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BIORREMEDIAÇÃO, TOXICIDADE E LESÃO CELULAR
EM DERRAMES DE GASOLINA
Leandro de Freitas Spinelli
Porto Alegre
Abril de 2005
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ii
LEANDRO DE FREITAS SPINELLI
BIORREMEDIAÇÃO, TOXICIDADE E LESÃO CELULAR
EM DERRAMES DE GASOLINA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Civil da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia.
Porto Alegre
Abril de 2005
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iii
LEANDRO DE FREITAS SPINELLI
BIORREMEDIAÇÃO, TOXICIDADE E LESÃO CELULAR
EM DERRAMES DE GASOLINA
Esta Tese de Doutorado foi julgada adequada para a obtenção do título de DOUTOR EM
ENGENHARIA e aprovada em sua forma final pelo professor orientador e pelo Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Civil da Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Porto Alegre, 15 de abril de 2005
Prof. Fernando Schnaid
D.Phil. pela University of Oxford
Orientador
Prof. Fernando Schnaid
Coordenador do PPGEC/UFRGS
BANCA EXAMINADORA
Prof. Pedro Alberto Selbach (UFRGS)
Profa. Fátima Menezes Bento (UFRGS)
PhD. pela Wisconsin University, USA
DSc. pela Universidade Federal do
Rio Grande do Sul
Profa. Rosane Maria Salvi (PUCRS)
Prof. Tácio Mauro Pereira de Campos
(PUCRJ)
DSc. Pela Universidade Federal
do Rio Grande do Sul
D.Phil. pela London University, UK
iv
À minha Familia.
v
AGRADECIMENTOS
Às Universidades:
PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA
DO RIO GRANDE DO SUL
Aos Órgãos Financiadores:
Às Empresas:
vi
Ao Orientador
Fernando Schnaid, PhD., UFRGS
Aos Professores
Jarbas Rodrigues de Oliveira, PhD., PUCRS
Pedro Alberto Selbach, PhD., UFRGS
Fátima Menezes Bento, PhD., UFRGS
Aos Profissionais da UFRGS
Adão dos Santos; Carlos Alberto Bissani, PhD; Clésio Gianello, PhD; Dércio Scholles, PhD;
Eder dos Santos, MSc; Elemar Antonino Cassol, PhD; Enilson Luiz Saccol de Sá, PhD;
Flávio Oliveira Camargo, PhD; Jader Ribeiro Amaro; João Diniz; José Ferreira da Silva;
Leandro Bochi da Silva Volk, MSc; Marino José Tedesco, PhD; Neroli Cogo, PhD; Rodrigo
Jacques, MSc
Aos Profissionais da PUCRS
Aldaiza N.S.Aguiar; Carlos Graeff-Teixeira, MD, PhD; Carlos Luiz Reichel, MD; Édison
Figueira dos Santos; Fabiana S.C. Soares; Fabiane Cristine Andrade; Fernanda Bordignon
Nunes, PhD; Ivo Vedana, PhD; Izabel Cristina S. de Almeida, MD, MSc; José Neri da Silva;
Laura Schumacher Schuh da Trindade; Leoni Bernardes da Fonseca; Luciano Diogo, MD,
MSc; Luiz Cláudio D’Ávila, MSc; Luiz Fernando Rodrigues; Manoel May Pereira, MD;
Melissa Guerra Simões Pires, PhD; Paulo Harald Wachter, MD, PhD; Renata Cristina
Machado Wiltuschnig; Rosane Maria Salvi, MD, PhD; Rosiane de Oliveira Gonçalves;
Vinícius Duval da Silva, MD, PhD
Aos Profissionais da Copesul S/A
João Ruy Dornelles Freire e Rosmari da Rosa Siqueira
Aos Profissionais da Petrobrás S/A
Alexandre Comparsi; Janaína Spier; Paulo Jorge Ribu de Freitas
Aos Profissionais da Mu-Mu Alimentos
Henrique Tell Vontobel, Henrique Vontobel e Harlei Mattis
Aos Colegas e Bolsistas
Bruna Selbach; Gisele Lovatel; Jairo A. Schlindwein; Janine V. Nascimento; José Antônio
Poloni; Juliana M. Thurow; Núbia de Oliveira; Rosângela Rodrigues; Thiago Bombardelli;
Vasyl Custódio Saciura; Vanessa Dominguez
Aos Amigos
vii
RESUMO
SPINELLI, L.F. Biorremediação, toxicidade e lesão celular em um derrame de gasolina. 2005.
Tese (Doutorado em Engenharia) – Programa de Pós-Graduação em Engenharia Civil,
UFRGS, Porto Alegre.
O presente trabalho abrange um estudo integrado que busca as relações existentes entre
processos de biorremediação de solos e alterações das condições fisiológicas dos organismos
que habitam os locais contaminados. Nos estudos envolvendo biorremediação, analisou-se
como um derrame de gasolina, simulado através de ensaios de laboratório em microcosmos,
altera a microbiota do solo e a dinâmica dos contaminantes ao longo do tempo. Para tanto,
avaliou-se a população microbiana (através de métodos de contagem direta e métodos
qualitativos com lâmina enterrada, e identificação dos microrganismos), o nitrogênio mineral,
o pH e a condutividade elétrica do solo, evolução de CO
2
, cromatografia gasosa, além de
ensaios de permeabilidade, pluviometria e agregação de partículas do solo. Observou-se que
materiais orgânicos melhoram as características gerais dos solos ao final dos tratamentos, e ao
mesmo tempo retém o contaminante – no caso gasolina – por um maior período de tempo.
Existe uma evidente influência dos microrganismos nos processos de biorremediação de
gasolina e do diesel analisados, comprovada através de cromatografia gasosa. Através de
testes em modelo animal, analisados através de parâmetros sangüíneos, histologia, pH e
condutividade elétrica de macerados de órgãos, observou-se alterações importantes no
metabolismo dos animais e, em especial, identificou-se um novo teste – baseado na variação
de condutividade elétrica – que pode auxiliar na análise fisiopatológica de órgãos com
supostas lesões. Uma integração entre as áreas de Engenharia Geotécnica, Agronomia,
Medicina, Biologia, Farmácia e Bioquímica foi obtida, provando a necessidade de projetos
multidisciplinares no futuro da pesquisa.
Palavras-chave: biorremediação; contaminação ambiental; derrame gasolina; toxicidade e
lesão celular.
viii
ABSTRACT
SPINELLI, L.F. Bioremediation, toxicity and cellular lesions in gasoline spill. 2005. PhD.
Thesis – Post Graduation Program in Civil Engineering, UFRGS, Porto Alegre.
This research consists of an integrated study to verify the relationships between
bioremediation processes and physiological and biochemical alterations of the living
organisms in contaminated sites. Bioremediation studies of gasoline spills were simulated by
laboratory tests. Soil microbiology (direct plate counting, qualitative methods -buried lamina-
and identifying), mineral nitrogen, pH and electrical conductivity, CO
2
evolution, gaseous
chromatography, and also permeability, pluviometry and aggregation tests of soil particles
were analyzed. It was observed that organic materials increase soil characteristics at the end of
all treatments when compared to a control, and at the same time, maintain the contaminant –
gasoline – for a larger period in soils. There is an obvious influence of the activity of the
microorganisms in the bioremediation process of gasoline and diesel oil. Highest levels of
moist maintain contaminants in soil, well identified by gaseous chromatography.
Experimental tests with animal model (blood parameters, histology and pH and electrical
conductivity of macerated organs) proved to be important in the prediction of alterations in
animal metabolism, and in particular, a new test based on electrical conductivity to analyze
pathologic lesions in organs such as kidney, lungs and bone marrow was identified.
Integration among geotechnical engineering, agronomy, medicine, biology, and pharmacy and
biochemistry was obtained which demonstrates the need of multidisciplinary projects.
Key words: bioremediation; environmental contamination; gasoline spill; toxicity and cellular
lesion.
ix
ABREVIATURAS
Acetil co-A: acetil coenzima A
ADP: adenosina difosfato
ALT: alanina aminotransferase
AST: aspartato aminotransferase
ATP: adenosina trifosfato
BTEX: benzeno, tolueno, etil-benzeno e xileno
CHCM: concentração hemoglobínica corpuscular média
CPK: creatinaquinase
CPK-MB: creatinaquinase fração MB
CS: citrato sintase
EDTA: ácido etileno diamino tetra-acético
ENA: anomalias nucleares eritrocitárias
EPA: Environmental Protection Agency
EROD: etoxiresorufina-O-dietilase
Hb: hemoglobina
Hct: hematócrito
HE: hematoxilina eosina
LDH: lactato desidrogenase
MPN: número mais provável
MTBE: metil terc-butil éter
MWD: diâmetro médio padrão
NAD+ e NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidada e na forma reduzida
NPK: solução de nitrogênio, fósforo e potássio
PAH: hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
PCR: reação em cadeia da polimerase
x
RBC: células vermelhas sanguíneas
SNC: sistema nervoso central
SVOC: compostos orgânicos semi-voláteis
TPH: hidrocarbonetos de petróleo totais
VCM: volume corpuscular médio
VOC: compostos orgânicos voláteis
WAF: fração acomodada em água
WBC: células brancas sanguíneas
γ
GT: gama glutamil transferase
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Esquema montado para a realização da pesquisa ..................
p.5
Figura 2.1: Habitat de solo contendo partículas minerais (Sa: areia, Si:
silt, C: argila), matéria orgânica (OM), água (W), raízes (R), e
microrganismos do solo [bactéria (B), actinomicetos (A), esporos de
micorrizas e hifas (My), hifas de fungos saprofíticos (H), nematódio
(N), protozoário ciliado (CP), e um mite (M)] (Sylvia et al.,
1999)..................................................................................................
p.9
Figura 2.2: Bactérias no solo. A microscopia pode ser usada para a
observação de bactérias no seu habitat natural. Bactérias visualizadas
por fluorescência (Prescott et al., 1999)..............................................
p.10
Figura 2.3: Estágios da formação de um biofilme: ancoragem,
colonização e crescimento das estruturas (CBE, 2005).......................
p.12
Figura 2.4: a) Secção transversal da colocação de sondas sensíveis ao
O
2
, em áreas de vazio e de aglomerados no biofilme, revelando que a
região dos canais de água é aeróbia; região central do aglomerado é
anaeróbia; b) Biofilme de cianobactérias, do gênero Synechococcus
(CBE, 2005) ......................................................................................
p.13
Figura 2.5: Diagrama de um reator preparado para o tratamento de um
solo escavado contaminado (Fogel et al., 1989) .................................
p.16
Figura 2.6: Tratamento de lençol freático in situ contaminado com
hidrocarbonetos utilizando trincheira de infiltração e um poço de
injeção (Morgan e Watkinson, 1989)..................................................
p.18
Figura 2.7: Exemplo de uma placa utilizando o método proposto por
Brown e Braddock (1990)..................................................................
p.19
Figura 2.8: Volatilização do benzeno, tolueno, etil-benzeno e xilenos
de um solo sob vários regimes de umidade (Frankenberger, 1992).....
p.27
Figura 2.9: Mineralização do diesel em ambiente aeróbio e anaeróbio
(Frankenberger, 1992)........................................................................
p.31
Figura 2.10: Desaparecimento do TPH em diferentes profundidades
(Zhou e Crawford, 1995)....................................................................
p.38
xii
Figura 2.11: Efeito da concentração de etanol na degradação aeróbica
de benzeno em microcosmo de aqüífero (Corseuil e Alvarez, 1996)..
p.39
Figura 2.12: Distribuição vertical das fases dos hidrocarbonetos (EPA,
1996).................................................................................................
p.41
Figura 2.13: Progressão do hidrocarboneto vazado de um tanque de
armazenamento subterrâneo (EPA, 1996)..........................................
p.42
Figura 2.14: Processos gerais que governam a gasolina na subsuperfície
(Powers et al., 2001)..........................................................................
p.45
Figura 3.1: Formação Botucatu no Estado do Rio Grande do Sul
(Nuñez, 1991)........................................................................................
p.59
Figura 3.2: Localização da jazida (Spinelli, 1999)...................................
p.60
Figura 3.3:
Cromatograma típico de um óleo diesel.................................
p.64
Figura 3.4: Visão geral dos experimentos: a) pote com solo + adição,
mostrando ainda as lâminas enterradas e o sistema de captação de
CO
2
; b) Visão do conjunto..................................................................
p.66
Figura 3.5:
Método da lâmina enterrada: a) esquema geral da lâmina
enterrada; b) escolha das regiões representativas para as análises......
p.68
Figura 3.6: Metodologia para contagem direta de microrganismos.........
p.70
Figura 3.7: Sistema utilizado para filtrar a gasolina.................................
p.72
Figura 3.8: Placas de Elisa (multi-poços) utilizadas para quantificação
de microrganismos degradadores de gasolina ....................................
p.72
Figura 3.9: Diagrama da estrutura morfológica de
Aspergillus sp.
(Maza et al., 1999)................................................................................
p.74
Figura 3.10: Diagrama de
Penicillium sp.
(Maza et al., 1999)................
p.74
Figura 3.11:
(a) Visão geral do equipamento mostrando o headspace
com amostras de solo e (b) amostras..................................................
p.77
Figura 3.12:
Sistema de injeção dos voláteis...........................................
p.77
Figura 3.13: Cromatografia do solo controle com a solução padrão.......
p.77
xiii
Figura 3.14:
Equipamento utilizado para os ensaios de agragados: a)
aparato completo e b) detalhe do solo submergido...............................
p.79
Figura 3.15: a) Visão geral dos tubos utilizados nos ensaios de
permeabilidade e pluviometria; b) esquema dos ensaios com suas
condições de contorno ........................................................................
p.80
Figura 3.16:
Rattus norvergicus
utilizados na pesquisa...........................
p.82
Figura 3.17: Disposição dos animais ao redor do solo contaminado........
p.82
Figura 3.18: Equipamento utilizado para medir parâmetros no sangue,
urina e proteínas dos rins e pulmões dos animais................................
p.84
Figura 3.19: Visão geral da maceração dos órgãos dos animais...............
p.87
Figura 3.20: Ensaios de condutividade elétrica e pH...............................
p.87
Figura 4.1: Liberação de CO
2
durante os testes preliminares: a) ao
longo dos 170 dias e b) visão expandida para 32 dias.........................
p.91
Figura 4.2: CO
2
total acumulado durante o período de ensaio preliminar
(170 dias)...........................................................................................
p.92
Figura 4.3: Liberação de CO
2
dos ensaios de biorremediação com a
gasolina da REFAP: a) ao longo dos 220 dias e b) visão expandida
para 32 dias........................................................................................
p.93
Figura 4.4: Liberação de CO
2
total acumulado durante o período de
ensaio (213 dias).................................................................................
p.94
Figura 4.5: Liberação de CO
2
comparativa entre os dois lodos
utilizados............................................................................................
p.95
Figura 4.6: Liberação de CO
2
comparativa entre a gasolina de posto de
combustível (com álcool) e a da REFAP (sem álcool).........................
p.96
Figura 4.7: Comparativo entre o CO
2
total das gasolinas utilizadas na
pesquisa ............................................................................................
p.97
Figura 4.8: Resultados observados nos testes com lâmina enterrada. A e
B são, respectivamente, aumentos de 100x e 400x. 1) Solo Controle;
2) Solo + Lodo; 3) Solo + Gasolina; 4) Solo + Gasolina + Lodo; 5)
Solo + Diesel; 6) Solo + Diesel + Lodo..............................................
p.99
xiv
Figura 4.9: Contagem de fungos ao longo do período de observação.....
p.100
Figura 4.10: Contagem de bactérias ao longo do período de observação
p.101
Figura 4.11: Medidas de pH do solo aos 65 e 95 dias medidos nos
ensaios preliminares com gasolina e óleo diesel provenientes de um
posto de combustível...........................................................................
p.104
Figura 4.12: Medidas do pH do solo nos ensaios com gasolina sem
álcool .................................................................................................
p.105
Figura 4.13: Medidas da condutividade elétrica nos ensaios com
gasolina sem álcool.............................................................................
p.106
Figura 4.14: Nitrogênio mineral do solo nos tratamentos com a gasolina
de posto de combustível (170 dias).....................................................
p.107
Figura 4.15: Nitrogênio mineral do solo nos tratamentos com a gasolina
da REFAP aos 65 e 170 dias..............................................................
p.108
Figura 4.16: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um
bioestimulante (NPK) em relação à esterilização do solo e efeitos da
microbiologia para o Benzeno.............................................................
p.109
Figura 4.17: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um
bioestimulante (NPK) em relação à esterilização do solo e efeitos da
microbiologia para o Tolueno..............................................................
p.110
Figura 4.18: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um
bioestimulante (NPK) em relação à esterilização do solo e efeitos da
microbiologia para o MTBE ..............................................................
p.110
Figura 4.19: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um
bioestimulante (NPK) em relação à esterilização do solo e efeitos da
microbiologia para o C
8
aromático......................................................
p.111
Figura 4.20: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um
bioestimulante (NPK) em relação à esterilização do solo e efeitos da
microbiologia para o C
9+
aromáticos...................................................
p.112
Figura 4.21: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em
relação ao Benzeno.............................................................................
p.113
Figura 4.22: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em
relação ao Tolueno.............................................................................
p.113
xv
Figura 4.23: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em
relação ao MTBE ...............................................................................
p.114
Figura 4.24: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em
relação ao C
8
aromático......................................................................
p.115
Figura 4.25: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em
relação aos C
9+
aromáticos..................................................................
p.115
Figura 4.26: Alteração do pH com o grau de contaminação com
gasolina e diesel...................................................................................
p.117
Figura 4.27: Alteração do pH na água com o grau de contaminação com
gasolina e diesel..................................................................................
p.117
Figura 4.28: Alteração da condutividade com o grau de contaminação
com gasolina e diesel.........................................................................
p.118
Figura 4.29: Alteração da condutividade elétrica na água com o grau de
contaminação com gasolina e diesel....................................................
p.119
Figura 4.30: Alteração da granulometria do solo com o grau de
contaminação aos 180 dias.................................................................
p.121
Figura 4.31: Alteração da granulometria do solo com o grau de
contaminação aos 240 dias.................................................................
p.121
Figura 4.32: Alteração do MWD no solo com o grau de contaminação
aos 180 e 240 dias..............................................................................
p.122
Figura 4.33: Alteração das concentrações de Benzeno nas diferentes
profundidades em relação ao tempo e ao regime pluviométrico
aplicado .............................................................................................
p.125-6
Figura 4.34: Alteração das concentrações de Tolueno nas diferentes
profundidades em relação ao tempo e ao regime pluviométrico
aplicado..............................................................................................
p.128-9
Figura 4.35: Alteração das concentrações de MTBE nas diferentes
profundidades em relação ao tempo e ao regime pluviométrico
aplicado..............................................................................................
p.131-2
Figura 4.36: Alteração das concentrações de C
8
aromático nas
diferentes profundidades em relação ao tempo e ao regime
pluviométrico aplicado.........................................................................
p.134-5
xvi
Figura 4.37: Alteração das concentrações de C
9+
aromáticos nas
diferentes profundidades em relação ao tempo e ao regime
pluviométrico aplicado.......................................................................
p.137-8
Figura 4.38: Concentração dos diferentes contaminantes no tanque de
solo contaminado nos diversos tempos de estudo................................
p.140
Figura 4.39: Concentração dos diferentes contaminantes no tanque de
solo contaminado nos tempos inicial e com 48h..................................
p.141
Figura 4.40: Alterações no WBC dos animais durante o período de
ensaios................................................................................................
p.142
Figura 4.41: Alterações no RBC dos animais durante o período de
ensaios...............................................................................................
p.143
Figura 4.42: Alterações na hemoglobina dos animais durante o período
de ensaios .........................................................................................
