga c actacggtagtagc gggg ggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-15 !D-DFL B1a-1 14 gcta.. ttactacggtagtagctac ctac 2 DFL 2
B1a_7-16 !D-DFL B1a-1 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-17 !D-DFL B1a-1 2 gccagaga tagctac taccgtagtaatagcc ttgactac 2 DFL 1
B1a_7-18 !D-DFL B1a-1 1 acaag. ttactacggtagtag gt actactttgactac 2 DFL 1
B1a_7-19 !D-DFL B1a-1 1 aa.... ctacg cctggtttgcttac 3 DFL 1
B1a_7-20 !D-DFL B1a-1 5 gcaagaca ttactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1a_7-21 !D-DFL B1a-1 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-22 !D-DFL B1a-1 2 gtaagaga agctac taccgtagtaa actggtacttcgatgtc 1 DFL 2
B1a_7-23 !D-DFL B1a-1 5 gcaagag. ggggg aaa tttattact tgggt ctac 2 DFL 2
B1a_8-25 !D-DFL B1a-2 3 gcaaga cc ggtgg actggtacttcgatgtc 1 DFL 2
B1a_8-26 !D-DFL B1a-2 3 gcaaga tattactacggtagtag t t actactttgactac 2 DFL 1
B1a_8-27 !D-DFL B1a-2 1 gcaaga t tacgg tttgactac 2 DFL 3
B1a_8-28 !D-DFL B1a-2 1 gca... cg ttactacggtagtagc tacgatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_8-29 !D-DFL B1a-2 2 gccagag. tt a tttattactacggtagtagc tactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_8-30 !D-DFL B1a-2 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-31 !D-DFL B1a-2 1 gcaaga tacggtagtag ctactttgactac 2 DFL 1
B1a_8-32 !D-DFL B1a-2 3 gcaaga aagaatcttggg tacggtagtag ctaccctgactac 2 DFL 1
B1a_8-33 !D-DFL B1a-2 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-35 !D-DFL B1a-2 11 atgagata tagctc gc actggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-36 !D-DFL B1a-2 2 gccagag. tt a tttattactacggtagtagc tactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_8-37 !D-DFL B1a-2 5 gcaaggga ttactacggtagtagctac cccgtc tactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_8-38 !D-DFL B1a-2 5 gcaaga gatcggagggg ttactacggtagtag ctggtacttcgatatc 1 DFL 1
B1a_8-39 !D-DFL B1a-2 2 gccagag. tgagc tactacggtagtagct cc tttgcttac 3 DFL 1
B1a_8-40 !D-DFL B1a-2 1 gcaaga a actacggtagtagc cat tactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-41 !D-DFL B1a-2 11 atgagata cggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-42 !D-DFL B1a-2 1 gcaagg gggg ggtttgcttac 3 NoD
B1a_8-44 !D-DFL B1a-2 2 gcc..... tctataggatttccg 3 NoD
B1a_8-45 !D-DFL B1a-2 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-46 !D-DFL B1a-2 2 gccagag. tt a tttattactacggtagtagc tactatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_8-48 !D-DFL B1a-2 1 gcaaga cgaagcggggg ctggtacttcgatgtc 1 NoD
B1a_7-49 !D-DFL B1a-1 5 gcaagaca tg acggtagt c ttgactac 2 DFL 1
B1a_7-50 !D-DFL B1a-1 11 atgagata c ggtag aag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-51 !D-DFL B1a-1 11 atgagata cggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-52 !D-DFL B1a-1 1 gcaaga gg ctacggtagt tactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_7-53 !D-DFL B1a-1 1 gcaag. gct ggtagtagctac t tactttgactac 2 DFL 3
B1a_7-54 !D-DFL B1a-1 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-55 !D-DFL B1a-2 2 gccagaga t ggtagtag c 3 DFL 1
B1a_8-56 !D-DFL B1a-2 11 atgaggta cggtagtag t tactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-57 !D-DFL B1a-2 1 acaaga ggggatt tttattactacggtagtagct c ctatgctatggactac 4 DFL 1
B1a_8-58 !D-DFL B1a-2 11 atgagata cggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1a_8-59 !D-DFL B1a-2 14 aa.... caagc attactacggtagtagctac g gg tactttgactac 2 DFL 1
B1a_8-60 !D-DFL B1a-2 3 gcaagata ttactacggtagtagct actac 2 DFL 1
Apêndice II: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos !D-DFL (B1a)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B1b_9-01 !D-DFL B1b-1 2 gccagaga t tccccc tattactacggtagtagctac cct .....tttgactac 2 DFL 1
B1b_9-02 !D-DFL B1b-1 1 gcaaga c ctacggtagtagcta ...actttgactac 2 DFL 2
B1b_9-03 !D-DFL B1b-1 1 gcaaga gagg ctacggtagtagctac g ........gactac 2 DFL 2
B1b_9-04 !D-DFL B1b-1 3 gcaag. ggta attactacggtagtag actactttgactac 2 DFL 2
B1b_9-06 !D-DFL B1b-1 14 gcaag. gg attactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_9-07 !D-DFL B1b-1 5 gcaagaca tg acggtag cc ......ttgactac 2 DFL 1
B1b_9-08 !D-DFL B1b-1 14 gctag. tagc .....tttgcttac 3 DFL 1
B1b_9-09 !D-DFL B1b-1 14 gctag. gggggg ....ctttgactac 2 NoD
B1b_9-10 !D-DFL B1b-1 1 gcaaga g actacggtagtagctac g ......ttgcttac 3 DFL 1
B1b_9-11 !D-DFL B1b-1 3 gcaagat. ggtgg gggcccg ..actggtacttcgatgtc 1 NoD
B1b_9-12 !D-DFL B1b-1 14 gcta.. cggtagta ........gctatggactac 4 DFL 2
B1b_9-14 !D-DFL B1b-1 1 gcaaga aggctc ..tactatgctatggactac 4 NoD
B1b_9-15 !D-DFL B1b-1 10 gtgagaca tc gg tacggtagta ccccg ....tggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_9-16 !D-DFL B1b-1 14 gccag. ggtagtagctac tcc ....ctttgactac 2 DFL 2
B1b_9-17 !D-DFL B1b-1 11 atgagata cggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_9-18 !D-DFL B1b-1 1 gcaaga ag ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_9-19 !D-DFL B1b-1 3 gcaaga t gg tactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1b_9-20 !D-DFL B1b-1 5 gcaag. c tattactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1b_9-21 !D-DFL B1b-1 1 gcaa.. attactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1b_9-22 !D-DFL B1b-1 1 gcaaga tacggtagtag .ctactttgactac 2 DFL 1
B1b_9-23 !D-DFL B1b-1 5 gcaaga t gggg actacgg ag ....ctttgactac 2 DFL 2
B1b_9-24 !D-DFL B1b-1 2 gccagaga tct gat ttactacggtagtagctac ..tactatgctatggactac 4 DFL 1
B1b_9-25 !D-DFL B1b-1 1 gcaaga tct cgg ggtagtagct cctggtttgcttac 3 DFL 1
B1b_9-26 !D-DFL B1b-1 2 gccagaga ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_9-27 !D-DFL B1b-1 3 gcaagata ttactacggtagtagct .........actac 2 DFL 1
B1b_9-28 !D-DFL B1b-1 14 gctaga tc ggg cggtagtag .ctcgtttgcttac 3 DFL 1
B1b_9-29 !D-DFL B1b-1 1 acaaga tc .......tgcttac 3 NoD
B1b_10-31 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. gc tactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_10-32 !D-DFL B1b-2 2 gccaga tc g tattactacggtagtag .ctactttgactac 2 DFL 1
B1b_10-33 !D-DFL B1b-2 14 gctaga cgagggagaatttg ggtag ......ttgactac 2 DFL 2
B1b_10-34 !D-DFL B1b-2 1 gcaaga ccctacggtagttg ctacggc cag .............. 2 DFL 1
B1b_10-35 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. g ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_10-37 !D-DFL B1b-2 1 gc.... gg ttattactacggtagtagc ga ......atgctatggactac 4 DFL 2
B1b_10-38 !D-DFL B1b-2 3 ........ tactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_10-39 !D-DFL B1b-2 1 acaaga gttaag ttattactac a ....gtttgcttac 3 DFL 3
B1b_10-40 !D-DFL B1b-2 1 gcaa.. tttattactacggtagtagctac ........gactac 2 DFL 1
B1b_10-41 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. tttattactacggtagtag .ctactttgactac 2 DFL 1
B1b_10-42 !D-DFL B1b-2 14 gc.... ccacct ttactacggtag ggg ....ctatgctatggactac 4 DFL 1
B1b_10-43 !D-DFL B1b-2 1 gcaaga tactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1b_10-44 !D-DFL B1b-2 2 gccaaa.. gggggg ggtagtagc ccc .....tttgcttac 3 DFL 1
B1b_10-45 !D-DFL B1b-2 10 gtgagaga ttactacggtagtagcta ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_10-46 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. ttc attactacggtagtag gg ...actttgactac 2 DFL 1
B1b_10-47 !D-DFL B1b-2 1 gcaa.. tttattactacggtagtagctac ........gactac 2 DFL 1
B1b_10-48 !D-DFL B1b-2 1 gcaa.. ttactacggtagtagc .......tgactac 2 DFL 2
B1b_10-49 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. g ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_10-50 !D-DFL B1b-2 14 gc.... ccacct ttactacggtag ggg ....ctatgctatggactac 4 DFL 1
B1b_10-51 !D-DFL B1b-2 1 gcaag. ggtcccg tattactacggt .tactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_10-52 !D-DFL B1b-2 2 gccaaacc gg g cggtagta cctggtttgcttac 3 DFL 1
B1b_10-53 !D-DFL B1b-2 2 gccagaga t ggggga ........gctatggactac 4 NoD
B1b_10-54 !D-DFL B1b-2 1 gcaaga tg ggtc tattactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1b_10-55 !D-DFL B1b-2 5 gcaagaca ttactacggtagtagct actactttgactac 2 DFL 1
B1b_10-56 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. cccc ttactacggtagtagc ...........tac 3 DFL 1
B1b_10-57 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. g ttactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B1b_10-58 !D-DFL B1b-2 10 gtga.... cctct tacggtagtagct gg ........gactac 2 DFL 1
B1b_10-59 !D-DFL B1b-2 2 gccagaaa tt at ggtagtagctac c ......ttgcttac 3 DFL 1
B1b_10-60 !D-DFL B1b-2 2 gccagag. gtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
Apêndice II: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos !D-DFL (B1b)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B2_11-01 !D-DFL B2-1 1 gcaaga tc ccc ctactggtacttcgatgtc 1 NoD
B2_11-03 !D-DFL B2-1 2 gccagaga ctacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_11-05 !D-DFL B2-1 1 gcaag gtc ttattactacggtagtagct gggccg actggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_11-07 !D-DFL B2-1 4 gcaagacc cgggg acggtagtagc cc ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_11-08 !D-DFL B2-1 14 gct ttc tattactacggtagtagctac gt gtttgcttac 3 DFL 1
