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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Joana Faber Barata
Bases estruturais e termodinâmicas do reconhecimento molecular em DNA, peptídeos e
proteínas: modelos de papilomavírus e proteína tirosina fosfatase.
Volume I
Rio de Janeiro
2007
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Joana Faber Barata
Bases estruturais e termodinâmicas do
reconhecimento molecular em DNA, peptídeos e
proteínas: modelos de papilomavírus e proteína
tirosina fosfatase.
UFRJ
V. I
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Joana Faber Barata
Bases estruturais e termodinâmicas do reconhecimento molecular em DNA, peptídeos e
proteínas: modelos de papilomavírus e proteína tirosina fosfatase.
Volume I
Tese de Doutorado apresentada ao programa de pós-
graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica
Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Química Biológica
Orientador: Luis Mauricio T.R. Lima
Co-orientador: Jerson L. Silva
Co-orientador: Steven C. Almo
Rio de Janeiro
2007
iv
Barata, Joana Faber
Bases estruturais e termodinâmicas do reconhecimento molecular
em DNA, peptídeos e proteínas: modelos de papilomavírus e proteína
tirosina fosfatase. / Joana Faber Barata. Rio de Janeiro: UFRJ/ IBqM,
2007-05-06
xvii, 134 f, il
Orientador: Luis Mauricio T. R. Lima
Co-orientador: Jerson L. Silva
Co-orientador: Steven C. Almo
Tese de doutorado – UFRJ/ Instituto de Bioquímica Médica/
Programa de Pós Graduação em Química Biológica
Referências bibliográficas: f. 105-116
1. reconhecimento molecular. 2. papilomavírus. 3. proteína tirosina
fosfatase. 4. espectroscopia. 5. cristalografia de macromoléculas. I.
Lima, Luis Mauricio T.R.; Silva, Jerson. L. II. Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós
Graduação em Química Biológica. III. Título.
v
O trabalho experimental dessa tese foi desenvolvido no grupo de biofísica química de
macromoléculas do laboratório de Controle de Qualidade da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação do professor Luis Mauricio T. R.
Lima e co-orientação do professor Jerson. L. Silva. Parte do trabalho experimental de tese foi
realizada durante o estágio de doutoramento realizado no Albert Einstein College of Medicine,
Nova York, Estados Unidos com auxílios do Programa de Doutoramento com Estágio no
Exterior da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (PDEE – CAPES)
e do Albert Einstein College of Medicine, NY, Estados Unidos, sob supervisão do professor
Steven C. Almo. Essa tese contou com recursos do Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq Universal 480986/2004-5 – coordenador, LMTR Lima),
Instituto Milênio para Biologia Estrutural em Biomedicina e Biotecnologia (Programa Milênio
– CNPq 420120/2005-0, coordenador, JL Silva), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ - PADOT III Rio Faperj 620023/03-1 –
coordenador LMTR Lima; PRONEX FAPERJ 2003 RJCV058 - coordenador PM Bisch),
Fundação Universitária José Bonifácio (FUJB 10719-1 – coordenador, LMTR Lima) e
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
vi
Joana Faber Barata
Bases estruturais e termodinâmicas do reconhecimento molecular em DNA, peptídeos e
proteínas: modelos de papilomavírus e proteína tirosina fosfatase.
Tese submetida ao corpo docente do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal
do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em
Química Biológica.
Orientador:
- Luis Mauricio T. R. Lima, professor adjunto da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal do Rio de Janeiro; Doutor em Química Biológica pela Universidade Federal do Rio de
Janeiro, UFRJ, Brasil, em 2001.
Co-orientador:
- Jerson Lima da Silva, professor titular do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro; Doutor em Química Biológica pela Universidade Federal do Rio de
Janeiro, UFRJ, Brasil, em 1983.
Membros titulares da banca:
- Richard Charles Garratt, professor titular da Instituto de Física de São Carlos da
Universidade de São Paulo; Doutor em Cristalografia pela University of London, UL,
Inglaterra em 1989.
- Paulo Mascarello Bisch, professor titular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da
Universidade Federal do Rio de Janeiro; Doutor em Ciências Físicas pela Universidade Livre
de Bruxelas, ULB, Bélgica em 1980.
- Ana Paula Valente Lacerda de Almeida, professora adjunta do Instituto de Bioquímica
Medica da Universidade Federal do Rio de Janeiro; Doutor em Ciências Biológicas
(Bioquímica) pela Universidade de São Paulo, USP, Brasil em 1994.
Revisor e suplente interno:
- Gabriela de Oliveira Paiva e Silva, professora adjunta do Instituto de Bioquímica Médica da
Universidade Federal do Rio de Janeiro; Doutor em Química Biológica pela Universidade
Federal do Rio de Janeiro / University of Arizona (Doutorado Sanduíche), UFRJ / UA, Brasil
em 2001.
Suplente externo:
- Luzineide Wanderley Tinoco, professora adjunta do no Núcleo de Pesquisas de Produtos
Naturais da Universidade Federal do Rio de Janeiro; Doutor em Química pelo Instituto Militar
de Engenharia, IME, Brasil em 1998.
vii
Agradecimentos
A realização desse trabalho foi possível porque pude contar com a ajuda de inúmeras pessoas.
A lista é grande e necessária, espero conseguir lembrar de todo mundo.
Ao Maurício, por tanta coisa que nem sei por onde começar. Por me ajudar a solucionar o que
muitas vezes parece insolucionável. Por sua paciência e incentivo. Por querer fazer de mim
sempre uma pessoa melhor. Por todo o apoio pessoal, profissional e por ser um amigo muito
querido além de um excelente orientador. Obrigada por me estimular a buscar sempre o
melhor, em todos os sentidos.
Ao meu pai, Sérgio Augusto Barata, por me estimular a realizar meus sonhos e me apoiar
incondicionalmente nas minhas decisões.
À minha mãe, Selma Faber, por saber relevar as minhas ausências e ser sempre tão carinhosa.
Ao meu irmão Sávio e a Elisabete por terem construído uma família linda e me fazer ter
vontade de fazer igual. Vocês são minhas referencias de vida, não tem jeito... Obrigada por
estarem sempre aqui.
À Verônica e a família Swalf, por todas as dificuldades superadas.
Ao Jérson Silva, meu co-orientador, pela confiança depositada nesse projeto.
À professora Débora Foguel, sempre atenciosa, por me fazer sentir sempre à vontade em seu
laboratório.
To Dr. Steve Almo for accepting me in his lab, to give me all support to develop my project
and be always available to talk when I needed.
Ao professor Ronaldo Mohana-Borges, pelas discussões sempre construtivas e por todos os
empréstimos de material.
Ao professor Hugo Verli da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande
do Sul e seu aluno Guilherme Giesel, pelas simulações de dinâmica molecular.
viii
Aos professores Richard Garratt, Paulo Bisch, Ana Paula Valente e Luzineide Tinoco, por
aceitarem fazer parte da banca de avaliação dessa tese.
À professora Gabriela Paiva e Silva, por fazer uma revisão cuidadosa em tão pouco tempo. E
por todo o apoio dado durante as aulas do bloco III.
À Yraima, por ser uma amiga muito querida. Por me fazer sentir sempre querida e lembrada,
principalmente no período em que estive longe. E principalmente por me apoiar e ouvir as
minhas lamúrias nesses tempos pré-tese!
À Carol, amiga querida, por ser um exemplo de elegância! Por estar sempre por perto com
uma calma aparente tranqüilizadora... Ainda vamos comemorar muitos aniversários juntas!
À Juliana, amiga querida, de quem morro de saudades... A vida no Rio não é mais a mesma
sem você. Poucas pessoas são capazes de entender a maluquice que é minha cabeça!
Ao Flávio e ao Léo por serem amigos queridos. Pelas viagens, cervejas, conversas, vídeos,
música e por fazerem minhas amigas felizes.
Ao Rodolpho, por me ajudar a lidar com meu próprio desespero e me ouvir falar por horas a
fio sobre os mesmos assuntos. E ainda achar bom!
Ao grupo de Biofísica Química de Macromoléculas do LabCQ, Vivian, Guilherme, Clara,
Natalia, Maria e Regiane. Em especial a Adriana, por dividir a bancada comigo há mais
tempo e compartilhar comigo esse momento tenso de nossas vidas. Você vai ver que vai
passar, quase sem doer, e seremos bem mais felizes depois disso.
À todos os amigos e colegas do LabCQ, pela convivência sempre agradável no dia a dia. As
professoras Sheila e Valéria, por junto com o Maurício, manterem o laboratório organizado e
funcionando. A Maria, por ser sempre tão atenciosa, pelo cafezinho delicioso e pelo bom
humor matinal. A Eliane, por sempre atender aos meus pedidos com um sorriso no rosto. A
Tailane, Vinícius, Bianca, Yara, Monique, por fazerem sempre do almoço um momento
agradável. Ao Marcio R. e Marcio M. pela companhia durante os experimentos tarde da noite.
ix
A Aninha, Lais, Zaida, Carol, Bianca W. e Edilene, que já saíram, mas fizeram parte do grupo
junto comigo e deixaram saudades.
Quoting a very good friend of mine and moving now to another country, I would like to thank
all the people in Almo’s lab for being so friendly and helpful all the time. Of course I have
special thanks: To Johnjeff, for being so patient, for teaching and helping me with PTPσ and
making me laugh; Yuri, for help me with PTP-IA2 structure and for teach me a lot; Ramu, for
all your help in the síncrotron, for trying so hard to communicate with me and for coffee
breaks; Agnes, for all the moments that we’ve spend together in the computer room, working
and talking. And, of course, for teaching me that is not every candy that is tasty… Brian and
Chenyang, for being so friendly. Wendy, for helping me with the Tap-Tag stuff and sending
my samples to Brazil so nicely. Jeannie, for everything. And special to Rafael (and Laura) for
making me fell at home since my first day in the lab. For watching the soccer games with me,
the happy hours and all the help with the lady robot. I miss our lunch time!
À todos os amigos e colegas do grupo LAPA/LTPV/CNRMN. A ajuda de vocês para
empréstimos, tempo de equipamento e discussões foi imprescindível para a realização desse
trabalho. Em especial a Talita, pelas caronas e conversas sempre agradáveis; A Renata e
Natália por me ensinarem um vocabulário totalmente novo e uma outra cultura; A Catarina,
por me contagiar sempre com seu bom humor e suas histórias; Ao Ricardo, Carlos, Anderson,
Mariana, Tuane, Priscila, pelas cervejas no bloco A e por sempre me receberem no lab como
se eu fizesse parte dele. A Dabinha, por toda a ajuda no passado. Obrigada por me estender a
mão quando eu mais precisei.
Ao Emerson, pela ajuda técnica inestimável.
Aos amigos do IBqM, do bloco A e dos outros corredores pela convivência durante esses anos
todos: Claudinha Darling, Jô Preta e Rogério, Susana e Robson (e pandinha), Tat e Alex, Guto
e Cláudia (sumidos, mas que moram no meu coração), Ana Paula P. da Silva, Ana Paula
Wasi, Pat Maionese e Daniel (e Miguelito), Renato, Lúcia, Aurélio, Marquito, Marcus, Astria,
Vitor, Clarissa, Pedro, Fred, Julio, Verônica, Andrea Da Poian, Andrea Preta. Espero não ter
esquecido muita gente...
x
À Fabiana, por ter me abrigado nas minhas primeiras semanas em NY, por todos os nossos
almoços, conversas e cervejas belgas. Por ser minha “família” e ponto de referência brasileira
em terra estrangeira.
À Elisa, por ser uma pessoa muito querida e fazer meu amigo-chefe Mau feliz!
À Alcira, por saber relevar e planejar escrever um livro comigo.
Ao Coldplay, Chico Buarque, Ney Matogrosso, Pink Floyd (e Roger Waters!), Miles Davis e
rádio Mec FM pela trilha sonora dessa tese.
Ao Joari, por me ouvir e me entender (muitas vezes melhor que eu mesma). Pelos passeios no
Central Park e na praia de Ipanema. Por estar comigo nos bons momentos (e outros nem
tanto) durante minha temporada em Nova York. Por compartilhar comigo o apartamento da
rua 117. Pelo seu amor, carinho e nossos planos de futuro, a você dedico essa tese.
xi
Resumo
Faber-Barata, Joana. Bases estruturais e termodinâmicas do reconhecimento molecular
em DNA, peptídeos e proteínas: modelos de papilomavírus e proteína tirosina fosfatase.
Rio de Janeiro, 2007. Tese (Doutorado em Química Biológica) – Instituto de Bioquímica
Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
A proteína E2 de papilomavírus é a principal proteína regulatória desse vírus e se liga a uma
seqüência consenso ACCg-N4-cGGT no genoma viral. Nesta tese foi testada a habilidade de
um peptídeo com 18 aminoácidos correspondente à hélice de reconhecimento ao DNA desse
vírus (α-hélice-1) de reconhecer e ligar seqüências de DNA contendo a seqüência consenso.
Medidas estequiométricas quantitativas mostram o reconhecimento específico do sítio ACCG
do DNA sem a necessidade da proteína inteira. Apesar da capacidade de reconhecimento e
ligação ao DNA ser mantida, foi verificado por medidas de dicroísmo circular que o peptídeo
encontra-se desenovelado em solução. Este fato é confirmado por simulações de dinâmica
molecular que mostram que o peptídeo é parcialmente desenovelado em solução, e que esse
desenovelamento é parcialmente reduzido após a formação do complexo com DNA, sugerindo
que os contatos entre o peptídeo e o DNA são os principais responsáveis pela manutenção da
conformação helicoidal. Esses dados demonstram que a ligação específica não é dependente
da conformação da hélice e que uma seqüência de aminoácidos mínima é suficiente para que
ocorra o reconhecimento e ligação ao DNA. Ensaios cristalográficos do complexo foram feitos
numa tentativa de buscar um maior entendimento dessa ligação. Além disso, nessa tese
também foram resolvidas a estrutura de duas proteínas tirosino fosfatases (PTP). A estrutura
da PTPσ foi resolvida na presença de um inibidor da enzima. A estrutura inédita da PTP-IA2,
uma importante PTP envolvida com diabetes tipo 1, também foi resolvida nessa tese. Juntas,
essas duas estruturas contribuem para um aumento no entendimento do funcionamento dessa
enzima que pode ser utilizado em trabalhos posteriores para o desenvolvimento de fármacos
seletivos para esses alvos biológicos.
xii
Abstract
Faber-Barata, Joana. Bases estruturais e termodinâmicas do reconhecimento molecular
em DNA, peptídeos e proteínas: modelos de papilomavírus e proteína tirosina fosfatase.
Rio de Janeiro, 2007. Tese (Doutorado em Química Biológica) – Instituto de Bioquímica
Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2007.
The E2 protein of papillomavirus is the main regulatory protein of this virus and it is known to
bind a consensus sequence ACCg-N
4
-cGGT in viral genome. In this work we tested the ability
of an 18 amino acid peptide (alpha1E2) corresponding to the DNA-recognition helix (alpha
helix-1) from E2 protein to bind and recognize its consensus double strand DNA. Quantitative
stoichiometric measurements revealed that specificity of recognition is given by the ACCG
half-site, demonstrating capacity of DNA recognition without the need of the whole protein
architecture. Besides the full capability of DNA recognition, the peptide was shown to be
intrinsically unfolded when free in solution, as measured by circular dichroism spectroscopy.
This was confirmed by molecular dynamics simulations, who shows that alpha1E2 partially
unfolds in aqueous solution. Such unfolding is considerably reduced when the peptide is
complexed to DNA, indicating that the contacts performed between the peptide and their
binding sites are the main responsible for the helix folding. These observations demonstrate
that specific DNA binding is not strictly dependent on a previous helical conformation,
achieved from a previously unfolded polypeptide, but undergoes an induced fit mechanism,
where the target sequence and the ligand induce mutual conformational modifications that
result in the full folded protein. Therefore, even an unfolded or partially folded peptide
appears to be able to discriminate dissimilar DNA sequences. Taken together these results
reveal that a minimal amino acid sequence is sufficient to drive specificity. Crystallography
assays were performed to better understand the formation of the complex. In this work we also
solved the structure of two protein tyrosine phosphatases (PTP). The structure of PTPσ was
solved in the presence of an inhibitor of the enzyme. We report here, for the first time, the
structure of PTP-IA2, an enzyme that is important in pathogenesis of diabetes type 1. Taken
together, these two structures could improve the understanding of how these enzymes function
and can be helpful for drug design.
xiii
Lista de figuras
Figura 1. Representação esquemática de ligação proteína-DNA. 6
Figura 2. Freqüência estimada do numero de casos de câncer cervical em 2002. 11
Figura 3. Representação esquemática do genoma do HPV. 14
Figura 4. Ciclo de vida de HPV. 16
Figura 5 Representação esquemática do genoma do HPV. 18
Figura 6. Produtos do gene E2 de papilomavírus. 19
Figura 7. Esquema mostrando a organização estrutural e funcional da proteína E2 de
papilomavírus.
19
Figura 8. Afinidade da proteína E2 de HPV por diferentes seqüências. 20
Figura 9. Complexo do domínio de ligação ao DNA da proteína E2 de HPV-18 com
DNA.
22
Figura 10: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do domínio de ligação ao DNA
das proteínas E2.
23
Figura 11. Comparação da estrutura da proteína E2c de HPV-16, HPV-18, HPV-31 e
BPV-1.
24
Figura 12. As proteínas tirosino fosfatase clássicas (PTP clássicas). 27
Figura 13. Estrutura das PTP. 28
Figura 14: Seqüência da proteína E2c de Papilomavírus. 33
Figura 15: Estrutura cristalográfica da proteína E2c com destaque para a α hélice 1 ou
hélice de reconhecimento.
34
Figura 16. Peptídeo usado nos ensaios de dinâmica molecular. 39
Figura 17. Esquema representativo do método da gota sentada. 41
Figura 18. Alinhamento de seqüências das proteínas PTPσ e PTP-IA2. 48
Figura 19. Dinâmica molecular do peptídeo livre e em complexo com DNA. 59
Figura 20. Modificações conformacionais após simulação de dinâmica molecular. 62
Figura 21. Fotos representativa dos cristais obtidos nos ensaios cristalográficos de
complexos [peptídeo:DNA].
63
Figura 22: Fotos dos cristais obtidos nos ensaios cristalográficos de complexos
[peptídeo:DNA].
64
Figura 23. Estrutura cristalográfica do DNA E2BSN4ACGT. 68
Figura 24. Análise comparativa da superposição entre os monômeros de DNA dupla fita
encontrados na unidade assimétrica.
69
Figura 25. Análise comparativa dos dois monômeros de DNA fita dupla da Unidade
Assimétrica.
70
Figura 26. Detalhe da molécula de DNA. 71
Figura 27. Detalhe do mapa de diferença eletrônico contendo “bolhas” não modeladas. 72
Figura 28. Superposição de E2BSN4ACGT com outras seqüências de DNA. 75
Figura 29. Análise comparativa dos monômeros de E2BSN4ACGT presentes na
Unidade Assimétrica com 423D.pdb e dsDNA ideal do tipo B.
76
Figura 30. Análise comparativa dos monômeros de dsDNA presentes na Unidade
Assimétrica com 423D.pdb.
77
Figura 31. Alguns parâmetros geométricos observados em estruturas de ácidos
nucléicos.
78
Figura 32a Análise estrutural de parâmetros geométricos locais inter-pares de bases dos
dsDNA analisados.
80
xiv
Figura 32b Análise estrutural de parâmetros geométricos locais inter-pares de bases dos
dsDNA analisados.
81
Figura 33. Análise estrutural das cavidades maiores e menores dos DNAs. 83
Figura 34. Superposição de E2BSN4ACGT com 1JJ4.pdb. 85
Figura 35. Proteína tirosino fosfatase σ em complexo com Tungstênio. 89
Figura 36. Detalhe do sítio ativo na presença de tungstênio nos dois domínios da PTPσ. 89
Figura 37. Representação aproximada do potencial eletrostático de superfície. 91
Figura 38. Superposição das formas apo e holo da PTPσ 92
Figura 39. Desvio médio quadrático dos carbonos α das estruturas apo e holo da PTPσ. 93
Figura 40. Detalhe do sítio ativo das estruturas apo (verde) e holo (vermelho) da PTPσ. 94
Figura 41. Análise da interação da molécula de tungstato com os aminoácidos do sítio
ativo
95
Figura 42. Estrutura cristalográfica da proteína PTP-IA2. 97
Figura 43. Sobreposição das duas moléculas presentes na unidade assimétrica de PTP-
IA2.
98
Figura 44. Desvio médio quadrático (RMSD) dos carbonos α dos dois monômeros
presentes na unidade assimétrica de PTP-IA2.
99
Figura 45. Sobreposição dos monômeros da PTP-IA2 com os dois domínios da PTPσ. 100
Figura 46. Representação esquemática do equilíbrio múltiplo envolvendo a ligação ao
DNA e a associação de subunidades.
105
Figura 47. sobreposição do sítio ativo das PTPσ e PTP-IA2. 109
xv
Lista de tabelas
Tabela 1. Proteínas codificadas por HPV e suas funções. 15
Tabela 2. Estruturas de proteína E2c publicadas na literatura 22
Tabela 3. Seqüências de DNA usadas em substituição molecular. 43
Tabela 4. Resumo dos dados obtidos com os ensaios de cristalografia dos complexos
[peptídeo:DNA].
65
Tabela 5. Dados de cristalografia e estatística de refinamento do conjunto de dados de
difração de E2BSN4ACGT.
66
Tabela 6. Análise estrutural média de parâmetros geométricos locais inter-pares de bases
dos DNA analisados.
79
Tabela 7. Programas disponíveis para predição de regiões de reconhecimento nucléico
em proteínas.
86
Tabela 8. Dados de cristalografia e estatística de refinamento do conjunto de dados de
difração da PTPσ na presença de tungstênio.
88
Tabela 9. Dados de cristalografia e estatística de refinamento do conjunto de dados de
difração da PTP-IA2.
96
xvi
Abreviaturas
DNA Ácido desoxirribonucléico
BisTris 2-(bis(2-hidróxietil)amino)-2-(hidróximetil)propano-1,3-diol
BPV-1 Papilomavírus Bovino tipo 1
BS Sítio de ligação (sigla do inglês binding site)
CD Dicroísmo circular
DBD Domínio de ligação ao DNA (sigla do inglês DNA Binding
Domain)
DTT 1,4-Ditiotreitol
E2c Porção C-terminal da proteína E2
E2BS Sítio de ligação da proteína E2c
EDTA Ácido etilenodiamino tetrácetico
HEPES Ácido N-(2-hidróxietil)-piperazine-N'-2-etanosulfônico
HPV Papilomavírus humano
HPV-16 Papilomavírus humano tipo 16
HPV-18 Papilomavírus humano tipo 18
LCR Região controladora de trasncrição (sigla do inglês long
control region)
MPD 2-metil-2, 4-pentanediol
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
ORP Fita de leitura aberta (sigla do inglês open reading frame)
Pdb Base de dados de proteína (sigla do inglês protein data bank)
PTP Proteína tirosina fosfatase
PTP-IA2 Proteína tirosina fosfatase IA2
PTPσ Proteína tirosina fosfatase sigma
RNA Acido ribonucléico
Tris Tris(hidroximetil aminometano)
xvii
Sumário
Introdução
1
Um pouco de história 3
O reconhecimento nucléico 5
Mecanismos de leitura indiretos 7
Código de reconhecimento 9
Papilomavírus Humano 10
Proteína E2 17
Proteínas tirosino fosfatase 25
Objetivos
30
Material e Métodos
31
Peptídeos sintéticos: 32
Oligonucleotídios sintéticos 34
Dicroísmo circular: 35
Ensaio de ligação peptídeo:DNA 36
Análise da interação [a1E2c:E2BS]: 37
Ensaios de Dinâmica Molecular: 38
Ensaios cristalográficos de complexos [peptídeo:DNA] 39
Resolução da estrutura de proteínas tirosina fosfatase. 43
Figuras. 46
Superposição das estruturas. 46
Análise das estruturas cristalográficas 46
Análise de parâmetros geométricos do DNA. 46
Análise das interações proteína-ligante 47
Resultados
49
Trabalho publicado na revista FEBS letters 51
Resultados de Dinâmica Molecular 57
Estudos cristalográficos do complexo peptídeo a1E2:DNA 62
Estudos cristalográficos de proteínas tirosina fosfatases. 87
Discussão
101
Proteínas tirosino fosfatase 107
Referências bibliográficas
111
Anexo 1. Lista de reagentes utilizados em ensaios de cristalografia
124
Anexo 2. Curriculum Vitae
133
Introdução
Introdução
2
Em sistemas biológicos é de fundamental importância que haja o reconhecimento
molecular de proteínas e outras macromoléculas. Muitas funções celulares dependem que esse
reconhecimento molecular seja dado de maneira específica e no momento determinado para
que possam ser executadas corretamente. Isto é válido tanto no reconhecimento de substratos
por enzimas, como no processo de interação proteína-proteína, como acontece nas vias de
transdução de sinal, incluído os processos de replicação celular e transcrição de proteínas.
Neste contexto, nós buscamos nessa tese aumentar os conhecimentos a respeito de
reconhecimento molecular utilizando dois modelos distintos, um modelo de interação
proteína-ácido nucléico e um segundo modelo de interação proteína-proteína. No primeiro
modelo, a questão do reconhecimento nucléico foi abordada com o uso de peptídeos
sintéticos. Foi testada a capacidade de reconhecimento e ligação ao DNA de peptídeos
sintéticos cuja seqüência corresponda à região ligadora de DNA da proteína E2 de
papilomavírus (Hedge, 2002). No segundo modelo, foram realizados estudos estruturais de
proteínas tirosino fosfatase humanas. Uma vez que um maior entendimento da estrutura
protéica pode fornecer informações importantes do mecanismo de reconhecimento de seu alvo
biológico, foram realizados ensaios cristalográficos de dois membros dessa família de
proteínas.
Introdução
3
Um pouco de história
A natureza do gene foi sugerida pela primeira vez pelo Monge Gregor Mendel no
século XIX, que reconheceu a presença de um fator particulado (gene) que seria responsável
pela transmissão de características (Macgregor e Poon, 2003). Quase ao mesmo tempo, a
molécula de ácido desoxirribonucléico (DNA) foi descrita pelo pesquisador suíço Friedrich
Miescher, em cujos trabalhos sugeriu que todos os núcleos possuíam uma substância química
específica de natureza ácida, que foi posteriormente batizada de ácido nucléico (Macgregor e
Poon, 2003). Porém, passaram-se décadas sem que se soubesse a função do DNA nos
processos celulares, permanecendo a questão de qual seria a molécula responsável pela
transmissão genética mendeliana. Essa visão começou a mudar com os trabalhos de Fred
Griffith, onde foi verificado que uma cepa benigna de pneumococos poderia ser transformada
em patogênica após a exposição a extrato livre de células de uma cepa de pneumococos
patogênica (Griffith, 1928). A partir desse momento passou-se a buscar a natureza desse fator
de transformação, que foi identificada anos mais tarde por Oswald Avery e colaboradores
(Avery et al, 1944). Através da análise do extrato livre de células, esses pesquisadores
identificaram que era a molécula de DNA (e não proteína ou RNA) o agente transformante,
publicando em 1944 os primeiros resultados mostrando que o DNA era o material genético
(Avery et al, 1944; Macgregor e Poon, 2003). Essa descoberta ganhou o reforço anos mais
tarde com os trabalhos de Hershey e Chase (1952) onde demonstraram que DNA mediava a
produção da progênie viral em bactérias infectadas por bacteriófagos. Esses resultados
puseram fim a anos de especulação a respeito da natureza química dos genes. É interessante
ver que nesse momento, sabia-se que a informação genética de alguma maneira residia no
DNA, porém como essa transmissão genética se dava, os mecanismos moleculares
envolvidos, continuava desconhecido. Sabia-se que os genes do DNA eram transformados em
proteínas, mas não se sabia como esse processo ocorria (Lewin, 2000, Macgregor e Poon,
2003).
Introdução
4
No início dos anos 50, pesquisadores direcionaram seus esforços na tentativa de
elucidar a estrutura do DNA. Nesse momento, estudos sobre a estrutura de macromoléculas se
tornaram possíveis com a introdução da técnica de difração de raios-x, recentemente descrita
por físicos (Macgregor e Poon, 2003). O trabalho de determinação da estrutura do DNA
esbarrou em várias dificuldades, começando pela impossibilidade nessa época do crescimento
de cristais de DNA. As imagens de difração eram adquiridas de fibras cuja resolução é baixa e
pouco informativa. Desses dados pôde-se inferir que a molécula de DNA era helicoidal e que
as bases encontravam-se orientadas perpedicularmente ao eixo da hélice. Quando Watson e
Crick publicaram a primeira estrutura proposta para o DNA (Watson e Crick, 1953a)
ofereceu-se uma nova maneira de entender os mecanismos moleculares por traz de todos os
processos celulares, como divisão celular, herança genética e síntese protéica (Watson e
Crick, 1953b; Macgregor e Poon, 2003).
A partir da proposição da estrutura do DNA, que foi a primeira macromolécula celular
a ter a sua estrutura resolvida, a grande questão passou a ser como os genes presentes na dupla
hélice de DNA davam origem às proteínas para a qual codificavam. Não havia nenhuma
molécula ou mecanismo conhecido até então que conectasse esses dois processos. Até que
uma série de trabalhos começa a sugerir a formação de uma estrutura complementar entre
DNA e RNA, seguida da descoberta, por Somura e colaboradores em 1960, de uma
macromolécula híbrida de DNA e RNA que era crucial para a síntese protéica. A descoberta
dessa molécula denominada ácido ribonucléico mensageiro (RNA mensageiro ou mRNA)
estabeleceu o dogma central da biologia molecular onde DNA é transcrito em RNA que é
traduzido em proteínas (Macgregor e Poon, 2003).
Hoje, o mecanismo de replicação e transcrição do material genético encontra-se bem
descrito na literatura (Lewin, 2000). Sabe-se que proteínas controlam a transcrição de genes
se ligando a sítios regulatórios específicos em regiões codificantes no núcleo. Sendo assim, o
reconhecimento de seqüências especificas de DNA por proteínas regulatórias desempenha um
Introdução
5
papel importante na regulação gênica (Mirny e Gelfand, 2002; Jayaram e Jain, 2004; Sarai e
Kono, 2005; Yan et al, 2006). E para que a ligação de proteínas regulatórias possa ocorrer,
são necessários à discriminação e o reconhecimento destes sítios ao longo do genoma. De
fato, uma das maiores questões da biologia molecular concerne o mecanismo detalhado de
reconhecimento de seqüências especificas no DNA por proteínas regulatórias (Seeman et al et
al, 1976; Gromiha et al, 2005).
O reconhecimento nucléico
Com o estudo de estruturas de complexos proteína-DNA por cristalografia de raios-x e
ressonância magnética nuclear, sabe-se que o reconhecimento nucléico é alcançado por
complementaridade estrutural entre o DNA e a proteína e por contatos específicos
estabelecidos por interações eletrostáticas, pontes de hidrogênio, pontes de hidrogênio
mediadas por moléculas de água, interações de van der Waals e interações hidrofóbicas
(Luscombe et al, 2001). O papel da estrutura do DNA e sua adaptabilidade dependente de
seqüência, ou seja, sua capacidade de dobrar e facilitar a ligação com a proteína, assim como
a contribuição de contra-íons e o papel de moléculas de água na interface de ligação são
menos compreendidos. A figura 1 ilustra o papel dessas diferentes forças de interação no
reconhecimento nucléico.