p.144
Figura 4.43: Alterações no hematócrito dos animais durante o período
de ensaios .............................................................................................
p.144
Figura 4.44: Alterações no VCM dos animais durante o período de
ensaios...............................................................................................
p.145
Figura 4.45: Alterações no HCM dos animais durante o período de
ensaios...............................................................................................
p.145
Figura 4.46: Alterações no CHCM dos animais durante o período de
ensaios .............................................................................................
p.146
Figura 4.47: Alterações nas plaquetas dos animais durante o período de
ensaios ..............................................................................................
p.146
Figura 4.48: Alterações nos linfócitos dos animais durante o período de
ensaios................................................................................................
p.148
Figura 4.49: Alterações na creatinina sérica dos animais durante o
período de ensaios...............................................................................
p.149
Figura 4.50: Alterações na creatinina urinária dos animais durante o
período de ensaios..............................................................................
p.150
Figura 4.51: Alterações na uréia excretada pela urina dos animais
durante o período de ensaios...............................................................
p.150
xvii
Figura 4.52: Alterações na uréia sérica animais durante o período de
ensaios...............................................................................................
p.151
Figura 4.53: Alterações na AST dos animais durante o período de
ensaios...............................................................................................
p.152
Figura 4.54: Alterações na ALT dos animais durante o período de
ensaios...............................................................................................
p.152
Figura 4.55: Alterações na fosfatase alcalina dos animais durante o
período de ensaios..............................................................................
p.153
Figura 4.56: Alterações nas proteínas totais no soro dos animais
durante o período de ensaios................................................................
p.154
Figura 4.57: Alterações nas proteínas urinárias dos animais durante o
período de ensaios..............................................................................
p.154
Figura 4.58: Alterações do sódio dos animais durante o período de
ensaios...............................................................................................
p.155
Figura 4.59: Alterações do potássio dos animais durante o período de
ensaios ..............................................................................................
p.155
Figura 4.60: Alterações da glicose dos animais durante o período de
ensaios................................................................................................
p.156
Figura 4.61: Alterações da LDH dos animais durante o período de
ensaios ..............................................................................................
p.157
Figura 4.62: Alterações da Creatinaquinase dos animais durante o
período de ensaios...............................................................................
p.158
Figura 4.63: Alterações das Frações MB dos animais durante o período
de ensaios...........................................................................................
p.158
Figura 4.64: Alterações da Troponina “I” dos animais durante o
período de ensaios.................................................................................
p.159
Figura 4.65: Alterações do Cálcio Total dos animais durante o período
de ensaios..........................................................................................
p.160
Figura 4.66: Alterações do pH do macerado de rim dos animais durante
o período de ensaios............................................................................
p.161
xviii
Figura 4.67: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de
rins dos animais normalizada por peso de rim durante o período de
ensaios..................................................................................................
p.162
Figura 4.68: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de
rins dos animais normalizada por peso de rim e por proteínas dos
diversos períodos de ensaios................................................................
p.162
Figura 4.69: Alterações do pH dos macerados de pulmão dos animais
durante o período de ensaios...............................................................
p.163
Figura 4.70: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de
pulmão dos animais normalizada por peso de pulmão durante o
período de ensaios..............................................................................
p.164
Figura 4.71: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de
pulmão dos animais normalizada por peso de pulmão e por proteínas
durante o período de ensaios..............................................................
p.164
Figura 4.72: Alterações do pH do plama dos animais durante o período
de ensaios...........................................................................................
p.166
Figura 4.73: Alterações da condutividade elétrica do plasma dos
animais normalizada por proteínas durante o período de ensaios ......
p.166
Figura 4.74: Alterações do pH urinário dos animais durante o período
de ensaios.............................................................................................
p.167
Figura 4.75: Alterações da condutividade elétrica da urina dos animais
normalizada por proteínas urinárias durante o período de ensaios .....
p.167
Figura 4.76: Alterações histológicas da medula óssea em aumentos de
50x (coluna da esquerda) e 400x (coluna da direita), para o grupo
controle (a, b), 0-24h de exposição (c, d), 24-48h (e, f), 48-72h (g, h)
e 48h cumulativas (i, j) .....................................................................
p.169-70
Figura 4.77: Alterações histológicas dos pulmões em aumentos de 50x
(coluna da esquerda) e 400x (coluna da direita), para o grupo
controle (a, b), 0-24h de exposição (c, d), 24-48h (e, f), 48-72h (g, h)
e 48h cumulativas (i, j) ........................................................................
p.171-2
xix
Figura 4.78: Alterações histológicas dos rins em aumentos de 50x
(coluna da esquerda) e 400x (coluna da direita), para o grupo
controle (a, b), 0-24h de exposição (c, d), 24-48h (e, f), 48-72h (g, h)
e 48h cumulativas (i, j) ........................................................................
p.173-4
xx
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1: Concentrações de oxigênio e dióxido de carbono na atmosfera
de um solo tropical nas condições úmido e seco (Russell, 1973)............
p.10
Tabela 2.2: Problemas relacionados a Biofilmes. Esta tabela resume os
vários sistemas nos quais os biofilmes se formam com conseqüências
indesejáveis (Adaptado de CBE, 2005)..................................................
p.13
Tabela 3.1: Propriedades físicas e químicas do solo...................................
p.61
Tabela 3.2: Características do lodo.............................................................
p.62
Tabela 3.3: Composição química da gasolina do posto de combustível......
p.62
Tabela 3.4: Composição química da gasolina da REFAP fornecida pela
empresa..................................................................................................
p.63
Tabela 3.5: Características do campo no microscópio................................
p.68
Tabela 3.6: Meios de Cultura utilizados......................................................
p.69
Tabela 3.7: Meios de Cultura para biodegradadores específicos.................
p.71
Tabela 4.1: Número de microrganismos avaliados pelo método da lâmina
enterrada................................................................................................
p.98
Tabela 4.2: Microrganismos encontrados no lodo puro e no solo nos
diferentes tratamentos ao final dos ensaios.............................................
p.102
xxi
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – A PESQUISA
....................................................................................
p.1
1 INTRODUÇÃO
.........................................................................................................
p.1
1.1 RISCOS AO AMBIENTE E AOS SERES VIVOS ..................................................
p.1
1.2 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................
p.2
1.3 OBJETIVOS DA PESQUISA ..................................................................................
p.2
1.4 HIPÓTESES DA PESQUISA ..................................................................................
p.3
1.5 O ESTUDO ...............................................................................................................
p.4
1.6 PROTEÇÃO DOS DIREITOS DOS ANIMAIS ......................................................
p.4
CAPÍTULO 2 – BIORREMEDIAÇÃO, TOXICIDADE E LESÃO CELULAR
...
p.6
2.1 BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS ..........................................................................
p.6
2.1.1 Introdução ..............................................................................................................
p.6
2.1.2 Microbiologia de Solos e seu Microambiente .......................................................
p.8
2.1.3 Biofilmes ...............................................................................................................
p.11
2.1.4 Metais Pesados nos Solos ......................................................................................
p.14
2.1.5 Biorremediação ......................................................................................................
p.14
2.1.6 Considerações sobre População Microbiana de uma Área Contaminada com
Hidrocarbonetos ..............................................................................................................
p.18
2.1.7 Volatilização e Cromatografia ...............................................................................
p.26
2.1.8 Mineralização dos Hidrocarbonetos de Petróleo ...................................................
p.29
2.1.9 Propriedades Físico-Químicas dos Solos Contaminados e Parâmetros Ambientais
p.31
2.1.10 Formação de Agregados ......................................................................................
p.36
2.1.11 Percolação de Contaminantes ..............................................................................
p.38
2.1.12 Considerações Finais de Biorremediação ...........................................................
p.46
2.2 TOXICIDADE E LESÃO CELULAR CAUSADAS POR HIDROCARBONETOS
p.47
xxii
2.2.1 Introdução ..............................................................................................................
p.47
2.2.2 Exposição Ambiental e Alterações Fisiológicas e Bioquímicas Causadas pelos
Hidrocarbonetos .......................................................................................................
p.50
2.2.3 Alterações Elétricas Celulares ...............................................................................
p.56
2.2.4 Considerações Finais em Toxicidade e Lesão Celular...........................................
p.57
CAPÍTULO 3 – METODOLOGIA DA PESQUISA
.................................................
p.58
3 INTRODUÇÃO
.........................................................................................................
p.58
3.1 SOLO UTILIZADO ..................................................................................................
p.58
3.2 LODO .......................................................................................................................
p.59
3.3 FERTILIZANTE MINERAL ....................................................................................
p.60
3.4 GASOLINAS ............................................................................................................
p.61
3.5 DIESEL ....................................................................................................................
p.64
3.6 TEMPERATURA E UMIDADE .............................................................................
p.64
3.7 ENSAIOS DE BIORREMEDIAÇÃO ......................................................................
p.65
3.7.1 Liberação de CO
2
...................................................................................................
p.65
3.7.2 Avaliação da População do Solo pelo Método da Lâmina Enterrada (Rossi-
Cholodny) ..................................................................................................................
p.67
3.7.3 Quantificação de Bactérias e Fungos .....................................................................
p.68
3.7.4 Identificação de Microrganismos ..........................................................................
p.72
3.7.5 Avaliação do pH e da Condutividade Elétrica do Solo ..........................................
p.73
3.7.6 Nitrogênio Mineral do Solo ...................................................................................
p.75
3.7.7 Cromatografia Gasosa ............................................................................................
p.76
3.7.8 Parâmetros de Contaminação do Solo ...................................................................
p.78
3.7.9 Ensaios de Agregados ……………………………………………. …………...
p.78
3.7.10 Ensaios de Permeabilidade e Pluviometria .........................................................
p.79
3.7.11 Caracterização do Solo em Relação a Metais Pesados ........................................
p.81
3.8 ENSAIOS DE TOXICIDADE E LESÃO CELULAR .............................................
p.81
xxiii
3.8.1 Hemograma e Plaquetas ........................................................................................
p.83
3.8.2 Dosagem da Creatinina e Uréia Sérica e Urinária, AST, ALT,
γ
GT, Fosfatase
Alcalina, Proteínas Totais e Proteinúria, Sódio, Potássio, Glicose, LDH, CPK,
CPK-MB, Troponina “I” e Cálcio Total ....................................................................
p.84
3.8.3 Histologia da Medula Óssea, dos Rins e dos Pulmões ..........................................
p.85
3.8.4 Condutividade Elétrica e pH .................................................................................
p.86
3.8.4.1 Condutividade Elétrica e pH Renal e Pulmonar ................................................
p.87
3.8.4.2 Condutividade Elétrica e pH do Sangue e da Urina ...........................................
p.88
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................
p.88
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS
.................................................................................
p.89
4.1 ENSAIOS DE BIORREMEDIAÇÃO EM ARENITO BOTUCATU ......................
p.89
4.1.1 Liberação de CO
2
...................................................................................................
p.89
4.1.2 Avaliação da População do Solo pelo Método da Lâmina Enterrada (Rossi-
Cholodny) ..................................................................................................................
p.97
4.1.3 Quantificação Microbiana: Bactérias e Fungos .....................................................
p.98
4.1.4 Identificação de Microrganismos ..........................................................................
p.101
4.1.5 Condutividade Elétrica e pH do Solo ...................................................................
p.102
4.1.6 Nitrogênio Mineral do Solo ...................................................................................
p.106
4.1.7 Cromatografia Gasosa ...........................................................................................
p.107
4.1.8 Parâmetros de Contaminação do Solo ..................................................................
p.116
4.1.9 Ensaios de Agregados ………………………………………………. …… …...
p.120
4.1.10 Ensaios de Percolação e de Pluviometria ............................................................
p.123
4.1.11 Presença de Metais Pesados no Solo ...................................................................
p.139
4.2 ENSAIOS EM MODELO ANIMAL ........................................................................
p.139
4.2.1 Cromatografia Gasosa do Solo Utilizado nos Ensaios com Modelo Animal .......
p.139
4.2.2 Hemograma e Plaquetas ........................................................................................
p.140
xxiv
4.2.3 Creatinina e Uréia Sérica e Urinária, AST, ALT,
γ
GT, Fosfatase Alcalina,
Proteínas Totais e Proteinúria, Sódio, Potássio, Glicose, LDH, CPK, CPK-MB,
Troponina “I” e Cálcio Total ......................................................................................
p.148
4.2.4 Condutividade Elétrica e pH Celular ....................................................................
p.160
4.2.4.1 Condutividade Elétrica e pH Renal e Pulmonar ................................................
p.160
4.2.4.2 Condutividade Elétrica e pH do Sangue e da Urina............................................
p.165
4.2.5 Histologia da Medula Óssea, Rins e Pulmões .......................................................
p.168
4.2.6 Considerações Finais sobre Toxicidade e Lesão Celular.......................................
p.172
4.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................
p.174
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES
................................................................................
p.176
5.1 BIORREMEDIAÇÃO DO SOLO ............................................................................
p.176
5.2 TOXICIDADE E LESÃO CELULAR EM MODELO ANIMAL ............................
p.179
SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS
.......................................................
p.183
REFERÊNCIAS
.............................................................................................................
p.184
CAPÍTULO 1 – A PESQUISA
1 INTRODUÇÃO
1.1 RISCOS AO AMBIENTE E AOS SERES VIVOS
Os hidrocarbonetos presentes nos combustíveis têm sido objeto de pesquisa, especialmente
devido aos acidentes envolvendo derrames ambientais decorrentes de problemas durante o
transporte, distribuição e armazenamento destes produtos. Diversos estudos na literatura
tratam de processos de recuperação e biorremediação de áreas contaminadas, assim como da
intoxicação aguda ou crônica de benzeno e tolueno em frentistas, pintores, artistas gráficos
etc. Nos processos de biorremediação, os microrganismos nativos do solo (ou indígenas)
utilizam os hidrocarbonetos do petróleo como fonte de carbono (C) e energia ao seu
crescimento nos solos. A degradação completa destes hidrocarbonetos resulta em produtos
finais atóxicos como dióxido de carbono (CO
2
), água (H
2
O) e biomassa celular. Diversos
tratamentos podem ser utilizados para acelerar a retirada dos hidrocarbonetos do solo, como
compostos orgânicos ou soluções nutritivas (Bioestimulação) aos microrganismos, como
soluções com nitrogênio, fósforo e potássio (NPK). Além disso, poucos estudos mostram de
forma eficaz a relação entre a exposição a estes hidrocarbonetos durante um processo de
contaminação (derrame) e os efeitos em animais quanto a lesões pulmonar, renal,
hematológica ou hepática. Não foi bem avaliado, até o momento, o que ocorre com uma
população que viva ao redor de vazamentos de combustíveis. Muito se ouve a respeito de
grandes derrames de gasolina e óleos em geral, mas não são delimitados os tempos em que as
pessoas devam permanecer afastadas dos locais destes derrames durante o tratamento
ambiental. Os problemas ambientais têm, portanto, natureza eminentemente
MULTIDISCIPLINAR, envolvendo profissionais de várias áreas do conhecimento.
2
1.2 JUSTIFICATIVA
Áreas contaminadas com hidrocarbonetos têm sido um problema cada vez mais constante.
Neste estudo, foi escolhido o solo da denominada Formação Botucatu para as análises da
contaminação, pois é um solo de boa representatividade no Estado do Rio Grande do Sul. A
dificuldade na escolha do processo adequado de biorremediação (superficial ou profunda) e
sua execução são objeto de estudo cada vez mais freqüente. Além disso, a remoção de
famílias ou comunidades inteiras dos locais acometidos pelas contaminações acarretam em
elevados custos. Basicamente, buscam-se respostas para as seguintes questões: no caso de um
derrame de gasolina em um solo (neste caso Arenito Botucatu), qual a profundidade que os
hidrocarbonetos podem atingir? Qual a influência da pluviometria no local? Que parâmetros
podem ser utilizados em um processo de biorremediação superficial? Qual a importância de
bioestimulantes? Um lodo industrial teria uma melhor aplicação que um fertilizante mineral?
Qual a fase mais crítica no que tange intoxicação e lesão para as populações locais durante um
processo de biorremediação? O que ocorre com estas populações durante exposições agudas
em diferentes tempos de derrame?
1.3 OBJETIVOS DA PESQUISA
O objetivo desta pesquisa é realizar um estudo multidisciplinar envolvendo técnicas de
biorremediação de gasolina e diesel (estudo preliminar) em um solo contaminado
artificialmente em laboratório, visando a avaliação da influência de alguns parâmetros como o
pH, condutividade elétrica, migração dos hidrocarbonetos no solo, com e sem pluviometria,
através da utilização de cromatografia gasosa, população microbiana, nitrogênio mineral,
formação de agregados e avaliação de metais pesados. Também tem como objetivo definir e
estudar a toxicidade celular renal, hepática, hematológica e pulmonar provocada através da
aspiração de voláteis de gasolina em ratos expostos a um solo contaminado propositalmente
em laboratório. Foi avaliada a relação entre a condutividade elétrica dos órgãos macerados e a
sua histologia. Foram avaliados os seguintes grupos em microcosmos:
•
solo controle;
3
•
solo + lodo resíduo de uma indústria alimentícia;
•
solo + gasolina;
•
solo + diesel (piloto);
•
solo + gasolina + lodo resíduo de uma indústria alimentícia;
•
solo + diesel + lodo resíduo de uma indústria alimentícia (piloto);
•
solo + gasolina + lodo resíduo de uma indústria alimentícia + NPK;
•
solo + gasolina + NPK;
A intoxicação e a lesão celular provocada em animais foram estudadas através da exposição
(24 e 48 horas) do contaminante aos diferentes grupos, em um solo contaminado
artificialmente com gasolina:
•
ratos controle;
•
ratos expostos por 24h aos voláteis desde o tempo zero, trocados a cada 24h;
•
ratos expostos por 48h para analisar efeitos cumulativos;
1.4 HIPÓTESES DA PESQUISA
As características de um solo contaminado podem ser melhoradas através de processos
bioquímicos e microbiológicos. A avaliação do pH e da condutividade elétrica dos solos e
fluídos pode auxiliar na caracterização, identificação e mapeamento de áreas contaminadas. A
análise da migração da contaminação de hidrocarbonetos no solo através de cromatografia
pode ser útil na previsão do estágio em que se encontra o processo de biorremediação.
Parâmetros como a evolução de CO
2
, nitrogênio mineral e microbiota podem servir como
indicativos da capacidade do solo em remediar contaminações. E a análise da dispersão dos
contaminantes através de ensaios de cromatografia gasosa nos solos contaminados, com e sem
pluviometria controlada, pode servir como modelo para prever futuros comportamentos do
4
binômio solo-contaminante em ambiente natural. O controle e a remediação de solos impõe o
conhecimento dos fenômenos de interação solo-microorganismos-bioquímica.
Populações que vivem em locais onde houve vazamentos de gasolina podem apresentar
alterações renais, hepáticas e medulares que perduram durante o processo de biorremediação
do combustível. A exposição aguda aos hidrocarbonetos pode acarretar danos aos tecidos em
função do tempo necessário para a retirada dos poluentes do solo. Estudos com cobaias podem
auxiliar no entendimento dos processos decorrentes de toxicidade e lesão celular causados
pela inalação dos contaminantes do solo.
