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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
POS-GRADUAÇÃO EM FISIOPATOLOGIA CLÍNICA E
EXPERIMENTAL - FISCLINEX
Aline Teixeira Silva Fagundes
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E
HOMEOSTASE GLICÊMICA E PAPEL DA
SINALIZAÇÃO DE LEPTINA EM RATOS
PROGRAMADOS PELA RESTRIÇÃO PROTÉICA
MATERNA NA LACTAÇÃO
Rio de Janeiro
2008
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Aline Teixeira Silva Fagundes
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E
HOMEOSTASE GLICÊMICA E PAPEL DA
SINALIZAÇÃO DE LEPTINA EM RATOS
PROGRAMADOS PELA RESTRIÇÃO PROTÉICA
MATERNA NA LACTAÇÃO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Fisiopatologia Clinica e Experimental
da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade do Estado do Rio de Janeiro
para obtenção do grau de Doutor em Ciências
Orientadora: Profª Patrícia Cristina Lisboa
Co-orientadora: Profª Magna Cottini da Fonseca Passos
Rio de Janeiro
2008
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CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/ BIBLIOTECA CB/A
F156 Fagundes, Aline Teixeira Silva. .
Avaliação da composição corporal e homeostase glicêmica e papel
da sinalização de leptina em ratos programados pela restrição protéica
materna na lactação / Aline Teixeira Silva Fagundes. – 2008.
x,82f. : il.
Orientador : Patrícia Cristina Lisboa.
Co-orientador : Magna Cottini da Fonseca Passos.
Tese (doutorado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro,
Faculdade de Ciências Médicas.
Bibliografia : f. 63-82.
1. Desnutrição - Teses. 2. Corpo - Composição - Teses. 3.
Metabolismo - Regulação - Teses. 4. Proteínas - Teses. 5. Tireóide –
Teses. I. Lisboa, Patrícia Cristina. II. Passos, Magna Cottini da
Fonseca. III. Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de
Ciências Médicas. IV. Título.
.
CDU 613.24
Aline Teixeira Silva Fagundes
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E HOMEOSTASE
GLICÊMICA E PAPEL DA SINALIZAÇÃO DE LEPTINA EM RATOS
PROGRAMADOS PELA RESTRIÇÃO PROTÉICA MATERNA NA
LACTAÇÃO
Aprovada em 04 de Agosto de 2008
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Fisiopatologia Clinica e Experimental da Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de
Janeiro para obtenção do grau de Doutor em Ciências
Drª. Patrícia Cristina Lisboa
Dep. de Ciências Fisiológicas do Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes
da UERJ (orientadora)
Drª. Magna Cottini da Fonseca Passos
Dep. de Nutrição Aplicada do Instituto de Nutrição da UERJ (co-orientadora)
Banca Examinadora:
Profª Raul Marcel González Garcia
Instituto de Ciências Biológicas da UFJF
Profª Vânia Maria Correa da Costa
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ
Profª Josely Correa Koury
Instituto de Nutrição da UERJ
Prof. Egberto Gaspar de Moura
Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da UERJ
Profª Patrícia Cristina Lisboa
Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes da UERJ
Rio de Janeiro
2008
DEDICATÓRIA
A Deus, por me permitir vivenciar este momento e
concluir mais uma etapa em minha vida
Aos meus pais, por serem a razão de minha existência
Ao meu irmão, meu fiel incentivador
Ao meu noivo Felipe, pelo amor, compreensão e paciência
Aos meus familiares e amigos, que, de alguma forma, contribuíram
para a concretização deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Patrícia Lisboa, pela confiança, paciência, dedicação,
incentivo, amizade e enorme colaboração, fundamentais para a conclusão deste
trabalho.
À minha co-orientadora, Magna Cottini da Fonseca Passos, também pela
confiança, amizade, orientação, tolerância e grande contribuição na elaboração deste
trabalho.
Ao Professor Egberto Gaspar de Moura, por confiar na minha pessoa e pela
revisão deste trabalho. Um referencial como chefe, pesquisador e professor.
Aos Professores Raul Garcia da UFJF e José Firmino do Lablip da UERJ pelas
dosagens realizadas.
À Coordenação de Pós-Graduação em Fisiopatologia, pela oportunidade
concedida na realização deste trabalho.
Ao Professor Alex Christian Manhães, pela manutenção da infra-estrutura do
Departamento de Fisiologia Endócrina, permitindo a execução deste trabalho.
Aos mestrandos do Laboratório: Gabriel, Juliana Gastão, Natália Lima, Paula
Trotta e Stephan; aos doutorandos Ananda Lages, Ísis Hara, Mabel Fraga e Mariana
Sarto; às mestres Aline Troina, Fernanda Toste, Luciane Pires e aos doutores Gustavo
Lopes, Isabela Bonomo, José Ricardo de Souza, Sheila Dutra, Patrícia Brito, pela
convivência amigável e pela ajuda nos momentos difíceis.
Às Amigas do laboratório Ana Paula Santos Silva e Elaine de Oliveira, pelo
apoio, compreensão, incentivo e sinceridade. Nunca esquecerei o que fizeram por mim!
Obrigada por tudo!
Aos alunos e ex-alunos de Iniciação Científica: Aline Rios, Ândria, Caroline,
Cíntia, Ellen, Illana, Ísis, Silvio e Ulisses, pois, sem eles, parte deste trabalho não teria
sido realizada.
A secretária do Fisclinex Amélia, por sua coloboração, empenho e eficiência em
todos os momentos.
Aos funcionários técnico-administrativos do Laboratório de Fisiologia Endócrina:
Andréa, Henrique e Lauciene, pela constante colaboração.
Ao bioterista Carlos Roberto, pelo extremo cuidado com os animais.
“Para alcançar a vitória, você deve colocar seu
talento no trabalho e seu gênio na sua vida.”
(Oscar Wilde)
RESUMO
FAGUNDES, Aline Teixeira Silva. Avaliação da composição corporal e homeostase
glicêmica e papel da sinalização de leptina em ratos programados pela restrição
protéica materna na lactação, 2008. Tese (Doutorado em ciências) - Faculdade de
Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
A restrição protéica neonatal causa baixo peso corporal, hipertireoidismo,
hipoinsulinemia, aumento de glicocorticóides e de catecolaminas nos animais aos 180
dias. Assim, estudamos nestes animais durante o seu desenvolvimento, a composição
corporal, lipídeos e proteínas no soro, além de alguns hormônios relacionados à
homeostase glicêmica. Ao nascimento, dividimos as ratas lactantes em: controle (C) –
alimentadas com ração comercial (23% de proteína) e RP – alimentadas com dieta
hipoprotéica (8% de proteína). Após o desmame, os filhotes receberam dieta comercial.
Os animais foram sacrificados em idades distintas (21, 90 e 80 dias). Os animais RP
apresentaram baixo massa corporal desde a lactação até 180 dias, menor massa de
gordura visceral e total (90 e 180 dias); menor conteúdo corporal de proteína e maior
água corporal aos 21 dias. A morfologia dos adipócitos viscerais e subcutâneos aos 180
dias mostrou menor área e perímetro. Observamos menor massa, comprimento e
diâmetro do fêmur em todas as idades estudadas. Detectamos maior conteúdo de
glicogênio hepático (21 dias) e muscular (180 dias). Aos 21 dias, a insulinemia foi
menor e a adiponectinemia foi maior. Aos 180 dias, detectamos menor insulina sérica e
glicemia. Em relação à função adrenal, verificamos maior concentração de
corticosterona sérica, maior conteúdo intra-adrenal e secreção in vitro de catecolaminas
aos 180 dias. A prole RP apresentou: menores concentrações de proteínas totais e
frações (21 dias), menor concentração de colesterol total (180 dias), maior
concentração de LDL-c (21 dias), menores concentrações de VLDL-c e triglicerídeos
(21 e 90 dias). Quanto à sinalização da leptina, observamos menor conteúdo de STAT3
no hipotálamo aos 180 dias. Na tireóide, estes animais apresentaram menor conteúdo
de Ob-Rb (21 dias) e a expressão de JAK2 foi maior aos 21 dias e menor aos 180 dias
de idade. Assim, a RP materna na lactação induz a uma desnutrição energético-
protéica, caracterizada por um prejuízo do anabolismo protéico dos filhotes, e após o
desmame, a prole apresenta menor adiposidade, sugerindo uma maior atividade
lipolítica, provavelmente causada pela ação de catecolaminas e glicocorticóides. Estes
animais parecem preservar a sensibilidade à insulina, que pode ser importante para o
controle glicêmico e para a função do tecido muscular. Além disso, apresentam uma
sinalização da leptina prejudicada no hipotálamo que parece indicar uma resistência a
este hormônio, apesar do baixo peso, enquanto na tireóide mostramos uma possível
regulação da via de sinalização de leptina pela função tireoideana.
Palavras-chave: Programação. Desnutrição. Composição Corporal. Metabolismo
Intermediário. Leptina.
ABSTRACT
Neonatal protein restriction (PR) causes lower body weight, hyperthyroidism,
hypoinsulinaemia, higher glucocorticoids and catecholamines in the adult rat offspring.
In this model, we studied the body composition, serum lipids and proteins, as well as,
some hormones related to glucose homeostasis in the offspring during development. At
birth, lactating rats were divided into: control (C) – fed a normal diet (23% protein) and
PR – fed a diet with 8% protein. After weaning, pups received normal diet. They were
killed at distinct ages until the 21, 90 and 180 days-old . PR rats presented lower body
weight since weaning until 180 days-old, lower visceral and fat mass (90
th
and 180
th
day), lower body protein and higher body water (21
st
day: +3%). At 180 days-old, the
visceral and subcutaneous adipocytes morphology showed lower area and perimeter.
Concerning the femur, we observed lower weight, length and width at all analized
periods. We detected higher liver (21 days-old) and muscle glycogen content (180 days-
old). At 21st day, insulinaemia was lower and adiponectinaemia was higher. At 180
th
day, we detected lower insulinaemia and glycaemia. Concerning adrenal function, we
verified higher serum corticosterone, adrenal catecholamines content and in vitro
secretion. PR offspring showed the following serum parameters: lower total protein
serum and fractions (21
st
day), lower total serum cholesterol (180
th
day), higher serum
LDL-c (21
st
day), lower serum VLDL-c and triglycerides (21
st
and 90
th
day). Regarding
the leptin signaling, we observed lower hypothalamic STAT3 content at 180
th
day. In
thyroid, these animals presented lower Ob-Rb content (21
st
day); JAK2 content was
higher at 21
st
day and lower at 180
th
day. Thus, maternal PR during lactation induces an
energy-protein malnutrition, characterized by an impairment of the pup’s protein
anabolism, and after weaning, the offspring showed lower central and total adiposity,
suggesting a higher lipolitic activity, probably caused by catecholamine and
glucocorticoid action. Perhaps, these animals preserve the insulin sensitivity that could
be important for the glicemic control and the muscle function. Furthermore, the PR
animals have a damage in the leptin signaling at hipothalamus, suggesting a leptin
resistance, despite of lower body weight, while at thyroid we showed a possible
regulation of leptin signaling by thyroid function.
Keywords: Programming. Malnutrition. Body Composition. Intermediary Metabolism.
Leptin.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ACh Acetilcolina
ACTH Hormônio adrenocortocotrófico
AgRP Proteína agouti
AKT Proteína quinase B
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
α-MSH
α-melanocortina
BSA Albumina bovina sérica
C Controle
CART Fator de transcrição regulado por anfetamina e cocaína
CLEP Controle Leptina
CRH Hormônio liberador de corticotropina
CT Colesterol total
D1 Iodotironina desiodase tipo 1
D2 Iodotironina desiodase tipo 2
DAB Diaminobenzidina
DBH
Dopamina β hidroxilase
DTT Dithiothreitol
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGTA Ácido tetraacético etileno glicol
ENDEF Estudo Nacional de Despesa Familiar
EPM Erro Padrão da Média
FAO Food and Agriculture Organization
FSH Hormônio folículo estimulante
GLUT4 Transportador de glicose tipo 4
GH Hormônio de crescimento
GPDm
α-glicerol fosfato desidrogenase mitocondrial
HCl Ácido clorídrico
HDL-c Lipoproteína de alta densidade
HOMA Homeostasis model assessment index
HTs Hormônios tireoideanos
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IGF-1 Fator do Crescimento do Tipo Insulina 1
IR Receptor de insulina
IRI Índice de resitência insulínica
IRS
Substrato do receptor de insulina
125I Radioisótopo de iodo
JAK Tirosina kinase janus kinase
KOH Hidróxido de potássio
L-Dopa Diidroxifenilalanina
LDL-c Lipoproteína de baixa densidade
LH Hormônio luteinizante
LPL Lipoproteína lípase
MCH Hormônio concentrador de melanina
MGV Massa de gordura visceral
mM Milimolar
NaF Fluoreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NIS Co-transportador de Na+/I+
NPY Neuropeptídeo Y
NT Neurotensina
Ob Gene da obesidade
Ob-R Receptor de leptina
ObRb Receptor de leptina de forma longa
PDE3B Fosfodiesterase 3B
PI3K Fosfatidilinositol 3-kinase
PKB Proteína Kinase B
PLC Fosfolipase C
PNDS Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da Mulher
POF Pesquisa de Orçamentos Familiares
POMC Pró-opiomelanocortina
PPARγ
Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
PRL Prolactina
PTH Paratormônio
RIE Radioimunoensaio
RNAm Ácido ribonucléico mensageiro
RP Restrição protéica
Rpm Rotações por minuto
SNC Sistema nervoso central
SOCS-3 Supressores de sinalização de citocinas 3
STAT Proteína de transdução de sinal e transcrição
T
3
3,5,3’- triiodotironina
T
4
3,5,3’,5’- tetraiodotironina (tiroxina)
TA Tecido adiposo branco
TAM Tecido adiposo marrom
TCA Ácido tricloroacético
TG Triglicerídeos
TGI Trato gastrointestinal
TH Tiroxina hidroxilase
TRH Hormônio liberador de tireotrofina
TSH Tireotrofina
T-TBS Tween - tris buffer saline
VLDL-c Lipoproteína de muito baixa densidade
WHO World Health Organization
SUMÁRIO
Página
INTRODUÇÃO
11
1. DESNUTRIÇÂO
11
2. PROGRAMAÇÃO METABÓLICA
14
3. LEPTINA
19
4. HORMÔNIOS QUE REGULAM A HOMEOSTASE GLICÊMICA
22
5. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO E HIPÓTESES
28
OBJETIVOS
30
METODOLOGIA
31
RESULTADOS
40
DISCUSSÃO
54
CONCLUSÕES
62
REFERÊNCIAS
63
11
Introdução
1. DESNUTRIÇÃO
As condições de saúde e nutrição de uma população constituem um reflexo de seu
consumo alimentar, principalmente para as crianças, cuja alimentação adequada é condição
fundamental para o pleno crescimento e desenvolvimento. O estado nutricional, representado
pelo equilíbrio entre o consumo alimentar e as necessidades metabólicas diárias específicas do
organismo, indica em que proporção as necessidades fisiológicas de nutrientes estão sendo
supridas para manter a composição e funções adequadas do organismo (Batista Filho & Rissin,
2003; Acuña & Cruz, 2004). Uma deficiência quantitativa e/ou qualitativa do consumo de
nutrientes constitui uma das causas imediatas mais significativas dos problemas de saúde e
nutrição (Sigulem et al, 2000). Sendo assim, a má nutrição contribui para aumento da morbi-
mortalidade (Acuña & Cruz, 2004).
A desnutrição é caracterizada por um desequilíbrio e/ou uma deficiência de nutrientes no
organismo. Tais desequilíbrios são freqüentemente produzidos pela deficiência relativa de
proteínas, carboidratos e gorduras como fontes de energia e micronutrientes, que cursam com
alterações fisiopatológicas que se traduzem em prejuízo funcional, danos bioquímicos e físicos.
Inicialmente ocorre perda de peso que, quando se torna crônica, é seguida pela parada no
crescimento (Gurmini et al, 2005). A desnutrição reflete prejuízo no crescimento, acumulado
durante o período pré e/ou pós-natal, por causa da má nutrição e saúde (Milman et al, 2005).
A desnutrição protéico-energética é a mais prevalente desordem nutricional entre
crianças de países em desenvolvimento. Estima-se que mais de 3,7 milhões de mortes
ocorridas nos anos 2000 são atribuídas à desnutrição (FAO, 2004).
A desnutrição protéica ocorre freqüentemente na gestação, lactação e até os 2 anos de
vida. Os fatores intercorrentes associados à desnutrição infantil são as inadequadas condições
de saúde, higiene e moradia (Romani & Lira, 2004; Rissin et al, 2006) sendo estes mais
freqüentes em países em desenvolvimento (Monteiro, 2003; Romani & Lira, 2004).
