( PDF ) Diagnóstico de neurotoxoplasmose em pacientes HIV-1 por PCR em tempo real em LCR

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FÁBIO LUÍS NASCIMENTO NOGUI

Diagnóstico de neurotoxoplasmose em pacientes HIV-1 por

PCR em Tempo Real em LCR

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina para obtenção do título de

Mestre em Doenças Infecciosas e

Parasitárias.

São Paulo

2006

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RESUMO

Encefalite causada por Toxoplasma gondii é a causa mais freqüente de

lesão em Sistema Nervoso Central no paciente com síndrome da imunodeficiência

adquirida (aids) (LUFT et al, 1992). Toxoplasma pode infectar qualquer célula

cerebral. Portanto, a clínica da neurotoxoplasmose (NT) não é específica e pode

incluir sinais e sintomas focais ou não de disfunção do sistema nervoso central. A

apresentação clínica varia de uma apresentação insidiosa, que envolve semanas,

a um estado confusional agudo ou mesmo fulminante. A toxoplasmose ocorre em

estágios avançados da doença e a ausência de anticorpos anti-toxoplasma pelo

método da imunofluorescência não exclui o diagnóstico (PORTER et al, 1992).

O tratamento geralmente é baseado no diagnóstico presuntivo e a terapia

padrão é a combinação de sulfadiazina, pirimetamina e leucovorim (LUFT et al,

1992).

Após o inicio da terapia específica, a resposta clínica e radiológica é

utilizada como confirmação diagnóstica. Há uma grande dificuldade de métodos

diagnósticos acurados para confirmação dos casos.

O objetivo do presente estudo é apresentar um método para detecção do

DNA de T.gondii por PCR-Multiplex em tempo real.

Resultados: Entre as 51 amostras de líquores colhidos, obtivemos uma

sensibilidade de 68,8%, especificidade de 100%, valor preditivo positivo de 100%

e um valor preditivo negativo de 87,8%.

Conclusão: O PCR em tempo real em LCR apresentou uma elevada

especificidade e sensibilidade em pacientes com suspeita de toxoplasmose

cerebral. Sendo um método pouco invasivo, poderia ser incluído no algoritmo

diagnóstico em pacientes com sida com lesão em SNC.

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COMPOSIÇÃO DA BANCA EXAMINADORA:

1)Dr. Acary Souza Bulle de Oliveira

2)Dr. Marcos Caseiro

3)Dr. Celso Granato

1 – INTRODUÇÃO

1.1 AIDS

A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (aids) foi reconhecida pela

primeira vez como entidade clínica em 1981 (CDC - MMWR, 1981). Em 1983, o

agente etiológico, o vírus da imunodeficiência humana HIV – 1, da família

Retroviridae, da subfamília dos lentivírus (BARRE-SINOUSSE et al,1983) foi

identificado e um teste imunoenzimático (ELISA) foi desenvolvido para identificar

o vírus da imunodeficiência humana. A infecção pelo HIV leva à

imunossupressão progressiva, especialmente da imunidade celular, e a uma

desregulação imunitária. Essa síndrome caracteriza-se pelo desenvolvimento de

infecções oportunistas, neoplasias e outras manifestações que justificam a

elevada mortalidade resultante dessa imunossupressão induzida pelo HIV. As

principais infecções oportunistas descritas são as infecções por micobactérias,

toxoplasmose, infecções fúngicas invasivas, sarcoma de Kaposi e linfoma não-

Hodgkin (SEPKOWITZ, 2001).

Significantes avanços terapêuticos ocorreram nas duas décadas seguintes

com a instituição das profilaxias primária e secundária para infecções

oportunistas, o desenvolvimento de várias drogas anti-retrovirais e o recente

conceito de terapia anti-retroviral altamente potente (TARV OU HAART). Estes

avanços contribuíram significativamente para o excepcional aumento na

sobrevida dos pacientes soropositivos ao HIV (HOGG et al, 1998; PALELLA et

al, 1998).

1.2 TERAPIA ANTI-RETROVIRAL ALTAMENTE POTENTE

A terapia anti-retroviral, quando usada em combinação com três ou mais

drogas (conhecida em nosso meio como terapia anti-retroviral altamente

potente), proporciona um controle da replicação retroviral e uma conseqüente

recuperação da deterioração imune. Atualmente, há um elevado número de

potentes drogas anti-retrovirais disponíveis, que podem ser associadas

(RICHMAN, 2001). Para a maioria dos pacientes infectados pelo HIV,

especialmente para aqueles pacientes virgens de tratamento, essa terapia é

efetiva em reduzir rapidamente os níveis plasmáticos de HIV-RNA; e obter um

aumento gradual de linfócitos auxiliadores CD4+ (RICHMAN, 2001; YENI et al,

2002). Uma vez que os atuais regimes anti-retrovirais disponíveis não

conseguem erradicar o HIV, o objetivo da terapia é a inibição prolongada de

replicação viral para que o paciente consiga manter uma resposta imune efetiva

contra a maioria dos patógenos microbianos ( YENI et al, 2002). As recentes

recomendações do Programa Nacional DST/AIDS do Ministério da Saúde e da

Internacional AIDS Society sugerem que o início do tratamento seja indicado aos

pacientes infectados pelo HIV sintomáticos e àqueles com contagem de linfócitos

CD4+ inferior a 350 células/ml (YENI et al, 2002). A maioria dos esquemas

pressupõe a administração de duas drogas inibidoras da transcriptase reversa

análogas de nucleosídeos (ITRN) associados a um inibidor da transcriptase

reversa não-nucleosídeo (ITRNN) ou a um inibidor da protease (isolado ou

associado no sentido de aumentar sua potência). Introduzida a terapia anti-

retroviral, sua atividade é avaliada pela contagem das células CD4 e pela carga

viral no plasma.

Partindo destas premissas, pacientes que apresentem complicações

neurológicas, sejam elas decorrentes de infecções oportunistas ou da própria

infecção pelo HIV (demência associada ao HIV), são beneficiados pela

introdução da terapia anti-retroviral. A restauração imune, isto é, o resultado do

efeito da TARV, geralmente tem um efeito benéfico nestas complicações

neurológicas. Porém, para algumas doenças neurológicas, como a

leucoencefalopatia multifocal progressiva (LEMP) ou demência associada ao

HIV, esses benefícios não são evidentes. Além da TARV, a terapia especifica da

doença também está indicada. A duração dessa terapia específica é

determinada pelo nível de imunossupressão. Antes de a TARV estar disponível,

o tratamento para infecção aguda tinha que ser acompanhado de profilaxia

secundária pelo resto da vida para evitar recidivas, como nos casos de

toxoplasmose e criptococose do sistema nervoso. A recomendação atual, com o

advento da terapia anti-retroviral altamente potente, é que a profilaxia secundária

pode ser descontinuada se a contagem de células CD4+ apresentar um aumento

significativo e sustentado em números absolutos e percentuais, isto é, se ocorrer

elevação do número de linfócitos auxiliadores acima de 200 células/μl e

permanecer acima deste nível por um período superior a três meses.

1.3 MANIFESTAÇÕES NEUROLÓGICAS NO PACIENTE COM

INFECÇÃO PELO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA

As complicações neurológicas ocorrem em 39 a 70% dos pacientes com

aids (LEVY ET AL, 1985). Há muitas causas de doença neurológica em

pacientes com infecção pelo HIV-1, incluindo infecção primária pelo próprio vírus

HIV, doenças oportunistas e toxicidade pelas drogas. As infecções oportunistas

mais freqüentes são a toxoplasmose cerebral, meningite por criptococos,

leucoencefalopatia multifocal progressiva (LEMP), meningite, tuberculose e

encefalite por citomegalovírus (CMV). Linfoma primário de sistema nervoso

central é ainda uma importante causa de lesão cerebral focal nesses pacientes.

As doenças neurológicas que estão mais diretamente relacionadas ao próprio

HIV são a demência pelo HIV, a mielopatia vacuolar e a neuropatia periférica. O

diagnóstico acurado dessas complicações neurológicas é crucial, pois muitas

dessas complicações são passíveis de tratamento e uma intervenção efetiva

pode levar não só a um aumento da sobrevida como uma melhora da qualidade

de vida.

1.4 TOXOPLASMOSE CEREBRAL NO PACIENTE INFECTADO

PELO VÍRUS HIV

O Toxoplasma gondii é um parasita coccidiano de felinos, podendo afetar

humanos e outros animais de sangue quente como hospedeiros intermediários.

É um protozoário intracelular obrigatório pertencente ao subfilo Apicomplexa,

classe Sporozoa e existe sob três formas evolutivas: o oocisto (que libera o

esporozoíto), o cisto tecidual (que contém e pode liberar o bradizoito) e

taquizoíto (MONTOYA et al, 2000; MONTOYA et al, 2004) (Figura 1).

Milhões de oocistos são liberados nas fezes dos gatos (hospedeiro

definitivo), causando infecção em outros mamíferos, incluindo os seres humanos

(hospedeiro intermediário). A ingestão de cistos teciduais é seguida pela

infecção de células epiteliais intestinais por bradizoítos ou esporozoítos,

respectivamente. Após a transformação em taquizoítos, esses organismos se

disseminam através do corpo pela corrente sangüínea ou pelo sistema linfático.

O parasita se transforma em cistos teciduais, uma vez alcançados os tecidos

periféricos. Essa forma de parasita persiste por toda vida do hospedeiro

(MONTOYA et al, 2000).

Se o sistema imune do hospedeiro está comprometido, os bradizoítos

podem se transformar em taquizoítos e causar destruição tecidual, levando às

manifestações clínicas (DEDICOAT et al, 2005).

A infecção primária no homem é geralmente subclínica, mas em alguns

pacientes a linfoadenopatia cervical ou doença ocular pode estar presente. A

Infecção ocular em pacientes imunocompetentes leva a uma corioretinite aguda

caracterizada por severa inflamação e necrose. Inflamação granulomatosa da

coróide é secundária a retinite necrotizante. Embora raro, taquizoíto e cistos

podem ser vistos na retina. Em pacientes imunocompetentes têm sido relatados,

nas toxoplasmoses agudas, quadro de miocardite e poliomiosite (MONTOYA et

al, 1997). O desenvolvimento de imunidade celular após a infecção aguda pelo

T.gondii resulta no controle, mas não na erradicação da infecção (MONTOYA et

al, 2000).

Em pacientes imunodeprimidos, por outro lado, pode haver dano ao

sistema nervoso central causado pelo T.gondii, caracterizado pelo

desenvolvimento de inúmeros focos de necrose e nódulos microgliais. Áreas de

necrose podem se calcificar e levar a achados radiológicos que são sugestivos,

embora não sejam patognomônicos da doença. Hidrocefalia pode resultar da

obstrução do aqueduto de Sylvius ou do forame de Monro. Taquizoítos e cistos

podem estar dentro ou adjacentes a focos necróticos próximos ou em nódulos da

glia, em regiões perivasculares e em tecidos cerebrais não envolvidos por

alterações inflamatórias. Presença de muitos abscessos cerebrais são

características do acometimento encefálico da toxoplasmose em pacientes

severamente imunocomprometidos e é uma característica especial de indivíduos

com aids. A biópsia cerebral destes pacientes possibilita a identificação de

taquizoitos, o que caracteriza infecção ativa. Nas necropsias de pacientes com

aids e encefalite por toxoplasmose, pode-se notar o envolvimento dos

hemisférios cerebrais, com predileção pelos gânglios da base (LUFT et al, 1983).

