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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Análise da cinética de expressão de genes para citocinas,
quimiocinas e seus receptores, moléculas de adesão e fator de
transcrição na pele e linfonodos de camundongos
infestados com carrapatos
Cláudia Espósito Passoni
Orientadora: Prof. Dra. Beatriz Rossetti Ferreira
Ribeirão Preto
2006
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Resumo
Carrapatos são artrópodes hematófagos de grande importância médica e
veterinária devido aos efeitos deletérios diretos por eles causados ao se fixarem e
sugarem seus hospedeiros, além de serem importantes vetores de doenças.
Durante o processo de repasto, carrapatos estimulam a resposta imune e
inflamatória dos hospedeiros. No entanto, são capazes de suprimir elementos da
imunidade natural e adquirida através de fatores presentes na saliva inoculada
durante o repasto, muitas vezes impedindo o hospedeiro de montar uma resposta
imune protetora. Pesquisas do nosso grupo mostraram que tanto cães como
camundongos BALB/c infestados por carrapatos Rhipicephalus sanguineus não
desenvolvem resistência aos carrapatos, mesmo após várias infestações. No atual
estudo realizou-se análise da cinética de expressão de genes de citocinas,
quimiocinas e seus receptores, moléculas de adesão e fator de sinalização
intracelulares relacionados à resposta imune /inflamatória induzida na pele e
linfonodos de camundongos durante infestações com carrapatos. Após sucessivas
infestações, a saliva dos carrapatos foi capaz de modular a resposta imune do
hospedeiro para o padrão Th2, induzindo aumento na expressão de IL-4 na pele
em 35 vezes. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que células do
linfonodo de animais re-infestados por carrapatos R. sanguineus quando
estimuladas com Con-A tem uma elevada produção de IL-4. No atual estudo foi
verificado um aumento na expressão gênica de IL-4 de 6,2 vezes nos linfonodos.
IL-4 parece estar controlando a inflamação local, pois observou-se inibição da
expressão de IFN-γ e IL-12 (em 28 e 93 vezes respectivamente) no terceiro dia de
infestação, o que possivelmente favoreceu a fixação e alimentação dos parasitas.
Foi também observada inibição na pele da expressão do gene de CCR4,
importante receptor responsável pela migração de células T para a pele, enquanto
outras moléculas como ICAM-1 e LFA-1, relacionadas à adesão celular, não
apresentaram expressão alterada. Por outro lado, o hospedeiro foi capaz de
responder ao estímulo do parasita induzindo o aumento de mensagem para as
quimiocinas MIP-1α e MIP-1β (70 e 4,9 vezes respectivamente), e a produção
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destas quimiocina na pele foi confirmada pela reação de imunhistoquímica. MIP-
1α e MIP-1β exercem função quimioatraente para as células CD11b
+
(macrófagos
e neutrófilos), presentes no sítio de fixação dos carrapatos. Os resultados obtidos
neste estudo permitem uma melhor compreensão da interação parasita-
hospedeiro e dos fatores que garantem ao parasita o controle da resposta
imunológica do hospedeiro, a fim de favorecer a sua sobrevivência. O
conhecimento gerado a partir do nosso estudo fornece base para futuras
pesquisas sobre o planejamento e desenvolvimento de novas estratégias de
controle dos parasitas.
Abstract
Ticks are haematophagous arthropods known to induce deleterious effects to their
hosts due to attachment and feeding, added to its capacity of transmitting
important medical and veterinary pathogens. During the feeding process, they
stimulate the immune and inflammatory host responses meanwhile suppress
elements of natural and acquired immunity by factors present in the inoculated
saliva, impairing the immune responses control by hosts. Mice and dogs (natural
host) do not develop resistance to Rhipicephalus sanguineus ticks, not even after
successive infestations. The aim of this study was to analyze the kinetics of the
expression of cytokines, chemokines and their receptors, adhesion molecules and
signalizing factor genes related to immune/ inflammatory responses induced in the
skin and lymph nodes of tick-infested mice. After successive infestations, tick
saliva modulated the immune response to Th2 pattern, induced by IL-4 augment in
35 fold in the skin. Ours previous research demonstrated that lymph node cells
from re-infested mice when stimulated with Con-A produced elevated quantities of
IL-4. In this work it was seen that IL-4 expression in lymph node cells was 6,2
times more expressed than in control group. Besides IL-4 should be controlling the
local inflammation, by the inhibit of IFN-γ and IL-12 expression (28 and 93 times
respectively) at third day pos-attachment, what probably favors the attachment and
parasite feeding. The gene expression CCR4, an important receptor for T cells
rolling to skin, was down-regulated meanwhile others molecules related to cellular
adhesion: ICAM-1 and LFA-1 had no alteration on their expression. By the other
hand, hosts can respond to the parasite by the increasing mRNA messages for the
chemokines MIP-1and MIP-1β (70 and 4,9 fold respectively) that was confirmed by
immunohistochemestry at the tick attachment site. MIP-1α and MIP-1β are
chemoatractive to CD11b
+
cells that are present in the infested skin. Our results
lead to a better understanding the host-parasite interaction and factors of the host
immune response that are controlled by ticks, that favor their surveillance. The
findings of our study permit the development of new strategies to control ticks.
1
II- Introdução
Carrapatos são artrópodes hematófagos de distribuição cosmopolita,
importantes vetores de doenças para o homem e para os animais domésticos. As
perdas econômicas resultantes do parasitismo por carrapatos são imensas e
relacionam-se principalmente ao seu parasitismo em bovinos. Além de sugarem
sangue de seus hospedeiros reduzindo sua capacidade produtiva, carrapatos
também são importantes transmissores de doenças, tais como babesiose,
anaplasmose e erliquiose, entre outras. Foi estimado que 80% do rebanho bovino
mundial seja infestado por carrapatos, o que de acordo com a "Food and
Agriculture Organization" (FAO) origina um custo de 7.500 milhões de dólares
anuais (ANON, 1995). Apesar do parasitismo por carrapatos em cães não resultar
em perdas econômicas relevantes, esses ácaros trazem transtornos evidentes
visto que canídeos residem no ambiente doméstico em contato direto com o
homem, e seguidamente são acometidos por infestações maciças de carrapatos.
Além das conseqüências mais comuns do parasitismo, tais como, irritação
na pele, prurido, anemia e caquexia, carrapatos R. sanguineus também são
vetores de parasitas para os cães/homens, dentre eles: Ehrlichia canis, Babesia
canis, B. bigemina, Rickettsia rhipicephali, R. coroni e Togoto vírus (CUPP et al.,
1991).
A principal espécie de carrapatos que infesta os cães domésticos é a
Rhipicephalus sanguineus, pertencente à família Ixodidadea e conhecidos por
“hard ticks”, por possuírem exoesqueleto, as fêmeas desta espécie são mais
longilíneas que os machos e possuem escudo dorsal limitado a dois terços do seu
corpo, já nos machos o escudo recobre todo o dorso do parasita e é ornamentado.
2
O ciclo de vida desta espécie se completa em apenas dois meses. Durante
este período o parasita necessita de três hospedeiros e ao final do ciclo cada
fêmea ingurgitada é capaz de ovipor cerca de 2.000-3.000 ovos (FREITAS et al.,
1982).
O controle dos carrapatos tem sido realizado através dos anos basicamente
pelo uso de acaricidas. Porém o desenvolvimento de resistência dos carrapatos
aos pesticidas tornou-se um problema freqüente (BIANCHI et al., 2003) e o custo
de desenvolvimento de novos compostos é alto (GRAF et al., 2004), com isso tem-
se buscado cada vez mais novos métodos de controle, baseado principalmente
nos fatores desencadeadores da resistência imunológica aos parasitas
(WILLADSEN et al. 2004).
A interface carrapato-hospedeiro é caracterizada por uma interação
inflamatória/imunológica complexa. Carrapatos induzem vias regulatórias e
efetoras no hospedeiro envolvendo anticorpos, complemento, células
apresentadoras de antígenos, linfócitos T e B, células inflamatórias e citocinas
(revisado por WIKEL, 1996). O processo físico e químico da alimentação e da
longa duração da fixação induz respostas homeostáticas, inflamatórias e
imunológicas nos hospedeiro. De forma a tentar conter estas respostas, os
carrapatos secretam através de sua saliva substâncias anti-hemostáticas,
antiinflamatórias e imunomoduladoras (PAESEN et al., 1999; VALENZUELA et al.,
2000; WANG et al., 1998; WAXMAN et al., 1990), incluindo anti-coagulantes,
inibidores de agregação plaquetária, vasodilatadores, cininases,
imunossupressores, etc (WIKEL, 1996). É importante ressaltar que tais
3
substâncias também auxiliam a transmissão/estabelecimento de patógenos por
carrapatos (HAJNICKÁ et al., 2000; 1998).
Para melhor se entender determinada patologia é necessário conhecer o
padrão de migração de leucócitos para o sítio de localização do patógeno. Melhor
ainda é poder comparar esse padrão entre animais resistentes e suscetíveis ao
patógeno, buscando explicações para o desenvolvimento de proteção. Nesse
sentido, o estudo da interação de carrapatos R. sanguineus-hospedeiros é
particularmente interessante, sendo que o hospedeiro natural (cão) e
camundongos não desenvolvem resistência, mesmo após diversas infestações,
enquanto que cobaias desenvolvem uma resistência bastante significativa já num
segundo contato com o ácaro (THEIS & BUDWISER, 1974; SZABÓ et al., 1995;
FERREIRA & SILVA, 1998). A reação inflamatória na pele de cães e
camundongos re-infestados com carrapatos R. sanguineus (suscetíveis) foi
descrita conter principalmente neutrófilos e eosinófilos; enquanto que a resposta
de cobaias re-infestadas com carrapatos (resistentes) era composta
principalmente por mononucleares, eosinófilos e basófilos (SZABÓ et al., 1999;
FERREIRA et al., 2003). Outras interações carrapato-hospedeiro, também têm
associado proteção a carrapatos com resposta cutânea basofílica (WIKEL, 1996).
