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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
JOSÉ LUIS MÜLLER
CULTIVO DE
Saccharomyces boulardii
EM BIORREATOR TIPO
AIR-
LIFT
E EM FRASCOS AGITADOS MECANICAMENTE
Itajaí - 2006
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2
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
JOSÉ LUIS MÜLLER
CULTIVO DE
Saccharomyces boulardii
EM BIORREATOR
AIR-LIFT
E EM FRASCOS AGITADOS MECANICAMENTE
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Tania Mari Bellé
Bresolin
Co-orientador: Prof. Dr. Pablo Angel
Sanchez Podlech
Itajaí, outubro de 2006
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3
CULTIVO DE
Saccharomyces boulardii
EM BIORREATOR
AIR-LIFT
E EM FRASCOS AGITADOS MECANICAMENTE
José Luis Müller
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias
Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Orientadora
____________________________________
Pabo Angel Sanchez Podlech, Dr.
Co-Orientador
__________________________________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra
Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra (UNIVALI)
Presidente
______________________________________
Tania Maria Bordin Bonfim, Dra.(UFPR)
Membro
______________________________________
César Augusto Tischer, Dr. (UNIVALI)
Membro
Itajaí (SC), 06 de outubro de 2006
4
Dedicatória
A minha esposa Simony e a Julia nossa filha,
por todos os momentos em que estivemos juntos e
que contribuiram de muitas maneiras para o êxito deste.
A minha família.
A Deus.
5
AGRADECIMENTOS
A meu co-orientador Dr. Pablo Angel Sanches Podlech pelo que ensinou-me,
pela dedicação e confiança que depositou em mim ao longo destes anos.
A professora Dra. Tania Mari Belle Bresolin por ter assumido como minha
orientadora e pelo envolvimento total com a dissertação.
A professora Dra. Marina da Silva Machado pelos trabalhos no cromatógrafo
gasoso e acima disto pela objetividade transmitida o que me ensinou a encurtar
distâncias e pela doação.
Ao professor Dr. Rivaldo Niero pela disponibilidade e também pela atenção
dada.
Ao professor Dr. Clóvis pela atenção e pelos materiais que emprestei
contando com sua confiança.
Agradeço a bolsista Karina Luvisotto Protti do Programa Integrado de Pós
Graduação e Graduação (PIPG) pelo esforço e dedicação.
A minha esposa Simony pela dedicação, amor e compreensão.
A pequena Júlia, minha filha que me traz motivação com sua presença e seu
sorriso sincero, por muitas vezes em meu colo quando estava no computador.
Aos meus queridos pais Mário e Diná, pela confiança e incentivo e também a
minhas irmãs Daniela e Cláudia.
Aos professores e amigos, Alexandre, Patrícia, Diva, David, Bia e Anilson pelo
companheirismo, amizade e carinho.
Aos amigos do Laboratório de Instrumentação Analítica/UNIVALI, onde uma
parte do trabalho foi conduzida.
À Pró-Reitoria de Pesquisa e Coordenação do Programa de Mestrado em
Ciências Farmacêuticas pelos auxílios concedidos.
À secretária do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Rosélia,
pela eficiência e amizade.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram de forma positiva para
realização deste trabalho.
6
7
Saccharomyces boulardii
GROWTH
IN AN AIR-LIFT FERMENTER
AND MECHANICALLY STIRRED FLASK
José Luis Müller
october/2006
Supervisor: Tania Mari Bellé Bresolin, PhD.
Area of Concentration: Natural Products and Bioactive substances
Number of Pages: 92
Air Lift Fermenters offer advantages such as efficient homogenization of the
components, low shear stress, and energy savings, since the medium is stirred by
the process of aeration, without the need for mechanical stirring. The goal of this
work was to evaluate the growth kinetic of S. boulardii yeast (probiotic) in an Air-lift
reactor, with aeration conditions of 1 and 1.5 air vvm (air volume/medium
volume/minutes), comparing this with their growth in mechanically stirred flasks, with
a view to future industrial application of this fermenter. A decrease in pH was
observed, with the uptake of glucose in the medium, which was completely
consumed, up to the end of the exponential phase (5h and 6h for the stirred flask and
Air
Ai
8
1 LISTA DE FIGURAS
Figura 01
Biorreator tipo
Air-lift
........................................................................
30
Figura 02
Agitador incubador de bancada......................................................
38
Figura 03
Biorreator com agitação aerada do tipo “
Air-lift
”..............................
39
Figura 04
Fluxograma dos processos descontínuos.......................................
40
Figura 05
Curva de calibração de concentração celular do
S. boulardii...
.......
42
Figura 06
Curva de calibração para glicose.....................................................
43
Figura 07
Curva de calibração do etanol pelo método de CG com
head-
space
................................................................................................
45
Figura 08
Análise dos parâmetros da concentração celular, concentração de
glicose consumida e pH dos 3 experimentos independentes
realizados em agitador incubador .................................................
55
Figura 09
Análise dos parâmetros da concentração celular (g/L), glicose
consumida (g/L) e pH e dos 3 experimentos independentes
realizados em Biorreator
Air-lift
1 vvm.............................................
60
Figura 10
Análise dos parâmetros da concentração celular (g/L), glicose
consumida (g/L) e pH e dos 3 experimentos independentes
realizados em Biorreator
Air-lift
1,5 vvm..........................................
61
Figura 11
Concentração celular durante todo o processo descontínuo, nos
biorreatores: agitador incubador
, Air-lift
1,0 vvm e 1,5
vvm............... ...................................................................................
66
Figura 12
Cromatograma em GC-
head-space
, do padrão de etanol e a
amostra
Air-lift
1,0 vvm....................................................................
68
Figura 13
Concentrações médias e desvios associados de etanol em três
experimentos (n=3) para os diferentes tipos de biorreatores
utilizados, medido em CG com
head space
manual.............................................................................................
69
Figura 14
Cromatograma ilustrativo do LQ e LD do método de CG com
head space
manual..........................................................................
74
9
2 LISTA DE TABELAS
Tabela 01:
Microrganismos com propriedades de probióticos......................
19
Tabela 02:
Composição do meio de cultura utilizado no processo
descontínuo.................................................................................
35
Tabela 03:
Influencia do antiespumante no meio reacional..........................
58
Tabela 04:
Influência do..Conversão de substrato em célula (produção específica de
células ao longo do processo descontínuo.................................
64
Tabela 05:
Produtividade de células em g/L/h (ao longo do processo
descontínuo.................................................................................
64
Tabela 06:
Velocidade específica de crescimento celular na fase
exponencial.................................................................................
65
Tabela 07:
Concentração média de células durante todo processo
descontínuo.................................................................................
66
Tabela 08:
Dados da regressão linear realizada nas curvas de
concentração celular dos biorreatores agitador incubador, Air-lift
1,0 e 1,5 vvm ao longo do processo descontínuo........................
68
Tabela 09:
Ensaio de recuperação, com método de CG usando head
space manual..............................................................................
72
Tabela 10:
Ensaio de recuperação de etanol em CG, usando head space
automático e n-propanol como padrão interno............................
73
Tabela 11:
Concentração de etanol (g/L) na avaliação da precisão
intermediária do método (três dias e dois analistas diferentes)..
75
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% porcentagem
Abs absorbância
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
ATP Adenosina Trifosfato
CG Cromatógrafo Gasoso
CV Coeficiente de Variação
DNA Ácido Desoxirribonucléico
g/g grama/grama
GL Gay Lussac
CLAE Cromatografia Gasosa de Alta Eficiência
HS head-space
IML Instituto Médico Legal
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Industrial
LQ Limite de Quantificação
m massa
P. A. pureza analítica
p/v peso/volume
R Fator de Recuperação
UV ultravioleta
v/v volume/volume
vvm volume de ar por volume de meio por minuto
11
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO
................................................................................
14
2.
OBJETIVOS
....................................................................................
16
2.1
Objetivo Geral..................................................................................
16
2.2
Objetivos Específicos......................................................................
16
3.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
...........................................................
17
3.1
Gênero Saccharomyces..................................................................
17
3.2
Saccharomyces boulardii................................................................
17
3.2.1
Mecanismos de ação do S. boulardii...............................................
22
3.2.1.1
Proteção ecológica..........................................................................
21
3.2.1.2
Imunoestimulação...........................................................................
22
3.2.1.3
Efeito trófico na mucosa intestinal...................................................
22
3.3
Crescimento celular.........................................................................
23
3.4
Processo Fermentativo Industrial Genérico....................................
25
3.4.1
Processo Descontínuo Tradicional (batelada).................................
26
3.4.2
Processo Descontínuo Alimentado (Melle-Boinot).........................
26
3.4.3
Processo Contínuo..........................................................................
27
3.5
Cultivo em agitador incubador de bancada....................................
27
3.6
Biorreator Air-lift...............................................................................
28
3.7
Cromatografia Gasosa....................................................................
31
4.
MATERIAL E MÉTODOS
...............................................................
34
4.1
Materiais..........................................................................................
34
4.1.1
Microrganismo.................................................................................
34
4.1.2
Reagentes e outros Materiais.........................................................
34
4.1.3
Meio de cultura................................................................................
35
4.1.4
Equipamentos..................................................................................
36
4.2
Métodos...........................................................................................
36
4.2.1
Preparo do Meio de Cultura............................................................
36
4.2.2
Obtenção do inóculo........................................................................
37
4.2.3
Cultivos............................................................................................
37
4.2.4
Cultivo em agitador incubador de bancada....................................
37
12
4.2.5
Cultivo em biorreator Air-Lift........................................................
38
4.3
Análise dos processos descontínuos..............................................
40
4.3.1
Análise da concentração celular......................................................
40
4.3.2
Análise do consumo de substrato (Glicose)....................................
42
4.3.3
Medida do pH..................................................................................
43
4.3.4
Análise da produção de etanol........................................................
44
4.3.5
Curva de Calibração........................................................................
44
4.3.6
Quantificação do etanol nas amostras............................................
45
4.4
Validação analítica do método de quantificação de etanol por CG
com head space manual.................................................................
46
4.4.1
Linearidade e faixa de aplicação.....................................................
46
4.4.2
Precisão...........................................................................................
47
4.4.3
Exatidão...........................................................................................
49
4.4.4
Limite de Detecção e Limite de Quantificação................................
51
4.5
4.5.1
4.5.2
4.5.3
4.6
Cálculolo dos parâmetros dos processos descontínuos.................
Conversão de substrato em células (NCO).....................................
Produtividade em células (biomassa)..............................................
Velocidade especifica......................................................................
Análise Estatística dos dados..........................................................
51
52
52
52
53
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
....................................................
54
5.1
Cultivos............................................................................................
54
5.1.1
Cultivo em agitador incubador de bancada....................................
54
5.1.2
Cultivo em biorreator Air-lift.............................................................
57
5.2
5.2.1
5.2.2
Cálculo dos Parâmetros dos Processos descontínuos..................
Conversão de substrato em célula..................................................
Produtividade...................................................................................
63
63
64
5.2.3
Velocidade específica......................................................................
64
5.2.4
5.3
5.4
Concentração de células.................................................................
Quantificação do etanol gerado nos processos descontínuos........
Valildação analítica..........................................................................
65
67
71
6.
CONCLUSÕES
...............................................................................
76
13
7.
8.
RECOMENDAÇÕES
.......................................................................
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
...............................................
APÊNDICES
....................................................................................
78
79
89
I
Resultados dos experimentos realizados em agitador incubador..
89
II
Resultados dos experimentos realizados em biorreator Air-
lift 1,0 VVM......................................................................................
90
III
Resultados dos experimentos realizados em biorreator Air-
lift 1,5 VVM......................................................................................
91
14
1. INTRODUÇÃO
Probióticos são definidos como um suplemento de microrganismos vivos que
trazem efeitos benéficos ao hospedeiro, pelo desenvolvimento do balanço da flora
natural, protegendo contra uma série de enfermidades (FULLER, 1991). Entre os
probióticos, dois grandes grupos microbianos foram particularmente estudados em
termos experimentais e clínicos e já são comercializados: as bactérias lácticas e as
leveduras (FULLER; GIBSON, 1997).
Os probióticos representam uma importante alternativa aos antimicrobianos
convencionais, para os quais muitos microrganismos patogênicos podem
desenvolver resistência. Em relação ao seu potencial protetor, cada probiótico
dispõe de mecanismos múltiplos e simultâneos de ação, como antagonismo contra
microrganismos patogênicos, efeito trófico nas mucosas, imunoestimulação do
hospedeiro e/ou inibição da produção ou ação de toxinas bacterianas. Isso
representa uma grande diferença e vantagem em relação aos quimioterapêuticos,
dificultando o desenvolvimento de resistência pôr mutações pontuais pelos agentes
patogênicos. Outra vantagem dos probióticos em relação aos antimicrobianos
convencionais é a ausência de impacto nefasto sobre o sistema digestivo
(COPPOLA; GIL-TURNES, 2004).
O maior número de trabalhos publicados sobre o uso de bioterapêuticos
relatam o uso do Saccharomyces boulardii. O S. boulardii não é um constituinte da
flora normal, ele sobrevive no trato gastrointestinal baixo após sua administração
oral podendo ser recuperado vivo nas fezes (ROFFE,1996). Estudos demonstram a
eficácia desta levedura para problemas gastrointestinais ocasionados por diversos
agentes etiológicos. Na diarréia aguda, diversos trabalhos mostram evidências de
sua ação benéfica sobre o uso de antibióticos e que devem ser reforçadas por novos
ensaios (McCULLOUGH, 1998).
Entre as formas comerciais de administração do S. boulardii, como agente
terapêutico está o produto liofilizado, na forma de cápsulas, comercializado por
empresas multinacionais como a Merck e laboratórios nacionais como o Legrand
(E.M.S.), Sigma Farma (E.M.S.) e Herald’s do Brasil LTDA.
15
O processo de fermentação descontínuo tradicional é o processo de escolha
na indústria alimentícia e farmacêutica, devido ao maior controle do processo e por
evitar contaminação (CARVALHO; SATO, 2001).