Figura 1: Ciclo da Toxoplasmose

O gato (1), hospedeiro definitivo, libera os oocistos (2) sendo possível a infecção de

herbívoros (3) e do homem (4). Adaptado de www.usp.br/coseas

1.4.1 EPIDEMIOLOGIA DA TOXOPLASMOSE

A prevalência da infecção por T.gondii varia, dependendo da localização

geográfica e do grupo populacional. Entre 3% e 67% dos adultos nos Estados

Unidos da América (EUA) têm anticorpos contra T.gondii (MONTOYA et al,

2000). Na Grã-Bretanha, 7,6 a 19,5% da população possuem anticorpos contra

T.gondii (ADES et al, 1993). Em outros países desenvolvidos, como a França,

encontrou-se uma soroprevalência de até 71% entre mulheres grávidas

(JEANNEL et al, 1988). A proporção de adultos com infecção latente por T.gondii

pode alcançar 70-80% em algumas regiões de países em desenvolvimento,

incluindo o sudeste do Brasil (NASCIMENTO et al, 2001). Na África, há uma

grande variação na prevalência de anticorpos, com 34% da população na África

do Sul, 27% em Uganda e Botsuawana, 54% dos doadores de sangue no

Quênia e 75% de seroprevalência na Nigéria (JACOBS et al, 1978; GRIFFIN et

al, 1983; ZUMLA et al, 1991; ONADEKO et al, 1996).

A transmissão para humanos ocorre primariamente pela ingestão de carne

mal cozida que contém cistos teciduais ou pela exposição aos oocistos através

da ingestão de vegetais contaminados, ou diretamente pelo contato com fezes

de gato (MONTOYA ET AL, 2000). Outros modos de transmissão incluem a via

transplacentária, transfusão de sangue e transplante de órgãos.

Em 1983, começaram a ser relatados os primeiros casos de toxoplasmose

em sistema nervoso central em adultos aparentemente saudáveis (LUFT et al,

1983). Neste ano, descreve-se no Lancet dez pacientes da Bélgica, E.U.A. e

Canadá com quadro de encefalite aguda causada por Toxoplasma gondii, no

qual nenhum dos pacientes apresentava condições predisponentes associadas à

toxoplasmose. Dos dez pacientes, nove faleceram. Dois pacientes eram

homossexuais e um era usuário de heroína injetável. Cinco eram provenientes

do Haiti, quatro tinham morado na América do Norte por 2-5 anos e oito

apresentavam importante linfopenia. O diagnóstico foi retardado pelo

desconhecimento que a toxoplasmose poderia causar encefalite necrotizante em

hospedeiro imunocompetente. Com esse grande número de casos, foi enfatizada

a necessidade de incluir a toxoplasmose no diagnóstico diferencial de encefalite

de causa desconhecida. Provavelmente, esta casuística representava a

descrição dos primeiros casos de toxoplasmose cerebral em pacientes com aids,

fato naquele momento desconhecido pelos autores.

A partir das primeiras descrições de pacientes com aids e toxoplasmose

encefálica, pode-se estabelecer uma série de interfaces clínicas como a

ocorrência em pacientes infectados pelo HIV com contagem de linfócitos

auxiliadores (CD4+) inferiores a 100 células/μL (LUFT et al,1992). Em estudo

realizado com 210 pacientes, evidenciou-se que a toxoplasmose cerebral

manifestava-se nos estágios avançados da doença, associada com baixa

contagem de linfócitos auxiliadores, média de 78 células/μl, sendo que 63%

destes pacientes possuiam menos que 100 células/μl e 87% tinham menos que

200 células/μl (DANNEMAN et al, 1991).

A toxoplasmose encefálica em pacientes com aids é quase sempre

causada pela reativação da infecção crônica. A incidência de toxoplasmose

cerebral entre pacientes infectados pelo vírus HIV é proporcional à prevalência

de infecção latente por T.gondii na população geral. Antes do advento da TARV,

um em cada três indivíduos infectados pelo HIV podia desenvolver toxoplasmose

encefálica com a progressiva deterioração imunológica do paciente portador do

HIV na ausência de profilaxia específica (LUFT et al, 1992; GRANT et al, 1990;

ZANGERLE et al, 1991). O risco da toxoplasmose encefálica decresceu após a

introdução de profilaxia primária contra pneumonia por Pneunocystis jirovecii,

com sulfametoxazol e trimetoprim, prevenindo indiretamente a infecção por

T.gondii. Atualmente, dados americanos, que encontram paralelo com os de

outras regiões, demonstram que, graças ao tratamento anti-retroviral potente, a

incidência nos EUA de toxoplasmose cerebral entre pacientes com aids declinou

de 2,1/100 pessoas-ano em 1992 à 0,7/100 pessoas-ano em 1997 (JONES et al,

1999).

No Brasil também houve uma diminuição acentuada dos casos de

toxoplasmose encefálica nos últimos anos. Segundo o Boletim Epidemiológico

da Vigilância Epidemiológica do Estado de São Paulo, a incidência de

toxoplasmose cerebral declinou de 17%, no período de 1980 a 1989, à 10,1%,

no período de 2001 – 2005 (BOLETIM EPIDEMIOLÓGICO, 2005).

1.4.2 PATOGÊNESE

Considera-se que a maior parte das encefalites por toxoplasmose em

pacientes com aids seja decorrente da reativação de infecções pregressas.

A imunidade celular mediada pelas células T, macrófagos e atividade de

citocinas tipo 1 (interleucina [IL]-12 e interferon [IFN]-gama) é necessária para

manter a quiescência da infecção crônica pelo T.gondii (SUBAUSTE et al,

1993). A IL-12 é produzida pelas células apresentadoras de antígenos, como as

células dendríticas e macrófagos. A IL-12 estimula a produção de IFN-gama, o

mais importante mediador da proteção do hospedeiro contra patógenos

intracelulares. IFN-gama estimula a atividade anti-T.gondii , não somente pela

ação dos macrófagos, mas também por células não fagocíticas. A produção de

IL-12 e IFN-gama são estimuladas pelo CD154 (também conhecido como CD40

ligante) em modelos humanos de infecção por T.gondii (SUBAUSTE et al, 2002).

CD 154 (expresso principalmente na atividade das células CD4) atua por induzir

as células dendríticas e macrófagos a secretar IL-12. O Fator de Necrose

Tumoral Alfa (TNF)-alfa é outra citocina essencial para o controle da infecção

crônica pelo T.gondii (YAP et al, 1998).

Os mecanismos pelos quais o HIV induz susceptibilidade às infecções

oportunistas, como toxoplasmose, são provavelmente múltiplos. Entre eles estão

incluídas a depleção de linfócitos CD4+; o prejuízo na produção de IL-2, IL-12 e

IFN-gama e a diminuição da expressão do CD154 em resposta ao T.gondii

(MURRAY et al,1984; SUBAUSTE et al, 2001; SUBAUSTE et al, 2004). Essas

deficiências podem estar relacionadas ao desenvolvimento de toxoplasmose

associada à infecção pelo HIV.

1.4.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

A infecção por T.gondii pode passar despercebida ou causar sinais e

sintomas que variam, dependendo do estado imune do paciente e sua

localização clínica.

A infecção primária em crianças e adultos imunocompetentes (incluindo

mulheres gestantes) é assintomática na maioria dos pacientes. Em

aproximadamente 10% dos casos é autolimitada e não específica, raramente

necessitando de tratamento. A principal manifestação clínica é a linfoadenopatia

isolada cervical ou occipital. Esse linfonodos não são dolorosos, não supuram,

sendo geralmente discretos e podem permanecer aumentados por 4 a 6

semanas. Muito infreqüentemente, miocardite, polimiosite, pneumonite, hepatite

ou encefalite podem atingir indivíduos saudáveis. A infecção aguda por

toxoplasmose durante a gestação é assintomática na maioria das mulheres, já a

toxoplasmose congênita pode apresentar diversas manifestações clínicas que

incluem hidrocefalia, microcefalia, calcificação intracraniana, corioretinite,

estrabismo, amaurose, epilepsia, retardo psicomotor ou mental, petéquia devido

a trombocitopenia e anemia. A tríade clássica de corioretinite, hidrocefalia e

calcificação cerebral não é tão freqüente, embora seja relacionada com a

toxoplasmose congênita. Nenhum dos sinais descritos nos recém-nascidos é

patognomônico de toxoplasmose e pode ser mimetizado por infecção congênita

por outros patógenos, que incluem citomegalovírus, herpes simples, rubéola e

sífilis (SWISHER et al, 1994).

A toxoplasmose associada à aids é tipicamente causada pela reativação

de infecção crônica e manifesta-se principalmente na forma de toxoplasmose

encefálica. Essa doença é a mais importante e prevalente causa de lesão

cerebral focal em pacientes com aids (LUFT et al, 1992).

Caracteristicamente, a toxoplamose encefálica apresenta início subagudo

acompanhado de anormalidades neurológicas e sistêmicas. Esses sinais e

sintomas geralmente estão limitados ao SNC e incluem cefaléia (49-55%), febre

(41-47%), alteração psicomotora ou comportamental (37-38%), confusão (15-

52%), letargia (12-43%), hemiparesia (39-49%), convulsão (24-29%), ataxia

(~30%) e paralisia de nervo craniano (17-28%). Paradoxalmente, cerca de 10%

dos pacientes podem apresentar encefalite difusa sem qualquer lesão focal

visível (SKIEST, 2002). A febre, o nível de consciência e os sinais focais

melhoram entre 2-3 dias a 2-3 semanas após o início do tratamento (ROULLET,

1999). Um estudo prospectivo envolvendo 55 pacientes com diagnóstico de

toxoplasmose encefálica internados no Instituto de Infectologia Emilio Ribas

corroborou estes sinais e sintomas acima descritos (Tabela 1, VIDAL et al,

2004).

Tabela 1: Principais Sinais e Sintomas em 55 Pacientes com neurotoxoplasmose

e aids

Sinais e Sintomas N(%)= 55

Cefaléia

Distúrbio Psicomotor

Hemiparesia

Confusão

Febre

Alteração de consciência

Convulsão

Alteração de nervo craniano

Alteração visual

Ataxia

Meningismo

Náusea, vômitos

Movimentos involuntários

40(73)

28(51)

25(46)

14(26)

11(20)

08(15)

05(09)

04(07)

03(05)

02(04)

Vidal: AIDS Patients Care STDS, Vol 19 (10). October 2005

Destaca-se ainda que muito raramente nos pacientes com aids, a

toxoplasmose pode apresentar-se como uma forma rapidamente fatal de

encefalite difusa (GRAY et al, 1989).