Procurando avaliar qual o tipo de reação de hipersensibilidade cutânea
seria induzida pela inoculação de um extrato bruto de carrapatos em hospedeiros
previamente infestados com carrapatos ou não, foi mostrado que cães e
camundongos re-infestados desenvolvem uma forte reação de hipersensibilidade
imediata, enquanto que cobaias desenvolvem uma pequena reação imediata e
forte reação de hipersensibilidade tardia (SZABÓ et al., 1995; FERREIRA et a.,
4
2003). O desenvolvimento de reação tardia num teste de hipersensibilidade
cutâneo a antígenos de carrapatos em cobaias (hospedeiros resistentes) sugere o
envolvimento do braço celular (Th1) da resposta imune no processo de aquisição
de resistência.
A importância de citocinas, quimiocinas e seus receptores na orquestração
do processo inflamatório/imunológico desenvolvido a diversos patógenos estão
bem documentada (FRESNO et al., 1997; LUSTER et al., 1998). No contexto da
interação carrapato-hospedeiro tem sido demonstrado que extratos de tecidos ou
saliva de carrapatos modulam as citocinas produzidas por seus hospedeiros
(WIKEL, 1996). Pesquisas envolvendo o estudo da modulação de citocinas por
carrapatos têm proposto que eles induzem preferencialmente um padrão de
citocinas do tipo Th2 quando infestam seus hospedeiros (GANAPANO et al., 1995;
1996; FERREIRA & SILVA 1998; 1999).
Experimentos com extrato de glândulas salivares (EGS) de carrapatos
Dermacentor andersoni mostraram inibição da produção de IL-1 e TNF por
macrófagos ativados de camundongos (RAMACHANDRA et al., 1992), já o EGS
de carrapatos Dermacentor reticulatus inibiu a atividade antiviral do IFN-α
(HAJNICKÁ et al., 2000). E o EGS de carrapatos Ixodes ricinus aumentou a
produção de IL-10 por camundongos, resultando em supressão dos níveis de IFN-
γ (KOPECKY et al., 1999). Nosso grupo demonstrou que células dos linfonodos de
camundongos sucessivamente infestados por carrapatos R. sanguineus produzem
elevadas concentrações de IL-4, IL-10 e TGF-β, em detrimento de IL-2, IFN-γ e IL-
5
12 quando comparadas com a síntese de citocinas por camundongos não
infestados.
Considerando que esses camundongos não desenvolvem resistência a
carrapatos, e que suas células não proliferam frente a uma estimulação com Con-
A (FERREIRA & SILVA, 1998), é possível argumentar que sua condição "não-
responsiva" pode comprometer sobremaneira o desenvolvimento de uma resposta
anti-carrapatos. A resposta Th2 desenvolvida por camundongos infestados com
carrapatos pode ser vantajosa para os ácaros, considerando que citocinas
associadas a um padrão Th2 têm sido atribuídas a resposta anti-inflamatória
(ABBAS et al., 1996) e inflamação no local de fixação dos carrapatos pode
prejudicar o ingurgitamento de ácaros (RIBEIRO et al., 1985).
As quimiocinas desempenham um papel chave na fisiologia leucocitária,
controlando o processo de desenvolvimento e maturação dos leucócitos, bem
como direcionando sua recirculação fisiológica e sua migração para tecidos
inflamados (ROSSI & ZLOTNIK, 2000). Quimiocinas são peptídeos que possuem
atividade quimiotática para leucócitos, e são produzidos por diferentes células
(fibroblastos, células endoteliais, leucócitos, etc) após estimulação com citocinas
ou produtos microbianos. A atração seletiva de leucócitos em resposta a
quimiocinas é determinada pela expressão de receptores específicos na superfície
celular.
Alguns receptores específicos foram associados com determinadas
subclasses de células T (ROSSI & ZLOTNIK, 2000). Como exemplo temos um
receptor para IP-10 e Mig, o CXCR3, que é fortemente expresso por células Th1, e
não por células Th2. Por outro lado o CCR3, um receptor para eotaxina e
6
RANTES, é preferencialmente expresso em Th2, e não por células Th1 (O'GARRA
et al., 1998). IFN-γ (uma citocina Th1) é capaz de induzir a produção de IP-10 e
Mig e regular positivamente a expressão de RANTES (LUSTER, 1998;
SALLUSTO et al., 2000), além de inibir a síntese de quimiocinas que atuam
estimulando a migração de neutrófilos, tais como KC e MIP-1α (ALIBERTI et al.,
2001). Um exemplo interessante da atividade das quimiocinas na resposta a
patógenos foi observado na doença de Lyme, na qual existe um infiltrado
inflamatório no tecido cardíaco, caracterizando cardite, com intensa expressão da
quimiocina JE (RUDERMAN et al., 1995). Camundongos infectados pelo vírus
Coxsackie também apresentam infiltrado inflamatório no tecido cardíaco, o qual é
dependente das quimiocinas MIP-1α e MIP-1β já que camundongos deficientes
dos genes dessas quimiocinas não desenvolvem cardite (COOK et al., 1995;
SEBACH, 1995). Eotaxina, um potente quimioatraente para eosinófilos, foi
associada ao controle de infecções por helmintos (CULLEY et al., 2000).
Recentemente foi descrita uma proteína ligante de IL-8 em extratos de células de
diferentes espécies de carrapatos. Essa proteína é capaz de impedir a ligação de
IL-8 a seus receptores em granulócitos humanos, impedindo a sua migração frente
a um estímulo quimiotático (HAJNICKÁ et al., 2001). Contudo a função das
quimiocinas se seus receptores em animais infestados por carrapatos tem sido
pouco estudada e acreditamos que ambos podem estar envolvidos na modulação
da resposta imune do hospedeiro pelos carrapatos.
Além da atuação das citocinas e quimiocinas, não menos importante é o
papel de moléculas de adesão na modulação da migração de células para a lesão
7
da fixação dos carrapatos. Essas moléculas pertencem a uma família de proteínas
envolvidas no recrutamento de células circulantes para o foco inflamatório. Um
dos poucos trabalhos publicados sobre moléculas de adesão na pele de
camundongos infestados com carrapatos mostrou que há aumento da expressão
de molécula de adesão intercelular (ICAM-1) como conseqüência da produção de
citocinas TNF-α e IL-1, resultando na migração de linfócitos para o local (MBOW
et al., 1994).
Baseado no acima exposto, no presente estudo serão investigados os
mecanismos pelos quais os carrapatos modulam a resposta imune de seus
hospedeiros. Para tal, será caracterizada a cinética da produção de citocinas,
moléculas de adesão, quimiocinas e seus receptores na pele de camundongos
infestados com carrapatos. Os resultados obtidos contribuirão com um melhor
entendimento da interação carrapato-hospedeiro, como também poderão auxiliar
no desenvolvimento de formas alternativas ao uso de produtos tóxicos para o
controle de ácaros.
III- Objetivos
GERAL
1. Contribuir para a compreensão dos mecanismos envolvidos nas relações
carrapato-hospedeiro os quais possam eventualmente auxiliar no controle de
carrapatos e dos patógenos transmitidos por eles.
ESPECÍFICOS
1. Determinar a cinética de expressão das citocinas: IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, IFN-γ,
TGF-β, na pele e linfonodos de camundongos BALB/c infestados ou não com
carrapatos.
2. Determinar a cinética de expressão das quimiocinas: MIP-1α, MIP-1β, RANTES,
MIG, KC, Eotaxina e dos receptores de quimiocinas: CCR3, CCR4, CCR5,
CXCR2, CXCR3 na pele de camundongos BALB/c infestados ou não com
carrapatos.
3. Determinar a cinética de expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e LFA-1
na pele e do fator de transcrição STAT-6 na pele e nos linfonodos de
camundongos BALB/c infestados ou não com carrapatos.
III - Material e Métodos
1. Manutenção da Colônia de Carrapatos
Apesar da colônia de carrapatos R. sanguineus já estar implantada em
nosso laboratório houve necessidade de ampliar a colônia, pois o número de
pesquisadores envolvidos com a pesquisa sobre os carrapatos aumentou muito
no último ano. Para tal, carrapatas fêmeas ingurgitadas foram obtidas de cães
saudáveis e colocadas individualmente para oviposição em recipientes plásticos,
com tampa de encaixe por pressão, perfurada de forma a permitir ventilação.
Após um período de 15 dias, as fêmeas foram retiradas e desprezadas.
Aguardou-se a eclosão completa das larvas (cerca de 22 dias).
Para a obtenção de todos os estágios de vida do carrapato, larvas e ninfas
não ingurgitadas foram alimentadas em cobaias nunca antes infestadas, dentro
de câmaras de alimentação fixas sobre o dorso dos animais com uma cola atóxica
(Britannia Adhesives P4104 Latex, UK). As infestações em cobaias foram
realizadas a cada quinze dias, sendo doze cobaias infestadas de cada vez, sendo
seis com larvas e seis com ninfas.
A infestação em cães, para obtenção de fêmeas de carrapatos ingurgitadas
a fim de obter novas larvas foi realizada mensalmente. Cães (fêmeas)
provenientes do biotério central da FMRP, em bom estado de saúde foram
selecionados para as infestações. Colocou-se quatro câmaras de alimentação por
animal, sendo que em cada uma eram liberados cerca de 120 carrapatos. Após o
período de ingurgitamento das fêmeas cerca de 20 fêmeas eram colocadas para
ovipor, sendo os carrapatos machos descartados. O restante dos carrapatos
ingurgitados eram utilizados para a produção de saliva que era empregada em
outros projetos. A cada três meses eram inseridas novas fêmeas de carrapatos
obtidas de cães saudáveis na colônia no intuito de preservar a variabilidade
genética dos carrapatos.