Um dos principais efeitos da desnutrição precoce é a alteração dos parâmetros
antropométricos, peso e estatura, considerados marcadores epidemiológicos de desnutrição
(Romani & Lira, 2004). A desnutrição também predispõe a várias complicações graves,
incluindo tendência à infecção, prejuízo na cicatrização de feridas, falência respiratória e
insuficiência cardíaca. Outros aspectos mais comprometedores referem-se à diminuição da
capacidade mental, ao retardo no desenvolvimento psicomotor, à diminuição do quociente de
12
inteligência e rendimento escolar e à redução da capacidade produtiva na idade adulta (Acuña
& Cruz, 2004, Romani & Lira, 2004; Milman et al, 2005; Mansur & Neto, 2006; Victora et al,
2008).
Apesar da desnutrição ainda ser freqüente no mundo, alguns estudos mostram uma
tendência para a mudança no panorama de sua prevalência. Estima-se que em todo o mundo,
a prevalência da desnutrição tenderá a diminuir de 26,5% em 1990 para 17,6% em 2015. Em
países desenvolvidos, a prevalência foi estimada a diminuir de 1,6% a 0,9%. Já nos países em
desenvolvimento estima-se que a desnutrição decline de 30,2% para 19,3%, com destaque
para a redução de 47% e 61% na prevalência de desnutrição na Ásia e América Latina,
respectivamente. Ao contrário, acredita-se que em regiões da África, a prevalência de
desnutrição aumente de 24,0% para 26,8%, evidenciando que as alterações do panorama da
desnutrição mundial não seguem o mesmo padrão (De Onis et al, 2004).
Os resultados da Pesquisa de Orçamentos Familiares (POF), 2002-2003, trazem
valiosas informações sobre o estado nutricional da população brasileira de crianças e de
adolescentes. Há menor prevalência de desnutrição (4,6%) na faixa etária da população
usualmente mais vulnerável a deficiências nutricionais (menores de 5 anos). Prevalências ainda
menores de desnutrição infantil, em torno de 3%-3,5%, indicativas de presença residual de
desnutrição e relativo controle do problema, encontradas nas áreas urbanas e rurais de
aproximadamente metade do País (Regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste); prevalências
intermediárias, entre 5% e 7%, indicativas da persistência do problema com baixa magnitude,
foram encontradas na Região Nordeste e nas áreas urbanas da Região Norte. Na área rural da
Região Norte, estudada pela primeira vez no País, encontrou-se a maior prevalência de
desnutrição infantil, 11%. A POF confirmou a estreita associação entre renda familiar e estado
nutricional, indicando que o problema da desnutrição infantil em 2002-2003 estava concentrado
nas famílias com renda de até 0,5 salário mínimo per capita, as quais correspondiam, naquele
período, a 22,1% das famílias brasileiras. A comparação dos dados da POF 2002-2003 com
resultados de inquéritos anteriores (ENDEF 1974-1975, POF 1987-1988 e POF 1995-1996)
ratificou a contínua redução da desnutrição infantil no País ao longo das três últimas décadas.
O fato novo e alvissareiro do declínio recente da desnutrição – observado entre 1996 e 2002-
2003 – foi o excepcional declínio nos estratos da população mais castigados pelo problema:
crianças do Nordeste rural e, de modo geral, crianças de famílias pertencentes aos dois
primeiros quintos da distribuição nacional da renda familiar (IBGE, 2006).
Recentemente, a Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde da Criança e da Mulher
(PNDS) de 2006, revelou que a prevalência da desnutrição na população brasileira de crianças
13
menores de cinco anos foi de 7% em 2006. A distribuição espacial dessa prevalência indica
freqüência máxima do problema na região Norte (15%) e pouca variação entre as demais
regiões (6% nas regiões Centro-Oeste, Nordeste, Sudeste e 8% na região Sul). Déficits de peso
em relação à altura, indicativos de casos agudos de desnutrição quando sua freqüência
ultrapassa 2 a 3%, foram encontrados em apenas 1,5% das crianças brasileiras menores de
cinco anos, não ultrapassando 2% em qualquer região ou estrato social da população. Essa
situação indica um equilíbrio adequado entre o acúmulo de massa corporal e o crescimento
linear das crianças, apontando para o virtual controle de formas agudas de deficiência
energética em todo o país (Ministério da Saúde, 2008).
Avaliações da prevalência dos déficits de crescimento, em comparações preliminares
das PNDS de 1996 e 2006, indicam redução de cerca de 50% na prevalência da desnutrição na
infância no Brasil: de 13% para 7%. No Nordeste, a redução foi excepcionalmente elevada,
chegando a 67% (de 22,1% para 5,9%). No Centro-Oeste, a redução foi de aproximadamente
50% (de 11% para 6%). Nas áreas urbanas da região Norte, as únicas estudadas nessa região
em 1996, a redução na desnutrição foi mais modesta, em torno de 30% (de 21% para 14%).
Nas regiões Sul e Sudeste, os dados indicam estabilidade estatística das prevalências.
Comparações quanto à prevalência de déficits de peso para altura confirmam a reduzida
exposição da população a formas agudas de desnutrição (Ministério da Saúde, 2008).
Em contrapartida, atualmente se verifica a co-existência de indivíduos magros e obesos
em uma mesma família, fenômeno visto tanto em países desenvolvidos quanto em
desenvolvimento, caracterizando uma transição entre desnutrição e obesidade (Doak et al,
2005). A prevalência desta transição é mais comum em países que passam por um processo de
mudança nutricional associada a aumento no desenvolvimento de doenças crônicas (Monteiro
et al, 1995; Wang et al, 2002; Sichieri et al 2003).
A POF de 2002-2003 também revelou a prevalência do excesso de peso na população
adulta brasileira em todas as regiões do País, nos meios urbano e rural e em todas as classes
de rendimentos. O excesso de peso superou a prevalência de déficits ponderais, em média, em
oito vezes no caso da população feminina e em quinze vezes no caso da população masculina.
A situação e a evolução da obesidade no País reproduz, em linhas gerais, o quadro descrito
para a prevalência do excesso de peso (IBGE, 2004).
A PNDS (2006) revelou que situações de excesso de peso em relação à altura foram
encontradas em 7% das crianças brasileiras menores de cinco anos, variando de 6% na região
Norte a 9% na região Sul, indicando exposição moderada à obesidade infantil em todas as
regiões do país. Comparações das PNDS de 1996 e 2006 quanto à prevalência de excesso de
14
peso para altura não indicam mudança na exposição da população à obesidade (Ministério da
Saúde, 2008).
O processo de transição nutricional se torna importante uma vez que o excesso de peso
e a obesidade são fatores de risco para outros agravos à saúde, como o diabetes mellitus tipo 2
e as doenças cardiovasculares. Segundo a World Health Organization (WHO), a crescente
prevalência da obesidade caracteriza uma pandemia global, constituindo um grave problema de
saúde pública. Apesar do aumento nas prevalências de sobrepeso em relação às de
desnutrição em países em desenvolvimento, a desnutrição infantil ainda permanece como um
problema de saúde pública no Brasil e no mundo (De Onis & Blössner, 2003).
2. PROGRAMAÇÃO METABÓLICA
O termo “programação” se refere a uma alteração permanente de uma determinada
função, conseqüente a um estímulo ou agressão (imprinting) ocorrido em um período crítico de
vida, como a gestação ou lactação (Barker, 1995; Lucas, 1999; Moura & Passos, 2005).
Diversos estudos mostraram que alterações nutricionais, hormonais e ambientais, nos períodos
críticos do desenvolvimento, poderiam influenciar permanentemente a estrutura e a fisiologia de
órgãos e tecidos (Walker & Courtin, 1985; Pracyck et al, 1992; Dorner & Plagemann, 1994;
Mantzoros et al, 1997; Passos et al, 2000; Godfrey & Robinson, 1998), predispondo a gênese
na vida adulta, de doenças cardiovasculares e da síndrome metabólica (obesidade,
dislipidemia, hipertensão arterial e diabetes mellitus tipo 2) (Barker et al, 1993; Godfrey &
Barker, 2000; Phillips, 2002; Yura & Fuji, 2006).
2.1. Programação por fatores nutricionais
Na maioria das vezes, o estímulo indutor da programação é a falta de nutrientes para o
desenvolvimento do feto, que altera a disposição de nutrientes para os tecidos com desvio
preferencial de suprimento ao cérebro em detrimento dos demais órgãos, como o fígado (Barker
& Clark, 1997).
O período da lactação é crítico, uma vez que há importante desenvolvimento cognitivo.
Como o crescimento e o desenvolvimento humanos são contínuos desde a concepção, não é
de se surpreender que a nutrição neonatal tenha impacto em parâmetros fisiológicos em fases
posteriores da vida.
Ravelli et al (1976) foram um dos primeiros pesquisadores a relacionar a obesidade na
idade adulta com a desnutrição nos primeiros dias de vida. Neste estudo epidemiológico,
15
verificou-se maior incidência de obesidade nos filhos adultos cujas mães sofreram restrição
alimentar nos dois primeiros trimestres da gravidez. Posteriormente, estudos experimentais
também evidenciaram tal associação (Jones et al, 1984; Anguita et al, 1993; Passos et al,
2000).
Sawaya et al (2003) e Ferreira et al (2005) mostraram que em populações de favelados
de São Paulo, a baixa estatura se associa ao nível de pobreza ao nascer e é também indicador
de risco para obesidade abdominal e hipertensão arterial. Em revisão recente, Sawaya (2006)
mostrou que além da obesidade e hipertensão, meninos e meninas com baixa estatura também
apresentam maiores riscos de desenvolver cardiopatias e diabetes na vida adulta.
No município do Rio de Janeiro, evidenciou-se que a deposição abdominal de gordura e
a hipertensão arterial em adultos se associam à desnutrição perinatal (Sichieri et al, 2000a,
Sichieri et al, 2000b).
Se o baixo peso ao nascer se associa à obesidade, por outro lado, o maior peso ao
nascimento programa o indivíduo para o aumento do IMC pelo aumento de massa magra
(Singhal et al, 2002). Esse estudo, realizado em crianças e adolescentes de ambos os sexos
avaliou a composição corporal e mostrou correlação entre o maior peso ao nascer e o aumento
da massa livre de gordura, sem qualquer correlação com a massa de gordura, idade, sexo,
comprimento, maturidade sexual, nível sócio-econômico ou atividade física.
Diversos estudos têm avaliado a possível associação entre subnutrição fetal e
hipertensão e/ou falência cardíaca. Foi demonstrado que pacientes com restrição nutricional na
vida fetal são mais propensos à hipertensão arterial (Langley-Evans & Jackson, 1996). Esses
conceitos foram reforçados por estudos que indicam que a dieta materna na gestação e a
nutrição perinatal inadequada afetam a organogênese e, conseqüentemente, a funcionalidade
na maturidade. Tais alterações levariam o adulto a apresentar problemas como hipertensão
arterial, doenças cardiovasculares e renais (Ingelfinger & Woods, 2002). Fernandez-Twinn et al
(2006) mostraram que restrição protéica materna na gestação e lactação programa a resposta
do coração aos estímulos β adrenérgicos, sugerindo um maior o risco de falência cardíaca.
Pires et al (2006) e Almeida & Mandarim-de-Lacerda (2005) mostraram que a restrição
protéica – RP (5% de proteína) ou calórica (50%) na gestação e lactação altera a estrutura renal
da prole, aumentando a chance de apresentar hipertensão na vida adulta. Ainda neste contexto,
Marcelino et al (2004) demonstraram hipertensão arterial e diminuição da enzima óxido nítrico
sintase na prole de mães submetidas à dieta com 0% de proteína no início da lactação.
Nwagwu & Cook (2000) demonstraram que a prole adulta de ratas submetidas à
restrição protéica moderada na gestação apresentou hipertensão, rins menores, maior volume
16
urinário, menor clearance de creatinina, uremia e maior albuminúria. Woods et al (2004) e
Hoppe et al (2007) observaram correlação entre restrição protéica na gestação e diminuição do
número de néfrons na prole.
A desnutrição protéica e/ou calórica, na gestação ou lactação, programa várias
modificações na homeostase glicêmica na vida adulta, tais como: hiperinsulinemia e resistência
à insulina (Fernandez-Twinn et al, 2003), menor secreção de insulina (Hales et al, 1991; Desai
& Hales, 1997; Moura et al, 1997; Bertin et al, 1999; Caldeira Filho & Moura, 2000; Ozanne &
Hales, 2002; Moura et al, 2002; Benyshek et al, 2004; Gravena et al, 2007), maior sensibilidade
à mesma (Moura et al, 1997; Caldeira Filho & Moura, 2000; Sampaio de Freitas et al, 2003),
diminuição de células beta, menor conteúdo de insulina pancreática (Bertin et al, 1999; Breant
et al, 2006) e aumento da gliconeogênese (Burns et al, 1997). Sardinha et al (2006) verificaram
que a ação anorexigênica central da insulina varia de acordo com o gênero em animais adultos
submetidos à desnutrição na gestação. Após injeção intracerebroventricular de insulina, os
machos adultos expostos à desnutrição intra-uterina (50%) apresentaram hipofagia, diferente
das fêmeas, que apresentaram resistência hipotalâmica a este hormônio.
Recentemente, Pinheiro et al (2008) também verificaram que a restrição protéica na
gestação e/ou lactação causa efeitos adversos na glicemia, insulinemia, leptinemia, peso e
gordura corporal da prole e que tais alterações podem ser passadas transgeracionalmente para
a segunda geração dos filhotes.
Na gestação, a restrição calórica de 30% está associada à hiperleptinemia, hiperfagia,
hiperinsulinemia e obesidade na prole adulta do sexo feminino (Vickers et al, 2001a; Vickers et
al, 2001b). Na lactação, a desnutrição protéica materna severa (0% de proteína) aumenta a
leptina sérica (Moura et al, 2002).
Já foi demonstrado aumento de catecolaminas em ratos adultos cujas mães receberam
dieta hipoprotéica na gestação e lactação (Petry et al, 2000) ou apenas na lactação (Fagundes
et al, 2007). Molendi-Coste et al (2006) sugeriram que a desnutrição materna perinatal altera
acentuadamente a diferenciação da medula adrenal na vida pos-natal, resultando no aumento
da atividade de células cromafins ao desmame, o que pode persistir até a vida adulta e
participar da programação das doenças crônicas.
Outros modelos que utilizam restrição protéica menos severa na lactação ou período
perinatal programam na idade adulta alterações na função tireoideana (Passos et al, 2002;
Dutra et al, 2003) e nos níveis de glicocorticóides (Lesage et al, 2002; Fagundes et al, 2007).
Em nosso laboratório, foi desenvolvido um modelo de restrição energética materna
exclusivamente na lactação para avaliar os seus efeitos em longo prazo sobre diversos
17
parâmetros. Verificamos que a prole adulta destas mães apresenta sobrepeso (Passos et al,
2000), alto T
3
e baixo TSH séricos (Passos et al, 2002, Dutra et al, 2003), maior expressão do
GH (Moura et al, 2007), maior expressão do receptor de leptina (Ob-Rb) na hipófise (Vicente et
al, 2004) e resistência ao efeito anorexigênico da leptina (Passos et al, 2004).
2.2. Programação por fatores hormonais
As concentrações de vários hormônios durante o período neonatal têm sido estudadas
como fatores de imprinting para diversas alterações fisiopatológicas em longo prazo.
Alterações séricas de hormônios tireoideanos em ratos neonatos alteram
permanentemente a sensibilidade do eixo hipotálamo-hipófise a estes hormônios (Walker &
Courtin, 1985; Pracyck et al, 1992). O tratamento com glicocorticóides na gestação está
associado à hipertensão arterial na prole adulta (Benediktsson et al, 1993). A hiperinsulinemia
neonatal causa obesidade em ratos adultos (Dorner & Plagemenn, 1994). A administração
neonatal de androgênios programa um padrão masculino de liberação de LH e FSH (Von Saal
& Bronson, 1980).
Em nosso laboratório foram desenvolvidos três modelos de imprinting hormonal na
lactação, com a finalidade de isolar fatores candidatos a programar a regulação do peso
corporal e outros parâmetros, como a função tireoideana nos modelos de desnutrição pós-natal.
São eles: hipertiroxinemia, hiperleptinemia e hipoprolactinemia. Escolhemos estas três
alterações hormonais porque o animal RP secreta mais T
3
pelo leite (Passos et al, 2001). Além
disso, as mães apresentaram hiperleptinemia e hipoprolactinemia (Lisboa et al, 2006).