1.4.4 DIAGNÓSTICO

Comumente, em pacientes imunocompetentes, o diagnóstico de

toxoplasmose pode ser estabelecido por detecção direta do parasita ou pela

diferença de títulos de anticorpos específicos pelas sorologias. A toxoplasmose

também pode ser diagnosticada pela demonstração do taquizoíto em biópsias

teciduais ou preparações citológicas de fluídos corpóreos, pelo isolamento de T.

gondii de fluídos corpóreos ou sangue ou pela amplificação de seu DNA. Através

da Reação de Cadeia de Polimerase (PCR), o DNA do T.gondii pode ser

demonstrado no líquido amniótico, cerebroespinhal, lavado broncoalveolar,

ocular, pleural, peritoneal, assim como em sangue periférico e urina (JOHNSON

et al, 1993; GUY et al, 1995, MONTOYA et al, 2002).

1.4.4.1 Sorologia

Os testes sorológicos mais utilizados detectam a presença de anti-T

gondii das classes IgG e IgM. Imonoglubulina G pode ser detectada através do

teste de Sabin-Feldman, imunofluorescência indireta (IFA), aglutinação ou

ensaio imunoenzimático (ELISA) (MONTOYA et al, 2000). Picos dos títulos de

IgG surgem após um e dois meses da infecção, mas permanecem elevados a

vida toda. Embora a IgM normalmente desapareça em poucas semanas ou

meses após a infecção, ela pode permanecer elevada por mais de um ano

(MONTOYA et al, 2000). Diferentes aglutinações são obtidas ao se comparar

títulos do taquizoíto fixado em metanol (antígeno AC) e taquizoíto fixado em

formalina (antígeno HS). A razão entre AC/HS é útil para distinguir infecção

crônica da aguda.

Sorologia para T. gondii é útil para identificar pacientes infectados pelo

HIV com alto risco de desenvolver toxoplasmose. Entre 97% e 100% das

pessoas infectadas pelo HIV com toxoplasmose cerebral possuem IgG anti-T.

gondii (GRANT et al, 1990; NAVIA et al, 1986; LUFT et al, 1984). Porém, a

produção de anticorpos específicos para T.gondii pode estar prejudicada no

paciente imunocomprometido (BENSALEM et al, 2002; SUKTHANA et al, 2000).

Já nos pacientes assintomáticos infectados pelo HIV, a soroprevalência é

de aproximadamente 50%. Um significante aumento na Ig G ocorre durante a

toxoplasmose em atividade em somente 30% dos pacientes e apenas 2% dos

pacientes demonstram alteração nos títulos de IgM durante a infecção cerebral

(LUFT et al, 1992). Por esses motivos, a sorologia não é útil para o diagnóstico

de neurotoxoplasmose em pacientes imunocomprometidos. Em um único estudo

a secreção espontânea in vitro de anticorpos anti- T.gondii em célula

mononuclear de sangue periférico (PBMC), realizada em 69 pacientes com aids,

encontrou uma sensibilidade de 85,4% e especificidade de 92,8% em pacientes

com suspeita de encefalite por toxoplasmose (LANCASCADE et al, 2000).

Outros métodos diagnósticos, como a detecção por microscopia direta do

T.gondii em sangue ou em camundongo infectado, apresentaram baixa

sensibilidade, além de ser um método demorado e considerado de pouca

utilidade na prática clínica (ANTINORI et al, 1997).

1.4.4.2 Estudo do Líquido Cefalorraquiano

O líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com toxoplasmose

encefálica pode revelar discreta pleocitose com predomínio de mononucleares e

hiperproteinorraquia (MONTOYA et al, 2000). Alguns autores sugerem fórmulas

para a detecção da produção intratecal de anticorpos IgG anti- T.gondii,

podendo ser utilizada a seguinte fórmula:

Títulos do Teste LCR Sabin-Feldman X IgG sérica Total

Total IgG LCR X Título do teste sérico

Uma razão maior que 1 indicaria a produção intratecal de anticorpos IgG

anti- T.gondii e confirmaria o diagnóstico de toxoplasmose cerebral (MONTOYA

et al, 2000).

1.4.4.3 Estudo Neuroradiológico

Estudos de imagem cerebral são indispensáveis para diagnóstico e

manejo de pacientes com toxoplasmose encefálica. A tomografia

computadorizada (CT) pode revelar lesões cerebrais hipodensas e focais

envoltas por reforço de contraste, que podem ser múltiplas e bilaterais,

ocorrendo entre 70 e 80% dos pacientes (POST et al, 1985; LEVY et al, 1990).

Essas lesões tendem a envolver os gânglios da base e a junção do hemisfério

corticomedular. A ressonância nuclear magnética (RNM) com ou sem contraste

é o método mais sensível, devido à sua superioridade de resolução, à

capacidade de avaliar em vários planos e à maior capacidade de detectar edema

tecidual (GILMAN, 1998).

Pacientes com uma única lesão, ou nenhuma lesão, visualizada pela CT

devem ser submetidos à RNM para determinar se não há presença de lesões

não visualizadas pela tomografia. Embora a toxoplasmose encefálica possa

ocasionalmente apresentar-se como lesão única na RNM, esse tipo de lesão

deve sugerir um diagnóstico alternativo, como o linfoma primário do sistema

nervoso central (SNC) (CIRCILLO et al, 1990).

Achados na RNM ou CT não são patognomônicos de toxoplasmose

encefálica. Linfoma primário de SNC não pode ser distinguido de

neurotoxoplasmose somente por meio dos critérios de imagem neuroradiológica

(ambos apresentam lesão contrastada com efeito de massa). No entanto, a

presença de hiperatenuação não realçada pela CT e a localização subependimal

sugerem a possibilidade de linfoma.

Novas técnicas de imagem aparentam ser úteis na distinção dessas lesões.

Muitos estudos têm avaliado a utilização do SPECT Tl-201 (“Single Photon

Emission Computerized Tomography - Thallium-201”) para distinguir linfoma

cerebral da toxoplasmose cerebral. O tecido cerebral normal apresenta baixa

captação de Tl-201, no entanto, há um aumento de captação em tumores

cerebrais (D’ AMICO et al, 1997). Por estes métodos, a sensibilidade e a

especificidade encontradas para o diagnóstico de linfoma de SNC variaram de

86% a 100% e de 76 a 100%, respectivamente (O’MALLEY et al, 1994;

LORBERBOYM et al, 1998).

A tomografia emissora de positron Fluoride 18 [18F]-fluoro-2-deoxyglicose

(FDG-PET) é outra técnica de imagem relacionada para diferenciar com acurácia

linfoma de SNC e lesões cerebrais não malignas em pacientes com aids. Com

esta tecnologia, áreas de menor metabolismo de glicose podem ser encontradas

em todos os pacientes com toxoplasmose encefálica e áreas de elevado

metabolismo de glicose são observadas em todos os pacientes com linfoma de

SNC (HOFFMAN et al, 1993; PIERCE et al, 1995).

Figura 2: TC de crânio de paciente com diagnóstico de toxoplasmose cerebral

confirmado por PCR em tempo real

Figura 3: RNM de crânio de paciente com diagnóstico de toxoplasmose cerebral

confirmado por PCR em tempo real

1.4.4.4 Estudo de Cultura

A toxoplasmose pode ser diagnosticada pelo isolamento do T. gondii em

culturas de fluídos corpóreos (sangue, LCR, lavado broncoalveolar) ou biópsia

tecidual em ambiente apropriado. Porém, estudos de isolamento não são úteis

para um rápido diagnóstico, requerendo tempo superior a seis semanas para sua

positivação, além de ser uma técnica dispendiosa e que acarreta riscos de

contaminação dos profissionais.

1.4.4.5 Histopatologia

Biópsia cerebral excisional pode propiciar o diagnóstico definitivo de

toxoplasmose no SNC. Achados variam de reação granulomatosa com gliose e

nódulos microgliais a encefalite necrotizante (NAVIA et al, 1986; FARKASH et al,

1986).

A biópsia cerebral não apresenta sensibilidade de 100% devido a

dificuldades técnicas na obtenção de material e à dificuldade para alcançar áreas

afetadas, além do potencial de complicações associadas ao método. Em estudo

realizado por Antinori et al com 158 pacientes com lesões cerebrais com efeito

de massa, a taxa de morbidade relacionada à biópsia foi de 1,3%. Morte

relacionada à biópsia ocorreu em 3,1% dos pacientes, ocorrendo em média após

14 dias da cirurgia. Todas as mortes resultaram da abordagem estereotáxica.

Quatro ocorreram em pacientes com LPSNC e uma em paciente com vasculite

cerebral. Em um paciente, a biópsia foi complicada por infecção da ferida

cirúrgica e osteomielite. Neste estudo, o risco de complicação relacionada à

biópsia (intra-operatória, morbidade ou mortalidade) foi mais elevada em

pacientes com CD4 inferior a 50 céls/mL (RR 6.26; 95% CI 0.80 a 45.83) ou com

múltiplas lesões com efeito de massa (RR 4.48; 95 % CI 1.93 a 150) (ANTINORI

et al, 1997).

1.4.4.6 Detecção do DNA

A Reação de Cadeia de Polimerase ( PCR) é um método que permite a

amplificação logarítmica de pequenas seqüências de DNA (geralmente de 100 a

600 pares de bases). Para a realização da PCR, utiliza-se uma enzima

termoestável (DNA polimerase) que, na presença de um par de

oligonucleotídeos iniciadores (primers) e dos nucleotídeos que compõem a

molécula de DNA, amplifica a região de interesse a partir de uma pequena

quantidade de DNA.

Entre as principais técnicas resultantes de modificações da PCR,

podemos citar o RT-PCR, nested PCR, multiplex PCR, PCR a partir de primers

randômicos e PCR em tempo real.

O RT-PCR utiliza uma enzima conhecida como transcriptase reversa para

converter uma amostra de RNA em cDNA antes da etapa de amplificação por

PCR, permitindo estudo de vírus de RNA e análises de expressão gênica. O

nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificações com um par de

primers internos aos utilizados na primeira etapa e visa a aumentar a

sensibilidade e especificidade do método. Já o PCR multiplex é uma reação de

amplificação desenhada para detectar múltiplas seqüências-alvos em uma

mesma amostra. PCR a partir de primers randômicos utiliza seqüências curtas

de oligonucleotídeos para amplificar regiões repetitivas do DNA genômico e é

bastante empregado em estudos epidemiológicos. Finalmente, o PCR em tempo

real permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente, em um

sistema fechado, sendo necessário para isto um termociclador que possua

sistema de monitoramento de emissão de fluorescência. Esta técnica é

empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral e

monitoramento de doença residual mínima.

A cinética do PCR em tempo real baseia-se na detecção da amplificação

associada à fluorescência em cada ciclo da reação. Não é baseada na corrida do

gel no final da reação como no PCR convencional e a análise computadorizada é

baseada em cada ciclo da fluorescência. O PCR em tempo real monitora a

fluorescência emitida durante a reação como um indicador do produto de uma

amplificação em cada ciclo do PCR (em tempo real). Quando comparado com o

PCR convencional, o PCR em tempo real apresenta menor risco de reação falso-

positiva (MENOTTI et al, 2003). O risco de falso-positivo resulta da

contaminação com materiais amplificados anteriormente, no caso do PCR em

tempo real esse risco é dramaticamente reduzido, pois não há a necessidade de

abrir o tubo no final da amplificação (COSTA et al, 2000).

