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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLOGICAS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
EFEITO DO 1,8-CINEOL SOBRE OS PARÂMETROS
ELETROFISIOLÓGICOS DAS CÉLULAS NERVOSAS
DO GÂNGLIO CERVICAL SUPERIOR DE RATOS
FRANCISCO WALBER FERREIRA DA SILVA
FORTALEZA, CEARÁ
JULHO - 2007
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FRANCISCO WALBER FERREIRA DA SILVA
EFEITO DO 1,8-CINEOL SOBRE OS PARÂMETROS ELETROFISIOLÓGICOS DAS
CÉLULAS NERVOSAS DO GÂNGLIO CERVICAL SUPERIOR DE RATOS
Dissertação apresentada como exigência parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas à
comissão julgadora da Universidade Estadual de Ceará,
sob a orientação do Prof. Dr. Francisco Sales Ávila
Cavalcante e co-orientação do Prof. Dr. José Henrique
Leal Cardoso.
Universidade Estadual de Ceará
Fortaleza, Ceará
Julho - 2007
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S586e Silva, Francisco Walber Ferreira da
Efeito do 1,8-cineol sobre os parâmetros eletrofisiológicos
das células nervosas do gânglio cervical superior de ratos. /
Francisco Walber Ferreira da Silva.— Fortaleza, 2007.
80p.
Orientador: Dr. Francisco Sales Ávila Cavalcante.
Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências
Fisiológicas.) — Universidade Estadual do Ceará, Centro de
Ciências da Saúde.
1. 1,8-cineol 2. Técnica do microeletrodo intracelular 3.
Gânglio cervical superior I. Universidade Estadual do Ceará,
Centro de Ciências da Saúde
CDD: 612
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
EFEITO DO 1,8-CINEOL SOBRE OS PARÂMETROS ELETROFISIOLÓGICOS DAS
CÉLULAS NERVOSAS DO GÂNGLIO CERVICAL SUPERIOR DE RATOS
FRANCISCO WALBER FERREIRA DA SILVA
Data do exame: 18 / 07 / 2007
Banca examinadora:
_________________________________________________________
Prof. Dr. Francisco Sales Ávila Cavalcante – UECE
(Orientador)
___________________________________________________________
Prof. Dr. Marcelo Alcântara Holanda – UFC
___________________________________________________________
Prof. Dr. Antônio José da Costa Sampaio - UVA
AGRADECIMENTOS
Ao prof. Francisco Sales Ávila Cavalcante pelo convite para fazer parte deste estudo,
pela orientação na minha vida acadêmica e pela amizade nesses anos de convivência.
Ao prof. José Henrique Leal Cardoso pela recepção em seu laboratório, pela sua co-
orientação neste trabalho e pelos importantes conhecimentos compartilhados.
Aos professores Carlos Jacinto de Oliveira, Francisco Geraldo de Melo Pinheiro e
Emerson Mariano da Silva, pela minha iniciação à vida científica ainda na graduação.
Aos professores da graduação de Licenciatura em Física pela minha formação
profissional e científica e aos professores do Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências
Fisiológicas pela atenção que tiveram comigo por ser um profissional da área de ciências
exatas e da terra.
Aos meus pais, Paulo e Izabel , e ao meu irmão, Walter, pelos incentivos e apoio em
seguir meus ideais, mesmo quando os caminhos não pareciam ser fáceis.
A minha namorada, Ticianna, pelos constantes conselhos durante momentos delicados
em minha vida.
Aos amigos do Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas, em especial João Luís,
Socorro Quintino, Sílvio Ramos, Paula Matias e Paula Virgínia, pela ajuda durante as
disciplinas e pela amizade e companheirismo que experimentamos durante nossa convivência.
Aos técnicos de laboratório Pedro e Franck pelo seu trabalho árduo e muitas vezes
invisível, mas imprescindíveis para o andamento de uma pesquisa científica.
Aos bolsistas de iniciação científica Davi Cavalcante, Luiz Júnior, Maria Donatila,
Tiago dos Santos e a prof.(a) Roseli Barbosa, pois sem eles esse trabalho não seria possível.
A todos os amigos que fiz no Laboratório de Eletrofisiologia, no Instituto Superior de
Ciências Biomédicas e todas as outras pessoas que contribuíram para a passagem de mais uma
etapa em minha vida.
SUMÁRIO
Listas de Abreviaturas................................................................................................................. i
Listas de Figuras....................................................................................................................... iv
Lista de Tabelas....................................................................................................................... vii
Resumo................................................................................................................................... viii
Abstract...................................................................................................................................... x
1. Introdução.......................................................................................................................... 01
1.1. Efeito do 1,8-Cineol sobre o Sistema Respiratório..................................................... 01
1.2. Efeito do 1,8-Cineol sobre o Sistema Imunológico.................................................... 04
1.3. Efeito do 1,8-Cineol sobre o Transporte de Substâncias pela Pele............................. 06
1.4. Efeito do 1,8-Cineol sobre o Trato Gastrintestinal..................................................... 10
1.5. Efeito do 1,8-Cineol sobre o Sistema Cardiovascular e Metabolismo Ósseo............. 12
1.6. Efeito do 1,8-Cineol sobre os Parâmetros Eletrofisiológicos..................................... 13
1.7. Características do Potencial de Ação nos Neurônios do Gânglio Cervical Superior. 16
1.7.1. Os canais para sódio......................................................................................... 18
1.7.2. Os canais para potássio.................................................................................... 19
1.7.3. Os canais para cálcio........................................................................................ 22
1.7.4. Os canais para cloreto...................................................................................... 22
1.8. Justificativa e Relevância do Estudo........................................................................... 24
2. Objetivos............................................................................................................................ 25
2.1. Objetivos Gerais......................................................................................................... 25
2.2. Objetivos Específicos................................................................................................. 25
3. Metodologia....................................................................................................................... 26
3.1. Preparo das Soluções e Drogas................................................................................... 26
3.2. Animais e Tecidos...................................................................................................... 26
3.2.1. Gânglio Cervical Superior............................................................................... 26
3.3. Medidas Eletrofisiológicas......................................................................................... 28
3.4. Análise dos Dados e Estatística.................................................................................. 30
3.4.1. Parâmetros eletrofisiológicos........................................................................... 31
3.5. Protocolos Experimentais........................................................................................... 31
4. Resultados.......................................................................................................................... 34
4.1. Ação do 1,8-cineol sobre o Potencial de Ação........................................................... 34
4.1.1. Curso Temporal da Inibição e Recuperação do Potencial de Ação................. 34
4.1.2. Amplitude do Potencial de Ação..................................................................... 36
4.1.3. Inclinações Máximas (dv/dt
máx
) do Potencial de Ação no Ramo Ascendente e
Descendente......................................................................................................... 40
4.1.4. Duração do Potencial de Ação......................................................................... 48
4.2. Ação do 1,8-Cineol sobre a Resistência de Entrada da Membrana Celular............... 52
4.3. Ação do 1,8-Cineol sobre o Potencial de Repouso Celular........................................ 56
4.4. Ação do 1,8-Cineol sobre a Excitabilidade Celular.................................................... 60
5. Discussão........................................................................................................................... 65
5.1. Efeito do 1,8-cineol sobre as Preparações Intactas do GCS de Ratos........................ 65
5.2. Estudos Anteriores Envolvendo o 1,8-cineol............................................................. 65
5.3. Estudos Anteriores Envolvendo Constituintes de Óleos Essenciais........................... 66
5.4. Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Associados ao PA (Curso Temporal,
Amplitude, Inclinações, Duração) na Concentração de 6 mM................................... 67
5.5. Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Associados ao PA (Curso Temporal,
Amplitude, Inclinações, Duração) na Concentração de 1 mM................................... 68
5.6. Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Resistência de Entrada da Membrana e
Potencial de Repouso na Concentração de 6 mM....................................................... 69
5.7. Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Resistência de Membrana e Potencial de
Repouso na Concentração de 1 mM........................................................................... 71
5.8. Efeito do 1,8-cineol sobre Todos os Parâmetros na Concentração de 0,1 mM...........71
5.9. Efeito do 1,8-cineol sobre a Excitabilidade Celular................................................... 72
5.10. Considerações Finais................................................................................................. 73
6. Conclusão........................................................................................................................... 74
Referências bibliográficas........................................................................................................ 75
LISTAS DE ABREVIATURAS
[Na]
i
Concentração de sódio intracelular
48/80 Composto degranulador dos mastócitos
ANOVA Análise de variância
ATPase Atividade catalítica do ATP
AZT Zidovudina
Ca
++
Íon cálcio
cAMP Adenosina monofosfato cíclico
cm/h Centímetro por hora
ClC-2 Canais para cloreto do tipo 2
CNGA2 Subunidade A2 do canal ativado por nucleotídeo cíclico
CNGA4 Subunidade A4 do canal ativado por nucleotídeo cíclico
CNGB1 Subunidade B1 do canal ativado por nucleotídeo cíclico
CNGC Canal ativado por nucleotídeo cíclico
DCC Clampeamento descontínuo de corrente
DMSO Dimetilsulfóxido
dPC Dipalmitoilfosfatidilcolina
dv/dt
máx
Inclinação máxima da voltagem em relação ao tempo
e.p.m. Erro padrão da média
GCS Gânglio cervical superior
GTN Glutationa
g
Na
Condutância para o íon sódio
g
K
Condutância para o íon potássio
g
Leak
Condutância para os demais íons (cloreto, etc.)
i
g
naf
Condutância de sódio com inativação rápida
g
nas
Condutância de sódio com inativação lenta
Hz Hertz
H-H Hodgkin & Huxley
IBMX 3-isobutil-1-metilxantina
ISCB Instituto superior de ciências biomédicas
I
Kv
Corrente de potássio dependente de voltagem
I
A
Corrente de potássio A
I
Ca
Corrente de cálcio dependente de voltagem
I
M
Corrente de potássio M
I
AHP
Corrente de potássio pós-hiperpolarização
I
KCa
Corrente de potássio dependente de cálcio
IL-4 Interleucina 4
IL-1β Interleucina 1β
K
+
Íon potássio
KHz Quilohertz
L-NAME l-nitro-arginina-metil-éster
L, N, P, Q, R Subtipos de canais para cálcio dependentes de voltagem
M Molar
mM Milimolar
μM Micromolar
Mg Miligrama
Ml Mililitro
mg/cm
2
Miligrama por centímetro quadrado
mg/kg Miligrama por quilograma
ii
Μg Micrograma
Min Unidade de tempo minuto
Μl Microlitro
μS Microsiemen
mV Milivolt
MΩ Megaohm
N Número de experimentos realizados
Na
+
Íon sódio
PA Potencial de ação
PAC Potencial de ação composto
PEG Polietileno glicol
Ppm Partes por milhão
R
Na
Resistência associada ao canal para sódio
R
K
Resistência associada ao canal para potássio
R
L
Resistência associada à condutância “leakage”
S Unidade de tempo segundo
TNFS Trinitrobenzeno sulfônico
TNF-α Fator de Necrose Tumoral α
UECE Universidade estadual de ceará
v/v Volume/volume
V Volt
V
m
Potencial transmembrana
iii
LISTAS DE FIGURAS
Nome da Figura Página
Figura 01: Fórmula química estrutural do 1,8-cineol.
01
Figura 02: Circuito elétrico representando a membrana celular no modelo de
Hodgkin e Huxley.
17
Figura 03: Valores de repouso das variáveis m e h e suas respectivas
constantes temporais como função do potencial de membrana.
19
Figura 04: Valores de repouso das variáveis kcf e kcs e suas respectivas
constantes temporais como função do potencial de membrana.
21
Figura 05: Montagem do aparato experimental necessário para o registro dos
parâmetros eletrofisiológicos descrito nesse trabalho.
29
Figura 06: Protocolo da fase de impalamento e estabilização montado com
comandos externos.
32
Figura 07: Protocolo para as outras fases do experimento montado com
comandos internos e externos.
33
Figura 08: Curso temporal da inibição e recuperação do PA sob a ação do
1,8-cineol na concentração de 6 mM em uma mesma célula.
35
Figura 09: Amplitude do PA na estabilização (n=5), sob a ação do 1,8-cineol
(6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o impalamento
foi mantido por um longo tempo
36
Figura 10: Amplitude do PA na estabilização (n=8), sob a ação do 1,8-cineol
(1 mM, n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células que não tiveram a
inibição do PA.
37
Figura 11: Amplitude do PA na estabilização (n=8, com e n=6 sem DMSO) e
sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células sob a
concentração de 0,1 mM da droga.
38
Figura 12: Inclinação máxima do ramo ascendente do PA na estabilização
(n=5), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para
40
iv
as células onde o impalamento foi mantido por um longo tempo.
Figura 13: Inclinação máxima do ramo descendente do PA na estabilização
(n=5), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para
as células onde o impalamento foi mantido por um longo tempo.
41
Figura 14: Inclinação do ramo ascendente do PA na estabilização (n=8), sob a
ação do 1,8-cineol (1 mM, n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células que
não tiveram a inibição do PA.
42
Figura 15: Inclinação do ramo descendente do PA na estabilização (n=8), sob
a ação do 1,8-cineol (1 mM, n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células
que não tiveram a inibição do PA.
43
Figura 16: Inclinação máxima do ramo ascendente do PA na estabilização
(n=8, com e n=6 sem DMSO) e sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem
DMSO) para as células sob a concentração de 0,1 mM da droga.
44
Figura 17: Inclinação máxima do ramo descendente do PA na estabilização
(n=8, com e n=6 sem DMSO) e sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem
DMSO) para as células sob a concentração de 0,1mM da droga.
45
Figura 18: Duração do PA na estabilização (n=5), sob a ação do 1,8-cineol
(6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o impalamento
foi mantido por um longo tempo.
48
Figura 19: Duração do PA na estabilização (n=8), sob a ação do 1,8-cineol
(1 mM, n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células que não tiveram a
.inibição do PA.
49
Figura 20: Duração do PA na estabilização (n=8, com e n=6 sem DMSO) e sob
a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células sob a
concentração de 0,1 mM da droga.
50
Figura 21: Resistência de entrada da membrana celular na estabilização
(n=5), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para
as células onde o impalamento foi mantido por um longo tempo.
52
Figura 22: Resistência de entrada da membrana celular na estabilização
(n=8), sob a ação do 1,8-cineol (n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as
53
v
células sob a ação da droga na concentração de 1 mM.
Figura 23: Resistência de entrada da membrana na estabilização (n=8, com e
n=6 sem DMSO) e sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para
as células sob a concentração de 0,1 mM da droga.
54
Figura 24: Potencial de repouso celular na estabilização (n=5), sob a ação do
1,8-cineol (6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o
impalamento foi mantido por um longo tempo.
56
Figura 25: Potencial de repouso celular na estabilização (n=8), sob a ação do
1,8-cineol (n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células sob a ação da
droga na concentração de 1 mM.
57
Figura 26: Potencial de repouso celular na estabilização (n=8, com e n=6 sem
DMSO) e sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as
células sob a concentração de 0,1 mM da droga.
58
Figura 27: Traçados do PA na estabilização, após a exposição do 1,8-cineol e
após a injeção de corrente na célula.
60
Figura 28: Amplitude da resposta de voltagem na estabilização (n=6), sob a
ação do 1,8-cineol (n=6) e após a injeção de corrente na célula para
reposicionamento do potencial transmembrana no valor do novo potencial de
repouso.
61
Figura 29: Inclinação máxima do ramo ascendente (a) e do ramo descendente
(b) do PA na estabilização (n=5), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e após
a injeção de corrente na célula (n=5).
62
Figura 30: Duração do PA na estabilização (n=6), sob a ação do 1,8-cineol (6
mM, n=6) e após a injeção de corrente na célula (n=6).
63
Figura 31: Corrente limiar de geração do PA na estabilização (n=6) e após a
injeção de corrente na célula (n=6).
63
vi
LISTAS DE TABELAS
Nome da tabela Página
Tabela 01: Amplitude do PA (mV) para diferentes fases do experimento sob a
ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM).
39
Tabela 02: Inclinação máxima do ramo ascendente do PA (mV/ms) para
diferentes fases do experimento sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e
0,1 mM).
46
Tabela 03: Inclinação máxima do ramo descendente do PA (mV/ms) para
diferentes fases do experimento sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e
0,1 mM).
47
Tabela 04: Duração do PA (ms) para diferentes fases do experimento sob a
ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM).
51
Tabela 05: Resistência de entrada da membrana celular (MΩ) para diferentes
fases do experimento sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM).
55
Tabela 06: Potencial de repouso celular (mV) para diferentes fases do
experimento sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM).
59
vii
RESUMO
O 1,8-cineol é um terpeno constituinte de diversos óleos essenciais de plantas
utilizadas na medicina popular. Este constituinte apresenta várias ações farmacológicas, como
antiinflamatória, antitumoral e gastroprotetora. Entretanto é difícil encontrar estudos que
relacionem a ação tanto de óleos essenciais como de seus constituintes sobre preparações do
sistema nervoso. Como muito desses óleos e seus constituintes são considerados anestésicos
locais, esse trabalho teve como objetivo estudar os efeitos do 1,8-cineol sobre os parâmetros
eletrofisiológicos, bem como sobre a excitabilidade nervosa, em preparações intactas de
células nervosas do Gânglio Cervical Superior (GCS) de ratos. Para isto, Ratos Wistar foram
sacrificados por concussão cerebral e seus GCS dissecados e montados em uma câmara para
superfusão com solução Locke e 1,8-Cineol. Foi utilizada a técnica do microeletrodo
intracelular e protocolos no modo de clampeamento de corrente para a determinação desses
parâmetros sob a ação do 1,8-cineol, sendo os dados continuamente monitorados e registrados
em computador. Na concentração de 6 mM, todas as células (n=12) tiveram a inibição do
Potencial de Ação (PA) e mostraram alteração nos parâmetros eletrofisiológicos estudados
(amplitude do PA, inclinações máximas, duração, resistência de entrada da membrana e
potencial de repouso). Os efeitos do 1,8-cineol foram reversíveis em até 45 min após a
exposição do tecido ao composto na concentração de 6 mM. Na concentração de 1 mM pode-
se distinguir dois blocos de resultados: células com inibição do PA e características
semelhantes às células sob exposição de 1,8-cineol na concentração de 6 mM (n=7) e células
onde não houve essa inibição (n=8). Contudo, para este último grupo de células, houve uma
pequena alteração na amplitude do PA e da inclinação máxima do ramo ascendente do PA
sem alteração do potencial de repouso celular. Já para a concentração de 0,1 mM não houve
alteração significativa nos parâmetros associados ao PA nem na resistência de entrada da
membrana celular e no potencial de repouso (n=14). Houve uma despolarização do potencial
transmembrana quando o tecido foi exposto a concentração de 6 mM e fizemos estudos sobre
a excitabilidade ao final dessa despolarização. Para isto, injetamos corrente continuamente na
célula com o intuito de retornar o potencial transmembrana a seu valor da estabilização e
encontramos alterações em alguns parâmetros eletrofisiológicos, assim como, alteração na
corrente limiar de geração do PA. Portanto, como conclusão, o 1,8-cineol bloqueou o PA nas
concentrações de 6 mM e 1 mM e seus efeitos foram reversíveis. Esse bloqueio pode se dar,
possivelmente, pela ação do composto diretamente sobre os canais para sódio ou pelo
viii
mecanismo indireto de despolarização da membrana celular, através da ativação do canal para
cloreto ativado por cálcio. Além do mais, os dados mostrados também demonstram que o 1,8-
cineol bloqueou a excitabilidade neuronal nas células do GCS de ratos.
ix
ABSTRACT
1,8-cineol is a terpene that constitutes many essential oils from medicinal folk plants.
This compound presents many pharmacological activities as anti-inflammatory, antitumoral
and gastroprotective. However it is difficult to find studies that relate the effects of both
essential oils and its compounds in nervous system tissues. Since many of these oils and its
constitutes are reported to be anesthetics drugs, the study of the effects of 1,8-cineol in
electrophysiological parameters, as well as nervous excitability, in rats intact Superior
Cervical Ganglion (SCG) nervous cells was performed. For this, Wistar rats were sacrificed
by cerebral concussion and its SCG dissected and mounted in a chamber for superfusion in
Locke solution and 1,8-cineol. It was used the intracellular microelectrode technique and
protocols in current clamp mode for determination of these parameters under 1,8-cineol
chalenge, being the data continuously monitored and recorded in computer. In the
concentration of 6 mM, all cells (n=12) had inhibition of Action Potential (AP) and showed
modifications in the electrophysiological parameters studied (AP amplitude, maximum
inclinations, duration, input membrane resistance and rest potential). The effects of 1,8-cineol
were reversible until 45 min after passage of the compound to the tissue in the concentration
of 6 mM. In the concentration of 1 mM it had two types of cells: with AP inhibition and
similar features to the cells treated with 1,8-cineol in the concentration of 6 mM (n=7) and
cells with no inhibition (n=8). However this last group of cells was weakly affected in the AP
amplitude and AP maximum ascendant inclination and showed no alteration of rest potential.
For the concentration of 0,1 mM there was no significant alteration in the parameters
associated to the AP, neither in the input membrane resistance, or in rest potential (n=14).