Introdução
6
Figura 1. Representação esquemática de ligação proteína-DNA. O processo de ligação é
acompanhado da liberação de moléculas de água e contra-íons, assim como mudanças na
conformação da proteína e do DNA. Adaptado de Jayaram e Jain, 2004.
Interações eletrostáticas apresentam um papel importante no reconhecimento e ligação
de proteínas ao DNA. Essas interações são dependentes da presença de íons de baixo peso
molecular, como cátions, que atuam na neutralização de cargas da superfície do DNA, que é
um poliânion. O efeito de contra-íon pelos cátions é função tanto da sua concentração como
do tipo de cátion (monovalentes – Na
+
, K
+
- divalentes – Ca
2+
, Mg
2+
). Em sua maioria, o
efeito é inespecífico e dependente da densidade de carga dos cátions, que vai reger a
capacidade de neutralização ou blindagem das cargas do fosfato (Record et al, 1976; Härd e
Lumdbäck, 1996). Qualquer processo que altere a densidade de cargas, como ligação a
proteínas, por exemplo, poderá ser afetado pela concentração de sais. Após a ligação com a
proteína esses contra-íons são deslocados da superfície do DNA para o solvente. Este
deslocamento favorece a ligação devido ao aumento da entropia. Esta condensação de íons em
torno do DNA sozinho e o seu deslocamento motivado pela ligação com proteínas é
conhecido como efeito polieletrolítico (Jayaram e Jaim, 2004).
Complementaridade estérica, como no exemplo de encaixe chave-fechadura em
interações enzima com substrato, é conhecida há muito tempo como sendo mecanismo de
reconhecimento. Com relação à ligação proteína e DNA, proteínas ligadoras de DNA não
possuem motivos estruturais complementares às voltas da dupla hélice do DNA. Porém, um
Introdução
7
exame detalhado da estrutura protéica envolvida na ligação ao DNA mostra a existência de
uma subestrutura ou elemento secundário (α-hélice na maioria dos casos e folha-beta em
alguns casos) que se encaixa no sulco maior da dupla hélice do DNA, onde fazem contatos de
Van der Waals significativos. O grau de extensão dos contatos da proteína com DNA estão
diretamente relacionados à força de interação de van der Waals (Jayaram e Jaim, 2004).
Estudos estruturais de proteínas e complexos de proteína:DNA têm indicado que o
reconhecimento especifico é alcançado por diferentes motivos estruturais, tais como hélice-
volta-hélice, zíper de leucina, e dedos de zinco (Madel-Gutfreund et al, 1995). Muitos desses
trabalhos mostram que complementaridade estrutural é alcançada pela inserção de uma α
hélice no sulco maior da dupla hélice do DNA (Harrison e Aggarwal, 1990; Gehring et al,
1994; Schmiedeskamp e Klevit, 1994; Ellenberger, 1994), embora alguns trabalhos também
tenham mostrado o papel de estrutura em folha beta (Raumann et al, 1994; Kim et al, 1993).
As pontes de hidrogênio, aparentemente, constituem a maioria das interações entre
proteína e DNA, envolvendo a cadeia lateral dos resíduos de aminoácidos e os átomos da base
nitrogenada. Interações envolvendo as bases do DNA e o esqueleto protéico também são
encontradas, e acredita-se que essas interações sejam responsáveis pela estabilização do
complexo, orientando a proteína de maneira a facilitar o contato entre a cadeia lateral dos
aminoácidos e as bases do DNA (Mandel-Gutfreund et al, 1995). Esse tipo de ligação
envolvendo a cadeia lateral dos aminoácidos e as bases do DNA faz parte de um mecanismo
de leitura direto do DNA pela proteína e são determinadas principalmente pela capacidade dos
átomos envolvidos em formar pontes de hidrogênio (Seeman et al, 1976).
Mecanismos de leitura indiretos
Muitos autores têm sugerido um importante papel de moléculas de água e de solvente
no mecanismo indireto de reconhecimento (Mattews, 1988; Jayram e Jaim, 2004; Lavery,
2006). Nesse caso, as bases são reconhecidas indiretamente com a intermediação de uma
Introdução
8
molécula de água do solvente que se encontra em contato direto com a cadeia lateral da
proteína, permitindo a formação de um complexo. Isso é verificado em muitas estruturas
cristalográficas de complexos proteína-DNA. Alteração na posição de qualquer dos
componentes envolvidos é capaz de afetar drasticamente a afinidade de ligação (Mattews,
1988).
A análise estrutural de um grande número de complexos entre proteínas e DNA tem
mostrado que o mecanismo de leitura direto feito pelas pontes de hidrogênio não é o único
mecanismo envolvido no reconhecimento e ligação de ácidos nucléicos, uma vez que são
descritos alguns exemplos na literatura de complexos proteína-DNA em que não há nenhuma
ponte de hidrogênio envolvida. É o caso do complexo específico operador-repressor do
triptofano (trp, Otwinowski et al, 1988). Outro indicativo do envolvimento de outros fatores
no reconhecimento nucléico é que muitos complexos apresentam apenas alguns pontos de
contato entre a proteína e o DNA, o que não justifica o tamanho da seqüência de bases que
usualmente é tida como sendo a seqüência necessária para o reconhecimento nucléico. A
flexibilidade do DNA dependente de seqüência tem sido descrita como sendo um importante
mecanismo indireto de reconhecimento nucléico. Alguns exemplos na literatura têm mostrado
a importância dessa adaptação estrutural, onde as seqüências de DNA que são menos
propensas a se dobrar apresentam menor afinidade de ligação e vice-versa (Jayaram e Jaim,
2004). A ligação da proteína E2 de papilomavírus ao seu DNA consenso, modelo utilizado
nessa tese, é um bom exemplo de leitura indireta, como será discutido mais adiante.
Adicionalmente, a neutralização dos fosfatos por resíduos básicos da proteína pode facilitar o
dobramento do DNA e a ligação à proteína. Histonas utilizam esse modo de ligação para o
empacotamento do DNA, muito embora essa ligação seja não específica. Análise estrutural
detalhada de proteínas ligadoras de DNA mostram uma distribuição assimétrica de cargas,
sendo o lado que interage com o DNA carregado positivamente e o lado oposto com excesso
Introdução
9
de carga negativa. Essa orientação de cargas parece auxiliar a ligação ao DNA (Jayaram e
Jaim, 2004).
A flexibilidade dependente de seqüência também é um fator importante no
reconhecimento nucléico. Mutações em bases que não estão envolvidas diretamente na
ligação com a proteína durante a formação do complexo têm mostrado afetar diretamente a
afinidade de ligação. Esse fato sugere a necessidade de uma adaptabilidade estrutural tanto da
proteína como do DNA. Uma mudança de conformação do DNA ou da proteína (em geral de
ambos) deve ser levada em consideração na hora de se avaliar e prever o reconhecimento
nucléico. Este fator é considerado como sendo um mecanismo indireto do reconhecimento
nucléico (Lavery, 2006). Esse mecanismo indireto é difícil de ser calculado e/ou previsto. E
com as análises da estrutura de diferentes complexos, pode-se sugerir que mesmo pequenas
deformações na estrutura do DNA podem exercer um importante efeito na especificidade de
seqüência.
Código de reconhecimento
A propensão de formar pontes de hidrogênio poderia funcionar como um mecanismo
de predição para identificação de possíveis sítios de ligação de proteínas no DNA ou ainda
para o desenvolvimento de novos sítios de ligação para proteínas (Seeman et al, 1976).
Entretanto a análise de estruturas feita por alguns autores (Mattews, 1988; Pabo e Sauer,
1992; Mandel-Gutfreund, 1995), não foi capaz de chegar a nenhum código preciso, como é o
código genético ou o código de transcrição do mRNA, por exemplo, embora algumas
preferências possam ser encontradas (Mandel-Gutfreund, 1995). Essas preferências são
baseadas na estrutura química dos aminoácidos e bases envolvidas. Por exemplo, aminoácidos
que são capazes de fazer duas pontes de hidrogênio vão preferencialmente ligar a bases
complementares (por exemplo, arginina e guanina, ácido aspártico e adenina ou glutamina e
adenina, Mandel-Gutfreund, 1995).
Introdução
10
A determinação de um padrão de reconhecimento e ligação ao DNA por proteínas e a
habilidade de modular interfaces existentes e criar novas interfaces poderia ser extremamente
útil para muitas aplicações biológicas e médicas (Havranek et al, 2004). Além disso, um
maior entendimento relacionado aos princípios que regem o reconhecimento nucléico poderia
prover informações úteis para o desenvolvimento de fármacos seletivos para seus alvos
biológicos.
Papilomavírus Humano
Papilomavírus são um pequeno grupo de vírus de DNA que infectam principalmente o
tecido epitelial de uma variedade de espécies animais, de pássaros a humanos (Howley,
1996). São parte da família taxonômica Papillomaviridae e normalmente, são espécie-
específico e tecido-específico, sendo distribuídos globalmente e ubiquamente. Mais de 100
tipos de papilomavírus humano (HPV) já foram descritos, dos quais 40 infectam o trato
genital (de Villers et al, 2004, Woodman et al, 2007, Wheeler, 2007). HPV é sexualmente
transmissível e tem sido associado com um amplo espectro de doenças proliferativas
epiteliais, desde as verrugas comuns a neoplasmas intraepiteliais que podem progredir a
carcinomas invasivos (Stanley, 2003). Segundo dados da organização mundial de saúde, 99%
dos casos de câncer de colo de útero contém DNA de HPV
1
. Este é o segundo tipo de câncer
mais comum mundialmente, responsável por 493 mil novos casos diagnosticados e 274 mil
mortes no ano de 2002 (Parkin e Bray, 2006). Boa parte da mortalidade associada a esse tipo
de câncer acontece nos países chamados em desenvolvimento, onde o câncer de colo de útero
é responsável por 15% dos casos de câncer em mulheres (Dell e Gaston, 2001, Parkin e Bray,
2006). Nos países chamados desenvolvidos esse número é bem menor (3,6%) devido à prática
de exames de prevenção e varredura citológica (Dell e Gaston, 2001, Parkin e Bray, 2006,
Trottier e Franco, 2006). No Brasil, o câncer de colo de útero é a terceira neoplasia maligna
1
http://www.who.int/vaccines/en/hpvrd.shtml
Introdução
11
mais comum entre as mulheres, sendo superado apenas pelo câncer de pele (não-melanoma) e
pelo câncer de mama. Segundo dados do INCA
2
é a quarta causa de morte por câncer em
mulheres no Brasil. No mundo, a maior taxa de incidência desse tipo de câncer é na África
subsaariana, Melanésia, América Latina, Caribe e Ásia (principalmente nas regiões sudeste e
centro-sul) (Parkin e Bray, 2006, figura 2).
Estimativa do número de casos de câncer
cervical em 2002
Razão/100.000
Estimativa do número de casos de câncer
cervical em 2002
Estimativa do número de casos de câncer
cervical em 2002
Razão/100.000
Figura 2. Freqüência estimada do número de casos de câncer cervical em 2002. As
regiões mais afetadas encontram-se destacadas em vermelho e as menos afetadas, em branco.
Adaptado de Parkin e Bray, 2006.
Os HPV podem ser sub-classificados de acordo com seu risco de desenvolvimento de
câncer. HPV-6 e HPV-11, por exemplo, infectam o trato anogenital e estão associados ao
2
http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=326
Introdução
12
desenvolvimento das verrugas (ou condilomas) genitais e por isso são chamados de HPV de
baixo risco. Por outro lado, outros tipos de HPV estão fortemente associados ao
desenvolvimento de câncer, e por essa razão são chamados de HPV de alto risco. Os HPVs de
alto risco mais comuns são HPV-16 (presente em aproximadamente 50% dos casos), seguido
de HPV-18 (aproximadamente 15%), HPV-45 (8%) e HPV-31 (5%) (Dell e Gaston, 2001).
Embora esses quatro tipos de HPV sejam os mais prevalecentes, há pelo menos mais 15 tipos
de HPV associados com câncer já descritos (Roden e Wu, 2006). Essa forte associação entre
DNA viral de HPV e câncer sugere que o HPV é o agente etiológico do câncer de colo de
útero. Porém, aparentemente, infecção por HPV de alto risco não é o único desencadeador da
doença visto que a maioria das infecções por HPV são subclínicas e apenas uma pequena
fração das lesões evolui para a formação do câncer cervical (Muñoz et al, 2006). Estudos da
progressão natural da doença mostram que a grande maioria das infecções por HPV e das
lesões intraepteliais relacionadas ao HPV são combatidas naturalmente pelo sistema imune
(Dell e Gaston, 2001).
Algumas formas de terapia estão disponíveis para o tratamento de lesões pré-
cancerosas, porém a maioria delas foca na remoção da lesão e não no tratamento da infecção
propriamente dita (Stanley, 2003). Esses tratamentos são eficazes no caso de infecções locais,
como no caso das verrugas genitais. Porém, em casos de neoplasias, esses tratamentos são
muitas vezes ineficientes (Dell e Gaston, 2001, Stanley, 2003, Wheeler, 2007), requerem
múltiplas aplicações, possuem uma alta taxa de falha (cerca de 30%) e uma taxa de
reincidência alta (cerca de 70%) (Dell e Gaston, 2001, Wheeler, 2007). Dessa maneira, novas
abordagens para o tratamento de lesões pré-cancerosas e/ou prevenção à infecção por HPV se
fazem necessárias (Dell e Gaston, 2001, Wheeler, 2007). Depois da iniciativa de erradicar a
infecção por HPV iniciada há mais de 50 anos com os programas de varredura (que chegou a
reduzir a incidência de câncer em cerca de 75% em algumas regiões), em junho de 2006 foi
aprovada pelo Food and Drugs Administration dos Estados Unidos, uma vacina quadrivalente
Introdução
13
contra precursores de câncer cervical e lesões genitais externas causadas pelos tipos de HPV
mais comuns (HPV-6, HPV-11, HPV-16 e HPV-18, Wright et al, 2006, Villa et al, 2006)
usando como base a proteína capsídica L1. Além disso, uma vacina bivalente para prevenção
contra infecção por HPV-16 e HPV-18 foi submetida para licenciamento na Europa. Essas
iniciativas podem ser consideradas um marco no esforço para redução do impacto do câncer
de colo de útero. Porém seus efeitos só deverão se fazer sentir efetivamente após algumas
gerações de mulheres submetidas a esse regime de vacinação (Wright et al, 2006). E, embora
essas vacinas possam reduzir o número de mulheres infectadas em longo prazo, em curto
prazo, medidas preventivas devem continuar a serem tomadas e novas abordagens devem ser
buscadas como alternativa de terapia para os milhões de mulheres atualmente infectadas.
O genoma viral consiste de um pequeno DNA dupla-fita de aproximadamente 8 kb
que é normalmente mantido na célula hospedeira como um episoma circular, com as faces de
leitura abertas (ORPs, sigla do inglês open reading frames) ocupando somente uma das fitas
(figura 3). Essas ORPs codificam proteínas que são classificadas como recentes ou tardias,
dependendo do momento em que são expressas durante a infecção e do grau de diferenciação
da célula hospedeira (Stanley, 2003). A tabela 1 mostra um resumo das proteínas codificadas
pelo genoma do HPV e suas funções. A transcrição dessas ORF é regulada pela proteína E2
viral e por vários fatores de transcrição celulares como será discutido mais adiante. Os sítios
de ligação para essas proteínas regulatórias estão localizados entre o início da ORF da
proteína E6 e o final do ORF da proteína L1, em uma região do genoma chamada de região de
controle longo (LCR, do inglês, long control region) ou região regulatória superior (URR, do
inglês, upstream regulatory region). Esta região do genoma viral contém cerca de 1000 pares
de bases e não codifica para proteínas, mas contém vários elementos cis necessários para a
regulação da expressão gênica, replicação do genoma e o empacotamento das partículas virais
(Muñoz et al, 2006). Os produtos dos genes E6 e E7 são oncoproteínas que desestabilizam os
supressores de tumor celulares p53 e Rb. A proteína E6 exerce seu efeito pela ligação e
Introdução
14
inativação da proteína supressora de tumor p53, levando a ubiquitinação e a sua degradação
via proteosoma (Dell e Gaston, 2001, Münger e Howley, 2002). A proteína E7, por sua vez,
liga e inativa a proteína retinoblastoma (Rb) o que, em última análise, leva ao descontrole do
ciclo celular (Dell e Gaston, 2001, Münger e Howley, 2002). As proteínas L1 e L2 são as
proteínas estruturais que formam o capsídio viral, sendo L1 a proteína majoritária,
correspondendo a 80% do conteúdo protéico do capsídio. L1, mas não L2, é capaz de se ligar
ao DNA, auxiliando na encapsulação do genoma viral (Zhou et al, 1994). O produto do gene
E1 é uma helicase necessária para a replicação. O produto do gene E2 tem um papel
fundamental na regulação da transcrição gênica e na replicação do DNA (Hedge, 2002).
Figura 3. Representação esquemática do genoma do HPV. Esse esquema representa o
arranjo das proteínas não estruturais (early) e proteínas estruturais (late) e a região reguladora
da transcrição URR (do inglês, upstream regulatory region). Adaptado de Muñoz et al, 2006.
Introdução
15
Proteína
viral
Função Algumas proteínas parceiras
E1
Helicase, ATPase, essencial para
replicação viral
E1, E2, DNA polimerase α-
primase, ciclina E-CDK2
E2
Fator de replicação viral, forma
complexo de iniciação da transcrição
junto com E1, importante na
encapsidação do genoma
E1, E2, Sp1, AMF-1, TBP,
TFIIB, p53, CBP, RPA
E4
Permite a montagem de novas
partículas virais
Proteínas do citoesqueleto
E5
Oncoproteína com fraca atividade de
transformação
EGFR, PGDFR, ATPase
vacuolar
E6
Oncoproteína, direciona p53 à
degradação via proteosoma
E2, p53, E6-AP, hDlg, hScrib,
Paxillin, Bak
E7
Oncoproteína, liga Rb, desregula ciclo
celular, leva a imortalização celular
Rb, p107, p130, TBP, ISGF3,
AP1, Mi2
β
, IGFBP-3, PK
L1 Proteína capsídica majoritária
L2 Proteína capsídica minoritária
Tabela 1. Proteínas codificadas por HPV e suas funções. Adaptado de Dell e Gaston, 2001,
Stanley, 2002, Parish et al, 2006.
O ciclo de vida do HPV está fortemente relacionado à diferenciação do queratinócito e
é separado em uma fase não-produtiva e uma fase produtiva de amplificação vegetativa
(figura 4). A infecção inicial se dá pelas células da camada basal da epiderme através de
pequenas lesões, onde o genoma viral é mantido como um elemento extracromosomal de
replicação autônoma (episoma) no núcleo das células hospedeiras. Durante este período não-
produtivo, somente os genes recentes são expressos, principalmente as proteínas E1 e E2 que
formam o complexo de replicação inicial. A proteína E2 apresenta diversos papéis
importantes nesta etapa da infecção, sendo necessária para a iniciação da transcrição gênica
viral e segregação do genoma. Nas células da camada basal o genoma viral é replicado
juntamente com o DNA celular da célula hospedeira durante a fase S, sendo distribuído
igualmente nas células filhas através da ligação de E2 aos cromossomos mitóticos que se dá
pela porção C-terminal da proteína Brd4 celular (Abbate et al, 2006). A proteína E2 também
Introdução
16
atua na repressão da expressão das oncoproteínas E6 e E7. Essa fase não-produtiva da
infecção inicial é seguida de uma fase proliferativa, onde, juntamente com a diferenciação dos
queratinócitos, há a expressão dos genes tardios (estruturais) e a montagem das partículas
virais. Essa fase é caracterizada pela integração do genoma viral no cromosoma da célula
hospedeira, levando à ruptura do ORF da proteína E2. Como resultado há um aumento na
expressão das proteínas E6 e E7 e o desenvolvimento do câncer. Estudos demonstraram que a
ruptura do gene da proteína E2 é necessária para a transformação celular, uma vez que a
reintrodução da proteína E2 em linhagens celulares cancerosas leva a repressão da transcrição
das oncoproteínas E6 e E7, estabilização da proteína supressora de tumor e o bloqueio da
passagem da fase G1 para a fase S do ciclo celular (Dell e Gaston, 2001). E2 também pode
induzir apoptose através de um mecanismo independente de p53 (Hedge, 2002).
Liberação dos vírus
Montagemdos
vírus/ liberação dos
vírus
Amplificação do
genoma
Manutenção do
genoma/ proliferação
celular
Manutenção do
genoma
Epiderme
Derme
Cutâneo Mucosa
Córneo
Granular
Suprabasal
Basal
Liberação dos vírus
Montagemdos
vírus/ liberação dos
vírus
Amplificação do
genoma
Manutenção do
genoma/ proliferação
celular
Manutenção do
genoma
Epiderme
Derme
Cutâneo Mucosa
Liberação dos vírus
Montagemdos
vírus/ liberação dos
vírus
Amplificação do
genoma
Manutenção do
genoma/ proliferação
celular
Manutenção do
genoma
Epiderme
Derme
Cutâneo Mucosa
Córneo
Granular
Suprabasal
Basal
Figura 4. Ciclo de vida de HPV. Os eventos chaves do ciclo de vida do HPV estão descritos
a direita. As diferentes camadas celulares do epitélio estão indicadas à esquerda. A expressão
das diferentes proteínas virais está indicada pelas setas coloridas, sendo a razão da expressão
indicada pela intensidade de cor da seta (cor clara, baixa expressão, cor forte, alta expressão).
Nas células da camada basal, durante a fase de manutenção do genoma há a expressão das
proteínas virais pela atividade do promotor p670. Com a diferenciação dos queratinócitos
ocorre a ruptura da ORP da proteína E2 e um aumento na expressão das oncoproteínas E6 e
E7 através da ativação do promotor p97. Nas camadas superiores, ocorre a expressão das
proteínas estruturais L1 e L2, e a montagem das partículas virais que são liberadas pelas
células da epiderme. Adaptado de Doorbar, 2006.
Introdução
17
O número de promotores da transcrição viral é bem variado em papilomavírus. De
uma maneira geral, HPVs considerados de alto risco oncogênico, como HPV-16 e HPV-18,
possuem apenas dois promotores. O P
97
de HPV-16 (correspondente ao P
89
em BPV-1) atende
as ORF de E6 e E7, sendo o mais importante, uma vez que sozinho regula a expressão dessas
proteínas. Em HPVs de baixo risco oncogênico, como HPV-6 e HPV-11, a expressão dessas
proteínas é regulada por dois promotores independentes. Em BPV-1 (papilomavírus bovino
tipo 1), um papilomavírus considerado como sem risco oncogênico em humanos, são seis os
promotores ativos nas células transformadas, sendo a regulação da expressão gênica nas
células infectadas por esse vírus altamente controlada.
Proteína E2
A proteína E2 é a principal proteína reguladora da transcrição viral de HPV. A região
LCR do genoma viral normalmente possui quatro sítios de ligação a E2 (E2BS, figura 5). A
localização desses sítios é conservada entre os papilomavírus de alto risco, o que sugere que a
sua posição possa ser necessária para a função viral normal (Dell e Gaston, 2001). Dois desses
sítios de ligação a E2 (BS1 e BS2, figura 5) estão localizados entre o sítio de ligação de Sp1 e
a caixa TATA. A ligação da proteína E2 nesses sítios impede a ligação de Sp1 e TBP, dois
importantes fatores transcricionais, o que leva a uma repressão da transcrição. Os outros dois
sítios de ligação a E2 estão localizados acima da região promotora e a ligação de E2 a esses
sítios por sua vez, leva a uma ativação da transcrição (Dell e Gaston, 2001). Além desse
mecanismo de regulação da transcrição, a proteína E2 pode atuar como um ativador ou um
repressor da transcrição viral dependendo do processamento pós transcricional sofrido pela
proteína (McBride et al, 1991; Dell e Gaston, 2001; Hedge, 2002). Sabe-se que células
infectadas podem conter somente o domínio C-terminal (E2-TR), responsável pela ligação ao
DNA e dimerização da proteína; uma proteína truncada E2-E8, proveniente de processamento
Introdução
18
pós-transcricional alternativo ou a proteína E2 inteira (figura 6, McBride et al, 1991). Como
muitas proteínas ligadoras de DNA, a proteína E2 apresenta uma estrutura bem conservada
com três domínios distintos (figura 7): um domínio amino terminal (N-terminal, domínio de
transativação) responsável pela interação com outros fatores transcricionais celulares e virais;
uma região (ou domínio) intermediária altamente flexível e pouco conservada, rica em
prolinas, onde ficam os sítios de fosforilação que levam à degradação da proteína (Penrose et
al, 2004) e um domínio carbóxi terminal (C-terminal) responsável pela ligação ao DNA e
homo e heterodimerização. As regiões N-terminal (aproximadamente 200 aminoácidos) e C-
terminal (aproximadamente 85 aminoácidos) são bem conservadas em todos os
papilomavírus. Como pode ser observado na figura 6, os produtos E2-TR e E8-E2 apresentam
deleção na porção N-terminal e com isso perdem a função de ativação da transcrição, embora
continuem a se ligar ao DNA, com isso reprimindo a sua transcrição.
Origem de replicação
Capsídio
Transformação
Transcrição,
replicação
Replicação
Transformação
Enhancer
Origem de replicação
Capsídio
Transformação
Transcrição,
replicação
Replicação
Transformação
Origem de replicaçãoOrigem de replicação
Capsídio
Transformação
Transcrição,
replicação
Replicação
Transformação
Enhancer
Figura 5 Representação esquemática do genoma do HPV. Genes para oito proteínas
recentes e duas proteínas tardias estão indicadas. Embaixo encontra-se um esquema para a
região de controle longo do DNA. Sítios de ligação da proteína E2 (BS) 1 a 4 estão
representados como caixas cinza. A caixa TATA e os promotores recentes P
97
/P
105
também
estão indicados. Para um melhor entendimento das funções das proteínas virais ver texto e
tabela 1. Adaptado de Hedge, 2002.
Introdução
19
E2
1410
E2-TR
168 410
E8-E2
206 410
E8
2443
3080
(48Kd)
(31Kd)
(28Kd)
E2
1410
E2-TR
168 410
E8-E2
206 410
E8
2443
3080
(48Kd)
(31Kd)
(28Kd)
E2
1410
E2-TR
168 410
E8-E2
206 410
E8
2443
3080
(48Kd)
(31Kd)
(28Kd)
E2
1410
E2
1410
E2-TR
168 410
E2-TR
168 410
E8-E2
206 410
E8 E8-E2
206 410
E8
24432443
30803080
(48Kd)
(31Kd)
(28Kd)
E2
1410
E2
1410
E2-TR
168 410
E2-TR
168 410
E8-E2
206 410
E8 E8-E2
206 410
E8
24432443
30803080
(48Kd)
(31Kd)
(28Kd)
Figura 6. Produtos do gene E2 de papilomavírus. As regiões N-terminal (aproximadamente
200 aminoácidos) e C-terminal (aproximadamente 85 aminoácidos) são bem conservadas em
todos os papilomavírus. A função da proteína E2 (ativação ou repressão da transcrição viral)
vai depender do processamento pós-transcricional sofrido pelo produto do gene E2. Os
produtos E2-TR e E8-E2 apresentam deleção na porção N-terminal e com isso perdem a
função de ativação da transcrição, embora continuem a se ligar ao DNA, com isso reprimindo
a sua transcrição. Adaptado de McBride et al, 1991.
Módulo C-terminalMódulo N-terminal
13280198
E1-HPV AMF-1 Sp1 TFIIB
65
E2-HPV
(dimerização)
reconhecimento DNA
(ACCGN
4
CGGT)
Módulo de ligação
Região rica em prolina e
sítios de fosforilação
Transativação
Ligação ao DNA e
dimerização
Módulo C-terminalMódulo N-terminal
13280198
E1-HPV AMF-1 Sp1 TFIIB
65
E2-HPV
(dimerização)
reconhecimento DNA
(ACCGN
4
CGGT)
Módulo de ligação
Região rica em prolina e
sítios de fosforilação
Transativação
Ligação ao DNA e
dimerização
Figura 7. Esquema mostrando a organização estrutural e funcional da proteína E2 de
papilomavírus. Encontra-se representado na figura as porções N-terminal, central e C-
terminal da proteína E2 indicando suas respectivas funções. Os números correspondem aos
aminoácidos iniciais e finais de cada módulo. Adaptado de Antson et al, 2000.
A ligação ao DNA se dá pelo reconhecimento e ligação a uma seqüência palindrômica
consenso do DNA ACCg-N
4
-cGGT, onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Esta seqüência
espaçadora variável (N
4
) pode influenciar a afinidade de ligação, uma vez que afeta a
capacidade do DNA de se dobrar após a ligação à proteína. Este sítio de ligação à E2
(E2DBS) se encontra repetido algumas vezes no DNA viral. Algumas diferenças entre os
Introdução
20
tipos virais têm sido descritas com relação à discriminação entre os diferentes E2DBS
contendo diferentes seqüências espaçadoras. Sabe-se, por exemplo, que os tipos virais mais
comumente associados a malignidade, como HPV-16 e HPV-18, ligam com maior afinidade a
E2DBS ricos em AT, isto é, cuja seqüência espaçadora possua maior número de bases AT.
Por outro lado, as proteínas E2 de papilomavírus bovino tipo 1 (BPV-1) não apresentam
preferência por seqüência espaçadora (Hines et al, 1998, Kim et al, 2000, Hedge, 2002, figura
8).
Afinidade relativa (unidades arbitrárias)Afinidade relativa (unidades arbitrárias)
Figura 8. Afinidade da proteína E2 de HPV por diferentes seqüências. As afinidades
relativas de HPV-18 (painel da direita), HPV-16 (painel central) e BPV-1 (painel da esquerda)
para E2BS cuja região espaçadora contém as seqüências ACGT, AATT, AAAA e TTAA
indicadas nas barras. Retirado de Hedge, 2002.
Introdução
21
Estruturas tanto por cristalografia de raios-x como por ressonância magnética nuclear
do domínio de ligação ao DNA de vários tipos de HPV já foram resolvidas e publicadas
(tabela 2; Bussiere et al, 1998, Hedge e Androphy, 1998, Kim et al, 2000, Dell et al, 2003,
Nadra et al, 2004, Hooley et al, 2006). A proteína E2 é um protótipo para um novo motivo
estrutural de proteínas ligadoras de DNA. Seu dímero forma um barril de folhas beta, com
cada subunidade formada por quatro folhas antiparalelas e duas α-hélices (α-hélice 1 e α-
hélice 2) alinhadas perpendicularmente ao barril (figura 9), contribuindo com meio barril. A
topologia de cada subunidade é β1−α1−β2−β3−α2−β4 (figura 9, painel A). A α-hélice 1 é a
hélice de reconhecimento onde estão localizados a maioria dos aminoácidos envolvidos em
contato direto e específico com o DNA. Nas estruturas em solução de HPV, essa hélice
apresenta uma mobilidade que pode ser importante para o reconhecimento e ligação ao DNA
(Hedge, 2002). A seqüência dessa região da proteína E2 é bem conservada, variando de 54%
de identidade (77% de similaridade) entre os tipos mais relacionados HPV-16 e HPV-18, a
33% de identidade (51% de similaridade) entre os tipos mais distantes HPV-16 e BPV-1
(Figura 10; Hedge, 2002). A maior conservação é vista nos resíduos que formam a hélice de
reconhecimento e a interface do dímero (figura 9 e 10).