O uso do PCR para a detecção de infecção por T.gondii tem sido bastante

utilizado e pode ser útil no diagnóstico de toxoplasmose (DUPON et al, 1995;

DUPOY-CAMET et al, 1993; FILICE et al, 1993). O PCR para T.gondii também

pode ser positivo em lavado broncoalveolar, assim como no humor aquoso e

vítreo de pacientes infectados pelo HIV com toxoplasmose (BRETAGNE et al,

1995; DANISE et al, 1995). Um PCR positivo em tecido cerebral não

necessariamente indica infecção ativa, pois os cistos teciduais persistem no

cérebro por um longo período após a infecção. O PCR em amostras de sangue

apresenta uma baixa sensibilidade para diagnóstico de toxoplasmose encefálica

em pacientes com aids (LAMORIL ET AL, 1996). A detecção de DNA de T.gondii

em líquido amniótico permite que se faça o diagnóstico de infecção intra-uterina

(GROVER ET AL, 1990).

1.4.5 TERAPIA

Pirimetamina é considerada a peça-chave no tratamento da

toxoplasmose. A combinação de pirimetamina (um inibidor da dihidrofolato

sintetase) mais sulfadiazina (um inibidor de dihidrofolato redutase) é o regime

padrão para o tratamento da toxoplasmose cerebral. Esse regime exibe uma

atividade sinérgica contra o T. gondii devido ao bloqueio seqüencial da via da

síntese do ácido folínico. Pacientes que recebem pirimetamina devem receber

ácido folínico para prevenir efeitos adversos hematológicos.

A resposta inicial à pirimetamina e à sulfadiazina é notada em 65 – 90%

dos pacientes (PORTER et al, 1992; DANNERMANN et al, 1992; LEPORT et al,

1988). Infelizmente, até 40% dos pacientes podem abandonar o tratamento

devido a efeitos adversos, destacando-se as reações alérgicas muco-cutâneas

relacionadas à sulfa (DANNERMANN et al, 1992; KATLAMA et al, 1996). Nesse

caso, a associação de pirimetamina e clindamicina é tão efetiva quanto

pirimetamina e sulfadiazina durante a fase aguda da terapia. Um estudo

prospectivo randomizado relatou que a associação sulfametoxazol-trimetoprim é

tão efetiva quanto pirimetamina e sulfadiazina para tratamento de toxoplasmose

cerebral (TORRE et al, 1998).

Exantema e diarréia são os efeitos adversos comuns na associação

pirimetamina e clindamicina.

Regimes alternativos são necessários para pacientes intolerantes a

sulfonamidas e clindamicina. Medicações que exibem atividade anti-T gondii in

vitro ou em modelos animais aparecem em relatos de caso.

A utilização de atovaquone suspensão oral associado à pirimetamina ou

sulfadiazina é uma alternativa eficaz para o tratamento de toxoplasmose

encefálica. Esse regime resultou em 77% de resposta clínica e radiológica na 6ª

semana com uma taxa de 5% de recorrência durante a fase de manutenção

(CHIRGWIN et al, 2002).

Azitromicina e claritromicina são eficazes para tratamento em modelos

animais e em estudos in vitro. Um pequeno estudo com claritromicina associada

à pirimetamina resultou em uma resposta clínica de 80% e radiológica de 50%

(FERNANDEZ-MARTIN et al, 1991). Um estudo fase I/II de azitromicina em

associação com pirimetamina relatou uma resposta de 67% durante a fase

aguda de terapia, infelizmente esse regime foi associado a 47% de recorrência

(JACOBSON et al, 2001).

Adicionais estudos são necessários antes desses agentes serem

recomendados para a rotina em pacientes com toxoplasmose cerebral.

(SUBAUSTE, 2006).

1.4.6 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

O principal diagnóstico diferencial em pacientes infectados pelo HIV com

lesão cerebral focal é o linfoma de SNC. Outras possibilidades diagnósticas

nestes pacientes são: abscesso fúngico, micobacteriose, citomegalovirose ou

sarcoma de Kaposi no SNC.

1.5 MANEJO DE TOXOPLASMOSE CEREBRAL EM PACIENTES

INFECTADOS PELO HIV

No início da pandemia de aids e antes do estabelecimento da profilaxia

primária para P. jirovecii para estes pacientes ou das normatizações de

tratamento anti-retroviral potente, a incidência de toxoplasmose encefálica

alcançava até 40% em pacientes com aids (PORTER ET AL, 1992).

Sendo a toxoplasmose encefálica a causa mais comum de lesão cerebral

focal em pacientes com aids, estabeleceu-se que, em pacientes com

manifestações clínicas encefálicas e imagens tomográficas sugestivas, a

conduta clássica e padrão é tratar o paciente empiricamente com drogas anti-

toxoplasma por duas semanas, reservando-se a biópsia cerebral somente na

ausência de melhora clínica ou radiológica (ANTINORI et al, 2000). Essa prova

terapêutica foi adotada desde os primórdios desta pandemia, baseando-se na

presença de lesão contrastada na tomografia computadorizada de crânio (CT) ou

Ressonância magnética de crânio (RNM). Adotou-se um algoritmo para

avaliação e tratamento de lesões intracranianas com efeito de massa em

pacientes com aids (Fluxograma 1) .

Caso houvesse a possibilidade de detecção de antígenos ou DNA de T.

gondii em amostras de LCR, que pode ser obtida com menor risco ao paciente, a

necessidade de biópsia cerebral poderia ser gradualmente reduzida (ANTINORI

et al, 2000).

Mesmo os exames subsidiários, que não possibilitam o diagnóstico de

certeza, envolvem riscos e custos. Os riscos da CT são principalmente inerentes

à exposição à radiação e aqueles associados ao agente do contraste como

reação alérgica, nefrotoxicidade e encefalopatia. A RNM é um procedimento

benigno, mas está contra-indicada para pessoas com marca-passo ou implantes

metálicos. Devido à morosidade do exame de RNM e o confinamento do

paciente num equipamento em forma de tubo (podendo proporcionar

claustrofobia), a RNM pode ser mais inconveniente para o paciente que a CT.

O risco de radionucleotídeo cerebral é principalmente a reação alérgica ao

isótopo preparado. Embora a experiência com FDG-PET esteja aumentando, o

custo e a grande limitação da disponibilidade restringe o seu uso para avaliação

de lesões com efeito de massa intracraniana na aids.

Para o clínico, há dois grandes riscos no tratamento empírico para

toxoplasmose cerebral no paciente HIV positivo com lesão cerebral contrastada:

1. Perder o momento exato de tratar outras desordens que são

diferenciais de toxoplasmose cerebral;

2. Causar uma toxicidade medicamentosa em pacientes sem encefalite

por T. gondii

Por isso, consideramos de suma importância um método diagnóstico

rápido e preciso para evitar tratamentos desnecessários e excluir outras

patologias como linfoma de Sistema Nervoso Central.

Fluxograma 1 : Algoritmo para avaliação e tratamento de lesões intracranianas

com efeito de massa na aids

Cefaléia, Convulsão, Alteração do

Status Mental ou Achados Neurológico

Focal

Imagem Cerebral

(CT/RNM)

NÃO

SIM

NÃO

Lesão com

provável

hernia

ão

Lesão c/

efeito de

assa

Estudos

Adicionais:

Punção Liquorica.

Biopsia. Aberta

Descompreensiva

Não possível ou

SPECT ou

PET (opção)

Não realizada Realizada?

NÃO

Sim

Não

Única

SIM

Múltiplas

Não

Sim

Positiva?

Terapia

antitoxoplasma

Melhora

clínica e

radiológica?

Múltiplas

lesões ou lesões

únicas?

Biópsia

Sorologia para

Toxoplasmose

Continuar

tratamento e

monitorizar

Fonte: American Academy of Neurology, 1998 , Vol 50.

Nesse fluxograma, destacam-se:

1. Lesões amplas com efeito de massa, que ameaçam obstruir por

herniação, requerem biópsia aberta descompressiva;

2. Quando possível, Tl SPECT (“Thallium Single Photon Emission Computed

Tomography”) é uma opção (SKIEST ET AL, 2000). Embora não muito

sensível, particularmente na presença de lesões pequenas e necróticas,

Tl SPECT, quando positivo, aparenta ser altamente específico para

LPSNC (ROULLET, 1999). Um resultado positivo justifica uma biópsia

cerebral estereotáxica. Resultados similares têm sido obtidos também

com PET empregado com F-fluorodexiglicose (FDG-PET);

3. Tratamento empírico para toxoplasmose deveria ser instituído em todos

os casos, exceto quando há uma lesão intracraniana única acompanhada

de sorologia negativa para toxoplasmose;

4. Uma concomitante sorologia negativa para toxoplasmose e uma lesão

única na imagem radiográfica é justificativa suficiente para realizar uma

biópsia estereotáxica;

5. Pacientes tratados presuntivavemente para toxoplasmose devem ser

cuidadosamente monitorizados tanto clínica quanto radiograficamente

para a resposta ao tratamento por um período de 10-14 dias.

2 – OBJETIVOS

Avaliar o método PCR-Multiplex em tempo real para diagnóstico de

encefalite por T.gondii em Líquido Cefalorraquidiano em pacientes infectados

pelo HIV-1. Serão analisadas as características de sensibilidade, especificidade,

valor preditivo positivo e valor preditivo negativo do teste.

3 – PACIENTES E MÉTODOS

O projeto foi aprovado pelos comitês de ética e pesquisa das instituições

envolvidas (Centro de Referência e Treinamento AIDS/DST do Estado de São

Paulo e do Hospital São Paulo – Universidade Federal de São Paulo). Foi obtido

o termo de consentimento livre e esclarecido dos pacientes envolvidos e mantido

o sigilo em relação à identidade dos pacientes.

3.1 DESENHO DO ESTUDO

Estudo corte transversal, com a realização de punção de líquido

cefalorraquidiano em amostra isolada no grupo de pacientes voluntários

envolvido na pesquisa.

3.2 CASUÍSTICA

Foram avaliados 51 pacientes, sendo 30 pacientes provenientes do

Hospital São Paulo – Universidade Federal de São Paulo e 21 pacientes

provenientes do Centro de Referência e Treinamento de DST/AIDS do Estado de

São Paulo. Deste grupo, 16 eram portadores do HIV com diagnóstico presuntivo

de toxoplasmose cerebral. Trinta e cinco pacientes foram considerados como

controles, constituindo-se de 23 pacientes infectados pelo HIV e 12 pacientes

não infectados pelo HIV, mas com outras doenças ou manifestações

neurológicas.

3.2.1 SELEÇÃO DOS PACIENTES

Foi realizada uma busca ativa entre os pacientes HIV positivos admitidos

no Pronto-socorro do Hospital São Paulo que apresentavam alguma

manifestação neurológica. Esses pacientes são rotineiramente submetidos a um

CT de crânio. Quando apresentam lesão sugestiva de toxoplasmose cerebral

caracterizada por lesão anelar contrastada e caso não haja contra-indicação de

punção liquórica, o paciente era puncionado pela equipe de liquoristas do

hospital, sendo uma amostra do LCR armazenada para realização do PCR em

tempo real. A sorologia para T.gondii era solicitada também nesse momento.