There was a membrane depolarization when the tissue was treated with the concentration of 6
mM and the excitability in the final of this depolarization was investigated. For this, we
injected current continuously in the cell to return the transmembrane potential to its value in
the stabilization and we found alterations in some electrophysiological parameters, as well as,
modification in the AP generation threshold current. Therefore, in conclusion, the 1,8-cineol
blocked the AP in the concentration of 6mM and 1mM and its effects were reversible. This
blockade could be, possibly, by the action of the compound directly in the sodium channels or
by indirect mechanism of cellular membrane depolarization, through the activation of
calcium-activated chloride channel. Besides, the data showed yet that 1,8-cineol blocked the
neuronal excitability in the rats SCG cells.
x
1. INTRODUÇÃO
Os terpenos são uma grande família de produtos naturais compostos por classes como
os monoterpenos, que contêm 10 átomos de carbono em sua estrutura (com duas subunidades
de isoprenos) e que fazem parte da composição de grande parte dos óleos essenciais de
plantas. O 1,8-cineol (também chamado apenas de cineol, eucaliptol ou até de cajeputol)
apresenta-se como o principal componente de diversos óleos essenciais como o da artemísia
(ASANOVA et al., 2003), do eucalipto, do óleo de alecrim (SANTOS & RAO, 1997), do
Croton Nepetaefolius (LIMA-ACCIOLY et al., 2006) dentre outros como composto principal
ou em menor quantidade. Sua fórmula química, mostrada na Figura 01, é C
10
H
18
O, com peso
molecular igual a 154,24D e nome químico 1,3,3-trimetil-2-oxabiciclico(2.2.2)-octano. Esse
composto é utilizado para tratamento de resfriados e para tratamento de doenças do sistema
gastroentestinal, além de demonstrar ações antimicrobianas (BALACS, 1997), e diversos
trabalhos envolvem os efeitos do 1,8-cineol sobre preparações tanto in vitro como in vivo.
B A
Figura 01: Fórmula química estrutural do 1,8-cineol. A Figura A foi adaptada de Moteki
et al., 2002, Fig. 01 e a Figura B, adaptada de Cal, Kupiec e Sznitowska, 2006, Fig. 01.
1.1 Efeito do 1,8-Cineol sobre o Sistema Respiratório
Alguns trabalhos mostraram a ação do 1,8-cineol sobre o sistema respiratório, tanto
em animais como em humanos. Jager e colaboradores (1996) fizeram um estudo com o
objetivo de determinar a farmacocinética do 1,8-cineol em humanos sujeitos a inalação
prolongada dessa droga e conseguir mais informações sobre a absorção, distribuição e
eliminação deste composto. Eles utilizaram quatro voluntários (dois homens e duas mulheres)
1
nos quais foi administrado o 1,8-cineol por inalação, através de um circuito fechado de
respiração com passagem de até 4 ml do composto por 20 min. Amostras de sangue foram
coletadas após 5 min de inalação até 60 min de experimento.
Os pesquisadores notaram que o 1,8-cineol foi rapidamente absorvido a partir do ar
inalado e pode ser detectado no sangue 5 min após o início do procedimento de
administração. Os valores da vida média de entrada desse composto e o tempo no qual a
concentração máxima de 1,8-cineol foi alcançada estiveram muito próximos em todos os
indivíduos (~3-7 min e 14-19 min, respectivamente). Já distribuição da meia-vida do 1,8-
cineol nos tecidos foi de 2 e 4,8 min para os dois homens, enquanto as duas mulheres
exibiram prolongados valores de 6,9 e 13,1 min. O valor do parâmetro cinético de eliminação
do 1,8-cineol para os homens foi de 31,1 e 32,6 min enquanto as mulheres tiveram valores 2,5
a 10 vezes maior.
Ainda com experimentos com seres humanos Juergens e colaboradores (2003)
executaram um teste aleatório placebo-controlado com objetivo de determinar a eficácia do
uso da terapia oral com o 1,8-cineol sobre a redução do uso de glicocorticosteróides em
pacientes com asma grave. Para tanto, eles utilizaram pacientes asmáticos que recebiam entre
5 e 24 mg de um glicocorticóide (prednisolona) e de modo paralelo aplicaram, aleatoriamente,
200 mg de 1,8-cineol ou placebo por até 12 semanas. Esses dois grupos foram comparados
com relação à gravidade de sua asma, como determinado pelo uso sistêmico de longa duração
da prednisolona concomitante com medicação para asma.
Após esse tratamento, os pacientes que foram submetidos à ingestão do 1,8-cineol por
terapia oral tiveram seu tratamento com glicocorticosteróides reduzido, em média, para
3,75mg e a maioria dos pacientes com asma crônica que receberam essa administração oral de
1,8-cineol permaneceu clinicamente estável, a despeito de uma redução média da dose oral de
esteróides. Ainda mais, este trabalho demonstra que uma terapia de longa duração com 1,8-
cineol é bem tolerada por seres humanos e que essa droga medeia uma atividade
antiinflamatória equivalente à prednisolona sugerindo, pela primeira vez, uma atividade
antiinflamatória relevante do 1,8-cineol na asma brônquica.
Para comprovar ainda mais essa ação antiinflamatória, esse mesmo pesquisador e seu
grupo de pesquisa (JUERGENS et al., 2004) estudaram a eficácia do 1,8-cineol sobre a
inibição da produção de citocinas associadas às células linfócitos T não-fracionados de
humanos comparados com monócitos in vitro. Essas células foram incubadas na presença e
2
ausência do 1,8-cineol nas concentrações de 10
-5
a 10
-9
M simultaneamente com o estímulo
por 20 h para estabilização das culturas de células.
Dados preliminares já apontavam a exclusão dos efeitos citotóxicos do 1,8-cineol
nestas concentrações sobre as culturas de células. Os resultados encontrados nesse estudo
mostraram que o 1,8-cineol na concentração terapêutica conhecida de 1,5 μg/ml (10
-5
M) teve
um efeito inibitório significante de 65-99% na produção de citocinas em linfócitos periféricos
humanos normais in vitro e apresentou-se como forte inibidor da produção do Fator de
Necrose Tumoral α (TNF-α) e da Interleucina 1β (IL-1β) em monócitos e linfócitos
estimulados. Além do mais, esse composto pode ter atividade antialérgica adicional devido ao
bloqueio da produção da Interleucina 4 (IL-4). Portanto, com base no estudo de Juergens e
colaboradores (2004) e com os resultados do trabalho de Juergens e colaboradores (2003),
observa-se que o tratamento sistêmico com o 1,8-cineol pode ser útil no controle da ativação
dos processos inflamatórios que estão ligados à exacerbação da asma e da doença pulmonar
obstrutiva crônica.
Já em um trabalho mais recente, Keinan e colaboradores (2005) investigaram a ação
de oleofinas (1,8-cineol e limoneno) no tratamento profilático da asma. Eles utilizaram grupos
de ratos sensibilizados com ovalbumina e hidróxido de alumínio para induzir a asma. Em um
grupo de animais foi administrado o limoneno e outro grupo administrado o 1,8-cineol, ambos
por 7 dias (do 14
o
ao 21
o
dia a partir do 1
o
dia de sensibilização dos animais) continuamente,
produzindo 125 ppm (partes por milhão), enquanto um terceiro grupo permaneceu como
controle.
Esses autores observaram que no grupo que recebeu inalação com o 1,8-cineol não
houve qualquer mudança apreciável na broncoconstrição, enquanto as observações acerca dos
ratos tratados com o limoneno mostraram significativa prevenção da obstrução brônquica.
Além do mais, os ratos tratados com limoneno mostraram redução significativa da infiltração
celular inflamatória peribronquial em comparação com o grupo tratado com o 1,8-cineol. O
estudo mostra, portanto, que o 1,8-cineol apresentou uma fraca atividade antiinflamatória em
relação ao outro composto, o limoneno, além de não reduzir de forma apreciável a
broncoconstrição.
Como levantado na literatura, há uma controvérsia acerca do efeito antiinflamatório do
1,8-cineol sobre preparações no sistema respiratório e para uma melhor caracterização de seus
efeitos mais trabalhos devem ser realizados.
3
1.2 Efeito do 1,8-Cineol sobre o Sistema Imunológico
Moteki e colaboradores (2002) investigaram os efeitos do 1,8-cineol (nas
concentrações 5 µM, 7,5 µM e 10 µM) sobre a proliferação e apoptose das células leucêmicas
humanas MOLT 4B e HL-60 e das células cancerígenas KATO III de estômago de humanos.
Essas células foram cultivadas na presença de veículo (etanol) ou do 1,8-cineol por 12, 24, 48
e 72 h, e ao final desses períodos foram executados testes no material celular das amostras.
Esses autores encontraram uma inibição significante dose-dependente da proliferação das
células MOLT 4B e HL-60. Para esses dois tipos de células, a inibição da proliferação
alcançou 100% na concentração de 10 µM, mas não para as células KATO III, onde nessa
mesma concentração a inibição foi de apenas 41,6% depois de 3 dias do cultivo dessas
células. A partir desse dado, os autores investigaram se parte desse efeito foi resultante da
indução de apoptose nessas células pela droga. Eles encontraram que as amostras de HL-60
tratadas com o 1,8-cineol já mostravam células que tiveram apoptose após 48 h de tratamento
com a dose de 7,5 µM. As células MOLT 4B também apresentaram esse perfil, mas esse fato
não ocorreu com as células cancerígenas KATO III do estômago. Portanto os autores
demonstraram, de acordo com os dados do seu trabalho, que o 1,8-cineol exerceu uma
atividade antitumoral a partir da inibição da proliferação das células leucêmicas humanas
devido à indução de apoptose.
Também com relação à atividade antitumoral, Asanova e colaboradores (2003)
investigaram os efeitos do 1,8-cineol, nas concentrações de 10
-6
M a 10
-2
M, na atividade
antitumoral em células do melanoma H
157
e carcinoma HT
144
de ratos. Na dose de 1×10
-2
M, a
inibição de crescimento das células H
157
e HT
144
foi 95 e 96%, respectivamente,
acrescentando ainda mais dados para essa atividade antitumoral do 1,8-cineol.
Ainda sobre o estudo do 1,8-cineol em células do sistema imunológio, Scelza e
colaboradores (2006) avaliaram a citotoxicidade desse constituinte, do óleo da laranja e do
clorofórmio sobre os macrófagos do peritônio retirados de ratos Swiss. Essas células foram
incubadas com solvente e o 1,8-cineol (nas concentrações finais de 0,050% e 0,025%) por 30
min, e em seguida foi avaliada a viabilidade celular comparada com os outros grupos.
Como resultados, os pesquisadores encontraram que todos os compostos foram
capazes de induzir a perda da viabilidade celular, refletindo assim sua citotoxicidade em
4
relação ao controle, com maior efeito nos grupos do 1,8-cineol e do clorofórmio. Além do
mais, o 1,8-cineol e o clorofórmio mostraram-se mais citotóxicos do que o óleo da laranja,
mas os autores ressalvaram a necessidade de reavaliar essa toxicidade.
Outro estudo que mostra os efeitos desse composto e sua toxicidade foi realizado por
Santos e Rao (1997) que estudaram a influência modulatória de vários agentes farmacológicos
no edema de pata induzido pelo 1,8-cineol e o papel dos mastócitos nessa resposta. Para isto,
a habilidade de induzir edema foi testada através de injeção subplantar de 1,8-cineol (10, 15 e
20 µl/pata) na pata de ratos Wistar. Como resultado, na dose de 10 µl o pico do edema foi
detectado 30 min após a injeção dessa droga e gradualmente diminuiu enquanto na dose de 15
e 20 µl, o 1,8-cineol induziu grande edema, com efeito de pico em 2 h e teve longa duração.
Esse edema de pata foi significantemente suprimido pelo antihistamínico difenidramina, pelo
antiserotoninérgico metilsergida e pelo antagonista tanto da histamina como da serotonina, a
ciproheptadina.
Os autores verificaram a possibilidade da ativação dos mastócitos no edema de pata
induzido por essa substância e encontraram que nos ratos pré-tratados com o composto 48/80
(um agente degranulador dos mastócito), o edema foi quase completamente ausente em
resposta ao 1,8-cineol. Também o citotifen, um estabilizador dos mastócitos que bloqueia a
liberação de mediadores químicos, mostrou-se efetivo no bloqueio do edema de pata induzido
pelo 1,8-cineol.
Para confirmar a influência do 1,8-cineol sobre os mastócitos, esse mesmo autor e seu
grupo de pesquisa investigaram o possível papel dessas células em resposta ao 1,8-cineol (nos
volumes de 10 µl, 20 µl e 40 µl/in situ) induzidos pelo esfregaço em ratos Wistar machos
(SANTOS & RAO, 2002). Outros compostos também foram utilizados (como o 48/80) e cada
rato foi utilizado apenas uma vez, num período de observação de 30 min.
Como resultado, quando comparados com solução salina, os efeitos do 1,8-cineol e do
48/80 na resposta ao esfregaço foram dose-dependente. Quando os ratos foram pré-tratados
com a difenidramina e a ciproheptadina, os efeitos do 1,8-cineol induzidos pelo esfregaço
diminuíram sensivelmente e com o pré-tratamento com um agonista do receptor A
1
da
adenosina, notavelmente suprimiu esse efeito da droga. De acordo com as conclusões dos
autores, esse efeito do 1,8-cineol sobre o receptor A
1
da adenosina pode indicar a liberação de
adenosina em altas concentrações a partir de tecidos danificados pelo esfregaço, o que
5
favorece a ativação do receptores A
3
dos mastócitos, com subseqüente degranulação e
liberação de mediadores inflamatórios.
1.3 Efeito do 1,8-Cineol sobre o Transporte de Substâncias pela Pele
Dentre todos os estudos sobre a ação do 1,8-cineol em tecidos biológicos,
investigações sobre o efeito de amplificador dessa droga no transporte de drogas através da
pele são muito encontradas. Cal e colaboradores (2001) avaliaram a penetração cutânea in
vitro de cinco diferentes terpenos (D-limoneno, L-limoneno, dipenteno, terpinoleno e 1,8-
cineol) liberados a partir de modelos de matrizes de poliuretano para camadas de pele isoladas
ou para um meio receptor, com o intuito de disponibilizar mais dados a cerca de sistemas
terapêuticos que utilizem a passagem de substâncias através da pele. Os terpenos foram
incorporados às matrizes, com composição acima de 39% de seu conteúdo total, e para o
estudo de liberação e penetração desses terpenos, essas matrizes foram colocadas sobre
amostras de pele do tórax de cadáveres humanos por até 8 h. Ao término do experimento, as
camadas da pele foram separadas, os níveis da concentração de terpenos mensurados e o meio
receptor também analisado.
Os pesquisadores encontraram que a taxa de liberação de terpenos da matriz em
direção ao meio receptor foi maior para o 1,8-cineol, provavelmente por ser o composto
menos lipofílico em comparação aos outros terpenos. Quando considerando apenas a derme
como a única barreira de passagem dos terpenos, a cinética de passagem foi similar àquela
observada à passagem para o meio receptor, indicando que a derme não se apresenta como
uma barreira para a difusão desses compostos. O perfil de penetração desses terpenos através
da epiderme com a camada córnea intacta (também designada de estrato córneo) também foi
estudado e a taxa de penetração foi menor na presença dessa estrutura para todos os terpenos,
comprovando que esta camada atua como uma barreira.
Considerando a acumulação de terpenos nas camadas da pele, o 1,8-cineol apresentou
quase duas vezes maior concentração do que os outros terpenos (~3,5 mg/cm
2
para a camada
córnea + epiderme e ~3 mg/cm
2
para a derme), o que de acordo com os autores demonstra que
uma possível ligação desse composto aos tecidos não pode ser descartada.
Esse mesmo autor e seu grupo de pesquisa também desenvolveram um trabalho
posterior onde tentaram correlacionar a cinética de absorção e eliminação de quatro terpenos
6
cíclicos (entre eles o 1,8-cineol) com as propriedades físico-químicas destes compostos. Eles
também utilizaram a pele da região do tórax de cadáveres humanos, que não possuíam
doenças de pele, para determinar esse parâmetro de absorção e eliminação da droga e as
camadas da pele, assim como no trabalho anterior, foram separadas para se determinar qual o
nível de acumulação desses terpenos nessas camadas. A penetração dos terpenos pela derme
foi estudada durante 4 h e a análise da camada córnea demonstrou uma acumulação dos
terpenos desde suas camadas mais externas para as mais internas e até mesmo uma rápida
penetração na epiderme. Como conclusão, esses pesquisadores encontraram que todos os
terpenos investigados apresentaram diferentes características de penetração e eliminação.
Considerando os terpenos cíclicos e acíclicos, os terpenos que possuem oxigênio em sua
composição apresentaram uma maior penetração na pele do que aqueles tipos hidrocarboneto
ou éster (CAL et al., 2006).
Como citado nos trabalhos de Cal e colaboradores (2001 e 2006) a pele apresenta uma
barreira substancial contra a permeabilidade de drogas e no que concerne às estratégias
disponíveis para a amplificação desse efeito, muita atenção é dada ao uso de substâncias
químicas amplificadoras dessa permeabilidade. Heard e colaboradores (2006) desenvolveram
um trabalho onde prepararam formulações simples utilizando ácido mefenâmico e polietileno
glicol (PEG) 400 como a droga a ser permeada através da pele. Para estudar os efeitos de
penetração, eles incorporam a estas formulações várias proporções de etanol e 1,8-cineol (5,
10 e 25%, v/v) e aplicaram na pele de orelhas de suínos.
Como resultados, eles encontraram que a pele de suínos foi 5 a 13 vezes mais
permeável ao etanol do que ao 1,8-cineol, mesmo quando esses compostos foram utilizados
nas mesmas quantidades. Como o 1,8-cineol é consideravelmente mais lipofílico do que o
etanol, uma hipótese para explicar essa baixa permeabilidade é o fato de os domínios polares
viáveis da epiderme e da derme poderem reduzir essa permeabilidade. O etanol é um potente
solvente tanto para espécies polares como para não-polares e é compreensível que uma
pequena quantidade de etanol é capaz de desfazer quantidades significativas de ligações
anfipáticas não-covalentes nos lipídios da camada córnea e que pode possuir efeito de
modulação na barreira da pele. Esse efeito, de acordo com os autores, aparentemente, não
ocorre com o 1,8-cineol. Assim, é proposto pelos pesquisadores, mesmo sendo algo simplista,
que os processos de difusão são suficientes para a atividade de amplificação da
permeabilidade pelo etanol e 1,8-cineol, apesar da modulação inicial que possa ocorrer dentro
da camada córnea.
7
Essa barreira natural da camada córnea (localizada na camada mais superficial da
epiderme) oferece dificuldades no transporte de drogas, incluindo a zidovudina (AZT), em
concentrações clínicas efetivas através da pele. Assim, Narishetty e Panchagnula (2005)
investigaram os efeitos do 1,8-cineol e do l-mentol na permeabilidade transdérmica do AZT
através da pele de cadáveres humanos, além de tentarem desvendar os mecanismos de ação a
nível molecular. Para isso, os autores utilizaram um modelo do sistema lipídico da camada
córnea, consistindo dos mais abundantes ingredientes dessa estrutura (mistura de lipídios
ternários de ceramidas III bovinas, colesterol e ácido palmítico), no intuito de estudar os
efeitos dos terpenos já citados na agregação subcelular, no estado conformacional das cadeias
alquil de lipídios e nas pontes de hidrogênio nas cabeças dos grupos ceramidas.
Os pesquisadores notaram que quando o 1,8-cineol e o l-mentol foram incorporados ao
modelo lipídico, eles aumentaram a desordem das cadeias alquil lipídicas em baixas
temperaturas, incluindo temperaturas fisiológicas. Tanto o 1,8-cineol como o l-mentol,
significantemente, aumentaram o pseudoestado de fluxo de AZT em comparação à água ou
veículo e o aumento em geral do fluxo observado para o AZT nesta investigação foi
ocasionado pelo efeito tanto do veículo como dos terpenos nas propriedades de barreira da
pele. Assim, os terpenos utilizados no trabalho de Narishetty e Panchagnula (2005) mostraram
efeitos tanto nas caudas alquil lipídicas quanto nas cabeças dos grupos polares. Em
temperaturas fisiológicas, os terpenos primariamente atuaram nas cabeças dos grupos polares,
quebrando a rede de pontes de hidrogênio inter e intralamelar e levando a um decréscimo da
integridade da barreira da pele.
Assim com o AZT, outras drogas foram estudadas. No trabalho de Gao e Singh (1997)
foram selecionados três terpenos (carvona, 1,8-cineol e timol) para investigar seus efeitos nas
mudanças biofísicas nos lipídios da camada córnea e na integridade macroscópica de barreira
da epiderme, correlacionando estas mudanças com a absorção cutânea in vitro do 5-
fluorouracil. Eles também utilizaram a pele de orelhas de suínos, com retirada das camadas da
pele por técnicas de separação por calor e as drogas foram utilizadas nas proporções de 5% de
terpenos e 50% de etanol.
Todos os terpenos aumentaram o transporte in vitro do 5-fluorouracil comparados com
o controle. O coeficiente de permeabilidade foi maior para o timol (~0,225 cm/h) seguido do
1,8-cineol (~0,125 cm/h). A perda de água pela epiderme também foi avaliada neste estudo.
Os pesquisadores encontraram que o 1,8-cineol não aumentou a fluidez da membrana
(diferentemente do timol que apresentou modificação na fluidez dos lipídios da camada
8
córnea), mas aumentou in vitro a perda de água pela via transepidérmica. Esse aumento
possivelmente refletiu uma perturbação na barreira da pele. Assim, todos os compostos
estudados provocaram perturbação na integridade de barreira da pele e apenas o timol
provocou, também, uma alteração na fluidez dos lipídios da camada córnea.