2.2.1. Programação por administração de tiroxina (T
4
)
Moura et al (2008) administraram T4 em filhotes nos 10 primeiros dias de lactação e
observaram que o hipertireoidismo neonatal programa um hipotireoidismo secundário, como
previamente demonstrado por outros estudos (Walker & Courtin, 1985; Pracyck et al, 1992).
Além disso, a prole programada apresentou, aos 60 dias de idade, menor consumo alimentar,
menor comprimento e peso corporal, apesar do maior conteúdo de gordura total e visceral e
hiperleptinemia. Tais animais também apresentaram alteração das atividades desiodases: maior
D2 hipofisária e hipotalâmica, menor D2 no TAM e menor D1 muscular (Moura et al, 2008).
2.2.2. Programação por administração de leptina
Em nosso laboratório, observamos na programação por hiperleptinemia materna ao final
da lactação que a prole adulta apresentou maior peso corporal, gordura visceral e total,
18
hiperleptinemia, resistência ao efeito central da leptina (Lins et al, 2005) e maior T
3
sérico
(Passos et al, 2007).
Quando a leptina foi injetada diretamente nos filhotes nos 10 primeiros dias de vida
(Cravo et al, 2002; Teixeira et al, 2003; Toste et al, 2006a e 2006b, Dutra et al, 2007),
observamos sobrepeso, hiperfagia, hiperleptinemia, resistência ao efeito anorexigênico da
leptina e menor expressão de Ob-Rb no hipotálamo e na tireóide, hipertireoidismo, menor
atividade D1 e GPD-m hepática, hiperinsulinemia, hipoadiponectinemia, hipertrigliceridemia e
maior percentual de proteína corporal total nos ratos adultos. Recentemente, Trevenzoli et al
(2007) evidenciou neste modelo, maior conteúdo adrenal de catecolaminas, maior freqüência
cardíaca e pressão arterial diastólica.
2.2.3. Programação por bloqueio de prolactina (PRL)
Nosso grupo desenvolveu um modelo experimental de programação pelo bloqueio da
PRL materna através do tratamento com bromocriptina (agonista dopaminérgico) ao final da
lactação (Bonomo et al, 2005; Bonomo et al, 2007; Bonomo et al, 2008). Os filhotes adultos
destas nutrizes apresentaram sobrepeso, sem alteração do consumo alimentar, maior gordura
total, visceral e proteína total, menor água e cinzas corporais totais, hiperleptinemia, resistência
a ação anorexigênica da leptina, hipercorticosteronemia, hipotireoidismo central, maior
conteúdo medular de catecolaminas, além de aumento de glicemia, resistência à insulina e
hipoadiponectinemia, hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia. O conjunto destes dados
sugerem que a hipoprolactinemia materna pode programar alguns parâmetros da síndrome
metabólica nos animais adultos.
2.3. Programação por fatores ambientais (nicotina)
O tabagismo na vida intra-uterina está associado ao retardo no crescimento e
desenvolvimento da progênie. Dados epidemiológicos (Vik et al, 1996; Kries et al, 2002; Goldani
et al, 2007) e experimentais (Gao et al, 2005; Chen et al, 2005) mostram que filhos de mães
que fumaram na gestação e lactação apresentam baixo peso ao nascer, seguido de sobrepeso
na infância e idade adulta, sendo isto freqüentemente associado à nicotina.
Nosso grupo de pesquisa está investigando os efeitos da exposição materna isolada à
nicotina apenas na lactação sobre a programação do peso corporal e da função tireoideana da
prole. Os resultados mostraram que a prole aos 180 dias de idade desenvolveu obesidade,
corroborando os achados da literatura, além de hiperleptinemia e hipotireoidismo secundário,
mostrando que a lactação é um período crítico para o imprinting pela nicotina (Oliveira, 2008).
19
3. LEPTINA
A leptina (do grego leptos, que significa magro) é uma proteína produzida pelo gene ob,
secretada principalmente pelo adipócito e que regula a ingestão alimentar e o balanço
energético corporal (Zhang et al, 1994; Pelleymounter et al, 1995; Friedman & Halaas, 1998). Já
se sabe que a leptina também é produzida em pequenas quantidades no músculo esquelético,
rim, células epiteliais mamárias, placenta, estômago, hipófise e hipotálamo, contudo a sua
função nestes tecidos ainda é pouco clara (Masuzaki et al, 1997; Bado et al, 1998; Combatsiaris
& Charron, 1999; Morash et al, 1999; Jin et al, 2000; Popovic et al, 2001). Acredita-se que a
leptina possa estar envolvida no aumento da lipólise, reprodução, angiogênese, formação
óssea, função tireoideana, crescimento e utilização da glicose (Barash et al, 1996; Siegrist-
Kaiser et al, 1997; Bouloumic et al, 1998; Sierra-Honigmann et al, 1998; Wang et al, 1999; Ducy
et al, 2000; Ahima et al, 2000; Karsenty, 2001).
O hipotálamo é o centro primário da ação da leptina. Ele produz uma série de
neuropeptídeos constituintes do circuito neural que regula o comportamento alimentar e o peso
corporal. Estes neuropeptídeos se classificam em 2 tipos: os orexígenos, que estimulam a
ingestão alimentar e são inibidos pela leptina e os anorexígenos, que inibem a ingestão
alimentar e são estimulados pela leptina. Os orexígenos são: neuropeptídeo Y (NPY), proteína
agouti (AgRP), hormônio concentrador de melanina (MCH), galanina, orexina. Os anorexígenos
são: pró-ópiomelanocortina (POMC), α-melanocortina (α-MSH), neurotensina (NT), hormônio
liberador de corticotrofina (CRH), transcrito regulado por anfetamina e cocaína (CART) (Sahu,
2004).
O receptor de leptina (Ob-R) é um membro da classe I da família dos receptores de
citocinas. Dentre as diversas isoformas (a, b, c, d, e, f) do Ob-R, o Ob-Rb apresenta o domínio
mais longo e é a isoforma mais expressa no hipotálamo (Sahu, 2004). O Ob-Rb é amplamente
expresso no núcleo arqueado, hipotálamo ventromedial e dorsomedial, regiões cerebrais
ligadas ao balanço energético (Elmquist et al, 1998); sendo também encontrado em: adipócitos
e hipófise (Jin et al., 1999; Vicente et al, 2004), tireóide (Nowak et al., 2002; Dutra et al, 2007),
ilhota pancreática, adrenal, endotélio vascular, ovário e fígado (Hoggard et al., 1997; Ahima et
al., 1999).
A leptina age através do receptor Ob-R ativando a via JAK-STAT, principal via de
sinalização da leptina (figura 1). Na cascata de sinalização da leptina, a sua ligação com o Ob-
R resulta na fosforilação e ativação de Janus quinase 2 (JAK2), que por sua vez fosforila outras
enzimas ou proteínas. A JAK2 ativada promove a fosforilação do resíduo de tirosina do
20
receptor, que serve de “âncora” para a proteína STAT3, que fosforilada, se dimeriza, transloca
para o núcleo, onde se liga à região promotora regulando a expressão de diversos genes,
incluindo SOCS3 (Bates & Myers, 2004; Sahu, 2004).
Figura 1: Modelo de sinalização da leptina (Adaptado de Sahu, 2004)
Fortes evidências sugerem que a via JAK-STAT é controlado por feedback negativo
através das proteínas da família SOCS (supressores de sinalização de citocinas) (Endo et al,
1997; Naka et al, 1997). Dentre os 8 tipos de SOCS, a leptina induz especificamente o mRNA
de SOCS3 no hipotálamo, que bloqueia a sua via de transdução de sinal pela inibição da
fosforilação de JAK2 (Bjorback et al, 1999; Bjorback et al, 2001).
Foi demonstrado que a leptina induz uma sinalização semelhante à insulina, envolvendo
a ativação de PDE3B (fosfodiesterase 3B), dependente de PI3-quinase (fosfatidilinositol 3-
quinase) e a redução de AMPc (Zaho et al, 1998; Zaho et al, 2000).
Diante de todas estas evidências, sugere-se que a interação do modelo JAK2-STAT3
com a via PI3K-PDE3B-AMPc constitui um componente importante da sinalização da leptina no
hipotálamo (Sahu, 2004), inclusive porque a SOCS3 também inibe a PI3K.
21
3.1. Leptina e função tireoideana
Diversos estudos têm mostrado a relação entre leptina e eixo hipotálamo-hipófise-
tireóide.
Escobar-Morreale et al (1997) verificaram que, em seres humanos, os HTs exercem um
efeito negativo sobre as concentrações séricas de leptina. Porém, os mecanismos precisos
desta influência ainda necessitam ser elucidados.
A leptina pode controlar a função tireoideana indiretamente. Segundo Ahima et al
(1996), Legradi et al (1997; 1998), Orban et al (1998) e Nillni et al (2000), a leptina estimula a
secreção de TSH por estimular a expressão do gene do pró-TRH.
Já foi evidenciada a presença de Ob-R na hipófise, além da síntese local de leptina (Jin
at al, 1999; Jin et al, 2000; Lloyd et al, 2001; Sone et al, 2001; Vicente et al, 2004). Ortiga-
Carvalho et al (2002) mostraram que a leptina “in vivo” tem um efeito estimulatório sobre a
liberação de TSH, provavelmente por ação no hipotálamo, enquanto que “in vitro” inibe a
secreção de TSH, sugerindo uma inibição autócrina/parácrina local. Da Veiga et al (2004)
demonstraram a influência dos HTs na modulação autócrina/parácrina da secreção de TSH, via
leptina. A resposta do TSH à leptina “in vivo” (estimulatória) e “in vitro” (inibitória) é nula no
hipotireoidismo, enquanto é preservada no hipertireoidismo.
A leptina também pode agir diretamente na tireóide, uma vez que Nowak et al (2002)
mostraram a existência de Ob-Rb na tireóide. O tratamento crônico com leptina induziu ao
aumento da tireóide, de T
3
e T
4
séricos, sugerindo um efeito direto da leptina sobre o
crescimento e secreção tireoideana e inibe o TSH, provavelmente pela manutenção do
feedback negativo com HTs. Porém, foi demonstrado em células FRTL5, que a leptina regula
negativamente os HTs, por inibir o NIS e a tireoglobulina (Isozaki et al, 2004). Além disto,
recentemente observamos em tireóide isoladas de ratos, que a leptina inibe diretamente a
captação tireoideana de iodeto, embora aumente a secreção de T4 (De Oliveira et al, 2007).
Diversos estudos evidenciaram o papel da leptina na modulação da conversão de T
4
a T
3
.
Trabalhos desenvolvidos com animais deficientes em leptina (ob/ob) mostraram redução da
atividade D1 hepática e renal e aumento da atividade D2 em cérebro (Hillgartener & Romsos,
1985; Kates & Himms-Hagen, 1985; Kaplan & Young, 1987). A injeção de leptina estimula a
atividade D1 em fígado (Cusin et al, 2000; Lisboa et al, 2003a) e tireóide (Lisboa et al, 2003a),
além de aumentar a expressão do RNAm da D2 no TAM (Cettour-Rose et al, 2002),
contribuindo para o aumento do T
3
sérico. Em relação às desiodases hipofisárias, a leptina
elevou a atividade D1 e diminuiu a D2 (Cabanelas et al, 2006). Evidenciamos que ratas
22
lactantes sob restrição protéica são hiperleptinêmicas e apresentam aumento da atividade da
D2 tireoideana e do TAM (Lisboa et al, 2003b).
4. HORMÔNIOS QUE REGULAM A HOMEOSTASE GLICÊMICA
Diversos hormônios estão envolvidos no controle da homeostase energética, como
insulina, glucagon, adrenalina, cortisol, GH, HTs, leptina e adiponectina entre outros. Estes
agem regulando os estoques corporais de glicogênio, gordura e proteínas no estado alimentado
e no estado de jejum, através dos processos de glicogênese/glicogenólise/gliconeogênese,
lipogênese/lipólise e síntese de proteínas/proteólise. Como quatro dos hormônios citados acima
serão abordados nesta Tese (glicocorticóides, catecolaminas, insulina e adiponectina), faremos
uma breve descrição deles a seguir.
4.1. Glicocorticóides
O cortisol é o principal glicocorticóide para seres humanos, enquanto a corticosterona é
o principal para roedores (Kaplan, 2000).
Os glicocorticódes são produzidos pela zona fasciculada do córtex adrenal sob estímulo
do ACTH. Fatores como estresse, citocinas inflamatórias, febre, traumas, hipotensão arterial e
hipoglicemia ativam o eixo hipotálamo-hipófise (CRH-ACTH) que culmina com o aumento da
liberação do cortisol (Mormède et al, 2007).
Os glicocorticóides têm inúmeros efeitos biológicos, afetando diversos órgãos e
sistemas. Eles regulam o metabolismo de carboidratos agindo como contra-reguladores da
insulina, estimulando a gliconeogênese hepática e aumentando a mobilização de substratos
neoglicogênicos de tecidos periféricos. Também diminuem a utilização periférica de glicose,
causando resistência à insulina e diminuindo a captação de glicose. A síntese de glicogênio
hepática é estimulada pelos glicocorticóides como fonte de glicose prontamente liberada
quando necessário (Elias et al, 2008).
Os glicocorticóides estimulam a diferenciação de adipócitos (principalmente
abdominais), aumentam a filtração glomerular, reduzem a síntese e a produção de colágeno,
promovem catabolismo muscular e inibição da síntese protéica, pois diminuem a captação de
aminoácidos pelo músculo. Eles têm ainda efeitos diretos sobre os osteoblastos, inibindo a
produção de IGF-I e podem causar vasoconstricção. Em altas concentrações possuem efeitos
anti-inflamatórios e de imunossupressão, fato que o torna uma importante agente terapêutico
em doenças alérgicas e auto-imunes (Elias et al, 2008).
23
Algumas evidências sugerem uma correlação entre leptina e eixo hipotálamo-hipófise-
adrenal, mas a interação entre esses sistemas ainda não é bem compreendida e os achados
experimentais freqüentemente são divergentes.
As isoformas Ob-Ra e Ob-Rb já foram descritas no córtex adrenal porcino, o que sugere
um papel da leptina sobre a secreção de corticosterona (Malendowicz et al., 2004).
Em seres humanos, o cortisol sérico no período pós-cirúrgico aumenta e a leptinemia é
reduzida quase à metade (Kain et al., 1999), mostrando uma relação inversa entre esses
hormônios. No jejum, onde ocorre maior corticosteronemia e menor leptinemia a reposição de
leptina em roedores diminui a elevação da corticosterona sérica (Ahima et al., 1996). O
tratamento com leptina reduz a corticosterona plasmática em camundongos ob/ob (Stephens et
al., 1995) e suprime a liberação de CRH na resposta à hipoglicemina (Heiman et al., 1997) e
restrição alimentar (Huang et al., 1998), porém potencializa a secreção basal de CRH em
condições basais (Costa et al., 1997).
Pacientes com hipercortisolismo apresentam hiperleptinemia, de forma similar ao que
ocorre na obesidade (Masuzaki et al., 1997).
4.2. Catecolaminas
A medula adrenal consiste em um gânglio simpático modificado cujos corpos celulares
não possuem axônios, sendo as catecolaminas secretadas para a circulação, e por isso
classificadas como hormônios. As catecolaminas – dopamina, noradrenalina e adrenalina – são
moléculas aminadas derivadas do aminoácido tirosina, produzidas pelas células cromafins da
medula por uma seqüência de reações enzimáticas altamente reguladas por fatores endócrinos,
parácrinos e autócrinos (Elias, 2008).
As células cromafins podem ser subdivididas em duas populações: células secretoras de
adrenalina (A) e secretoras de noradrenalina (N). Como as células do tipo A estão em maioria, a
medula secreta principalmente a adrenalina. A medula tem como principal estimulador
fisiológico a acetilcolina (ACh), que quando liberada pelas terminações dos neurônios pré-
ganglionares simpáticos estimula a função endócrina do tecido. ACh ativa principalmente os
receptores nicotínicos e, em menor grau, os receptores muscarínicos na membrana de células
cromafins (Zaika et al., 2004).
A biossíntese das catecolaminas ocorre a partir do aminoácido tirosina, proveniente da
dieta ou da hidroxilação da fenilalanina no fígado. A etapa limitante de sua síntese é a
conversão de tirosina em diidroxifenilalanina (L-Dopa), catalisada pela tirosina hidroxilase (TH).
Dopa é descarboxilada a dopamina, que é convertida a noradrenalina pela dopamina β-
24
hidroxilase (DBH). Nas células cromafins da medula adrenal, a noradrenalina é metabolizada
em adrenalina pela feniletanolamina-N-metiltransferase (FNMT), que tem sua ação dependente
de glicocorticóides (Elias et al, 2008).
