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Papel do zinco sobre a
fertilidade e função testicular
de ratos expostos ao tabaco
Botucatu - SP
2009
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista ‐
UNESP, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Doutor
no Programa de Pós‐Graduação em
Fisiopatologia em Clínica Médica
(Área de Concen‐tração: Saúde).
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PAPEL DO ZINCO SOBRE A FERTILIDADE E FUNÇÃO
TESTICULAR DE RATOS EXPOSTOS AO TABACO
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista -
UNESP, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Doutor no Programa de
Pós-Graduação em Fisiopatologia em Clínica
Médica (Área de Concentração: Saúde).
Orientador: Prof. Dr. Oduvaldo Câmara Marques Pereira
Botucatu – SP
2009
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PAPEL DO ZINCO SOBRE A FERTILIDADE E FUNÇÃO
TESTICULAR DE RATOS EXPOSTOS AO TABACO
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista -
UNESP, para obtenção do Título de Doutor no
Programa de Pós-Graduação em
Fisiopatologia em Clínica Médica (Área de
Concentração: Ciências da Saúde).
Botucatu – SP
2009
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL:
Rosemeire Aparecida Vicente
Garcia, Patricia Carvalho.
Papel do zinco sobre a fertilidade e função testicular de ratos expostos ao
tabaco / Patrícia Carvalho Garcia. – Botucatu : [s.n.], 2009.
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista, 2009.
Orientador: Prof. Dr. Oduvaldo Câmara Marques Pereira
Assunto CAPES: 40101002
1. Fumo – Vício. 2. Fertilidade. 3. Zinco.
CDD 616.07
Palavras-chave: Espermatozóides; Fertilidade; Função testicular; Tabaco;
Zinco.
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” UNESP
Faculdade de Medicina de Botucatu
Candidata: Patrícia Carvalho Garcia
Tese: Papel do zinco sobre a fertilidade e função testicular de ratos expostos ao tabaco
Orientador: Prof. Dr. Oduvaldo Câmara Marques Pereira
A comissão julgadora dos trabalhos de defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública
realizada a 18/02/2009, considerou
( ) Aprovada ( ) Reprovada
Examinador(a): Assinatura:.......................................................................................................
Nome:..............................................................................................................
Instituição:.......................................................................................................
Examinador(a): Assinatura:.......................................................................................................
Nome:..............................................................................................................
Instituição:.......................................................................................................
Examinador(a): Assinatura:.......................................................................................................
Nome:..............................................................................................................
Instituição:.......................................................................................................
Examinador(a): Assinatura:.......................................................................................................
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Instituição:.......................................................................................................
Examinador(a): Assinatura:.......................................................................................................
Nome:..............................................................................................................
Instituição:.......................................................................................................
Examinador(a): Assinatura:.......................................................................................................
Nome:..............................................................................................................
Instituição:.......................................................................................................
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A Deus
Presença constante em minha vida!
Dedi catória
Aos meus Pais: Durval e Maria José
e aos meus irmãos: Mirna, Mirela, Marcelo e Alexandre.
Pelo imenso amor, enorme compreensão, orações e constante
estímulos que me impulsionaram a buscar vida nova a cada dia,
meus agradecimentos por terem aceito se privar de minha companhia
pelos estudos, concedendo a mim a oportunidade de me realizar ainda mais.
Dedi catória
Ao Prof.Dr. Oduvaldo Câmara Marques Pereira
Não existem palavras que possam exprimir a gratidão
e o reconhecimento por transmitir suas experiências
e conhecimentos com muita dedicação e respeito.
Obrigada por todos esses anos preciosos de ensinamentos!
Dedi catória
Ao meu namorado Fabiano Paixão
Se hoje consigo subir mais um degrau da escada
da vida é porque sempre tive você ao meu lado.
Obrigada por fazer parte de minha vida!
TzÜtwxv|ÅxÇàÉá
Agradecimentos
A realização deste trabalho só foi possível graças á colaboração direta ou indireta de muitas
pessoas. Manifesto a todas elas e de maneira particular: a todos os amigos do Hemocentro
que sempre me incentivaram e me ajudaram a vencer mais um obstáculo: Adriana, Ana
Claudia, Carla, Claudete, Cléo, Fernando, Gleide, Giancarla, José Mauro, Marcelo, Márcia,
Nádia, Pollyanna, Sandra, Silvio, Rosane, Rejane, Rute e muitos que não citarei nome, mas
que estão no meu coração, muito obrigado!
A Dra. Eliana Milanesi Rubio, que me ensinou os primeiros passos da pesquisa científica e
de Educação, além de me apoiar e acreditar no meu trabalho.
Aos amigos Michele, Renata e Rodrigo pelos ensinamentos, dedicação e auxílios prestados
nos experimentos.
Aos amigos e professores do Departamento de Clínica Médica e Farmacologia, por terem
contribuído para meu crescimento intelectual e profissional.
Aos amigos dos Laboratórios Experimentais, em especial Ivone, Georgette, Mário e
Davidson, pelos cuidados com os animais e auxílio no desenvolvimento do protocolo
experimental.
Ao Professor Doutor Carlos Alberto Padovani, pelos auxílios prestados com maior
competência para a realização da análise estatística deste trabalho.
Aos amigos do departamento de Farmacologia pela amizade e pelas experiências acadêmicas
trocadas
Agradecimentos
A Maria Inês e Valéria Secco, pelos muitos ensinamentos, sempre me acolhendo e
incentivando minha vida profissional. Obrigado por acreditarem em mim
Às funcionárias da biblioteca pela revisão das referências bibliográficas.
Aos animais de laboratório utilizados para que este trabalho pudesse ser desenvolvido.
Aos amigos que embora não tenham contribuído diretamente, estão sempre ao meu lado.
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Epígrafe
Certeza!
De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que precisamos continuar...
A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar...
Portanto devemos:
Fazer da interrupção um caminho novo...
Da queda um passo de dança...
Do medo uma escada...
Do sonho uma ponte...
Da procura um encontro...
(Fernando Pessoa)
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Resumo
GARCIA, P.C. Papel do zinco sobre a fertilidade e função testicular de ratos expostos ao
tabaco. 2009. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) – Faculdade de Medicina de Botucatu,
Universidade Estadual Paulista – UNESP, São Paulo.
Aproximadamente um terço da população mundial é tabagista. Devido ao fato de ser um
carcinógeno que causa mutações nas células somáticas, o tabaco pode afetar a saúde
reprodutiva masculina. No homem o tabagismo é um fator de risco para o desenvolvimento de
diversas enfermidades urológicas, embora o mecanismo exato de atuação seja ainda
desconhecido. Por outro lado, ao analisarmos os aspectos reprodutivos, verificamos que o
zinco é essencial para a espermatogênese como um co-fator de metaloenzimas envolvidas na
transcrição do DNA, na expressão dos receptores esteróides e na síntese protéica, bem como
apresenta ação anti-oxidante e anti-apoptótica. Com base nestas informações, o objetivo do
presente trabalho consistiu em analisar o papel do zinco sobre a fertilidade e função testicular
de ratos expostos ao tabaco. Ratos Wistar com 60 dias de idade (n=10/grupo) foram divididos
em quatro grupos G1 (grupo controle), G2 (expostos a fumaça do tabaco-20 cigarros/dia), G3
(grupo controle suplementado com zinco-20mg/Kg cloreto de zinco diariamente por
gavagem) e G4 (expostos a fumaça do tabaco e suplementados com zinco). A duração do
tratamento foi de oito semanas. Ao final do experimento foram avaliados os seguintes
parâmetros: massa corporal, peso úmido dos órgãos da reprodução e da glândula adrenal,
concentração plasmática de testosterona, função testicular (análise seminal e produção diária
de espermatozóides), fertilidade e comportamento sexual. As respostas farmacológicas da
musculatura lisa genital acessória masculina (vesícula seminal e ducto deferente) a drogas
autonômicas e danos no DNA do espermatozóide foram também avaliados. Os resultados
foram comparados entre si pela análise de variância não-paramétrica, para modelo com dois
fatores, complementada com teste de comparações múltiplas de Tukey, p<0,05. No grupo G2
(exposto ao tabaco) observou-se uma diminuição na concentração de testosterona associada à
diminuição na concentração, na motilidade e na morfologia dos espermatozóides. Em
conseqüência desses efeitos tóxicos na espermatogênese verificaram-se taxas reduzidas de
fertilidade e viabilidade fetal. Foram também observados comprometimento no
comportamento sexual masculino e dano no DNA dos espermatozóides. No ducto deferente a
exposição ao tabaco levou a uma diminuição na resposta contrátil à noradrenalina sem
comprometer a sensibilidade. Finalizando, a suplementação com zinco foi capaz de proteger
os danos tóxicos que o tabaco provocou nos espermatozóides e na fertilidade. A exposição ao
tabaco mostrou-se também relacionada a uma diminuição na qualidade seminal. Demonstrou-
se assim uma correlação, entre o tabagismo e a infertilidade/subfertilidade masculina,
enquanto que a suplementação com zinco protegeu a maioria das alterações provocadas pelo
tabaco. Portanto o zinco, um agente anti-oxidante e estimulante de divisão celular, pode ser
indicado como um tratamento promissor em homens com infertilidade provocada pelos
componentes tóxicos do tabaco.
Palavras- chave: espermatozóides – tabaco - zinco - fertilidade – função testicular
TuáàÜtvà
Abstract
GARCIA, P.C. Role of zinc on fertility and testicular function of rats exposed to tobacco.
2009. Doctor Thesis- Botucatu Medical School, São Paulo State University – UNESP, São
Paulo.
About one-third of the world's male population smokes tobacco daily. Considering the larger
number of men worldwide who smoke, and that cigarette is a known somatic cells mutagen
and carcinogen, there is a major concern that smoking may adversely affect male reproductive
health. For men the smoking is a risk factor for the development of a variety of urological
diseases, although the exact mechanism of action is still unknown. Furthermore, when we
look at the reproductive issues, we found that zinc is essential for spermatogenesis as a co-
factor of metalloenzyme involved in the transcription of DNA, the expression of steroid
receptors and protein synthesis. In addition, zinc presents anti-oxidant and anti-apoptotic
actions. Based on this information, the purpose of this study was to examine the role of zinc
on fertility and testicular function in rats exposed to tobacco. Male Wistar rats were divided
into four groups (10/group): Control (G1), Cigarette smoke (G2), Zinc (G3: Zn 20mg/kg-
daily by gavages) and Zinc/cigarette (G4). The treatment was applied during eight weeks.
After finishing the treatment, the following parameters were analyzed: body weight, wet
weight of the reproductive organs and the adrenal gland; plasma testosterone concentration,
testicular function (seminal analysis and daily production of spermatozoa); fertility and sexual
behavior. The pharmacological responses of male accessory genital smooth muscle (vas
deferens and seminal vesicle) to autonomic drugs and DNA damage in the spermatozoa were
also evaluated. The results were compared by non-parametric analysis of variance, for model
with two factors, and the test for multiple comparisons of Tukey was applied when necessary ,
p<0.05. The exposure to cigarette smoke decreased the concentration of testosterone parallel
to a decrease in the concentration, morphology, and motility of spermatozoa. As a result of
these toxic effects on spermatogenesis the rates of fertility and fetal viability were reduced.
Impairment was also observed in male sexual behavior and damages the DNA in
spermatozoa. The vas deferens exposure to tobacco led to a decrease in contractile response to
norepinephrine without compromising the sensitivity to this drug. Finally, zinc
supplementation was able to protect the toxic damage that smoking caused in the spermatozoa
and fertility. Exposure to tobacco proved to be also linked to a decrease in spermatozoa
quality. This study showed a correlation between the smoking and male infertility/subfertility,
and that the majority of the changes caused by smoking was protected by zinc
supplementation. As a result the zinc, an anti-oxidant agent and stimulant of cell division, can
be indicated as a promising treatment in men with infertility caused by toxic components of
tobacco.