Nem sempre o 1,8-cineol promove uma boa permeabilidade às drogas. Em um
experimento de amplificação da penetração do diclofenaco de sódio (a partir de gel carbômero
contento propileno glicol) em amostras de pele retirada da região abdominal de ratos Wistar
machos, o 1,8-cineol não se mostrou uma boa opção. Os melhores amplificadores de
penetração foram os terpenos acíclicos (como o geraniol, utilizado neste estudo), mas as
cetonas não revelaram uma forte atividade amplificadora, assim como o 1,8-cineol
(ARELLANO et al., 1996).
Como foi proposto que os terpenos provocam uma perturbação na integridade da
barreira da pele e aumento da fluidez dos lipídios da camada córnea (Gao e Singh, 1997) e
que esses compostos, provavelmente, se ligam aos tecidos (Cal et al., 2001), o trabalho de
Turina e colaboradores (2006) provavelmente explica essas observações. O objetivo do
trabalho desses pesquisadores foi estudar a habilidade de alguns terpenos (timol, cânfora, 1,8-
cineol, geraniol e mentol) de se incorporar em modelos de membrana e de afetar a sua
organização supramolecular, de forma a determinar características de sua particular interação
com biomembranas. Para isto eles construíram filmes monomoleculares (também chamados
de filmes Langmuir) de dipalmitoilfosfatidilcolina (dPC) e determinaram a penetração desses
monoterpenos nestas camadas na interface ar-água, o tamanho das vesículas dos
monoterpenos e a concentração micelar crítica.
Os pesquisadores encontraram que todos os monoterpenos estudados tiveram valores
de concentração micelar crítica entre 3 e 8 µM, na seguinte ordem: 1,8-
cineol<timol<geraniol<mentol<cânfora. Ainda mais, a penetração desses terpenos na camada
monomolecular de dPC foi evidenciada por um incremento na pressão lateral de superfície
por área constante. Todos os terpenos foram capazes de penetrar na camada, de uma subfase
aquosa para a monocamada de dPC, sob uma pressão inicial bem acima de 37 mN/m e esse
parâmetro reflete a habilidade dos monoterpenos de deformar a interface água-lipídio.
Portanto, como conclusão desses autores, os resultados apontam para fato que mesmo
interações específicas de drogas-membrana podem ser modificadas pela agregação de outros
compostos.
9
1.4 Efeito do 1,8-Cineol sobre o Trato Gastrintestinal
O 1,8-cineol também é tradicionalmente utilizado como agente condimentar de
alimentos. Devido a esse uso, Boyle e colaboradores (2005) investigaram a absorção desse
composto pelo organismo administrado na dieta, com o intuito de demonstrar a relação direta
da concentração sanguínea do 1,8-cineol e a cessação da fome no Trichosurus vulpecula
(gambá de cauda-de-escova da montanha). Esses animais foram alimentados com dietas que
possuíam o 1,8-cineol em diversas concentrações por três dias e amostras de sangue foram
coletadas ao fim desse período. Os autores encontraram que a concentração de 1,8-cineol no
sangue, para cada tratamento com concentração de droga diferente, foi similar e os
metabólitos do 1,8-cineol presentes no sangue estiveram 10 vezes maiores do que os níveis do
próprio 1,8-cineol. Portanto, eles levantaram a hipótese de que o controle imediato da
alimentação parece ser regulado pelos níveis sangüíneos de 1,8-cineol, enquanto os
metabólitos estão, provavelmente, envolvidos na ingestão crônica dessa droga.
Recentemente Neves e colaboradores (2007) também fizeram estudo com o 1,8-cineol
sobre o volume gástrico e parâmetros cardiovasculares (pressão arterial, pressão venosa
central e freqüência cardíaca). Eles utilizaram ratos Wistar machos mantidos em jejum por 24
h e as doses empregadas do composto foram de 1 a 3 mg/kg. Os pesquisadores encontraram
que o 1,8-cineol reduziu, de maneira dose-dependente, a pressão arterial e a freqüência
cardíaca, mas isso não acontece com a pressão venosa central.
Ainda neste estudo, foi investigado o efeito do 1,8-cineol sobre a motilidade intestinal
e os autores encontraram que essa substância foi capaz de aumentar, também de maneira
dose-dependente, o tônus estomacal, diminuindo, assim, a compliância gástrica. Os dados
apresentados neste estudo mostram que os efeitos do 1,8-cineol podem resultar de um reflexo
autonômico ou de uma ação direta deste óleo essencial no músculo liso intestinal, além do
que, quando há uma vagotomia bilateral, os efeitos do 1,8-cineol sobre a freqüência cardíaca e
pressão arterial cessam.
Santos e colaboradores (2004) propuseram um estudo para examinar a possível
influência da aplicação local do 1,8-cineol na colite aguda induzida por ácido trinitrobenzeno
sulfônico (TNFS) em ratos Wistar machos. Esses animais foram tratados com o 1,8-cineol
administrado por instilação intraretal nas doses de 200 e 400 mg/kg. Os resultados obtidos
10
mostraram que o 1,8-cineol possuiu efeitos preventivos na colite induzida pelo TNFS, como
verificado por seus efeitos nas mudanças macroscópicas, histológicas e bioquímicas do tecido.
O 1,8-cineol reduziu significantemente o peso úmido dos segmentos distais do cólon e os
pontos de dano no cólon, comparados com o controle que recebeu apenas o veículo.
Santos e colaboradores (2004) documentaram que esse constituinte na concentração de
400 mg/kg foi capaz de reduzir a atividade da enzima mieloperoxidase, um marcador
bioquímico da infiltração de neutrófilos em tecidos danificados, bem como houve uma
notável depleção dos níveis da glutationa (GTN) nos tecidos do cólon. A redução da atividade
dessa enzima pode ser interpretada como uma manifestação da atividade antiinflamatória do
1,8-cineol e como a GTN é um dos mais abundantes antioxidantes intracelulares que possui
um papel essencial em proteger a célula de danos oxidativos, os pesquisadores concluíram
que o tratamento com 1,8-cineol melhorou o balanço oxidativo colônico nos animais com
colite, pois ele foi capaz de reduzir a atividade da mieloperoxidase e os níveis teciduais da
GTN.
Já Santos e Rao (2001) investigaram o efeito protetor do 1,8-cineol sobre o sistema
gastrointestinal e os possíveis mecanismos envolvidos nessa proteção. Para isto eles
utilizaram ratos Wistar machos e induziram danos na mucosa gástrica através da ingestão
intragástrica de etanol (1 ml/rato). As doses de 1,8-cineol, também administradas de forma
oral, foram 25, 50, 100 e 200 mg/kg e após 60 min da ingestão do etanol os ratos foram
sacrificados e seus estômagos retirados para análises.
Os pesquisadores encontraram que o 1,8-cineol ofereceu prevenção do dano gástrico
induzido pelo etanol nas doses de 50 a 200 mg/kg de maneira similar ao ácido
nordihidroguaiarético (um inibidor da lipooxigenase). Como essas doses são relativamente
pequenas, eles ainda levantam a hipótese de que esse composto seja um inibidor preferencial
da enzima lipooxigenase. Ainda mais, foi estudado se o efeito gastroprotetor do 1,8-cineol foi
devido à liberação endógena de adenosina e óxido nítrico, com a utilização de um antagonista
da adenosina (PT-8) e de um inibidor da óxido nítrico sintase dependente de cálcio, a l-nitro-
arginina-metil-éster (L-NAME).
Como resultado, nenhum destes compostos modificou a resposta do 1,8-cineol no
dano gastrointestinal, sugerindo que nem a adenosina nem o óxido nítrico participam do efeito
gastroprotetor.
11
1.5 Efeito do 1,8-Cineol sobre o Sistema Cardiovascular e Metabolismo Ósseo
Soares e colaboradores (2005) desenvolveram um estudo sobre a ação do 1,8-cineol
sobre a atividade contrátil dos músculos papilares cardíacos em ratos Wistar machos. Os
parâmetros de força isométrica de pico, tempo gasto até alcançar a tensão de pico, tempo de
relaxamento foram determinados na presença e ausência do 1,8-cineol, no intervalo de
concentrações de 0,003 mM a 0,5 mM.
Como resultados, o 1,8-cineol reduziu a força de maneira dose-dependente, com
redução de 50% da força de contração na concentração de 0,3 mM. Os outros parâmetros
também foram reduzidos de maneira dose-dependente. Como o desenvolvimento da força
depende da concentração de cálcio extracelular, os pesquisadores avaliaram a força na
presença e ausência do composto a diferentes concentrações de cálcio extracelular (0,62 mM
a 5 mM). Contudo, o 1,8-cineol não reduziu a força de contração em resposta ao aumento de
força devido ao aumento da concentração de cálcio extracelular. Ainda mais, contrações
tetânicas foram iniciadas a partir do uso de 5 mM de cafeína e após 20 min da exposição ao
1,8-cineol (na concentração de 0,3 mM), houve redução da força isométrica. Portanto, no
estudo de Soares e colaboradores (2005) o 1,8-cineol reduziu a contratilidade miocárdica de
maneira dependente de concentração e ainda possuiu efeito depressor das contrações tetânicas
sem redução da miosina ATPase.
Diversos ingredientes da dieta humana estão relacionados com a inibição da
reabsorção óssea, como vegetais comuns, saladas e ervas. Como os monoterpenos estão
distribuídos amplamente no reino das plantas e em algumas ervas que são comumente
utilizadas na nutrição humana, Mühlbauer e colaboradores (2003) resolveram investigar
diversos óleos essenciais, ervas e seus constituintes sobre seus efeitos no metabolismo ósseo.
O 1,8-cineol e outros compostos foram misturados com a comida úmida dos ratos em
quantidades diárias por rato.
Para o monitoramento da reabsorção óssea a substância tetraciclina
3
H foi injetada em
ratos machos recém-nascidos desde a 1ª semana de vida até a 6ª semana, pois essa substância
é depositada nos ossos e liberada quando o osso é reabsorvido. Assim, a medida dessa
tetraciclina foi monitorada diariamente através da excreção de
3
H na urina. Uma mistura de
quatro monoterpenos em 200 mg de óleo de folhas secas (128 mg, composta de 80 mg de
thujone, 24 mg de 1,8-cineol, 14 mg de cânfora e 10 mg de borneol) inibiu a reabsorção óssea
12
por 26 ± 5%. Utilizando apenas os constituintes thujone, eucaliptol e cânfora nas mesmas
doses acima (80 mg, 24 mg e 14 mg respectivamente), a inibição também foi significativa.
Para saber se os monoterpenos agem diretamente sobre as células ósseas, os autores
investigaram os efeitos desses terpenos na reabsorção in vitro em células de osteoclastos
isolados. A atividade de reabsorção foi diminuída significantemente nas culturas com o timol,
borneol e cânfora (na concentração de 1 mM). Já outros monoterpenos, incluindo o 1,8-cineol,
não se mostraram ativos in vitro nessa concentração. Assim, como mostrado pelos
pesquisadores, os compostos borneol, timol e cânfora inibiram a reabsorção óssea atuando
diretamente nas células ósseas e não indiretamente, por exemplo, influenciando os hormônios
calciotrópicos ou estimulando a absorção de cálcio intestinal.
1.6 Efeito do 1,8-Cineol sobre os Parâmetros Eletrofisiológicos
Grande parte dos trabalhos presentes na literatura utiliza o 1,8-cineol como uma
substância para deflagrar reações em neurônios receptores olfatórios e poucos trabalhos
mencionam a ação do 1,8-cineol sobre os parâmetros eletrofisiológicos de células neuronais.
Uma exceção é o trabalho de Lima-Accioly e colaboradores (2006), que estudaram os efeitos
do 1,8-cineol sobre a excitabilidade das células nervosas. Eles utilizaram ratos Wistar machos
de onde retiraram o nervo ciático e o colocaram em uma câmara de mistura (câmara de
Harvard) para estimulá-lo com a presença e ausência do 1,8-cineol. Nesse tipo de preparação,
eles tentaram investigar qual a ação desse composto, nas concentrações de 1 a 8 mM, sobre
parâmetros do Potencial de Ação Composto (PAC), tais como a amplitude pico-a-pico,
velocidade de condução nervosa, cronaxia e reobase.
Esses pesquisadores encontraram que a baixas concentrações de 1,8-cineol (1 e 2 mM)
não houve efeito significante nos parâmetros do PAC. Entretanto, para concentrações
maiores, houve uma progressiva e significante alteração dos parâmetros que foram revertidos
a seus valores iniciais (controle) após 180 min de lavagem da preparação. Nas concentrações
de 4 mM, 6 mM e 8 mM houve redução da amplitude pico-a-pico de 76,5 ± 4,4%, 70,0 ± 3,9
% e 14,8 ± 4,1% em relação ao controle, respectivamente. Esse efeito também foi verificado
na velocidade de condução nervosa na concentração de 6mM e 8mM com redução de 86,4 ±
4,5% e 76,1 ± 5,2% em relação ao controle, respectivamente. A cronaxia e a reobase também
13
foram investigadas e os pesquisadores encontraram um aumento desses parâmetros a partir de
90min de exposição à droga na concentração de 8mM.
Assim, de acordo com os autores, as alterações observadas nos parâmetros do PAC
neste estudo (amplitude pico-a-pico, velocidade de condução nervosa, cronaxia e reobase)
mostraram que o 1,8-cineol bloqueou a excitabilidade nervosa no nervo ciático de ratos e que
essas modificações indicam uma dependência de ativação de canais para sódio, seja de
maneira direita ou indireta, tais como despolarização da membrana ou bloqueio do
metabolismo do axônio.
Chen e colaboradores (2006) desenvolveram um trabalho de investigação sobre os
canais ativados por nucleotídeos cíclicos (CNGC) participantes da transdução da informação
olfatória e a ação de odorantes (isoanil acetato, anisol, 1,8-cineol e limoneno) sobre a
modulação destes canais. Como a aplicação destes compostos odorantes em células nativas
inevitavelmente influencia a atividade de todas as moléculas sinalizadoras, esses
pesquisadores utilizaram um sistema de expressão heteróloga, onde algumas subunidades do
CNGC foram expressas em oócitos de Xenopus, mas também os neurônios receptores
olfatórios de ratos foram dissociados.
Na situação onde havia apenas o canal ativado por nucleotídeos cíclicos (oócitos de
Xenopus), o 1,8-cineol e os outros compostos inibiram a ação do canal, entretanto com uma
potência de inibição menor se comparado com os neurônios nativos. O canal formado
somente pela subunidade CNGA2 foi menos sensível a esses compostos do que quando essa
subunidade foi expressa junto com CNGA4 e CNGB1. Essas duas últimas subunidades são
importantes, pois elas estão ligadas às propriedades do canal, tais como aumento na
permeabilidade ao cálcio e a velocidade da modulação do canal pelo complexo cálcio-
calmodulina.
De acordo com os autores, o arranjo assimétrico das quatro subunidades do CNGC
pode possibilitar que a ativação do canal seja alterada devido a uma distorção na bicamada
lipídica da membrana, pois a concentração efetiva desses odorantes, neste trabalho, é muito
alta (~5 a 10 mM), dentro da ordem de grandeza de concentração que provoca quebra da
membrana do oócito. A corrente induzida por odorantes nos neurônios olfatórios é conhecida
por ter duas componentes: uma componente através dos CNGC e outra a partir dos canais de
cloreto ativados por cálcio. Os íons cálcio fluem através dos CNGC que abrem os canais de
cloreto ativados por cálcio. Assim, a aparente inibição observada nos neurônios olfatórios,
14
pode ser resultado do desaparecimento dessa corrente de cloreto devido a um fechamento dos
CNGC.
Zufall e colaboradores (2000) fizeram um minucioso trabalho a cerca da amplificação
dos transientes de cálcio, induzidos por substâncias odorantes, devido à liberação desse íon e
seu papel na transdução do sinal olfatório nos neurônios olfatórios receptores da salamandra.
Eles dissociaram esses neurônios do epitélio nasal desses animais adultos, perfizeram testes
eletrofisiológicos (tanto em clampeamento de corrente como de voltagem) e de quantidade de
cálcio (imagens de microscopia confocal) e a substância odorante utilizada foi o 1,8-cineol na
concentração de 300 µM.
Como resultados, quando o tecido foi exposto ao 1,8-cineol na concentração
mencionada por 1 s, ele teve efeito similar ao inibidor da fosfodiesterase, o 3-isobutil-1-
metilxantina (IBMX). Essa substância é conhecida por estimular a via da adenosina
monofosfato cíclica (cAMP) sensível à substâncias odorantes, causando abertura dos CNGC e
permitir a entrada de cálcio.
Combinando essas duas técnicas (eletrofisiologia e imagem de microscopia confocal)
esses pesquisadores encontraram que esses tipos de neurônios possuem uma reserva de cálcio
que pode ser liberada no repouso aplicando a substância tapsigargina (um inibidor de uma
enzima chamada SERCA, que capta o cálcio citosólico e o guarda nas reservas do retículo
endoplasmático), além de que essas reservas estão compartimentadas nos neurônios olfatórios
receptores. Além do mais, os dados obtidos pelos autores fornecem evidências da
contribuição significativa da liberação de cálcio a partir as reservas sensíveis à tapsigargina
iniciados por estímulo de substâncias odorantes.
Reiserts e Matthews (2001) também investigaram o uso do 1,8-cineol, (nas
concentrações de 10, 30, 100 e 300µM), nos disparos de Potenciais de Ação (PA) e nas
respostas da corrente receptora. Eles utilizaram a técnica de pipeta de sucção, considerada não
invasiva e que fornece registros estáveis por um longo período de tempo, para determinação
desses parâmetros nas células dos receptores olfatórios isolados de ratos.
Esses pesquisadores encontraram que quando as células eram expostas a um pulso
breve de 1,8-cineol (1 s), uma grande corrente receptora foi detectada (a partir da
concentração de 30 µM) acompanhada, durante a fase de ascensão dessa corrente, por curtos
disparos de correntes de alta freqüência. Na concentração mais alta (300 µM) a forma de onda
da corrente receptora desenvolvia um pico inicial, seguido de uma fase de platô. A freqüência
15
de disparos variou gradualmente com o aumento de concentração da droga, chegando até
mesmo próximo a níveis de saturação.
Eles também fizeram experimentos com exposição prolongada de 1,8-cineol (30 a 60
s). Na concentração de 10 µM, para essa exposição prolongada de droga, houve disparos de
potenciais esporádicos durante o período de estimulação com o constituinte. Já nas
concentrações de 100 µM e 300 µM nenhum PA foi evocado devido ao aumento transiente da
corrente receptora.
Os pesquisadores notaram que a exposição a níveis baixos de 1,8-cineol iniciou tanto
disparo de PA de alta freqüência como nenhuma resposta, de forma que freqüências
intermediárias não foram encontradas. Essa tendência dos disparos de potenciais foi
acentuada pelo colapso progressivo na amplitude dos picos dos potenciais. Esse efeito,
provavelmente, resultou da progressiva e completa inativação dos canais para sódio
dependentes de voltagem.
Os autores ainda expuseram o tecido a baixas concentrações de sódio extracelular
ainda sobre o estímulo do 1,8-cineol, de forma que a corrente receptora não foi abruptamente
reduzida. Eles citam que, como essa corrente não foi bastante reduzida, outro íon pode estar
atuando como, por exemplo, o cloreto. Nessas condições, para o cloreto agir, é necessário que
os canais de cloreto ativados por cálcio estejam abertos e que as concentrações de cálcio
dentro da célula permaneçam elevadas. Assim, os pesquisadores propõem que deva existir um
mecanismo trocador de sódio-cálcio nesse tipo de célula e que esse trocador possui um papel
importante na saída do cálcio que entra através dos CNGC durante as respostas às substâncias
odorantes.
1.7 Características do PA nos Neurônios do Gânglio Cervical Superior
O PA pode ser entendido como uma variação abrupta do potencial transmembrana
(V
m
) celular e que se propaga para todas as regiões de uma célula excitável. Essa variação
abrupta se dá, explicado no momento de forma simplória, pela entrada ou saída de íons da
célula. Esses íons movem-se através dos seus gradientes de concentração e conseguem
atravessar a membrana celular devido a estruturas chamadas de canais iônicos. Estes canais
possuem uma característica de seletividade, onde um íon atravessa suas estruturas mais
facilmente que outro íon e, em eletrofisiologia, estes canais são representados como
16
condutâncias. Assim, os canais para sódio são estruturas que permitem, principalmente, a
passagem de íons sódio. É bem verdade que outros íons (como o potássio) podem atravessar
esse canal, mas a sua quantidade em comparação ao íon preponderante é ínfima. Portanto,
temos as condutâncias ao íon sódio, potássio, cloreto etc. Essas condutâncias possuem
propriedades particulares. A condutância ao íon sódio possui características diversas da
condutância ao íon potássio e ainda é comum encontrar diferenças entre canais que são
permeáveis ao mesmo íon.
O modelo de geração de PA em células excitáveis, como os neurônios, utiliza diversas
condutâncias. Uma descrição clássica e apropriada da geração e propagação dos PA é
encontrada em um artigo de Hodgkin & Huxley (1952), onde eles estudaram o
comportamento elétrico da membrana do nervo gigante da lula. Eles propuseram um análogo
elétrico à membrana celular onde esta continha condutâncias, que representavam os canais
iônicos, fontes de tensão (ou voltagem), que representavam os potenciais de Nernst para os
íons respectivos, e um capacitor, representando a membrana celular. Todos esses elementos
estão mostrados na Figura 02.