1.5 O ESTUDO
O estudo consistiu em duas etapas (Figura 1.1):
a) Ensaios de Biorremediação: realizados e analisados no Laboratório de Microbiologia
Agrícola e do Ambiente e no Laboratório de Fertilidade da Faculdade de Agronomia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul; análises complementares de Microbiologia:
realizadas no Laboratório de Microbiologia do Hospital São Lucas da Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul; Análises especiais de cromatografia foram feitos na Copesul
S/A;
b) Ensaios de Toxicidade e lesão celular em modelo animal: realizados no Laboratório de
Biofísica da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul e analisados pelos
Laboratórios de Bioquímica, Microbiologia e Patologia do Hospital São Lucas da PUCRS;
1.6 PROTEÇÃO DOS DIREITOS DOS ANIMAIS
A pesquisa em modelo animal foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da PUCRS
(Ofício n
o
492/04-CEP em 20 de julho de 2004), considerando os procedimentos apresentados
na Lei no. 6.638 (08/05/1979) e na Declaração Universal dos Direitos dos Animais,
UNESCO, Bruxelas (28/01/1978).
5
Figura 1.1: Esquema montado para a realização da pesquisa
Pulmonar
Derrame de
Gasolina
Toxicidade e
Lesão Celular
Hematológica
Renal
Hepática
Biorremediação
Superficial
Cromatografia Gasosa
Microbiologia
pH e Condutividade
Nitrogênio Mineral
Evolução de CO
2
Ensaios de Percolação
c/ e s/ Pluviometria
Cardíaca
CAPÍTULO 2 – BIORREMEDIAÇÃO, TOXICIDADE E LESÃO
CELULAR
2.1 BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS
2.1.1 Introdução
Zhou e Crawford (1995) observam que a contaminação de solos com gasolina, diesel, óleos
em geral e outros produtos de petróleo através de vazamentos, derrames e por outras fontes
tem se tornado importante foco de pesquisa. Compostos contidos na gasolina como o
benzeno, tolueno, etil-benzeno e isômeros de xileno (BTEX) são contaminantes especialmente
perigosos e estão entre as prioridades na lista de remediação do
Environmental Protection
Agency (EPA)
. Vazamentos advindos de tanques de combustíveis são uma das maiores fontes
de contaminação de gasolina, e é estimado que mais de 10% dos 3,5 milhões de tanques de
armazenamento de produtos de petróleo estejam vazando nos EUA e tenham causado mais de
300.000 incidentes ambientais. Os vazamentos não apenas contaminam os ecossitemas dos
solos, mas são também uma potencial fonte de contaminação para os aqüíferos a longo prazo
(Zhou e Crawford, 1995).
Os hidrocarbonetos contaminantes de solos e lençóis freáticos podem ser removidos destes
locais através de diversos métodos, como por exemplo “air spraying”, extração de vapor do
solo e biorremediação. Estratégias para uma biorremediação “in situ” barata e limpa incluem a
atenuação natural, bioestimulação, “bioventing”, “bioaugmentação”, “land-farming”,
compostagem e fitorremediação. Estes mais diversos métodos podem ser vistos em um grande
número de publicações que relatam processos de biorremediação e biodeterioração de
gasolina (Solano-Serena et al., 1999; Cunha e Leite, 2000; Passman et al., 2001) e diesel
(Richard e Vogel, 1999; Olson et al., 1999; Bento e Gaylarde, 2001; Gallego et al., 2001;
Bento et al., 2004) em solos. Frankenberger (1992) apresenta os princípios básicos da
biorremediação, que está se tornando um método bastante popular na limpeza de
hidrocarbonetos devido à sua simplicidade e aplicabilidade a grandes áreas, baixo custo e
7
eficiência, favorecendo a completa destruição dos contaminantes. Microrganismos nativos dos
solos podem utilizar os hidrocarbonetos como fonte de carbono (C) e energia para o seu
crescimento e proliferação nos solos. A degradação completa dos hidrocarbonetos
(mineralização) pela população microbiana resulta na formação de produtos inócuos como
dióxido de carbono (CO
2
), água (H
2
O) e biomassa celular como produtos finais
(Frankenberger, 1992; Alexander, 1994; Paul e Clark, 1996).
O “land farming” o u “land treat ment” tem sido freqüentemente utilizada pela indústria para
degradar resíduos e se tornou um processo freqüente para o tratamento de materiais ricos em
hidrocarbonetos que foram derramados sobre o solo (Alexander, 1994). A biodegradação de
óleos pode ser estimulada pela adição de nutrientes, promoção de aeração, fornecimento de
umidade adequada e incidência luminosa (Frankenberger, 1992; Alexander, 1994; Prescott et
al., 1999; Tedesco et al., 1999; Selbach e Camargo, 2001). A umidade do solo é um fator
limitante para as rápidas transformações microbianas, sendo então necessárias formas de
manter níveis de umidade ótimos para os organismos aeróbicos. Estas técnicas já são
padronizadas para o controle de aterros sanitários na Engenharia Civil.
Os efeitos de co-solvência também são importantes, já que a gasolina brasileira contém álcool,
componente que é miscível em água. O incremento da solubilidade dos componentes benzeno,
tolueno, etil-benzeno e xileno (BTEX) em água é devido ao fato do álcool migrar para a fase
aquosa (Corseuil e Fernandes, 1999). Uma vez que a gasolina brasileira contém
aproximadamente 22-24% de etanol (Cunha e Leite, 2000; Cordazzo et al., 2000), os efeitos
de co-solvência devem ser considerados, não somente pelos BTEX serem relativamente
solúveis em água, mas por também serem cancerígenos (Frankenberger, 1992; Friedman,
1996; Klaassen, 2003; Kumar et al., 2005).
Existem diversas técnicas que direta ou indiretamente monitoram os processos dinâmicos que
ocorrem durante a biorremediação. Para tanto, são necessárias informações básicas, como a
concentração de óleo residual, densidade de microrganismos degradadores de óleo,
propriedades químicas e fisicas do solo (como a evolução de CO
2
, alterações do pH ou
condutividade elétrica do solo, nitrogênio inorgânico), o potencial de biodegradação e as taxas
ideais de fertilizantes químicos a serem aplicados (Frankenberger, 1992; Alexander, 1994;
Tedesco et al., 1999). Estas técnicas foram utilizadas em uma das etapas deste trabalho
experimental para avaliar o comportamento de um lodo orgânico como promotor da
8
decomposição de diesel e gasolina no solo de Arenito Botucatu, comparadas a adição de um
fertilizante mineral (NPK) e também a um solo sem qualquer tratamento. Os resultados
obtidos neste tipo de testes de laboratório podem servir de base para se poder prever a
remediação de uma área contaminada por hidrocarbonetos, uma vez que os fatores limitantes
dos microcosmos foram adequadamente considerados. Derrames de diesel e gasolina em solos
podem ocorrer como conseqüência de acidentes durante o transporte, armazenamento ou
bombeamento, e o conhecimento de alternativas de remediação é imprecindível (Spinelli et
al., 2005).
Dada a complexidade do problema decorrente da variedade de processos associados à
biorremediação, esta revisão aborda alguns dos fenômenos considerados essenciais à presente
análise, como microbiologia de solos, biofilmes, efeitos decorrentes da presença de metais
pesados e técnicas de biorremediação existentes, além de aspectos ligados a toxicidade e lesão
celular.
2.1.2 Microbiologia de Solos e seu Microambiente
Algumas características dos solos influenciam diretamente a disponibilidade de nutrientes e os
processos microbiológicos e bioquímicos (Prescott et al., 1999). Um diagrama esquemático de
um solo típico é mostrado na Figura 2.1. A parte orgânica decorre de plantas, animais, insetos
e outros materiais adicionados, os quais são gradualmente transformados em humus rico em
nutrientes. Estes variados componentes formam agregados heterogêneos de vários tamanhos,
contendo uma complexa rede de poros. Bactérias e fungos utilizam diferentes estratégias
funcionais para aproveitar esta complexa matriz física. A maioria das bactérias do solo se
localiza na superfície das partículas do solo e necessitam água e nutrientes na sua imediata
vizinhança (Figura 2.2). Bactérias são mais freqüentemente encontradas em superfícies de
menor porosidade (2 a 6
µ
m em diâmetro). Nesta condição, é menos provável que sejam o
alimento de protozoários, ao invés de outras que se expõem no exterior da superfície de grãos
de areia ou partículas de matéria orgânica (Prescott et al., 1999; Paul e Clark, 1996).
9
Figura 2.1: Habitat de solo contendo partículas minerais (Sa: areia, Si: silt, C: argila), matéria
orgânica (OM), água (W), raízes (R), e microrganismos do solo [bactéria (B), actinomicetos
(A), esporos de micorrizas e hifas (My), hifas de fungos saprofíticos (H), nematódio (N),
protozoário ciliado (CP), e um mite (M)] (Sylvia et al., 1999)
Os fungos filamentosos, em contraste, tendem a se localizar fora dos agregados. Estes
organismos, através de crescimento filamentoso, formam pontes entre regiões separadas, nas
quais a umidade é mantida (Prescott et al., 1999). Os fungos filamentosos podem mover
nutrientes e água por grandes distâncias nos solos. Protozoários, insetos de solo, nematódios e
outros animais de solo também estão presentes. Muitos destes organismos se alimentam de
bactérias e fungos.
10
Devido às limitações de difusão dos gases por dentro e por fora dos agregados e a
possibilidade dos espaços estarem saturados, grandes mudanças em sais dissolvidos e gases
podem ocorrer nestes pequenos poros e microambientes. Solos geralmente têm altas
concentrações de CO
2
, CO e outros gases em comparação com a atmosfera, e uma
correspondente diminuição da concentração de O
2
(Tabela 2.1). Tais mudanças serão mais
acentuadas em porosidades menores, onde muitas bactérias são encontradas. Podem ser
formados gradientes de oxigênio e microambientes anaeróbios. Quando isso ocorre, o solo
rapidamente passa de uma condição aeróbia, com alguns microambientes anaeróbios, para um
meio predominantemente anaeróbio. À medida que se distancia da superfície, menos O
2
permanece disponível, especialmente em ambientes úmidos, menos permeáveis (Prescott et
al., 1999).
Figura 2.2: Bactérias no solo. A microscopia pode ser usada para a observação de bactérias no
seu habitat natural (Prescott et al., 1999).
Tabela 2.1: Concentrações de oxigênio e dióxido de carbono na atmosfera de um solo tropical
nas condições úmido e seco (Russell, 1973).
Oxigênio (%)
Dióxido de carbono (%)
Profundidade (cm)
Úmido
Seco
úmido
seco
10
13,7
20,7
6,5
0,5
25
12,7
19,8
8,5
1,2
45
12,2
18,8
9,7
2,1
90
7,6
17,3
10,0
3,7
120
7,8
16,4
9,6
5,1
11
Outros fatores físicos também influenciam os microrganismos. Em pH neutro, a maioria dos
componentes sólidos do solo, incluindo os microrganismos, estão negativamente carregados.
Íons positivamente carregados como os de hidrogênio e de amônio são atraídos a estas
superfícies negativamente carregadas. Este fator pode alterar os microambientes. Argilas e
humus – que consistem em matéria orgânica parcialmente degradada ou estabilizada –
também atraem e combinam uma variedade de substâncias orgânicas e inorgânicas. Isso inclui
muitos íons de metais e produtos de decomposição (Prescott et al., 1999).
2.1.3 Biofilmes
Durante os processos de biodegradação ocorre a formação de biofilmes (Maier et al., 2000;
CBE, 2005). O biofilme é uma camada de matéria orgânica e microrganismos formado pela
ancoragem e proliferação de bactérias à superfície de um objeto. Os biofilmes são
caracterizados pela presença de polímeros extracelulares bacterianos que criam uma camada
de limo em superfícies sólidas como metais, plásticos, partículas de solo, implantes médicos,
tecidos vegetais ou animais (Figura 2.3 e Tabela 2.2). A secreção de polissacarídeos promove
uma matriz de ancoragem de células bacterianas e forma a arquitetura interna da comunidade
do biofilme. Esta matriz também influencia o funcionamento e sobrevivência dos biofilmes
em ambientes hostís. O biofilme pode ser formado por bactérias de uma única espécie, mas
mais freqüentemente consiste de muitas espécies, assim como também de fungos, algas,
protozoários, detritos e produtos de corrosão. Essencialmente, biofilmes podem se formar em
qualquer superfície exposta a bactérias e um pouco de umidade. Uma vez ancorados a uma
superfície, os microrganismos formadores do biofilme acarretam uma variedade de reações
prejudiciais ou benéficas à saúde pública, dependendo das condições ambientais à sua volta.
Biofilmes implicam em 65% das infecções bacterianas humanas, causam colmatação,
contaminação de produtos, falha em equipamentos, e decréscimo de produtividade devido ao
tempo para se limpar os sistemas e reparos (CBE, 2005).
Muitas bactérias são planctônicas – flutuam na água. Entretanto, a maioria das bactérias que
causam problemas é séssil – aderem a superfícies – e vivem em biofilmes. Atualmente sabe-se
que uma bactéria, ao ancorar-se a uma superfície, "liga" diferentes tipos de genes, os quais as
“transformam” efetivamente em diferentes organismos. Recent es estudos têm revelado que
12
existem significativas diferenças no nível da expressão dos genes e envolvem ciclos de
nutrientes entre os membros de uma espécie bacteriana (Maier et al., 2000; CBE, 2005).
Figura 2.3: Estágios da formação de um biofilme: ancoragem, colonização e crescimento das
estruturas (CBE, 2005).
O comportamento dos biofilmes bacterianos é muito mais complexo que o das células
suspensas, pois as bactérias vivem em comunidades no biofilme. Dentro destas populações,
aparentemente há uma "divisão de trabalho"; enquanto algumas células utilizam a energia dis-
ponível para acionar rotas metabólicas que afetam parte da degradação de compostos orgâni-
cos, outras células adjacentes da mesma população utilizam os produtos degradados para
produzir novas células que são adicionadas ao ambiente (Maier et al., 2000; CBE, 2005).
Na Figura 2.4 se observa a secção transversal de um biofilme e a introdução de sondas
sensíveis ao O
2
, com áreas de vazio e de aglomerados no biofilme, revelando que a região dos
canais de água é aeróbia. A região central do aglomerado é anaeróbia. Este é um fato muito
importante, visto que um intenso aglomerado protege e permite a sobrevivência de células
anaeróbias em seu interior. Ao contrário, regiões em que ocorre fluxo de água apresenta vida
aeróbia, pois carrega O
2
em seus fluídos. E na Figura 2.4b observa-se uma fotografia de um
biofilme utilizando-se um microscópio de varredura a laser (“tapete” microbiano termofílico
encontrado no Parque Nacional Yellowstone, células de cianobactérias do gênero Synecho-
coccus – CBE, 2005).
13
Tabela 2.2: Problemas relacionados a Biofilmes. Esta tabela resume os vários sistemas nos
quais os biofilmes se formam com conseqüências indesejáveis (Adaptado de CBE, 2005)
Sistema
Impacto da formação do Biofilme
Torres de resfriamento de águas
Redução das transferências de calor e massa
Trocadores de calor
Redução das transferências de calor
Fabricação de papéis
Degradação da qualidade do produto
Processamento de alimentos
Contaminação
Processamento de fotografias
Manchas de impressão, falhas de equipamento
Osmose reversa
Redução da permeabilidade das membranas, degradação
de materiais
Piscinas
Riscos à saúde, degradação de cosméticos
Drenos
Diminuição fluxo, colmat. geotêxteis
Equipamentos
Corrosão e biodeterioração
Recuperação de poços
Colmatação dos poços de injeção de água, fontes
(produção de sulfeto de hidrogênio) e corrosão
Bombas de água potável
Riscos à saúde
Figura 2.4: a) Secção transversal da colocação de sondas sensíveis ao O
2
, em áreas de vazio e
de aglomerados no biofilme, revelando que a região dos canais de água é aeróbia; região
central do aglomerado é anaeróbia; b) Biofilme de cianobactérias, do gênero Synechococcus
(CBE, 2005)
14
2.1.4 Metais Pesados nos Solos
Frankenberger (1992) comenta que os efeitos inibitórios dos metais pesados podem
influenciar na biodegradação de materiais orgânicos. A presença de matais pesados nas borras
oleosas, óleos de motores entre outros acarreta em efeitos deletérios para os microrganismos
oxidadores de carbono na decomposição de hidrocarbonetos. Jensen (1977) estudou os efeitos
do chumbo na biodegradação de óleos em solos e mostrou que o elemento pode causar certas
mudanças nas populações de solo. Tornabene e Edwards (1972) relatam que o chumbo pode
ser imobilizado e está largamente associado às membranas celulares microbianas e não com a
fração citoplasmática. Os solos apresentam naturalmente chumbo em torno de 15 a 100 ppm.
(Frankenberger, 1992). Outros elementos de importância incluem o Zn, Cu, Cr, Ni e Cd. Em
aplicações repetidas de lodos oleosos em procedimentos de “landfarming”, os metais pesados
podem se acumular em níveis tais que reduzam a biodegradação. Entretanto, muitos destes
elementos são fortemente imobilizados nos solos como resultado de formação de complexos
com matéria orgânica e absorção a minerais argilosos. Os íons de cádmio são mais tóxicos aos
microrganismos do que o chumbo, além da biodisponibilidade do cádmio em solos
geralmente ser maior que a do chumbo para iguais concentrações (Frankenberger, 1992;
Alexander, 1994).
Gomes et al. (1998) fazem uma revisão a respeito da biorremediação de metais por
microrganismos. Os autores relatam que os íons metálicos são acumulados por
microrganismos para manutenção de funções biológicas vitais, porém nem sempre são
acumulados por necessidades ou exigências metabólicas. Mostram que os microrganismos
isolados de processos industriais e ambientes poluídos apresentam altas concentrações de
metais e têm alta tolerância a estes elementos. A resistência destes microrganismos está
diretamente relacionada à sua habilidade de acumular os metais, sendo este processo
dependente ou não do seu metabolismo.
2.1.5 Biorremediação
Conforme Alexander (1994), o objetivo da biorremediação é degradar poluentes orgânicos a
concentrações que não sejam detectáveis ou, se detectáveis, a concentrações abaixo dos
15
limites estabelecidos como seguros ou aceitáveis pelos órgãos reguladores. Por estarem
dispersos, representando riscos à saúde ou à ecologia, e estarem suscetíveis a detoxicação mi-
crobiana, grande interesse recai diretamente sobre óleos e seus derivados, gasolina e seus
constituintes, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), alifáticos clorados como TCE
e tetracloroetileno (também chamados de percloroetileno ou PCE), e hidrocarbonetos aro-
máticos clorados. Apesar de não serem biodegradados, metais são de especial interesse em
biorremediação porque podem ser alterados e convertidos a uma forma menos danosa pelos
microrganismos (Alexander, 1994).
Alexander (1994), Allard e Neilson (1997) e Boopathy (2000) mostram que certos critérios
devem ser conhecidos quando se fala em biorremediação: (a) a existência de microrganismos
que tenham a necessária atividade catabólica; (b) estes organismos devem ter a capacidade de
transformar os compostos a uma taxa razoável e baixar suas concentrações a níveis que
estejam dentro de normas estabelecidas; (c) não devem gerar produtos ainda mais tóxicos
durante a remediação; (d) o local não deve apresentar concentrações ou combinações de
químicos notoriamente inibitórios às espécies biodegradantes, ou meios de diluição devem
existir; (e) os componentes alvo devem estar disponíveis aos microrganismos; (f) condições
locais de campo ou no biorreator devem ser criadas para conduzir o crescimento microbiano
ou sua atividade como, por exemplo, um suplemento adequado de nutrientes inorgânicos,
suficiente O
2
ou outro aceptor de elétrons, umidade favorável, temperatura estável e uma fonte
de C e energia para o crescimento caso o poluente seja cometabolizado; (g) os custos desta
tecnologia devem ser menores ou, pelo menos não mais caros que outras tecnologias que
possam também destruir os químicos. Nenhum destes critérios é trivial. Dificuldades em se
entender qualquer um destes itens podem resultar em falhas nos processos de biodegração ou
na inabilidade para se chegar aos objetivos estabelecidos.
