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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Bioquímica e Imunologia
Caracterização molecular da via de modificação pós -
traducional de proteínas dependente de SUMO em
Schistosoma mansoni
Fernanda Janku Cabral
Tese de Doutorado apresentada ao
Departamento de Bioquímica e
Imunologia da FMRP-USP, para
obtenção do título de Doutor em
Ciências, área de concentração:
Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues
Ribeirão Preto
2007
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Cabral, Fernanda Janku
Caracterização molecular da via de modificação pós -
traducional de proteínas dependente de SUMO em Schistosoma
mansoni. Ribeirão Preto, 2007.
154p., il., 30cm.
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP- Departamento de Bioquímica e Imunologia.
Orientador: Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues
1. Schistosoma mansoni, 2. Modificação pós-traducional,
3. SUMO, 4. RT-PCR
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Dedico este trabalho aos meus
queridos pais Heloisa e Sebastião
Cabral, por todo o amor, apoio e
incentivo. À minha irmã Heloísa Maria,
minha melhor amiga e a minha sobrinha
Maria Luísa.
Minha vida, nossas vidas formam um só
diamante
.
(
Carlos Drummond de Andrade)
Agradecimentos
À Universidade de São Paulo, pela formação científica, desde a graduação em Química
até o meu Doutoramento em Bioquímica.
Ao Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues, pela orientação, pela oportunidade de fazer a pós-
graduação estudando Schistosoma mansoni e SUMO em seu laboratório, por todos os
ensinamentos recebidos durantes todos esses anos e pela amizade. Muito Obrigada.
À Profa. Dra. Renata Guerra de Sá, pela co-orientação, por todo o treinamento em
Biologia Molecular, e também por me encaminhar pelo estudo da via de Sumorilação
como sendo um ponto interessante no desenvolvimento do parasita e pela amizade.
Aos membros da banca examinadora: Prof. Dr. Marcelo D. Gomes, Prof. Dr. Luis Ricardo
O. Tosi, Profa. Dra. Gloria R. Franco e Prof. Dr. Franklin D. Rumjanek, pela
disponibilidade e sugestões que contribuíram muito para este trabalho.
Aos professores do Departamento de Bioquímica e Imunologia, por todos os
ensinamentos de Bioquímica recebidos, em especial ao Prof. Dr. Wilson Lodi, por suas
observações sobre os meus resultados no exame de qualificação. Ao Prof. Dr. Fernando
de Lucca e Prof. Dr. João Atílio Jorge, pela disponibilidade em participar da minha banca
de qualificação. A Profa. Dra. Isis do Carmo Kettelhut, e a todos do seu laboratório, pela
atenção e apoio todas as vezes que precisei.
Ao Prof. Dr. Celso Rodrigues Franci, e a todos do seu laboratório, em especial Cláudia
Caligioni, Fernanda Lima e Bruno Del Bianco Borges, pela oportunidade de trabalhar em
colaboração no Laboratório de Neuroendocrinologia no Departamento de Fisiologia desta
faculdade.
À Profa. Dra. Isabel Miranda Santos, pelo apoio sempre que precisei e pelo incentivo.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e Imunologia, em especial aos
funcionários da secretaria, Ivone, Lúcia, Ronaldo e Teia, por todo o apoio técnico recebido
e pela amizade.
À Olinda Mara Brigato, pela manutenção do ciclo biológico do S.mansoni. À Elenice
Aparecida Macedo, pelo apoio técnico laboratorial. E também agradeço pela amizade
atenção e disponibilidade.
Ao Matheus Gomes, por ter gentilmente cedido uma alíquota da cultura de
esquistossômulos, realizadas no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular da
Universidade Federal de Ouro Preto, para as análises de qPCR. A todos do LBBM, pela
receptividade e hospitalidade, quando estive visitando o laboratório.
À Tânia Defina pela disponibilidade e auxilio técnico com a máquina de Real Time PCR,
presente no Departamento de Biologia Celular e Bioagentes Patogênicos, que está sob
coordenação da Dra Ângela Kaysel Cruz.
Aos funcionários da Documentação Científica, em especial Maria, pelo apoio técnico.
A todos que passaram pelo Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, entre 2000 a
2006, pela convivência agradável, pelos ensinamentos e amizade. Em especial Andressa
Andreoli, pela possibilidade de trabalharmos juntas; onde aprendi bastante e pela
amizade. Ao Olavo Pereira Jr, pela amizade e trabalho em equipe. E, William de Castro
Borges, pelo privilégio de conviver com você, pelos ensinamentos e amizade.
Aos atuais estudantes do Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas: Ana Carolina,
Carla, Cláudia, Enyara, Érika, Lizandra e Sérgio, pelo cotidiano alegre, discontraído e pela
amizade.
A todos os meus amigos de todos os tempos, aos que ainda vejo e aos que não vejo
mais, muitas saudades. A todos os amigos e colegas da pós-graduação. Ao William
Festuccia, pela amizade e por todo o tempo de convivência agradável que deixou
saudades.
À Sra. Maria Odette de Araújo Cortez, diretora da Associação de Cultura Brasil-Estados
Unidos, pelo apoio em todo o meu curso de Inglês, de onde sai, para ser bem sucedida no
teste de proficiência em língua Inglesa.
I am also glad to my American friends who helped me to advance my English, and to Paul
Pearson for things I learned with you at all.
Aos meus familiares, tios, tias, primos e primas (das Famílias Janku e Cabral). Aos meus
Avôs paternos Adelina e José Cabral (ambos in memorian). Aos meus Avôs maternos
Elvira e Josef Janku (in memorian), por todos os momentos felizes, por todo o carinho e
cuidados recebidos desde a infância e ao longo da vida.
À Pró-reitoria de pós-graduação, pelo auxilio concedido, para participar do VI International
Wokshop on Proteasomes, Clermont-Ferrand (França) e também no Experimental Biology
2006, São Francisco (CA), EUA. A FAPESP e a bolsa do CNPq, pelo auxilio financeiro a
este trabalho
Pelo sonho é que vamos,
comovidos e mudos.
Chegamos? Não chegamos?
Haja ou não haja frutos,
pelo sonho é que vamos.
Basta a fé no que temos.
Basta a esperança naquilo
que talvez não teremos.
Basta que a alma demos,
com a mesma alegria,
ao que desconhecemos
e ao que é do dia a dia.
Chegamos? Não chegamos?
- Partimos. Vamos. Somos.
(Sebastião da Gama)
________________________________________________________ Abreviaturas
i
ABREVIATURAS
αP
32
ATP Adenosina trifosfato radiomarcada na posição α com fósforo 32
ATP Adenosina trifosfato
BSA Albumina sérica bovina
°C Graus Celsius
CaCl
2
Cloreto de Cálcio
cDNA DNA complementar
Cm Centímetros
cpm Contagem por minuto
DEPC Dietilpirocarbonato
DNA Ácido desoxiribonucléico
DNAg DNA genômico
dNTP Deoxinucleosídeo trifosfato (N=A,C,G ou T)
DO Densidade óptica
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético (sal dissódico)
g Grama(s)
HCl Ácido Clorídrico
HEPES 2-4-(2-hidroxietil)-Piperazinil-(1)-Ácido Etanosulfônico
kDa Kilodaltons - 1kDa equivale a 1000 Daltons
kb Kilobases - 1kb equilvale a 1000 bases nucleotídicas
KCl Cloreto de Potássio
________________________________________________________ Abreviaturas
ii
LB Lúria Bertani - Meio de cultura bacteriano
mA Miliampère
M Mol.L
-1
(Molar)
MgCl
2
Cloreto de Magnésio
MgSO
4
Sulfato de Magnésio
mg Miligrama
mL Mililitro(s)
mM milimolar
mm milímetro
MOPS [Ácido 3-(N-Morfolino)Propanosulfônico]
NaCl Cloreto de Sódio
NaHCO
3
Bicarbonato de Sódio
Na
2
HPO
4
Fosfato de sódio dibásico
NaOAc Acetato de Sódio
NaOH Hidróxido de Sódio
ng nanograma
pb pares de base
PBS Solução salina tamponada com fosfato
RNAse A Ribonuclease A
RNA Ácido Ribonucléico
RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro
RPM Rotações por minuto
RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase Chain Reaction
qRT-PCR Quantitative Reverse Transcriptase – Polymerase Chain reaction
________________________________________________________ Abreviaturas
iii
SDS Dodecilsulfato de sódio
Taq Thermos aquaticus
Tris Tris-hidroximetilaminometano
U Unidades
Xg Velocidade de sedimentação em unidade gravitacional
µCi microcuries
µg micrograma
µL microlitro
µM micromolar
v/v volume/volume
V Volts
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................1
1.1 O Schistosoma mansoni....................................................................................2
1.2 O ciclo de vida do S. mansoni e a patologia da esquistossomose ....................3
1.3 O genoma do S. mansoni e a necessidade da era de descoberta de
genes ......................................................................................................................6
1.4 O início de um novo tempo: a era do genoma funcional .................................10
1.5 Modificação pós-traducional de proteínas.......................................................12
1.6 A proteína Ubiquitina – símile: Small Ubiquitin Modifier (SUMO)....................15
1.7 A via de conjugação de SUMO aos seus substratos alvo: o processo de
sumorilação...........................................................................................................16
1.8 A enzima E1 ativadora ou Aos1/Uba2.............................................................18
1.9 A enzima E2 conjugadora: a Ubc9 ..................................................................18
1.10 SUMO E3 ligases ..........................................................................................20
1.11 Proteases específicas de SUMO...................................................................23
1.12 As proteínas modificadas por SUMO ............................................................24
2. OBJETIVOS ......................................................................................................27
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................29
3.1. Manutenção do ciclo biológico do S.mansoni.................................................30
3.2. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos (Wilson &
Harrop, 1993) ........................................................................................................30
3.3 Anotação da via de modificação de proteínas ubiquitina-símile
dependente de SUMO em S. mansoni..................................................................32
3.4. Extração de RNA total....................................................................................33
3.5. Extração do RNA total para PCR quantitativo em tempo real ........................34
3.6. Quantificação de DNA e RNA ........................................................................35
3.7 Obtenção dos cDNAs para a análise da expressão dos genes que
codificam para os componentes da via de sumorilação em S. mansoni ...............35
3.8. Clonagem no vetor pGENT – easy do transcrito obtido por PCR e
transformação em células competentes................................................................37
3.9. Minipreparação de DNA plasmidial ................................................................37
3.10. Sequenciamento ..........................................................................................38
3.11. Análise computational das sequências ........................................................38
3.12. Análise da expressão diferencial dos genes que codificam para alguns
componentes da via de sumorilação utilizando PCR quantitativo .........................39
3.13. Análise da expressão e tamanho dos trancritos utilizando Northern Blot.....40
3.14. Preparo da sonda radioativa ........................................................................41
3.15. Reação de hibridização................................................................................42
3.16. Autoradiografia .............................................................................................43
3.17 Obtenção dos extratos totais e nucleares de parasitas adultos e
cercárias e Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1...............................43
3.18. Determinação da estrutura genômica dos genes que codificam para
SUMO e Ubc9 .......................................................................................................45
3.19. Extração do DNA genômico .........................................................................45
3.20. Amplificação das seqüências de SUMO a partir do DNA genômico ............46
3.21. Estimativa do número de cópias dos genes por Southern blot.....................47
4. RESULTADOS ..................................................................................................49
4.1. Análise in silico da via de sumorilação em S. mansoni. .................................50
4.2. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do cDNA
codificando para SMT3C em S. mansoni..............................................................52
4.3. Estrutura genômica do gene SmSMT3C e número de cópias desse gene
por genoma haplóide.............................................................................................55
4.4 Expressão do gene que codifica para SmSMT3C no ciclo de vida do
parasita. ................................................................................................................58
4.4.1- Padrão de transcrição de SmSMT3C no ciclo de vida do parasita ............58
4.4.2 Northern Blot ................................................................................................59
4.4.3 - Detecção dos conjugados sumorilados.....................................................59
4.5. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do gene que codifica
para a enzima conjugadora E2 de SUMO (Ubc9). ................................................62
4.6. Estrutura genômica do gene que codifica para SmUbc9 em S. mansoni.......65
4.7. Expressão do gene que codifica para o gene SmUbc9 no ciclo de vida do
parasita. ................................................................................................................67
4.7.1 - RT-PCR......................................................................................................67
4.7.2 – Northern Blot .............................................................................................68
4.7.3 – Western Blot..............................................................................................68
4.8 Caracterização do pseudogene  Ubc9 em S. mansoni.................................70
4.9 – Sequenciamento das seqüências genômica e do cDNA do gene ψ Ubc9 ...71
4.10 – Determinação do número de cópias dos genes SmUbc9 e ψUbc9 em
S. mansoni ............................................................................................................73
4.11 – Expressão do ψUbc9 nos estágios de desenvolvimento do parasita .........75
4.12. Anotação das enzimas E3 ligases e das proteases específicas de
SUMO ...................................................................................................................77
4.13. Caracterização da seqüência da proteína predita a enzima E3 ligase
SIZ-PIAS em S. mansoni ......................................................................................78
4.14. Análise da expressão do cDNA que codifica para PIAS1 no ciclo de
vida do parasita.....................................................................................................81
4.15. Caracterização da seqüência da proteína predita a enzima E3 ligase
RanBP2 em S. mansoni........................................................................................84
4.16. Caracterização da expressão do cDNA que codifica para RanBP2 em
S. mansoni ............................................................................................................87
4.17. Caracterização da seqüência predita da protease específica de SUMO
(SUSP) em S. mansoni .........................................................................................90
4.18. Caracterização da expressão do cDNA codificando para ULP1 no ciclo
de vida do parasita ................................................................................................93
5. - DISCUSSÃO ...................................................................................................95
5.1 SUMO..............................................................................................................96
5.2. Ubc9.............................................................................................................104
5.3. SUMO E3 ligases .........................................................................................111
5.3.1. Siz-PIAS....................................................................................................111
5.3.2. RanBP2.....................................................................................................115
5.4.Proteases de SUMO .....................................................................................118
6. CONCLUSÕES ...............................................................................................121
RESUMO.............................................................................................................124
SUMMARY..........................................................................................................127
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................130
APÊNDICES
Apêndice 1: SmSMT3C.......................................................................................146
Apêndice 2: SmUbc9...........................................................................................147
Apêndice 3: SUMO E3 ligases ............................................................................148
Apêndice 4: Protease específica de SUMO (ULP1) ............................................151
1. Introdução
__________________________________________________________Introdução
2
“O Jeca não é assim: está assim”
"Hei de empregar toda a minha fortuna nesta obra de saúde geral, dizia ele. O meu patriotismo é este. Minha divisa: Curar
gente. Abaixo a bicharia que devora o brasileiro..."
“Um país não vale pelo tamanho, nem pela quantidade de habitantes. Vale pelo trabalho que realiza e pela qualidade da
sua gente. Ter saúde é a grande qualidade de um povo. Tudo mais vem daí.”
Jeca Tatu – Monteiro Lobato
1.1. O Schistosoma mansoni
Na classe trematoda, encontramos a família Schistosomatidae que
apresenta sexos separados e são parasitos de vasos sanguíneos de mamíferos e
aves. Essa família é dividida em duas subfamílias: Bilharzielinae e
Schistosomatinae. Na primeira encontramos os vermes sem dimorfismo sexual,
que parasitam aves e alguns mamíferos domésticos ou silvestres, portanto sem
interesse médico direto. Na segunda, estão incluídos os que apresentam um nítido
dimorfismo sexual e com espécies que parasitam o homem e animais (Neves,
2005).
A espécie Schistosoma foi descrita primeiramente por Bilharz em 1852 e
posteriormente Weinland em 1858 denominou o gênero deste helminto de
Schistosoma, uma vez que o macho apresenta o corpo fendido (schisto=fenda;
soma=corpo), mas a denominação da espécie Schistosoma mansoni foi dada por
Sambon em 1907. Os estudos de Pirajá da Silva na Bahia, que foram realizados
na mesma época contribuíram muito para a confirmação que o S. mansoni
produzia ovos, habitava as veias mesentéricas e tratava-se de uma espécie
distinta.
__________________________________________________________Introdução
3
O S. mansoni é um trematodo digenético e sendo um digenético apresenta
um ciclo vital complexo que incluem dois ou três hospedeiros. Os vermes adultos
parasitam praticamente todos os sistemas dos vertebrados. O primeiro hospedeiro
intermediário é, com poucas exceções, um molusco gastrópodo. Quando há no
ciclo um segundo hospedeiro intermediário, este faz, com freqüência, parte da
dieta do hospedeiro definitivo vertebrado. A transmissão está geralmente a cargo
de dois estágios larvais nadadores e, na sua maioria, os ciclos vitais dos
digenéticos dependem, portanto, da água para a sua realização (Wilson, RA
1979).
As três espécies principais que infectam o homem são: S. mansoni,
encontrada nas Américas Central e do Sul e na África; S. hematobium, encontrada
na África e Oriente Médio; S. japonicum (uma zoonose), encontrada na China,
Japão e nas Filipinas.
1.2. O ciclo de vida do S. mansoni e a patologia da esquistossomose
Na natureza, adaptações numerosas e complexas devem ser feitas pelos
parasitas, cujos ciclos biológicos envolvem acomodações alternadas a ambientes
tão diferentes como a água e o meio interno de seus hospedeiros. Neste contexto,
o parasita S. mansoni, que apresentando um ciclo de vida complexo, mostra uma
notável interação adaptativa entre o parasita e seus hospedeiros intermediários e
definitivos e com o ambiente natural onde o ciclo ocorre (Neves, 2005).
O ciclo de vida do parasita se inicia quando a fêmea deposita seus ovos
imaturos, espiculados na parede do intestino (Figura 1). Estes ovos se
__________________________________________________________Introdução
4
desenvolvem e atingem a luz intestinal, e posteriormente são eliminados com as
fezes e eclodem ao entrarem em contato com a água doce. O miracídio é um
estágio que não se alimenta, capaz de se movimentar através de movimentos
rápidos. Quando o miracídio encontra o molusco do gênero Biomphalaria, ocorre a
penetração através da epiderme do caramujo. Imediatamente após penetrar na
hemocele do caramujo, o miracídio sofre metamorfose, tornando-se esporocisto-
mãe. Este é um estágio em que o parasita se alimenta, porém carecendo de um
tubo digestivo, deve adquirir nutrientes por difusão ou transporte ativo. Dentro do
esporocisto, a segunda geração, que consiste de numerosos esporocistos-filhos,
desenvolve-se por multiplicação assexuada. O hépatopâncreas do caramujo fica
repleto de esporocistos filhos, que se multiplicam, dando origem à terceira
geração, as larvas denominadas, cercarias (Wilson, 1979). A cercária é a forma
infectante do homem, que ocorre por penetração ativa das cercarias na pele do
individuo. As cercarias penetram ativamente através da secreção de enzimas
digestivas. Depois de penetrarem a pele, estas perdem a cauda e algumas horas
depois, as cercarias completam a metamorfose transformando-se em
esquistossômulos. Os esquistossômulos atingem os pulmões e depois migram
através da corrente sangüínea para o sistema porta-hepático, onde ocorre a
maturação e o acasalamento dos vermes adultos e o início da ovoposição (Neves,
2005).
__________________________________________________________Introdução
5
Figura 1: Ciclo Biológico do S. mansoni. Adaptado de RA Wilson, Introdução à
Parasitologia Ed. EDUSP, 1979.
A esquistossomose afeta mais de 200 milhões de pessoas em todo mundo
e estima-se que mais de 1,53 milhões de pessoas estão incapacitadas devido à
doença (WHO 2004 e Chitsulo et al, 2006). A patogenia da esquistossomose
depende de vários fatores, dos quais podemos destacar: a carga parasitária, a
linhagem do parasita, as características do hospedeiro, isto é, a imunidade, o
__________________________________________________________Introdução
6
estado nutricional e a idade. O ovo é o principal fator patogênico na
esquistossomose. Dos ovos depositados na parede intestinal, 30% são eliminados
nas fezes. O restante permanece retido nas paredes do intestino e no parênquima
hepático, sendo o responsável direto pela reação inflamatória granulatomatosa
nos tecidos. Esta reação constitui o granuloma esquistossomótico, elemento
característico na patologia da infecção.
O desenvolvimento do S. mansoni ocorre como resultado da expressão
coordenada de um conjunto de genes distintos, necessários para as alterações
bioquímicas e adaptações morfológicas observadas durante o ciclo de vida.
Desta forma, o conhecimento dos genes e dos mecanismos que controlam
as suas expressões, permitirão uma melhor compreensão, de como o parasita
está programado para viver em ambientes distintos. O conhecimento molecular
também poderá permitir, novos modelos de investigação de moléculas
importantes, que servirão de base para a estruturação de novas drogas
quimioterápicas, que reduziriam os efeitos patológicos da moléstia na sua forma
crônica, bem como, de futuras vacinas, que poderiam resultar numa ação de
desencadeamento da resposta imune protetora, ou num bloqueio do
desenvolvimento do parasita no hospedeiro vertebrado.
1.3. O genoma do S. mansoni e a necessidade da era de descoberta de
genes
O S.mansoni, apresenta um genoma estimado em 2x10
8
pb, organizado em
oito pares de cromossomos sendo sete pares autossômicos e um par de
__________________________________________________________Introdução
7
cromossomos sexuais com um conteúdo de GC de 34%. Os machos são
homogaméticos (ZZ) e a fêmea heterogamética (ZW) (Tanaka, 1995).
Devido ao complexo ciclo de vida do parasita, implicando em numerosas
mudanças morfológicas, fisiológicas e bioquímicas, imagina-se que o seu genoma
possa ser regulado por uma expressão gênica diferencial, desta forma, além dos
genes constitutivos, pode-se esperar a existência de dois outros grupos: um
primeiro grupo, regulado por mecanismos de estresse (térmico, osmótico ou
oxidativo), e um segundo, regulado a longo do desenvolvimento do parasita,
influenciado diretamente pelo hospedeiro (vertebrado ou invertebrado) (Rollinson
& Southgate, 1987).
No Início dos anos 90 a grande questão que emergia na pesquisa sobre
esquistossomose era, qual o melhor prospecto para identificar novos alvos para
drogas, vacinas, e o desenvolvimento de diagnósticos e para dissecar a base
biológica da resistência à droga, diversidade antigênica, infectividade e patologia?
A resposta para essa questão complexa surgiu com a emergente genômica e
posteriormente a genômica funcional (El-sayed et al, 2004). Assim nascia a era de
descoberta de genes do parasita, que se deu através de uma iniciativa do
Programa de Pesquisas em Doenças Tropicais da Organização Mundial de Saúde
e de outras agências de fomento (Johnston et al, 1997).
Assim no período entre 1993 a 1995, ocorreu uma rápida expansão do
conhecimento do genoma do Schistosoma, incluindo o desenvolvimento de
bibliotecas de cDNA de várias fases do ciclo de vida do parasita, construção de
bibliotecas de cromossomos artificiais de leveduras, mapas físicos parciais dos
cromossomos, e a geração de mais que 6000 ESTs (E
xpressed Sequence Tags)
__________________________________________________________Introdução
8
de S. mansoni (Hillier et al 1996, Adams et al 1993b, Blaxter et al 1996 e Adams et
al 1995).
As primeiras EST´s foram depositadas por Franco et al 1995, e foram nesta
primeira etapa sequenciadas 607 ESTs de uma biblioteca de cDNA de vermes
adultos, onde foram identificados 154 novos genes. Assim, a era de descoberta de
genes do parasita S. mansoni começou, com o sequenciamento e depósito das
sequências nos bancos de dados de EST´s que são sequências parciais de cDNA
com 150-600 bp, obtidas a partir das extremidades 3' e 5' do cDNA.
Paralelamente ao sequenciamento de EST´s em larga escala, diversos
outros grupos também foram descrevendo genes importantes na biologia do
parasita. Assim, foi descrito em S. mansoni a presença de introns pequenos (30-
50 pb) (Roche et al 1994), e genes com íntrons de tamanho superior a 3 Kb, como
por exemplo, o da glutationa S-transferase (Sm28 GST) (McNair et al 1993), e
genes que não possuem íntrons, como por exemplo, aqueles que codificam as
proteínas da casca do ovo (Rodrigues et al, 1989). Apesar do grande avanço no
conhecimento da genômica e do transcriptoma do parasita, ainda não se tem
descrito, como se processa a maquinaria de remoção desses pequenos íntrons,
bem como a função de seqüências de RNAs não codificadores e também de
pseudogenes e seu papel como possíveis reguladores da expressão gênica.
Mas, o avanço no número de seqüências de Schistosoma ocorreu a partir
de 2003, como resultado de dois projetos de sequenciamento que ocorreram
simultaneamente no Brasil e na Ásia, o projeto Transcriptoma do S. mansoni,
financiado pela FAPESP, com a participação de um consórcio de laboratórios,
__________________________________________________________Introdução
9
conhecido como a rede ONSA (Organization of Nucleotide Sequence and
Analysis) e o projeto transcriptoma do S. japonicum, respectivamente.
No projeto transcriptoma do S. japonicum foram geradas 43.707 ESTs de
casais, machos, fêmeas e ovos, respectivamente (Hu et al 2003). Essas ESTs
foram agrupadas em 13,131 genes que provavelmente codificam para a maioria
das proteínas sintetizadas pelo parasita.
No projeto transcriptoma do S. mansoni foram seqüenciados 163,586 ESTs,
sendo que 151,684 foram originadas de bibliotecas do tipo ORESTES (Open
reading frames ESTs), ou seja, a região central do gene, e os 11,902 seqüências
restantes foram originadas de bibliotecas normalizadas de vermes adultos. Desta
forma o total predito de genes é aproximadamente 14,000 genes, cobrindo
aproximadamente 92% do transcriptoma do parasita (Verjovski et al 2003).
De acordo com a classificação funcional dos transcritos através do Gene
Ontology (GO), os genes do parasita identificados apresentam várias funções
importantes relacionadas com o complexo plano de vida e desenvolvimento deste
parasita (Verjovski et al 2003). Assim, foram identificados genes envolvidos em
interações célula–célula, processos de desenvolvimento, resposta ao estímulo
externo e transdução de sinal. Estes genes são específicos dos metazoários,
representando a conservação relativa desses genes em relação aos outros
metazoários.
Desta maneira, foram identificados genes que codificam para os
componentes de detecção de luz, incluindo parálogos de SmRodopsina, rodopsina
quinase, arrestina e transducina. Tanto a proteína rodopsina quanto à enzima
rodopsina quinase são transcritas em ovos e esporocistos, o que se torna
__________________________________________________________Introdução
10
consistente ao examinarmos a resposta da cercária e dos miracídios à luz. Por
outro lado, a identificação de genes que codificam para os receptores de insulina e
fatores de crescimento, reforça a idéia de que o parasita capta moléculas do
hospedeiro, para uso próprio.
O controle da expressão gênica e a diferenciação ficam evidenciados ao
analisar os genes que estão implicados no silenciamento da cromatina, bem como
também dos genes que codificam para proteínas do tipo grupo polycomb, tais como
os EZ (Enhancer of Zeste), ESC (Extra Sex Combs), que são proteínas responsáveis
pela manutenção do padrão de diferenciação celular (Verjovski et al 2003).
As iniciativas de sequenciamento do genoma completo do parasita S.
mansoni ainda estão em andamento com projetos financiados pelo National
Institutes of Health (NIH) no instituto TIGR (The Institute for Genomic Reasearch,
Rockville, MD, USA), por outra iniciativa brasileira a Minas Gerais genome
Network EST project e também pelo Instituto Sanger Centre, financiado pela
Welcome Trust, UK (El-sayed et al 2004, Brindley, 2005).