Key-words: spermatozoa – tobacco – zinc – fertility – testicular function
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Aparato utilizado para a exposição à fumaça do cigarro............................................35
Figura 2: A) Laparotomia exploratória; B) Dissecação de órgãos da reprodução e glândula
adrenal.........................................................................................................................................37
Figura 3: Análise seminal: A) Câmara de Makler; B) Amostra de espermatozóides na câmara
de Makler vista ao microscópio (10x); C) Vitalidade espermática (cabeça incolor = vivo e
cabeça corada = morto) (40x); D) Análise morfológica (40x)....................................................39
Figura 4: A) Câmara de Neubauer vista ao microscópio com os cinco quadrantes escolhidos
para contagem; B) Ampliação do quadrante e visualização das espermátides ou das cabeças de
espermatozóides..........................................................................................................................40
Figura 5: Laparotomia exploratória. A) Visualização dos cornos uterinos; B) Ponto de
reabsorção fetal; C) Ovários dissecados e corpos lúteos separados............................................42
Figura 6: Comportamento sexual. A) Caixa de observação; B) Comportamento sexual
masculino de monta com intromissão e fêmeas em lordose........................................................44
Figura 7: A) Polígrafo - transdutor de força isométrico e câmara muscular de órgão isolado; B)
Curvas concentração-resposta.....................................................................................................47
Figura 8: A) Equipamentos para a corrida de eletroforese: cuba de eletroforese com banho de
gelo e fonte de eletroforese; B) Microscópio de Fluorescência acoplado ao software Comet
Assay II........................................................................................................................................49
Figura 9: Taxas de perda pré- e pós-implantação, implantação e viabilidade fetal, de ratas que
acasalaram com machos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco...........................57
Figura 10: Curvas concentração-resposta para ACh (Acetilcolina) de vesícula seminal isolada
de ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco......................................................59
Figura 11: Curvas concentração-resposta para a MCh (Acetil-β-metilcolina) de vesícula
seminal isolada de ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco............................60
Figura 12: Lâminas contendo os espermatozóides dos diferentes grupos experimentais
analisadas pelo Software do Teste do COMETA para danos oxidativos no DNA. A)
espermatozóides dos ratos do grupo controle; B) espermatozóides dos ratos do grupo tabaco;
C) espermatozóides dos ratos do grupo zinco; D) espermatozóides dos ratos do grupo tabaco +
zinco............................................................................................................................................63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Massa corporal, peso úmido de órgãos da reprodução, da glândula adrenal e
testosterona plasmática dos ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco+zinco................52
Tabela 2: Análise seminal (vitalidade, motilidade, morfologia e concentração) dos ratos dos
grupos controle, tabaco, zinco e tabaco+zinco............................................................................53
Tabela 3: Contagem espermática (Número de espermátides, Produção diária de
espermatozóides, Número de espermatozóides na cabeça/corpo e cauda do epidídimo e trânsito
espermático) de ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco+zinco..................................55
Tabela 4: Número de ratas acasaladas e prenhes, corpos lúteos, fetos vivos, sítios de
reabsorção, pontos de implantação, índices gestacional, de fertilidade e de masculinidade,
obtidos a partir do teste de fertilidade com machos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco
+ zinco.........................................................................................................................................56
Tabela 5: Comportamento sexual (latência para a 1ª intromissão, número de intromissões,
latência para a 1ª ejaculação, latência para intromissão pós-ejaculação, número de intromissões
pós-ejaculação, número total de intromissões e número total de ejaculações) dos ratos dos
grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco..........................................................................58
Tabela 6: Respostas farmacológicas dos agonistas total Acetilcolina (ACh) e parcial Acetil-β-
metilcolina (MCh) em vesícula seminal isolada de ratos adultos dos grupos controle, tabaco,
zinco e tabaco + zinco.................................................................................................................60
Tabela 7: Resposta farmacológica do agonista total Noradrenalina em vesícula seminal e ducto
deferente isolados de ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco........................61
Tabela 8: Análise dos danos oxidativo do DNA nos espermatozóides dos grupos controle,
tabaco, zinco e tabaco + zinco, através do teste do COMETA...................................................63
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SUMÁRIO
1 Introdução 22
2 Objetivo 30
3 Material e Métodos
3.1. Animais
3.2. Drogas e reagentes
3.3. Acasalamento e diagnóstico de prenhez
3.4. Grupos experimentais
3.5. Exposição ao cigarro
3.6. Determinação da concentração plasmática de testosterona
3.7. Massa corporal e peso úmido de órgãos da reprodução
3.8. Avaliação da função testicular
3.9. Análise reprodutiva
3.10. Parâmetros farmacológicos
3.11. Determinação de danos oxidativos no DNA
3.12. Análise dos resultados
32
32
32
33
33
34
35
36
37
40
44
47
49
4 Resultados 51
5 Discussão 65
6 Conclusões 77
7 Referências Bibliográficas 79
8 Anexos 94
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Introdução
22
1 INTRODUÇÃO
O tabaco foi usado inicialmente nas Américas com propósitos religiosos e cerimoniais.
Atualmente, aproximadamente, um terço da população mundial de 15 anos ou mais é
tabagista (fumantes ativos), o que corresponde a 1,2 bilhões de pessoas. Uma parcela
significante de indivíduos é também afetada quando estes inalam fumaça proveniente do
cigarro (fumantes passivos) (DAVIS, 1997; ZENZES, 2000; YACH & BETTCHER, 2000).
O tabagismo é reconhecido mundialmente como um perigo à saúde e como principal causa de
algumas patologias. Porém, dados nacionais recentes têm mostrado prevalência ao redor de
40% entre homens e de 25% entre mulheres (BRASIL, 2004).
Considerando-se o grande número de tabagistas e o fato de que o tabaco é um
conhecido carcinógeno que causa mutações nas células somáticas, há um consenso que o
tabaco pode afetar a saúde reprodutiva masculina (SCHIMIDT, 1986; VINE, 1996; ZAVOS
et al., 1998; KAPAWA et al., 2004). Entretanto, por razões éticas, não é possível testar tal
hipótese em humanos através de um estudo randomizado e controlado. Além disso, poucos
constituintes do tabaco foram avaliados em relação à sua toxicidade ou efeito no
espermatozóide humano (SERGERIE et al., 2000; SALEH et al., 2002). Portanto, o impacto
do tabaco na fertilidade masculina permanece ainda um assunto altamente controverso. Vários
estudos mostram que o tabaco tem um efeito prejudicial na qualidade do sêmen, mais
significativamente na concentração, motilidade e morfologia dos espermatozóides (VINE et
al., 1996; MERINO et al., 1998; MAK et al., 2000). Além disso, o cigarro foi também
associado a um prejuízo na capacidade de penetração do espermatozóide (SOFIKITIS et al.,
1995). Adicionalmente, pais que fumavam tiveram um aumento significativo na porcentagem
de espermatozóides com algum dano no DNA (POTTS et al., 1999; LU & MORIMOTO,
2008) e um elevado risco de defeitos ao nascimento, além do aparecimento de câncer na
Introdução
23
infância em seus descendentes (ZHANG et al., 1992; SORAHAN, 1995; SORAHAN et al.,
1997). Por outro lado, estudos não encontraram associação entre o tabaco e a qualidade do
esperma (HOIDAS et al., 1985; VOGT et al., 1986), prejuízo na capacidade de penetração ou
dano no DNA do espermatozóide (SERGERIE et al., 2000). Tais resultados contraditórios
seriam, em parte, devido ao fato de que estes estudos foram conduzidos em duas populações
diferentes: homens saudáveis e homens inférteis. Outra importante fonte de conflito entre os
estudos pode ser a dificuldade em controlar fatores que se misturam como a exposição a
outras substâncias tóxicas, status socioeconômico e anormalidades na genitália masculina
(SALEH et al., 2002).
Há relatos de diminuição na concentração dos espermatozóides e do volume do sêmen
nos últimos 50 anos (CARLSEN et al., 1992; YOUNGLAI, et al., 1998). Isto vem sendo
associado a fatores ambientais e ao estilo de vida (SHARPE et al., 2000; SHARPE &
FRANKS, 2002; POLANSKA & WIDLAK, 2003). Diferentemente das causas genéticas de
infertilidade masculina, causas ambientais de infertilidade são de particular interesse devido à
possibilidade de medidas curativas ou preventivas. Um fator significativo e corrigível é a
nutrição e mudança de estilo de vida. Estudos experimentais em animais têm demonstrado a
importância dos efeitos da nutrição na espermatogênese (KWIECINSKI et al., 1989; VAN
PELT & ROOIJ, 1991; CIERESZKO & DABROWSKI, 1995; WONG et al., 2000a).
Infertilidade pode ser definida como a inabilidade de um casal sexualmente ativo, sem a
utilização de métodos contraceptivos, de estabelecer gravidez dentro de um período de um
ano, período no qual por volta de 90% dos casais o fazem. Ela é um fenômeno universal que
atinge aproximadamente 8% a 15% dos casais, independente dos fatores socioeconômicos ou
culturais (WHO, 1999). Aproximadamente 25% de todos os casos de infertilidade masculina
são atribuídos a defeitos nos espermatozóides. Destes casos, em 50% o defeito ocorre no
espermatozóide e pode estar relacionado ao consumo de tabaco (HULL et al., 2000). É
Introdução
24
importante se considerar que a infertilidade é um grande fardo psicológico e social para o
casal, que se vê incapaz de ter descendentes que possam vir a complementar seus projetos de
vida. O quadro atual das pesquisas sobre infertilidade mostra efeitos psicológicos múltiplos e
inter-relacionados. Pode abranger desde aqueles propriamente pessoais, como o estresse,
sentimentos de perda e o comprometimento da auto-estima, até as dificuldades para o
relacionamento conjugal, implicando mesmo em prejuízo para o relacionamento social mais
extenso (DUNKEL-SCHETTER & LOBEL, 1991; HANSELL et al., 1998; TRINDADE &
ENUMO, 2002).
No homem o tabagismo é também um fator de risco para o desenvolvimento de diversas
enfermidades urológicas, embora o mecanismo exato de atuação seja ainda desconhecido
(MIKHAILIDIS et al., 1998). A presença de cotinina, metabólito da nicotina, no líquido
seminal foi associada à toxicidade aos espermatozóides, alterando a morfologia, diminuindo a
motilidade e levando o homem a uma condição de subfertilidade (PATTERSON et al., 1990;
VINE et al., 1996; WONG et al., 2000b). Por outro lado, Trummer et al. (2002)
correlacionaram o tabagismo com baixos níveis de testosterona e um aumento no número de
leucócitos no sêmen. Este último, por sua vez, está associado ao estresse oxidativo seminal
pela produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (SALEH et al., 2002;
PASQUALOTTO et al., 2008). Portanto, o sêmen de indivíduos tabagistas pode apresentar
altos níveis de estresse oxidativo devido à quantidade elevada de EROs e uma capacidade
antioxidante reduzida (ASAMI et al., 1997; FRAGA et al., 1996; ZENZES et al.; 1999).
O mecanismo de ação das EROs na fisiologia normal dos espermatozóides não foi
completamente elucidado. Vários resultados de estudos convergem para a definição de que os
processos de hiperativação, capacitação, ligação com a zona pelúcida e reação acrossômica
sejam processos oxidativos ou regulados por redução (DE LAMIRANDE & GAGNON,
1995; DE LAMIRANDE et al., 1997; AITKEN et al., 1991). Fisiologicamente, existe um
Introdução
25
equilíbrio entre a produção de EROs e a proteção antioxidante. Os agentes antioxidantes estão
presentes tanto no gameta masculino (superóxido dismutase, catalase, glutationa
peroxidase/redutase, entre outros) quanto no plasma seminal (albumina, piruvato, taurina,
hipotaurina e vitaminas C e E, entre outros) (DE LAMIRANDE et al., 1997). No entanto, os
espermatozóides por si próprios possuem uma capacidade limitada de resistir ao estresse
oxidativo, sendo altamente dependentes do sistema de proteção antioxidante do plasma
seminal. Isto ocorre porque os espermatozóides possuem apenas uma pequena quantidade de
citoplasma em sua porção intermediária, o que por sua vez não é suficiente para a proteção
completa da membrana. Desta forma, a pouca quantidade de citoplasma e a presença de
grandes quantidades de ácidos graxos poliinsaturados na membrana plasmática dos
espermatozóides os tornam susceptíveis ao estresse oxidativo (AITKEN, 1994). Assim, a
produção excessiva de EROs leva à peroxidação lipídica, responsável por uma série de
eventos deletérios que afetam a integridade da cromatina espermática, causam alta freqüência
de quebra de fitas de DNA (FRAGA et al., 1996; AITKEN & KRAUSZ, 2001; HAUSER et
al., 2003); podendo prejudicar a concentração, motilidade e a morfologia dos espermatozóides
comprometendo assim seu bom funcionamento; diminuem a taxa de reação acrossômica,
capacitação espermática e ligação do espermatozóide à zona pelúcida do oócito devido a
perda de fluidez da membrana (ALVAREZ et al., 1987; AGARWAL et al., 1994; REQUENA
et al., 1997; PASQUALOTTO et al., 2000; SHARMA et al., 1999) e finalmente, podem
provocar a destruição da membrana plasmática levando à morte celular (CHEESEMAN &
SLATER, 1993; YAGI, 1987). Embora exista um consenso em relação ao estresse oxidativo
como a principal fonte de dano ao espermatozóide, pouco se progrediu para o
desenvolvimento de terapias antioxidantes para a infertilidade. Reforçando esses achados,
estudo anterior realizado em nosso laboratório (GARCIA et al., 2004), mostrou que
Introdução
26
indivíduos tabagistas apresentavam diminuição na qualidade seminal (volume, concentração,
motilidade e morfologia) levando a um estado de subfertilidade.
Adicionalmente, o tabaco contém substâncias químicas, que são capazes de induzir
aneuploidia, uma das mais comuns e sérias anormalidades cromossomais que afetam os
embriões e a prole humana. A aneuploidia compreende um dos maiores defeitos genéticos que
pode ser transmitido via espermatozóide (RUBES et al., 1998; SHI et al., 2001; COMHAIRE
et al., 2000). O mecanismo ainda é incerto, mas sabe-se que o tabaco contém agentes
aneugênicos e mutagênicos que podem atuar diretamente na meiose das células germinativas
após a formação de metabólitos tóxicos (RUBES et al., 1998; ROBBINS et al., 2005). Os
espermatozóides e as espermátides parecem ser altamente vulneráveis a mutações químicas
durante o período pós-meiótico, quando freqüentemente aparecem novos pontos de mutações
e rearranjos estruturais nos cromossomas (SALEH et al., 2002; SAKKAS et al., 2002). Os
espermatozóides, desta maneira, representam o produto celular final do processo de indução,
acumulação de dano cromossomal e mutação gênica que tenham ocorrido na linhagem
germinativa masculina. Agravante é o fato de que as células espermáticas possuem pouca
capacidade de reparo e, portanto, o risco de transmissão paternal de dano genotóxico é grande
(ZENZES et al., 1999; SAID, 2003; SHAMSI et al. 2008).