B2_11-09 !D-DFL B2-1 14 aa cccttt gtttgcttac 3 NoD
B2_11-11 !D-DFL B2-1 2 gcaagaga tc gagac tactac cgtagtaatctc g cctggtttgcttac 3 DFL 1
B2_11-13 !D-DFL B2-1 14 aatgca tg gcgtc ctacgg c gt actactttgactac 2 DFL 1
B2_11-14 !D-DFL B2-1 2 gccagaga tc ccaaatttttccc tattactacggtagtagct cct tttgcttac 3 DFL 2
B2_11-15 !D-DFL B2-1 2 gccagaga tc gcg attactacggtagtagctac g actggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_11-17 !D-DFL B2-1 5 gcaag gg attactacggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_11-18 !D-DFL B2-1 14 gcta ttactacggtagtagctac tgactac 2 DFL 2
B2_11-19 !D-DFL B2-1 2 gccaaaca tg g tactacggtagtagcta agaaaacgtt ctatgctatggactac 4 DFL 2
B2_11-20 !D-DFL B2-1 2 gccagaga tc aa agtagct t cttctttgactac 2 DFL 1
B2_11-22 !D-DFL B2-1 10 gtgagaca gagggg tactacggta agggg ctatgctatggactac 4 DFL 2
B2_11-23 !D-DFL B2-1 10 gtgagac gagg ttactacggta at tactttgactac 2 DFL 1
B2_11-24 !D-DFL B2-1 5 gcaaga ggtagtag ctactttgactac 2 DFL 1
B2_11-25 !D-DFL B2-1 1 gcaaga a actacggtagtagc c cctggtttgcttac 3 DFL 1
B2_11-26 !D-DFL B2-1 2 gccag ctacggtagtagct cctggtttgcttac 3 DFL 1
B2_11-27 !D-DFL B2-1 1 gca ttttca attactacggtagtagcta t ctttgactac 2 DFL 2
B2_11-28 !D-DFL B2-1 5 gcaagaca t a actacggtagtagc c actggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_11-29 !D-DFL B2-1 5 gcaagaca tg acggtagtag ctactggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_11-30 !D-DFL B2-1 3 gcaag tggggc tactac ctcctggtacttcgatgtc 1 DFL 2
B2_12-31 !D-DFL B2-2 5 gcaagaca ttactacggtagtag ctactttgactac 2 DFL 1
B2_12-32 !D-DFL B2-2 2 gcaagaga ctacggtagtag aggc tactatgctatggactac 4 DFL 1
B2_12-33 !D-DFL B2-2 1 gcaaga a attactacggtagtagc cc tgactac 2 DFL 1
B2_12-34 !D-DFL B2-2 1 gcaag tgggc ttattactacggtag agaggg actactttgactac 2 DFL 2
B2_12-35 !D-DFL B2-2 1 gcaaga gg tactacggtagtagct gg ctggtacttcgatgtc 1 DFL 2
B2_12-37 !D-DFL B2-2 1 gcaaga tc cc attactacggtagtagc ct ctatgctatggactac 4 DFL 1
B2_12-38 !D-DFL B2-2 1 gcaaga gcgacaa attactacggtagtagctac g attgg gactac 2 DFL 1
B2_12-39 !D-DFL B2-2 3 gcaaga gggaggg ggg actggtacttcgatgtc 1 NoD
B2_12-40 !D-DFL B2-2 3 gcaagag ggc actacggtagtagc ccc tttgcttac 3 DFL 1
B2_12-41 !D-DFL B2-2 1 gcaaga t gggtgggacggaccg ggtacttcgatgtc 1 NoD
B2_12-42 !D-DFL B2-2 1 gcaa cta attactacggtagtagc tttgcttac 3 DFL 1
B2_12-43 !D-DFL B2-2 1 gcaaga ga tattgactac 4 NoD
B2_12-44 !D-DFL B2-2 2 gccagaaa t gg acgg gg ctatgctatggactac 4 DFL 3
B2_12-45 !D-DFL B2-2 3 gcaaga g attactacggtagtagctac gactac 2 DFL 1
B2_12-46 !D-DFL B2-2 5 gcaagaca gaccat ctacggtagtagc cc gt actactttgactac 2 DFL 1
B2_12-47 !D-DFL B2-2 14 gctaga g attac tttgcttac 3 DFL 1
B2_12-48 !D-DFL B2-2 2 gccagaga tc cctc ttactacggtagtagctac ctctt ttactatgctatggactac 4 DFL 1
B2_12-52 !D-DFL B2-2 1 gcaaga agggaggggggt tggtacttcgatgtc 1 NoD
B2_12-53 !D-DFL B2-2 14 g aa attactacggtagtagcta gagg ctac 2 DFL 2
B2_12-55 !D-DFL B2-2 14 aa ccg ctacggtagtagct ctcc ctttgactac 2 DFL 1
B2_12-56 !D-DFL B2-2 1 gcaag gag cggtagtagc ccc g cctggtttgcttac 3 DFL 1
B2_12-57 !D-DFL B2-2 5 gcaaga tc aggggg ttactacggtagtagctac g actggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_12-58 !D-DFL B2-2 5 gcaaggca tg acg attactacggtagtagctac a actggtacttcgatgtc 1 DFL 1
B2_12-59 !D-DFL B2-2 5 gcaagaca t ttgtccccc tattactacggtagtagc cc gtttgcttac 3 DFL 1
B2_12-60 !D-DFL B2-2 1 a gctac t actactttgactac 2 DFL 1
Apêndice II: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos !D-DFL (B2)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B1a-01 !D-DiD B1a-1 2 gccag... tagcttctactatgattacgata cctggtttgcttac 3 iD i1
B1a-02 !D-DiD B1a-1 1 gcaag. tagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-03 !D-DiD B1a-1 2 gccagaga g gcttctactatgattacgataaa t ....tggtacttcgatgtc 1 iD i2
B1a-04 !D-DiD B1a-1 1 gcaaga cacgaaggggc agtagaag tc g cctggtttgcttac 3 iD 2
B1a-05 !D-DiD B1a-1 5 gcaaga tc ttatcgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B1a-06 !D-DiD B1a-1 14 gctaga gg ttatcgtaatcata acc ......ttgactac 2 iD 1
B1a-07 !D-DiD B1a-1 5 gcaa.... tcatagtag agg cctggtttgcttac 3 iD 2
B1a-08 !D-DiD B1a-1 5 gcaagaca tcgtaatcatagtagaagc .....tttgactac 2 iD 1
B1a-09 !D-DiD B1a-1 14 gc.... gtgcgcgg cctggtttgcttac 3 NoD
B1a-10 !D-DiD B1a-1 1 gcaaga tatcgtaatc ...actttgactac 2 iD 1
B1a-12 !D-DiD B1a-1 2 gccagag. tc cgtaatcatagtagaagcta ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-13 !D-DiD B1a-1 3 gcaaga tc gg ......ttgcttac 3 NoD
B1a-17 !D-DiD B1a-1 2 gccagaga tagtagaag ...ctggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-18 !D-DiD B1a-1 10 gtgagac. tg gcttctactatgattacg ....tggtacttcgatgtc 1 iD i2
B1a-19 !D-DiD B1a-1 2 gccag... ttatcgtaatcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-20 !D-DiD B1a-1 1 gca... tatcgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B1a-22 !D-DiD B1a-1 2 gccagaga gagggga atcgtaatcatagtagaagctac gt cga ......ttgcttac 3 iD 2
B1a-23 !D-DiD B1a-1 2 gccagaga tc cctc tatcgtaatcatagtagaa ag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1a-24 !D-DiD B1a-1 2 gccagag. tagcttctactatgattacgataa actactttgactac 2 iD i2
B1a-26 !D-DiD B1a-1 5 gcaagaca ggg aa tttatcgtaatcatagtagaagct actactttgactac 2 iD 1
B1a-27 !D-DiD B1a-2 1 gca... tatcgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B1a-29 !D-DiD B1a-2 2 gccaga.. g tcgtaatcatagtagaagc cacttt ctactggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1a-32 !D-DiD B1a-2 2 gccagaga tc tggg cgtaatcatagtagaagct t attactatgctatggactac 4 iD 2
B1a-33 !D-DiD B1a-2 2 gccagag. ............ttgactac 2 NoD
B1a-34 !D-DiD B1a-2 2 gccagaga ccccattttttcctc tatcgtaatca aag .....ggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1a-35 !D-DiD B1a-2 10 gtgagaca gacgggggagggaa tttatcgtaatcatag aga .......tgcttac 3 iD 1
B1a-36 !D-DiD B1a-2 5 gcaagaca tcgtaatcatagtagaagctac ........gctatggactac 4 iD 1
B1a-37 !D-DiD B1a-2 3 gcaag. cttctactatgattacg ..actggtacttcgatgtc 1 iD i1
B1a-39 !D-DiD B1a-2 1 gcaaga tttatcgtaatcatagta ........gactac 2 iD 2
B1a-40 !D-DiD B1a-2 5 gcaagaca tcgtaatcatagtagaag ....ctatgctatggactac 4 iD 1
B1a-42 !D-DiD B1a-2 1 gcaa.. aga ..actggtacttcgatgtc 1 NoD
B1a-43 !D-DiD B1a-2 1 ...... atcgtaatcatagtagaagc .......tgactac 2 iD 2
B1a-44 !D-DiD B1a-2 1 gcaaga ggggggccc tttatcgtaatcatagtagaagcta agggatggtt .ctactttgactac 2 iD 2
B1a-45 !D-DiD B1a-2 5 gcaagaca ttatcgtaatcatagtagaagc c actactttgactac 2 iD 1
B1a-47 !D-DiD B1a-2 11 atgagat. t tagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-48 !D-DiD B1a-2 1 acaaga gggg atcatagtagaagctac g ggg ......atgctatggactac 4 iD 1
B1a-49 !D-DiD B1a-2 2 gccaga.. a tttatcgtaatcatagtagaagctac ..tactatgctatggactac 4 iD 1
B1a-50 !D-DiD B1a-2 2 gccagaga t ggg agcttctactatgattacgata caa cccggtttgcttac 3 iD i1
B1a-51 !D-DiD B1a-2 3 gcaa.... tcgtaatcatagtagaagcta cctggtttgcttac 3 iD 2
B1a-52 !D-DiD B1a-2 3 gcaag... tcgtaatcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-53 !D-DiD B1a-2 4 gcaaga.. gcttctactatgattacga ......ttggctac 2 iD i2
B1a-54 !D-DiD B1a-2 1 gcaaga gag cgtaatca cca
ccagg
cctggtttgcttac 3 iD 1
B1a-55 !D-DiD B1a-2 2 gccaaacc ggt cggatacgagctaa ...ggtttgcttac 3 NoD
B1a-58 !D-DiD B1a-2 11 atgagat. t tagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-59 !D-DiD B1a-2 2 gccaaaca ...ctggtacttcgatgtc 1 NoD
B1a-61 !D-DiD B1a-2 5 gcaag. tcatagta ggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-62 !D-DiD B1a-2 1 gcatg. cttctactatgattacgata .........actac 2 iD i1
B1a-63 !D-DiD B1a-2 5 ........ aatcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-64 !D-DiD B1a-2 1 gcaag. cttctactatgattacgata ..actggtacttcgatgtc 1 iD i1
B1a-65 !D-DiD B1a-2 1 gcaaga aggcaatttggg aaa tttatcgtaatcatagtagaagcta ggg ......atgctatggactac 4 iD 2
B1a-66 !D-DiD B1a-2 1 gca... tatcgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B1a-67 !D-DiD B1a-2 5 gcaagac gtaatcatagtagaag ....ctatgctatggactac 4 iD 1
B1a-68 !D-DiD B1a-2 1 gcaag. tcgtaatcatagtagaagcta ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-69 !D-DiD B1a-2 1 gcaaga aag atcgtgatcatagtagaagc cccg .....tttgactac 2 iD 2
B1a-71 !D-DiD B1a-2 11 atgagata tagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-72 !D-DiD B1a-2 10 gtgagaca gaggag cgtaatcatagtagaagctac gt tt ....tggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1a-73 !D-DiD B1a-2 1 gca... tatcgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B1a-74 !D-DiD B1a-2 14 gct... tatcgtaa .......tgactac 2 iD 1
B1a-75 !D-DiD B1a-2 3 gcaag. cttctactatgattacg ..actggtacttcgatgtc 1 iD i1
B1a-76 !D-DiD B1a-2 2 gccagaga t aaa tttatcgtaatcatagtagaag ...actatgctatggactac 4 iD 2
B1a-77 !D-DiD B1a-2 1 gca... tatcgtaatcatagtagaag ...ctggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-79 !D-DiD B1a-2 2 gccagaga tcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-80 !D-DiD B1a-2 1 gcaa.. tcgtaatcatagtagaagc .......tgactac 2 iD 2