1.4. O início de um novo tempo: a era do genoma funcional
O sequenciamento do genoma e do transcriptoma do S. mansoni abrirá
com certeza, várias perspectivas para o estudo da biologia do parasita, no sentido
de manipulação de genes essenciais no desenvolvimento e manutenção do
parasitismo, no estabelecimento de novas drogas contra a parasitose e também
do estabelecimento de uma vacina para prevenção e terapêutica.
Estudos relacionados à manipulação do genoma através de RNAi, como
__________________________________________________________Introdução
11
descrito por Skelly et al 2003, mostrou que o gene que codifica para catepsina B
no estágio de desenvolvimento esquistossômulo-verme adulto, pode perfeitamente
ser silenciado.
Iniciativa relacionada ao proteoma celular tem sido extensivamente estudada
através da separação das proteínas solúveis e/ou secretáveis através de eletroforese
bidimensional. As proteínas selecionadas são digeridas com tripsina e os peptídeos
resultantes são analisados em espectrômetro de massa e são correlacionados aos
cDNAs depositados nos bancos de dados do transcriptoma (Curven et al 2004).
O transcriptoma também possibilitou a identificação de genes que podem
ser possíveis alvos para novas drogas e candidatos à vacina. Foram identificados
16 possíveis novos alvos para droga, alguns por analogia com outros alvos
anteriormente validados em outros helmintos, em particular aqueles envolvidos
com neurotransmissão, tais como o acetilcolina nicotínico e o receptor para
glutamato (Verjovski et al 2003). Entretanto, a presença de oito transcritos
codificando proteínas da família de multi-resistência a drogas (MDR) dos
transportadores ABC (Skatrud, 2002), que estão envolvidos na desintoxicação e
transporte de metabólitos, pode significar um promissor mecanismo de resistência
a drogas que o parasita pode utilizar.
Outros 28 genes analisados possuem a característica de estarem envolvidos,
na sobrevida do parasita, e também são expressos na superfície da célula ou
apresentam a característica de serem secretáveis, e são exclusivamente expressos
nos estágios intra-mamífero. Todas essas características os tornam candidatos a
vacinas. Outros genes que são expressos exclusivamente na transição cercária-
__________________________________________________________Introdução
12
esquistossômulo-verme adulto, e são essenciais para a sobrevivência do parasita se
tornam também bons candidatos à vacina (Verjovski et al 2004).
Desta forma o estudo sistemático dos bancos de dados de seqüências de
DNA deste parasita, pode levar tanto ao avanço da biologia celular quanto ao
possível controle da parasitose.
1.5. Modificação pós-traducional de proteínas
Dentro dessa perspectiva do genoma funcional, durante os últimos anos, o
Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, sob a coordenação do Prof. Dr.
Vanderlei Rodrigues, vem estudando extensivamente a via de modificação de
proteínas dependente de ubiquitina, no parasita S. mansoni.
No contexto celular, processos de modificação pós-traducional, como a
fosforilação, a glicosilação e a acetilação, controlam vários processos celulares
importantes que mantém a homeostase e o funcionamento celular. As proteínas
também participam de processos de modificação de outras proteínas.
A ubiquitina é uma proteína altamente conservada, durante a evolução das
espécies, possuindo um peso estimado de 8000 Da, com 76 resíduos de
aminoácidos. A poliubiquitinação da lisina 48 (K48) das proteínas está relacionada
com a proteólise citoplasmática dependente de proteassoma. As proteínas
monoubiquitinadas na lisina 29 (K29), estão relacionadas com a modulação de
receptores de superfície na endocitose (Ciechanover e Schwartz, 1998).
O processo de ubiquitinação ocorre através da ligação covalente (via
ligações isopeptídicas), um processo que envolve a ativação da porção C-terminal
__________________________________________________________Introdução
13
da ubiquitina, pela enzima ubiquitina ativadora (E1), e posterior transferência dos
grupos amino de resíduos lisil para o substrato protéico, catalisado pelas enzimas
conjugadoras de ubiquitina (UBCs ou E2).
Por apresentar um papel de regulação da meia vida de proteínas chaves
em células eucarióticas, o sistema de conjugação da ubiquitina tem mostrado
exercer importantes papéis numa ampla variedade de processos celulares, tais
como, o reparo do DNA (JENTSCH, 1992), controle do ciclo celular (GOEBL et
al,1988) e resposta ao estresse (SEUFERT et al 1990).
Desta forma, em nosso laboratório a atividade do proteassoma de vermes
adultos e cercárias, foi analisada depois de serem incubados com os inibidores do
proteassoma. Todos os inibidores do proteassoma mostraram uma inibição de
cerca de 80% em cercária. Em vermes adultos, a inibição foi cerca de 59% na
presença de MG-115. A proteólise endógena também foi verificada e os resultados
mostraram que em cercária, a proteólise endógena aumentou cerca de 1,4 a 2,5
vezes depois da estimulação com ATP com ou sem ubiquitina. A adição de
MG132, um peptídeo aldeído inibidor do proteassoma, causou uma redução de
90% e 75% na proteólise endógena, estimulada por ATP e ubiquitina em cercária
e vermes adultos, repectivamente (Guerra-Sá et al 2005).
Recentemente, dados bioquímicos forneceram as primeiras evidências da
relação entre a via de ubiquitinação e o CSN, quando se demonstrou a interação
do CSN com o complexo E3 ligase SCF (Lyapina et al., 2001). Algumas
evidências experimentais, também indicam que o CSN interage diretamente com o
proteassoma 26S e compete com o complexo 19S, e em excesso molar de CSN
__________________________________________________________Introdução
14
ocorre a substituição da tampa do 19S pelo CSN, o que influencia diretamente a
atividade peptidásica do proteassoma in vitro (Huang et al., 2005).
Desta forma, através da análise do banco de dados do transcriptoma e da
análise da expressão dos genes que codificam para as subunidades da tampa do
proteassoma e do complexo COP9 sigalossoma, foi possível sugerir que existe
uma regulação diferencial das subunidades da tampa do proteassoma e das
subunidades do COP9 em cercárias. Estes resultados aliados aos resultados da
diminuição da taxa de proteólise em cercária inferem que os baixos níveis de
proteólise em cercária podem sugerir uma montagem alternativa do proteassoma
em cercária comparado com os resultados de expressão diferencial dos
componentes da base e da tampa do proteassoma e do COP9 signalossoma em
cercária e em vermes adultos (Cabral FJ, et al 2006).
O perfil proteômico da via de ubiquitinação no ciclo de vida do parasita,
bem como a atividade do 20S purificado foi descrito recentemente no nosso
laboratório (Castro-Borges et al 2007). A expressão dos genes que codificam para
as subunidades da tampa e da base do proteassoma no ciclo de vida do parasita
também foram avaliadas recentemente no nosso laboratório (Pereira OSJ, Tese
de Doutorado, 2005).
As primeiras evidências em relação a SUMO em S. mansoni foram através da
presença de vários conjugados ubiquitinados, que poderiam estar associados, não
somente a substratos ubiquitinados, mas também a substratos sumorilados, obtidos
através da reação cruzada com o anticorpo anti-ubiquitina (Guerra-Sá, R. tese de
Doutorado, 2000). Outro resultado do nosso grupo aponta para a um gene que
codifica para SUMO2 (SMT3B) em S. mansoni (Cabral FJ, manuscrito em preparo).
__________________________________________________________Introdução
15
1.6. A proteína Ubiquitina – símile: Small Ubiquitin Modifier (SUMO)
Entre os sistemas que modificam proteínas, a ligação covalente da
ubiquitina-símile, SUMO, aos substratos alvo, processo denominado sumorilação,
representa depois da ubiquitinação, o exemplo mais estudado de modificação pós-
traducional que envolve interação proteína-proteína (Seeler & Dejean, 2003).
Embora a mecânica dos processos de ubiquitinação e sumorilação sejam
semelhantes, os alvos modificados, nem sempre são os mesmos, e em alguns
casos a sumorilação pode até antagonizar com a ubiquitinação.
A SUMO é uma proteína que apresenta apenas 18% em similaridade de
seqüência primária com a ubiquitina (Melchior, 2000), mas apresenta uma grande
similaridade em estrutura tridimensional, como podemos observar através da
Figura 2.
Figura 2: SUMO e Ubiquitina. (A) Comparação entre as estruturas tridimensionais de
SUMO e Ubiquitina, mostrando a semelhança de estrutura dimensional entre as duas
proteínas. (B) Alinhamento entre as proteínas SUMO e Ubiquitina. Adaptado de Johnson
E.S., Annu. Rev. Biochem., 2004
__________________________________________________________Introdução
16
Na estrutura tridimensional de SUMO, existe uma extensão variável de
aproximadamente 22 aminoácidos, a qual não existe na estrutura da ubiquitina, e
que pode funcionar como uma interface adicional para possíveis interações
proteína-proteína. Além do mais, a SUMO possui em sua porção carboxi-terminal
um duplo motivo de Glicina (Gli-Gli), pelo qual SUMO se liga aos seus substratos
alvo. Em contraste com a ubiquitina, a SUMO1 não é capaz de se conjugar à ela
mesma e formar cadeias poli-SUMO (Johnson ES, 2004).
A via de sumorilação é conservada em diversos organismos. Os
organismos D. melanogaster e S. cerevisiae expressam apenas um gene
codificando para SUMO, enquanto que em plantas são expressos oito genes
codificando para SUMO (Kurepa et al 2002). Em mamíferos SUMO1 está em sua
maioria na forma conjugada, enquanto que as duas outras isoformas de SUMO, as
proteínas SUMO2 e SUMO3 se apresentam na forma não conjugada, e são
sujeitas à conjugação depois de situações de estresse celular (Saitoh et al, 2000).
Relatos recentes apontam para a existência de SUMO4, participando de eventos
relacionados a doenças auto-imunes (Pearce & Merriman, 2006).
1.7. A via de conjugação de SUMO aos seus substratos alvo: o processo
de sumorilação
A conjugação de SUMO aos seus substratos alvo, assim como a
ubiquitinação, depende de três enzimas, que são necessárias, para primeiramente
ativar o substrato alvo, através de uma enzima E1, com gasto de energia na forma de
ATP. A enzima E1 catalisa a adenilação do motivo Gli-Gli na porção C-teminal de
__________________________________________________________Introdução
17
SUMO. A SUMO adenilada se liga a E1 de forma não covalente, e então SUMO é
transferida ao resíduo de cisteína da enzima E1 para formar uma ligação tiól-éster
entre o grupo sulfidrila (-SH) da cisteína e o grupamento –COOH da SUMO. Assim,
SUMO é então transferida a Ubc9, a enzima E2, formando uma ligação tiól-éster com
o grupamento sulfidrila do sítio ativo de Ubc9 (Figura 3). Posteriormente as E3 ligases
ligam a SUMO ao substrato auxiliando na ligação ao substrato (Johnson e Gupta,
2001; Kagey et al 2003; Kahyo et al, 2001; Pichler et al, 2002; Sachdev et al 2001;
Takahashi et al, 2001). Desta forma, SUMO é ligada ao substrato através de uma
ligação isopeptídica entre a sua porção C-terminal (–COOH ) e um grupamento ε-
amino de um resíduo de lisina específico da proteína alvo (Chen 2004).
Como as vias de ubiquitina e SUMO são vias de conjugação semelhantes,
porém distintas, as enzimas que participam do processo de ubiquitinação não são as
mesmas que participam da sumorilação, como descreveremos nos itens seguintes.
Figura 3: A via de sumorilação. A SUMO é traduzida como uma pré-proteína e deve ser
processada através da clivagem pela protease específica de SUMO ou Ulp1. Depois de
processada, a proteína é conjugada através do domíno carboxi-terminal Gli-Gli, aos seus
substratos alvos com o auxílio de três enzimas: E1 (Aos1/Uba2) ativadora, E2 (Ubc9)
conjugadora e E3 ligases do tipo Pias, Polycomb2 ou RanBP2. Adaptado de Seeler e
Dejean, Mol. Cel. Biol, 2003.
__________________________________________________________Introdução
18
1.8. A enzima E1 ativadora ou Aos1/Uba2
A enzima ativadora de SUMO é um heterodímero consistindo de duas
subunidades, ou seja, a subunidade Aos1 de 38 kDa e a subunidade Uba2 de
71kDa (Dohmen et al 1995, Johnson et al 1997). Ambas as subunidades são
conservadas entre as espécies e em S. cerevisiae, esta proteína é essencial para
a viabilidade da levedura. Em levedura a subunidade Aos1 é 29% idêntica à região
N-terminal da E1 de ubiquitina de levedura, enquanto a porção Uba2 apresenta
28% de identidade com os 561 aminoácidos da porção C-terminal da enzima E1
de ubiquitina de levedura, a enzima Uba1. Essas regiões de homologia contêm os
dois motivos de ligação a SUMO (um em Aos1 e outro em Uba2) e a seqüência
consenso do sítio ativo de cisteína, responsável pelas ligações tiól-ésteres,
realizadas por essas enzimas (Melchior, 2000), visto que E1 cataliza a adenilação
de SUMO, e então forma a ligação tiól-ester com a posterior transferência para a
enzima E2 conjugadora (Chen, 2004).
1.9. A enzima E2 conjugadora: a Ubc9
A enzima conjugadora E2 de SUMO, a proteína Ubc9 é uma proteína
bastante conservada entre as espécies, e foi primeiramente identificada em
mutantes de levedura sensíveis a temperatura (Seufert et al 1995; Watanabe et al
1996). As similaridades entre SUMO e ubiquitina são reforçadas pela notável
similaridade entre Ubc9 e a grande família de enzimas conjugadoras de ubiquitina
(Giraud et al 1998; Haas e Siepmann 1997; Tong et al 1997).
__________________________________________________________Introdução
19
Apesar de existirem semelhanças entre Ubc9 e as enzimas E2 de
ubiquitina, a diferença entre a superfície de cargas entre essas proteínas, torna-se
uma diferença muito peculiar e determinante, na especificidade da Ubc9 por
SUMO. A superfície de cargas da Ubc9 é positivamente carregada, apresentando
um ponto isoelétrico de 8.7, em contraste com o ponto isoelétrico das E2s, mais
negativamente carregadas, que apresentam um pI em torno de 6.7 (Chen, 2004).
Um recente estudo de RMN, mapeou a interface de cargas entre Ubc9 e SUMO, e
mostrou que essas proteínas apresentam uma grande complementaridade em
seus potenciais eletrostáticos e hidrofobicidade (Liu et al 1999). Esses resultados,
explicam a especificidade de Ubc9 por SUMO. Até o momento, Ubc9 é a única
enzima capaz de conjugar SUMO aos seus substratos alvo.
A sumorilação dos substratos é dependente de uma seqüência consenso
ψKxE(ψ representa um aminoácido hidrofóbico, K é uma lisina, x é qualquer
aminoácido e E representa o aminoácido Glu), esse motivo foi identificado através
da comparação dos sítios de modificação de SUMO-1 nas proteínas alvo
(Desterro et al 1997). A análise da estrutura de mutantes de substratos por
espectro de RMN, combinada com a análise da cinética de reação da modificação,
revelaram que o motivo ψKxE é onde a Ubc9 se liga aos substratos alvos (Lin, et
al 2002).
Diversos relatos indicam que a Ubc9 realiza suas funções em diferentes
compartimentos celulares. Em leveduras, experimentos utilizando a proteína de
fusão Ubc9-βgalactosidase, mostraram que a proteína de fusão estava localizada
dentro do núcleo (Seufert et al 1995). Experimentos utilizando imunoflorescência
indireta detectaram Ubc9 endógena no citoplasma e nucleoplasma e perto do
__________________________________________________________Introdução
20
envelope nuclear, de células de mamíferos (Melchior 2000). Este aglomerado de
Ubc9 perto do envelope nuclear está diretamente associado com a modificação de
RanGAP1 e RanBP2 (Mahajan et al 1997).
As outras isoformas de SUMO, ou seja, a SUMO-2 e SUMO-3 também se
ligam a Ubc9 na mesma superfície, onde se liga SUMO-1 e com a mesma
afinidade (Tatham et al 2003). Este fato está correlacionado com a conservada
superfície de ligação de Ubc9 nos três parálogos, embora SUMO-2 e SUMO-3
apresentem somente 50% de identidade em sequencia de aminoácidos com
SUMO-1 (Saitoh & Hinchey, 2000).
1.10. SUMO E3 ligases
A existência de proteínas que funcionavam como SUMO E3 ligases,
permaneceu desconhecida até a descoberta de que as proteínas Siz1 e Siz2, que
são membros da família PIAS (protein inhibitor of activated STAT), funcionavam
como enzimas que ligavam SUMO aos seus substratos (Takahashi et al 2001).
Até o momento estão caracterizadas três tipos de proteínas que funcionam como
SUMO E3 ligases: Siz-PIAS, Polycomb2 e RanBP2.
A proteína Siz1 foi inicialmente identificada interagindo geneticamente com
o complexo condensina (Strunnikov et al 2001). O nome Siz é derivado dos nomes
dos domínios S
AP e Miz, e estes dois domínios estão presentes em todas as
proteínas PIAS. A proteína Siz 2 foi primeiramente descoberta como um ligante de
Cdc12 de levedura em experimentos de duplo-híbrido (Strunnikov et al 2001).
Depois de alguns meses dessa descoberta, dois grupos anunciaram que Siz1 e
__________________________________________________________Introdução
21
Siz2 apresentavam atividade SUMO E3 ligase (Johnson e Gupta, 2001; Takahashi
et al 2001).
Pelo menos cinco diferentes proteínas PIAS, codificadas por quatro genes
distintos, estão descritos em mamíferos. PIAS1 e PIAS3 foram identificadas como
ligantes específicos e reguladores negativos dos fatores de transcrição STAT1 e
STAT3, respectivamente, e PIASxα, PIASxβ ePIASy foram identificadas por
homologia e são derivadas do processamento alternativo do mRNA de PIAS1 e 3
(Johnson 2004). PIAS1 foi independentemente identificada como uma proteína
que interage com a proteína Gu/RNAII-helicase, e foi denominada GBP(Valdez et
al 1997). Até o momento não foi elucidado ao certo, quantas variantes oriundas de
processamento de RNA, são expressos para cada gene do tipo PIAS.
A função SUMOE3 ligase das proteínas PIAS depende da presença do
domínio SP-RING, que é caracterizado como um domínio de 35 aminoácidos com
o domínio conservado SAP na porção N-terminal e o outro domínio conservado
RING na porção central da proteína, sendo o domínio RING responsável pela
interação com a Ubc9 (Melchior e Pichler, 2004). O domíno RING também é
característico por possuir atividade E3 ligase na via de ubiquitina.
Outra classe de SUMOE3 ligase caracterizada é denominada Polycomb2
ou Pc2. A proteína Pc2 é uma proteína de 558 amoniácidos com um tamanho
predito de 61kDa (Satijn et al 1997). A proteína hPc1/m33 e a proteína hPc3,
possuem o domínio Chr
omatin organization modifier (chromo), na porção amino-
terminal e o domínio C-box, na porção carboxi-terminal, onde o domínio chromo é
responsável pela ligação à cromatina e o domínio C-box é responsável pela
repressão da expressão gênica (Melchior e Pichler, 2004). A função E3 ligase
__________________________________________________________Introdução
22
parece estar relacionada com a região da molécula que se localiza entre a região
chromo e a região C-box. Esta região não mostra nenhuma similaridade com outra
SUMO ou ubiquitina E3 ligase (Kagey et al 2003).
Os repressores transcricionais do grupo Polycomb (PcG), exercem um
importante papel na regulação da atividade dos genes na cromatina. As funções
associadas com as proteínas PcG, estão relacionadas à manutenção do padrão
de expressão dos genes homeóticos durante o desenvolvimento embrionário, à
diferenciação das células hematopoiéticas e à regulação da proliferação celular.
Essas funções podem ser antagonizadas pelo grupo de ativadores transcricionais,
da família trithorax (TRX) (revisado por Brock e van Lohuizen, 2001; Francis and
Kingston, 2001; Jacobs e Lohuizen, 2002; Orlando, 2003; Satijn e Otte, 1999).
O terceiro tipo de SUMOE3 ligase caracterizado até o momento é a
proteína RanBP2/Nup358, e consiste num resíduo de aproximadamente 300
aminoácidos que se localiza na região do complexo do poro nuclear (Pichler et al
2002, Yokoyama et al 1995; Wang et al 1999). O domínio E3 que é denominado
IR (internal repeat), contém duas repetições de um resíduo de aproximadamente
50 aminoácidos que não apresenta nenhuma similaridade de seqüência com
outras E3 ligases de ubiquitina anteriormente caracterizadas. Esse domínio IR,
tem a capacidade de sumorilar RanGAP1 e formar um composto trimérico estável,
envolvendo SUMO, Ubc9 e RanGAP1 e assim pode ser responsável pela
localização de SUMO-RanGAP1 no complexo do poro nuclear (Saitoh et al 1998;
Matunis et al 1998).
__________________________________________________________Introdução
23
1.11. Proteases específicas de SUMO
O padrão de proteínas sumoriladas é dinâmico e muda durante o ciclo
celular em resposta a vários estímulos (Li e Hochstrasser 1999). As proteases de
SUMO, também chamadas de isopeptidases, apresentam duas funções nesse
processo: elas removem SUMO das proteínas, tornando a modificação reversível,
e também fornecendo uma fonte de SUMO livre para ser usada para conjugação a
outras proteínas. A proteína SUMO em sua forma livre é gerada tanto da clivagem
do pequeno peptídeo da porção C-terminal da pré-proteína quanto da
desumorilação de conjugados de SUMO com outras proteínas. De qualquer forma,
ambas essas fontes de SUMO livre são importantes para a manutenção dos níveis
normais de SUMO intracelulares (Kurepa et al, 2002; Johnson et al 1997).
Todas as enzimas que clivam SUMO contém uma porção C-terminal de
aproximadamente 200 aminoácidos, chamado ULP (Ubiquitin-like protease),
responsável pela atividade de clivagem (Mossessova e Lima, 1999). O domínio
ULP não apresenta nenhuma similaridade de seqüência com as proteases que
clivam ubiquitina. Ao invés disso, o domínio ULP está relacionado, com proteases
virais (Li e Hochstrasser et al, 1999; Strunnikov et al 2001). As proteases de
SUMO tem uma porção N-terminal variável, as quais podem ser seqüências
regulatórias que direcionam as enzimas para diferentes partes da célula (Li e
Hochstrasser, 2003; Panse et al, 2003; Hang et al 2002; Itahana et al 2006).
__________________________________________________________Introdução
24
Tabela 01 - Proteases específicas de SUMO (adaptado de Seller e Dejean, 2003)
Nos genomas de mamíferos, sete genes codificam para proteínas com
domínio ULP (Tabela 1), mas pelo menos uma dessas cliva Nedd8 ao invés de
SUMO (Gan-Erdene et al, 2003; Mendoza et al, 2003; Yeh et al, 2000). Essas
enzimas incluem SENP3, a qual se localiza no nucleoplasma (Nishida et al, 2000);
SUSP1 encontrada no citoplasma (Kim et al, 2000); SENP1 encontrada no núcleo
(Bailey et al, 2002). A diversidade dos locais onde as proteases de SUMO podem
ser encontradas na célula, reflete como a via de sumorilação pode ser regulada
em relação à especificidade de substratos ( Seeler e Dejean 2003).
1.12. As proteínas modificadas por SUMO
Nos últimos anos, vários relatos relacionam SUMO envolvida controlando
diversos processos celulares importantes (Figura 4).
__________________________________________________________Introdução
25
Figura 4: Substratos de SUMO agrupados por função e localização. A SUMO realiza
suas funções modificando importantes proteínas majoritariamente no núcleo, mas
podendo sumorilar substratos também no cistoplasma. Adaptado de Seeler e Dejean, Mol.
Cel. Biol, 2003.
Através da Figura 4 podemos destacar o papel de SUMO na manutenção
da integridade do genoma, em processos de transdução de sinais e controle da
transcrição.
O primeiro substrato modificado por SUMO foi descoberto por Mahajan et al
(1997), e está relacionado com o controle do transporte de moléculas do
citoplasma para o núcleo, através do complexo do poro nuclear.
Diversos relatos colocam SUMO na evidência como participante de um
mecanismo emergente que permite o controle da atividade transcricional. Estudos
envolvendo receptores nucleares, e a proteína Sp3 indicam que essas proteínas
__________________________________________________________Introdução
26
possuem um domínio chamado SC (Sinergy Control), que apresenta homologia de
seqüência com o sítio de sumorilação ΨkxE (Iniguez-Lluhi e Pearce, 2000).
Também esses estudos indicam que a mutação de cada um dos aminoácidos do
sitio de sumorilação, leva a uma abolição da repressão, sugerindo que a
sumorilação (ou ligação da Ubc9) está mecanisticamente envolvida na repressão
(Snowden et al 2000, Yang et al 2006). O mecanismo, pelo qual SUMO inibe a
transcrição, ainda não está completamente elucidado mas, um modelo possível é
que a modificação por SUMO pode promover ou inibir as interações proteína-
proteína e desta forma regular a montagem de complexos transcricionais (Verger
et al 2003).
Devido ao fato da via de sumorilação estar envolvida em importantes
aspectos da fisiologia celular, incluindo, transcrição dos genes, mitose, localização
sub-celular, transporte núcleo-citoplasma e regulação da estabilidade protéica
(Verger et al 2003), em S. mansoni, esta via pode controlar aspectos importantes,
relacionados com o complexo plano de desenvolvimento sofrido por esse parasita
bem como a manutenção do parasitismo no hospedeiro vertebrado.
2. Objetivos
___________________________________________________________Objetivos
28
Objetivo geral
Este trabalho tem como objetivo geral verificar a conservação da via de
sumorilação e suas características em S. mansoni.
Objetivos específicos
Determinar um panorama geral das seqüências que codificam para os
genes da via de sumorilação, através da análise in silico nos bancos de
dados disponíveis do parasita;
Idealizar oligonucleotídeos específicos para recuperar os genes que
codificam para a via de sumorilação, clonar e sequenciar os transcritos
obtidos e analisar as seqüências utilizando ferramentas de bioinformática;
Estudar a estrutura genômica dos genes que codificam para SUMO e Ubc9;
Determinar a expressão dos genes que codificam para SUMO, Ubc9,
SUMO E3 ligases e SUMO protease no ciclo de vida do parasita, através de
RT-PCR, qRT-PCR e Northern Blot;
Avaliar o padrão dos conjugados sumorilados em extratos de proteínas
totais e nucleares desse parasita por Western Blot. Avaliar a expressão de
Ubc9 por Western Blot utlizando anticorpo anti-Ubc9.
3. Materiais e Métodos
___________________________________________________Materiais e Métodos
30
3.1. Manutenção do ciclo biológico do S.mansoni.
O ciclo biológico do S.mansoni, linhagem LE é rotineiramente mantido no
Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas, do Departamento de Bioquímica e
Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP.
Os ovos do S.mansoni presentes nas fezes de camundongos das linhagens
Swiss ou Balb/C previamente infectados com o parasita foram recolhidos pelo
método de Hoffmann e expostos por aproximadamente 1 hora sob luz, para a
liberação de miracídio. Os miracídios foram utilizados para infectar o hospedeiro
intermediário, o caramujo da espécie Biomphalária glabrata, que após 38 a 43 dias
liberou a forma infectante do parasita, as cercárias, a forma infectante do
hospedeiro vertebrado. As cercárias foram inoculadas, no camundongo via
subcutânea e após aproximadamente 50 dias os vermes adultos foram
perfundidos do sistema porta-hepático (SMITHERS & TERRY, 1965).
Após a coleta, os parasitas foram mantidos em solução salina 0,9% ou no
meio RPMI (Invitrogen). Para a obtenção dos vermes (macho ou fêmea), estes
foram mecanicamente separados com o auxilio de um pincel, sendo em seguida
congelados e mantidos à -70ºC, até o momento do uso.