O zinco é um micronutriente que atua como co-fator para mais de 80 metaloenzimas
envolvidas na transcrição do DNA e na síntese protéica (EBISCH et al., 2006). Uma vez que
a transcrição do DNA é a principal parte do desenvolvimento das células germinativas, o
zinco é comumente importante para a reprodução. Desta forma, algumas proteínas formadas
com a participação do zinco estão implicadas na expressão genética dos receptores dos
hormônios esteróides (FAVIER, 1992; FREEDMAN, 1992). O zinco também têm
propriedades anti-apoptóticas (CHIMIENTI et al., 2003), anti-depressivas (CIESLIK et al.,
Introdução
27
2007) e anti-oxidantes (ZAGO & OTEIZA, 2001). Dois mecanismos para essa função
antioxidante foram descritos: o zinco pode agir contra a oxidação pela ligação aos grupos
sulfidril em proteínas, e por ocupar os sítios de ligação do ferro e cobre em lipídios, proteínas
e DNA (BRAY & BETTGER, 1990; ZAGO & OTEIZA, 2001).
O sistema antioxidante sanguíneo é classificado em enzimático e não enzimático. O
enzimático é representado, principalmente, pelas enzimas antioxidantes: a superóxido
dismutase (SOD) que catalisa a dismutação do ânion radical superóxido (O2
•
) a peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) e O
2
, a catalase (CAT) que atua na decomposição de H
2
O
2
a O
2
e H
2
O e a
glutationa peroxidase (GPx) que atua sobre peróxidos em geral, com utilização de glutationa
como co-fator (VASCONCELOS et al., 2007). A SOD corresponde a uma família de enzimas
com diferentes grupos prostéticos em sua composição. Nos sistemas eucariontes existem duas
formas de SOD. A forma SOD – cobre/zinco está presente principalmente no citoplasma,
enquanto que SOD - manganês está localizada primariamente na mitocôndria (FERREIRA &
MATSUBARA, 1997). A enzima Cu-Zn SOD é a primeira linha de defesa contra as espécies
reativas do oxigênio e contra a peroxidação do lipídio (SUN et al., 2006).
Na reprodução masculina o zinco parece ser importante em vários aspectos como:
esteroidogênese testicular (FAVIER, 1992; HAMDI et al., 1997; AGARWAL & SALEH,
2002); desenvolvimento testicular (HAMDI et al., 1997); consumo de oxigênio pelo
espermatozóide (ELIASSON et al., 1971; HUACUJA et al., 1973); condensação da cromatina
nuclear (KVIST et al., 1990); reação acrossômica (RIFFO et al., 1992); atividade da acrosina
(STEVEN et al., 1982); estabilização da cromatina do espermatozóide (KVIST et al., 1990);
síntese de testosterona (LEAKE et al., 1984), e conversão de testosterona a 5α –
dihidrotestosterona (NETTER et al., 1981). As concentrações de zinco estão muito elevadas
nos órgãos genitais masculinos, comparadas a outros tecidos e fluídos corporais (MANN,
1964), particularmente na glândula prostática a qual é amplamente responsiva às altas
Introdução
28
quantidades de zinco no plasma do sêmen. Os próprios espermatozóides contêm zinco,
provenientes dos testículos (KVIST et al., 1990). Entretanto, a relação entre as concentrações
de zinco no sêmen e os parâmetros de fertilidade, entretanto, não estão elucidados.
Omu et al. (1998) demonstraram que a terapia com zinco apresenta um importante
papel no tratamento de pacientes astenozoospérmicos, provavelmente pela sua ação
antioxidante, estabilizando a membrana do espermatozóide. Neste sentido, Koca et al. (2003)
demonstraram que pacientes inférteis tem uma diminuição nos níveis de frutose e zinco no
sêmen, sendo estes associados a uma diminuição na capacidade antioxidante, resultando em
dano na função dos espermatozóides. Estudos recentes também associam a deficiência de
zinco como fator de risco para subfertilidade masculina e após tratamento com o zinco foi
observada uma melhora na concentração e na motilidade dos espermatozóides dos pacientes
inférteis (WONG et al.,2000b; WONG et al., 2002; HAIDL, 2002).
Dessa forma, torna-se interessante uma maior atenção ao estilo de vida, hábitos
alimentares e/ou exposição a determinadas substâncias que possam levar a prejuízos na
reprodução, comprometendo assim a perpetuação das espécies. Procurou-se, desta maneira,
demonstrar os prováveis efeitos ocasionados pelo tabaco sobre a fertilidade e verificar se um
micronutriente como zinco, importante para a espermatogênese, pode proteger desses efeitos.
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Objetivos
30
2. OBJETIVO GERAL
Investigar alterações reprodutivas resultantes da exposição ao tabaco em ratos e o papel do
zinco como um possível protetor.
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
¾ Investigar se a exposição ao tabaco em ratos pode causar disfunções:
- no comportamento sexual, na fertilidade e parâmetros seminais;
- na concentração plasmática de testosterona, no peso corporal e de órgãos acessórios
da reprodução;
- no padrão de resposta da vesícula seminal e ducto deferente a drogas autonômicas;
- no DNA do espermatozóide;
¾ Avaliar se a suplementação com zinco pode atuar como um possível protetor das
disfunções resultantes da exposição ao tabaco.
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Material e Métodos
32
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1. ANIMAIS
Foram utilizados ratos albinos Wistar, machos e fêmeas, provenientes da colônia do
Biotério da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP. Para realização
dos experimentos, os animais foram transferidos para o Centro de Pesquisa Experimental da
Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, onde foram mantidos sob condições
padronizadas (temperatura de 25 ± 1
o
C, umidade de 55 ± 5 %, fotoperíodo de 12h claro/12h
escuro) e com água e ração à vontade. O projeto de pesquisa e o protocolo experimental foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Faculdade de
Medicina de Botucatu, UNESP (protocolo 430-anexo).
3.2. DROGAS E REAGENTES
Acetilcolina (acetylcholine chloride, Sigma Co., EUA); Acetil-β-metilcolina (acetyl-β-
methylcholine, Sigma Co., EUA); Ácido ascórbico P.A. (L-ascorbic chloride, Sigma Co.,
EUA); Adrenalina (epinephrine bitartrate, Sigma Co., EUA); Albumina bovina (Sigma Co.,
EUA); Bicarbonato de sódio P.A. (NaHCO
3
, Lab. Synth, Brasil); 17β-Benzoato de Estradiol
(Sigma Co., EUA); Cloreto de cálcio diidratado P.A. (CaCl
2
2H
2
O, Lab. Nuclear, Brasil);
Cloreto de potássio P.A. (KCl, Lab. Pro Analysi, Brasil); Cloreto de sódio P.A. (NaCl, Lab.
Nuclear, Brasil); Cocaine hydrochloride (Lab. Merck do Brasil); Corticosterona (Sigma Co.,
EUA); DL-Propranonol (Sigma Co., EUA); DTT (
DL
-Dithiothreitol, Sigma Co., EUA); EDTA
(Invitrogen S.A, EUA); Fenilefrina (phenylephrine hydrochloride, Sigma Co., EUA); Fosfato
de sódio hidratado P.A. (NaH
2
PO
4
H
2
O, Lab. Merck do Brasil); Glicose P.A. (Lab. Inlab,
Brasil); Noradrenalina (arterenol hydrochloride, Sigma Co., EUA); Prazosin hydrocloride
(Pfizer S.A); Propionato de Testosterona (Sigma Co., EUA); Pentobarbital Sódico (Hypnol
3%, Fontoveter); Proteinase K (Fungal, Invitrogen); Sulfeto de Amônio, solução a 40 %
Material e Métodos
33
puríssima (Vetec-Química fina Ltda); Thimerosal (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
EUA); Triton X100 (Octyl-phenoxy polyethoxyethanol, Sigma Chemical Co., EUA); MOPS
(3-N-morpholino propanesulfonic acid - Invitrogen S.A, EUA); Yohimbine hydrochloride
(Sigma Co., EUA);
3.3. ACASALAMENTO E DIAGNÓSTICO DE PRENHEZ
Para a obtenção dos diferentes grupos experimentais foram colocados para acasalar em
gaiolas coletivas, no final da tarde, duas ratas fêmeas adultas em proestro e estro, virgens e
ciclando normalmente, com um rato macho adulto comprovadamente fértil. Foram utilizados
animais com 90 dias de idade. Na manhã do dia seguinte, os machos foram retirados das
gaiolas das fêmeas e foram coletadas células da mucosa vaginal, com o auxílio de um swab
embebido em solução fisiológica (NaCl 0,9%), tomando-se o cuidado de não estimular a
cérvix, evitando-se assim a indução de pseudo-prenhez. O material coletado foi espalhado em
uma lâmina histológica para análise ao microscópio óptico (“Zeiss”, aumento 10/0, 25 x 6,3).
A prenhez foi considerada positiva quando foram encontrados espermatozóides nas lâminas
de esfregaço vaginal e constatada a fase estro do ciclo estral. Esse dia foi considerado o
primeiro dia da prenhez (PEREIRA et al., 2003).
3.4. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Aos 60 dias de idade, os filhotes obtidos no item anterior foram aleatoriamente distribuídos
em quatro grupos (n=10/grupo):
¾ Grupo 1 (controle): ratos não expostos à fumaça do tabaco e sem suplementação
com zinco;
¾ Grupo 2 (tabaco): ratos expostos à fumaça do tabaco (20 cigarros) uma hora por
dia, durante 8 semanas (adaptado de KAPAWA et al., 2004);
Material e Métodos
34
¾ Grupo 3 (zinco): ratos não expostos à fumaça do tabaco e suplementados com
zinco. Os animais receberam 20mg/Kg de cloreto de zinco – dose fisiológica
(PAKSY et al., 1996; ALI et al., 2002) por gavagem diariamente, durante 8
semanas;
¾ Grupo 4 (tabaco/zinco): ratos expostos à fumaça do tabaco (20 cigarros) uma
hora por dia durante 8 semanas e suplementados diariamente com zinco
(20mg/Kg de cloreto de zinco) por gavagem;
3.5. EXPOSIÇÃO AO CIGARRO
Foi utilizado o método descrito por Paiva et al. (2003), que utiliza um aparato
especialmente construído para expor os animais à fumaça de cigarro. Os ratos foram
colocados em uma câmara transparente conectada ao aparato de fumar com um volume de
aproximadamente 95x80x65 cm
3
. Puffs de fumaça foram retirados do cigarro por vácuo e
jogados na câmara. A fumaça foi liberada em uma taxa de 10 cigarros/30minutos com
intervalo de descanso de 10 minutos. Este procedimento foi realizado duas vezes no período
da manhã, até o final do período de tratamento (oito semanas), período que abrange o ciclo
espermático completo nos ratos – aproximadamente 52 dias (RUSSEL & BRINSTER, 1996;
FRANÇA et al., 1998). Foi utilizado cigarro comercial com a seguinte composição
especificada pelo fabricante: 0,7 mg de nicotina, 10 mg de alcatrão e 10 mg de monóxido de
carbono. A eficácia da exposição ao tabaco foi confirmada pela dosagem de carboxi-
hemoglobina que obteve os níveis equivalentes a tabagistas após um mês da exposição ao
tabaco (COHb/mg/dl= 5.3±2.8) (CASTARDELI et al., 2005).
Material e Métodos
35
Figura1. Aparato utilizado para a exposição à fumaça do cigarro.
3.6. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE TESTOSTERONA
Na manhã seguinte ao término do tratamento, os animais dos diferentes grupos
experimentais foram pesados, anestesiados com pentobarbital sódico, pela via intra-peritoneal
(i.p.), na dose de 40 mg/Kg e submetidos à laparotomia. Amostras de sangue foram coletadas
da artéria aorta abdominal, em seringas contendo heparina. Todo o experimento foi realizado
sempre no mesmo horário. Imediatamente após a coleta, as amostras de sangue foram
centrifugadas (2.500 rpm por 20 minutos a 2
o
C) e o plasma estocado a -20º C para posterior
determinação da concentração plasmática de testosterona por radioimunoensaio
(GERARDIN et al., 2005). Para a dosagem de testosterona plasmática foi utilizado o kit de
Testosterona total, Coat-A-Count® (Diagnostics Products Corporation, Los Angeles, CA,
USA). Consiste de um radioimunoensaio de fase sólida marcado com
125
I designado para a
dosagem quantitativa da testosterona em soro ou plasma em ratos sem extração. O principio
do procedimento é o imunoensaio competitivo, utilizando-se anticorpos altamente específicos
à testosterona. Foram utilizadas 20µL de cada amostra para o procedimento, sendo a
sensibilidade analítica do teste de 4ng/dL (0,14nmol/L). O coeficiente de variação intraensaio
foi de 4,1 %.
Material e Métodos
36
Para a dosagem de testosterona plasmática o procedimento consistiu em adicionar 50 µL da
amostra de plasma e 1mL de
125
I em tubos de polipropileno revestidos com anticorpos
específicos para a testosterona, sendo incubados em banho-maria a 37ºC durante 3 horas. Em
seguida, procedeu-se à remoção do
125
I. As contagens foram realizadas em contador de raios
gama (Gamma 5500B, Beckman), sendo a quantidade de testosterona presente determinada a
partir de uma curva de calibração. As análises foram realizadas no Laboratório do
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, sob supervisão da Profa. Dra. Eunice Oba.
3.7. MASSA CORPORAL E PESO ÚMIDO DE ÓRGÃOS DA REPRODUÇÃO
Os animais foram pesados e após a coleta de sangue (item 3.6) os órgãos da
reprodução (testículos, epidídimo, vesícula seminal com secreção e sem secreção - conteúdo
vesicular, ducto deferente e próstata ventral) e a glândula adrenal foram identificados,
removidos e dissecados (Figura 2). Após secagem em papel de filtro foram determinados os
respectivos pesos úmidos, empregando-se balança analítica. A partir do peso úmido dos
testículos direito e esquerdo e da massa corporal, foi determinado o índice gônado-somático
dos animais, empregando-se a fórmula:
Onde, TD = testículo direito e TE = testículo esquerdo.