O Air-lift é um biorreator agitado pneumaticamente, utilizado no processo
industrial em batelada (SCHMIDELL et al., 2001), onde as reações se processam na
presença de células vivas. Este equipamento promove ligação entre o líquido do
topo e da base, com direcionamento do gás de modo a obter turbulência e
autocirculação dirigida, permitindo elevada transferência de oxigênio. Este tipo de
biorreator pode proporcionar processos de produção de microrganismos em grande
escala, sem limitação de oxigênio local, além de apresentar forças de cisalhamento
muito baixas, preservando os tecidos, principalmente os micelianos que se
apresentam mais frágeis (MERCHUK, 1990). A aeração é fator importante para que
se obtenha uma maior formação de massa celular viável durante o processo
fermentativo. A injeção do gás serve para agitar e aerar, eliminando o gasto de
energia para agitação, e promovendo um aumento na capacidade de transferência
de massa e calor (SIEGUEL; ROBINSON, 1992). Este equipamento é de construção
simples e econômica, possibilitando uma manutenção fácil e de baixo custo,
podendo representar uma alternativa ao processo industrialmente mais utilizado, o
sistema em batelada contínua, tendo em vista, especialmente a economia de
energia, um dos principais custos do processo industrial
O objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento de crescimento de S.
boulardii em biorreator Air-lift, ainda não relatado na literatura, com diferentes
condições de aeração e baixas concentrações de substrato, comparando a cinética
de crescimento, neste equipamento, com o processo em frascos com agitação
mecânica, normalmente utilizado para estabelecer as variáveis do processo para
posterior aumento de escala. De tal modo a contribuir para o desenvolvimento de um
insumo farmacêutico nacional que pode ser utilizado em doenças que apresentam
grande impacto na Saúde Pública, como as diarréias de diferentes etiologias.
16
2. OBETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Analisar a cinética de crescimento da levedura Saccharomyces boulardii em
biorreator tipo Air-lift, comparando com frascos agitados mecanicamente.
2. 2 Objetivos Específicos
• Determinar os valores de pH, consumo de glicose e crescimento celular e
comparar os parâmetros de crescimento (produtividade, velocidade específica de
crescimento, conversão de substrato em células e concentração de células) em
frascos com agitação mecânica e biorreator Air-lift;
• Analisar a influência do fornecimento das taxas de O
2
de 1,0 e 1,5 vvm (volume
de ar por volume de meio por minuto) no cultivo de células utilizando o biorreator
Air-lift;
• Desenvolver e validar a metodologia de quantificação do etanol por cromatografia
gasosa, usando a técnica de head space manual;
• Quantificar por cromatografia gasosa pela técnica de head space manual, a
concentração de etanol gerado durante o cultivo de células.
17
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Gênero
Saccharomyces
O Saccharomyces boulardii é um fungo do filo Ascomicota, ordem
Saccharomycetalia, família Saccharomycetacea e gênero Saccharomyces (BISBY et
al., 2006).
Os fungos são organismos eucarióticos cujos núcleos são dispersos em um
micélio (conjunto de hifas) contínuos ou septados. Não possuem plastos ou
pigmentos fotossintéticos e sua nutrição é obtida por absorção. São saprofíticos,
parasitos facultativos ou biotróficos. São predominantemente filamentosos, mas
algumas espécies são leveduriformes (ALEXOPOULOS, 1985).
A levedura Saccharomyces é um microrganismo aeróbio facultativo. Os
produtos finais da metabolização do açúcar irão depender das condições ambientais
em que a levedura se encontra. Em aerobiose a maior parte do açúcar é
transformada em biomassa, CO
2
e H
2
O, já em anaerobiose passa a ser convertido
em etanol e CO
2.
O etanol e o CO
2
resultantes se constituem, tão somente, de
produtos de excreção, sem utilidade metabólica para a célula em anaerobiose.
Entretanto, o etanol, bem como outros produtos de excreção (como o glicerol e
ácidos orgânicos) podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e
biomassa (LIMA et al., 2001).
Industrialmente, a levedura do gênero Saccharomyces tem sido utilizada na
produção de cervejas, vinhos e pães. Também a produção de etanol peloa levedura
Saccharomyces tem grande importância socioeconômica na indústria alimentícia e
como fonte de combustível ecologicamente correta (MARQUES; SERRA, 2004).
3.2.
Saccharomyces boulardii
O nome S. boulardii é inválido para o Código de Nomenclatura Botânica
Internacional devido a falta de uma publicação reconhecida internacionalmente.
18
Manuais de taxonomia consideram o S. boulardii um sinônimo do S cereviseae
(MCCULOUGH, 1998).
O S. boulardii foi primeiramente isolado de frutas silvestres (lychee) na
Indochina nos anos 50 e desde então tem sido usado como probiótico, adicionado à
dieta alimentar com a finalidade de equilibrar a flora intestinal e com fins terapêuticos
no tratamento de diarréias (SURAWICZ et al.,1989; RASIC, 1983).
O termo probiótico deriva do grego e significa “pró-vida”, sendo o antônimo de
antibiótico, que significa “contra a vida”. O termo probiótico é usado para designar
preparações ou produtos que contêm microrganismos viáveis definidos e em
quantidade adequada, que alteram a microbiota própria das mucosas por
implantação ou colonização de um sistema do hospedeiro, e que produzem efeitos
benéficos em sua saúde (SCHREZENMEIR; DE VRESE, 2001).
Vários microrganismos são usados como probióticos, entre eles bactérias
ácido-lácticas, bactérias não ácido lácticas e leveduras (Tabela 01). Além das
propriedades mencionadas, um probiótico deve ser inócuo, manter-se viável por
longo tempo durante a estocagem e transporte, tolerar o baixo pH do suco gástrico,
resistir à ação da bile e das secreções pancreática e intestinal, não possuir genes
transmissores de resistência a antibióticos, possuir propriedades anti-mutagênicas e
anticarcinogênicas, assim como resistir a fagocitose (COPOLA; GIL-TURNES,
2004).
O estabelecimento de uma flora intestinal, que se inicia no nascimento do ser
humano, levando anos para atingir uma forma definitiva, porém continua sendo
inerente ao meio ambiente onde a pessoa reside. Esta flora bacteriana presente no
trato gastrointestinal humano é formada por um complexo ecossistema constituído
de vários microrganismos anaeróbios facultativos ou não. Alterações passíveis de
provocar modificação deste ecossistema podem conduzir a uma situação patológica.
Assim os alimentos não são metabolisados e, portanto não podem ser absorvidos
pelo organismo a nível intestinal (SAAVEDRA et al., 1995).
Não são conhecidos probióticos capazes de se instalar no sistema digestivo,
mesmo após uma ingestão prolongada, já que a microbiota local, perturbada ou não,
impede essa colonização. Contudo, diversos bioterapêuticos sobrevivem durante a
sua passagem intestinal como no caso do S. boulardii (KLEIN et al., 1993).
19
Tabela 01
: Microrganismos com propriedades de probióticos.
Lactobacillus
Bifidobacterium
Outras bactérias ácido
láticas
Bactérias não ácido láticas
e leveuras
L. acidophilus
B. adolescentis
Enterococcus faecalis
Bacillus cereus var. toyoi
L. amylovorus
B. animalis
Enterococcus faecium
Escherichia coli cepa nissle
L. casei
B. bifidum
Lactococcus lactis
Propionibacterium
freudenreichii
L. crispatus
B. breve
Leuconostoc
mesenteroides
Saccharomyces cerevisiae
L. delbrueckii
B. infantis
Pediococcus acidilactici
Saccharomyces boulardii
L. gallinarum
B. lactis
Sporolactobacillus inulinus
L. gasseri
B. longum
Streptococcus thermophilus
L. johnsonii
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
Fonte: (HOLZAPFEL ; SCHILLINGER, 2002)
Os níveis populacionais do bioterapêutico devem ser suficientemente
elevados para obter um impacto no local onde se espera que ele desenvolva sua
função. Em ecologia microbiana, considera-se que um microrganismo influi no
ecossistema onde ele se encontra, somente quando a sua população é igual ou
superior a 10
7
unidades formadoras de colônias/g ou mL (UFC/g ou UFC/mL) do
conteúdo. A concentração em células viáveis do probiótico deve ser, portanto,
ajustada na preparação inicial, levando-se em conta a capacidade de sobrevivência
20
do microrganismo, sem se multiplicar no tubo digestivo e o efeito de diluição
intestinal, de maneira a atingir no mínimo 10
7
UFC/g do conteúdo intestinal. A
ingestão diária de um probiótico em quantidade adequada é, portanto, indispensável
para manter níveis artificialmente elevados do microrganismo no ecossistema
digestivo, permitindo que ele desenvolva o efeito benéfico desejado (DUCLUZEAU;
RAIBAUD, 1979).
Quanto aos benefícios terapêuticos, diversos estudos têm demonstrado a
eficácia da levedura S. boulardii no tratamento da diarréia causada por Clostridium
difficile, na colite associada a tratamentos com antibióticos, na diarréia em crianças e
na doença de Crohn (ACEVEDO; ROMERO; ESPEJO, 2004).
Materan et al. (1992), mostraram, uma diferença significativa no número de
evacuações após três dias, tanto na diarréia bacteriana quanto na diarréia virótica
(2,36
±
1,52 contra 3,95
±
2,4 respectivamente; P
<
0,03), pelo um estudo
randomizado duplo-cego usando S. boulardii ou placebo em 120 pacientes
O efeito do S. boulardii na prevenção da diarréia do viajante foi avaliado, em
estudo duplo-cego, por Kollaritsch et al. (1993) pelo sua administração a adultos que
viajavam para várias regiões do mundo. Os resultados em prevenir a diarréia foram
melhores, dependendo da região geográfica para a qual viajavam, podendo este
efeito ser devido à variação do agente etiológico.
O cultivo da levedura S. boulardii em agitador incubador foi verificado em
alimentos como leite e iogurte UHT (Ultra High Temperature - processo de
esterilização do meio em uma temperatura alta por um pequeno intervalo de tempo,
em torno de 4 segundos, e resfriado rapidamente) (KLIJN, 1997). Foram avaliadas
suas propriedades fisiológicas, de crescimento, sobrevivência, utilização de
açúcares (produção de álcool e gás) e concentrações de ácidos orgânicos. O ensaio
foi realizado em temperatura de 25 °C até o tempo de 48 horas. A quantificação do
álcool e glicose foi realizada utilizando CLAE, segundo o método descrito por
Molnar-Pearl e Morvai (1992). O crescimento e sobrevivência da levedura S.
boulardii foi relacionada ao decréscimo nas concentrações de glicose e galactose
presentes no meio de cultura (leite e iogurte testados) com alta produção de álcool
(4,03%). Como regra, o ácido orgânico presente em maior quantidade foi o ácido
lático (1,57–1,98%), seguido pelo ácido cítrico (0,46-0,55%) e ácido succínico (0,25-
0,5%) nos alimentos testados (VILJOEN, 2001).
21
Uma das formas de administração do microrganismo S. boulardii como agente
terapêutico é na forma de cápsulas. Uma de suas apresentações (Floratil), possui
100 mg de S. boulardii –17 liofilizado (100 mg de liofilizado contém cerca de 2 x 10
9
células). Devido ao processo de liofilização, o mesmo permanece viável por um
tempo maior. Além deste produto comercial, existem empresas nacionais que
recentemente passaram a comercializar o micorganismo S. boulardii, tais como
Herald’s do Brasil Ltda (Florazin®), Grupo EMS Legrand (Repoflor®), Sigma Farma
(Lactipan®)). Porém, não há dados disponíveis sobre a produção de biomassa desta
levedura em biorreator tipo Air Lift.
3.2.1 Mecanismos de ação do
S. boulardii
3.2.1.1 Proteção ecológica
Dentre os mecanismos utilizados pelo S. boulardii cita-se o de proteção
ecológica. Este pode ser classificado em dois tipos: a) os que impedem a
multiplicação de alvos patogênicos – antagonismo; b) os que impedem a ação
patogênica (modulação de toxinas) (BOUCAUD, et al 1998).
O antagonismo pode ser explicado pelas competições por nutrientes ou sítios
de adesão e também pela produção de metabólitos ou substâncias tóxicas
(RIGOTHIER et al., 1994). O tratamento com S. boulardii reduziu a mortalidade de
ratos jovens infectados com Entamoeba histolítica. Foi observado in vitro, que o
contato entre este protozoário e o S. boulardii, suas membranas ou o sobrenadante
de cultivo da levedura, reduz o número de trofozoítos capazes de aderir a eritrócitos.
Na produção de metabólitos como ácidos orgânicos (tem-se em particular o ácido
lático, ao qual a Salmonella sp. é particularmente sensível) ou o H
2
O
2
(somente nas
partes superiores do trato digestivo, onde o O
2
molecular ainda está presente em
quantidade suficiente para permitir esta produção) (RIGOTHIER et al., 1990).
Apesar de algumas bactérias também modularem a produção de substâncias
tóxicas por microrganismos patogênicos, essa capacidade é uma propriedade
marcante do S. boulardii (CORTHIER; DUBOS; DUCLUZEAU, 1986). Diversos
22
trabalhos mostram que esse agente é capaz de reduzir, em modelos animais ou de
cultura de células intestinais, os danos resultantes da ação de toxinas bacterianas
de Vibrio cholerae (DIAS et al., 1996; VIDON et al., 1986), de Escherichia coli
(ROUX; CZERUCKA; RAMPAL, 1994; MASSOT; DESCONCLOIS; ASTOIN, 1982) e
de Clostridium difficile (CORTHIER; DUBOS; DUCLUZEAU, 1986).
Vários mecanismos podem explicar esta propriedade de modulação de toxina
pelo S. boulardii:
A) Produção de uma proteína de 120 quilodaltons, sem atividade proteolítica,
que reduz a formação do íon cloreto (Cl
-
) mediado pela adenosinamonofosfato
cíclico (AMPc) e canal de cálcio (Ca
+
) em jejuno de rato onde foram adicionadas a
toxina da cólera ou a toxina termolábil de Escherichia coli. A secreção de Cl
-
pelo
epitélio intestinal é responsável pela ligação da toxina colérica em receptores
celulares (CZERUCKA; RAMPAL, 1999);
B) Produção, também, de uma proteína de 54 kD que degrada a toxina A do
Clostridium difficile assim como o seu receptor no enterócito in vitro (POTHOULAKIS
et al., 1993);
C) A presença de receptores específicos na superfície do S. boulardii para
uma toxina da cólera que poderia desviar esta toxina de seus receptores nos
enterócitos, fato este demonstrado utilizando-se a toxina marcada com iodo radiativo
I
125
(BRANDÃO et al., 1998).