Figura 02: Circuito elétrico representando a membrana celular no modelo de Hodgkin e
Huxley. As condutâncias estão representadas por g
Na
= 1/R
Na
, g
K
= 1/R
K
e g
leak
= 1/R
L
e os
potenciais de Nernst logo abaixo das condutâncias no circuito (adaptado de Hodgkin &
Huxley, 1952, Fig. 01).
Nesse modelo, a corrente iônica total que atravessa a membrana é dividida em três
componentes: uma associada aos íons sódio, outra associada aos íons potássio (g
Na
e g
K
representado na figura 02, respectivamente) e uma pequena corrente chamada de vazamento
(leakage) formada pela reunião dos íons cloreto e outros íons (g
leak
na figura 02). Eles também
propuseram um modelo matemático que descreve o curso temporal desse PA, composto por
17
diversas equações diferenciais. Eles concluíram que as respostas de um axônio gigante de lula
isolado a estímulos elétricos são devidas a alterações reversíveis nas permeabilidades ao sódio
e potássio, deflagradas por mudanças no V
m
.
O modelo de Hodgkin & Huxley (H-H) ainda é muito utilizado para representar outros
modelos de células excitáveis em diversos organismos e estruturas. No Gânglio Cervical
Ssuperior (GCS), existem diversos trabalhos sobre as condutâncias envolvidas na geração do
PA e todos eles utilizam como base o modelo de H-H com suas condutâncias e potenciais de
Nernst característicos. As condutâncias presentes no GCS definem correntes iônicas com
características distintas, mesmo entre canais que permitem a passagem do mesmo íon, como
citado anteriormente. Assim, diversas correntes estão associadas ao PA no GCS de ratos.
1.7.1 Os Canais para Sódio
O papel biológico relativamente simples da corrente de íons sódio (I
Na
) é gerar, nas
células excitáveis, a rápida ascensão do PA. Os mecanismos de ativação e inativação dessa
corrente foram estudados por Belluzzi & Sacchi (1986). Eles utilizaram os neurônios
simpáticos do GCS de ratos e encontraram que a cinética de ativação e inativação
(representado pela letra m e h, respectivamente) da I
Na
podem ser aproximados ao formalismo
m
3
h utilizado por Hodkgkin e Huxley (1952) no axônio gigante da lula. A faixa de voltagens
da componente cinética de ativação dessa corrente (m) está em torno de -50 mV e -40 mV,
chegando ao seu valor máximo (aproximadamente 1) entre -10 mV e 0 mV. Já a faixa de
voltagens da componente cinética da inativação (h) está em torno de -80 mV a -40 mV. Essas
faixas de voltagem e componentes cinéticas de ativação e inativação estão mostradas na figura
03.
18
(a) (b)
Potencial (mV)
-60 -30 0 30
0,0
0,1
0,2
0,3
Cinética de ativação m
0,0
0,5
1,0
Potencial (mV)
-100 -50 0
Cinética de ativação h
0,0
0,5
1,0
Constante temporal h (ms)
0
5
10
15
20
25
Constante temporal m (ms)
Figura 03: Valores de repouso das variáveis m e h e suas respectivas constantes
temporais como função do potencial de membrana. Em (a) a linha contínua representa a
cinética de ativação da componente m e a linha tracejada a constante temporal m. Em (b) a
linha contínua representa a cinética de ativação da componente h e a linha tracejada a
constante temporal h.
Uma característica de destaque do trabalho de Belluzzi & Sacchi (1986) foi o fato dos
autores conseguirem isolar e caracterizar duas componentes da I
Na
nas células nervosas do
GCS. Eles encontraram que existem duas classes de inativação que definem duas
componentes na condutância ao sódio: uma inativação rápida (chamada de g
Naf
) e uma
inativação lenta (chamada de g
Nas
). Esta última funciona como amplificador dos efeitos de
despolarização da corrente de I
Na
e os valores destas condutâncias são, de acordo com Sacchi
e colaboradores (1998), 9,28 µS e 7,43 µS para a g
Naf
e g
Nas,
respectivamente.
1.7.2 Os Canais para Potássio
No GCS existem cinco tipos de correntes que transportam íons potássio e estão
relacionadas ao PA: a corrente retificadora retardada (I
KV
), a corrente A (I
A
), a corrente M
(I
M
), a corrente pós-hiperpolarização (I
AHP
) e a corrente de potássio dependente de cálcio
(I
KCa
).
A corrente retificadora retardada dependente de voltagem (I
KV
) é ativada em V
m
mais
positivos do que -40 mV, aumenta em amplitude com o aumento da despolarização e a
condutância associada a essa corrente alcança os valores de saturação em torno de +20 mV.
19
Entretanto a I
KV
declina em despolarizações prolongadas, com um desenvolvimento desse
declínio mais lento se comparado com a sua ascensão. Mesmo com esse declínio, essa
corrente não possui inativação aparente (e se possui, a constante de tempo da inativação é
muito longa) e o curso temporal dessa ativação pode ser descrito por uma cinética de primeira
ordem (n) de acordo com o formalismo de Hodgkin & Huxley (BELLUZZI et al., 1985a).
De acordo com Belluzzi e colaboradores (1985b) a corrente A (I
A
) é caracterizada
como uma corrente transiente e considerada uma característica estável das membranas
excitáveis (assim como a I
KV
). As características dessa corrente são: completa inativação em
valores de potencial próximos ao potencial de repouso celular; quando há uma remoção da
inativação, há uma modesta repolarização da membrana; quando há a ativação da I
A
devido a
despolarização, também há uma subseqüente inativação exponencial logo em seguida.
A I
A
é ativada em V
m
mais positivos que -60 mV e sua amplitude também aumenta
com o aumento da despolarização, alcançando o pico em 1 a 2,5ms e subseqüentemente
decaindo para zero com um curso temporal exponencial, como já citado anteriormente. O
desenvolvimento e a remoção da inativação da I
A
também seguem um curso temporal
exponencial de maneira dependente de voltagem na faixa de -100 mV e -40 mV. Assim, ainda
como citam Belluzzi e colaboradores (1985b), aproximadamente 50% dos canais que
conduzem essa corrente estão disponíveis no potencial de repouso fisiológico, mas não existe
um conceito unificado que defina seu papel funcional. As funções dessa corrente vão desde
controle da latência dos disparos de PA, modulação das trajetórias dos PA “anode break”,
controle dos disparos repetitivos e modulação da amplitude dos potenciais pós-sinápticos
(GALVAN & SEDLMEIR, 1984).
A corrente M (I
M
) é formada, também, por íons potássio, ativada e desativada
lentamente, e não possui mecanismo de inativação. Essa corrente está ligada ao controle da
geração de PA, pois ela atua na repolarização da membrana celular em direção ao valor de
repouso do V
m
. Além do mais, a inibição da I
M
resulta em pequena despolarização, aumento
da resistência da membrana e aumento na excitabilidade celular (IKEDA E
KAMMERMEIER, 2002). A I
M
é ativada em valores de potenciais mais positivos do que -60
mV e a condutância associada a essa corrente chega à saturação em aproximadamente -30
mV. Wang & McKinnon (1995) estudaram as correntes de potássio nas células do GCS e
encontraram que a ausência ou a presença da I
M
determina se uma célula responde de modo
fásico ou tônico a um estímulo persistente despolarizante, pois essa corrente foi encontrada,
exclusivamente, nos neurônios que responderam de modo fásico.
20
Duas correntes iônicas que transportam íons potássio são reguladas pelo íon cálcio: a
corrente pós-hiperpolarização (I
AHP
) e a corrente de potássio dependente de cálcio (I
KCa
).
A I
AHP
possui a característica de duração prolongada logo após a geração de um PA.
Ela é uma corrente independente da voltagem, ativada por pulsos despolarizantes de alta
duração e amplitude, mas que possui dependência do íon cálcio que permeia a célula. Sacchi e
colaboradores (1995), mostraram que quando a I
Ca
era aumentada, seja pelo aumento do nível
de despolarização ou pelo aumento do período de entrada do cálcio, havia um aumento
correspondente da I
AHP
e uma entrada de 1,7×10
7
íons de cálcio era necessária para uma
ativação significante da condutância associada a essa corrente. A sua amplitude decresce
linearmente com a hiperpolarização da membrana celular e ela é quase completamente
abolida em valores de potencial próximos ao potencial de Nernst para o íon potássio.
Já a corrente de potássio dependente de cálcio (I
KCa
), foi estudada por Belluzzi &
Sacchi (1990). Seus dados apresentam a existência de duas componentes da I
KCa
: uma
componente nomeada de rápida e outra de lenta. Estas componentes são ativadas por
despolarização após -30 mV, mas a faixa de voltagens onde elas estão ativas é muito restrita.
As variáveis cinéticas de ativação tanto da componente rápida como da lenta (denominadas de
kcf e kcs) alcançam o valor máximo logo após 0 mV, como pode ser visto na Figura 4.
Potencial (mV)
-60 -40 -20 0 20
Constante temporal kcf (ms)
1
2
3
4
Cinética de ativação kcf
0,0
0,5
1,0
Potencial (mV)
-40 -20 0 20
Constante temporal kcs (mV)
0
100
200
300
400
500
Cinética de ativação kcs
0,0
0,5
1,0
(b) (a)
Figura 04: Valores de repouso das variáveis kcf e kcs e suas respectivas constantes
temporais como função do potencial de membrana. Em (a) a linha contínua representa a
cinética de ativação da componente kcf e a linha tracejada a constante temporal kcf. Em (b) a
linha contínua representa a cinética de ativação da componente kcs e a linha tracejada a
constante temporal kcs.
Os autores ainda destacam no trabalho que a I
Ca
e a I
KCa
compartilham a mesma
dependência de voltagem e que ambas dependem da concentração de cálcio extracelular.
21
Devido a essa dependência de cálcio, a sua ativação se inicia com um atraso de 0,4 a 0,7 ms
em relação à I
Ca
, o que corresponde a uma entrada no neurônio de, aproximadamente, 3×10
5
íons de cálcio, necessário para ativar essa corrente (SACCHI et al., 1998).
1.7.3 Os Canais para Cálcio
Beluzzi & Sacchi (1989), fizeram um estudo sobre as correntes de cálcio (I
Ca
) nos
neurônios do GCS. Eles encontraram evidências da presença de duas componentes da
macrocorrente I
Ca
: uma componente com inativação e outra componente de repouso tardia que
exibe uma dependência diferenciada quando um potencial é imposto à célula (clampeamento
do potencial de repouso). Em condições de inibição do movimento dos íons Na
+
e K
+
, essa I
Ca
é iniciada a partir de despolarizações em torno de -30 mV. A I
Ca
alcança sua amplitude
máxima entre 0 e +10 mV em 2 a 3 ms e após, decai virtualmente para zero se for mantida
uma despolarização. Essa fase de decaimento indica o processo de inativação dessa corrente e
ela ocorre durante o funcionamento normal do neurônio.
Em muitos tipos de neurônios, os canais para cálcio regulados por voltagem podem ser
classificados no tipos L, N, P, Q e R e essa classificação advém da sensibilidade destes canais
a diferentes agentes bloqueadores, como as dihidropiridinas (bloqueadoras dos canais tipo L)
ou as toxinas da família da agatoxina (bloqueadora dos canais do tipo P e Q). Martínez-Pinna
e colaboradores (2002) encontraram em experimentos utilizando neurônios intactos do GCS
de ratos que todos os subtipos de canais existem neste tecido e que eles contribuem para a
corrente total de Ca
2+
, tanto na resposta a pulsos despolarizantes como na própria constituição
do PA. Ainda mais, os autores também propõem que os canais do tipo L, N e R contribuem de
maneira significativa para a corrente total, enquanto uma pequena componente da corrente
flui pelos canais do tipo P e Q.
1.7.4 Os Canais para Cloreto
Os canais para cloreto atualmente recebem muita atenção. Até pouco tempo, as
condutâncias que transportavam esse íon eram incluídas, junto com outras condutâncias, na
classe de condutâncias de vazamento. Entretanto, esse tipo de canal apresenta diversas
22
características e peculiaridades. Clark e colaboradores (1998) investigaram a possível
existência de uma corrente retificadora de cloreto ativada por hiperpolarização nos neurônios
dissociados do GCS de ratos. Eles encontraram que essa corrente existe neste tipo de tecido e
que é ativada em potenciais mais negativos do que -30 mV. Além do mais, essa corrente foi
bloqueada pela aplicação externa de cádmio ou zinco, da mesma maneira que a corrente de
cloreto ClC-2 expressa nos oócitos do Xenopus. Os pesquisadores ainda demonstraram a
presença do mRNA dos canais ClC-2 nos neurônios do GCS, a partir dos experimentos com
reação em cadeia da transcriptase-polimerase reversa, sugerindo que estes canais podem
funcionalmente ser expressos nessas células.
Com relação às propriedades desta condutância, ela apresenta uma dependência de
voltagem na faixa de -40 mV a -120 mV, como citado anteriormente, e Sacchi e
colaboradores (2003) mostraram também outras características. Eles demonstraram que
existem mecanismos que controlam a condutância do cloreto e que estão ativos na região do
potencial de membrana onde o neurônio é considerado passivo. Outra característica crucial é a
dependência de atividade neuronal prévia, isto é, a condutância do cloreto varia se
anteriormente a célula fosse estimulada. Portanto, de acordo com o trabalho dos autores, as
condutâncias do cloreto são diferentes se a célula foi estimulada previamente. Contudo, a
resposta a esse comportamento foi explicada em um trabalho posterior. Sacchi e
colaboradores (2007) observaram que a condutância ao cloreto variava de 20 a 33 µS após
disparos de PA. Ainda mais, com a depleção do sódio intracelular e seu sucessivo
restauramento por ionoforese, o neurônio foi levado de um estado estável de baixa
condutância ao cloreto para uma alta condutância (isto é, uma maior sensibilização dessa
condutância). A sensibilização da condutância ao cloreto foi ausente na concentração
intracelular de sódio ([Na]
i
) igual a zero, desenvolveu-se bem (com valor de condutância
chegando a 20 µS) com [Na]
i
igual a 15 mM e tendeu a valores de saturação (em torno de 60
µS) para valores maiores da [Na]
i
. Assim, de acordo com o trabalho de Sacchi e
colaboradores (2007), sob condições fisiológicas o disparo de PA e os períodos de silêncio
(onde não há resposta da célula) podem continuamente modular o grau de sensibilização da
condutância ao cloreto. Isto pode influenciar o controle do potencial de membrana natural
mediado pela condutância ao cloreto, resultando em um contínuo ajuste da excitabilidade
neuronal.
23
1.8 Justificativa e Relevância do Estudo
O 1,8-cineol mostra-se um constituinte com ação distinta e peculiar em diversos
tecidos biológicos. Esse composto é encontrado em óleos essenciais de diversas plantas, com
muitos usos terapêuticos já citados. Entretanto, para a grande maioria das plantas, não existem
dados que confirmem cientificamente a sua utilidade terapêutica. É difícil encontrar na
literatura científica estudos que relacionem a ação tanto de óleos essenciais como de seus
constituintes sobre preparações do sistema nervoso e, até o momento, não foram encontrados
trabalhos que relatem a utilização da técnica do microeletrodo intracelular na investigação dos
efeitos destes constituintes em tecidos biológicos. Exceto pelos trabalhos que utilizam o 1,8-
cineol para deflagrar PA nos neurônios receptores olfatórios, outros trabalhos visam apenas
avaliar parâmetros comportamentais que compreendam mecanismos do sistema nervoso.
Portanto, é com o intuito de disponibilizar mais dados da ação do 1,8-cineol sobre o sistema
nervoso, que resolvemos investigar a ação deste composto sobre os parâmetros
eletrofisiológicos das preparações intactas dos neurônios do GCS de ratos.
24
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivos Gerais
Este trabalho tem como objetivo estudar os efeitos do 1,8-Cineol sobre parâmetros
eletrofisiológicos, bem como sobre a excitabilidade celular, em preparações intactas de
células nervosas do GCS de ratos.
2.2 Objetivos Específicos
• Demonstrar a ação do 1,8-Cineol nas concentrações de 6mM, 1mM e 0,1mM
sobre o curso temporal do PA;
• Determinar as alterações nos parâmetros associados ao PA, como amplitude,
inclinação máxima do ramo ascendente e descendente e duração do PA;
• Determinar as alterações dos parâmetros resistência de entrada da membrana
celular e potencial de repouso das células nervosas nestas concentrações;
• Elucidar os possíveis mecanismos de ação desse óleo sobre a excitabilidade
elétrica nas células nervosas desse tecido.
25
3. METODOLOGIA
3.1 Preparo das Soluções e Drogas
A solução de Locke foi utilizada como solução nutritiva do tecido e possuía a seguinte
composição com concentrações em mM: NaCl 136; KCl 5,0; MgCl
2
0,98; NaH
2
PO
4
0,36;
NaHCO
3
11,9; CaCl
2
2,0 e glicose 5,0. Essa solução teve seu pH ajustado para 7,4. O preparo
da solução contendo o 1,8-Cineol se deu através da diluição desse composto em
Dimetilsulfóxido (DMSO), a 0,2% da solução total, e em solução de Locke. As concentrações
de 1,8-Cineol utilizadas neste estudo foram 6 mM, 1 mM e 0,1 mM. Os experimentos foram
realizados sob temperatura controlada entre 18 e 22°C no laboratório de eletrofisiologia do
Instituto Superior de Ciências Biomédicas (ISCB) da Universidade Estadual do Ceará
(UECE). Todos os sais e drogas utilizados foram de grau de pureza analítica e adquiridos da
Sigma Chemical (St Louis, MO, EUA) ou da Reagem (Rio de Janeiro, BRASIL).
3.2 Animais e Tecidos
Foram utilizados ratos (Rattus novergicus) albinos adultos, variedade Wistar, com
massa corporal entre 200 e 350 g, provenientes do biotério do ISCB da UECE. Os animais
foram mantidos em caixas de propileno à temperatura de 26 ± 2 ºC, com livre acesso a água e
ração. Os experimentos foram realizados obedecendo aos padrões éticos de manipulação e
utilização de animais experimentais estabelecidos pelo Comitê de Ética de Utilização de
Animais da UECE (número do protocolo: 06379067-0).
3.2.1 Gânglio Cervical Superior
Os animais foram sacrificados por concussão cerebral e em seguida medida a sua
massa. A dissecação cirúrgica foi realizada através de uma incisão longitudinal da pele na
face ventral do pescoço, seguida da remoção das glândulas, músculos e tecido adiposo para a
localização da traquéia e do ramo da artéria carótida que irriga o pescoço e a cabeça, pois
26
estas estruturas servem como referencia para a localização dos GCS. Os GCS são
relativamente discretos em ratos, podendo ser identificados para sua dissecação e estão
posicionados na região onde a artéria carótida inicia sua bifurcação. Tanto o gânglio direito
como o esquerdo foram rapidamente retirados e depositados em uma placa de Petri contendo
solução Locke para permitir o seu fácil manuseio para eliminação de tecidos anexos e da
cápsula de tecido conjuntivo que o reveste. Os gânglios foram utilizados em experimentos no
mesmo dia ou permaneceram sob refrigeração (~4 ºC) por um período não maior que 24 h.
Não se observou alteração nos parâmetros eletrofisiológicos com a manutenção do tecido
nessas condições (seja ele utilizado prontamente ou após 24 h de sua dissecação).
Após os procedimentos acima descritos, o tecido foi transferido para uma câmara de
acrílico com fundo Silgard®, especialmente projetada para permitir a superfusão desse tecido.
Sua fixação ao fundo da câmara foi possível com o emprego de microalfinetes inoxidáveis,
tomando o cuidado de prendê-lo pelas extensões pré e pós-ganglionar. Para evitar que o
gânglio fosse empurrado pelo microeletrodo durante o impalamento das células,
microalfinetes foram colocados nas laterais do tecido, não o perfurando, mas atuando como
um esbarro.
A superfusão do tecido foi realizada por meio de fluxo mantido por gravidade,
ajustado entre 1 e 1,5 ml/min, com solução de Locke. Para minimizar os efeitos de
capacitância do eletrodo, o nível de líquido da câmara foi controlado na menor altura possível
acima da superfície do gânglio.
Para a fixação do GCS e observação dos procedimentos de impalamento, a câmara foi
montada em uma lupa (modelo COLLEGE STEREO, MLW Intermed, Schöneiche,
Alemanha), com ampliação máxima de 40×. Em particular, a ampliação de 20× foi suficiente
para a execução desses procedimentos. A movimentação do microeletrodo, bem como o
impalamento das células, foi feita com um micromanipulador hidráulico (modelo MWO-3,
Narishige International Inc., Long Island, NY, EUA).
As soluções para a superfusão foram colocadas em frascos mariote e conectadas à
câmara por meio de cânulas e válvulas three-way, que permitiram a troca de soluções com
rapidez e sem descontinuidade de fluxo. As montagens das conexões e frascos foram
otimizadas de forma a reduzir as distâncias entre os locais onde estavam as soluções e a
câmara, com o intuito de diminuir o lapso de tempo entre a abertura da válvula e o início da
exposição do tecido às outras soluções.