X 100
massa corporal
peso do TD + peso do TE
Índice gônado-somático =
Material e Métodos
37
Figura 2. A) Laparotomia exploratória; B) dissecação de órgãos da reprodução e
glândula adrenal.
3.8. AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO TESTICULAR
A) Análises Seminais, adaptado para ratos da WHO (1999).
Os animais foram anestesiados com pentobarbital sódico, 40 mg/Kg, i.p. para a coleta
dos espermatozóides, por perfuração do ducto deferente. Imediatamente após, os
espermatozóides foram diluídos em 0,5 mL de meio de cultura e mantidos em placa
aquecedora a 37ºC, para análise microscópica.
¾ Motilidade espermática: 10µl de espermatozóides diluídos foram colocados na câmara de
contagem de Makler (Makler Counting Chamber, Sefi-Medical, Haifa, Israel- Figura 3A) e
a leitura feita em microscopia de fase no aumento 200X (Figura 3B). A leitura foi feita em
duas amostras diferentes de cada animal sendo analisados 100 espermatozóides por
amostra e realizada a média. Os espermatozóides foram classificados como móveis (tipo
A+B: espermatozóides com progressão rápida ou lenta, com capacidade fertilizante) e
imóveis (tipo C+D: espermatozóides sem progressão ou imóveis).
¾ Concentração espermática: após a análise do padrão de motilidade, verificou-se a
concentração dos espermatozóides estimada em milhões por mililitro. Utilizou-se câmara
de Makler com microscopia de fase, aumento 200X, com auxílio de contador de células. A
A
B
Material e Métodos
38
câmara de Makler possui uma profundidade de 0,01 mm e uma marcação graduada de 100
quadrados (área total de 1 mm
2
) cada um com 0,1 mm x 0,1 mm. O volume compreendido
na área de 10 quadrados após a colocação da lamínula é de 0,001 mm
3
ou 1 milhão por mL
(Figura 3B). Foram contados os espermatozóides presentes em 10 quadrados (marcação da
própria câmara) escolhidos aleatoriamente, em três campos diferentes e realizada a média.
¾ Vitalidade espermática: foi analisada após a sobrevivência dos espermatozóides ao
corante eosina. Em um tubo contendo 50 µL de espermatozóides diluídos em meio de
cultura foram adicionadas uma gota de eosina amarela (3%) e duas gotas de nigrosina
(8%). Após a homogeneização realizaram-se os esfregaços em lâminas. A vitalidade foi
analisada em microscopia de fase com aumento de 400X. Para cada animal foram
realizados dois esfregaços e em cada um foi contabilizado um total de 100 células e
realizada a média. Nos espermatozóides mortos a cabeça apresentou-se corada com eosina
(vermelho) e os vivos não se coraram (Figura 3C).
¾ Morfologia espermática: foram preparados dois esfregaços de sêmen para cada animal,
secados à temperatura ambiente e fixados em álcool 70 % por 15 minutos. As lâminas
foram coradas com hematoxilina e depois colocadas em corante de Shorr por 5 minutos.
Foram contados, no mínimo, 200 espermatozóides por lâmina com aumento de 1000X
(imersão) e classificados como morfologicamente normais ou anormais (Figura 3D)
(LINDER et al., 1992).
Material e Métodos
39
Figura 3. Análise seminal: A) Câmara de Makler; B) Amostra de espermatozóides na câmara
de Makler vista ao microscópio (10x); C) Vitalidade espermática (cabeça incolor = vivo e
cabeça corada = morto) 40x; D) Análise morfológica 40x.
B) Contagem espermática
O testículo e o epidídimo foram removidos e pesados (conforme item 3.7) e a seguir
estocados a -20ºC para posterior determinação da concentração de células germinativas.
¾ Contagem das cabeças de espermátides no testículo e cálculo da produção diária de
espermatozóides: Para a realização da contagem espermática, os testículos de ratos
foram descongelados, a túnica albugínea retirada, o parênquima testicular pesado,
homogeneizado com uma mistura de 0,9 % de NaCl, 0,05 % de Triton X100 e 0,01 % de
Thimerosal. A contagem das espermátides resistentes à homogeneização foi realizada
utilizando hemocitômetros. A contagem de espermatozóides foi realizada em câmara de
Neubauer (Figuras 4 A e B). Para cada animal, foi calculado o valor médio de quatro
contagens. O número de espermatozóides produzidos pelo testículo por dia foi estimado
pela razão entre o número total de espermátides por testículo dividido por 6,1, que é o
número de dias que essas espermátides maduras (estágio 19 da espermiogênese) estão
presentes no epitélio germinativo (GERARDIN et al., 2006).
A
B
C
D
Material e Métodos
40
¾ Contagem do número e cálculo do trânsito de espermatozóides no epidídimo: O
número de espermatozóides na cabeça/corpo e cauda do epidídimo foi estimado segundo
a técnica descrita por Robb et al. (1978). As porções epididimárias foram separadas logo
após a coleta e congeladas até homogeneização. A contagem de espermatozóides foi
realizada em câmara de Neubauer. Para cada animal, foi calculado o valor médio de
quatro contagens. O tempo de trânsito dos espermatozóides pelo epidídimo foi calculado
dividindo-se o número de espermatozóides na cabeça/corpo ou cauda epididimária, pelo
valor obtido na produção diária de espermatozóides de cada animal.
Figura 4. A) Câmara de Neubauer vista ao microscópio com os cinco quadrantes escolhidos
para contagem; B) Ampliação do quadrante e visualização das espermátides ou das cabeças
de espermatozóides.
3.9. ANÁLISE REPRODUTIVA
A) Teste de fertilidade
Os ratos dos diferentes grupos experimentais foram colocados para acasalar com ratas
adultas não tratadas, virgens e com ciclo estral regular. Cada rato foi colocado em uma gaiola
A
B
Material e Métodos
41
coletiva com duas fêmeas. A partir da manhã seguinte, diariamente e até o 15
o
dia ou até que
tenham acasalado, foi realizado o esfregaço vaginal (conforme item 3.3). O material coletado
foi espalhado em uma lâmina histológica para análise ao microscópio óptico (“Zeiss”,
aumento 10/0,25x6,3). O dia em que foram encontrados espermatozóides nas lâminas e
constatada a fase estro do ciclo estral, foi considerado o primeiro dia da prenhez. No dia
anterior ao término da prenhez as ratas foram eutanasiadas com overdose de pentobarbital
sódico, i.p., e colocadas em decúbito dorsal. Realizou-se uma incisão longitudinal na parede
abdominal para visualização dos cornos uterinos. A partir da análise do conteúdo dos cornos
uterinos (Figura 5A) foi determinado o número de implantações (fetos vivos, mortos e sítios
de reabsorção-Figura 5B). Quando necessário, foi realizada a técnica de coloração dos cornos
uterinos com o reativo de Salewski, uma preparação de sulfeto de amônio a 10 %
(SALEWSKI, 1964) que permite a visualização das implantações e de reabsorções precoces.
Adicionalmente, os ovários foram isolados e os corpos lúteos separados e contados (Figura
5C) (PEREIRA et al., 2003). A partir da contagem das implantações e dos corpos lúteos
foram determinados os seguintes parâmetros:
nº de fetos vivos
X 100
nº de implantações
nº de implantações
X 100
nº de corpos lúteos
nº de implantações – nº de fetos vivos
X 100
nº de implantações
nº de corpos lúteos – nº de implantações
X 100
nº de corpos lúteos
Taxa de perda pré-implantação =
Taxa de perda pós-implantação =
Taxa de implantação =
Viabilidade fetal =
Material e Métodos
42
A partir do total de fêmeas acasaladas (que apresentaram espermatozóides na lâmina
de esfregaço vaginal), fêmeas prenhes (que acasalaram e levarem a prenhez a termo) e fêmeas
que apresentaram fetos vivos, foram calculados os seguintes índices:
De posse do número de fetos (machos e fêmeas) obtidos por laparotomia em fêmeas não
tratadas acasaladas com machos dos grupos experimentais, foi possível determinar o índice de
masculinidade da prole:
Figura 5. Laparotomia exploratória. A) Visualização dos cornos uterinos; B) Ponto de
reabsorção fetal; C) Ovários dissecados e corpos lúteos separados.
B) Comportamento sexual
Após o teste de fertilidade os ratos dos diferentes grupos experimentais, agora
sexualmente experientes foram orquiectomizados bilateralmente, após anestesia com
pentobarbital sódico na dose 40 mg/Kg (i.p.) e mantidos em biotério com ciclo claro/escuro
nº de fetos machos
X 100
nº total de fetos
nº de fêmeas prenhes
X 100
nº de fêmeas que acasalaram
nº de fêmeas que apresentaram fetos vivos
X 100
nº de fêmeas prenhes
Índice gestacional =
Índice de fertilidade =
Índice de masculinidade =
A
B
C
Material e Métodos
43
invertido. Os experimentos iniciaram-se após um período mínimo de 15 dias para adaptação
dos animais ao ciclo claro/escuro invertido e recuperação da cirurgia. Para a avaliação do
comportamento sexual os animais foram colocados em gaiolas de observação (acrílico
transparente), durante o período escuro do ciclo claro-escuro, sob luz com filtro vermelho.
¾ Comportamento sexual masculino: Os animais orquiectomizados receberam
propionato de testosterona 1mg/dia (s.c.), três vezes por semana, durante 15 dias, de
modo que a primeira administração foi realizada no dia seguinte à orquiectomia e a
última, no dia anterior à avaliação do comportamento sexual masculino (RIBEIRO &
PEREIRA, 2005). Desta maneira, os níveis de andrógenos dos animais dos dois
grupos experimentais avaliados foram similares, descartando a hipótese de uma
deficiência hormonal, quando da ausência de comportamento sexual masculino. No
dia do experimento, inicialmente, cada macho foi colocado na gaiola de observação
(Figura 6A), onde permaneceram por pelo menos cinco minutos para adaptação. Em
seguida, introduziu-se na mesma caixa uma fêmea comprovadamente receptiva
(apresentando lordose) em estro natural ou induzido previamente pela administração
de benzoato de estradiol, 20μg/Kg, i.p. 24h antes do teste (ARTECHE et al., 1997,
GERARDIN et al., 2008). Os animais foram observados por 30 minutos. Contudo,
quando não apresentavam comportamento sexual ao final de 10 minutos, a avaliação
foi concluída e considerou-se que este não apresentou tal comportamento. Cada animal
foi testado uma única vez. Foram avaliados os seguintes parâmetros: latências para 1
ª
monta, intromissão, ejaculação; latências para 1
ª
monta e intromissão pós 1
ª
ejaculação; número de montas (montas sem inserção peniana e intromissões) e
intromissões até a 1
ª
ejaculação, número total de montas (montas sem inserção peniana
e intromissões), intromissões e ejaculações durante o teste. A ocorrência de
Material e Métodos
44
intromissão peniana foi considerada quando foi observado o seguinte conjunto de
sinais: monta com duração superior a dois segundos, lordose (encurvamento
característico do dorso da fêmea- Figura 6B) e limpeza da região genital do macho
após a monta. A ejaculação foi evidenciada pela observação de intromissão seguida
pelo levantar do tronco do macho e parada por alguns segundos.
Figura 6. Comportamento sexual. A) Caixa de observação; B) Comportamento sexual
masculino de monta com intromissão e fêmeas em lordose.
3.10. PARÂMETROS FARMACOLÓGICOS
Foram analisadas as respostas farmacológicas da musculatura lisa genital acessória
masculina (vesícula seminal e/ou ducto deferente) às drogas parassimpatomiméticas (agonista
total: acetilcolina e agonista parcial: acetil-β-metilcolina) para estudar o receptor muscarínico
e à droga simpatomimética (noradrenalina, na presença de um cocktail contendo propranolol
0,1 µM, ioimbina 0,1 µM, corticosterona 10 µM e cocaína 6µM e da incubação com o
antagonista prazosin em doses crescentes) para estudar o adrenoceptor α
1
. O cocktail foi
utilizado para bloquear β-adrenoceptores, adrenoceptores α
2,
captação extraneuronal e
B
A
Material e Métodos
45
captação neuronal, respectivamente, registrando assim as respostas induzidas pela
noradrenalina em adrenoceptor α
1
.
¾ Isolamento e montagem da vesícula seminal e ducto deferente para registro das
respostas a drogas autonômicas: Os ratos foram pesados e sacrificados por overdose de
pentobarbital sódico, i.p. Em seguida, a vesícula seminal desprovida de glândula
coaguladora e o ducto deferente foram identificados, removidos e isolados. Livres de
tecidos conjuntivos, os órgãos foram lavados internamente com líquido nutriente a 30ºC.
Para estudo das contrações isométricas da musculatura lisa genital acessória isolada foi
utilizado um polígrafo de dois canais “Ugo Basile” (modelo 7070, Figura 7A), segundo a
técnica descrita por Pereira (1987). A vesícula seminal e o ducto deferente foram
montados em câmara muscular de órgão isolado, com capacidade de 10 ml, contendo
líquido nutriente aerado, com auxílio de bomba de aquário e mantidos à temperatura de
30
o
C. O líquido nutriente utilizado foi o Tyrode modificado, segundo Picarelli et al.
(1962), com pH variando de 7,5 a 7,8, contendo a seguinte composição em mM: NaCl
136,0; KCl 5,6; CaCl
2
2H
2
O 1,8; NaH
2
PO
4
H
2
O 0,36; NaHCO
3
15,0 e glicose 5,5 diluídos
em água destilada. O órgão isolado foi fixado por uma extremidade à terminação S de
uma haste de vidro que foi colocada na câmara muscular e pela outra extremidade a um
transdutor de força isométrico “Ugo Basile” (modelo 7004) e submetido a uma tensão
inicial de um grama. A preparação permaneceu por um período de estabilização de 45
minutos, antes do início do experimento de resposta as drogas, sendo trocado o líquido
nutriente a cada 10 minutos. Após o período de estabilização o tecido foi estimulado com
KCl 80 mM e a contração registrada em polígrafo.