3.2.1.2 Imunoestimulação
Outra capacidade do S. boulardii é a de imunoestimulação. Trabalhos
experimentais confirmam essa capacidade estimuladora que se traduz por aumento
dos títulos em anticorpos, da atividade de macrófago, do número de células killer, do
número de células T e de interferon (PERDIGON et al., 1995).
O tratamento com doses inferiores à posologia normal do S. boulardii em
camundongos imunossuprimidos (Ciclofosfamida), protegeu também os animais
conforme revelam os dados de (1) translocação bacteriana para linfonodos
mesentéricos, fígado e baço; (2) histopatologia da mucosa intestinal e (3)
sobrevivência. Houve significativo aumento do número de eritrócitos, hemoglobina,
leucócitos, neutrófilos, células polimorfonucleares, fagócitos, componentes do
complemento como C3, C5 e principalmente Cd3. Houve também aumento da
23
atividade quimiotáxica dos leucócitos e da atividade anticomplementar do soro. Não
foi encontrado aumento significativo do número de eosinófilos, basófilos, monócitos
e de proteínas séricas como albumina e imunoglobulinas. Não foram encontrados
efeitos mutagênicos e nem modificação na população de linfócitos (PÉRET FILHO et
al., 1997).
3.2.1.3 Efeito trófico na mucosa intestinal
Há também o chamado efeito trófico na mucosa intestinal. Este ocorre devido
à presença de poliaminas (espermidina e espermina) em leveduras entre outras
células. Estas são necessárias para suas divisões celulares, sínteses de Ácido
Desoxiribunucleico DNA e de proteínas (TYAGI et al., 1984).
As mesmas poliaminas seriam responsáveis pelos efeitos tróficos na mucosa
do intestino delgado com aumento da atividade das dissacaridases, do conteúdo de
DNA da mucosa, da concentração celular de imunoglobulinas poliméricas, de IgA
secretora, além do aumento do componente secretor de IgA nas células das
vilosidades e criptas (BUTS et al., 1993).
Em estudo realizado no homem, administrou-se, por via oral, o S. boulardii na
dose de 1g /dia por 14 dias a sete voluntários. Houve aumento das enzimas
sacarase, (82%); lactase (77%) e maltase (75%), corroborando os resultados
encontrados em animais (BUTS et al., 1986).
3.3 Crescimento celular
Considera-se como crescimento celular, em sistemas microbiológicos, o
aumento da massa resultante de um acréscimo ordenado de todos os componentes
de protoplasma. Assim, aumentos de tamanho decorrentes de fenômenos como
absorção de água ou acúmulo de material de reserva não pode ser considerado
como crescimento. Em microbiologia, embora seja possível estudar o crescimento
individual, geralmente o que se mede é o crescimento de uma população,
exprimindo-se quer em termos de massa total pela leitura da densidade ótica, quer
em função do número de indivíduos pela contagem da unidade formadora de
colônias por ml (SCHMIDELL et al., 2001).
24
Na biossíntese, as células, também chamadas de biomassa, consomem
nutrientes para crescer e produzir mais células e produtos importantes.
Internamente, a célula usa seus nutrientes para produzir mais células e energia. Esta
transformação dos nutrientes em energia e bioprodutos é realizada por meio de
várias emzimas (catalizadores) que a célula utiliza numa série de reações para
produzir os metabólitos. Estes produtos tanto podem permenecer na célula (produto
intracelular), como podem ser secretados para fora das células (produto extracelular)
(FOGLER, 1999).
Os microrganismos durante seu crescimento apresentam fases
características, que são: I) Fase “lag”, onde inicialmente há um período em que
contagens não revelam aumento do número de células. Essa fase ocorre quando os
microrganismos semeados vêm de uma cultura “velha”, não mais em crescimento
exponencial. É a conseqüência de uma necessidade de renovação dos
microrganismos que, em culturas velhas, já perderam alguns sistemas enzimáticos
por esgotamento do substrato, ou estão deficientes em ácidos nucléicos ou outros
componentes importantes do protoplasma (LIMA et al., 2001).
II) Fase de crescimento exponencial (fase log), que se destaca dentro do
contexto produtivo. Trata-se de um período onde os microrganismos se encontram
na plenitude de suas capacidades, num meio cujo suprimento de nutrientes é
superior às necessidades do organismo semeado. Durante esta fase a velocidade
específica de crescimento (µ) é constante e máxima. Desse modo uma
representação semilogarítmica da concentração celular com o tempo de cultivo
deverá resultar em uma reta (RAMIREZ, 1993).
III) Fase estacionária. Ao fim de certo tempo, variável com a natureza do
microrganismo e condições de cultura, a velocidade de crescimento vai diminuindo
até atingir a fase em que o número de novos organismos é igual ao número de
organismos que morrem.
IV) Fase de declínio. Depois de certo tempo, o número de organismos que
morrem torna-se progressivamente superior ao dos que surgem. Eventualmente a
cultura se torna improdutiva para este microrganismo (LIMA et al., 2001).
O S. boulardii tem a capacidade de utilizar ácidos orgânicos como fonte de
carbono elevando o pH do meio. Em contrapartida, a presença de bactérias
produtoras de ácido lático pode reduzir ou apenas aumentar levemente o pH
(SURIYARACHCHI; FLEET, 1981).
25
O fornecimento de substratos específicos ao meio reacional fermentativo está
relacionado a formação de massa celular. Em processos fermentativos controlados
em que se empregam leveduras do gênero Saccharomyces a glicose é o substrato
limitante principal fonte de energia utilizada no metabolismo responsável pelo
crescimento e multiplicação do microrganismo. Segundo Porro, Brambilla e
Alberghina (2003) alguns trabalhos relacionam o metabolismo da glicose como fonte
de carbono necessária para o crescimento celular.
3.4 Processo Fermentativo Industrial Genérico
O termo fermentação é derivado doa verbo Latin fervere (ferver), descrevendo
a ação da levedura em extratos de frutas e cereais maltados. A indústria do
processo teve início nos Estados Unidos pela Fleischmann em 1868.
Aperfeiçoamentos na engenharia tecnológica trouxeram juntamente com os
conhecimentos da bioquímica das fermentações uma grande fundamentação para a
moderna indústria de processos fermentativos. Atualmente muitas leveduras como o
Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii, Pichia guilhermondii, entre outras são
utilizadas em processos industriais de grande importância econômica. O processo
fermentativo industrial genérico é um processo complexo que pode ser representado
em seis etapas principais (STANBURY; WHITAKER , 1995):
• A formulação do meio para ser usado no cultivo do microrganismo durante o
desenvolvimento do inóculo e na produção de biomassa e/ou metabólitos
secundários;
• A esterilização do meio,
26
Todo o processo fermentativo requer uma série de cuidados a fim de que
obtenha uma produtividade desejada, como, por exemplo, a esterilização do meio.
Um processo fermentativo pode ser levado adiante com grande perda de tempo e
material até que se identifique a presença de um microrganismo contaminante.
Muitas substâncias químicas industriais e vários antibióticos são produzidos
por fermentação sob condições controladas. Alguns dos processos fermentativos
empregados são: processo descontínuo (batelada tradicional), processo descontínuo
alimentado, processo contínuo, processo semi-contínuo e em estado sólido.
3.4.1 Processo descontínuo tradicional (batelada)
O processo fermentativo descontínuo vêm sendo utilizada pelo homem desde
a antiguidade e, ainda hoje, é a mais empregada para obtenção de vários produtos
fermentados. Este tipo de processo fermentativo possui vantagens sobre os demais,
no que tange a possíveis contaminações visto que não são adicionados substratos
no decorrer do processo. Desvantagens ficam por conta da produtividade menor já
que em processos contínuos a obtenção do substrato ocorre de maneira mais
dinâmica devido a adição constante dos substratos necessários.
Seu modo de operação pode ser descrito assim: no instante inicial a solução
nutriente esterilizada é inoculada com o microrganismo e incubada no biorreator, de
modo a permitir que o processo fermentativo ocorra sob condições controladas e
seguras. No decorrer do processo fermentativo nada é adicionado, exceto oxigênio
(no caso de processos aeróbicos), antiespumante, e ácido ou base para controle de
pH. Terminada o processo, descarrega-se o biorreator, e o meio fermentado segue
para os tratamentos finais (MAIORELLA; BLANCH; WILKG, 1981).
3.4.2 Processo Batelada Alimentada (
Melle-Boinot
)
Segundo Drews (1964), o processo clássico de batelada simples
(descontínuo) foi sendo rapidamente substituído pelo processo Melle-Boinot. Em
meados dos anos 70 praticamente todas as destilarias já operavam o processo de
batelada alimentada. O processo se baseia na alimentação contínua e crescente do
substrato à dorna (sem purga, que é a retirada do microorganismo ou seu produto do
27
metabolismo, e até o volume máximo deste), seguindo a curva de crescimento da
massa celular e conseqüente taxa de consumo de substrato, de maneira que a
concentração de açúcares totais permaneçam baixas e constantes,
de modo que
este não represente um fator de inibição do crescimento celular. Neste processo é
empregado um tratamento ácido (pH entre 2,5 e 4,5) do creme de leveduras, com a
finalidade de eliminar contaminantes e utilização deste como inóculo para a próxima
batelada. Este método é utilizado na produção de levedura de panificação
(CARVALHO; SATO, 2001).
3.4.3 Processo Contínuo
O interesse pelo processo contínua no Brasil intensificou-se na década de 80,
devido a redução dos custos de produção e devido a incentivos do programa Pró-
álcool. Novos processos foram sendo desenvolvidos e desde então produtos com
elevada produtividade são obtidos desta maneira como é o caso da extração à
vácuo do álcool que reduz a toxicidade celular do produto produzindo um mosto três
vezes mais concentrado. O diferencial do processo está no uso de um tanque à
vácuo (o vácuo é obtido pelo uma coluna de água), acoplado ao sistema de
fermentação contínua que permite extrair o etanol durante o processo fermentativo
(ZARPELON; ANDRIETTA, 1992; ANDRIETTA; STUPIELLO, 1990; ANDRIETTA;
MAUGERI-FILHO, 1994).
A produção industrial de substratos, produtos de metabolismo ou massa
celular visa uma alta produtividade aliada a baixos custos. Um dos fatores aplicados
para desonerar o processo fermentativo é a reciclagem sucessiva de células
Para a reciclagem de células a cada processo fermentativo, emprega-se a
centrifugação sendo que, a redução dos componentes reciclados com a levedura
podem melhorar o processo fermentativo (LEÃO; VAN UDEN, 1984; OKOLO;
JOHSTON; BERRY, 1987; MARQUES; SERRA, 2004).
3.5 Cultivo em agitador incubador de bancada
O agitador incubador é um equipamento aplicável em testes que necessitem
28
de agitação orbital constante e temperatura controlada. Apresenta variação mínima
de temperatura, possibilitando variações ambientais diversas e é empregado
especialmente em laboratórios de biologia, microbiologia e biotecnologia. É de
grande versatilidade quando se objetiva reproduzir um meio fermentativo com
condições de temperatura homogênea em todo sistema, aeração e velocidade de
agitação constantes. É um equipamento freqüente em laboratórios com este
propósito, possuindo também baixo custo de manutenção (BARROS e HIRATA,
2002).
Em estudos realizados por Barros (2002) foi utilizado o agitador de bancada
para avaliar alguns parâmetros de crescimento do Saccharomyces boulardii. A
freqüência de agitação utilizada foi de 200 min.
-1
, com amplitude de agitação de 2,8
cm. As condições de cultivo foram: 45 mL de meio de cultura e 5 mL de inóculo,
correspondente a 10 % do volume total do erlenmeyer. Variáveis como temperatura
de 30 °C e 36,5 °C e concentração de glicose de 10, 20 e 40 g/L foram comparadas.
Os resultados mais promissores foram aqueles que combinaram a concentração de
glicose de 10 g/L e temperatura de 30 °C. Nestas condições a conversão de
substrato em células foi de 44,9 % ou seja, 90 % do valor teórico para
microrganismos aeróbios, a velocidade específica de crescimento do microrganismo
(µ) na fase exponencial foi 0,3563 h
-1
.
O mesmo tipo de agitador incubador foi também utilizado por
Ribeiro e Horii
(1999) que estudaram
três linhagens de levedura da espécie Saccharomyces
cerevisiae a 30
o
C por 24h. Foram avaliadas para se verificar seus desempenhos,
sob parâmetros cinéticos, bem como a formação de compostos secundários no
processo do caldo de cana-de-açúcar, destinado à produção de aguardente.
3.6 Biorreator
Air-lift
O biorreator Air-lift (Figura 1) é empregado em processos em batelada,
composto de uma torre com relação altura/diâmetro elevada e com ligação entre o
líquido do topo e da base com volume máximo de 2300 mL. O gás é injetado pela
base do equipamento pelo um distribuidor formando uma dispersão gás-fluido. As
bolhas do gás sobem pelo líquido contido na torre deslocando-o, provocando assim
29
turbulência e autocirculação dirigida. O gás é retirado no topo do equipamento. A
turbulência gerada e a grande distância que as bolhas de gás devem atravessar, em
contato com o líquido, promovem altos níveis de transferência de oxigênio. Este tipo
de biorreator pode proporcionar processos de produção de microrganismos em
escala industrial, sem limitação de oxigênio local, proporcionando uma eficiente
mistura, além de apresentar forças de cisalhamento muito baixas, preservando os
tecidos, principalmente os micelianos que se apresentam mais frágeis (MERCHUK,
1990).
O biorreator Air-lift é de construção simples e de baixo custo, possibilitando
uma manutenção fácil e econômica. Como não existem partes mecânicas móveis
necessárias para a agitação, há redução do perigo de contaminação facilitando a
limpeza e a esterilização. A injeção do gás serve para agitar e aerar, eliminando o
gasto de
30
A primeira zona de expansão de gás é denominada riser, onde o gás é
injetado pela base do equipamento pelo um distribuidor, formando uma dispersão
gás-líquido. As bolhas de gás sobem pelo líquido contatando-o e deslocando-o.
Essa seção tem maior gás-holdup (fração volumétrica de gás na zona de dispersão)
e é onde ocorre a maior transferência de massa.
Figura 01
: Biorreator tipo Air-lift (PEDRINI et al., 1999).
O líquido deixa o topo do riser e entra na zona de desprendimento do gás e, com
uma menor quantidade de gás, escoa em sentido contrário pelo downcomer até o
31
fundo do biorreator, retornando ao riser. Dessa forma, a fase líquida circula
continuamente no biorreator (SIEGEL; ROBINSON, 1992).