Nos pacientes com quadro clínico e radiológico compatível com toxoplasmose

cerebral era introduzida a terapia específica composta de sulfadiazina associada

à pirimetamina. Esses pacientes eram acompanhados durante seu período de

internação e após a alta eram acompanhados no ambulatório de infectologia do

HSP através de revisão prospectiva do prontuário.

3.2.2 PACIENTES CONTROLES

Os pacientes controles eram provenientes do ambulatório de líquor do

HSP ou eram pacientes internados nas enfermarias do hospital e puncionados

por alguma manifestação neurológica. A sorologia para HIV era solicitada no

momento da punção.

Os controles provenientes do CRT/DST-AIDS, todos HIV positivos sem

toxoplasmose cerebral, apresentavam um CT de crânio sem lesão compatível

com toxoplasmose cerebral. Esses pacientes foram acompanhados no período

da internação pelo pesquisador.

3.2.3 CRITÉRIO DIAGNÓSTICO

Diagnóstico de encefalite por toxoplasmose em pacientes infectados pelo

HIV-1 foi baseado em diagnóstico presuntivo que implicava a presença de sinais

e sintomas de disfunção de SNC e lesão com efeito de massa constatada pela

CT ou RNM de cérebro e resposta ao tratamento especifico após 02 semanas.

3.3 MÉTODOS LABORATORIAIS

3.3.1 COLETA DE LÍQUOR

Todas as amostras foram colhidas pelo pesquisador ou médico que

assistia ao paciente na rotina de investigação do quadro neurológico em

pacientes internados no Hospital São Paulo e no Centro de Referência e

Treinamento de AIDS/DST do Estado de São Paulo. As amostras colhidas foram

processadas para realização do PCR em tempo real no Instituto Fleury, setor de

Biologia Molecular.

Em cada tubo foi coletado de 2 a 4ml de LCR.

3.3.2 REAÇÃO DE CADEIA DE POLIMERASE EM TEMPO REAL

Neste ensaio, foram amplificadas, em uma única reação, uma seqüência

específica do genoma do T.gondii (região de 529bp, repetido mais de 300 vezes

no genoma desse parasita) e um segmento do gene da beta-actina humana,

para controle interno da reação. O fragmento 529bp foi utilizado por apresentar

uma elevada sensibilidade e especificidade no PCR para fim diagnóstico. São

utilizados duas sondas TaqMan MGB, especificas para T.gondii e controle

interno, e equipamentos ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) ou Rotor-Gene

3000 (Corbett Research). As sondas TaqMan são oligonucleotídeos que contêm

um corante flourescente, tipicamente na base 5’ (reporter) e um corante de

inibição de inibição tipicamente na base 3’ (quencher). Originalmente, quando

irradiado, o corante reporter excitado transfere energia para molécula do corante

quencher mais próxima, resultando em uma inibição de fluorescência do reporter

(FRET – Fluorescent Resonance Energy Transmition). As sondas TaqMan são

preparadas para hibridizar uma região interna do produto da PCR. Durante a

PCR, quando a polimerase amplifica o alvo no qual a sonda TaqMan está ligada,

a atividade da exonuclease 5’ da polimerase cliva a sonda. Esta clivagem separa

o corante reporter do quencher, não ocorrendo mais FRET. A fluorescência do

repórter aumenta em cada ciclo e é proporcional à taxa de sondas clivadas e, por

conseqüência é proporcional à quantidade de amplificação ao DNA inicial (Figura

4). Para o teste de sensibilidade, utilizamos diluições seriadas do DNA de

T.gondii; o limite de detecção foi estimado em 80fg de DNA, equivalente a um

parasita por reação. Foram utilizados controles negativos para obter um maior

controle de qualidade. O resultado foi expresso como detectado, calculado pela

interposição da curva de diluição padrão do parasita (Figura 5). O tempo para

execução deste exame é, em média, de 4 horas.

Figura 4

Figura 4: Visão do TaqMan em ação. A liberação do corante quencher (Q em vermelho)

no quadro 2 faz com que a luz emitida do corante repórter (R em azul) possa ser

observada.

Figura 5

Figura 5: Amostra positiva (G3/G4) e negativa (E1/E2) para T. gondii

(a) Amplificação de T.gondii (sonda marcada com FAM)

(b) Amplificação do controle interno (sonda marcada com VIC)

3.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para avaliação da validade do teste diagnóstico, utilizamos os seguintes

VPP = ___A____

A + B

Valor Preditivo Negativo (VPN): é a probabilidade de um resultado negativo

obtido por um determinado instrumento ser de fato negativo.

VPN = ___C____

C + D

Diferenças nas proporções foram comparadas pelo teste exato de Fischer.

Para as variáveis contínuas, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis. Para as

variáveis em que foi utilizada a média, foi utilizado +/- 1 como desvio padrão.

Odds ratio (ORs) com intervalo de confiança (IC) de 95% foram calculados para

todas as variáveis. Consideramos um valor de p < 0,005 como estatisticamente

significante.

Toda análise estatística foi feita pelo programa estatístico Statistical

Package for the Social Sciences software versão 11.5 (SPSS, Chicago, IL, EUA).

4 – RESULTADOS

Foram avaliados, no período de Agosto de 2004 a Novembro de 2005, 51

pacientes, sendo que destes, dezesseis apresentavam quadro de aids e

diagnóstico presuntivo de toxoplasmose cerebral. Trinta e cinco pacientes foram

avaliados como controles, dentre estes 23 pacientes eram infectados pelo HIV e

12 pacientes possuíam sorologia negativa para HIV. Todos os pacientes foram

submetidos à punção liquórica para pesquisa do DNA do Toxoplasma gondii,

aplicando a reação de cadeia de polimerase em tempo real.

4.1 TOXOPLASMOSE CEREBRAL

Dos dezesseis pacientes que apresentavam quadro clínico neurológico e

radiológico de toxoplasmose cerebral, nove eram do sexo masculino (56,25%),

sendo oito pacientes provenientes do Hospital São Paulo da Universidade

Federal de São Paulo e oito pacientes do Centro de Referência e Treinamento

DST/AIDS do Estado de São Paulo. Em todos os pacientes, foi realizada a

pesquisa da Imunoglobulina sérica (IgG e IgM) pelo método imunoensaio para T

gondii e a lesão cerebral focal foi diagnosticada pelo exame de neuroimagem

(Quadro III). Todos os pacientes realizaram tomografia computadorizada (TC) de

crânio e três pacientes realizaram paralelamente ressonância nuclear magnética.

A terapia empregada foi a associação de sulfadiazina com a pirimetamina,

com exceção de um paciente em que foi utilizada clindamicina em substituição a

sulfa. Como preconizado no critério de inclusão, houve resposta ao tratamento

em todos os casos avaliados. Esta resposta foi caracterizada pela melhora

clínica e radiológica a partir do 14º dia de terapia. O número de linfócitos

auxiliadores (célula T CD4) variou de 07 a 212 células/mm³ ( média de 72,75

cél/mm³ e mediana de 44 cél/mm³ ). Em nove pacientes (56,2%), número de

células T CD4 foi inferior a 100 cél/mm³.

Dentre os dezesseis pacientes com diagnóstico presuntivo de

toxoplasmose cerebral com resposta ao tratamento, em cinco não foi possível

detectar a presença de DNA de toxoplasmose cerebral através de PCR em

tempo real. Nestes pacientes, o nível de células CD4 variou de 09 a 169

células/mm³ (média de 98,2 cél/mm³ e mediana de 150 cél/mm³). Através do

teste de Kruskal-Wallis, notamos que não houve uma diferença estatisticamente

significativa entre os dois grupos (p=0,125) em relação ao valor de célula CD4

(Tabela 3)

Tabela 3 – Média e mediana de linfócitos T CD4 entre os pacientes com PCR em

tempo real detectado e não detectado.

Linfócitos TCD4 (cél/mm³)

MÉDIA MEDIANA P

PCR

DETECTADO

PCR NÃO

DETECTADO

72,75

98,2

150

0.125

A data da coleta do LCR em relação ao início da terapia variou do 1º ao

9º dia, sendo que em doze casos (75%) essa coleta ocorreu nas primeiras 72

horas da admissão do paciente no serviço (Anexo I ).

Foram comparadas algumas variáveis clínicas e laboratoriais entre os 5

pacientes falso negativos e os 11 pacientes que apresentaram resultados de

PCR em tempo real positivo. Utilizando a diferença de proporção entre os

pacientes com PCR positivo para T.gondii em relação aos pacientes com PCR

negativo temos: febre (OR, O,250; IC 95% 0,03 A 2,32; p=0,299), cefaléia (OR,

1,250; IC 95% 0,146 A 10,699; p=1,00), convulsão (OR, 0,15; IC 95% 0,01 A

1,562; p=0,245), déficit motor (OR, 0,56; IC 95% 0,06 A 4,75; p=1,00), alteração

de consciência (OR, 2,62; IC 95% 0,30 A 22,99; p=0,596). Portanto, não houve

diferença estatística quando comparamos as manifestações clínicas dos dois

grupos (Tabela 4).

Tabela 4: Manifestações Clínicas de pacientes com toxoplasmose cerebral com

PCR positivo e PCR negativo

NTx + PCR+

NTx + PCR-

Sinais

e Sintomas

Nº de pacientes (%) Nº de pacientes (%)

Alteração

do nível

de consciência

07 63,6 02 40 0,596

Cefaléia

com aids foi realizado LCR para quimioterapia intra-tecal de leucemia linfocítica

aguda (Anexo IV).

Entre os doze pacientes controles não portadores do HIV, todos eram

provenientes do Hospital São Paulo. A faixa etária variou de 18 a 75 anos (média

= 39,41 anos) e oito (66,6%) eram do sexo masculino e quatro (33,3%) do sexo

feminino. As doenças neurológicas que levaram a coleta do LCR foram: 04

(33,3%) por meningoencefalite herpética, 01 (8,33%) por politraumatismo, 01

(8,33%) por meningeoma, 01 (8,33%) por trombose venosa cerebral, 01 (8,33%)

por Síndrome de Guillan-Barré, 01 (8,33%) por neurite óptica, 01 (8,33%) por

tumor pineal, 01 (8,33%) por corioretinite por toxoplasmose, 01 (8,33%) por

meningite viral (Quadro V).

Todos os controles fossem soropositivos ao HIV ou não apresentaram

PCR real time com resultado negativo, evidenciando a especificidade do método

nesta amostra em 100%.

Destacamos que nos pacientes que apresentavam corioretinite por

toxoplasmose, tanto no portador do HIV quanto do não portador, a pesquisa do

T. gondii por PCR em tempo real foi negativa no líquor.

4.3 – ANÁLISE ESTATÍSTICA

A avaliação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e

valor preditivo negativo foram calculados a partir da Tabela 2x2 (Tabela 4).