Material e Métodos
46
¾ Curvas concentração-resposta: As drogas acetilcolina, acetil-β-metilcolina e
noradrenalina foram preparadas a 10
-1
M em solução de HCl 0,01 N e mantidas à
temperatura de -20º C. Imediatamente antes de sua utilização a noradrenalina foi diluída
em solução de NaCl 0,9 %, contendo ácido ascórbico 0,005 % (PEREIRA et al., 1998) e
as drogas colinérgicas em solução de NaCl 0,9 %. Foram realizadas curvas concentração-
resposta completas pela técnica das doses cumulativas descritas por Van Rossum (1963),
onde a concentração da droga no líquido que banha o órgão vai aumentando
geometricamente (Figura 7B). As curvas iniciaram-se com baixas concentrações dos
agonistas, incapazes de provocar efeito mensurável, até atingirem concentrações altas, às
quais não se segue aumento de efeito. As curvas concentração-resposta para as drogas
colinérgicas (acetilcolina e acetil-β-metilcolina) foram realizadas nas vesículas seminais.
As curvas concentração-resposta para a noradrenalina foram realizadas em vesículas
seminais e ductos deferentes. Seguiu-se com pelo menos um par de curvas concentração-
resposta de noradrenalina até a verificação da estabilidade da preparação, refletida pela
obtenção de curvas semelhantes. A seguir foram realizadas curvas concentração-resposta
de noradrenalina na presença (incubado por 15 minutos) do antagonista prazosin em
concentrações crescentes (10
-8
, 3x10
-8
e 10
-7
M) e do cocktail contendo propranolol (0,1
µM), ioimbina (0,1 µM), corticosterona (10 µM) e cocaína (6 µM). Foi observado um
intervalo de tempo de 30 minutos entre uma curva concentração-resposta e outra.
¾ Parâmetros de sensibilidade a drogas: Após a obtenção das curvas concentração-
resposta, foi estimada a potência dos agonistas através da determinação do parâmetro
pD
2
, expresso como o negativo do logaritmo da concentração do agonista, a qual produz
50 % do seu efeito máximo (MILLER et al., 1948), determinado pelo método gráfico de
interpolação de cada curva concentração-resposta obtida, empregando-se o software
Material e Métodos
47
Prisma 3.0. Para o agonista parcial foi determinada também a atividade intrínseca (α),
resultado da comparação do efeito máximo do agonista parcial acetil-β-metilcolina e o
efeito máximo produzido pelo agonista total acetilcolina (ARIENS, 1954). A potência do
antagonista prazosin (pA
2
) em antagonizar as respostas ao agonista noradrenalina foi
determinada por análise de regressão linear, utilizando a equação: -log K
B
= -log [B] + log
(DR-1), onde DR é a relação de concentração do agonista encontrada para obtenção de
efeitos iguais na ausência e na presença do antagonista; [B] é a concentração molar do
antagonista e K
B
é a constante de afinidade do antagonista pelo receptor em estudo. A
concentração do antagonista que promove um deslocamento à direita na curva
concentração-resposta do agonista de duas vezes corresponde ao pA
2
(KENAKIN, 1997).
Figura 7. A) Polígrafo - transdutor de força isométrico e câmara muscular de órgão
isolado; B) Curvas concentração-resposta.
3.11. DETERMINAÇÃO DE DANOS OXIDATIVOS NO DNA
A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), provenientes de diversos
componentes presentes no cigarro pode levar a indução de danos oxidativos no DNA. Estes
danos podem ser mensurados através do Ensaio Cometa, o qual detecta quebras de fita
simples, quebras de fita dupla e sítios lábeis alcalinos.
B
A
Material e Métodos
48
O ensaio foi conduzido de acordo com a metodologia adaptada de Singh et al. (2003)
que utilizou células humanas.Todas as etapas foram realizadas sob luz indireta. Uma alíquota
de 20 μL da suspensão de espermatozóides foi embebida em 100 μL agarose de baixo ponto
de fusão a 0,5% e difundida sobre uma lâmina de microscópio recoberta com agarose normal
a 1,5%. As lâminas foram cobertas com lamínulas e deixadas por 10 minutos, à 4ºC. Após
esse período, as lamínulas foram retiradas e as lâminas imersas em solução de lise (2,5 M
NaCl, 100 mM EDTA, 10mM Tris, 1% sal de sódio, N-lauril sarcosinato, pH 10, com 1% de
Triton X-100 e 10mM DTT-Ditiotreitol) por 24h, à 4ºC. Após esse período, as lâminas foram
deixadas 15 minutos em estufa a 37ºC e acrescidas de proteinase K (0,5 mg/mL) e deixadas
mais 22h em estufa a 37ºC. Em seguida, as lâminas foram imersas em solução de MOPS
(10x) por 1h e 20 minutos, à temperatura ambiente e abrigadas da luz. Posteriormente, as
células foram expostas a um tampão (solução de eletroforese: 500mM EDTA, 2 ml de
DMSO, 500 mM NaCl e 100 mM tris, pH 9), a 4
o
C, por 30 minutos, para permitir a
expressão das quebras de fita simples e dos sítios lábeis alcalinos (“alkali unwinding”). A
eletroforese foi conduzida, na mesma solução, a 4
o
C, por 30 min, a 25 V e 300 mA (Figura
8A). Após a eletroforese, as lâminas foram neutralizadas (0,4 M Tris, pH 7,5) por 15 minutos,
fixadas em etanol absoluto por 5 minutos e armazenadas. Posteriormente, as lâminas foram
coradas com 50 μL de Brometo de etídio (EtBr: 20 μg/mL) e analisadas em microscópio de
fluorescência acoplado a um sistema de análise de imagem (Comet Assay II – Perceptive
Instruments - Figura 8B). Foram analisadas, em aumento de 400x, 100 células (50 células por
lâmina). Os parâmetros utilizados para avaliação de danos no DNA foram a média do “tail
moment” e do “tail intensity”. Segundo o fabricante (Perceptive Instruments) “tail moment” é
definido como “quantidade de DNA da cauda x distância de migração da cauda e “tail
intensity” é a porcentagem de DNA na cauda do cometa. Estes parâmetros refletem o nível de
danos no DNA da cauda em cada célula.
Material e Métodos
49
Figura 8. A) Equipamentos para a corrida de eletroforese: cuba de eletroforese com
banho de gelo e fonte de eletroforese; B) Microscópio de Fluorescência acoplado ao
software Comet Assay II.
3.12. ANÁLISE DOS RESULTADOS
Foram determinadas as médias ± erro padrão ou desvio padrão da média e/ou
medianas e intervalos interquartis dos resultados obtidos nos quatro grupos experimentais. Os
resultados foram comparados entre si por testes estatísticos específicos (Técnica para análise
de variância não-paramétrica, para modelo com dois fatores, complementada com teste de
comparações múltiplas de Tukey). Foram consideradas significantes as diferenças associadas
à probabilidade p<0,05 (ZAR, 1999).
A
B
exáâÄàtwÉá
Resultados
51
4 RESULTADOS
4.1. MASSA CORPORAL E DE ÓRGÃOS DA REPRODUÇÃO, DA GLÂNDULA
ADRENAL E CONCENTRAÇÃO PLASMÁTICA DE TESTOSTERONA
A massa corporal e o peso úmido de órgãos da reprodução, da adrenal e concentração
de testosterona estão apresentados na Tabela 1. Não houve diferença entre os grupos com
relação à massa corporal, peso úmido do testículo, vesícula seminal, secreção vesicular,
próstata e adrenal. Entretanto, houve aumento significativo no peso úmido do epidídimo do
grupo zinco quando comparado com o grupo controle e aumento significativo no peso úmido
do ducto deferente do grupo tabaco + zinco quando comparado com os grupos tabaco e zinco.
Apesar de um aparente aumento na secreção vesicular no grupo tabaco e zinco quando
comparado aos grupos controle e tabaco + zinco, não se observou diferença estatisticamente
significativa. Adicionalmente constatamos uma diminuição significativa do nível plasmático
de testosterona no grupo de tabaco em relação ao grupo controle e tabaco + zinco.
Resultados
52
Tabela 1. Massa corporal, peso úmido de órgãos da reprodução, da glândula adrenal e
testosterona plasmática dos ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco+zinco.
Grupos Experimentais
Parâmetros Controle Tabaco Zinco Tabaco + Zinco
Massa Corporal (g) 400,02±47,65 369,91±30,83 383,10±39,25 415,40±78,21
Testículo (g) 1,72±0,24 1,77±0,13 1,71±0,25 1,76±0,16
Epidídimo (g) 0,50 (0,47-0,55) 0,54 (0,50-0,56) 0,58 (0,55-0,58)* 0,59 (0,56-0,62)
Vesícula seminal (g) 0,15 (0,14-0,16) 0,14 (0,13-0,17) 0,14 (0,11-0,18) 0,15 (0,13-0,19)
Secreção vesicular (g) 0,41±0,03 0,47±0,09 0,50±0,01 0,40±0,09
Ducto deferente (mg) 74,60 (67,30-84,30) 71,10 (68,00-73,10 70,10 (65,50-80,00) 82,65 (75,10-94,70)#∆
Próstata (g) 0,34 (0,31-0,38) 0,33 (0,25-0,44) 0,37 (0,33-0,45) 0,32 (0,23-0,47)
Adrenal (mg) 28,22±4,50 26,72±4,00 23,04±5,86 24,49±5,44
Testosterona (ng/dl) 158,50(102,30-
604,00)
82,50(53,20-
99,50)§
364,00(110,90-
711,00)
235,00(130,00-
461,50)∆
Valores expressos em média ± DP ou mediana e intervalo interquartil (IQ
25%
-IQ
75%
) (10
ratos/grupo), p<0,05, teste análise de variância não-paramétrica para o modelo com dois
fatores complementada com teste de comparações múltiplas de Tukey.
§ p<0,05 (controle x tabaco); * p<0,05 (controle x zinco); ∆ p<0,05 (tabaco x tabaco + zinco)
# p<0,05 (zinco x tabaco + zinco).
O índice gônado-somático não apresentou diferença significativa entre os grupos [Controle=
0,86% (0,84-1,27); tabaco= 0,99% (0,83-1,40); zinco= 0,87% (0,82-1,34); tabaco + zinco=
0,84% (0,80-1,37)].
Resultados
53
4.2. AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO TESTICULAR
Os resultados da análise seminal da secreção contida no ducto deferente estão
apresentados na Tabela 2. Os ratos do grupo tabaco apresentaram reduções significativas nas
porcentagens de espermatozóide vivos e morfologicamente normais, bem como na
concentração espermática, em relação ao grupo controle e tabaco + zinco. Observou-se no
grupo zinco um aumento significativo na concentração, assim como na vitalidade e motilidade
dos espermatozóides quando comparado aos grupos controle e tabaco + zinco. A morfologia e
a vitalidade apresentaram-se diminuídas significativamente no grupo tabaco quando
comparados com o grupo controle.
Tabela 2. Análise seminal (vitalidade, motilidade, morfologia e concentração) dos ratos dos
grupos controle, tabaco, zinco e tabaco+zinco.
Grupos Experimentais
Parâmetros Controle Tabaco Zinco Tabaco +
Zinco
Vitalidade
(%) Sptz Vivos
98,00 (97,00-
98,00)
91,00 (89,50-
92,50) §
100,00 (99,00-
100,00) *
97,50 (97,00-
98,75) ∆#
Motilidade
(%) Sptz Móveis A+B
26,00 (14,00-
34,00)
17,50 (14,00-
19,00)
35,50 (34,00-
43,00)
22,00 (19,00-
24,00) ∆
Morfologia
(%) Sptz Normais
98,00 (97,25-
98,75)
96,00 (93,00-
97,00) §
97,00 (97,00-
98,75)
98,00 (97,25-
98,75) Δ
Concentração (x 10
6
)
66,20 ± 15,56 56,00
±
46,43 144,60
±
17,90* 127,30
±
27,03∆#
Sptz= espermatozóides
Valores expressos em mediana e intervalo interquartil (IQ
25%
-IQ
75%
) ou média ± DP de 10
ratos/grupo. p<0,05, teste análise de variância não-paramétrica para o modelo com dois
fatores complementada com teste de comparações múltiplas de Tukey.
§ p<0,05 (controle x tabaco); * p<0,05 (controle x zinco); ∆ p<0,05 (tabaco x tabaco + zinco)
# p<0,05 (zinco x tabaco + zinco).
Resultados
54
Na Tabela 3 encontram-se os resultados da contagem espermática. Os ratos do grupo
tabaco apresentaram reduções significativas no número de espermátides em relação ao grupo
controle. Observamos também aumento no número de espermatozóides nas porções cabeça-
corpo e cauda do epidídimo no grupo zinco quando comparado com o grupo controle. Para o
tempo de trânsito espermático na cabeça-corpo do epidídimo verificou-se um aumento
significativo do grupo zinco em relação ao grupo controle. O tempo de trânsito espermático
na cauda do epidídimo apresentou-se diminuída no grupo zinco quando comparado com o
grupo controle. Para todos os parâmetros da contagem espermática realizada observou-se
recuperação dos parâmetros no grupo tabaco + zinco quando comparados com o grupo tabaco.
Resultados
55
Tabela 3. Contagem espermática (Número de espermátides, Produção diária de
espermatozóides, Número de espermatozóides na cabeça/corpo e cauda do epidídimo e tempo
de trânsito espermático) de ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco+zinco.