Introdução
22
Estrutura Tipo de HPV Amostra Técnica Resolução Referência
2AYG HPV-31 proteína Cristalografia 2,4 Å Bussiere et al, 1998
1JJH BPV-1 proteína Cristalografia 2,5 Å Hedge et al, 1998
1DHM HPV-31 proteína RMN n/d Liang et al, 1996
1ZZF HPV-16 [proteína:DNA] RMN n/d n/d
*
1BY9 HPV-16 Proteína Cristalografia 2,2 Å
Hedge e Androphy,
1998
1JJ4 HPV-18 [proteína:DNA] Cristalografia 2,4 Å Kim et al, 2000
1F9F HPV-18 proteína Cristalografia 1,9 Å Kim et al, 2000
1R8H HPV-6 proteína Cristalografia 1,9 Å Dell et al, 2003
2AYE HPV-6 Proteína Cristalografia 2,3 Å Hooley et al, 2006
2AYB HPV-6 [proteína:DNA] Cristalografia 3,2 Å Hooley et al, 2006
2AYG HPV-6 [Proteína:DNA] Cristalografia 3,1 Å Hooley et al, 2006
1R8P HPV-16 proteína RMN n/d Nadra et al, 2004
2BOP BPV-1 [proteína:DNA] Cristalografia 1,7 Å Hedge et al, 1992
Tabela 2: Estruturas de proteína E2c publicadas na literatura.
n/d, dado não disponível.
*a ser publicado.
A B
Figura 9. Complexo do domínio de ligação ao DNA da proteína E2 de HPV-18 com
DNA. Painel A, estrutura do monômero do domínio de ligação ao DNA (DBD) da proteína
E2 (retirado de Hedge, 2002). Painel B, representação do dímero do DBD da proteína E2 em
complexo com DNA. Figura feita com auxílio do programa PyMol (Material e Métodos) a
partir da estrutura publicada na base de dados protein data bank sob o código de acesso
1JJ4.pdb (Kim et al, 2000). Destacado em vermelho encontra-se a hélice de reconhecimento
ao DNA (α-hélice-1).
Introdução
23
E2-HPV16 (pdb:1by9) --TTPIVHLKGDANTLKCLRYRFK-KHCTLYTAVSSTWHWT--------- 38
E2-HPV6 (pdb:1R8H) SSATPIVQFQGESNCLKCFRYRLNDKHRHLFDLISSTWHWASPK--APHK 48
E2-HPV18 (pdb:1jj4) --MTPIIHLKGDRNSLKCLRYRLR
-KHSDHYRDISSTWHWT--------K 39
E2-BPV1 (pdb:2bop) ---SCFALISGTANQVKCYRFRVKKNHRHRYENCTTTWFTVADNGAERQG 47
: : :.* * :** *:*.. :* : ::**. .
E2-HPV16 (pdb:1by9) -AIVTLTYDSEWQRDQFLSQVKIPKTITVSTGFMS---- 72
E2-HPV6 (pdb:1R8H) HAIVTVTYHSEEQRQQFLNVVKIPPTIRHKLGFMSMHLL 87
E2-HPV18 (pdb:1jj4) TGILTVTYHSETQRTKFLNTVAIPDSVQILVGYMT---- 74
E2-BPV1 (pdb:2bop) QAQILITFGSPSQRQDFLKHVPLPPGMNIS-GFTASLDF 85
. : :*: * ** .**. * :*
Figura 10: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do domínio de ligação ao DNA
das proteínas E2. As seqüências das proteínas E2 de papilomavírus humano dos tipos 6, 16 e
18 (HPV-6, HPV-16 e HPV-18) e papilomavírus bovino do tipo 1 (BPV-1) foram alinhadas
com o auxilio do programa ClustalW. As seqüências foram extraídas da base de dados protein
data bank (pdb) sob os códigos de acesso indicados na figura. Em vermelho estão indicados
os aminoácidos hidrofóbicos; em azul estão indicados os aminoácidos ácidos; em verde estão
indicados os aminoácidos carregados. (*) na última linha indica aminoácidos idênticos em
todas as seqüências; (:) indica substituições conservadas de acordo com a tabela de cores
indicada na legenda; e (;) indica que substituições semiconservadas podem ser observadas de
acordo com a mesma tabela de cores. A seqüência correspondente à α-hélice 1 ou hélice de
reconhecimento encontra-se sublinhada.
Embora a estrutura tridimensional da proteína E2 DBD seja bem similar entre os
diferentes tipos, há uma diferença com relação à orientação das subunidades. Isso é
claramente visto comparando uma das subunidades quando a outra subunidade é superposta
em diferentes estruturas (figura 11). Desta maneira as proteínas E2 podem ser classificadas
em dois grupos diferentes; HPV-16 e HPV-31 alocadas em um grupo, enquanto HPV-18 e
BPV-1 caem em outro. A hélice de reconhecimento de HPV-16 da subunidade não superposta
é deslocada cerca de 4 Å e inclinada 25
o
relativo à hélice correspondente em BPV-1 e HPV-
18. Essa diferença sutil na estrutura quaternária provavelmente irá influenciar o grau de
deformação do DNA após a ligação (Hedge, 2002). No complexo, a hélice de reconhecimento
é inserida sucessivamente no sulco maior do DNA (figura 9), fazendo contato direto com
metade da seqüência de ligação (E2BS). A proteína sofre uma deformação após a ligação,
sendo a principal diferença vista em BPV-1, onde uma volta composta por 10 resíduos de
aminoácidos entre β2 e β3 assume uma conformação ordenada. O DNA se enrola em volta do
barril de folha β, de maneira que as hélices de reconhecimento entrem no sulco maior do
Introdução
24
DNA. O DNA é dobrado cerca de 43
o
-51
o
em direção ao sulco menor (na região espaçadora)
(Hedge, 2002).
Figura 11. Comparação da estrutura da proteína E2c de HPV-16, HPV-18, HPV-31 e
BPV-1. As proteínas encontram-se superpostas pela subunidade da esquerda. A hélice de
reconhecimento das proteínas esta destacada em cores diferentes. Devido à localização das
hélices de reconhecimento, essas proteínas podem ser classificadas em dois grupos diferentes;
BPV-1 e HPV-18 se encontram em um grupo e HPV-16 e HPV-31 se encontram em outro.
Adaptado de Hedge, 2002.
O reconhecimento nucléico é feito por mecanismos diretos e indiretos. Resíduos de
aminoácidos da hélice de reconhecimento participam de rede de pontes de hidrogênio com
elementos do E2BS no DNA. Os modelos estruturais fornecem uma boa idéia a respeito dessa
interação.
Introdução
25
Proteínas tirosino fosfatase
Fosforilação de resíduos de tirosina de proteínas de membrana ou proteínas
intracelulares é um mecanismo importante de regulação da fisiologia de eucariotos, tanto na
saúde como na doença (Alonso et al, 2004). É usado para a comunicação entre e dentro das
células, para mobilidade, formato, proliferação, diferenciação, regulação de transcrição
gênica, processamento de mRNA e transporte de moléculas dentro e para fora das células
(Fisher et al, 1991, Alonso et al, 2004). Também possui um importante papel na coordenação
desses processos durante a embriogênese, desenvolvimento de órgãos, homeostase tecidual e
no sistema imune (Alonso et al, 2004). Os níveis de fosfotirosina dentro da célula são
controlados pela ação coordenada das proteínas tirosina cinases com as proteínas tirosino
fosfatases (PTP, EC 3.1.3.48) (Fauman et al, 1996). O desbalanço nos níveis de fosforilação
de tirosinas tem um papel na patogênese de inúmeras doenças adquiridas ou hereditárias,
variando de câncer a deficiências imunes.
Baseado nas seqüências de aminoácidos dos domínios catalíticos, as PTPases foram
classificadas em 4 famílias de proteínas principais. A classe I de PTPases é a maior família e
contém as clássicas proteínas tirosino fosfatases e as proteínas tirosino fosfatase de
especificidade dupla, que acomodam resíduos de fosfotreonina/ fosfoserina em seu sítio ativo,
além de fosfotirosina. A classe II de PTP é composta de enzimas de baixo peso molecular
com especificidade para resíduos de fosfotirosina e são estruturalmente semelhantes a
arsenato redutases de bactérias. A classe III de PTPases possuem especificidade para resíduos
de fosfotirosina e fosfotreonina. Essas três classes possuem uma cisteína no seu sítio ativo
importante para a catálise. Já a quarta classe possui um mecanismo de catálise com um ácido
aspártico chave e dependência de cátion, apresenta especificidade para fosfotirosina ou
especificidade dupla para fostirosina e fosfoserina (Alonso et al, 2004). Essa grande
diversidade molecular provavelmente reflete diferentes enzimas específicas para diferentes
vias de transdução de sinal que acontecem na célula simultaneamente. Embora poucas
Introdução
26
PTPases tenham seu papel associado a vias de sinalização específicas, muitos dados
bioquímicos tem sido revelados a respeito dessas enzimas (Fauman et al, 1996, Tonks, 2006).
PTPases clássicas
A classe I de PTP pode ainda ser classificada em várias subfamílias de acordo com sua
arquitetura e o grau de homologia do domínio catalítico. As PTPases clássicas (figura 12)
podem ser divididas em enzimas transmembrana, semelhante ao receptor (receptor-like -
RPTP) ou enzimas intracelulares, não-semelhantes ao receptor (nonreceptor-like - NRPTP)
(Alonso et al, 2004, Tonks, 2006). Essas enzimas clássicas contêm aproximadamente 280
resíduos de aminoácidos e são caracterizadas pelo motivo HCX
5
R no sítio ativo, onde a
cisteína funciona como um nucleófilo essencial para catálise e se encontra separada da
arginina por cinco resíduos de aminoácidos. Camundongos e ratos apresentam 38 genes para
PTP, incluindo pseudogenes que são preditos como sendo proteínas funcionais. Em humanos,
foram descritas 37 PTPases clássicas, com 12 pseudogenes únicos em humanos, alguns dos
quais são transcritos, mas cuja função permanece desconhecida. As PTPases semelhantes a
receptor (RPTP) possuem domínios arranjados em seqüência no seu segmento intracelular.
Toda a atividade catalítica encontra-se no domínio localizado próximo a membrana (D1),
enquanto o domínio distal (D2) normalmente é inativo (exceção para PTPα), apesar de sua
integridade ser importante para a atividade, especificidade e estabilidade da proteína como um
todo (Tonks, 2006). Além disso, D2 é importante para interações proteína-proteína que
regulam a dimerização das RPTPases.
Introdução
27
Domínio Meprin/A5/μ
Seqüência justamembrana semelhante
a caderina
Semelhante a anidrase carbônica
Fortemente glicosilado
Domínio PTP
Domínio semelhante a fibronectina tipo III
Semelhante a imunoglobulina
Pseudo-domínio PTP
Rico em prolina
Domínio PDZ
Domínio de histidina
Domínio FERM
Motivo de reconhecimento de adesão RDGS
Proteína semelhante a ligadora de retinaldeído celular / SEC14
Homólogo a Src-2
Motivo de interação com cinases
PTPs semelhante a receptor PTPs não transmembrana
Domínio Meprin/A5/μ
Seqüência justamembrana semelhante
a caderina
Semelhante a anidrase carbônica
Fortemente glicosilado
Domínio PTP
Domínio semelhante a fibronectina tipo III
Semelhante a imunoglobulina
Pseudo-domínio PTP
Rico em prolina
Domínio PDZ
Domínio de histidina
Domínio FERM
Motivo de reconhecimento de adesão RDGS
Proteína semelhante a ligadora de retinaldeído celular / SEC14
Homólogo a Src-2
Motivo de interação com cinases
Domínio Meprin/A5/μ
Seqüência justamembrana semelhante
a caderina
Semelhante a anidrase carbônica
Fortemente glicosilado
Domínio PTP
Domínio semelhante a fibronectina tipo III
Semelhante a imunoglobulina
Pseudo-domínio PTP
Domínio Meprin/A5/μ
Seqüência justamembrana semelhante
a caderina
Semelhante a anidrase carbônica
Fortemente glicosilado
Domínio Meprin/A5/μ
Seqüência justamembrana semelhante
a caderina
Semelhante a anidrase carbônica
Fortemente glicosilado
Domínio Meprin/A5/μ
Seqüência justamembrana semelhante
a caderina
Semelhante a anidrase carbônica
Fortemente glicosilado
Domínio PTP
Domínio semelhante a fibronectina tipo III
Semelhante a imunoglobulina
Pseudo-domínio PTP
Domínio PTP
Domínio semelhante a fibronectina tipo III
Semelhante a imunoglobulina
Pseudo-domínio PTP
Rico em prolina
Domínio PDZ
Domínio de histidina
Domínio FERM
Motivo de reconhecimento de adesão RDGS
Proteína semelhante a ligadora de retinaldeído celular / SEC14
Homólogo a Src-2
Motivo de interação com cinases
Rico em prolina
Domínio PDZ
Domínio de histidina
Domínio FERM
Rico em prolina
Domínio PDZ
Domínio de histidina
Domínio FERM
Motivo de reconhecimento de adesão RDGS
Proteína semelhante a ligadora de retinaldeído celular / SEC14
Homólogo a Src-2
Motivo de interação com cinases
Motivo de reconhecimento de adesão RDGS
Proteína semelhante a ligadora de retinaldeído celular / SEC14
Homólogo a Src-2
Motivo de interação com cinases
PTPs semelhante a receptor PTPs não transmembrana
Figura 12. As proteínas tirosino fosfatase clássicas (PTP clássicas). Desenho
representativo das PTP clássicas mostrando os diferentes domínios que podem ser
encontrados. Adaptado de Tonks, 2006.
As estruturas de todas as clássicas RPTPases publicadas até o momento revelam uma
arquitetura comum de uma proteína globular composta por 8 folhas beta torcidas flanqueadas
por quatro α hélices de um lado e outra α hélice do lado oposto; a seqüência essencial para
catálise fica localizada na parte de baixo da fenda catalítica; e quatro voltas, três das quais
possuem os aminoácidos responsáveis pela catálise e pela especificidade ao substrato. A
figura 13 mostra um desenho representativo da PTPσ nativa mostrando os dois domínios D1
(em verde) e D2 (em magenta).
Introdução
28
Figura 13. Estrutura das PTP. Desenho representativo da porção intracelular da proteína
tirosino fosfatase sigma (PTPσ), mostrando seus dois domínios D1 (com atividade catalítica,
a esquerda em verde) e D2 (pseudodomínio, sem atividade catalítica, a direita em magenta).
Figura feita com o auxílio do programa pymol (Material e Métodos) a partir da estrutura
depositada na base de dados protein data bank sob o código de acesso 2FH7.pdb (Alvarado et
al, 2006). Destacado em amarelo encontra-se a região do sítio ativo contendo a seqüência
HCX
5
R.
PTPases atuam não somente como um contraponto à ação das proteínas cinases,
inibindo a sinalização dependente de fosfotirosina, mas parecem também possuir um papel
ativador de algumas funções. Há alguns exemplos de superativação dessas enzimas em câncer
humano, onde a superexpressão de cd45 tem sido detectada em muitos cânceres, normalmente
associados a um prognóstico ruim (Kristjansdottir e Rudolph, 2004). Além disso, uma
mutação pontual de Arg360 por um triptofano em PTP lyp tem sido associada com uma série
de doenças auto-imunes como diabetes tipo I (Bottini et al, 2004), doença de Graves (Smyth
et al, 2004), artrite reumatóide (Begovich et al, 2004, Carlton et al, 2005) e lupus eritematoso
sistêmico (Kyogoku et al, 2004). Estudos têm mostrado que essa mutação promove um ganho
Introdução
29
de função que gera uma enzima mais ativa e inibindo a sinalização por células T de maneira
mais efetiva que a enzima selvagem (Vang et al, 2005). De qualquer maneira, estudos a
respeito dessa classe de enzimas ainda são muito recentes e muitas dessas enzimas
permanecem não caracterizadas.
Introdução
30
Objetivos
Como objetivo geral dessa tese pretendemos buscar um melhor entendimento dos
mecanismos de reconhecimento macromoleculares. Para isso utilizamos dois modelos
experimentais nessa tese. Em uma primeira abordagem trabalhamos com peptídeos sintéticos
correspondentes em seqüência à região específica (α-hélice) de reconhecimento e ligação ao
DNA da proteína E2 de papilomavírus humano. Em um segundo momento, fizemos uma
análise estrutural de duas proteínas tirosino fosfatase humanas.
Sendo assim, este projeto de tese apresenta os seguintes objetivos específicos:
Verificar o reconhecimento de ligação a seqüências específicas e não específicas de
DNA pelo peptídeo sintético α1E2 (correspondente à α-hélice 1 de ligação ao DNA da
proteína E2 de HPV-16);
Determinar a estrutura do peptídeo sintético α1E2 livre em solução e em complexo
com DNA;
Realizar simulações de dinâmica molecular de peptídeo correspondente a α-hélice 1 de
HPV-18 livre e em complexo com DNA;
Determinar a estrutura cristalográfica de diferentes peptídeos sintéticos
(correspondentes a α-hélice 1 de HPV-16, HPV-18 e BPV-1) em complexo com duas
seqüências distintas de DNA;
Determinar a estrutura da proteína tirosino fosfatase sigma na presença de um inibidor
competitivo (tungstato);
Determinar a estrutura inédita da proteína tirosino fosfatase IA2.
Material e Métodos
Material e Métodos
32
Peptídeos sintéticos: Os peptídeos correspondentes à hélice de reconhecimento ao DNA
(α1E2) de HPV16, HPV 18 e BPV-1 foram sintetizados e purificados por HPLC (>95% de
pureza) pela empresa Genemed (Califórnia, Estados Unidos). O peso molecular dos peptídeos
foi confirmado por espectrometria de massa pela própria empresa. Todos os peptídeos foram
ressuspensos em uma solução contendo DTT 0,1M e estocados a -20
o
C até a sua utilização.
As seqüências usadas nesse trabalho foram as seguintes:
α1E2 : H
2
N- GDA NTL KCL RYR FKK HCT –COOH; α-hélice 1 de HPV16 (seqüência estendida);
16α1E2 : H
2
N- DAN TLK CLR YRF K –COOH; α-hélice 1 de HPV16;
18α1E2 : H
2
N- DRN SLK CLR YRL R –COOH; α-hélice 1 de HPV18;
bpv1α1E2 : H
2
N- TAN QVK CYR FRV KKN –COOH, α-hélice 1 de BPV1
NR-peptide : H
2
N- DRG WGN GCG LFG KGG –COOH, seqüência não específica;
A figura 14 mostra a seqüência da proteína E2c dos Papilomavírus utilizados nessa
tese com seu motivo de estrutura secundária. A figura 15 mostra a estrutura cristalográfica
dessas proteínas, destacando a região correspondente aos peptídeos utilizados. O peptídeo
α1E2 teve sua seqüência estendida de modo a compreender toda a seqüência da α-hélice 1
(região sublinhada), grande parte da α-hélice 2 e mais um aminoácido na sua porção N-
terminal. Isso se deve ao fato de acreditarmos que as regiões vizinhas ajudariam a manter a
estabilidade desse peptídeo em solução, uma vez que se encontra agora fora do contexto da
proteína inteira. Os demais peptídeos foram utilizados nos ensaios cristalográficos, e
correspondem estritamente à seqüência da α-hélice 1. Nesse caso, como pretendíamos avaliar
a estrutura tridimensional dessa região fora do contexto da proteína inteira, foi mantida a
fidelidade à seqüência descrita na literatura e disponível nas bases de dados.
Material e Métodos
33
HPV-18 (1JJ4)
BPV-1 (2BOP)
HPV-16 (1BY9)
HPV-18 (1JJ4)
BPV-1 (2BOP)
HPV-16 (1BY9)
Figura 14: Seqüência da proteína E2c de Papilomavírus. As seqüências da proteína E2c de
HPV16 (código 1BY9.pdb), HPV18 (código 1JJ4.pdb) e BPV1 (código 2BOP.pdb) com os
respectivos motivos de estrutura secundária estão apresentados. A região da α-hélice 1
encontra-se sublinhada em vermelho. Seqüência e motivo de estrutura secundária foram
retirados da página da Internet pdbsum
4
.
4
http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
Material e Métodos
34
CD
BA
CD
BA
Figura 15: Estrutura cristalográfica da proteína E2c com destaque para a α-hélice 1 ou
hélice de reconhecimento. A e B, HPV16 (código 1BY9.pdb); C, HPV18 (código 1JJ4.pdb);
D, BPV1 (código 2BOP.pdb). Em vermelho encontra-se destacado o peptídeo utilizado em
ensaios de ligação (A). Em laranja (B, C, D) encontram-se destacados os peptídeos utilizados
nos ensaios de cristalografia.
Oligonucleotídios sintéticos: oligonucleotídios utilizados nessa tese foram comprados como
fita simples da empresa Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, Estados Unidos) e
utilizados sem purificação adicional. Parte dos oligonucleotídios utilizados nos estudos de
anisotropia possuíam uma molécula de fluoresceína ligada a sua extremidade 5’ através de
uma cadeia alifática de 6 carbonos. O anelamento e determinação da concentração dos
oligonucleotídios foram feitos segundo Lima e Prat-Gay, 1997. Os oligonucleotídios foram
ressuspensos em tampão de anelamento (Tris-HCl pH 8,0 10mM, EDTA pH 8,0 10mM, NaCl
50mM, MgCl
2
0,2mM) ou água e estocados a -20
o
C. O anelamento foi feito colocando-se os
oligos em uma placa quente aquecida a 96
o
C por 15 minutos. Após esse tempo, a placa era
Material e Métodos
35
desligada até lentamente alcançar a temperatura ambiente (23
o
C) em aproximadamente 12
horas. Os oligonucleotídios foram checados para completa hibridização por eletroforese em
gel de poliacrilamida não-desnaturante. Abaixo se encontram listadas as seqüências dos
oligonucleotídios (fita simples) utilizadas nesta tese. A região responsável pelo
reconhecimento à proteína E2 encontra-se sublinhada. A região espaçadora (não envolvida no
reconhecimento nucléico) encontra-se destacada em negrito.
E2DBS fita A (E2 Binding site): 5’-GTAACCGAAATCGGTTGA-3’
E2DBS fita B: 5’-TCAACCGATTCGGTTCA-3’
Half-E2DBS fita A: 5’-GCAACCG
ACATATATATA-3’
Half-E2DBS fita B: 5’-TATATATATGTCGGTTGC-3’
NS-DNA (DNA não-específico) fita A: 5’-ACTGTATGAGCATACAGTA-3’
NS-DNA (DNA não-específico) fita B: 5’ –TACTGTATGCTCATACAGT-3’
E2BSN4AATT: 5'-CAACCG
AATTCGGTTG-3' (autocomplementar)
E2BSN4ACGT: 5'-CAACCGACGTCGGTTG-3' (autocomplementar)
Os oligonucleotídios (fita dupla) E2DBS, Half-E2DBS e NS-DNA foram utilizados
nos ensaios de ligação por anisotropia de fluorescência. Os oligonucleotídios E2BSN4AATT e
E2BSN4ACGT foram usados nos ensaios cristalográficos.
Dicroísmo circular: O dicroísmo circular (CD) é utilizado para medir a atividade óptica de
moléculas assimétricas em solução. Essa técnica consiste na emissão de uma luz plana
polarizada que, ao passar pela amostra, é dividida em dois componentes de igual magnitude,
porém em sentidos contrários: o componente de polarização da direita e da esquerda. O termo
dicroísmo circular se refere à absorção diferencial desses dois componentes. Se após a
passagem por uma amostra esses dois componentes não são absorvidos ou são absorvidos
igualmente, há a regeneração da luz plana polarizada. Se, ao contrário, um dos dois
Material e Métodos
36
componentes é absorvido pela amostra em maior extensão, o resultado da combinação dos
dois componentes é uma radiação elipticamente polarizada. CD mede a diferença na
absorbância entre a luz polarizada circularmente pela esquerda e pela direita, geralmente
reportada em termos de elipticidade em graus. O espectro de CD é obtido quando o dicroísmo
é medido como uma função do comprimento de onda (Lakowics, 1999; Kelly et al, 2005).
Os estudos de dicroísmo circular foram realizados no espectropolarímetro Jasco-715
(Jasco Corporation, Tókio, Japão) acoplado a um termocontrolador de Peltier. As amostras
foram diluídas em tampão de ligação (BisTris 50mM, pH 7,0, DTT 1mM) e o espectro de
dicroísmo circular foi obtido variando-se o comprimento de onda entre 250 e 210 nm, com
uma velocidade de 50 nm/mim, a cada 0,2 nm em uma cubeta de quartzo de 1,00 mm de
caminho óptico. Todos os espectros mostrados nessa tese são uma média de pelo menos três
acumulações independentes e foram subtraídos do espectro do respectivo tampão. Os
resultados foram expressos em elipticidade molar [θ] calculada pela seguinte fórmula:
[θ]=([θ]obs . MRW)/ (10 . l . c) (equação 1),
onde [θ]obs é a elipticidade observada nos diferentes comprimentos de onda em miligraus,
MRW é o peso molecular da proteína dividido pelo número de aminoácidos, c a concentração
de proteína em mg/ml e l é o caminho ótico da cubeta em centímetros.
Ensaio de ligação peptídeo:DNA: A formação de complexo entre o peptídeo e DNA foi
medida através de anisotropia de fluorescência (Lundblad et al, 1996, Lakowics, 1999) que
está baseada na observação do movimento rotacional em solução de macromoléculas
marcadas com um fluoróforo, sendo, por essa razão, tipicamente uma medida das
propriedades hidrodinâmicas do fluoróforo.
As medidas de ligação por anisotropia de fluorescência foram realizadas em tampão
de ligação (Bis-Tris 5 mM, DTT 1 mM, pH 7.0), a 22
o
C. Alíquotas de uma solução
Material e Métodos
37
concentrada de α1E2 foram adicionadas seqüencialmente a uma solução contendo uma
concentração fixa de DNA marcado com fluresceína. A amostra foi então homogeneizada e
equilibrada por 2 min antes das medidas de anisotropia de fluorescência (Lima e Silva, 2004).
Em todos os casos a diluição máxima foi menor que 10% do volume total e foi considerada na
análise dos resultados obtidos. Medidas de anisotropia foram realizadas em
espectrofluorímetro ISS-PC1 (ISS, Champaign, IL, USA), montado em “L”. As amostras
foram excitadas a 485 nm e a emissão foi medida através de um filtro laranja com “cut-off” de
ondas curtas WG3-69. Valores de anisotropia foram calculados pelo próprio programa ISS,
conforme a equação:
A = (I
par
– I
per
) / (I
par
+ 2I
per
) (equação 2),
Sendo (I
par
– I
per
) as intensidades de emissão quando os polarizadores estão orientados
paralelamente ou perpendicularmente ao polarizador de excitação, respectivamente. Para cada
amostra, foram coletadas medidas de anisotropia até que os erros absolutos fossem menores
que 0,005. Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes (experimentos
independentes) e apresentaram o mesmo perfil.
Análise da interação [a1E2c:E2BS]: A formação do complexo entre peptídeo e DNA medido
por titulação isométrica foi analisada considerando-se um equilíbrio reversível simples de 2
estados entre o peptídeo e o DNA, usando o formalismo de Hill (Lima e Silva, 2004; Cantor e
Schimmel, 1980). Para essa análise, o formalismo é:
Fração ligada = ([L]
n
/ Kd
n
) / (1 + ([L]
n
/ Kd
n
)) (equação 3),
onde L é a concentração do peptídeo livre e Kd a constante de dissociação aparente para os
sítios de interação. Ajustando a equação (3) aos dados experimentais, podemos calcular o
coeficiente de Hill “n” e a constante de dissociação Kd. O número de Hill pode não refletir a
estequiometria de ligação, uma vez que pode incluir todos os componentes alostéricos devido
Material e Métodos
38
à transição conformacional de uma ou mais macromoléculas envolvidas no complexo. A
equação foi ajustada aos dados através de regressão não-linear dos menores quadrados usando
o programa Sigma-Plot 2002 (versão 8.0, Jandel Scientific Co.).
Ensaios de Dinâmica Molecular: Para investigar ao nível atômico os aspectos dinâmicos do
reconhecimento mútuo entre a α-hélice 1 (hélice de reconhecimento) de HPV-18 e seu sítio
específico no DNA foram feitas simulações de dinâmica molecular do peptídeo livre ou
ligado. Este trabalho foi realizado em colaboração com o professor Hugo Verli da Faculdade
de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Para os ensaios de dinâmica molecular foi usado como modelo a estrutura
cristalográfica do complexo de HPV-18 e DNA (código 1JJ4.pdb) publicada na base de dados
protein data bank. A seqüência correspondendo aos resíduos 294 a 311 (figura 16) foi
utilizada em duas simulações de 30 ns usando um protocolo de simulação previamente
descrito pelo grupo do professor Hugo Verli (Verli e Guimarães, 2005) usando a suíte de
programas GROMACS (Berendsen et al, 1995, Lindahl et al, 2001) e o campo de força para
todos os átomos OPLS AA/L. Na primeira simulação, foi utilizado somente o peptídeo
correspondente a α1E2 (resíduos 294-311) em solução, em um sistema com aproximadamente
7.000 átomos. A segunda simulação foi feita usando o mesmo peptídeo anterior, α1E2,
complexado ao seu sítio de reconhecimento ACCG no DNA em um sistema com
aproximadamente 22.000 átomos. Em ambas as simulações foi utilizado um modelo de águas
SPC, neutralizados através da adição de íons positivos (Na+) ou negativos (Cl-) em um passo
de integração de 2 fs.
Material e Métodos
39
Figura 16. Peptídeo usado nos ensaios de dinâmica molecular. Estrutura cristalográfica do
complexo [HPV-18:DNA] (1JJ4.pdb). Em magenta encontra-se destada a região da α hélice 1
de HPV-18 usada nos ensaios de dinâmica molecular.
Ensaios cristalográficos de complexos [peptídeo:DNA]: Ensaios cristalográficos foram
realizados durante meu estágio de doutoramento no Albert Einstein College of Medicine, em
Nova York, Estados Unidos, para tentar elucidar a estrutura tridimensional dos complexos
formados entre peptídeos derivados da α-hélice 1 de papilomavírus e seu DNA consenso. Para
os ensaios cristalográficos, inicialmente, foi feita uma solução de complexo contendo
peptídeo e DNA a uma concentração final de 476 μM (ou aproximadamente 3,12 mg/ml).
Posteriormente, após a análise dos resultados iniciais, a concentração de complexos utilizada
para os ensaios cristalográficos foi aumentada para 2,6 mM (ou ~12,7 mg/ml). Para a
formação dos complexos, quantidades equimolares de peptídeo e DNA eram misturadas e
incubadas por 15 minutos em banho de gelo imediatamente antes dos ensaios cristalográficos.
As medidas cristalográficas foram realizadas utilizando-se o método da gota sentada
(sitting drop). Nesse método, a gota contendo amostra e solução de cristalização é colocada
para equilibrar sobre uma “ponte” acima da solução de cristalização do poço (figura 17).