Tabela 4: Diagnóstico de Toxoplasmose Encefálica por PCR em tempo real

NEUROTOXOPLASMOSE PCR-Tempo Real

Presentes Ausentes

TOTAL

POSITIVO 11 00 11

NEGATIVO 05 36 41

TOTAL 16 36 52

Obtivemos os seguintes resultados:

[IC 95%]

Sensibilidade: 68,8% [44,4%; 85,8%]

Especificidade: 100,0% [90,4%; 100,0%]

Valor Preditivo Negativo: 87,8% [74,5%; 94,7%]

Valor Preditivo Positivo: 100,0% [74,1%; 100,0%]

É importante destacar que não houve falso-positivos, comprovando uma

especificidade de 100%. Porém, houve cinco casos de pacientes com

toxoplasmose cerebral e PCR em tempo real negativo, levando a uma

sensibilidade de 68,8%.

5 - DISCUSSÃO

Complicações neurológicas ocorrem freqüentemente em pessoas

infectadas pelo vírus HIV-1. A encefalite por T.gondii é a mais freqüente causa

de doença cerebral focal nos pacientes com aids (GABUDZA et al, 1987).

Mais de 50% das pessoas infectadas com o HIV desenvolverão sintomas

neurológicos da doença. Avaliações de autópsias revelam anormalidades

neuropatológicas em mais de 90% de pacientes falecidos com aids. É estimado

que 50.000 pessoas desenvolvam doença neurológica associada ao HIV

anualmente nos EUA. Complicações neurológicas ocorrem geralmente no

estado avançado da doença com profunda imunossupressão, no entanto, 10 a

20% das pessoas infectadas pelo HIV iniciarão o quadro de aids com essas

complicações (BENSALEM et al, 2002). Em nossa pesquisa, apenas um

paciente com diagnóstico de toxoplasmose cerebral apresentou contagem de

linfócito auxiliadores T CD4 maior que 200 cél/mm³ (Anexo I ).

Nesses pacientes com complicações neurológicas, lesões cerebrais focais

(LCF) são um dos principais problemas do diagnóstico em pacientes infectados

pelo vírus HIV-1. A causa mais comum de LCF nessa população é a

toxoplasmose cerebral. No Brasil, por exemplo, segundo o último Boletim

Epidemiológico de 2005 do Programa Estadual DST/AIDS do Estado de São

Paulo, foram notificados 20.059 (14,9%) casos de neurotoxoplasmose desde

1980.

A infecção pelo T.gondii pode ser diagnosticada indiretamente pelos

métodos sorológicos ou diretamente por métodos diretos como PCR,

hibridização e histologia.

Quando na presença de manifestações clínicas sugerindo envolvimento

cerebral, estudos de neuroimagem como a Tomografia Computadorizada (TC)

de Crânio ou a Ressonância Nuclear Magnética são indispensáveis. Um

diagnóstico presuntivo é baseado no quadro clínico, estudo de imagem

(tomografia computadorizada/ressonância nuclear magnética) e resposta ao

tratamento após 2 semanas. A biópsia cerebral é considerada o padrão ouro

para o diagnóstico definitivo, porém não é isenta de risco para o paciente. Em

um estudo retrospectivo multicêntrico realizado por Antinori, envolvendo 160

biópsias cerebrais em pacientes com infecção por HIV portadores de lesões

cerebrais focais, a sensibilidade detectada foi de 87%, mas esse procedimento

levou a uma considerável morbidade e mortalidade, 7,5 % e 3,1%,

respectivamente (ANTINORI et al, 2000).

Além disso, a terapia empírica para toxoplasmose implica no atraso

diagnóstico e no tratamento de outras doenças, como linfoma de SNC.

O objetivo desse trabalho é a avaliação de um método acurado para

diagnóstico de toxoplasmose cerebral para se evitar tratamentos desnecessários

e procedimentos diagnósticos invasivos.

Essa pesquisa demonstrou que o PCR em tempo real no LCR é um

método relativamente rápido e simples que pode ser utilizado em países em

desenvolvimento para confirmação de um caso suspeito, além de ser uma

técnica diagnóstica menos invasiva quando comparada com a biópsia cerebral.

Quando comparado com o PCR convencional, o PCR em tempo real apresenta

menor risco de reação falso-positiva (MENOTTI et al, 2003). O risco de falso-

positivo resulta da contaminação com materiais amplificados anteriormente, no

caso do PCR em tempo real esse risco é dramaticamente reduzido, pois não há

a necessidade de abrir o tubo no final da amplificação (COSTA et al, 2000).

A escolha da realização de PCR em LCR baseou-se em estudos que

comprovaram uma elevada especificidade e sensibilidade desse método.

Esses estudos evidenciaram que o PCR em LCR apresentou uma

sensibilidade que varia de 12% a 70% (geralmente 50 a 60%) e uma

especificidade de aproximadamente 100% em pacientes com toxoplasmose

encefálica (PARMLEY et al, 1992; DUPON et al, 1995; EGGERS et al, 1995). A

maioria dos estudos utiliza a seqüência repetitiva do gene B1 e relata uma

sensibilidade que varia de 13,3 a 65% quando realizada em líquido

cerebroespinhal (LIN et al, 2000; BURG et al, 1989). Muitos estudos têm

demonstrado o valor diagnóstico do PCR em amostras de sangue, mas a

sensibilidade tem variado muito, de 25 a 77% (FRANZEN et al, 1997; GUY et al,

1995).

Em um estudo retrospectivo realizado por Antinori, analisando a presença

de DNA do T.gondii em 5 pacientes infectados pelo HIV, com suspeita clínica de

toxoplasmose encefálica (grupo 1), 8 pacientes infectados pelo HIV com outros

sintomas (grupo 2) e outros 7 pacientes não infectados pelo HIV com outras

doenças neurológicas (grupo 3), o PCR foi positivo em 2/4 dos pacientes com

diagnóstico final de toxoplasmose encefálica e negativo em todos os outros

grupos. Esse pequeno estudo confirmou a baixa sensibilidade e a alta

especificidade do PCR para diagnóstico da toxoplasmose encefálica (ANTINORI

et al, 2000).

Em outro estudo, em que foram avaliadas 88 amostras de LCR de

pacientes infectados pelo HIV, 56 destes com lesão cerebral focal, foram

testados prospectivamente por nested PCR do gene B1 do T.gondii. Seis dos 18

pacientes com toxoplasmose encefálica, mas nenhum com outra desordem

cerebral, foram PCR positivo (33,3% de sensibilidade e 100% de especificidade).

Considerando apenas aqueles pacientes com toxoplasmose encefálica, cujo

LCR foi coletado antes ou durante a primeira semana de terapia anti-

toxoplasmose, a sensibilidade atingiu 50%. A administração de profilaxia anti-

toxoplasmose não afetou o resultado do PCR. Todos os pacientes com outras

desordens em SNC foram PCR-negativa (SKIEST et al, 2002).

Vidal e colaboradores recentemente avaliaram, no Instituto de Infectologia

Emílio Ribas, amostras de LCR de 12 pacientes com aids no primeiro episódio

de toxoplasmose cerebral e 18 pacientes com aids com outras doenças

oportunistas neurológicas e sem toxoplasmose cerebral prévia. As amostras de

todos os pacientes com toxoplasmose cerebral apresentaram resultado positivo

no PCR (sensibilidade de 100%) e a amostra de um dos 18 pacientes com aids

(e com outras desordens neurológicas) também apresentou resultado positivo no

PCR (especificidade 94,4%) (VIDAL et al, 2004).

Em nosso estudo, avaliamos indivíduos HIV positivos atendidos no Pronto

Socorro do Hospital São Paulo e na Internação do CRT/ DST-AIDS do Estado de

São Paulo com quadro neurológico com suspeita de lesão cerebral focal. Foi

realizado exame neuroradiológico e foram admitidos com suspeita de

toxoplasmose encefálica. A punção liquórica era realizada logo após a admissão

dos pacientes em regime de internação e o diagnóstico presuntivo destes 16

pacientes era confirmado baseado nas recomendações do Centers for Disease

Control and Prevetion (CDC MMWR,1987).

Utilizamos o PCR em tempo real baseado na amplificação do fragmento

529 bp do DNA do T.gondii repetida de 200 a 300 vezes por se apresentar

menos repetido e apresentar um padrão de seqüências mais divergentes,

fazendo com que se elevem à sensibilidade dos testes diagnósticos para

toxoplasmose quando se compara com a utilização do gene B1 (HOMAN et al,

2000; REISCHL et al, 2003).

As manifestações clínicas nos pacientes com aids envolvem uma vasta

apresentação de sinais clínicos que incluem alteração do status mental,

convulsão, déficit motor, distúrbios de nervos cranianos, anormalidades

sensitivas, sinais cerebelares, meningismo, desordens de movimento e

manifestações neuropsiquiátricas. Essas alterações foram observadas em nossa

amostra, destacando-se as alterações do nível de consciência (56,3%), déficit

motor (50%) e cefaléia (43,8%).

Foi realizada a pesquisa da Imunoglobulina sérica ( IgG e IgM ) pelo

método imunoensaio contra T.gondii nos pacientes com diagnóstico presuntivo e

em todos havia a presença de anticorpos confirmando que este grupo havia sido

exposto previamente ao protozoário (Anexo I ).

Os pacientes foram submetidos à TC de Crânio (com e sem contraste) e/

ou RNM de Crânio, sendo visualizada lesão compatível com toxoplasmose

encefálica (100% realizaram TC de Crânio e 18,75% realizaram CT de Crânio e

RNM de Crânio). A lesão predominante visualizada nos exames de

neuroimagem foi a de granuloma anelar contrastado (Anexo III). Lesões múltiplas

foram observadas em 07 (43.75%) dos casos suspeitos. Não foi possível a

realização de RNM em todos os pacientes, porém nos três pacientes em que foi

realizado esse exame o PCR em tempo real foi detectado para T gondii. A RNM

é considerada um exame de melhor capacidade de resolução. Em todos os

pacientes com suspeita de toxoplasmose cerebral, nos quais o PCR foi não

detectado, não foi realizado RNM e em dois desses pacientes (Nº 1 e 8 do

Quadro 6) não houve realce das lesões. Porém, devido à melhora do quadro

com a terapia empírica, foram considerados como portadores de encefalite por

toxoplasmose.

O esquema terapêutico utilizado foi a associação de sulfadiazina com

pirimetamina. Consideramos o diagnóstico de toxoplasmose encefálica como

definitivo quando constatada melhora clínica e de imagem após 14 dias do

tratamento específico.

A contagem de linfócitos T CD4+ variou de 07 a 212 cél/mm³ (média de

51,7 cél/mm³ e mediana de 27 cél/mm³) nos 11 pacientes com PCR em tempo

real detectado, sendo que em 08 casos (72,7%) apresentavam menor que 100

cél/mm³, enquanto nos 5 pacientes com diagnóstico presuntivo de toxoplasmose

cerebral, porém com PCR em tempo real não detectado, a contagem de

linfócitos T CD4+ variou de 09 a 171 cél/mm³ (média de 98,2 cél/mm³ e mediana

de 150 cél/mm³). Mesmo com um valor de média e mediana no grupo com PCR

em tempo real detectado com linfócitos T CD4 menor, essa diferença não foi

estatisticamente significante. Não se justificando por este aspecto os testes de

PCR falsamente negativos.