Grupos Experimentais
Parâmetros Controle Tabaco Zinco Tabaco + Zinco
Número de espermátides
(10
6
/testículo)
219,52
±
18,54 201,89
±
12,67§
227,53±19,75 236,05±21,36∆
Número de espermátides
(10
6
/g/testículo)
1511,60
±
50,76 1346,40
±
70,45§
1623,30±80,71 1541,50±80,65∆
DSP (nº de espermátides
×10
6
/testículo/dia)
35,98
±
3,04 33,13
±
2,08 36,10 ± 5,10 38,84
±
3,50∆
DSP (nº de espermátides
×10
6
/rato/dia)
71,96±6,02 66,26±4,06 72,20±9,75 77,68±6,89∆
Número de sptz
×10
6
/g/cabeça-corpo do
epidídimo
337,48 (324,98-
347,46)
293,78 (288,74-
298,75)
980,00 (970,00-
1056,00)*
945,00 (930,00-
970,00)∆
Número de sptz
×10
6
/g/cauda do
epidídimo
845,75 (812,50-
898,36)
772,50 (730,14-
826,20)
1200,00(1060,0
0-1250,00)*
1180,00 (1070,00-
1210,00)∆
Tempo de trânsito
espermático na cabeça-
corpo do epidídimo
(dias)
2,76
±
0,40 2,56
±
0,39
3,85±0,31* 3,95±0,40∆
Tempo de trânsito
espermático na cauda do
epidídimo (dias)
4,56
±
0,29 4,97
±
0,67
2,65±0,16* 2,91±0,14∆
Sptz= espermatozóides; DSP: produção diária de espermatozóides. Valores expressos em média ± DP
10 ratos/grupo. p<0,05, teste análise de variância não-paramétrica para o modelo com dois fatores,
complementada com teste de comparações múltiplas de Tukey.
§ p<0,05 (controle x tabaco); * p<0,05 (controle x zinco); ∆ p<0,05 (tabaco x tabaco + zinco).
4.3. ANÁLISE REPRODUTIVA
A Tabela 4 apresenta os dados do teste de fertilidade de ratas controles não tratadas e que
foram acasaladas com ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e/ou tabaco + zinco. Apesar de
100% dos ratos do grupo tabaco acasalarem com as ratas controle, após 15 dias de coabitação,
somente 75% das ratas ficaram prenhes. Não houve diferença significativa entre os grupos
quanto ao número de corpos lúteos, sítios de reabsorção e sítios de implantação, bem como nos
índices gestacional e de masculinidade nas ratas prenhes dos diferentes grupos. No 21º dia de
Resultados
56
prenhez, as ratas que acasalaram com ratos do grupo tabaco apresentaram redução significativa
no número de fetos vivos quando comparado com o grupo controle, essa redução também foi
observada no grupo tabaco + zinco quando comparado ao grupo zinco. As ratas que acasalaram
com os ratos do grupo tabaco também apresentaram uma diminuição significativa da taxa de
fertilidade quando comparadas com as ratas que acasalaram com os ratos do grupo controle e
tabaco + zinco.
Tabela 4. Número de ratas acasaladas e prenhes, corpos lúteos, fetos vivos, sítios de reabsorção,
pontos de implantação, índices gestacional, de fertilidade e de masculinidade, obtidos a partir do
teste de fertilidade com machos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco.
Grupos Experimentais
Parâmetros Controle Tabaco Zinco Tabaco + Zinco
Fêmeas acasaladas
20 (100%) 20 (100%) 20 (I00%) 20 (100%)
Fêmeas prenhes
20 (100%) 15 (75%)§ 20 (100%) 19 (95%)
Corpos lúteos
10,50 (9,50-
11,50)
9,00 (7,50-
10,50)
12,00 (11,00-
13,00)
11,75 (10,50-
13,00)
Fetos vivos
12,25 (7,00-
14,50)
9,00 (7,50-
10,50) §
11,75(11,50-12,00) 9,75 (9,00-11,00) #
Sítios de reabsorção
1,00 (0,50-1,50) 1,25 (0,00-
2,50)
0,00 (0,00-1,00) 0,50 (0,00-1,00)
Sítios de implantação
11,25 (10,50-
11,50)
8,75 (6,00-
11,50)
10,00 (10,00-
11,50)
9,50 (8,50-11,00)
Índice gestacional (%)
Índice de fertilidade (%)
Índice de masculinidade (%)
100,00
100,00
55,55
93,33
75,00§
53,95
100,00
100,00
52,75
100,00
95,00∆
52,80
Valores expresso em mediana (IQ
25%
-IQ
75%
) ou % de 10machos/grupo (2 fêmeas/macho). p<0,05, teste
análise de variância não-paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada com teste de
comparações múltiplas de Tukey.
§ p<0,05 (controle x tabaco); ∆ p<0,05 (tabaco x tabaco + zinco); # p<0,05 (zinco x tabaco + zinco).
A partir dos dados da Tabela 4 foram calculadas as taxas de perda pré- e pós-
implantação, implantação e viabilidade fetal (Figura 9). Apesar das ratas que acasalaram com
ratos do grupo tabaco apresentarem um aumento aparente na taxa de perda pré-implantação e
diminuição na taxa de implantação quando comparada com as ratas dos outros grupos, não
houve diferença estatisticamente significativa. Observou-se, entretanto uma diminuição
Resultados
57
significativa (27%) na viabilidade fetal nas ratas que acasalaram com os ratos do grupo tabaco
quando comparado as ratas que acasalaram com os ratos dos grupos controle (G1= 98,13%;
G2=73,75%*; G3= 95,00%; G4= 92,41%).
*
Perda Pré-
implantação
Perda Pós-
implantação
Viabilidade
fetal
Implantação
Figura 9. Taxas de perda pré- e pós-implantação, implantação e viabilidade fetal, de ratas que
acasalaram com machos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco. Valores
expressos em porcentagem. *p<0,05 (grupo controle x tabaco), teste análise de variância não-
paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada com teste de comparações
múltiplas de Tukey.
A avaliação do comportamento sexual masculino encontra-se na Tabela 5. O grupo
tabaco apresentou uma demora significativa na latência para a 1ª intromissão. No entanto,
verificou-se um aumento na latência para a 1ª ejaculação, com diminuição no número de
intromissões quando comparado ao grupo controle. Reduções no número total de
intromissões, no número total de ejaculações e no número de intromissões pós-ejaculação
foram também observadas nos ratos do grupo tabaco quando comparado ao grupo controle. Já
Resultados
58
no grupo tabaco + zinco verificou-se uma redução significativa para a latência para 1ª
ejaculação, latência para intromissão pós-ejaculação, número de intromissões, número de
ejaculações e número de intromissões pós-ejaculação quando comparado com o grupo zinco.
Observamos ainda um aumento significativo no número de intromissões pós-ejaculação no
grupo tabaco + zinco quando comparado com o grupo tabaco.
Tabela 5. Comportamento sexual (latência para a 1ª intromissão, número de intromissões,
latência para a 1ª ejaculação, latência para intromissão pós-ejaculação, número de
intromissões pós-ejaculação, número total de intromissões e número total de ejaculações) dos
ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco.
Grupos Experimentais n=10
Parâmetros Controle
Tabaco Ø
Zinco Tabaco + Zinco
Latência para 1ª
intromissão (s)
36,50 (4,00-80,00) 115,00 (71,00-
193,00)§
54,50 (43,00-59,00) 75,50 (37,00-102,00)
Nº de intromissões
até 1ª ejaculação
26,00 (20,50-28,75) 18,50 (13,00-29,00) 23,00 (14,50-30,50) 22,00 (19,25-23,00)
Latência para 1ª
ejaculação (s)
1138,00 (1092,00-
1360,00)
389,50 (216,00-
541,00)§
1332,00 (756,00-
1800,00)
5422,50 (353,00-
637,00) #
Latência para
intromissão pós-
ejaculação (s)
1580,50 (1430,00-
1708,00)
270,00 (256,00-
316,00) §
1639,50 (1147,00-
1800,00)
2275,00 (229,00-
305,00) #
Nº de intromissões
pós-ejaculação
33,50 (23,00-53,00) 6,00 (2,00- 13,00) § 18,50 (7,00-29,00) * 13,50 (10,00-8,00) ∆#
Nº total de
intromissões
60,50 (49,00-67,00) 33,50 (25,00-38,00) § 51,00 (25,00-69,00) 35,00 (30,00-41,00) #
Nº total de
ejaculações
3,10 ± 0,73 1,50±0,70§ 2,80 ± 1,75 1,60±1,17#
Valores expressos em média + DP ou mediana (IQ
25%
-IQ
75%
). p<0,05, teste análise de
variância não-paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada com teste de
comparações múltiplas de Tukey.
Ø Dois animais do grupo tabaco não apresentaram comportamento sexual.
§ p<0,01 (controle x tabaco); * p<0,05 (controle x zinco); ∆ p<0,05 (tabaco x tabaco + zinco)
# p<0,05 (zinco x tabaco + zinco).
Resultados
59
4.4. PARÂMETROS FARMACOLÓGICOS
As curvas concentração resposta às drogas colinérgicas da vesícula seminal estão
apresentadas nas Figuras 10 e 11. Na Tabela 6 encontram-se os valores dos parâmetros de
sensibilidade obtidos a partir destas curvas. Observou-se uma diminuição significativa da
potência do agonista total - acetilcolina (pD
2
ACh) no grupo zinco quando comparada com o
grupo tabaco + zinco e um aumento significativo da potência do agonista parcial- acetil-β-
metilcolina (pD
2
MCh) no grupo tabaco quando comparado com o grupo controle e tabaco +
zinco. Para a atividade intrínseca (α), resultado da comparação do efeito máximo do agonista
parcial acetil-β-metilcolina e o efeito máximo produzido pelo agonista total acetilcolina,
verificou-se uma redução significativa no grupo tabaco quando comparado com o grupo
tabaco+ zinco. Não houve diferença significativa entre os grupos para a resposta contrátil
máxima da ACh.
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3
0
50
100
Controle
Tabaco
Controle + Zn
Tabaco +Zn
Log [M] Acetilcolina
% do Efeito
Zinco
Figura 10. Curvas concentração-resposta para ACh= Acetilcolina de vesícula seminal isolada
de ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco (n=5 ratos/grupo).
Resultados
60
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
0
50
100
Controle
Tabaco
Controle + Zn
Tabaco + Zn
Log [M] Acetilβ-metilcolina
% do Efeito
Zinco
Figura 11. Curvas concentração-resposta para a MCh= Acetil-β-metilcolina de vesícula
seminal isolada de ratos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco + zinco (n=5
ratos/grupo).
Tabela 6. Respostas farmacológicas dos agonistas total Acetilcolina (ACh) e parcial Acetil-β-
metilcolina (MCh) em vesícula seminal isolada de ratos adultos dos grupos controle, tabaco,
zinco e tabaco + zinco.
Grupos Experimentais
Parâmetros Controle Tabaco Zinco Tabaco + zinco
pD
2
ACh
4,81
± 0,18 5,08
±
0,15 4,65
±
0,24# 5,01
±
0,37
pD
2
MCh
4,67 ± 0,29 5,41
±
0,32§ 4,60
±
0,36 4,82
±
0,16∆
Atividade intrínseca
(α) da MCh
0,73
± 0,09 0,65
±
0,09 0,80
±
0,08 0,80
±
0,09∆
Resposta contrátil
máxima da ACh (g)
1,98 ± 0,10 2,02 ± 0,26 1,53 ± 0,20 1,41 ± 0,14
pD
2
= -log[ EC
50
]; α = razão entre resposta máxima do agonista parcial em relação ao
agonista total.
Valores expressos em média
± DP, 5 animais/grupo. p<0,05, teste análise de variância não-
paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada com teste de comparações
múltiplas de Tukey.
§ p<0,05 (controle x tabaco); ∆ p<0,05 (tabaco x tabaco + zinco); # p<0,05 (zinco x tabaco +
zinco).
Resultados
61
As respostas farmacológicas da vesícula seminal e do ducto deferente à Noradrenalina
estão apresentadas na Tabela 7. Não foi observado diferença estatisticamente significativa na
sensibilidade (pD
2
) à Noradrenalina na vesícula seminal, entretanto observou-se uma
diminuição significativa na resposta contrátil máxima no grupo zinco quando comparado com
o grupo controle. Todavia, no ducto deferente uma diminuição significativa foi observada no
grupo zinco em relação ao grupo controle na sensibilidade à Noradrenalina, porém não se
verificou diminuição significativa na resposta contrátil máxima para o grupo zinco, mas sim
para o grupo tabaco quando comparado ao grupo controle.
Tabela 7. Resposta farmacológica do agonista total Noradrenalina (NOR) em vesícula
seminal e ducto deferente isolados de ratos adultos dos grupos controle, tabaco, zinco e tabaco
+ zinco.
Grupos Experimentais
Parâmetros Controle Tabaco Zinco Tabaco +
zinco
pD
2
NOR (VS)
5,40
±
0,14 5,13
±
0,03 5,10 ± 0,18 5,18
±
0,06
Resposta contrátil máxima
da NOR (g) (VS)
2,88 ± 0,14 2,84 ± 0,39 1,96 ± 0,17* 1,92 ± 0,20
pD
2
NOR (DD)
6,02 ± 0,08 5,94± 0,20 5,70 ± 0,11* 5,76 ± 0,08
Resposta contrátil máxima
da NOR (g) (DD)
2,92 ± 0, 08 2, 52 ± 0,18§ 2,90 ± 0,16 2,48 ± 0,19
VS: Vesícula seminal; DD: Ducto deferente; pD
2
= -log[EC
50
].