Os receptores adrenégicos são classificados farmacologicamente em dois grupos –
receptores tipos α (α1 e α2) e β (β1, β2 e β3) – determinados a partir da potência de seus
agonistas, como adrenalina e noradrenalina. Todos os subtipos de receptores adrenérgicos são
acoplados à proteína G, mas cada um possui um sistema característico de segundos
mensageiros. Os do tipo α
1
estão acoplados à enzima fosfolipase C (PLC) e produzem seus
efeitos pela liberação de cálcio intracelular. Os receptores α
2
quando ativados reduzem o AMPc
intracelular, além de inibirem canais de cálcio e estimularem canais de potássio. Todos os
receptores do tipo β aumentam o AMPc (Rang et al., 2001).
Embora pertençam à mesma família, os receptores adrenégicos possuem distribuição
característica e efeitos tecido-específicos. Os receptores α1, em geral, estão nas células
musculares lisas presentes em diversos sistemas, como vasos sanguíneos, brônquios e trato
gastrointestinal (TGI). Quando estimulados promovem constrição (vasos e brônquios) e
contração (músculos de esfíncteres, útero e íris), exceto sobre o TGI, onde causam
relaxamento. Os receptores α2 inibem a liberação de noradrenalina pelos nervos simpáticos
(Elias et al, 2008).
A ativação dos receptores β
1
, encontrados principalmente no coração, aumentam a
frequência cardíaca e a força de contração do músculo cardíaco. Os agonistas β1 possuem
efeito “anti-obesidade” pela indução de lipólise no tecido adiposo branco (TA) e termogênese no
tecido adiposo marrom (TAM). Os receptores β
2
promovem relaxamento da musculatura lisa em
geral são muito expressos no tecido pulmonar, onde induzem dilatação dos brônquios quando
ativados. Na musculatura esquelética, causa tremor, aumento da massa tecidual e velocidade
de contração e glicogenólise. No fígado, a ativação dos receptores β
2
induzem a glicogenólise,
importante mecanismo regulador da glicemia. (Berne & Levy, 1993).
A leptina também atua na medula da glândula supra-renal pois já foram identificados
receptores para a leptina nas células cromafins de seres humanos (Glasow et al., 1998), ratos
(Cao et al., 1997), porcos (Takekoshi et al., 1999) e bois (Yanagihara et al., 2000). Em células
cromafins isoladas, a leptina induz a síntese de catecolaminas, mas os dados a respeito do seu
efeito sobre a secreção são conflitantes, alguns autores encontram efeito estimulatório
enquanto outros não encontram efeito (Glasow et al., 1998; Takekoshi et al., 1999; Yanagihara
et al., 2000).
25
Trevenzoli et al (2007) evidenciou no modelo de programação hormonal por injeção
neonatal de leptina que os ratos adultos apresentaram, maior conteúdo adrenal de
catecolaminas, maior expressão de tirosina hidroxilase na medula adrenal e maior secreção in
vitro de catecolaminas basal e pós-estímulo com cafeína.
4.3. Insulina
A insulina é um hormônio anabólico secretado pelas células β das ilhotas pancreáticas e
essencial para a manutenção da homeostase de glicose e do crescimento e diferenciação
celular (Carvalheira et al, 2002).
A insulina age em praticamente todas as células do organismo. Possui diversos efeitos
metabólicos, mas também age sobre a expressão de genes e síntese protéica, assim, como na
proliferação e diferenciação celulares. No fígado, a insulina inibe a glicogenólise, a
gliconeogênese e a conversão de ácidos graxos e aminoácidos em cetoácidos; aumenta a
síntese de glicogênio, de triglicerídeos e de lipoproteínas VLDL. No músculo, aumenta a
captação de aminoácidos e síntese protéica, aumenta o transporte de glicose (GLUT4) e a
síntese de glicogênio. No tecido adiposo branco, aumenta a lipogênese, a captação de glicose
através da síntese e translocação do transportador de glicose (GLUT4) e a metabolização a
glicerofosfato, a hidrólise de triglicerídeos extracelulres, o influxo de ácidos graxos livres, a
esterificação dos ácidos graxos e inibe a lipólise. Outras funções incluem: aumento da produção
de óxido nítrico no endotélio e da atividade da Na
+
/K
+
- ATPase, prevenção da apoptose e
inibição da ingestão alimentar (Cisternas, 2006; Machado et al, 2008)
O receptor de insulina (IR) é uma glicoproteína heterotetramérica de membrana
plasmática constituída por duas subunidades α e duas subunidades β, unidas por ligações
dissulfeto (Kahn, 1985). A subunidade α é extracelular e contém o sítio de ligação ao hormônio,
enquanto a β é uma proteína transmembrana que possui atividade tirosina quinase (Kasuga et
al, 1982). A insulina induz a autofosforilação do IR, aumentando a sua capacidade de fosforilar
um ou mais substratos protéicos intracelulares. A fosforilação em tirosina de seu substrato (IRS)
inicia uma cascata de reações de fosforilação e defosforilação que regula os seus efeitos
metabólicos e de crescimento (Sun et al, 1991; Sun et al, 1995; White & Kahn, 1994; White,
1997).
Há uma estreita associação entre a enzima fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-quinase) com
o IRS após estimulação com insulina (Folli et al, 1992). A PI3-quinase é a molécula ativada pelo
IRS-1 mais estudada (Carpenter & Cantley, 1990). Algumas proteínas, como a AKT (ou PKB),
são ativadas pela PI3-quinase (Cheatham et al, 1994; Shepperd et al, 1998) e são importantes
26
na regulação da expressão de genes e no crescimento celular em resposta a inúmeros
estímulos (Yenush & White, 1997). No tecido adiposo e no músculo esquelético, a AKT em
resposta ao estímulo da insulina encontra-se ligada a vesículas contendo o transportador de
glicose 4 (GLUT4) (Kupriyanova et al, 1999).
Diversos estudos mostram a relação entre leptina e insulina. Faraj et al (2008)
mostraram que a hiperinsulinemia por si só regula a concentração e a expressão de leptina em
homens magros e saudáveis. Em um modelo animal de lipodistrofia induzida pela dieta, a
infusão de leptina pode atenuar a esteatose hepática e a hiperinsulinemia através da redução
da síntese de triglicerídeos hepáticos e melhora da sensibilidade à insulina (Nagao et al, 2008).
Van den Hoek et al (2008) mostraram que tanto o bloqueio da sinalização da leptina quanto à
adiposidade podem contribuir para a resistência à insulina em indivíduos obesos, pois a
diminuição da sinalização central da leptina pode afetar criticamente o metabolismo glicídico
destes indivíduos.
Toste et al (2006a) mostraram que o tratamento com leptina em ratos no período pós-
natal leva à hiperleptinemia e hiperinsulinemia na vida adulta. Já Vickers et al (2008) mostraram
que o tratamento neonatal com leptina causou hiperinsulinemia na prole adulta e que este efeito
é dependente do estado nutricional materno na gestação.
Poucos trabalhos mostraram os efeitos em longo prazo da desnutrição protéica perinatal
sobre a resposta insulínica da prole (Moura et al, 1997; Caldeira Filho & Moura, 2000) Sampaio
de Freitas et al (2003) evidenciaram que RP neonatal programa para maior atividade da PI3K e
maior translocação de GLUT4 no músculo de ratos adultos. Garcia-Souza et al (2008)
mostraram que a desnutrição protéica neonatal precoce prejudica a sensibilidade à insulina em
ratos adultos por promover alterações em etapas críticas da sinalização da insulina no tecido
adiposo, que podem contribuir para modificações permanentes na homeostase glicêmica.
Recentemente, detectamos hipoinsulinemia e discreta hipoglicemia na prole adulta programada
pela RP na lactação, sugerindo maior sensibilidade à insulina (Fagundes et al, 2007).
4.4. Adiponectina
A adiponectina é um hormônio protéico produzido pelos adipócitos, que possui
propriedades anti-aterogênicas e de sensibilização à insulina em seres humanos e ratos (Hotta
et al., 2000; Yamauchi et al., 2001; Maeda et al., 2002; Combs et al., 2003).
Oposto à leptina, que geralmente é proporcional à massa adiposa, a adiponectina é
maior em mulheres e indivíduos magros, estando inversamente relacionada com a quantidade
de gordura corporal (Arita et al., 1999; Swarbrick & Havel, 2008).
27
A adiponectina parece ser a única adipocitocina que é produzida em menores
quantidades em obesos do que em indivíduos magros e possui predominantemente atividades
benéficas como aumentar a sensibilidade à insulina, estimular a oxidação lipídica inibir a reação
inflamatória e induzir a vasodilatação do endotélio mediada por óxido nítrico (Bełtowski et al,
2008).
O PPARγ é um receptor nuclear que regula o metabolismo da glicose e dos lipídios. É
altamente expresso em adipócitos, tendo um papel importante na ativação de adipocitocinas,
incluindo a adiponectina (Kawada et al, 2008).
Estudos in vitro sugerem que a produção de adiponectina pode ser determinada
primariamente pelo tamanho do adipócito e sensibilidade à insulina. Além disso, a produção de
adiponectina é inibida por alguns hormônios, incluindo testosterona, prolactina, glicocorticóides
e hormônio do crescimento e por inflamação e estresse oxidativo no tecido adiposo (Swarbrick
& Havel, 2008).
A administração intracerebroventricular de adiponectina em ratos aumentou o gasto
energético, sugerindo que a adiponectina atua no SNC regulando o metabolismo energético,
através do incremento da termogênese e da oxidação lipídica (Qi et al., 2004).
A adiponectina aumenta a sensibilidade à insulina, talvez pelo aumento na oxidação de
gordura no tecido, o que resulta em menores níveis de ácidos graxos circulantes e reduzidos
conteúdos hepáticos ou intramiocelulares de triglicerídeos (Havel, 2002).
A
hipoadiponectinaemia pode ser vista como um sinal precoce de risco cardiovascular,
predispondo à aterosclerose, bem como um fator acelerador do progresso da placa
aterosclerórica.
Estudos in vitro indicam que a adiponectina pode modular a progressão da
aterosclerose por seus efeitos anti-inflamatórios e anti-proliferativos (Tarquini et al, 2007).
Devido aos efeitos similares da adiponectina e HTs sobre a termogênese, acredita-se na
existência de uma relação entre estes hormônios. Em um estudo realizado com ratos
hipotireóideos não foi encontrada qualquer alteração na
concentração de adiponectina, porém
nos animais hipertireóideos verificou-se aumento da adiponectina sérica (Aragão et al., 2007).
Existem poucos estudos que mostram a interação entre adiponectina e leptina. Em
ratos, a administração de leptina diminui rapidamente a adiponectina (Ueno et al 2004).
Contudo em camundongos ob/ob, o tratamento com leptina aumenta a adiponectina sérica
(Delporte et al 2004). Camundongos transgênicos que super-expressam adiponectina humana
apresentaram hipoleptinemia comparados com o grupo controle (Otabe et al 2007).
Recentemente, Fenton et al (2008) mostraram em células intestinais pré-neoplásicas, que a
adiponectina bloqueia a proliferação destas células induzida pela leptina.
28
5. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO E HIPÓTESES
Embora diversos trabalhos mostrem os efeitos em longo prazo da restrição protéica na
gestação ou gestação e lactação, poucos enfocam exclusivamente o período crítico da
lactação.
Até o momento, nossos dados da prole aos 180 dias de idade cujas mães foram
submetidas a RP de 8% na lactação sugerem o desenvolvimento de uma disfunção metabólica,
mesmo em vigência de uma alimentação pós-desmame com as quantidades adequadas de
proteína (quadro 1).
RESUMOS DOS DADOS DO NOSSO LABORATÓRIO NO MODELO DE PROGRAMAÇÃO
PELA RESTRIÇÃO PROTÉICA (RP) MATERNA NA LACTAÇÃO
PROLE ADULTA (180 dias)
Peso corporal
↓
Passos et al, 2000
Ingestão alimentar normal
Passos et al, 2000
Captação tireóidea de
125
I
↑
Passos et al, 2002
T
3
e T
4
séricos
↑
Passos et al, 2002
TSH sérico
↓
Dutra et al, 2003
GPDm hepática
↑
Lisboa et al, 2008
D1 hepática
↑
Dutra et al, 2003
Desiodases tireoideanas normais
Dutra et al, 2003, Lisboa et al, 2008
D2 hipofisária
↑
Lisboa et al, 2008
D1 hipofisária normal
Lisboa et al, 2008
D1 muscular
↑
Lisboa et al, 2008
D2 muscular normal
Lisboa et al, 2008
Secreção de TSH pós-TRH in vitro
↓
Lisboa et al, 2008
Gordura visceral e total
↓
Fagundes et al, 2007
Proteína corporal total normal
Fagundes et al, 2007
Água corporal total normal
Fagundes et al, 2007
Leptinemia normal
Teixeira et al, 2002
Insulinemia
↓
Fagundes et al, 2007
Glicemia
↓
Fagundes et al, 2007
29
HOMA normal
Fagundes et al, 2007
Corticosteronemia
↑
Fagundes et al, 2007
Conteúdo medular de catecolaminas
↑
Fagundes et al, 2007
Ob-Rb hipofisário
↑
Vicente et al, 2004
Efeito anorexigênico da leptina resistente
Passos et al, 2004
RNAm do GH
↓
De Moura et al, 2007
Comprimento corporal normal
De Moura et al, 2007
Anteriormente, foi demonstrado que neste modelo há uma programação para menor
ganho de peso corporal e hipertireoidismo. Durante o meu mestrado, conseguimos melhor
caracterizar o fenótipo desta prole programada, mostrando menor adiposidade central e total,
aumento de corticosterona sérica e de catecolaminas na medula adrenal, evidenciando uma
importante disfunção metabólica. Além disto, verificamos hipoinsulinemia e hipoglicemia,
sugerindo maior sensibilidade à insulina. Desta forma, buscamos complementar o
conhecimento a respeito do fenótipo “desperdiçador” ou “gastador” destes animais (contrário ao
“thrifty phenotype”), e mais, através do estudo temporal, tentamos compreender quando se
iniciam as mudanças metabólicas. Face às alterações de glicocorticóides, adrenalina e insulina,
torna-se interessante saber como se encontram os depósitos hepático e muscular de glicogênio
e o perfil lipídico. A avaliação da adiponectina sérica nos fornecerá informações sobre a
sensibilidade à insulina neste modelo experimental. O estudo da sinalização da leptina se deve
ao fato de ter sido demonstrado, previamente, que a prole RP adulta programada é resistente
ao efeito anorexigênico da leptina (Passos et al, 2004). Apesar da concentração sérica de
leptina destes animais estar inalterada comparada ao controle, a relação leptina/peso corporal
da prole RP se encontra elevada (+33%), o que reforça o quadro de resistência central a este
hormônio. Sendo assim, seria de se esperar alterações na via de sinalização da leptina, que
serão avaliadas pela expressão hipotalâmica de Ob-Rb, JAK2, STAT3 e SOCS3. Além disso, já
se demonstrou uma dissociação entre o efeito central e periférico da leptina (Correia et al, 2002;
Rahmouni et al, 2005). Por isso, resolvemos avaliar a via de sinalização da leptina também na
tireóide. Uma vez que se sabe da existência de uma importante inter-relação entre leptina e
função tireoideana, a investigação da ação da leptina nestes tecidos poderá nos informar a
respeito do desenvolvimento do hipertireoidismo da prole adulta RP.
30
OBJETIVOS
GERAL
Estudar a composição corporal, os hormônios envolvidos no controle do metabolismo
intermediário e a sinalização de leptina em ratos programados pela restrição protéica neonatal.
ESPECÍFICOS
Na prole de diferentes idades cujas mães foram submetidas à restrição protéica na
lactação, avaliaremos:
• o consumo alimentar, massa e composição corporais (gordura visceral, conteúdo
corporal de gordura total, proteína, água, minerais totais e no fêmur);
• o conteúdo de glicogênio hepático e no músculo esquelético sóleo;
• a morfologia do tecido adiposo subcutâneo e visceral;
• a concentração circulante de proteínas totais, albumina, globulina, glicose, triglicerídeos,
colesterol total e frações;
• as concentrações séricas de corticosterona, insulina e adiponectina;
• o conteúdo de catecolaminas na medula adrenal e sua secreção “in vitro”;
• a sinalização da leptina em hipotálamo e tireóide.