A colônia está sendo mantida numa estufa incubadora para B.O.D
(demanda bioquímica de oxigênio) Te-401, umidificada a uma temperatura de
28
o
C. Os vários estágios dos carrapatos são mantidos em potes plásticos, com
diâmetro de 3 cm e altura de 5 cm, com a tampa perfurada, de forma a permitir a
ventilação dos frascos. As câmaras de alimentação foram confeccionadas de
acordo com Bechara et al. (1995), com pequenas alterações.
2. Infestações em Camundongos
As infestações foram conduzidas de forma controlada dentro de câmaras
de alimentação, fixas com cola atóxica ao dorso dos camundongos (Britannia
Adhesives P4104 Latex, UK). As câmaras foram confeccionadas a partir de tubos
de plástico transparente com tampa rosqueável (com diâmetro de 0,5 cm). O
fundo dos tubos foi removido de forma que ficaram com um formato tubular de
cerca de 1 cm de comprimento. Ao fundo foi então colado uma peça de borracha
fina de 1 a 2 mm de espessura, cortada em formato de disco (diâmetro de 1,5 cm)
com uma janela central de diâmetro interno equivalente ao do tubo. Sob a peça de
borracha foi colado um tecido de algodão, de dimensões e formato iguais ao disco
de borracha.
Para este estudo foram utilizados camundongos BALB/c não infestados
(normais), sham infestados (submetidos à colagem da câmara de alimentação,
entretanto sem contato com carrapatos) e infestados. Cada grupo infestado e
sham infestado foi composto de quatro animais para os tempos de 24 horas, três
dias e seis dias contados a partir da fixação dos carrapatos, ou no caso dos
animais sham infestados, contados a partir de 24 horas após a colocação das
câmaras e o grupo que não recebeu tratamento (normal) composto apenas por
quatro animais.
Os animais que receberam tratamento foram divididos em três grupos. Um
grupo que foi infestado uma vez e dois grupos três vezes infestados (com intervalo
de 25-30 dias entre cada infestação), sendo que os dois primeiros continham vinte
e quatro animais cada e o terceiro era composto por quatro animais. O material
colhido dos animais dos dois primeiros grupos foi utilizado na extração de RNA e
análise de expressão gênica por PCR em tempo real e o material do terceiro grupo
utilizado para reações de imunohistoquímica.
Para as infestações foram liberados quatro fêmeas e dois machos de
carrapatos R. sanguineus adultos dentro de cada câmara. Os caracteres
morfológicos observados para a diferenciação sexual dos carrapatos foram
baseados em Freitas et al. (1978).
3. Coleta das Amostras de Tecido
Os fragmentos de pele do local da fixação dos carrapatos e os linfonodos
que drenam a região próxima ao local de colocação da câmara de alimentação
dos carrapatos (axilares) foram coletados.
O ponto de coleta da pele dos animais infestados foi estipulado seguindo os
seguintes critérios: (1) a pele foi coletada no local de inserção da peça bucal dos
carrapatos (2) o tamanho da área coletada é referente a 2mm de pele à esquerda
e à direita, acima e abaixo do ponto de inserção da peça bucal do parasita. No
caso dos animais Sham, a pele foi coletada no ponto central do interior da câmara,
uma vez que estes animais não entraram em contato com o carrapato e, para os
animais normais, a pele foi coletada na região dorsal.
Os fragmentos de pele e os linfonodos foram coletados nos diversos
tempos de infestação, ou seja, 1, 3 e 6 dias após o início da infestação com
carrapatos ou após a colocação das câmaras (animais sham).
As amostras coletadas com o intuito de se determinar a cinética de
expressão gênica foram imersas em Trizol para extração de RNA. O material
destinado para as reações de imunohistoquímica foi embebido em meio de
congelamento (Tissue-Tek O.C.T., Torrance, USA), congelado em nitrogênio
líquido e conservado a temperatura de –70º C para posterior identificação dos
tipos celulares presentes no local de fixação dos carrapatos.
4. Extração de RNA
A extração de RNA total de pele e linfonodos de camundongos foi realizada
utilizando Trizol e o material foi processado conforme a metodologia do fabricante
(Invitrogen, Life Technology, Carlsbad, USA).
Cada amostra foi colocada em um tubo tipo “eppendorf” de 2 ml de fundo
chato, contendo 0,5 ml de Trizol. O material foi triturado com o auxílio de um
homogeinizador de tecido Ultra-Turrax Tw8 (Ika ® - Werke, GmbH & Co., GE) cuja
haste havia sido autoclavada e tratada com RNase away (Invitrogen, Molecular
Bioproducts, Carlsbad, USA) antes de ser utilizada, sendo em seguida adicionado
mais 0,5 ml de Trizol ao tubo. Em seguida, o material foi congelado a –70°C até ser
utilizado.
Após o material ser descongelado, realizou-se a extração do RNA total do
tecido utilizando kit de extração de RNA (Promega ®, Madison, WI), seguindo o
protocolo do fabricante, com algumas alterações. Brevemente: adicionou-se 200 µl
de clorofórmio (Sigma) para cada 1 ml da suspensão celular, obtida após o
trituramento do tecido. Após 15 minutos descansando a temperatura ambiente (T.A.)
a mistura foi centrifugada a 12000 g, por 10 minutos (T.A.). A solução transparente
do lisado (± 500 µl) foi transferida para um tubo novo, adicionado 200 µl de etanol
95%, cuidadosamente homogeneizado e esta solução transferida para a coluna de
afinidade de RNA. A solução foi centrifugada a 12000 g, por 1 minuto (T.A.) e em
seguida adicionado os tampões específicos do kit, conforme recomenda o fabricante,
intercalado por centrifugações de 1 minuto a 12000 g. As amostras foram eluídas da
coluna em 30 µl de água (livre de nucleases) colocada sobre a membrana.
Em seguida uma alíquota de 5 µl da suspensão final foi utilizada para
detecção da concentração de RNA/ µl nas amostras, a qual foi determinada
utilizando-se o aparelho GeneQuant (Pharmacia Amersham Biosciences, USA).
Finalmente separou-se 1 µg da amostra extraída para aplicar em um gel de
RNA, sendo o restante armazenado a –70º C, até a confecção do DNA
complementar.
5. Gel de RNA
Para verificar a integridade do RNA extraído e possível contaminação do
material com DNA genômico, 1 μg da amostra de RNA foi aplicada em gel de
agarose 1,5% para RNA. Esse gel foi confeccionado seguindo protocolo preconizado
por SAMBROOK et al. (1989) como descrito a seguir: 2,2 mg de agarose foi
adicionado em um erlemeyer contendo 100 ml de água mili-Q autoclavada duas
vezes. O erlemeyer foi aquecido até que a agarose se dissolvesse por completo na
água e então 24 ml de formaldeído 37% e 30 ml de MOPS 5x (21g de MOPS em
1000 ml de água DEPC) foram adicionados. A solução foi então colocada no suporte
da cuba de corrida (previamente tratada com NaOH 0,5 M por 30 minutos), sendo o
pente colocado sobre esta solução. Após o resfriamento da solução, retirou-se o
pente.
Antes de se aplicar as amostras no gel, o volume referente à concentração de
1 μg da amostra foi colocado em um eppendorf de volume 500 μl, juntamente com 2
μl de MOPS 5x, 3,5 μl de formaldeído, 1,0 μl de brometo de etídio (0,5 μl/ml) e
completou-se a reação com um volume de formamida suficiente para que o volume
final da reação fosse de 20 μl. A reação foi aquecida a 65°C por 15 minutos e
resfriada imediatamente em gelo. Foi adicionado 2 μl de azul de bromofenol (100
mg/ml) e a reação foi aplicada no gel de agarose submergido em tampão de corrida
MOPS. A cuba foi ligada a uma fonte de 80V, 115mA, 9W por 30 minutos. O gel foi
visualizado em luz UV e fotografado.
6. Reação de Transcriptase Reversa
A produção do DNA complementar (cDNA) foi obtida através de uma
reação de transcrição reversa, para tal, foram utilizados os seguintes reagentes:
enzima M-MVL transcriptase reversa (Promega Corporation, Madison, WI), dNTP,
Oligo dT e DTT (Gibco BRL, Life Technology, USA) e 1 μg de RNA da amostra, de
acordo com as especificações do fabricante. O cDNA foi sintetizado no
termociclador PTC-100 (MJ Research, Watertown, MA), sendo as condições da
reação: cinco minutos a 70° C e uma hora a 42° C, seguido de refrigeração à 4° C.
7. Reação de PCR em Tempo Real
A expressão dos genes analisados foi quantificada pela técnica de PCR em
tempo real, utilizando-se o sistema SYBR Green em um aparelho GeneAmp 7000
(Applied Biosystems – USA). Primers específicos para tal metodologia que foram
criados a partir das seqüências do mRNA dos genes alvos, com auxílio do
software Primer Express (Applied Biosystems - USA). A seqüência de cada par de
primers, assim como, a concentração utilizada e as propriedades de cada reação
(temperatura de anelamento, temperatura de dissociação e número de pares de
base por primer) encontram-se descritas na tabela 1. Previamente, as reações de
PCR em tempo real foram otimizadas com relação às concentrações ideais de
cada par de primers, de modo a maximizar a eficiência e a especificidade de
amplificação, exemplificada na figura 1.
Nas reações de PCR em tempo real foram utilizados 12,5 μl do reagente
SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems; que contém o fluorófuo SYBR
Green 1; a enzima polimerase Taq Gold; DNTPs com dUTP; o fluorófuo ROX,
utilizado como referência passiva para normalização dos níveis de fluorescência; e
os demais componentes do tampão já devidamente otimizados), 5μl da solução de
cDNA (sintetizado como descrito anteriormente), 5,5 μl de água Mili Q tratada com
DEPC e 1μl de cada par de primer, ou seja, 1μl da seqüência sense e anti-sense.