3.2. Transformação mecânica de cercárias em esquistossômulos (Harrop &
Wilson, 1993)
Depois de recolhidas as cercárias, esta foram limpas de detritos
provenientes dos moluscos, com o auxilio de uma pipeta e foram permitidas
___________________________________________________Materiais e Métodos
31
decantar em béquer autoclavado em banho de gelo por 2 horas. Decorrido esse
intervalo de tempo, o sobrenadante foi desprezado e as cercárias transferidas
para um tubo estéril. A seguir as cercárias foram lavadas com água declorada e
decantadas durante 20 minutos. Posteriormente foram transferidas para um tubo
de 15 mL, e o volume final foi completado com água declorada filtrada para 7 mL
sendo permitida a decantação das cercárias por 10 minutos. Após repetir este
procedimento por 3 vezes todo o volume de água, foi retirado e descartado.
A seguir foram adicionados 7 mL de meio RPMI suplementado com soro
bovino fetal (GIBCO). Após 10 minutos de decantação o meio foi desprezado e
sendo adicionados outros 7mL de RPMI suplementado. Os parasitas foram
submetidos à agitação com auxílio de um vortex por 90 segundos em velocidade
alta, para permitir a quebra mecânica da cauda. Os corpos cercarianos obtidos
foram incubados por 4 horas em estufa de CO
2
.
Decorrido este intervalo de tempo, procedemos à lavagem dos
esquistossômulos para a remoção das caudas. Para isso a 2 mL de RPMI
contendo 120.000 esquistossômulos foram adicionados 3 mL de meio RPMI e este
conteúdo de 5mL foram distribuídos em tubos eppendorfs, para o procedimento de
lavagem e retirada das caudas. Os esquistossômulos foram decantados por 10
minutos, o sobrenadante onde estavam as caudas foi retirado e foram adicionados
mais 1mL de RPMI em cada tubo e foi permitido decantar por 4 minutos. Os
esquistossômulos foram lavados até não serem detectadas caudas. A detecção da
inexistência de caudas foi feita como auxílio de um microscópio invertido. Depois
de estarem livres de caldas cercarianas, os esquistossômulos foram congelados e
estocados em –70 °C até o momento do uso.
___________________________________________________Materiais e Métodos
32
3.3 Anotação da via de modificação de proteínas ubiquitina-símile
dependente de SUMO em S. mansoni.
Para a identificação e comparação das seqüências, foram adotados os
procedimentos descritos por Louis et al, 2001 e Birney & Durbin, 2000, constituído
de 5 etapas sucessivas, como resumidamente descritas abaixo:
1- Todas as seqüências, previamente analisadas (via BLAST) pelo grupo de
Bioinformática, do Projeto Genoma do S. mansoni, que apresentaram homologia
com genes envolvidos com a via de sumorilação;
2- Posteriormente, estas seqüências foram agrupadas em clusters, nas seguintes
categorias: SUMO, enzima E2 - Ubc9, enzimas E3 ligases e enzimas
desumoriladoras (SUSPs).
3- Em seguida, foi analizada a qualidade da montagem dos clusters, através da
avaliação de todas as corridas que foram utilizadas para obter a seqüência
consenso do respectivo cluster. Somente foram utilizados os clusters formados por
bases com qualidade maior do que 20, estimados pelo programa Phred Phrap;
4- As análises para a identificação dos domínios protéicos foram realizadas
utilizando os programas Pfam (Bateman et al., 2000) e SMART (Schultz et al.,
2000);
5- Todas as seqüências foram analisadas utilizando o banco de dados GeneDB,
Sanger Center – UK.
6- Os alinhamentos foram realizados utilizando o programa ClustalW
(www.ebi.ac.uk/clustalw), e posteriormente foram submetidos ao programa
BOXSHADE.
___________________________________________________Materiais e Métodos
33
3.4. Extração de RNA total
Cerca de 100mg de vermes foram homogenizados em 1mL de Trizol LS
(INVITROGEN) com auxílio de um politron, até completa solubilização. Em
seguida, a mistura foi incubada por 15 minutos a temperatura ambiente.
Decorrido este intervalo de tempo, foi adicionado à mistura 200 µL de
clorofórmio, e as amostras foram agitadas em vortex vigorosamente por 1 minuto
e incubadas a temperatura ambiente durante 20 minutos, sendo posteriormente
centrifugadas a 10000 x g por 10 minutos a 4
°C.
Após esta etapa de centrifugação, a mistura separa-se em uma fase inferior
de cor vermelha (fase fenol-clorofórmio), interfase e fase aquosa superior incolor.
O DNA fica na interfase e as proteínas na fase orgânica, enquanto o RNA
permanece exclusivamente na fase aquosa. A fase aquosa foi transferida para um
tubo ésteril (tipo eppendorf) e o RNA precipitado pela adição de 500 µL de
isopropanol. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, o RNA foi
então recuperado por centrifugação a 10000 x g por 10 minutos a 4°C. O
sobrenadante foi desprezado e o precipitado lavado com 1,0 mL de etanol 70%
em água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC), e em seguida, centrifugado a
10000 x g por 8 minutos a 4°C. O precipitado final foi seco a vácuo e
ressuspendido em 50 µL de água tratada com DEPC.
Para a extração do RNA total das formas larvais do S. mansoni foram
utilizados aproximadamente 120000 cercárias, 120000 esquitossômulos e 5000
___________________________________________________Materiais e Métodos
34
ovos. A Figura 5 mostra um gel típico do procedimento de extração que foi
conduzido como descrito acima.
3.5. Extração do RNA total para PCR quantitativo em tempo real
Para extrairmos o RNA total utilizados nos experimentos de análise da
expressão dos genes que codificam para a via de sumorilação, utilizando PCR em
tempo real, utilizamos o kit "Purelink Micro-to-Midi Total RNA purification system"
(Invitrogen), como descrito resumidamente abaixo.
O RNA foi extraído pelo método do Trizol conforme descrito anteriormente.
Depois da extração do RNA procedemos à lavagem e eluição do ácido nucléico,
conforme o boletim técnico do fabricante, como descrito resumidamente abaixo.
Para o procedimento de lavagem, foram transferidos aproximadamente
700uL da amostra de RNA com etanol para a coluna com resina, e foi centrifugada
a 12.000xg por 1 minuto e descartado o volume eluido da coluna. Esse processo
foi repetido e foi posteriormente adicionado 700 uL do tampão de lavagem (Wash
buffer I) e foi centrifugado por 1 minuto a 12.000xg. A seguir foram adicionados
500uL do tampão de lavagem II (Wash buffer II), e foi centrifugado a 12.000xg por
Figura – 5: Análise em gel de
agarose/formaldeído a 1%, do RNA
total obtido a partir de parasitas
adultos (1), ovos (2),
esquistossômulos (3); cercárias (4)
1 2 3 4
___________________________________________________Materiais e Métodos
35
1 minuto e descartado todo o volume. Depois disso, a coluna foi transferida para o
tubo coletor e o RNA foi eluido em 30uL de água livre de RNAse e foi incubado por
1 minuto. Para recolher o RNA foi centrifugado por 12.000xg por 2 minutos, e
mantido a -70oC até o uso.
3.6. Quantificação de DNA e RNA
As concentrações de DNA e RNA foram estimadas a partir da medida de
absorbância a 260nm. Uma unidade de absorbância a 260nm corresponde
aproximadamente a 50µg/mL de DNA (fita dupla) e 40µg/mL para RNA e DNA de
fita simples. O grau de pureza da preparação foi estimado através da relação entre
as leituras a 260 e 280nm. As preparações foram consideradas boas, quando o
valor da razão A=260/280 variou entre 1,8-2,2.
3.7 Obtenção dos cDNAs para a análise da expressão dos genes que
codificam para os componentes da via de sumorilação em S. mansoni
Para a técnica do RT-PCR, a primeira fita do cDNA foi sintetizada utilizando
o kit ThermoScript
TM
RT-PCR System (Invitrogen), 5ug de RNA total obtido como
descrito e como iniciador oligodT (50nmoles), exatamente como descrito no
boletim técnico do fabricante. Posteriormente, foram realizadas amplificações
utilizando 2µL desta reação, combinados com os oligonucleotídeos específicos
___________________________________________________Materiais e Métodos
36
para a amplificação dos genes em estudo nesse trabalho, como indicado na
Tabela 02.
Tabela 02- Oligonucleotídeos utilizados neste estudo. Os clusters foram recuperados do
banco de dados do projeto genoma do Schistosoma e analisados conforme descrito no
item 1. A seguir, utilizamos o programa Gene Runner para a idealização dos oligos
Para a obtenção do cDNA, utilizamos um programa de amplificação com 35
ciclos, cada um composto de uma etapa de desnaturação durante 1 minuto a
95°C, uma de anelamento do iniciador durante 1 minuto (conforme indicado na
Tabela 01) e uma de extensão durante 2 minutos a 72°C, utilizando como
polimerase a enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen). Como controle endógeno
utilizamos o gene da alfa-tubulina Uma alíquota de 10uL desta reação foi
analisada em gel de agarose a 1,5%.
___________________________________________________Materiais e Métodos
37
3.8. Clonagem no vetor pGEMT – easy do transcrito obtido por PCR e
transformação em células competentes
Os cDNA amplificados foram posteriormente clonados no vetor pGEMT
easy (Promega), utilizando o kit conforme instrução do fabricante.
Cerca de 5,0 µL da reação de ligação foram utilizados nos procedimentos
de transformação. Nestes experimentos foram utilizadas células competentes
preparadas pelo método descrito por HANAHAN (1985)
O plasmídio foi introduzido em bactéria competente Escherichia coli da
linhagem DH5α, através de choque térmico (90 segundos a 42°C; 2 minutos em
banho de gelo), crescimento sob agitação em meio SOC (SOB enriquecido com
glicose) a 200 RPM e 37°C, por 1h e 30 min. Decorrido este intervalo, a
suspensão bacteriana foi plaqueada em meio LB/ampicilina contendo X-GAL
(20µL/mL), para a seleção dos plasmídeos com inserto (colônias brancas) e sem
inserto (colônias azuis) e mantidas em estufa durante uma noite a 37°C.
3.9. Minipreparação de DNA plasmidial
Cerca de 1,5 mL da cultura bacteriana crescida em LB/ampicilina, durante
uma noite foram transferidos para tubos "eppendorf" e o precipitado bacteriano, foi
obtido por centrifugação a 10.000 x g por 2 minutos.
Em seguida, este precipitado foi solubilizado em 300 µL de solução GTE-
RNase (500 mM TRIS-HCl; 10mM EDTA; 100 µg de RNase A; pH=8.0). Após 15
___________________________________________________Materiais e Métodos
38
minutos de incubação à temperatura ambiente foram adicionados 300 µL de
solução NaOH-SDS (200mM NaOH;1% SDS) seguido de 5 minutos de incubação
à temperatura ambiente. Logo após, adicionou-se 300 µL de KOAc (3.0 M Acetato
de potássio; pH=5.5) e centrifugou-se durante 10 minutos a 14.000g. O
sobrenadante foi transferido para um novo tubo sendo adicionado a este, 400·µL
de isopropanol. Em seguida, as amostras foram centrifugadas durante 10 minutos
a 14.000 x g à temperatura ambiente. Decorrido este intervalo de tempo, foi
descartado o sobrenadante e o precipitado resultante lavado com 700 µL de etanol
70%. As amostras foram novamente centrifugadas a 4-5
o
C por 5 minutos.
Por fim, descartou-se o etanol e o precipitado seco foi ressuspendido em 23
µL de água. Uma alíquota de 3 µL foi analisado em gel de agarose 0,8%.
3.10. Sequenciamento
Os plasmídeos bem como produtos de PCR foram seqüenciados utilizando
o kit Big Dye Terminator v3.0, exatamente como descrito no boletim técnico do
fabricante. As amostras foram analisadas em sequenciador automático de DNA
ABI 3100 (Applied Biosystems), seguindo protocolos já padronizados no nosso
Laboratório.
3.11. Análise computational das sequências
As sequências obtidas foram submetidas à busca de homologia com
___________________________________________________Materiais e Métodos
39
nucleotídeos e aminoácidos utilizando os algoritmos BLASTn e BLASTx,
respectivamente, disponíveis no site www.ncbi.nlm.nih.gov. Também foram
utilizados os algoritmos pfam e PRODOM (www.expasy.org), para identificar os
domínos conservados nas sequências de aminoácidos preditas. As seqüências
foram alinhadas utilizando o programa CLUSTALW (www. ebi.ac.uk) e
posteriormente foram formatadas utilizando o programa boxshade
(http://www.ch.embnet.org/).
3.12. Análise da expressão diferencial dos genes que codificam para alguns
componentes da via de sumorilação utilizando PCR quantitativo
Para análise da expressão dos genes codificando para alguns componentes
da via de sumorilação em S. mansoni foi utilizada a técnica de PCR em tempo
real. Desta forma foram desenhados oligonucleotídeos específicos (Tabela 03)
utilizando o programa Vector NTI (INVITROGEN). As reações da PCR foram
realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG ROX
(INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A reação de PCR quantitativo
foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI 7500 Applied
Biosystems. As análises foram feitas utilizando o método do ∆∆Ct, uilizando a
fórmula 2
-∆∆Ct
, para calcular a expressão gênica relativa dos genes em estudo,
conforme boletim técnico do fabricante do aparelho de qPCR (Applied
Biosystems).
___________________________________________________Materiais e Métodos
40
Tabela 03- Oligonucleotídeos utilizados para o PCR quantitativo. Os clusters foram
recuperados do banco de dados do projeto genoma do Schistosoma geneDB e analisados
conforme descrito no item 1. A seguir, utilizamos o programa VectorNTI (Invitrogen) para
a idealização dos oligos. Como controle endógeno foi utilizado o gene que codifica para
alfa-tubulina.
Cluster Gene Seqüência Temperatura de
anelamento
tamanho
Smp016410 RanBP2 F5´TTGTCAGCGCGCCAAACTTTATC3´
R5´GGCACGGTTCTCAGCTGTTTGAA3´
60 391
Sm07718 PIAS1 F5´CATTCTTGAAGGTCGCATCGGTACA3`
R5´GGGTACCAATCGCCAATAACCATCT3`
60 370
Smp068320 Ulp1 F5´AGTCGGTTGGCGAGTGGTGGTT3´
R5´GCCTGAGAAGTGGATGCGATCAA3´
60 327
M80214(*) Alfa –
Tubulina
F5´ CGTATTCGCAAGTTGGCTGACCA3’
R5’ CCATCGAAGCGCAGTGATGCA´
60 377
(*) Webster et al Mol. Biochem. Parasitol. (1992)
3.13. Análise da expressão e tamanho dos trancritos utilizando Northern Blot
A confecção dos géis de agarose formaldeído 1% foi feita de acordo com
Maniatis et al., 1989. Para cada amostra de RNA total (10 a 20µg), foi adicionado
o tampão da amostra de RNA (formamida deionizada 62,5%, formaldeído 1,14M,
MOPS 1,25X, azul de bromofenol 0,25% e brometo de etídeo 0,5µg/mL de
concentração). As amostras de RNA foram desnaturadas a 65ºC por 15 minutos,
seguido de banho de gelo por 3 minutos, aplicadas nos poços de gel de agarose e
a corrida eletroforética foi ajustada para 90 a 100 volts.
Em seguida, o gel foi tratado com SSC 10X durante 1 hora, e os RNAs
transferidos para uma membrana de nylon Hybond N+(GE Healthcare) durante 16
___________________________________________________Materiais e Métodos
41
horas. Posteriormente, o sistema de transferência foi desmontado, as membranas
lavadas durante 5 minutos em SSC 6X, colocada entre duas folhas de papel de
filtro 3mm, embrulhada em papel alumínio e incubado em estufa a 80ºC por 2
horas para permitir a imobilização dos RNA na membrana.
3.14. Preparo da sonda radioativa
Para a obtenção das sondas radioativas, utilizamos a técnica de Random
Primer Extension (FEINBERG & VOGELSTEIN, 1983), e o kit Random Primer
Labelling System (Invitrogen). Este procedimento permite obter fragmentos de
DNA marcados com
32
P que podem ser empregados como sonda em
experimentos de hibridização. O método baseia-se na utilização de
hexanucleotídeos sintéticos aleatórios, como iniciadores para a polimerização de
qualquer segmento de DNA molde. Para que ocorra a síntese de uma nova fita,
são necessários uma mistura de deoxinucleotídeos e o fragmento Klenow da DNA
polimerase I. Neste caso, um dos deoxinucleotídeos, o dCTP, possui um
32
P na
posição α.
Na reação de obtenção da sonda, cerca de 50-100ng do cDNA de interesse
foram desnaturadas por 5 minutos a 100°C, sendo em seguida adicionados 2µL de
cada um dos deoxinucleotídeos (dTTP,dGTP e dATP, na concentração final de
0,5mM) e 4µCi [α
32
P] dCTP e 1 unidade de DNA polimerase I (fragmento Klenow) e
água milli-Q estéril para completar um volume final de 50µL. A reação foi incubada a
temperatura ambiente por 1 hora, sendo posteriormente interrompida pela adição de
___________________________________________________Materiais e Métodos
42
2µL de EDTA 0,5M. Em seguida, para a remoção dos nucleotídeos não incorporados,
a sonda foi purificada em coluna de Sephadex G-50, previamente equilibrada com
tampão NT (Tris-HCl 10mM, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM pH 8,0). A coluna foi
montada em pipeta Pasteur, contendo lã de vidro na sua extremidade e o
empacotamento feito por sedimentação. Foi adicionado à sonda, 7µL do corante blue
dextran e a mistura foi aplicada no topo da coluna. A sonda marcada, foi eluida no
mesmo tampão (NT), sendo recolhida em um tubo do tipo eppendorf.
3.15. Reação de hibridização
As membranas de nitrocelulose (contidas em saco plástico), inicialmente
foram pré-hibridizadas a 65°C, sob agitação moderada, por no mínimo 4 horas, em
uma solução previamente aquecida composta por: 6x SSC, 2x reagente de
Denhardt e 0,1% SDS (100mg/mL) e 20µg de DNA de esperma de salmão para
1mL de solução de pré-hibridização, por 4 a 6 horas sob agitação leve.
Posteriormente, foi adicionada a sonda previamente desnaturada, com uma
atividade específica de 2x10
8
cpm/µL. A incubação foi mantida por 16 horas. Em
seguida, para retirar o excesso de sonda não incorporada e remover os híbridos
não homólogos, as membranas foram lavadas sequencialmente, uma vez, com as
seguintes soluções:
1) Solução 1: SSC 2X, SDS 0,1X, 15 minutos a temperatura ambiente;
2) Solução 2: SSC 0,5X, SDS 0,1%, 15 minutos, temperatura ambiente, com
agitação moderada;
___________________________________________________Materiais e Métodos
43
3) Solução 3: SSC 0,1X, SDS 0,1%, 15 minutos, temperatura ambiente, com
agitação moderada;
4) Solução 4: SSC 0,1X, SDS 1% por 30 minutos a 50°C, com agitação
moderada.
3.16. Autoradiografia
Para verificar as regiões de homologia, as membranas obtidas após a
reação de hibridização, foram levemente secas, em papel de filtro,
embrulhadas em filme de PVC e acondicionada em cassetes contendo
intensificador e expostas a filmes Kodak (X-OMAT-XAR-5). O período de
exposição variável de acordo com a intensidade do sinal, monitorada
previamente com contador VICTOREEN, modelo 489-110C.
As revelações foram feitas de acordo com as instruções do fabricante,
utilizando como solução reveladora o Revelador e Reforçador GBX e como
fixadora, o Fixador e Revelador GBX (KODAK).
3.17 Obtenção dos extratos totais e nucleares de parasitas adultos e
cercárias e Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1
A partir de parasitas adultos e cercárias foram preparados extratos de
proteínas totais. Os parasitas foram homogenizados no tampão (Tris 5mM pH 8,0;
glicerol 1%, EDTA 1mM; PMSF 1mM; DTT 1mM e MG132 1mM). Com o auxílio de
___________________________________________________Materiais e Métodos
44
um politron, os parasitas foram homogenizados brevemente e centrifugados a
10.000 x g por 30 minutos. O precipitado foi descartado e o sobrenandante foi
centrifugado a 40.000 x g por 60 minutos. A concentração protéica foi determinada
pelo método de Pierce (Smith, 1985). O extrato total foi analisado em SDS-PAGE
12% (Laemmli, 1970).
Para o extrato nuclear, os parasitas foram ressuspendidos no tampão RSB
(Tris 10mM pH 7,6; NaCl 10mM; MgCl
2
3mM; Triton X-100 e PMSF 1mM),
homogenizados em politron e centrifugados a 2000 x g por 10 minutos a 4ºC. O
sobrenadante contendo a fração citosólica foi estocada a -70ºC. O precipitado
contendo os núcleos foi ressuspendido em tampão RSB e posteriormente
centrifugado como descrito. Finalmente os núcleos foram incubados por 45
minutos em tampão RSB acrescido de NaCl 0,8 M, para que ocorra a lise
osmótica dos núcleos, e centrifugados a 10.00 x g por 45 minutos 4ºC. O
sobrenadante foi dialisado por 3 horas em tampão E ( HEPES 20 mM pH 7,6;
MgCl
2
; EDTA 0,1 mM; DTT 1mM e PMSF 10mM). A concentração protéica foi
determinada pelo método de Pierce, conforme descrito no manual técnico do
fabricante e analisada por eletroforese SDS-PAGE.
Cerca de 20µg de proteína nucleares e citossólicas de vermes adultos bem
como as proteínas totais de cercárias, foram transferidos para uma membrana de
PVDF (Hybond –GE healthcare) e submetidas à análise por Western Blot. Após a
eletrotransferência em Mini-Protean a membrana foi bloqueada com 5% de leite
desnatado no tampão de bloqueio (Tris 1M pH 7,5; Tween 20). Depois da reação
de bloqueio as membranas foram incubadas com o anticorpo primário (diluição
1/500) anti-SUMO (Santa Cruz Biotechnologies), por 4 horas. Decorrido este
___________________________________________________Materiais e Métodos
45
tempo as membranas foram lavadas e posteriormente incubadas com o anticorpo
secundário Anti IgG de cabra biotinilado (Calbiochem) conjugado à fosfatase
alcalina ( diluição 1/1000) por 1h e 30 minutos. A enzima foi detectada usando os
reagentes NBT/BCIP (INVITROGEN).
O procedimento acima também foi realizado utilizando como anticorpo
primário anti-Ubc9 (santa Cruz biotech) e anticorpo secundário anti-IgG de coelho
(Calbiochem).
3.18. Determinação da estrutura genômica dos genes que codificam para
SUMO e Ubc9
3.19. Extração do DNA genômico
Os parasitas adultos mantidos –70
°C foram transferidos para um cadinho
de porcelana juntamente com gotas de nitrogênio líquido, com a finalidade de
facilitar a pulverização dos vermes. Em seguida, procedeu-se a extração do DNA
genômico, conforme o seguinte protocolo simplificado por Costa (Tese de
Doutorado, 1997).
Para cada 100 mg de verme pulverizado, foram adicionados 250 µL do
tampão de lise (Tris 0,05 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, 1% de N-laurilsarcosina e 100
µg/mL de proteinase K) e mantidos a 37
°C durante 1 hora . A seguir, foi
acrescentado 100µL de NaCl 5M e a mistura incubada por 10 minutos a 65°C e
___________________________________________________Materiais e Métodos
46
posteriormente foi adicionado 50µL de uma solução de CTAB/NaCl a 10%,
seguido por uma incubação de 20 minutos a 65°C.
O DNA foi extraído com clorofórmio (v:v) e posteriormente precipitado pela
adição (v/v) de isopropanol. Após 30 minutos de incubação à -20°C, o DNA foi
centrifugado a 12000 x g, lavado com etanol a 70%, seco, ressuspenso em água e
armazenados a 4°C.
Na Figura 6, está apresentada uma análise em gel de agarose de uma
preparação de DNA genômico, realizada como descrito acima. Este método
permite a obtenção de DNA íntegro.
3.20. Amplificação das seqüências de SUMO a partir do DNA genômico
Cerca de 50 ng de DNA genômico foram utilizados nas amplificações. Os
componentes da mistura de reação foram: água (livre RNAse); tampão para
enzima Taq DNA polimerase; MgCl
2
; oligos direto e reverso; dNTPs; 50 ng de
DNA genômico; Taq DNA polimerase. Como iniciadores foi utilizado o par de
Figura – 6: Análise em gel de
agarose 0,7% do DNA
genômico obtido através de
parasitas adultos.Marcador
de peso molecular λDNA-
HindIII.
___________________________________________________Materiais e Métodos
47
oligos SUMO gene específico.
A reação de amplificação consistiu de 40 ciclos de desnaturação a 95°C por
45 segundos; emparelhamento ou anneling dos oligonucleotídeos conforme a
Tabela 1 por 1 minuto e extensão a 72°C por 1min e 20 seg. O produto da reação
de PCR foi analisado em gel de agarose 1,5%.
3.21. Estimativa do número de cópias dos genes por Southern blot
Cerca de 10µg do DNA genômico foram digeridos com 5U/µL de cada
enzima de restrição, e a digestão se procedeu durante uma noite. Resultados
ilustrativos estão mostrados na Figura 9.
Os fragmentos de DNA gerados foram separados em gel de agarose 0,7%,
utilizando corrente de 60mV em tampão TAE (Tris-Acetato 0,04M,EDTA 1mM). O
padrão de peso molecular utilizado foi o de 1Kb (GIBCO-BRL).
Após a eletroforese, o gel foi tratado como segue:
1) Lavagem em solução despurinizante – HCl 0,25M
2) Lavagem em solução desnaturante – NaOH 0,5M/NaCl1,5M
3) Lavagem em solução neutralizante – Tris-HCl 0,5M/NaCl 1,5M pH=7,5.
Todas as lavagens foram realizadas durante 30 minutos e sob agitação
constante. O sistema de transferência de DNA por capilaridade foi montado de
acordo com a técnica descrita por SOUTHERN, 1975. Uma membrana do
tamanho exato do gel foi umedecida com SSC10X e colocada sobre o mesmo. A
membrana, então foi recoberta com três folhas de papel de filtro Whatman 3mm e
___________________________________________________Materiais e Métodos
48
uma pilha de 8cm de papel poroso (todos os papéis do mesmo tamanho do gel) e
por fim, um peso de aproximadamente 500 gramas. Decorridas 18 horas, o
sistema foi desmontado, a membrana foi lavada com SSC 6X e o DNA,
imobilizado na membrana no forno a 80ºC por 2 horas.
As sondas forma preparadas e marcadas conforme descrito no item 3.14. As
membranas foram hibridizadas, lavadas com solução de alta estringência e
autoradiografadas, conforme descrito nos itens 3.15 e 3.16 respectivamente.
Figura – 7: Perfil de digestão
do DNAg. Aproximadamente
10µg do DNAg extraído a
partir de parasitas adultos
(casais) foram digeridos com
as seguintes enzimas de
restrição: (1) ECORI; (2)
HindIII; (3) Bgl II; (4) PstI
PM 1 2 3 4
4. Resultados
SUMO (Small Ubiquitin Modifier)
__________________________________________________________ Resultados
50
4.1. Análise in silico da via de sumorilação em S. mansoni.
As seqüências correspondentes à via de sumorilação foram obtidas através
da busca por identidades de seqüência em relação aos bancos de dados da
FAPESP, geneDB (Sanger & Welcome Trust) e TIGR (The Institute for Genomic
Research). Atualmente sabe-se que já estão anotados praticamente 92% do
transcriptoma do parasita, o que corresponde a aproximadamente 14.000 genes
(Verjovski et al 2004). Diante deste fato, neste trabalho traçamos um perfil,
reconstituindo praticamente toda a via de sumorilação neste parasita. Como
podemos observar pela análise da Tabela 04, o parasita apresenta todos os genes
que codificam para as proteínas que a célula necessita para sumorilar um
substrato alvo, ou seja, a proteína SUMO, a enzima conjugadora Ubc9, as
enzimas E3 ligases dos tipos PIAS, e RanBP2, as proteases especificas de SUMO
– do termo em Inglês - SUSP, ou ULP 1 (Ubiquitin-like protease) que são
responsáveis tanto pela de-sumorilação de um substrato alvo, quanto pela
maturação de SUMO, tornando esta em sua forma ativa.