31
Metodologia
Ratas Wistar adultas, nulíparas, foram mantidas em biotério com temperatura (25±1°C) e
ciclo claro-escuro (7:00-19:00h) controlados. Estas ratas foram acasaladas (3 fêmeas:1 macho),
recebendo água e ração comercial ad libitum até o nascimento da prole. Nosso modelo
experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética para uso animal do Instituto de Biologia Roberto
Alcântara Gomes da UERJ (CEA/183/2007), que baseou sua análise nos princípios descritos no
“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (Bayne, 1996).
Após o nascimento, separamos as ratas lactantes em 2 grupos experimentais:
• controle (C): livre acesso à água e à dieta normal (23% de proteína);
• restrição protéica (RP): livre acesso à água e à dieta hipoprotéica (8% de proteína).
No dia do nascimento, a ninhada foi ajustada em 6 filhotes machos. Este número de
animais parece conferir o maior potencial lactotrófico (Fischbeck and Rasmussen, 1987).
Utilizamos 6 mães por grupo e sacrificamos aleatoriamente 2 filhotes de cada mãe em cada
período experimental.
A dieta hipoprotéica foi elaborada em nosso laboratório e sua composição é mostrada na
tabela 1. A fonte protéica (soja) foi a ração comercial macerada (Guabi – GuabiNutrilabor, São
Paulo). A fim de se obter uma dieta hipoprotéica e isocalórica, o amido de milho foi
acrescentado. As vitaminas e os sais minerais foram compensados de acordo com as
recomendações do American Institute of Nutrition Rodents Diets AIN-93G.
Tabela 1: Composição das rações normo e hipoprotéica para 1 Kg de ração
Ingredientes (g) Controle Hipoprotéica
Proteína de soja 230.0 80.0
Amido de milho 676.0 826.0
Óleo de soja 50.0 50.0
Mistura de vitaminas** 4.0 4.0
Mistura de minerais** 40.0 40.0
Análise:
Energia Total (kcal) 4070.4 4070.4
Proteína (%) 23.0 8.0
Carboidrato (%) 66.0 81.0
Lipídios (%) 11.0 11.0
** Mistura de vitaminas e minerais formulada conforme recomendação do Instituto
Americano de Nutrição AIN-93G de dieta para roedores; contém a quantidade
recomendada de iodo (Reeves et al, 1993).
32
A restrição protéica foi iniciada ao nascimento, definido como o dia 0 e foi mantida até os
21 dias da lactação (desmame). Após o desmame, todas as proles receberam dieta normal até
o dia do sacrifício.
As proles C e RP foram sacrificadas aos 21, 90 e 180 dias de idade por decapitação e
coletamos amostras de sangue, além dos seguintes tecidos: tireóide, hipotálamo, adrenal
esquerda, fígado, músculo esquelético (sóleo), fêmur direito, tecido adiposo subcutâneo e
visceral, massa de gordura visceral (MGV) e carcaça. O sangue foi centrifugado a 3.000 rpm
(1.500xg) por 20 minutos para obtenção do soro, que foi congelado a -20ºC para posterior
análise.
Massa corporal total:
Avaliada diariamente na lactação e de 4 em 4 dias do desmame até o sacrifício.
Ingestão alimentar:
Controlada de 4 em 4 dias do desmame até o sacrifício. A quantidade ingerida de ração
foi calculada pela diferença entre o peso da ração que restou na gaiola (Rf) e a quantidade total
colocada 4 dias antes (Ri). Calculamos a ingestão diária de ração, de acordo com a fórmula:
Ingestão de ração (g) = Ri – Rf / 4,
n
Onde n corresponde ao número de ratos em cada gaiola e 4 é o número de dias.
Composição corporal:
Após sacrifício das proles aos 21, 90 e 180 dias de idade, o trato gastrointestinal foi
removido e todas as vísceras foram descartadas. Em seguida, as carcaças foram pesadas,
amolecidas em autoclave por 1h e homogeneizadas em liqüidificador com água destilada na
proporção 1:1 (Leshner et al, 1972). Todos os resultados da composição corporal foram
expressos em g/100g de carcaça (Toste et al, 2006a; Bonomo et al, 2007; Fagundes et al,
2007)
33
1. Avaliação da massa de gordura visceral (MGV)
Foi pesada para estimativa da adiposidade central e corresponde à gordura das regiões
retroperitoneal, mesentérica e epididimal (Hansen et al., 1997; Toste et al, 2006a; Bonomo et al,
2007; Fagundes et al, 2007).
2. Avaliação do conteúdo corporal total de gordura
Determinado pelo método gravimétrico descrito por Stansbie et al (1976). Alíquotas de
3g do homogeneizado da carcaça foram hidrolisadas em banho-maria a 70ºC por 2h com KOH
30% e etanol absoluto e, após acidificação com ácido sulfúrico 6M, os ácidos graxos totais e o
colesterol livre foram extraídos mediante 3 lavagens sucessivas com éter de petróleo. O
material foi transferido para um recipiente previamente pesado, e posteriormente, levado à
capela de exaustão até secagem completa, para a realização da pesagem.
3. Avaliação do conteúdo corporal total de proteína
Determinado em alíquotas de 1g do homogeneizado da carcaça, que foram aquecidas a
37ºC por 1h em KOH 0,6N, sob agitação. Após centrifugação (2.000xg/10 min), a concentração
de proteínas totais foi medida colorimetricamente no sobrenadante, segundo Lowry et al (1951),
utilizando–se curva padrão de BSA.
4. Avaliação do conteúdo corporal total de água
Cerca de 1g do homogeneizado de carcaça foi pesado e levado à estufa (90°C) e
mantidos a esta temperatura até que o peso das amostras desidratadas se mantivesse
constante (Pace & Rathbun, 1945).
5. Avaliação do conteúdo corporal total de minerais
O homogenato foi pesado e colocado em estufa (90°C) overnight, levado à mufla
(600ºC) por aproximadamente 4 h e pesada (Comizio et al, 1998).
6. Avaliação do conteúdo de minerais no osso
O fêmur direito foi limpo de qualquer tecido aderido e seco a 100
o
C por 72 h. A gordura
foi extraída por sucessivas imersões em solução de clorofórmio-metanol (3:1), a qual era
removida a cada 3 dias e o osso seco por 48 h a 100
o
C, por 15 dias. O osso livre de gordura e
seco foi pesado, medido e levado a 600
o
C até se tornar branco e cristalino. Dados expressos
em g/peso do fêmur (Rodriguez et al, 1998).
34
Dosagem de glicose proveniente do glicogênio tecidual:
Para a dosagem de glicose proveniente da hidrólise do glicogênio hepático e muscular
(sóleo), utilizamos o Kit comercial Glucox (Doles, Goiás, Brasil), que consiste em um sistema
enzimático composto por uma solução contendo tampão fosfato (pH 7,4), glicose oxidase
(GOD), peroxidase (POD), 4-aminoantipirina (4-AAP) e p-hidroxibenzoato. Ao se adicionar à
solução contendo glicose, as seguintes reações ocorrem:
GOD
Glicose + O2 + H2O →→→→ Ácido glucônico + H2O2
POD
2H2O2 + 4-AAP →→→→ 4-Antipirilquinomina + 4 H2O
O produto formado pela oxidação da 4-AAP, a 4-antipirilquinomina, era de coloração
avermelhada e a sua concentração determinada pela absorbância a 510nm. A determinação
da concentração de glicose foi feita a partir da utilização de uma curva padrão com quantidades
crescentes de glicose (Casimiro-Lopes et al, 2008).
1. Avaliação do conteúdo de glicogênio hepático
Determinado nas proles aos 21, 90 e 180 dias de idade.
O glicogênio hepático foi extraído por modificações do método de Miller (1959). O tecido
foi homogeneizado em 4 ml de TCA a 10%. Seguiu-se uma centrifugação (2.000xg/4ºC/10 min),
foi retirado 2 ml do sobrenadante e adicionou-se 5 ml de etanol absoluto. Esta mistura foi
mantida a 4ºC para precipitação do polímero de glicose, por 24 h. As amostras foram
novamente centrifugadas (2.000xg/4ºC/10 min) e ao precipitado foi adicionado 1 ml de HCl
(1N), sendo a mistura fervida por 30 minutos, para quebra do polímero de glicose. Em seguida,
foi adicionado 1 ml de NaOH (1N), para neutralizar a mistura. Após a neutralização, 200 µl da
amostra foram utilizados para a dosagem de glicose utilizando o Kit Glucox.
2. Avaliação do conteúdo de glicogênio muscular
Determinado nas proles aos 21, 90 e 180 dias de idade.
O sóleo foi homogeneizado em 1 ml de tampão (50mM Tris-HCl pH 7,2; 5mM NaF, 5mM
EGTA e 1mM DTT) e centrifugado (2000xg/4ºC/20 min.). Coletamos 600µl do sobrenadante que
foi congelado a –20ºC. No dia seguinte, 100 µl do sobrenadante foram incubados com 2
unidades de amiloglicosidase de Aspergillus niger (Sigma No. A7420, em NaAc 0,2 M, pH 4,8),
35
no volume de 200 µl, por 4h a 40ºC, para hidrolisar o glicogênio (Parrou & François, 1997).
Após incubação, o conteúdo de glicose foi dosado utilizando o Kit Glucox. Para garantir que a
glicose medida é oriunda somente da quebra do glicogênio pela amiloglicosidase, um controle
de cada amostra foi preparado na ausência da enzima, sendo a presença de glicose nestes
controles descontada da amostra que continha enzima.
Morfologia do tecido adiposo visceral e subcutâneo:
Esta análise foi realizada somente nas proles aos 180 dias de idade.
1. Confecção das lâminas histológicas
Uma amostra de tecido adiposo visceral e subcutâneo foi retirada com auxílio de uma
tesoura e pinça, sendo o material fixado em formol tamponado por 72 h. Foram realizados 5
banhos de álcool absoluto a 56
o
C por 40 minutos cada. A técnica de inclusão em parafina foi
adequada, com maior tempo de desidratação para que o tecido adiposo ficasse mais íntegro.
Em seguida, foi diafanizado com 4 banhos de xilol por 40 minutos a 56
o
C e, por fim, foram
realizados 3 banhos em parafina líquida. Os blocos de parafina, depois de prontos, foram
seccionados utilizando-se o micrótomo (Microtec-CUT 4050). As secções de 5 µm foram
coletadas em lâminas e coradas com Hematoxilina-Eosina, segundo técnica de rotina.
2. Morfometria: aquisição, captura e análise de imagens
Os cortes histológicos foram analisados por um sistema composto por um microcópio
óptico Olympus BX 40, cuja ocular é acoplada a câmera de vídeo Optronics 1-CCD, que
transmite as imagens obtidas a um microcomputador, modelo Pentium II. Esse computador
exibe imagens em um monitor SVGA. A região selecionada para análise corresponde ao campo
central das secções histológicas, que foi observado pela videocâmera utilizando-se uma
objetiva 20. A obtenção da área e do perímetro dos adipócitos foi realizada com o programa
“Image J” (Media Cybernetics). Na área de 60 µm
2
, 6 adipócitos foram escolhidos
aleatoriamente para a obtenção de área e perímetro médios. Com o auxílio do mouse, o limite
das células foi contornado.
Dosagem da Glicemia
:
Através da análise em glicosímetro (ACCU-CKEK
®
Advantage, Roche Diagnostics,
Mannheim, Germany) utilizando-se fitas-testes comerciais contendo glicose-oxidase, do sangue
coletado da veia caudal das proles em jejum de 12 h, aos 21, 90 e 180 dias de idade.
36
Dosagem da Insulinemia
:
Determinada nas proles aos 21, 90 e 180 dias de idade através de kit de RIE comercial
(ImmuChemTM125I, tubo revestido, ICN Biomedicals, Inc, USA), com coeficiente de variação
intra-ensaio de 4,22%. Os resultados foram expressos em µUI/mL e o limite de detecção do
ensaio foi de 0,1 a 10 ng/mL
Estimativa de sensibilidade insulínica:
Avaliamos a sensibilidade insulínica de duas formas:
• Razão insulina (µUI/mL) / glicose (mmol/L)
• Índice de resistência insulínica (IRI): insulina (µUI/mL) X glicemia (mmol/L)
Dosagem da adiponectinemia:
Determinada nas proles aos 21 e 180 dias de idade por RIE específico para murinos
(ImmuChemTM 125I, duplo anticorpo, LINCO Research, Inc, USA). O coeficiente de variação
intra-ensaio foi 3,73%. O limite de detecção do ensaio foi de 0,5 a 100 ng/mL
Dosagem da corticosteronemia total:
Determinada nas proles aos 21, 90 e 180 dias de idade por por RIE específico
(ImmuChemTM
125
I, duplo anticorpo, ICN Biomedicals, Inc, USA). O coeficiente de variação
intra-ensaio foi 7,1%.
Avaliação das catecolaminas totais (adrenalina e noradrenalina):
1. Conteúdo adrenal in vivo
Determinado pelo método fluorimétrico do trihidroxiindol (Trevenzoli et al, 2007) nas
proles aos 21, 90 e 180 dias de idade.
A adrenal foi homogeneizada em 500 µl de ácido acético 10% usando um
ultrassonicador e centrifugada (10.000xg/ 5 min). Em 50µl do sobrenadante, foram adicionados
250µl de tampão fosfato 0,5 M, pH 7,0 e a seguir, 25µl de ferricianeto de potássio 0,5%. A
solução foi incubada por 20 minutos. A reação foi paralisada com 500µl de ácido
ascórbico/NaOH 10N (1:19). Após, adicionamos 2 ml de água destilada e a leitura de
fluorescência foi realizada (420nm para excitação e 510nm para emissão). Todas as estapas
37
foram realizadas em banho de gelo. Paralelamente à dosagem de catecolaminas foi feita uma
curva padrão de adrenalina. Os resultados foram expressos em µM de catecolaminas.
2. Secreção in vitro
As medulas adrenais das proles de 180 dias de idade foram mantidas em solução salina
Krebs-Hepes com 0,5% de albumina, composta por (em mM): Cl
-
154,26; Na
+
143,4; Ca
2+
2,5;
Mg
2+
1,18; SO
4
2-
1,2; K
+
5,9 e Hepes 25. Adicionamos glicose para uma concentração final
∼85mg/dL, próxima da glicemia. A secreção de catecolaminas foi obtida pela incubação do
explante na ausência (basal) e na presença de estímulo (cafeína). Para preservar a
osmolaridade do sistema, a solução estimuladora teve menor quantidade de sódio, equivalente
à de cafeína acrescentada, em mM. A medula foi transferida a meios sem cafeína para retornar
as condições basais. Ao fim da incubação, acrescentamos 20µl de ácido acético para conservar
as catecolaminas e armazenamos a -20ºC para posterior dosagem pelo método fluorimétrico do
trihidroxiindol (Trevenzoli et al, 2007).
Esquema 1: Sistema in vitro de avaliação da secreção basal
e estimulada de catecolaminas totais em medula adrenal
isolada de ratos programados aos 180 dias de vida.
Determinação das proteínas séricas:
Quantificadas nas proles aos 21, 90 e 180 dias de idade.
A reação do Biureto (Gornall et al, 1949) foi realizada para medir as proteínas séricas
totais e a absorbância dos produtos foi lida em espectrofotômetro (automated A15 BioSystems®
analyzer). A albumina sérica foi determinada pelo método do verde de bromocresol (Doumas et
al, 1971) e a fração globulina foi medida pela diferença entre a proteína total e a albumina. Os
valores foram expressos em mg/dL.
Avaliação do perfil lipídico:
Quantificadas nas proles aos 21, 90 e 180 dias de idade.
Medula grupo C
Solução salina
Krebs-Hepes
Cafeína
25mM
Medula grupo RP
5 10 15 20 25 30
Tempo (min)
Temp. 25ºC
38
As concentrações séricas de colesterol total (CT), triglicerídeos, das frações HDL-
colesterol (HDL-c), foram avaliados por método enzimático colorimétrico Biosystem ® (Simões
et al, 2007). Os valores de LDL-c and VLDL-c foram obtidos usando a fórmula de Friedewald
(1972):
1) LDL-c (mg/dL) = colesterol total – (Triglicerídeos/5) – HDL-c
2) VLDL-c (mg/dL) = Trigliceíideos/5
Os índices de Castelli I e II foram obtidos através da seguintes fórmulas:
1) Índice de Castelli I = Colesterol total / HDL -c
2) Índice de Castelli II = LDL-c / HDL-c
Cascata de sinalização de leptina no hipotálamo e na tireóide:
Os tecidos das proles aos 21 e 180 dias de idade foram homogeneizados em tampão de
lise a 4
o
C (50mM Hepes pH 6,4, 1mM MgCl
2
10mM EDTA, Triton X-100 1%,1 mg/ml de
aprotinina, 1 mg/ml de leupeptina e 1 mg/ml de SBTI) e armazenados a -20
o
C. A dosagem
protéica foi determinada pelo método de Bradford (1976).