As reações foram submetidas ao protocolo de ciclos, seguindo as
orientações do fabricante em um aparelho GeneAmp 7000 (Applied Biosystems –
USA), brevemente descritos aqui: 2 min a 50ºC, 10 min a 95ºC e quarenta ciclos
de 30 segundos a 95º C, 30 segundos a 56º C e 1 minuto a 72°C. Nas reações
com o SYBR Green foi empregado um ciclo final de vinte minutos com
temperatura crescente de 60 a 95ºC para a obtenção de uma curva de
dissociação dos produtos da reação, utilizada para a análise da especificidade de
amplificação.
O sistema utilizado realiza as reações de amplificação e detecção e
quantifica as amostras através da análise do nível de fluorescência gerado pela
incorporação de nucleases fluorogênicas (SYBR Green1) aos produtos de
amplificação durante o curso da reação. Os resultados foram analisados com base
no valor de “cicle threshold” (CT) ou linha de corte, definido após a reação, sendo
este o ponto correspondente ao número de ciclos aonde a amplificação atinge um
dado limiar, que permite a análise quantitativa da expressão do gene avaliado;
exemplificado figura 2.
Todas as amostras também foram submetidas a reações para detecção de
RNA mensageiro para beta-actina, um gene de expressão constitutiva, utilizando
como controle positivo da reação de amplificação, assim como os níveis de
expressão de beta-actina foram utilizados para a normalização dos níveis de
expressão do gene alvo como indica o fabricante do aparelho GeneAmp 7000
(Applied Biosystems – USA) e descrito na literatura por LIVAK &SCHMITTGEN
(2001).
8. Reação de Imunohistoquímica
Para a identificação por imunohistoquímica de macrófagos/neutrófilos de
camundongos infestados por carrapatos foi utilizado o anticorpos monoclonal
primárioe anti-CD11b (anti-MAC-1, adquirido da R&D Systems, Inc (Minneapolis,
MN). Para a confirmação da produção das quimiocinas MIP-1α e MIP-1β foram
utilizados os seguintes anticorpos monoclonais primários: anti- MIP-1α e anti-MIP-
1β, (adquiridos da Santa Cruz). As amostras de pele e linfonodos, congelados em
meio de criopreservação (Tissue-Tek O.C.T., Torrance , USA), foram seccionadas
com uso de um criostato (Leica CM 1850), originando cortes de 5 μm de
espessura.
Cada biópsia da pele foi submetida a cortes seriados. A escolha do corte
para a realização da reação de imunohistoquímica seguiu os seguintes critérios,
descritos por SZABÓ & BECHARA (1999): (1) local de fixação da peça bucal do
carrapato, (2) presença do cone de cemento sobre a derme, (3) presença da
derme inflamada e (4) presença da epiderme inflamada, esquematizado na figura
3.
Após os cortes serem colocados nas lâminas, previamente preparadas com
polilisina 0,1%, eles foram fixados em acetona 100% por 10 minutos à –20
o
C e
secados à temperatura ambiente. Os cortes foram tratados com água oxigenada a
3% por 30 min, no escuro, para bloqueio da peroxidase endógena, lavados com
solução de PBS 1% (pH 7,2). As lavagens eram sempre em número de 3, com
intervalos de 2 minutos. O bloqueio da inespecificidade da reação foi feito com
solução contendo fonte de proteína: soro de coelho normal e/ou leite em pó
desnatado a 3% em água destilada, por 30 minutos. O anticorpo primário foi
adicionado e incubado "overnight" em câmara úmida. No dia seguinte, após a
estabilização dos cortes à temperatura ambiente por 30 minutos, o anticorpo
secundário biotinilado foi adicionado na diluição adequada por 30 minutos. Após
nova lavagem, a incubação seguinte foi realizada com o complexo ABC por 30
minutos. Finalmente, os sítios imunorreativos foram revelados com o substrato
diamino-benzidina (DAB). Os cortes foram então contra-corados com hematoxilina
e as lâminas montadas para análise em microscópio óptico. Os resultados foram
fotodocumentados utilizando uma câmara digital colorida de alta resolução
refrigerada 3.3 Megapixel com tecnologia FireWire U-V105C2 (Olympus) acoplada
ao microscópio óptico.
9. Análise Estatística dos Resultados
Para avaliar as diferenças de expressão gênica dos genes analisados entre
os grupos: normal, sham e uma e três vezes infestados nos diferentes períodos
observados foi utilizada a análise de variância one way ANOVA e o teste de Tukey
como pós-teste. Foram consideradas diferenças significativas quando P<0,05 (*
ou
+
) ou P<0,001 (** ou
++
).Os ensaios de imunohistoquímica foram realizados
com o intuito de confirmar a presença de macrófagos/neutrófilos (marcação para
CD11b
+
) e a produção das quimiocinas MIP-1α e MIP-1β “in situ”. Desta forma, por
se tratar de uma análise qualitativa, não foram empregados recursos estatísticos
para avaliação dos resultados obtidos.
Tabela 1. Seqüência dos primers, concentração utilizada e propriedades da reação
e Seqüência primer sense [ ] (μg/μl) tA(°C) tD(°C)
Seqüência primer anti-sense
Β −actina AGC TGC GTT TTA CAC CCT TT 0,15 56 75
AAG CCA TGC CAA TGT TGT CT
IL-4 CTG ACG GCA CAG AGC TAT TGA 0,2 56 84
TAT GCG AAG CAC CTT GGA AGC
IL-5 GAG GTT ACA GAC ATG CAC CAT T 0,2 56 79
TCA GTT GGT AAC ATG CAC AAA G
IL-10 TGG ACA ACA TAC TGC TAA CCG 0,1 56 78
GGA TCA TTT CCG ATA AGG CT
TGF-β GCT GAA CCA AGG AGA CGG AAT 0,1 56 80
GCT GAT CCC GTT GAT TTC CA
IL-12 AGC ACC AGC TTC TTC ATC AGG 0,2 56 83
GCG CTG GAT TCG AAC AAA G
IFN-γ GCA TCT TGG CTT TGC AGC T 0,15 56 81
CCT TTT TCG CCT TGC TGT TG
MIP-1α, TTC TGC TGA CAA GCT CAC CCT 0,1 56 83
ATG GCG CTG AGA AGA CTT GGT
MIP-1β, CCT GAC CAA AAG AGG CAG ACA 0,1 56 85
AGC AAG GAC GCT TCT CAG TGA
RANTES TTC CCT GTC ATC GCT TGC TCT 0,2 56 83
CGG ATG GAG ATG CCG ATT TT
MIG AAT TTC ATC ACG CCC TTG AGC 0,15 56 79
CAG CTG TTG TGC ATT GGA TAG C
KC CTT CCC TTG GAC ATT TTG TGT C 0,2 56 79
TTT GAA CGT CTC TGT CCC GAG
Eotaxina ATA TCA GCA CCA GTC GCC CA 0,1 56 78
TCA TGC CCC CCT TTT AAG ATG
CCR3 GCT CTC TGG ATT GAA GTG TGC A 0,15 56 80
AAG TAT CAC GTC CAC CAC CTG G
CCR4 CGA TTC CAA AGA TGA ATG CCA 0,2 56 79
TCC CCA AAT GCC TTG ATA CC
CCR5 TGC ACA AAG AGA CTT GAG GCA 0,15 56 84
AGT GGT TCT TCC CTG TTG GCA
CXCR2 TTC CTC CAC AGC TGC CTT AAC 0,15 56 77
ATC TTG AGA AGT CCA TGG CGA
CXCR3 AAC GTC AAG TGC TAG ATG CCT 0,15 56 78
TCT CGT TTT CCC CAT AAT CG
ICAM-1 TCG TGA TGG CAG CCT CTT ATG 0,15 56 77
TTT TAT GGC CTC CTC CTG AGC
LFA-1 TTT GCT GAA AGC TAG AGC ATG 0,2 56 80
TAA GCC ACG TTG TGT TTG C
STAT-6 ATG GGC TGA TCA TTG GCT TT 0,1 56 82
TGA CGT GTG CAA TGG TGA TG
[ ] (μg/μl): Concentração do primer utilizada na reação em μg/μl)
tA(°C): Temperatura de anelamento do primer tD(°C): Temperatura de dissociação do primer
IV- Resultados
Cinética de expressão de citocinas na pele de animais infestados por
carrapatos R. sanguineus
Uma vez que as citocinas atuam diretamente no processo de
diferenciação do padrão de resposta imune celular em diversas doenças,
decidiu-se investigar a cinética do padrão de expressão de algumas citocinas
durante uma infestação por carrapatos. Para isso, camundongos BALB/c
submetidos ao protocolo de infestação foram sacrificados em diferentes tempos
pós-fixação dos carrapatos, a pele do local coletada, o RNA total extraído e a
expressão das citocinas IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-β foi analisada por
PCR em tempo real (Figs. 4 a 6).
A pele dos camundongos sham (3x) mostrou um aumento na expressão
das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ e IL-12 em comparação com o grupo
infestado (3x) (Figs. 4A e B), sendo o pico da expressão para ambas as
citocinas com três dias de colocação da câmara. Os animais re-infestados
demonstraram significativa redução da expressão de IFN-γ e IL-12 (12,6 vezes
no dia 1 e 28,4 vezes no dia 3 para IFN-γ e 93,3 vezes para IL-12 no dia),
sendo p<0,001 quando comparados aos seus respectivos controles.
O inverso ocorreu com a expressão gênica de IL-4 (Fig. 5A). Isso é,
camundongos re-infestados com carrapatos, tanto nos tempos de 1 dia quanto
3 dias mostraram uma maior expressão de IL-4 que os controles (p<0,05 e
p<0,001 respectivamente). A expressão de IL-4, nos referidos tempos, também
foi estatisticamente maior no grupo re-infestado em relação ao grupo apenas
uma vez infestado (p<0,05 e p<0,001 respectivamente). Interessantemente, a
amostra de pele coletada 6 dias após início da terceira infestação já não
apresentava expressão de IL-4, sugerindo que essa citocina pode
desempenhar papel nos tempos iniciais da infestação com carrapatos, ou ainda
que essa expressão não é contínua.