B1a-81 !D-DiD B1a-2 10 gtg..... gccgg tcatagtagaagc ctc g cctggtttgcttac 3 iD 1
B1a-82 !D-DiD B1a-2 5 gcaagag. tcgtaatcatagtagaag cctggtttgcttac 3 iD 2
B1a-83 !D-DiD B1a-2 14 gctag. tcgtaatcatagtagaag ...ctggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-84 !D-DiD B1a-2 2 gccaga.. ggggg cgtaatcatagtagaagc ctactggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1a-85 !D-DiD B1a-2 1 gcaaga g .....ggtacttcgatgtc 1 NoD
B1a-86 !D-DiD B1a-2 10 gtgag... tcc ttatcgtaatcatagtagaagctac gt gc ...ggtttgcttac 3 iD 1
B1a-87 !D-DiD B1a-2 5 gcaagaca tcgtaatcatagtagaag ....ctttggctac 2 iD 1
B1a-88 !D-DiD B1a-2 2 gccagag. gggg cgtaatcatagtagaagcta g ctactggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1a-89 !D-DiD B1a-2 14 gc.... cc ......ttgcttac 3 NoD
B1a-91 !D-DiD B1a-2 2 gccagag. gacc tatcgtaatcatagtagaa cc ....ctatgctatggactac 4 iD 2
B1a-92 !D-DiD B1a-2 11 atgagata tagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1a-93 !D-DiD B1a-2 14 gctaga t tc .....tttgtttcc 3 NoD
B1a-94 !D-DiD B1a-2 1 gcaag. g .....tttgcttac 3 NoD
B1a-95 !D-DiD B1a-2 5 gcaag... gga ttatcgtaatcatagtagaagct actactttgactac 2 iD 1
Apêndice III: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos !D-iD (B1a)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B1b-3-01 !D-DiD B1b-1 2 gccagag. gagggg ...actttgactac 2 noD
B1b-3-03 !D-DiD B1b-1 3 gcaggagacaga t ggg g ctactggtacttcgatgtc 1 noD
B1b-3-04 !D-DiD B1b-1 5 gcaagac. gtaatcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-3-05 !D-DiD B1b-1 2 gccagag. cc cgtaatcatagtagaag .ctaccttgactac 2 iD 1
B1b-3-06 !D-DiD B1b-1 1 ggaaga gggac .cttctttgactac 2 noD
B1b-3-07 !D-DiD B1b-1 2 gccagag. ggccc atcgtaatcatagtagaagct t actactttgactac 2 iD 2
B1b-3-09 !D-DiD B1b-1 2 gccagaga tcgtaatcata .....ggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-3-10 !D-DiD B1b-1 2 gccagaga t ggccctt tttatcgtaatcatagtagaagctac g cctggtttgcttac 3 iD 1
B1b-3-11 !D-DiD B1b-1 5 gcaagaga tcgtaatcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-3-12 !D-DiD B1b-1 1 gcaag. tcgtaatcatagtagaag ....ctttgactac 2 iD 1
B1b-3-14 !D-DiD B1b-1 1 gcaaga ggggg cgtaatcatggtagaag atgc ....ctttgactac 2 iD 2
B1b-3-15 !D-DiD B1b-1 5 gcaagac. gtaatcatagtagaagct actactttgactac 2 iD 1
B1b-3-16 !D-DiD B1b-1 5 gcaag. gga .......tgcttac 3 noD
B1b-3-18 !D-DiD B1b-1 1 gcaag. gcaaac ttatcgtaatcatagtagaagc c ......ttgactac 2 iD 1
B1b-3-19 !D-DiD B1b-1 5 gcaagac. c ttatcgtaatcatagtagaagctac ct ctactggtacctcgatgtc 1 iD 1
B1b-3-20 !D-DiD B1b-1 1 gcaaga tcc cgtaatcatagtagaagctac gg ....ctttgactac 2 iD 1
B1b-3-21 !D-DiD B1b-1 10 gtgag... cccc tatcgtaatcatagtagaagctac gtac ...ggtttgcttac 3 iD 1
B1b-3-22 !D-DiD B1b-1 2 gccagaga tc gtatctcg tatcgtaa actactttgactac 2 iD 2
B1b-3-23 !D-DiD B1b-1 3 gcaaga gggg atcgtaatcatagtagaag acc ....ctttgactac 2 iD 1
B1b-3-24 !D-DiD B1b-1 1 acaaga gcttctactatgattacg ga ....gtttgcttac 3 iD i2
B1b-3-25 !D-DiD B1b-1 1 ...... atcgtaatcatagtagaagctac g ....tggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1b-3-26 !D-DiD B1b-1 2 gccaga.. tctctatcg ...........tac 2 noD
B1b-3-27 !D-DiD B1b-1 3 gcaag. gtcg catagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-3-28 !D-DiD B1b-1 5 gcaagac. g agaagc ctc ctactggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1b-3-29 !D-DiD B1b-1 1 gcaagg gggg ...ggtttgcttac 3 noD
B1b-4-31 !D-DiD B1b-2 1 gcaaga ggacagatttc ttatcgtaatcatagtagaagc ..tactatgctatggactac 4 iD 1
B1b-4-32 !D-DiD B1b-2 3 gca..... ggg ttatcgtca ........gcttac 3 iD 3
B1b-4-33 !D-DiD B1b-2 1 gcaaga gcttctact gggc ...ggtttgcttac 3 iD i2
B1b-4-34 !D-DiD B1b-2 3 gcaagaga tc cc tatcgtaatcatagtagaag ctacaggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-4-35 !D-DiD B1b-2 2 gccagag. cctggtttgcttac 3 noD
B1b-4-36 !D-DiD B1b-2 10 gtgaga.. c atcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B1b-4-37 !D-DiD B1b-2 2 gccag... ......gtacttcgatgtc 1 noD
B1b-4-39 !D-DiD B1b-2 2 gccagag. t c gtagcttctactatgattacgataa gaagcg .....ggtacttcgatgtc 1 iD i2
B1b-4-40 !D-DiD B1b-2 2 gccagag. gacc tatcgtaatcatagtagaa cc ....ctatgctatggactac 4 iD 2
B1b-4-41 !D-DiD B1b-2 2 gccaga.. ggg gcttctactatgattacgataa gagttcct .......tacttcgatgtc 1 iD i2
B1b-4-42 !D-DiD B1b-2 1 gcaaga tc gggg cgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B1b-4-43 !D-DiD B1b-2 5 gcaagaca tcgtaatcatagtagaagctac cc ....gtttgcttac 3 iD 1
B1b-4-44 !D-DiD B1b-2 1 ac.... gggggccccg ........gctatggactac 4 noD
B1b-4-46 !D-DiD B1b-2 1 gcaaga g atcgtaatcatagtagaagctac .....tttgcttac 3 iD 1
B1b-4-47 !D-DiD B1b-2 1 gcaaga c gtagcttctactatgattacgataaa .......tacttcgatgtc 1 iD i1
B1b-4-48 !D-DiD B1b-2 10 gtgaga.. cc ....ctttgactac 2 noD
B1b-4-49 !D-DiD B1b-2 1 gca... tttatcgtaatcatagtagaagctac g ....tggtacttcgatgtc 1 iD 2
B1b-4-50 !D-DiD B1b-2 14 gctag. cc atcgtaatcata .....ggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-4-51 !D-DiD B1b-2 11 atgagata tagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-4-53 !D-DiD B1b-2 6 accagg gtgatgaaagg gaagctac c ....gtttgcttac 3 iD 3
B1b-4-54 !D-DiD B1b-2 2 gccagag. tagcttctactatgattacgataa ......atgctatggactac 4 iD i2
B1b-4-55 !D-DiD B1b-2 2 gccagag. tttatcgtaatcatagtagaag tg ..actggtacttcgatgtc 1 iD 1
B1b-4-56 !D-DiD B1b-2 2 gccagaga ttatcgtaatcatagtagaagctac g cctggtttgcttac 3 iD 1
B1b-4-58 !D-DiD B1b-2 2 gccagag. gagggtttgct .................tac 4 noD
B1b-4-59 !D-DiD B1b-2 1 acaaga tc aag tcgtaatcatagtagaagcta .ctggtttgcttac 3 iD 1
B1b-4-60 !D-DiD B1b-2 3 gcaagaga tc ...actttgactac 2 noD
Apêndice III: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos !D-iD (B1b)
Clone ID Mouse População
Familia V
H
Região V
H
3'
P N1 P Região D P N2 P
Região J
H
5' J
H
Família D RF
B2-5-01 !D-DiD B2-1 5 gcaaga.. gaag atcgtaatcatagtagaagct actactttgactac 2 iD 1
B2-5-02 !D-DiD B2-1 1 gca... c gtagcttctactatgattacg g .ctactttgactac 2 iD i1
B2-5-03 !D-DiD B2-1 5 gcaaggg. g tcgtaatcatagtagaagc ct .ttactatgctatggactac 4 iD 1
B2-5-04 !D-DiD B2-1 14 aatgc. ttatcgtaatcatagtagaagctac gt gg ..actggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-5-05 !D-DiD B2-1 14 aatgca ggagggc tttatcgtaatcatagtagaagcta .ctggtttgcttac 3 iD 1
B2-5-06 !D-DiD B2-1 1 gcaaga tc cgtaatcatagtagaagctac gt actactttgactac 2 iD 2
B2-5-08 !D-DiD B2-1 3 gcaagata tcgtaatcatagtagaagctac ccc ag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-5-10 !D-DiD B2-1 1 gcaag. ta atcgtaatcatagtagaagctac ct ....gtttgcttac 3 iD 1
B2-5-11 !D-DiD B2-1 3 gcaaga.. caatcct .........ctatggactac 4 noD
B2-5-12 !D-DiD B2-1 5 gcaagaca tg atcgtaatcatagtagaagct cccc gt actactttgactac 2 iD 1
B2-5-13 !D-DiD B2-1 2 gccagaga .ctggtttgcttac 3 noD
B2-5-14 !D-DiD B2-1 14 aat... agac tttatcgtaatcatagtagaagc ..tacaatgctatggactac 4 iD 1
B2-5-15 !D-DiD B2-1 10 gtgaga.. catgga ........gctatggactac 4 noD
B2-5-17 !D-DiD B2-1 2 gccagaga tc agggatcgtctc ...actttgactac 2 noD
B2-5-18 !D-DiD B2-1 14 aatgca tg ggg tcgtaatcatagtagaagc ccccct .....tttgcttac 3 iD 1
B2-5-19 !D-DiD B2-1 5 gcaa.... tcatagtaga gg cctggtttgcttac 3 iD 2
B2-5-20 !D-DiD B2-1 2 gccag... ccttc .....ggtacttcgatgtc 1 noD
B2-5-21 !D-DiD B2-1 14 gctag. taa agtagaagctac tg .....ggtacttcgatgtc 1 iD 2
B2-5-22 !D-DiD B2-1 5 gcaagaga tcgtaatcatagtagaag ....ctatgctatggactac 4 iD 1
B2-5-23 !D-DiD B2-1 5 gcaagaca aggg tac gtagcttctactatgattacgat gtccc g ctactggtacttcgatgtc 1 iD i2
B2-5-24 !D-DiD B2-1 5 gcaa.. acccg cgtaatc g ............cgatgtc 1 iD 1
B2-5-25 !D-DiD B2-1 5 gcaagaca tcgtaatcatagtagaagctac ........gactac 2 iD 1
B2-5-26 !D-DiD B2-1 14 gctaga gg cgtaatcatagtagaag acacgacttc ......gtacttcgatgtc 1 iD 2
B2-5-27 !D-DiD B2-1 1 gcaaga t tgggg cgtaatcatagtagaagct cc g cctggtttgcttac 3 iD 1
B2-5-28 !D-DiD B2-1 3 gcaaga ggcgg cgtaatcatagtagaagc cg agt actactttgactac 2 iD 2
B2-5-29 !D-DiD B2-1 3 gcaaga gacgc cgtaatcatagtagaagctac gt c .ctactttgactac 2 iD 2
B2-5-30 !D-DiD B2-1 14 aatgca tg gaaa cgtaatcatagtagaagctac g gc ........gctatggactac 4 iD 1
B2-6-31 !D-DiD B2-2 1 gcaaga g atcgtaatcatagtagaagc c cctggtttgcttac 3 iD 1
B2-6-32 !D-DiD B2-2 14 ...... ctaattatgggccac cgtaatcatagtagaagc g cctggtttgcttac 3 iD 1
B2-6-34 !D-DiD B2-2 3 gcaaga g atcgtaatcatagtag t .....tttgcttac 3 iD 1
B2-6-35 !D-DiD B2-2 2 gccagag. t c gtagcttctactatgattacgataa gaagcg .....ggtacttcgatgtc 1 iD i2
B2-6-36 !D-DiD B2-2 10 gtgagaga cgttaccc .....ggtacttcgatgtc 1 noD
B2-6-37 !D-DiD B2-2 10 gtgaga.. caaa ......ttgactac 2 noD
B2-6-38 !D-DiD B2-2 5 gcaaga tct c atcgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B2-6-39 !D-DiD B2-2 5 gcaagaga g gaagctac gt cctggtttgcttac 3 iD 2
B2-6-40 !D-DiD B2-2 1 acaaga cgtaatcatagtagaag .ctactttgactac 2 iD 1