Na Tabela 04 observamos que as seqüências dos componentes da via de
sumorilação, foram montadas a partir de seqüências provenientes de vários
estágios do parasita, indicando que esta via se encontra presente e pode estar
ativa em todos estágios, salvo algumas diferenças de expressão de alguns genes
que podem ocorrer ao longo do desenvolvimento.
__________________________________________________________ Resultados
51
Tabela 04: Panorama geral das seqüências de DNA que codificam para a via de
sumorilação depositadas nos bancos de dados de projetos de sequenciamento em larga
escala do parasita S. mansoni. Os números de acesso na Tabela se referem aos bancos
de dados da FAPESP, organizado pelo consórcio de sequenciamento do transcriptoma do
parasita (São Paulo, Brasil), e aos bancos de dados GeneDB organizado pelo Sanger
Centre –Welcome Trust (UK), e TIGR (US).
Biblioteca homologia Numero de acesso
Transcriptoma
São Paulo
Numero de acesso
GeneDB.org e
TIGR
Adultos Smt3 601278 Smp045510
esporocisto Smt3
miracideos Smt3
ovos SAE subunit 2 Sm11888
esquistossômulos SAE subunit 2
702113
710176
Adultos UBC9 604764
610543
TC17938 TC19135*
ovos 718421
604326
603621
607598
611539
700408
Sm07718
SUMOE3/PIAS
SumoE3/Pias
Adultos SUMOE3/RanBP2/Nup358 Smp016400
ovos SUMOE3/RanBP2/Nup358 Smp016410
esporocistos SUMOE3/RanBP2/Nup358
miracideos SUMOE3/RanBP2/Nup358
Cercarias SUMOE3/RanBP2/Nup358
esquistossomulos SUMOE3/RanBP2/Nup358
607171
601355
Adultos SUMO specific protease Sm24864
esporocistos SUMO specific protease Sm05075
ovos SUMO specific protease Sm00592
miracideos SUMO specific protease Smp068320
esquistossômulos SUMO specific protease
612155
602232
603232
603433
(*) as TCs em asterísticos indicam as seqüências que foram retiradas do banco da Tigr.
__________________________________________________________ Resultados
52
4.2. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do cDNA codificando
para SMT3C em S. mansoni
Para a validação dos resultados in silico foram desenhados
oligonucleotídeos que compreendiam a região codificadora do gene de SMT3C ou
SUMO-1. Após o RT-PCR obtivemos um cDNA que apresentou um tamanho de
270bp e codifica para uma proteína de 90 aminoácidos e após isso passamos a
denominar esse gene de SmSMT3C (Figura 7).
O cDNA foi submetido à análise de seqüência utilizando os algoritmos
BLASTn para nucleotídeos e BLASTx para aminoácidos. Posteriormente a
seqüência predita de aminoácidos foi alinhada com as seqüências provenientes de
outros organismos utilizando o programa CLUSTALW presente no site
www2.ebi.ac.uk/clustalw. O resultado apresentado na Figura 8 representa essa
análise, e mostra que essa proteína predita de S. mansoni,é bem conservada
entre os seus ortólogos. Além disso, podemos observar que a SmSMT3C,
apresenta o domínio ubiquitina, importante para a formação da estrutura
tridimensional característica dessas proteínas e também para a conjugação
dessas proteínas aos seus substratos alvo.
Outra característica importante que podemos destacar na seqüência predita de
aminoácidos é a presença do motivo Gli-Gli na sua porção C-terminal, motivo este,
responsável pela modificação pós-traducional por SUMO das proteínas celulares. A
análise da seqüência predita da proteína também nos levou a constatar que tanto S.
mansoni quanto outros invertebrados como D. melanogaster, C. elegans e a levedura
S. pombe, não apresenta o motivo ψKXE, como circulado na Figura 8, esse motivo
__________________________________________________________ Resultados
53
pode ser reconhecido por Ubc9 levando a autosumorilação (Chen 2004). A razão
pela qual isso ocorre ainda permanece a ser elucidada.
Figura - 8: Alinhamento da seqüência predita de proteínas de SmSMT3C em relação
aos outros organismos, mostrando que SmSMT3C é bastante conservada em relação
aos seus ortólogos. As abreviaturas são: Rn (Rattus norvegicus ); Hs (Homo sapiens); Sc
(Saccharomyces .cerevisiae ); Mm (Mus musculus); Dm (Drosophila melanogaster ); Sm
(Schistosoma .mansoni); Sj (Schistosoma japonicum ); Ce (Caenorhabditis elegans) Cb
(Caenorhabditis briggsae) At (Arabidopsis thaliana) Sp (Schizosaccharomyces pombe).O
domínio circulado se refere ao domínio conservado de SUMO ΨKXE, onde Ψ é um
aminoácido hidrofóbico, K é uma lisina, X é qualquer aminoácido e E é glutamato.
Figura 7: Amplificação do gene que
codifica para SMT3C por RT-PCR
utilizando oligonucleotídeos específicos.
(1) cDNA SmSMT3C em vermes adultos de
tamanho 270pb. (MW) Padrão de peso
molecular de 100 pb (Invitrogen)
__________________________________________________________ Resultados
54
A filogenia molecular é uma forma de análise, pela qual podemos agrupar
seqüências de organismos diferentes, e desta forma avaliar as semelhanças bem
como a conservação dessas seqüências ao longo da evolução das espécies.
Através da Figura 9, podemos dizer que a seqüência de SmSMT3C é bem
conservada entre as espécies analisadas e que essas seqüências foram divididas
em dois clados distintos, onde as seqüências de S. mansoni e S. japonicum se
encontram em um ramo específico, próximo ao ramo de D. melanogaster e das
seqüências de H. sapiens e R. norvegicus.
Figura 9: Análise filogenética para SmSMT3C e seus ortólogos. A árvore filogenética
foi calculada utilizando neighbor-joining contido no programa Mega 3.0. As distâncias
lineares entre as seqüências homólogas são inversamente proporcionais às seqüências
de aminoácidos.
Schistosoma mansoni
Schistosoma japonicum
__________________________________________________________ Resultados
55
4.3. Estrutura genômica do gene SmSMT3C e número de cópias desse gene
por genoma haplóide.
O DNA genômico do parasita S. mansoni for extraído pelo método do CTAB
e amplificado por PCR como descrito em Materiais e Métodos. Na Figura 10A,
mostramos o resultado dessa amplificação, onde obtivemos um produto de
aproximadamente 400pb. O alinhamento desse produto seqüenciado em relação
ao cDNA (Figuras 10B e 10C) mostra, que a região codificadora desse gene é
interrompida por dois pequenos íntrons de 28 e 36 pb. Além disso, também o gene
desse parasita apresenta os sítios conservados GT....AG, que são requeridos pela
maquinaria de processamento do mRNA eucariótico.
__________________________________________________________ Resultados
56
genomica ATGACTGATAGTGCCAATAAGGTAAGCATTTTTGCGATATAAATACTATTTTTCTGATGA 60
cDNA -----------------------------------------------------GGCACGA 7
* **
genomica TGGTAACCAAAGAATTTCTTAAT-TAATTCAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCA 119
cDNA GGTTTGTCGGGATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCA 67
* * * * ** * * * ******************************
genomica AAGTGCAAGGACAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCA 179
cDNA AAGTGCAAGGACAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCA 127
************************************************************
genomica AGAAATTAATTACTGCTTACTGCGATCGATTAGT
AAGCATTTGATCAGCATATACTCAAT 239
cDNA AGAAATTAATTACTGCTTACTGCGATCGATTAG--------------------------- 160
*********************************
genomica CTCCTTTAG
GGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGAAACAGCGTTCAT 299
cDNA ----------GCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGAAACAGCGTTCAT 210
**************************************************
genomica GAAACTGATACTCCTGGCTCGGT
AAGTTAACCTTATAGTTCACATTAAAATTTATAGTTG 359
cDNA GAAACTGATACTCCTGGCTCG------------------------------------TTG 234
********************* ***
genomica GAAATGGAAGAAAATGATACCGTTGAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTG------ 413
cDNA GAAATGGAAGAAAATGATACCGTTGAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 294
******************************************************
Figura 10: Organização genômica do gene SmSMT3C em S. mansoni. (A)
Amplificação do DNA genômico por PCR usando os oligonucleotídeos específicos para o
gene que codifica para SMSMT3C. (B) e (C) Organização estrutural do gene SmSMT3C.
Representação esquemática da região codificadora e a localização genômica dos éxons e
suas posições relativas. O primeiro íntron contém 28pb e o segundo contém 36pb. MW
representa o peso molecular de 1Kb (Invitrogen). Os nucleotídeos sublinhados indicam os
sítios conservados de splicing.
A B
C
DNA genômico
cDNA
__________________________________________________________ Resultados
57
O número de cópias que esse gene apresenta por genoma haplóide foi
investigado, utilizando a técnica de Southern Blot. Foram utilizadas as enzimas
EcoRI, que apresenta o sítio interno, na seqüência se SmSMT3C, e as enzimas
HindIII, BglII, PstI, que não apresentam sítio interno na seqüência de S. mansoni.
Pela análise da autoradiografia podemos sugerir, que esse gene possui duas
cópias por genoma haplóide do parasita (Figura 11).
Figura 11: Southern Blot utilizando o gene SmSMT3C como probe. O DNA genômico
de S. mansoni foi digerido com EcoRI e apresenta sítio interno na seqüência de
SmSMT3C; HindIII ;BglII;PstI.
EcoRI
HindIII
BglII
PstI
__________________________________________________________ Resultados
58
4.4 Expressão do gene que codifica para SmSMT3C no ciclo de vida do
parasita.
4.4.1- Padrão de transcrição de SmSMT3C no ciclo de vida do parasita
Através da técnica de RT-PCR podemos estudar a expressão desse gene
no ciclo de vida do parasita. Na Figura 12 podemos observar que o gene que
codifica para SmSMT3C apresenta expressão durante o ciclo de vida do parasita.
Figura 12: RT-PCR para o gene SmSMT3C no ciclo de vida do parasita.
Aproximadamente 1ug de RNA foi utilizado para a síntese da primeira fita. Foram
aplicados 10ul do produto da PCR no gel de agarose 1% e corados com Brometo de
etídeo (Invitrogen). Como controle endógeno utilizamos o gene que codifica para α-
tubulina.
PM
Vermes adultos
Ovos
Esquistossômulos
cercárias
__________________________________________________________ Resultados
59
4.4.2 Northern Blot
Através da técnica de Northern Blot, utilizando RNA total, avaliamos a
expressão do gene SmSMT3C, estimamos o tamanho desse transcrito e a presença
de uma ou várias mensagens. O resultado do Northern Blot apresentado na Figura
13, mostra que coexistem dois transcritos de tamanhos 1,0 e 1,8 Kb respectivamente,
sendo o transcrito de 1,0Kb mais abundante do que o transcrito de 1,8 Kb.
4.4.3 - Detecção dos conjugados sumorilados
Para realizarmos o experimento de Western Blot, utilizamos o anticorpo
anti-SUMO 1 humano (Santa Cruz, biotechnologies). Conforme podemos verificar
na Figura 14B, S. mansoni apresenta várias bandas, o que significa a presença de
vários conjugados sumorilados tanto em extratos nucleares e citoplasmáticos de
vermes adultos (canaletas 1 e 2) quanto em extrato total de cercárias (canaleta 3).
Figura 13: Northern Blot utilizando
como sonda o gene SmSMT3C em S.
mansoni. A autoradiografia mostrou
duas bandas de diferentes intensidades
de tamanhos 1,0 e 1,8 Kb
respectivamente. O gene que codifica
para α-tubulina,foi utilizado como
controle constitutivo.
1,8
1,0
α-tubulina
__________________________________________________________ Resultados
60
Como podemos avaliar através da Figura 14B, os conjugados sumorilados se
encontram mais expressos na fração protéica nuclear do que na fração citossólica.
A
Figura 14: Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1. Aproximadamente 20ug
do extrato nuclear, citoplasmático de vermes adultos e extratos totais de cercárias
obtidos como descrito em Materiais e Métodos, foram analisados através de um gel
SDS-PAGE 10%, seguido por Western Blot utilizando o anticorpo anti-SUMO-1. (A) Gel
réplica corado com Comassie Brilliant Blue. (B) Detecção dos conjugados sumorilados.
As setas indicam os conjugados sumorilados nas fases correspondentes. Como controle
endógeno dos extratos citoplasmáticos e totais foi utilizado o anticorpo anti-
β-actina de
camundongo.
PM
núcleo
citoplasma
cercárias
188
62
49
28
14
kDa
núcleo
citoplasma
cercárias
188kDa
28kDa
β-actina 43kDa
B
__________________________________________________________ Resultados
61
Enzima E2 conjugadora de SUMO – Ubc9
__________________________________________________________ Resultados
62
4.5. Clonagem, sequenciamento e análise da seqüência do gene que codifica
para a enzima conjugadora E2 de SUMO (Ubc9).
Assim como anteriormente descrito para o gene SmSMT3C, foram
desenhados oligonucleotídeos específicos para a região codificadora do gene de
SmUbc9. Após o RT-PCR, verificamos a amplificação de um transcrito de 450 pb
conforme mostrado na Figura 15, que foi seqüenciado conforme descrito em
Materiais e Métodos e foi posteriormente denominado SmUbc9.
Figura 15: Amplificação do transcrito que codifica para SmUbc9 em S. mansoni.
Aproximadamente 1ug de RNA total foram utilizados para a síntese da primeira fita de
cDNA. Cerca de 10uL da reação de PCR foram analisados em gel de agarose 1% e
corados com Brometo de etideo (Invitrogen).
O alinhamento da proteína predita de S. mansoni utilizando ClustalW,
mostrou a presença do domínio UBC (Ub- conjugating enzyme catalytic)
conservado (Figura 16). Este domínio é responsável pela atividade catalítica da
enzima, ou seja, pela ligação tiól-ester, que esta enzima realiza em seus
substratos alvo.
PM 1
450 pb
__________________________________________________________ Resultados
63
Figura 16: Alinhamento
da proteína predita
SmUbc9 em relação
aos outros organismos.
O alinhamento mostra
que SmUbc9 é bastante
conservada em
comparação com outros
organismos. As
abreviaturas são: Sm (S.
mansoni); Sj (S.
japonicum) Hs (H.
sapiens); Gg (Gallus
gallus) Dm (D.
melanogaster); Ce (C.
elegans) At (A. thaliana);
Sc (S. cerevisiae); Tb
(Trypanosoma brucei); Pf
(Plasmodium falciparum);
Gl (Giardia lamblia). O
retângulo assinalado
representa o domínio
cisteíno protease
característico da Ubc9.
__________________________________________________________ Resultados
64
Na Figura 17, mostramos um resultado de filogenia molecular, para
reforçarmos a conservação de SmUbc9 em relação aos outros organismos e
também mostrarmos que a seqüência de proteína de S. mansoni, está
filogenéticamente próxima da seqüência do parasita S. japonicum, assim como de
outros organismos como C. elegans e D. melanogaster.
Figura 17: Filogenia molecular para a seqüência predita de aminoácidos de SmUbc9
e sua conservação em relação aos seus ortólogos. A árvore filogenética foi calculada
usando o algoritmo neighbor-joining presente no programa MEGA 3. As distâncias
lineares entre as seqüências homólogas são inversamente proporcional às similaridades
entre as seqüências de aminoácidos.
__________________________________________________________ Resultados
65
4.6. Estrutura genômica do gene que codifica para SmUbc9 em S. mansoni
O DNA genômico foi extraído conforme descrito em Materiais e Métodos e
foi utilizado para a reação de PCR para determinarmos a estrutura genômica, ou
seja, a estrutura éxon-íntron, e também o número de cópias por genoma haplóide
correspondente ao gene SmUbc9. A reação de PCR mostrou-nos um produto
amplificado de 500 pb, que foi clonado, seqüenciado e alinhado com a seqüência
de cDNA para investigarmos a presença de íntrons. Na Figura 18
A, mostramos a
banda de 500 pb correspondente à amplificação do DNA genômico utilizando os
oligonucleotídeos específicos para o gene SmUbc9. O alinhamento da seqüência
do cDNA versus a seqüência genômica, mostrou que a seqüência genômica do
gene SmUbc9 é interrompida por dois pequenos íntrons e apresenta a seqüência
de splicing não canônico AT...AC (Figuras 18B/C).
__________________________________________________________ Resultados
66
cDNAUBC9 TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTT 59
GenomicUBC9 TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTT 60
***********************************************************
cDNAUBC9 TTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGT 119
GenomicUBC9 TTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGT 120
************************************************************
cDNAUBC9 GATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAAT----------------------------- 150
GenomicUBC9 GATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAAT
CTTATAGCATGTTAAAAAGGAGTTTCTTT 180
*******************************
cDNAUBC9 ------TTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAG 204
GenomicUBC9 AGATAC
TTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAG 240
******************************************************
cDNAUBC9 ACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTT 264
GenomicUBC9 ACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTT 300
************************************************************
cDNAUBC9 GGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTC 324
GenomicUBC9 GGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTC 360
************************************************************
cDNAUBC9 CCACAATGT-------------------------------------GCCTTTTTTCCCAG 347
GenomicUBC9 CCACAAT
GTCTAAATAGCTTTAAAAAGAGTATACTATGGATCTTACGCCTTTTTTCCCAG 420
********* **************
cDNAUBC9 GTATACTACAATTCCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400
GenomicUBC9 GTATACTACAATTCCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 473
Figura 18: Amplificação do DNA genômico utilizando os oligonucleotídeos
específicos para o gene SmUbc9. (A) Produto da PCR para SmUBC-9 genômica. (B)
Organização estrutural do gene SmUBC-9. Representação esquemática da região
codificadora e da localização genômica dos exons e suas posições relativas. O primeiro
íntron contém 37 pb e o segundo contém 35 pb. MW é o peso molecular de 100 bp
(Invitrogen). (C) Alinhamento da seqüência do cDNA com a seqüência genômica para o
gene SmUbc9. As seqüências sublinhadas significam as junções de splicing não-
canônicas AT...AC.
C
A
B
ATG
STOP
1
151
187
369
409
473
DNA
Genômico
cDNA
__________________________________________________________ Resultados
67
4.7. Expressão do gene que codifica para o gene SmUbc9 no ciclo de vida do
parasita.
4.7.1 - RT-PCR
Através do método do Trizol (Invitrogen) descrito em Materiais e Métodos, o
RNA das diversas fases do ciclo de vida do parasita, ou seja, vermes adultos,
cercárias, ovos e esquistossômulos foram extraídos e submetidos à reação de RT-
PCR. Na Figura 19, mostramos os transcritos resultantes, e verificamos que o gene
que codifica para SmUbc9 é expresso em todas as fases do ciclo de vida avaliadas.
Figura 19: Expressão do gene SmUbc-9 no ciclo de vida S. mansoni. Cerca de 50
nanogramas of mRNA de vermes adultos, cercárias, esquistossômulos e ovos foram
utilizados para a avaliar a expressão desse gene no ciclo de vida do parasita.
Aproximadamente 10uL do produto amplificado foram analisados em gel de agarose 1,0%
e corados com Brometo de etídeo. Como controle endógeno foi utilizado o gene que
codifica para α-tubulina.
PM
Vermes adultos
Cercárias
Esquistossômulos
ovos
__________________________________________________________ Resultados
68
4.7.2 – Northern Blot
O RNA de vermes adultos, obtido como descrito anteriormente, foi
submetido à eletroforese em gel de agarose/formaldeído (Maniatis et al, 1989) e
posteriormente transferido para uma membrana de náilon e hibridizado utilizando
como sonda o cDNA que codifica para o gene SmUbc9. Na Figura 20, podemos
observar que SmUbc9 apresenta apenas um transcrito de tamanho aproximado de
1,32 Kb.
Figura 20: Northern Blot utilizando o cDNA de SmUbc9 como probe. Como controle
endógeno foi utilizando o gene que codifica para α-tubulina de S. mansoni
4.7.3 – Western Blot
Para avaliar a funcionalidade da via de sumorilação em S. mansoni e
aproveitando a similaridade de seqüência entre SmUbc9 e outros organismos,
α-tubulina
Ubc9
1,32Kb
__________________________________________________________ Resultados
69
procedemos à técnica de Western Blot, utilizando o anticorpo anti-ubc9 humano
(Santa Cruz, biotechnologies). Na Figura 21 podemos observar que a proteína
Ubc9 se encontra na sua forma não conjugada tanto no extrato nuclear, quanto no
extrato citoplasmático do parasita e apresenta um peso molecular de
aproximadamente 20 KDa, conforme descrito por Kovalenko et al 1995.
Figura 21: Western blot da proteína SmUbc9 utilizando anticorpo anti-Ubc9.
Aproximadamente 20ug do extrato total de vermes adultos obtido como descrito em
Materiais e Métodos foram analisados através de um gel SDS-PAGE 10%, seguido por
Western Blot utilizando o anticorpo anti-Ubc9 humano (Santa Cruz Biotech). (A) Gel
réplica corado com Comassie Brilliant Blue. (1) núcleo (2) citoplasma. (B) Detecção da
proteína Ubc9. Como controle dos extratos citoplasmáticos foi utilizado o anticorpo anti-β-
actina de camundongo.
A
PM
núcleo
cito
p
lasma
188
62
49
28
14
kDa
B
20 KDa
Núcleo
Citoplasma
β-actina
43kDa
__________________________________________________________ Resultados
70
4.8 Caracterização do pseudogene
ψ
SmUbc9 em S. mansoni.
Através da análise dos bancos de dados, FAPESP, TIGR e geneDB, foram
selecionados duas seqüências que apresentavam homologia com as seqüências que
codificam para a enzima conjugadora de SUMO, a proteína Ubc9. Essas entradas
foram analisadas utilizando o programa ORFinder no site www.ncbi.nih.nlm.gov e
podemos verificar que o cluster 604764, apresenta uma ORF aberta, que codifica
para a proteína Ubc9 como demonstramos nos itens anteriores, através da estrutura
genômica desse gene, bem como da sua expressão no ciclo de vida do parasita .
Desta forma primeiramente foi necessário avaliar se a seqüência referente
à entrada 610543 (ou TC19135) apresentava uma ORF aberta. Conforme
podemos verificar na Figura 22, esse gene apresenta várias interrupções,
causadas por códons de parada em sua seqüência de DNA. Assim as análises “in
silico” apontam para um possível pseudogene em S. mansoni, visto que esse gene
não é capaz de codificar uma proteína funcional. Porém as análises “in silico” não
foram suficientes para afirmar se a seqüência identificada no projeto genoma,
seria um candidato a ser um pseudogene, pois interrupções muitas vezes podem
indicar erros de sequenciamento.
Figura 22: Representação esquemática da interrupção do código aberto de leitura
(ORF) do
ψ
SmUbc9 por códigos de parada. A seqüência foi submetida ao programa
ORF finder, e verificamos que a ORF do
ψ
SmUbc9 é interrompida em vários locais,
im
p
ossibilitando a ori
g
em de uma
p
roteína funcional
__________________________________________________________ Resultados
71
4.9 – Sequenciamento das seqüências genômica e do cDNA do gene
ψSmUbc9
Para confirmar a possibilidade, que o possível transcrito possa ser um
transcrito biológico e não um artefato de sequenciamento foram desenhados
oligonucleotídeos específicos e procedemos aos experimentos de RT-PCR e o PCR
genômico e posteriormente sequenciamos os produtos da PCR, utilizando o kit Big
Dye v3.0 (Applied Biosystems), conforme descrito em Materiais e Métodos. O
transcrito resultante do RT-PCR mostrou-nos um tamanho de 500 pb, conforme
indicado na Figura 23
A. Na amplificação do DNA genômico, verificamos uma banda
de 600 pb (Figura 23B)
Figura 23: Amplificação do gene
ψ
SmUbc9 por PCR utilizando os oligonucleotídeos
específicos. Cerca de 1ug de RNA ou DNA genômico foram utilizados na reação da PCR
e foram analisados 10uL de do produto da PCR e corados com Brometo de Etídeo
(Invitrogen). (A) RT-PCR do transcrito de ψUbc9. O resultado da PCR amplificou um
produto de 500 pb de tamanho (1). PM é o peso molecular de 100pb (Invitrogen). (B) PCR
genômico. (1) Amplificação de um produto de 600 pb.
Conforme descrito acima, esses produtos foram seqüenciados e podemos
alinhar essas duas seqüências e excluir a hipótese de artefato de
PM
1
600pb
B
A
500pb
__________________________________________________________ Resultados
72
sequenciamento, visto que a região do cDNA que tem identidade com a proteína,
se alinhou perfeitamente com a sequencia genômica , sem interrupções ou falhas,
exceto àquelas regiões interrompidas por íntrons (Figura 24). Desta forma, este
critério assegura que as interrupções dentro da seqüência de cDNA não
correspondem a interrupções na seqüência genômica. Portanto através dos
resultados de RT-PCR e PCR genômico, podemos sugerir que se trata mesmo, de
um gene presente no genoma do parasita que não possui código aberto de leitura,
o que por definição pode se tratar de um pseudogene, que contém 1 íntron retido
conforme mostrado na Figura 24.
ΨUbc9cDNA GCTTTTTACCCGACTGTCGTATTCTCCTTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCNTCAG 60
ΨUbc9gen --------------TGTCGTATTCTT-TTCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAG 45
*********** **************************** ****
ψUbc9cDNA CTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTGATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAAT-- 118
ΨUbc9gen CTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTGATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAAT
CT 105
**********************************************************
ψUbc9cDNA ---------------------------------TTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCA 145
ΨUbc9gen TATAGCATGTTAAAAAGGAGTTTCTTTAGATAC
TTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCA 165
***************************
ψUbc9cDNA ATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATG 205
ΨUbc9gen ATGTTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATG 225
************************************************************
ΨUbc9cDNA GAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTA 265
ΨUbc9gen GAATAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTA 285
************************************************************
ΨUbc9cDNA CATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGT------------------------ 301
ΨUbc9gen CATTCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAAT
GTCTAAATAGCTTTAAAAAGAGTATA 345
************************************
Figura 24: Alinhamento do
ψ
SmUbc9 cDNA em relação a seqüência genômica desse
pseudogene. As seqüências foram alinhadas utilizando ClustalW presente no site
www.ebi.ac.uk. A seqüência genômica possui íntrons, e também possui as seqüências de
junção de splicing não-canônico AT...AC (sublinhadas na Figura), que caracterizam um
splicing de mRNA eucariótico.
__________________________________________________________ Resultados
73
4.10 – Determinação do número de cópias dos genes SmUbc9 e ψSmUbc9
em S. mansoni
Outra questão que nos chamou atenção foi à origem do pseudogene, se ele
foi um resultado de retroposição, ou se derivava de uma duplicação gênica.
Alguns estudos que correlacionam a origem de pseudogenes por retroposição,
afirmam que esses pseudogenes, devem possuir uma cauda de poliadenilação,
não possuírem íntrons e possuírem uma ORF truncada. Através do
sequenciamento, verificamos que a seqüência genômica do gene ψSmUbc9 é
interrompida por um íntron e pelo menos nos nossos resultados de
sequenciamento, visto que a seqüência pode não estar completa, não verificamos
a presença de cauda de poliA (Figura 24). Para avaliar se esse gene poderia ser
resultado de uma duplicação gênica, avaliamos por Southern Blot o número de
cópias desse gene, comparado com o gene estrutural de Ubc9.