A expressão de IL-5 estava reduzida em 14,7 vezes no tempo de seis
dias do grupo três vezes infestado em relação ao grupo sham (3x) (p<0,05; Fig.
5B).
As citocinas imunorreguladoras IL-10 e TGF-β não mostraram alteração
estatisticamente significativa na intensidade de expressão entre os diversos
grupos e tempos (Figs. 6A e B). Muito embora tenha sido observado uma
tendência de aumento de expressão de IL-10 no grupo de camundongos três
vezes infestado (tempo de 3 dias) em comparação ao seu controle sham (3x).
Cinética de expressão de quimiocinas e seus receptores na pele de
animais infestados por carrapatos R. sanguineus
As quimiocinas, citocinas quimioatraentes, e seus receptores possuem
um papel fundamental no tráfego de leucócitos para sítios inflamatórios.
Adicionalmente, recentemente tem sido mostrado que quimiocinas podem atuar
na ativação e diferenciação de diferentes tipos de células, fenômenos
essenciais para se montar uma resposta inflamatória/imune eficiente a
patógenos. Desta forma a compreensão da cinética de expressão dos genes
de quimiocinas e de seus receptores favorece o entendimento da formação
deste infiltrado. Assim, procurou-se caracterizar a cinética de expressão dos
genes de quimiocinas e de seus receptores durante a infestação com
carrapatos.
As quimiocinas pró-inflamatórias MIP-1α e MIP-1β mostraram uma
expressão significativamente elevada (aumento de 70,7 e 4,94 vezes
respectivamente) no tempo de 3 dias de fixação dos carrapatos do grupo re-
infestado em relação ao sham (3x) (p<0,05; Figs. 7A e B). A expressão
também foi maior quando comparado ao grupo uma vez infestado (p<0,05 para
MIP-1α e p<0,001 para MIP-1β).
RANTES e o seu receptor CCR5 (que também é receptor para as
quimiocinas MIP-1α e MIP-1β) não mostraram alteração na intensidade de
expressão entre os grupos nos tempos analisados (Figs. 8A e B).
A expressão de KC aumentou 9,2 vezes no tempo de 1 dia de fixação
dos carrapatos no grupo re-infestado quando comparado ao grupo sham (3x) e
ao grupo uma vez infestado, sendo p<0,05 para ambas comparações (Fig. 9A).
Já seu receptor, o CXCR2, demonstrou um aumento na expressão de 7,98
vezes no tempo de 6 dias de fixação dos carrapatos no grupo uma vez
infestado em relação ao grupo sham (1x) (p<0,001). Já aos 6 dias da re-
infestação com carrapatos se observou uma redução de 4,5 vezes na
expressão deste receptor comparado ao grupo uma vez infestado (p<0,05; Fig
9B).
A quimiocina MIG e seu receptor (CXCR3) não sofreram alterações
significantes na expressão durante uma ou três infestações por carrapatos
(Figs. 10A e B). O mesmo ocorreu para Eotaxina (Fig.11A). CCR3, receptor de
eotaxina, por sua vez, mostrou uma importante diminuição na sua expressão
(8,91 vezes) aos 6 dias pós-fixação dos carrapatos no grupo uma vez
infestado, quando comparado ao mesmo tempo do grupo sham (1x) (p<0,001;
Fig. 11B).
A mensagem relativa a expressão do receptor CCR4 mostrou seu nível
reduzido em 4,2 e 23,2 vezes nos grupos infestados (1 e 3x infestados) no
tempo de 1 dia pós-fixação dos carrapatos com relação aos seus respectivos
grupos sham (p<0,05 para 1x infestado e p<0,001 para 3x infestado; Fig 12).
Cinética de expressão das moléculas de adesão ICAM-1 e LFA-1 e do fator
de transcrição STAT-6 na pele de animais infestados por carrapatos R.
sanguineus
Procurando ampliar o estudo sobre os mecanismos de indução da
resposta inflamatória/imunológica a carrapatos na pele de camundongos
verificou-se ainda algumas moléculas de adesão, assim como o envolvimento
do fator de transcrição STAT-6, uma vez que este fator está intimamente
relacionado com a polarização da resposta imunológica para um padrão T
helper tipo 2 (TH2).
Apesar do grupo sham (3x) ter mostrado uma tendência de aumento de
expressão gênica para ICAM-1 e LFA-1, as diferenças para com o grupo de
camundongos três vezes infestado não foram consideradas significativas pelo
teste estatístico empregado (Figs. 13A e B).
A expressão do gene STAT-6 foi similar entre os tempos e grupos
analisados (Fig. 14).
Cinética de expressão de citocinas e do fator de transcrição STAT-6 no
linfonodo de animais infestados por carrapatos R. sanguineus
Observou-se um aumento na expressão de mensagem para IFN-γ e IL-
12 nos linfonodos, tanto nos camundongos sham (1x) como nos infestados
uma vez com carrapatos, no tempo de 1 dia em relação ao tempo de 3 dias;
sugerindo uma resposta à cola empregada para adesão da câmera de
alimentação (Figs. 15A e B).
A citocina de padrão Th2, IL-4, apresentou aumento de 6,1 vezes na sua
expressão no grupo que foi três vezes infestado no tempo de 6 dias em relação
ao grupo controle sham (3x) (p<0,05; Fig.16A). Já IL-5, outra citocina de
padrão Th2, não variou a sua expressão entre os grupos que foram infestados
em comparação aos respectivos controles (Fig. 16B).
A expressão de IL-10 e TGF-β ocorreu de forma muito similar (Figs. 17A
e B), sendo que ambas citocinas mostraram uma redução de expressão no
tempo de 1 dia do grupo infestado uma única vez em comparação ao tempo
controle (p<0,001 para IL-10 e p<0,05 para TGF-β).
Quanto ao fator de transcrição STAT-6, houve um aumento de sua
intensidade de expressão (aumento de 1,5 vezes) no grupo infestado uma vez
no tempo de 1 dia em relação ao grupo sham (1x) (p<0,05). Nos grupos
infestados três vezes com carrapatos a expressão deste fator de transcrição
não variou (Fig. 18).
Detecção de quimiocinas na pele de camundongos três vezes infestados
com carrapatos R. sanguineus
Devido à observação que as quimiocinas MIP-1α, MIP-1β e KC estavam
com sua expressão gênica aumentada na pele de camundongos infestados
três vezes com carrapatos, procurou-se verificar se estaria havendo produção
delas no local por imunohistoquímica. Para tal, camundongos BALB/c três
vezes infestados foram sacrificados aos 6 dias de fixação dos carrapatos e a
pele do local retirada e congelada em meio específico (Tissue-Tek O.C.T.,
Torrance, USA). Em seguida, os tecidos foram seccionados em criostato,
montadas as lâminas, e realizadas as reações de imunohistoquímica utilizando
anticorpos específicos para as quimiocinas MIP-1α, MIP-1β e KC.
Os resultados obtidos mostraram a presença de um grande número de
células com marcação para as quimiocinas MIP-1α e MIP-1β, tanto na
epiderme quanto na derme superficial e profunda da pele provinda de
camundongos infestados com carrapatos (Fig. 19). Apesar de inúmeras
tentativas, o ensaio de imunohistoquímica para KC não funcionou.
1
V – Discussão
Carrapatos necessitam permanecer em contacto direto com seus
hospedeiros por vários dias para completar seu repasto sanguíneo. Essa
associação íntima favorece o desenvolvimento de mecanismos de controle por
parte de seus hospedeiros. Sendo assim, o sucesso de sua sobrevivência como
espécie depende da capacidade dos mesmos em conter esses mecanismos.
A interação de carrapatos R. sanguineus- hospedeiros pode ser vista como
um exemplo de sucesso de parasitismo, pois o hospedeiro natural, o cão
doméstico, assim como camundongos (modelo experimental), não desenvolvem
resistência, nem mesmo após diversas infestações (THEIS & BUDWISER, 1974;
SZABÓ et al, 1995; FERREIRA & SILVA, 1998).
A infestação por carrapatos induz a resposta imune de hospedeiros
envolvendo células apresentadoras de antígenos, células T e B, anticorpos,
citocinas, moléculas do sistema complemento, basófilos, mastócitos, eosinófilos e
um grande número de moléculas bioativas (WIKEL, 1996; BROSSARD & WIKEL,
1997).
Uma vez que a resposta inflamatória e imunológica montada pelo
hospedeiro em resposta a carrapatos parece ser determinante quanto à proteção
(resistência) ou susceptibilidade, a identificação dos fatores envolvidos no
recrutamento seletivo de diferentes tipos celulares para o local de fixação e órgãos
linfóides periféricos, tais como quimiocinas e seus receptores, moléculas de
adesão, assim como as citocinas envolvidas no processo podem fornecer dados
2
para a compreensão dos motivos que levam alguns hospedeiros a permanecerem
susceptíveis a novas infestações.
No atual estudo realizou-se a análise da cinética de expressão de genes
relacionados à resposta imune /inflamatória induzida na pele e nos linfonodos de
camundongos durante infestações com carrapatos.
De um modo geral, nossa pesquisa verificou maior alteração na expressão
de genes relacionados à resposta imune /inflamatória na pele do que nos
linfonodos de camundongos BALB/c re-infestados por carrapatos R. sanguineus.
Inesperadamente a cola utilizada para fixação da câmara de alimentação
dos carrapatos induziu uma resposta imune nos camundongos, caracterizada por
um aumento significativo na expressão de genes de citocinas associadas com o
padrão Th1 (IFN-γ e IL-12). Essa elevação na expressão foi observada somente
nos animais sham (3x), sugerindo uma resposta imune adquirida a algum produto
da composição da cola. É importante ressaltar que o efeito “cola-câmara” apenas
interferiu na expressão de IFN-γ e IL-12 da pele.