Quando a amostra entra em equilíbrio por difusão de vapor com a solução, isto é, quando a
Material e Métodos
40
concentração de reagentes da gota é aproximadamente a mesma da solução do poço, a
amostra alcança uma condição de supersaturação, favorável ao crescimento de cristais. As
varreduras iniciais foram feitas utilizando concentração de complexo de 476 μM (ou 3,12
mg/ml), em caixas de cristalização de 96 poços (INTELLI-PLATE, Art Robbins Instruments,
California, Estados Unidos) montada pelo robô Tecan Genesis Freedom 200 (Tecan Trading
AG, Suíça), com gotas de 2 μl (1 μl de amostra mais 1 μl de solução de cristalização) em
câmaras de temperatura controlada a 14
o
C (80 μl de solução de cristalização eram adicionadas
a cada poço pelo mesmo robô). Nesses primeiros testes de cristalização, foram utilizados os
kits Cristal Screen I e II, Index Screen (Hampton Research, ver anexo 1 no final da tese para
lista das soluções componentes) e Wizard Screen I e II (Emerald Biosystens, anexo 1). Esses
kits são efetivos e práticos para a determinação das condições de cristalização iniciais da
maioria das macromoléculas. Caixas de cristalização de 24 poços também foram montadas
manualmente nessa etapa para a utilização dos kits Natrix e Nucleic Acid Mini Screen, ambos
da Hampton Research conforme instruções do fabricante. Esses dois últimos foram utilizados
por serem mais apropriados à cristalização preliminar de fragmentos de ácidos nucléicos
livres e em complexos com proteínas. Os resultados obtidos com esses ensaios iniciais foram
considerados posteriormente na elaboração de ensaios de refinamento para o melhoramento
dos cristais obtidos.
Material e Métodos
41
Figura 17. Esquema representativo do método da gota sentada. O esquema representa um
poço de uma placa de 96 poços. A gota (representada em azul claro na figura) contendo a
amostra e solução de cristalização se localiza sobre uma “ponte” (retângulo cinza) acima da
solução do poço (azul escuro) contendo os reagentes de cristalização. Quando a concentração
de reagentes na gota se iguala à concentração de reagentes do poço através da difusão de
vapor, a amostra entra em supersaturação, condição favorável ao crescimento dos cristais.
(adaptado da Hampton Research
5
).
Foram realizados experimentos de microseeding (Bergfors, 2003) para o
melhoramento do tamanho e da qualidade de difração dos cristais obtidos na etapa inicial,
porém essa metodologia não apresentou resultado satisfatório. Nos experimentos de
microseeding, foi adicionado 1 μl de solução de cristalização à gota contendo micro-cristais.
Após o equilíbrio, 1 μl foi transferido da gota para um tubo de PCR. Esses micro-cristais
foram, então, moídos utilizando-se a ponteira de uma pipeta e essa solução foi utilizada para
semear novas gotas preparadas nas mesmas condições iniciais, utilizando uma ferramenta de
streak seeding (Hampton Research), que consiste basicamente em um pêlo seguro por uma
haste para melhor manipulação. Alternativamente, a ferramenta de seeding foi encostada em
uma gota contendo micro-cristais (para coletar as sementes de nucleação) e passada
imediatamente sobre nova gota montada nas mesmas condições de cristalização iniciais,
porém com a concentração de proteína reduzida.
5
http://www.hamptonresearch.com/support/pdf101/4.pdf
Material e Métodos
42
Os dados de difração por raios-x dos cristais utilizados nessa tese foram obtidos na
linha de luz X29A do National Synchrotron Light Source do Brookhaven National
Laboratory, utilizando comprimento de onda 1,77 Å e um detector ADSC Quantum 315.
Foram coletadas 180 imagens de rotação (ômega = 1
o
) a temperatura de 100 K com 3
segundos de exposição, a uma distância amostra-detector de 140 mm. O conjunto de imagens
foi processado (indexado, integrado e escalonado) com o auxílio do programa HKL2000
(Otwinowski e Minor, 1997).
O conteúdo do solvente, o número estimado de subunidades da unidade assimétrica e
o coeficiente de Mattews foram calculados pela opção cell content analysis do programa
Phaser (McCoy et al, 2005), programa pertencente a suíte de programas CCP4i (Potterton et
al, 2003). Foram feitas tentativas de resolução da estrutura através de substituição molecular
com os programas phaser (McCoy et al, 2005), AMoRe (Navaza, 2001), e MolRep (Vagin e
Teplyakov, 1997), todos da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003), utilizando como
modelos as estruturas cristalográficas do DNA sozinho (423D.pdb e 1ILC.pdb); a estrutura
cristalográfica do DNA obtida do complexo [HPV-18:DNA] (1jj4.pdb); a estrutura
cristalográfica do DNA retirado do complexo [BPV-1:DNA] (2bop.pdb) e a estrutura de DNA
B ideal gerada pelo programa Coot (Emsley e Cowtan, 2004) com a seqüência usada nos
ensaios de cristalografia. A tabela 3 mostra as seqüências de bases das fitas de DNA usadas
como modelo.
Material e Métodos
43
Modelo Res. # pb Seqüência Referência
DNA B Ideal (gerado pelo
programa Coot)
n/a 16 5’-ACACCGACGTCGGTGT-3’ Emsley e
Cowtan, 2004
1JJ4.pdb (Complexo
E2c:DNA de HPV-18)
2.4 Å 16 5’-CAACCGAATTCGGTTG-3’ Kim et al, 2000
2BOP.pdb (Complexo
E2c:DNA de BPV-1)
1.7 Å 17 5’-CCGACCGACGTCGGTCG-3’ Hedge et al, 2002
423D.pdb (Cristal de DNA) 1.6 Å 12 5’-ACCGACGTCGGT-3’ Rozenberg, et al,
1998
1ILC.pdb (Cristal de DNA) 2.2 Å 12 5’-ACCGAATTCGGT-3’ Hizver et al, 2001
Tabela 3. Seqüências de DNA usadas em substituição molecular.
Na reconstrução visual foi utilizado o programa Coot versão 0.3.1 (Emsley e Cowtan,
2004) levando-se em consideração a concordância com o mapa de densidade eletrônica
2|F
obs
|-|F
calc
|, com α
calc
contornado a 1σ e o mapa de diferença |F
obs
|-|F
calc
|, α
calc
contornado a
3σ. Os valores de R
fac
, R
free
e de figura de mérito foram utilizados como parâmetros de
sucesso assim como a concordância das coordenadas com o mapa de densidade eletrônica.
Moléculas de água foram adicionadas através de ciclos do programa ARP/wARP (Zwart, et
al, 2004) alternados com Refmac5 (Winn et al, 2001) baseado nos picos do mapa de diferença
|F
obs
|-|F
calc
|, α
calc
entre 3-5σ e validadas através de inspeção visual com o programa Coot
(Emsley e Cowtan, 2004). Alternativamente foi testada a adição de moléculas de água com a
opção de “achar moléculas de água” do programa Coot (Emsley e Cowtan, 2004).
Resolução da estrutura de proteínas tirosino fosfatase. O laboratório do professor Steve
Almo, no Albert Einstein College of Medicine, localizado no Bronx, Nova York, onde fui
realizar meu estágio de doutoramento (doutorado sanduíche, bolsa CAPES PDEE) é um dos
membros do Consórcio de Genômica Estrutural de Nova York (New York Structural
Genomics Consortium). Este consórcio, do qual fazem parte ainda o Departamento de
Biologia do Laboratório Nacional Brookhaven (Brookhaven National Laboratory, BNL), a
Escola de Medicina Monte Sinai (Mount Sinai School of Medicine), a Universidade
Material e Métodos
44
Rockefeller (Rockefeller University) e a Escola de Medicina Weill da Universidade Cornell
(Weill Medical College of Cornell University) de Nova York e as Universidades da Califórnia
em São Francisco e Universidade da Califórnia em São Diego, tem por objetivo o estudo
funcional e estrutural de proteínas em larga escala. Este projeto, financiado pelo National
Instute of Heath (NIH) dos Estados Unidos, propõe a resolução da estrutura cristalográfica do
maior número possível de proteínas, que são depositadas na base de dados protein data bank.
Além disso, esse projeto prevê a caracterização de parâmetros biofísicos medidos e calculados
para a criação de uma base de dados pública e tentar correlacionar esses dados com os dados
estruturais obtidos (Bonnano et al, 2005).
Os alvos biológicos que atendem a certos critérios são escolhidos através da análise
genômica depositada em bases de dados. Uma empresa pertencente ao grupo (Structural
GenomiX, Inc.) é responsável pela clonagem, expressão e purificação de todas as proteínas.
Esse processo é todo automatizado e proteínas solúveis, purificadas e em alta concentração
(mais que 10 mg/ml) são enviadas posteriormente para os laboratórios pertencentes ao
consórcio, que são responsáveis por fazer os ensaios de cristalização. Os dados de difração de
raios-x dos cristais obtidos são coletados no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron
(National Synchrotron Light Source, NSLS, BNL) ou ainda na Fonte de Fótons Avançada do
Laboratório Nacional Argonne (Advanced Photon Source, APS, Argonne National
Laboratory). Muitas vezes apenas o conjunto de dados de difração são enviados aos
laboratórios para a determinação da estrutura cristalográfica (Bonnano et al, 2005).
Dessa maneira estive envolvida na resolução da estrutura de duas proteínas tirosino
fosfatases humana, a proteína tirosino fosfatase sigma (PTPσ) e a Proteína tirosino fosfatase
IA2 (PTP-IA2). A PTPσ teve a sua estrutura nativa inédita resolvida anteriormente por outro
membro do laboratório através de substituição molecular e foi depositada na base de dados
protein data bank sob o código de acesso 2FH7.pdb. Porém, para um melhor entendimento do
Material e Métodos
45
processo de catálise, foram feitos ensaios cristalográficos de PTPσ na presença de tungstato.
Tungstato é um inibidor competitivo da enzima (K
D
= 61 µM em pH 7,0, Zhang et al, 1994) e
como os fosfatos do substrato (fosfotirosina) e produto (ortofosfato) apresenta uma estrutura
tetraédrica. Desta maneira, a presença de tungstato na estrutura cristalográfica da PTPσ
poderia nos fornecer importantes informações a respeito do mecanismo de reação dessa
enzima.
Cristais de PTPσ foram crescidos em 0,2 M de formato de magnésio (condição D8 da
matriz Index Screen, Hampton Research, anexo 1) e mergulhados em solução contendo
diferentes concentrações de tungstato por diferentes períodos de tempo (técnica denominada
de soaking). Após esse processo de soaking, os cristais eram transferidos para uma solução
crio-protetora contendo a concentração de tungstato utilizada, 0,2 M de formato de magnésio
e 30% de glicerol. Os cristais eram, então, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e
armazenados até o momento de serem difratados. Após a coleta dos dados de difração, os
mesmos foram indexados, integrados e escalonados usando o programa HKL2000
(Otwinowski e Minor, 1997). A estrutura foi determinada usando ciclos de refinamento de
corpo rígido e restrito com o programa Refmac5 (Winn et al, 2001) da suíte de programas
Ccp4i (Winn et al, 2001). O mapa de densidade eletrônica e as coordenadas geradas eram
abertos com o auxilio do programa Coot (Emsley e Cowtan, 2004) e a presença de forte
densidade positiva no mapa |F
obs
|-|F
calc
| (com sigma contornado em torno de 3σ) na região do
sítio ativo era procurada. A presença de tungstato foi encontrada nas concentrações de 25 mM
e 50 mM incubados por 3 horas.
No caso da estrutura da PTP-IA2, os cristais foram crescidos e o conjunto de dados de
difração de raios-x foi coletado por outros laboratórios pertencentes ao consórcio de genômica
estrutural de Nova York. Esse conjunto de dados foi enviado ao laboratório do professor
Steve Almo para a resolução da estrutura cristalográfica. A resolução da sua estrutura foi feita
Material e Métodos
46
por substituição molecular usando como modelo a estrutura da PTPσ nativa (2FH7.pdb) que
apresenta alta homologia com a estrutura da PTP-IA2 (figura 18). A substituição molecular
foi feita com o programa Phaser (McCoy et al, 2005) e o refinamento foi feito utilizando o
programa Refmac5 (Winn et al, 2001), ambos do conjunto de programas CCP4i (Potterton et
al, 2003). O melhoramento da estrutura foi feito com o programa Coot (Emsley e Cowtan,
2004). A estrutura resolvida foi depositada na base de dados protein data bank sob o código
de acesso (2I1Y.pdb).
Figuras. Todas as figuras de estrutura desta Tese foram feitas usando o programa PyMol
(DeLano Scientific LLC, Califórnia, Estados Unidos). Os gráficos foram feitos utilizando o
programa SigmaPlot 2002 (versão 8.0 e 10, Systat Software Inc, Califórnia, Estados Unidos).
Superposição das estruturas. Estruturas foram superpostas para a visualização do desvio
médio quadrático entre elas com o auxílio do programa Superpose da suíte de programas
CCP4i (Potterton et al, 2003). O gráfico resultante dessa superposição foi feito utilizando o
programa SigmaPlot 10 (Systat Software Inc, Califórnia, Estados Unidos). A figura das
coordenadas geradas pela superposição foi feita pelo programa PyMol (DeLano Scientific
LLC, Califórnia, Estados Unidos).
Análise das estruturas cristalográficas. As estruturas cristalográficas resultantes dessa tese
foram analisadas através do programa Procheck (Laskowski et al, 1993) e Sfcheck (Vaguine
et al, 1999) da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003)
Análise de parâmetros geométricos de DNA. A análise dos parâmetros geométricos (Tilt, Roll,
Twist, Shift, Slide, Rise), assim como a análise da profundidade e tamanho dos sulcos maior e
Material e Métodos
47
menor das fitas de DNA foram calculados com o auxílio do programa disponível na Internet
Curves
6
.
Análise das interações proteína-ligante: A análise das interações da proteína tirosino fosfatase
com o tungstato foi feita através do programa LigPlot, disponível no sítio da Internet pdbsum
(www.pdbsum.com).
6
http://www.ibpc.fr/UPR9080/Curindex.html
Material e Métodos
48
2FH7_ MSLESMLSHPPIPIADMAEHTERLKANDSLKLSQEYESIDP--GQQFTWE 48
2I1Y_ -SLEPAQANMDISTGHMILAYMEDHLRNRDRLAKEWQALCAYQAEPNTCA 49
***. :: *. ..* . : .: :*::*:::: . .: *
2FH7_ HSNLEVNKPKNRYANVIAYDHSRVILQPIEGIMGSDYINAN-YVDGYRRQ 97
2I1Y_ TAQGEGNIKKNRHPDFLPYDHARIKLKVESSPSRSDYINASPIIEHDPRM 99
:: * * ***:.:.:.***:*: *: .. ******. :: *
2FH7_ NAYIATQGPLPETFGDFWRMVWEQRSATIVMMTRLEEKSRIKCDQYWPNR 147
2I1Y_ PAYIATQGPLSHTIADFWQMVWESGCTVIVMLTPLVEDGVKQCDRYWPDE 149
*********..*:.***:****. .:.***:* * *.. :**:***:.
2FH7_ GTETYGFIQVTLL-DTIELATFCVRTFSLHKNGSSEKREVRQFQFTAWPD 196
2I1Y_ GASLYHVYEVNLVSEHIWCEDFLVRSFYLKNVQTQETRTLTQFHFLSWPA 199
*:. * . :*.*: : * * **:* *:: :.*.* : **:* :**
2FH7_ HGVPEYPTPFLAFLRRVKTCNPPDAGPIVVHCSAGVGRTGCFIVIDAMLE 246
2I1Y_ EGTPASTRPLLDFRRKVNKCYRGRSCPIIVHCSDGAGRTGTYILIDMVLN 249
.*.* . *:* * *:*:.* : **:**** *.**** :*:** :*:
2FH7_ RIKP-EKTVDVYGHVTLMRSQRNYMVQTEDQYSFIHEALLEAVGCGNTEV 295
2I1Y_ RMAKGVKEIDIAATLEHVRDQRPGLVRSKDQFEFALTAVAEEVNAILKAL 299
*: * :*: . : :*.** :*:::**:.* *: * *.. . :
2FH7_ PARSLYAYIQKLAQVEPGEHVTGMELEFKRLANSKAHTSRFISANLPCNK 345
2I1Y_ PQ------------------------------------------------ 301
*
2FH7_ FKNRLVNIMPYESTRVCLQPIRGVEGSDYINASFIDGYRQQKAYIATQGP 395
2I1Y_ --------------------------------------------------
2FH7_ LAETTEDFWRMLWENNSTIVVMLTKLREMGREKCHQYWPAERSARYQYFV 445
2I1Y_ --------------------------------------------------
2FH7_ VDPMAEYNMPQYILREFKVTDARDGQSRTVRQFQFTDWPEQGVPKSGEGF 495
2I1Y_ --------------------------------------------------
2FH7_ IDFIGQVHKTKEQFGQDGPISVHCSAGVGRTGVFITLSIVLERMRYEGVV 545
2I1Y_ --------------------------------------------------
2FH7_ DIFQTVKMLRTQRPAMVQTEDEYQFCYQAALEYLGSFDHYATEGHHHHHH 595
2I1Y_ --------------------------------------------------
Figura 18. Alinhamento de seqüências das proteínas PTPσ e PTP-IA2. As seqüências das
proteínas PTPσ (2FH7.pdb) e PTP-IA2 (2I1Y.pdb) foram alinhadas com o auxilio do
programa ClustalW 1.83
7
. As seqüências foram extraídas da base de dados protein data bank
(pdb) sob os códigos de acesso indicados na figura. Em vermelhos estão indicados os
aminoácidos hidrofóbicos; em azul estão indicados os aminoácidos ácidos; em verde estão
indicados os aminoácidos carregados. (*) na última linha indica aminoácidos idênticos em
todas as seqüências; (:) indica substituições conservadas de acordo com a tabela de cores
supracitada; e (;) indica que substituições semiconservadas podem ser observadas de acordo
com a mesma tabela de cores. Destacado em amarelo encontra-se a região associada ao sítio
ativo da enzima (Tonks, 2006).
7
www.ebi.ac.uk/tools/clustalw
Resultados
Resultados
50
Para aumentar os conhecimentos relacionados ao reconhecimento nucléico, foi
investigado neste trabalho foi investigada a capacidade de ligação de um peptídeo sintético
derivado de uma proteína ligadora de DNA. Foi desenhado um peptídeo cuja seqüência
corresponde à α-hélice 1 de reconhecimento da proteína E2 de HPV- 16 (α1E2) e a sua
ligação a diferentes seqüências de DNA foi medida através de anisotropia de fluorescência.
Com isso, podemos verificar que o peptídeo é capaz de reconhecer especificamente o DNA
consenso de HPV-16, ligando-se ao seu sítio ACCG. Outro peptídeo não relacionado testado
(cuja seqüência não tem sido relacionada à ligação com ácidos nucléicos na literatura) não
mostrou a mesma capacidade de ligação para todas as seqüências de DNA utilizadas.
Análise do conteúdo de estrutura secundária do peptídeo mostrou que este se apresenta
desenovelado em solução, porém a contribuição do peptídeo no espectro de dicroísmo circular
do complexo [peptídeo:DNA] sugere que após a ligação este peptídeo torna-se estruturado.
Entretanto, apesar do peptídeo ser derivado de uma região da proteína com estrutura
secundária em α hélice, o espectro observado sugere uma estrutura em forma de folha β. Estes
dados de estrutura secundária são indiretos e serão melhor investigados futuramente.
Esse trabalho é a primeira evidência na literatura da discriminação e ligação ao DNA
por um peptídeo derivado da hélice de reconhecimento ao DNA de uma proteína. Mostramos
pela primeira vez que apenas uma seqüência mínima de aminoácidos é suficiente para que
haja o reconhecimento e ligação ao DNA sem a necessidade da estrutura protéica completa.
Esse mecanismo poderia ser compartilhado por outras proteínas com a mesma função de
ligação ao DNA, o que merece ser mais bem investigado. Os resultados desse trabalho foram
publicados na revista FEBS letters em janeiro de 2006 (Faber-Barata et al, 2006a) e
encontram-se reproduzidos a seguir.
Resultados
51
Resultados
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Resultados
53
Resultados
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Resultados
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Resultados
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Resultados
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Recentemente foi reportada a ligação de peptídeos derivados do domínio de ligação ao
DNA do fator transcricional de leveduras GCN4 a seqüências consenso de DNA (Wang et al,
2003). Neste modelo, a exemplo do que é descrita para a proteína E2 de papilomavírus, a
proteína inteira reconhece e se liga ao DNA como um dímero. Estudos anteriores com
peptídeos mostraram que dímeros de peptídeos contendo a região básica N-terminal (domínio
de ligação ao DNA) da proteína inteira eram capazes de fazer o reconhecimento e definiu-se
15 aminoácidos cruciais para que essa ligação acontecesse (Talanian et al, 1992). Porém,
como foi visto por dicroísmo circular e calorimetria, apenas o monômero do peptídeo é capaz
de reconhecer seu DNA consenso de maneira específica, sugerindo a possibilidade de uma via
de ligação monomérica da GCN4 (Wang et al, 2003). Os resultados encontrados apresentados
no trabalho publicado na revista FEBS letters também mostram o reconhecimento e ligação a
sítios específicos no DNA consenso por uma seqüência mínima peptídica, sugerindo a
possibilidade de uma via de ligação monomérica nesse sistema. Esses resultados reforçam a
hipótese de uma possível via de ligação do monômero da proteína E2 sugerido em trabalhos
anteriores do nosso grupo (Lima et al, 2000; Lima e Silva, 2004).
Resultados de Dinâmica Molecular
Os resultados apresentados com as análises de dicroísmo circular sugerem que o
peptídeo correspondente à α-hélice 1 da porção C-terminal da proteína E2 de papilomavírus
(α1E2), encontra-se intrinsecamente desenovelado quando livre em solução, mantendo a sua
capacidade de discriminação e ligação a moléculas de DNA contendo a sua seqüência
consenso. Para investigar os aspectos dinâmicos do reconhecimento mútuo entre o peptídeo
α1E2 e seu DNA consenso, foram realizadas simulações de dinâmica molecular do peptídeo
livre em solução e do peptídeo ligado no seu sítio de ligação na molécula de DNA. Esses
Resultados
58
ensaios foram realizados em colaboração com o professor Hugo Verli da Faculdade de
Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Para as simulações de dinâmica molecular foi utilizada como modelo a estrutura
cristalográfica do complexo da proteína E2 de HPV-18 com seu DNA consenso (retirados da
base de dados protein data bank sob o código de acesso 1JJ4.pdb). Esta estrutura foi escolhida
não só por possuir alta homologia de seqüência com o modelo usado anteriormente (HPV-16,
figura 10, Introdução), mas principalmente por ser uma estrutura de complexo com o DNA, o
que nos permite investigar os pontos de contato entre as duas moléculas. Neste modelo, a
volta correspondente aos resíduos 324-328 (Gly-Ala-Gly-Asn-Glu) encontrava-se ausente e
teve que ser reconstruída com o auxílio do programa Swiss-Pdb Viewer program 3 (Guex e
Peitsch, 1997). Baseadas nessa estrutura reconstruída foram realizadas duas simulações de 30
ns, conforme descrito em Material e Métodos.
Para monitorar o progresso das simulações realizadas e checar a estabilidade dos
elementos de estrutura secundária, foi avaliado o desvio médio quadrático (RMSD) da
simulação do peptídeo, usando como referência a estrutura cristalográfica reconstruída. Como
pode ser observado na figura 19 (painel A), na medida do complexo (linha vermelha, figura
19, painel A) há uma grande variação até 5 ns em relação à estrutura cristalográfica, seguida
de estabilização em torno de 0,6 nm. A medida do peptídeo sozinho (linha preta, figura 19,
painel A), ao contrário, apresenta uma maior estabilização inicial em relação à estrutura
cristalográfica, seguida de um aumento em torno de 10 ns de simulação. Foi medida também
somente a região N-terminal do peptídeo complexada ao DNA (resíduos 296-303, linha verde,
figura 19, painel A) que se apresentou bastante estável, sem alterações significativas e com
variação máxima de 0,2 nm (valor máximo observado em torno de 0,3 nm) ao longo de toda a
simulação. A grande estabilidade observada nessa região indica que o caráter helicoidal é
mantido entre os resíduos 296-303 quando o peptídeo encontra-se complexado com o DNA.
Resultados
59
Uma avaliação das simulações até 5 ns (período de tempo que apresentou maior
variação em relação à estrutura cristalográfica) das medida do DNA sozinho (linha preta,
figura 19, painel B) e do complexo [peptídeo:DNA] (linha vermelha, figura 19, painel B),
mostrou que o DNA livre sofre uma variação significativa, maior do que a variação sofrida
pelo complexo. Os valores de RMSD observados indicam que há uma grande flutuação na
geometria do DNA e do peptídeo, porém a formação do complexo parece oferecer uma
estabilização conformacional do DNA.
Figura 19. Dinâmica molecular do peptídeo livre e em complexo com DNA. Painel A,
desvio médio quadrado (RMSD) do peptídeo α1E2 livre (linha preta), complexo [α1E2:DNA]
(linha vermelha) e resíduos 296-303 em complexo com DNA (linha verde). Painel B, RMSD
do DNA livre (linha preta) e do complexo [α1E2:DNA] (linha vermelha). Painel C, distância
entre os resíduos C- e N-terminal do DNA livre (linha preta), do DNA em complexo (linha
vermelha) e dos resíduos 296-303 (linha verde). Painel D, energia de interação entre peptídeo
e DNA (linha preta), entre as duas fitas do DNA (linha vermelha) e entre o complexo
[α1E2:DNA] e o solvente (linha verde).
Resultados
60
Analisando as distâncias entre a porção N-terminal e C-terminal (figura 19, painel C)
podemos verificar que o DNA sozinho sofre grande variação (linha preta), assim como o
DNA do complexo (linha vermelha), apesar da variação dessa última ser em menor extensão.
Este resultado sugere que o DNA possui uma maior mobilidade em solução, que é reduzida
quando este se encontra complexado ao peptídeo. A região dos resíduos 296-303 (linha verde)
praticamente não sofre alteração ao longo da simulação. Este resultado é um indicativo de que
essa região do peptídeo apresenta uma maior estabilidade, provavelmente devido a sua
interação com o DNA, conforme sugerido anteriormente. Essas modificações
conformacionais, entretanto, parecem ocorrer sem grande modificação nas propriedades
físico-quimicas dos componentes envolvidos (figura 19, painel D), uma vez que a energia de
interação do complexo (linha preta), da dupla-fita de DNA (linha vermelha) e do complexo
com o solvente (linha verde) não mostram variações significativas da trajetória. A figura 20
mostra as modificações conformacionais sofridas pelo peptídeo livre e em complexo com
DNA após 30 ns de simulação.
Ensaios de dinâmica molecular para a proteína E2c de HPV-16 e BPV-1 mostraram
propriedades dinâmicas diferentes nessas duas proteínas que podem provavelmente ser
correlacionada com diferentes modos de interação das mesmas com DNA. Em HPV-16, a
volta maior que conecta as folhas β1 e β2 é altamente flexível, e acaba refletindo em uma
maior flexibilidade da hélice de reconhecimento α1, que, em sua parte central, perde
parcialmente seu conteúdo de estrutura secundária (Falconi et al, 2007) de maneira
semelhante ao observado para a α-hélice 1 de HPV-31 (Liang et al, 1996). Para BPV-1, no
entanto, a α-hélice 1 permanece estruturada apesar da alta flexibilidade conformacional
apresentada pelo barril (em contraste com a rigidez do barril em HPV-16). Dessa maneira, a
alta flexibilidade do peptídeo verificada nas nossas medidas de dinâmica molecular parece
Resultados
61
condizer com dados da literatura obtidos com as proteínas de papilomavírus humano, onde
alguns resíduos, principalmente na porção central da hélice, perdem seu caráter helicoidal e
adotam uma conformação alternativa de volta ou hélice 3-10, sugerindo uma adaptabilidade
conformacional para melhor se ajustar ao sulco maior do DNA (Falconi et al, 2007). É
interessante notar que o peptídeo utilizado nesse trabalho é derivado de HPV-18, que possui
orientação das suas subunidades similar a BPV-1, sendo esses dois tipos virais classificado no
mesmo grupo (Hedge, 2002). Entretanto, o comportamento dinâmico apresentado aqui tem
características similares ao reportado para HPV-16 e HPV-31 (Falconi et al, 2007; Liang et al,
1996). Trabalhos anteriores de dinâmica molecular do DNA têm sido alvo de investigação na
literatura (Djuranovic et al, 2004; Djuranovic e Hartmann, 2005) e sugerem que as suas
formas livres e em complexo com proteína E2c são bastante similares.
Resultados
62
N-terminal
C-terminal
N-terminal
C-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
C-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
30ns MD
AB
N-terminal
C-terminal
N-terminal
C-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
C-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
C-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
C-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
30ns MD
N-terminal
C-terminal
N-terminal
30ns MD
AB
Figura 20. Modificações conformacionais após simulação de dinâmica molecular. Painel
A, modificação conformacional do peptídeo α1E2 após 30 ns de simulação de dinâmica
molecular. Painel B, modificação conformacional do complexo [α1E2:DNA] após 30 ns de
simulação de dinâmica molecular. Pode-se observar um desenovelamento progressivo do
peptídeo livre (A) que é parcialmente prevenido quando este interage com a molécula de
DNA (B).
Estudos cristalográficos do complexo peptídeo a1E2:DNA
Para buscar um melhor entendimento ao nível atômico da interação entre o peptídeo
sintético α1E2 e seu DNA consenso, foram realizados ensaios cristalográficos com esses dois
componentes. A resolução da estrutura do complexo pode ajudar a revelar as bases estruturais
de reconhecimento nucléico pelo peptídeo ao ser comparado com os dados estruturais de
complexos feitos com a proteína E2c inteira e DNA publicados na literatura (Hedge et al,
1998; Kim et al, 2000).
Resultados
63
A partir dos resultados obtidos com as matrizes iniciais descritos em Material e
Métodos, foram realizados diversos ensaios de refinamento tentando aumentar o tamanho dos
cristais. Os cristais obtidos nesses ensaios possuíam a forma de pequenas placas hexagonais.
A figura 21 mostra um cristal obtido nesses ensaios.
Figura 21. Fotos representativas dos cristais obtidos nos ensaios cristalográficos de
complexos [peptídeo:DNA]. Cristais do complexo [18α1E2:E2BSN4ACGT] foram obtidos
pelo método da gota sentada na condição de cristalização H3 do kit Crystal Screen (BisTris
0,1 M, pH 6,5, MgCl
2
0,2 M, 1,6-hexanediol 3,5M), utilizando 496 μM de complexo.
Em um segundo momento, novos ensaios de refinamento foram feitos utilizando
amostra de complexo mais concentrada: 2,6 mM de complexo [DNA:peptídeos] (1:1) (ou
12,7 mg/ml). Nesses ensaios foram usados matrizes variando-se a concentração de MPD (de
20 a 50% v/v), pH (5,5 – 8,5) e MgCl
2
(0,1 ou 0,2M MgCl
2
) em placas de sitting drop de 24
poços. De uma maneira geral, os melhores cristais eram obtidos na faixa de concentração de
MPD intermediária (25-35% v/v). Essa segunda abordagem produziu um número menor de
cristais de maior tamanho, apesar de não ter havido grande melhora na resolução da difração
por raios-x (aproximadamente 2.8-3.0 Å para todos os cristais obtidos). A figura 22 apresenta
a foto de alguns desses cristais obtidos com essa abordagem. A tabela 4 mostra um resumo
dos resultados dos ensaios cristalográficos obtidos de complexos [peptídeo:DNA].