Para realizarmos o Southern Blot, digerimos o DNA genômico o parasita com
enzimas de restrição. O gene estrutural SmUbc9 foi digerido com quatro enzimas de
restrição KpnI (para a qual existe um sítio interno no gene de Ubc9), EcoRI, XhoI e
HindIII tranferimos para a membrana de Nylon (HybondN+) e utilizamos o gene
SmUbc9 como sonda (Figura 25). Para o pseudogene ψSmUbc9, realizamos a
digestão com cinco enzimas de restrição, ou seja, Sau3A (a qual existe sítio interno
no gene ψUbc9), EcoRI, SalI, BamHI e XhoI e hibridizamos usando o produto de
PCR ψSmUbc9 genômico como sonda (Figura 26). Os resultados da hibridização
indicaram que existe, apenas uma cópia por genoma haplóide de ambos os genes,
indicando que pode ter ocorrido uma duplicação do DNA genômico, ocorrendo a
__________________________________________________________ Resultados
74
formação de dois genes distintos: um estrutural e funcional e um outro pseudogene, e
até o momento sem função conhecida.
Figura 25: Southern Blot
utilizando como sonda o gene
SmUbc9. O DNA genômico do
parasita foi digerido com quatro
enzimas de restrição: (1) EcoRI, (2)
XhoI, (3) HindIII e (4) KpnI. As setas
indicam o tamanho das bandas
resultantes da hibridização do DNA
genômico com o cDNA de SmUbc9.
20,6 Kb
21,2 Kb
EcoRI
XhoI
HindII
KpnI
Figura 26: Southern Blot utilizando
como sonda o pseudogene
ψ
SmUbc9. O
DNA genômico do parasita S. mansoni, foi
digerido com cinco enzimas de restrição:
Sau3A, EcoRI, SalI,BamHI e XhoI. As
setas indicam os tamanhos das bandas
resultantes da hibridização do DNA
genômico.
Sau3A
SalII
BamHI
XhoI
EcoRI
23Kb
__________________________________________________________ Resultados
75
4.11 – Expressão do ψSmUbc9 nos estágios de desenvolvimento do parasita
Foi de nosso interesse também, investigar se esse pseudogene
apresentava expressão no ciclo de vida do parasita. Para isso extraímos RNA total
de vermes adultos, cercária e de ovos. O resultado de RT-PCR indicou que esse
pseudogene se encontra expresso apenas nas formas adultas do parasita, como
está indicado na Figura 27.
PM 1
2
3 C
500 pb
Tubulina
Figura 27: Expressão do pseudogene
ψ
SmUbc9 no desenvolvimento do
parasita. A expressão desse mRNA foi
avaliado nos estágios de (1) Vermes
adultos, (2) Cercárias, (3) Ovos. Cerca de
1,0ug de RNA cada estágio foram
utilizados para a síntese da primeira fita de
cDNA. A expressão do gene foi avaliada
em gel de agarose 1,0 % e corada com
brometo de etídeo (Invitrogen).
__________________________________________________________ Resultados
76
SUMO E3 Ligases
__________________________________________________________ Resultados
77
4.12. Anotação das enzimas E3 ligases e das proteases específicas de SUMO
De acordo com a Tabela 04, os genes do parasita S. mansoni estão
anotados nos bancos de dados seqüências que codificam para SUMO E3 ligases
do tipo PIAS e RanBP2, e também que codificam para proteases específicas de
SUMO. Em relação às seqüências que codificam para a E3 ligase do tipo PIAS, os
grupos de seqüências foram montados com seqüências oriundas dos estágios de
esporocistos, esquistossômulos e ovos. Para a protease específica de SUMO, os
grupos de seqüências foram montados com seqüências provenientes de adultos,
esporocistos, ovos, miracídios e esquistossômulos. Para RanBP2, as seqüências
foram montadas com seqüências vindas dos seis estágios avaliados.
Diante da possibilidade de uma eventual expressão diferencial estágio-
específica de SUMO E3 ligase e protease específica de SUMO, foram idealizados
oligonucleotídeos específicos, para avaliar a possível regulação estágio-
específica desses genes durante o desenvolvimento do parasita.
Os cDNAs obtidos através do RT-PCR foram seqüenciados e as
seqüências foram submetidas aos bancos de dados utilizando os algoritmos
Blastn para nucleotídeos e Blastx para proteína, em busca de homologia com as
seqüências depositadas. Os domínios conservados também foram avaliados
utilizando pfam que está presente em www.expasy .org.
__________________________________________________________ Resultados
78
4.13. Caracterização da seqüência da proteína predita da enzima E3 ligase
SIZ-PIAS em S. mansoni
Através da busca de homologias com o domínio MIZ-zinc finger, nos
bancos de dados do parasita S. mansoni, encontramos algumas seqüências que
possuíam o domínio SAP (Tabela 4). Dessas seqüências de DNA apenas duas
apresentavam os domínios SAP e MIZ-Zinc finger. Foi escolhida para posterior
análise àquela que apresentava homologia com a proteína predita PIAS1, a qual
apresenta atividade de SUMO E3-ligase descrita em outros organismos.
O domínio Miz Zinc finger tem atividade ligase para a conjugação de SUMO
aos substratos alvo e está envolvido no reparo do DNA e na organização
cromossomal. A proteína Miz1(Msx interacting zinc finger) contém um motivo dedo
de zinco e tem atividade especifica em ligação ao DNA, agindo como fator de
transcrição que modula positivamente a expressão gênica. Assim, Miz1 se liga à
proteína Msx2, acentuando a habilidade de se ligar ao DNA (Hochstrasser 2001).
Desta forma foram desenhados oligonucleotídeos específicos (Tabela 2),
que amplificavam a região de domínio Zf-Miz (Figura 29 A). O cDNA de
aproximadamente 400 pb foi seqüenciado (Figura 28) e a seqüência foi traduzida
utilizando o programa ORF finder, e foi sujeita a análise utilizando os algoritmos
Blast x e Blast p e pfam para busca de homologia com outras seqüências
depositadas nos bancos de dados.
__________________________________________________________ Resultados
79
Figura 28: cDNA codificando para PIAS em vermes adultos. O cDNA apresenta um
tamanho de 400pb. Gel de agarose 1,2% corado com Brometo de etideo (Invitrogen).
Peso molecular de 100 pb (invitrogen).
De acordo com o alinhamento mostrado na Figura 29 A e B, podemos notar
que a PIAS de S. mansoni, apresenta grande similaridade com o motivo SP-RING
presente nas outras proteínas PIAS de outros organismos. O motivo SP-RING
apresenta uma seqüência consenso SX
2
CX
15
CX
1
HX
2
C/SX
17
CX
2
C faltando duas
cisteínas, quando comparado com o motivo RING clássico, e ainda não está
completamente elucidado se este motivo se dobra em uma estrutura
tridimensional compatível para a ligação de Zn
2+
(Melchior e Pichler, 2004). No
motivo SP-RING também, nota-se a presença do aminoácido triptofano (W)
conservado no meio da seqüência SP-RING e acredita-se que esse aminoácido
seja essencial na função E3 ligase, visto que quando ocorre uma mutação nesse
triptofano, a atividade E3 ligase fica comprometida (Kotaja et al 2002).
PM
PIAS
400 pb
__________________________________________________________ Resultados
80
A
B
Figura 29 – Conservação do domínio RING-finger e Miz em S.
mansoni. (A) Representação esquemática do domínio Zf-Miz da proteína
predita PIAS de S. mansoni. (B) Alinhamento da seqüência conservada
utilizando CLUSTALW e formatado utilizando BOXSHADE. As seqüências
utilizadas para o alinhamento correspondem aos seguintes organismos:
gi|31873097 (Caenorhabditis elegans); gi|21627618 (Drosophila
melanogaster); gi|20138891 (Homo sapiens);
gi|34922831(PIASy)(H.sapiens); gi|27529862 proteína KIAA1224 [Homo
sapiens]; gi|927340 (Saccharomyces cerevisiae); gi|2498628 proteína
NFI1 protein(Saccharomyces cerevisiae); gi|4106659
(Schizosaccharomyces pombe); gi|2104683 (Vicia faba); gi|3979878
(Caenorhabditis elegans). A abreviatura Sm corresponde à seqüência de
Schistosoma mansoni
__________________________________________________________ Resultados
81
Como podemos observar, a seqüência predita de PIAS de S. mansoni,
apresenta o domínio SP-RING bastante conservado, apresentando a estrutura
característica SX
2
CX
15
CX
1
HX
2
C/SX
17
CX
2
C. Na seqüência do parasita, apenas não
se observa a presença do aminoácido triptofano conservado, mas isso também
ocorre nas seqüências de outros organismos, como a levedura S. pombe e o
nematódeo C. elegans, o que sugere, que em invertebrados esse aminoácido
pode não ser tão importante para a função E3 ligase, quanto em eucariotos
superiores.
Utilizando o programa pfam (Apêndice 1) para a análise da seqüência da
proteína predita, podemos sugerir que a seqüência de PIAS de S. mansoni se
trata da proteína PIAS 1, devido a presença do motivo Gu-binding protein,
característico das proteínas do tipo PIAS1.
4.14. Análise da expressão do cDNA que codifica para PIAS1 no ciclo de vida
do parasita
Para analisarmos a expressão do cDNA que codifica para PIAS1 no ciclo de
vida do parasita, o qual denominamos SmPIAS1, desenhamos novos
oligonucleotídeos apropriados à análise por PCR quantitativo em tempo real
(Tabela 3). Esses oligonucleotídeos apresentam a particularidade de
apresentarem um maior conteúdo de GC na porção 3’, e também apresentam um
Tm de 60°C, mais apropriado para a amplificação do transcrito, nas condições dos
ciclos da PCR e também para a análise empregando curvas de dissociação. As
reações da PCR foram realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green qPCR
__________________________________________________________ Resultados
82
SuperMix-UDG ROX (INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A reação
de PCR quantitativo foi conduzida conforme programação contida no aparelho ABI
7500 (Applied Biosystems).
Portanto, a análise da expressão do cDNA de 350pb obtido por qPCR que
codifica para SmPIAS 1 através do desenvolvimento do parasita, aponta para uma
expressão diferencial desse gene (Figura 30). Através do gráfico da Figura 30A,
podemos verificar que esse gene apresenta um pico de expressão em zero hora,
onde a expressão praticamente dobra, em relação ao estágio de cercária.
Posteriormente, ocorre uma diminuição da expressão quase chegando à zero em
72h, quando o parasita se encontra em sua migração da pele para os pulmões.
Por fim, ocorre novamente um aumento de quase cinco vezes na expressão em
relação à cercária, desse transcrito em vermes adultos.
__________________________________________________________ Resultados
83
A
B
Figura 30: Expressão do gene SmPIAS 1 SUMO E3 ligase no desenvolvimento do
parasita. (A) A expressão do mRNA foi avaliado nos estágios de cercárias, esquistossômulos
(0h, 8.5h, 18.5h, 24h, 48h e 72h) e vermes adultos. Como controle endógeno normalizador foi
utilizado o gene da α-tubulina e a análise da expressão gênica relativa foi determinada pelo
método do 2
-∆∆Ct
, onde foi designado como calibrador da curva a expressão relativa à
mensagem correspondente à fase de cercária. Os resultados foram posteriormente
normalizados em relação ao transcrito de menor expressão, para efeito de representação
gráfica. Cerca de 5,0ug de RNA cada estágio foram utilizados para a síntese da primeira fita
de cDNA.(B) A expressão do gene foi confirmada em gel de agarose 1,5 % e corada com
brometo de etídeo (Invitrogen) e (PM) é o peso molecular de 100 pb (Invitrogen)..
Expressao de PIAS
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
120.0
Cercaria E-0h E-8,5h E-18,5h E-24h E-48h E-72h Verme
Adulto
Estagios
Expressao genica relativa
PM
Cercária
0 h
8,5 h
18,5 h
24 h
48 h
72 h
Vermes adultos
Controle negativo
__________________________________________________________ Resultados
84
4.15. Caracterização da seqüência da proteína predita a enzima E3 ligase
RanBP2 em S. mansoni
O domínio ligante de proteína Ran ou Ran-ligante apresenta
aproximadamente 150 resíduos de aminoácidos. A proteína Ran é uma proteína
nuclear do tipo GTPase (Ras-like nuclear small GTPase), a qual regula o
transporte de proteínas, mediado por receptor entre o núcleo e o citoplasma
(Pichler et al 2002). A hidrólise de RanGTP é estimulada por RanGAP e pelo
domínio Ran ligante, o qual também contém as proteínas acessórias RanBP1 e
RanBP2. Essas proteínas acessórias estabilizam a forma ativa e ligada a GTP da
proteína Ran. A importância deste dominio Ran-ligante é de grande extensão no
transporte núcleo-citoplasma visto que este se encontra em múltiplas cópias, em
proteínas do complexo do poro nuclear (Revisado por Johnson, 2004).
Desta forma foram desenhados oligonucleotídeos específicos (Tabela 2),
que amplificavam a região de domínio RanBP2 (Figura 32). O cDNA de
aproximadamente 700 pb foi seqüenciado (Figura 31) e a seqüência foi traduzida
utilizando o programa ORF finder e a seqüência do domínio predito foi sujeita a
análise utilizando os algoritmos Blastx e Blastp e pfam para busca de homologia
com outras seqüências depositadas nos bancos de dados.
PM
700pb
RanBP2
Figura 31: cDNA codificando para
RanBP2 em vermes adultos. O
cDNA apresenta um tamanho de
700pb. Gel de agarose 1,2% corado
com Brometo de etideo (Invitrogen).
Peso molecular de 100 pb
(invitrogen
__________________________________________________________ Resultados
85
RanBP2 é a proteína acessória que participa do transporte de proteínas
através do complexo do poro nuclear funciona também como uma proteína SUMO
E3-ligase. Como se pode observar pela Figura 32 A/B, esta proteína apresenta o
domínio IRM-1 na sua porção N-terminal, que possui o motivo SBM (SUMO
Binding Motif). Este motivo possui uma estrutura composta pelos aminoácidos V-
X-V/I-V/I, ou seja, V é o aminoácido valina e X é qualquer aminoácido. O
aminoácido valina pode ser substituído por isoleucina em alguns casos, sem
prejuízo para a função de ligação do substrato. Na seqüência de RanBP2 do
parasita S. mansoni, como podemos observar através da Figura 32 A/B, está
destacado esse motivo, indicando a importância deste para a função dessa
proteína no parasita.
Conforme podemos observar também através da Figura 32B, seqüência de
S. mansoni apresenta o domínio RanBD, o que pode refletir também na
conservação da função dessa proteína no contexto celular desse parasita. Outra
característica importante que constatamos através da análise da seqüência da
proteína predita, foi a ausência dos domínios HECT e RING, característico de
enzimas do tipo E3 ligases.
__________________________________________________________ Resultados
86
A
B
Figura 32 – Representação do domínio RanBP2 em S. mansoni. (A) Representação esquemática do domínio RanDB da proteína
predita RanBP2 de S. mansoni. (B) Alinhamento da seqüência conservada utilizando CLUSTALW e formatado utilizando
BOXSHADE. Os números de acesso correspondentes às seqüências utilizadas para o alinhamento são: gi|58382388 (Anopheles
gambiae); gi|81868330|(camundongo); gi|45550830 (Drosophila melanogaster); gi|113412935 (Homo sapiens);Sm (S. mansoni).O
domínio V/IxV está destacado em alaranjado.
__________________________________________________________ Resultados
87
4.16. Caracterização da expressão do cDNA que codifica para RanBP2 em S.
mansoni
Em relação à expressão dessa enzima no ciclo de vida do parasita, as
análises da expressão gênica relativa foram feitas como anteriormente descrito no
item 4.14, para o gene que codifica para SmPIAS1. Desta forma, podemos
observar através da Figura 33A, que o transcrito de aproximadamente 380pb, o
qual denominamos SmRanBP2, apresenta uma expressão diferencial, sendo que
o gene começa a ser expresso quando o esquistôssomulo alcança 18.5h de
desenvolvimento, ou seja, depois de quase um dia de cultura. Depois com dois
dias de desenvolvimento, a expressão desse gene aumenta aproximadamente 35
vezes em relação à expressão inicial em 18.5h. Posteriormente quando o verme
alcança 72h, ocorre uma diminuição da expressão, a qual se mantém em níveis
acentuados de diminuição até o estágio de vermes adultos, onde o parasita
alcança a sua completa maturação.
__________________________________________________________ Resultados
88
A
B
α - Tubulina
PM
Cercária
0 h
8,5 h
18,5 h
24 h
48 h
72 h
Vermes adultos
Controle negativo
Expressao de RanBP2
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Cercaria E-0h E-8,5h E-18,5h E-24h E-48h E-72h Verme
Adulto
estagios
expressao genica relativa
Figura 33: Expressão do gene SmRanBP2 SUMO E3 ligase no desenvolvimento
do parasita. (A) A expressão desse mRNA foi avaliado nos estágios de cercárias,
esquistossômulos (0h, 8.5h, 18.5h, 24h, 48h e 72h) e vermes adultos. Como controle
endógeno normalizador foi utilizado o gene da α-tubulina e a análise da expressão
gênica relativa foi determinada pelo método do 2
-∆∆Ct
, onde foi designado como
calibrador da curva a expressão relativa à mensagem correspondente à fase de
esquistossômulos de 18.5h. Posteriormente os resultados de expressão foram
normalizados em relação ao transcrito de menor expressão, para efeito de
apresentação gráfica. Cerca de 5,0ug de RNA cada estágio foram utilizados para a
síntese da primeira fita de cDNA.(B) A expressão do gene foi confirmada em gel de
agarose 1,5 % e corada com brometo de etídeo (Invitrogen) e (PM) é o peso molecular
de 100 pb (Invitrogen).
__________________________________________________________ Resultados
89
Protease específica de SUMO (SUSP)
__________________________________________________________ Resultados
90
4.17. Caracterização da seqüência predita da protease específica de SUMO
(SUSP) ou ULP1 em S. mansoni
Através da pesquisa pelos bancos de dados do parasita S. mansoni, foram
identificados várias seqüências que apresentavam homologia com cDNAs que
codificavam para proteases especificas de SUMO (SUSP ou ULPs). Desta forma
foram idealizados oligonucleotídeos específicos, que amplificaram um transcrito de
aproximadamente 630pb (Figura 34). Este cDNA foi seqüenciado, conforme
descrito em Materiais e Métodos e depois da análise inicial em relação aos bancos
de dados, concluímos se tratar de uma proteína do tipo ULP.
Figura 34: cDNA codificando para ULP1 em vermes adultos. O cDNA apresenta um
tamanho de 630pb. Gel de agarose 1,2% corado com Brometo de etideo (Invitrogen).
Peso molecular de 100 pb (invitrogen).
PM
ULP1
630pb
__________________________________________________________ Resultados
91
O alinhamento da proteína predita de S. mansoni, com as regiões
conservadas de outras proteínas ULPs de outros organismos, mostra que o sítio
catalítico dessa protease está bem conservado neste organismo. Estudos iniciais
utilizando inibidores indicaram que esta proteína é uma cisteíno-protease (Li &
Hochstrasser, 1999). Observando o alinhamento da protease de S. mansoni
(Figura 35B) com as proteases de outros organismos, concluímos que esta
protease também é uma cisteíno protease, visto que apresenta o resíduo de
cisteína, conservado na posição C-terminal da seqüência de proteína. Os outros
aminoácidos do sítio catalítico, ou seja, o aminoácido Histidina (H) e Aspártico (D)
também estão conservados na seqüência protéicas dessa protease de S.
mansoni.
Outra característica relevante sobre a seqüência predita da protease ULP1
é pertencer à classe das peptidades C48, como anteriormente descrito por
Rawlings e Barrett, 2000. Essa classe de proteases, são bastante distintas, em
relação às suas seqüências de aminoácidos as UCHs (Ubiquitin C-terminal
Hydrolases) e também das DUBs (Deubiquitinating Enzymes).
__________________________________________________________ Resultados
92
A
B
Figura 35 – Alinhamento da protease ULP1 em S. mansoni. (A) Representação esquemática do domínio C48 e ULP1 da proteína
predita de S. mansoni. (B) Alinhamento da seqüência conservada utilizando CLUSTALW e formatado utilizando BOXSHADE, os
asterísticos correspondem aos aminoácidos que constituem o sítio catalítico dessa cisteíno-protease. As seqüências utilizadas para o
alinhamento correspondem aos seguintes organismos: gi|731795(Saccharomyces cerevisiae); >gi|19173615 (Encephalitozoon cuniculi);
gi|15214320 ULP2(Schizosaccharomyces pombe); gi|15214321 Ubiquitin-like-specific protease 1 (Schizosaccharomyces pombe);
gi|17380332 Ubiquitin-like-specific protease 1 (Saccharomyces cerevisiae); lcl|query corresponde a seqüência de Schistosoma mansoni.
__________________________________________________________ Resultados
93
4.18. Caracterização da expressão do cDNA codificando para ULP1 no ciclo
de vida do parasita
Em relação à expressão dessa enzima no ciclo de vida do parasita, as
análises da expressão gênica relativa foram feitas como anteriormente descrito no
item 4.14, para o gene SmPIAS1. Em relação à expressão dessa enzima no ciclo
de vida do parasita, podemos observar através da Figura 36A, que o transcrito de
380pb apresenta uma expressão diferencial, onde o início da expressão ocorre em
0h do desenvolvimento. Depois, apresenta um pico de expressão acentuado,
aumentando em cerca de 120 vezes em 8.5h, em relação à expressão inicial
ocorrida em 0h. Posteriormente, ocorre uma nova diminuição em 18.5h e um
discreto aumento, até o segundo dia de desenvolvimento onde ocorreu um
aumento de até 80 vezes em relação à 0h. Em três dias de desenvolvimento,
ocorre uma diminuição da expressão, voltando a aumentar consideravelmente,
quando o verme adulto já se encontra no sistema porta-hepático.
__________________________________________________________ Resultados
94
A
Expressao de ULP1
-
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
120.00
140.00
160.00
Cercaria E-0h E-8,5h E-18,5h E-24h E-48h E-72h Verme
Adulto
estagios
Expressao genica relativa
B
α - Tubulina
PM
Cercária
0 h
8,5 h
18,5 h
24 h
48 h
72 h
Vermes adultos
Controle negativo
Figura 36: Expressão do gene SmULP1 no desenvolvimento do parasita. (A) A
expressão desse mRNA foi avaliado nos estágios de cercárias, esquistossômulos (0h,
8.5h, 18.5h, 24h, 48h e 72h) e vermes adultos. Como controle endógeno foi utilizado o
gene da α-tubulina e a análise da expressão gênica relativa foi determinada pelo
método do 2
-∆∆Ct
, onde foi designado como calibrador da curva, a expressão relativa à
mensagem correspondente à fase de esquistossômulos de 0h. Posteriormente os
resultados foram normalizados em relação ao transcrito de menor expressão, para
efeito de representação gráfica. Cerca de 5,0ug de RNA cada estágio foram utilizados
para a síntese da primeira fita de cDNA.(B) A expressão do gene foi confirmada em gel
de agarose 1,5 % e corada com brometo de etídeo (Invitrogen) e (PM) é o peso
molecular de 100 pb (Invitrogen).
5. Discussão
___________________________________________________________Discussão
96
5.1 SUMO
Modificações pós-traducionais de proteínas são rápidas, e alteram a função
das proteínas reversivelmente, com custo baixo de energia (Johnson 2004). As
modificações pós-traducionais que podem ocorrer na célula podem ser do tipo
acetilação, fosforilação, glicosilação, ubiquitinação e sumorilação. A ubiquitinação
modifica os seus substratos celulares, e dependendo do resíduo de lisina
modificado, direciona o alvo para a degradação protéica dependente do
proteassoma 26S. A modificação dos substratos por SUMO, em contraste à
ubiquitinação não direciona os substratos modificados à proteólise, ao contrário
disso, estabiliza a meia vida das proteínas (Melchior, 2000).
A sumorilação assim como a ubiquitinação, requer algumas proteínas
acessórias necessárias para o processamento de precursores de SUMO, pois esta
é traduzida em sua forma inativa necessitando de uma clivagem enzimática para a
maturação de SUMO. As enzimas E1, E2 e E3 são responsáveis pela cascata
bioquímica dependente de ATP levando à conjugação dos substratos alvo. Por fim
as proteases dependentes de SUMO são responsáveis pela desconjugação de
SUMO e a liberação de SUMO livre no meio celular (Seeler and Dejean, 2003).
A SUMO é uma proteína bastante conservada entre a evolução das
espécies. Os membros da família SUMO, estão presentes em organismos
protozoários, metazoários, plantas e leveduras. As análises de ESTs em bancos
de dados de genomas indicam a presença de pelo menos um membro da família
SUMO em Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea, Disctyostelium discoideum e
Candida albicans. O primeiro relato da presença de SUMO, a qual foi denominada
___________________________________________________________Discussão
97
SMT3 foi em S. cerevisiae, em experimentos envolvendo o gene MIF2. Esse gene
quando sofre mutação, compromete a viabilidade da levedura (Meluh e Koshland,
1995; Johnson et al, 1997). Em C. elegans também foi descrito um gene que
codifica para SUMO 1 (Choudhury e Li, 1997).
Em metazoários as proteínas do tipo SUMO podem ser divididas em duas
famílias: uma família que compreende a proteína SUMO-1, e a outra família que
engloba os membros da família SUMO 2/3 (Saitoh e Hinchey, 2000). Atualmente
já se tem caracterizado uma nova proteína chamada SUMO4, que participa de
processos relacionados a doenças autoimunes (Pearce e Merriman, 2006).
Durante os últimos anos, os processos de modificação pós-traducional de
proteínas dependente de ubiquitina e de vias ubiquitina-símile, vêm sendo
extensivamente estudado, no nosso laboratório. A primeira evidência da existência
de SUMO em S. mansoni, vem de experimentos de western blot, utilizando
anticorpo anti-ubiquitina, onde a presença de várias bandas poderia indicar uma
reação cruzada com SUMO. Mas, o primeiro relato definitivo, aconteceu com o
sequenciamento de um cDNA codificando para SUMO, posteriormente
denominado SmSMT3B neste parasita, onde ocorre a sumorilação sem efeito
proteolítico (Cabral FJ, Dissertação de Mestrado, 2002). Estes resultados em
conjunto com o sequenciamento do transcriptoma vieram alterar o panorama
sobre o conhecimento existente sobre essa via de modificação pós-traducional no
parasita S. mansoni.
Devido à via de sumorilação ser muito conservada durante a evolução das
espécies, e apresentar funções importantes na célula, neste estudo através de
seqüências depositadas nos bancos de dados de genoma do S. mansoni, foi
___________________________________________________________Discussão
98
permitido caracterizar os componentes do sistema de sumorilação, tanto in silico,
quanto utilizando técnicas de biologia molecular. Os resultados in silico
apresentados na Tabela 04, listam os 20 componentes da via de sumorilação
seqüenciados pelo consórcio do transcriptoma, correspondente a 0.15% do total
de genes expressos pelo parasita S. mansoni. A família de proteínas SUMO,
apresenta uma nomenclatura passível de muita confusão. Este nome foi atribuído,
de acordo com a nomenclatura proposta por Saitoh (2004), o qual propõe que
SUMO 1, SUMO2 e SUMO3, são denominadas SMT3C, SMT3B e SMT3A,
respectivamente
A partir da entrada SmAE601278, depositada no banco de dados do Projeto
Transcriptoma do S. mansoni, foram idealizados oligonucleotídeos específicos
para validarmos os resultados obtidos in silico, bem como determinar a sua
estrutura genômica, através de PCR e Southern Blot. Na Figura 7, mostramos o
resultado do RT-PCR para o gene que codifica para SMT3C em S. mansoni. Na
Figura, mostramos o resultado de amplificação de uma banda de 270 pb,
correspondente ao gene, que então passamos a denominar de SmSMT3C (S.
mansoni SMT3C).