Nossos resultados mostraram que o aumento de expressão de IFN-γ e IL-
12 pela cola (citocinas de um padrão Th1) foi inibido significativamente quando
foram adicionados carrapatos às câmaras de alimentação. Já foi demonstrado
que a saliva de carrapatos contém substâncias antiinflamatórias. Um extrato de
glândulas salivares (EGS) de carrapatos Dermacentor andersoni inibiu a produção
de IFN-γ por linfócitos T de camundongos (RAMACHNADRA & WIKEL; 1992;
BOWMAN; 1997). Assim como EGS de Aedes aegypti reduziu a capacidade de
3
produção de IFN-γ por linfócitos T estimulados com concanavalina-A (Con-A)
(CROSS et al., 1994b).
A diminuição da expressão de IFN-γ e IL-12 nos animais re-infestados foi
acompanhada de elevação na expressão do gene IL-4, tanto na pele como nos
linfonodos. Esses achados concordam com trabalhos prévios de nosso grupo
mostrando que células de linfonodos de camundongos C3H/HeJ re-infestados com
carrapatos R. sanguineus quando estimuladas in vitro com Con-A produzem
menores quantidades de IFN-γ e IL-12 e maiores quantidades de IL-4 que os
controles (FERREIRA & SILVA, 1999). Amostras de pele de camundongos
infestados com larvas de carrapatos I. ricinus também apresentaram aumentada
expressão de mRNA para IL-4 nos tempos correspondentes aos encontrados no
nosso estudo (BROSSARD & WIKEL, 2004).
IL-4 é uma citocina associada ao padrão Th2, que antagoniza os efeitos de
IFN-γ (ABBAS & LICHTMAN 5ª ed; 2005) e favorece a infecção por diversos
parasitas, tais como Leishmania major. Foi descrito um peptídeo vasodilatador
denominado maxadilan (MAX) na saliva de mosquitos transmissores de
Leishmania major que induz a produção de prostaglandina E2 (PGE
2
) e IL-6
(LERNER & SHOEMARKER; 1992). PGE
2
pode pré-sensibilizar células T naives
para síntese de IL-4, IL-10 e IL-13, e níveis baixos de IL-2, IFN-γ (DEMEURE et
al., 1997; HARRIS et al., 2002). Considerando que já foi demonstrado que a saliva
de diversas espécies de carrapatos possui PGE
2
(RIBEIRO et al.,1985 e 1988), e
que a saliva de carrapatos R. sanguineus contém 19-26 ng/ml of PGE
2
(CAVASSANI et al., 2005), esta pode estar aumentando a expressão de IL-4 na
4
pele e linfonodos de camundongos infestados. No entanto, possivelmente outros
fatores devem estar implicados, pois foi demonstrado que a adição de PGE
2
sintética, numa concentração 38 vezes maior que a existente nos ensaios de
cultura celular com saliva, induziu apenas uma inibição parcial de proliferação
celular induzida com Con-A (redução de 17,1% em comparação com 82,6%
induzida pela saliva) (FERREIRA & SILVA, 1998).
Outra citocina que pode auxiliar no controle da expressão de IFN-γ e IL-12 é
IL-10 (ABBAS & LICHTMAN, 5ª ed., 2005), que apesar de não ter significado
estatístico, mostrou tendência de aumento de expressão na pele, com pico aos
três dias no grupo re-infestado, juntamente com o pico de mRNA para IL-4. A
produção de IL-10 por queratinócitos de camundongos é capaz de inibir a
produção de IFN-γ pelas células T em reações de hipersensibilidade (UCHI et al.,
2000). O mesmo ocorre em infecções por L. major, onde a produção de IL-10 na
pele regula negativamente a produção de IFN-γ (MBOW et al. 1998).
Desta forma, substâncias antiinflamatórias da saliva dos carrapatos
associadas à indução da expressão de IL-4 e IL-10 na pele dos animais re-
infestados podem estar inibindo a expressão das citocinas IFN-γ e IL-12, e assim
atuarem de forma a conter um possível ambiente inflamatório produzido pelo
infiltrado celular presente no sítio da fixação dos carrapatos. De fato, a despeito
de ser observado um acúmulo de neutrófilos e eosinófilos na lesão de
alimentação, não se visualizou destruição tecidual (FERREIRA et al., 2003) e foi
descrito que saliva de carrapatos R. sanguineus pode inibir a função de neutrófilos
in vitro (INOKUMA et al., 1997).
5
A cola empregada para a fixação da câmara também aumentou mRNA para
IL-5 no grupo sham (1x) e (3x), sendo esse aumento controlado pela presença dos
carrapatos na terceira infestação, tempo de 6 dias. IL-5 pertence a um perfil Th2
de citocinas juntamente com IL-3 e GM-CSF, e está envolvida na proliferação,
diferenciação, maturação e migração de eosinófilos (LAMPINEN et al., 2004). Foi
descrito que camundongos transgênicos para IL-5 demonstram eosinofilia e
infiltrado eosinofílico em vários órgãos (TOMINAGA et al., 1991). Já com relação a
carrapatos, o acúmulo de eosinófilos é freqüente no sítio de fixação de diferentes
espécies de carrapatos, principalmente em espécies hospedeiros que
desenvolvem resistência (MBOW et al., 1994; SZABÓ e BECHARA, 1999). Por
outro lado, camundongos infestados com carrapatos R. sanguineus não mostram
um infiltrado significativo de eosinófilos na pele, nem após três infestações
sucessivas (FERREIRA et al., 2003). Talvez essa falta de eosinófilos esteja
relacionada com pouca expressão gênica para IL-5 demonstrada em nosso
trabalho.
Outra molécula relacionada com migração de eosinófilos é Eotaxina, que se
liga ao receptor CCR3 expresso em eosinófilos, e também presente em basófilos e
células T do padrão Th2 (FORSSMANN et al., 1997; SALLUSTO et al., 1997).
Sendo assim, Eotaxina freqüentemente está presente em respostas Th2 como
reações alérgicas, sendo sua produção induzida por histamina provinda de
mastócitos (GOW et al., 2004).
Dado que trabalhos vêm demonstrando que infestações por carrapatos em
hospedeiros susceptíveis geralmente induzem um padrão de resposta Th2
(GANAPANO et al., 1995, 1996; FERREIRA & SILVA, 1998, 1999) era de se
6
esperar um aumento na expressão de mRNA para Eotaxina nos grupos de
camundongos infestados, o que não ocorreu. Essa aparente contradição pode ser
explicada pela presença de substâncias anti-histamínicas no EGS de carrapatos
R. sanguineus (CHINERY et al.,1997). Nesse caso a expressão de Eotaxina
poderia estar sendo bloqueada pela ação da histamina. Adicionalmente, o receptor
de Eotaxina, CCR3, que está expresso na superfície de eosinófilos, mostrou
reduzida e expressão no tempo de 1 dia pós fixação dos carrapatos no grupo uma
vez infestado. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que carrapatos
tentem minimizar a presença de eosinófilos em seu sítio de fixação através da
inibição de IL-5, Eotaxina e receptores CCR3.
A diferenciação de células T numa subpopulação Th2 estimulada por
antígenos é dependente de IL-4, que se dá pela ativação de STAT-6, um fator de
transcrição que estimula o desenvolvimento de Th2. Nossos resultados mostram
que há um aumento na expressão de STAT-6 nas células dos linfonodos do grupo
infestado (1X) no tempo de 1 dia após a fixação dos carrapatos. Já no grupo re-
infestado, STAT-6 não foi alterado pela presença dos carrapatos. Este aumento
inicial na expressão de STAT-6 possivelmente pode estar modulando o perfil das
citocinas produzidas durante a primeira infestação. As principais fontes produtoras
de IL-4 são células Th2 já diferenciadas e mastócitos, contudo a expressão de IL-4
não foi significativa no grupo re-infestado (que, teoricamente poderia ter células T
específicas polarizadas para algum padrão). Intrigante é o fato de que na pele dos
animais re-infestados, onde a expressão de IL-4 está elevada, STAT-6 não estava
expresso. Como então ocorreria a expressão da citocina do padrão Th2, IL-4, sem
que a via de STAT-6 tenha sido ativada?
7
Um modelo de infecção de padrão Th2 bem estabelecido é a infecção pelo
helminto Schistosoma mansoni, que induz uma forte resposta Th2, com a
produção de elevados níveis das citocinas IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, através da
ativação da via de STAT-6. Interessantemente, quando animais deficientes para o
receptor de IL-4 e para o fator STAT-6 foram infectados por S. mansoni, estes
animais foram capazes de diferenciar células T naives em células T efetoras Th2
produtoras de IL-4, sugerindo a existência de outras vias de sinalização
(JANKOVIC et al., 2000).
Nosso grupo realizou sucessivas infestações com carrapatos R. sanguineus
em camundongos deficientes de STAT-6 (“knockouts”) com o objetivo de verificar
a resistência dos animais à fixação dos carrapatos, porém nenhum dos
parâmetros associados à resistência (aumento no tempo para iniciar a fixação,
diminuição do período de fixação e redução do peso de ingurgitamento das
fêmeas) foram observados (resultados não mostrados). É provável que a indução
da expressão de IL-4 na pele e nos linfonodos dos animais re-infestados, de fato,
não ocorra via STAT-6, e sim por uma via alternativa, ainda não descrita.
Juntamente com a Eotaxina previamente discutida, diversas quimiocinas
desempenham inúmeras atividades, dentre as quais mediar o tráfego de
leucócitos durante a homeostasia e inflamação, assim como realizar a ponte entre
a imunidade inata e adaptativa. Juntamente a moléculas de adesão, tais como
integrinas e selectinas, quimiocinas e seus receptores participam de uma
complexa rede molecular que facilita a migração de tipos celulares específicos
para dentro e para fora de tecidos. Importante também é seu papel na
angiogênese, diferenciação e maturação celular, cicatrização, desenvolvimento de
8
tecidos linfóides, assim como na indução de respostas imunes associadas ao
padrão Th1 e Th2 (ONO et al., 2003).