27
28
Para a retirada de líquido da câmara foi utilizada uma bomba de infusão, com uma de
suas extremidades conectada a um estreito tubo (para agir como um sugador de líquido) e a
outra a um depósito de descarte de solução. Essa montagem foi instalada fora do local onde
estava a câmara, para evitar a adição de vibração ao sistema. Por fim, a solução que fica na
câmara considerada como meio extracelular foi aterrada e, portanto, atribuído valor do
potencial igual a zero.
3.3 Medidas Eletrofisiológicas
Os registros eletrofisiológicos foram feitos utilizando a técnica do microeletrodo
intracelular, no modo de clampeamento de corrente (current clamp). Neste modo há a fixação
do valor da corrente a ser injetada por essa técnica de forma a medir as variações de potencial
advindo do sistema. Os potenciais transmembrana foram obtidos através do uso de
microeletrodos confeccionados com vidro do tipo borossilicato (diâmetro externo e interno
1,0 e 0,5 mm, respectivamente), apresentando resistências na faixa de 40 a 90 MΩ. Foi
utilizado um puxador de micropipetas (modelo P-97, Sutter Instrument, Novato, CA, EUA),
para a preparação desses microeletrodos e, como etapa posterior, o preenchimento de sua
cavidade interna com uma solução de 95% de potássio 3M e 5% de citrato de potássio. Para a
conversão de corrente iônica em corrente elétrica, essa solução é posta em contato com um fio
de prata, revestido com uma fina camada de cloreto de prata, conectado a um eletrômero
(modelo AXOCLAMP 2B, Axon Instruments, Foster City, CA, EUA). Este eletrômero possui
algumas saídas para o monitoramento dos sinais, onde foram conectados osciloscópios: um
para o monitoramento do V
m
e da corrente injetada (modelo 5111A, TEKTRONIX,
Beaverton, OR, EUA) e outro para monitoramento da carga e descarga do microeletrodo
(modelo HM303-6, HAMEG Instruments, Mainhausen, Alemanha). A aquisição dos registros
eletrofisiológicos foi feita através do uso de uma interface A/D (modelo DIGIDATA 1200,
Axon Intruments, Foster City, CA, EUA) controlada por um software (CLAMPEX, versão
6.0) e os dados armazenados em computador. A Figura 05 ilustra essa montagem.
(C)
(B)
A
(A)
Figura 05: Montagem do aparato experimental necessário para o registro dos parâmetros eletrofisiológicos descrito nesse trabalho. O
gânglio é fixado no fundo de uma câmara de acrílico (A), com Sylgard® e os dados dos parâmetros eletrofisiológicos são enviados para um
eletrômero (B). Este eletrômero possui saídas para o monitoramento dos sinais, onde foram conectados osciloscópios (D). A aquisição dos
registros eletrofisiológicos foi feita através do uso de uma interface analógico/digital (C) controlada por um software e os dados armazenados em
computador (E). Um gerador de sinais (F) foi acoplado ao sistema para determinar a freqüência com a qual os dados eram gerados e coletados.
29
(E)
(D)
(F)
Após o impalamento de uma célula, o V
m
foi considerado como sendo a deflexão
máxima de voltagem medida entre o valor do potencial na ponta do eletrodo e o valor do
potencial no meio extracelular (potencial nulo). Devido à diferença de mobilidade entre os
íons potássio e cloreto, freqüentemente havia a formação de um potencial de ponta no
eletrodo de forma que, nas análises, subtraiu-se do valor do potencial medido o valor do
potencial de ponta estabelecido. O valor desse potencial de ponta era verificado após a
retirada do microeletrodo da célula. Os sinais foram registrados ora pelo modo Bridge (com
freqüência de corte de 30 kHz), ora pelo modo descontínuo de clampeamento de corrente (do
inglês Discontinnuous Current Clamp [DCC], freqüência de amostragem de 1-2 kHz e
freqüência de corte de 3 kHz), pois o confronto dos dados desses dois modos permite uma
análise mais fidedigna dos parâmetros eletrofisiológicos.
3.4 Análise dos Dados e Estatística
A análise dos dados foi feita com os softwares Clampfit® (versão 8.1.0.12, Axon
Instruments) e Sigmaplot® (versão 9.01, Systat Software). As células foram consideradas
significativas nesse trabalho quando, ao final do período de estabilização (2,5 a 5 min), o
potencial de repouso apresentasse valor mais negativo que -40 mV e resistência de entrada da
membrana superior a 30 MΩ. Os resultados estão representados no formato média ± erro
padrão da média (e.p.m.), onde a variável n representa o número de experimentos feitos. Para
a comparação de dois grupos, utilizou-se o teste t de Student pareado e não pareado ou o teste
de Wilcoxon quando os dados não apresentaram normalidade de distribuição. Além do mais,
os testes de Análise de Variância (ANOVA) também foram executados sobre os grupos de
dados que apresentavam normalidade de distribuição e com valores iguais de variância, com a
utilização dos testes de comparação múltipla de Student-Newman-Keuls ou de Fisher. Já o
teste ANOVA de Kruskal-Wallis foi realizado quando estes dados possuíam diferentes
valores de variância ou não apresentavam normalidade de distribuição. Foram considerados
estatisticamente significantes os resultados que apresentaram a prevalência menor que 5%
(p<0,05).
30
3.4.1. Parâmetros Eletrofisiológicos
Os parâmetros eletrofisiológicos estudados neste trabalho foram: o potencial de
repouso celular, a resistência de entrada da membrana celular, o curso temporal da ação do
1,8-cineol sobre o PA, a amplitude do PA, a inclinação máxima da voltagem em relação ao
tempo (dv/dt
máx
) do ramo ascendente e descendente do PA e a duração desse potencial. Como
já citado, o potencial de repouso foi determinado como sendo uma deflexão estável do V
m
após o período de estabilização da célula. A resistência de membrana foi determinada pela lei
de ohm, V=R·i, onde V representa a diferença de voltagem entre o valor máximo alcançado
do potencial transmembrana devido à injeção de uma corrente e o potencial de repouso. O
decurso temporal do PA foi determinado através das sucessivas comparações entre os
traçados dos episódios sob a ação do 1,8-cineol e a amplitude desse potencial determinada
pela diferença entre o valor de pico e o potencial de repouso. As inclinações máximas dos
ramos ascendente e descendente foram determinadas pela razão entre a variação da voltagem
de dois pontos próximos e a variação de tempo entre esses dois pontos. Por fim, a duração do
PA foi determinada como o intervalo de tempo quando o potencial de ação, no ramo
ascendente e descendente, alcança 50% do valor de sua amplitude.
3.5 Protocolos Experimentais
Para o estudo da ação do 1,8-Cineol sobre a excitabilidade elétrica das células do GCS
foram utilizados dois protocolos experimentais distintos, mas apresentando pontos em
comum. Para os dois protocolos foi utilizado tanto o modo Bridge como o modo DCC e o
tempo entre os episódios (sweeps) eram de 1 s (freqüência de 1 Hz). Essa freqüência foi
determinada por um gerador de sinais que estava acoplado ao sistema, de forma que atuava
como um sincronizador desses equipamentos (também chamado de trigger). Portanto, os
protocolos podiam ser montados utilizando tanto comandos externos (através do gerador de
sinais, o trigger externo) como de comandos internos (através do uso do software no
computador, o trigger interno). O primeiro protocolo foi montado apenas com comandos
externos como demonstrado na figura 06. A duração total do episódio desse protocolo foi de
260 ms, com freqüência de amostragem de 20 kHz. A janela de pulso de corrente (tempo no
qual havia a injeção de corrente no sistema) tinha, aproximadamente, duração de 100 ms e
31
amplitude de -100 pA. Esse protocolo auxiliava no impalamento das células, pois o valor do
potencial registrado na ponta do eletrodo podia variar de valores positivos a negativos (em
relação ao potencial nulo da solução na câmara) indicando até um falso impalamento. Com a
janela de pulso de corrente de amplitude negativa, ao penetrar na célula, havia o carregamento
da capacitância de membrana, denunciado pela curva exponencial no início e no fim da janela
de pulso da resposta da voltagem representado na Figura 06. Este comportamento confirmava
o verdadeiro impalamento da célula. Além do mais, parâmetros eletrofisiológicos da fase de
estabilização foram obtidos, como resistência de membrana e potencial de repouso.
Figura 06: Protocolo da fase de impalamento e estabilização montado com comandos
externos. A duração total do episódio do protocolo foi de 260 ms, com freqüência de
amostragem de 20 kHz, amplitude do pulso hiperpolarizante igual a -100 pA e largura de 100
ms. Os traçados mostrados estão no modo DCC.
O segundo protocolo foi montado com comandos internos e externos, como mostra a
Figura 07. A duração total do episódio foi de 960 ms dividido em duas faixas de freqüência de
amostragem: de 0 a 192 ms a 20 kHz e de 193 a 960 ms a 5 kHz. Estas duas faixas de
amostragem foram necessárias para mostrar com maior clareza algumas propriedades do PA.
Duas janelas de pulsos de corrente foram criadas. A janela de pulso de corrente determinada
pelos comandos internos estava localizada na faixa de 193 a 960 ms, com duração de 300 ms
e amplitude de valor fixo igual a -100 pA. Já a janela de pulso de corrente determinada pelos
comandos externos estava localizada na faixa de 0 a 192 ms, com duração de,
aproximadamente, 100 ms. Esta janela de pulso possuía amplitude ajustável, podendo ser
modificada a qualquer momento. Assim, este outro protocolo foi utilizado nas outras fases dos
32
experimentos. Essas fases, sob este protocolo, foram definidas como: estabilização;
determinação do limiar de geração do PA; exposição ao 1,8-Cineol; lavagem.
Figura 07: Protocolo para as outras fases do experimento montado com comandos
internos e externos. A duração total do episódio foi de 960 ms dividido em duas faixas de
freqüência de amostragem: de 0 a 192 ms a 20 kHz e de 193 a 960 ms a 5 kHz. Na faixa de
amostragem a 20 kHz, a amplitude do pulso era ajustável, enquanto a amplitude do pulso na
faixa de 5 kHz possuía valor fixo e igual a -100 pA. Na figura, esta fase representa a
determinação do limiar de geração do PA. Os traçados mostrados estão no modo BRIDGE.
Ainda mais, foi possível executar a injeção de corrente, diferente das correntes nas
janelas dos pulsos citados anteriormente, em todo o protocolo. Para isso, utilizamos comandos
de injeção de corrente de maneira contínua (do inglês, Direct Current Command [DC
Command]) de modo que uma corrente escolhida pelo usuário, de valor e polaridade variável,
pudesse ser injetada na célula para manter o V
m
em um novo valor fixo (análogo a um
clampeamento de voltagem). Utilizamos essa manobra nas células onde houve modificação
do potencial de repouso celular ao final da exposição com o 1,8-cineol. O objetivo era voltar o
Vm ao valor do potencial de repouso celular na estabilização e realizar medições nas
propriedades elétricas dos neurônios sob esta nova condição e ainda com o tecido sob a ação
da droga.
33
4. RESULTADOS
4.1 Ação do 1,8-Cineol sobre o Potencial de Ação
4.1.1 Curso Temporal da Inibição e Recuperação do Potencial de Ação
O 1,8-cineol na concentração de 6 mM apresentou efeito de inibição do PA e alteração
nos parâmetros eletrofisiológicos. Todas as células nessa concentração apresentaram inibição
do PA (n=12). Nas células onde foi possível manter o impalamento por um período de tempo
longo (até uma hora após a administração da droga) houve uma recuperação dos parâmetros
eletrofisiológicos como também do curso temporal do PA (n=5). A Figura 08 (a) demonstra
esse parâmetro de inibição do PA para essa concentração, com tempo médio de inibição de
159,75 ± 34,73 s após o início da abertura da válvula de exposição ao 1,8-cineol. Esse tempo
de inibição auxiliou na determinação do tempo de exposição à droga para as outras doses
empregadas (1 mM e 0,1 mM). Já a Figura 08 (b) apresenta a recuperação da inibição do PA,
com tempo de recuperação de até 45 min de lavagem.
Já para a concentração de 1 mM, bem como para a concentração de 0,1 mM, o tempo
de exposição do tecido à droga foi de 150 s, estipulado a partir da média do tempo de inibição
do PA para a concentração de 6 mM. Houve células que, assim como as células expostas ao
1,8-cineol na concentração de 6 mM, demonstraram inibição do PA (n=7) e outras que não
apresentaram esse efeito (n=8) ao final da exposição à droga. Os traçados dessa inibição se
assemelham aos da Figura 08 (a).
Para a concentração de 0,1 mM o curso temporal do PA foi avaliado tanto com o uso
do veículo solubilizante do 1,8-cineol, o DMSO, como para a solução com a droga sem esse
veículo. O curso temporal do PA não apresentou modificações tanto com a solução contendo
o veículo do 1,8-cineol (n=8) como com a solução sem o veículo (n=6) ao final da exposição
do tecido ao 1,8-cineol (final dos 150 s de exposição).
34
(a)
Curso temporal da inibição do potencial de ação sob ação do 1,8-Cineol [6mM]
Episódios 1 ao 268 (Intervalo de 27 episódios)
0 20 40 60 80 100 120
Figura 08: Curso temporal da inibição e recuperação do PA sob a ação do 1,8-cineol n
concentração de 6 mM em uma mesma célula. Em (a) está mostrado a inibição do PA, em
(b) a recuperação dessa inibição e em (c) estão mostrados os traçados do primeiro e do últim
episódio (esquerda e centro, respectivamente) do curso temporal mostrado em (a) e do últim
episódio (direita) mostrado em (b).
a
o
o
(c)
(b)
Tem
140
p
o
(
ms
)
160 180 200 220 240 260 280 300
Curso temporal da recuperação da inibição do potencial de ação sob a ação do 1,8-Cineol [6mM]
Episódios 1 ao 600 (Intervalo de 60 episódios)
0 20 40 60 80 100 120
Tem
140
p
o
(
ms
)
160 180 200 220 240 260 280 300
Tempo (ms)
100 200 300
Potencial (mV)
40
-60
-40
-20
20
Tempo (ms)
100 200 300
Potencial (mV)
40
-60
-40
-20
20
Tempo (ms)
100 200 300
Potencial (mV)
20
-20
-40
-60
40
35
4.1.2 Amplitude do Potencial de Ação
Na concentração de 6 mM, as resposta de voltagem das células analisadas eram PA
que possuíam, em média, amplitude igual a 64,89 ± 4,55 mV (n=12). Durante a aplicação do
1,8-cineol, a amplitude da resposta foi decaindo progressivamente e modificada, ao final da
aplicação da droga, para uma resposta passiva com amplitude igual a 14,86 ± 1,21 mV
(n=12). Todas as células sob esta concentração tiveram bloqueio do PA. Além do mais, estes
dados apresentaram diferença estatística significante (p≤0,001, teste-t de Student pareado).
Para as células em que foi possível manter o impalamento durante longo tempo (até uma hora
após a aplicação da droga) houve recuperação desse parâmetro durante a lavagem (n=5). Os
valores da amplitude na estabilização, ao final da aplicação do cineol e ao final da lavagem
foram 67,88 ± 9,12 mV, 14,80 ± 1,28 mV e 61,20 ± 9,74 mV, respectivamente (Figura 09).
Para estes dados, houve diferença estatística significante apenas da fase do cineol em relação
às demais fases (p<0,001, ANOVA, Teste de Fisher).
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Amplitude (mV)
0
20
40
60
80
100
*
Figura 09: Amplitude do PA na estabilização (n=5), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM,
n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o impalamento foi mantido por um
longo tempo. No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados
e as linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a
mediana dos valores da amplitude do PA.* diferença estatisticamente significante em relação
às fases de estabilização e final da lavagem (p<0,001, ANOVA, Teste de Fisher).
Para a concentração de 1 mM, como relatado anteriormente, houve células que
demonstraram inibição do PA (n=7) e conseqüentemente redução estatisticamente significante
36
da amplitude do PA (p≤0,001, teste-t de Student pareado). A amplitude do PA e da resposta
local desse grupo de células na fase de estabilização e ao final da exposição ao 1,8-cineol foi
58,75 ± 3,40 mV e 17,92 ± 0,96 mV, respectivamente. A Figura 10 mostra os dados das
células onde não houve essa inibição do PA ao final da exposição ao 1,8-cineol. A amplitude
na fase de estabilização, final da aplicação do 1,8-cineol e final da lavagem foi 81,69 ± 3,10
mV (n=8), 71,13 ± 5,17 mV (n=8), 72,37 ± 8,18 mV (n=6), respectivamente, e não houve
diferença estatística significante entre as fases do experimento (p=0,318, ANOVA).
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Amplitude (mV)
40
50
60
70
80
90
100
110
Figura 10: Amplitude do PA na estabilização (n=8), sob a ação do 1,8-cineol (1 mM,
n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células que não tiveram a inibição do PA. No
gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas
pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a mediana dos
valores da amplitude do PA. Para essa concentração, não houve diferença estatística
significante dos dados entre as fases do experimento (p=0,318, ANOVA).
Já na concentração de 0,1 mM, todas as células estudadas (n=14) não apresentaram
redução estatisticamente significante da amplitude entre as diversas fases do experimento
(p=0,836, ANOVA). Os valores da amplitude, nessa concentração, para a estabilização, final
da aplicação do 1,8-cineol e final da lavagem foi 71,36 ± 2,96 mV (n=14), 71,12 ± 3,02 mV
(n=14), 74,02 ± 4,96 mV (n=9), respectivamente. Ainda mais, foi investigado se o veículo
solubilizante do 1,8-cineol, o DMSO, possuía algum efeito sobre o tecido. Tanto as células
onde foi administrada a concentração de 0,1 mM da droga na presença do veículo como a
concentração na sua ausência não apresentaram diferença estatística significante (p=0,507 e
p=0,531, teste-t de Student pareado para a concentração com e sem o veículo,
37
respectivamente). Os dados da amplitude sob a ação da droga com DMSO estão representados
na Figura 11 (a) e seus valores na estabilização e final da ação do 1,8-cineol foi 67,70 ± 2,77
mV (n=8) e 68,58 ± 2,70 mV (n=8), respectivamente. Sob a ação da droga sem DMSO,
mostrado na Figura 11 (b), os valores da amplitude na estabilização foi 76,23 ± 5,53 mV
(n=6) e ao final da ação do 1,8-cineol, 74,50 ± 6,14 mV (n=6).
Fases do experimento (C/ DMSO)
Estabiização Cineol
Amplitude (mV)
50
60
70
80
90
100
Fases do experimento (S/ DMSO)
Estabilização Cineol
Amplitude (mV)
50
60
70
80
90
100
(b) (a)
Figura 11: Amplitude do PA na estabilização (n=8, com e n=6 sem DMSO) e sob a ação
do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células sob a concentração de 0,1 mM
da droga. Em (a) está mostrado a amplitude do PA das células com exposição ao 1,8-cineol
mais o solubilizante e em (b) sem o DMSO. Nos gráficos, os limites das caixas representam o
25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam,
respectivamente, a média e a mediana dos valores da amplitude do PA. Para essa
concentração, não houve diferença estatística significante dos dados entre as fases do
experimento tanto na presença do veículo como na ausência (p=0,507 e p=0,531, teste-t de
Student pareado para a concentração com e sem o veículo, respectivamente).
Os dados da amplitude do PA, em suas diferentes fases e sob diferentes concentrações,
estão sumarizados na Tabela 01.
38
Tabela 01: Amplitude do PA (mV) para diferentes fases do experimento sob a ação do
1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM). Dados descritos como média ± e.p.m. e o valor de n
representa o número de experimentos feitos.
Concentração Estabilização
Final da
aplicação do
1,8-cineol
Final da
lavagem
todas as células
64,89 ± 4,55
(n=12)
14,86 ± 1,21
(n=12)
1
*
6 mM
com recuperação
67,88 ± 9,12
(n=5)
14,80 ± 1,28
(n=5)
2
61,20 ± 9,74
(n=5)
com inibição do PA
58,75 ± 3,40
(n=7)
17,92 ± 0,96
(n=7)
1
* *
1 mM
sem inibição do PA
81,69 ± 3,10
(n=8)
71,13 ± 5,17
(n=8)
72,37 ± 8,18
(n=6)
todas as células
71,36 ± 2,96
(n=14)
71,12 ± 3,02
(n=14)
* * *
com DMSO
67,70 ± 2,77
(n=8)
68,58 ± 2,70
(n=8)
* * *
0,1 mM
sem DMSO
76,23 ± 5,53
(n=6)
74,50 ± 6,14
(n=6)
* * *
1
dado estatisticamente significante em relação à fase de estabilização;
2
dado estatisticamente significante em
relação as outras fases;
* em algumas células (n=7) não foi possível manter o impalamento por um período de tempo
longo suficiente para permitir a recuperação desse parâmetro, enquanto em n=5 células isso
foi possível; * * não foi possível manter o impalamento por um tempo longo o suficiente para
a recuperação desse parâmetro; * * * como não houve modificação significativa desse
parâmetro na fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação à estabilização, os dados foram
omitidos.