Alexander (1994) discute variações dos processos de biorremediação, que incluem sistemas
que provem a irrigação de água e nutrientes, uma barreira impermeável na parte inferior do
solo e meios de coleta do material lixiviado, como em um colchão reativo (Figura 2.5). Uma
camada impermeável pode ser feita tanto de argila como de materiais sintéticos. Estes tipos de
reatores são utilizados em muitos locais nos quais a biorremediação é utilizada, em solos
contaminados com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, BTEX, ou ainda ambos (Ryan et
al., 1991). As camadas impermeáveis e os sistemas de coleta de lixiviação podem ser
16
necessários, uma vez que os tratamentos convencionais podem resultar em contaminação de
camadas inferiores e de águas subterrâneas pelos compostos ou produtos de transformação
microbianos que são carreados pelas águas de percolação (Alexander, 1994; Corseuil e
Fernandes, 1999). Em alguns casos, tubulações perfuradas podem ser instaladas sobre as
camadas impermeáveis para coletar os fluídos percolantes e areia pode ser posta à sua volta
para melhorar a drenagem. Fluídos removidos do sistema podem ser levados a tratamentos,
podendo ocorrer em um biorreator adjacente. Água e nutrientes também podem ser inseridos
por meio de sistemas de irrigação, e toda a operação pode ser feita em um sistema fechado
com plásticos, como em uma estufa, caso produtos voláteis tóxicos sejam emitidos
(Alexander, 1994).
Figura 2.5: Diagrama de um reator preparado para o tratamento de um solo escavado
contaminado (Fogel et al., 1989)
Estudos recentes mostram que certos surfactantes, especialmente os etoxilatos álcoois não-
iônicos, em baixas concentrações também estimulam a biodegradação de hidrocarbonetos
adsorvidos no solo. Este importante efeito promotor ocorre cada vez que pequenos compostos
são liberados do solo pelos surfactantes (Foght et al., 1989; Aronstein et al., 1991; Bognolo,
1999; Bardi et al., 2000).
A biorremediação pode ser ainda incrementada por vários processos nos quais os sólidos
contaminados são misturados constantemente com um líquido em um tratamento à base de
lama. A operação lembra os procedimentos de lama ativada que é comum em tratamento de
esgotos, e permite a aeração, mistura adequada e controle de muitos fatores que afetam a
biodegradação. Níveis de O
2
dissolvido, o pH e a concentração de nutrientes inorgânicos
podem ser monitorados e controlados. Alguns biorreatores são inoculados com uma única
espécie ou ainda com uma mistura de microrganismos capazes de trabalhar de forma efetiva
17
sob condições controladas (Alexander, 1994). Procedimentos com lama podem ser
combinados com tecnologias de lavagem para remover os contaminantes do solo (Compeau et
al., 1991).
Alexander (1994) comenta que um procedimento comum para a biorremediação “ in situ” de
águas subterrâneas consiste na introdução de nutrientes e O
2
diretamente nos aqüíferos,
permitindo que a microflora indígena destrua as moléculas indesejadas. Este processo é
algumas vezes chamado de biorrestauração. Vazamentos de tanques de armazenamento de
gasolina resultam no aparecimento de benzeno, tolueno, etilbenzeno e xilenos nos solos.
Apesar dos BTEX estarem inicialmente na fase de gasolina, cuidados devem ser tomados,
pois são tóxicos e porque podem entrar na fase aquosa na forma de suspensão (Couseuil e
Fernandes, 1999). Águas subterrâneas contaminadas com diesel e combustíveis de aviação JP-
4 também são tratados de maneira similar.
Testes de laboratório podem determinar uma quantidade ótima de nutrientes a serem
adicionados, e isso é especialmente importante para evitar pouca ou muita quantidade
suplementada. Pouca quantidade de nutrientes pode resultar em transformações lentas, e muita
pode colmatar os poços ao aqüífero devido a grande quantidade de biomassa que será formada
(biofilme), causando a parada do processo de remediação (Frankenberger, 1992; Alexander,
1994). Um procedimento comum nestes casos é adicionar os nutrientes em solução através de
poços de injeção diretamente para a zona saturada ou através de galerias de infiltração para a
região não-saturada ou região superfície-solo (Figura 2.6). A água é retirada dos poços e os
nutrientes são repostos, refazendo-se a circulação. As concentrações dos contaminantes e
nutrientes são medidas em intervalos regulares de tempo através de amostragem dos poços
instalados entre os pontos de injeção e remoção. Em alguns casos, a água não é recirculada,
mas disposta na superfície (Thomas e Ward, 1989).
Alexander (1994) mostra que a resposta dos microrganismos ao N, P e O
2
ou a eficácia da
biodegradação é simples de ser determinada em laboratório e também em um biorreator, no
qual as medidas podem ser feitas através dos fluxos de entrada e saída destes compostos. O
mesmo não acontece quando temos uma biorremediação “ in situ”. Os poluentes podem
desaparecer do local como resultado de volatilização e biorremediação do composto do solo
ou da água ou meramente por diluição em fluxos d’água. A forma para se acessar a atividade
18
microbiana em campo é determinar as mudanças na concentração dos contaminantes com o
tempo.
Figura 2.6: Tratamento de lençol freático “ in situ” contaminado com hidrocarbonetos
utilizando trincheira de infiltração (acima) e um poço de injeção (abaixo)(Morgan e
Watkinson, 1989).
2.1.6 Considerações sobre População Microbiana de uma Área Contaminada
com Hidrocarbonetos
Frankenberger (1992) relata que os mais recentes métodos de enumeração de microrganismos
degradadores de petróleo incluem o plaqueamento em agar-óleo, em um meio com óleo-gel-
sílica e inoculação em um meio líquido pela técnica do número mais provável (MPN). Walker
e Colwell (1976) sugeriram que o número de microrganismos degradadores deve ser expresso
19
como uma percentagem da população total bacteriana. Um ágar nutriente geralmente é
utilizado para a contagem total e o MPN para os microrganismos degradadores específicos. Os
oxidadores de hidrocarbonetos variam entre menos de 1% a 10% do total de bactérias do solo
em estudo. Se houver uma população degradadora específica maior que 3% do número total
de bactérias, o solo é considerado como tendo um alto potencial de degradação de
hidrocarbonetos (Frankenberger, 1992). A população microbiana nativa pode ser aclimatada à
presença de contaminantes orgânicos e a degradação ocorrerá naturalmente, podendo ser
limitada por fatores ambientais.
Brown e Braddock (1990) desenvolveram um método para a enumeração de microrganismos
degradadores específicos. A técnica se baseia na habilidade dos microrganismos degradadores
em emulsificar o óleo quando na condição de única fonte de carbono em microcultivo. Os
poços são considerados positivos quando a emulsificação de óleo é claramente indicada pela
fragmentação do óleo. A Figura 2.7 ilustra como exemplo os resultados pela técnica do
número mais provável (MPN) de cinco poços contendo uma amostra de sedimento marinho
contaminado. As diluições de 10
-2
e 10
-3
são todas positivas para a emulsificação de óleo crú,
sendo quatro ou cinco para diluição 10
-4
positivas, e apenas uma de cinco da diluição de 10
-5
é
positiva. Posteriormente, Braddock e Catterall (1999) mostraram, através de pequenas
modificações no método (utilizado nesta Tese), que é possível se estimar populações de
heterotróficos totais assim como de degradadores de gasolina e óleo diesel.
Figura 2.7: Exemplo de uma placa utilizando o método proposto por Brown e Braddock
(1990)
20
Cunha e Leite (1997) realizaram seu estudo tentando otimizar condições ambientais em
microcosmos não-esterilizados contaminados com gasolina e inoculados de
Pseudomonas
putida
. Bioestimulação com NH
4
NO
3
, K
2
HPO
4
e H
2
O
2
em diversas concentrações foram
testadas. A concentração de nitrato de amônia ótima ficou em 30
µ
mol/g de solo, o fósforo
apresentou um efeito inibitório para qualquer concentração testada, e o peróxido de
hidrogênio se mostrou ótimo em 0,1mM.
Margesin e Schinner (1997) realizaram um estudo comparativo da eficiência dos
microrganismos indígenas e inoculados (degradadores específicos adaptados ao frio) na
biodegradação de diesel em solos alpinos e sua relação com um fertilizante mineral (C:N:P =
100:10:2). A atividade dos microrganismos indígenas na biodegradação do diesel melhorou
significativamente com o fertilizante e mostrou que a bioestimulação parece apresentar
melhores resultados quando comparada a “
bioaumentação
”. Um fator interessante do estudo é
o fato de nenhum tratamento com inóculo e fertilizante ter sido mais eficiente do que os
microrganismos nativos bioestimulados.
Olson et al. (1999) estudaram as taxas de biodegradação de algumas classes de
hidrocarbonetos (alcanos e aromáticos) separados de um óleo diesel comprado de um posto de
combustíveis. Foi utilizado um inóculo de microrganismos degradadores específicos isolados
de um solo contaminado, acompanhando-se seu crescimento em placas de Petri e as frações de
hidrocarbonetos por cromatografia gasosa. Os hidrocarbonetos foram avaliados
separadamente e em combinações. Os autores observaram uma correlação entre o crescimento
microbiano e as perdas de biodegradação. A fração de aromáticos ainda se mantinha em altos
níveis ao final do experimento em 35 dias, sugerindo que após a depleção de compostos de
alcanos, o consórcio microbiano não conseguiu degradar de maneira eficaz os compostos
aromáticos. Controles sem o inóculo tiveram muito poucas perdas. Nos tratamentos contendo
microrganismos, observaram uma contagem, ao final de 35 dias, de mais de 50 vezes o
número de células encontradas inicialmente. Olson et al. (1999) notaram que as taxas de
eliminação dos hidrocarbonetos seguem uma ordem de degradação, sendo primeiramente
degradados os n-alcanos, seguidos pelos isoalcanos e aromáticos.
Richard e Vogel (1999) estudaram um consórcio de bactérias capazes de degradar óleo diesel,
composto por diversos tipos de
Pseudomonas sp.
e por
Achromobacter sp
. Conforme
21
Alexander (1994), o fato de encontrar
Pseudomonas sp.
não é surpresa, visto que tem alta
freqüência nos solos avaliados na literatura. Richard e Vogel (1999) observaram que após 50
dias de incubação, 90% do diesel incial havia sido biodegradado pelo consórcio, não sendo
encontrado nenhum composto aromático ao final do experimento. A eficácia do consórcio de
bactérias avaliado evidenciou um benefício dos membros do consórcio não degradadores
específicos na mineralização de hidrocarbonetos.
Cunha e Leite (2000) avaliaram a biodegradação de gasolina em diversos tratamentos
contendo solo inoculado ou não com diferentes consórcios de culturas bacterianas. Os
microrganismos capazes de crescer na presença de gasolina foram isolados do solo e vários
sistemas de tratamento foram testados usando tanto as espécies isoladas quanto a
Pseudomonas putida
obtida de coleção de cultura. O sistema constituído somente da
microflora autóctone apresentou valores médios de degradação de 50%. A associação de
Pseudomonas putida
,
Pseudomonas alcaligenes
,
Burkholderia cepacia
e a microflora
indígena do solo mostraram o melhor percentual de remoção dos hidrocarbonetos. O solo não
foi esterilizado de forma a se avaliar condições ambientais. Cunha e Leite (2000) observaram
que o crescimento de uma população específica causa um desequilíbrio na comunidade por
competição por espaços físicos, nutrientes e água, reduzindo para pequenas quantidades os
microrganismos que têm a melhor performance em biodegradar.
Capelli et al. (2001) analisaram a possibilidade de biorremediação de hidrocarbonetos de óleo
crú utilizando microrganismos indígenas. Foram realizados ensaios de laboratório com
microcosmos inoculados com bactérias indígenas com seguimento por 45 dias. O conteúdo
total de hidrocarbonetos foi reduzido em média 70% ao final dos ensaios. Os hidrocarbonetos
saturados e aromáticos foram os mais rápidos a serem degradados, com uma mínima
degradação ocorrendo nas frações de resinas (20%) e as frações de asfaltanos permaneceram
constantes. Ao contrário da situação onde ocorre uma contaminação acidental, a microflora
indígena da pesquisa era exposta continuamente a altos níveis de contaminação. Foi
observado que os hidrocarbonos interferem na quimiotaxia dos microrganismos não-
degradadores pelos seus substratos, favorecendo o sucesso da microbiota degradadora. Cada
espécie é capaz de degradar apenas um número limitado de moléculas da fração dos
hidrocarbonetos, então um incremento da curva de crescimento pode ser um indicativo do
aumento do número de espécies.
22
Mishra et al. (2001) conduziram um experimento in situ em uma área de 4.000m
2
(300
toneladas de lodo oleoso), contaminada com um lodo oleoso pertencente a uma refinaria,
utilizando um consórcio de bactérias degradadoras específicas. O tempo de estudo foi 120
dias. Inicialmente, foram realizados testes preliminares para identificar um consórcio de
bactérias que fossem capazes de degradar o lodo oleoso. O estudo envolveu uma parte da área
como controle e em outra foi adicionada uma solução nutriente para fins de comparação com
a área onde foi aplicado o consórcio de bactérias, validando a opção da adição de nutrientes e
de um consórcio de bactérias. Os contaminantes foram medidos como hidrocarbonetos totais
(TPH).
Mishra et al. (2001) observam que pelas características do lodo oleoso em ser heterogêneo, é
praticamente impossível a degradação do material por apenas uma espécie, sendo necessária
uma população mista com um substrato específico para realizar a tarefa. Os autores discutem
que a “
bioaugmentação
” é uma técnica promissora nos processos de biorremediação e relatam
que bactérias indígenas em um consórcio garantem aos microrganismos terem uma maior
tolerância à toxicidade que os hidrocarbonetos possuem e são mais resistentes às variações
ambientais.
Rahman et al. (2002) descrevem métodos para incrementar as taxas de biodegradação de
gasolina em solos contaminados por biorremediação ex situ. Os autores utilizam dois tipos de
lodos, surfactantes e um consórcio de bactérias constituído por
Micrococcus sp
.,
Bacillus sp
.,
Corynebacterium sp
.,
Flavobacterium sp
. e
Pseudomonas sp
. O trabalho mostra que a
situação onde todos os parâmetros analisados estão agrupados apresenta a melhor eficácia de
degradação, aparentemente um resultado esperado.
Trindade et al. (2002) comentam que derrames de óleo nos solos argilosos têm estimulado
diversos estudos na área de biorremediação. Isto porque há uma grande dificuldade de
remediar estes solos devido às fortes interações entre o solo e os contaminantes, além da baixa
permeabilidade, tornando praticamente impraticável a técnica tradicional de biorremediação in
situ. Trindade et al. (2002) realizaram experimentos de forma a avaliar a eficiência da
remoção de poluentes através da adição de microrganismos degradadores nativos de solos
(
Nocardia nova
,
Pandoraea sp
.,
Rhodotorula glutinis
) e definir o melhor “pool” a ser
utilizado no tratamento. Juntamente com esta abordagem, foi avaliada a influência de taxas de
nutrientes em termos de C:N:P.
23
Ruberto et al. (2003) analisaram a resposta dos microrganismos indígenas à presença de um
óleo utilizado nas estações científicas argentinas na Antártica. Foram criados microcosmos
com solos antárticos suplementados com N e P em C:N:P de 100:12:3, valores maiores que os
utilizados previamente na prática internacional. A
Acinetobacter sp
. foi utilizada como
“ bioaugmentação”, sendo previamente retirada e isolada de um rio cronicamente
contaminado. As bactérias heterotróficas e degradadoras específicas foram identificadas ao
longo dos ensaios.
Ruberto et al. (2003) observaram que no 10º dia de tratamento havia perdas de 54 a 61% em
todos os tratamentos. Esta significante diminuição foi atribuída à volatilização dos compostos
mais voláteis do óleo. Neste momento, não havia diferenças significativas entre os
tratamentos. Por volta do dia 20, todas as condições bióticas mostraram uma diminuição do
conteúdo de hidrocarbonetos. A fertilização com N e P determinou maiores valores residuais
de TPH, apresentando diferenças significativas para os outros tratamentos ao final dos
ensaios. Comparados ao controle abiótico, a atividade dos microrganismos indígenas reduziu
em 35% os TPH, enquanto a “ bioaugmentação” em 65%. A presença do óleo, de forma geral,
determinou um aumento na contagem microbiana, apesar de nos tratamentos com adição de N
e P, a contagem ter diminuído, principalmente relacionada à microflora indígena. A
“ bioaugmentação” com o
Acinetobacter sp
. apresentou as maiores contagens. Ruberto et al.
(2003) discutem que um dos mais importantes resultados da pesquisa é a resposta positiva da
microflora indígena antártica a uma poluição aguda por hidrocarbonetos. Mostram também
que o
Acinetobacter sp
. pode incrementar o processo de degradação do solo, sendo uma
importante ferramenta em biorremediação de áreas frias.
Peressutti et al. (2003) estudaram as mudanças da bacteriocenose nos solos da Patagônia
poluídos por óleos durante processos de biorremediação realizados em laboratório. Alguns
tratamentos receberam bioestimulação com NH
4
NO
3
e K
2
HPO
4
, e foram feitos um controle
abiótico e um outro apenas com bioestimulação sem contaminação. A enumeração bacteriana
foi feita através da técnica do número mais provável (MPN), avaliando microrganismos
heterotróficos e degradadores específicos.
Peressutti et al. (2003) relatam que as bactérias autóctones contidas no solo contaminado
foram eficazes em reduzir significativamente o conteúdo poluente total no solo após sete
24
meses de estudo, sem um período de adapatação inicial, provavelmente devido à história de
exposição prévia do solo a contaminações. Algum resíduo ainda encontrado foi atribuído à
presença de hidrocarbonetos tóxicos, além da ausência de nutrientes e outros hidrocarbonos
disponíveis. As bactérias gram negativas mostraram um efeito predominante nos processos de
biorremediação durante os primeiros sete meses e, após, a bacteriocenose autóctone foi
dominante com gram positivos. Conforme Peressutti et al. (2003), Greene et al. (2000)
mostraram mudanças semelhantes das comunidades de solos contaminados, relatando uma
sucessão de
Pseudomonas sp
. por
Rhodococcus sp
.
Prenafeta-Boldú et al. (2004) estudaram a biodegradação de uma mistura de BTEX e MTBE
em microcosmos e descrevem os efeitos da inoculação de um fungo capaz de metabolizar
tolueno denominado
Cladophialophora sp
., confirmado no solo por sondas de DNA através
de técnicas de biologia molecular. O fungo foi isolado previamente de um solo contaminado
por BTEX. Também foi avaliado no trabalho o efeito do pH a longo prazo. Quatro diferentes
tratamentos foram avaliados, sendo um solo não tratado com sua microflora nativa, um solo
autoclavado inoculado com o fungo, um não autoclavado inoculado com o fungo e um solo
autoclavado não inoculado (controle abiótico). Prenafeta-Boldú et al. (2004) observaram que a
atividade biodegradadora foi induzida pelos microrganismos indígenas 3 dias após a adição da
mistura de BTEX e MTBE. Enquanto os BTEX foram degradados em 8 dias, o MTBE não
mostrou sinais de degradação. A biodegradação também foi observada no solo estéril
inoculado com as conídeas do fungo, porém somente os compostos TEX foram consumidos.
Em um segundo solo estudado, em condições de pH neutro, não-estéril, inoculado com o
fungo, os tratamentos apresentaram pequenas variações nos BTEX, com taxas de degradação
do etil-benzeno um pouco mais significantes que os demais compostos. Em condições ácidas,
a atividade de biodegradação dos degradadores nativos foi consideravelmente menor que no
caso de pH neutro. Observou-se que a biodegradação do benzeno sempre necessitou da
atividade dos microrganismos indígenas e que a presença do fungo inoculado não mostra
qualquer efeito na degradação do composto. O MTBE também não foi biodegradado
significativamente neste tratamento, mostrando que o composto é mais recalcitrante que os
BTEX.