É de grande importância o desenho do separador de gás, neste caso de
circulação externa, para evitar o transbordamento do líquido, assim como também a
manutenção da homogeneidade
.
Como a força motriz da circulação de líquido é a
diferença de densidade média ou da pressão hidrostática entre as seções do riser e
do downcomer o Air-lift de circulação externa, permite um maior desprendimento de
gás, resultand
32
Classificada dentro dos métodos modernos de análise química e ocupando
um lugar de merecido destaque, é muito utilizada para quantificação, separação e
identificação de espécies químicas (GOBATO; LANÇAS, 2001).
Quando a concentração de amostras de interesse é muito baixa, inferior ao
limite de detecção, o enriquecimento da amostra torna-se necessário. Várias
técnicas de enriquecimento baseadas em princípios físico-químicos estão
disponíveis. Sendo necessário a analise de amostras gasosas ou voláteis em
matrizes sólidas ou líquidas, pode-se empregar a técnica denominada Head space
(COMPTON, 1992).
A técnica de Head space é usada para designar a fase gasosa imediatamente
acima da fase sólida ou líquida, armazenadas em um recipiente hermeticamente
fechado. A amostra contida no frasco deve ser volátil. A mesma é aquecida até uma
temperatura adequada, próxima de seu ponto de ebulição onde então, retira-se uma
amostra da fase gasosa para injeção e análise no cromatógrafo gasoso. (DE MARIA;
MOREIRA, 2003).
Segundo a “Lei de Raoult” em soluções ideais a pressão parcial do solvente
sobre uma solução é dada pelo produto da pressão de vapor do solvente puro pela
fração molar do solvente na solução (ATKINS, 1999).
O composto a ser analisado (analito) é, necessariamente, mais volátil que a
matriz, podendo ser determinado sem a interferência de outros componentes da
amostra, pela análise do vapor desprendido do analito. Assim torna-se possível
determinar componentes voláteis na amostra de forma direta. Além disso, a técnica
de head space torna-se insubstituível e muito eficiente, pois possibilita a introdução
da amostra sem pré-tratamento no cromatógrafo a gás (GOBATO; LANÇAS, 2001).
O uso da cromatografia gasosa, pela técnica de Head-space, aplicada para
analisar etanol em fluidos biológicos como o sangue, demonstrou resultados
promissores. A reprodutibilidade para os fluídos biológicos testados resultaram em
coeficientes de variação entre 0,8 e 2,9 % e o ensaio de recuperação uma média de
99 %. A linearidade foi verificada na faixa de 0,01 a 20 g/L para o etanol em solução
aquosa e o limite de detecção foi de 0,01 g/L. A quantificação do etanol pela técnica
de head space demonstrou ser um método altamente seguro, sendo necessária
uma pequena quantidade de amostra (0,1 mL). O uso do padrão interno e uma
possível manipulação da amostra não foram necessárias (MACCHIA et al., 1995).
Em um estudo da produção de compostos voláteis majoritários no processo
33
do mosto de uva pelas leveduras Kloeckera apiculata e Saccharomyces cerevisiae
foi utilizado a técnica de head space dinâmico para o isolamento dos compostos
voláteis, dentre eles o etanol. A técnica de head space dinâmico consiste em um
sistema fechado de injeção, onde o gás de arraste passa pelo frasco contendo o
analito, arrastando-o para os compartimentos que aprisionam a amostra volatilizada,
fazendo sua injeção automática, controlada por computador (MAMEDE; PASTORE,
2004).
A técnica de head space dinâmico acoplado diretamente ao GC/MS
(cromatógrafo gasoso com detector de espectroscopia de massa) foi também
utilizada para a análise de compostos voláteis presentes em 84 tipos de mel de 14
tipos florais oriundos de 10 países. Foram identificados alguns álcoois (etanol,
isobutanol) dentre outros compostos característicos. Também compostos como
hexanal e heptanal, acetona, dicetonas, alcanos e compostor sulfurosos. A técnica
de head space dinâmico utilizou o injetor do tipo “purge and trap” no qual a amostra
é injetada no próprio detector, minimizando desta maneira interferentes no processo.
(DE MARIA; MOREIRA, 2003).
34
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Microrganismo
A espécie em estudo, Saccharomyces boulardii foi obtida a partir do
medicamento comercializado sob o nome Floratil
- Merck - Indústria Farmacêutica
(lote 1013161, validade 12/2003). Cada cápsula de 100 mg contém cerca de 2x10
8
células de S. boulardii-17 na forma liofilizada.
4.1.2 Reagentes e outros Materiais
• Sulfato de sódio anidro (Analítica);
• Sulfato de magnésio (Analítica);
• Método enzimático Glicose PAP Liquiform (Labtest Diagnóstica);
•
35
•
Lacres de Alumínio 20 mm;
• Recravador manual 20 mm “tipo Vick” ;
• Seringa de Hamilton 250 µL, embolo de borracha, mod. 1725N-250 UL,
agulha 22S;
• Gás Hidrogênio (White Martins);
• Gás Nitrogênio (White Martins);
• Ar sintético (White Martins).
4.1.3 Meio de cultura
O meio de cultura utilizado apresentou a composição mostrada na
Tabela 02.
Na composição do meio de cultura, foram levados em consideração os
principais elementos constituintes da célula microbiana, principalmente a
concentração de carbono. Em sistemas aerados o rendimento do substrato em
células, teoricamente, se encontra na faixa de 0,5, sabendo-se que 50% do corpo da
célula constitui-se de carbono. Também foram consideradas as concentrações de
nitrogênio, fosfato, enxofre, vitaminas do complexo B e magnésio, de maneira a
produzir uma quantidade de células, em relação ao percentual do peso seco,
correspondente a 10 vezes a quantidade inicial (QUINTERO, 1993).
Tabela 02:
Composição do meio de cultura utilizado no processo descontínuo
Substâncias
Quantidade g/L
Glicose anidra
10
Peptona de carne
2
Extrato de levedura
2
KH
2
PO
4
0,6
Uréia
0,36
Sulfato de amônio
0,12
Sulfato de magnésio
H
2
O
0,24
qsp. 1000mL
FONTE: PELCZAR; REID; CHAN, 1996.
36
4.1.4 Equipamentos
- Balança semi analítica (Marte AS 2.000);
- Balança analítica (Bel - 210);
- Cabine de segurança biológica Classe IIA (Veco VLFS – 12);
- Autoclave vertical (Phoenix AV - 75);
- Banho termostatizado ( Marconi BTC 9090);
- Agitador incubador de bancada (Marconi –712);
- Biorreator tipo “Air-lift” em vidro com capacidade de 2.300 mL;
- Espectrofotômetro de feixe simples (Micronal B - 442);
- Espectrofotômetro de duplo feixe (Shimadzu UV - 1601);
- pHmetro com compensação manual de temperatura (Digimed DM – 20);
- Cromatógrafo gasoso (Shimadzu CG – 14B);
- Coluna capilar ( HP-PORAPLOT Q);
- Motocompressor (Schulz MSV – 6,0);
- Estufa de cultura microbiológica (Marconi );
4.2 Métodos
4.2.1 Preparo do Meio de Cultura
Os substratos (Tabela 02) foram pesados em balança semi-analítica e
solubilizados com água purificada, sendo o volume completado com água em
proveta, obtendo-se o meio de cultura.
Para o processo em agitador incubador foram utilizados erlenmeyers de 500
mL de capacidade contrendo 45 mL de meio de cultura, tampados com tampão de
algodão hidrófobo e gaze (os tampões possuíam o mesmo peso para evitar
diferença de fluxo de ar para dentro dos frascos durante o processo). Os
erlenmeyers tampados foram esterilizado em autoclave por 20 minutos à 121°C
(RUBILAR, 1987).
Para o processo em Air-lift, foram transferidos 2.070 mL de meio de cultura
para um kitassato de 4.000 mL. Este volume contido no kitassato foi esterilizado em
37
autoclave à 121°C, por 30 minutos portanto, 10 minutos a mais devido ao maior
volume de meio (RUBILAR, 1987).
4.2.2 Obtenção do Inóculo
Foram preparados erlenmeyers de 500 mL, cada um recebendo 50 mL de
meio previamente esterilizado em autoclave. O pré-inóculo foi preparado em
condições assépticas, utilizando-se levedura liofilizada (Floratil®), sendo as cápsulas
previamente desinfetadas externamente com gase estéril embebido em solução de
hipoclorito de sódio a 1%. Foram transferidos 100 mg da levedura liofilizada
(Floratil
) para cada 100 mL de meio de cultura esterilizado, (transferindo-se o
volume de dois erlenmeyer para um) obtendo-se uma concentração de 1 mg/mL. A
seguir foi homogeneizado por dois minutos em agitador incubador. Em seguida, o
volume de 100 mL foi novamente dividido em dois erlenmeyer. Após 12 horas sob
agitação de 200 min
-1
em agitador-incubador à 30
°
C obteve-se o inóculo.
A densidade ótica do inóculo foi medida fornecendo a concentração celular.
Foi adotado um limite de concentração celular mínima em 3,9 g/L para que valores
baixos fossem descartados e não interferissem no processo celular.
4.2.3 Cultivos
O cultivo das células foi realizado utilizando-se duas técnicas: cultivo em
agitador-incubador (Figura 2) e em biorreator Air-lif (Figuras 1 e 3).
4.2.4 Cultivo em agitador incubador
Para cada ensaio foram preparados 11 erlenmeyers, contendo 50 mL de volume
final de trabalho, sendo 45 mL de meio de cultura esterilizado, (conforme item 4.2.1)
e 5 mL de pré-inóculo (conforme item 4.2.2), adicionado em cabine de segurança
biológica.
Dos 11 frascos erlenmeyers, dez foram colocados em agitador incubador de
bancada rotativo, com sistema de aeração forçada, sob agitação de 200min
-1
a 30
±
1
°
C. O primeiro erlenmeyer foi considerado o momento inicial do processo
38
fermentativo (tempo zero, t
0
), e os demais foram retirados do agitador incubador em
intervalos regulares de uma hora até o limite de 12 horas. As variáveis analisadas
foram: concentração celular (g/L), pH, concentração de glicose (g/L) e concentração
de etanol (g/L).
Figura 02:
Agitador incubador de bancada
4.2.5 Cultivo em biorreator
Air-lift
O biorreator tipo Air lift utilizado foi construído de acordo com Pedrini et al.
(1997) e possui sistema de circulação externa com controle de temperatura no
downcomer (Figura 01).
Para cada ensaio foi preparado um erlenmeyer de 4000 mL, contendo 2.300
mL de volume final de trabalho, sendo 2.070 mL de meio de cultura esterilizado,
(conforme item 4.2.1) e 230 mL de pré-inóculo (conforme item 4.2.2), adicionado em
condições assépticas e posteriormente sob a chama de bico de Bunsen como
segundo recurso de esterilização para a abertura do erlenmeyer antes de vertê-lo.
Juntamente com o meio de cultivo foi adicionado 0,2% v/v de antiespumante
volume este definido pelo ensaio com insulflamento de ar (Tab. 03) com quantidades
crescentes do antiespumante.
O pré-inóculo preparado no erlenmeyer foi vertido no biorreator sob a chama
de um bico de Bunsen. O fluxo de ar no sistema foi regulado externamente em 1,0
ou 1,5 vvm (Volume de ar por Volume de meio, por Minuto) com temperatura
39
controlada de 30 ± 1 °C pelo trocador de calor colocado no downcomer (circulação
do meio descendente e lateral composta por camisa com circulação independente
de água para o controle de temperatura do sistema).
Figura 03:
Biorreator com agitação aerada do tipo “Air-lift” (PEDRINI et al., 1997)
No tempo zero (t
0
) e a partir a segunda hora em intervalos regulares de uma
hora, foram retiradas amostras de 35 mL para as análises da concentração de
microrganismos, concentração de glicose, pH e concentração de etanol.
A figura 4 resume as metodologias de cultivo utilizadas:
40
Figura 04
: Fluxograma dos processos descontínuos
4.3
Análise dos Processos Fermentativos descontínuos
4.3.1 Análise da concentração celular
Para elaborar a curva de calibração do método, inicialmente foram tomadas
duas alíquotas de 20 mL de cultivo, as quais foram filtradas pelo seringa acoplada
Meio de cultura
+ liofilizado (1mg/mL)
Inóculo
Cultivo em
Agitador
incubador
30°C, 12 h,
200 min
-1
Cultivo em
Air Lift 30°C,
12 h, 2300 mL,
1 e 1,5 vvm
Meio de
cultura
Análises:
- pH
- concentração celular
- Glicose
- Etanol
Esterilização 121 °C, 20 min.
Levedura liofilizada
100 mg, conc. Glic.
10 g/L.
Inoculação em cabine de
segurança biológica
Agitação em agitador-
incubador 30°C, 12 h,
200 min
-1
41
ao sistema de filtração composto de membranas de acetato de celulose 25 mm
(Millipore) com tamanho de poro de 0,22 µm. As membranas foram posteriormente
dessecadas a 40 °C, até massa constante (m). A concentração celular (C) foi
calculada pela relação entre a massa de cada membrana dessecada (descontando-
se a massa constante da própria membrana) e o volume de amostra filtrado (V)
conforme a equação 01:
C = m(g) Equação 4.01
V (L)
O meio de cultivo, com concentração celular conhecida, foi diluído com água
purificada, em oito diferentes concentrações, na faixa de 0,04 a 0,4 g/L. A
absorbância de cada solução, homogeneizada, foi medida em espectrofotômetro de
feixe simples no comprimento de onda de 610 nm, utilizando cubetas de acrílico com
1cm de caminho óptico
e o meio de cultivo como branco. A leitura da absorbância foi
realizada em duplicata.
A curva de calibração foi elaborada plotando-se a média dos valores da
absorbância em função da concentração celular. Foi realizada uma análise de
regressão linear, usando o software Excel 3.0 e calculado o quadrado do coeficiente
de correlação (R
2
) e a equação da reta. O método demonstrou linearidade no
intervalo de 0,04-0,28 g/L, com R
2
de 0,9995, conforme mostrado na figura 05.