39
4.1.3 Inclinações Máximas (dv/dt
máx
) do Potencial de Ação no Ramo Ascendente e
Descendente
As inclinações máximas (dv/dt
máx
) do ramo ascendente e descendente do PA foram
estudadas sob a ação do 1,8-cineol. Na concentração de 6 mM, as células analisadas
possuíam, em média, dv/dt
máx
de ramo ascendente igual a 41,46 ± 7,78 mV/ms (n=12). Após a
aplicação da droga, como o PA foi completamente inibido nessa concentração, não há valor
da dv/dt
máx
do ramo ascendente e, portanto, atribuído o valor zero (n=12). No grupo de células
onde o impalamento pode ser mantido por um longo tempo houve recuperação desse
parâmetro e a dv/dt
máx
do ramo ascendente teve valor igual a 45,50 ± 14,06 mV/ms na
estabilização (n=5), valor igual a zero ao final da aplicação da droga (n=5) e valor igual a
41,00 ± 16,31 mV/ms ao final da lavagem (n=5). Estes dados, mostrados na Figura 12,
apresentaram diferença estatística significante apenas da fase de exposição ao 1,8-cineol em
relação às demais e entre a fase de estabilização e final da lavagem não houve diferença
estatística significante (p<0,05, ANOVA, Teste de Student-Newman-Keuls).
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Inclinação (mV/ms)
0
20
40
60
80
100
*
Figura 12: Inclinação máxima do ramo ascendente do PA na estabilização (n=5), sob a
ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o
impalamento foi mantido por um longo tempo. No gráfico, os limites das caixas
representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior
representam, respectivamente, a média e a mediana dos valores da inclinação máxima do
ramo ascendente do PA. * diferença estatisticamente significante em relação às fases de
estabilização e final da lavagem (p<0,05, ANOVA, Teste de Student-Newman-Keuls).
40
Para a dv/dt
máx
do ramo descendente do PA na concentração de 6 mM, as células
analisadas possuíam, em média, valor igual a -24,17 ± 3,32 mV/ms (n=12). Assim como na
dv/dt
máx
do ramo ascendente, após o final da aplicação do 1,8-cineol, o valor desse parâmetro
para o ramo descendente foi zero (n=12). No grupo de células onde o impalamento pode ser
mantido por um longo tempo, a dv/dt
máx
do ramo descendente teve valor igual a -22,00 ± 3,74
mV/ms na estabilização (n=5), valor igual a zero ao final da aplicação da droga (n=5) e valor
igual a -20,50 ± 2,78 mV/ms ao final da lavagem (n=5). Os dados da inclinação para essa
concentração mostrado na Figura 13 apresentaram diferença estatística significante apenas da
fase de exposição do 1,8-cineol em relação às demais e entre a fase de estabilização e final da
lavagem não houve diferença estatística significante (p<0,05, ANOVA, Teste de Student-
Newman-Keuls).
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Inclinação (mV/ms)
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
*
Figura 13: Inclinação máxima do ramo descendente do PA na estabilização (n=5), sob a
ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o
impalamento foi mantido por um longo tempo. No gráfico, os limites das caixas
representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior
representam, respectivamente, a média e a mediana dos valores da inclinação máxima do
ramo descendente do PA. * diferença estatisticamente significante em relação às fases de
estabilização e final da lavagem (p<0,05, ANOVA, Teste de Student-Newman-Keuls).
Na concentração de 1 mM as células que apresentaram inibição do PA tiveram o valor
da dv/dt
máx
do ramo ascendente na estabilização igual a 40,00 ± 5,77 mV/ms (n=7) e valor
igual a zero após a exposição à droga (n=7). Já para as células que não apresentaram essa
inibição, o valor da dv/dt
máx
do ramo ascendente na estabilização, ao final da exposição do
41
1,8-cineol e ao final da lavagem foi 71,25 ± 10,93 mV/ms (n=8), 52,50 ± 7,50 mV/ms (n=8) e
50,00 ± 9,31 mV/ms (n=6), respectivamente. Mesmo com a redução do valor da inclinação na
fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação à estabilização, estes dados não apresentaram
diferença estatística significante entre as três fases do experimento (p=0,239, ANOVA). A
Figura 14 mostra os dados dessa inclinação nas células sem inibição do PA para a
concentração de 1 mM.
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Inclinação (mV/ms)
20
40
60
80
100
120
Figura 14: Inclinação do ramo ascendente do PA na estabilização (n=8), sob a ação do
1,8-cineol (1 mM, n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células que não tiveram a
inibição do PA. No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos
dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a
mediana dos valores da inclinação máxima do ramo ascendente do PA. Para essa
concentração, não houve diferença estatística significante dos dados entre as fases do
experimento (p=0,239, ANOVA).
Para o ramo descendente, o valor da dv/dt
máx
no grupo de células com inibição do
potencial foi -30,00 ± 3,09 mV/ms (n=7) na estabilização e zero na fase final da exposição ao
1,8-cineol (n=7). Nas células onde não houve essa inibição do PA nessa concentração, o valor
da dv/dt
máx
do ramo descendente na estabilização, ao final da aplicação do 1,8-cineol e ao
final da lavagem foi -38,75 ± 2,95 mV/ms (n=8), -35,00 ± 2,67 mV/ms (n=8) e -38,33 ± 3,07
mV/ms (n=6) respectivamente. Estes dados também não apresentaram diferença estatística
significante entre as fases do experimento (p=0,386, ANOVA) e estão mostrados na
Figura 15.
42
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Inclinação (mV/ms)
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
Figura 15: Inclinação do ramo descendente do PA na estabilização (n=8), sob a ação do
1,8-cineol (1 mM, n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células que não tiveram a
inibição do PA. No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos
dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a
mediana dos valores da inclinação do ramo descendente do PA. Para essa concentração, não
houve diferença estatística significante dos dados entre as fases do experimento (p=0,386,
ANOVA).
Para a concentração de 0,1 mM, os valores da dv/dt
máx
do ramo ascendente do PA na
estabilização e ao final da aplicação da droga foi 63,57 ± 5,70 mV/ms (n=14) e 60,71 ± 5,97
mV/ms (n=14), não demonstrando diferença estatística significante entre essas fases (p=
0,461, teste de Wilcoxon). Nas células onde foi administrado o 1,8-cineol com o DMSO, os
valores desse parâmetro também não apresentaram diferença estatística significante (p=0,815,
teste-t de Student pareado), bem como nas células onde não foi utilizado esse solubilizante
(p=0,296, teste-t de Student pareado). Os valores da dv/dt
máx
do ramo ascendente do PA nas
células onde foi utilizado o DMSO na estabilização e ao final da exposição do 1,8-cineol foi
60,00 ± 3,27 mV/ms (n=8) e 58,75 ± 5,15 mV/ms (n=8), respectivamente. Nas células onde
não foi utilizado o DMSO, o valor da dv/dt
máx
do ramo ascendente na estabilização e ao final
da exposição ao 1,8-cineol foi 68,33 ± 13,02 mV/ms (n=6) e 63,33 ± 12,82 mV/ms (n=6),
respectivamente. As Figuras 16 (a) e (b) mostram esses dados das inclinações sob a ação do
1,8-cineol com (a) e sem solubilizante (b).
43
Fases do experimento (C/ DMSO)
Estabiização Cineol
Inclinação (mV/ms)
20
40
60
80
100
120
Fases do experimento (S/ DMSO)
Estabilização Cineol
Inclinação (mV/ms)
20
40
60
80
100
120
(b) (a)
Figura 16: Inclinação máxima do ramo ascendente do PA na estabilização (n=8, com e
n=6 sem DMSO) e sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células
sob a concentração de 0,1 mM da droga. Em (a) está mostrado a dv/dt
máx
do ramo
ascendente do PA das células com exposição ao 1,8-cineol mais o solubilizante e em (b) sem
o DMSO. Nos gráficos, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e
as linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a mediana
dos valores da inclinação máxima do ramo ascendente do PA. Para essa concentração, não
houve diferença estatística significante dos dados entre as fases do experimento tanto com o
veículo como sem (p=0,815 e p=0,296 teste-t de Student pareado para a concentração com e
sem o veículo, respectivamente).
Já para o ramo descendente, o valor desse parâmetro em todas as células estudadas sob
essa concentração na estabilização e ao final da aplicação da droga foi -45,00 ± 3,74 mV/ms
(n=14) e -42,14 ± 3,95 mV/ms (n=14), não demonstrando diferença estatística significante
(p=0,391, teste-t de Student pareado). As células sob a administração do 1,8-cineol com o
DMSO tiveram o valor da dv/dt
máx
do ramo descendente igual a -50,00 ± 4,63 mV/ms na
estabilização (n=8) e -47,50 ± 5,26 mV/ms ao final da exposição ao óleo (n=8). As células
sob a administração do 1,8-cineol sem o DSMO tiveram o valor da dv/dt
máx
do ramo
descendente igual a -38,33 ± 5,43 mV/ms na estabilização (n=6) e -35,00 ± 5,00 mV/ms ao
final da exposição ao 1,8-cineol (n=6). Estes dados estão demonstrados na Figura 17 (a) com
o uso do DMSO e na Figura 17 (b) sem o uso do veículo e não apresentaram diferenças
estatísticas significantes em relação aos seus respectivos grupos (p=0,668, teste-t de Student,
para as células com o uso do DMSO e p=0,500, teste de Wilcoxon, para as células sem o uso
do DMSO).
44
Fases do experimento (C/ DMSO)
Estabiização Cineol
Inclinação (mV/ms)
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
Fases do experimento (S/ DMSO)
Estabilização Cineol
Inclinação (mV/ms)
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
(b) (a)
Figura 17: Inclinação máxima do ramo descendente do PA na estabilização (n=8, com e
n=6 sem DMSO) e sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células
sob a concentração de 0,1 mM da droga. Em (a) está mostrado a dv/dt
máx
do ramo
descendente do PA das células com exposição ao 1,8-cineol mais o solubilizante e em (b) sem
o DMSO. Nos gráficos, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e
as linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a mediana
dos valores da inclinação máxima do ramo descendente do PA. Para essa concentração, não
houve diferença estatística significante dos dados entre as fases do experimento tanto com o
veículo como sem (p=0,668, teste-t de Student, para as células com o uso do DMSO e
p=0,500, teste de Wilcoxon, para as células sem o uso do DMSO).
Os dados das inclinações máximas, tanto do ramo ascendente com do descendente do
PA em suas diferentes fases e sob diferentes concentrações, estão sumarizados na Tabela 02 e
Tabela 03.
45
Tabela 02: Inclinação máxima do ramo ascendente do PA (mV/ms) para diferentes fases
do experimento sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM). Dados descritos como
média ± e.p.m. e o valor de n representa o número de experimentos feitos.
Concentração Estabilização
Final da
aplicação do
1,8-cineol
Final da
lavagem
todas as células
41,46 ± 7,78
(n=12)
0,00 ± 0,00
(n=12)
1
*
6 mM
com recuperação
45,50 ± 14,06
(n=5)
0,00 ± 0,00
(n=5)
2
41,00 ± 16,31
(n=5)
com inibição do PA
40,00 ± 5,77
(n=7)
0,00 ± 0,00
(n=7)
1
* *
1 mM
sem inibição do PA
71,25 ± 10,93
(n=8)
52,50 ± 7,50
(n=8)
50,00 ± 9,31
(n=6)
todas as células
63,57 ± 5,70
(n=14)
60,71 ± 5,97
(n=14)
* * *
com DMSO
60,00 ± 3,27
(n=8)
58,75 ± 5,15
(n=8)
* * *
0,1 mM
sem DMSO
68,33 ± 13,02
(n=6)
63,33 ± 12,82
(n=6)
* * *
1
dado estatisticamente significante em relação à fase de estabilização;
2
dado estatisticamente significante em
relação as outras fases;
* em algumas células (n=7) não foi possível manter o impalamento por um período de tempo
longo suficiente para permitir a recuperação desse parâmetro, enquanto em n=5 células isso
foi possível; * * não foi possível manter o impalamento por um tempo longo o suficiente para
a recuperação desse parâmetro; * * * como não houve modificação significativa desse
parâmetro na fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação à estabilização, os dados foram
omitidos.
46
Tabela 03: Inclinação máxima do ramo descendente do PA (mV/ms) para diferentes
fases do experimento sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM). Dados descritos
como média ± e.p.m. e o valor de n representa o número de experimentos feitos.
Concentração Estabilização
Final da
aplicação do
1,8-cineol
Final da
lavagem
todas as células
-24,17 ± 3,32
(n=12)
0,00 ± 0,00
(n=12)
1
*
6 mM
com recuperação
-22,00 ± 3,74
(n=5)
0,00 ± 0,00
(n=5)
2
-20,50 ± 2,78
(n=5)
Com inibição do PA
-30,00 ± 3,09
(n=7)
0,00 ± 0,00
(n=7)
1
* *
1 mM
Sem inibição do PA
-38,75 ± 2,95
(n=8)
-35,00 ± 2,67
(n=8)
-38,33 ± 3,07
(n=6)
todas as células
-45,00 ± 3,74
(n=14)
-42,14 ± 3,95
(n=14)
* * *
com DMSO
-50,00 ± 4,63
(n=8)
-47,50 ± 5,26
(n=8)
* * *
0,1 mM
sem DMSO
-38,33 ± 5,43
(n=6)
-35,00 ± 5,00
(n=6)
* * *
1
dado estatisticamente significante em relação à fase de estabilização;
2
dado estatisticamente significante em
relação as outras fases;
* em algumas células (n=7) não foi possível manter o impalamento por um período de tempo
longo suficiente para permitir a recuperação desse parâmetro, enquanto em n=5 células isso
foi possível; * * não foi possível manter o impalamento por um tempo longo o suficiente para
a recuperação desse parâmetro; * * * como não houve modificação significativa desse
parâmetro na fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação à estabilização, os dados foram
omitidos.
47
4.1.4 Duração do Potencial de Ação
A média da duração do PA na concentração de 6 mM para todas as células (n=12) foi
de 5,15 ± 0,49 ms. Após a aplicação da droga o PA foi inibido e, portanto, não há duração
desse potencial (valor representado por zero). No grupo de células onde o impalamento pode
ser mantido por um longo tempo houve recuperação desse parâmetro e a duração na
estabilização, após a aplicação da droga, e no fim da lavagem foi 4,66 ± 0,59 ms (n=5), zero
(n=5) e 4,98 ± 0,31 ms (n=5), respectivamente. Estes dados apresentaram diferença estatística
significante da fase de exposição ao óleo em relação às demais (p<0,05, ANOVA, teste de
Student-Newman-Keuls) e estão mostrados na Figura 18.
Fases
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Duração (ms)
0
1
2
3
4
5
6
7
*
Figura 18: Duração do PA na estabilização (n=5), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5)
e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o impalamento foi mantido por um
longo tempo. No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados
e as linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a
mediana dos valores da duração do PA. * diferença estatisticamente significante em relação às
fases de estabilização e final da lavagem (p<0,05, ANOVA, teste de Student-Newman-Keuls).
Na concentração de 1 mM as células que apresentaram inibição do PA tiveram o valor
da duração na estabilização igual a 5,11 ± 0,38 ms (n=7) e ao final da exposição ao 1,8-cineol
igual a zero (n=7). Na Figura 19 há a demonstração dos dados das células que não
apresentaram essa inibição e o valor da duração do PA na fase de estabilização, ao final da
exposição ao 1,8-cineol e ao final da lavagem foi de 4,91 ± 0,48 ms (n=8), 4,94 ± 0,47 ms
(n=8) e 6,28 ± 1,37 ms (n=6), respectivamente. Para estes dados, não foi encontrada diferença
48
estatística significante entre as fases do experimento (p=0,552, ANOVA, teste de Kruskal-
Wallis).
9Figura 1
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Duração (ms)
3
4
5
6
7
8
9
10
: Duração do PA na estabilização (n=8), sob a ação do 1,8-cineol (1 mM, n=8) e
a todas as células
estudad
ao final da lavagem (n=6) para as células que não tiveram a inibição do PA. No gráfico,
os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e
contínua no interior representam, respectivamente, a média e a mediana dos valores da
duração do PA. Para essa concentração, não houve diferença estatística significante dos dados
entre as fases do experimento (p=0,552, ANOVA, teste de Kruskal-Wallis).
Já para a concentração de 0,1 mM, os valores da duração do PA par
as na estabilização, ao final da exposição ao 1,8-cineol e no final da lavagem foi,
respectivamente, 4,12 ± 0,26 ms (n=14), 4,11 ± 0,31 ms (n=14) e 4,29 ± 0,38 ms (n=9). Estes
dados não apresentaram diferença estatística significante entre as três fases do experimento
(p=0,914, ANOVA). Nas células onde foi administrado o 1,8-cineol com o solubilizante, os
valores da duração na estabilização e após a exposição à droga não apresentaram diferença
estatística significante (p=0,196, teste-t de Student pareado), bem como nas células onde não
foi administrado o DMSO (p =0,625, teste de Wilcoxon). Esses valores, mostrados na Figura
20 (a), da duração do potencial nas células onde foi utilizado a droga mais o solubilizante,
foram iguais a 4,40 ± 0,36 ms (n=8) na estabilização e 4,17 ± 0,35 ms (n=8) na fase final da
exposição ao 1,8-cineol. Nas células onde não foi utilizado o 1,8-cineol com o solubilizante, o
valor da duração na estabilização e ao final da exposição ao óleo foi de 3,74 ± 0,33 ms (n=6) e
4,02 ± 0,59 ms (n=6), respectivamente, e esses dados estão mostrados na Figura 20 (b).
49
Fases do experimento (C/ DMSO)
Estabiização Cineol
Duração (ms)
2
3
4
5
6
Fases do experimento (S/ DMSO)
Estabilização Cineol
Duração (ms)
2
3
4
5
6
(b) (a)
Figura 20: Duração do PA na estabilização (n=8, com e n=6 sem DMSO) e sob a ação do
1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células sob a concentração de 0,1 mM da
droga. Em (a) está mostrado a duração do PA das células com exposição ao 1,8-cineol mais o
solubilizante e em (b) sem o DMSO. Nos gráficos, os limites das caixas representam o 25° e o
75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam,
respectivamente, a média e a mediana dos valores da duração do PA. Para essa concentração,
não houve diferença estatística significante dos dados entre as fases do experimento tanto com
o veículo como sem (p=0,196, teste-t de Student pareado, e p=0,625, teste de Wilcoxon para a
concentração com e sem o veículo, respectivamente).
Os dados da duração do PA, em suas diferentes fases e sob diferentes concentrações,
estão sumarizados na Tabela 04.
50
Tabela 04: Duração do PA (ms) para diferentes fases do experimento sob a ação do 1,8-
cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM). Dados descritos como média ± e.p.m. e o valor de n
representa o número de experimentos feitos.
Concentração Estabilização
Final da
aplicação do
1,8-cineol
Final da
lavagem
todas as células
5,15 ± 0,49
(n=12)
0,00 ± 0,00
(n=12)
1
*
6 mM
com recuperação
4,66 ± 0,59
(n=5)
0,00 ± 0,00
(n=5)
2
4,98 ± 0,31
(n=5)
com inibição do PA
5,11 ± 0,38
(n=7)
0,00 ± 0,00
(n=7)
1
* *
1 mM
sem inibição do PA
4,91 ± 0,48
(n=8)
4,94 ± 0,47
(n=8)
6,28 ± 1,37
(n=6)
todas as células
4,12 ± 0,26
(n=14)
4,11 ± 0,31
(n=14)
* * *
com DMSO
4,40 ± 0,36
(n=8)
4,17 ± 0,35
(n=8)
* * *
0,1 mM
sem DMSO
3,74 ± 0,33
(n=6)
4,02 ± 0,59
(n=6)
* * *
1
dado estatisticamente significante em relação à fase de estabilização;
2
dado estatisticamente significante em
relação as outras fases;
* em algumas células (n=7) não foi possível manter o impalamento por um período de tempo
longo suficiente para permitir a recuperação desse parâmetro, enquanto em n=5 células isso
foi possível; * * não foi possível manter o impalamento por um tempo longo o suficiente para
a recuperação desse parâmetro; * * * como não houve modificação significativa desse
parâmetro na fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação à estabilização, os dados foram
omitidos.
51
4.2 Ação do 1,8-Cineol sobre a Resistência de Entrada da Membrana Celular
Nesta etapa, estudamos o comportamento da resistência de entrada da membrana
celular sob a ação do 1,8-cineol. Na concentração de 6 mM, todas as células investigadas
(n=12) tiveram uma redução do valor desse parâmetro na fase final da exposição à droga, com
células mostrando uma recuperação desse valor ao final da lavagem (n=5). A média da
resistência de entrada para todas as células (n=12) na fase da estabilização e ao final da
exposição ao 1,8-cineol foi 69,92 ± 11,13 MΩ e 41,21 ± 3,49 MΩ, respectivamente, e estes
valores mostraram diferença estatística significante (p≤0,001, teste de Wilcoxon). A Figura 21
apresenta os dados das células onde o impalamento pode ser mantido por um longo tempo e o
valor da resistência na estabilização, ao final da exposição ao 1,8-cineol e ao final da lavagem
foi, respectivamente, 47,51 ± 10,78 MΩ (n=5), 34,05 ± 2,94 MΩ (n=5) e 51,35 ± 6,43 MΩ
(n=5). Note que estes dados não se mostraram estatisticamente significantes entre si (p=0,265,
ANOVA, teste de Fisher).
Figura 21: Resistência d
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Resistência de entrada (Mohm)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
e entrada da membrana celular na estabilização (n=5), sob a
ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o
impalamento foi mantido por um longo tempo. No gráfico, os limites das caixas
representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior
representam, respectivamente, a média e a mediana dos valores da resistência de entrada da
membrana do PA. Para essa concentração, não houve diferença estatística significante dos
dados entre as fases do experimento (p=0,265, ANOVA, teste de Fisher).