B2-6-41 !D-DiD B2-2 3 gc.... ggc ttatcgtaatcatagtagaagcta ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-6-43 !D-DiD B2-2 5 gcaaga tc gggg tatcgtaatcatagtagaagct ca .tactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-6-44 !D-DiD B2-2 5 gcaagaga tcgtaatcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-6-45 !D-DiD B2-2 3 gcaaga gg tcgtaatcatagtagaag ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-6-46 !D-DiD B2-2 2 gccagaca a tatcgtaatcatagtagaagc cct .....tttgcttac 3 iD 1
B2-6-47 !D-DiD B2-2 1 gcaaga tc ttatcgtaatcatagtagaag ....ctaccctatggactac 4 iD 1
B2-6-48 !D-DiD B2-2 2 gccaaac. atcgtaatcatagtagaagctac g cctggtttgcttac 3 iD 1
B2-6-50 !D-DiD B2-2 1 gcaag. cgtaa ...ggtttgcttac 3 iD 2
B2-6-51 !D-DiD B2-2 2 gccagaga gggg tatcgtaatcatagtagaagctac gtcg g ctactggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-6-52 !D-DiD B2-2 5 gcaagac. gagg cgtaatcatagtagaagctac cg ..actggtacttcgatgtc 1 iD 2
B2-6-53 !D-DiD B2-2 2 gccagag. gg cgtaatcatagtagaagc ..tacgatgctatggactac 4 iD 1
B2-6-54 !D-DiD B2-2 2 gccaaa.. ggcctttc ttatcgtaatcatagtagaagctac g ..actggtacttcgatgtc 1 iD 1
B2-6-56 !D-DiD B2-2 14 aatgc. cc atcgtaatcatagtagaagctac gt cc ...actttgactac 2 iD 1
B2-6-57 !D-DiD B2-2 1 acaaga aacgcggg ....ctatgctatggactac 4 iD
B2-6-58 !D-DiD B2-2 2 gc...... agggagtaatc gtaatcatagtagaagc c cctggtttgcttac 3 iD 1
B2-6-59 !D-DiD B2-2 2 gccagaga gg tttatcgtaatc c ....gttcgcttac 3 iD 1
B2-6-60 !D-DiD B2-2 14 gctaga ccctcc tatcgtaatcatagtagaagc ct ....ctttgactac 2 iD 1
Apêndice III: Transcritos de CDR-H3 de subpopulações de linfócitos B da cavidade peritoneal de camundongos !D-iD (B2)
10. ANEXOS
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ANEXO 1 - manuscrito 1:
TITLE: FAST AND QUANTITATIVE METHOD FOR THE DESCRIPTION
OF IMMUNOGLOBULIN REPERTOIRES.
AUTHORS: André M Vale
1
, Robert L Schelonka
2
, Yingxin Zhuang
2
, Jeremy B
Foote
2
, G, Larry Gartland
2
, Alessandra Granato
1
, Ulisses G Lopes
3
, John F
Kearney
2
, Maria Bellio
1
, Harry W Schroeder, Jr
2
. & Alberto Nobrega
1
1. Departamento de Imunologia, Instituto de Microbiologia, Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Av. Carlos Chagas Filho 373, CCS, Bloco I, CEP: 21941-902, Rio de
Janeiro-RJ, Brazil.
2. Department of Medicine, Department of Microbiology, Department of Genetics,
Department of Pediatric Dentistry, and Department of Pediatrics, University of
Alabama at Birmingham, Birmingham, AL 35294, USA.
3. Departamento de Biologia Molecular, Instituto de Biofísica, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Av. Carlos Chagas Filho 373, CCS, Bloco G, CEP:21941-902, Rio
de Janeiro-RJ, Brazil.
Correspondence should be addressed to A.N. ([email protected])!
ABSTRACT:
The quantitative simultaneous description of immunoglobulin repertoire for both gene usage
and antigen specificity is major goal in immunology. Current quantitative assays are very
laborious and depend on extensive gene cloning prior to screening for antigen specificity.
Here we describe an alternative method, based on high efficiency single B cell cultures
coupled to RT-PCR, that can be used to circumvent this limitation and enable a fast
characterization of immunoglobulin gene usage, clonal sizes and antigen specificities.
RESULTS AND DISCUSSION:
In mice and humans newly formed B cells are continuously generated from
hematopoietic precursors in the bone marrow. These cells undergo a complex process of
V(D)J rearrangement to form a surface immunoglobulin receptor. Variable region gene
segments can be randomly combined to generate a huge diversity of B lymphocytes of greater
than 10
10
B cell clones, with each B cell clonotype expressing a unique heavy chain and light
chain rearrangement. Newly formed B lymphocytes are destined to a short-live unless they
succeed in engagement of their surface immunoglobulin. This antigen selection process
appears to be at work in the absence of foreign antigenic stimuli, structuring a natural B cell
repertoire on reactivity against self-antigenic determinants. It has been shown that natural
antibodies essential for the innate immune protection against bacterial infections
1
, cross react
with self antigens. The genes responsible for the encoding of these antibody molecules have
been shown to possess characteristic gene rearrangement patterns, revealing a correlation
between antigen specificity and variable region gene usage
2
. This association has also been
proposed to exist in the development of antibodies in autoimmune diseases
3, 4
.
Studies on the association of antigen specificity with variable region gene usage in the
B cell repertoire often depend on the generation of a collection of hybridomas, which are then
screened for antigen binding with subsequent gene sequencing
3, 4
. Although this approach is
useful to isolate specific clones, it introduces an inextricable bias due to its reliance on the
generation of hybridomas. This transformation process makes it highly difficult to derive
quantitative conclusions on the clonal sizes of the original repertoire. With the advent of flow-
cytometer single cell sorting and single cell PCR technologies, alternative methods have been
developed to obtain a more faithful representation of the genetic B cell repertoire
5, 6, 7
.
Recently, this strategy has been fortified by subsequently sequencing heavy and light chain
genes from the sorted single cells and then cloning and transfecting these genes into suitable
recipient cells capable of secreting the respective immunoglobulin. This antibody can then be
screened for antigen recognition
8
. Although this approach avoids the introduction of
distortions in clonal sizes created by hybridoma technology, the main obstacle for its usage
resides in the excessive labor required for large scale single cell sequencing, cloning and
transfection of the hundreds to thousands of sequences needed to estimate antigen specific
clonal frequencies in unimmunized individuals. Thus, to date, V gene usage and antigen
specificity in the B cell repertoire of naive mice has only been established for clones that can
be detected by antigen specific screening by flow-cytometry. The classic example is the
estimation of the number of anti-phosphatidylcholine B cell clones
2, 9
.
We describe here a general approach for the fast analysis of B cell repertoire that is
based on high efficiency single cell cultures of B lymphocytes simultaneously characterized
for V gene usage and antigen specificity. This approach has enabled us to overcome the
difficulties mentioned above. The overall procedure used for the quantitative determination of
antigen specific clonal frequencies (anti-X) and V genes usage is explained in detail in the
Supplementary Methods online. It is schematically depicted in Figure1. Briefly, (i) the
desired B cell population is isolated (flow-cytometer, magnetic beads, etc.) and variable
number of B cells/well (10 000, 3000, 1000, 300, 100, 30,10, 3,1, 0.3) are cultured upon a
monolayer of stromal S17 cells (3000 cells/well, 250 µl, flat bottom 96-well plate). The cells
are then stimulated with polyclonal mitogens. The frequency of B cells responding to the
mitogenic stimuli and the frequency of anti-X reactivity are then obtained by limiting dilution
analysis (LDA). A second set of B cell cloning cultures on monolayers of S17 feeders cells
(0.66 cell/well, 200 µl, round bottom 96 well plate) are then performed. The number of wells
depend on the values of the frequencies being estimated in -i- above (e.g. 500 to 10 000
wells). (iii).on day 5 of culture 25 µl of supernatants from all culture wells are collected and
tested for the presence of total immunoglobulin. (iv) on day 6 of culture, 20 µl are collected
from the bottom of wells that scored positive for Ig secretion in step –iii- and kept frozen with
RNAse-inhibitors; these samples contain B cells and plasmocytes that have grown in these
wells. (v) the remaining 200 µl of supernatant from the same set of single cell cultures are
collected and tested for the presence of antigen specific reactivity (anti-X); wells scoring
positive for anti-X reactivity are identified. (vi) from wells that scored positive for anti-X in
step –iv-, the frozen 20 µl containing secreting B cells, previously obtained, are thawed and
their heavy and light genes amplified by one step RT-PCR. Because secreting B cells are
highly enriched for mRNA transcripts of Ig genes, single round RT-PCR was routinely
sufficient to obtain enough material for gene sequencing. Alternatively the first round can be
followed by second round semi-nested PCR. For the amplification of V genes, previously
characterized degenerate primers, both for heavy and light chains V genes, were used in RT-
PCR
7, 9
(Supplementary Methods online). The strategy described above saves the effort of
hundreds/thousands of sequencing, cloning and transfections because only the cultures scoring
positive for antigen binding are processed, together with a defined number of unrelated
controls.