A absorbância das alíquotas retiradas dos processos (agitador incubador e
Air-lift) nos diferentes tempos (itens 4.2.4 e 4.2.5) foi lida (em triplicata), segundo
mesmo procedimento descrito na elaboração da curva de calibração de
concentração celular e, pela equação da reta (figura 05), foi calculada a
concentração celular das amostras. Para as concentrações celulares que ficaram
acima da linearidade do método foram realizadas diluições para adequar os valores
a linearidade e posteriormente calculados as correções referente à diluição.
42
y = 1,854x + 0,0135
R
2
= 0,9995
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0
0,04
0,08
0,12
0,16
0,2
0,24
0,28
0,32
Concentração Celular (g/L)
Absorbância
Figura 05:
Curva de calibração de concentração celular do
S. boulardii
4.3.2 Análise do consumo de substrato (Glicose)
O consumo de glicose do meio foi quantificado pelo método enzimático
Glicose PAP Liquiform® (Labtest Diagnóstica). Este método tem como princípio uma
reação em que a glicose oxidase (GOD) catalisa a oxidação da glicose de acordo
com a seguinte reação:
GOD
Glicose + O
2
+ H
2
O Ácido Glucônico + H
2
O
2
Para quantificar o consumo de glicose durante os cultivos, as alíquotas
retiradas nos diferentes tempos foram filtradas pela membrana filtrante Millipore
0,22
µ
m a fim de separar as células contidas no meio fermentado. As amostras
filtradas foram armazenadas em geladeira (2 a 8
°
C) durante o cultivo, até o
momento da realização da análise de glicose, sendo submetidas ao teste após
atingir a temperatura ambiente. A absorbância das amostras foi lida em duplicata,
conforme descrito na elaboração da curva-padrão de glicose e, pela equação da reta
(figura 06), foi calculada a concentração de glicose.
43
O peróxido de hidrogênio formado reage com o 4-aminoantipirina e o fenol
sob ação catalisadora da peroxidase, pelo uma reação oxidativa de acoplamento
que forma a antipirilquinonimina, de cor vermelha cuja intensidade de cor é
proporcional à quantidade de glicose na amostra (BERGMEYER, 1986).
Foi construída uma curva de calibração de glicose elaborando-se 7 diferentes
concentrações, na faixa de 0,06-0,36 g/L, descontando-se a umidade do padrão, de
2,76%. Após a reação citada acima, foi lida a absorbância de cada solução, em
duplicata, em espectrofotômetro de duplo feixe no comprimento de onda de 505 nm,
utilizando-se cubeta de acrílico de 1cm
de caminho óptico, e reagente 1 (peroxidase)
como branco. A equação da reta foi calculada pelo regressão linear, utilizando-se o
software Excel 3.0. O método apresentou linearidade na faixa de 0,06-0,36 g/L, com
R
2
de 0,9989, conforme mostra a figura 06.
y = 3,0407x + 0,1986
R
2
= 0,9989
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0
0,06
0,12
0,18
0,24
0,3
0,36
0,42
Concentração de glicose (g/L)
Absorbância
Figura 06:
Curva de calibração para glicose no meio de cultivo
4.3.3 Medida do pH
O pH foi medido potenciometricamente em pHmetro com compensação
manual de temperatura, usando eletrodo de cerâmica pontual (Digimed DME-CV1),
conforme Farmacopéia Brasileira (1988).
Antes de se medir o pH, em cado processo, foi realizada a calibração do
44
pHmetro com tampões padronizados pH 4,01 e pH 7,01 e a recuperação do eletrodo
com ácido e base após a leitura subseqüente das alíquotas de três processos
fermentativos.
4.3.4 Análise da produção de etanol
A análise de etanol foi realizada por cromatografia utilizando-se a técnica
de head-space.
a) Procedimento da Técnica
head space
manual:
Em um frasco de vidro de
10 mL contendo 1,0 g de Sulfato de sódio anidro adicionou-se 2,0 mL da alíquota
dos cultivos, conforme descrito no item 6.3.1. O frasco foi fechado imediatamente
com septo de teflon e selado com lacre de alumínio.
O frasco foi colocado por 30 minutos em estufa de secagem previamente
aquecida a 75°C ± 5°C e, com auxílio de uma microseringa tipo Hamilton (própria
para gases), 50 µL da fase vapor foi injetada manualmente no cromatógrafo. A
seringa juntamente com a agulha foi previamente aquecida durante 15 minutos na
mesma temperatura para evitar a condensação de vapores. Esse experimento foi
realizado em triplicata.
b) Análise cromatográfica:
O equipamento utilizado foi um cromatógrafo
Shimadzu, modelo CG 14B provido de detector de ionização de chama (DIC),
equipado com uma coluna capilar de sílica fundida PQ-Poraplot Q (Varian), com 12,5
m de comprimento e 0,32 mm de diâmetro interno. O método utilizado foi da
padronização externa e as condições cromatográficas foram: temperatura: coluna :
isoterma em 100
°
C por 15 minutos; injetor em 230
°
C; detector em 250
°
C; split:
1:10; gás de arraste: hidrogênio (1mL/min.). O processamento de conversão dos
dados analógicos para digital foi realizado pelo software Microquímica.
4.3.5 Curva de Calibração
As curvas de calibração foram obtidas a partir de soluções aquosas contendo
etanol nas concentrações de 0,16 a 12,560 g/L, submetidas ao procedimento de
45
head space descrito no item 4.3.4.a). Cada concentração foi analisada em triplicata.
As curvas foram realizadas em triplicata e cada curva foi construída com a média
dos valores encontrados para cada concentração. Plotou-se um gráfico da área
média do pico do etanol em função da concentração de etanol nas respectivas
soluções padrões. Foi realizada uma análise de regressão linear, usando o software
Origin 5.0 e calculado o coeficiente de correlação e a equação da reta. O método
demonstrou linearidade no intervalo de 0,16 - 12,56 g/L, com R de 0,99, conforme
mostrado na figura 07.
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
15,0
1
2
3
4
5
6
7
Y = A + B * X
Parameter
Value
Error
------------------------------------------------------------
A
0,03967
0,11401
B
4,48288E-4
1,8538E-5
------------------------------------------------------------
R
SD
N
P
------------------------------------------------------------
0,99491
0,22235
8
<0.0001
------------------------------------------------------------
1ª curva
2ª curva
3ª curva
curva média
Área média de etanol
Concentração de etanol (g/L)
Figura 07:
Curva de calibração do etanol pelo método de CG com head-space
4.3.6 Quantificação de etanol nas amostras
Para quantificar a produção de etanol durante os cultivos, as alíquotas
retiradas nos diferentes tempos foram filtradas pelo membrana filtrante Millipore
0,22
µ
m. As amostras filtradas foram envasadas, conforme descrito no item 4.3.4.a) e
congeladas em freezer até o momento da análise, na temperatura de -20 °C. Foram
calculadas as médias das triplicatas das áreas registradas no CG e, pela equação da
reta (figura 07), foi calculada a concentração de etanol.
46
4.4 Validação analítica do método de quatificação de etanol por CG com
head
space
manual
A necessidade de se mostrar a qualidade em medições químicas, pelo sua
comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais exigida
(RIBANI et al., 2004). Neste contexto, a validação de um método deve garantir, pelo
estudos experimentais, que este atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados, de acordo com as normas oficiais
(BRASIL, 2003).
O método de quantificação do etanol produzido durante os cutivos, por CG
usando head space manual foi validado baseando-se na United States
Pharmacopea (2000) e na RE 899 (BRASIL, 2003) sendo classificado como um
ensaio de categoria I (doseamento de componente principal). Portanto, para a
validação deste método foi exigida a determinação dos seguintes parâmetros:
exatidão, precisão, linearidade, sendo adicionalmente estimado o limite de detecção
e de quantificação.
4.4.1 Linearidade e faixa de aplicação
A Linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica em demonstrar
que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito
na amostra, dentro de um intervalo especificado. A faixa de aplicação está
compreendida entre os limites de quantificação superior e inferior de um método
analítico. Normalmente é derivado do estudo de linearidade e depende da aplicação
pretendida do método (VENERANDA, 2004).
A linearidade é determinada por tratamento matemático dos resultados
obtidos nas análises, de amostras contendo concentrações de analito na faixa
alegada para o método. Esse tratamento geralmente é a regressão linear, pelo
método dos quadrados mínimos.
É usualmente expressa em termos da variância em
torno da inclinação da reta da linha de regressão calculada de acordo com uma
relação matemática estabelecida, a partir de resultados obtidos na análise de
amostras com diferentes concentrações do analito (BARROS et al., 2002).
Para quantificar o composto de interesse é possível utilizar o método da
padronização externa. Este método consiste em comparar a área da substância a
47
ser quantificada na amostra com áreas obtidas de soluções com a substância a ser
quantificada em diversas concentrações. Assim se obtém uma relação entre área e
concentração. Pelo gráfico ou da equação da curva resultante é possível de se
calcular a concentração desta substância na amostra (RIBANI et al, 2004).
Em contrapartida, outro método utilizado para a quantificação de compostos é
o da padronização interna. Este método consiste na preparação das soluções
padrão de concentrações conhecidas da substância de interesse, às quais se
adiciona a mesma quantidade conhecida de um composto chamado de padrão
intern
48
a)
Repetibilidade
(precisão intra-corrida): concordância entre os resultados
de um mesmo método, dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista,
mesma instrumentação sob as mesmas condições e mesmo local. A repetibilidade
do método é verificada por, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o
intervalo linear do método, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com
3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da concentração do
teste.
b)
Precisão intermediária
(precisão inter-corridas): expressa as variações
dentro do laboratório, em diferentes dias, diferentes analistas, diferentes
instrumentos. Para a determinação da precisão intermediária recomenda-se um
mínimo de dois dias diferentes com analistas diferentes
c)
Reprodutibilidade
(precisão inter-laboratorial): concordância entre os
resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos colaborativos,
geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para
inclusão de metodologia em farmacopéias. A precisão pode ser expressa como
desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV) não se admitindo
valores superiores a 5% segundo legislação vigente (BRASIL, 2003).
Há autores que citam que o coeficiente de variação desejado para o ensaio
de teor de macrocomponentes é de 2% para o sistema e de 1% para o instrumento
(BARROS et al., 2002). Green (1996) sugere como critério de precisão para uma
ensaio analítico um CV de no máximo 1% para a repetibilidade de injeções da
mesma amostra e no máximo 2% para a repetibilidade intra-corrida e a RE 899
(BRASIL, 2003) estabelece máximo de 5%.
A precisão do método
de quantificação do etanol por CG usando head space
manual foi determinada pela precisão intermediária (precisão inter-corrida), sendo
realizada uma vez por dia, por dois analistas diferentes e em 3 dias diferentes.
Juntamente com as amostras de cada processo fermentativo, injetou-se no mesmo
dia uma amostra padrão de etanol com concentração conhecida, em triplicata.
Foi calculado o desvio padrão relativo (DPR), sendo desejável um DPR de no
máximo 5% (BRASIL, 2003). Outros autores como Green (1996) citam um DPR
aceitável para a quantificação de um macrocomponente de até 2%, no caso da
precisão intermediárias, enquanto que, para impurezas seria aceitável um DPR de
até 10%.
49
4.4.3 Exatidão
A exatidão traduz a concordância dos valores experimentais com o valor
verdadeiro, ou seja, é o grau de compatibilidade entre valor médio obtido de uma
série de resultados e o valor de referência aceito. Resultado exato é o resultado
ideal, sem erro sistemático (BARROS, 2002; LEITE, 2002).
Exatidão perfeita ou ideal não pode ser alcançada. Portanto, exatidão em seu
significado analítico é sempre considerada dentro de certos limites. Estes limites
podem ser estreitos ao nível de concentrações elevadas, e largos ao nível de traços
(BARROS, 2002). Apesar de não haver critério de aceitação especificado nas
normas oficiais, Green (1996) cita uma variação aceitável de ± 2% para a avaliação
de macrocomponentes, porém para avaliação de impurezas, usando métodos de
maior complexidade, este autor estipula variações aceitáveis de 10-20%. Já o
INMETRO estabelece variação aceitável entre 70-120%, para este último caso
(GARP, 1999).
A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da
linearidade e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de no mínimo
nove determinações dentro do intervalo linear ou sejam três concentrações baixa,
média e alta com três replicatas cada.
A exatidão é expressa pela relação entre concentração média determinada
pelo método e a concentração teórica correspondente (Equação 4.02):
Exatidão = concentração média experimental x 100 Equação 4.02
concentração teórica
São utilizadas diferentes estratégias para inferir a exatidão de um método
analítico:
a) Comparação de métodos
: comparar o procedimento do teste proposto com um
segundo teste, do qual a exatidão é definida e resulta no valor de 100 % (por
exemplo: método previamente validado) (BRASIL, 2003). Foi comparado com outro
método de referência, no caso a cromatografia gasosa com head space automático
e usando padrão interno (em colaboração com o Instituto Médico Legal (IML-SC) por
intermédio da professora Dra. Alvorita Bittencourt). Foi utilizado o head space -
marca Tecmar 7000, CG - Trace GC 2000, coluna Poropack Q 6 pés de níquel,
50
diâmetro interno 0,2 cm, fase móvel hélio 25 mL/min, ar sintético (350) e hidrogênio
(15), Temperatura do injetor 230ºC, coluna 200ºC, detector FID 230ºC.
O meio de cultura esterilizado em autoclave (matriz) foi “contaminado” com
etanol, em concentrações crescentes de 0,23; 0,58; 1,60 e 3,51 g/L, em triplicata.
Uma alíquota de 1mL de cada uma destas soluções (matriz contaminada com
concentrações crescentes de etanol) foi adicionada em frascos de análise próprios
para a técnica de head space, com capacidade para 22 mL, acrescido de 1mL de
padrão interno (n.-propanol 99,99% pureza, Merck), para posterior análise. A
recuperação do etanol foi calculada pela equação 4.03.
% Recuperação = concentração média experimental X 100 Equação 4.03
concentração teórica
b) Ensaio de recuperação:
A recuperação (ou fator de recuperação), R, é a
proporção da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada na
porção analítica do material teste, que é extraída e passível de ser quantificada
(THOMPSON et al., 1999). O ensaio de recuperação consiste na “contaminação” de
um placebo ou matriz, isenta do analito e, após subemeter ao método, é calculada a
porcentagem de recuperação do analito.
A exatidão do método analítico utilizado neste trabalho foi inferida de duas
formas: i) pela comparação de resultados obtidos com a metodologia desenvolvida
na UNIVALI com aqueles realizados em um CG com head space automático e
usando padrão interno (em colaboração com o IML-SC) e ii) pelo ensaio de
recuperação, usando o método de CG com head space manual.