Prenafeta-Boldú et al. (2004) mostram que o tolueno e o etil-benzeno servem como substratos
ao crescimento dos fungos, enquanto os xilenos são cometabolizados e o benzeno não foi
25
degradado. O benzeno somente foi degradado pelos microrganismos nativos com taxas
independentes da presença ou não do fungo. Ficou claro que não há antagonismo entre os
degradadores de BTEX indígenas e o fungo introduzido.
Sabaté et al. (2004) apresentam um protocolo para biorremediação em duas fases. A primeira
fase envolve a caracterização microbiana baseada na enumeração dos microrganismos
heterotróficos e dos degradadores específicos e do conhecimento de sua atividade metabólica.
Em uma segunda fase, sugerem a identificação dos tratamentos mais apropriados e a avaliação
dos aditivos no microcosmo. Os autores utilizaram NH
4
Cl e K
2
HPO
4
em taxas de C:N:P de
100:10:1, aeração através da mistura do solo semanalmente, surfactante, inoculação de
microrganismos degradadores específicos e glicose.
Mielniczuk (1991) e Sabaté et al. (2004) relatam que os tratamentos contendo glicose são os
mais eficientes na biodegradação dos contaminantes. Sabaté et al. (2004) mostram que a
inoculação de um consórcio de degradadores específicos de frações pesadas de petróleo não
apresentou efeitos significativos. A comunidade microbiana natural, especialmente em solos
contaminados cronicamente, usualmente degrada os óleos se há condições favoráveis
(Alexander, 1994).
Diversos autores mostram a importância da utilização da capacidade de biodegradação e
biorremediação de bactérias autóctones dos solos contaminados. Muitas vezes, apenas um
bioestimulante pode incrementar e otimizar a remoção de contaminantes de solos sem que
seja necessária a introdução de um consórcio de microrganismos. A microbiota previamente
exposta a contaminações possui uma “memória biológica”, sendo mais eficaz na remoção dos
contaminantes no caso de derrames contínuos. Entretanto, diversos autores consideram a
introdução de consórcios de microrganismos como fator decisivo nos processos de
biorremediação. Existem métodos que determinam as frações de microrganismos totais e
degradadores específicos. Deve haver uma relação ótima de C:N:P, onde nenhum destes
elementos deve estar na forma recalcitrante, podendo-se obter facilmente esta relação em
ensaios de laboratório.
26
2.1.7 Volatilização e Cromatografia
A volatilização é um processo extremamente importante na biorremediação e, ao mesmo
tempo, pouco considerada nos trabalhos atuais. O aumento da temperatura incrementa a
volatilização dos compostos, sendo o inverso verdadeiro. Da mesma forma, a temperatura
influencia no metabolismo celular, aumentando ou diminuindo sua atividade em uma relação
diretamente proporcional. Além disso, as taxas de degradação são relacionadas ao número da
população microbiana. A mineralização dos hidrocarbonetos em CO
2
como produto final da
biorremediação é um fator importante para ser monitorado em qualquer estudo de laboratório,
mostrando elevadas taxas nos solos contaminados em relação aos controles, maiores ainda nos
solos bioestimulados ou com alguma inoculação.
McGill et al. (1981) estimaram que até 20 – 40% dos óleos crus podem volatilizar dos solos.
As altas temperaturas no verão favorecem a volatilização principalmente quando os solos
secam. A Figura 2.8 ilustra a capacidade de volatilização dos BTEX de um solo contaminado
por gasolina sob diferentes regimes de umidade. A volatilização dos BTEX tende a aumentar
com a diminuição da umidade. A taxa de volatilização é uma função da temperatura,
composição dos óleos, radiação solar e espessura das camadas do contaminante nos solos. A
volatilização e a biodegradação tendem a remover seletivamente as frações de hidrocarbonetos
mais leves. Estas frações incluem as cadeias curtas de alifáticos e hidrocarbonetos aromáticos,
como o benzeno, tolueno e xilenos (Frankenberger, 1992).
Donaldson et al. (1992) realizaram um estudo com painéis revestidos de polímeros sintéticos
onde adicionavam 10 dos hidrocarbonetos mais comumente encontrados na gasolina e
monitoravam suas perdas em 5 diferentes tratamentos, que incluíam um controle de solo seco,
e outros com variantes de umidade. Alguns eram deixados secar naturalmente, enquanto
outros eram umedecidos e revolvidos periodicamente, ou apenas uma vez durante os
experimentos. Os tanques foram dispostos ao meio ambiente. Os autores observaram que as
maiores taxas de volatilização passiva ocorreram nos solos com algum nível de umidade.
Menores taxas de volatilização ocorrem à medida que o conteúdo argiloso aumenta, e a
mistura contínua é importante na promoção de redistribuição dos químicos e taxas de perdas.
As perdas de hidrocarbonetos ocorreram de forma mais acelerada durante os experimentos
feitos no verão, em resposta a um maior aquecimento do solo e ventos quentes sobre a
27
superfície. Donaldson et al. (1992) mostraram que a volatilização pode ser utilizada para
remediar solos contaminados por gasolina a menores custos.
Zhou e Crawford (1995) observaram que enquanto o solo controle autoclavado mantinha os
TPH praticamente inalterados durante o período de estudos, os TPH dos outros tratamentos
diminuíram gradualmente para todas as concentrações. Nas condições experimentais, as taxas
de degradação foram diretamente relacionadas ao número da população microbiana.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
10
15
20
Umidade (%)
Volatilização (mg.kg
-1
)
Tolueno
Benzeno
Xileno
Etil-Benzeno
Figura 2.8: Volatilização do benzeno, tolueno, etil-benzeno e xilenos de um solo sob vários
regimes de umidade (Frankenberger, 1992)
Spilborghs (1997) estudou em um microcosmo o comportamento de um vazamento de
gasolina a subsuperfície e aplicou a técnica “ air sparging” objetivando a biorremediação do
contaminante. Na pesquisa foi simulado um vazamento de tanques de armazenamento de
combustíveis. O processo foi monitorado por 216 dias, mostrando uma total degradação dos
BTEX aos 126 dias, com biodegradação mais intensa do tolueno (98 dias), seguido pelo
benzeno (112 dias) e xilenos ao final do trabalho (126 dias).
Solano-Serena et al. (1998) avaliaram o potencial da microflora originária de solos
contaminados e não-contaminados em degradar gasolina em condições não limitantes, ou seja,
28
a capacidade de degradação intrínseca da microflora. A performance dos microrganismos foi
investigada através de uma gasolina modelo (GM23) constituída pelos 23 mais representativos
hidrocarbonetos contidos em gasolinas comerciais. Foram realizadas análises cromatográficas
e um acompanhamento por produção de CO
2
. A degradação dos componentes do GM23 foi
avaliada em diferentes tratamentos. No tratamento com amostra de solo não contaminado
previamente, não foi observada a degradação dos hidrocarbonetos de cadeias longas até o
tempo de 28 dias, mostrando que os alcanos de cadeias longas e ramificadas são menos
suscetíveis à degradação microbiana, necessitando muitas vezes de associações de cepas e
cometabolismo. O reforço da microflora com duas cepas originárias de solos contaminados
mostrou uma maior atividade de degradação com a completa eliminação de todos os
compostos aos 28 dias. Solano-Serena et al. (1998) observaram ainda que a completa
eliminação ocorre independentemente dos compostos estarem isolados ou na mistura total.
Então, notaram que a degradação da gasolina parece ser uma soma da degradação dos
compostos individuais.
Solano-Serena et al. (1999) analisaram a biodegradação de gasolina utilizando uma microflora
obtida de um lodo ativado de tratamento de uma estação de tratamento de águas. A cinética da
degradação foi estudada em culturas em meio líquido utilizando como parâmetros o CO
2
, O
2
e
análise cromatográfica de diferentes compostos. Os autores observaram que 62% do carbono
degradado era mineralizado em CO
2
e o resto era convertido em biomassa. Uma solução
nutritiva contendo gasolina (400mg/L) foi degradada em 25 dias, com diferentes taxas
ocorrendo para cada um dos hidrocarbonetos.
Solano-Serena et al. (2000) realizaram um estudo de seleção de população microbiana que
fossem capazes de degradar hidrocarbonetos recalcitrantes de gasolina através de
monitoramento de cultura e decomposição por “ headspace”. A metodologia empregada foi a
monitorização por cromatografia da produção e consumo de CO
2
e O
2
. Neste trabalho, os
autores compararam solos contaminados previamente com um não contaminado. Diversos
hidrocarbonetos presentes na gasolina foram utilizados para selecionar a microflora
especializada de várias amostras e foi constatado que o monitoramento de CO
2
é um método
bastante eficaz para selecionar o isolamento de populações degradantes de produtos
recalcitrantes.
29
Loehr et al. (2001) fizeram uma revisão sobre a emissão de compostos orgânicos voláteis
(VOCs) e semi-VOCs (SVOCs) em processos de biorremediação através de estudos de casos.
Sua avaliação focou como SVOCs de interesse hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(PAHs), policlorados bifenis (PCBs) e pentaclorofenóis (PCP) e VOCs de interesse os BTEX.
A proposta do trabalho foi documentar a extensão dos VOCs e SVOCs como parte dos
processos de biorremediação. Tais informações são necessárias para identificar o quanto a
volatilização contribui para as perdas de carbono orgânico e a magnitude das emissões
gasosas. A volatilização, sorção e biodegradação podem simultaneamente afetar os compostos
químicos. Um aumento da biorremediação ou adsorção diminui a volatilização porque há
menos químicos para volatilizar. Portanto, fatores como a quantidade de químicos, as taxas de
atividade microbiana, a volatilização por si só e a maneira de operação dos processos podem
afetar as perdas dos VOCs e SVOCs.
2.1.8 Mineralização dos Hidrocarbonetos de Petróleo
Conforme Frankenberger (1992), Alexander (1994) e Maier et al. (2000), a completa
destruição dos contaminantes ocorre quando os hidrocarbonetos são mineralizados em CO
2
como produto final da biorremediação. De acordo com os autores, a monitorização deste
processo deve ser padronizada em todos os estudos para que se possam determinar os teores
ótimos de agentes bioestimulantes adicionados aos solos. A detecção do CO
2
é muito mais
sensível do que a monitorização do desaparecimento dos hidrocarbonetos de petróleo total
(TPH) sob a adição de nutrientes. Da mesma forma, a depleção de substratos específicos não é
um bom parâmetro para se monitorar a biodegradação, uma vez que produtos intermediários
tóxicos podem ser formados. Geralmente a degradação inicia após 2 a 4 dias de um período de
estabilização, atingindo taxas ideais dentro de uma a duas semanas do início da incubação
(Frankenberger, 1992).
Conforme Frankenberger (1992), agentes emulsificantes microbianos incluem ácidos
orgânicos e cadeias longas de ácidos graxos que aumentam a interface para a utilização
microbiana de frações minerais solúveis e insolúveis de componentes dos óleos. O autor
discute a extrema importância do papel da emulsificação no aumento da interface óleo-água,
favorecendo a degradação microbiana. Relata também que os óleos pesados são mais difíceis
30
de serem atacados à medida que a viscosidade e o peso molecular aumentam. Os óleos mais
viscosos são difíceis de se dispersar em meio líquido e têm menos superfície exposta para o
crescimento microbiano.
Dobson e Wilson (1964) mostraram que solos tratados com hidrocarbonetos apresentavam
taxas de respiração maiores que os solos não tratados (controles). A comparação permite
refletir sobre o grau de contaminação e taxas de biodegradação na presença de
hidrocarbonetos. Geralmente uma prévia exposição aos hidrocarbonetos resulta em maiores
taxas de degradação. Rowell (1975) mostrou que as taxas de mineralização no solo aumentam
progressivamente com o aumento das taxas de óleos aplicados, apesar de não ter apresentado
um valor máximo alcançado. Seus estudos indicaram que a decomposição de óleo ocorre até
mesmo em concentrações que aparentemente saturam o solo. Stone et al. (1940) mostraram
que após 2 ou 3 transferências de culturas bacterianas expostas ao óleo, os procedimentos de
biodegradação ocorriam mais rapidamente e o período de incubação era diminuído
apreciavelmente, com emulsificação completa em 3 a 5 dias em temperatura ambiente.
Entretanto, cultivos contínuos em placas com nutrientes diminuem a habilidade destas
culturas em atacar os hidrocarbonetos, indicando que muitas das biotransformações são
mediadas por plasmídeos.
Deeb e Alvarez-Cohen (2000) mostraram que apesar dos isolados utilizados na sua pesquisa
serem capazes de biotransformar o o-xileno, eles não conseguiram mineralizar o composto em
CO
2
. Entretanto, os autores não conseguiram identificar o quanto a presença de etil-benzeno
em uma mistura de compostos aromáticos afeta o potencial de mineralização. Evidenciaram
que, em relação a este potencial, as misturas de culturas são mais efetivas que as culturas
puras na mineralização de BTEX. Aparentemente as interações interespécies são necessárias
para a completa biodegradação de múltiplos compostos nas misturas de hidrocarbonetos. O
MTBE contido nas misturas não foi degradado por nehuma das culturas para qualquer que
fosse sua concentração, que por sua vez não apresenta efeito inibidor nas taxas de
transformação de BTEX até um nível de 200mg/L.
31
2.1.9
Propriedades Físico-Químicas dos Solos Contaminados e Parâmetros
Ambientais
A biorremediação é dependente de uma série de fatores ambientais que incluem a aeração, pH,
umidade, temperatura e concentração de nutrientes. A presença de oxigênio é essencial para
uma biodegradação efetiva dos óleos. A decomposição anaeróbia de hidrocarbonetos de
petróleo conduz a taxas de degradação extremamente baixas (Figura 2.9) (Frankenberger,
1992; Alexander, 1994; Paul e Clark, 1996; Tedesco et al., 1999; Maier et al., 2000).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
3
6
13
20
Tempo (Dias)
Evolução de CO
2
(mg.kg
-1
)
Somente Umidade
100 ppm Uréia-N
Somente Umidade
100 ppm Uréia-N
Aerado
Não Aerado
Figura 2.9: Mineralização do diesel em ambiente aeróbio e anaeróbio (Frankenberger, 1992)
Conforme Frankenberger (1992), um solo ideal para ser biorremediado adequadamente deve
possuir textura arenosa com alta porosidade que permita uma diluição de oxigênio. Esta alta
porosidade permitiria a aeração para a oxidação dos hidrocarbonetos, necessitando ainda silte
e argila na matriz de solo para manter a umidade. O pH deve ser mantido em torno do neutro e
geralmente os solos necessitam fertilizantes como nitrogênio e fósforo para promover uma
adequada degradação de hidrocarbonetos de petróleo. O autor discute não haver necessidade
de suplementação de nitrogênio em solos que contenham mais de 50mg/kg de nitrogênio
orgânico (NH
4
-N + NO
3
-N) ao menos que o solo esteja severamente contaminado. E as
32
quantidades de fósforo necessárias para mineralizar os hidrocarbonetos de petróleo são bem
menores que as de nitrogênio.
Loynachan (1978) mostrou que amostras perturbadas de solos aumentam a utilização de
hidrocarbonetos devido ao aumento da área de contato para difusão de oxigênio. O conteúdo
de oxigênio no subsolo pode ser aumentado através da adição de peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
). Na presença de catalase, o peróxido se transforma e água e O
2
, tendo sido utilizado
como agente bioestimulante para biorremediação in situ (Frankenberger, 1992).
Dibble e Bartha (1979) realizaram um estudo em laboratório com a intensão de avaliar e
otimizar os parâmetros de “land farming”. A biodegradação de uma lama oleosa foi
monitorada através da evolução de CO
2
e análises periódicas de hidrocarbonetos residuais. Os
parâmetros estudados no solo foram a umidade, pH, nutrientes minerais, micronutrientes,
suplementos orgânicos, taxas de tratamento e freqüência e temperatura. A biodegradação da
lama oleosa foi ótima para uma capacidade de campo de 30 a 90%, pH de 7,5 a 7,8, C:N e C:P
de 60:1 e 800:1, respectivamente, e temperatura de 20ºC ou maior. Micronutrientes e
suplementos orgânicos não trouxeram benefícios. Além disso, aplicações pequenas e
freqüentes de hidrocarbonetos resultaram em melhores taxas de biodegradação quando
comparadas a grandes aplicações.
A faixa de pH ideal para promover a biodegradação de óleos em solos está entre o neutro para
levemente alcalino. A maioria dos estudos indica que o pH ótimo para degradação de
hidrocarbonetos de petróleo está entre 7 e 8, e mostra que valores de pH acima de 9,5 inibem a
degradação (Frankenberger, 1992). De acordo com o autor, solos ácidos podem ser tratados
com CaCO
3
para incrementar a atividade biológica. O uso de Na
2
CO
3
deve ser evitado porque
é um forte alcalinizante, além de ser muito expansivo. O presente trabalho avaliou um
processo de biorremediação em um solo ácido (Arenito Botucatu) sem qualquer correção de
pH a fim de se verificar uma condição natural de biorremediação.
Frankenberger (1992) e Alexander (1994) mostram que a umidade do solo contaminado afeta
a biodegradação de óleos devido à dissolução de compostos residuais, ação dispersiva e a
necessidade da microbiota de manter uma alta atividade de metabolismo. A umidade
excessiva limita o suplemento de oxigênio gasoso, sendo que a maioria dos estudos indica que
a umidade ótima encontra-se entre 50 e 80% da capacidade de campo. Os autores sugerem
33
precauções quanto aos solos saturados no que tange a processos de lixiviação dos
hidrocarbonetos residuais ou fertilizantes nitrogenados solúveis em água. Os extremos de
umidade (ou formação de biofilmes) e dissecamento do solo reduzem a eficácia da
biorremediação. Conforme Frankenberger (1992), a umidade do solo deve ser mantida através
de reaplicações de água a intervalos regulares.
A aplicação de nutrientes promove a atividade de bioemulsificantes pelos microrganismos,
criando compostos intermediários solúveis em água capazes de migrar a maiores
profundidades no solo (Verstraete et al., 1976). Entretanto, a maioria dos hidrocarbonos é
hidrofóbica na natureza e absorvem à matéria orgânica, não sendo livremente transportados
pelo solo (Frankenberger, 1992). Na presente pesquisa fez-se um estudo da migração de
contaminantes sem se considerar a presença de nutrientes, e o solo utilizado apresenta pouca
matéria orgânica. Hillel (1989) mostrou que a migração de hidrocarbonetos é dependente da
textura do solo (permeabilidade, difusão e dispersão hidrodinâmica), uniformidade e
configuração das camadas, umidade e viscosidade dos fluídos de óleo.
Basicamente todas as transformações biológicas são afetadas pela temperatura
(Frankenberger, 1992; Alexander, 1994; Maier et al., 2000; Nelson e Cox, 2002). À medida
que a temperatura aumenta, aumenta a atividade biológica até um valor onde começa a ocorrer
desnaturação das enzimas. A temperatura ideal para a degradação de hidrocarbonetos varia de
18 a 30ºC, ocorrendo a taxas mínimas em 5ºC ou menos. Entretanto, os microrganismos se
adaptam a temperaturas extremas. Baixas temperaturas diminuem a volatilização e aumentam
a solubilidade dos hidrocarbonetos voláteis em água. Então, quando consideramos uma
operação de “
land-farming
”, devemos considerar a incidência solar e o local de disposição.
Estudos de laboratório devem ser conduzidos considerando a temperatura média de campo
(Frankenberger, 1992).