Valores expressos em média ± DP, 5 animais/grupo. p<0,05, teste de análise de variância não-
paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada com teste de comparações
múltiplas de Tukey.
§ p<0,05 (controle x tabaco); * p<0,05 (controle x zinco)
Resultados
62
Para o ducto deferente que apresentou diminuição significativa a sensibilidade (pD
2
) à
Noradrenalina do grupo zinco em relação ao controle foram realizadas curvas concentração-
resposta de noradrenalina na presença do antagonista prazosin em concentrações crescentes e
do cocktail contendo propranolol, ioimbina, corticosterona e cocaína. A partir desses dados
determinou-se a potência do antagonista prazosin (pA
2
) em antagonizar as respostas ao
agonista noradrenalina por análise de regressão linear (pA
2
Ducto Deferente): grupo controle
7,85 ± 0,11 e grupo zinco 7,90 ± 0,06) e através da análise da regressão de Schild verificou-se
que a diminuição da sensibilidade encontrada no ducto deferente à Noradrenalina não se deve
a uma alteração dependente exclusivamente dos adrenoceptores α
1.
4.5. DETERMINAÇÃO DE DANOS OXIDATIVOS NO DNA
A avaliação dos danos oxidativos do DNA nos espermatozóides dos ratos dos
diferentes grupos experimentais, através do teste do COMETA, encontram-se na Tabela 8. O
grupo tabaco apresentou um aumento significativo na quantidade de danos no DNA da cauda
x distância de migração da cauda (tail moment) quando comparado ao grupo controle e tabaco
+ zinco. Também foi observado um aumento significativo na porcentagem de DNA lesado na
cauda do cometa (tail intensity) no grupo tabaco quando comparado ao grupo controle e
tabaco zinco. As lâminas contendo as células analisadas estão ilustradas na figura 12.
Resultados
63
Tabela 8. Análise dos danos oxidativo do DNA nos espermatozóides dos grupos controle,
tabaco, zinco e tabaco + zinco, através do teste do COMETA.
Grupos Experimentais
Parâmetros Controle Tabaco Zinco Tabaco + zinco
Tail moment
0,15 (0,08-2,51) 1,38 (0,01- 2,77)
§
0,50 (0,13-0,97) 0,49 (0,01-1,95) ∆
Tail Intensity
3,79 (1,77-6,75) 15,21(8,89-
20,01)§
5,38 (4,10-9,35) 7,57(5,64-12,48) ∆
Tail moment: é definido como “quantidade de DNA da cauda x distância de migração da
cauda; Tail intensity: é a porcentagem de DNA na cauda do cometa.
Valores expressos em mediana (IQ
25%
-IQ
75%
). P<0,05, teste análise de variância não-
paramétrica para o modelo com dois fatores, complementada com teste de comparações
múltiplas de Tukey. § p<0,05 (controle x tabaco); * p<0,05 (controle x zinco); ∆ p<0,05
(tabaco x tabaco + zinco)
A
B
C D
Figura 12. Lâminas contendo os espermatozóides dos diferentes grupos experimentais
analisadas pelo Software do Teste do COMETA para danos oxidativos no DNA. Os pontos
vermelhos representam as cabeças dos espermatozóides e os halos (dispersão dos
fragmentos) são proporcionais aos danos no DNA; A) espermatozóides dos ratos do grupo
controle; B) espermatozóides dos ratos do grupo tabaco; C) espermatozóides dos ratos do
grupo zinco; D) espermatozóides dos ratos do grupo tabaco + zinco.
W|ávâááûÉ
Discussão
65
5 DISCUSSÃO
Nos últimos anos, estudos sobre o estilo de vida, hábitos alimentares e/ou exposição a
determinadas substâncias tem sido associadas como possíveis contribuintes para o declínio na
concentração de espermatozóides e subseqüente infertilidade masculina (BECKER &
BERHANE, 1997). Tais estudos são interessantes, principalmente pela possibilidade de se
utilizar medidas preventivas, pois os tratamentos atualmente indicados para infertilidade em
reprodução assistida possuem custos elevados.
No presente estudo, foi observada uma diminuição significativa na concentração
plasmática de testosterona no grupo tabaco. Este hormônio é essencial para os caracteres
secundário e a completa competência reprodutiva no adulto (SELMANOFF et al., 1977;
FRANÇA et al.,1993; RUSSEL & FRANÇA, 1995). Nossos resultados corroboram com
aqueles encontrados por Yamamoto et al. (1998) que verificaram que ratos que inalavam a
fumaça do tabaco, possuíam baixos níveis de testosterona, associado à diminuição no número
de espermatozóides e baixa motilidade. Já a suplementação com zinco aumentou em duas
vezes a concentração plasmática de testosterona em relação à concentração do grupo controle,
mas ambos dentro da normalidade. Todavia, Omu et al. (1998) não observaram diferenças nas
concentrações dos hormônios sexuais (FSH, LH, Testosterona e Prolactina) após tratamento
com zinco em homens saudáveis.
O aumento significativo na concentração de testosterona nos ratos dos grupos
suplementados com zinco pode ter sido responsável pelo aumento na concentração de
espermatozóides no ducto deferente e no epidídimo desses animais. Por outro lado, a
diminuição da concentração de testosterona no grupo tabaco pode ter sido responsável pela
diminuição na concentração de espermátides observada no testículo. Além disso, estavam
Discussão
66
prejudicadas a morfologia (% normais) e a vitalidade (% vivos) dos espermatozóides dos ratos
do grupo tabaco. Neste sentido, os resultados de vários trabalhos associaram o tabagismo com
a diminuição da qualidade seminal (MAK et al., 2000; SALEH et al., 2002; KAPAWA et al.,
2004; GAUR et al., 2007; RAMLAU-HANSEN et al., 2007). Os efeitos prejudiciais na
qualidade dos espermatozóides de ratos (vitalidade, motilidade e concentração) foram
prevenidos no presente estudo, pela suplementação com o zinco, melhorando inclusive a
motilidade espermática dos animais tabaco + zinco em relação ao grupo tabaco. Li et al.
(2008) também observaram um aumento da concentração e motilidade espermática em
homens suplementados com zinco. A motilidade espermática depende diretamente da
produção de energia sob a forma de ATP pelas mitocôndrias presentes na peça intermediária
do espermatozóide. Assim, os espermatozóides podem apresentar uma diminuição na
motilidade devido a dois fatores: uma diminuição na produção de energia pelas mitocôndrias
da peça intermediária ou a ocorrência de lesão nas proteínas do axonema (AITKEN &
SAWYER, 2003; TURNER, 2003). Estudos realizados por De Lamirande & Gagnon (1992a,
1992b) indicaram que a motilidade espermática pode ser o indicador mais sensível de estresse
oxidativo, pois os altos níveis de EROs inibem as enzimas da fosforilação oxidativa e/ou da
glicólise, limitando a geração de ATP (BAUMBER et al., 2000; HUANG et al., 2000;
HUANG et al., 2001). Devido à abundância de ácidos graxos poliinsaturados nas membranas
das células germinativas e sua susceptibilidade à oxidação pela presença de grupos metilenos
entre duplas ligações, tornam-se alvos mais prováveis para ação dos oxidantes (WAGNER et
al., 1994; DIX & AIKENS, 1993). Shen et al. (1997) relataram altos níveis de 8-
Hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG) nos espermatozóides de tabagistas, sendo este a maior
forma de dano oxidativo, associado com presença de cotinina no plasma seminal. Nesse
sentido, um dos prováveis mecanismos envolvidos na diminuição da qualidade espermática
Discussão
67
observada nos ratos do grupo tabaco pode ser decorrente da formação de EROs. O zinco
provavelmente tenha protegido desses danos devido à sua ação antioxidante. Corroborando
com os efeitos antioxidantes do zinco, encontraram-se evidências de dano oxidativo em
proteínas, lipídios e DNA em ratos e camundongos zinco - deficientes (OTEIZA et al., 1995;
BAGCHI et al., 1998). Evidenciou-se também um efeito protetor do zinco contra o dano
oxidativo e na depleção da glutationa em camundongos (BAGCHI et al., 1998). É importante
considerar que contrariamente ao esperado o zinco bem como outros metais, em altas
concentrações, podem também catalisar as reações que levam à formação de EROs (LLOYD
et al., 1998).
O epidídimo é formado por ductos altamente contorcidos que conecta o ducto eferente
ao ducto deferente (HERMO & ROBAIRE, 2002; SULLIVAN et al., 2005). Os
espermatozóides de mamíferos ao sair do testículo são funcionalmente imaturos e necessitam
do processo de maturação que ocorre durante a passagem pelo epidídimo (CUASNICÚ et al.,
2002; OLSON et al., 2002). Em ratos a partir do momento que os espermatozóides atingem a
parte proximal da cauda do epidídimo, adquirem o potencial para a motilidade progressiva,
garantindo a sobrevivência e o sucesso na fertilização (ZENICK et al., 1994). Sabe-se
também que alterações no tempo de trânsito através do epidídimo têm uma importante função
na maturação dos espermatozóides. Assim, tais alterações, acelerando ou retardando, podem
alterar os parâmetros seminais como a quantidade, a morfologia e a motilidade dos gametas
(FERNANDEZ et al., 2007). No presente estudo o tabaco não interferiu no tempo de trânsito
dos espermatozóides, porém nos animais suplementados com zinco verificou-se um aumento
no tempo de transito da cabeça e corpo do epidídimo e uma diminuição na cauda do
epidídimo. Essas alterações no tempo de trânsito apresentaram um efeito benéfico para os
espermatozóides, uma vez que a permanência por mais tempo na cabeça e corpo do epidídimo
Discussão
68
provavelmente tenha melhorado a maturação dos espermatozóides. Assim, observou-se uma
melhora nos grupos zinco e tabaco + zinco nos parâmetros qualitativos seminais
(concentração, vitalidade e motilidade). Dessa forma, a saída mais rápida da cauda do
epidídimo não comprometeu a motilidade, pelo contrário melhorou. Esses resultados sugerem
que talvez essa parte final do epidídimo esteja apenas funcionando como armazenamento dos
espermatozóides já viáveis, em ratos. No presente estudo a exposição ao tabaco ocasionou
também efeitos tóxicos na espermatogênese, uma vez que as contagens espermáticas
reduzidas são usualmente consideradas indicadores para detectar quantitativamente os efeitos
adversos na espermatogênese (BAN et al., 1995). Os parâmetros espermáticos incluindo
motilidade e morfologia podem também fornecer informações do potencial de toxicidade
reprodutiva (SEED et al., 1996). Todavia a suplementação com zinco conseguiu prevenir e
até melhorar a função testicular dos animais expostos ao tabaco. Adicionalmente Chia et al.
(2000) relataram que as concentrações de zinco seminal estão baixas em pacientes inférteis.
Por outro lado, do ponto de vista reprodutivo, observa-se que a deficiência de zinco induz a
oligozoospermia, disfunção erétil e hipogonadismo em ratos e homens (SANSTEAD et al.,
1967; PRASAD & COSSACK, 1984; EBISCH et al. 2007).
No presente estudo, os ratos dos diferentes grupos experimentais foram capazes de
acasalar ratas controles. Porém, somente 75% das fêmeas acasaladas com ratos do grupo
tabaco ficaram prenhes. Todavia apresentaram redução no número de fetos vivos. Como
conseqüências observaram-se taxas reduzidas de fertilidade e viabilidade fetal. Como foram
encontrados espermatozóides no trato genital feminino dessas ratas, estes resultados sugerem
que os prejuízos observados na fertilidade podem estar relacionados com alterações na
qualidade dos espermatozóides. A diminuição na qualidade seminal tem sido então associada
com diminuição na fertilidade (OVERSTREET & KATZ, 1987). De fato, alterações nas
Discussão
69
análises seminais foram observadas no presente trabalho, incluindo reduções na concentração
espermática, vitalidade, motilidade e morfologia normal dos espermatozóides obtidos do
ducto deferente no grupo tabaco. Além disto, os ratos do grupo tabaco apresentaram reduções
na produção diária de espermátides. O número de espermátides presentes no testículo e a
produção diária espermática são então indicadores importantes da fertilidade masculina.
Como conseqüência das alterações nos parâmetros seminais observou-se uma
subfertilidade/infertilidade dos ratos expostos ao tabaco, reforçando estudos anteriores de
Kapawa et al. (2004) e Gaur et al. (2007) que já associavam tabagismo com diminuição da
fertilidade. Esses prejuízos no processo de fertilização podem ser decorrentes de alterações na
espermatogênese e na maturação espermática ou por uma toxicidade direta nos
espermatozóides (YAMAMOTO et al., 1998). Por outro lado, a suplementação com zinco foi
capaz de proteger os danos tóxicos que o tabaco provocou nos espermatozóides. Observou-se
então no presente estudo a recuperação de todos os parâmetros seminais e um aumento de
duas vezes no número de espermatozóides no epidídimo no grupo zinco, explicando um
significante aumento no peso desse órgão em relação ao grupo controle. Nossos resultados
corroboram com aqueles encontrados por Ebisch et al. (2006) que sugeriram que um dos
prováveis mecanismos de proteção pelo zinco seria por atuar sobre parâmetros endócrinos,
aumentando a espermatogênese através da estimulação das células de Sertoli e de Leydig.