Outro aspecto que poderia diferenciar os pacientes com PCR não

detectado foi o número de lesões nesses pacientes, pois 04 (80%) apresentavam

uma única lesão visualizada por exame de neuroimagem. Podemos supor que

esses pacientes com uma melhor imunidade, representada por um CD4 acima

de 100 cél/mm³ e com uma única lesão visualizada, a baixa carga de parasita

presente no momento da punção (apesar dos sinais e sintomas compatíveis com

toxoplasmose cerebral) prejudicou a amplificação do DNA do T gondii, influindo

sob o ponto de vista de sensibilidade em nossa amostra. Outro fator que poderia

diminuir a sensibilidade do teste seria a realização de punção liquórica nos

pacientes tardiamente, após a introdução do tratamento, fato este já ressaltado

por Novati et al (1994). Procuramos, portanto, realizar a punção logo no 2º dia

após verificar que não haveria risco para o paciente ao realizar essa punção para

a maioria dos pacientes.

Nos pacientes considerados casos houve 68,8% de sensibilidade, porém,

não pudemos, por motivos éticos, realizar biópsia cerebral nos pacientes com

PCR negativo para definir com certeza o diagnóstico etiológico. É importante

destacar que não houve nenhum resultado positivo para PCR em tempo real nos

pacientes controles, confirmando, portanto, a excelente (100%) especificidade do

teste. Portanto, o achado de um teste de PCR em tempo real para T. gondii no

LCR positivo tem elevado valor diagnóstico, especialmente naqueles pacientes

cuja CT ou RNM são pouco típicas. Nesta situação, pode-se racionalizar ainda

mais a utilização de um método mais invasivo que é a biopsia do SNC.

Na população estudada, encontramos, portanto, uma sensibilidade de

68,8%, especifidade de 100%, valor preditivo positivo de 100% e o valor preditivo

negativo de 87,8%. Gianotti e colaboradores, utilizando o PCR para T gondii em

52 pacientes com diagnóstico presuntivo de toxoplasmose cerebral,

evidenciaram uma especificidade de 100%, sensibilidade de 16%, valor preditivo

positivo de 100% e valor predtivo negativo de 40% (GIANOTTI et al, 1997). Já

Cingolani e colaboradores encontraram uma sensibilidade de 33,3% em um

estudo envolvendo 88 pacientes infectados por HIV-1 utilizando nested PCR.

Outro estudo também utilizando nested PCR mostrou uma sensibilidade de

100% quando a coleta de LCR foi realizada durante a primeira semana de

tratamento (NOVATI et al, 1994).

Dado o pequeno número de indivíduos avaliados, consideramos que este

estudo, embora pioneiro em nosso meio, deva ser seguido de outros com maior

número de pacientes avaliados. Enfatizamos que a realização de PCR em tempo

real em pacientes com aids e suspeita de toxoplasmose cerebral poderá em

breve constituir-se em grande arma no arsenal diagnóstico, evitando a realização

de exames como a biópsia cerebral que tem grande potencial de

morbimortalidade. A pesquisa de T.gondii por um método menos invasivo e de

rápido resultado como o real time seria uma importante ferramenta no algoritmo

do diagnóstico desta doença.

6 – CONCLUSÕES

1. No presente estudo, o PCR em tempo real em líquido cefalorraquidiano

apresentou elevada especificidade e sensibilidade (100% e 68,8%,

respectivamente) para o diagnóstico de toxoplasmose cerebral em

pacientes portadores do vírus HIV com lesão cerebral com efeito de

massa;

2. Método pouco invasivo, quando comparado com biópsia estereotáxica,

poderia ser incluída no algoritmo diagnóstico em pacientes HIV positivos

com lesão em SNC.

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Anexo I - DIAGNÓSTICO DE TOXOPLASMOSE CEREBRAL EM PACIENTES COM AIDS

Nº Paciente Sexo Sorologia

toxo

Lesão

cerebral

(CT/RNM)

Tratamento

Ntx

Resposta ao

Tratamento

CD4 PCR Dia da

coleta/Inicio

TTO

Local

1 LJC MASC IgG+/IgM- + P/S + 104 NEGATIVO 1ºD CRT

2 MAS FEMIN IgG+/IgM- + P/S + 09 POSITIVO 2ºD CRT

3 IBS MASC IgG+/IgM- + P/S + 09 POSITIVO 2ºD CRT

4 ENM FEMIN IgG+/IgM- + P/S + 120 POSITIVO 2ºD HSP

5 AA MASC IgG+/IgM- + P/S + 150 NEGATIVO 2ºD CRT

6 ESS FEMIN IgG+/IgM- + P/Cl + 27 POSITIVO 2ºD CRT

7 LRM MASC IgG+/IgM- + P/S + 161 NEGATIVO 5ºD CRT

8 BMS FEMIN IgG+/IgM- + P/S + 171 NEGATIVO 3ºD CRT

9 MAS FEMIN IgG+/IgM- + P/S + 60 POSITIVO 2ºD HSP

10 APRC FEMIN IgG+/IgM- + P/S + 52 POSITIVO 3ºD HSP

11 ACS MASC IgG+/IgM- + P/S + 212 POSITIVO 1ºD HSP

12 MSO MASC IgG+/IgM- + P/S + 21 POSITIVO 2ºD HSP

13 MSPS FEMIN IgG+/IgM- + P/S + 36 POSITIVO 9ºD HSP

14 RDS MASC IgG+/IgM- + P/S + 09 NEGATIVO 1ºD CRT

15 JMGS MASC IgG+/IgM- + P/S + 16 POSITIVO 4ºD HSP

16 ACB MASC IgG+/IgM- + P/S + 07 POSITIVO 2ºD HSP

Anexo II - MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM SUSPEITA DE TOXOPLASMOSE CEREBRAL

Nº Iniciais FEBRE CEFALÉIA CONVULSÃO DEFICIT MOTOR ALT

PAR CRANIANO

ALT

CONSCIÊNCIA

PCR

01 LJC + - + + - + NEGATIVO

02 MAS + + - + - + POSITIVO

03 IBS + + - + - - POSITIVO

04 ENM - - - - - + POSITIVO

05 AA - - - + - - NEGATIVO

06 ESS - - - - - + POSITIVO

07 LRM + + - - - - NEGATIVO

08 BMS - - + + - - NEGATIVO

09 MAS - - - - - + POSITIVO

10 APRC - + - + + - POSITIVO

11 ACS - - + - - - POSITIVO

12 MSO + - - + + - POSITIVO

13 MSPS - + - - - + POSITIVO

14 RDS + + + - - + NEGATIVO

15 JMGS - + - - - + POSITIVO

16 ACB - - + + - + POSITIVO

Anexo III – Laudo do exame de imagem em pacientes com suspeita de toxoplasmose cerebral

Nº Paciente Exame PCR Laudo

1 LJC CT NEG Lesão hipoatenuante fronto parietal D e occipital E (sem contraste)

2 MAS CT POS Imagem hipoatenuante parietal D e frontal D, lesão com contraste anelar parietal E

3 IBS CT POS Lesão cerebral em cada hemisfério de provável natureza inflamatória

4 ENM CT POS Áreas anelares com edema ao redor dos gânglios da base e lobo frontal E

5 AA CT NEG Área focais hipoatenuantes subcorticais fronto-parietal bilateral e núcleo capsular,

mínimo realce de contraste adjacente

6 ESS CT POS Lesão expansiva em núcleo capsular talâmico E e mesencéfalo com efeito de massa e tênue realce anelar

7 LRM CT NEG Lesão hipodensa parietal posterior E com efeito expressivo

8 BMS CT NEG Lesão hipodensa parietal D (sem realce de contraste)

9 MAS CT POS Lesão hipodensa fronto parietal D e tronco cerebral

RNM Uma lesão bulbo pontino e lesão cortical D

10 APRC CT POS Hipodensidade occipital E com realce de contraste

RNM Várias lesões corticais/subcorticais e tronco periventricular, algumas com realce anelar

11 ACS CT POS Imagem focal hipoatenuante para-vernix E

12 MSO CT POS Áreas anelares em r. occipital D e para-ventricular D e E

RNM Lesão arredondada com hiposinal em T1 localizada em margem ventricular lateral D e E e occipital D com

contorno anelar após injeção de contraste

13 MSPS CT POS Lesões hipodensas em fossa posterior causando compressão do 4º Ventrículo, lesão hipodensa

suboccipital/núcleo base E com efeito de massa, lesão cortical frontal D

14 RDS CT NEG Lesão hipodensa em núcleo da base E com realce anelar e edema peri-lesão

15 JMGS CT POS Lesões hipodensas em região subcortical D

16 ACB CT POS Múltiplas lesões parieto-occipital D, córtex frontal e parietal bilateral, sem realce significativo de contraste

TC: Tomografia Computadorizada

RNM: Ressonância Nuclear Magnética

Anexo IV – PACIENTES CONTROLES PORTADORES DO HIV

Nº Inicias Sexo IDADE Doença associada CD4 LOCAL

01 AA MASC 53 Neurosífilis 291 HSP

02 RK FEMIN 51 Neurosífilis 170 HSP

03 EP MASC 38 Neurocriptococose 20 HSP

04 EAM MASC 60 Encefalopatia hepática 235 HSP

05 MASC FEMIN 27 LEMP 47 CRT

06 DJBP MASC 38 Meningoencefalite / Tuberculose 24 CRT

07 MDO FEMIN 40 Neurocriptococose 19 CRT

08 SCSP MASC 40 Neurocriptococose 36 CRT

09 SRH MASC 33 Neurosífilis 05 HSP

10 EJTS FEMIN 44 Meningite bacteriana 58 HSP

11 MALP FEMIN 33 Acidente Vascular Cerebral 27 HSP

12 MMS FEMIN 29 Leucemia Linfocítica Aguda 232 HSP

13 GK MASC 43 Epilepsia 348 HSP

14 SAB FEMIN 38 IVAS 169 CRT

15 AASN MASC 46 Corioretinite por toxoplasmose 162 CRT

16 ACG MASC 41 Neurosífilis 465 CRT

17 RQS MASC 34 Meningoencefalite / Tuberculose 220 CRT

18 RG MASC 31 Meningoencefalite / Tuberculose 268 CRT

19 GVM MASC 42 Epilepsia 162 CRT

20 SSL FEMIN 32 Neurocriptococose 45 CRT

21 ADM FEMIN 51 IVAS 78 CRT

22 MIS MASC 37 Neurosífilis 145 HSP

23 SM FEMIN 37 Meningoencefalite / Tuberculose 105 CRT

HSP – HOSPITAL SÃO PAULO

CRT – CENTRO DE REFERÊNCIA E TREINAMENTO DST/AIDS

Nº Inicias SEXO IDADE Doença associada LOCAL

01 MTS FEMIN 70 Meningoencefalite herpética HSP

02 GAD MASC 25 Politraumatismo HSP

03 JG MASC 36 Meningeoma HSP

04 CRS MASC 36 Meningoencefalite herpética HSP

05 CAA FEMIN 18 Meningoencefalite herpética HSP

06 IS FEMIN 40 Trombose Venosa Cerebral HSP

07 LABC MASC 45 Síndrome Guillan-Barré HSP

08 TLS MASC 22 Neurite Óptica HSP

09 JBM MASC 54 Tumor Pineal HSP

10 MRR FEMIN 75 Meningoencefalite herpética HSP

11 BMS MASC 28 Corioretinite por toxoplasmose HSP

12 DC MASC 34 Meningite Viral HSP

Anexo V – PACIENTES CONTROLES NÃO PORTADORES DO HIV

HSP – HOSPITAL SÃO PAULO

ABSTRACT

Toxoplasmosis Encephalitis (TE) is the main cause of focal disease in

Central Nervous System in patients with acquired immunodeficiency syndrome

(AIDS) (LUFT et al, 1992).