Desta forma, o gene SmSMT3C foi clonado e seqüenciado e a seqüência
foi analisada nos bancos de dados, utilizando BLASTx e BLASTn, ou seja, nos
bancos correspondentes a proteínas e nucleotídeos respectivamente. Através da
análise da seqüência de aminoácidos podemos concluir que a proteína SmSMT3
apresenta os seus domínios relacionados à sua função, bem conservados.
O resultado da análise da seqüência primária de aminoácidos (Figura 8)
mostrou que o gene SmSMT3C codifica para uma proteína de 90 aminoácidos,
___________________________________________________________Discussão
99
que apresenta um duplo resíduo de glicina na porção C-terminal responsável pela
conjugação dessa proteína aos seus alvos, e também verificamos que esta
proteína predita apresenta uma extensão N-terminal flexível, a qual se mostra
ausente, quando comparada com a proteína ubiquitina (Apêndice). Até o
momento, não se sabe ao certo, a função dessa extensão N-terminal, mas
acredita-se que esta extensão possa ser uma boa candidata a interações proteína-
proteína (Melchior, 2000).
Ainda, em relação à seqüência de aminoácido, nota-se a presença de uma
leucina, após o motivo Gli-Gli, na porção C-terminal SmSMT3C predita. Como
acontece em outros organismos (Johnson 2004), este aminoácido pode ser
presumivelmente removido pelas proteases específicas de SUMO, para gerar
SUMO em sua forma madura, para que ocorra a cascata bioquímica de
conjugação.
Através da análise filogenética, podemos sugerir que SmSMT3C é bem
conservada em relação aos outros organismos, e que se encontra próxima à
seqüência de S. japonicum, e também próxima de eucariotos superiores, desta
forma podemos sugerir que a SmSMT3C, em S. mansoni pode estar envolvida
nos mesmos processos biológicos, como os descritos para outros modelos
experimentais.
A primeira função descrita para SUMO, por Mahajan e colaboradores está
relacionada ao tráfego de proteínas do citoplasma para o núcleo. Nesse estudo,
estabeleceu-se que SUMO pode modificar a proteína RanGAP1 no complexo do
poro nuclear e desta forma internalizar essa proteína no núcleo (Melchior 2000).
De acordo com o modelo estabelecido para o transporte de proteínas entre o
___________________________________________________________Discussão
100
núcleo e o citoplasma, é sugerido que Ubc9 conjuga SUMO, ainda na parte
citoplasmática do complexo do poro nuclear, e desta forma internalizando as
proteínas que estão sumoriladas (revisado por Seeler e Dejean, 2003). Desta
forma, além da importância da modificação por SUMO no núcleo, esta modificação
apresenta a sua importância na face citoplasmática da célula.
Diversos relatos apontam para a importância da sumorilação no núcleo,
através das HDACs, levando a repressão da expressão gênica através da
modificação das histonas (revisado por Gill, 2005). Também estudos de
imunoflorescência, relacionados com o fator de transcrição nuclear Sp3, indicam
que a forma reprimida de Sp3, ou seja, modificada por SUMO, se localiza na
periferia nuclear (Di Bacco, 2004).
A estrutura genômica para o gene SmSMT3C foi caracterizada, através da
PCR do DNA genômico utilizando os oligonucleotídeos específicos cobrindo a
ORF inteira, permitindo a determinação da organização éxon-íntron do gene.
Desta forma, o alinhamento da seqüência de cDNA versus a seqüência genômica
(Figura 10C), mostrou que a seqüência genômica do gene SmSMT3C é
interrompida por dois íntrons pequenos de tamanhos 28 e 36pb respectivamente e
apresenta pelo menos uma cópia por genoma haplóide (Figura 11).
Os íntrons possuem a seqüência consenso de processamento do mRNA
eucariótico, GT...AG dependente do spliceosoma U2, encontrado em todos os
eucariotos (Will & Luhrmann, 2005). Enquanto que a maquinaria de
processamento exige uma seqüência mínima de 50pb (Wieringa et al 1984;
Thompson e Domdey, 1987), os genes de S. mansoni apresentam introns
menores, do que àqueles requeridos pela maquinaria anteriormente descrita.
___________________________________________________________Discussão
101
Estes íntrons pequenos são característicos de S. mansoni, tais como ao
anteriormente descrito para o gene que codifica para GAPDH (Charrier-Ferrara et
al 1992), glutationa peroxidase (Mei e LoVerde, 1995), Sm23 (Lee et al 1995) e
RhoI (Vermeire et al 2003). Apesar de possuir as seqüências consenso de
processamento do mRNA, ainda, o mecanismo pelo qual a maquinaria U2 retira
esses pequenos íntrons, ainda permanece a ser elucidado.
O número de cópias por genoma haplóide do gene SmSMT3C, também foi
investigado, utilizando a técnica de Southern Blot. A Figura 11 mostra a presença
de duas cópias por genoma haplóide. Diversos genes de múltiplas cópias por
genoma têm sido investigados em vários organismos. Em Arabidopsis, vários
genes que codificam para SUMO, ou seja, SUMO 1 a 8 foram determinados.
Esses genes codificam para várias isoformas de SUMO, algumas relacionadas ao
controle do mecanismo de estresse osmótico, oxidativo e/ou térmico. Outros
genes foram denominados como pseudogenes, pela sua incapacidade de codificar
uma proteína funcional (Vierstra et al 2003).
Em relação à expressão do gene que codifica para SmSMT3C no ciclo de
vida do parasita (Figura 12), podemos concluir através do RT-PCR, que este gene
é expresso de forma constitutiva durante o desenvolvimento do parasita. Durante
o desenvolvimento de C. elegans, a modificação pós-traducional dependente de
SUMO, exerce um papel importante relacionado à modificação das histonas, e
também via modificação de fatores de transcrição levando a repressão
transcricional.
Diversos relatos em S. mansoni apontam para a importância dos fatores de
transcrição para o desenvolvimento, crescimento e diferenciação do parasita.
___________________________________________________________Discussão
102
Durante o desenvolvimento dos metazoários, o controle da expressão gênica
implica na coordenação precisa entre a ativação e a repressão de conjuntos de
genes. Esses mecanismos envolvem numerosos fatores de transcrição que se
ligam ao DNA, como por exemplo, a família dos receptores nucleares (Robinson-
Rechavi et al 2003). Os receptores nucleares regulam a expressão gênica se
ligando aos seus elementos de resposta correspondentes e recrutando proteínas
associadas, desta forma ativando ou reprimindo a expressão gênica (Kumar et al
2004).
A subfamília dos receptores nucleares órfãos fushi tarazu (FTZ),
desempenha papéis importantes no desenvolvimento e na diferenciação sexual
dos vertebrados e invertebrados, sendo também detectado em S. mansoni, onde
se observou, que enquanto os níveis do mRNA permaneciam praticamente
constantes quando comparado com os estágios larvais e adulto, a proteína era
mais abundante em adultos do que em miracídios, sugerindo uma regulação ao
nível traducional (de Mendonça et al 2002).
Outra característica importante relacionada à função desse receptor está
relacionada à ligação da proteína ao elemento de resposta monomérico SF1, o
que sugere que essa interação em Schistosoma está relacionada com a regulação
da transcrição durante o desenvolvimento, assim como ocorre, nos outros
metazoários (de Mendonça et al 2002). É visto também que SmFTZ interage com
o homólogo de RXR (Receptor X Retinoic), potencializando a atividade
transcricional de SmFTZ (Bertin, 2005). Relatos anteriores indicam que a via de
sumorilação modifica RXRα (Wu et al, 2004). Em S. mansoni, o mRNA desse
receptor esta presente em todas as fases do ciclo, porém apresenta elevados
___________________________________________________________Discussão
103
níveis em fases de miracídio e cercária, quando comparado com verme adulto. Em
contraste, a proteína apresenta um alto nível de expressão na fase de
esquistôssomulo, mesmo apresentando seqüências PEST, que usualmente
determina à meia vida curta das proteínas (de Mendonça et al 2000). Devido ao
fato de SUMO prolongar a meia vida dos seus substratos alvo, neste caso, a meia
vida do receptor pode ser prolongada para desempenhar suas funções na
diferenciação e desenvolvimento do verme jovem para o verme maduro.
Ainda em relação ao controle da expressão gênica, o S. mansoni,
apresenta as proteínas do tipo CBP (Creb binding protein) e p300 que são
coativadores transcricionais com atividade de histona acetilase, que modifica a
cromatina, levando esta ao seu estado relaxado (Bertin et al 2006). Até o
momento, sumorilação dessas proteínas está relacionada à atividade de reparo do
DNA (Mohan et al 2006).
Desta forma, através dos resultados de expressão dos transcritos de SUMO
no ciclo de vida do parasita S. mansoni, podemos especular que a via de
sumorilação pode estar atuando, no sentido de regular o desenvolvimento desse
parasita, através do seu papel no controle da expressão gênica (Verger, 2003).
Através de experimentos utilizando o anticorpo anti-SUMO-1 humana,
podemos verificar que a via de sumorilação está funcionalmente ativa no parasita
(Figura 14B). O anticorpo anti-SUMO-1 humano foi utilizado, devido à
conservação da seqüência de S. mansoni relacionado à proteína humana (Figura
8). De uma forma semelhante, na Figura 14B podemos verificar que o perfil de
sumorilação em vermes adultos é maior em proteínas nucleares do que em
citoplasmáticas. Além disso o perfil de conjugados sumorilados em cercárias
___________________________________________________________Discussão
104
também se mostrou bastante evidente. Esses resultados analisados em conjunto
com os níveis de expressão do mRNA (Figura 12) sugerem, que SUMO pode
participar de mecanismos moleculares relacionados ao desenvolvimento durante a
transição de cercária para verme adulto. Futuros experimentos para analisar a
transição miracídio-cercária poderão dar novas pistas sobre os mecanismos
moleculares que o parasita utiliza na transição de vida livre aquática, para o
interior do hospedeiro invertebrado.
5.2. Ubc9
A enzima E2 conjugadora de SUMO, denominada de Ubc9, pertence à
família UBC (Ub-conjugating enzyme catalytic), e apresenta um domínio catalítico
específico para a conjugação de SUMO aos seus numerosos substratos (Johnson,
2004). Além disso, diversos relatos mostram que sistemas biológicos cujo gene
Ubc9 é silenciado ocorre uma interrupção do ciclo celular o que reforça a hipótese
da sumorilação de proteínas específicas para a viabilidade celular (Seufert et al
1995; Schwarz, 1998).
No nosso estudo foi demonstrada a presença de dois genes que codificam
para Ubc9 em S. mansoni. Esses dois genes foram identificados a partir de
análises in silico dos bancos de seqüência de DNA disponíveis para este parasita
(Tabela 4). Como descrito em Resultados, S. mansoni apresenta um gene
estrutural o qual foi denominado SmUbc9 e outro pseudogene, o qual foi chamado
ψ
SmUbc9.
___________________________________________________________Discussão
105
O gene estrutural foi clonado, seqüenciado e de acordo com a análise da
seqüência podemos afirmar que esse gene codifica para uma proteína de 130
aminoácidos, que apresenta o aminoácido Cisteína 93, conservado e posicionado,
para a catálise da formação da ligação tiól-ester, responsável pela conjugação de
SUMO aos seus substratos alvo. O alinhamento da proteína predita de S. mansoni
(Figura 16) e a análise filogenética (Figura 17) mostraram que esta proteína é bem
conservada entre os outros organismos. Na árvore filogenética também podemos
constatar que esta proteína está bastante próxima evolutivamente do parasita S.
japonicum e de outros vermes, como C. elegans e também dos eucariotos
superiores como H. sapiens.
A estrutura genômica do SmUbc9 utilizando alinhamento do fragmento
genômico versus o cDNA foi determinada (Figura 18), e concluímos que SmUbc9
é interrompido por dois pequenos íntrons de 37 e 35pb respectivamente. A análise
da região flanqueadora desses íntrons evidencia a presença de sítios de splicing
não canônicos AT...AC (Figura 18C). A maioria dos íntrons nas células
eucarióticas são removidos pelo spliceosoma dependente da enzima U2. A
remoção dos íntrons desse tipo raro de splicing, que apresentam a seqüência
AT...AC, ocorre através da atividade de enzima U12, através de um mecanismo
idêntico ao anteriormente descrito para os íntrons dependente de U2 (Tarn &
Steitz, 1997).
A presença de dois spliceosomas distintos em alguns eucariotos, dentre
eles o parasita S. mansoni, leva à abertura de questões intrigantes, relacionadas à
origem e evolução desses mecanismos de remoção de íntrons (Will & Luhrmann,
2005; Tarn & Steitz, 1997). O íntrons dependentes de U12, já foram identificados
___________________________________________________________Discussão
106
em plantas e animais, indicando que os spliceosomas dependentes de U2 e U12,
coexistem nas células a bilhões de anos (Will & Luhrmann, 2005). O gene
prospero conhecido pela sua importância no desenvolvimento do sistema neural
de Drosophila, também apresenta AT-AC íntrons (Yuh & Steitz, 1997). Acredita-se
que esses íntrons que possuem a seqüência AT...AC dependente de U12, sejam
fósseis moleculares, por isso se tornaram raros atualmente, e os que existiram no
passado foram gradualmente se convertendo em íntrons do tipo U2 (Burge et al
1998,Will & Luhrmann 2005). Os genes que possuem esses íntrons possuem
importantes funções no desenvolvimento e regulação de vias importantes nos
metazoários (Tarn & Steitz, 1997). Também gostaríamos de ressaltar a anotação
de várias seqüências relacionadas à montagem de spliceosomas funcionais no
banco de dados do genoma do S. mansoni. Dentre elas destacamos a 612184 e
612353, supostamente codificadoras de snRNAs similares aos encontrados nos
spliceosomas encontrados na regra não-canônica AT-AC.
O gene que codifica para SmUbc9 é expresso em todas as fases do ciclo
de vida do parasita (Figura 19), e experimentos de Northern Blot indicam que o
parasita apresenta apenas um transcrito expresso de tamanho 1,32Kb (Figura 20).
Resultados de expressão do mRNA humano, também indicou que o gene HsUbc9
é expresso em vários tecidos humanos e apresenta um tamanho de 1,3Kb e está
envolvido em processos de divisão celular (Kovalenko et al 1995). Desta forma
podemos especular sobre a importância desse gene na diferenciação e
viabilidade, pois se sabe que a proteína Ubc9 é importante para a progressão do
ciclo celular da fase G2 para M, em leveduras. A mutação desse gene causa a
___________________________________________________________Discussão
107
acumulação de células mal formadas, possuindo um apenas um núcleo (Seufert,
1995).
Apesar de apresentar uma estrutura similar a outras enzimas da famíla E2,
que atuam na via de ubiquitina (Chen 2004), até o momento Ubc9 é a enzima
conjugadora de SUMO para todos os exemplos estudados. Em S. mansoni, a
proteína Ubc9 é expressa tanto no citoplasma quanto no núcleo, conforme
evidenciado pela banda de 20kDa, obtida utilizando anticorpo anti-Ubc9 e em
fração de proteínas nucleares e citoplasmáticas (Figura 21).
Além de um gene estrutural também detectamos um pseudogene, o qual
passará a ser discutido nos parágrafos seguintes.
Para certificarmos que o possível pseudogene ψSmUbc9, não se tratava de
um artefato de sequenciamento, recuperamos a seqüência do banco de dados,
que está depositada no banco do Transcriptoma do S. mansoni sob o número
610543 (ou TC19135 – entrada depositada pelo projeto genoma do TIGR), e
desenhamos oligonucleotídeos específicos, que amplificou um produto por RT-
PCR de 500pb (Figura 23 A). O PCR genômico revelou um produto de 600pb
(Figura 23B). Esses dois produtos de PCR foram seqüenciados, alinhados e
utilizando ClustalW podemos verificar a presença de íntrons na seqüência
genômica do pseudogene (Figura 24).
Pseudogenes são definidos como cópias de genes que não são capazes de
produzir uma proteína funcional. Esses genes apresentam interrupções em sua
região codificadora causadas por mudanças na posição do ATG inicial
(frameshifts) e/ou códigos de parada prematuros (Harrison et al 2003). Os
pseudogenes podem ser classificados como pseudogenes processados, ou seja,
___________________________________________________________Discussão
108
aqueles que são originados de transcrição reversa de um mRNA, ou pseudogenes
duplicados, ou seja, aqueles que surgiram da duplicação do DNA genômico e a
posterior disabilitação (Zhang .et al 2004).
No genoma humano foram identificados aproximadamente 8.000
pseudogenes processados, localizados em regiões pobres em GC (Zhang et al
2003). Os pseudogenes processados se caracterizam por (i) não possuírem
íntrons, (ii) apresentam sítios de poliadenilação e (iii) representam a seqüência
completa do cDNA do gene funcional e não apresentam seqüências promotoras
(Tsytsykova, et al 1998). Os grandes grupos de pseudogenes identificados no
genoma humano compreendem as proteínas ribossomais, seguido dos
pseudogenes dos receptores olfatórios (Zhang et al 2003).
Através da análise in silico do genoma murino também foram identificados
aproximadamente 5000 pseudogenes, sendo que estes pseudogenes tendem a
ser representados por proteínas ribossomais e genes de manutenção. Os
pseudogenes são denominados de “fósseis moleculares”, devido a sua
importância na genômica evolutiva e comparativa (Zhang et al 2004).
Em Drosophila também foram feitos estudos na tentativa de se identificar
possíveis pseudogenes. No estudo feito por Harrison e colaboradores (2003)
foram identificados 110 pseudogenes sendo que desses, 19 eram processados,
outros 34 não tinham evidencia de serem processados e 6 poderiam ter surgido de
duplicação gênica.
Em S. mansoni ainda não se tem um estudo completo utilizando bancos de
dados listando os possíveis pseudogenes. O único relato existente até o momento
trata-se do gene SGTP2 relacionado com o transporte de glicose. O pseudogene
___________________________________________________________Discussão
109
SGTP2 contém um íntron mal processado, apresenta mutações no código aberto
de leitura e, portanto não codifica uma proteína funcional. Os resultados de
expressão deste pseudogene, utilizando Northern Blot mostraram que este gene
apresenta uma expressão diferencial durante o desenvolvimento do parasita,
sendo apenas expresso em fêmeas adultas (Skelly et al 1994). Devido ao parasita
possuir um baixo conteúdo de GC (Johnston 1999), muitos outros pseudogenes
podem estar contidos no genoma do parasita, esperando para serem descobertos.
De acordo com os experimentos de Southern blot foi constatado que no
genoma de S. mansoni, o gene
ψ
SmUbc9 possui apenas uma cópia (Figura 25).
Sendo que esse gene não possui nenhuma das características citadas acima
como sendo um pseudogene processado, os nossos resultados sugerem que
ψ
SmUbc9 pode ser um pseudogene resultante de uma duplicação gênica.
Pseudogenes duplicados surgem da duplicação do DNA genônico ou mesmo de
um erro durante o processo de crossing over, durante a divisão celular. Desta
forma os pseudogenes duplicados conservam a estrutura éxon-íntron dos genes
funcionais, embora muitas vezes incompletas, o que determina o silenciamento
desses genes (Zhang et al 2003).
No genoma de camundongos, foi relatada a presença de quatro cópias para
o gene Ubc9, sendo que três dessas são pseudogenes não-processados. O gene
estrutural apresenta uma estrutura contendo sete éxons, codifica para uma Ubc9
funcional. Os pseudogenes ψUbc9 1 e ψUbc9 2, apresentam um código de leitura
aberto, mas codificam uma proteína incapaz de se ligar ao seu substrato alvo. O
___________________________________________________________Discussão
110
pseudogene ψUbc9 3, apresenta vários códigos de parada em sua seqüência,
desta forma não codifica para uma proteína ( Tsytsykova et al 1998).
O gene
ψ
SmUbc9 em S. mansoni é expresso apenas nos vermes adultos,
conforme mostrado na Figura 27. Estudos recentes relacionam os ncRNAs (non-
coding RNAs), como um mecanismo para aumentar a complexidade da regulação
da expressão gênica, e juntamente com o processamento alternativo do RNA
aumentam a variedade e complexidade do transcriptoma. Os resultados também
sugerem que a razão de seqüências de RNA que não codificam para proteína
aumenta com a complexidade do organismo (Mattick e Makunin, 2006). Desta
forma, o parasita S. mansoni por apresentar um ciclo de vida complexo, sendo as
formas larvais mais simples, os nossos resultados sugerem que a presença de
pseudogenes pode ser perfeitamente plausível na forma adulta, se consideramos
a complexidade do verme adulto em relação às formas larvais.
As larvas miracídio e cercária dos trematódeos digenéticos são adaptadas
para uma existência de natação ativa, sem se alimentar. A penetração no
hospedeiro é acompanhada por uma importante reorganização dos tecidos e da
fisiologia do parasita, que pode ser adequadamente descrita como metamorfose.
Parece provável que as condições físicas e químicas, fornecidas por esse
hospedeiro, atuem como desencadeantes desse crescimento. Em Schistosoma, o
início do crescimento está separado do processo de metamorfose (Wilson, 1979).
Assim, apesar de ainda não estar elucidado os mecanismos do estímulo, pelo qual
isso ocorre, o transcriptoma fornece várias pistas moleculares que podem estar
envolvidas nesse processo (Verjovski et al 2003).
___________________________________________________________Discussão
111
Diante dessas evidências os ncRNAs, assim como os pseudogenes podem
estar relacionados, exercendo um papel de regulação da expressão gênica na
diferenciação, como por exemplo, em embriões de Drosophila, onde o bxd ncRNA,
reprime a transcrição gênica da proteína ubx, através de um mecanismo de
elongação dos ncRNA do tipo bxd (Petruk et al 2006).
A modulação da estabilidade do mRNA consiste num método bastante
eficiente de controle da expressão gênica durante o crescimento celular e
diferenciação, bem como outras transições fisiológicas (Jacobson et al, 1996;
Ross, 1995). Os pseudogenes processados participam desse processo,
protegendo o mRNA codificante da possível degradação (Hirotsume et al 2003).
Os mecanismos pelo quais os pseudogenes não processados exercem os seus
papéis na célula, ainda permanecem a serem elucidados.
5.3. SUMO E3 ligases
5.3.1. Siz-PIAS
De acordo com as análises in silico e a caracterização molecular realizada
até o momento pode-se constatar que o S. mansoni apresenta a maquinaria
indispensável para a sumorilação dos substratos alvo. Desta forma, também
procedemos à análise das moléculas que são capazes de atuar como SUMO E3
ligases.
De acordo com a Figura 29, podemos verificar que o S. mansoni possui o
domínio SP-RING, bastante conservado em relação aos outros organismos. O
___________________________________________________________Discussão
112
domínio RING foi primeiramente descrito como sendo responsável pela
dimerização de várias proteínas (Joazeiro e Weissman, 2000). Depois, vários
trabalhos foram publicados, que levaram a conclusão de que o domínio RING
exercia um papel fundamental, mediando à transferência da ubiquitina aos
substratos alvo. De acordo com Hershko e Ciechanover (1998), as ubiquitina E3
ligases são enzimas que se ligam diretamente ou indiretamente aos substratos
protéicos específicos e promove a transferência da ubiquitina, diretamente ou
indiretamente, de um intermediário ligado por ligação tiól-éster para a ligação
amida com as proteínas ou cadeias de poliubiquitina.
Ao contrário dos domínios HECT de ubiquitina, que catalisam diretamente a
ligação isopeptídica, o domínio RING, funciona como um adaptador, e não forma
uma ligação tiól-éster com a ubiquitina (Fang et al 2003; Freemont, 2000;
Hatakeyama e Nakayama; Joazeiro e Weissman, 2000). O domínio RING acentua
a ubiquitinação e contribui para dirigir a especificidade da ligação, embora não se
saiba ainda, se RING funciona como uma simples ponte ou contribui
alostéricamente influenciando a enzima E2 (Jackson e Eldridge, 2002; Lima, 2002;
Pickart, 2001).
As proteínas do tipo Siz-PIAS possuem o domínio RING bastante
conservado e isso levou a interpretação de que essas proteínas podem funcionar
como ligases. Experimentos de duplo-híbrido de levedura levaram a identificação
de Siz-PIAS como interagindo com SUMO, e a semelhança do domínio RING de
PIAS com o domínio das E3 ligases de ubiquitina, levaram a dedução que essas
proteínas podem participar da via de sumorilação (Hochstrasser, 2001). Depois
outros relatos confirmaram que SUMO e PIAS participam da modificação pós-
___________________________________________________________Discussão
113
traducional de fatores de transcrição, reprimindo a transcrição na periferia do
núcleo (Jackson, 2001; Verger, 2003; Gill, 2005).
A família de fatores de transcrição Sp1, Sp2 e Sp3, são proteínas que se
ligam aos promotores do tipo GC-boxes, com grande afinidade e especificidade,
possuindo três motivos dedo de zinco altamente conservados e localizados na
região C-terminal da proteína. O nocaute do gene que codifica para Sp3 em
camundongos levou a defeitos nos ossos e no desenvolvimento dos dentes,
sugerindo um papel importante na diferenciação desses tecidos (Bowman et al
2000; Gollner et al, 2001). Estudos indicam que a sumorilação de Sp3 dependente
de PIAS e Ubc9 leva a regulação da atividade do fator transcricional, e desta
forma reprimindo a expressão gênica (Sapetschnig, 2002; Ross, 2002). Outros
cofatores transcricionais como, por exemplo, o receptor de androgênio (AR), o co-
ativador transcricional GRIP e as HDACs (histonas deacetilases), são todos
modificados por SUMO via proteínas do tipo PIAS (Seeler e Dejean, 2003).
Um dos objetivos desse trabalho foi avaliar a expressão do gene SmPIAS
durante a transição cercária-esquistossômulos-vermes adultos, e para isso
desenvolvemos uma cultura de esquistossômulos recuperadas com quatro horas
após a infecção, a qual denominamos zero hora, depois 8.5h, 18.5h, 24h, 48h, e
72h de cultivo in vitro. Esta fase temporal mimetiza o período correspondente aos
três dias de infecção no hospedeiro mamífero.
De acordo com a Figura 30, a o gene que codifica para a SUMO E3 ligase
SmPIAS1 apresenta uma expressão diferencial durante o desenvolvimento do
parasita. Após a penetração da cercária, o desenvolvimento do esquistôssomulo
pode ser dividido entre a migração da pele até os pulmões e deste para o fígado.
___________________________________________________________Discussão
114
A fase de crescimento se inicia ao final da migração dos pulmões, quando o
parasita recebe estímulos do hospedeiro (Lawson e Wilson, 1980). Outros estudos
ainda indicam que a fase de migração compreende desde o dia zero pós-infecção,
quando o parasita ainda está alojado na pele, chegando ao fígado no oitavo dia
(Crabtree e Wilson 1980). As divisões celulares, também só acontecem quando o
parasita chega ao sistema porta-hepático (Clegg 1965). Neste processo de
migração o parasita passa por um estado metabólico semi-dormente, havendo
apenas mudanças na morfologia do verme, possivelmente para se adequar em
tamanho aos capilares das veias, que compreendem a rota de migração do
esquistôssomulo (Wilson et al 1978). Várias evidências indicam que a síntese de
proteínas é bastante diminuída no dia zero de infecção e depois ocorre um
aumento até alcançar o pico máximo no oitavo dia (Yuckenberg et al 1987, Harrop
e Wilson, 1993), quando o verme recebe o estímulo para crescer e também
terminar de formar o seu tegumento heptalaminado, característico de vermes
adultos totalmente diferenciados (Hockley e McLaren, 1973). Além disso, durante
a migração, o esquistôssomulo pode utilizar no processo de transformação,
proteínas pré-sintetizadas na fase de cercária (Harrop e Wilson, 1993).