No primeiro caso (i) o meio de cultura esterilizado em autoclave (matriz) foi
“contaminado” com etanol, em concentrações crescentes de 0,23; 0,58; 1,60 e 3,51
g/L, em triplicata. Uma alíquota de 1mL de cada uma destas soluções (matriz
contaminada com concentrações crescentes de etanol) foi adicionada em frascos de
análise próprios para a técnica de head space, com capacidade para 22 mL,
acrescido de 1mL de padrão interno (n.-propanol 99,99% pureza, Merck), para
posterior análise. A recuperação do etanol foi calculada pela equação 4.02.
No segundo caso (ii) foi aplicado o ensaio de recuperação usando o mesmo
método de CG com head space manual, um volume fixo de 2 mL do meio de cultura
estéril (matriz) foi colocado em frascos com capacidade de 22 mL com volumes
51
crescentes de uma solução padrão de etanol grau CLAE (99,9%), nas
concentrações de 1,17; 1,96; 3,14; 6,28; 9,81 e 12,56 g/L, em triplicata, a fim de
contemplar toda a faixa de linearidade do método, previamente estabelecida (Figura
07). As alíquotas de meio de cultura esterilizado em autoclave (matriz) contaminadas
com padrão foram analisadas quanto ao teor de etanol, conforme descrito no item
4.3.4.a); Os ensaios foram realizados em dois dias diferentes.
A concentração de cada frasco foi analisada conforme descrito no item
(4.3.4.a), em triplicata, determinando-se a concentração pela equação da reta,
conforme o item (4.3.5). A recuperação foi calculada pela equação 4.02 (BRASIL,
2003).
4.4.4 Limite de Detecção e Limite de Quantificação
O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da substância em
exame que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada, utilizando
um determinado procedimento experimental (RIBANI et al., 2004). Em análises
cromatográficas o LD de um método é a menor quantidade do analito que produz
uma resposta (sinal) detectável acima do nível de ruído do cromatógrafo, mais
precisamente três vezes o nível de ruído. Como exemplo de critério aceitação o LD
corresponde a uma concentração que produz uma relação sinal/ruído ≥ 3 (GREEN,
1996). Os mesmos critérios de LD podem ser adotados para o limite de
quantificação (LQ), utilizando a relação sinal-ruído de 10:1.
Para o cálculo do LD e LQ do método de quantificação do etanol por CG com
head space manual, foi utilizado o método de relação sinal-ruído, sendo que,
amostras dos respectivos padrões de baixa concentração (0,08 e 0,2 g/L) foram
preparadas e injetadas no cromatógrafo até a relação sinal-ruído ser de 3:1 e 10:1,
respectivamente.
4.5 Cálculo dos parâmetros do processo descontínuo
Os parâmetros característicos dos processos descontínuos: conversão de
substrato em células, produtividade e velocidade específica foram calculados
conforme equações abaixo.
52
4.5.1 Conversão de substrato em células (NCO)
É dada pela diferença entre a concentração inicial e final de glicose no meio
de cultico (LIMA et al., 2001).
NCO = CELf – CELi X 100 Equação 4.04
GLIt
Onde:
NCO = Conversão de substrato em células
CELf = Concentração de células final g/L
CELi = Concentração de células inicial g/L
GLIt = glicose total consumida (g)
4.5.2 Produtividade em células (P)
É determinada pela razão entre a massa de células produzida por volume de
meio no cultivo por unidade de tempo (LIMA et al., 2001).
P = X Equação 4.05
(Vm x T)
Onde:
P = produtividade g/Lx h
X = massa celular (g)
T = tempo de cultivo (12 horas)
Vm = volume de meio (L)
4.5.3 Velocidade especifica (
µµ
)
u = dx/dt . 1/x
Onde:
dx = células geradas
53
dt = células existentes
x = tempo
Para os cultivos realizados em agitador incubador e em biorreator Air lift a
unidade de medida da velocidade específica é h
-1
(1/ tempo) e foi calculada
medindo-se a quantidade de células geradas em grama, por grama de células
existentes, por tempo.
4.6 Análise Estatística dos dados
Todos os parâmetros avaliados (pH, concentração de células, glicose e
etanol) foram analisados em triplicata calculando-se a média, desvio padrão e
coeficiente de variação (CV). As análises foram consideradas reprodutíveis para
CV< 5 %.
Para a mesma condição de cultivo o experimento foi realizado em triplicata e
com análise de variância (ANOVA), seguido por teste “a posteriori” (Tukey ou
Fischer). Foi utilizado software estatístico Statisc 6.0 (STATSOFT, 2001), onde
valores que correspondem a p< 0,05 foram considerados estatisticamente
significativos.
A concentração celular e a produção de etanol foram analisadas
estatisticamente pelo análise de covariância, utilizando o aplicativo Statística 6.0 –
(STATSOFT, 2001) para cada uma das condições de cultivo (agitador incubador e
Air-lift 1,0 e 1,5 vvm).
54
5.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os processos descontínuos foram realizados em condições definidas a fim de
se observar, quantificar e comparar as duas técnicas. Os cultivos foram feitos em
triplicata para agitador incubador, biorretor Air-lift 1,0 vvm
e 1,5 vvm, sendo mantidas
idênticas condições para a formulação do meio, temperatura e tempo de cultivo.
Para fins comparativos não houve reposição de glicose durante todas as etapas do
processo.
5.1 Cultivos
5.1.1 Cultivo em agitador incubador
Foram realizados três cultivos em agitador incubador com concentração inicial
de glicose de 10 g/L, durante 12 h, sendo avaliado a cada hora, parâmetros de
concentração celular, consumo de glicose, pH e produção de etanol, utilizando-se as
curvas de calibração de cada método, conforme citado em Material e Métodos.
Os resultados foram organizados do seguinte modo: Inicialmente foram
demonstrados os resultados de concentração celular (C), consumo de glicose (G) e
pH, sendo que a concentração de etanol será discutida posteriormente.
A tabela contendo os resultados individuais de C, G e pH dos três
experimentos realizados em agitador incubador com temperatura e rotação
constante estão no Apêndice I. A figura 08 mostra os gráficos destes parâmetros.
Durante o cultivo a dinâmica das variáveis foi demonstrada pelas variações contidas
no gráfico do crescimento celular, pH e consumo de glicose como substrato
limitante.
55
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L)
e pH
X (g/L)
pH
glicose (g/L)
8a
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L)
e pH
X (g/L)
pH
glicose (g/L)
8b
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L)
e pH
(Xg/L)
pH
glic. g/L
8c
Figura 08:
Análise dos parâmetros da concentração celular (g/L), concentração de
glicose consumida (g/L) e pH (ver apêndice I) dos três experimentos independentes
realizados em agitador incubador.
56
O crescimento celular também chamado de formação de células apresentou,
no início do processo, o que se denomina de fase Lag ou fase de latência que tem
duração de duas horas. O crescimento celular é reduzido devido à fase de
adaptação na qual a célula sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos
componentes presentes no meio. É uma fase adaptativa a fatores como
temperatura, aeração, mudança de escala e também relacionados com a
concentração do inóculo, idade do microrganismo e com seu estado fisiológico.
Nesta mesma fase o consumo de substrato e o pH sofreram pequenas variações
devido ao baixo metabolismo celular (SCHMIDELL et al., 2001).
Na segunda fase que começa na segunda hora, chamada de fase de
transição, pôde-se observar o início da reprodução propriamente dita, houve um
aumento gradual tanto na velocidade de específica de crescimento e no fim desta
fase toda a população começa a se dividir em um intervalo regular médio de tempo
(figura 08) (SCHMIDELL et al., 2001).
A próxima fase (fase Log, Logarítmica ou exponencial) foi observada no
período de 2-5 horas (Figura 08). Nesta fase pôde-se observar que a curva
apresentou uma inclinação acentuada, atribuída a fatores e condições favoráveis ao
metabolismo, em que a formação de unidades funcionais celulares é máxima. A
velocidade específica de crescimento nesta fase também é constante e máxima
(tabela 06). O consumo de substrato também é máximo nesta fase, pois visa suprir
as necessidades celulares no processo alcoólica onde uma molécula de glicose é
convertida em duas moléculas de ATP’s gerando energia para a célula. Como o S.
boulardii é um anaeróbio facultativo, o processo alcoólica ocorre independente do
fornecimento de ar ao sistema (LIMA et al., 2001).
O pH sofreu uma queda provavelmente devido à formação de ácidos
orgânicos (ácidos succínico, lático, acético e outros) e, conseqüentemente, o
aumento da acidez do meio de fermentação (RIBÉREAU-GAYON; PEINAUD, 1996).
Segundo Moraes (2001), espécies de leveduras como S. cerevisiae em
aerobiose apresentam crescimento glicose-etanol diáuxico. A glicose é metabolizada
a etanol na primeira fase exponencial de crescimento, quando as células
apresentam uma alta velocidade (tempo de geração de 1,7 hora). A segunda fase de
crescimento inicia quando a glicose está quase toda consumida. É separada da
primeira por uma fase de transição, como se fosse uma latência. A velocidade de
57
crescimento apresenta tempo de geração de 5 a 8 horas. Na produção industrial de
leveduras de panificação, observa-se um tempo de geração de 3 a 4 horas, quando
se forma uma boa concentração de álcool e de 5 a 6 horas nas culturas livres de
álcool. Na primeira fase de crescimento, as funções do ácido tricarboxílico (TCA) são
apenas para a formação de esqueletos carbônicos para propósitos biossintéticos. As
atividades das enzimas são baixas, assim como as dos demais sistemas envolvidos,
por exemplo, citocromos. Na segunda fase do crescimento diáuxico as atividades
aumentam, havendo a formação de enzimas de metabolismo oxidativo, crescente na
fase interlag. Se a concentração de glicose ultrapassa determinado nível, cerca de
250 a 300 mg/L, essas enzimas não se formam ou são inibidas. À medida que o
mecanismo passa a ser melhor entendido, recebe o nome de repressão catabólica,
que é mais geral. Evita-se a repressão catabólica, cultivando-se a levedura em meio
de cultura com baixa concentração de glicose, o que é possível em fermentação
contínua ou, melhor ainda, em descontínuo-alimentado (“fedbatch”) (MORAES,
2001).
Marques e Serra (2004) analisaram a interferência da concentração inicial de
glicose no processo fermentativo, analisando concentrações de 180 e 310 g/L. Este
autor considerou a concentração de 180 g/L não inibitória enquanto a de 310 g/L
como sendo inibitória. Argumentou que teores elevados de substrato limitante
podem promover uma inibição e acarretar uma demora para o consumo destes
açúcares. Portanto, a concentração inicial de 10 g/L de glicose utilizada no presente
trabalho ficou muito aquém das concentrações testadas anteriormente, não
apresentando interferência no crescimento inicial do microrganismo, apesar deste ter
sido realizado em processo descontínuo.
5.1.2 Cultivo em biorreator
Air- lift
Tendo em vista o volume de espuma formado nas seis primeiras horas do cultivo
no biorreator Air-lift o uso de antiespumante (Antifoam FG-10) se fez necessário
para evitar possíveis vazamentos e perda de meio. Foi analisado o efeito da adição
do antiespumante quanto à formação de espuma e interferência do mesmo no
crescimento celular, este último sendo avaliado pela absorbância, conforme mostra a
tabela 03.
O controle visual quanto à formação de espuma foi feito a cada hora e a medida
58
da absorbância foi realizada no tempo zero (controle) e na sexta hora (fim da fase
exponencial) momento até o qual a presença do antiespumante causaria mais
interferência no crescimento celular.
Tabela 03
: Influência do antiespumante no cultivo
% do
antiespumante
adicionado
(v/v)Presença de
espuma
Concentração de
células (g/L)*
0,0
Início
+++
Após 6h
+
Após 6h
0,523 (±0,0034)
0,2
+
-
0,529 (±0,0015)
0,4
+
-
0,526 (±0,0032)
1,0
+
-
0,536 (±0,004)
1,4
+
-
0,553 (±0,0035)
1,8
+
-
0,554 (±0,0005)
∗ Média da triplicata mais o desvio padrão; (+++) forte presença de espuma; (+)
discreta presença de espuma e (-) ausência de espuma
Visualmente, quando adicionado o antiespumante, para todos os volumes
testados, não ocorreu formação de espuma volumosa no início do ensaio, tampouco
houve turvação do meio. Houve formação de espuma somente no frasco sem adição
de antiepumante, ressaltando a eficiência do mesmo em reduzir a tensão superficial
resultante das pontes de hidrogênio existentes entre as moléculas de água. Após 06
h de agitação não houve presença de espuma em nenhum dos frascos contendo
antiespumante e discreta presença no frasco sem antiepumante, indicando tratar-se
de um fenômeno que ocorre nos momentos iniciais do cultivo. Quanto à possível
interferência do antiespumante no crescimento celular, observou-se a ausência de
variação
significativa da concentração celular, com a adição dos diferentes volumes
de antiespumante, indicando que o antiespumante não interferiu no crescimento
celular mesmo na maior concentração pois todos os frascos apresentaram
concentrações semelhantes.
Desta forma foi selecionado o menor volume adicionado (0,2%) de
antiespumante para os ensaios posteriores, sendo comprovada a eficácia desta
59
concentração de antiespumante no biorreator Air-lift, para 2300 mL de meio, onde
não houve formação de espuma.
Adicionalmente, após finalizado o teste da interferência do antiespumante, foi
insuflado 1,5 VVM de ar nos frascos e não foi observada a formação de espuma, em
nenhum dos frascos.
Foram realizados 6 cultivos em biorreator Air-lift com concentração inicial de
glicose de 10 g/L, sendo uma triplicata para cada aeração (1,0 e 1,5 VVM), durante
12 h, sendo avaliado a cada hora os parâmetros de concentração celular (C),
consumo de glicose (G), pH e produção de etanol, utilizando-se as curvas de
calibração de cada método, conforme citado em Materiais e Métodos.
Novamente os resultados foram organizados do seguinte modo: Inicialmente
são demonstrados os resultados de C, G e pH, sendo que a concentração de etanol
será discutida posteriormente.
As tabelas contendo os resultados individuais de C, G e pH dos 6
experimentos em cada condição de aeração do biorreator Air-lift, estão nos
apêndices II e III.