52
Na concentração de 1 mM, há a distinção de dois grupos de células que se
correlacionam à inibição do PA. Para todas as células onde houve inibição do PA (n=7), os
valores da resistência de entrada tiveram uma redução do seu valor ao final da exposição ao
1,8-cineol. Esses valores, em média, foram iguais a 89,07 ± 9,98 MΩ na estabilização e 59,31
± 5,89 MΩ ao final da exposição à droga, além de apresentarem diferença estatística
significante (p=0,005, teste-t de Student pareado). Para as células onde não houve essa
inibição (n=8), seis tiveram uma redução do valor da resistência de entrada na fase final da
aplicação da droga e duas tiveram um leve aumento desse valor que continuou na lavagem.
Nesse grupo de células, o valor desse parâmetro na estabilização, ao final da exposição ao
1,8-cineol e ao final da lavagem foi 77,82 ± 8,88 MΩ (n=8), 67,17 ± 7,79 MΩ (n=8) e 70,32 ±
7,08 MΩ (n=6), respectivamente. Estes dados, também apresentados na Figura 22, não
apresentaram diferença estatística significante entre as fases do experimento (p=0,624,
ANOVA, teste de Fisher).
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Resistência de entrada (Mohm)
20
40
60
80
100
120
Figura 22: Resistência de entrada da membrana celular na estabilização (n=8), sob a
ação do 1,8-cineol (n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células sob a ação da droga
na concentração de 1 mM. No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75°
percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam,
respectivamente, a média e a mediana dos valores da resistência de entrada da membrana
celular. Para essa concentração, não houve diferença estatística significante dos dados entre as
fases do experimento (p=0,624, ANOVA, teste de Fisher).
Já para a concentração de 0,1 mM, para todas as células estudadas, a resistência de
entrada da membrana celular na estabilização e ao final da exposição ao 1,8-cineol foi 61,55 ±
6,10 MΩ (n=14) e 60,46 ± 5,27 MΩ (n=14), respectivamente, sem diferença estatística
53
significante entre esses dados (p=0,693, teste-t de Student pareado). Nas células onde o 1,8-
cineol foi administrado com o solubilizante DMSO, os valores desse parâmetro foram iguais a
64,85 ± 7,42 MΩ (n=8) na estabilização e 66,49 ± 7,55 MΩ (n=8) ao final da exposição ao
1,8-cineol. Esses dados estão mostrados na Figura 23 (a). Nas células sem o uso do
solubilizante, com dados mostrados na Figura 23 (b), os valores na estabilização e ao final da
exposição ao 1,8-cineol foram iguais a 57,14 ± 10,79 MΩ (n=6) e 52,41 ± 6,27 MΩ (n=6),
respectivamente. Estes dados não apresentaram diferenças estatísticas significantes, tanto no
grupo de células onde houve o uso do DMSO como no grupo de células sem esse
solubilizante (p=0,554, teste-t de Student pareado, para as células com o DMSO e p=0,313,
teste de Wilcoxon, sem o DMSO).
Fases do experimento (C/ DMSO)
Estabiização Cineol
Resistência de entrada (Mohm)
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Fases do experimento (S/ DMSO)
Estabilização Cineol
Resistência de entrada (Mohm)
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
(b) (a)
Figura 23: Resistência de entrada da membrana na estabilização (n=8, com e n=6 sem
DMSO) e sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células sob a
concentração de 0,1 mM da droga. Em (a) está mostrado a resistência de entrada das células
com exposição ao 1,8-cineol mais o solubilizante e em (b) sem o DMSO. Nos gráficos, os
limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e
contínua no interior representam, respectivamente, a média e a mediana dos valores da
resistência de entrada da membrana celular. Para essa concentração, não houve diferença
estatística significante dos dados entre as fases do experimento tanto com o veículo como sem
(p=0,554, teste-t de Student pareado, para as células com o DMSO e p=0,313, teste de
Wilcoxon, para as células sem o DMSO).
Os dados da resistência de entrada da membrana celular, em suas diferentes fases e
sob diferentes concentrações, estão sumarizados na Tabela 05.
54
Tabela 05: Resistência de entrada da membrana celular (MΩ) para diferentes fases do
experimento sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM). Dados descritos como
média ± e.p.m. e o valor de n representa o número de experimentos feitos.
Concentração Estabilização
Final da
aplicação do
cineol
Final da
lavagem
todas as células
69,92 ± 11,13
(n=12)
41,21 ± 3,49
(n=12)
1
*
6 mM
com recuperação
47,51 ± 10,78
(n=5)
34,05 ± 2,94
(n=5)
51,35 ± 6,43
(n=5)
com inibição do PA
89,07 ± 9,98
(n=7)
59,31 ± 5,89
(n=7)
1
* *
1 mM
sem inibição do PA
77,82 ± 8,88
(n=8)
67,17 ± 7,79
(n=8)
70,32 ± 7,08
(n=6)
todas as células
61,55 ± 6,10
(n=14)
60,46 ± 5,27
(n=14)
* * *
com DMSO
64,85 ± 7,42
(n=8)
66,49 ± 7,55
(n=8)
* * *
0,1 mM
sem DMSO
57,14 ± 10,79
(n=6)
52,41 ± 6,27
(n=6)
* * *
1
dado estatisticamente significante em relação à fase de estabilização;
* em algumas células (n=7) não foi possível manter o impalamento por um período de tempo
longo suficiente para permitir a recuperação desse parâmetro, enquanto em n=5 células isso
foi possível; * * não foi possível manter o impalamento por um tempo longo o suficiente para
a recuperação desse parâmetro; * * * como não houve modificação significativa desse
parâmetro na fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação à estabilização, os dados foram
omitidos.
55
4.3 Ação do 1,8-Cineol sobre o Potencial de Repouso Celular
Estudamos, também, o comportamento do potencial de repouso celular sob a ação do
1,8-cineol. Na concentração de 6 mM, todas as células investigadas (n=12) tiveram uma
despolarização do potencial de repouso na fase final da exposição à droga, com células
mostrando uma recuperação desse valor ao final da lavagem (n=5). Em média, o potencial de
repouso para todas as células na fase da estabilização e ao final da exposição ao 1,8-cineol foi
-52,82 ± 2,81 mV (n=12) e -43,36 ± 2,40 mV (n=12), respectivamente, e estes valores
mostraram diferença estatística significante (p≤0,001, teste-t de Student pareado). Para as
células onde foi possível manter o impalamento por um longo tempo, esse parâmetro
apresentou recuperação. A Figura 24 mostra os dados do potencial de repouso nas diversas
fases do experimento e seu valor na estabilização, ao final da exposição ao 1,8-cineol e ao
final da lavagem foi, respectivamente, -51,35 ± 3,96 mV (n=5), -40,94 ± 3,97 mV (n=5) e -
50,69 ± 6,51 mV (n=5). Estes dados mostraram diferença estatisticamente significante entre a
fase de estabilização e final da exposição ao 1,8-cineol (p=0,042, teste-t de Student pareado),
mas estatisticamente não significante entre a fase final da exposição à droga e final da
lavagem (p=0,145, teste-t de Student pareado).
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Potencial de repouso (mV)
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
*
#
Figura 24: Potencial de repouso celular na estabilização (n=5), sob a ação do 1,8-cineol
(6 mM, n=5) e ao final da lavagem (n=5) para as células onde o impalamento foi mantido
por um longo tempo. No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil
dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média
e a mediana dos valores do potencial de repouso celular. * diferença estatisticamente
56
significante em relação à fase de estabilização (p=0,042, teste-t de Student pareado);
# diferença estatisticamente não significante em relação à fase final da exposição ao 1,8-
cineol (p=0,145, teste-t de Student pareado) e em relação à fase de estabilização (p=0,929,
teste-t de Student pareado).
Na concentração de 1 mM, assim como no parâmetro resistência de entrada da
membrana celular, há a distinção de dois grupos de células que se correlacionam à inibição do
PA. Para todas as células onde houve inibição do PA (n=7), ocorreu uma despolarização do
potencial de repouso ao final da exposição ao 1,8-cineol. Esses valores, em média, foram
iguais a -47,47 ± 2,65 mV na estabilização e -39,36 ± 3,19 mV ao final da exposição à droga,
além de apresentarem diferença estatística significante (p≤0,001, teste-t de Student pareado).
Para as células onde não houve essa inibição (n=8), seis células apresentaram leve
despolarização do potencial de repouso, enquanto duas células apresentaram hiperpolarização
ao final da aplicação do 1,8-cineol que continuou na lavagem. Nesse grupo de células, o valor
desse parâmetro na estabilização, ao final da exposição ao 1,8-cineol e ao final da lavagem foi
-55,93 ± 1,30 mV (n=8), -55,12 ± 3,33 mV (n=8) e -56,64 ± 5,38 mV (n=6), respectivamente.
Estes dados, demonstrados na Figura 25, não apresentaram diferença estatística significante
entre as fases do experimento (p=0,953, ANOVA, teste de Fisher).
Figura 25: Potencial de repouso celular na estabilização (n=8),
Fases do experimento
Estabilização Cineol Fim da lavagem
Potencial de repouso(mV)
-70
-65
-60
-55
-50
-45
-40
sob a ação do 1,8-cineol
(n=8) e ao final da lavagem (n=6) para as células sob a ação da droga na concentração de
1 mM. No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as
linhas pontilhada e contínua no interior representam, respectivamente, a média e a mediana
dos valores do potencial de repouso celular. Para essa concentração, não houve diferença
57
estatística significante dos dados entre as fases do experimento (p=0,953, ANOVA, teste de
Fisher).
Na concentração de 0,1 mM, para todas as células estudadas, o valor do potencial de
repouso na estabilização e ao final da exposição ao 1,8-cineol foi -49,60 ± 1,65 mV (n=14) e -
50,93 ± 1,79 mV (n=14), respectivamente, sem diferença estatística significante entre esses
dados (p=0,091, teste de Wilcoxon). Nas células onde a droga foi administrada com o
solubilizante DMSO, os valores desse parâmetro foram iguais a -49,49 ± 1,94 mV (n=8) na
estabilização e -51,67 ± 2,29 mV (n=8) ao final da exposição ao 1,8-cineol e esses dados estão
demonstrados na Figura 26 (a). Nas células sem o uso do solubilizante, os valores na
estabilização e ao final da exposição ao 1,8-cineol foram iguais a -49,75 ± 3,07 mV (n=6) e -
49,94 ± 3,05 mV (n=6), respectivamente, e os dados estão mostrados na Figura 26 (b). Estes
dados não apresentaram diferenças estatísticas significantes, tanto no grupo de célula onde
houve o uso do DMSO como no grupo de células sem esse solubilizante (p=0,196, teste-t de
Student pareado, para as células com o DMSO e p=0,941, teste-t de Student pareado, sem o
DMSO).
Fases do experimento (C/ DMSO)
Estabiização Cineol
Potencial de repouso (mV)
-65
-60
-55
-50
-45
-40
-35
Fases do experimento (S/ DMSO)
Estabilização Cineol
Potencial de repouso (mV)
-65
-60
-55
-50
-45
-40
-35
(a) (b)
Figura 26: Potencial de repouso celular na estabilização (n=8, com e n=6 sem DMSO) e
sob a ação do 1,8-cineol (n=8, com e n=6 sem DMSO) para as células sob a concentração
de 0,1 mM da droga. Em (a) está mostrado o potencial de repouso celular das células com
exposição ao 1,8-cineol mais o solubilizante e em (b) sem o DMSO. Nos gráficos, os limites
das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no
interior representam, respectivamente, a média e a mediana do potencial de repouso celular.
Para essa concentração, não houve diferença estatística significante dos dados entre as fases
do experimento tanto com o veículo como sem (p=0,196, teste-t de Student pareado, para as
células com o DMSO e p=0,941, teste-t de Student pareado, sem o DMSO).
58
Os dados do potencial de repouso, em suas diferentes fases e sob diferentes
concentrações, estão sumarizados na Tabela 06.
Tabela 06: Potencial de repouso celular (mV) para diferentes fases do experimento sob a
ação do 1,8-cineol (6 mM, 1 mM e 0,1 mM). Dados descritos como média ± e.p.m. e o valor
de n representa o número de experimentos feitos.
Concentração Estabilização
Final da
aplicação do
cineol
Final da
lavagem
todas as células
-52,82 ± 2,81
(n=12)
-43,36 ± 2,40
(n=12)
1
*
6 mM
com recuperação
-51,35 ± 3,96
(n=5)
-40,94 ± 3,97
(n=5)
1
-50,69 ± 6,51
(n=5)
2
com inibição do PA
-47,47 ± 2,65
(n=7)
-39,36 ± 3,19
(n=7)
1
* *
1 mM
sem inibição do PA
-55,93 ± 1,30
(n=8)
-55,12 ± 3,33
(n=8)
-56,64 ± 5,38
(n=6)
todas as células
-49,60 ± 1,65
(n=14)
-50,93 ± 1,79
(n=14)
* * *
com DMSO
-49,49 ± 1,94
(n=8)
-51,67 ± 2,29
(n=8)
* * *
0,1 mM
sem DMSO
-49,75 ± 3,07
(n=6)
-49,94 ± 3,05
(n=6)
* * *
1
dado estatisticamente significante em relação à fase de estabilização;
2
dado estatisticamente não significante
em relação ao final da exposição ao 1,8-cineol;
* em algumas células (n=7) não foi possível manter o impalamento por um período de tempo
longo suficiente para permitir a recuperação desse parâmetro, enquanto em n=5 células isso
foi possível; * * não foi possível manter o impalamento por um tempo longo o suficiente para
a recuperação desse parâmetro; * * * como não houve modificação significativa desse
59
parâmetro na fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação à estabilização, os dados foram
omitidos.
4.4 Ação do 1,8-Cineol sobre a Excitabilidade Celular
Investigamos também qual alteração o 1,8-cineol provoca na excitabilidade elétrica
celular dos neurônios do gânglio cervical superior. Partimos do pressuposto de que como o
1,8-cineol na concentração de 6 mM provocou uma despolarização do potencial de repouso
celular em todas as células estudadas (n=12), que modificação ocorreria nos parâmetros
associados ao PA (e à excitabilidade) se o potencial de repouso, ao final da ação do 1,8-
cineol, voltasse ao valor da fase de estabilização? Para isso, ao final da ação do 1,8-cineol (6
mM), quando o PA fosse completamente inibido, injetamos corrente na célula (com um
clampeamento de voltagem manual, injetando corrente constantemente) de forma que o
potencial de repouso retornasse a valores próximos ou iguais ao potencial de repouso celular
na fase de estabilização. A Figura 27 demonstra o curso temporal do PA sob as condições
iniciais (estabilização e após a exposição ao 1,8-cineol) e sob as novas condições de potencial
de repouso impostas (após a injeção de corrente) em uma das células estudadas.
Legenda
Estabilização
Após o 1,8-cineol
Após corrente
Tem
p
o
(
ms
)
0 50 100 150 200 250 300
Potencial (mV)
-60
-40
-20
0
20
Figura 27: Traçados do PA na estabilização, após a exposição do 1,8-cineol e após a
injeção de corrente na célula. Foi feito a média de 5 episódios no traçado após a exposição
do 1,8-cineol para a redução do ruído.
60
Essas células apresentaram, em média, potencial de repouso na estabilização igual a -
50,50 ± 3,18 mV (n=6) e ao final da exposição do 1,8-cineol igual a -40,48 ± 3,06 mV (n=6).
Ao injetarmos a corrente o valor do potencial de repouso, em média, foi -51,63 ± 3,49 mV
(n=6). A amplitude da resposta de voltagem (potencial de ação) na estabilização, ao final da
exposição ao 1,8-cineol a após a injeção de corrente foi 73,79 ± 6,00 mV (n=6), 16,31 ± 2,33
mV (n=6) e 54,28 ± 5,52 mV (n=6), respectivamente. Este dados, mostrados na Figura 28,
exibiram diferença estatística significante entre as fases de estabilização e final da exposição
ao 1,8-cineol (p<0,001, ANOVA, teste de Fisher) e da fase de estabilização com os valores da
amplitude após a injeção de corrente na célula (p=0,013, ANOVA, teste de Fisher).
Fases do experimento
Estabilização Cineol Após corrente
Amplitude (mV)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
*
#
Figura 28: Amplitude da resposta de voltagem na estabilização (n=6), sob a ação do 1,8-
cineol (6 mM, n=6) e após a injeção de corrente na célula para reposicionamento do
potencial transmembrana no valor do novo potencial de repouso. No gráfico, os limites
das caixas representam o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no
interior representam, respectivamente, a média e a mediana da amplitude do PA. * diferença
estatisticamente significante em relação à fase de estabilização (p<0,001, ANOVA, teste de
Fisher); # diferença estatisticamente significante em relação à fase de estabilização (p=0,013,
ANOVA, teste de Fisher).
A dv/dt
máx
do ramo ascendente do PA na estabilização, ao final da exposição ao 1,8-
cineol e após a injeção de corrente foi 60,00 ± 12,25 mV/ms (n=5), zero (n=5) e 30,00 ± 0,00
mV/ms (n=5), respectivamente, e estão mostrados na Figura 29 (a). Estes dados também
apresentaram diferença estatística significante entre todas as fases, seja da estabilização contra
a fase de exposição à droga, estabilização e após a injeção de corrente ou após a injeção de
corrente contra a fase final de exposição ao 1,8-cineol (p<0,05, ANOVA, teste de Student-
61
Newman-Keuls). Já para a dv/dt
máx
do ramo descendente do PA, o valor dessa inclinação na
estabilização foi -42,00 ± 3,74 mV/ms (n=5), zero (n=5) na fase final da exposição ao 1,8-
cineol e -32,00 ± 3,74 mV/ms (n=5) após a injeção de corrente na célula. Nestes dados,
mostrados na Figura 29 (b), existe diferença estatística significante entre as fases de
estabilização e final da exposição ao 1,8-cineol e na fase de exposição à droga e após a
injeção de corrente na célula. Contudo, entre a fase de estabilização e após a injeção de
corrente na célula, não houve diferença estatística significante dos dados (p<0,05, ANOVA,
teste de Student-Newman-Keuls).
Fases do experimento
Estabilização Cineol após corrente
Inclinação (mV/ms)
0
20
40
60
80
100
Fases do experimento
Estabilização Cineol após corrente
Inclinação (mV/ms)
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
*
#
(a) (b)
Figura 29: Inclinação máxima do ramo ascendente (a) e do ramo descendente (b) do PA
na estabilização (n=5), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, n=5) e após a injeção de corrente
na célula (n=5). Em (a) está mostrado a inclinação máxima do ramo ascendente do PA e em
(b) a inclinação máxima do ramo descendente. Nos gráficos, os limites das caixas representam
o 25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam,
respectivamente, a média e a mediana dos valores das inclinações máximas do PA. Houve
diferença estatística significante dos dados da dv/dt
máx
do ramo ascendente do PA entre todas
as fases do experimento (p<0,05, ANOVA, teste de Student-Newman-Keuls). * diferença
estatisticamente significante em relação à fase de estabilização (p<0,05, ANOVA, teste de
Student-Newman-Keuls); # não há diferença estatisticamente significante em relação à fase de
estabilização (p<0,05, ANOVA, teste de Student-Newman-Keuls).
A duração do PA na estabilização, ao final da exposição ao óleo e após a injeção de
corrente foi 5,08 ± 0,66 ms (n=6), zero (n=6) e 7,62 ± 1,18 ms (n=6), respectivamente (Figura
30). Houve apenas diferença estatística significante da fase de exposição ao 1,8-cineol em
relação às demais (p<0,05, ANOVA, teste de Student-Newman-Keuls).
62
Fases do experimento
Estabilização Cineol Após corrente
Duração (ms)
0
2
4
6
8
10
12
*
Figura 30: Duração do PA na estabilização (n=6), sob a ação do 1,8-cineol (6 mM, n=6) e
após a injeção de corrente na célula (n=6). No gráfico, os limites das caixas representam o
25° e o 75° percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam,
respectivamente, a média e a mediana dos valores da duração do PA. * diferença estatística
significante dos dados apenas na fase final da exposição ao 1,8-cineol em relação às demais
(p<0,05, ANOVA, teste de Student-Newman-Keuls).
Já para a corrente limiar de geração do PA, seu valor foi 325 ± 73,9 pA (n=6) na
estabilização. Após a injeção da corrente, essa corrente limiar teve seu valor alterado para 583
± 138 pA (n=6). Estes dados, mostrados na Figura 31, apresentaram diferença estatística
significante entre si (p=0,012, teste-t de Student pareado).
Figura 31: Corrente limiar de geração do PA na estabilização (n=6) e após a
Fases do experimento
Corrente limiar antes Corrente limiar após
Corrente limiar (pA)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
*
injeção de
corrente na célula (n=6). No gráfico, os limites das caixas representam o 25° e o 75°
percentil dos dados e as linhas pontilhada e contínua no interior representam,
63
respectivamente, a média e a mediana dos valores da corrente limiar de geração do PA.
* diferença estatisticamente significante entre os dados (p=0,012, teste-t de Student pareado).