Colocamos 40µg e 100µg de proteína das amostras (hipotálamo e tireóide,
respectivamente) em gel de acrilamida 10% (SDS-PAGE) para separação das proteínas (Sone
et al, 2001; Nowak et al, 2002). As amostras foram então transferidas para uma membrana de
nitrocelulose ou PVDF (Amersham Biosciences) por 1 h utilizando-se o sistema Semi-dry
(BIO-RAD, CA, EUA). Após bloqueio, a membrana foi incubada overnight com anticorpo
primário específico para cada proteína a ser detectada (Ob-Rb, JAK2, STAT3, SOCS3). Depois
de 3 lavagens com tampão T-TBS (0,1% Tween em TBS), seguiu-se então uma incubação
adicional com o anticorpo secundário conjugado com a biotina por 1h sob agitação, seguido da
incubação com peroxidase conjugada com estreptavidina. Após lavagem da membrana
com tampão T-TBS, as proteínas imunorreativas foram visualizadas pela marcação com
3,3’-diaminobenzidina (DAB) (5mg em 15ml de tampão Tris 0,1 M pH 7,4) para hipotálamo ou
por quimioluminescência (ECL, Amersham Biosciences) para tireóide. As bandas foram
quantificadas por densitometria, utilizando o software Scion Image.
Dosagem de Proteína:
Utilizamos os métodos de Bradford (1976) e Lowry et al (1951). O BSA foi usado para
elaborar a curva padrão, sendo a leitura da absorbância realizada a 595nm.
39
Análise Estatística:
Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Utilizamos o
two-way ANOVA (análise de variância bivariada) para avaliar as evoluções de massa corporal e
consumo alimentar. Para os demais dados utilizamos o teste t student não pareado. As
diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
40
Resultados
Massa corporal e Ingestão alimentar
Corroborando dados anteriores do nosso grupo, verificamos que a prole RP mostrou
menor ganho de massa corporal (F
62,2596
=21.82; p<0.0001), desde a lactação (-41% ao
desmame) até os 180 dias de idade (-18%; fig 1A), apesar de não apresentar alteração no
consumo alimentar relativo à massa corporal após o desmame (fig 1B).
(A)
(B)
Figura 1: Evolução de massa corporal (A) e ingestão de ração (B) do desmame até os 180 dias de vida
dos ratos cujas mães foram submetidas à dieta normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação, n= 12
animais/grupo. Valores representam média ± EPM, * p<0,05.
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
100
200
300
400
500
600
C
RP
*
Dias
MAssa corporal (g)
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
100
200
300
400
500
600
C
RP
*
Dias
MAssa corporal (g)
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
5
10
15
20
25
C
RP
Dias
Ingestão de ração/100g PC (g)
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0
5
10
15
20
25
C
RP
Dias
Ingestão de ração/100g PC (g)
0 5 10 15 20 25
0
10
20
30
40
50
C
RP
*
Dias
Massa corporal (g)
0 5 10 15 20 25
0
10
20
30
40
50
C
RP
*
Dias
Massa corporal (g)
41
Composição corporal
A tabela 2 mostra a composição corporal dos animais adultos cujas mães foram
submetidas ou não à RP durante a lactação.
A MGV do grupo RP foi menor aos 90 e aos 180 dias de idade (-14%, -19%; p<0,05,
respectivamente), assim como o conteúdo de gordura total (-16%, -14%; p<0,05,
respectivamente). O conteúdo de proteína corporal foi menor na prole RP aos 21 dias de idade
(-20%, p<0,05), não diferindo nos demais períodos analisados. O conteúdo de água corporal
total apresentou-se significativamente maior, na prole RP, apenas aos 21 dias de idade (+3%, p
<0,05). Na prole RP, o conteúdo mineral não foi modificado em nenhum dos períodos avaliados.
Tabela 2 : Composição corporal dos animais programados pela RP na lactação
21 dias
90 dias
180 dias
C
1,1 ± 0,2 2,8 ± 0,1 3,6 ± 0,2
MGV
(g/100g PC)
RP
1,1 ± 0,1 2,4 ± 0,1* 2,9 ± 0,1*
C
9,0 ± 0,9 6,8 ± 0,3 9,2 ± 0,4
Gordura Corporal
(g/100g carcaça)
RP
10,3 ± 0,4 5,7 ± 0,2* 7,9 ± 0,5*
C
12,2 ± 0,4 9,0 ± 0,9 8,3 ± 0,9
Proteína corporal
(g/100g carcaça)
RP
9,8 ± 0,4* 10,3 ± 0,4 7,5 ± 0,7
C
66,8 ± 0,6 62,9 ± 1,4 62,5 ± 1,3
Água corporal
(g/100g carcaça)
RP
68,9 ± 0,8* 63,4 ± 0,8 63,2 ± 0,8
C
2,9 ± 0,1 4,5 ± 0,8 3,9 ± 0,9
Cinzas corporais
(g/100g carcaça)
RP
3,0 ± 0,1 3,4 ± 0,6 2,7 ± 0,4
Valores representam média ± EPM; n=12 animais/grupo; * p<0,05
42
A avaliação dos fêmores da prole programada ou não pela RP materna na lactação e o
conteúdo de glicogênio tecidual (hepático e muscular) são mostrados na tabela 3.
Os animais RP apresentam aos 21, 90 e 180 dias de idade, fêmores com menor peso (-
53%, -12%, -9%, respectivamente; p<0,05), menor comprimento (-18%, -6%, -5%,
respectivamente; p<0,05) e menor diâmetro (-30%, -7%, -7%, respectivamente; p<0,05), mas
sem alteração no conteúdo das cinzas.
Em relação ao glicogênio tecidual, observou-se que o conteúdo de glicogênio hepático
foi maior na prole RP somente aos 21 dias de idade (+1,04 vezes, p<0,05), enquanto o
conteúdo de glicogênio muscular foi maior no grupo RP apenas aos 180 dias (+106%; p<0,05,
fig 3C), embora estes animais apresentem, desde os 90 dias de idade, tendência a maior
conteúdo (+84%; p=0,16) quando comparado ao grupo controle.
Tabela 3: Minerais ósseos e glicogênio tecidual dos animais programados pela RP na lactação
21 dias
90 dias
180 dias
C
0,05 ± 0,003 0,5 ± 0,02 0,6 ± 0,02
Peso do fêmur
(g)
RP
0,02 ± 0,001* 0,4 ± 0,01* 0,5 ± 0,02*
C
1,7 ± 0,06 3,7 ± 0,03 3,7 ± 0,04
Comprimento do fêmur
(cm)
RP
1,4 ± 0,02* 3,4 ± 0,05* 3,5 ± 0,05*
C
0,3 ± 0,005 0,4 ± 0,007 0,4 ± 0,009
Diâmetro do fêmur
(cm)
RP
0,2 ± 0,006* 0,3 ± 0,006* 0,3 ± 0,01*
C
67,6± 0,5 39,8± 0,2 35,9± 0,3
Cinzas
(g/100g osso)
RP
70,2 ± 1,1 40,0 ± 0,3 35,9 ± 0,2
C
1,5 ± 0,2 0,8 ± 0,1 0,5 ± 0,03
Glicogênio hepático
(mM/g tecido)
RP
3,0 ± 0,3* 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,06
C
22,0 ± 9,2 22,3 ± 6,9 21,4 ± 2,1
Glicogênio muscular
(µM/mL.g tecido)
RP
26,6 ± 10,6 41,0 ± 10,6 44,2 ± 9,2*
Valores representam média ± EPM; n=12 animais/grupo; * p<0,05
43
Morfologia do Tecido Adiposo
A figura 2 mostra a morfologia do adipócito subcutâneo e visceral.
Os animais RP apresentam, no tecido adiposo subcutâneo, menor área e menor
perímetro (-15% e -6%, respectivamente, p< 0,05; figura 2A e 2B), assim como no tecido
adiposo visceral (-41% e -22%, respectivamente, p< 0,05; figura 2C e 2D).
(A) (B)
(C) (D)
C RP
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
*
Área de adipócitos
subcutâneos (
µ
m²)
C RP
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
*
Área de adipócitos
subcutâneos (
µ
m²)
C RP
0
100
200
300
400
*
Perímetro de adipócitos
viscerais (
µ
m)
C RP
0
100
200
300
400
*
Perímetro de adipócitos
viscerais (
µ
m)
C RP
0
50
100
150
200
250
300
350
*
Perímetro de adipócitos
subcutâneos (
µ
m)
C RP
0
50
100
150
200
250
300
350
*
Perímetro de adipócitos
subcutâneos (
µ
m)
C RP
0
2000
4000
6000
8000
10000
*
Área de adipócitos
viscerais (
µ
m²)
C RP
0
2000
4000
6000
8000
10000
*
Área de adipócitos
viscerais (
µ
m²)
44
(E)
(F)
Figura 2: Área e perímetro de adipócitos subcutâneos (A e B) e viscerais (C e D); Secções histológicas de
tecido adiposo subcutâneo (E) e visceral (F) dos ratos aos 180 dias cujas mães foram submetidas à dieta
normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação; Objetiva 20x; A → adipócito; n=12 animais/grupo.
Valores representam média ± EPM, *p<0,05
Controle –
adipócito
subcutâneo
RP –
adipócito
subcutâneo
Controle –
adipócito
subcutâneo
Controle –
adipócito
subcutâneo
RP –
adipócito
subcutâneo
RP –
adipócito
subcutâneo
Controle –
adipócito
visceral
RP –
adipócito
visceral
Controle –
adipócito
visceral
Controle –
adipócito
visceral
RP –
adipócito
visceral
RP –
adipócito
visceral
A
A
A
A
45
Avaliação do Metabolismo Glicídico
A tabela 4 mostra alguns parâmetros do metabolismo glicídico da prole cujas mães
foram submetidas à RP durante a lactação.
A glicemia dos animais RP foi menor apenas aos 180 dias de idade (-17%, p<0,05),
enquanto a insulinemia foi menor aos 21 e 180 dias de vida (-63%, e -24%, p<0,05;
respectivamente), Em relação à estimativa de sensibilidade à insulina, os animais RP
apresentaram tanto a razão insulina/glicemia como o IRI menores apenas aos 21 dias (ambos -
60%,p<0,05).
Tabela 4: Avaliação do Metabolismo Glicídico dos animais programados pela RP durante a lactação
21 dias
90 dias
180 dias
C
95,50 ± 2,8 95,1 ± 2,5 80,9 ± 3,7
Glicemia
(mg/dL)
RP
89,3 ± 3,5 93,3 ± 1,5 67,00 ± 2,0*
C
56,7 ± 5,8 95,2 ± 7,1 67,4 ± 5,8
Insulinemia
(µUI/mL)
RP
21,2 ± 3,5* 96,6 ± 4,2 51,4 ± 4,3*
C
11,14 ± 1,38 18,13 ± 1,18 13,01 ± 0,97
Razão I/G
RP
4,37 ± 0,91* 19,75 ± 1,56 12,33 ± 0,68
C
290,3 ± 24,1 502,5 ± 47,6 268,1 ± 33,7
IRI
RP
115,2 ± 13,1* 536,3 ± 43,6 238,6 ± 33,0
Valores representam média ± EPM; n=12 animais/grupo; * p<0,05
A figura 3 mostra os resultados de adiponectina sérica dos animais cujas mães foram
submetidas à RP durante a lactação. A prole RP apresentou maior adiponectina sérica aos 21
dias de idades (+169%, p< 0,05; fig 3A).
46
(A) (B)
Figura 3: Adiponectina sérica aos 21 (A) e 180 (B) dias de vida dos ratos cujas mães foram submetidas à
dieta normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação, n=12 animais/grupo. Valores representam média
± EPM, *p<0,05.
Avaliação da função adrenal
A corticosterona sérica e o conteúdo intra-glandular de catecolaminas são mostrados na
tabela 5. Na prole RP, a corticosteronemia e o conteúdo de catecolaminas na medula adrenal
apresentaram-se maior aos 180 dias de idade (+50%, + 98%; p< 0,05, respectivamente), sem
qualquer alteração nos outros períodos estudados.
Tabela 5: Corticosteronemia e conteúdo de catecolaminas na adrenal dos animais programados pela RP
durante a lactação
21 dias
90 dias
180 dias
C
137,7 ± 11,4 464,8 ± 102,6 461,0 ± 32,9
Corticosteronemia
(ng/dL)
RP
138,9 ± 8,9 327,9 ± 40,4 695,8 ± 88,9*
C
1,7 ± 0,2 20,8 ± 2,7 30,7 ± 3,4
Conteúdo intra-glandular de
catecolaminas (µM)
RP
1,5 ± 0,3 21,4 ± 1,9 61,0 ± 13,8*
Valores representam média ± EPM; n=12 animais/grupo; * p<0,05
C RP
0
10
20
30
*
Adiponectina(µg/mL)
C RP
0
10
20
30
*
Adiponectina(µg/mL)
C RP
0
2
4
6
Adiponectina (µg/mL)
C RP
0
2
4
6
Adiponectina (µg/mL)
47
A figura 4 mostra a secreção de catecolaminas estimulada in vitro por cafeína. A prole
RP apresentação maior secreção
in vitro aos 15, 20 e 25 minutos (+39%, +26% e +21%,
respectivamente; p<0,05).
Figura 4: Secreção de catecolaminas estimulada in vitro por cafeína de animais aos 180 dias de vida
cujas mães foram submetidas à dieta normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação, n= 12
animais/grupo. Valores representam média ± EPM, *p<0,05
Avaliação das proteínas séricas e do perfil lipídico
As tabelas 6 e 7 mostram a avaliação das proteínas séricas e o perfil lipídico de ratos
programados pela RP materna durante a lactação.
Os animais RP apresentam menores concentrações séricas de proteínas totais,
albumina e globulina apenas aos 21 dias de idade (-17%, -21%, -12%, respectivamente;
p<0,05), normalizando-se nos demais períodos estudados.
Em relação ao perfil lipídico, os ratos RP apresentam maior LDL-c, índice de Castelli I e
II (+69%, +27%, +80%, respectivamente; p<0.05), menor VLDL-c e triglicerídeos (-43%, -42%,
respectivamente; p<0.05) aos 21 dias de idade. Aos 90 dias, esta prole apresenta menor VLDL-
c e triglicerídeos (-35%, -39%, respectivamente; p<0.05). Verificamos menor colesterol total nos
animais RP apenas aos 180 dias (-16%, p<0.05). Nenhuma alteração foi observada nos níveis
de HDL-c, nos diferentes períodos analisados.
5 10 15 20 25 30
0
200
400
600
800
1000
1200
C
RP
*
*
*
Tempo (min)
Catecolaminas
(nM/mg de adrenal)
5 10 15 20 25 30
0
200
400
600
800
1000
1200
C
RP
*
*
*
Tempo (min)
Catecolaminas
(nM/mg de adrenal)
48
Tabela 6: Proteínas séricas e perfil lipídico dos animais programados pela RP durante a lactação
21 dias 90 dias 180 dias
C
4,4 ± 0,1 6,7 ± 0,1 6,6 ± 0,3
Proteínas totais (mg/dL)
RP
3,7 ± 0,1* 6,5 ± 0,1 6,3 ± 0,1
C
2,2 ± 0,1 2,9 ± 0,1 2,9 ± 0,2
Albumina (mg/dL)
RP
1,8 ± 0,1* 2,9 ± 0,1 2,8 ± 0,1
C
2,2 ± 0,1 3,7 ± 0,1 3,7 ± 0,1
Globulina (mg/dL)
RP
1,9 ± 0,1* 3,6 ± 0,1 3,5 ± 0,1
Valores representam média ± EPM; n=12 animais/grupo; * p<0,05
Tabela 7: Perfil lipídico dos animais programados pela RP durante a lactação
21 dias 90 dias 180 dias
C
101,3 ± 7,5 49,7 ± 2,8 68,0 ± 2,7
Colesterol total (mg/dL)
RP
123,6 ± 10,7 54,5 ± 1,4 57,8 ± 0,9*
C
24,3 ± 1,4 19,3 ± 1,1 23,9 ± 1,4
HDL-c (mg/dL)
RP
22,4 ± 0,9 19,1 ± 0,9 20,9 ± 1,4
C
50,1 ± 4,7 17,5 ± 2,9 30,2 ± 3,7
LDL-c (mg/dL)
RP
85,2 ± 8,7* 24,1 ± 3,1 29,1± 1,3
C
23,6 ± 3,3 20,0 ± 1,9 8,9 ± 0,9
VLDL-c (mg/dL)
RP
13,4 ± 2,4* 13,1 ± 0,9* 10,8 ± 1,2
C
97,3 ± 10,9 106,3 ± 8,1 45,4 ± 4,1
Triglicerídeos (mg/dL)
RP
57,0 ± 6,1* 65,4 ± 4,3* 44,9 ± 2,8
C
4,1 ± 0,1 2,6 ± 0,1 2,7 ± 0,1
Índice de Castelli I
RP
5,2 ± 0,3* 3,1 ± 0,2 2,9 ± 0,2
C
2,0 ±0,1 0,5 ± 0,2 1,3 ± 0,2
Índice de Castelli II
RP
3,6 ±0,2* 0,9 ± 0,2 1,4 ± 0,2
Valores representam média ± EPM; n=12 animais/grupo; * p<0,05
49
Cascata de sinalização de leptina no hipotálamo
A prole RP aos 21 dias de idade não apresentou alterações nas expressões
hipotalâmicas de Ob-Rb (fig 5A), JAK-2 (fig 5B), STAT3 (fig 5C) ou SOCS3 (fig 5D).