The method is illustrated here with the cloning of a peritoneum B1a clonotypes from
BALB/c mice, recognizing a 190 kD antigen in syngenic mouse brain immunoblots. Many
sets of cultures containing varying numbers of B1a stimulated with mitogens cells were
prepared for the estimation of the frequency of B1a cells recognizing that antigen; the
supernatant of these cultures were then tested for reactivity with a 190 kD molecule in
immunoblots of brain extract. Polyclonal activation of B lymphocytes with mitogens can be
optimized to stimulate up to 100% of B cells. In the experiment described in figure 2, the
combination of LPS with CpG stimulates 90 -100 % of B1a cells to proliferation and IgM
secretion (fig 2A), eliminating bias in the analysis of repertoire. Fig 2B shows the Poisson’s
estimation of the frequency of reactivity with the 190 kD antigen among B1a cells, estimated
as 1/67 (1.15 %). Once the frequency was obtained, appropriate numbers of B cell cloning
cultures of B1a lymphocytes stimulated with LPS, 720 replicates, 0.66 cells/well, were done,
and a total of 188 wells scored positive for IgM secretion on day 5. The amount of IgM
present in those supernatants averaged 18 ng/ml (fig 2C) being sufficient for the screening for
reactivity with the antigen of choice (fig 2D)
10
.
Figure 3A shows the result of one-step RT-PCR for the amplification of heavy chain
genes from B cell cloning cultures (0.66 cells/well) from a number of wells that scored
positive for IgM secretion. On the gel shown in figure 3A, 7 out of 11 wells were amplified.
We have done several different experiments, and routinely the efficiency of amplification has
averaged 70 %, The sequences obtained in these experiments are shown in Supplementary
Table 1 online. This efficiency is compatible with the value published by Kantor et al 1997,
for this same promiscuous VH primer. One hundred percent efficiency should be possible to
achieve with a suitable mixtures of alternative primers. Because the cell cloning method we
employed was limiting dilution (0.66 cells/well), some positive wells may contain two
different clonotypes; this is readily detected in the sequencing of RT-PCR products and those
wells are discarded from further analysis. Alternatively, direct single cell cloning in 96-well
plates by cell sorting can be used to avoid this possibility. It is critical to note that
amplification of VH and VL genes were only possible using irradiated S17 stromal cell line as
feeders cells
11
; single cell cultures using the classical protocol with young rat thymocytes as
feeders cells (600 000/well) resulted in a high percentage of growing clones
12
, but a total
failure in the RT-PCR amplification (fig 3B). In the experiment described in figure 2, from a
total of 188 IgM secreting clones, 3 cultures scored positive for the recognition of the 190 kD
antigen; VH and VL sequencing of B cells from these positive cultures were performed and
results showed in figure 3C and 3D, showing the predicted amino acids in CDR-3.
In conclusion, the method described here allows the quantitative analysis of
immunoglobulin repertoire, identifying clonotypes, clonal sizes and their antigen specific
frequencies; this new approach should be instrumental for studies on natural antibody
repertoire, immune response, and autoimmunity in the mouse. The application of an analogous
strategy for studies of human B cell repertoires will depend on the availability of an analogous
high efficiency single B cell culture system.
REFERENCES
1. Briles, D.E. et al. J. Exp. Med. 153, 694 - 705 (1981).
2. Seidl, K.J. et al. Int . Immunol. 9, 689 –702 (1997).
3. Shlomchik, M. et al. J. Exp. Med. 171, 265-192 (1990).
4. Krishnan R.M., Jou N-T. & Marion T.N. J Immunol. 157, 2430-2439 (1996).
5. Ehlich, A. et al. Cell 72, 695-704 (1993).
6. Brezinschek, H.P., Brezinschek, R.I. & Lipsky, P.E. J. Immunol. 155, 190-202 (1995).
7. Kantor, A.B., Merrill, C.E., Herzenberg, L.A. & Hillson, J.L. J. Immunol. 158, 1175–1186
(1997).
8. Tiller T. J Immunol Methods. 329, 112-124 (2008).
9. Seidl, K.J. PNAS 96, 2262–2267 (1999).
10. Adams, E., Basten, A. & Goodnow, C.C., PNAS 87, 5687-5691 (1990).
11. Collins L.S. & Dorshkind K. J Immunol. 138, 1082-1087 (1987).
12. Andersson, J., Coutinho, A., Lernhardt, W. & Melchers, F. Cell 10, 27-34. (1977).
13. Kyte, J. & Doolittle, R.F. J. Mol. Biol. 157, 105–132 (1982).
Figure legends
Figure 1:
Title: Schematic description of the strategy adopted for the quantitative analysis of
immunoglobulin repertoire.
Legend: (i) The desired population of B lymphocytes is isolated and cultivated for 7 days in
different cell numbers on monolayers of S17 stromal cells in flat-bottom 96 well plates.
Supernantants of these cultures are tested for antigen binding and the frequency of secreting B
cells producing antibodies to antigen “X” is estimated by limiting dilution analysis. (ii) A
large number of replicates of B cell cultures, 0.66 cells/well round-bottom 96 well plates (B
cell cloning cultures) are done, that number depending on the frequency of anti-X
lymphocytes obtained previously. (iii) On day 5 of culture, 25 microliters of supernantant are
collected from each well and screened by ELISA for the presence of secreted
immunoglobulin. (iv) On day 6 of culture, 20 microliters are collected from the bottom of the
wells to obtain B cells and plasmocytes from Ig+ wells, and kept frozen (-80º C) in the
presence of RNAse inhibitors. The remaining 200 microliters of supernantants of these wells
are also collected for antigen binding assay. (v) The collected supernants are screened for
binding to antigen “X”. (vi) Frozen samples of B cells and plasmocytes from wells that scored
positive for anti-“X” are submitted to one step RT-PCR for the amplification of VH and VL
genes. frozen samples of B cells and plasmocytes from wells that scored negative for anti-“X”
are also amplified and serve as controls.
Figure 2:
Title: Determination of the frequency of B1a cells recognizing a 190 kD antigen from mouse
brain.
Legend: (A) Sorted B1a cells were cultivated in variable cell numbers on monolayers of S17
stromal cells in flat-bottom 96 well plates, and the frequencies of cells responding to different
mitogens are estimated by limiting dilution analysis. (B) The frequency of secreting B cells
producing antibodies to 190 kD antigen from mouse brain was again calculated by limiting
dilution analysis. (C) B cell cloning cultures, 0.66 cells/well round-bottom 96 well plates, 720
replicates, were done and 188 scored positive for IgM secretion; the distribution of the amount
of IgM produced in the wells, averaging 18 ng/ml, is shown. (D) The 188 supernatants from B
cell cloning cultures were tested for reactivity with 190 kD antigen in immunoblot of mouse
brain (BALB/c); the reactivities of 16 samples (a-p) are shown.; On lane (b), a supernatant
that scored positive for reactivity with the 190kD antigen is indicated with an arrow; lane
(ctr)shows the reactivity profile of a supernatant from bulk culture of 10000 B1a cells and the
reactivity with the 190 kD antigen is also indicated. The supernatant in lane (o) recognizes a
70 kD antigen. Lanes (q-r) contain secondary antibody controls.
Figure 3:
Title: One step RT-PCR amplification of immunoglobulin gene transcripts from B cell cloning
cultures.
Legend: (A) Samples containing B cells from cell cloning cultures, 0.66 cells/well, in the
presence of S17 stromal cells (3000 cells/well), that scored positive for the secretion of IgM
were submitted to one step RT-PCR for the amplification of transcripts of VH genes, using a
promiscuous VH primer (see supplementary methods). The final RT-PCR products (~ 400 bp)
were identified by electrophoresis (lanes c-m) and indicated in the figure with an arrow. In the
gel shown, transcripts from 7 out of 11 IgM+ cultures were amplified – 64 % efficiency (the
average of several experiments was close to 70 % efficiency): lane b, culture with S17 alone;
lane a, DNA ladder. (B) A parallel set of cultures were done using rat thymocytes as feeder
cells. Samples containing B cells from cell cloning cultures, 0.66 cells/well, which scored
positive for the secretion of IgM were submitted to one step RT-PCR as above. No RT-PCR
amplification product could be detected (results representative from 3 different experiments).
(C) mRNA from samples containing B cells from cloning cultures that scored positive for the
recognition of 190 kD antigen in mouse brain were submitted to one step RT-PCR for the
amplification of transcripts of immunoglobulin V genes using a promiscuous primer as
described (see supplementary methods). The sequence of the CDR3 from heavy chains and
their genes are shown together with the indication of the respective VL and JL genes for each
clonotype. Clone ID, clone identifier. V
H
family, name according to the IMGT classification.
3’V
H
– Region, the most 3' nucleotides of the V
H
(starting with Cys = TGT). P-N-P,
palindromic (P) and N region sequence. D-Region, D
H
sequence component of CDR-H3. 5’J-
Region, the most 5' nucleotides of the J
H
; underlined sequences can be from either of two
germline elements. J
H
name, number of the J
H
element. D
H
name, D
H
element used; RF, the D
H
reading frame used. Dots represent nucleotides loss. Light Chain, the V! Family and the J!
usage of the light chain paired with the respective hevy chain is indicated. (D) ID, sequence
identifier. Base, the predicted amino acid sequence of the CDR-H3 base. Loop, the predicted
amino acid sequence of the CDR-H3 loop. Hydrophobicity, the average, normalized Kyte-
Doolittle hydrophobicity
13
of the CDR-H3 loop. CDR-L3 predicted aa, the predicted amino
acid sequence of the light chain CDR-3.
FIGURE 1
FIGURE 2
FIGURE 3
C
D
Supplementary Methods
Animals and cells
Peritoneal cells were obtained from female BALB/cJ mice, from transgenic !D-DFL female
mice which have only the DFL16.1 DH gene segment (1). In all cases animals were 8 to 12
weeks of age. Thymocytes used as feeder cells were obtained from 4 weeks old Sprague–
Dawley Rats. The bone marrow-derived stromal cell line S17 was used in all experiments as
feeder cells (kindly provided by Dr. Christopher Clogh, University of Alabama at
Birmingham, USA), (2).