64
5. DISCUSSÃO
5.1 Efeito do 1,8-cineol sobre as Preparações Intactas do GCS de Ratos
A grande descoberta deste estudo foi o bloqueio reversível do potencial de ação nas
células nervosas do gânglio cervical superior de ratos pelo 1,8-cineol, também conhecido por
cajeputol ou eucaliptol. Esse bloqueio se faz acompanhar de alteração reversível do potencial
de repouso, aspecto em que o 1,8-cineol se distingue de muitos terpenóides de baixo peso
molecular que são constituintes de óleos essenciais, como o eugenol e o estragol. Esses dois
constituintes são considerados anestésicos locais, ou seja, supostamente bloqueiam o PA sem
alterar o potencial de repouso celular. O presente estudo, dentro do melhor do nosso
conhecimento e do que está disponível na literatura internacional, é o primeiro a demonstrar
estes efeitos.
5.2 Estudos Anteriores Envolvendo o 1,8-cineol
Como já citado, estudos anteriores que envolvem a ação do 1,8-cineol sobre
eletrofisiologia concentram-se, primariamente, sobre a via de transdução de sinal do sistema
olfatório. Contudo, há diferenças da ação das substâncias chamadas de odorantes nesse
sistema. Chen e colaboradores (2006) mostraram uma ação modulatória de inibição do 1,8-
cineol sobre o canal ativado por nucleotídeos cíclicos (CNGC). Mas outros trabalhos mostram
que essas substâncias odorantes possuem papel de amplificação de transientes de cálcio
(ZUFALL et al., 2000) e possuindo papel chave na transdução do sinal olfatório. Ainda sobre
o trabalho de Zufall e colaboradores (2000), os autores encontraram que o 1,8-cineol
estimulava a via da adenosina monofosfato cíclica (cAMP) causando abertura dos CNGC e
permitindo a entrada de cálcio. Assim, esta entrada de cálcio possibilitava a abertura de um
canal específico, os canais para cloreto ativado por cálcio, e que ainda pode ser adicionada da
idéia de Reiserts e Matthews (2001) que propõe a existência de um mecanismo trocador de
sódio-cálcio para possibilitar a saída do cálcio que entra através dos CNGC durante as
respostas às substâncias odorantes.
65
Em relação à excitabilidade, o trabalho de Lima-Accioly e colaboradores (2006)
demonstra a ação do 1,8-cineol no bloqueio do PAC e que corrobora com a ação desta
substância neste trabalho na concentração de 6 mM. O trabalho citado anteriormente utilizou
uma faixa de concentrações entre 1 e 8 mM, onde a dose de 1 mM e 2 mM não demonstraram
efeitos significativos de bloqueio da excitabilidade. Neste trabalho, em doses menores do que
1 mM (especificamente 0,1 mM), não houve alteração dos parâmetros estudados, mas na dose
de 1mM houve um efeito em um grupo de células. Esse efeito apenas em um grupo de células
não é surpreendente, pois provavelmente a concentração de 1 mM está próxima da
concentração limiar de atuação dessa droga, faixa de concentração em que a dispersão de
efeito é maior.
5.3 Estudos Anteriores Envolvendo Constituintes de Óleos Essenciais
Outros constituintes de óleos essenciais que são terpenóides de baixo peso molecular,
como o anetol, estragol e eugenol e são similares ao 1,8-cineol, também apresentam efeitos
sobre preparações que envolvem o sistema nervoso e que possuem certa analogia com o 1,8-
cineol. Albuquerque e colaboradores (1995) fizeram um estudo sobre a ação do anetol e do
estragol (0,05 a 1 mg/ml) em preparações de músculo de sapos e ratos. Estes compostos são
isômeros, derivados do fenilpropanol e apresentaram duas ações nestes tecidos: uma de
depressão ou bloqueio da transmissão neuromuscular e a produção de contração quando as
preparações eram rapidamente resfriadas. Estes pesquisadores encontraram que estes
compostos bloquearam as contrações iniciadas por estimulação nervosa e que também a
resposta do reto abdominal de sapos à acetilcolina foi reduzida. Já para a segunda ação, estes
pesquisadores sugerem que o anetol e o estragol podem atuar no retículo sarcoplasmático,
mas não definem se sua ação se dá pelos mecanismos de liberação de cálcio destas reservas,
pelos mecanismos de seqüestro do cálcio ou por ambos os mecanismos.
O estragol também apresentou efeitos sobre o potencial de ação composto do nervo
ciático de ratos (LEAL-CARDOSO et al., 2004). Este composto induziu bloqueio do PAC de
maneira dose-dependente a partir da concentração de 2 mM. Na concentração de 4 mM, o
estragol alterou significantemente a amplitude pico-a-pico do PAC, a velocidade de condução,
a cronaxia e a reobase, demonstrando, assim, um bloqueio da excitabilidade nervosa neste
tipo de preparação.
66
Esse mesmo grupo de pesquisa também estudou o efeito do terpineol sobre o PAC nas
preparações do nervo ciático de ratos (MOREIRA et al., 2001). Estes pesquisadores também
encontraram que na concentração de 300 µM, houve redução da amplitude pico-a-pico e da
velocidade de condução ao fim de 180 min de exposição à droga. Na concentração de 600
µM, houve o bloqueio quase por completo do PAC e esse dado preenche um critério para dar
a essa substância, assim como o estragol e o 1,8-cineol, uma atividade anestésica local.
Entretanto, outros critérios devem ser obedecidos para a classificação dessa atividade, como a
interação direta da droga com canais para sódio dependentes de voltagem e ausência de
alteração consistente do potencial de repouso celular.
O timol também preenche, em parte, essa atividade anestésica local. Haeseler e
colaboradores (2002), estudaram o efeito de bloqueio do timol e mentol nas correntes de sódio
dependentes de voltagem em sistemas heterólogos de células HEK 293 expressando a
subunidade alfa dos canais para sódio das células nervosas IIA do cérebro de ratos ou os
canais para sódio do músculo esquelético humano, hSkM1. Os autores encontraram como
resultado principal que o timol, e de maneira menos potente o mentol, bloqueou os canais para
sódio dependentes de voltagem tanto neurais como esqueléticos de maneira dependente de
concentração sugerindo, assim, um efeito anestésico local e antinociceptivo.
5.4 Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Associados ao PA (Curso Temporal,
Amplitude, Inclinações, Duração) na Concentração de 6 mM
Em vistas deste trabalho, a concentração de 6 mM de 1,8-cineol apresentou efeito
máximo sobre as preparações intactas de neurônios do GCS de ratos. Como mostrado nos
resultados, todas as células sob esta concentração apresentaram inibição do PA com a
subseqüente alteração em todos os parâmetros estudados. A amplitude do PA ficou reduzida
apenas à resposta local ou resposta passiva da membrana celular e, como o PA foi inibido, foi
atribuído o valor zero aos outros parâmetros relacionados ao PA (inclinação máxima do ramo
ascendente e descendente e duração do PA). Nas células onde o impalamento pode ser
preservado por um longo tempo, houve a recuperação do curso temporal do PA e dos
parâmetros eletrofisiológicos, denunciando que os efeitos provenientes da ação do 1,8-cineol
são reversíveis. Em contraste com o trabalho de Lima-Accioly e colaboradores (2006) nessa
concentração, os efeitos provenientes do 1,8-cineol sobre o tecido foram rápidos, tanto na
67
inibição (em média 150 s) quanto na recuperação dos parâmetros, com a reversão do efeito de
inibição do PA sendo detectada após 2,5 min de lavagem até 45 min. Essa diferença na
velocidade de instalação e reversão desses efeitos talvez se deva a que os nervos ciáticos dos
estudos de Lima-Accioly foram mantidos intactos e com todos os envoltórios preservados.
Essa condição talvez tenha retardado o acesso do 1,8-cineol aos axônios.
5.5 Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Associados ao PA (Curso Temporal,
Amplitude, Inclinações, Duração) na Concentração de 1 mM
Na concentração de 1 mM pode-se distinguir dois blocos de resultados. Em um grupo
de células houve a inibição do potencial de ação, com características semelhantes às células
sob exposição de 1,8-cineol na concentração de 6 mM. A amplitude do PA ficou reduzida à
resposta passiva da célula e os outros parâmetros relacionados ao PA foram atribuídos o valor
zero. Contudo, nenhum impalamento pode ser mantido por um longo período de tempo para a
recuperação dos parâmetros e do curso temporal sob esta concentração. Em outro grupo de
células, não houve a inibição do PA após a exposição do 1,8-cineol por 150 s e os parâmetros
inclinação máxima do ramo descendente e duração do PA não sofreram alterações
significativas. Entretanto, pode-se suspeitar que a amplitude do PA foi reduzida, assim como
o valor da inclinação máxima do ramo ascendente foi alterado, porque se juntarmos o fato que
o potencial de repouso, sob esta concentração, permaneceu num valor estável tanto na fase
final da aplicação do 1,8-cineol como na lavagem, algum mecanismo deve ter atuado para a
diminuição dos parâmetros já citados. Caso aceite que a inclinação máxima do ramo
ascendente e a amplitude do PA foram alteradas sem alteração do potencial de repouso, esse
fato implica que o 1,8-cineol apresentou um componente de ação direta sobre o canal para
sódio, seja bloqueando, inativando, dificultando ou retardando a abertura deste canal.
Diversos trabalhos apontam a ação de substâncias diretamente sobre canais iônicos,
como o trabalho de Haeseler e colaboradores (2002) que demonstrou a ação do timol sobre os
canais para sódio dependentes de voltagem. Como a inclinação máxima do ramo ascendente
do PA está relacionada com corrente de íons sódio e visto que esse parâmetro teve seu valor
reduzido ao final da ação do 1,8-cineol na concentração de 1 mM, este trabalho também
propõe que esse composto, assim como o timol, deva ter uma ação direta sobre o canal para
sódio.
68
5.6 Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Resistência de Entrada da
Membrana e Potencial de Repouso na Concentração de 6 mM
A resistência de entrada da membrana celular sob a ação do 1,8-cineol na
concentração de 6 mM teve seu valor reduzido em todas as células estudadas. Nas células
onde o impalamento pode ser mantido por um longo tempo, houve recuperação do valor da
resistência de entrada. Mesmo não sendo estatisticamente significante a diferença entre o
valor da resistência ao final da ação o 1,8-cineol e da estabilização, Zufall e colaboradores
(2000) mostraram que esse composto possui uma ação similar à IBMX de ativação de canais
iônicos específicos (os canais CNGC), o que significa um aumento da condutância da
membrana (e conseqüente redução da resistência, pois resistência e condutância possuem uma
razão inversamente proporcional). Assim, durante a lavagem (onde já não há mais a presença
do 1,8-cineol e apenas da solução nutridora Locke) é de se esperar que não haja mais a
ativação da condutância, o que é denunciado pelos dados de recuperação da resistência de
entrada da membrana na fase final da lavagem.
O potencial de repouso, sob a ação do 1,8-cineol na concentração de 6 mM, sofreu
uma despolarização de, aproximadamente, 10 mV em todas as células estudadas.
Possivelmente esse seja um mecanismo de inibição do PA, pois a despolarização se dava de
modo lento e gradual. Desse modo, o potencial transmembrana alcançava os valores de
ativação dos canais para sódio lentamente acarretando, também, que esses canais entrassem
no estado de inativação. Assim, uma população de canais para sódio poderia rapidamente se
abrir, mas logo entrariam no estado inativado, onde assim permaneceriam até que o potencial
transmembrana retornasse ao valor do potencial de repouso original. Esse fato pode ser
demonstrado no grupo de células onde houve recuperação do curso temporal do PA. Nesse
grupo de células, como demonstrado nos resultados, o potencial de repouso voltou ao valor
inicial da estabilização. Essa despolarização pode ser comparada à despolarização sofrida por
outros tecidos (como os neurônios receptores olfatórios da salamandra e de ratos) quando
expostos ao 1,8-cineol.
O fato da despolarização da membrana ocorrer simultaneamente com a redução da
resistência de entrada reforça a hipótese da existência de canais para cátions ativados por
nucleotídeos cíclicos (CNGC) e de canais para cloreto ativados por cálcio nesse tipo de célula.
Reuter e colaboradores (1998) investigaram a existência dos canais para cloreto ativados por
69
cálcio nos neurônios sensórios olfatórios de ratos e o seu papel na transdução do sinal
quimioelétrico. Os pesquisadores encontraram que os canais para cloreto ativados por cálcio
conduzem uma corrente para dentro com efluxo de cloreto, que leva a uma despolarização da
membrana celular. Essa despolarização está ligada aos canais para cátions ativados por
nucleotídeos cíclicos. Quando os CNGC são ativados, eles permitem a entrada de cátions,
nesse caso principalmente o cálcio, para dentro da célula. Essa entrada de íons cálcio acarreta
na ativação dos canais para cloreto ativado por cálcio, com a saída de cloreto da célula e
despolarização da membrana. Contudo, esse mecanismo não é exclusivo para este tipo de
tecido, sendo encontrado em outras preparações (SÁNCHEZ-VIVES & GALLEGO, 1994;
ZUFALL et al., 2000; REISERT & MATTHEWS, 2001).
Algumas substâncias possuem efeito de liberação de cálcio das reservas intracelulares.
O etanol é uma destas substâncias que aumenta a concentração basal de cálcio intracelular,
além de inibir o influxo de cálcio extracelular através dos canais para cálcio dependentes de
voltagem em culturas de neurônios do GCS de ratos (XIAO et al., 2005). O 1,8-cineol
também possui essa atividade nos neurônios receptores olfatórios da salamandra (ZUFALL et
al., 2000; REISERT & MATTHEWS, 2001). Se o 1,8-cineol exercer esse efeito de liberação
de cálcio dessas reservas intracelulares dos neurônios do GCS de ratos, também seria possível
a ativação dos canais para cloreto ativados por cálcio, não dependendo diretamente dos
CNGC (SCOTT et al., 1995). Assim, esse seria um mecanismo adicional para a ativação deste
tipo de canal.
Os canais para cloreto ativados por cálcio aparecem em diversos tipos celulares como
nos neurônios da medula espinhal de ratos, motoneurônios, em cultura de neurônios do
hipocampo, nos neurônios do gânglio da raiz dorsal de ratos, entre outros (SCOTT et al.,
1995) e também em preparações de neurônios axotomizados do GCS de ratos (SÁNCHEZ-
VIVES & GALLEGO, 1994). Como esses tipos de canais já foram descritos no GCS e diante
dos resultados encontrados sob esta concentração, este trabalho sugere a possível ação do 1,8-
cineol sobre os canais para cloreto ativados por cálcio nos neurônios do GCS de ratos.
70
5.7 Efeito do 1,8-cineol sobre os Parâmetros Resistência de Membrana e
Potencial de Erepouso na Concentração de 1 mM
Sob a concentração de 1 mM, os dois grupos de células apresentam características
distintas. No grupo de células com inibição do potencial de ação, houve redução significativa
da resistência de membrana e despolarização do potencial de repouso. Novamente, estas
células apresentam características semelhantes a das células que foram expostas à dose de 6
mM. Já para as células sem inibição do PA, a resistência de membrana foi levemente
modificada, mas estatisticamente não significante. Como já citado o potencial de repouso não
sofreu alteração, demonstrando que o sistema causador da despolarização da membrana
celular na concentração de 6 mM não foi acionado (ou se foi acionado, atuou fracamente)
neste tipo de célula e sob a concentração de 1 mM.
5.8 Efeito do 1,8-cineol sobre Todos os Parâmetros na Concentração de 0,1 mM
Na concentração de 0,1mM, investigou-se a interferência do veículo solubilizante do
1,8-cineol, o DMSO, nessas preparações. A ausência ou presença do DMSO não alterou os
parâmetros eletrofisiológicos estudados. Como um todo, a concentração de 0,1mM não
mostrou alteração significativa nos parâmetros associados ao PA (amplitude, inclinações
máximas do ramo ascendente e descendente e duração do PA) nem na resistência de entrada
da membrana celular e no potencial de repouso. Esses dados demonstraram que realmente se
obteve um resultado dependente de concentração, pois valores pequenos de concentração não
promoveram efeito. Adicionalmente, demonstram que os resultados observados foram devido
à ação do 1,8-cineol e não do veículo da droga (DMSO).
Esses dados contrastam com alguns trabalhos encontrados na literatura, como o de
Reisert e Matthews (2001). Neste trabalho, os autores conseguiram obter respostas de
disparos de correntes com a aplicação de doses acima de 30 µM (ou 0,03 mM) de 1,8-cineol
nas células receptoras olfatórias isoladas de ratos. Além do mais, a dose de 100 µM (ou 0,1
mM) foi utilizada no trabalho de Reiset e Matthews (2001) e também deflagrou essas
respostas de corrente. O trabalho de Zufall e colaboradores (2000) também utilizou o 1,8-
cineol na concentração de 300 µM (ou 0,3 mM) para deflagrar respostas celulares nos
71
neurônios receptores olfatórios da salamandra. Quando os pesquisadores utilizaram um pulso
de 1 s de duração de 1,8-cineol na concentração mencionada acima, este composto induziu
uma despolarização, a partir do potencial de repouso de -60 mV, para -24 mV. Essa
despolarização durou em torno de 3 s e durante a fase de despolarização do potencial
transmembrana, disparos transientes de potenciais de ação ocorreram. Como se pode notar, a
menor dose de 1,8-cineol empregada neste trabalho pode provocar respostas em outros
tecidos. Entretanto, nos neurônios o GCS de ratos isso não foi constatado. Essa diferença de
potência farmacológica para os efeitos do 1,8-cineol no GCS em comparação com os
neurônios olfatórios não foi pesquisada no presente estudo. Contudo, pode-se sugerir como
hipótese explicativa que a expressão dos canais iônicos envolvidos na resposta ao 1,8-cineol
seja diferente nas duas preparações.
5.9 Efeito do 1,8-cineol sobre a Excitabilidade Celular
O 1,8-cineol também mostrou-se um bloqueador da excitabilidade celular nas
preparações intactas dos neurônios do GCS. Diversos trabalhos apontam os efeitos de
terpenóides no bloqueio da excitabilidade em nervo ciático de rato (LIMA-ACCIOLY et al.,
2006; LEAL-CARDOSO et al., 2004; MOREIRA et al., 2001). Perfizemos experimentos
onde o potencial de repouso, após o efeito despolarizante do 1,8-cineol, retornava ao seu valor
original da fase de estabilização. Dois parâmetros não tiveram alterações estatisticamente
significantes entre a fase de estabilização e após a injeção de corrente: inclinação máxima do
ramo descendente e duração do PA. Os outros parâmetros tiveram alterações significativas. A
amplitude do PA teve um valor menor do que a da estabilização, assim como a inclinação
máxima do ramo ascendente. Considerando que o potencial transmembrana ao final da
exposição ao 1,8-cineol foi imposto a um valor muito próximo e até mesmo igual ao potencial
de repouso na estabilização, deve haver algum mecanismo que esteja atuando para a redução
dos parâmetros já citados. Como proposto na concentração de 1 mM, o 1,8-cineol pode estar
atuando diretamente sobre os canais para sódio, diminuindo, assim, o valor da inclinação
máxima do ramo ascendente do PA e reduzindo a amplitude. Esse é mais um fato para a
inclusão desse mecanismo de atuação dessa droga sobre a inibição do PA.
Além do mais, a corrente limiar de geração do PA também foi modificada. De acordo
com os dados, é necessário um valor maior de corrente para deflagrar uma resposta da célula.
72
Assim, visto estas alterações nesses parâmetros, demonstrou-se que o 1,8-cineol atuou no
bloqueio da excitabilidade celular nesse tipo de preparação.
5.10 Considerações Finais
Esse estudo demonstra que o 1,8-cineol possui efeitos de inibição do PA e bloqueio da
excitabilidade neuronal. O 1,8-cineol, assim como outros terpenos, apresentou uma atividade
anestésica local em trabalhos anteriores, de forma que é relevante a caracterização e possível
elucidação dos mecanismos de ação deste composto a partir de técnicas mais elaboradas,
como a do microeletrodo intracelular. Fatos de destaque neste trabalho estão no efeito deste
constituinte em despolarizar o potencial de repouso celular e da possível ação desta substância
sobre um canal iônico que provoca esse efeito. Além do mais, como existe uma larga
utilização de óleos essenciais constituídos por terpenos como o 1,8-cineol na medicina
popular e em medicamentos, esse estudo acrescenta novas informações sobre a ação deste
composto em preparações intactas de neurônios do sistema nervoso.
73
6. CONCLUSÕES
• O 1,8-cineol bloqueia o potencial de ação nas células nervosas do gânglio
cervical superior de ratos na concentração de 6 mM e 1 mM e seus efeitos são
reversíveis;
• Na concentração de 6 mM, o 1,8-cineol provoca despolarização do potencial
de repouso celular e alteração nos parâmetros eletrofisiológicos amplitude,
inclinações máximas do ramo ascendente e descendente, duração do PA e
resistência de entrada da membrana;
• Um possível mecanismo de inibição do PA encontra-se na ação direta do 1,8-
cineol sobre os canais para sódio dependentes de voltagem;
• Outro possível mecanismo reside na despolarização lenta e gradual do
potencial de repouso devido a ativação de um canal para cloreto ativado por
cálcio. A ativação desse canal pode se dar através da liberação de cálcio das
reservas intracelulares, devido à entrada de cálcio pelos canais para cátions
ativados por nucleotídeos cíclicos ou por ambos os processos, mediado pelo
1,8-cineol;
• O 1,8-cineol bloqueia a excitabilidade nervosa em células intactas do gânglio
cervical superior de ratos;
74
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