As taxas de C:N e C:P para se converter 100% dos hidrocarbonetos em biomassa microbiana é
10:1 e 100:1, respectivamente (Frankenberger, 1992; Selbach e Camargo, 2001). O nitrogênio
é a chave da produção de proteínas e ácidos nucleicos, enquanto o P é necessário na produção
de ATP para funções metabólicas, além de também constituir ácidos nucleicos, fosfolipídeos e
ácidos tecóicos. Os fertilizantes mais comuns utilizados em solos contaminados incluem
nitrato de amônia, sulfato de amônia e uréia. A uréia não é muito utilizada porque os óleos
refinados inibem a hidrólise da uréia a amônia e CO
2
.
34
Zhou e Crawford (1995) realizaram um estudo dos efeitos do oxigênio, nitrogênio e
temperatura na biodegradação de gasolina em um solo em micro e macro escala. Os
componentes voláteis foram medidos por cromatografia gasosa em um headspace sobre o solo
contaminado disposto em recipientes fechados. Os autores comentam que em um estudo de
biodegradação é difícil separar as perdas devido à volatilização das que ocorrem via
metabolismo microbiano. Foram realizadas também contagens de microrganismos em placas
ao longo do tempo de experimentos. Diferentes concentrações de oxigênio (5, 6, 8, 10, 12, 18,
50 e 90%) foram consideradas nos microcosmos. Após ser simulado o vazamento de gasolina
no solo, os hidrocarbonetos, a concentração de oxigênio e de CO
2
foram monitoradas via
cromatografia. O efeito da adição de nutrientes foi avaliado via diferentes concentrações de
vapores de amônia ou NH
4
NO
3
e K
2
HPO
4
.
Zhou e Crawford (1995) mostraram os efeitos da temperatura durante o processo de
biorremediação, simulando a temperatura do sub-solo do seu local de estudo (11ºC), 25ºC e a
maior temperatura da superfície encontrada no verão (37ºC). Os TPH iniciais eram de 1780
ppm e outros fatores eram constantes. Os valores de V
máx
e k
s
mostraram que as taxas de
degradação aumentaram com a temperatura. A temperatura afeta a natureza física e a
composição do petróleo, as taxas de metabolismo dos hidrocarbonetos e a composição das
populações microbianas. Altas temperaturas aumentam a evaporação dos alcanos de cadeia
curta e outros hidrocarbonetos de baixo peso molecular, geralmente causando toxicidade à
membrana dos microrganismos, além de diminuir a viscosidade e solubilidade dos
hidrocarbonetos na fase aquosa.
Zhou e Crawford (1995) observaram que maiores taxas de oxigênio não necessariamente
resultam em maiores taxas de biodegradação aeróbica pelos microrganismos, sendo para o
caso de estudo 10% a concentração ótima de oxigênio (a atmosfera tem 21%). Os autores
explicam o fato observando que a atividade da nitrogenase é maior em concentrações de O
2
abaixo do valor atmosférico, e há muitas bactérias aeróbicas fixadoras de nitrogênio no solo.
Radwan et al. (2000) realizaram um estudo para verificar a biorremediação de
hidrocarbonetos em solos desérticos através da utilização de fertilização do solo com uma
mistura de glicose e peptona. A magnitude da atenuação foi bastante elevada para ser
atribuída somente ao conteúdo de nitrogênio da peptona adicionada. A fertilização com KNO
3
contendo a mesma quantidade de nitrogênio da peptona mostrou uma melhora do efeito de
35
atenuação, mas menor em intensidade quando comparado ao composto de glicose e peptona.
A mistura acarreta em um grande aumento da população de microrganismos, mantendo seu
número alto até mesmo após a atenuação dos orgânicos.
Radwan et al. (2000) avaliaram a possibilidade de utilizar a água do mar na biorremediação de
hidrocarbonetos no deserto por questões de custo, mas os resultados não foram satisfatórios,
sendo necessária água doce. Além disso, observaram que os degradadores de hidrocarbonos
respondem inicialmente à glicose e peptona e, após depletada a matéria orgânica adicionada, a
população microbiana metaboliza os hidrocarbonetos.
Trindade et al. (2002) relatam que para o solo estudado, a otimização da biodegradação
ocorreu quando o C:N:P foi ajustado em 100:1,25:1. É sabido que cada sistema apresenta sua
condição de C:N:P ótima, dependendo do tipo de contaminante, concentração,
biodisponibilidade, além da habilidade dos microrganismos na degradação do poluente. A
taxa 100:10:1 é extremamente utilizada na literatura, porém em algumas situações específicas,
o carbono do óleo não é completamente assimilado pela biomassa por ter compostos
recalcitrantes ou metabolizados parcialmente. Trindade et al. (2002) discutem que o
nitrogênio inorgânico pode ser melhor relacionado com a umidade do solo (N
H2O
) do que com
o nível de substrato C:N para suprir mais adequadamente este nutriente evitando inibição.
Uma superfertilização é dependente da umidade, que por sua vez pode reduzir a atividade dos
microrganismos degradadores, sensíveis ao potencial de água no solo. Solos com maiores
umidades podem diluir melhor o nitrogênio do que aqueles com baixa umidade. Deve-se
lembrar, entretanto, que uma maior umidade diminui as taxas de transferência de O
2
. Deste
novo conceito, a concentração ótima de N
H2O
é 2000 a 2500 mgN/kg de H
2
O. As taxas de C:N
de 100:1,25 e 100:5 utilizadas no trabalho de Trindade et al. (2003) resulta em valores de
5004 e 20015mgN/kg de H
2
O, respectivamente.
A textura do solo é um parâmetro extremamente importante no processo de biorremediação,
uma vez que mantém ou não umidade, e conseqüentemente aeração. A umidade ideal para
otimizar os processos parece estar na faixa de 50 a 80% da capacidade de campo. A
proliferação excessiva da microbiota promove a formação de biofilmes, que pode colmatar o
solo, diminuindo sua aeração. O pH ideal, conforme diversos autores, está em uma faixa ao
redor do neutro para levemente alcalino. Neste trabalho, buscou-se não alterar o pH do solo
para avaliar a biorremediação em condições naturais.
36
2.1.10 Formação de Agregados
Um solo pode ser composto de material solto e partículas instáveis ou consistir em um
material estruturado de partículas interligadas associadas em agregados, possuindo formas e
tamanhos regulares. O arranjo, ou organização das partículas no solo (configuração interna da
matriz de solo), é chamado de estrutura do solo. Burland (1990) definiu o termo “ estrutura” de
um solo natural como consistindo de duas partes: a malha que representa um arranjo espacial
de partículas de solo e contatos interpartícula e “ ligação” entre partículas, as quais podem ser
progressivamente destruídas durante carregamentos (deformações plásticas). Ambos a malha e
as ligações são fortemente afetados pelos processos de deposição, mudanças climáticas,
atividade biológica e manejos dos solos, e são vulneráveis a forças destrutivas de natureza
mecânica e fisico-químicas (Khonke, 1968; Hillel, 1998).
Os agrônomos usualmente estão interessados, pelo menos para as camadas superficiais, em
terem um solo solto e poroso e com boas condições de permeabilidade. Os engenheiros
geotécnicos, por outro lado, necessitam de um solo denso e rígido para prover a máxima
estabilidade e resistência ao cisalhamento e mínima permeabilidade. Ambos os casos
necessitam do conhecimento das relações que envolvem a estrutura do solo. Há dois tipos
principais de estabilidade: a capacidade do solo em reter sua estrutura sob ação da água e a
sua capacidade de secar retendo a estrutura sob ação de forças mecânicas externas como
forças de compactação (Khonke, 1968; Hillel, 1998). Na prática da engenharia geotécnica,
técnicas para melhorar as características do solo podem ser empregadas em diferentes tipos de
solo, e abrangem uma variedade de métodos, como reforço, cimetação, compactação e
remoção de água (Schnaid et al., 2001). O cimento Portland (material inorgânico) pode ser
utilizado para melhorar as propriedades dos solos e resulta do processo de trocas de íons e
floculação (Burland, 1989, 1990; Petley et al., 1993; Zhu et al., 1995; Cuccovillo e Coop,
1999). Dependendo da percentagem de cimento adicionado ao solo, um solo com baixa
densidade gradualmente se modifica para uma estrutura cimentada na qual suas propriedades
são função da mistura. Estas propriedades não se encaixam necessariamente em teorias
clássicas de mecânica do solo (Leroueil e Vaughan, 1990).
A agregação de solo é um importante aspecto que pode decorrer de processos de
biorremediação (Southam et al., 2001), sendo útil e importante sua consideração na
37
engenharia geotécnica, especialmente no estudo de taludes, barragens e estradas. A estrutura
característica de solos é frequentemente atribuída a “oxida ção” origina da pelas variações no
nível do lençol freático nos depósitos de argilas moles. Parte dos compostos de oxidação de
ferro nos solos é catabolizada pelos microrganismos em formação de biofilmes. Algumas
bactérias são conhecidas por fazerem a oxidação de Fe
2+
enzimaticamente, como as
Thiobacillus ferrooxidans
,
Leptospirillum ferrooxidans
,
Sulfolobus
sp.,
Acidianus
sp., e
Gallionella
sp. Todos os gêneros mencionados podem ser associados com a formação de
“cimentos” em depósitos de ferro (Paul and Clark, 1996).
Khonke (1968) e Hillel (1998) mostram que a atividade microbiana afeta a agregação do solo
e que se modifica conforme os microrganismos presentes, que podem incluir espécies de
protozoários, bactérias, fungos e actinomicetos. O autor discute a importância das bactérias da
rizosfera, que têm uma associação direta com as raízes de plantas, assim como os fungos, que
formam redes extensivas de adesão através de finos filamentos conhecidos por hifas. A
composição da microfauna e da microflora depende da temperatura e umidade, pH do solo e
seu potencial de oxidação e redução, nutrientes e tipos e quantidade de matéria orgânica
presente no solo (Alexander, 1977, 1994).
Os microrganismos do solo agregam partículas por meio de mecanismos complexos, como
adsorção, modificações físicas, cimentação e excreção de produtos mucilaginosos (Khonke,
1968; Hillel, 1998). Neste contexto são importantes diversos produtos microbianos capazes de
formar os agregados, como os polissacarídeos, hemiceluloses ou uronídeos e outros polímeros
naturais (Coleman e Crossley, 1996). Estes materiais são conectados às superficies de argilas
por meio de pontes de cátions, hidrogênio e forças de Van der Waals, e mecanismos de
adsorção de ânions. Os polissacarídeos, em particular, consistem em moléculas grandes,
lineares e flexíveis capazes de formar ligações múltiplas com diversas partículas de uma só
vez. Em alguns casos, os polímeros orgânicos localizam-se entre as partículas de argila e
formam uma cápsula ao redor dos agregados. Em outros casos, soluções de agentes orgânicos
ativos penetram nos agregados de solo e então formam cimentos insolúveis (apesar de ainda
serem biologicamente biodegradáveis)(Khonke, 1968; Hillel, 1998). Todo este conhecimento
foi empregado nesta Tese para demonstrar a agregação de partículas de solo em um
microcosmo contaminado por gasolina, fator importante que deve ser analisado em de
processos de biorremediação, conforme avalia Southam et al. (2001).
38
2.1.11 Percolação de Contaminantes
Zhou e Crawford (1995) apresentam na Figura 2.10 o desaparecimento dos TPH pela
degradação microbiana a 25ºC em amostras retiradas de diferentes profundidades, com
conseqüentes tipos de formação de solo diferentes (argila e combinações com silte e
cascalho). Foi colocada a mesma concentração inicial de TPH e mantidas outras variáveis
constantes, conforme os autores. Zhou e Crawford (1995) observaram que as taxas de
degradação dos TPH foram diretamente proporcionais à população microbiana existente no
solo, como já visto no item 2.1.6. Os autores consideram que outros fatores como
profundidade e tamanho de partículas não influenciam as taxas de biodegradação de forma tão
óbvia. Entretanto, isso não é verdade, uma vez que os solos são, para efeitos práticos,
diferentes, consistindo em um erro metodológico dos autores. O trabalho, apesar deste fato,
apresenta uma importante contribuição.
0
10
20
30
40
50
60
70
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90
100
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Tempo (Dias)
Desaparecimento de TPH (% concentração inicial)
S1
S2
S3
S4
Figura 2.10: Desaparecimento do TPH em diferentes profundidades (Zhou e Crawford, 1995)
Corseuil e Alvarez (1996) discutem que progressos significativos foram feitos no
entendimento da hidrogeoquímica e fatores microbiológicos que influenciam na
biorremediação natural de aqüíferos contaminados nos EUA e na Europa, mas que, entretanto,
esta experiência deve ser extrapolada com cuidado para áreas contaminadas no Brasil, onde a
39
gasolina contém aproximadamente 22% de etanol. Conforme os autores, os hidrocarbonetos
encontram-se em um estado reduzido, e sua oxidação pode ser feita termodinamicamente. Os
microrganismos podem mediar a oxidação utilizando aceptores de elétrons durante seus
processos de respiração. A utilização preferencial observada reflete um potencial decrescente
de oxidação e aceptores de elétrons: oxigênio, nitrato, Fe
3+
, sulfato e dióxido de carbono. A
cinética da oxidação é mais rápida para os aceptores de elétrons de maior potencial de
oxidação. A presença de etanol na gasolina brasileira representa um adicional significativo da
demanda de oxigênio, diminuindo a degradação aeróbia dos BTX em aqüíferos com limitação
de oxigênio (Figura 2.11).
EPA (1996) mostra que após um episódio de vazamento de um tanque de armazenamento
subterrâneo, os hidrocarbonetos se infiltram no solo e interagem com o mesmo, manifestando-
se de diversas formas (Figura 2.12). Os compostos hidrocarbonetos de petróleo podem se
particionar em cinco fases em subsuperfície: a) vapor (no gás do solo); b) residual (retido por
ação da capilaridade); c) adsorvido (na superfície das partículas sólidas, incluindo matéria
orgânica); d) dissolvido (na água); e) fase livre (hidrocarboneto líquido, móvel).
0
5
10
15
20
25
0
10
20
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50
60
70
80
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100
Tempo (Dias)
Concentração de Benzeno Aquoso (mg.L
-1
)
0 mg etanol/L
20 mg etanol/L
300 mg etanol/L
Figura 2.11: Efeito da concentração de etanol na degradação aeróbica de benzeno em um
microcosmo de aqüífero (Corseuil e Alvarez, 1996)
40
A massa de hidrocarbonetos das fases residual e livre irão se volatilizar e solubilizar
parcialmente, para se tornar componentes do vapor do solo e da água subterrânea (EPA,
1996). Quanto aos hidrocarbonetos da fase vapor, estes são muito mais móveis e podem
migrar a grandes distâncias ao longo do fluxo preferencial, como em fraturas, juntas, camadas
de areia e linhas de utilidades subterrâneas. A proporção em que a massa inicial de
contaminante se distribui nestas diversas fases pode ser estimada a partir do mapeamento das
plumas de fase livre e dissolvida, da concentração do contaminante no solo e no vapor do
solo. Deve-se atentar para o fato de que a retenção capilar consegue manter na forma imóvel
quantidades significativas de hidrocarbonetos puros, que agem como fonte permanente de
contaminação do aqüífero e como fonte de vapores para a superfície (EPA, 1996).
EPA (1996) relata que após o vazamento, os hidrocarbonetos tendem a migrar
descendentemente sob influência das forças gravitacionais e capilares. Enquanto a fonte de
vazamento continuar fornecendo produto, o solo vai se tornando mais saturado de
hidrocarbonetos e o centro de massa da pluma vai migrando descendentemente, deixando uma
fase residual de hidrocarbonetos imóveis no solo ao lado a acima da frente de avanço da
pluma. Se o volume de hidrocarbonetos vazados é pequeno em relação à capacidade de
retenção do solo, os hidrocarbonetos tenderão a ficar retidos por capilaridade no solo e a
massa total de contaminante ficará imobilizada. Para haver acúmulo de fase livre sobre o nível
d’água, o volume vazado deve ser suficiente para exceder a capacidade de retenção do solo
entre o ponto de vazamento e o nível d’água.
Na Figura 2.13 está representada a progressão do hidrocarboneto vazado de um tanque de
armazenamento subterrâneo. A Figura 2.13A ilustra a massa de hidrocarbonetos antes de
atingir a franja capilar. Se a fonte de produto cessasse neste momento, provavelmente não
haveria fase livre. A Figura 2.13B ilustra o que ocorreria se o vazamento continuasse e o
volume vazado fosse suficiente para iniciar o acúmulo de fase livre e o deslocamento da franja
capilar. O produto livre começa a deslocar a franja capilar e alguns dos seus compostos
solúveis dissolvem-se na água subterrânea. A Figura 2.13C ilustra o momento em que a fonte
cessa. Os resíduos de hidrocarbonetos permanecem no solo abaixo do tanque. A pluma de fase
livre se espalha lateralmente e uma pluma de contaminante dissolvido migra no sentido do
fluxo subterrâneo (EPA, 1996).
41
Figura 2.12: Distribuição vertical das fases dos hidrocarbonetos (EPA, 1996)
42
Figura 2.13: Progressão do hidrocarboneto vazado de um tanque de armazenamento
subterrâneo (EPA, 1996)
Corseuil et al. (1998) investigaram os efeitos do etanol na degradação de compostos BTX sob
condições de aceptores de elétrons comumente encontradas nos projetos de biorremediação
em microcosmos de aqüíferos. Os microcosmos foram feitos com material arenoso
proveniente de um aqüífero contendo pouca matéria orgânica (0,2%) e sabidamente nunca
expostos anteriormente aos BTX. A água subterrânea foi coletada do mesmo local. Controles
43
e testes com nutrientes também foram executados. Além disso, foram recriadas situações
anaeróbicas no mesmo experimento. Os resultados mostraram que o etanol é
preferencialmente utilizado sobre os compostos de BTX e há um período sem degradação dos
compostos enquanto o etanol é degradado. Conforme os autores, a preferência pelo etanol
sobre os BTX mostra que o álcool é um substrato facilmente degradado que pode ser oxidado
pelas enzimas constituintes da microbiota através de vias metabólicas centrais. Os efeitos de
degradação do etanol anteriormente aos BTX também foi observado no meio aeróbio nos
tratamentos com a adição de nutrientes. Uma vez que a gasolina brasileira possui grande parte
de etanol, existe a possibilidade que nas águas subterrâneas impactadas por vazamentos, etc, o
oxigênio disponível seja rapidamente consumido antes que a degradação dos BTX inicie. Esta
observação é particularmente importante para o benzeno, o mais tóxico dos BTX e que se
degrada muito lentamente em condições anaeróbias. O fato sugere que o benzeno possa
migrar sem bioatenuação até que o etanol seja biodegradado.
Corseuil et al. (1998) observaram que o tolueno foi degradado sob todas as condições de
aceptores de elétrons testados, com taxas de degradação aumentando conforme o potencial de
oxidação (aeróbio > desnitrificadores > redutores de ferro > redutores de sulfato >
metanogênicos). O benzeno somente foi degradado em microcosmos aeróbicos, sendo
recalcitrante para as demais condições estudadas durante um período de 99 dias de incubação.
Solano-Serena et al. (2000) relatam que a persistência da gasolina em um solo contaminado
depende da migração dos contaminantes e dos processos de biorremediação. Cordazzo et al.
(2000) realizaram um estudo numérico bidimensional para o escoamento de gasolina
acrescida de álcool no solo para a região saturada em volumes finitos com um modelo de
biodegradação de primeira ordem. Foi, portanto, considerado o efeito do etanol na
biodegradação dos constituintes da gasolina, fenômenos de co-solvência e retardo da pluma.