Flow cytometry and cell sorting
Single cell suspensions were prepared from the peritoneal cavity by washing with 9 ml of
complete RPMI 1640 medium (GIBCO) (supplemented with 10% heat-inactivated FCS, 2
mM L-glutamine, 1mM Sodium Pyruvate, 50 !M 2-ME, 100 U penicillin, and 100 "g/ml
streptomycin). Cells were washed and resuspended in an appropriate volume of RPMI for
counting and staining. The total peritoneal cavity cells from each mouse group were pooled
and incubated at 2.5 x 10
8
cells/mL in RPMI medium containing the followings monoclonal
Abs: anti-B220 (RA 3.6B2) PB (BD Pharmingen), anti-CD5 PE (53-7.3)(BD Pharmingen),
and anti-Mac-1 FITC (M1/70) (BD Pharmingen). Analysis and sorting were then performed
on a MoFlo instrument (DakoCytomation) and the cells were collected directly in sterile tubes
containing RPMI medium for further use in the cultures.
B cell culture and Limiting Dilution Assay (LDA)
Sorted B1a cells were cultured in 250"l of complete RPMI medium in 96 well flat-bottom in
the presence of 30"g/mL of LPS (Salmonella typhimurium, Sigma-Aldrich), 1.5 "g/ml of CpG
(ODN 1828, Invivogen), 1.0 "g/ml of Pam3Cys (Invivogen) and combinations of these
ligands. All cultures received 6 x 10
5
rat thymocytes or 3x10
3
S17 as growth-supporting
cells/well. The preparation of S17 as feeder cell was done according the previous described
protocol (2) with some modifications. Briefly, one day before start the LDA cultures, plates
were coated with 3 x 10
3
S17 per well and incubated overnight at 37
o
C with 5% CO
2
. The
next day, the S17 culture plates were irradiated at 3000 rads and received the sorted B1a cells
at variable numbers in 24 replicates for each cell concentration, as follow: 18; 6; 2 and 0.66 B
cell per well, to determine the frequency of IgM secreting clones by ELISA according to
Poisson’s distribution (3, 4) and 10,000; 3,000; 1,000; 300; 100; 30 B cells per well to
estimate the clonal frequencies of antigen-specific B cells using an antigen binding assay. In
the present work we have used the immunoblot protocol according to Nobrega et al (5).
Culture supernatants were harvested usually on the 9
th
day of culture unless indicated in the
text.
B cell cloning cultures
In parallel to bulk cultures described above, sorted B1a cells were diluted to 6.6 cells per mL
and cultured on S17 layer, as above, at the mean concentration of 0.66 cells per well in 96
well round-bottom plates; in the data showed here, 720 replicates per experiment were done.
At the 5
th
day of culture, 25!l from each supernatant were harvested without disturbing the
cells on the bottom, and the concentration of IgM present in the supernatant of each individual
well was measured by ELISA.
ELISA
To determine the IgM concentration on the supernatants from cultures of secreting B1a cells,
ELISA was performed using anti mouse IgM-specific reagents (Southern Biotechnology);
briefly, microplates (half-area, Costar, 96 well plate, #3690) were coated overnight at 4ºC with
2.0 !g/ml of monoclonal anti-mouse IgM allotype a, clone RS3.1, in PBS; the wells were
washed with PBS and blocked with PBS 1% gelatin (MERCK, #345808) for 2 h, at room
temperature; samples were diluted in PBS-1% gelatin/0.1% tween incubated overnight at 4ºC
and wells were then washed with PBS, and secondary antibody was diluted in PBS-1%
gelatin/0.1% tween (SIGMA), and added for 2 h at room temperature; wells were further
washed with PBS and the reaction revealed with OPD substract (SIGMAFAST P9187);
reaction was stopped with 50 !l of HCl 1N and read at 490 nm. To define the IgM
concentration, the supernatants were serially 3-fold diluted and the standard curves were
obtained using polyclonal mouse IgM (Southern Biotechnology).
One-step RT-PCR amplification of VH and VL genes
As B cells cultured with LPS divides every 18 hr, on the 6
th
day of B cell cloning cultures,
around 128 cells, derived from a unique cell, are expected to be present in each well (2).
Therefore, on day 6 of B cell cloning culture, 20!l were harvested from the bottom of each
well that scored positive for IgM in the supernantant; these samples contain B cell
plasmocytes and were submitted to one-step RT-PCR. The Ig cDNA were synthesized and
amplified in one-step, using 5!l of sample (obtained from B cell cloning cultures as described)
pipetted directly into 20!l of the QIAGEN One-Step RT-PCR Kit master mix, consisting of:
5!l of 5x RT-PCR buffer, 1!l of dNTPs (10mM), 1 !l of RT-PCR Enzyme Mix (Omniscript
and Sensiscript Reverse Transcriptases and HotStarTaq DNA Polymerase), 0.25!l of RNAsin
(40U/!l, Promega), 0.5!l of each primers (0.5 !l of stock solution that is 10!M for each
primer), RNase-free water sufficient to bring the final volume to 20!l of master mix. The
promiscuous primers for VH, V" and V# were designed according to Kantor et al (1997) and
Seidl et al (1997): MsVHE = 5’-GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3’, MsV"M = GAT
ATT GTG ATG ACC CAG TCT, MsVM1= CAG GCT GTT GTG ACT CAG GAA TCT,
respectively. The specific C! primer was designed by us: C!1 = 5’-
GACAGGGGGCTCTCG-3’. C" and C#, MsC"1 = 5’-ACA CTC ATT CCT GTT GAA GCT
CTT-3’ and MsC#M1 = 5’-GCA GGA GAC AAA CTC TTC TCC ACA-3’, were designed
according to Seidl et al (1997). Because the current approach involves B cell proliferation by
LPS, it provides higher starting amounts of RNA transcripts from plasmocytes than single cell
PCR from sorted resting B cells, and routinely a single round of RT-PCR was sufficient to
obtain DNA for sequencing. The one-step RT-PCR conditions were as follows: reverse
transcription at 50
o
C for 30 minutes followed by HotStarTaq activation at 94
o
C for 15 minutes
and the First Round PCR performed for 50 cycles at 94
o
C for 20 sec, 50
o
C for 30 sec, 72
o
C for
1 minute and a final extension at 72°C for 10 min. When needed, a second round of
amplification was done using semi-nested PCR using the same promiscuous primers and an
internal C! constant region primer C!IN = 5’- GGGAAGACATTTGGGAAGGACTGAC -
3’, C" M13-MsC"2 5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT AGA TGG TGG GAA GAT
GGA-3’, and C# M13-MsC#2TGT 5’-AAA ACG ACG GCC AGT GAG CTC CTC AGA
GGA AGG TGG AAA-3’ (Seidl et al 1997). The second round PCR was performed as
follows: activation of High Fidelity Taq (Invitrogen) at 94°C for 3 minutes and 50 cycles at
94
o
C for 20 sec, 50
o
C for 30 sec, 68
o
C for 45 sec and a final extension at 68°C for 5 minutes.
After PCR, the positive samples were identified by ethidium bromide staining in 1.5% agarose
gels. The cDNA were purified from the gel using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN),
primed with the promiscuous primers, and sequenced at the University of Alabama at
Birmingham Heflin Center Sequencing Core or at FIOCRUZ of Rio de Janeiro, Brazil.
To detect contamination, samples with S17 alone were added at the two PCR rounds as a
negative control. Since we can verify the IgM reactivity for each single clone sequenced, two
clones with the same VH/V" or VH/V# rearrangement and different IgM specificity could be
considered contamination, and both sequences must be discarded from analysis. Whereas two
samples isolated from different cell cultures with identical VH/V! or VH/V" recombination
and the same IgM specificity in two independent supernatants could be safely considered
isolated from two different cells.
Sequence analysis
Gene segments were assigned according to published germline sequences for the Ig gene
segments as listed in the ImMunoGeneTics database (6) (http://imgt.cines.fr:8104).
Quantifying clonal sizes
Cloning of identical heavy and light chain sequences in samples from different wells are
initially scored as repeats of the same clonotype and then tested for matching in antigen
recognition. When identical heavy and light chain sequences are obtained in two distinct
wells, there is the possibility to check whether it has occurred because of hazardous
contamination during PCR, or if it truly represents a second cell belonging to the same
clonotype. As control, cultures containing B cells that do not recognize the antigen in
consideration are amplified in parallel, if contamination happens, it would likely occur in
these samples as well. Because the supernatants of all Ig secreting cultures have been saved,
they can be tested for antigen reactivity to check if samples possessing identical VH/VL genes
coincide for antigen recognition; if they do not coincide, contamination would have indeed
occurred; otherwise the conclusion on the true presence of a second cell from the same
clonotype is validated.
SUPPLEMENTARY METHODS REFERENCES
1. Schelonka, R.L. J. Immunol. 175, 6624-6632. (2005).
2. Collins L.S. & Dorshkind K. J Immunol. 138, 1082-1087 (1987).
3. Andersson, J., Coutinho, A., Lernhardt, W. & Melchers, F. Cell 10, 27-34. (1977).
4. Taswell C. J. Immunol. 126, 1614-1619 (1981).
5. Nobrega A. Eur. J. Immunol. 28, 1204-1215 (1998).
6. Lefranc, M-P. Nucleic Acids Res. 31, 307–310 (2003).
Supplementary Table
Supplementary Table 1:
Title: One step RT-PCR amplification of immunoglobulin gene transcripts from B1a cell
cloning cultures from BALB/c and !D-DFL mice
Legend: Samples containing B cells from cell cloning cultures, 0.66 cells/well, in the presence
of S17 stromal cells (3000 cells/well), that scored positive for the secretion of IgM were
submitted to one step RT-PCR for the amplification of transcripts of VH genes, using a
promiscuous VH primer (see supplementary methods). The sequence of the CDR3 from heavy
chains and their genes are shown for each clonotype. Two experiments were done using B1a
cells either from BALB/c or !D-DFL, transgenic for the expression of single DFL16.1 gene
segment (BALB/c background). Clone ID, clone identifier. Exp, experiment identifier. Mouse,
WT, BALB/c; !D-DFL, single DFL16.1 transgenic mice. V
H
family, name according to the
IMGT classification. 3’V
H
– Region, the most 3' nucleotides of the V
H
(starting with Cys =
TGT). P-N-P, palindromic (P) and N region sequence. D-Region, D
H
sequence component of
CDR-H3. 5’J-Region, the most 5' nucleotides of the J
H
; J
H
, number of the J
H
element. D
H
family, D
H
family element used. Dots represent nucleotides loss. Fifty clonotypes were
successfully sequenced from a total of 72 IgM positive wells (!70% efficiency).
Clone
ID
Exp
Mouse
VH
Family
3'V-REGION
P
N1
P
D-REGION
P
N2
P
5'J-REGION
JH
D
Family
59745
1
WT
J558
gcaaga
cacga
ag
ctaactggg..
actactttgactac
2
DQ52
59746
1
WT
3660
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2
DFL
59747
1
WT
VHSM7
gcta..
a
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3
NoD
59748
1
WT
VHQ52
gccagaaa
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g
ggcgg
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4
DSP
59749
1
WT
VHQ52
gcaag...
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g
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3
DSP
59750
1
WT
J558
ggaag.
gg
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t
....ctatgctatggactac
4
DFL
59751
1
WT
VHQ52
gccaga..
ac
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2
NoD
59752
1
WT
J558
ggaaga
ccccctg
...ggtttgcttac
3
NoD
59753
1
WT
VHQ52
gccag...
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3
NoD
59754
1
WT
VHQ52
gccaga..
a
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1
DFL
59755
1
WT
VHQ52
gccagag.