(A) (B)
(C) (D)
Figura 5: Expressão do Ob-Rb (A), JAK-2 (B), STAT-3 (C) e SOCS3 (D) em hipotálamo de animais aos
21 dias de vida cujas mães foram submetidas à dieta normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação,
n= 7animais/grupo. Valores representam média ± EPM, *p<0,05
Anti-ObR
C RP
Anti-β Actina
Anti-ObR
C RPC RP
Anti-β Actina
Anti-JAK2
C RP
Anti-β Actina
Anti-JAK2
C RPC RP
Anti-β Actina
Anti-STAT-3
Anti-β Actina
C RP
Anti-STAT-3
Anti-β Actina
C RPC RP
Anti-SOCS
C RP
Anti-β Actina
Anti-SOCS
C RPC RP
Anti-β Actina
C RP
0
5000
10000
15000
Expressão de ObR no hipotálam
o
(unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
Expressão de ObR no hipotálam
o
(unidades arbitrárias)
CRP
0
2500
5000
7500
10000
12500
Expressão de JAK2 no hipotálam
o
(unidades arbitrárias)
CRP
0
2500
5000
7500
10000
12500
Expressão de JAK2 no hipotálam
o
(unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
Expressão de STAT3 no hipotálamo
(unidades arbitrarias)
C RPC RP
0
5000
10000
15000
Expressão de STAT3 no hipotálamo
(unidades arbitrarias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de SOCS no hipotálamo
(unidades arbitrárias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de SOCS no hipotálamo
(unidades arbitrárias)
50
Aos 180 dias de vida, observamos menor expressão de STAT3 (-55%, p<0,05; fig 6C)
no hipotálamo da prole RP, não havendo alteração das demais proteínas da via de sinalização.
(A) (B)
(C) (D)
Figura 6: Expressão do Ob-Rb (A), JAK-2 (B), STAT-3 (C) e SOCS3 (D) em hipotálamo de animais aos
180 dias de vida cujas mães foram submetidas à dieta normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação,
n= 7 animais/grupo. Valores representam média ± EPM, *p<0,05
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de ObR no Hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de ObR no Hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
25000
*
Expressão de STAT-3 no Hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
25000
*
Expressão de STAT-3 no Hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
25000
Expressão de SOCS no Hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
25000
Expressão de SOCS no Hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
Expressão de JAK2 no hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
Expressão de JAK2 no hipotálamo
(Unidades arbitrárias)
Anti-ObR
C RP
Anti-β Actina
Anti-ObR
C RPC RP
Anti-β Actina
Anti-JAK2
Anti-β Actina
C RP
Anti-JAK2
Anti-β Actina
C RPC RP
Anti-SOCS
Anti-β Actina
C RP
Anti-SOCS
Anti-β Actina
C RPC RP
Anti-STAT3
Anti-β Actina
C RP
Anti-STAT3
Anti-β Actina
C RPC RP
51
Cascata de sinalização de leptina na tireóide
A prole RP aos 21 dias de idade apresentou menor expressão tireoideana de Ob-Rb (-
63%, p<0,05; fig 7A) e maior expressão de JAK-2 (+115%, p<0,05; fig 7B), não apresentando
alteração de STAT3 e SOCS3.
(A) (B)
(C) (D)
Figura 7: Expressão do Ob-Rb (A), JAK-2 (B), STAT-3 (C) e SOCS3 (D) em tireóide de animais aos 21
dias de vida cujas mães foram submetidas à dieta normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação, n= 7
animais/grupo. Valores representam média
± EPM, *p<0,05
Anti-ObR
C RP
Anti-β Actina
Anti-ObR
C RPC RPC RP
Anti-β Actina
C RP
0
5000
10000
15000
*
Expressão de ObR na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
*
Expressão de ObR na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
2500
5000
7500
10000
*
Expressão de JAK2 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
2500
5000
7500
10000
*
Expressão de JAK2 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
25000
Expressão de STAT 3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
5000
10000
15000
20000
25000
Expressão de STAT 3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
Anti-JAK2
C RP
Anti-β Actina
Anti-JAK2
C RP
Anti-β Actina
Anti-STAT3
C RP
Anti-β Actina
Anti-STAT3
C RP
Anti-β Actina
Anti-SOCS
C RP
Anti-β Actina
Anti-SOCS
C RP
Anti-β Actina
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de SOCS3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de SOCS3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
52
Aos 180 dias de vida, a prole RP exibiu apenas menor expressão de JAK-2 na tireóide
(-61%, p<0,05; fig 8B).
(A) (B)
(C) (D)
Figura 8: Expressão do Ob-Rb (A), JAK-2 (B), STAT-3 (C) e SOCS3 (D) em tireóide de animais aos 180
dias de vida cujas mães foram submetidas à dieta normal (C) ou restrição protéica (RP) na lactação. n= 7
animais/grupo, Valores representam média
± EPM, *p<0,05
C RP
0
2500
5000
7500
10000
12500
Expressão de ObR na tire
ó
ide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
2500
5000
7500
10000
12500
Expressão de ObR na tire
ó
ide
(unidades arbitrárias)
Anti-ObR
C RP
Anti-β Actina
Anti-ObR
C RPC RPC RP
Anti-β Actina
Anti-JAK2
C RP
Anti-β Actina
Anti-JAK2
C RP
Anti-β Actina
Anti-JAK2
C RP
Anti-β Actina
Anti-SOCS
C RP
Anti-β Actina
Anti-SOCS
C RP
Anti-β Actina
C RP
0
2000
4000
6000
8000
10000
*
Expressão de JAK2 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
2000
4000
6000
8000
10000
*
Expressão de JAK2 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão SOCS3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão SOCS3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de STAT3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
C RP
0
10000
20000
30000
Expressão de STAT3 na tireóide
(unidades arbitrárias)
Anti-STAT3
Anti-β Actina
C RP
Anti-STAT3
Anti-β Actina
C RPC RP
53
RESUMO DOS DADOS APRESENTADOS NESTE TRABALHO
Ratos programados pela RP materna na lactação
21 dias 90 dias 180 dias
Peso Corporal
Ð Ð Ð
Consumo Alimentar N N N
Massa de Gordura Visceral N
Ð Ð
Gordura corporal total N
Ð Ð
Proteína corporal total
Ð
N N
Água corporal total
Ï
N N
Cinzas corporais N N N
Peso do fêmur
Ð Ð Ð
Comprimento do fêmur
Ð Ð Ð
Diâmetro do fêmur
Ð Ð Ð
Cinzas no fêmur N N N
Glicogênio hepático
Ï
N N
Glicogênio muscular N N
Ï
Área do tecido adiposo subcutâneo --- ---
Ð
Perímetro do tecido adiposo subcutâneo --- ---
Ð
Área do tecido adiposo visceral --- ---
Ð
Perímetro do tecido adiposo visceral --- ---
Ð
Glicemia N N
Ð
Insulina sérica
Ð
N
Ð
Relação I/G
Ð
N N
Produto I.G
Ð
N N
Adiponectina sérica
Ï
N N
Corticosterona sérica N N
Ï
Conteúdo de Catecolaminas N N
Ï
Secreção “in vitro” de catecolaminas --- ---
Ï
Proteínas totais
Ð
N N
Albumina
Ð
N N
Globulina
Ð
N N
Colesterol Total N N
Ð
HDL-c N N N
LDL-c
Ï
N N
VLDL-c
Ð Ð
N
Triglicerídeos
Ð Ð
N
Índice Castelli I
Ï
N N
Índice Castelli II
Ï
N N
Expressão de ObR no hipotálamo N ----- N
Expressão de JAK-2 no hipotálamo N ----- N
Expressão de STAT no hipotálamo N --
Ð
Expressão de SOCS no hipotálamo N ----- N
Expressão de ObR na tireóide
Ð
-- N
Expressão de JAK-2 na tireóide
Ï
--
Ð
Expressão de STAT na tireóide N ----- N
Expressão de SOCS na tireóide N ----- N
54
Discussão
A lactação é um período crítico para o desenvolvimento dos mamíferos, sendo
importante para o estabelecimento do fenômeno da programação (Moura & Passos, 2005).
Devido a isto, fatores nutricionais, como a restrição protéica quando impostos à mãe nesta fase
podem influenciar o crescimento da prole.
Corroborando com os dados anteriores do nosso laboratório (Passos et al, 2000;
Teixeira et al, 2002; De Moura et al, 2007; Fagundes et al, 2007), as proles cujas mães
receberam dieta hipoprotéica (8% de proteína) na lactação apresentaram menor peso corporal
durante a lactação, que não foi revertido pela introdução da dieta comercial (23% de proteína)
após o desmame, apresentando menor ganho de peso até os 180 dias de idade.
Ao desmame, o conteúdo de água corporal total foi discretamente maior nos filhotes RP,
sem alteração dos conteúdos de gordura e cinzas corporais. Neste mesmo período (21 dias de
idade), o único compartimento em menor proporção foi a proteína corporal total, sugerindo que
este é o principal responsável pelo menor peso corporal da prole RP. Este resultado já era
esperado, pois nesta fase, a mãe ainda se encontra em uso de dieta hipoprotéica. É sabido que
as ratas lactantes RP apresentam hipofagia, causada pela combinação da hiperleptinemia e
hipoprolactinemia (Lisboa et al, 2006) e conseqüentemente, transfere um leite um leite
deficiente em proteína e em volume (Passos et al, 2000). Além disso, como a leptinemia da
prole RP varia durante a lactação, sendo menor no início e maior no final (Teixeira et al, 2002),
esta variável deve ser levada em consideração e não somente a quantidade e a concentração
de nutrientes do leite produzido. Estas mesmas alterações também podem explicar os menores
níveis de proteínas séricas totais e frações na prole RP ao desmame, refletindo uma
desnutrição visceral (baixo estoque), uma vez que a albumina é principalmente produzida por
vísceras (por exemplo, fígado e rim) e é considerada um importante marcador de desnutrição
(Ikizler et al, 1999). Nas idades mais avançadas, há uma normalização destes parâmetros pois
estes animais passam a receber dieta normoprotéica.
Acreditamos que o menor acúmulo de proteína corporal nos animais desnutridos ao final
da lactação possa ser decorrente da redução do GH, uma vez que estes ratos apresentam
menor expressão hipofisária de RNAm para GH, e essa alteração traz como conseqüência um
menor comprimento naso-anal na prole RP (De Moura et al, 2007). O GH, além de estimular o
crescimento via IGF-1, age diretamente sobre o músculo aumentando a síntese protéica e
diminuindo o catabolismo (Casanueva & Dieguez, 1998), e portanto, na sua deficiência, explica
além do comprimento, o menor peso da prole RP.
55
Apenas ao desmame, o conteúdo hepático de glicogênio foi maior nos filhotes das mães
RP, apesar da hipoinsulinemia e das concentrações inalteradas de glicocorticódes séricos e
catecolaminas na adrenal. Isto corrobora o estudo de Gosby et al (2003) que mostraram que
ratos com 10 e 26 dias de vida cujas mães sofreram desnutrição protéica na gestação e
lactação, apresentaram maior conteúdo de glicogênio hepático. A leptina aumenta a síntese de
glicogênio hepático (Berti et al, 1997; Aiston & Agius, 1999) e diminui a sua degradação
(O’Doherty et al, 1999). Como a prole RP apresenta hiperleptinemia ao desmame (Teixeira et
al, 2002), sugerimos que o maior conteúdo de glicogênio hepático detectado em nosso trabalho
é, em parte, explicado pela ação da leptina.
Quanto à glicemia, a prole RP aos 21 dias de idade não mostrou qualquer alteração,
embora estes animais apresentem menores insulinemia, razão I/G e produto IxG. Como o
aumento de ambos os parâmetros (I/G e IxG) refletem resistência à insulina (Matthews et al,
1985; Ahren & Scheurink, 1998; Festen et al, 2007), sugerimos que a prole RP apresente maior
sensibilidade insulínica neste período da vida. Esta hipótese pôde ser confirmada pelo aumento
da adiponectina sérica nestes animais ao desmame, uma vez que este hormônio está
relacionado com a sensibilidade à insulina (Hotta et al, 2000; Yamauchi et al, 2001; Maeda et al,
2002; Combs et al, 2003). Além disso, estes achados podem ser parcialmente responsáveis
pelo maior acúmulo de glicogênio hepático observado ao desmame. Nosso trabalho corrobora
Latorraca et al (1998), que mostraram que a restrição protéica na gestação e lactação reduz a
secreção de insulina, mas aumenta a sua sensibilidade em ratos ao desmame.
A menor concentração circulante de insulina aos 21 dias de vida da prole RP pode estar
associada aos maiores níveis de leptina sérica previamente mostrados por Teixeira et al (2002),
uma vez que já foi evidenciado que a leptina inibe a produção de insulina, através de sua ação
direta na célula β (Kieffer & Habener, 2000).
Ao contrário da lactação, na idade adulta (90 e 180 dias), o menor peso corporal da
prole RP pode ser atribuído ao menor conteúdo de gordura, tanto visceral, quanto total.
Em relação à morfologia do tecido adiposo visceral e subcutâneo da prole RP aos 180
dias de idade, encontramos menores área e perímetro em ambos os tipos de adipócitos. Desta
forma, complementando o achado de menor conteúdo de gordura corporal, os adipócitos da
prole RP são pouco desenvolvidos. Isto corrobora Almeida & Mello (2004), que mostraram que
a desnutrição intra-uterina reduz o tamanho dos adipócitos.
Após o desmame, ambas as proles RP e C receberam ração comercial normoprotéica
(23% de proteína) até os 180 dias de vida. O conteúdo de proteína corporal total normal na vida
adulta sugere que estes animais recuperaram a deficiência de proteína corporal apresentada
56
durante a lactação. Além disso, a ingestão de quantidades adequadas de proteínas contribuiu
também para uma recuperação parcial no ganho de peso dos animais, já que aos 180 dias de
vida, a diferença entre os grupos C e RP foi de apenas 18%, enquanto ao desmame foi de 41%.
Em relação ao perfil de proteínas séricas dos animais RP, nenhuma alteração foi encontrada
aos 90 e 180 dias, sugerindo que a ingestão de quantidades normais de proteína após o
desmame recuperou a síntese de proteínas séricas viscerais.
Ambos os parâmetros, menor peso corporal e não alteração do consumo alimentar após
o desmame, sugerem uma disfunção metabólica na prole RP (fenótipo “desperdiçador”). Esta
hipótese pode ser confirmada pelo menor conteúdo de gordura central e total verificada desde
os 90 dias de idade. Recentemente (Fagundes et al, 2007) demonstramos que os animais RP
aos 180 dias de idade apresentaram menor conteúdo de gordura (33%), menor insulinemia
(26%), maior corticosteronemia (51%) e maior conteúdo de catecolaminas intra-adrenal (90%)
(dados confirmados nesta Tese) que poderiam contribuir para um aumento da lipólise ou
inibição da lipogênese, justificando a menor adiposidade. Além disso, esta prole apresenta
hipertireoidismo (Passos et al, 2002), evidenciando que estes animais programados
desenvolvem um provável hipermetabolismo.
Na avaliação in vitro da secreção de catecolaminas da medula estimulada por cafeína,
observamos maior secreção destas pela prole RP adulta. Portanto, podemos crer que estes
animais produzem e liberam mais catecolaminas. Este achado pode ser responsável pela
menor insulinemia, uma vez que as catecolaminas inibem a secreção de insulina através dos
receptores α1 nas células β (Ahren et al, 1984).
Aos 90 e 180 dias de vida a prole RP não apresentou diferença em relação ao conteúdo
corporal total de água. O fato de não detectarmos diferença deste compartimento corporal pode
se dever à baixa sensibilidade do método para detectar variações pequenas na água corporal.