A figura 09 mostra os gráficos dos parâmetros para o biorreator Air-lift com
aeração de 1,0 vvm, enquanto a figura 10 mostra os gráficos dos parâmetros para o
biorreator Air-lift com aeração de 1,5 vvm.
O perfil dos processos fermentativos em biorreator Air-lift (Figuras 09 e 10)
apresentou similaridade com o processo em agitador incubador (Figura 08), porém
pode-se observar que a fase exponencial em biorreator Air-lift ocorre no período de
2-6 h, mais prolongada em comparação com a fase exponencial em agitador
incubador, de 2-5 h com aparente modificação da velocidade específica de
crescimento demonstrado na tabela 6 (pág 65).
60
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L)
e pH
(Xg/L)
pH
glic. g/L
9a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L)
e pH
(Xg/L)
pH
glic. g/L
9b
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L)
e pH
(Xg/L)
pH
glic. g/L
9c
Figura 09:
Análise dos parâmetros da concentração celular (g/L), glicose consumida
(g/L) e pH e dos 3 experimentos independentes realizados em Biorreator
Air-lift
1,0
vvm.
61
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L) e pH
(Xg/L)
pH
glic. g/L
10a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0
2
4
6
8
10
12
14
Tempo (h)
Conc. celular (g/L)
0
2
4
6
8
10
Conc. glicose (g/L) e pH
(Xg/L)
pH
glic. g/L
10b
62
O término do conteúdo de glicose, no final da fase exponencial, coincide com
uma inflexão na curva de concentração celular, a qual continua a crescer até o final
do período de 12 h. Com a finalidade de verificar o comportamento e a cinética de
crescimento do microrganismo quando submetido a diferentes tpécnicas de cultivo,
(agitador-incubador e biorreator Air-lift onde, teoricamente, neste último caso o
fornecimento de oxigênio seria mais eficiente), foram verificadas as respectivas
eficiências com base nas velocidades específica de crescimento. Foi aplicado a
linearização dos valores obtidos pelo logaritmo neperiano e utilizada para os
cálculos de velocidade específica de crescimento
Analisando-se os gráficos (Figuras 08, 09 e 10) foi observado que o S.
boulardii apresentou duas velocidades de crescimento, uma em fase exponencial (2-
6h) e uma outra em fase linear em todos os ensaios, durante as 12 horas de
acompanhamento. Esta fase linear indica a mudança de velocidade, a qual ocorre
no momento em que há apenas a presença da glicose residual (0,5 a 1,5g%).
A existência de duas velocidades de crescimento, no mesmo ensaio indica a
existência de outros fatores de interferência, que podem ser a mudança da fonte de
carbono proveniente da formação de um metabólito primário como o etanol utilizado
posteriormente como substrato ou a concentração inicial de biomassa. Se ao termino
do processo for considerado como etanol produzido apenas aquele existente na fase
aquosa do meio e desprezado o etanol intracelular, o rendimento da reação
decresce linearmente quando a concentração inicial de biomassa aumenta
(BORZANI, 2006).
O consumo de etanol, glicerol e outros ácidos orgânicos, no decorrer do
processo fermentativo, ocorrem devido à oxidação metabólica pela célula com o
objetivo de gerar mais ATP e biomassa, mas apenas em aerobiose (SCHMIDELL, et
al. 2001).
O etanol foi a primeira substância a ser reconhecida como inibidor do
processo alcoólica. As leveduras do gênero Saccharomyces são consideradas as de
melhor resistência ao efeito tóxico do etanol. Este efeito é considerado resultante de
vários aspectos: os mecanismos inibidores de base, a presença ou não de outros
inibidores, composição do meio, pressão parcial em oxigênio, temperatura, natureza
da cepa e condições de cultura (batelada ou contínua) (LUONG, 1984). Pantoja et
al. (2001) relataram o efeito tóxico do etanol em fermentação alcoólica., na
concentração de 12 % v/v após 72 horas de fermentação.
63
Utilizando-se como inóculo o S. cerevisiae foram analisados valores
crescentes de concentração de etanol no meio fermentativo e concluiu-se que
somente acima do teor de 7,2% v/v ocorreu inibição do crescimento celular. Após 72
h de fermentação utilizando S. cerevisiae, o rendimento de substrato consumido, em
etanol, foi de 0,49 g/g, corr
,4, o r i um
64
Tabela 04:
Conversão de substrato em célula (produção específica de células ao
longo do cultivo (0-12h).
Biorreat
or
Média (g/g)
Desvio padrão
A
0,334333
a
0,023438
B
0,392667
a,b
0,037005
C
0,417333
b
0,021385
Todos
0,381444
0,044233
A = biorreator
Air-lift
1,0 vvm; B = biorretor
Air-lift
1,5 vvm, C= agitador incubador; n = 3
Os valores representam as médias de triplicata
±
desvio padrão; a-b-c: as médias com letras
diferentes dentro da mesma coluna apresentam diferença significativa entre si (p< 0,05) de acordo
com o teste de Tukey
5.2.2 Produtividade
A produtividade expressa a massa de células produzida (g) por volume (L) de
meio por unidade de tempo (h). Como mostra a tabela 05, este parâmetro foi
estatisticamente igual para os três experimentos.
Tabela 05:
Produtividade de células em g/L/h (ao longo do cultivo (0-12h).
Biorre
ator
Média (g/L.h)
Desvio padrão
A
0,262667
a
0,025146
B
0,319667
a
0,029670
C
0,325333
a
0,024786
Todos
0,302556
0,037852
A = biorreator
Air-lift
1,0 vvm; B = biorreator
Air-lift
1,5 vvm, C= agitador incubador; n = 3
Os valores representam as médias de triplicata
±
desvio padrão; a-b-c: as médias com letras
diferentes dentro da mesma coluna apresentam diferença significativa entre si (p< 0,05) de acordo
com o teste de Tukey
65
5.2.3 Velocidade específica
O cálculo da velocidade específica de crescimento é o primeiro passo para a
formulação e ajuste de um modelo matemático. É de grande importância em dois
aspectos: a) Formulação de relações cinéticas que são a base para a construção do
modelo; b) Obtenção de estimativas preliminares dos parâmetros por meio de
0.63999 0 Td(m)Tj9.473771 0 cm BT/R571 11.68 Tc(po)Tj12.48 0 Td-0.03624 Tc3.8604 Tw(r )Tj10.68 0 Td(m)Tj9.47998 0 Td(e)Tj6.12002 0 Td(i)Tj2.51997 0 Td-0.03162998 0 Td(e)Tj6.12002270.4 7920 m5866d(i)Tj2.39995 0 ááá Tc3.8604 T0 0to; b s 3 O40.03624 Tc3.861i
66
produção deste pró-biótico. Para facilitar a análise do parâmetro de concentração
celular foram comparados os três processos ao longo de todo o período de cultivo
(0-12h). Conforme mostra a Tabela 07, aparentemente, a concentração celular não
diferiu estatisticamente entre os 3 processos analisados de acordo com o teste de
Tukey (p<0,05).
Tabela 07:
Concentração média de células durante todo o cultivo (0-12h).
Biorreator
Média (g/L)
Desvio padrão
A
3,153
a
0,301
B
3,969
a
0,536
C
3,907
a
0,294
todos
3,659
0,528
A = biorreator
Air-lift
1,0 vvm; B = biorreator
Air-lift
1,5 vvm, C= agitador incubador; n = 3
Os valores representam as médias de triplicata
±
desvio padrão; a-b-c: as médias com letras
diferentes dentro da mesma coluna apresentam diferença significativa entre si (p< 0,05) de acordo
com o teste de Tukey
A figura 11 mostra o comportamento deste parâmetro, ao longo de todo o
período de cutivo, com as três técnicas empregadas.
Air-lift 1,0 vvm
Air-lift 1,5 vvm
Shaker
67
As curvas apresentadas mostram crescimento com tendência linear em todo o
tempo amostrado, com uma pequena inflexão a partir do tempo 6 h, o que coincide
com o final da fase exponencial do processo, conforme observado anteriormente
(Figuras 08, 09 e 10). Os dados das regressões realizadas nas curvas acima
constam da Tabela 08.
Os valores de R (coeficiente de correlação) calculados para todos os cultivos
demonstraram valores tendendo a 1. Porém foram mais próximos da linha de
tendência na primeira fase que compreende o tempo 0-6 horas. Esta é a fase
exponencial de crescimento, onde as condições são ideais para a formação de
células.
Na próxima fase que compreende o tempo 7-12 horas há uma queda nos
valores de r demonstrando menor homogeneidade nos valores obtidos. Isto pode
estar relacionado à mudança de substrato utilizado, onde a
velocidade passa a ser
linear e não mais exponencial, de acordo aos cálculos utilizados e/ou com a
presença de interferentes comuns no decorrer do processo como formação de
metabólitos, escassez de substrato ou possíveis contaminantes.
5.3 Quantificação do etanol gerado nos processos descontínuos
Para melhor compreender o mecanismo envolvido nos cultivos, foi avaliada a
produção de etanol nos diferentes sistemas. Para tanto, foi utilizada a
cromatografia gasosa, usando a técnica de head-space, porém, pela
indisponibilidade do sistema automático acoplado ao cromatógrafo, o método
manual foi desenvolvido e validado.
Neste método de padronização externa, o etanol elui com um tempo de
retenção de 1,8 min, conforme mostra a figura 12, sendo observada a presença de
outra substância volátil na amostra, a qual não foi identificada, em tempo de
retenção de cerca de 1,1 min.
Utilizando esta metodologia, analisou-se a produção de etanol nos 3
cultivos. A figura 13 mostra que a produção de etanol apresentou uma tendência
linear de incremento apresentando um máximo em cerca de 6 h seguido de queda
até o tempo 12 h para os biorreatores Air-lift, em ambas as aerações. O pico de
concentração para o agitador-incubador ocorreu no tempo 5 h, coincidente com o fim
68
da fase exponencial observada anteriormente (Figuras 08, 09 e 10). Após este
tempo ocorre um progressivo decréscimo de etanol, sugerindo que este metabólito
possa estar servindo como fonte de carbono para a continuidade do processo.
Tabela 08:
Dados da regressão linear realizada nas curvas de concentração celular
dos biorreatores agitador incubador, Air-lift 1,0 e 1,5 vvm ao longo do processo
descontínuo (0-12 h).
Biorreator
tempo
R
Equação da reta
0-6 h
0,9958
Ln y = - 0,9865 + 0,3505 X
agitador
incubador
7-12 h
0,9981
y = 0,8137 + 0,2923 X
0-6 h
0,9942
Ln y = - 1,2019 + 0,3497 X
Air-lift 1,0
vvm
7-12 h
0,9853
y = 1,2299 + 0,1894 X
0-6 h
0,9945
Ln y = - 1,2342 + 0,3819 X
Air-lift 1,5
vvm
7-12 h
0,9887
y = 0,7110 + 0,2881 X
r = coeficiente de correlação; y = variável dependente e x = variável independente
Figura 12:
Cromatograma em GC head space manual, do padrão de etanol e da
amostra de cultivo em Air-lift 1,0 vvm.
69
Figura 13:
Concentrações médias e desvios associados de etanol em três
experimentos (n=3) para os diferentes tipos de biorreatores utilizados, medido em
CG com head space manual
O etanol é um produto de excreção e em condições de anaerobiose o mesmo
pode ser oxidado metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa (LIMA et al.,
2001). Sendo assim acreditamos que a aeração possa ter apresentado deficiências
e que por ser um anaeróbio facultativo, a levedura S. boulardii conseguiu utilizar o
etanol como substrato.
Os resultados indicam similaridade entre os 3 processos descontínuos, sendo
que os parâmetros de crescimento celular e produção de etanol demonstram estar
intimamente relacionados. À medida em que aumenta a concentração celular, até
atingir o final da fase exponencial, há um aumento na produção de etanol. A partir do
momento em que a glicose é totalmente consumida (final da fase exponencial)
começa ocorrer um decréscimo na concentração de etano ta.
70
A principal função do consumo da glicose como fonte de carbono refere-se à
multiplicação celular e sua manutenção. Porém, interferentes como: variações no
pH, presença de outros metabólitos como gliceróis e ácidos orgânicos, quantidade
de oxigênio dissolvida no meio de cultivo poderão desviar parte da glicose
necessária ao metabolismo celular e multiplicação celular para a produção de etanol
(LIMA et al.,2001).
Moraes (2001) relata que espécies de leveduras como S. cerevisiae em
aerobiose apresentam crescimento glicose-etanol diáuxico, onde a glicose é
metabolizada a etanol na primeira fase exponencial de crescimento, quando as
células apresentam uma alta velocidade (tempo de geração de 1,7 h). Isto significa
que este microrganismo teria uma velocidade específica em torno de 0,4 h-1. No
caso do S. boulardii, no biorreator Air lift 1,5 vvm, a velocidade específica atingiu
0,38 h-1 (Tabela 06), semelhante ao valor da literatura para o S. cerevisae. Portanto,
teoricamente, em termos de formação de células, o S. boulardii poderia atingir 40%
do total de glicose consumida, considerando que há, em média 9,769 g/L de glicose
neste biorreator, poderia haver a produção de 3,91 g/L de células, sendo que o
observado foi 3,98 g/L (Tabela 07).
No caso do álcool, se fosse umo processo anaeróbia, onde apenas 10 % do
total de glicose seria convertida em células, haveria, teoricamente, uma produção de
etanol com 45% do total de glicose consumida, ou seja, 4,4 g/L de álcool (PORRO,
2003).
No gráfico da Figura 13 pode-se observar a produção de 3,4 g/L de etanol no
final da fase exponencial para o biorreator Air lift 1,5 vvm e para o agitador
incubador, semelhante ao cálculo teórico realizado, sendo o biorreator Air lift 1,0
vvm, com valores inferiores. Como o sistema é aeróbico, o etanol parece estar
sendo consumido para a formação de células. No caso da velocidade específica,
somente o biorreator Air lift 1,5 vvm se aproximou do valor teórico, o que poderia ser
explicado pela quantidade de ar disponível ser maior neste sistema.