Visto que PIAS1 exerce um papel na diferenciação celular e no
desenvolvimento, então os baixos níveis de expressão deste gene nos períodos
estudados em relação aos vermes adultos, sugerem que este gene, pode
participar no processo de diferenciação que o parasita sofre até o sétimo dia do
seu desenvolvimento. Entretanto a detecção dos níveis de PIAS por Western Blot,
neste mesmo período de tempo estudado, poderá revelar a existência de tradução
acoplada aos níveis de transcritos detectados neste estudo. Futuros experimentos
___________________________________________________________Discussão
115
envolvendo proteoma, imunoprecipitação e Western blot utilizando um anticorpo
anti-PIAS, em culturas de 5, 7 e 21 dias contribuirão na elucidação esta hipótese.
5.3.2. RanBP2
A proteína Ran é requerida para o transporte nuclear, controle do ciclo
celular, formação das fibras do fuso mitótico e pela formação do núcleo pós-
mitótico (Azuma e Dasso, 2002). A modificação de RanGAP1 por SUMO1,
promove a sua associação a RanBP2, uma proteína de 358 kDa, que está
localizada na face citoplasmática do complexo do poro nuclear (Yokoyama et al
1995). Outros estudos indicaram também que RanGAP1 e outras proteínas se
tornam covalentemente ligados a SUMO1, de uma maneira bastante similar a
ubiquitina (Melchior, 2000). Pichler e colaboradores (2002) revelaram que a
nucleoporina RanBP2 tem atividade SUMO E3 ligase e através da interação direta
com a Ubc9, RanBP2 transfere SUMO1 para o substrato Sp100. O domínio E3
ligase tem 33 kDa de tamanho e não se assemelha ao domínio RING, presente
nas E3 ligases do tipo PIAS (Pichler et al 2002).
O domínio responsável pela atividade ligase de RanBP2 é o domínio IR
(Yokoyama et al 1995). Como podemos observar na Figura 32, o parasita S.
mansoni apresenta o domínio IR e RanDB, conservados, sugerindo que o parasita
pode apresentar a atividade SUMO E3 ligase de RanBP2.
O gene SmRanBP2 que codifica para RanBP2, apresenta um aumento real
de transcrição de aproximadamente 40 vezes em esquistossômulos obtidos após
48 horas de cultura in vitro, quando comparados a cercarias e vermes adultos,
___________________________________________________________Discussão
116
sugerindo que o transporte núcleo-citoplasma mediado por SUMO seja importante
tanto para os processos de migração, como para as mudanças morfológicas
sofridas pelo verme nos primeiros dias de desenvolvimento, no interior do
hospedeiro vertebrado(Figura 33).
O processo de diferenciação em células eucarióticas requer mudanças na
maquinaria do transporte nuclear em resposta ao estímulo da própria
diferenciação, bem como do crescimento. Estas mudanças ocorrem em paralelo
com modificações críticas e estágio-especificas na localização de fatores de
transcrição e também de proteínas que participam em processos de
remodelamento de cromatina que no momento da diferenciação devem estar
obrigatóriamente dentro do núcleo (revisado por Hogarth et al 2005).
Por outro lado este perfil de expressão nos primeiros 3 dias de
desenvolvimento pode indicar que este gene é expresso de forma temporal, ou
seja, ocorre um pico de expressão inicial seguido de um decaimento constante até
o silenciamento parcial, detectado no estágio de verme adulto, conforme indicado
na Figura 33A.
De acordo com os estudos realizados, o possível modelo para o transporte
consiste em primeiramente SUMO1 se ligar ao complexo RanBP2-Ubc9. Depois o
substrato ligado é transferido para SUMO e então ambos são transferidos para o
interior do núcleo através do poro (Figura 37). Possivelmente, após o translado,
RanGTP promove a liberação do substrato do receptor (Pichler et al 2002;Matunis
et al 1998, Melchior, 2000).
___________________________________________________________Discussão
117
(1) (2) (3) (4)
Figura 37: Possível mecanismo de translado de proteínas através do poro nuclear
dependente de Sumorilação. (1) Formação do complexo SUMO-RanBP2; (2)
Transferência do substrato a RanBP2; (3) Transporte através do poro; (4) Liberação do
substrato no núcleo. Possivelmente SUMO proteases podem atuar nesse mecanismo.
Adaptado de Azuma e Dasso, Dev. Cell. (2002).
Embora SUMO modifique os seus substratos alvos através do conjunto E1-
E2-E3 ligase, também é possível a interação direta de Ubc9 com o substrato alvo
(Seeler e Dejean 2003). A expressão diferencial dos genes de SmPIAS e
SmRanBP2 durante o ciclo de vida do parasita sugere que durante o seu
desenvolvimento, S. mansoni pode utilizar diferentes plataformas de sumorilação.
Baseado nos resultados obtidos até o momento de expressão dos genes
que codificam para SUMO-1, Ubc9, PIAS e RanBP2 em S. mansoni, juntamente
com o padrão de sumorilação sugerem que em cercárias esta modificação pode
ocorrer através do reconhecimento direto do motivo ψKxE do substrato, pela Ubc9,
e posteriormente ocorre a ligação de SUMO mediada pela E2 conjugadora, num
processo independente de SUMO E3 ligases. Ao contrário, em vermes adultos, a
ligação pode ocorrer através da plataforma SUMO-E1-E2-E3 (Figura 38). Futuros
experimentos estão sendo delineados para tentarmos responder estas questões.
___________________________________________________________Discussão
118
Figura 38: Possível interação entre as enzimas que promovem a sumorilação dos
substratos alvo. (A) Os resultados de expressão dos genes que codificam para o
sistema de sumorilação, sugerem uma interação direta entre a enzima Ubc9, SUMO e os
substratos. (B) Regulação da sumorilação por E3 ligases do tipo RING em vermes
adultos, que proporciona maior especificidade de substratos.
5.4.Proteases de SUMO
As proteases desempenham um papel central na célula através da
manutenção da integridade celular (Takeichi, 1991; Gumbiner 1996), regulação da
adesão célula-célula e regulação da expressão gênica no núcleo (Reiss et al,
2005).
As proteases de SUMO ou Ulps (Ubiquitin –like proteases) foram
denominadas SENPs (Sentrin especific protease) (1 a 7) em humanos (Gong et al
2000; Hang e Dasso, 2002; Kim et al 2000). Várias isoformas de Ulps forma
detectadas também em camundongos, e sabe-se que a isoforma de SENP2, ou
seja, a proteína SuPr1 (SUMO protease 1) desempenha um papel fundamental na
regulação do fator de transcrição Sp3, ao catalisar a reação de remoção de SUMO
(Gill 2004). Sendo a reação de sumorilação reversível e fortemente controlada
Ubc9
SUMO
Substrato
A
RING E3
Ubc9
SUMO
Substrato
B
___________________________________________________________Discussão
119
durante o processo, os exemplos acima ilustram a importância de proteases
específicas para a via de sumorilação.
O parasita apresenta uma diversidade de proteases de SUMO durante o
seu ciclo de desenvolvimento, como mostra a Tabela 4. Diversos estudos indicam
que a porção N-terminal dessas proteínas é quem determina a localização e,
portanto o reconhecimento dos seus respectivos substratos (Watts, 2004).
As Ulps são definidas como cisteíno proteases, possuindo tanto a
habilidade de gerar de SUMO madura, bem como de desconjugar SUMO, clivando
a ligação isopeptídica de substratos específicos (Watts, 2004). A seqüência da
proteína predita para o S. mansoni apresenta os resíduos de His, Cis e Asp do
sitio catalítico conservados, pertencendo à classe das peptidases C-48, assim
como as enzimas desubiquitinadoras (Figura 35).
Os resultados obtidos até o momento sugerem uma expressão diferencial
de SmULP1 durante o desenvolvimento (Figura 36). Em cercárias, não fomos
capazes de encontrar expressão desse transcrito. A expressão dessa protease se
inicia depois de 8.5h de cultivo in vitro, voltando a níveis quase indetectáveis após
3 dias de cultivo. Além disso, esse perfil de expressão sugere que a taxa de
desumorilação em cercarias é baixa e que o seu aumento progressivo transcrição
em esquistossômulos com 8.5 h, 18.5 h, 24 h e 48 h de cultivo pode estar
relacionado com um aumento da desumorilação de substratos específicos neste
estagio de vida do parasita. Esta hipótese colabora com a teoria que a
sumorilação tem um efeito estabilizador de proteínas (Melchior 2000). Futuros
experimentos de expressão dessa protease em esquistôssomulos de 5 e 7 dias,
bem como do proteoma da via de sumorilação, podem confirmar qual o papel da
___________________________________________________________Discussão
120
sumorilação na biologia celular do parasita. Por outro lado, como o genoma deste
parasita ainda não está completo, ainda podem ser encontradas outras enzimas
que escaparam dos métodos de predição utilizados neste trabalho.
Portanto, os nossos resultados sugerem que a via de modificação pós-
traducional dependente de SUMO em S. mansoni, pode estar relacionada, com
esse intrigante e ainda molecularmente pouco esclarecido processo de
metamorfose desacoplada do crescimento, que esse parasita experimenta. Desta
forma, essa via pode representar um dos vários sinais moleculares que este
parasita recebe, para seguir essa rota migratória, que desencadeia várias
mudanças morfológicas, desde movimentos de alongamento e retração,
desenvolvimento de um tegumento mais complexo e reorganização do sistema
nervoso (Lawson e Wilson, 1980; Crabtree e Wilson, 1980; Hockley e McLaren,
1973), para no final se desenvolver completamente no sistema porta-hepático do
hospedeiro e completar o seu ciclo de parasitismo.
6. Conclusões
__________________________________________________________ Conclusões
122
• Através dos dados do projeto transcriptoma, podemos sugerir que o
sistema de sumorilação é conservado nesse parasita.
• Os genes que codificam para a proteína SmSMT3C e SmUBC9,
apresentam todos os domínios conservados em relação aos outros
organismos.
• Os genes apresentam uma estrutura genômica contendo íntrons,
característica comum a alguns genes de S. mansoni. O gene que codifica
para SmSMT3C apresenta as sequências consenso de junção de splicing
GT...AG, enquanto que o gene que codifica para SmUbc9 obedece a regra
não – canônica de splicing AT...AC.
• A complexidade do genoma do parasita fica ressaltada pela identificação de
um pseudogene para Ubc9, podendo exercer importantes funções na
regulação da transcrição estágio específica.
• Os nossos resultados apontam para a existência de duas SUMO E3 ligases
no genoma do parasita sendo expressas principalmente em vermes adultos
e esquistossômulos. A baixa expressão de SUMO E3 ligases em cercarias
juntamente com a presença de conjugados sumorilados sugere que a
plataforma de sumorilação em cercárias pode se dar diretamente através
da ligação de Ubc9 ao domínio ψKXE e posterior transferência de SUMO
ao substrato alvo.
• A regulação da sumorilação através da ação das proteases de SUMO ou
ULP1 também pode ser um mecanismo importante na biologia do parasita.
Devido ao fato dessas proteases serem expressas de uma forma estágio-
__________________________________________________________ Conclusões
123
específicas, também reforça a idéia de que a sumorilação estabiliza a meia
vida de proteínas, nos diversos tipos de ambientes e estresses que este
parasita experimenta durante o seu ciclo de vida.
• Em S. mansoni o padrão de sumorilação é preferencialmente de proteínas
nucleares não histonas.
• Devido ao fato da via de sumorilação estar envolvida em importantes
aspectos da fisiologia celular, incluindo, transcrição dos genes, mitose,
localização sub-celular, transporte núcleo-citoplasma e regulação da
estabilidade protéica em S. mansoni, esta via também pode contribuir com
aspectos importantes, relacionados à manutenção do parasitismo, e
também com o complexo plano de desenvolvimento sofrido por esse
parasita durante um ciclo de vida completo.
Resumo
__________________________________________________
Resumo
125
Os parasitas do gênero Schistosoma são agentes causadores da
esquistossomose, uma doença crônica, que desabilita os indivíduos portadores e
afeta milhares de pessoas em vários locais do planeta. O S. mansoni apresenta
um ciclo de vida complexo dependente de dois hospedeiros: um invertebrado, o
caramujo, do gênero Biomphalária; e o definitivo, o homem. Recentemente, o
consórcio de sequenciamento do transcriptoma do parasita, liberou cerca de
14.000 ESTs, representando cerca de 92% dos genes expressos pelo parasita.
Essas seqüências incluem genes responsáveis pelo metabolismo, integridade
celular e vias de modificação pós-traducionais. Até o momento, poucas
informações são conhecidas sobre o papel das modificações pós-traducionais no
desenvolvimento do parasita. A SUMO, da sigla em inglês Small ubiquitin modifier,
é covalentemente ligada a um amplo espectro de substratos e pode regular a
atividade de várias proteínas eucarióticas.
Na tentativa de entender os aspectos da sumorilação no desenvolvimento
do parasita, foi realizada uma busca através dos bancos de dados de seqüências
de DNA disponíveis para o parasita, baseando-se na identidade de seqüências
relacionadas à via de sumorilação dos outros organismos. Desta forma de posse
das seqüências e utilizando ferramentas de biologia molecular foi possível
caracterizar a via de sumorilação em S. mansoni. A análise da estrutura genômica
para o gene que codifica SmSMT3C, mostrou que a região codificadora é
interrompida por dois pequenos íntrons. A ORF codifica para uma proteína de 90
aminoácidos, bastante conservada durante a evolução. A expressão deste
transcrito foi avaliada através de RT-PCR e podemos constatar que esse expresso
durante todas as fases do desenvolvimento estudadas.
__________________________________________________
Resumo
126
Em relação ao gene SmUbc9, podemos constatar através do alinhamento
do cDNA e da seqüência genômica, que este gene é interrompido por dois
pequenos íntrons. Também evidenciamos a presença de um pseudogene, o qual
denominamos de ψSmUbc9. O resultado do Western Blot, utilizando anticorpo
anti-ubc9 e extratos nucleares e citoplasmáticos do parasita, revelou uma proteína
de 20KDa. A expressão do transcrito de SmUbc9 foi avaliada, e constatamos que
o gene é expresso em todas as fases do ciclo analisadas. Através do perfil de
expressão das SUMO E3 ligases (Siz-PIAS e RanBP2) e da enzima
desumoriladora ULP1, podemos contatar que esses transcritos são
diferencialmente expressas durante as fases do desenvolvimento estudadas.
Portanto, os nossos resultados sugerem que a via de sumorilação pode ser
importante para o entendimento de vários aspectos da biologia do parasita, como
a regulação da expressão gênica, a integridade do genoma e transdução de
sinais.
Summary
___________________________________________________________ Summary
128
Schistosomes are parasitic blood flukes which causes the chronic
debilitating disease schistosomiasis, affecting hundreds of millions of people
worldwide. The S. mansoni presents a complex life cycle dependent of two hosts:
an invertebrate – the Biomphalaria snail, and a vertebrate – the man. Recently was
released by Transcriptome Sequencing Project about 14,000 sequences covering
92% of total of the expressed genes of the parasite, including genes responsible
for metabolism, cell integrity and posttranslational modification pathways. To date
little is known about the roles of post translational pathways in the development of
S. mansoni. SUMO, the small ubiquitin modifier, is covalently attached to a broad
spectrum of substrates and is well-known that the covalent linkage of SUMO to its
targeted substrates may regulate protein activity in eukaryotes.
In the attempt to understand the role of SUMO modification in S. mansoni
development we assembled a list of potential components of the SUMO pathway
from genome draft of the parasite. Our searches were based on the similarity of
these pathway components related to other organisms. The genomic structure was
evaluated for SmSMT3C (SUMO-1) and our results suggest that the coding region
is interrupted by small introns. The ORF for SmSMT3C codes a protein of the 90
amino acids presenting high degree of similarity and conserved motifs related to
SUMO from other organisms. RT-PCR for gene expression evaluation was
performed and SmSMT3C transcript is highly expressed through life cycle.
Immunoblot analysis using an isoform-specific antibody detected SUMO
conjugates in crude S. mansoni extracts.
The ORF analysis for SmUbc9 has shown a predicted protein which is
highly conserved through organisms analyzed. The alignment of cDNA and
___________________________________________________________ Summary
129
genomic sequences has shown that SmUbc9 is interrupted by small introns and we
evidenced the presence of ψSmUbc9 pseudogene on genome of the parasite.
Furthermore Western blot using human anti-ubc9 has detected a protein of 20kDa.
In addition mRNA expression of SmUbc9 gene was also evaluated in the
developmental stages of the parasite. Resulting transcripts were expressed in adult
worms, cercariae, schistosomula and eggs. qRT-PCR was also performed using
primers designed for E3 ligases (Siz/PIAS and RanBP2), and desumoylating
enzyme (ULP1), suggesting these genes are differentially expressed. Taken
together our results suggest that SUMO pathway may be crucial for understanding
several unclear aspects of S. mansoni biology regards to the regulation of gene
expression, genome maintenance, and signal transduction.
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Apêndices
_________________________________________________
Apêndice
146
Apêndice 1: SmSMT3C
Alinhamento dos cDNAs de SMT3C no ciclo de vida do parasita
CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment
adulto ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60
cercaria ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60
ovos ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60
esquistossomulos ATGACTGATAGTGCCAATAAGGAAGCTCCTTCAGAACACATTAATATCAAAGTGCAAGGA 60
************************************************************
adulto CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120
cercaria CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120
ovos CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120
esquistossomulos CAAGAAGGGTCAATTATTCACTTCAAGATACGGAAAAGCACACCTTTCAAGAAATTAATT 120
************************************************************
adulto ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180
cercaria ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180
ovos ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180
esquistossomulos ACTGCTTACTGCGATCGATTAGGCGTTAATCAGTCTGCTGTGCGGTTTTTTTTCGATGGA 180
************************************************************
adulto AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240
cercaria AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240
ovos AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240
esquistossomulos AACAGCGTTCATGAAACTGATACTCCTGGCTCGTTGGAAATGGAAGAAAATGATACCGTT 240
************************************************************
adulto GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276
cercaria GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276
ovos GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276
esquistossomulos GAGGTTTTCCAGGCACAAACTGGTGGATTGTAACTA 276
************************************
Alinhamento de SmSMT3C e SmUbiquitina
Smubiquitina 1 -------------MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAG 47KQLEDGR
SmSMT3C 1 MTDSANKEAPSEHINIKVQGQEGSIIHFKIRKSTPFKKLITAYCDRLGVNQSAVRFFFDG 60NSVHETD
Smubiquitina 55 TLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG- 76
SmSMT3C 68 TPGSLEMEENDTVEVFQAQTGGL 90
Análise dos domínios da proteína predita SmSMT3
Descriptions
Title PssmId Multi-Dom E-value
cd01763, Sumo, Small ubiquitin-related modifier (SUMO) proteins are conjugated to nume... 29166 No 6e-27
COG5227, SMT3, Ubiquitin-like protein (sentrin) [Posttranslational modification, prote... 34824 No 2e-17
smart00213, UBQ, Ubiquitin homologues; Ubiquitin-mediated proteolysis is involved in t... 47543 No 0.000004
pfam00240, ubiquitin, Ubiquitin family. This family contains a number of ubiquitin-lik... 40338 No 0.0001
_________________________________________________
Apêndice
147
Apêndice 2: SmUbc9
Alinhamento do cDNA de SmUbc9 no ciclo de vida do parasita
CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignment
adulto TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60
cercaria TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60
ovos TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60
esquistossomulos TTACAAGTTGGGATTTCGAAAAGACTCGGCCTGCTTTTTAACCCGACTGTCGTATTCTTT 60
************************************************************
adulto TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120
cercaria TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120
ovos TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120
esquistossomulos TCTGTTTTGTATATATAATGTATAGGCGTCAGCTTGAGCAGGATCTTTGGGATTTGGGTG 120
************************************************************
adulto ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180
cercaria ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180
ovos ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180
esquistossomulos ATCTAATAAATCTTGAATACCTAAGAGAATTTGTTTGATTGTAACTGCCGGTCTCCAATG 180
************************************************************
adulto TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240
cercaria TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240
ovos TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240
esquistossomulos TTTTTCTTCATCCAAGAGGGAAAGACACACGGTACCAGACGGAAATACATTGGGATGGAA 240
************************************************************
adulto TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300
cercaria TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300
ovos TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300
esquistossomulos TAAAGGTGGCTCAAACTTGCATTTGGGAGGTGTTGTTGGATATTCCGGCTTGAAGTACAT 300
************************************************************
adulto TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360
cercaria TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360
ovos TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360
esquistossomulos TCTAAGACTGAACAATCCTCCCTCCCACAATGTGCCTTTTTTCCCAGGTATACTACAATT 360
************************************************************
adulto CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400
cercaria CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400
ovos CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400
esquistossomulos CCAAGTCATCAGGTCTAACGACCCATCAGGGTTCTTCATG 400
****************************************
_________________________________________________
Apêndice
148
Apêndice 3: SUMO E3 ligases
Seqüência do cDNA que codifica PIAS
1 CGAAACTTGAATGAAGACGGTAGCGTAACTCGGAATACAATGTCTGGACCTTCTCAAACA 60
61 CCTGTTATTGCTGAATTGAATTTAGTATGTCCAGTATTTCGTACGAGAATGCGTATACCT 120
121 GGTCGTATTGCAGGTTGTCAACATGTAGAGGCATTTGATATGGAAGCTTTTCTACGTAGA 180
181 GAGGTTCTTTGGCCCAGGCTGAATTGTCCAATTTGTGGACATAAAAGCCCTGCTGGGCTG 240
241 GATGGATTATGCATTGATACCACCATATTGTATGCTTCGCAATTAGTACCTCAGTCAGCT 300
301 GAAAGTATTCTTGTACGCTCAGATGGTTATTGGCGATTGGTACCCCCATTATGTTTAGAT 360
361 CTGCCTAATGAAGTTGATCAATGGCAACCTTTAATTGGTCCACTGACAGAAGTAGTATCT 420
421 CAGGCTTTTAATCAGATCTCGTCAAAAGGTTCACTTCGTGGACAAAATCCCAGCAGTGTT 480
481 GGAGTACGACAAATTACTACTCATTGCCATACAAATGTCTCTCAAACAATACCTGATTGG 540
541 AATCAATCGCCTTTACAAAGAATTTCACCTCAGCAACAACGACAACCACC-----------590
PIAS ORF:
>lcl|Sequence 1 ORF:16..996 Frame +1
MSFVVIXYQNHLQXGHWPPDAVQIRFNDYLLRLDRSSVNGGQPAHKVACVKQLCRPGRNQLEIAILGLGE
DPNQPSTMAKRRATAQTLEAHRFAAFMAHMPALNVLLDGLQRRRPAGVNTLCDILEGRIGTRNLNEDGSV
TRNTMSGPSQTPVIAELNLVCPVFRTRMRIPGRIAGCQHVEAFDMEAFLRREVLWPRLNCPICGHKSPAG
LDGLCIDTTILYASQLVPQSAESILVRSDGYWRLVPPLCLDLPNEVDQWQPLIGPLTEVVSQAFNQISSK
GSLRGQNPSSVGVRQITTHCHTNVSQTIPDWNQSPLQRISPQQQRQP
Análise do domínio conservado utilizando Pfam
MIZ zinc finger
This domain has SUMO (small ubiquitin-like modifier) ligase activity and is involved in DNA repair and
chromosome organisation [2].