Resultados
64
Figura 22: Fotos dos cristais obtidos nos ensaios cristalográficos de complexos
[peptídeo:DNA]. Cristais foram obtidos em varreduras de MPD pelo método da gota sentada
em placas de 24 poços com 2,6 mM de amostra. A, complexo [16α1E2:E2BSN4AATT]
(BisTris 0,1M, pH 6,5, MgCl
2
0,2M, MPD 30%). B, complexo [16 α1E2:E2BSN4ACGT]
(HEPES 0,1M, pH 7,5, MgCl
2
0,2M, MPD 22%). C, complexo [18 α1E2:E2BSN4AATT]
(Tris 0,1M, pH 8,5, MgCl
2
0,2M, MPD 30%). D, complexo [18 α1E2:E2BSN4ACGT]
(BisTris 0,1M, pH 5,5, MgCl
2
0,2M, MPD 26%). E, complexo [BPV1 α1E2:E2BSN4AATT]
(Tris 0,1M, pH 8,5, MgCl
2
0,2M, MPD 30%). F, complexo [BPV1 α1E2:E2BSN4ACGT]
(HEPES 0,1M, pH 7,5, MgCl
2
0,2M, MPD 22%).
Resultados
65
Complexo Presença de
cristais
Resolução Grupo
espacial
[16α1E2:E2BSN4AATT]
√
n/t
n/d
[16α1E2:E2BSN4ACGT]
√
3.2 Å
P3
1
[18α1E2:E2BSN4AATT]
√
3.1 Å
P3
1
[18α1E2:E2BSN4ACGT]
√
2.8 Å
P3
1
[BPV1α1E2:E2BSN4AATT]
√
n/t
n/d
[BPV1α1E2:E2BSN4ACGT]
√
2.8 Å
P3
1
Tabela 4. Resumo dos dados obtidos com os ensaios de cristalografia dos complexos
[peptídeo:DNA].
n/t, não testado.
n/d, dado não disponível
Dos cristais obtidos com os ensaios cristalográficos, apenas os cristais obtidos com os
complexos [16α1E2:E2BSN4ACGT, [18α1E2:E2BSN4AATT] e
[BPV1α1E2:E2BSN4ACGT] foram testados e mostraram difratar em torno de 3 Å (tabela 4).
Conjuntos de imagens desses cristais foram coletados e estão aguardando refinamento. Os
cristais obtidos com o complexo [16α1E2:E2BSN4AATT] não chegaram a ser testados e o
complexo de [BPV1α1E2:E2BSN4AATT] foi testado mas apresentava uma resolução baixa
(em torno de 7Å) e por isso não foi coletado conjunto de dados de difração com esses cristais.
O cristal obtido com o complexo [18α1E2:E2BSN4ACGT] difratou com 2.8 Å de resolução,
foi coletado um conjunto de dados de difração que foi processado para resolução da estrutura
como descrito a seguir. Os dados cristalográficos e estatísticas de refinamento desse conjunto
de dados foram obtidos com o uso do programa Sfcheck (Vaguine et al, 1999) da suíte de
programas CCP4i (Potterton et al, 2003) e estão apresentados na tabela 5.
Resultados
66
Dados e parâmetros E2BSN4ACGT
Grupo espacial P3
1
Parâmetros de célula a = b = 51,41
c = 95,61
Resolução (Å) 31.9 − 2.80
Número de subunidades na U.A. 2
Vm (coef de Mattews) 2,32
Completeza (%) 99.8 %
I/σ (I) 37.6 (2.6)
Número de reflexões únicas 6942
Multiplicidade 5.1
Refinamento
R
factor
0.236
R
free
0.31
Rmsd distância de ligação 0,023
Rmsd ângulo de ligação 0,343
Tabela 5. Dados de cristalografia e estatística de refinamento do conjunto de dados de
difração de E2BSN4ACGT. Dados obtidos com o auxílio do programa sfcheck (Vaguine et
al, 1999) da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003).
O faseamento foi feito pelo programa AMoRe usando o modelo 423D.pdb contendo
12 pb. A solução encontrada foi refinada usando o programa Refmac5 (Winn et al, 2001) da
suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003). Ao se abrir o mapa de densidade eletrônica
resultante, foi observada uma densidade forte positiva no mapa de diferença eletrônica cujo
formato lembrava bases de DNA, o que sugere que os dados de difração de fato
corresponderiam a um DNA de 16 pb usados nos ensaios cristalográficos. Essa solução
encontrada continha 12 pb e foi editada usando um editor de texto (gedit para Linux) de modo
a manter somente uma cadeia de DNA de fita simples. A essa cadeia simples de DNA foram
adicionados quatro novas bases com o auxílio de um editor de texto (gedit) e do programa
pdbset da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003). O DNA fita simples gerado,
contendo agora a torção / dobramento gerado pelo programa de substituição molecular e 16
pb foi então mutado no programa Coot (Emsley e Cowtan, 2004) para conter a seqüência
correta do DNA usado nos ensaios de cristalização. Essa fita de DNA fita simples de 16 pb
Resultados
67
modificada foi utilizada como modelo em novo ciclo de substituição molecular pelo programa
Phaser (McCoy et al, 2005). Duas das soluções encontradas pelo programa continham DNA
dupla fita que eram superponíveis e foi utilizado em novo ciclo de substituição molecular pelo
mesmo programa, onde nova dupla fita de DNA foi encontrada.
Após essa resolução estrutural, a estrutura foi refinada utilizando ciclos de
refinamento restritos com o programa Refmac5 (Winn et al, 2001). A qualidade do mapa foi
melhorada após um ciclo de simulated annealing com o auxílio do programa Phenix (Adams
et al, 2002). Em seguida, foram realizados novos ciclos de refinamento restrito com Refmac5
(Winn et al, 2001), seguido de inspeção visual e melhoramento da estrutura com o programa
Coot (Emsley e Cowtan, 2004).
O refinamento dos dados revelou a presença de duas duplas hélices de DNA na
unidade assimétrica (denominadas nessa tese de cadeia DA e cadeia CB) que pertencem ao
grupo espacial P3
1
(Figura 23, painel A). Essas duas moléculas estão relacionadas entre si em
ângulo de quase 90
o
, (figura 23, painéis B e C). Análise comparativa dessas fitas de DNA foi
feita com o auxílio do programa Superpose da suíte de programas CCP4i (Potterton et al,
2003) e encontra-se representada na figura 24. O gráfico de desvio quadrático médio (RMSD)
resultante dessa análise é apresentado na figura 25. Notamos em ambas as representações, de
imagem e cálculo de RMSD, que a superposição obtida entre as cadeias A/C e D/B resulta em
menores diferenças (figura 24 e figura 25). A figura 26 mostra um detalhe da estrutura
resolvida mostrando o detalhe do contorno do mapa de densidade eletrônica obtida com os
resultados cristalográficos.
Resultados
68
A
B
C
A
B
C
Figura 23. Estrutura cristalográfica do DNA E2BSN4ACGT. Painel A, duas duplas fitas
de DNA encontradas na unidade assimétrica isoladas mostrando a torção sofrida pelo DNA
(cadeias DA e CB, respectivamente). Painel B, as duas moléculas de DNA conforme se
encontram na unidade assimétrica, em ângulo uma com a outra. Painel C, mesmo que B vista
do topo.
Resultados
69
DA
C
BDA
C
B
DA
C
BDA
C
B
DA
C
BDA
C
B
DA
C
BDA
C
B
Figura 24. Análise comparativa da superposição entre os monômeros de DNA dupla fita
encontrados na unidade assimétrica. Painel superior, cadeias DA (azul) e cadeias CB
(magenta), superposição entre as cadeias D-C e A e B. Painel inferior, cadeias DA (verde) e
cadeias CB (vermelho); superposição entre as cadeias D-B e A-C. Esquerda, superposição das
estruturas; direita, esquema da sobreposição. Superposição feita pelo programa Superpose da
suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003).
Resultados
70
Cadeia Principal
n
o
da base nitrogenada
12345678910111213141516
RMSD (Å)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
C vs D
A vs B
A vs C
B vs D
A
Cadeia lateral
n
o
da base nitrogenada
12345678910111213141516
RMSD (Å)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
C vs D
A vs B
A vs C
B vs D
B
Figura 25. Análise comparativa dos dois monômeros de DNA fita dupla da Unidade
Assimétrica. O gráfico representa o desvio médio quadrático das bases de DNA. A cadeia
principal representa a posição relativa das bases nitrogenadas enquanto a cadeia lateral
representa os fosfatos. Superposição das cadeias C-D; A-B, A-C e B-D conforme indicado na
legenda. Seqüência cadeias A, B, C e D: 5' CA ACCG ACGT CGGT TG 3'. Análise feita
através do programa Superpose da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003).
Resultados
71
Figura 26. Detalhe da molécula de DNA. A figura mostra o contorno do mapa de densidade
eletrônica obtido com 2|F
obs
| - |F
cal
| contornado em 1σ e |F
obs
| - |F
cal
| contornado em 3σ. Figura
gerada em PyMol.
Investigando os mapas de densidade eletrônica gerados não foi observada nenhuma
densidade que pudesse ser um indicativo da presença do ligante, no caso, o peptídeo 18α1E2.
Porém uma inspeção mais cuidadosa mostrou a presença de algumas bolhas de densidade
positiva no mapa de diferença |F
obs
|-|F
calc
| (contornado em 3σ) que são muito grandes para
serem consideradas moléculas de água. Essas bolhas de densidade, representadas como
moléculas de água, localizam-se principalmente no sulco maior da molécula de DNA, de
maneira a conectar as duas cadeias. A figura 27 exemplifica esse fato exibindo detalhe de
duas (das sete totais) dessas bolhas de densidade.
Resultados
72
Figura 27. Detalhe do mapa de diferença eletrônico contendo “bolhas” não modeladas.
Figuras geradas com screenshot usando o programa Coot para Windows, versão 0.1.2
(Emsley e Cowtan, 2004). Painel A, cadeias D (vermelho) e A (amarelo); painel B, cadeias C
(azul) e B (verde). Mapa de densidade eletrônica obtido com 2|F
obs
| - |F
cal
| contornado em 1σ e
|F
obs
| - |F
cal
| contornado em 3σ.
Resultados
73
A presença dessas bolhas de densidade poderia ser um indicativo de presença de
ligante no conjunto de dados. Devido à baixa resolução dos dados (2.8 Å) é possível que o
mapa de diferença esteja incompleto e um maior refinamento dos dados seria necessário para
que fosse possível a observação de densidade correspondente à presença do ligante. Além
disso, também é possível que devido a danos sofridos pelo cristal pela forte intensidade de
raios-x incidente durante a coleta de dados, o ligante que estivesse presente no conjunto de
dados tenha sido perdido. Já foi verificada anteriormente variação isomórfica significativa
induzida pela irradiação de cristais por raios-x, que ocasionam danos no cristal e a perda de
derivativos, como metais pesados utilizados para o faseamento de estruturas inéditas
(Ramagopal et al, 2005). Dessa maneira, embora não seja possível a observação de densidade
eletrônica no mapa de diferença correspondente a presença do ligante, não é possível afirmar
com certeza que o peptídeo 18α1E2 não esteja presente no conjunto de dados.
Para tentar resolver essa questão, nós fizemos o alinhamento da estrutura de
E2BSN4ACGT com diferentes estruturas de DNA reportadas na literatura, obtidos na forma
livre e em complexo com a proteína E2, numa tentativa de inferir a possível presença do
ligante. O resultado desse alinhamento encontra-se na figura 28. Como pode ser observado, o
DNA obtido dos ensaios cristalográficos realizados nessa tese (representado em verde) é
quase perfeitamente alinhado com o DNA obtido da estrutura cristalográfica de 423D.pdb
(representado em vermelho, figura 28). Esse DNA foi cristalizado originalmente sozinho, na
ausência de ligante (ausência de proteína) e representa a forma livre do DNA no cristal
(Rozenberg et al, 1998). Quando o alinhamento foi feito com o DNA obtido da estrutura
cristalográfica 2BOP.pdb (representado em magenta na figura 28, painel C e D), pode-se
perceber grandes diferenças entre as duas cadeias refletindo a discordância do alinhamento
obtido. O mesmo pode ser observado quando o alinhamento foi feito com a estrutura
cristalográfica do DNA obtido de 1JJ4.pdb (representado em laranja, figura 28, painel E e F).
Resultados
74
Estas duas últimas estruturas (2BOP e 1JJ4.pdb) são estruturas cristalográficas obtidas de
complexos com a proteína E2 de BPV-1 e HPV-18, respectivamente, e representam o DNA
na sua forma ligada (Hedge et al, 2002; Kim et al, 2000). O DNA obtido a partir dessas
estruturas apresenta um dobramento característico após a ligação com a proteína que não é
observado no DNA livre (representado pela estrutura 423D.pdb). Uma comparação mais
cuidadosa foi feita através da sobreposição da estrutura obtida com os ensaios cristalográficos
E2BSN
4
ACGT, a estrutura do DNA livre de 423D.pdb e a estrutura de um DNA tipo B ideal
grado pelo programa Coot, pelo programa Superpose (a exemplo do que foi feito
anteriormente para as duas moléculas sozinhas), representado na figura 29. O gráfico de
desvio quadrático médio (RMSD) resultante dessa análise é apresentado na figura 30.
Notamos em ambas as representações, de imagem e cálculo de RMSD, que a superposição
obtida entre as cadeias A/B da estrutura 423D.pdb com as duas moléculas presentes na
unidade assimétrica (através da sobreposição das bases 1-12 de 423D.pdb e as bases
correspondentes 3-14 em E2BSN4ACGT) resulta diferenças muito sutis, sem relevância
significativa. O mesmo se dá com a sobreposição com o DNA tipo B ideal. O fato de os
resultados obtidos com essa tese apresentarem maior concordância com o DNA cristalizado
na forma livre parece ser um forte indicativo da ausência de peptídeo nos cristais difratados.
Resultados
75
AB
CD
EF
AB
CD
EF
Figura 28. Superposição de E2BSN4ACGT com outras seqüências de DNA. Painel A e B,
E2BSN4ACGT (verde) superposto com 423D.pdb (vermelho)
; Painel C e D, E2BSN4ACGT
(verde) superposto com DNA de 2BOP.pdb (magenta); Painel E e F, E2BSN4ACGT (verde)
superposto com DNA de 1JJ4.pdb (laranja). À direita (A, C, E), DNAs representados como
desenhos. À esquerda (B, D, F), representados como sticks.
Resultados
76
Figura 29. Análise comparativa dos monômeros de E2BSN4ACGT presentes na Unidade
Assimétrica com 423D.pdb e dsDNA ideal do tipo B. Superposição feita com auxílio do
programa Superpose (CCP4i, Potterton et al, 2003) das bases da dsDNA de 423D.pdb
(vermelho) e uma seqüência de DNA B Ideal gerado pelo programa Coot (azul) com dsDNS
AD (direita, painel de baixo) e CB (esquerda, painel de baixo) de E2BSN4ACGT (verde).
Seqüência alinhada de todas as cadeias: 5' ACCG ACGT CGGT 3.
Resultados
77
Superposição entre E2BSN4ACGT vs 423D.pdb
Cadeia principal
Seqüência
CAACCGACGTCGGTTG
RMSD, Å
0
1
2
3
4
5
6
7
423D-AB vs BC
423D-AB vs CB
423D-AB vs AD
423D-AB vs DA
Superposição entre E2BSN4ACGT vs 423D.pdb
Cadeia lateral
Seqüência
CAACCGACGTCGGTTG
RMSD, Å
0
1
2
3
4
5
6
7
423D-AB vs BC
423D-AB vs CB
423D-AB vs AD
423D-AB vs DA
Superposição entre E2BSN4ACGT vs Ideal-B
Cadeia principal
Seqüência
CAACCGACGTCGGTTG
RMSD, Å
0
1
2
3
4
5
6
7
Ideal B -AB vs BC
Ideal B -AB vs CB
Ideal B -AB vs AD
Ideal B -AB vs DA
Superposição entre E2BSN4ACGT vs Ideal-B
Cadeia lateral
Seqüência
CAACCGACGTCGGTTG
RMSD, Å
0
1
2
3
4
5
6
7
Ideal B -AB vs BC
Ideal B -AB vs CB
Ideal B -AB vs AD
Ideal B -AB vs DA
A
B
C
D
Figura 30. Análise comparativa dos monômeros de dsDNA presentes na Unidade
Assimétrica com 423D.pdb. O gráfico representa o desvio médio quadrático (RMSD) feito
pelo programa Superpose (CCP4i, Potterton et al, 2003) das bases de DNA da fita AB de
423D.pdb e das fitas AB de uma estrutura de DNA Ideal gerada pelo programa Coot (Emsley
e Cowtan, 2004) sobreposta as fitas BC, CB, AD e DA de E2BSN4ACGT (indicados na
legenda). Seqüência alinhada de todas as cadeias: 5' ACCG ACGT CGGT 3.'
Na análise comparativa da estrutura cristalográfica de diversos oligonucleotídeos de
12 pb contendo a seqüência consenso ACCG-N4-CGGT reconhecida pela proteína E2 de
papilomavírus com a estrutura cristalográfica do DNA obtido de complexos de E2c:DNA
(Rozenberg et al, 1998) verificou-se que os pares de base centrais da seqüência espaçadora
contribuem diretamente na indução de geometria do DNA (dobramento ou deformação da
estrutura). Isso é possível de ser percebido pela proteína mesmo sem contato direto com essa
região espaçadora, o que é denominado de mecanismo de leitura indireto (indirect readout,
Resultados
78
ver Introdução). Nesse trabalho, os autores apresentam a descrição de alguns parâmetros
locais de dsDNA entre as formas livre e complexadas a E2, conforme apresentado na figura
31 (Lu e Olson, 2003, Rozenberg et al, 1998)
Figura 31. Alguns parâmetros geométricos observados em estruturas de ácidos
nucléicos. Parâmetros retirados da homepage do programa 3DNA
8
(Lu e Olson, 2003).
Empregando o programa Curves foi calculado os parâmetros locais dos dois dsDNA
(cadeias DA e CB) (Figura 32) encontrados na unidade assimétrica da estrutura
E2BSN4ACGT resolvida nessa tese. Uma primeira observação que fazemos dessa análise
comparativa dos parâmetros geométricos entre os dois DNAs (Figuras 32a e 32b) é de que
eles são similares entre si mas com variações suficientes que os tornam distintos
cristalograficamente (comparar círculos pretos – cadeia AD - com triângulos vermelhos –
8
http://rutchem.rutgers.edu/~xiangjun/3DNA/
Resultados
79
cadeia CB). Em seguida, destacamos que as bases das duas extremidades (5’e 3’) dos dois
dsDNA apresentam flutuações entre os parâmetros bastante distintos da média geral
observado para as outras 12 pb centrais (Figuras 32a e 32b, painéis pequenos), como também
observado na Figura 24, que evidencia o possível rompimento dos contatos de Watson-Crick
e orientação das bases longe do eixo central do DNA.
Ao compararmos os resultados de nosso cristal notamos que esta região central, de 12
pb, é pouco variada, mantendo flutuação suave de seus parâmetros dentro da média observada
(tabela 6), sem variação significativa, não sofrendo distorções consideráveis e mantendo uma
estrutura conformacional global perto daquelas típicas descritas para DNA ideais tipo B
(Figura 32, losangos amarelos; Gorin et al, 1995). Essas características que observamos para o
E2BSN4ACGT utilizado nessa tese é similar àquela forma ‘livre’ descrita por Rozenberg et al
(1998) (Figura 32, quadrados verdes), sendo que o nosso possui 4 bases a mais (duas em cada
extremidade) mas como mesma seqüência de 12 bases central (ACCG ACGT CGGT;
423D.pdb).
Duplex Shift Slide Rise Tilt Roll Twist
(Å) (Å) (Å) (
o
) (
o
) (
o
)
dsDNA A-D -0.06 -1.10 3.44 -0.96 -2.55 32.78
dsDNA B-C 0.00 -0.44 3.32 -0.78 5.90 28.34
423D.pdb 0.13 -0.39 3.39 0.72 4.26 34.38
Ideal B-DNA 0.00 0.00 3.38 0.00 -0.02 35.95
Tabela 6. Análise estrutural média de parâmetros geométricos locais inter-pares de
bases dos DNA analisados. Os parâmetros foram calculados com auxilio do programa
Curves (Lavery e Sklenar, 1988).
Resultados
80
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Slide, Å
-4
-2
0
2
4
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Shift, Å
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Rise, Å
0
1
2
3
4
5
6
7
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Shift, Å
-2
-1
0
1
2
dsDNA fitas AD
dsDNA fitas BC
ds 423D
dsDNA B Ideal
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Slide, Å
-2
-1
0
1
2
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Rise, Å
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
A
B
C
Figura 32a Análise estrutural de parâmetros geométricos locais inter-pares de bases dos
dsDNA analisados. Os parâmetros foram calculados empregando-se o programa Curves. Em
círculos pretos (cadeias DA) e triângulos vermelhos (cadeias CB), dsDNA resolvidos nessa
tese; quadrados verdes, 423D.pdb e losangos amarelos, DNA B ideal com mesma seqüência.
Coluna da direita, parâmetros geométricos de todas as bases das seqüências utilizadas. Coluna
da esquerda, visão aproximada dos 12 pb centrais (excluindo as duas bases das extremidades
Resultados
81
em DA, CB e DNA B Ideal).
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Roll,
o
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Twist,
o
-150
-100
-50
0
50
100
150
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Tilt,
o
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Roll,
o
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Twist,
o
20
25
30
35
40
45
5' --- 3'
C
A
A
A
A
C
C
C
C
G
G
A
A
C
C
G
G
T
T
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
G
Tilt,
o
-10
-5
0
5
10
dsDNA fitas AD
dsDNA fitas BC
ds423D
ds DNA B Ideal
D
E
F
Figura 32b Análise estrutural de parâmetros geométricos locais inter-pares de bases dos
dsDNA analisados. Os parâmetros foram calculados empregando-se o programa Curves. Em
círculos pretos (cadeias DA) e triângulos vermelhos (cadeias CB), dsDNA resolvidos nessa
tese; quadrados verdes, 423D.pdb e losangos amarelos, DNA B ideal com mesma seqüência.
Coluna da direita, parâmetros geométricos de todas as bases das seqüências utilizadas. Coluna
da esquerda, visão aproximada dos 12 pb centrais (excluindo as duas bases das extremidades
em DA, CB e DNA B Ideal).
Resultados
82
Entretanto, é curioso notar que os valores de slide (figura 32a , painel B) das quatro
bases da extremidade (em negrito na seqüência: 5’ CA AC CG ACGT CG GT TG 3’) de
ambos os DNA dupla fita apresenta distribuição distinta da média observada na região central.
Isso pode indicar uma estruturação nessa região central, cuja causa merece ser mais bem
investigada. Essa estruturação poderia ser explicada por fatores geométricos típicos desta
seqüência ou a indução pela presença de algum fator contactante, como DNA simetricamente
relacionado, íons magnésio, o próprio peptídeo ou algum outro fator aqui não relacionado. Se
de fato os dois DNAs são idênticos em seqüência, entendemos que essas diferenças estruturais
possam ser explicadas por indução via empacotamento cristalino e/ou ainda devido a
ocupância, caso comprovada, do peptídeo apenas em regiões particulares. A origem da
relação causa-conseqüência, ou seja, se uma possível heterogeneidade conformacional induz
esse particular empacotamento cristalino ou se a formação da rede cristalina induz a
heterogeneidade conformacional, e de que forma a eventual ligação do peptídeo foi afetada
por ou induziu tais mudanças está por ser mais profundamente avaliada e deve ser alvo de
investigação pelo nosso grupo no futuro.
Avaliamos ainda as características gerais das cavidades dos DNAs, em termos de
largura e profundidade. Como podemos notar na Figura 33 abaixo, os dois DNA
compreendendo as fitas AD (círculos pretos) e BC (triângulos vermelhos) possuem larguras
dos sulcos idênticas, guardada a resolução do cristal. Entretanto, todos eles apresentam entre
si um pouco de variação quanto à profundidade do sulco. De qualquer forma, esses dados
tomados em conjunto são mais um indício de que de fato esses dois DNA guardam
substanciais diferenças cristalográficas, ainda que idênticos em seqüência, guardando forte
identidade estrutural entre si.
Resultados
83
5' --- 3'
C
1
A
2
A
3
C
4
C
5
G
6
A
7
C
8
G
9
T
1
0
C
11
G
1
2
G
1
3
T
1
4
T
1
5
Largura (sulco menor), Å
4
6
8
10
12
14
cadeias AD
cadeias BC
423D.pdb
Ideal B
5' --- 3'
C
1
A
2
A
3
C
4
C
5
G
6
A
7
C
8
G
9
T
1
0
C
1
1
G
1
2
G
1
3
T
1
4
T
1
5
Profundidade (sulco menor), Å
0
2
4
6
8
10
5' --- 3'
C
1
A
2
A
3
C
4
C
5
G
6
A
7
C
8
G
9
T
1
0
C
1
1
G
1
2
G
1
3
T
1
4
T
1
5
Largura (sulco maior), Å
4
6
8
10
12
14
5' --- 3'
C
1
A
2
A
3
C
4
C
5
G
6
A
7
C
8
G
9
T
1
0
C
1
1
G
1
2
G
1
3
T
1
4
T
1
5
Profundidade (sulco maior), Å
0
2
4
6
8
10
A
B
C
D
Figura 33. Análise estrutural das cavidades maiores e menores dos DNAs. Os parâmetros
foram calculados empregando-se o programa Curves.
A sobreposição da estrutura do DNA obtida nos ensaios cristalográficos dessa tese
(representado em verde) com o complexo [E2c:DNA] de HPV-18 (1JJ4.pdb) (figura 34,
painel A) nos permite imaginar qual seria a posição do peptídeo no caso de sua presença no
cristal (figura 34, painel B). Entretanto, os dados de dinâmica molecular revelaram que o
peptídeo apresenta uma forte tendência a se desenovelar nas regiões não contactantes, mesmo
Resultados
84
após a formação do complexo, mantendo-se porém estruturado helicoidalmente nas regiões de
reconhecimento nucléico. Desse modo, se o peptídeo estivesse presente no cristal ligado ao
DNA, acreditamos que a sua localização deveria ser estrita a duas ou três hélices, uma vez
que uma boa parte dos aminoácidos estaria desordenada e, portanto, com baixa ocupância,
não aparecendo nos dados de difração. Esses dados em conjunto são bastante reveladores,
pois demonstram que mesmo uma pequena região, compreendendo cerca de duas a três voltas
(aproximadamente 6 a 10 aminoácidos) de α-hélice é suficiente para realizar reconhecimento
nucléico específico, discriminando com elevada habilidade seqüências de bases consenso de
seqüências aleatórias. Este fato sugere fortemente que possa existir um grande potencial de
reconhecimento associado às características individuais, químicas, físico-químicas e
estereoquímicas inerentes a cada aminoácido individualmente, assim como conjugados a
fatores locais de vizinhança imediata (aminoácido em respeito denominado N e seus
adjacentes, N-2 / N-1 / N / N+1 / N+2).
Resultados
85
A
B
A
B
Figura 34. Superposição de E2BSN4ACGT com 1JJ4.pdb. Painel A, Uma dupla fita de
DNA E2BSN4ACGT (verde) em superposição com 1JJ4.pdb (azul e laranja). Painel B,
E2BSN4ACGT (verde) mostrando a localização da região correspondente ao peptídeo 18α1E2
retirado de 1JJ4.pdb (amarelo).
A busca por um código simples de reconhecimento, associando cada aminoácido com
uma base ou conjunto de bases nitrogenadas e a química dessas interações, têm sido intenso
alvo de investigação (Seeman et al, 1976; Mandel-Gutfreund et al, 1995; Luscombe et al,
2001). Com o aumento no número de estruturas resolvidas de complexos proteína:ácido
nucléico pode-se observar a preferência de certos aminoácidos por bases determinadas. Essas
Resultados
86
preferências levam em consideração a estrutura química dos elementos envolvidos (Mandel-
Gutfreund et al, 1995) e têm servido de base ao desenvolvimento de uma série de programas
por diversos autores capazes de estimar o potencial de determinada(s) região(ões) de proteínas
se ligarem a DNA. Alguns desses programas encontram-se listados na tabela 7 e estão
disponíveis na Internet. Mas, apesar do grande número de trabalhos nesse sentido, ainda não é
possível predizer a possível seqüência consenso de ligação de determinada proteína ligadora
de DNA. Acreditamos que com o avanço dos trabalhos nesse sentido, essa possa ser uma
questão a ser resolvida em futuro próximo. Considerando-se o alcance do conhecimento
científico atual, não é difícil vislumbrar um cenário em que somente a partir das seqüências de
proteína poderemos predizer sua estrutura e função, empregando-se para isso as estruturas já
existentes, seus motivos estruturais, e as classes de famílias de proteínas, motivos de
enovelamento, acoplamento entre conservação de seqüência e atividade funcional e/ou
enzimática.
Programa Comentário Referência
PreDS Tsuchiya et al, 2005
dbsPSSM Ahmad e Sarai, 2005
BindN Utiliza potencial eletrostático de superfície Wang e Brown, 2006
Displar Analisa perfil de seqüências e acessibilidade
de solvente.
Tjong e Zhou, 2007
DBSpred Fornece informação de seqüência e
acessibilidade ao solvente
Ahmad et al, 2004
DP-Bind Hwang et al, 2007
proMATEUS Neuvirth et al, 2007
PDNA-pred Shanahan, et al, 2004
predictdnahth Prevê se determinada estrutura tridimensional
contém o motivo estrutural de ligação ao DNA
hélice-volta-hélice (HTH)
McLaughlin e Berman,
2003
Tabela 7. Programas disponíveis para predição de regiões de reconhecimento nucléico
em proteínas.
Resultados
87
Estudos estruturais cristalográficos de proteínas tirosino fosfatases.
As proteínas tirosino fosfatase apresentam um papel fundamental em vias de
transdução de sinal, de maneira semelhante ao que é descrito na literatura para as proteínas
tirosino cinase. Porém, apesar da sua importância, muito pouco se sabe ainda a respeito dessa
família de enzimas, sendo que muitos membros dessa família necessitam ainda serem mais
bem caracterizados. Nesse contexto, nessa tese nós realizamos ensaios cristalográficos, dentro
do projeto do consórcio de genômica estrutural de Nova York, para tentar elucidar a estrutura
tridimensional dessas proteínas.
A proteína tirosino fosfatase sigma (PTPσ) é uma proteína do tipo receptor de
membrana com uma porção extracelular contendo três domínios de imunoglobulinas, uma
porção transmembranar e dois domínios intracelulares seguidos, sendo o primeiro domínio
(D1) ativo e o segundo domínio (D2 ou pseudo-domínio) inativo (Siu et al, 2007). A estrutura
inédita dos dois domínios intracelulares da PTPσ foi resolvida na literatura recentemente e
depositada na base de dados protein data bank (Alvarado et al, 2006; 2FH7.pdb). A resolução
da estrutura dessa proteína na presença de um ligante poderia fornecer importantes
informações estruturais a respeito do seu mecanismo de catálise que ajudaria a aumentar o
conhecimento a respeito dessa família de proteínas. Para isso, foram feitos ensaios
cristalográficos na presença de tungstato, um inibidor competitivo dessa enzima que, por ser
tetravalente como o substrato dessa enzima (fosfotirosina), é capaz de ligar ao sítio ativo
(Fauman et al, 1996). Tentativas de obtenção de co-cristal de PTPσ e tungstato não foram
bem sucedidas, porém ao mergulharmos o cristal de PTPσ crescido na sua forma apo em
solução contendo alta concentração de tungstato, foi possível obter a estrutura dessa proteína
na sua forma holo (na presença de tungstato). Os dados cristalográficos e as estatísticas de
refinamento dessa estrutura estão apresentados na tabela 8. A figura 35 mostra um desenho
Resultados
88
representando a estrutura da forma holo da PTPσ. Essa estrutura, assim como a forma apo
resolvida anteriormente, apresenta os dois domínios intracelulares D1 (figura 35, representado
em verde) e D2 (figura 35, representado em magenta). Pode-se observar no centro dos dois
domínios, próximo a cisteína 1589 (em D1, figura 36, painel A) e próximo a cisteína 1880
(em D2, figura 36, painel B) da região descrita como sendo o sítio catalítico (Alonso et al,
2004; Tonks, 2006), uma densidade positiva forte no mapa de diferença |F
obs
|-|F
calc
|
contornado a 3σ, indicando a presença de tungstato do conjunto de dados. Essa diferença de
densidade eletrônica encontra-se representada na figura 35 como uma nuvem vermelha. Isso
pode ser mais bem visualizado na figura 36, que mostra o sítio ativos dos dois domínios em
uma visão mais aproximada, destacando a cadeia lateral dos aminoácidos envolvidos com a
atividade biológica dessa proteína.