Toxoplasma can infect any brain cell. However, the clinical signs aren’t

specific and present or not signs and focal symptoms of central nervous system

dysfunction.

Clinical presentation varies from insidiousis forms to an acute mental

status change or to a fulminant form. Toxoplasmosis occurs in advanced stages

of human immunodeficiency virus infection, and the absence of antitoxoplasma

antibodies on immunofluorescence assay does not exclude the diagnosis

(PORTER et al, 1992).

Treatment is often based in presumptive diagnosis and the standard

treatment is the combination of pyrimethamine plus sulfadiazine plus folinic acid

(LUFT et al, 1992).

After the beginning of the specific therapy, the clinic and radiologic

response is the way to confirm the diagnosis. However, there is a great difficult in

diagnosis method to confirm the cases. In this study, we‘ve aim to present a

method to detect T.gondii DNA by Real-Time polymerase chain reaction (PCR)

Multiplex.

Results: Among 51 cerebrospinal fluid samples, we had 68,8% of

sensibility, 100% of specificity, 100% of positive predictive value and 87,8% of

negative predictive value.

Conclusions: The real time PCR in LCR presented a high specificity and

sensibility in patients under suspicion of encephalitis toxoplasmosis. Being a less

invasive method, we could include it in the algorithmic diagnosis in HIV-infected

patients with CNS focal lesion.

FÁBIO LUÍS NASCIMENTO NOGUI

Diagnóstico de neurotoxoplasmose em pacientes HIV-1 por

PCR em Tempo Real em LCR

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina para obtenção do título de

Mestre em Doenças Infecciosas e

Parasitárias.

São Paulo

2006

FÁBIO LUÍS NASCIMENTO NOGUI

Diagnóstico de neurotoxoplasmose em pacientes HIV-1 por

PCR em Tempo Real em LCR

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola Paulista

de Medicina para obtenção do título de

Mestre em Doenças Infecciosas e

Parasitárias.

Orientador: Prof. Dr. David Salomão Lewi

Co-orientador: Prof. Dr. Gilberto Turcato Junior

Co-orientador: Prof. Dr. Sandro Mattas

Coordenador: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo

São Paulo

2006

Nogui, Fábio Luís Nascimento

Diagnóstico de neurotoxoplasmose em pacientes HIV-1 por PCR em

Tempo Real em LCR. / Fábio Luís Nascimento Nogui - São Paulo, 2006

xii, 59 pp.

Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de

Medicina. Programa de Pós-graduação em Doenças Infecciosas e Parasitárias.

Titulo em inglês: Diagnosis of Toxoplasmic Encephalitis in HIV-1 patients by

Real Time-PCR in Cerebrospinal Fluid.

1. Toxoplasmose cerebral. 2. Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo

Real. 3. Líquido Cefalorraquidiano.

Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro do Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), processo número

132682/2004 -4, sob aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da

UNIFESP/EPM, sob o número 0208/4.

DEDICATÓRIA

A minha mãe, minha grande incentivadora (in memorem).

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Dr. David Salomão Lewi, por sua transmissão de

conhecimento e paciência nos momentos de inquietudes.

Ao Dr. Mauro Figueredo, pela oportunidade de realização deste trabalho.

À Dra. Kozue Myashiro, por sua competência e profissionalismo, além da

acolhida em seu laboratório.

Ao Dr. Gilberto Turcato, pela amizade, por suas correções e sugestões,

contribuindo de forma decisiva para realização deste trabalho.

Ao Dr. Sandro Mattas, por sua disponibilidade e competência,

esclarecendo minha dúvidas, contribuindo para a conclusão deste trabalho.

Ao Dr. Alexandre Marra, por todo seu apoio estatístico, além de ser

sempre um exemplo e uma referência.

À Dra. Lucy Corrêa, um exemplo a ser seguido pelo profissionalismo e,

acima de tudo, uma grande amiga.

À Dra. Rosana Del Bianco e Dra. Valquiria Brito, pelo brilhantismo e apoio

para realização deste trabalho.

Ao Dr. Jose Vidal, pela permuta de informações e, principalmente, seu

apoio e amizade.

A todos os meus amigos, em especial aqueles que compartilharam esse

momento: Andréa Higa, Carlos Pontes, Érika Ferrari da Silva, Graziela Lanzara,

Márcia Matsuoka, Nilton Amorim e Taciana Sales (em ordem alfabética).

iii

A todos os residentes, ex-residentes das Disciplinas de Infectologia e

Neurologia da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina

(UNIFESP/EPM), pela inestimável contribuição na seleção dos pacientes, meus

sinceros agradecimentos.

A todos os amigos do Ambulatório de Infectologia, Enfermaria, Secretaria

e Secretaria da pós-graduação da Disciplina de Infectologia e Parasitárias (DIPA)

da Escola Paulista de Medicina, meu muito obrigado.

Ao meu pai e irmãos pelo apoio na realização deste trabalho.

Agradeço, especialmente, a todos os pacientes que permitiram e

ajudaram na realização desse trabalho.

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA............................................................................................................................. i

AGRADECIMENTOS................................................................................................................... ii

LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................... vi

LISTA DE TABELAS................................................................................................................... vi

LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................................ vii

ANEXO......................................................................................................................................... vii

RESUMO...................................................................................................................................... viii

1 – INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 01

1.1 – AIDS....................................................................................................................... 01

1.2 - TERAPIA ANTIRETROVIRAL ALTAMENTE POTENTE....................................... 01

1.3 - MANIFESTAÇÕES NEUROLÓGICAS NO PACIENTE COM INFECÇÃO PELO

VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA..........................................................

1.4 - TOXOPLASMOSE CEREBRAL NO PACIENTE INFECTADO PELO HIV............. 03

1.4.1 – EPIDEMIOLOGIA DA TOXOPLASMOSE.................................................. 05

1.4.2 – PATOGÊNESE............................................................................................ 07

1.4.3 - MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS..................................................................... 08

1.4.4 – DIAGNÓSTICO............................................................................................10

1.4.4.1 – Sorologia....................................................................................... 11

1.4.4.2 – Estudo do Líquido Cefalorraquidiano........................................ 12

1.4.4.3 – Estudo Neuroradiológico............................................................ 12

1.4.4.4 – Estudo de Cultura........................................................................ 15

1.4.4.5 – Histopatologia.............................................................................. 16

1.4.4.6 – Detecção do DNA........................................................................ 16

1.4.5 – TERAPIA..................................................................................................... 18

1.4.6 – DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL.................................................................. 19

1.5 - MANEJO DE TOXOPLASMOSE CEREBRAL EM PACIENTES INFECTADOS

PELO HIV.................................................................................................................

2 – OBJETIVOS........................................................................................................................... 23

3 – PACIENTES E MÉTODOS.....................................................................................................24

3.1 - DESENHO DO ESTUDO......................................................................................... 24

3.2 – CASUÍSTICA.......................................................................................................... 24

3.2.1 - SELEÇÃO DOS PACIENTES..................................................................... 24

3.2.2 – PACIENTES CONTROLES........................................................................ 25

3.2.3 – CRITÉRIO DIAGNÓSTICO........................................................................ 25

3.3 - MÉTODOS LABORATORIAIS................................................................................26

3.3.1 – COLETA DE LÍQUOR.................................................................................26

3.3.2 – REAÇÃO DE CADEIA DE POLIMERASE EM TEMPO REAL.................. 26

3.2.3 – ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................ 29

4 – RESULTADOS....................................................................................................................... 31

4.1 - TOXOPLASMOSE CEREBRAL............................................................................. 31

4.2 – CONTROLES..........................................................................................................33

4.3 - ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................ 35

5 – DISCUSSÃO.......................................................................................................................... 36

6 – CONCLUSÕES...................................................................................................................... 42

7 – BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................... 43

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ciclo da Toxoplasmose..........................................................................................05

Figura 2: CT de crânio de paciente com diagnóstico de toxoplasmose cerebral

confirmado por PCR em tempo real.....................................................................

Figura 3: RNM de paciente com diagnóstico de toxoplasmose cerebral confirmado

por PCR em tempo real.........................................................................................

Figura 4:

Visão do TaqMan em ação.......................................................................................

Figura 5

:Amostra positiva (G3/G4) e negativa (E1/E2) para T. gondii ..................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais Sinais e Sintomas em 55 Pacientes com toxoplasmose cerebral e

aids...........................................................................................................................

Tabela 2: Avaliação da validade de um teste diagnóstico...................................................28

Tabela 3: Média e mediana de linfócitos T CD4 entre os pacientes com PCR em

tempo real detectado e não detectado................................................................

Tabela 4: Manifestações Clínicas de pacientes com toxoplasmose cerebral com pcr

positivo e pcr negativo...........................................................................................

Tabela 4: Diagnóstico de Toxoplasmose Encefálica por PCR em tempo real...................

ANEXOS

Anexo I - DIAGNÓSTICO DE TOXOPLASMOSE CEREBRAL EM PACIENTES COM

AIDS.........................................................................................................................

Anexo II - MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS EM PACIENTES COM SUSPEITA DE

TOXOPLASMOSE CEREBRAL............................................................................

Anexo III - LAUDO DO EXAME DE IMAGEM EM PACIENTES COM SUSPEITA DE

TOXOPLASMOSE CEREBRAL............................................................................

Anexo IV - PACIENTES CONTROLES PORTADORES DO HIV...........................................58

Anexo V - PACIENTES CONTROLES NÃO PORTADORES DO HIV....................................59

vii

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

TC Tomografia Computadorizada

HAART “Highly Active Anti-Retroviral Therapy”

HIV-1 “Human Immunodeficiency Virus Type 1”

LCF Lesão Cerebral Focal

LCR Líquido Cefaloraquiano

LP Linfoma Primário

NT Neurotoxoplasmose

PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia de Polimerase)

RNA Ácido Ribonucléico

RNM Ressonância Nuclear Magnética

SNC Sistema Nervosa Central

TARV Terapia Antiretroviral

viii

RESUMO

Encefalite causada por Toxoplasma gondii é a causa mais freqüente de

lesão em Sistema Nervoso Central no paciente com síndrome da

imunodeficiência adquirida (aids) (LUFT et al, 1992). Toxoplasma pode infectar

qualquer célula cerebral. Portanto, a clínica da neurotoxoplasmose (NT) não é

específica e pode incluir sinais e sintomas focais ou não de disfunção do sistema

nervoso central. A apresentação clínica varia de uma apresentação insidiosa,

que envolve semanas, a um estado confusional agudo ou mesmo fulminante. A

toxoplasmose ocorre em estágios avançados da doença e a ausência de

anticorpos anti-toxoplasma pelo mét

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