O método considerado como padrão-ouro para esta avaliação seria o emprego de “isótopos
radioativos”, como o deutério, trítio ou oxigênio-18 (Mattsson & Thomas, 2006).
Quanto ao compartimento mineral na prole RP, observamos apenas uma tendência a
ser menor aos 90 e 180 dias de vida, que somado aos compartimentos de gordura poderia
colaborar para o menor peso corporal. Ressaltamos que a nossa avaliação de cinzas corporais
é total, não diferenciando o “pool” mineral do esqueleto (cálcio e fosfato) de outros tecidos
(como por exemplo, o músculo). Para tentar compreender melhor os efeitos da RP materna na
lactação sobre o metabolismo ósseo, avaliamos diretamente os fêmures dos animais.
Observamos que os animais RP apresentaram fêmures com menores peso, comprimento e
diâmetro aos 21, 90 e 180 dias. Estes dados corroboram com Reichling & German (2000), que
57
verificaram que ratos submetidos à restrição protéica (4% de proteína) apresentam fêmures
com menor comprimento e diâmetro. Mehta et al (2002) também evidenciaram que a restrição
protéica materna (intrauterina) resulta em redução da massa óssea, mostrando uma
programação do crescimento dos ossos e cartilagens. O período neonatal e a infância precoce
são importantes períodos para o aumento mineral ósseo (Land & Schoenau, 2008). Além disso,
o eixo GH-IGF1 e os hormônios sexuais podem estar relacionados com o prejuízo no
crescimento ósseo destes animais (Lytras & Tolis, 2007). Aumentos na secreção de GH e IGF-1
induzem à deposição óssea e elevados níveis de esteróides gonadais diminuem a reabsorção
(Misra et al, 2008). Como os animas RP apresentam menor expressão hipofisária de RNAm
para GH dos 21 aos 180 dias (Moura et al, 2007), isto poderia justificar os resultados
encontrados de menor crescimento ósseo nesta prole. A avaliação futura de IGF-1 e hormônios
sexuais também poderão nos ajudar a compreender tal achado. Alguns estudos mostraram que
neurônios do hipotálamo ventro-medial controlam a função dos osteoblastos, sugerindo que a
leptina desempenhe um papel anti-osteogênico (Ducy et al, 2000; Takeda et al, 2002; Sainsbury
et al, 2003). Como os animais RP são hiperleptinêmicos ao desmame (Teixeira et al, 2002) e
resistentes à ação central da leptina aos 180 dias (Passos et al, 2004), acreditamos que este
seja mais um fator responsável pelo menor crescimento ósseo nos animais RP.
Em relação à determinação do conteúdo de minerais totais ósseos, não observamos
qualquer alteração em todos os períodos analisados. Talvez, a hipercorticosteronemia e o
hipertireoidismo dos animais RP aos 180 dias de vida, tragam como consequência futura uma
diminuição de massa mineral em idades mais avançadas, pois se sabe que estes hormônios
aumentam a desmineralização óssea (Adler & Rosen, 1994; Sato, 2006; Chitre & Hayes, 2008).
De acordo com Molina-Perez et al (2000), a desnutrição protéica leva à osteoporose, prejudica
a deposição mineral óssea, aumenta a excreção urinária de hidroxiprolina, acompanhadas de
aumento sérico de PTH e 1,25 dihidroxicolecalciferol, e uma discreta hipomagnesemia,
hipercalciúria e hiperfosfatúria. Crítica similar à avaliação de água total pelo método da carcaça
cabe a este compartimento, sendo que o emprego de técnicas mais precisas, como a
“espectroscopia de absorção atômica” (Baydar et al, 2005; George, 2006), seriam necessárias
para evidenciar o conteúdo específico de minerais.
Aos 180 dias, os animais RP apresentaram uma discreta redução da glicemia, menor
insulina sérica e tendência a menor razão I/G e menor IxG, sugerindo que estes animais
mantém a sensibilidade insulínica desde o desmame. Estes achados corroboram com estudos
prévios (Moura et al, 1997; De Souza Caldeira Filho & Moura, 2000) que mostraram uma menor
secreção de insulina e maior sensibilidade em ratos adultos submetidos à RP pós-natal severa
58
(0% ou 4% de proteína). Zambrano et al (2006) também evidenciou uma hipoglicemia e maior
sensibilidade à insulina em ratos adultos cujas mães foram submetidas à RP (10% de proteína)
durante a lactação. Contudo, ratos cujas mães foram submetidas à RP na gestação e lactação
nascem menores e foram programados para a hiperinsulinemia e resistência à insulina,
desenvolvendo Diabetes Mellitus na vida adulta (Fernandez-Twinn et al, 2003). Em relação aos
níveis de insulina e sua sensibilidade, a principal diferença entre este estudo e os nossos
resultados, parece ser o período da desnutrição, já que a organogênese pode ser afetada na
gestação, programando para o Diabetes Mellitus. No presente trabalho detectamos que a prole
RP apresentou maior conteúdo de glicogênio muscular apenas aos 180 dias, fato que pode ser
explicado pelo aumento da sensibilidade à insulina. Além disso, Sampaio de Freitas et al (2003)
demonstraram que a RP neonatal programa para maior atividade da PI3K e maior translocação
de GLUT-4 em músculos de ratos, o que ajuda a explicar nossos dados de maior conteúdo de
glicogênio muscular. Para explicar este provável aumento na sensibilidade, seria esperado um
aumento na adiponectina sérica nestes animais. Porém, não observamos qualquer alteração
neste parâmetro. Tal resultado pode ser atribuído ao fato da produção de adiponectina ser
inibida por alguns hormônios, incluindo glicocorticóides (Swarbrick & Havel, 2008), que estão
elevados no presente trabalho e também porque a adiponectina não é o único fator responsável
pela sensibilidade à insulina.
No entanto, o conteúdo de glicogênio hepático que também se esperava estar
aumentado em nosso estudo, devido ao aumento de corticosterona e pela maior sensibilidade à
insulina (ambos aumentam a glicogênese), não foi alterado. Este achado difere daqueles
descritos por Bellinger & Langley-Evans (2005), que mostraram maior glicogênio hepático na
prole RP aos 90 dias. Porém, isto pode ser atribuído ao fato da restrição protéica materna (9%
de proteína) ter ocorrido durante a gestação. A não alteração do conteúdo de glicogênio pode
ser explicado pelo efeito contrário causado pelo possível aumento de catecolaminas, causando
glicogenólise. Como a corticosterona tem um efeito permissivo na ação das catecolaminas no
fígado (Gómez-Muñoz et al, 1989; Coderre et al, 1991), a hipercorticosteronemia parece manter
o estoque de glicogênio hepático. Ou seja, é possível que a prole RP adulta tenha ambos
glicogênese e glicogenólise ativadas, mantendo o balanço destas. Estes animais parecem
preservar a sensibilidade à insulina, que pode ser importante para o controle glicêmico e para a
função do tecido muscular (síntese de proteínas e de glicogênio).
Talvez os animais RP desenvolvam uma sensibilidade à insulina diferenciada,
apresentando uma maior sensibilidade no hepatócito e no músculo e uma resistência no
adipócito. Sendo assim, as alterações de sensibilidade à insulina poderiam ser esclarecidas
59
através da avaliação da expressão das proteínas envolvidas na sinalização da insulina em
diferentes tecidos (fígado, músculo e adipócito, por exemplo).
A desnutrição protéica provocou alterações importantes no perfil lipídico da prole ao
desmame, porém poucas alterações foram programadas. Em relação ao perfil lipídico, a prole
RP apresentou maior LDL-c, maior índice de Castelli I e II, menor VLDL-c e triglicerídeos ao
desmame. Este menor VLDL-c e triglicerídeos foi programado aos 90 dias de vida. É possível
que estes animais apresentem menor atividade da lipoproteína lipase (LPL) ou da lípase
hepática. Boualga et al (2000) demonstrou que o consumo de uma dieta hipoprotéica previne o
aumento na atividade extra-hepática da LPL. Menor atividade da LPL sugere que a dieta
hipoprotéica limita o estoque de lipídeos no tecido adiposo, devido à redução da disponibilidade
de VLDL-triglicerídeos. Segundo Havel (2002), a adiponectina aumenta a sensibilidade à
insulina, talvez pelo aumento na oxidação de gordura no tecido, o que resulta em menores
níveis de ácidos graxos circulantes e reduzidos conteúdos hepáticos ou intramiocelulares de
triglicerídeos. Sendo assim, o maior nível de adiponectina nos animais RP aos desmame
poderia contribuir para os menores níveis de triglicerídeos encontrados neste mesmo período.
Estas alterações também podem ser conseqüentes à modificações no perfil lipídico do leite
(Passos et al., 2000). O leite das lactantes RP apresentou redução no teor protéico, apesar de
não ter alteração na concentração total de lipídeos. Porém, como estas mães produziram
menos leite, a quantidade total de lipídeos transferida pelo leite para a prole, foi menor.
Entretanto, deve ter havido uma maior passagem de colesterol. Isto causa logo no inicio da
vida, uma piora nos índices de Castelli. Porém, parece que mecanismos adaptativos durante o
desenvolvimento corrigem as possíveis conseqüências deste imprinting neonatal. Se algo
acontece, é até um efeito protetor uma vez que aos 180 dias, os animais RP mostraram menor
colesterol sérico. Este resultado corrobora achados anteriores de Zambrano et al (2006), em
que a RP na lactação programou para menor concentração sérica de lipídeos totais nos animais
adultos. Não encontramos outra referência na literatura, comparável ao nosso estudo. A
alteração das concentrações séricas de colesterol podem estar associadas à maior
sensibilidade à insulina no fígado ou à ação dos HTs, que se encontram elevados neste modelo
(Passos et al, 2002) e têm efeito conhecido, aumentando a excreção biliar de colesterol
(Berkenstam et al, 2008).
Embora Teixeira et al (2002) não tenham observado diferença significativa na leptinemia
entre as proles RP e controle aos 180 dias, verificamos que a relação leptina/peso corporal é
maior no grupo RP (+33%). Posteriormente, nosso grupo demonstrou que esta prole não
diminuiu a ingestão alimentar em resposta a injeção aguda à leptina, portanto, caracterizando
60
uma resistência central a este hormônio (Passos et al, 2004). Neste contexto, resolvemos então
avaliar a expressão das proteínas envolvidas na sinalização da leptina no hipotálamo na prole
RP aos 21 e 180 dias. Somente aos 180 dias, encontramos menor expressão de STAT3,
apesar da expressão de Ob-Rb, JAK-2 e SOCS3 estarem normais. Tal resultado poderia
contribuir para explicar a resistência ao efeito anorexigênico da leptina, pois sabe-se que a
proteínas STATs participam da etapa final da cascata de sinalização da leptina (Bates & Myers,
2004; Sahu, 2004). Recentemente, foi demonstrado que um aumento da proteína tirosina
fosfatase 1B (PTP1B) poderia ser o fator envolvido na resistência central à leptina (Morrison et
al, 2007; Picardi et al, 2008), uma vez que inibe a sinalização da leptina através da
desfosforilação de JAK2 (Kaszubska et al, 2002; Zabolotny et al, 2002; Myers, 2004). Sendo
assim, a expressão de PTP1B é inversamente proporcional à sensibilidade à leptina (Cheng et
al, 2002). Uma futura determinação da fosforilação da JAK2 poderia ajudar a esclarecer tal
hipótese. Além disto, a fosforilação das outras proteínas envolvidas na cascata de sinalização
da leptina, aliada à sua expressão, poderia nos ajudar a compreender o fenômeno de
resistência a este hormônio.
Uma outra hipótese seria a alteração na via alternativa de sinalização para a leptina, que
envolve a ativação de PDE3B (fosfodiesterase 3B), dependente de PI3-quinase (fosfatidilinositol
3-quinase) e a redução de AMPc (Zaho et al, 1998; Zaho et al, 2000; Carvalheira et al, 2005). A
determinação das proteínas envolvidas nesta via também nos ajudariam elucidar as alterações
na resposta central à leptina.
Considerando que existe correlação entre leptina com função tireoideana e sabendo que
os animais RP apresentam alteração da concentração sérica dos hormônios tireoideanos, TSH
e/ou leptina (Passos et al, 2002; Teixeira et al, 2002; Dutra et al, 2003; Lisboa et al, 2008),
decidimos investigar se a restrição protéica materna na lactação modifica a via de sinalização
de leptina na tireóide de animais aos 21 e 180 dias de vida. No presente estudo, verificamos
que ao desmame (21 dias), a prole RP apresenta menor expressão de Ob-Rb e maior
expressão de JAK2. Já aos 180 dias, a prole RP apresentou menor expressão de JAK2. Na
idade adulta, parece existir uma relação inversa entre as concentrações séricas de HTs e a
expressão de proteínas da via de sinalização da leptina. Poucos estudos mostraram a
expressão de Ob-Rb na tireóide (Nowak et al, 2002, Isozaki et al, 2004, Dutra et al, 2007) e
pouco se conhece sobre a regulação dos receptores neste tecido.
Na situação de hiperleptinemia há menor expressão de Ob-Rb na tireóide (Dutra et al,
2007). Sendo assim, esta poderia ser uma explicação para nossos resultados nos animais ao
desmame, uma vez que a prole RP apresenta hiperleptinemia (Teixeira et al, 2002). Coope et al
61
(2008) evidenciaram que a injeção de adiponectina intracerebroventricular ativa JAK-2 e STAT-
3 no hipotálamo. Não sabemos se este hormônio atua diretamente na tireóide, mas caso atue, a
maior adiponectinemia nos animais RP ao desmame explicaria a maior expressão de JAK-2.
Park et al (2000) mostraram que o TSH induz a fosforilação em tirosina da JAK2. Como
os animais RP aos 180 dias apresentam menor TSH sérico (Dutra et al, 2003) é possível que a
fosforilação da JAK-2 tireoideana esteja alterada em função do TSH. Sendo assim, em relação
à JAK-2, ressaltamos que somente a sua expressão não é suficiente para chegarmos a uma
conclusão sobre a ativação ou inibição da sinalização da leptina na tireóide. A avaliação da
fosforilação desta e das demais proteínas da via de sinalização da leptina, seria útil para o
melhor entendimento das alterações nos animais nesta idade.
Estudos com diferentes modelos de hipo e hipertireoidismo, com a administração de
drogas anti-tireoideanas, HTs, TSH, TRH são necessários para elucidar os fatores envolvidos
na regulação da via de sinalização de leptina na tireóide.
O objetivo deste estudo foi melhor compreender quando as alterações hormonais e
metabólicas se iniciam durante o desenvolvimento da prole submetida à desnutrição neonatal. A
avaliação temporal dos dados aumentou nossos conhecimentos sobre a programação
metabólica, evidenciando que o animal programado se torna hipermetabólico, aumentando o
risco de doenças cardiovasculares, em oposição ao melhor perfil lipídico.
A programação pela restrição
protéica neonatal serve de modelo experimental para o
quadro de desnutrição protéico-calórica, ainda muito freqüente nas classes sociais menos
favorecidas como por exemplo no semi-árido nordestino e no Norte do país, que por
dificuldades econômicas, utilizam uma dieta com inadequada oferta de proteínas e de outros
nutrientes e excesso de carboidratos. Desta forma, nosso trabalho serviu para que pudéssemos
identificar melhor o fenótipo e melhor compreender as possíveis alterações em curto e em longo
prazos que ocorrem nos filhos de mães que sofreram desnutrição protéico-energética durante a
lactação e cuja dieta se modifica para melhor, após o desmame, em países como o nosso, em
desenvolvimento.
62
Conclusões
A restrição protéica na vida pós-natal imediata leva a um quadro de desnutrição calórico-
protéica, caracterizada por um prejuízo inicial do anabolismo protéico. Contudo, após o
desmame, a prole mostrou menor adiposidade corporal, sugerindo uma elevada atividade
lipolítica, provavelmente causada pela ação de catecolaminas e glicocorticóides. Apesar disto,
estes animais parecem preservar a sensibilidade à insulina, que pode ser importante para o
controle glicêmico e para a função do tecido muscular (síntese de proteínas e de glicogênio).
O estudo da via de sinalização de leptina no hipotálamo neste modelo de programação
contribuiu para elucidar o mecanismo da resistência à ação anorexigênica que estes animais
apresentam na idade adulta, uma vez que a via JAK-STAT está prejudicada. Além disso, o
estudo da via de sinalização da leptina na tireóide foi realizado pela primeira vez neste modelo
experimental, mostrando uma possível regulação desta via pela função tireoideana.
63
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