Dados e parâmetros PTPσ + WO
4
Grupo espacial P6
1
Parâmetros de célula a = b = 94,45
c = 123,96
Resolução (Å) 50 – 2.1
Número de subunidades na U.A. 1
Completeza (%) 96,82
I/σ (I) 7,2
Número de reflexões únicas 33.591
Refinamento
R
factor
0,17
R
free
0,21
Rmsd distância de ligação, Å 0.018
Rmsd ângulo de ligação, Å 1.580
Gráfico de Ramachandran
Favoráveis (%) 92,3
Permitidos (%) 7,1
Generosamente permitidos (%) 0,6
Não permitidos (%) 0,0
Tabela 8. Dados de cristalografia e estatística de refinamento do conjunto de dados de
difração da PTPσ na presença de tungstato. Dados obtidos com o auxílio do programa
Procheck (Laswowski et al, 1993) da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003).
Resultados
89
Figura 35. Proteína tirosino fosfatase σ em complexo com tungstato. Cristais de PTPσ na
presença de tungstato foram obtidos e difratados conforme descrito em Material e Métodos.
Em verde está representado o domínio 1 e em magenta está representado o domínio 2 (ou
pseudodomínio, sem atividade biológica descrita). Em vermelho está representada a
densidade eletrônica do mapa |F
obs
|-|F
calc
| contornado em 3σ, correspondente à presença de
tungstato (em traços azuis e vermelhos) na região do sítio ativo.
A
B
A
B
Figura 36. Detalhe do sítio ativo na presença de tungstato nos dois domínios da PTPσ.
Painel A, domínio 1 (verde); Painel B, Domínio 2 ou pseudodomínio (magenta). A cadeia
lateral dos resíduos de aminoácidos envolvidos na catálise está em destaque em traços brancos
em ambos os painéis. Em vermelho, a densidade eletrônica do mapa |F
obs
|-|F
calc
| contornado
em 3σ correspondente à presença de tungstato. Em traço azul e vermelho está representada a
molécula de tungstato nos dois painéis.
Resultados
90
O cálculo do potencial eletrostático da estrutura da PTPσ na presença de tungstato
mostra que o fundo da região onde se localiza o sítio ativo e onde encontra-se a molécula de
tungstato, tem um grande potencial eletrostático positivo (figura 37). Este potencial positivo é
observado no sítio ativo dos dois domínios (figura 37, painéis A e B). Além disso, algumas
protusões e depressões são observadas na superfície da molécula, próximo ao bolso de ligação
de fosfotirosina no sítio ativo. Esse mesmo potencial positivo pode ser observado na mesma
região dos dois domínios na estrutura da apo proteína (figura 37, painéis C e D). Isso também
pode ser observado em outras estruturas de PTPases, indicando que esse, potencialmente, é
um fator comum necessário para o funcionamento da enzima (Yang et al, 1998).
Resultados
91
A
B
CD
A
B
CD
A
B
CD
Figura 37. Representação aproximada do potencial eletrostático de superfície (não leva
em consideração solvente, cálculo realizado em vácuo). Figura gerada em PyMol. Painéis A
(domínio 1) e B (domínio 2), estrutura holo da PTPσ. Painéis C (domínio 1) e D (domínio 2),
estrutura apo da PTPσ. Destacado em linha pontilhada branca encontra-se o bolso de ligação
de fosfotirosina no sítio ativo.
A estrutura da holo proteína foi superposta à forma apo da proteína e não pôde ser
notada grande diferença entre as estruturas, como observado na figura 38. O gráfico dos
desvios médios quadráticos dessas duas proteínas (figura 39) mostra que há uma discreta
mudança (menor que 0,5 Å) ou nenhuma mudança (guardada a resolução) dos carbonos α que
formam o esqueleto da proteína. A figura 40 mostra uma visão aproximada do sítio ativo das
duas proteínas superpostas, ilustrando a semelhança entre eles. Nessa figura estão destacados
os aminoácidos pertencentes ao sítio ativo (HCX
5
R, Alonso et al, 2004; Tonks et al, 2006) da
proteína e não pode ser observadas nenhuma alteração conformacional significativa da cadeia
Resultados
92
lateral desses aminoácidos com a presença do ligante. Porém, a análise da interação do
tungstato com os resíduos do sítio ativo nos dois domínios mostra uma maior interação no
primeiro domínio, como evidenciado pelo maior número de contatos (figura 41). No domínio
1 os fosfatos do tungstato encontram-se coordenados pelo nitrogênio amídico da maioria dos
aminoácidos do sítio ativo (figura 41, painel A). Além disso, o enxofre da cisteína interage
diretamente com a molécula de tungstato. Em contraste, no segundo domínio, apenas dois
aminoácidos do sítio ativo estão envolvidos em contato direto com a molécula de tungstato
através do nitrogênio amídico (figura 41, painel B) e dois aminoácidos estão envolvidos
através de interações de Van der Waals.
Figura 38. Superposição das formas apo e holo da PTPσ. Figura gerada usando PyMol.
Superposição feita com programa Superpose da suíte CCP4i (Potterton et al, 2003). A forma
apo da PTPσ está representada pela linha verde; a forma holo pela linha vermelha. A
molécula de tungstato está representada pelas esferas azuis e vermelhas no centro dos dois
domínios.
Resultados
93
PTPσ Cadeia principal RMSD (Å) apo vs holo
Aminoácido número
1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 1700 1750 1800 1850 1900 1950
RMSD (Å)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Figura 39. Desvio médio quadrático dos carbonos α das estruturas apo e holo da PTPσ.
A análise comparativa das estruturas apo e holo de PTPσ foi feita através do programa
Superpose da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003; ver Material e Métodos).
Resultados
94
A B
C D
AA B
CC D
Figura 40. Detalhe do sítio ativo das estruturas apo (verde) e holo (vermelho) da PTPσ.
A sobreposição das duas estruturas foi feita pelo programa Superpose da suíte de programas
CCP4i (Potterton et al, 2003). Painéis A e C, sítio ativo do domínio 1; painéis B e D, sítio
ativo do domínio 2. Em azul e vermelho encontram-se representada as moléculas de tungstato.
Figura gerada pelo programa PyMol. Os aminoácidos presentes no sítio ativo (HCX
5
R)
encontram-se em destaque.
Resultados
95
ABAB
Figura 41: Análise da interação da molécula de tungstato com os aminoácidos do sítio
ativo. As interações dos aminoácidos do sítio ativo do domímio 1 (painel A) e do domínio 2
(painel B) da proteína tirosino fosfatase sigma com a molécula de tungstato foram analisados
através do programa LigPlot.
Além da estrutura da PTPσ, foi resolvida a estrutura inédita da proteína tirosino
fosfatase IA2, depositada na base de dados protein data bank sob o código de acesso
2I1Y.pdb (Faber-Barata et al, 2006b). Os dados cristalográficos e estatísticas de refinamento
estão apresentados na tabela 9. Essa proteína, diferente da PTPσ, possui somente um domínio
intracelular que é descrito na literatura como sendo um pseudo-domínio, portanto sem
atividade catalítica (Tonks, 2006). A estrutura cristalográfica dessa proteína apresentou duas
moléculas na unidade assimétrica (figura 42). As duas moléculas encontradas são muito
similares, como pode ser observado na sobreposição (figura 43). Porém, pode-se observar
duas regiões divergentes compreendendo os aminoácidos 81 a 90 e 239 a 250. Essa
Resultados
96
divergência pode ser também visualizada no gráfico do desvio médio quadrático (RMSD) das
duas estruturas (figura 44).
Dados e parâmetros PTP-IA2
Grupo espacial P2
1
2
1
2
1
Parâmetros de célula a = 72,90 b = 74,23
c = 121,06
Resolução (Å) 50 – 2,23
Número de subunidades na U.A. 2
Vm (coef de Mattews), Å
3
/Da 2,23
Completeza (%) 99,64 (98,7)
I/σ (I) 2,7 (0,5)
R
sym
0,19
Número de reflexões únicas 32.726
Multiplicidade 6,8
Refinamento
R
factor
0,19
R
free
0.26
Rmsd distância de ligação, Å 0.008
Rmsd ângulo de ligação , Å 1.146
Gráfico de Ramachandran
Favoráveis (%) 92
Permitidos (%) 6.6
Generosamente permitidos (%) 0.8
Não permitidos (%) 0.6
Tabela 9. Dados de cristalografia e estatística de refinamento do conjunto de dados de
difração da PTP-IA2. Dados obtidos com o auxílio do programa Procheck (Laswowski et al,
1993) da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003).
Resultados
97
Figura 42. Estrutura cristalográfica da proteína PTP-IA2. A unidade biológica é
composta de apenas um monômero. Em azul e amarelo estão representadas as duas moléculas
encontradas na unidade assimétrica. Figura gerada pelo programa PyMol.
Resultados
98
A
B
A
B
Figura 43. Sobreposição das duas moléculas presentes na unidade assimétrica de PTP-
IA2. Painel A, Superposição dos dois monômeros de PTP-IA2 presentes na unidade
assimétrica destacando as regiões divergentes. Em azul, monômero A e amarelo, monômero
B. Painel B, detalhe das regiões divergentes: à direita, região compreendendo os aminoácidos
81-90, e a esquerda, 239-250. Figura gerada usando PyMol. Superposição feita com programa
Superpose da suíte CCP4i (Potterton et al, 2003).
Resultados
99
PTPIA2 Cadeia Principal RMSD (Å) monômero A vs monômero B
Aminoácido número
700 750 800 850 900 950
RMSD (Å)
0
2
4
6
8
Figura 44. Desvio médio quadrático (RMSD) dos carbonos α dos dois monômeros
presentes na unidade assimétrica de PTP-IA2. A análise comparativa dos dois monômeros
foi feita através do programa Superpose da suíte de programas CCP4i (Potterton et al, 2003;
ver Material e Métodos).
A estrutura apo da proteína PTPσ foi utilizada como modelo de substituição molecular
para a resolução da estrutura de PTP-IA2. Isso se dá devido à alta homologia de seqüência
encontrada entre as proteínas da família tirosina fosfatase. Apesar da grande homologia de
seqüência, pode-se observar mudanças conformacionais na estrutura da PTP-IA2 quando
comparada aos dois domínios da PTPσ (figura 45).
Resultados
100
AB
CD
AB
CD
Figura 45. Sobreposição dos monômeros da PTP-IA2 com os dois domínios da PTPσ.
Sobreposição e figura feitas com o programa PyMol. Em azul encontra-se representado o
monômero A da PTP-IA2; em amarelo, o monômero B da PTP-IA2. Em verde está
representado o domínio 1 da PTPσ e em vermelho o domínio 2 da mesma proteína.
Discussão
Discussão
102
No trabalho apresentado (Faber-Barata et al, 2006a) foi mostrado pela primeira vez o
reconhecimento e ligação a uma molécula consenso de DNA por um peptídeo sintético
contendo a α-hélice 1 de HPV-16. Foi verificado que uma seqüência mínima de aminoácidos
correspondente à região ligadora de DNA é capaz de discriminar entre diferentes seqüências
de DNA mesmo fora do contexto da proteína inteira. Esses resultados foram a primeira
evidência na literatura de reconhecimento nucléico por seqüências peptídicas mínimas. A
possibilidade desse mecanismo de reconhecimento poder ser estendido a outros sistemas
biológicos permanece em aberto e merece ser mais bem investigado futuramente.
Em trabalhos anteriores foi observado na proteína inteira que a região da hélice de
reconhecimento (α hélice-1) da proteína E2 livre (não complexada ao DNA) de HPV-31
apresenta mais de uma conformação e que essa região se encontra em equilíbrio dinâmico
conformacional entre uma forma helicoidal e uma conformação desordenada localmente
(Liang et al, 1996). O mesmo pode ser observado nos resultados mostrados nessa tese, tanto
na análise da estrutura secundária por dicroísmo circular (CD), como nas simulações de
dinâmica molecular do peptídeo livre. Já foi sugerido que a flexibilidade dessa região seria
necessária para facilitar o ajuste e a ligação corretos com a seqüência de DNA cognata (Liang
et al, 1996). Nessa tese, foi observado que embora essa região se encontre preferencialmente
na forma desenovelada (como observado nos dados de CD e nas simulações de dinâmica
molecular) ainda assim ela é capaz de discriminar e ligar-se especificamente à seqüência de
DNA consenso. Esse dado é condizente com a observação da ligação da hélice de
reconhecimento que pode se apresentar desordenada em solução. A ligação ao DNA
favoreceria a conformação helicoidal observada em estruturas cristalográficas dessa região,
também observado aqui nas simulações de dinâmica na presença de DNA.
As simulações de dinâmica molecular mostram que o peptídeo derivado da hélice de
reconhecimento ao DNA de HPV é desordenado quando sozinho em solução, confirmando os
Discussão
103
dados anteriores de CD (Faber-Barata et al, 2006a). Este peptídeo é capaz de se enovelar após
a complexação com o DNA, conforme pode ser inferido com a contribuição do peptídeo no
espectro de CD do complexo após a subtração da contribuição do DNA livre. Embora essa
conclusão tenha sido baseada em medidas indiretas, uma vez que o conteúdo de estrutura
secundária do peptídeo é mascarado pelo espectro do DNA no CD, essa sugestão é
confirmada pelas simulações de dinâmica molecular do complexo [peptídeo:DNA], que
mostram que o peptídeo se mantém parcialmente enovelado quando complexado ao DNA. A
ligação ao DNA, então, diminui a flexibilidade observada para o peptídeo sozinho,
favorecendo a manutenção (ou formação) de uma estrutura helicoidal. Pode ser concluído,
portanto, que os contatos formados entre o peptídeo e o DNA são os principais responsáveis
pela formação da hélice e a redução do desenovelamento do peptídeo (figuras 21 e 22). Essa
diminuição da flexibilidade e ganho de estrutura secundária da hélice de reconhecimento
também pode ser estendido para a proteína inteira, como já observado anteriormente (Liang et
al, 1996).
A afinidade de ligação do peptídeo ao DNA é bem menor do que a reportada na
literatura para a proteína E2c (duas ordens de grandeza, Lima e Silva, 2004). Essa diminuição
da afinidade é esperada uma vez que o peptídeo encontra-se fora do contexto da proteína
inteira onde existem outros pontos de contato com o DNA; a α-hélice 1 é a região onde se
encontra a maioria dos aminoácidos envolvidos no reconhecimento e ligação ao DNA, porém
alguns pontos de contato também são localizados em uma volta em forma de grampo (Liang
et al, 1996; Kim et al, 2000). Além disso, a proteína inteira é descrita como sendo um dímero
em solução sendo, portanto, composta por duas hélices de reconhecimento, o que traria uma
maior estabilidade ao complexo, que é refletida em uma maior afinidade de ligação.
Apesar dessa diferença de afinidade, foi observado que essa ligação é específica ao
sítio ACCG do DNA consenso (Faber-Barata et al, 2006a). Por essa razão, apesar da
Discussão
104
formação de complexo com outras seqüências consenso contendo diferentes espaçadores não
terem sido ainda testadas, acreditamos que não deveria haver diferença no reconhecimento
especifico e na afinidade de ligação dependente de seqüência espaçadora. Essa questão
permanece a ser investigada futuramente.
O fato de uma seqüência mínima de aminoácidos ser capaz de fazer o reconhecimento
e ligação ao DNA levanta a questão de uma possível via de ligação monomérica ao DNA da
proteína E2. Como já mencionado anteriormente, a proteína E2 é descrita como sendo um
dímero em solução, se ligando ao DNA nessa conformação. A especificidade de ligação ao
sítio ACCG do DNA consenso reforça a sugestão levantada em outros trabalhos do nosso
grupo de uma possível ligação do monômero da proteína E2 ao DNA (Lima et al, 2000; Lima
e Silva, 2004). A presença de espécies monoméricas da proteína E2 e a sua possível ligação
permanecem a ser investigada futuramente e não invalida a via descrita de ligação do dímero
da proteína E2 ao DNA. Na verdade, nós propomos que os dois mecanismos possam ocorrer
simultaneamente, dependendo unicamente da concentração de uma e outra espécie em
solução. Essa hipótese encontra-se ilustrada na figura 47. Mas uma vez, como mencionado
anteriormente, experimentos ainda precisam ser realizados com a proteína inteira a fim de
comprovação da hipótese aqui sugerida.
Discussão
105
Figura 46. Representação esquemática do equilíbrio múltiplo envolvendo a ligação ao
DNA e a associação de subunidades. Comunicação pessoal (L. M. T. R Lima).
A fim de investigar os pontos de contato entre o peptídeo sintético usado nos ensaios
de ligação ao DNA publicados anteriormente, assim como investigar o possível papel da
seqüência espaçadora do DNA na especificidade de ligação, foram feitos ensaios
cristalográficos com peptídeos derivados de diferentes papilomavírus (HPV-16, HPV-18 e
BPV-1, ver Material e Métodos para a seqüência correta de cada peptídeo) e dois DNAs
consenso que diferem apenas na seqüência espaçadora. Apesar do sucesso na obtenção dos
cristais só foi possível até o momento a difração por raios-x de parte dos cristais obtidos,
sendo que somente um deles teve a sua estrutura refinada. Infelizmente, não parece haver
densidade eletrônica no mapa de diferença |F
obs
| - |F
calc
| correspondente à presença do peptídeo
inteiro. A presença de algumas bolhas de densidade no mapa de diferença |F
obs
| - |F
calc
| (sigma
Discussão
106
acima de três), principalmente na proximidade do sulco maior do DNA, parece sugerir a
presença de alguma molécula que não água, uma vez que são maiores do que as demais
moléculas de água encontradas no restante do conjunto de dados. Íons magnésio são
comumente utilizados na cristalização de DNA e de complexos de DNA e proteínas, tendo
sido utilizado nos nossos ensaios de cristalização (a uma concentração de 0,2 mM). Porém,
como já foi descrito, apenas estruturas com alta resolução permitem que esses íons magnésio
sejam identificados facilmente no mapa de densidade eletrônica (Rozemberg et al, 1998), o
que definitivamente não foi o caso, uma vez que a resolução desse conjunto de dados é de 2.8
Å. Íons magnésio são normalmente bem coordenados por moléculas de água, o que não é
possível de se observar com a resolução obtida. A presença dessas bolhas de densidade
merecem ser mais bem investigada futuramente e nenhuma conclusão sobre a sua origem
pode ser feita no presente momento. Fica levantada a hipótese dessas bolhas de densidade
serem parte do peptídeo que permanece enovelada após a formação do complexo, sendo
necessária a finalização do refinamento desses dados para a sua confirmação.
Foram feitas comparações da estrutura do DNA obtido dos ensaios cristalográficos
com a estrutura de outros DNAs reportados na literatura, tanto na forma livre, isto é, na
ausência de proteína (423D.pdb, Rozenberg, et al, 1998) como DNAs retirados de estruturas
de complexo com proteina E2 de HPV-18 (1JJ4.pdb, Kim et al, 2000) e BPV-1 (2bop.pdb,
Hedge et al, 2002). Os DNAs obtidos dos complexos com proteína E2 possuíam um
dobramento ou torção característicos que, como já discutido anteriormente, é resultado de
modificações conformacionais mútuas sofridas pela proteína e pelo DNA após a ligação. O
DNA na forma livre (na ausência de proteína), por sua vez, possui uma conformação mais
linear (apesar de diferir do DNA B ideal). O resultado desse alinhamento mostrou que o DNA
obtido nos nossos ensaios cristalográficos possui uma conformação semelhante ao DNA livre,
uma vez que são quase perfeitamente alinhados (figuras 28 e 29) e muito diferente dos DNAs
Discussão
107
obtidos das estruturas cristalográficas de complexos com a proteína E2. Esses dados não são
muito conclusivos uma vez que não é esperada uma torção pronunciada do DNA após a
formação do complexo com o peptídeo, já que não se verificou mudança significativa na
estrutura secundária do DNA observado por CD (Faber-Barata et al, 2006a).
Nessa tese, nós demonstramos que a especificidade de ligação ao DNA não é
dependente da conformação helicoidal da hélice de reconhecimento e que um peptídeo
desenovelado, mas contendo a seqüência mínima de aminoácidos é capaz de reconhecer e
ligar o DNA. A ligação é decorrente de um mecanismo de encaixe induzido onde ambos os
componentes (peptídeo e DNA) sofrem modificações conformacionais que resultam na
formação do complexo da proteína inteira. A difração e o refinamento dos cristais obtidos nos
ensaios de cristalografia (não analisados ainda), assim como a realização de ensaios de
ligação entre os diferentes peptídeos (16α1E2 e BPV1α1E2) e DNA, poderiam nos fornecer
informações estruturais que permitam inferir o possível papel da seqüência espaçadora do
DNA no mecanismo de leitura indireto conforme discutido anteriormente.
Proteínas tirosina fosfatase
Proteínas tirosina fosfatases são uma família de enzimas que catalisam a
defosforilação de resíduos de fosfotirosinas em proteínas. Junto com as proteínas tirosina
cinases atuam regulando os níveis de fosfotirosina nas vias de transdução de sinal (Yang et al,
1998; Tonks, 2006). Nessa tese nós resolvemos a estrutura da proteína tirosino fosfatase
humana sigma (PTPσ) na presença de um inibidor conhecido dessa enzima. Comparando a
estrutura da holo proteína com a sua forma apo não foi possível detectar nenhuma diferença
significativa na orientação dos aminoácidos presentes no sítio ativo dessa enzima. Há um
ligeiro desvio na cadeia lateral dos aminoácidos presentes no sítio ativo das duas moléculas
como pode ser observado na figura 38, porém a análise do desvio médio quadrático dessas
Discussão
108
duas enzimas mostra que esse desvio não é significativo, não chegando a 1 Å na maioria das
regiões (figura 39).
É interessante observar a presença da molécula de tungstato nos dois domínios da
proteína. Em ambos os casos, a molécula de tungstato encontra-se coordenada por resíduos de
cisteína e localizada no meio de cavidades com forte potencial eletrostático positivo,
coordenados pela seqüência típica do sítio ativo dessa classe de enzimas (HCX
5
R, Tonks,
2006). No domínio 1 (D1) essa região corresponde aos aminoácidos 1588 a 1595 e no
domínio 2 (D2 ou pseudo-domínio) essa região corresponde aos aminoácidos 1879 a 1886.
Nos dois domínios, a molécula de tungstato parece estar associada com o nitrogênio amídico
da cavidade onde se encontra. Embora pareça peculiar a presença de um forte inibidor da
enzima em um domínio que não possui atividade catalítica descrita não é de se estranhar a sua
presença nessa localização devido ao alto grau de conservação dos domínios. Muitos pseudo-
domínios de PTP são descritos por possuírem o mesmo padrão de enovelamento dos domínios
funcionais, mas a ausência de resíduos importantes no sítio ativo são críticos para a atividade.
Na PTP LAR (uma PTP do tipo clássica receptor de membrana – como a PTPσ) somente duas
mutações pontuais são necessárias para a conversão de um pseudo-domínio inativo para um
domínio ativo (Nam et al, 1999), o mesmo se dando para PTPα, onde duas mutações são
suficientes para um aumento da atividade nos mesmo níveis de D1 (Buist et al, 1999). Porém,
no caso da PTPσ, ambos os domínios possuem a mesma seqüência dentro do sítio ativo
(HCSAGVGR) o que poderia explicar a presença do tungstato nos dois domínios. Não foi
testada a capacidade catalítica dos dois domínios separadamente e por isso nada podemos
afirmar a respeito da funcionalidade desse peseudo-domínio.
A proteína tirosino fosfatase IA-2 é o principal antígeno de diabetes tipo-1 que ocorre
associado à destruição de células β pancreáticas pela resposta imune. É um receptor de
membrana do tipo I que possui um domínio extracelular N-teminal glicosilado, uma região
Discussão
109
transmembrana e um único domínio citoplasmático (Kim et al, 2007). Seu domínio
intracelular do tipo tirosina fosfatase é descrito como sendo um pseudodomínio inativo. A
estrutura cristalográfica da PTP-IA2 foi resolvida e a sua estrutura inédita depositada na base
de dados protein data bank sob o código de acesso 2I1Y.pdb (figura 42).
A comparação da estrutura inédita da PTP-IA2 (cujo domínio PTP é inativo) com o
domínio 1 da PTPσ (ativo) mostra que as duas estruturas possuem o mesmo padrão de
enovelamento. Porém, como discutido anteriormente para o peseudodomínio da PTPσ, uma
simples mutação pontual é capaz de promover drásticas alterações na atividade catalítica
dessas enzimas, como é o caso da PTPα (V555Y
e E690D, Buist et al, 1999) e LAR (L1644Y
e E1779D, Nam et al, 1999). Como pode ser observado no alinhamento de seqüência dessas
duas proteínas, a PTP-IA2 apresenta uma substituição no sítio ativo que pode ser a
responsável pela perda de sua atividade catalítica (A por D dentro da seqüência típica do sítio
ativo, ver figura 20 em Material e Métodos). Essa diferença pode ser observada na figura 47,
onde é mostrado um detalhe da sobreposição do sítio ativo dessas duas enzimas.
Figura 47. Sobreposição do sítio ativo das PTP sigma e IA-2. Em rosa, está representada o
sítio ativo da PTPσ e em verde o sítio ativo da PTP-IA2.
Discussão
110
A resolução da estrutura da PTP-IA2, inédita durante o momento do seu depósito,
fornece acesso a detalhes estruturais importantes sobre essa enzima que podem ser
posteriormente utilizados em estudos implicando o envolvimento dessa proteína com
respostas auto imunes que estão associadas a destruição de células β em diabetes tipo-I. Essas
informações estruturais também podem ser utilizadas no desenvolvimento de fármacos e no
desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico dessa doença.
Sabe-se que a função das proteínas tirosina fosfatase atuam não só como um inibidor
da sinalização dependente de fosfotirosinas, em contraponto a atividade das proteínas tirosina
cinases, mas cada vez mais tem se entendido o papel dessas proteínas como reguladores
positivos de funções celulares, muitas vezes associados a doenças (Tonks, 2006). A
caracterização estrutural e funcional de membros dessa família pode contribuir com o
aumento do conhecimento do seu mecanismo de funcionamento, podendo levar à contribuição
significativa na contenção de várias patologias.
Referências
Referências bibliográficas
112
Abbate, E.A., Voitenleitner, C. e Botchan, M.R. (2006) Structure of the papillomavirus DNA-
tethering complex E2:Brd4 and a peptide that ablates HPV chromosomal association.
Mol Cell. 24, 877-889.
Abbate, E.A.; Berger, J.M. e Botchan, M.R. (2004) The X-ray structure of the papillomavirus
helicase in complex with its molecular matchmaker E2. Genes Dev. 18, 1981–1996.
Adams, P.D., Grosse-Kunstleve, R.W., Hung, L.-W., Ioerger, T.R., McCoy, A.J., Moriarty,
N.W., Read, R.J., Sacchettini, J.C., Sauter, N.K. e Terwilliger, T.C. (2002). PHENIX:
building new software for automated crystallographic structure determination. Acta
Cryst. D58, 1948-1954.
Ahmad, S. e Sarai, A. (2005) PSSM-based prediction of DNA binding sites in proteins BMC
Bioinformatics 6, 33-39.
Ahmad, S., Gromiha, M.M. e Sarai, A. (2004) Analysis and prediction of DNA-binding
proteins and their binding residues based on composition, sequence and structural
information. Bioinformatics 20, 477–486
Alonso, A., Sasin, J., Bottini, N., Friedberg, I., Friedberg, I., Osterman, A., Godzik, A.,
Hunter, T., Dixon, J e Mustelin, T. (2004) protein tyrosine phosphatases and the human
genome. Cell. 117, 699-711.
Alvarado, J., Udupi, R., Smith, D., Koss, J., Wasserman, S.R., Ozyurt, S., Atwell, S., Powell,
A., Kearins, M.C., Rooney, I., Maletic, M., Bain, K.T., Freeman, J.C., Russell, M.,
Thompson, D.A., Sauder, J.M., Burley, S.K. e Almo, S.C. (2006) Crystal Structure Of
The Phosphatase Domains Of Human Ptp Sigma. A ser publicado.
Avery, O.T., MacLeod, C. e McCarty, M. (1944) Studies on the chemical nature of the
substance inducing transformation of pneumococcal types. J. Exp. Biol. 79, 137-158.
Begovich, A.B., Carlton, V.E., Honigberg, L.A., Schrodi, S.J., Chokkalingam, A.P.,
Alexander, H.C., Ardlie, K.G., Huang, Q., Smith, A.M., Spoerke, J.M., Conn, M.T.,
Chang, M., Chang, S.Y., Saiki, R.K., Catanese, J.J., Leong, D.U., Garcia, V.E.,
McAllister, L.B., Jeffery, D.A., Lee, A.T., Batliwalla, F., Remmers, E., Criswell, L.A.,
Seldin, M.F., Kastner, D.L., Amos, C.I., Sninsky, J.J. e Gregersen, P.K. (2004) A
missense single-nucleotide polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine
phosphatase (PTPN22) is associated with rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet. 75,
330-337.
Berendsen, H. J. C., van der Spoel, D. e van Drunen, R. (1995) GROMACS: A message-
passing parallel molecular dynamics implementation. Comp. Phys. Comm. 91, 43–56.
Bergfors T. (2003) Seeds to crystals. J Struct Biol. 142, 66-76.
Referências bibliográficas
113
Bonanno, J.B., Almo, S.C., Bresnick, A., Chance, M.R., Fiser, A., Swaminathan, S., Jiang, J.,
Studier, F.W., Shapiro, L., Lima, C.D., Gaasterland, T.M., Sali, A., Bain, K., Feil, I.,
Gao, X., Lorimer, D., Ramos, A., Sauder, J.M., Wasserman, S.R., Emtage, S., D'Amico,
K.L. e Burley, S.K. (2005) New York-Structural GenomiX Research Consortium
(NYSGXRC): a large scale center for the protein structure initiative. J Struct Funct
Genomics. 6, 225-232.
Bottini, N., Musumeci, L., Alonso, A., Rahmouni, S., Nika, K., Rostamkhani, M.,
MacMurray, J., Meloni, G.F., Lucarelli, P., Pellecchia, M., Eisenbarth, G.S., Comings,
D. e Mustelin, T. (2004) A functional variant of lymphoid tyrosine phosphatase is
associated with type I diabetes. Nat Genet. 36, 337-338.