Uma importante fonte exógena de radicais livres é o tabaco, um aerossol heterogêneo
composto de mais de 4000 elementos incluindo elevadas concentrações de EROs e do
nitrogênio (STEDMAN, 1968). Em tabagistas se faz obrigatório o uso das reservas corporais
de antioxidantes para neutralizar o elevado nível de EROs que são produzidas. Como
conseqüência ocorre uma depleção de antioxidantes, predispondo os tabagistas ao
desenvolvimento de doenças degenerativas (ANBARASI et al., 2006). Além disso, essa
Discussão
70
deficiência de antioxidantes em tabagistas pode ser agravada por uma nutrição pobre em
antioxidantes (ZONDERVAN et al., 1996). Quando o nível normal do sistema de defesa de
antioxidantes não é suficiente para erradicar as EROs livres em excesso, a administração ou
suplementação com antioxidantes exógenos tem um importante papel de proteção (REKHA et
al., 2001). Desta forma, o zinco provavelmente por sua ação antioxidante tenha sido capaz de
prevenir danos em vários parâmetros reprodutivos, no presente estudo. Neste sentido, tem
sido experimentalmente demonstrado que vários micronutrientes com propriedades
antioxidantes podem agir como efetivos agentes de proteção contra o estresse oxidativo
induzido pelos componentes do tabaco (SOHN et al., 1993; DILSIZ et al., 1999; HELEN et
al., 1999; KOUL et al., 2001; EBISCH et al., 2006; EBISCH et al., 2007; LI et al., 2008).
Adicionalmente o cádmio, um metal pesado também presente no tabaco, diminui a
biodisponibilidade do selênio e do zinco, levando a uma depleção do status de antioxidação
(PRESTON, 1991). Dessa forma a terapia com zinco e selênio mostrou-se efetiva em
tabagistas (AL-BADER et al., 1999; DILSIZ et al., 1999). Em adição, o tabagismo induz
doenças crônicas que secundariamente levam a alterações na cinética/metabolismo mineral,
agravando assim os danos causados pelo tabaco (ANBARASI et al., 2006).
Em relação ao comportamento sexual, no presente estudo, 80% dos ratos expostos ao
tabaco apresentaram comportamento sexual masculino associado a uma demora na latência
para a primeira intromissão, uma redução na latência para a primeira ejaculação, assim como
redução no número de intromissões pós-ejaculação, no número total de intromissões e
ejaculações, indicando uma possível diminuição na libido, associada à ejaculação precoce
e/ou disfunção erétil. Nossos resultados foram também semelhantes aos resultados
encontrados em vários estudos, que demonstraram efeitos prejudiciais do tabaco sobre o
comportamento sexual (diminuição da libido e disfunção erétil) em humanos (VIRAG et al.,
Discussão
71
1985; GOSSIAN et al., 1986; MIKHAILIDIS et al., 1998; ELHANBLY et al., 2004;
PASQUALOTTO et al., 2004). Por outro lado, a suplementação com zinco melhorou o
comportamento sexual dos animais. Todavia esta suplementação não conseguiu melhorar o
número de intromissões pós-ejaculação. O mecanismo para essas alterações provavelmente
nesse estudo não estavam relacionadas à redução no nível de testosterona observado em
tabagistas, uma vez que nesse estudo os níveis de testosterona plasmática foram
normalizados, antes da avaliação do comportamento sexual, sugerindo que outros fatores
podem também estar interferindo nesses parâmetros.
É interessante ressaltar que em roedores a fertilidade (capacidade de gerar
descendentes) não é um parâmetro muito sensível para estudos toxicológicos, visto que há
uma excessiva produção de espermatozóides nessa espécie, provavelmente desnecessários
para a fertilidade basal. Em humanos, porém, a produção espermática é bem reduzida
(SHARPE, 1994). Dessa forma, o potencial de um agente tóxico afetar a reprodução
masculina é provavelmente maior para humanos que para animais, já que em ratos uma
redução de 50 ou 90% no número de espermatozóides férteis durante o acasalamento não
diminui a fertilidade (AMANN, 1989). Mesmo assim, no presente estudo, o modelo
experimental de exposição ao tabaco em ratos foi capaz de induzir alterações prejudiciais nos
parâmetros espermáticos e conseqüentemente na fertilidade dos ratos, mostrando o potencial
prejuízo do tabagismo para a reprodução, em homens. Porém, a suplementação com zinco
mostrou-se efetiva em prevenir danos na reprodução. Assim, considerando que a
suplementação com zinco foi capaz de prevenir os efeitos prejudiciais do tabaco em espécies
menos sensíveis, especula-se que este tratamento apresente também um efeito potencialmente
benéfico em humanos.
Discussão
72
Os hormônios da reprodução são também de fundamental importância para o
desenvolvimento, para a manutenção do padrão de respostas e pela plasticidade dos receptores
autonômicos da musculatura lisa genital acessória, essenciais para a ereção e ejaculação.
Neste sentido, observamos, desde os trabalhos pioneiros de Wilcke (1937) que mudanças nos
níveis de hormônios da reprodução resultam em alterações na excitabilidade e contratilidade
da musculatura lisa genital acessória masculina. No presente estudo, a exposição ao tabaco,
induziu redução na concentração plasmática de testosterona e com isso pôde-se observar um
aumento na sensibilidade da vesícula seminal ao agonista parcial (MCh). A exposição ao
tabaco ocasionou prejuízos na contratilidade máxima da musculatura lisa genital acessória do
ducto deferente ao mediador NOR, provavelmente trazendo comprometimento na liberação
dos espermatozóides. Este prejuízo corrobora com o aumento no tempo de trânsito na cauda
do epidídimo que serve como um reservatório, bem como diminuição na concentração de
espermatozóides, observado no presente estudo.
Portanto, a redução da fertilidade observada nos animais do grupo tabaco
provavelmente tenha sido ocasionada pela diminuição da qualidade e quantidade espermática,
agravada pelas alterações na resposta contrátil da vesícula seminal e ducto deferente, às
drogas autonômicas, importantes no processo ejaculatório. Todavia, na vesícula seminal a
suplementação com zinco na dose utilizada, diminuiu a resposta contrátil, enquanto no ducto
deferente diminuiu a sensibilidade da musculatura lisa genital acessória à noradrenalina,
porém sem prejuízos na resposta contrátil. Isso provavelmente tenha acontecido como
conseqüência do aumento de duas vezes na concentração de testosterona. Nesse sentido,
vários autores observaram o aparecimento de contrações espontâneas e rítmicas e/ou aumento
de sensibilidade, a várias drogas, tanto no ducto deferente quanto na vesícula seminal isolados
de ratos após depressão androgênica (PICARELLI & VALLE, 1969; ABREU et al., 1980;
Discussão
73
PORTO et al., 1981; PEREIRA et al., 1991). Desta forma, níveis plasmáticos fisiológicos de
androgênios são realmente importantes para o desenvolvimento dos órgãos acessórios da
reprodução bem como para a manutenção do padrão de respostas da musculatura lisa genital
acessória masculina (PEREIRA et al., 1998), participando assim da manutenção da
homeostase reprodutiva.
Na análise dos danos oxidativos do DNA, através do ensaio COMETA padronizado
para espermatozóide de rato, no presente trabalho, pode-se observar um aumento de DNA
lesado no grupo tabaco. A suplementação com zinco também conseguiu evitar esses danos
ocasionados no DNA dos espermatozóides, sugerindo que um agente antioxidante pode ser
indicado como um tratamento promissor na proteção de dano oxidativo ao DNA. A
ocorrência da fragmentação de DNA em espermatozóides pode ser explicada por três
possíveis mecanismos: apoptose absortiva, falhas na compactação da cromatina e estresse
oxidativo (SAKKAS et al., 1999; SAILER et al., 1995; HUGHES et al., 1996; KODAMA et
al., 1997).
A liberação das EROs, sustentada por meio do alcatrão e de gases do cigarro, leva a
um estresse oxidativo promovendo a peroxidação do lipídio e, conseqüentemente, a
perturbações no sistema de defesa de antioxidantes no sangue e tecidos de tabagistas (PRYOR
& STONE, 1993; LU & MORIMOTO, 2008). A modulação no status de antioxidação pelo
aumento da peroxidação dos lipídios durante a exposição ao tabaco tem sido relatada em
vários órgãos (BASKARAN et al., 1999; CHITRA et al., 2000; DELIBAS et al., 2003). Esses
dados se somam aos demais resultados do presente estudo ao demonstrar também efeitos
prejudiciais do tabaco sobre a fertilidade, bem como em prevenir esses danos através da
suplementação com zinco que age como um antioxidante. Estes resultados sugerem que um
Discussão
74
dos mecanismos de dano causado pelo tabaco sobre a reprodução é mediado por ação das
EROs que levam ao estresse oxidativo.
Como mencionado anteriormente o zinco, também possui propriedades anti-
apoptóticas. Os efeitos inibitórios do zinco têm sido postulados como envolvendo dois
mecanismos: inicialmente nas vias apoptóticas, onde o zinco inibe as caspases (proteases
envolvidas na morte celular programada), e mais tarde, nos eventos da cadeia apoptótica na
qual o zinco pode anular as proteases cálcio e magnésio dependentes que causam a
fragmentação apoptótica do DNA (PERRY et al., 1997; CHAI et al., 1999; TRUONG-TRAN
et al., 2000; CHIMIENTI et al., 2003; SAID et al., 2004). É importante ressaltar que
concentrações altas de zinco podem ser tóxicas, induzir a apoptose e até mesmo a necrose
(TRUONG-TRAN et al., 2000; CHIMIENTI et al., 2003). Outras evidências sobre o
envolvimento do zinco na apoptose ocorreu pela observação de que a depleção do zinco pode
induzir apoptose em vários tipos celulares, enquanto que a suplementação com zinco pode
proteger as células contra diversas moléculas pró-apoptóticas prevenindo a morte celular
programada (SUNDERMAN-JR, 1995; CHIMIENTI et al., 2003). A apoptose induzida pelas
EROS pode ser inibida por vários antioxidantes (HOCKENBERY et al., 1993; KANE et al.,
1993). A administração de antioxidantes como o zinco, como demonstrado no presente estudo
pode melhorar o equilíbrio redox nas células. Todavia, Halliwell (1999) demonstrou que o uso
de antioxidantes como a vitamina C sem a precisa necessidade/indicação, pode
paradoxalmente induzir o dano ao DNA. Adicionalmente, os espermatozóides com dano no
DNA podem apresentar uma redução na capacidade de fertilização e implantação, porém
podem ocasionar conseqüências desconhecidas na saúde da próxima geração (LEWIS &
AGBAJE, 2008). Há um crescente número de estudos que associam riscos mutacionais
elevados em certas ocupações paternas (como a exposição a metais, solventes, pesticidas e
Discussão
75
principalmente o tabaco) a um aumento no número de defeitos ao nascimento e de câncer na
infância (OLSHAN & MATTISON, 1994; JI et al., 1997; SORAHAN et al.,1997; SMITH et
al., 2000). Novos relatos também mostram aumento de esquizofrenia, acondroplasia e na
Síndrome de Apert em filhos de homens mais velhos com elevados índices de dano no DNA
dos espermatozóides (AITKEIN & LULIIS, 2007). Esses dados sugerem que os danos no
DNA dos espermatozóides podem ter impacto negativo na saúde da prole, justificando uma
maior necessidade de estudos nesta linha para avaliar o real impacto do tabagismo na saúde
reprodutiva. Finalmente, o aumento do dano ao DNA dos espermatozóides dos ratos expostos
ao tabaco pode ser decorrente, ao menos em parte, do aumento dos níveis de estresse
oxidativo. Isso é suportado por estudos mostrando que o estresse oxidativo não somente
resulta em dano à membrana plasmática como também ao DNA nuclear do espermatozóide,
causando aumento de quebras nas fitas simples e duplas do DNA (TWIGG et al., 1998;
AITKEN, 1999; SALEH et al., 2002; AGARWAL et al., 2006; LU & MORIMOTO, 2008).
Frente aos dados acima discutidos, verificou-se que a exposição ao tabaco (fatores
ambientais e/ou estilo de vida) está relacionada a uma diminuição na fertilidade e que a
suplementação com zinco foi capaz de prevenir a maioria dos danos causados pelo tabaco,
mostrando-se como uma alternativa promissora no tratamento de homens com infertilidade
provocada pelos componentes do tabaco.
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Conclusão
6 CONCLUSÕES
¾ A exposição ao tabaco diminuiu a testosterona plasmática, sugerindo comprometimento
do eixo hipotálamo – hipófise – gônadas. A suplementação com zinco aumentou em duas
vezes a concentração de testosterona, sugerindo um possível mecanismo protetor.
¾ O tabaco comprometeu a quantidade e a qualidade espermática e subseqüente capacidade
de gerar descendentes viáveis. Entretanto, a suplementação com zinco protegeu os
espermatozóides dos efeitos do tabaco.
¾ Alterações observadas no comportamento sexual dos animais do grupo exposto ao tabaco
sugerem uma redução na libido com subseqüente ejaculação precoce e/ou disfunção erétil. O
zinco não foi capaz de prevenir estas alterações, entretanto melhorou a libido.
¾ No ducto deferente a exposição ao tabaco levou a uma diminuição na resposta contrátil
máxima à noradrenalina sem comprometer a sensibilidade, sugerindo um provável mecanismo
compensatório de liberação dos espermatozóides. Entretanto o zinco diminuiu a sensibilidade
do ducto deferente à noradrenalina sem comprometer a resposta contrátil.
¾ A exposição ao tabaco levou a danos oxidativos no DNA dos espermatozóides indicando
que o prejuízo à reprodução pode ter decorrido do estresse oxidativo. A suplementação com
zinco conseguiu prevenir esses danos ao agir como um antioxidante.
¾ A exposição ao tabaco está relacionada a uma diminuição na qualidade seminal,
demonstrando assim uma correlação entre o tabagismo e a infertilidade/subfertilidade.
¾ A suplementação com zinco protegeu a maioria dos danos provocados pelo tabaco,
mostrando que este agente antioxidante e estimulante de divisão celular pode ser uma
alternativa promissora em homens com infertilidade provocada pelos componentes do tabaco.
77
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ReferênciasBibliográficas
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