Avaliando a expressão das quimiocinas MIP-1α e MIP-1β na pele de
camundongos re-infestados evidenciou-se elevada expressão de mRNA para
ambas quimiocinas aos três dias pós fixação dos carrapatos. Esse aumento foi
confirmado ao se detectar, por imunohistoquímica, um grande número de células
marcadas para as proteínas MIP-1α e MIP-1β na derme e epiderme desses
animais.
MIP-1α e MIP-1β exercem importante função na resposta inflamatória na
pele e são responsáveis por atrair diversas células inflamatórias para o local. Foi
visto que camundongos C3H/HeN e BALB/c desafiados com o antígeno
dinitrofluorobenzeno (DNFB), tem um aumento MIP-1α e MIP-1β na pele são
responsáveis respectivamente pela atração de mastócitos e de células T para o
local (WANG et al., 1998). Um estudo mostrou que a inoculação intradérmica de
MIP-1α humano na pele de indivíduos saudáveis resultou na migração de
neutrófilos para o local (LEE et al. 2000). No modelo R. sanguineus-camundongos
também se observou aumento de neutrófilos na pele de animais re-infestados
(FERREIRA et al., 2003). Adicionalmente, observamos um acúmulo de células
marcadas para CD11b (marcador de macrófagos e neutrófilos) em nosso atual
estudo (resultados não mostrados). Em conjunto, esses achados sugerem o
envolvimento de MIP-1α e MIP-1β na formação do infiltrado celular presente no
sítio de fixação dos carrapatos.
9
Existem dois receptores para as quimiocinas MIP-1α e MIP-1β, são eles:
CCR5 e CCR1 comumente expressos na superfície de macrófagos, células T e
neutrófilos (MACKAY, 2001; PEASE & WILLIAMS, 2006). Uma vez que
detectamos muitas células marcadas para as quimiocinas MIP-1α e MIP-1β na
pele dos animais re-infestados, e por já ter sido descrito que o infiltrado é
predominantemente composto por neutrófilos (FERREIRA et al., 2003), buscamos
analisar a expressão de um dos receptores, o CCR5. Contudo, a expressão deste
não variou entre os grupos sham e infestados.
Em um estudo realizado sobre a migração de neutrófilos, para a pele de
indivíduos, frente ao estímulo MIP-1α, verificou-se que estes não expressavam o
receptor CCR5, mas expressavam CCR1 constitutivamente (LEE et al. 2000).
Dessa forma, a migração celular para o local da picada do carrapato pode se dar
pela expressão de CCR1 na superfície dos neutrófilos. Seria interessante ter
avaliado a expressão do gene para este receptor, contudo optamos por analisar a
expressão de CCR5, uma vez que este é descrito na literatura como sendo o
principal receptor de MIP-1α e MIP-1β.
KC é uma quimiocina produzida pelos queratinócitos da pele, que exerce
uma potente atração para neutrófilos (UCHI et al.; 2000), como também para
basófilos, células T e eosinófilos (HAJNICKÁ et al., 2004). A expressão de KC
estava aumentada na pele no tempo de 1 dia do grupo re-infestado. Isso concorda
com trabalhos do nosso grupo mostram que animais susceptíveis ao carrapato R.
sanguineus, quando re-infestados, têm um aumento no número de neutrófilos no
local de fixação (SZABÓ & BECHARA, 1999; FERREIRA et al., 2003). Por outro
10
lado, pacientes que desenvolveram uma resposta inflamatória sistêmica à picada
de carrapatos do gênero Amblyomma mostraram um aumento dos níveis
plasmáticos de RANTES, MIP-1α, IL-8 (citocina correspondente ao KC de
camundongos), sendo que com o passar do tempo estes níveis diminuíam (FENG
et al., 2000; JENSENIUS et al., 2003). Os autores discutem que o aumento da
produção destas quimiocinas provavelmente seria responsável pela resposta
inflamatória inicial causada pelos carrapatos (JENSENIUS et al., 2003). Foi
demonstrado ainda, que a saliva e extrato de glândula salivar (EGS) de fêmeas de
carrapatos Dermacentor reticulatus ou Ixodes ricinus alimentadas por 5 dias
possuem uma proteína ligante de IL-8 humana (HAJNICKÁ et al., 2004).
Nosso trabalho mostrou que durante as primeiras 24 horas de fixação dos
carrapatos R. sanguineus há aumento da expressão de KC na pele, que
juntamente com o aumento de MIP-1α e MIP-1β, poderia estar induzindo um
processo inflamatório com a participação de neutrófilos. O fato de KC estar
diminuído nos outros períodos avaliados pode estar ocorrendo pela atividade
inibitória da saliva de carrapatos demonstrada por HAJNICKÁ et al. (2004).
Um receptor de quimiocina constitutivamente expresso em células Th2 e T
de memória que fazem migração para a pele é o CCR4 (BAEKKEVOLD et al.,
2005). Esse receptor mostrou estar com sua expressão reduzida durante a
primeira e terceira infestação em relação ao grupo sham, logo após 1 dia de
fixação dos carrapatos. Uma explicação para o fenômeno observado poderia ser
que a saliva dos carrapatos estaria modulando negativamente o mRNA para
CCR4 no intuito de impedir que células T efetoras e de memória cheguem ao
11
local. Porém existem outras vias pelas quais células T podem migrar para a pele.
De fato, foi demonstrado que células T são capazes de migrar para a pele
inflamada, não somente pela expressão de CCR4, mas também pela interação de
um carboidrato ligante presente na sua superfície (CLA- antígeno de linfócitos
cutâneos) e a E-Selectina, altamente expressa no endotélio dos vasos da pele
(BIEDERMANN et al., 2002).
Outras moléculas que poderiam estar relacionadas com a migração de
células T para a pele são ICAM-1 e LFA-1, que não se mostraram alteradas
durante as infestações com carrapatos. Esses resultados concordam com a
hipótese que a migração dessas células para pele possa estar ocorrendo via CLA-
E-Selectina.
Na primeira infestação, a saliva dos carrapatos não estimulou intensamente
a resposta imune do hospedeiro, pois não houve um aumento significativo na
expressão dos genes estudados. Já após várias infestações, a saliva dos
carrapatos foi capaz de modular a resposta imune do hospedeiro para o padrão
Th2, induzindo a expressão de IL-4 e IL-10 na pele, controlando a inflamação
local, o que favorece a fixação e alimentação dos parasitas. Por outro lado, o
hospedeiro foi capaz de responder ao estímulo do parasita produzindo
quimiocinas tais como MIP-1α, MIP-1β e KC, que exercem função quimioatraente
para os neutrófilos (células CD11b
+
), que passam a se acumular no sítio de
fixação dos carrapatos.
Os resultados obtidos neste estudo permitem uma melhor compreensão da
interação parasita-hospedeiro e dos fatores que garantem ao parasita o controle
12
da resposta imunológica do hospedeiro, a fim de favorecer a sua sobrevivência. O
conhecimento gerado a partir do nosso estudo fornece base para futuras
pesquisas sobre o planejamento e desenvolvimento de novas estratégias de
controle de carrapatos.
VI- Conclusões
1 - Carrapatos R. sanguineus modulam a resposta imune do hospedeiro
susceptível para o padrão Th2, através da indução da expressão de IL-4, e são
capazes de conter a inflamação local inibindo a expressão das citocinas
inflamatórias IFN-γ e IL-12, favorecendo assim a sua fixação e alimentação.
2 - A produção de IL-4 não se dá pela via de sinalização de STAT-6 e
provavelmente ocorre por uma via alternativa, ainda não descrita.
3 - A saliva dos carrapatos inibem a expressão de mRNA de CCR4 nos
grupos 1 e 3 vezes infestados, provavelmente no intuito de impedir a migração de
células T de memória para o local, e não alteram a expressão das moléculas de
adesão ICAM-1 e LFA-1 também envolvidas no processo de migração celular.
4 – O hospedeiro é capaz de responder a injuria causada pelo parasita
através da produção das quimiocinas MIP-1α e MIP-1β, que juntamente com o
aumento da expressão de KC, coordenam a migração de células CD11b
+
para o
local.
1
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A1: 0,2
A1: 0,2
μ
μ
g
g
A2: 0,15
A2: 0,15
μ
μ
g
g
A3: 0,1
A3: 0,1
μ
μ
g
g
A4:CN
A4:CN
Amplifica
Amplifica
ç
ç
ão espec
ão espec
í
í
fica
fica
Amplifica
Amplifica
ç
ç
ão inespec
ão inespec
í
í
fica
fica
Primer
Primer
MIP
MIP
-
-
1
1
α
α
Figura 1: Exemplo de análise da curva de dissociação para determinação da especificidade
da reação de amplificação através de PCR em tempo real. A especificidade da reação de
amplificação foi analisada através da curva de dissociação, comparando os picos obtidos da
dissociação do produto amplificado à temperatura de dissociação (TD) do fragmento de
amplificação esperado (nesse exemplo, TD MIP-1α = 83ºC). A figura demonstra os resultados
obtidos pela dissociação uma mesma amostra na qual diferentes concentrações de primers (
sense
e anti-sense
) para MIP-1α foram utilizadas (A1: 0,2 μg; A2: 0,15 μg; A3: 0,1 μg; todas adicionadas
a 5 μl de cDNA da amostra teste) e de um controle negativo (A4: 0,1 μg+ água). Podemos
observar a gradativa redução dos produtos inespecíficos (identificados como os picos nas
temperaturas de 67ºC e 74ºC) e a detecção do produto específico (identificado pelo pico na
temperatura de 83ºC) com a diminuição da concentração de primers na reação.