Também foi resolvido numericamente o campo de velocidades da água subterrânea através
das equações de Darcy, que permitiram o modelamento de escoamentos mais complexos,
envolvendo bombeamentos e sucções no solo. Cordazzo et al. (2000) verificaram que há
preferencialmente a degradação do etanol por parte dos microrganismos, retardando a
degradação dos compostos de BTEX.
Deeb e Alvarez-Cohen (2000) avaliaram o impacto das inerações do substrato nas taxas de
biotransformação e potenciais de mineralização de monoaromáticos e metil terc-butil éter
44
(MTBE) que geralmente são encontrados em plumas de contaminação de lençóis freáticos. Os
hidrocarbonetos de petróleo são contaminantes comuns dos lençóis freáticos, sendo de
particular interesse os aromáticos e oxigenados da gasolina, primariamente o benzeno,
tolueno, etil-benzeno, xilenos e MTBE. Deeb e Alvarez-Cohen (2000) utilizaram um
consórcio de dois isolados microbianos de um aqüífero contaminado por gasolina,
controlando as perdas abióticas de volatilização através de solos controle estéreis contendo
BTEX marcados com material radioativo. Os autores tentaram identificar as interações de
substrato nas misturas de BTEX quanto a aspectos positivos (cometabolismo) e negativos
(inibição). Observaram que a presença de etil-benzeno tem um efeito inibitório nas
transformações de benzeno, tolueno e xilenos e, por outro lado, notaram que a presença de
outros componentes em misturas binárias com o etil-benzeno possuem um efeito negativo
sobre este composto. Deeb e Alvarez-Cohen (2000) mostram ainda que as vias de
biodegradação obtidas através de culturas puras confirmaram que o tolueno e o etil-benzeno
são degradados pela mesma via metabólica.
Powers et al. (2001) fizeram uma revisão do transporte de etanol e BTEX na subsuperfície
após um derrame de gasolina contendo o álcool. O etanol aumenta a concentração aquosa dos
BTEX devido a um efeito de co-solvência, e pode inibir a biodegradação dos compostos
consumindo preferencialmente os aceptores de elétrons e os nutrientes. O etanol pode
aumentar o espraiamento das plumas de BTEX. Os autores também afirmam que o efeito do
etanol na atenuação natural dos BTEX é sistema-específico e depende da capacidade de
assimilação dos aqüíferos.
Considerando as políticas de incentivo para a expansão do uso de etanol como combustível e
seu uso junto à gasolina tanto nos EUA como no Brasil, Powers et al. (2001) acreditam que o
álcool será encontrado mais freqüentemente nas plumas do lençol freático contendo BTEX.
Os autores consideram que um maior estudo dos efeitos do etanol e do transporte dos
compostos de BTEX é necessário para se determinar se os benefícios econômicos e
ambientais da adição de etanol à gasolina trarão efeitos negativos na qualidade dos lençóis
freáticos e no meio ambiente em geral. Devemos, entretanto, avaliar também a possibilidade
de combate aos vazamentos e a prevenção de futuros derrames utilizando toda a tecnologia
disponível. A gasolina brasileira contém aproximadamente 22-24% de etanol (Cunha e Leite,
2000; Cordazzo et al., 2000; Powers et al., 2001).
45
Conforme já visto anteriormente, a presença de químicos oxigenados tem um impacto na
migração da gasolina na subsuperfície após um vazamento ou derrame, e conseqüentemente
na saúde pública. Powers et al. (2001) relatam que há numerosos processos que afetam a
concentração de contaminantes nos aqüíferos, que incluem a infiltração da gasolina pela zona
não-saturada, espalhando-se pelo nível d’água, com dissolução de compostos mais solúveis da
gasolina para a água, sendo estes químicos transportados com o lençol freático até sua
adsorção e biorremediação (Figura 2.14). A Figura 2.14 é uma modificação da Figura 2.13
(EPA, 1996).
Figura 2.14: Processos gerais que governam a gasolina na subsuperfície (modificado de
Powers et al., 2001)
A adição de etanol a gasolina afeta uma relação de equilíbrio ideal por efeitos de co-solvência,
causados pela presença de altas concentrações de compostos orgânicos, como os álcoois, na
fase aquosa. Estes co-solventes reduzem a polaridade da fase aquosa, ocasionando uma
redução do coeficiente de atividade da fase aquosa e permitindo uma maior concentração de
compostos orgânicos hidrofóbicos na fase aquosa (Powers et al., 2001). Corseuil e Fernandes
(1999) mostraram que até mesmo pequenas concentrações de etanol na fase aquosa aumentam
a solubilidade dos BTEX. Uma concentração de etanol aquoso de 10% aumenta a
concentração de BTEX dissolvido em 30%.
46
Powers et al. (2001) discutem que os transportes de massa no lençol freático são controlados
por processos de advecção e dispersão hidrodinâmica. A advecção é o principal meio de
transporte de hidrocarbonetos na direção do fluxo de velocidades, enquanto a dispersão
hidrodinâmica é responsável pelo transporte em outras direções.
De acordo com os químicos e condições de redox nos aqüíferos, o etanol pode estimular
processos microbiológicos que afetam as propriedades hidrodinâmicas dos aqüíferos. A
formação de agregados de células e biofilmes reduzem a porosidade e se torna um importante
mecanismo de colmatação. Microrganismos podem também afetar a permeabilidade dos
aqüíferos contribuindo na dissolução mineral (CaCO
3
) ou precipitação (FeS). A combinação
do crescimento microbiano com a precipitação mineral pode resultar em uma significante
redução da porosidade e permeabilidade ao longo do tempo (Powers et al., 2001).
2.1.12 Considerações Finais de Biorremediação
Conforme Frankenberger (1992), um estudo ideal de solos contaminados deve incluir
investigações das propriedades físicas e químicas do solo contaminado, dinâmica da
população microbiana, metais pesados, depleção de TPH, BTEX ou outro parâmetro
específico, e mineralização de hidrocarbonetos. As propriedades físico-químicas devem ser
caracterizadas em termos de pH, nitrogênio inorgânico, fósforo inorgânico e análise de
agregação de particulas. Os microrganismos devem ser enumerados em relação ao total da
população e degradadores específicos. Metais pesados devem ser considerados, pois inibem a
biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo. A quantidade de CO
2
pode fornecer um índice
confiável da degradação do petróleo. Tratamentos que considerem estudos em microcosmos
devem incluir controles estéreis e não estéreis e aplicações de nutrientes. A melhor relação
C:N:P deve ser estabelecida. Por fim, pode-se considerar um estudo de voláteis e TPH ou
hidrocarbonetos específicos, através de técnicas cromatográficas. A presente Tese abrange
todos estes itens e ainda efeitos de permeabilidade e agregação de partículas, e toxicidade e
lesão celular causadas durante um procedimento de biorremediação de gasolina.
47
2.2 TOXICIDADE E LESÃO CELULAR CAUSADAS POR
HIDROCARBONETOS
2.2.1 Introdução
A gasolina e o querosene, dois destilados do petróleo preparados pelo fracionamento do óleo
cru, contém hidrocarbonetos alifáticos, aromáticos e vários outros hidrocarbonetos com
cadeias ramificadas e insaturadas. Esses compostos são usados como combustíveis para
iluminação, aquecimento e motores; veículos para alguns pesticidas; agentes de limpeza e
solventes para tintas. Como geralmente são armazenados em garrafas que foram usadas para
embalar bebidas, a gasolina e o querosene são causas comuns de intoxicações acidentais em
crianças. Uma preocupação associada à exposição crônica à gasolina é que ela contém cerca
de 2% de benzeno e, por essa razão, pode causar leucemia (Klaassen, 2003).
As intoxicações causadas pela ingestão de gasolina e querosene são semelhantes às
provocadas pelo álcool etílico (Klaassen, 2003). Os sinais e sintomas incluem incoordenação,
agitação, excitação, confusão, desorientação, ataxia, delírio e finalmente coma, que pode
estender-se por algumas horas ou vários dias. A inalação de concentrações altas dos vapores
da gasolina como, por exemplo, por trabalhadores que limpam tanques de armazenamento
(Takamiya et al., 2003), pode causar morte imediata ou em algumas horas. Os vapores da
gasolina sensibilizam o miocárdio, de forma que quantidades pequenas de epinefrina
circulante podem desencadear fibrilação ventricular (muitos hidrocarbonetos exercem essa
ação). Concentrações altas do vapor de gasolina também podem causar depressão rápida do
SNC e óbito devido à insuficiência respiratória. Com a inalação de concentrações altas por
algumas horas, o paciente pode desenvolver pneumonite (Klaassen, 2003).
As intoxicações causadas por hidrocarbonetos resultam da inalação dos vapores ou ingestão
das preparações líquidas. A ingestão é mais perigosa porque os líquidos têm tensão superficial
baixa é podem ser facilmente aspirados para o trato respiratório junto com os vômitos ou a
eructação. A morbidade é atribuída à aspiração, que ocorre durante a ingestão ou por ocasião
do tratamento. A lesão pulmonar não é causada pela absorção gastrintestinal da gasolina ou do
querosene. A pneumonite química, complicada por pneumonia bacteriana e edema pulmonar
secundários, é a seqüela mais grave da aspiração. O óbito causado pelo edema pulmonar
48
hemorrágico geralmente ocorre em 16 a 18h e raramente além de 24h depois da aspiração
(Klaassen, 2003; Kumar et al., 2005).
O exame dos tecidos dos pacientes que evoluíram ao óbito demonstra pulmões pesados,
edemaciados e hemorrágicos. Os alvéolos estão preenchidos por um exsudato rico em
proteínas, células e fibrina, geralmente com um padrão semelhante ao da doença da membrana
hialina. As paredes alveolares estão espessadas e podem romper-se, causando seqüelas menos
comuns como enfisema e pneumotórax. Os linfonodos pulmonares estão inflamados e, em
alguns casos, foram encontradas broncopneumonia e atelectasia (Klaassen, 2003; Kumar et
al., 2005).
As medidas sintomáticas e de sustentação provavelmente são o melhor tratamento para as
intoxicações por gasolina ou querosene (Ervin, 1983; Gosselin et al., 1984). Tendo em vista o
risco de aspiração, os vômitos ou a lavagem gástrica devem ser evitados, a menos que os
riscos estejam justificados pela presença de outras substâncias tóxicas no destilado do
petróleo. A catarse pode ser induzida com sulfato de magnésio ou sódio. Antibióticos são
usados se houver indicação específica, como por exemplo pneumonite bacteriana. A
epinefrina e compostos relacionados devem ser evitados porque podem provocar arritmias
cardíacas. O tratamento deve incluir a correção dos distúrbios hidreletrolíticos (Klaassen,
2003; Kumar et al., 2005).
O benzeno é um solvente excelente, sendo um composto amplamente usado nas sínteses
químicas e componente natural dos combustíveis para automóveis. Entretanto, o benzeno tem
causado efeitos tóxicos graves nos seres humanos expostos a concentrações altas. Depois da
exposição aguda a uma grande quantidade de benzeno, por ingestão ou inalação dos vapores
concentrados, o efeito tóxico principal ocorre no SNC (White e Proctor, 1997; Feldman et al.,
1999; Cairney et al., 2002). Os sintomas causados pela exposição branda são tonturas,
fraqueza, euforia, cefaléia, náuseas, vômitos, sensação de constrição torácica e marcha
cambaleante. Se a exposição for mais grave, os sintomas progridem para visão embaçada,
tremores, respiração superficial e rápida, irregularidades ventriculares, paralisia e
inconsciência (Klaassen, 2003; Kumar et al., 2005).
Em geral, a exposição prolongada ao benzeno se deve à inalação do vapor ou ao contato com
a pele. Os sinais e sintomas da exposição prolongada ao benzeno incluem efeitos no SNC e no
49
trato gastrintestinal (cefaléia, perda do apetite, sonolência, nervosismo e palidez), mas a
manifestação tóxica principal é a anemia aplásica. As células da medula óssea que se
encontram nas fases iniciais do desenvolvimento são as mais sensíveis ao benzeno (Andrews
e Snyder, 1991) e a parada da maturação acarreta depleção gradativa das células circulantes.
Uma preocupação importante é a relação entre exposição prolongada ao benzeno e leucemia
(Rinsky et al., 1987; Mehlman, 1991). Os estudos epidemiológicos foram realizados com
trabalhadores da indústria de pneumáticos e fábricas de sapatos, nas quais o benzeno é
amplamente usado. Entre os trabalhadores que morreram devido à exposição ao benzeno, os
óbitos foram causados por leucemia ou anemia aplásica, em percentagens praticamente iguais.
O benzeno é classificado pela EPA e IARC como carcinógeno humano. Esse composto é
metabolizado a uma série de produtos fenólicos com anéis fechados e seus conjugados
(Snyder et al., 1993). A anemia aplásica e a leucemia provavelmente não se devem a um
desses metabólitos, mas envolvem a ação conjunta de vários metabólitos (Snyder et al.,
1993).
No processo de produção desses metabólitos, são formados intermediários reativos que se
ligam covalentemente com várias proteínas e DNA e podem ser responsáveis pelos efeitos
tóxicos do benzeno na medula óssea (Kalf et al., 1987).
O tolueno é muito usado como solvente de tintas, vernizes, colas, esmaltes e produtos e como
intermediário químico das sínteses de outros compostos orgânicos. O tolueno é depressor do
SNC e concentrações baixas causam fadiga, fraqueza e confusão, podendo levar a arritmias
ventriculares, inibição do reflexo vagal, depressão respiratória e anoxia. A intoxicação crônica
também envolve o rim e o fígado (Raikhlin-Eisenkraft et al., 2001). É pelos efeitos dos
solventes como o tolueno no SNC que os "cheiradores de cola" inalam seus vapores. Ao
contrário do benzeno, o tolueno não causa anemia aplásica ou leucemia. Contudo, os
solventes da cola costumam ser misturados e os "cheiradores" geralmente são expostos a
outros solventes além do tolueno (Klaassen, 2003).
A presente pesquisa, como já enfatizado, buscou analisar e verificar o que ocorre com uma
população que habite ao redor de um processo de biorremediação de gasolina. A literatura é
vasta no que se refere a trabalhadores de fábricas de tintas, gráficas e postos de combustível
em relação à concentração e metabolização de compostos BTEX, PAHs, PCBs, PCPs, suas
rotas bioquímicas e acidentes com estes produtos envolvendo seres vivos (Wong e Raabe,
1997; Powley e Carlson, 1999; Jo e Song, 2001; Senzolo et al., 2001; Takamiya et al., 2003),
50
além de alterações neurológicas (White e Proctor, 1997; Feldman et al., 1999; Cairney et al.,
2002). Entretanto, poucos trabalhos avaliaram histologia, hematologia, funções hepáticas e
outras atividades enzimáticas (Caldwell, 1997; Gagnon e Holdway, 1999; Pacheco e Santos,
2001; Khan et al., 2001), genéticas (Andreoli et al., 1997; Pitarque et al., 1999; Ansari-Lari et
al., 2003; Celik e Akbas, 2005) e reprodutivas (McKee et al., 2000; Roberts et al., 2001),
endócrinas (Pacheco e Santos, 2001) ou o sistema urinário e cardio-respiratório (Khan et al.,
2001; Long et al., 2003) como um todo. Nenhum trabalho avaliou de forma clara todo este
conjunto em um modelo único, e nunca foi avaliado o que ocorre com uma população ao
redor de um processo de biorremediação.
2.2.2 Exposição Ambiental e Alterações Fisiológicas e Bioquímicas Causadas
pelos Hidrocarbonetos Presentes na Gasolina
Massad et al. (1985) realizaram uma investigação comparativa da exposição inalatória à
exaustão de motores a gasolina e etanol. Ratos Wistar foram introduzidos em câmaras de
inalação e expostos a várias concentrações de monóxido de carbono, gasolina e etanol no ar.
Os ensaios mostraram que a concentração letal para 50% da amostra em 3h era maior para a
gasolina do que para o etanol. Os autores observaram que a gasolina contém outras
substâncias nocivas além do CO, sendo as responsáveis pela maior toxicidade.
Mehlman (1991) realizou um estudo epidemiológico com seres humanos e demonstrou um
importante aumento de câncer em diversos órgãos como resultado à exposição de gasolina e
seus componentes. Na análise dos componentes constituintes da gasolina, o autor estabeleceu
relações inequívocas entre o benzeno e o 1,3-butadieno e o surgimento de câncer. Corseuil e
Alvarez (1996) relatam que todos os compostos BTEX são poderosos depressores do sistema
nervoso central (SNC), sendo que o benzeno, ainda, pode causar leucemia nos seres humanos.
Caldwell (1997) discute que o benzeno é considerado tóxico para os mamíferos, mas somente
em altas dosagens (100mg/L) e por longos períodos de exposição.
Laitinen et al. (1994) avaliaram a exposição de mecânicos a vapores de gasolina durante
ajustes de sistemas de injeção, carburadores e outros reparos no seu ambiente de trabalho. Os
autores observaram que o contato direto na pele com a gasolina ocorre seguidamente e é
51
significante, uma vez que a maioria destes trabalhadores não utiliza luvas protetoras, sendo
que há penetração da gasolina pela pele – rota principal da exposição (cerca de 80%). Periago
e Prado realizaram um estudo semelhante com atendentes de postos de combustível,
observando uma relação significativa entre o volume de gasolina vendido e a concentração de
BTX no ambiente, vista através de dosímetros 3M-3500 colocados nos frentistas.
Hakkola e Saarinen (1996) mediram a exposição de motoristas de caminhão tanque à gasolina
e alguns de seus compostos durante o seu dia de trabalho, principalmente no carregamento e o
descarregamento do caminhão, fato que ocorria em torno de quatro vezes ao dia. A
concentração de benzeno encontrada foi de 1,1 a 18 mg/m
3
, e a exposição durante os
percursos foi considerada insignificante.
Wang e Raabe (1997) avaliaram os riscos de desenvolver um mieloma múltiplo à exposição
de benzeno em uma meta-análise com 250.000 trabalhadores envolvidos com petróleo. O
mieloma múltiplo, ou mielomatose, é uma proliferação maligna de células da medula óssea. A
análise indicou que os trabalhadores do petróleo não estão em risco aumentado para o
mieloma múltiplo em resultado de sua exposição aos produtos do petróleo em seu ambiente
de trabalho.
Caldwell (1997) avaliou as alterações das enzimas séricas aspartato aminotransferase (AST),
alanina aminotransferase (ALT), gama glutamil-transferase (
γ
GT) e a histologia do fígado,
baço, guelras e rins de algumas espécies de peixes submetidos a um derrame de uma mistura
de hidrocarbonetos aromáticos. O acidente envolveu um vagão de trem contendo 114.000L da
mistura, vazada sobre o Rio Nemadji, Wisconsin, EUA. Caldwell (1997) mostrou através da
análise histológica que o tecido das guelras dos peixes coletados na área contaminada
apresentaram hiperplasia basal, fusão do epitélio lamelar, produção excessiva de muco e
edema lamelar. Os outros órgãos não apresentaram alterações quando comparados aos
controles. Das três enzimas avaliadas, a AST foi significativamente aumentada no
I. melas
e
no
C. commersoni
(
P<0,001
). O autor discute que apesar de não significante, há uma
tendência de elevação da AST nos demais peixes e da ALT em quase todas as espécies. A
γ
GT não foi detectada em nehuma das espécies coletadas. Esta avaliação, entretanto, deve ser
vista com extrema cautela, uma vez que parâmetros biológicos são bastante variáveis e, além
disso, uma amostragem muito insignificante foi feita em alguns grupos, em especial nestes
onde foram observadas as diferenças (N = 4 ou até mesmo 2!). Caldwell (1997) relata que
52
Gingerich e Dalich (1978) demonstraram que uma dose de 1,0mL/kg de monoclorobenzeno
elevou a ALT de 27 para 56 U/L em trutas
Oncorhnychus mykiss
num período de 72h,
retornando ao normal 24h após a retirada do contaminante. Caldwell (1997) sugere que as
aminotransferases podem ser um bom indicador de exposição a contaminantes em peixes.