Buist, A., Zhang, Y.L., Keng, Y.F., Wu, L., Zhang, Z.Y. e den Hertog, J. (1999) Restoration
of potent protein-tyrosine phosphatase activity into the membrane-distal domain of
receptor protein-tyrosine phosphatase alpha. Biochemistry 38, 914-922.
Bussiere, D.E., Kong, X., Egan, D.A., Walter, K., Holzman, T.F., Lindh, F., Robins, T. e
Giranda, V.L. (1998) Structure of the E2 DNA-binding domain from human
papillomavirus serotype 31 at 2.4 A. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D54, 1367-
1376.
Cantor, C. R. e Schimmel, P. R. (1980) Biophysical Chemistry Part III: The behavior of
biological macromolecules. W. H. Freeman & Co, Nova Iorque.
Carlton, V.E., Hu, X., Chokkalingam, A.P., Schrodi, S.J., Brandon, R., Alexander, H.C.,
Chang, M., Catanese, J.J., Leong, D.U., Ardlie, K.G., Kastner, D.L., Seldin, M.F.,
Criswell, L.A., Gregersen, P.K., Beasley, E., Thomson, G., Amos, C.I. e Begovich, A.B.
(2005) PTPN22 genetic variation: evidence for multiple variants associated with
rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet. 77, 567-581.
Cicero, D.O.; Nadra, A.D.; Eliseo, T.; Dellarole, M.; Paci, M. e de Prat-Gay, G. (2006)
Structural and thermodynamic basis for the enhanced transcriptional control by the
human papillomavirus strain-16 E2 protein.
Biochemistry 45, 6551–6560.
De Villiers, E.-M; Fauquet, C.; Broker, T.R.; Bernard, H.-U. e Hausen, H.Z. (2004)
Classification of Papillomavirus. Virology 324, 17-27.
Dell, G. e Gaston, K. (2001) Human papillomaviruses and their role in cervical cancer.
Cell.
Mol. Life Sci. 58, 1923-1942.
Dell, G., Wilkinson, K.W., Tranter, R., Parish, J., Brady, R.L. e Gaston, K. (2003)
Comparison of the Structure and DNA-binding Properties of the E2 Proteins from an
Oncogenic and a Non-oncogenic Human Papillomavirus J.Mol.Biol. 334, 979-991.
Djuranovic, D. e Hartmann, B. (2005) Molecular dynamics studies on free and bound targets
of the bovine papillomavirus type I E2 protein: The protein binding effect on DNA and
the recognition mechanism. Byophs. J. 89, 2542-2551.
Referências bibliográficas
114
Djuranovic, D., Oguey, C. e Hartmann, B. (2004). The role of DNA structure and dynamics in
the recognition of bovine papillomavirus E2 protein target sequences. J. Mol. Biol. 339,
785-796.
Doorbar, J. (2005) The papillomavirus life cycle. J. Clin. Virol. 32S, S7-S15.
Doorbar, J. (2006) Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer.
Clin Sci. 110, 525-541.
Ellenberger, T. (1994) Getting a grip on DNA recognition: structures of the basic region
leucine zipper, and the basic region helix-loop-helix DNA binding domains. Curr. Opin.
Struct. Biol. 4, 12-21.
Emsley, P. e Cowtan, K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta
Cryst. D60, 2126-2132.
Faber-Barata, J, Mohana-Borges, R. e Lima, L.M. (2006a) Specificity in DNA recognition by
a peptide from papillomavírus E2 protein. FEBS lett. 580, 1919-1924.
Faber-Barata, J., Patskovsky, Y., Alvarado, J., Smith, D., Koss, J., Wasserman, S.R., Ozyurt,
S., Atwell, S., Powell, A., Kearins, M.C., Maletic, M., Rooney, I., Bain, K.T., Freeman,
M., Russell, J.C., Thompson, D.A., Burley, S.K. e Almo, S.C. - New York Structural,
Genomics Research Consortium (2006b) Crystal Structure Of The Phosphatase Domain
Of Human Ptp Ia- 2. Estrutura depositada na base de dados protein data bank sob o
código de acesso 2I1Y.pdb.
Falconi, M., Santalamazza, A., Eliseo, T., de Prat Gay, G., Cícero, D.O. e Desideri, A. (2007)
Molecular dynamics of the DNA-binding domain of the papillomavirus E2
transcriptional regulator uncover differential properties for DNA target accommodation.
FEBS J. 274, 2385-2395.
Fasman, G.D. (1996) Circular dichroism and conformational analysis of biomolecules.
Plenum Press, NY, London.
Fauman, E.B., Yuvaniyama, C., Schubert, H.L., Stuckey, J.A. e Saper, M.A. (1996) The x-ray
crystal structures of Yersinia Tyrosine Phosphatase with bound tungstate and nitrate. J.
Mol. Biol. 31, 18780-18788.
Ferreiro, D.U. e Prat-Gay, G. (2003) A protein-DNA binding mechanism proceeds through
multi-state or two-state parallel pathways. J. Mol. Biol. 331, 89-99.
Ferreiro, D.U., Dellarole, M., Nadra, A.D. e Prat-Gay, G. (2005) Free energy contributions to
direct readout of a DNA sequence. J. Biol. Chem. 280, 32480-32484.
Ferreiro, D.U., Lima, L.M., Nadra, A.D., Alonso, L.G., Goldbaum, F.A. e Prat-Gay, G.
(2000) Distinctive cognate sequence discrimination, bound DNA conformation, and
Referências bibliográficas
115
binding modes in the E2 C-terminal domain from prototype human and bovine
papillomavirus. Biochemsitry 39, 14692-14701.
Fisher, E.H., Charbonneau, H. e Tonks, N.K. (1991) Protein tyrosine phosphatases: a diverse
family of intracellular and transmembrane enzymes. Science 253, 401-406.
Gauthier, J.M., Dillner, J. e Yaniv, M. (1991) Structural analysis of the human papillomavirus
type 16-E2 transactivator with antipeptide antibodies reveals a high mobility region
linking the transactivation and the DNA-binding domains. Nucleic Acid Res. 19, 7073-
7079.
Gehring, W.J., Qian, Y.Q., Billeter, M., Furunkubo-Tokunaga, M., Otting, G. e Wüthrich, K.
(1994) Homeodomain-DNA recognition. Cell 78, 211-223.
Giranda, V.L. (1998) Structure of the E2 DNA-binding domain from human papillomavirus
serotype 31 at 2.4 A. Acta Crystallogr D Biol. Crystallogr. 54, 1367–1376.
Gorin, A.A., Zhurkin, V.B. e Wilma, K. (1995) B-DNA Twisting Correlates with Base-pair
Morphology J. Mol. Biol, 24734-48 .
Griffith, F. (1928) The significance of pneumococcal types. J. Hyd. 27, 113-159.
Gromiha, M.M., Siebers, J.G., Selvaraj, S., Kono, H. e Sarai, A. (2005) Role of inter and
intramolecular interactions in protein-DNA recognition. Gene 364, 108-113.
Guex, N. e Peitsch, M.C. (1997) SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment
for comparative protein modeling. Electrophoresis 18, 2714–2723.
Härd, T e Lundbäck, T. (1996) Thermodynamics of sequence-specific protein DNA
interactions. Biophys. Chem. 62, 121-139.
Harrison, S.C. e Aggarwal, A.K. (1990) DNA recognition by proteins with the helix-turn-
helix motif. Annu. Rev. Biochem. 59, 933-969.
Havranek, J.J., Duarte, C.M. e Baker, D. (2004) A simple physical model for the prediction
and design of protein-DNA interactions. J Mol Biol. 344, 59-70.
Hedge, R. (2002) The papillomavirus E2 proteins: strucuture, function and biology. Annu.
Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 343-360.
Hedge, R.S. e Androphy, E.J. (1998) Crystal structure of the E2 DNA-binding domain from
human papillomavirus type 16: implications for its DNA binding-site selection
mechanism. J. Mol. Biol. 284, 1479–1489
Referências bibliográficas
116
Hedge, R.S., Wang, A-F., Kim, S-S. e Shapira, M. (1998) Subunit rearrangement
accompanies sequence-specific DNA-binding by the bovine papillomavirus 1 E2
protein. J. Mol. Biol. 276, 797-808.
Hegde, R.S., Grossman, S.R., Laimins, L.A. e Sigler, P.B. (1992) Crystal structure at 1.7 A of
the bovine papillomavirus-1 E2 DNA-binding domain bound to its DNA target. Nature
359, 505-512.
Hershey, A.D. e Chase, M. (1952) Independent functions of viral proteins and of nucleic acids
in the growth of the bacteriophage. J. Gen. Physiol. 36, 39-56.
Hines, C.S., Meghoo, C., Shetty, S., Biburger, M., Brenowitz, M. e Hedge, H. (1998) DNA
structure and flexibility in the sequence-specific binding of papillomavirus E2 proteins.
J. Mol. Biol. 276, 809-818.
Hizver, J., Rozenberg, H., Frolow, F., Rabinovich, D. e Shakked, Z. (2001) DNA bending by
an adenine--thymine tract and its role in gene regulation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,
8490-8495.
Hooley, E.; Fairweather, V.; Clarke, A.R.; Gaston, K. e Brady, R.L. (2006) The recognition of
local DNA conformational by the human papillomavirus type 6 E2 protein. Nucleic
Acids Res. 14, 3897-3908.
Howley, P.M. (1996) Papillomaviridae: the viruses and their replicarion. Em Fields, B.N.,
Knipe, D.M., Howley, P.M. editors. Virology, vol 2, Philadelphia: Lippincott-
Hwang, S., Gou, Z. e Kuznetsov, I.B. (2007) DP-Bind: a web server for sequence-based
prediction of DNA-binding residues in DNA-binding proteins. Bioinformatics 23, 634-
636.
Jayaram, B e Jain, T. (2004) The role of water in protein-DNA recognition. Annu. Rev.
Biomol. Struct. 33, 343-361.
Kelly, S. M., Jess, T. J. e Price, N. C. (2005) How to study proteins by circular dichroism.
Biochim. Biophys. Acta. 1751, 119-139.
Kim, S.J., Jeong, D.G., Jeong, S.K., Yoon, T.S. e Ryu, S.E. (2007) Crystal structure of the
major diabetes autoantigen insulinoma-associated protein 2 reveals distinctive immune
epitopes. Diabetes 56, 41-48.
Kim, S.S, Tam, J.K., Wang, A.F. e Hedge, R.S. (2000) The structural basis of DNA target
discrimination by papillomavirus E2 proteins. J. Biol. Chem. 275, 31245-31254.
Kim, Y., Geiger, J.H., Hahn, S. e Sigler, P.B. (1993) Crystal structure of a yeast TBP/TATA-
box complex. Nature 365, 512-519.
Referências bibliográficas
117
Kristjansdottir, K. e Rudolph, J. (2004) Cdc25 phosphatases and câncer. Chem. Biol. 11,
1043-1051.
Kyogoku, C., Langefeld, C.D., Ortmann, W.A., Lee, A., Selby, S., Carlton, V.E., Chang, M.,
Ramos, P., Baechler, E.C., Batliwalla, F.M., Novitzke, J., Williams, A.H., Gillett, C.,
Rodine, P., Graham, R.R., Ardlie, K.G., Gaffney, P.M., Moser, K.L., Petri, M.,
Begovich, A.B., Gregersen, P.K. e Behrens, T.W. (2004) Genetic association of the
R620W polymorphism of protein tyrosine phosphatase PTPN22 with human SLE. Am J
Hum Genet. 75, 504-507.
Lakowics, J.R. (1999) Principles of fluorescence spectroscopy. Kluwer academic/ Plenum
publishers, New York.
Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. e Thornton, J.M. (1993) PROCHECK: a
program to check the stereochemical quality of protein structures. J. App. Cryst. 26 283-
291.
Lavery, R. (2006) Recognizing DNA. Q Rev Biophys. 38, 339-344.
Lavery, R. e Sklenar, H. (1988). The definition of generalized helicoidal parameters and of
axis curvature for irregular nucleic-acids. J. Biomol. Struct. Dyn. 6, 63-91.
Lewin, B. (2000) In Genes VII. Oxford University Press, Nova York, eds.
Lewis, H. e Gaston, K. (1999) Magnesium íons enhance the transfer of human papillomavirus
E2 protein from non specific to specific binding sites. J. Mol. Biol. 294, 885-896.
Liang, H.; Petros, A.M.; Meadows, R.P.; Yoon, H.S.; Egan, D.A.; Walter, K.; Holzman, T.F.;
Robins, T. e Fesik, S.W. (1996) Solution structure of the DNA-binding domain of a
human papillomavirus E2 protein: evidence for flexible DNA-binding regions.
Biochemistry 35, 2095–2103.
Lima L. M. e Prat-Gay, G. (1997) Conformational changes and stabilization induced by
ligand binding in the DNA-binding domain of the E2 protein from human
papilomavírus. J. Biol. Chem. 272, 19295-19303.
Lima L. M. e Silva, J. L. (2004) Positive contribution of hydration on DNA binding by E2c
protein from papillomavirus. J. Biol. Chem. 279, 47968-47974.
Lima, L. M., Foguel, D. & Silva, J. L. (2000) DNA tightens the dimeric DNA-binding domain
of human papillomavirus E2 protein without changes in volume. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 97, 14289–14294.
Lindahl, E., Hess, B. e van der Spoel, D. (2001) Gromacs 3.0: A package for molecular
simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod. 7, 306–317.
Referências bibliográficas
118
Lu, X.J. e Olson, W.K. (2003). 3DNA: a software package for the analysis, rebuilding and
visualization of three-dimensional nucleic acid structures, Nucleic Acids. Res. 31, 5108-
5121.
Lundblad, J. R., Laurance, M. e Goodman, R. H. (1996) Fluorescence polarization analysis of
protein-DNA and protein-protein interactions. Mol. Endocrinol. 10, 607-612.
Luscombe, N.M., Laskowski, R.A. e Thorton, J.M. (2001) Amino-acid-base interactions: a
three-dimensional analysis of protein-DNA interactiosn at an atomic level. Nucleic Acid
Res. 29, 2860-2874.
Macgregor, R.B. e Poon, G.M.K. (2003) The DNA double helix fifty years on. Comput Biol
Chem. 27, 461-467.
Mandel-Gutfreund, Y., Schueler, O. e Margalit, H. (1995) Comprehensive analysis of
hydrogen bonds in regulatory protein DNA-complexes: in search of common principles.
J. Mol. Biol. 253, 370-382.
Mattews, B.W. (1988) No code for recognition. Nature 335, 294-295.
McBride, A.A., Romanczuk, H. e Howley, P.M. (1991) The papillomavirus E2 regulatory
proteins. J. Biol. Chem. 266, 18411-18414.
McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Storoni, L.C. & Read, R.J. (2005). Likelihood-
enhanced fast translation functions. Acta Cryst D61, 458-464.
McLaughlin, W.A. e Berman, H.M. (2003) Statistical models for discerning protein structures
containing the DNA-binding helix-turn-helix motif. J Mol Biol. 330, 43-55.
Mirny, L.A. e Gelfand, M.S. (2002) Structural analysis of conserved base pairs in
protein_DNA complexes.
Nucleic Acids Res. 30, 1704-1711.
Mohana-Borges, R., Pacheco, A.B., Souza, F.J., Foguel, D., Almeida, D.F., e Silva, J.L.
(2000) LexA repressor forms stable dimers in solution. The role of specific DNA in
tightening protein-protein interactions. J. Biol. Chem. 275, 4708-4712.
Münger, K. e Howley, P.M. (2002) Human papillomavirus immortalization and
transformation functions. Virus Res. 89, 213-228.
Muñoz, N., Catellsagué, X., González, A.B. e Gissman, L. (2006) Chapter 1: HPV in the
etiology of human cancer. Vaccine. 24S3, S1-S10.
Nadra, A.D., Eliseo, T., Mok, Y.K., Almeida, F.C.L., Bycroft, M., Prat-Gay, G. e Cicero, D.
(2004) Solution structure of the HPV-16 E2 DNA binding domain, a transcriptional
regulator with a dimeric β-barrel fold. J. Biomol. NMR. 30, 211-214.
Referências bibliográficas
119
Nam, H.J., Poy, F., Krueger, N.X., Saito, H. e Frederick, C.A..(1999) Crystal structure of the
tandem phosphatase domains of RPTP LAR. Cell 97, 449-457.
Navaza, J. (2001) Implementation of molecular replacement in AMoRe. Acta Crystallogr D
Biol Crystallogr. 57, 1367-72.
Neuvirth, H. , Heinemann, U. , Birnbaum, D. , Tishby, N. e Schreiber, G. (2007) ProMateus--
an open research approach to protein-binding sites analysis. Nucleic Acids Res, 1–6.
Otwinowski, Z. e Minor, W (1997) Processing of X-ray Diffraction Data Collected in
Oscillation Mode. Methods in Enzymology, 276, 307-326.
Otwinowski, Z., Schevitz, R.W., Zhang, R.G., Lawson, C.L., Joachimiak, A., Marmorstein,
R.Q., Luisi, B.F. e Sigler, P.B. (1988) Crystal structure of trp repressor/operator
complex at atomic resolution. Nature. 335, 321-329.
Pabo, C.O. e Sauer, R.T (1992) Transcription factors: structural families and principles of
DNA recognition. Annu Rev Biochem. 61, 1053-1095.
Parish, J.L., Kowalczyk, A., Chen, H.T., Roeder, G.E., Sessions, R. Buckle, M. e Gaston, K.
(2006) E2 Proteins from High- and Low-Risk Human Papillomavirus Types Differ in
Their Ability To Bind p53 and Induce Apoptotic Cell Death. J. Virol. 80, 4580–4590.
Parkin, D.M. e Bray, F. (2006) Chapter 2: The burden of HPV-related cancers. Vaccine 24,
11–25.
Penrose, K.J., Garcia-Alai, M. Prat-Gay, G. e McBride, A.A. (2004) Casein kinase II
phosphorylation-induced conformational switch triggers degradation of the
papillomavirus E2 protein. J. Biol. Chem. 279, 22430-22439.
Potterton, E., Briggs, P., Turkenburg, M. e Dodson, E. (2003) A graphical user interface to the
CCP4 program suite. Acta. Cryst. D59 1131-1137.
Ramagopal, U.A., Dauter, Z., Thirumuruhan, R., Fedorov, E. e Almo, S.C. (2005) Radiation-
induced site-specific damage of mercury derivatives: phasing and implications. Acta
Cryst. D61, 1289-1298.
Raumann, B.E., Rould, M.A., Pabo, C.O. e Sauer, R.T. (1994) DNA recognition by beta-
sheets in the Arc repressor-operator crystal structure. Nature 367, 754-757.
Record, M.T., Lohman, T.M. e Haseth, P. (1976). Ion effects on ligand-nucleic acid
interactions. J. Mol. Biol. 107, 145-158.
Roden, R e Wu, T.C. (2006) How will HPV vaccines affect cervical cancer? Nat. Rev. Cancer
6, 753-763.
Referências bibliográficas
120
Rozenberg, H., Rabinovich, D., Frolow, F., Hegde, R.S. e Shakked, Z. (1998) Structural code
for DNA recognition revealed in crystal structures of papillomavirus E2-DNA targets.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 15194-15199.
Sanders, C.M. e Maitland, N.J. (1994) Kinetic and equilibrium binding studies of the human
papillomavirus type-16 transcription regulatory protein E2 interacting with core
enhancer elements. Nucleic Acid Res. 22, 4890-4897.
Sarai, A. e Kono, H. (2005) Protein-DNA recognition patterns and predictions. Annu. Rev.
Biophys. Biomol. Struct. 34, 379-398.
Schmiedeskamp, M. e Klevit, R.E. (1994) Zinc finger diversity. Curr. Opin. Struct. Biol. 4,
28-35.
Seeman, N.C., Rosenberg, J.M. e Rich, A. (1976) sequence specificity of double helical
nucleic acid by proteins. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 73, 804-808.
Shanahan, H.P., Garcia, M.A. , Jones S. e Thornton J.M. (2004) Identifying DNA binding
proteins using structural motifs and the electrostatic potential. Nucleic Acids Res. 32,
4732-41.
Siu, R., Fladd, C. e Rotin, D. (2007) N-cadherin is an in vivo substrate for protein tyrosine
phosphatase sigma (PTPsigma) and participates in PTPsigma-mediated inhibition of
axon growth. Mol Cell Biol. 27,208-219.
Smyth, D., Cooper, J.D., Collins, J.E., Heward, J.M., Franklyn, J.A., Howson, J.M., Vella, A.,
Nutland, S., Rance, H.E., Maier, L., Barratt, B.J., Guja, C., Ionescu-Tirgoviste, C.,
Savage, D.A., Dunger, D.B., Widmer, B., Strachan, D.P., Ring, S.M., Walker, N.,
Clayton, D.G., Twells, R.C., Gough, S.C. e Todd, J.A. (2004) Replication of an
association between the lymphoid tyrosine phosphatase locus (LYP/PTPN22) with type
1 diabetes, and evidence for its role as a general autoimmunity locus. Diabetes. 53,
3020-3023.
Stanley, M. (2002) Prognostic factors and new therapeutic approaches to cervical cancer.
Virus Res. 89, 241-248.
Stanley, M. (2003) Chapter 17: Genital human papillomavirus infections--current and
prospective therapies. J Natl Cancer Inst Monogr. 31, 117-124.
Talanian, R.V., McKnight, C.J., Rutkowski, R. e Kim, P.S. (1992) Minimum length of a
sequence-specific DNA binding peptide. Biochemistry. 31, 6871-6875.
Thain, A., Webster, K. Emery, D., Clarke, A.R., e Gaston, K. (1997) DNA binding and
bending by the human papillomavirus type 16 E2 protein. Recognition of an extended
binding site. J. Biol. Chem. 272, 8236-8242.
Referências bibliográficas
121
Tjong, H. e Zhou, H.X. (2007) DISPLAR: an accurate method for predicting DNA-binding
sites on protein surfaces Nucleic Acids Res. 35, 1465–1477.
Tonks, N.K. (2006) Protein tyrosine phosphatases: from genes, to function, to disease. Nat
Rev Mol Cell Biol. 7, 833-846.
Trottier, H. e Franco, E.L. (2006) The epidemiology of genital human papillomavirus
infection. Vaccine, 24, 4-15.
Tsuchiya, Y., Kinoshita, K. e Nakamura, H. (2005) PreDs: a server for predicting dsDNA-
binding site on protein molecular surfaces. Bioinformatics 21, 1721-1723.
Vagin, A. e Teplyakov, A (1997) MOLREP: an automated program for molecular
replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025.
Vaguine, A.A., Richelle, J. e Wodak, S.J. (1999) SFCHECK: a unified set of procedures for
evaluating the quality of macromolecular structure-factor data and their agreement with
the atomic model. Acta Cryst. D55, 191-205.
Vang, T., Congia, M., Macis, M.D., Musumeci, L., Orru, V., Zavattari, P., Nika, K., Tautz, L.,
Tasken, K., Cucca, F., Mustelin, T. e Bottini, N. (2005) Autoimmune-associated
lymphoid tyrosine phosphatase is a gain-of-function variant. Nat Genet 37, 1317-1319.
Veeraraghavan, S., Mello, C.C., Androphy, E.J. e Baleja, J.D. (1999) Structural correlates for
enhanced stability in the E2 DNA binding domain from bovine papillomavirus.
Biochemistry 38, 16115-16124.
Verli, H. e Guimaraes, J.A. (2005) Insights into the induced fit mechanism in antithrombin–
heparin interaction using molecular dynamics simulations. J. Mol. Graph. Mod. 24, 203-
212.
Villa, L.L., Ault, K.A., Giuliano, A.R., Costa, R.L., Petta, C.A., Andrade, R.P., Brown, D.R.,
Ferenczy, A., Harper, D.M., Koutsky, L.A., Kurman, R.J., Lehtinen, M., Malm, C.,
Olsson, S.E., Ronnett, B.M., Skjeldestad, F.E., Steinwall, M., Stoler, M.H., Wheeler,
C.M., Taddeo, F.J., Yu, J., Lupinacci, L., Railkar, R., Marchese, R., Esser, M.T., Bryan,
J., Jansen, K.U., Sings, H.L., Tamms, G.M., Saah, A.J. e Barr, E. (2006) Immunologic
responses following administration of a vaccine targeting human papillomavirus Types
6, 11, 16, and 18. Vaccine. 24, 5571-83.
Wang, L e Brown, S.J. (2006) BindN: a web-based tool for efficient prediction of DNA and
RNA binding sites in amino acid sequences Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34,
243–248.
Wang, X., Cao, W. Cao, A. e Lai, L. (2003) Thermodynamic characterization of the folding
coupled DNA binding by the monomeric transcription activator GCN4 peptide. Biophys.
J. 84, 1867-1875.
Referências bibliográficas
122
Watson, J.D. e Crick, F.H.C. (1953a) A structure for deoxyribosenucleic acid. Nature. 171,
737-738.
Watson, J.D. e Crick, F.H.C. (1953b) Genetical implications of the structure of
deoxyribosenucleic acid. Nature. 171, 964-967.
Weinberg, R.L., Veprintsev, D.B. e Fersth, A.R. (2004) Cooperative binding of tetrameric
p53 to DNA. J. Mol. Biol. 341, 1145-1159.
Wheeler, C.M. (2007) Advances in primary and secondary interventions for cervical cancer:
human papillomavirus prophylactic vaccines and testing. Nat. Clin. Prac.t Oncol. 4,
224-35.
Winn, M., Isupov, M. e Murshudov, G.N. (2001) Use of TLS parameters to model anisotropic
displacements in macromolecular refinement. Acta Cryst. D57, 122-133.
Woodman, C.B., Collins, S.I. e Young, L.S. (2007) The natural history of cervical HPV
infection: unresolved issues. Nat. Ver. Cancer. 1, 11-22.
Wright, T.C., Bosch, F.X., Franco, E.L., Cuzick, J., Schiller, J.T. Garnett, G.P. e Meheus, A.
(2006) HPV vaccines and screening in the prevention of cervical cancer; conclusions
from a 2006 workshop of international experts. Vaccine 24S3, S3/251–S3/261.
Yan, C. Terribilini, M., Wu, F., Jernigan, R.L., Dobbs, D. e Honavar, V. (2006) Predicting
DNA-binding sites from amino acid sequence. BMC Bioinformatics, 7, 262.
Yang, J., Liang, X., Niu, T., Meng, W., Zhao, Z e Zhou, G.W. (1998) Crystal Structure of the
Catalytic Domain of Protein-tyrosine Phosphatase SHP-1. J. Biol. Chem. 273, 28199–
28207.
Zhang, Y., Xi, Z., Hedge, R.S., Shakked, Z. e Crothers, D.M. (2004) predicting indirect
readouts effects in protein-DNA interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 8837-
8341.
Zhang, Z.Y., Wang, Y., Wu, L., Fauman, E.B., Stuckey, J.A., Schubert, H.L., Saper e M.A.,
Dixon, J.E. (1994) The Cys(X)5Arg catalytic motif in phosphoester hydrolysis.
Biochemistry. 51, 15266-15270.
Zhou, J., Sun, X.Y., Louis, K. e Frazer, I.H. (1994) Interaction of human papillomavirus
(HPV) type 16 capsid proteins with HPV DNA requires an intact L2 N-terminal
sequence. J Virol. 68, 619-625.
Zimmerman, J.M., e Maher 3
rd
, L.J. (2003) Solution measurement of DNA curvature in
papillomavirus E2 binding sites. Nucleic Acid Res. 31, 5134-5139.
Referências bibliográficas
123
Zwart, P.H., Langer, G.G. e Lamzin, V.S. (2004) Modelling bound ligands in protein crystal
structures. Acta Crystallogr. D60, 2230-2239.
Anexo 1
Lista de reagentes utilizados em ensaios de cristalografia
Tube
#
1.
2.
3.
4.
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46.
47.
48.
Solutions for Crystal Growth
Salt
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
0.1 M Sodium chloride
0.8 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate
1.0 M Ammonium sulfate
1.1 M Sodium malonate pH 7.0
1.0 M Succinic acid pH 7.0
1.0 M Ammonium sulfate
15% v/v Tacsimate pH 7.0
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
0.2 M Calcium chloride dihydrate
Tub e
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41.
42.
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45.
46.
47.
48.
Buffer ◊
0.1 M Citric acid pH 3.5
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Citric acid pH 3.5
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
None - pH 5.6
None - pH 6.9
None - pH 8.2
0.1 M HEPES pH 7.5
None
None
None
None
None
None
None
None
None
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M HEPES pH 7.0
None
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M Citric acid pH 3.5
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
Tub e
#
1.
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4.
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6.
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34.
35.
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39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
Precipitant
2.0 M Ammonium sulfate
2.0 M Ammonium sulfate
2.0 M Ammonium sulfate
2.0 M Ammonium sulfate
2.0 M Ammonium sulfate
2.0 M Ammonium sulfate
3.0 M Sodium chloride
3.0 M Sodium chloride
3.0 M Sodium chloride
3.0 M Sodium chloride
3.0 M Sodium chloride
3.0 M Sodium chloride
0.3 M Magnesium formate dihydrate
0.5 M Magnesium formate dihydrate
0.5 M Magnesium formate dihydrate
0.3 M Magnesium formate dihydrate
1.26 M Sodium phosphate monobasic monohydrate
0.14 M Potassium phosphate dibasic
0.49 M Sodium phosphate monobasic monohydrate
0.91 M Potassium phosphate dibasic
0.056 M Sodium phosphate monobasic monohydrate
1.344 M Potassium phosphate dibasic
1.4 M Sodium citrate tribasic dihydrate
1.8 M Ammonium citrate tribasic pH 7.0
0.8 M Succinic acid pH 7.0
2.1 M DL-Malic acid pH 7.0
2.8 M Sodium acetate trihydrate pH 7.0
3.5 M Sodium formate pH 7.0
1.1 M Ammonium tartrate dibasic pH 7.0
2.4 M Sodium malonate pH 7.0
35% v/v Tacsimate pH 7.0
60% v/v Tacsimate pH 7.0
1.5 M Ammonium sulfate
0.5% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000
1% w/v Polyethylene glycol 3,350
0.5% v/v Jeffamine ED-2001
®
pH 7.0
1% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2,000
0.5% w/v Polyethylene glycol 8,000
2% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 1,500
30% v/v Jeffamine M-600
®
pH 7.0
30% v/v Jeffamine ED-2001
®
pH 7.0
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000
28% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2,000
45% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
Index contains ninety-six unique reagents. To determine the formulation of each reagent, simply read across the page.
◊ Buffer pH is that of a 1.0 M stock prior to dilution
with other reagents components:
pH with HCl or NaOH.
Index
™
HR2-144 Reagent Formulation
HR2-144 Reagent Formulation
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#
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61.
62.
63.
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65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
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78.
79.
80.
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85.
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88.
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92.