Os dados encontrados sugerem haver pouca diferença entre os 3 processos
descontínuos testados, mostrando a viabilidade na transferência de escala para a
produção do S. boulardii, em biorreator Air-lift 1,5 vvm, condição na qual obteve-se
maior velocidade específica de crescimento. Porém, seria necessário investigar o
processo em quantidades mais elevadas de glicose, para a produção em escala do
S. boulardii neste biorreator. Estes resultados sugerem que apenas a eficiência de
71
oxigenação oferecida foi responsável pelo aumento da velocidade específica de
crescimento Como uma elevada concentração de substrato inibe o crescimento da
levedura, normalmente se utiliza o sistema processo contínuo em processos
industriais, porém para viabilizar o uso industrial do biorreator Air lift, na produção
desta levedura, em bateladas, deverá ser posteriormente avaliada a utilização de
elevada concentração de substrato neste equipamento. Deste modo, poderiam ser
selecionadas as condições ideais para minimizar esta inibição. Outro parâmetro
importante a ser determinado em estudos futuros, neste equipamento, seria a
medida do teor de oxigênio dissolvido, a fim de melhor caracterizar o mesmo e
avaliar sua eficiência.
5.4 Validação analítica
Para validar o método de quantificação do etanol produzido nos processos
descontínuos, usando CG com técnica de head space manual, foram determinados
os parâmetros de linearidade, faixa, exatidão, precisão, limite de quantificação e
detecção com base em compêndios oficiais (UNITED STATES PHARMACOPEIA,
2000) e na Resolução 899 (BRASIL, 2003).
Inicialmente foi avaliada a linearidade do método, sendo as curvas de
calibração obtidas a partir de soluções aquosas de etanol (99,9%, grau CLAE) e
submetidas ao procedimento de head space manual conforme descrito no item 4.3.4.
As curvas foram feitas em triplicata e foi realizada uma análise de regressão linear
com o cálculo do coeficiente de correlação e determinação da equação da reta. O
método apresentou resposta linear, na faixa de 0,16 - 12,56 g/L, cuja curva
apresentou valores de r
2
• 0,994 com intercepto em y próximo a z er o (figura 0 7 ), o
que é considerado aceitável (BRASIL, 2003).
A exatidão do método foi analisada de duas maneiras: a) pelo ensaio de
recuperação, utilizando o método de head space manual, com padrão externo
(SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997) e b) comparando os resultados obtidos com
a técnica de head space manual e uso de padrão externo com os resultados da
mesma amostra analisada em outro aparelho, com técnica de head space
automático e padrão interno.
O percentual de recuperação de etanol, usando o método manual
72
desenvolvido, consta da Tabela 09.
Tabela 09:
Ensaio de recuperação, com método de CG usando head space manual
Conc.adicionada
(g/L)
ÁREA
(Média)
Conc. média
recuperada (g/L)
Recuperação Média
±
dp (g/L)
%
Recuperação
1,17
0,84
1,79
1,79 (
±
0,20)
152,99
0,85
1,82
1,82 (
±
0,03)
155,55
1,96
1,55
3,37
3,37 (
±
0,04)
171,93
1,39
3,02
3,02 (
±
0,15)
154,08
3,14
2,37
5,20
5,20 (
±
0,23)
165,60
2,24
4,92
4,92 (
±
0,11)
156,68
6,28
4,42
9,78
9,78 (
±
0,12)
155,73
4,47
9,89
9,89 (
±
0,37)
157,48
9,81
6,78
15,24
15,24 (
±
0,35)
155,35
6,99
15,51
15,51 (
±
0,47)
158,10
12,56
9,23
20,50
20,50 (
±
0,20)
163,21
O ensaio foi realizado em dois dias diferentes, em triplicata; dp = desvio
padrão
A recuperação média global, envolvendo todas as concentrações testadas, na
faixa de 25-200% da concentração alvo (6 g/L), foi de 158,79 %. Tal resultado indica
um erro de + 58,79% nos valores de etanol quantificados por este método. O erro
elevado provavelmente possa ser atribuído ao processo de quantificação, com várias
etapas envolvidas e procedimentos manuais. Porém, a quantificação de substâncias
em baixas quantidades, usando métodos complexos, que envolvam várias etapas de
processamento, podem apresentar variação aceitável de 70-120% segundo o
INMETRO (GARP, 1999). Entretanto, o método utilizado neste trabalho apresentou
erro superior ao considerado aceitável na literatura, indicando que a técnica
automática de head space seria a mais indicada para a quantificação de etanol
durante o processo fermentativo. Todavia, em função da indisponibilidade de tal
equipamento, os dados resultantes do método de head space manual foram
utilizados, neste trabalho, após aplicação de uma correção de – 58,79%.
A fim de comprovar o erro encontrado no ensaio de recuperação do método
de head space manual desenvolvido, a matriz (meio de cultivo esterilizado em
73
autoclave) foi adicionada com três concentrações de etanol, em triplicata, do mesmo
modo que aquele realizado no ensaio de recuperação, porém desta vez analisando
o teor de etanol pelo um outro cromatógrafo, acoplado à head space automático
(gentilmente cedido pelo IML-SC) e usando o método do padrão interno, sendo os
resultados expostos na Tabela 10.
Tabela 10:
Ensaio de recuperação de etanol em CG, usando head space automático
e n-propanol como padrão interno
Conc. adicionada (g/L)
Conc. Medida média
±
dp
CV (%)
% recuperação
0,58
0,59 ± 0,31
5,35
102,05
1,60
1,59 ± 0.22
1,38
99,51
3,51
3,36 ± 1,83
5,45
95,76
O método de CG com head space automático e uso de padrão interno
apresentou exatidão adequada na faixa de concentração de 0,58-3,51 g/L (Tabela
10), com recuperação média global de 99,11%. Tais resultados indicam que a fonte
de erro do método pode estar no fato da técnica de head space ser manual ou no
uso do cálculo do etanol pelo padrão externo ao invés de padrão interno.
Foram avaliados os limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD) do
método manual desenvolvido,pela análise sinal-ruído. A Figura 14 mostra que o LQ
do método é de 0,2 g/L (concentração na qual o pico do etanol possui uma relação
10:1 com a variação da linha de base) e o LD é de 0,08 g/L (concentração na qual o
pico do etanol possui uma relação 3:1 com a variação da linha de base). Portanto, o
método proposto apresenta baixos limites de detecção e quantificação, o que é
adequado para a finalidade proposta, devido a grande variação na concentração de
etanol durante o cultivo celular.
74
Figura 14:
Cromatograma ilustrativo do LQ e LD do método de CG com head space
manual
A precisão do método foi avaliada em dias diferentes, com dois analistas
diferentes, determinado-se, portanto, a precisão intermediária (Tabela 12). Os limites
de aceitação para a precisão de métodos que quantificam impurezas diferem na
literatura, como sendo de 10 % (GREEN, 1996) a 5% (BRASIL, 2003). O método de
CG com head space manual apresentou, portanto, precisão aceitável, considerando-
se que possui várias etapas de processamento, como mostram os valores de DPR
inferiores a 10 %, houve variações nos resultados, provavelmente resultantes do
analista e das variações do aparelho em dias diferentes.
Portanto, o método de CG com head space manual foi considerado validado e
aplicado na quantificação de etanol, ao longo dos processos descontínuos, porém,
levando-se em consideração um desconto de 58,8% nos resultados do teor de
etanol resultantes da aplicação do método.
75
Tabela 11:
Concentração de etanol (g/L) na avaliação da precisão intermediária do
método (três dias e dois analistas diferentes)
Réplica
Conc. Teórica
(g/L)
dia 1
analista 1
dia 2
analista 2
dia 3
analista 1
Média
±
dp
CV (%)
1
3,14
3,55
3,79
3,59
2
3,14
3,52
3,79
3,66
3
3,14
3,64
3,70
3,74
3,66
±
0,09
2,7
1
6,28
6,80
6,07
7,49
2
6,28
7,26
6,09
7,17
3
6,28
7,08
6,14
7,46
6,84 ± 0,59
8,6
1
9,42
9,02
7,03
8,27
2
9,42
9,50
7,88
8,40
3
9,42
8,99
8,60
8,06
8,42±0,73
8,67
dp = desvio padrão; CV = coeficiente de variação
76
6 CONCLUSÕES
• Os processos descontínuos em agitador incubador, biorreator Air-lift, 1,0 vvm
e 1,5 vvm, apresentaram perfil de crescimento celular, consumo de glicose e
variação de pH semelhantes.
•
A fase exponencial de crescimento diferiu no processo em agitador-incubador
sendo de 2-5 h em relação aos processos conduzidos em biorreator Air-lift,
nos quais esta fase ocorreu em 2-6 h independente da aeração, sendo que
após a fase exponencial houve uma mudança na velocidade de crescimento,
em todos os processos descontínuos.
• O consumo de glicose foi mais rápido no agitador incubador (consumo total
em 5 h) em relação ao biorreator Air-lift (consumo total em 6 h), independente
da aeração neste último.
• O pH diminuiu à medida em que a glicose foi sendo consumida, em todos os
processos descontínuos, provavelmente devido à formação de ácidos
orgânicos pelo metabolismo anaeróbio e conseqüente aumento de acidez do
meio. Após o consumo da glicose o pH permaneceu estável.
• A produtividade e a concentração final de células não diferiu estatisticamente
(p < 0,05) nos diferentes processos descontínuos analisados enquanto a
conversão de substrato em células foi semelhante no agitador incubador e no
biorreator Air-lift 1,5 vvm durante a fase exponencial, não houve diferença
significativa na produção celular entre os três cultivos, sugerindo que o maior
fornecimento de ar para o biorreator Air-lift (1,5 vvm), proporcionou maior
velocidade específica de crescimento no tempo compreendido entre 0 e 6 h,
estes resultados sugerem que a aeração foi responsável pelo aumento da
velocidade específica de crescimento.
•
O etanol produzido durante os processos descontínuos apresentou relação
com o crescimento celular, atingindo o máximo ao final da fase exponencial
seguido de decréscimo até o final dos experimentos, provavelmente o etanol
produzido no meio foi utilizado como fonte de carbono, após o término da
glicose.
•
A metodologia para quantificação do etanol por head space manual
77
demonstrou resultados aceitáveis em se tratando de uma técnica com muitas
etapas e procedimentos manuais, sendo o método considerado validado,
levando-se em consideração o erro de + 58,8%, aplicando-se um fator de
correção nos resultados. A precisão do método foi aceitável, com linearidade
na faixa contemplando todos os valores observados e boa sensibilidade.
78
7 RECOMENDAÇÕES
Sugere-se avaliar concentrações superiores de glicose, para uma futura
ampliação de escala no biorreator Air-lift já que este apresenta vantagens em
relação aos processos descontínuos com agitação mecânica. Também sugere-se
avaliar o teor de oxigênio dissolvido no meio para melhor caracterizar a performance
do biorreator.
79
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90
APÊNDICES
APÊNDICE I
Resultados dos experimentos realizados em agitador-incubador de bancada
agitação 200mim
-1
.
Experi-
mentos
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Tempo
(h)
Conc. Celular
(g/L)
pH
Glicose
(g/L)
0
0,43
0,41
0,34
5,85
6,00
6,02
8,98
9,56
9,55
2
0,80
0,76
0,62
4,89
5,00
5,21
7,69
8,02
7,96
3
1,04
1,06
0,89
4,45
4,65
4,71
5,74
5,70
5,66
4
1,78
1,70
1,27
4,11
4,24
4,33
2,77
2,80
2,82
5
2,41
2,31
1,87
3,8
3,97
4,01
2,16
0,15
0,35
6
2,72
2,62
2,24
3,93
4,04
4,06
0,05
0,06
0,09
7
3,03
3,06
2,59
3,85
4,06
4,09
0
0,03
0,08
8
3,54
3,22
2,80
3,84
4,08
4,08
0
0
0
9
3,60
3,50
3,11
3,83
4,04
4,04
0
0
0
10
3,86
4,00
3,47
3,78
4,02
3,88
0
0
0
12
4,07
4,63
4,20
3,72
3,95
3,56
0
0
0
inóculo
4,3
4,60
4,34
3,9
3,9
4,01
0
0
0
Os experimentos realizados em agitador-incubador e biorreator tipo Air Lift foram
feitos independentemente e em triplicata.
91
APÊNDICE II
Resultados dos experimentos realizados em biorreator Air-lift 1,0 VVM
Experi-
mentos
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Tempo
(h)
Conc. celular
(g/L)
pH
Glicose
(g/L)
0
0,31
0,30
0,31
6,03
6,2
6,28
0,81
9,68
9,51
2
0,53
0,60
0,54
5,1
5,12
5,35
0,75
8,18
8,22
3
0,79
0,94
0,83
4,65
4,63
4,76
0,69
5,11
5,57
4
1,22
1,31
1,35
4,17
4,22
4,3
0,68
4,52
4,25
5
1,78
1,97
1,90
3,75
3,92
3,8
0,38
1,81
1,68
6
2,25
2,35
2,16
3,7
3,84
3,77
0,05
0,08
0,07
7
2,54
2,55
2,32
3,87
3,87
3,84
0
0
0,05
8
2,67
2,81
2,73
3,93
3,98
3,93
0
0
0
9
2,96
3,03
2,93
3,97
4,02
3,95
0
0
0
10
3,22
3,40
3,14
3,89
3,86
3,9
0
0
0
12
3,36
3,79
3,69
3,84
3,76
3,88
0
0
0
Inóculo
4,27
4,05
4,52
3,88
3,95
3,87
0
0
0
92
APÊNDICE
III
Resultados dos experimentos realizados em biorreator Air-lift 1,5 VVM
Experi-
mentos
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Tempo
(h)
Conc. celular
(g/L)
pH
Glicose
(g/L)
0
0,26
0,27
0,34
6,04
6,28
6,15
9,63
9,81
9,86
2
0,54
0,45
0,69
4,98
5,38
5,19
8,32
8,39
8,80
3
0,92
0,76
1,09
4,54
4,89
4,73
5,73
5,62
7,08
4
1,37
1,26
1,71
4,1
4,47
4,36
3,56
4,83
3,13
5
1,99
1,82
2,36
3,75
3,88
4,04
1,98
2,01
0,57
6
2,42
2,38
2,87
3,87
3,67
4,13
0,09
0,05
0,09
7
2,59
2,42
3,04
3,91
3,82
4,13
0,08
0,04
0,08
8
2,80
2,91
3,39
4,00
3,86
4,15
0
0
0
9
3,17
3,06
3,73
3,94
3,89
4,1
0
0
0
10
3,57
3,29
4,06
3,9
3,86
4,02
0
0
0
12
4,23
3,70
4,85
3,82
3,88
4
0
0
0
Inóculo
4,274
3,93
4,03
3,80
3,81
4,32
0
0
0
Livros Grátis
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