TD=67
TD=67
º
º
C
C
TD=74
TD=74
º
º
C
C
TD=83
TD=83
º
º
C
C
A5 (CN)
A5 (CN)
A1
A1
A3
A3
A4
A4
A2
A2
Ct
Ct
=18,5
=18,5
Ct
Ct
=19,6
=19,6
Ct
Ct
=23,7
=23,7
Ct
Ct
=24,8
=24,8
Ct
Ct
=ND
=ND
Fase exponencial
Fase exponencial
Fase de platô
Fase de platô
Fase linear
Fase linear
Ct
Ct
Figura 2: Análise quantitativa da expressão de mRNA através de PCR em tempo real. O
sistema utilizado realiza as reações de amplificação e detecção, e quantifica as amostras
(termociclador GeneAmp 7000, associado ao Software ABI Prism, Applied Biosystems - USA)
através da análise do nível de fluorescência gerado pela incorporação nucleases fluorogênicas
(SYBR Green 1) aos produtos de amplificação durante o curso da reação. Os resultados foram
analisados com base no valor de Ct (“cicle threshold” ou linha de corte), sendo este o ponto
correspondente ao número de ciclos aonde a amplificação das amostras atinge um limiar
(determinado entre o nível de fluorescência dos controles negativos e a fase de amplificação
exponencial das amostras) o que permite a análise quantitativa da expressão do fator avaliado. A
figura demonstra os resultados obtidos para a amplificação de 4 amostras (A1-4) e de um
controle negativo (A5); exemplificando as fases de amplificação, a determinação do Ct, assim
como os valores de Cts de cada uma das amostras.
(Figura cedida por SZABÓ & BECHARA, 1999)
2
4
5
2
3
4
5
Figura 3: Histograma representativo do local da amostra da pele coletada de camundongos
BALB/c infestados por carrapatos
R. sanguineus
utilizados nas reações de
imunohistoquímica. A escolha do corte para a realização da reação de imunohistoquímica baseou-
se na identificação das regiões 1-4 representadas na figura e compreendendo apenas as zonas 1
e 2. (1) extrato córneo, (2) presença do cone de cemento sobre a epiderme, (3) local de fixação
da peça bucal do carrapato (4) da epiderme inflamada e (5) derme inflamada.
1
1
ZONA 1ZONA 3
ZONA 2ZONA 2
ZONA 3
ZONA 4
ZONA 4
0
10
20
30
40
50
60
70
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
**
**
IFN-
γ
(mRNA)
0
10
20
30
40
50
60
70
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
**
IL-12 (mRNA)
Figura 4: Expressão relativa de mRNA de IFN-γ e IL-12 na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de IFN-γ (A) e IL-12 (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina. *p< 0,05 e **p< 0,001 quando comparado ao grupo controle Sham
correspondente.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
2500
5000
7500
10000
12500
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
*
++
**
+
IL-4 (mRNA)
0
40
80
120
160
200
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
*
IL- 5 (mRNA)
Figura 5: Expressão relativa de mRNA de IL-4 e IL-5 na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de IL-4 (A) e IL-5 (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina. *p< 0,05 e **p< 0,001 quando comparado ao grupo controle Sham
correspondente e
+
p< 0,05 e
++
p< 0,001 quando comparado ao grupo infestado 1x
correspondente.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
IL-10 (mRNA)
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
TGF-
β
(mRNA)
Figura 6: Expressão relativa de mRNA de IL-10 e TGF-β na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de IL-10 (A) e TGF-β (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
*
+
MIP-1
α
(mRNA)
0
25
50
75
100
125
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
*
++
MIP-1
β
(mRNA)
Figura 7: Expressão relativa de mRNA de MIP-1α e MIP-1β na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de MIP-1α (A) e MIP-1β (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina. *p< 0,05 quando comparado ao grupo controle Sham
correspondente e
+
p< 0,05 e
++
p< 0,001 quando comparado ao grupo infestado 1x
correspondente.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
1
2
3
4
5
RANTES (mRNA)
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
CCR5 (mRNA)
Figura 8: Expressão relativa de mRNA de RANTES e CCR5 na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de RANTES (A) e CCR5 (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
150000
300000
450000
600000
750000
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
+
*
KC (mRNA)
0
40
80
120
160
200
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
**
+
CXCR2 (mRNA)
Figura 9: Expressão relativa de mRNA de KC e CXCR2 na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de KC (A) e CXCR2 (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina. *p< 0,05 e **p< 0,001 quando comparado ao grupo controle Sham
correspondente e
+
p< 0,05 e quando comparado ao grupo infestado 1x correspondente.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
MIG (mRNA)
0
80
160
240
320
400
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
CXCR3 (mRNA)
Figura 10: Expressão relativa de mRNA de MIG e CXCR3 na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de MIG (A) e CXCR3 (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
200000
400000
600000
800000
1000000
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
Eotaxina (mRNA)
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
**
CCR3 (mRNA)
Figura 11: Expressão relativa de mRNA de Eotaxina e CCR3 na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de Eotaxina (A) e CCR3 (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina. **p< 0,001 quando comparado ao grupo controle Sham
correspondente.
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
**
*
CCR4 (mRNA)
Figura 12: Expressão relativa de mRNA de CCR4 na pele de camundongos infestados
por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos indicados,
sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de CCR4 determinados por PCR em
tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste estatístico One Way-
ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da média ± SEM da
intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene constitutivo beta-
actina. *p< 0,05 e **p< 0,001 quando comparado ao grupo controle Sham correspondente.
1 dia
3 dias
6 dias
0
25000
50000
75000
100000
125000
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
LFA-1 (mRNA)
Figura 13: Expressão relativa de mRNA de ICAM-1 e LFA-1 na pele de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos
indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de ICAM-1 (A) e LFA-1 (B)
determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste
estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da
média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene
constitutivo beta-actina.
1 dia
3 dias
6 dias
0
20000
40000
60000
80000
100000
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
ICAM-1 (mRNA)
A
B
0
1
2
3
4
5
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
STAT-6 (mRNA)
Figura 14: Expressão relativa de mRNA de STAT-6 na pele de camundongos infestados
por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus sanguineus
ou não (Sham). A pele do sítio de fixação dos carrapatos foi coletada nos tempos indicados,
sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de STAT-6 determinados por PCR em
tempo real. Os resultados obtidos foram comparados pelo teste estatístico One Way-
ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da média ± SEM da
intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene constitutivo beta-
actina.
1 dia
3 dias
6 dias
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
IFN-
γ
(mRNA)
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
IL-12 (mRNA)
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
Figura 15: Expressão relativa de mRNA de IFN-γ e IL-12 no linfonodo de
camundongos infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus sanguineus
ou não (Sham). O linfonodo drenante do sítio de fixação dos
carrapatos foi coletada nos tempos indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de
expressão de IFN-γ (A) e IL-12 (B) determinados por PCR em tempo real. Os resultados
obtidos foram comparados pelo teste estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste
de Tukey e representam os valores da média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA
do gene alvo normalizado pelo gene constitutivo beta-actina.
0
3
6
9
12
15
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
*
IL-4 (mRNA)
0
2
4
6
8
10
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
IL-5 (mRNA)
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
Figura 16: Expressão relativa de mRNA de IL-4 e IL-5 no linfonodo de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). O linfonodo drenante do sítio de fixação dos carrapatos foi
coletada nos tempos indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de IL-
4 (A) e IL-5 (B) determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram
comparados pelo teste estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e
representam os valores da média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo
normalizado pelo gene constitutivo beta-actina. *p< 0,05 quando comparado ao grupo
controle Sham correspondente.
0
1
2
3
4
5
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
**
IL-10 (mRNA)
0
1
2
3
4
5
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
*
TGF-
β
(mRNA)
1 dia
3 dias
6 dias
A
B
Figura 17: Expressão relativa de mRNA de IL-10 e TGF-β no linfonodo de
camundongos infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com
carrapatos
Rhipicephalus sanguineus
ou não (Sham). O linfonodo drenante do sítio de
fixação dos carrapatos foi coletado nos tempos indicados, sendo o RNA total extraído e os
níveis de expressão de IL-10 (A) e TGF-β (B) determinados por PCR em tempo real. Os
resultados obtidos foram comparados pelo teste estatístico One Way-ANOVA e em
seguida pelo teste de Tukey e representam os valores da média ± SEM da intensidade de
expressão de mRNA do gene alvo normalizado pelo gene constitutivo beta-actina. *p< 0,05
e **p< 0,001 quando comparado ao grupo controle Sham correspondente.
0
120000
240000
360000
480000
600000
Sham 1x
Sham 3x
Infestado 1x
Infestado 3x
STAT-6
*
1 dia
3 dias
6 dias
Figura 18: Expressão relativa de mRNA de STAT-6 no linfonodo de camundongos
infestados por carrapatos. Animais Balb/C foram infestados com carrapatos
Rhipicephalus
sanguineus
ou não (Sham). O linfonodo drenante do sítio de fixação dos carrapatos foi
coletado nos tempos indicados, sendo o RNA total extraído e os níveis de expressão de
STAT-6 determinados por PCR em tempo real. Os resultados obtidos foram comparados
pelo teste estatístico One Way-ANOVA e em seguida pelo teste de Tukey e representam os
valores da média ± SEM da intensidade de expressão de mRNA do gene alvo normalizado
pelo gene constitutivo beta-actina. *p< 0,05 quando comparado ao grupo controle Sham
correspondente.
Figura 19: Presença de células produtoras de MIP-1α e MIP-1β na pele de camundongos
três vezes infestados. Animais Balb/C foram três vezes infestados com carrapatos
Rhipicephalus sanguineus
, sendo sacrificados 6 dias após a fixação dos mesmos. Segmentos
de pele no local de fixação foram coletados e congelados em meio de criopreservação
(Tissue-Tek, O.C.T.). Cortes do tecido de 0,5 μm de espessura foram submetidos a reações
de imunohistoquímica com anticorpos específicos anti-MIP-1α e anti-MIP-1β. (A) células com
marcação para MIP-1α, (B) células com marcação para MIP-1β, (C) controle do anticorpo
primário. Objetiva 40x.
A
B
C
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