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2
NoD
59756
1
WT
VHQ52
gccagaa.
gcct
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3
NoD
59757
1
WT
3660
gcaaga
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2
DSP
59758
1
WT
VHQ52
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g
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3
NoD
59759
1
WT
J558
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gg
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4
DFL
59760
1
WT
VHQ52
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1
DFL
59761
1
WT
7183
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2
DSP
59762
1
WT
J558
gcaaga
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attactatgctatggactac
4
DFL
59763
1
WT
VHQ52
gccag...
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g
t
.ctggtttgcttac
3
DSP
78-2
2
WT
VHQ52
gccaga..
.......tggttac...
......ttgactac
2
DSP
80-2
2
WT
VHX24
gc......
gatta
tctactatggtaactac
ct
.ttactatgctatggactac
4
DSP
82-1
2
WT
VHQ52
gccaga..
ac
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2
NoD
83-1
2
WT
VHQ52
gccagaa.
c
.......tgactac
2
NoD
85-1
2
WT
VHQ52
gccagaaa
tgc
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ccc
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3
DSP
86-1
2
WT
J558
gcaaga
t
.....tgggac
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3
DQ52
87-1
2
WT
VHSM7
gctaga
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2
DSP
94-1
2
WT
VHQ52
gccaaaca
tg
g
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3
NoD
95-2
2
WT
VHQ52
gccaaac.
tc
..tattactacggtagtag....
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1
DFL
59765
1
!D-DFL
3660
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2
DFL16.1
59766
1
!D-DFL
VHQ52
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1
DFL16.1
59767
1
!D-DFL
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2
DFL16.1
59768
1
!D-DFL
VH10
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.tactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
59769
1
!D-DFL
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ggc
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1
DFL16.1
59770
1
!D-DFL
VHX24
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2
DFL16.1
59771
1
!D-DFL
J558
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cgggggca
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2
DFL16.1
59772
1
!D-DFL
J558
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ta
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ctactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
59773
1
!D-DFL
J558
tgtgcaag.
.......ctacggtagtag....
ctactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
59774
1
!D-DFL
J558
tgtgcaaga
ggggg
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tcc
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3
DFL16.1
59775
1
!D-DFL
J558
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gggga
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gga
......ttgactac
2
DFL16.1
59776
1
!D-DFL
VHQ52
tgtgccaga..
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a
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ctactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
59777
1
!D-DFL
VHQ52
tgtgccaga..
a
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ctactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
49-1
2
!D-DFL
VHQ52
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1
DFL16.1
58-2
2
!D-DFL
VH11
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..........cggtagtag....
ag
..actggtacttccatgtc
1
DFL16.1
60-2
2
!D-DFL
VHQ52
gccagaga
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ctactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
64-2
2
!D-DFL
3660
gcaaga
agtaccct
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g
cctggtttgcttac
3
DFL16.1
67-2
2
!D-DFL
VHQ52
gccagaga
....ttactacggtagtag....
ctactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
69-2
2
!D-DFL
VHQ52
gccaga..
....ttactacgg..........
..tactttgactac
2
DFL16.1
71-2
2
!D-DFL
VHQ52
gccagaga
tagggcttc
..tattactacg...........
atcggaa
attactatgctatggactac
4
DFL16.1
73-2
2
!D-DFL
J558
acaaga
c
....ttactacggtagta.....
cctc
cctggtttgcttac
3
DFL16.1
74-2
2
!D-DFL
7183
gcaag.
gcctc
.ttattactacggtagtag....
agagactt
.tactggtacttcgatgtc
1
DFL16.1
!
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ANEXO 2 - manuscrito 2:
TITLE : GENETIC CONTROL OF B CELL RESPONSE TO LPS:
DIFFERENTIAL EFFECTS IN DISTINCT B CELL POPULATIONS.
!
AUTHORS: VALE A M*, HAYASHI E*, GRANATO A*, BELLIO M*,
NOBREGA A*
AFFILIATIONS: (*) Department of Immunology, Institute of Microbiology,
Federal University of Rio de Janeiro, Brazil.
Corresponding author: Alberto Nobrega, email: [email protected]
!
1
2
3
4
5
6
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8
9
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64
65
T I T L E : G E N E T I C C O N T RO L O F B C E L L R ESPO NSE T O L PS:
DI F F E R E N T I A L E F F E C TS IN DIST I N C T B C E L L PO PU L A T I O NS.
A U T H O RS: V A L E A *, H A Y ASH I E*, B E L L I O M*, N O BR E G A A*.
A F F I L I A T I O NS: (*) Department of Immunology, Institute of Mic robiology,
Fede ral Unive rsity of Rio de Janeiro, B razil.
Corresponding author: Albe rto Nobrega, e mail: afnobrega@gmail. com
*Manuscript
Click here to download Manuscript: Vale et al 2009.doc Click here to view linked References
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60
61
62
63
64
65
A BS T R A C T
Lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria activates B cell to
proliferate and differentiate into plasma cells. This response is depends critically on the
expression of TLR4. However, multiple other genes contribute to the control of the B cell
response to LPS, as RP105 and MHC class II. Here we have studied the genetic control
of the B cell response to LPS at the single cell level by limiting dilution analysis,
eliminating co-stimulatory and feeder-cell dependent effects of LPS that occur in bulk
cultured B lymphocytes. We compared the response to LPS of splenic B cells versus
peritoneal cavity B cells on the BALB/c genetic background, low responder to LPS and
on the C57BL/6J background, high responder to LPS. We show that the genetic
background has a differential effect in splenic B cells, which displayed lower response
when compared to peritoneal cavity B cells. Surprisingly, on the F1 (B6xBc) background,
peritoneal B cells behaved as high responders (close to 100 % as in B6), whereas splenic
B cells displayed a response similar to the low responder BALB/c strain (33 %). The data
presented here reveals a previous unsuspected behavior in the genetic control of the B
cell response to LPS, with a differential impact in splenic versus peritoneal B cells. These
results suggest new experimental approaches to unravel the mechanisms underlying the
control of a signaling pathway that is of fundamental importance in the biology of the B
lymphocyte.
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I N T R O D U C T I O N
Lipopolysaccharide (LPS) from the cell wall of gram-negative bacteria plays a
fundamental role in the triggering of innate immunity. The action of LPS on distinct cell
types of the immune system, and on somatic cells as well, depends on the expression of
toll-like receptor four (TLR4) (Poltorak et al.1998 ). The recognition of LPS by TLR4
triggers a cascade of intracellular events that leads to the translocation of NF-KB and AP-
1 to the nucleus, resulting in the transcription of a series of genes for cytokines, e.g. TNF-
a, IL-1, IL-6, INF-beta, which play a critical role in innate immune response ( Kawai and
Akira .2007 ). Mice genetically deficient for TLR4 are highly susceptible to gram-
negative bacterial infections and simultaneously resistant to LPS spesis, confirming the
fundamental role of this molecule in the response to LPS (Hoshino et al. 1999, Kalis et al.
2003 ). The triggering of TLR4 by LPS depends on multiple factors such as LPS-binding
protein (LBP), CD14, and MD2, that act in concert to promote the efficient engagement
of TLR4 and its associated signalling machinery; it has been proposed that LBP binds to
LPS, and this complex would be recognized by CD14 in the cell membrane, which would
further associates with MD2/TLR4 complex to enable the recruitment of the signaling
molecules (da Silva Correia 2001 ).
The action of LPS is not limited to myeloid cells or mucosal epithelial cells
directly involved in innate immunity. It has been shown that the triggering of TLR4 in
antigen presenting cells has a profound impact in the activation of T cells and the
commitment of the adaptive immune reponse to TH1/TH2 phenotypes. The action of LPS
on T lymphocyte activation is believed to be mediated by TLR4-dependent up-regulation
of the co-stimulatory molecules B7-1 and B7-2 on the surface of dendritic cells, and
secretion of cytokines (e.g. IL-12) (Medzhitov 2001). Elegant experiments have shown
that, in the absence of TLR4, dendritic cells drive the proliferation of antigen specific T
lymphocytes that are unable to acquire effector functions (Spörri and Reis e Sousa 2005).
B cell responses in the mouse are also under the influence of TLR4, not only
because of their role as APCs in T cell dependent humoral immunity, but also because
LPS has direct effects in B lymphocytes, being able to promote the full activation of B
cells, leading to proliferation and differentiation to plasmocytes (Andersson 1977). The
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action of LPS in B cells seems to depend not only on TLR4, but also on another receptor
from the TLR family, RP105 (Ogata et al. 2000 ). The genetic ablation of this element
profoundly affects the B cell response to LPS, and it has been proposed that RP105
associates with MD1 and cooperate with TLR4/MD2 to generate the complete signaling
for the activation of the B lymphocyte. Interestingly, it has recently been shown that an
MHC linked locus has a strong impact in the B cell response to LPS, probably through
the control of the expression of RP105 (Rodo et al. 2006 ).
Here we have studied the genetic control of the B cell response to LPS at the
single cell level by limiting dilution analysis, eliminating co-stimulatory and feeder-cell
dependent effects of LPS that occur in bulk cultured B lymphocytes. We show that the
BALB/c genetic background, low responder to LPS, has a differential effect in splenic B
cells, that displayed lower response when compared to peritoneal cavity B cells. On the
F1 (B6xBc) background, peritoneal B cells behaved as high responders (close to 100 %
as in B6), whereas splenic B cells displayed a response similar to the low responder
BALB/c strain (33 %). Interestingly, we also observed that concomitant triggering with
TLR9 ligands cooperate with LPS to promote the activation of B lymphocytes from the
low responder strain BALB/c, resulting in the activation of 90-100 % of cells.
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M A T E R I A L A N D M E T H O DS
Ani
m
als
BALB/cJ, C57BL/6J, F1(B6xBc), CB.17 and BC8, mice were obtained from Instituto de
Microbiologia, Unversidade Federal do Rio de Janeiro, or from Department of
Microbiology, University of Alabama at Birmingham; in all cases animals aged 8 to 12
weeks. Rats were were obtained from Instituto de Microbiologia, Unversidade Federal do
Rio de Janeiro. All experiments were approved by the Ethical Comission of the Instituto
de Microbiologia.
Cells and cell sorting
Single cell suspensions were prepared from spleen, by gently disruption of the organ in
Petri dish containing complete medium; peritoneal cells were prepared from the
peritoneal cavity by washing with 9 ml of complete RPMI 1640 medium (GIBCO)
(supplemented with 10% heat-inactivated FCS, 2 mM L-glutamine, 1mM Sodium
Pyruvate, 50 µM 2-ME, 100 U penicillin, and 100 µg/ml streptomycin). Cells were
washed and resuspended in an appropriate volume of RPMI for counting and staining.
The percentage of B cells in each cell suspension was determined by flow cytometry
analysis, gating on B220+ cells . For sorting, total peritoneal cavity cells were pooled and
incubated at 2.5 x 10
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cells/mL in RPMI medium containing the followings monoclonal
Abs: anti-B220 (RA 3.6B2) PB (BD Pharmingen), anti-CD5 PE (53-7.3)(BD
Pharmingen), and anti-Mac-1 FITC (M1/70) (BD Pharmingen). Analysis and sorting
were then performed on a MoFlo instrument (DakoCytomation) and the cells were
collected directly in sterile tubes containing RPMI medium for further use in the cultures.