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Solutions for Crystal Growth
Salt
0.2 M Calcium chloride dihydrate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium acetate
0.05 M Calcium chloride dihydrate
0.05 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Potassium chloride
0.05 M Ammonium sulfate
None
0.02 M Magnesium chloride hexahydrate
0.01 M Cobalt (II) chloride hexahydrate
0.2 M L-Proline
0.2 M Trimethylamine N-oxide dihydrate
5% v/v Tacsimate pH 7.0
0.005 M Cobalt (II) chloride hexahydrate
0.005 M Nickel (II) chloride hexahydrate
0.005 M Cadmium chloride hydrate
0.005 M Magnesium chloride hexahydrate
0.1 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium sulfate
0.2 M Ammonium sulfate
0.2 M Ammonium sulfate
0.2 M Ammonium sulfate
0.2 M Sodium chloride
0.2 M Sodium chloride
0.2 M Sodium chloride
0.2 M Sodium chloride
0.2 M Lithium sulfate monohydrate
0.2 M Lithium sulfate monohydrate
0.2 M Lithium sulfate monohydrate
0.2 M Lithium sulfate monohydrate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate
0.2 M Sodium malonate pH 7.0
0.2 M Ammonium citrate tribasic pH 7.0
0.1 M Succinic acid pH 7.0
0.2 M Sodium formate
0.15 M DL-Malic acid pH 7.0
0.1 M Magnesium formate dihydrate
0.05 M Zinc acetate dihydrate
0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate
0.1 M Potassium thiocyanate
0.15 M Potassium bromide
Buffer ◊
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.05 M HEPES pH 7.5
0.05 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M HEPES pH 7.0
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BIS-TRIS pH 5.5
0.1 M BIS-TRIS pH 6.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
Precipitant
45% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
45% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
45% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
45% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
45% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
30% v/v Polyethylene glycol monomethyl ether 550
30% v/v Polyethylene glycol monomethyl ether 550
35% v/v Pentaerythritol propoxylate (5/4 PO/OH)
30% v/v Pentaerythritol ethoxylate (15/4 EO/OH)
45% v/v Polypropylene glycol P 400
22% w/v Poly(acrylic acid sodium salt) 5,100
20% w/v Polyvinylpyrrolidone K 15
10% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2,000
10% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000
12% w/v Polyethylene glycol 3,350
17% w/v Polyethylene glycol 10,000
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
25% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol 3,350
15% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol 3,350
15% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol 3,350
20% w/v Polyethylene glycol 3,350
30% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2,000
30% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2,000
Index contains ninety-six unique reagents. To determine the formulation of each reagent, simply read across the page.
◊ Buffer pH is that of a 1.0 M stock prior to dilution
with other reagents components:
pH with HCl or NaOH.
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#
49.
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55.
56.
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72.
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77.
78.
79.
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81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
Tube
#
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
Index
™
HR2-144 Reagent Formulation
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A1.
A2.
A3.
A4.
A5.
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A8.
A9.
A10.
A11.
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B1.
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B3.
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B6.
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B11.
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C10.
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C12.
D1.
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D6.
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34 Journey
Aliso Viejo, CA 92656-3317 U.S.A.
Tel: (949) 425-1321 • Fax: (949) 425-1611
E-mail: [email protected]
Website: www.hamptonresearch.com
© 2000-2007 Hampton Research Corp. all rights reserved
Printed in the United States of America. This guide or
parts thereof may not be reproduced in any form without
the written permission of the publishers.
Solutions for Crystal Growth
Salt
0.02 M Calcium chloride dihydrate
None
None
None
0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
None
0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium acetate
None
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate
0.2 M Calcium chloride dihydrate
0.2 M Ammonium sulfate
None
0.2 M Lithium sulfate monohydrate
0.2 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Ammonium sulfate
0.2 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Sodium acetate trihydrate
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Calcium chloride dihydrate
None
0.2 M Ammonium acetate
0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate
0.2 M Sodium acetate trihydrate
None
0.2 M Ammonium sulfate
0.2 M Ammonium sulfate
None
None
None
None
None
None
None
None
None
None
0.05 M Potassium phosphate monobasic
None
None
0.2 M Zinc acetate dihydrate
0.2 M Calcium acetate hydrate
None
None
Tub e
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A1.
A2.
A3.
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A10.
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Buffer ◊
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
None
None
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Imidazole pH 6.5
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
None
None
None
None
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M HEPES sodium pH 7.5
None
None
None
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Tris hydrochloride pH 8.5
Tub e
#
A1.
A2.
A3.
A4.
A5.
A6.
A7.
A8.
A9.
A10.
A11.
A12.
B1.
B2.
B3.
B4.
B5.
B6.
B7.
B8.
B9.
B10.
B11.
B12.
C1.
C2.
C3.
C4.
C5.
C6.
C7.
C8.
C9.
C10.
C11.
C12.
D1.
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D3.
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D6.
D7.
D8.
D9.
D10.
D11.
D12.
Precipitant
30% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
0.4 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate
0.4 M Ammonium phosphate monobasic
2.0 M Ammonium sulfate
30% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
1.4 M Sodium acetate trihydrate
30% v/v 2-Propanol
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
1.0 M Ammonium phosphate monobasic
30% v/v 2-Propanol
30% v/v Polyethylene glycol 400
28% v/v Polyethylene glycol 400
30% w/v Polyethylene glycol 8,000
1.5 M Lithium sulfate monohydrate
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
20% w/v Polyethylene glycol 8,000
30% v/v 2-Propanol
25% w/v Polyethylene glycol 4,000
30% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
30% v/v Polyethylene glycol 400
20% v/v 2-Propanol
1.0 M Sodium acetate trihydrate
30% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
20% v/v 2-Propanol
30% w/v Polyethylene glycol 8,000
0.8 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate
30% w/v Polyethylene glycol 8,000
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
2.0 M Ammonium sulfate
4.0 M Sodium formate
2.0 M Sodium formate
0.8 M Sodium phosphate monobasic monohydrate
0.8 M Potassium phosphate monobasic
8% w/v Polyethylene glycol 8,000
8% w/v Polyethylene glycol 4,000
1.4 M Sodium citrate tribasic dihydrate
2% v/v Polyethylene glycol 400
2.0 M Ammonium sulfate
20% v/v 2-Propanol
20% w/v Polyethylene glycol 4,000
10% v/v 2-Propanol
20% w/v Polyethylene glycol 4,000
20% w/v Polyethylene glycol 8,000
30% w/v Polyethylene glycol 1,500
0.2 M Magnesium formate dihydrate
18% w/v Polyethylene glycol 8,000
18% w/v Polyethylene glycol 8,000
2.0 M Ammonium sulfate
2.0 M Ammonium phosphate monobasic
Crystal Screen (DeepWell Block) contains forty-eight unique reagents beginning at position A1.
To determine the formulation of each reagent, simply read across the page.
◊ Buffer pH is that of a 1.0 M stock prior to dilution with
other reagent components: pH with HCl or NaOH.
Crystal Screen HT
™
HR2-130 Reagent Formulation
Crystal Screen 2 HT
™
HR2-130 Reagent Formulation
Tube
#
E1.
E2.
E3.
E4.
E5.
E6.
E7.
E8.
E9.
E10.
E11.
E12.
F1.
F2.
F3.
F4.
F5.
F6.
F7.
F8.
F9.
F10.
F11.
F12.
G1.
G2.
G3.
G4.
G5.
G6.
G7.
G8.
G9.
G10.
G11.
G12.
H1.
H2.
H3.
H4.
H5.
H6.
H7.
H8.
H9.
H10.
H11.
H12.
Salt
2.0 M Sodium chloride
0.5 M Sodium chloride
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
None
None
2.0 M Ammonium sulfate
None
None
1.5 M Sodium chloride
None
0.2 M Sodium chloride
0.01 M Cobalt (II) chloride hexahydrate
0.1 M Cadmium chloride hydrate
0.2 M Ammonium sulfate
0.2 M Potassium sodium tartrate tetrahydrate
0.5 M Ammonium sulfate
0.5 M Sodium chloride
None
0.01 M Iron (III) chloride hexahydrate
None
None
0.1 M Sodium phosphate monobasic monohydrate
0.1 M Potassium phosphate monobasic
None
1.6 M Ammonium sulfate
0.05 M Cesium chloride
0.01 M Cobalt (II) chloride hexahydrate
0.2 M Ammonium sulfate
0.01 M Zinc sulfate heptahydrate
None
0.5 M Ammonium sulfate
None
None
0.1 M Sodium chloride
None
0.05 M Cadmium sulfate hydrate
None
None
None
None
0.2 M Magnesium chloride hexahydrate
None
0.01 M Nickel (II) chloride hexahydrate
1.5 M Ammonium sulfate
0.2 M Ammonium phosphate monobasic
None
0.01 M Nickel (II) chloride hexahydrate
0.1 M Sodium chloride
None
None
Tube
#
E1.
E2.
E3.
E4.
E5.
E6.
E7.
E8.
E9.
E10.
E11.
E12.
F1.
F2.
F3.
F4.
F5.
F6.
F7.
F8.
F9.
F10.
F11.
F12.
G1.
G2.
G3.
G4.
G5.
G6.
G7.
G8.
G9.
G10.
G11.
G12.
H1.
H2.
H3.
H4.
H5.
H6.
H7.
H8.
H9.
H10.
H11.
H12.
Buffer ◊
None
None
None
None
None
None
None
None
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
0.1 M MES monohydrate pH 6.5
None
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M HEPES pH 7.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M Tris pH 8.5
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M BICINE pH 9.0
0.1 M BICINE pH 9.0
Tube
#
E1.
E2.
E3.
E4.
E5.
E6.
E7.
E8.
E9.
E10.
E11.
E12.
F1.
F2.
F3.
F4.
F5.
F6.
F7.
F8.
F9.
F10.
F11.
F12.
G1.
G2.
G3.
G4.
G5.
G6.
G7.
G8.
G9.
G10.
G11.
G12.
H1.
H2.
H3.
H4.
H5.
H6.
H7.
H8.
H9.
H10.
H11.
H12.
Precipitant
10% w/v Polyethylene glycol 6,000
0.01 M Hexadecyltrimethylammonium bromide
25% v/v Ethylene glycol
35% v/v 1,4-Dioxane
5% v/v 2-Propanol
1.0 M Imidazole pH 7.0
10% w/v Polyethylene glycol 1,000
10% w/v Polyethylene glycol 8,000
10% v/v Ethanol
2.0 M Sodium chloride
30% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
1.0 M 1,6-Hexanediol
30% v/v Polyethylene glycol 400
30% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2,000
2.0 M Ammonium sulfate
1.0 M Lithium sulfate monohydrate
2% v/v Ethylene imine polymer
35% v/v tert-Butanol
10% v/v Jeffamine M-600
®
2.5 M 1,6-Hexanediol
1.6 M Magnesium sulfate heptahydrate
2.0 M Sodium chloride
12% w/v Polyethylene glycol 20,000
10% v/v 1,4-Dioxane
30% v/v Jeffamine M-600
®
1.8 M Ammonium sulfate
30% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000
25% v/v Polyethylene glycol monomethyl ether 550
1.6 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 6.5
30% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
10% w/v Polyethylene glycol 6,000
5% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
20% v/v Jeffamine M-600
®
1.6 M Ammonium sulfate
2.0 M Ammonium formate
1.0 M Sodium acetate trihydrate
70% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
4.3 M Sodium chloride
10% w/v Polyethylene glycol 8,000
8% v/v Ethylene glycol
20% w/v Polyethylene glycol 10,000
3.4 M 1,6-Hexanediol
25% v/v tert-Butanol
1.0 M Lithium sulfate monohydrate
12% v/v Glycerol
50% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
20% v/v Ethanol
20% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 2,000
20% v/v Polyethylene glycol monomethyl ether 550
2.0 M Magnesium chloride hexahydrate
2% v/v 1,4-Dioxane
10% w/v Polyethylene glycol 20,000
◊ Buffer pH is that of a 1.0 M (0.5 M for MES) stock prior to
dilution with other reagent components:
pH with HCl or NaOH.
Crystal Screen 2 (DeepWell Block) contains forty-eight unique reagents beginning at position E1.
To determine the formulation of each reagent, simply read across the page.
34 Journey
Aliso Viejo, CA 92656-3317 U.S.A.
Tel: (949) 425-1321 • Fax: (949) 425-1611
E-mail: [email protected]
Website: www.hamptonresearch.com
© 2000-2007 Hampton Research Corp. all rights reserved
Printed in the United States of America. This guide or
parts thereof may not be reproduced in any form without
the written permission of the publishers.
Solutions for Crystal Growth
Wizard I random s
p
arse matrix cr
y
stallization screen - technical sheet
Formulations:
(
Patent No. 6,267,935
)
crystallant buffer (0.1 M) salt (0.2 M)
1 20% (w/v) PEG-8000 CHES pH 9.5 none 1
2 10% (v/v) 2-propanol HEPES pH 7.5 NaCl 2
3 15% (v/v) ethanol CHES pH 9.5 none 3
4 35% (v/v) 2-methyl-2,4-pentanediol imidazole pH 8.0 MgCl
2
4
5 30% (v/v) PEG-400 CAPS pH 10.5 none 5
6 20% (w/v) PEG-3000 citrate pH 5.5 none 6
7 10% (w/v) PEG-8000 MES pH 6.0 Zn(OAc)
2
7
8 2.0 M (NH
4
)
2
SO
4
citrate pH 5.5 none 8
9 1.0 M (NH
4
)
2
HPO
4
acetate pH 4.5 none 9
10 20% (w/v) PEG-2000 MME Tris pH 7.0 none 10
11 20% (v/v) 1,4-butanediol MES pH 6.0 Li
2
SO
4
11
12 20% (w/v) PEG-1000 imidazole pH 8.0 Ca(OAc)
2
12
13 1.26 M (NH
4
)
2
SO
4
cacodylate pH 6.5 none 13
14 1.0 M sodium citrate cacodylate pH 6.5 none 14
15 10% (w/v) PEG-3000 imidazole pH 8.0 Li
2
SO
4
15
16 2.5 M NaCl Na/K phosphate pH 6.2 none 16
17 30% (w/v) PEG-8000 acetate pH 4.5 Li
2
SO
4
17
18 1.0 M K/Na tartrate imidazole pH 8.0 NaCl 18
19 20% (w/v) PEG-1000 Tris pH 7.0 none 19
20 0.4 M NaH
2
PO
4
/1.6 M K
2
HPO
4
imidazole pH 8.0 NaCl 20
21 20% (w/v) PEG-8000 HEPES pH 7.5 none 21
22 10% (v/v) 2-propanol Tris pH 8.5 none 22
23 15% (v/v) ethanol imidazole pH 8.0 MgCl
2
23
24 35% (v/v) 2-methyl-2,4-pentanediol Tris pH 7.0 NaCl 24
25 30% (v/v) PEG-400 Tris pH 8.5 MgCl
2
25
26 10% (w/v) PEG-3000 CHES pH 9.5 none 26
27 1.2 M NaH
2
PO
4
/0.8 M K
2
HPO
4
CAPS pH 10.5 Li
2
SO
4
27
28 20% (w/v) PEG-3000 HEPES pH 7.5 NaCl 28
29 10% (w/v) PEG-8000 CHES pH 9.5 NaCl 29
30 1.26 M (NH
4
)
2
SO
4
acetate pH 4.5 NaCl 30
31 20% (w/v) PEG-8000 phosphate-citrate pH 4.2 NaCl 31
32 10% (w/v) PEG-3000 Na/K phosphate pH 6.2 none 32
33 2.0 M (NH
4
)
2
SO
4
CAPS pH 10.5 Li
2
SO
4
33
34 1.0 M (NH
4
)
2
HPO
4
imidazole pH 8.0 none 34
35 20% (v/v) 1,4-butanediol acetate pH 4.5 none 35
36 1.0 M sodium citrate imidazole pH 8.0 none 36
37 2.5 M NaCl imidazole pH 8.0 none 37
38 1.0 M K/Na tartrate CHES pH 9.5 Li
2
SO
4
38
39 20% (w/v) PEG-1000 phosphate-citrate pH 4.2 Li
2
SO
4
39
40 10% (v/v) 2-propanol MES pH 6.0 Ca(OAc)
2
40
41 30% (w/v) PEG-3000 CHES pH 9.5 none 41
42 15% (v/v) ethanol Tris pH 7.0 none 42
43 35% (v/v) 2-methyl-2,4-pentanediol Na/K phosphate pH 6.2 none 43
44 30% (v/v) PEG-400 acetate pH 4.5 Ca(OAc)
2
44
45 20% (w/v) PEG-3000 acetate pH 4.5 none 45
46 10% (w/v) PEG-8000 imidazole pH 8.0 Ca(OAc)
2
46
47 1.26 M (NH
4
)
2
SO
4
Tris pH 8.5 Li
2
SO
4
47
48 20% (w/v) PEG-1000 acetate pH 4.5 Zn(OAc)
2
48
All formulations are made with ultrapure ASTM Type I water and sterile-filtered stock solutions. Store at 4-25 ºC.
© 2004 Emerald BioSystems, Inc., (888) 780-8535, FAX (206) 780-8549, www.emeraldbiosystems.com
Wizard II random sparse matrix crystallization screen - technical sheet
Formulations:
(
Patent No. 6,267,935
)
crystallant buffer (0.1 M) salt (0.2 M)
1 10% (w/v) PEG-3000 acetate pH 4.5 Zn(OAc)
2
1
2 35% (v/v) 2-methyl-2,4-pentanediol MES pH 6.0 Li
2
SO
4
2
3 20% (w/v) PEG-8000 Tris pH 8.5 MgCl
2
3
4 2.0 M (NH
4
)
2
SO
4
cacodylate pH 6.5 NaCl 4
5 20% (v/v) 1,4-butanediol HEPES pH 7.5 NaCl 5
6 10% (v/v) 2-propanol phosphate-citrate pH 4.2 Li
2
SO
4
6
7 30% (w/v) PEG-3000 Tris pH 7.0 NaCl 7
8 10% (w/v) PEG-8000 Na/K phosphate pH 6.2 NaCl 8
9 2.0 M (NH
4
)
2
SO
4
phosphate-citrate pH 4.2 none 9
10 1.0 M (NH
4
)
2
HPO
4
Tris pH 8.5 none 10
11 10% (v/v) 2-propanol cacodylate pH 6.5 Zn(OAc)
2
11
12 30% (v/v) PEG-400 cacodylate pH 6.5 Li
2
SO
4
12
13 15% (v/v) ethanol citrate pH 5.5 Li
2
SO
4
13
14 20% (w/v) PEG-1000 Na/K phosphate pH 6.2 NaCl 14
15 1.26 M (NH
4
)
2
SO
4
HEPES pH 7.5 none 15
16 1.0 M sodium citrate CHES pH 9.5 none 16
17 2.5 M NaCl Tris pH 7.0 MgCl
2
17
18 20% (w/v) PEG-3000 Tris pH 7.0 Ca(OAc)
2
18
19 1.6 M NaH
2
PO
4
/0.4 M K
2
HPO
4
phosphate-citrate pH 4.2 none 19
20 15% (v/v) ethanol MES pH 6.0 Zn(OAc)
2
20
21 35% (v/v) 2-methyl-2,4-pentanediol acetate pH 4.5 none 21
22 10% (v/v) 2-propanol imidazole pH 8.0 none 22
23 15% (v/v) ethanol HEPES pH 7.5 MgCl
2
23
24 30% (w/v) PEG-8000 imidazole pH 8.0 NaCl 24
25 35% (v/v) 2-methyl-2,4-pentanediol HEPES pH 7.5 NaCl 25
26 30% (v/v) PEG-400 CHES pH 9.5 none 26
27 10% (w/v) PEG-3000 cacodylate pH 6.5 MgCl
2
27
28 20% (w/v) PEG-8000 MES pH 6.0 Ca(OAc)
2
28
29 1.26 M (NH
4
)
2
SO
4
CHES pH 9.5 NaCl 29
30 20% (v/v) 1,4-butanediol imidazole pH 8.0 Zn(OAc)
2
30
31 1.0 M sodium citrate Tris pH 7.0 NaCl 31
32 20% (w/v) PEG-1000 Tris pH 8.5 none 32
33 1.0 M (NH
4
)
2
HPO
4
citrate pH 5.5 NaCl 33
34 10% (w/v) PEG-8000 imidazole pH 8.0 none 34
35 0.8 M NaH
2
PO
4
/1.2 M K
2
HPO
4
acetate pH 4.5 none 35
36 10% (w/v) PEG-3000 phosphate-citrate pH 4.2 NaCl 36
37 1.0 M K/Na tartrate Tris pH 7.0 Li
2
SO
4
37
38 2.5 M NaCl acetate pH 4.5 Li
2
SO
4
38
39 20% (w/v) PEG-8000 CAPS pH 10.5 NaCl 39
40 20% (w/v) PEG-3000 imidazole pH 8.0 Zn(OAc)
2
40
41 2.0 M (NH
4
)
2
SO
4
Tris pH 7.0 Li
2
SO
4
41
42 30% (v/v) PEG-400 HEPES pH 7.5 NaCl 42
43 10% (w/v) PEG-8000 Tris pH 7.0 MgCl
2
43
44 20% (w/v) PEG-1000 cacodylate pH 6.5 MgCl
2
44
45 1.26 M (NH
4
)
2
SO
4
MES pH 6.0 none 45
46 1.0 M (NH
4
)
2
HPO
4
imidazole pH 8.0 NaCl 46
47 2.5 M NaCl imidazole pH 8.0 Zn(OAc)
2
47
48 1.0 M K/Na tartrate MES pH 6.0 none 48
All formulations are made with ultrapure ASTM Type I water and sterile-filtered stock solutions. Store at 4-25 ºC.
© 2004 Emerald BioSystems, Inc., (888) 780-8535, FAX (206) 780-8549, www.emeraldbiosystems.com
Natrix
™
HR2-116 Reagent Formulation
Tube #
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
Salt
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.01 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.1 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.01 M Magnesium sulfate heptahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.1 M Ammonium sulfate,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.02 M Magnesium chloride hexahydrate
0.1 M Ammonium acetate,
0.005 M Magnesium sulfate heptahydrate
0.1 M Potassium chloride,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.005 M Magnesium sulfate heptahydrate
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.01 M Magnesium sulfate heptahydrate
0.015 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.1 M Potassium chloride,
0.025 M Magnesium chloride hexahydrate
0.04 M Magnesium chloride hexahydrate
0.04 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.01 M Calcium chloride dihydrate
0.01 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.01 M Magnesium sulfate heptahydrate
0.1 M Ammonium acetate,
0.015 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.005 M Magnesium chloride hexahydrate
0.08 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.01 Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Ammonium acetate,
0.01 M Calcium chloride dihydrate
0.08 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.1 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.2 M Ammonium acetate,
0.01 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.05 M Magnesium sulfate hydrate
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.005 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Ammonium chloride,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.1 M Potassium chloride,
0.005 M Magnesium sulfate hydrate
0.1 M Potassium chloride,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.1 M Potassium chloride,
0.01 M Calcium chloride dihydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.025 M Magnesium sulfate hydrate
0.2 M Ammonium acetate,
0.15 M Magnesium acetate tetrahydrate
0.1 M Ammonium acetate,
0.02 M Magnesium chloride hexahydrate
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.1 M Potassium chloride,
0.015 M Magnesium chloride hexahydrate
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.05 M Ammonium acetate,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Potassium chloride,
0.05 M Magnesium chloride hexahydrate
0.025 M Magnesium sulfate hydrate
0.005 M Magnesium sulfate hydrate
0.1 M Potassium chloride,
0.01 M Magnesium chloride hexahydrate
0.2 M Ammonium chloride,
0.01 M Calcium chloride dihydrate
Tube #
1.
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47.
48.
Buffer ◊
0.05 M MES monohydrate pH 5.6
0.05 M MES monohydrate pH 5.6
0.05 M MES monohydrate pH 5.6
0.05 M MES monohydrate pH 5.6
0.05 M MES monohydrate pH 5.6
0.05 M MES monohydrate pH 5.6
0.05 M MES monohydrate pH 6.0
0.05 M MES monohydrate pH 6.0
0.05 M MES monohydrate pH 6.0
0.05 M MES monohydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.0
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M Sodium cacodylate trihydrate pH 6.5
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M HEPES sodium pH 7.0
0.05 M Tris hydrochloride pH 7.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 7.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 7.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 7.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 7.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 8.5
0.05 M Tris hydrochloride pH 8.5
Tube #
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Precipitant
2.0 M Lithium sulfate monohydrate
2.5 M Ammonium sulfate
20% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
10% v/v Polyethylene glycol 400
5% w/v Polyethylene glycol 8,000
20% w/v Polyethylene glycol 8,000
15% v/v 2-Propanol
0.6 M Sodium chloride
10% v/v Polyethylene glycol 400
5% w/v Polyethylene glycol 4,000
1.0 M Lithium sulfate monohydrate
1.8 M Lithium sulfate monohydrate
1.7 M Ammonium sulfate
15% v/v 2-Propanol
5% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
30% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
10% w/v Polyethylene glycol 4,000
1.3 M Lithium sulfate monohydrate
2.0 M Ammonium sulfate
10% v/v 2-Propanol
10% w/v 1,6-Hexanediol
15% v/v Polyethylene glycol 400
10% w/v Polyethylene glycol 4,000
10% w/v Polyethylene glycol 4,000
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
10% w/v Polyethylene glycol 8,000
30% w/v Polyethylene glycol 8,000
1.6 M Lithium sulfate monohydrate
4.0 M Lithium chloride
1.6 M Ammonium sulfate
25% v/v Polyethylene glycol monomethyl ether 550
20% w/v 1,6-Hexanediol
30% w/v 1,6-Hexanediol
15% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
5% v/v Polyethylene glycol 400
10% v/v Polyethylene glycol 400
20% v/v Polyethylene glycol 200
5% w/v Polyethylene glycol 4,000
5% w/v Polyethylene glycol 8,000
1.6 M Ammonium sulfate
10% v/v Polyethylene glycol monomethyl ether 550
5% v/v 2-Propanol
10% v/v (+
/
-)-2-Methyl-2,4-pentanediol
10% w/v Polyethylene glycol 4,000
1.8 M Ammonium sulfate
35% w/v 1,6-Hexanediol
30% v/v Polyethylene glycol 400
30% w/v Polyethylene glycol 4,000
Natrix contains forty-eight unique reagents. To determine the formulation of each reagent, simply read across the page.
◊ Buffer pH is that of a 1.0 M stock prior to dilution with other reagent
components: pH with HCl or NaOH.
34 Journey
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Nucleic Acid Mini Screen
TM
HR2-118 Reagent Formulation
1.
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24.
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
10% v / v MPD
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Printed in the United States of America. This guide or
parts thereof may not be reproduced in any form without
the written permission of the publishers.
Solutions for Crystal Growth
Tu b e
Number
Precipitant
1.
2.
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8.
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40 mM Na Cacodylate pH 5.5
40 mM Na Cacodylate pH 5.5
40 mM Na Cacodylate pH 5.5
40 mM Na Cacodylate pH 5.5
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 6.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
40 mM Na Cacodylate pH 7.0
Tu b e
Number
Buffer
1.
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5.
6.
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8.
9.
10.
11.
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19.
20.
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22.
23.
24.
20 mM Cobalt Hexamine
20 mM Cobalt Hexamine
20 mM Cobalt Hexamine
20 mM Cobalt Hexamine
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
12 mM Spermine tetra-HCl
Tu b e
Number
Polyamine
1.
2.
3.
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5.
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8.
9.
10.
11.
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14.
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20.
21.
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24.
None
80 mM Sodium Chloride
12 mM Sodium Chloride /
80 mM Potassium Chloride
40 mM Lithium Chloride
80 mM Potassium Chloride
80 mM Potassium Chloride
80 mM Sodium Chloride
80 mM Sodium Chloride
80 mM Sodium Chloride /
12 mM Potassium Chloride
12 mM Sodium Chloride /
80 mM Potassium Chloride
80 mM Sodium Chloride
80 mM Potassium Chloride
None
80 mM Potassium Chloride
80 mM Potassium Chloride
80 mM Sodium Chloride
80 mM Sodium Chloride
80 mM Sodium Chloride /
12 mM Potassium Chloride
12 mM Sodium Chloride /
80 mM Potassium Chloride
80 mM Sodium Chloride
80 mM Potassium Chloride
40 mM Lithium Chloride
40 mM Lithium Chloride
None
Tu b e
Number
Monovalent Ion
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
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17.
18.
19.
20.
21.
22.
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20 mM Magnesium Chloride
20 mM Magnesium Chloride
None
20 mM Magnesium Chloride
20 mM Magnesium Chloride
None
20 mM Magnesium Chloride
None
20 mM Magnesium Chloride
None
20 mM Barium Chloride
20 mM Barium Chloride
80 mM Strontium Chloride
20 mM Magnesium Chloride
None
20 mM Magnesium Chloride
None
20 mM Magnesium Chloride
None
20 mM Barium Chloride
20 mM Barium Chloride
80 mM Strontium Chloride /
20 mM Magnesium Chloride
80 mM Strontium Chloride
80 mM Strontium Chloride /
20 mM Magnesium Chloride
Tu b e
Number
Divalent Ion
Nucleic Acid Mini Screen contains twenty-four unique reagents. To determine the formulation of each reagent, simply read across the page.
Anexo 2
Curriculum vitae Joana Faber Barata
134
Curriculum vitae
Joana Faber Barata (Faber-Barata, J.)
Nascimento: 12/11/1976
Naturalidade: Rio de Janeiro
Formação acadêmica / titulação:
Doutorado em Química Biológica, 2003-2007. Instituto de Bioquímica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil, com período sanduíche em Albert
Eisntein College of Medicine, Bronx, Estados Unidos. Orientador: Luis Maurício Trambaioli
da Rocha Lima; Co-orientador: Jérson Lima da Silva. Bolsista da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil.
Mestrado em Química Biológica, 2002-2003. Instituto de Bioquímica Médica, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil. Orientador: Mauro Sola Penna; Co-orientador: Luis
Maurício Trambaioli da Rocha Lima. Bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior, CAPES, Brasil.
Bacharelado em Ciências Biológicas – Modalidade Genética, 1994-2002. Instituto de
Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, UFRJ, Brasil.
Orientação de estudantes:
1. Tatiana Correa Carneiro Lobo - Iniciação Científica – de maio/2002 a agosto/2003
(atualmente aluna de pós-graduação do Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ).
2. Raquel Marchetti - Iniciação Científica – de Julho/2004 – Janeiro/2005
Artigos Publicados
1. A radioassay for phosphofructokinase-1 activity in cell extracts and purified enzyme.
Mauro Sola-Penna, Ana Cristina dos Santos, Gutemberg G. Alves, Tatiana El-Bacha,
Joana Faber-Barata, Monica F. Pereira, Fredson C. Serejo, Andrea T. Da Poian and
Martha M. Sorenson. Journal of Biochemical and Biophysical Methods (2002) 50(2-3)
129-140.
2. Opposing effects of two protective osmolytes – trehalose and glycerol – on thermal
inactivation of rabbit muscle 6-phosphofructo-1-kinase. Joana Faber-Barata and
Mauro Sola-Penna. Molecular and Cellular Biochemistry (2005) 269, 203-207.
3. Specificity in DNA recognition by peptide from papillomavirus E2 protein. Joana
Faber-Barata, Ronaldo Mohana-Borges e Luis Mauricio Lima. (2006) FEBS let.,
580, 1919-1924.
4. Zancan, P., Marinho-Carvalho, M. M., Faber-Barata, J., Dellias, J.M. e Sola-Penna,
M. (2007) ATP and fructose-2,6-bisphosphate regulate skeletal muscle key glycolytic
enzyme 6-phosphofructo-1-kinase through modulation of the enzyme oligomeric
conformation: a study of enzyme denaturation. Submetido para publicação.
5. Zancan, P., Almeida, F.V.R., Faber-Barata, J. e Sola-Penna, M. (2007) ATP and
fructose-2,6-bisphosphate regulate skeletal muscle key glycolytic enzyme 6-
phosphofructo-1-kinase through modulation of the enzyme oligomeric conformation:
an enzyme inactivation study. Submetido para publicação.
(3 manuscritos em preparação)
Comunicações em congresso:
11 comunicações em congressos nacionais e 2 comunicações em congressos internacionais
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