_________________________________________________
Apêndice
149
RanBP2
Sequência do cDNA que codifica para RanBP2
1 ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55
56 TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115
116 AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175
176 CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235
236 CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295
296 TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355
356 GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415
416 GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475
476 GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535
536 CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595
596 TCTGAGCAGCCTGA-----------------------------------------------609
Alinhamento RanBP2 expresso durante o ciclo de vida do parasita:
adultos ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55
ovos ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55
esquistossomulos ACCAGTAACAAAGTCGTTCCTTTTTA--CTTCTCCATTCA-CTAC--AAACTCTTCTGTA 55
************************** ************ **** *************
adultos TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115
ovos TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115
esquistossomulos TGCGCACCATCGATTCCTACATTTTCTACTCCTTTAGTATCCAATGCGTCAGCTAACGAG 115
************************************************************
adultos AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175
ovos AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175
esquistossomulos AAAAAAACAGTTGCACCCAGTACAGGATTCACTTTTTCTTTTGGTAACGCATTATCTAAA 175
************************************************************
adultos CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235
ovos CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235
esquistossomulos CTGAATGAAACGAATAATCCATCGACAGTTAATTTTTCAACTCCTACTCTTAGTAGTAGT 235
************************************************************
adultos CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295
ovos CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295
esquistossomulos CATCACAACGACGATAATGATGACGATAAAGTCGAACTTCTAGATGATTCGAAGTTGACA 295
************************************************************
adultos TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355
ovos TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355
esquistossomulos TTTAAACCTGTGCTTGAAGTTATGCCACAAAAGATTAAAGTTGTAACTGGAGAAGAAAAT 355
************************************************************
adultos GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415
ovos GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415
esquistossomulos GATGACGTTATATTTTGTCAGCGCGCCAAACTTTATCGTTGGGACAATAACACTTGGCAC 415
************************************************************
adultos GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475
ovos GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475
esquistossomulos GAACGTGGAGTTGGTGATTTAAAATTACTTCGTTCTACAATAACTGGTGTAATACGTTGT 475
************************************************************
adultos GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535
_________________________________________________
Apêndice
150
ovos GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535
esquistossomulos GTGATGCGTCGTGATCATGTCTTGAAAGTATGCTGTAATCATGTGATCGGAGCTGGTATG 535
************************************************************
adultos CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595
ovos CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595
esquistossomulos CATTTAAAACCTATGAATACTGGAGGTGGTCGTGCTTGGAGTTGGTGGGCTATCGATTAC 595
************************************************************
adultos TCTGAGCAGCCTGA 609
ovos TCTGAGCAGCCTGA 609
esquistossomulos TCTGAGCAGCCTGA 609
**************
ORF:
>S.m
MPQKIKVVTGEENDDVIFCQRAKLYRWDNNTWHERGVGDLKLLRSTITGVIRCVMRXDHVITSEFAAACRSSI
WEGTQRVXP
Análise do domínio conservado utilizando Pfam:
_________________________________________________
Apêndice
151
Apêndice 4: Protease específica de SUMO (ULP1)
1 GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60
61 TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120
121 ATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180
181 GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240
241 ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300
301 ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360
361 ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420
421 ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480
481 CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540
541 GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591
alinhamento da seqüência no ciclo de vida:
adulto GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60
ovos GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60
esquistossomulos GTAAAGGACATTAANTGGAAACAAATTGGGTTAAAGTGGATATGGTAATCAAATTTCTAC 60
************************************************************
adulto TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120
ovos TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120
esquistossomulos TTACAATTTATTACAACGTGCGAAGTCAACATCAAACAAATCTTCCTCGTATCGCTGTGT 120
************************************************************
adulto TATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180
ovos TATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180
esquistossomulos TATCAACATTTTTTTATGCAAAGTTAACAGCACCGATAGGTGGAGGTTATTCAGGAGTGC 180
************************************************************
adulto GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240
ovos GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240
esquistossomulos GACGTTGGACACGACAAATAAAATTATTTGATCAAGATATTATACTTATTCCAATTCATG 240
************************************************************
adulto ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300
ovos ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300
esquistossomulos ACAGAGGAATGCATTGGTGTTTAAGTTGTATCGATTTACGTGTTAAAACGATAACATATT 300
************************************************************
adulto ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360
ovos ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360
esquistossomulos ACGATTCAATGGGTTCTGGTAATATGAAGTGTTTGAATCAGTTAATGGATTATTTGAAAA 360
************************************************************
adulto ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420
ovos ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420
esquistossomulos ATGAATCATTAGACAAAAGAAATGTTGAACTGAAAGACCCGGATTCTTGGAAACTCGTCA 420
************************************************************
adulto ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480
ovos ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480
esquistossomulos ATACAGAGGACACTGTGCCTCAACAGTACAACGGCTCCGACTGTGGTGTTTTCCTGTGTA 480
************************************************************
adulto CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540
ovos CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540
esquistossomulos CATTTGGTGAATTCATCTCTCGTGATGCTTCATTTAAATCGAATTCCCGCGGCCGCCATG 540
************************************************************
adulto GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591
ovos GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591
esquistossomulos GCGGCCGGGAGCATGCGACGACGGGCCCAATTCGCCCATAGGATCGTTAAC 591
***************************************************
_________________________________________________
Apêndice
152
Analise da ORF:
>Sm
MVIKFLLTIYYNVRSQHQTNLPRIAVLSTFFYAKLTAPIGGGYSGVRRWTRQIKLFDQDIILIPIHDRGM
HWCLSCIDLRVKTITYYDSMGSGNMKCLNQLMDYLKNESLDKRNVELKDPDSWKLVNTEDTVPQQYNGSD
CGVFLCTFGEFISRDASFKSNSRGRHGGREHATTGPIRP
Detalhes da interação do domínio peptidase C48 com as proteínas que apresentam esse domínio
depositado no banco de dados Pfam
Valores de confiança do alinhamento da seqüência primária de ULP1 utilizando Pfam:
Alinhamento cruzado da proteína de S. mansoni com a proteína de S. japonicum no banco Pfam:
_________________________________________________
Apêndice
153
Conservação do domínio C48 entre os filos artropoda, plathelmintos e fungi
| | |
| | +---Arthropoda(19)
| | | |
| | | +---Hexapoda(19)
| | | |
| | | +---Insecta(19)
| | | |
| | | +---Pterygota(19)
| | | |
| | | +---Neoptera(19)
| | | |
| | | +---Endopterygota(19)
| | | |
| | | +---Diptera
(19)
| | | |
| | | +---Nematocera(3)
| | | | |
| | | | +---Culicoidea(3)
| | | | |
| | | | +---Culicidae(3)
| | | | |
| | | | +---Anophelinae(3)
| | | | |
| | | | +---Anopheles gambiae str. PEST
(3)
| | | |
| | | +---Brachycera(16)
| | | |
| | | +---Muscomorpha(16)
| | | |
| | | +---Ephydroidea(16)
| | | |
| | | +---Drosophilidae
(16)
| | | |
| | | +---Drosophila pseudoobscura
(3)
| | | |
| | | +---Drosophila grimshawi
(1)
| | | |
| | | +---Drosophila melanogaster
(12)
| | |
| | +---Platyhelminthes(3)
| | |
| | +---Trematoda(3)
| | |
| | +---Digenea(3)
| | |
| | +---Strigeidida(3)
| | |
| | +---Schistosomatoidea(3)
| | |
| | +---Schistosomatidae(3)
| | |
| | +---Schistosoma japonicum
(3)
| |
| +---Mycetozoa(4)
| | |
| | +---Dictyosteliida(4)
| | |
| | +---Dictyostelium discoideum AX4
(4)
| |
| +---Fungi
(47)
| | |
| | +---Ascomycota
(39)
| | | |
| | | +---Pezizomycotina
(18)
| | | | |
| | | | +---Eurotiomycetes(9)
| | | | | |
| | | | | +---Eurotiales(9)
| | | | | |
| | | | | +---Trichocomaceae
(9)
| | | | | |
| | | | | +---Emericella(3)
| | | | | | |
| | | | | | +---Aspergillus nidulans FGSC A4
(3)
| | | | | |
| | | | | +---Mitosporic trichocomaceae
(6)
_________________________________________________
Apêndice
154
| | | | | |
| | | | | +---Aspergillus oryzae
(3)
| | | | | |
| | | | | +---Aspergillus fumigatus
(3)
| | | | |
| | | | +---Sordariomycetes
(9)
| | | | |
| | | | +---Hypocreomycetidae(3)
| | | | | |
| | | | | +---Hypocreales(3)
| | | | | |
| | | | | +---Nectriaceae(3)
| | | | | |
| | | | | +---Gibberella zeae
(3)
| | | | |
| | | | +---Sordariomycetidae(6)
| | | | |
| | | | +---Sordariales
(6)
| | | | |
| | | | +---Chaetomiaceae(3)
| | | | | |
| | | | | +---Chaetomium globosum CBS 148.51
(3)
| | | | |
| | | | +---Sordariaceae(3)
| | | | |
| | | | +---Neurospora crassa
(3)
Schistosoma mansoni encodes SMT3B and SMT3C molecules responsible for
posttranslational modification of cellular proteins.
Fernanda J. Cabral, Olavo dos S. Pereira Jr., Camila S. Silva, Renata G. Sá, Vanderlei
Rodrigues*
Department of Biochemistry and Immunology, School of Medicine, University of São Paulo
Av Bandeirantes 3900, Monte Alegre, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil
Key words: S.mansoni, SMT3, post-translational modification
Abstract
The sumoylation pathway is a posttranslational modification of nuclear proteins
widespread among several organisms. SMT3C is the main protein involved in this process and
it is covalently conjugated to a diverse assortment of nuclear protein targets. Ubiquitin and
SUMO pathways are both biochemically similar but substrates modified posttranslationally by
SMT3C are not targeted to proteasome degradation. To date 3 SUMO paralogues (SMT3C,
A/B) have been characterized in mammals and plants. In this work we characterized two SUMO
related genes, named SMT3B and SMT3C throughout the parasite life cycle.
Abbreviations: mRNA, messenger RNA; RT-PCR, reverse transcription – polymerase chain
reaction; CTAB, hexadecyltrimethylammonium.
*
Corresponding Author. Tel: +55-16-3602-3235; Fax: 55-16-3633-6840
E-mail address: vrodrigu@fmrp.usp.br (V. Rodrigues)
2
1.Introduction
The posttranslational protein modification process plays an important role on protein
function by altering its activity, sub cellular localization and/or ability to interact with other
proteins. SUMO (Small ubiquitin modifier) is the best-characterized member of a growing family
of ubiquitin-like proteins. This protein resembles ubiquitin in a structure but it does not target its
substrates to proteolysis by 26S proteasome (Melchior, 2000). In mammalian cells, SUMO
modification system plays a role such as modulation of protein-protein
interactions,
transcriptional control, and stabilization of
proteins by blocking of ubiquitination sites (Gotissa et
al, 1999).
There are three SUMO paralogues SUMO 1, SUMO 2 and SUMO3 described in human
and mice also named SMT3C, SMT3B and SMT3A respectively. Whereas the mature forms of
SUMO 2 and SUMO 3 are 95% identical to each other at the amino acid level, SUMO2/3
subfamily proteins are only 47% identical to SUMO 1 (Saitoh and Hinchey 2000). Very limited
data are available at the moment with regard to the abundance of SUMO 2 versus SUMO 3 at
the protein level, since there is no tool to distinguish between SUMO 2 and 3 proteins (Saitoh,
2004).
The SUMO 2/3 conjugation or sumoylation process is identical and requires the same
enzymes of the SUMO 1 conjugation process, first of all depending of an enzymatic complex
called AOS1/UBA2 heterodimer for SUMO activation (E1) and a single E2 enzyme (UBC9) for
conjugation (Jentsch and Pyrowolakis, 2000). In contrast to SUMO–1, SUMO 2/3 is able to form
poly-SUMO chains (Tatham et al, 2001).
Schistosoma mansoni is the agent of schistosomiasis, a parasitic disease affecting 300
million people around tropical and subtropical areas of the world (WHO, 2004). Schistosomes
are trematodes sexually dimorphic, and through its development the parasite undergoes several
morphological and biochemical changes to adapt itself to different habitats and hosts
(vertebrate and invertebrate). Posttranslational pathways may play an important role in
development of parasites. Over the years several groups have been identified important targets
to suffer posttranslational modifications such as SmRK1 a novel protein member of the TGFβ
3
receptor family, which is expected to promote the target and cellular sub-localization of the
modified substrates (Beall et al, 2000)
However in parasites little is known about SUMO pathway or the nature of its targets,
here we report the molecular characterization of transcripts encoding S. mansoni SUMO-2
(SMT3B) and SmSUMO-1 (SMT3C), respectively. The profile expression of both genes was
investigated through the biological cycle of the S. mansoni, and the analysis of the sequences
shows the clear evidence of the conserved modification system in this parasite.
2. Materials and Methods
2.1. Identification and analysis of SMT3B and SMT3C in S. mansoni. A cDNA encoding the
open reading frame of Schistosoma mansoni SMT3B (SmSMT3B) was obtained by RT-PCR,
using the forward primer 5’-TCTAATTCGTTTCAGAGAGACTCCCGC-3’ and reverse primer 5’-
CGAAAACGAAGAGTTTATTTGTAAGATAA-3’ as idealized from Caenorhabditis elegans
sequence (Choudhury et al, 1997). The S. mansoni gene encoding SMT3C, was identified by
BLAST searches using the S. mansoni transcriptome database at http://bioinfo.iq.usp.br/schisto,
deposited under the number 601278 (Verjovski-Almeida, 2003). The corresponding predicted
ORFs were aligned using the ClustalW algorithm available at www2.ebi.ac.uk/clustalw. The
primers were: fw 5´-ATGACTGATAGTGCCAATAA-3´ / rv 5´-CAATCCACCAGTTTGTGCCT-3´.
The PCR reactions for both genes were conducted as follows: initial desnaturation for 5
minutes, following 35 cycles of desnaturation at 95°C for 1 minute, annealing at 55°C and
extension at 72°C for 1 minute and the final extension at 72°C for 10 minutes. Negative controls
were performed using all PCR reagents less cDNA. All PCR products were cloned in pGEMT-
easy cloning vector (PROMEGA) and were sequenced in ABI 3100 automated sequencer
(Applied biosystem), using dye terminator kit.
2.3. Construction of phylogenetic trees and analysis of the sequences. The ClustalW alignments
of the SmSMT3B and SmSMT3C predicted proteins sequences were used for generation of the
trees as a requirement for the utilization of the Mega software (version 3.0) described by Kumar
et al 2004. The confidence of the branches was evaluated by bootstrap analysis using 1,000
samplings. Phylogenetic trees were visualized using Treeview v16.6 (Page et al, 1996). The
GenBank proteins sequences and accession numbers used in these analyses were as follows:
SMT3B ortologues from Bombix mori, GB access ABD36355; Drosophila melanogaster, GB
4
access NP477411; Saccharomyces cerevisiae, GB access NP010798; Arabidopsis thaliana,
GB access NP200327. SMT3C orthologs from Rn (Rattus norvegicus gi|19424298); Hs (Homo
sapiens gi|1770519); Sc (Saccharomyces cerevisiae gi|30584365); Mm (Mus musculus
gi|4091893); Dm (Drosophila melanogaster gi|6934292); Sj (Schistosoma japonicum
gi|28341405); Ce (Caenorhabditis elegans gi|2501447); Cb (Caenorhabditis briggsae
gi|39589515); At (Arabidopsis thaliana gi|1707372); Sp (Schizosaccharomyces pombe
gi|11279016). The alignment of SmSMT3B proteins sequences was done with the ortologs from
databanks as follow: AAX30012 Schistosoma mansoni; NP200327 Arabidopsis thaliana;
XP001256201 Bos taurus; NP 001003422 Danio rerio; XP521229 Pan troglodytes; spQ6GPW2
Xenopus laevis; NP579932 Mus musculus. The searche for DNA and protein identity was done
using BLAST algorithm at www.ncbi.nlm.nih.gov. The analyses of the predicted proteins were
done using expasy at www.expasy.org using LAlign, PRODOM and Prosite algorithms. The
alignment of predicted SmSMT3B and SmSMT3C were performed using BOXSHADE.
2.4.mRNA isolation and Northern blot analysis. Ten micrograms of total RNA from adult worms
were electrophoresed in a 1% agarose gel and transferred to nylon Hybond N+ (GE
Healthcare). Specific SmSMT3B and SmSMT3C radiolabeled probes were constructed by using
Random Primers DNA Labelling System (Invitrogen) and hybridization procedures were
executed as described (Maniatis, 1989).
2.5. Preparation of protein extracts. B. glabrata infected snails were induced to shed cercariae
under light exposure for 2h and the cercariae were recovered by sedimentation on ice. Adult
worm parasites were obtained by liver perfusion of Balb/c mice after 50 days of infection. Crude
cytosolic lysates were prepared from both stages of the parasite. Briefly, the parasites were
suspended in buffer A (5mM Tris-HCl pH 8,0; 1% glycerol; 1mM EDTA; 1mM PMSF; 1mM DTT
and 1mM MG132), homogenized in Polytron®, and centrifuged at 10,000xg for 30 minutes. The
pellet was discarded and the supernatant centrifuged at 40,000xg for 60 minutes. The protein
content was estimated by the Pierce method (Smith et al 1985).
The nuclear protein extract from adult worms was prepared by homogenization of the
parasites in buffer B (10 mM Tris-HCl pH 7.6; 10 mM NaCl; 3 mM MgCl
2
; 0.1% Triton X-100 and
1 mM PMSF), followed by centrifugation at 2000xg for 10 minutes at 4ºC. The supernatant
containing the cytosolic fraction was stored at -70ºC. The pellet containing the nuclei was
5
resuspended in 2 ml of buffer B and centrifuged as described above. Finally, the nuclei were
incubated for 45 minutes in buffer B plus 0.8 M NaCl and centrifuged at 10,000xg for 45 minutes
at 4ºC. The supernatant was dialyzed for 3 hours in buffer C (20mM HEPES pH 7.6; 5mM
MgCl
2
; 0.1mM EDTA; 1mM DTT and 10mM PMSF). The protein content was determined as
before described and 20 µg of both cytosolic and nuclear fractions were loaded onto a 10%
SDS-PAGE (Laemmli, 1970); separation was followed by staining with Comassie Brilliant blue.
2.6.Immunoblot analysis. Nuclear and total protein extracts from adult worms and cercariae
were transferred to a PVDF membrane (Hybond – Amersham Biosciences) (Towbin et al,
1992). Following an overnight blocking step in TBST buffer (10mM Tris-HCl pH 7.5, 150mM
NaCl, 5% non-fat milk and 0.05% Tween 20), the blotted proteins were submitted to
hybridization with an anti-SUMO antibody (Santa Cruz Biotech) at 1:500 dilution for 4h in the
same buffer. Biotinylated anti-goat IgG conjugated to alkaline phosphate at 1:1000 dilution was
used as the secondary antibody during a 90 min incubation. SUMO-conjugated proteins were
visualized after incubation of the membrane with the alkaline phosphatase substrates
NBT/BCIP (Invitrogen) as described by the manufacturer.
3. Results
3.1. Sequencing and analysis of cDNAs coding for SmSMT3C and SmSMT3B proteins
The full-length cDNA sequence of SmSMT3B presents a 742-bp size, and the sequence
was deposited on GENBANK under the number AY817504. The position of the ATG start codon
was inferred at position 327 and encodes a protein of 94 amino acids presenting a theoretical
molecular mass of 10KDa and a pI equal to 8,82.
Amino acids sequence comparison showed that SmSMT3B, shares the Ub-fold motif
important for folding and conjugation to the protein to its targets, as well as the conserved
residues of C-terminal Gly-Gly important for conjugation (Figure 1). As a result, it is likely that
SmSMT3B assume a similar shape to human SUMO-1 despite substantial sequence
divergence. Otherwise the comparison of amino acid sequence of SmSMT3B with SmUbiquitin
(Guerra-Sá, personal communication) has also shown that SmSMT3B and Ubiquitin shares
approximately 16% of amino acid sequence. SmSMT3B also present an extended N-Terminal
tail and two amino acids more at C-terminal region after Gly-Gly motif, which is necessary to be
processed by proteolytic enzymes in order to become active (Melchior, 2000).
6
In the effort to analyze the similarity of SmSMT3B sequence compared to others
organisms we performed searches of the predicted protein sequences, and we have found that
SmSMT3B is conserved through metazoans (Figure 1A). Afterwards using phylogenetic tools
we have found that SMT3B subfamilies should have arisen after an evolutionary split of insects
and yeast (Figure 1B). This finding suggest that subfamily SUMO 2/3 polypeptides are present
in at least some invertebrates species, although their function, abundance and nature of its
targets is less understood than their mammalian homologues.
In order to validate the in silico predictions of the SMT3C gene we have used the
molecular reconstitution approach described before (Material and Methods) and allow us to
obtain a 270 bp cDNA fragment of the SmSMt3C gene from adult worms total RNA. This cDNA
contains an open reading frame encoding a protein of 90 amino acid residues, and presents all
protein sequence features that we have already been described for SmSMT3B sequence.
Furthermore the analysis using LAlign on Expasy website, we have showed that SmSMT3C and
its paralogue in S. mansoni SmSMT3B (Figure 2) present 48.8% of similarity of sequence, in
agreement with data in other organisms (Saitoh and Hinchey, 2000).
In addition the alignment of predicted protein sequence and philogenetic analysis from
plants, worms, human, fruit fly and yeast, showed that SMT3C protein predicted sequence is
well conserved (Figure 3A). The phylogenetic analysis showed that SmSMT3C is closely related
to S. japonicum orthologs, as expected from the evolutionary proximity between these parasites
(Figure 3B). Even though C. elegans is considered closely related to S. mansoni, an ancient
splitting of the SUMO–1 gene is evident when comparing these organisms (Figure 3B).
3.2. Genomic structure of the SmSMt3C gene
Genomic DNA amplification using SmSMT3C specific primers (the same used for RT-
PCR), showed a DNA amplification transcript with 400 bp (Fig. 3C
1). The alignment of predicted
aminoacids sequences from cDNA and genomic transcript showed that the coding region of
SmSMT3C is interrupted by two small introns with 28 and 36 bp respectively (Fig. 3C
2).
3.3. Expression profile of SmSMT3B and SmSMT3C genes during the parasite life cycle
The endogenous mRNA expression of SmSMT3C/B genes through parasite stages of
adult worms, eggs, schistosomula and cercariae were compared by semi-quantitative RT-PCR
using α-tubulin gene as internal control (Figure 4A). The results showed both genes are
7
expressed in all stages and the SmSmT3B gene showed a constitutive expression in all stages
and the SmSMT3C gene showed an expression level 7 to 9 times higher than SmSMT3B
approximately. Interesting the SmSMT3C gene showed a very low expression level in cercariae
stage.
3.4 Northern blot analysis
The SmSM3Tb and SmSM3TC probes recognized messages with 1.3 Kb and 1.0 Kb
respectively and also another message with 1.8 kb was recognize with SmSMT3C probe (Fig.
4B). Since this gene showed the existence of introns, this last message probably is a immature
form of the SmSM3TC mRNA.
3.5 The SMT3C conjugation pathway is present in S. mansoni
To confirm that S. mansoni may potentially conjugate SMT3C to other proteins, we used
immunoblot analysis with an anti-SUMO-1 antibody to detect the free and conjugated forms in
crude cytosolic and nuclear extracts from adult worms and cercariae. As shown in Figure 5B,
immunoreactive proteins could be observed in cercariae and adult parasites and the level of
conjugated proteins were more intense in the nuclear fraction of adult worms
4. Discussion
The SUMO conjugation pathway is biochemically similar to ubiquitin, but its
substrates it is not targeted for proteolitic degradation by ATP-ubiquitin-proteasome pathway
(Melchior, 2000). Several studies have shown that SUMO is a nuclear protein related to control
important cellular processes such as genome integrity (Johnson 2004), transcriptional
regulation by modification of transcription factors such as c-Jun and c-Fos (Bossis, et al 2005),
regulation of gene expression by modification of repression complexes (Girdwood et al 2004),
and trafficking of proteins from nucleus to cytoplasm through modification of RANGAP-1 protein
(Matunis et al, 1996).
Based on evolutionary proximity of C.elegans and S.mansoni we idealized primers to
amplify the related SMT3B gene in S. mansoni, and a 600-bp fragment corresponding to
SMT3B cDNA was amplified, and showed an ORF with 282 nucleotides, coding a protein with
94 amino acids (Figure 1A). Amino acids sequence analysis showed the C-terminal Gly-Gly
8
conserved motif responsible for attachment and conjugation of SUMO on its substrates and the
presence of a flexible N-terminal extension which is absent on ubiquitin sequence. As the same
way as ubiquitin, SMT3B has a C-terminal extension of two amino acids (Figure 1A) that might
be processed by SMT3 specific proteases in order to become SUMO mature (Johnson, 2004).
Using the strategy of molecular phylogeny, we grouped our SMT3B sequence with
ortologues from other organisms and we have found that SmSMT3B is well-conserved
throughout the invertebrates. Thus, SmSMT3B is closest of plant SMT3B and it seems to be a
recent aquisition of invertebrates after a split of yeast and insects (Figure 1B). The search for
homologues of SmSMT3B on S. mansoni databanks such as TIGR (The Institute for Genomic
Research), S. mansoni Transcriptome Project, and S. mansoni geneDB was recently performed
and the SmSMT3B sequence is annotated on TIGR database as a mature transcript under the
number NP1435753, and we have not evidenced the presence of introns.
The existence of two paralogs for SMT3 was not expected for invertebrates, but during
our in silico analysis through genome databases of S. mansoni, we have found another paralog
for SMT3 identified as SMT3C. The new paralog was characterized and the genomic structure
of SmSMT3C gene was determined. SmSMT3C gene contains two very small introns of 28 and
36 base pair, respectively. All two introns contain the consensus GT...AG splice junction
sequences (Figure 3C). While the general requirement for the splicing machinery is a minimum
of 50 bp (Wieringa et al 1984; Thompson and Domdey, 1987), all the introns of this gene are
smaller than this requirement. These small introns are characteristic of genes from S. mansoni,
such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Charrier-Ferrara et al 1992), gluthationa
peroxidase (Mei and Lo-Verde 1996), Sm23 (Lee et al 1995). Details of how these small introns
are spliced remain to be elucidated.
SmSMT3C exhibits a C-terminal double glycine, responsible for SUMO-1 conjugation to
the targeted substrate (Jentsch and Pyrowolakis, 2000). The philogenetical analysis of
SmSMT3C, have shown that this gene is conserved through the evolutive scale, and
SmSMT3C sequence belongs the same branch of S. japonicum SMT3 sequence (Figure 3B).
According to Figure 2, both paralogs of SMT3 present 48.8% of identity as previously described
for other organisms (Saitoh 2004).
9
The expression profile of SmSMT3B/C genes in the life cycle of S. mansoni was
evaluated using RT-PCR (Figure 4A). The profile of expression of SMT3C is very similar to
other organisms such as Arabidopsis and mouse, which SMT3C is more abundant than
SMT3B. Because the key role of SMT3B/C genes are posttranslational modification of proteins
then the presence of two paralogs may suggest a variety of targeted substrates to these
modifications. Even though we have not detected the protein levels for SMT3B, our results
using specific antibody for SMT3C show the presence of sumoylated conjugates in nuclear as
well as cytosolic fractions of proteins from adult worms. Previous studies in other organisms,
suggest that the modification SMT3B dependent is related with several kinds of cellular stresses
(Kurepa 2002). In fact during its development S. mansoni cross-talk with different environments
and temperatures as for example 25°C when the parasite is an infective larvae form (cercariae)
or 37°C in the intra mammalian stages, suggesting that the parasite may modify its substrates
through sumoylation pathway to adapt to its environments conditions.
Because S. mansoni presents all genes necessary to conjugate SMT3 to its targeted
substrates, and the presence of nuclear proteins conjugates (Figure 5B), our results suggest
that this posttranslational pathway may be potentially involved on gene expression regulation.
Several studies have shown that SMT3 playing a role on transcription factors modifications (Di
Bacco, 2003) as well as histone modifications, which are associated to transcriptional
repression (Shiio and Eisenman, 2003). The whole mechanism about SMT3 inhibits
transcription is not absolutely clear, but some results suggest that through SMT3 modification
may occur a regulation of assembly of transcriptional complexes (Verger, 2003).
Taken together our results may reinforce the importance of SUMO post-translational
pathway in S.mansoni, and natural targets of this post-translational modification pathway in S.
mansoni constitute the subject of our further investigation
Acknowledgements
This work was supported by Brazilian agencies of research, FAPESP (Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), CAPES (Coordenação de Apoio ao Pessoal de
Nível Superior) and CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico).
We also thank Ms. Elenice A. Macedo and Ms. Olinda M. Brigato for technical assistance.
10
Figures and Legends
Figure 1: Identification and characterization of SmSMT3B gene. (A) Local alignment between
the SmSMT3B amino acids predicted sequence and its ortologues, using CLUSTALW program
at
www.ebi.ac.uk and BOXSHADE. Identical residues are shaded in black and similar
residues in grey. (B) Phylogenetic tree for SmSMT3B and its orthologs in others organisms. The
neighbor-joining tree was calculated using Mega 3.0. Linear distances between homologue
sequences are inversely proportional to their amino acid sequence similarity.
Figure 2: Amino acid sequence comparison of the S. mansoni SmSMT3B and SmSMT3C
genes. Identical amino acids residues are shaded in black and similar residues in grey
Figure 3: Organization of S. mansoni SMT3C gene.
(A) Alignment of SmSMT3C protein with other organisms. The alignment shows that the
SmSMT3C amino acids sequence is conserved in comparison to other organisms. The
abbreviations are: Rn (Rattus norvegicus ); Hs (Homo sapiens); Sc (Saccharomyces
cerevisiae); Mm (Mus musculus); Dm (Drosophyla melanogaster ); Sm (Schistosoma mansoni);
Sj (Schistosoma japonicum ); Ce (Caenorhabditis elegans) Cb (Caenorhabditis briggsae) At
(Arabidopsis thaliana) Sp (Schizosaccharomyces pombe).
(B) Phylogenetic tree for SmSMT3C and its orthologs. The neighbor-joining tree was calculated
using Mega 3.0. Linear distances between homolog sequences are inversely proportional to
their amino acid sequence similarity. (C) Amplification of the genomic DNA by PCR using
SmSMT3C gene-specific primers (1). Schematic representation of the SmSMT3C coding region
and the genomic localization of exons with their relative positions (2). The first intron contains
28 bp and the second 36 bp. MW is 1Kb molecular weight markers.
Figure 4: Expression profile of SmSMT3B and SmSMT3 genes.
(A) Expression of SmSMT3B and SmSM3TC genes in four developmental stages of S.
mansoni. Fifty nanograms of mRNA from adult worms, eggs, schistosomula, and cercariae,
were used for semi-quantitative RT-PCR using the α-tubulin gene as a internal control.
Densitometry was performed using Gene Quantity software (Biorad). (B) Ten micrograms of
total RNA from adult worms were used for Northern blot analysis. Specific SmSM3TB and
11
SmSMT3C probes were used to show specific messages. The α-tubulin gene was used as
control of mRNA expression.
Figure 5: Immunoblot of SmSMT3C.
Twenty micrograms of crude preparations obtained as described in section 2.6 were analyzed
by 10% SDS-PAGE followed by immunoblotting with the anti-SUMO-1 antibody. (A) Replica gel
stained with Coomassie Brilliant blue. Nuclear (1) and cytosolic (2) proteins from adult worms
and cytosolic proteins of cercariae (3). (B) Detection of SUMO conjugates for the corresponding
lanes. The arrows indicate SUMO conjugates in both adult worms and cercariae. MW,
molecular weight markers.
12
Figure 1
Figure 2
13
Figure 3
14
Figure 4
Figure 5
15
References
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