B cell culture and Li
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iting Dilution Assay (LDA)
B cells were cultured in 250µl of complete RPMI medium in 96 well flat-bottom in the
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presence of 30µg/mL of LPS (
S
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onella typhi
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uriu
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, Sigma-Aldrich), 1.5 µg/ml of
CpG (ODN 1828, Invivogen), 1.0 µg/ml of Pam3Cys (Invivogen) and combinations of
these ligands. All cultures received 6 x 10
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rat thymocytes or 3x10
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S17 as growth-
supporting cells/well. In some experiments thymocytes were used as feeder cells,
obtained from 4 weeks old Sprague!Dawley Rats. The bone marrow-derived stromal cell
line S17 was used in the majority of the experiments as feeder cells (Collins and
Dorshkind 1987 ). The preparation of S17 as feeder cell was done as following: briefly,
one day before start the LDA cultures, plates were coated with 3 x 10
3
S17 per well and
incubated overnight at 37
o
C with 5% CO
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. The next day, the S17 culture plates were
irradiated at 3000 rads and received the B cells at variable numbers in 48 replicates for
each cell concentration, 18; 6; 2 and 0.66 B cell per well, to determine the frequency of
"#$% &'()'*+,#% (-.,'&% /0% 12"34% 5((.)6+,#% *.% 7.+&&.,8&% 6+&*)+/9*+.,% :4,6')&&.,% ;<==>?%
Culture supernatants were harvested usually on the 9
th
day of culture .
ELI
S
A
To determine the the presence of IgM in the supernatants from cultures of secreting B
cells, ELISA was performed using anti mouse IgM-specific reagents (Southern
Biotechnology); briefly, microplates (half-area, Costar, 96 well plate, #3690) were coated
overnight at 4ºC with 2.0 µg/ml of monoclonal anti-mouse IgM, in PBS; the wells were
washed with PBS and blocked with PBS 1% gelatin (MERCK, #345808) for 2 h, at room
temperature; samples were diluted in PBS-1% gelatin/0.1% tween incubated overnight at
4ºC and wells were then washed with PBS, and secondary antibody was diluted in PBS-
1% gelatin/0.1% tween (SIGMA), and added for 2 h at room temperature; wells were
further washed with PBS and the reaction revealed with OPD substract (SIGMAFAST
P9187); reaction was stopped with 50 µl of HCl 1N and read at 490 nm.
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R ESU L T S A N D D ISC USSI O N
In vitro B cell activation by LPS depends not only on the direct triggering of B
lymphocyte itself, but also on the presence of ill-characterized factors that support B cell
growth and are provided by feeder cells . Indeed, splenic B cells do not grow in response
to LPS stimulus if cultured below a critical density of 2000 cells/ml, and young rat or
mouse thymocytes have been classicaly used as feeders cell types for low density B cell
cultures, although the B cell itself can provide the feeder effect if cultured in higher
density (Andersson 1977).. More recently, stromal cell lines (S17, OP9) have been used
as feeder cells and show superior capacity to sustain B cell growth and differentiation.
Therefore, it is not possible to ascertain if the different response to LPS displayed by
purified B cells from different mouse strains, cultured in bulk, are exclusively due to
genetic control on the B cell activation itself, or if it is also due to an impact in the feeder
cell effect. In order to eliminate this bias, we analyzed B cell response to LPS, from high
and low responder mouse strains, culturing B lymphocytes under limiting dilution
conditions, down to single B cell/well, using a common feeder cell type in all cultures.
Figure 1A shows the results obtained with splenic B cells from BALB/c and C57BL/6
mice, cultured either with young rat thymocytes or S17 stroma cells as feeders. B cell
response was measured by the presence of significant amount of IgM in the supernantants
in day 9 of culture. In both cases the frequency of B cells responding in the BALB/c
strain was approximately threefold lower than in the B6 strain; interestingly, in the
presence of S17 feeders, close to 100 % of B6 B cells responded to LPS stimulus, thus
showing the major impact of the feeder cell factor. Table 1 shows the results obtained in
three different experiments. Thereafter S17 was chosen as feeder cells for all
experiments.
As the parameter being used to evaluate the response to LPS is the presence of
secreted IgM, we thought it would be important to test if the variation in the heavy chain
genes only, could alter the outcome of the assay. For that purpose we evaluated the
frequency of splenic B cells rsponding to LPS in the congenic mouse lineages BC8 (B6
background, congenic for the IgMa haplotype), and CB.17 (BALB/c background,
congenic for the IgMb haplotype). We found that genetic variation on these loci have no
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effect in the frequency of B lymphocytes responding to LPS, which followed the
bakground of the mouse lineages (data not shown).
The response to LPS varies along B lymphocyte maturation, increasing
progressively as the B cell advances through the transitional states to the follicular and
marginal zone phenotypes (Meyer-Bahlburg et al. 2008 ). These data suggest that
different B cell populations may have distinct requirements to respond to TLR4
signaling. Figure 2A and 2B shows that BALB/c peritoneal B cells have indeed superior
clonal growth when compared to their splenic counterpart; B1a and B1b have equivalent
clonal growth, whereas B2 peritoneal cells displayed intermediary behavior between
splenic B cells and B1 cells (fig 2C). Data from three independent experiments are shown
in table 2. Interestingly, we found that concomitant addition of CpG (TLR9 ligand), but
not Pam3Cys (TLR2 ligand), to LPS, was able to markedly increase the frequency of
clonal of B1a B cells from BALB/c mice up to 90 %.(data not shown).
We then analysed the genetic control of the response to LPS comparing the clonal
growth of splenic versus peritoneal B cells, either from B6, BALB/c and (B6 x BALB/c)
F1 mice - F1(B6xBc). Interestingly, these populations suffered distinct genetic impact,
as revealed by the different clonal growth (figure 3). Peritoneal B cells from F1 exhibited
near 100 % clonal growth, equal to the high responder B6 strain, whereas F1 splenic B
cells displayed clonal growth values intermediary between B6 and BALB/c. In B6 strain,
clonal growth was close to 100 % in both B cell populations. Data from three diferent
experiments are shown in table 3. Similar results were obtained either with F1(B6xBc).
or F1(Bcx B6) (not shown).
Peritoneal B1a cells have been shown to derive from a distinct B cell precursor,
abundant in the fetal liver and neonatal bone marrow, that progressively disappears in
ontogeny ( Montecino-Rodriguez et al. 2006 ). It is possible that the different embrionic
origin of B1a lymphocytes may be related to their higher response to LPS through the
differential expression of genes, specially those involved in B cell activation. It has been
shown that the absence of molecules involved in the BCR signaling cascade affects
primarily the formation of the B1a cell population (Desiderio 1997, Sato et al 1996), and
it seems reasonably to speculate that B1a cells may respond better to LPS because of a
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lower threshold for their activation. The same argument may apply to B1b and B2
peritoneal cells, whose hematopoietic origins are still unclear. The results showing that
stimulation through TLR9 was able to markedly augment the frequency of responding
B1a cells, supports the notion that combined TLRs triggering may overcome the
insufficient signaling generated by the engagement of a single type of TLR4 only,
suggesting that a possible limitation in LPS receptors may explain the low responder
profile of the BALB/c strain, instead of a more general phenotype involving signaling
cascades. Recently it has been shown that the
MH C
locus has a strong impact in the B
cell response to LPS, probably through the regulation of the expression of RP105 (Rodo
et al 2006 ). We have not investigated here if the surface expression of RP105 differs
between splenic and peritoneal B cells, and this point deserves further clarification. On
the other hand, class II MHC molecules themselves have been implicated in the
regulation of the response to LPS, as suggested by the higher B cell response to LPS in
MHC II
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mice, and the inhibitory effects of anti-MHC II antibodies upon LPS stimulated
B cells (Rodo et al 2006, Forsgren et al 1987). It interesting to observe that fetal liver B
cell precursors, that gave origin to B1a, lack the expression of MHC molecules, which
are only expressed several days after the maturation of the precursor into a B lymphocyte
(Lam and Stall 1994). It is an intriguing possibility to consider the hypothesis that the
absence of MHC class II during the maturation period of the B cell could have a later
effect on the threshold for the response to LPS.
In conclusion, the data presented here revealed a previous unsuspected behavior
in the genetic control of the B cell response to LPS, with a differential impact in splenic
versus peritoneal B cells. These results suggest new experimental approaches to unravel
the mechanisms underlying the control of a signaling pathway that is of fundamental
importance in the biology of the B lymphocyte.
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FIGURE LEGENDS
FIGURE 1:
TITLE: Comparison of feeder cell efficiency between S17 and thymocytes.
LEGEND: Splenic B cells were cultivated under limiting dilution conditions in the
presence of LPS, 30µg/mL, using either rat thymocytes or S17 stroma cell line as feeeder
cells. The percentage of negative cultures is ploted against the B cell number/well, and
!"#$%#&'(#)*+!*"#),+&-(&.*'#//)*0#"#*'1/'%/12#-*1''+"-(&.*2+*3+())+&4)*-()2"(5%2(+&6*789*
C57BL/6J . (B) BALB/c.
FIGURE 2:
TITLE: Comparison of the frequencies of LPS responding cells from spleen or peritoneal
cavity..
LEGEND: Splenic or peritoneal cavity B cells were cultivated under limiting dilution
conditions in the presence of LPS, 30µg/mL, using S17 stroma cell line as feeeder cells.
The percentage of negative cultures is ploted against the B cell number/well, and
!"#$%#&'(#)*+!*"#),+&-(&.*'#//)*0#"#*'1/'%/12#-*1''+"-(&.*2+*3+())+&4)*-()2"(5%2(+&6*789*
C57BL/6J . (B) BALB/c. In (C), sorted B1a, B1b or B2 peritoneal cells from BALB/c
were cultivated under limiting dilution conditions in the presence of LPS, as above. The
percentage of negative cultures is ploted against the B cell number/well, and frequencies
of responding cells were calculated accordi&.*2+*3+())+&4)*-()2"(5%2(+&6
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FIGURE 3:
TITLE: Differential impact of the genetic control of LPS response in splenic versus
peritoneal B cells.
LEGEND: Splenic or peritoneal cavity B cells from F1(B6xBc) were cultivated under
limiting dilution conditions in the presence of LPS, 30µg/mL, using S17 stroma cell line
as feeeder cells. The percentage of negative cultures is ploted against the B cell
!"#$%&'(%))*+,!-+.&%/"%!01%2+3.+&%243!-1!5+0%))2+(%&%+0,)0"),6%-+,003&-1!5+63+731223!82+
distribution.
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TABLE LEGENDS:
Table 1:
Frequencies of LPS responding splenic B cells from C57BL/6J or BALB/cJ mice,
cultivated under limiting dilution conditions in the presence of LPS, 30µg/mL, using
either rat thymocytes or S17 stroma cell line as feeeder cells. Results from three different
experiments are shown. Frequencies were estimated as in figure 1.
Table 2:
Frequencies of LPS responding splenic or peritoneal cavity B cells from C57BL/6J or
BALB/cJ mice, cultivated under limiting dilution conditions in the presence of LPS,
30µg/mL, using S17 stroma cell line as feeeder cells. Results from three different
experiments are shown. Frequencies were estimated as in figure 2.
Table 3:
Frequencies of LPS responding splenic or peritoneal cavity B cells from (B6xBc)F1
mice, cultivated under limiting dilution conditions in the presence of LPS, 30µg/mL,
using S17 stroma cell line as feeeder cells. Results from three different experiments are
shown. Frequencies were estimated as in figure 3.
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Table 1:
Table 2:
Table 3:
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