Powley e Carlson (1999) relatam que a toxicidade do benzeno está relacionada ao seu
metabolismo. Os metabólitos envolvidos são o fenol, hidroquinona, catecol e provavelmente o
óxido de benzeno. Inicialmente ocorre a formação do óxido de benzeno, com meia-vida de 8
minutos no sangue de ratos, sugerindo que saia do fígado para a medula óssea. Uma vez que
este óxido é um composto eletrofílico estável, pode contribuir diretamente para a toxicidade
do benzeno. Um outro mecanismo de toxicidade proposto é que a hidroquinona seria
metabolizada na medula óssea a p-benzoquinona, que seria a responsável pelos efeitos
leucemogênicos. Experimentos in vivo, entretanto, mostraram que o fenol ou a hidroquinona
sozinhos não causam lesões significativas à medula óssea em ratos, apenas quando em
conjunto (Powley e Carlson, 1999).
Gagnon e Holdway (1999) analisaram os efeitos metabólicos de uma exposição de um tipo de
salmão, o
Salmo salar
, a águas contaminadas por óleo crú disperso e por sua fração
acomodada em água (WAF). Foram avaliadas as enzimas aeróbicas citrato sintase e citocromo
C oxidase, e a lactato desidrogenase pela fração anaeróbica em guelra durante uma exposição
por quatro dias, seguidas por 8 dias de depuração em águas limpas. Relativamente ao início do
tratamento, a atividade da LDH foi significativamente inibida pela exposição ao óleo disperso
e a WAF. Ao final do tratamento, a atividade da lactato desidrogenase permaneceu diminuída,
comparada ao início do tratamento, mostrando que a atividade desta enzima pode ser sensível,
a longo prazo, como marcador de exposição a águas contaminadas.
Khan et al. (2001) avaliaram os efeitos de múltiplas exposições, em pequenas dosagens, de
ratos submetidos a um óleo crú (0,25 a 1,25mL/kg) e um diesel comercial (mL/kg). A
exposição dos ratos a esta dosagem não causou sintomas de intoxicação. Análises de sangue
para indicadores hematológicos e clínicos não mostraram qualquer modificação significativa
em relação ao controle. Os parâmetros laboratoriais avaliados no sangue foram a
hemoglobina, glicose, uréia, proteínas totais séricas, albumina sérica, AST, ALT, fosfatase
alcalina, LDH. Entre os ensaios complementares, o achado principal da pesquisa foi um
aumento da atividade hepática da etoxiresorufina-O-dietilase (EROD), uma enzima associada
53
ao citocromo P-450 [CYP] 1A1/A2 nos ratos tratados com óleo crú e óleo diesel, sugerindo
neo-sínteses de algumas isoformas (Khan et al., 2001). Conforme Nelson e Cox (2002), os
citocromos são proteínas transportadoras de elétrons localizadas na membrana plasmática,
essenciais na formação do ATP a partir do ADP.
Ahmed (2001) faz uma revisão sobre a toxicidade e os efeitos à saúde causados pela
exposição à gasolina com MTBE e relata que composto é o aditivo mais utilizado na gasolina,
compondo até 15% do volume. O MTBE é carcinógeno, apesar de seu potencial permanecer
incerto. Estudos sugerem que o efeito carcinógeno se deva a dois de seus principais
metabólitos, o formaldeído e o tributanol (Ahmed, 2001; Dekant et al., 2001). O
Environmental Protection Agency (EPA) propôs sua eliminação como aditivo à gasolina nos
EUA. Hong et al. (1997) discutem que a inalação do MTBE constitui a maior rota para a
exposição ambiental ao produto. Estudos em ratos e em humanos mostraram que o MTBE
inalado é eliminado pelos principalmente pelos pulmões e pelos rins na urina.
Senzolo et al. (2001) analisam a exposição ocupacional de trabalhadores de uma refinaria no
norte da Itália à exposição de gasolina. Foram avaliadas as concentrações do ar de benzeno,
tolueno, n-pentano e n-hexano durante as 8h do turno de trabalho e benzeno e tolueno na urina
dos trabalhadores. O hábito de fumar foi considerado como fator de confusão na avaliação do
benzeno, uma vez que a substância está presente no cigarro. Foi observada uma significante
correlação entre o benzeno ambiental e hemático e urinário, sendo mais significativo o
primeiro. O benzeno continua por mais tempo no organismo, acumulando-se principalmente
no tecido gorduroso, nervoso e medula óssea (Candura et al., 1995). Nenhum composto
analisado atingiu os limites máximos estabelecidos pelos organismos de controle industrial.
Jo e Song (2001) avaliaram grupos de pessoas que trabalham próximos a fontes emissoras de
compostos orgânicos voláteis (VOCs), exaustão de motores, emissões de vapor de gasolina,
entre outros, durante seu horário de trabalho. Os autores constataram que para todos os
trabalhadores analisados, as concentrações de VOCs na respiração pós-trabalho eram
significativamente maiores que na condição pré, dependendo somente do composto e da
profissão de cada grupo. O fator tabagismo foi considerado no estudo, de forma idêntica a
Senzolo et al. (2001), sendo observado como a causa primária de exposição ao benzeno para
todos os trabalhadores avaliados na pesquisa. Da mesma forma, Fruin et al. (2001) avaliaram
a exposição ambiental ao benzeno em uma base aérea nos EUA no período de 1989 a 1997.
54
Observaram que as concentrações de benzeno no ar diminuíram no período. Atribuem o fato à
diminuição do conteúdo de benzeno na gasolina e outras fontes menores de emissão, assim
como a redução à exposição ao tabaco.
Pacheco e Santos (2001) avaliaram a biotransformação e as repostas endócrina e genéticas da
Anguilla anguilla
L. a águas contaminadas por hidrocarbonetos. Os animais foram expostos às
frações solúveis em água (WSF) de diesel e gasolina, simulando ambientes de portos em
laboratório e avaliando suas condições reais in situ. Foram estudadas as atividades do EROD e
da ALT do fígado, cortisol, glicose e lactato do plasma, cortisol inter-renal e o aparecimento
de anomalias nucleares eritrocitárias. Ambas as exposições ao diesel e gasolina induziram um
aumento da atividade da etoxiresorufina-O-dietilase (EROD) no fígado, assim como o
aparecimento de anomalias nucleares eritrocitárias (ENA) aos seis dias de exposição,
revelando as propriedades tóxicas dos hidrocarbonetos. Os peixes expostos às frações de
gasolina mostraram um aumento da atividade da ALT a curto prazo e lesão no fígado a longo
prazo, vistas pela diminuição da atividade da ALT. Nos ensaios de campo, com peixes
sobrevivendo em gaiolas na região do porto de Aveiro, Portugal, não foram vistas quaiquer
alterações significativas, mostrando a influência de outros fatores ambientais, tais como o
regime de marés e a toxicidade e distribuição dos poluentes aquáticos.
Pacheco e Santos (2001) relatam estudos de biotransformação em peixes que revelaram que a
exposição aos PAHs induz as atividades enzimáticas dependentes do citocromo P-450 como a
EROD. O naftaleno, o mais simples dos PAHs, e seus substitutos metil derivados estão
representados nas parcelas de 0,4% nos óleos diesel (podendo chegar a 10% em alguns tipos)
e 1% na gasolina. Os autores concluem que os estudos com a
A. anguilla
L. mostraram que o
cortisol sangüíneo pode ser um importante marcador biológico do estresse tóxico nos peixes,
inclusive para períodos curtos de exposição. E o EROD e o ENA se mostraram importantes
marcadores nas contaminações de diesel e gasolina.
Takamiya et al. (2003) relatam um caso de intoxicação de gasolina aguda durante uma
lavegem de um tanque, no qual a vítima sobreviveu por apenas 26h após o incidente. Antes da
retirada do homem de 50 anos do tanque, contendo 4480 ppm de vapor de gasolina, foi
necessária uma intensa ventilação por 30 minutos. Ao ingressar no hospital foram realizados
exames de laboratório que indicaram disfunção renal. Na autópsia foram observadas lesões
bolhosas na face, tórax e membros superiores, o coração continha sangue hemolizado, os
55
pulmões apresentavam superfícies vermelhas escuras com extravasamento pleural, com
parênquima congesto e edematoso. Os rins estavam com a medula congesta e com o córtex
anêmico, parte dos órgãos abdominais e cérebro com autólise. Havia forte odor de gasolina no
trato alimentar.
Conforme Takamiya et al. (2003), a análise microscópica mostrou degeneração das fibras de
colágeno abaixo das lesões bolhosas. Além da congestão e edema pulmonar, havia
extravasamento de sangue e infiltração de neutrófilos nos alvéolos. Os rins apresentavam
necrose, desaparecimento de núcleos celulares do epitélio tubular proximal, fluído
eosinofílico nos espaços capsulares dos glomérulos e túbulos, com medula congesta. O baço
apresentava hemólise. Wang e Irons (1961) já haviam mostrado que a exposição a 5000 –
16000 ppm de gasolina por 5 minutos causa a morte.
Long et al. (2003) investigaram os efeitos da exposição de hidrocarbonetos (óleo crú) em
Mytilus edulis planulatus
via diluição (WAF) em coluna d’água e sedimentos contaminados
através de alterações em enzimas respiratórias. Foram medidas as atividades do citrato sintase
(CS) e lactato desidrogenase (LDH) nos guelra. As enzimas CS e LDH estão envolvidas na
respiração celular e produção de adenosina trifosfato (ATP) a partir da glicose. O LDH é
responsável pela regeneração de NAD+ (necessária no metabolismo da glicose e na
subseqüente produção de ATP) a partir de NADH para continuação da glicólise. A atividade
do LDH é uma medida da capacidade anaeróbica da célula (Gagnon e Holdway, 1999). Em
condições aeróbicas, o ciclo do ácido cítrico começa quando o piruvato, produto final da
glicólise, passa para dentro da membrana mitocondrial e é convertido a acetil-coenzima A
(Acetil coA). A CS cataliza a reação entre o Acetil coA e o oxalacetato para produzir CO
2
,
NADH e citrato e conseqüentemente ATP. A atividade do CS é uma medida da capacidade
aeróbica da célula (Gagnon e Holdway, 1999).
Long et al. (2003) mostraram que o tratamento WAF não apresentou diferenças significativas
para o controle com relação a LDH ou CS, apesar de mostrar algumas tendências de redução
com o tempo e concentrações. No caso da exposição a sedimentos contaminados, a LDH
aumentou sua atividade nos grupos contaminados entre os meses 2 e 4, após o início dos
experimentos, principalmente nos grupos expostos a maiores níveis de contaminação,
diminuindo aos 6 meses. A CS novamente não apresentou alterações. Os resultados mostram
uma mudança do estado aeróbico para anaeróbico após 2 meses de exposição. A avaliação dos
56
tecidos mostrou que há uma acumulação de PAHs até além de 2 meses, diminuindo aos 6
meses. Da mesma forma que o trabalho de Caldwell (1997) há poucos indivíduos nos ensaios
para uma avaliação mais precisa dos resultados, com desvios muito altos. Long et al. (2003),
inclusive, não mostram desvio padrão, mas, sim, erro padrão, diluindo o desvio pela raiz do
número de indivíduos. Concluem, após várias considerações, que as enzimas respiratórias não
são marcadores efetivos de exposição aos hidrocarbonetos no
Mytilus edulis planulatus
.
2.2.3 Alterações Elétricas Celulares
Bonincontro et al. (1997) estudaram tráfego de íons intramembrana em apoptose por meio de
cultura de células. O estudo das modificações da estrutura e da função da membrana foi feito
por meio de medidas de condutividade elétrica da suspensão das células, como uma função da
freqüência do campo elétrico aplicado às amostras. A comparação entre as células normais e
as apoptóticas mostrou que a morte celular programada causa uma diminuição da
condutividade da membrana, indicando uma diminuição do tráfego de íons intramembrana.
Em estudos médicos, Thielecke et al. (2001) utilizaram medidas de impedância como meio
de seleção bioeletrônica para terapias anti-câncer. Os autores mostram que as alterações na
morfologia da agregação celular, como apoptose ou necrose, podem ser detectadas por
monitoramento do comportamento elétrico das membranas e espaços extracelulares com alta
resolução e reprodutibilidade.
Bonincontro e Risuleo (2003) analisaram espectroscopia dielétrica na investigação de
propriedades conformacionais de proteínas. Neste estudo foram avaliadas a lisozima, o
citocromo C e a metamioglobina. Os autores mostram que a espectroscopia dielétrica em
radiofreqüências é uma ferramenta poderosa no estudo das propriedades das proteínas.
Sola et al. (2003) utilizaram tecnologias de microeletrodos para monitorar isquemia-
reperfusão em rins de ratos e as mudanças induzidas por manejos terapêuticos. Os autores
observaram que a isquemia induz a um rápido aumento do potássio extracelular, assim como
o modulo de impedância, seguido por uma fase lenta de crescimento, enquanto o pH cai
rapidamente.
57
2.2.4 Considerações Finais em Toxicidade e Lesão Celular
Diversos autores mostram relações de causa e efeito entre exposição e concentrações de
tóxicos nos organismos, e ainda mostram relações com câncer em longo prazo, principalmente
leucemia. Outros autores relacionam a exposição aos hidrocarbonetos a alterações de AST,
ALT,
γ
GT, LDH e EROD. Muitos destes trabalhos apresentam problemas metodológicos,
com número de indivíduos pesquisados insuficientes ou ainda controles não específicos, como
grupos compostos por 2 a 4 indivíduos, ou ainda comparar trabalhadores expostos a
contaminantes ambientais a escolares, sem considerar o fator idade, ou ainda que os próprios
escolares podem fumar. Entretanto, muitos destes trabalhos apresentam relações inequívocas
entre exposição e efeitos/concentrações de contaminantes. Nesta pesquisa foram incluídos
alguns destes parâmetros avaliados na literatura e diversos outros, tentando-se identificar
parâmetros e padrões de toxicidade e lesão celular.
CAPÍTULO 3 – METODOLOGIA DA PESQUISA
3 INTRODUÇÃO
Os experimentos de biorremediação foram desenvolvidos em laboratório utilizando-se
amostras de solo contaminado com hidrocarbonetos e dispostos em recipientes herméticos.
Alguns aditivos foram condicionados ao solo contaminado de forma a estimular a
decomposição dos hidrocarbonetos (fertilizante mineral e um lodo de agroindústria). Foram
testadas diferentes combinações do solo contaminado com os aditivos.
No caso dos ensaios de toxicidade e lesão em modelo animal, foi considerado somente o solo
contaminado pelos 50.000L/ha, sem qualquer bioestimulante, uma vez que se buscou avaliar a
exposição dos animais frente a esta concentração de gasolina no solo.
3.1 SOLO UTILIZADO
O solo utilizado na pesquisa foi um horizonte C, substrato de arenito, pertencente a
denominada Formação Botucatu. Apresenta-se como uma areia fina siltosa, mal graduada,
fracamente plástica. A localização da formação Botucatu no Estado do Rio Grande do Sul
pode ser vista na Figura 3.1. A jazida de onde foram coletadas as amostras pertence a um
talude situado às margens da rodovia estadual RS-240, na localidade de Vila Scharlau,
Município de São Leopoldo, RS (Figura 3.2). O material já foi exaustivamente estudado por
Nuñez (1991), Prietto (1996), Spinelli (1999) e Spinelli et al. (2005). As propriedades físicas
do solo estão apresentadas na Tabela 3.1 e são uma média dos valores encontrados por Nuñez
(1991) e Prietto (1996). Os parâmetros da curva granulométrica, diâmetro efetivo (D
10
) e
coeficiente de uniformidade (C
u
), seguem as definições apresentadas por Lambe & Whitman
(1979). A mesma tabela também mostra uma análise química complemetar do solo (Spinelli
et al., 2004), visando parâmetros relacionados à microbiologia de solos, tais como macro e
micronutrientes, etc.
59
Figura 3.1: Formação Botucatu no Estado do Rio Grande do Sul (Nuñez, 1991)
3.2 LODO
O resíduo utilizado como “bioaugmentação” foi um lodo proveniente de uma estação de
tratamento de efluentes líquidos de uma indústria alimentícia do Município de Viamão, RS.
Ao longo da pesquisa foram feitas duas coletas deste material, ambas no mês de março, em
anos diferentes, com suas características apresentadas na Tabela 3.2. É interessante observar
que as duas amostras de lodo têm propriedades distintas, uma vez que se utilizou uma parcela
para os ensaios piloto e posteriormente se buscou uma maior quantidade para o conjunto da
pesquisa e armazenamento para o caso de serem necessárias repetições dos ensaios. O pro-
cesso de tratamento na empresa envolve a incorporação dos rejeitos sólidos à água e sulfato
de alumínio. O lodo precipita e a água é tratada e liberada ao meio ambiente. Nos ensaios,
além dos nutrientes adicionados ao solo, existe umidade ótima de tratamento, devendo-se
então considerar a água contida no lodo.
60
Figura 3.2: Localização da jazida (Spinelli, 1999)
3.3 FERTILIZANTE MINERAL
Neste trabalho buscou-se uma comparação entre um lodo industrial (“bioaugmentação”) e um
fertilizante mineral (bioestimulador) como promotores do processo de biorremediação. O
fertilizante mineral utilizado foi uma solução (NPK) contendo NH
4
NO
3
(0,55g/50mL de água
destilada) e KH
2
PO
4
(1,75g/50mL de água destilada), utilizada como 2,5 mL/kg solo seco.
61
Tabela 3.1: Propriedades físicas e químicas do solo.
Propriedades Valores Propriedades Valores
Limite de Liquidez (LL) 21,5 % P – mg.L
-1
1,7
Limite de Plasticidade (LP) 19,0 % K – mg.L
-1
14
Índice de Plasticidade (IP) 5,5 % Al
troc.
- cmol
c
L
-1
0,5
Limite de Contração (LC) 16,0 % Ca
troc.
- cmol
c
L
-1
0,7
Densidade (γ
s
)
26,9 kN/m
3
Mg
troc.
- cmol
c
L
-1
0,7
Diâmetro Efetivo (D
10
) 0,003 mm Al + H - cmol
c
L
-1
2,3
Coeficiente de Uniformidade (C
u
) 37 CTC - cmol
c
L
-1
3,8
% Areia Média (0,42 < ø < 2 mm) 3,3 % S – mg.L
-1
6,9
% Areia Fina (0,074 < ø < 0,42 mm) 48,2 % Zn - mg.L
-1
1,1
% Silte (0,005 < ø < 0,074 mm) 32,5 % Cu – mg.L
-1
0,4
% Argila (ø < 0,005 mm) 16,0 % B – mg.L
-1
0,7
pH (H
2
O) 4,5 Mn – mg.L
-1
43
Matéria Orgânica - % 1,2 Relação Ca/Mg 1,0
% SAT of CTC – Básico 38 Relação Ca/K 20
% SAT of CTC – Al 13,2 Relação Mg/K 20
3.4 GASOLINA
Inicialmente, durante a realização dos ensaios preliminares, foi selecionada aleatoriamente
uma gasolina de um posto de combustíveis (Petrobrás) da região metropolitana de Porto
Alegre, RS, com composição básica apresentada na Tabela 3.3. Posteriormente, foi obtida,
para a continuidade da pesquisa, gasolinas sem álcool com origem direta da Refinaria Alberto
Pasqualini/Petrobrás, cujas composições químicas foram fornecidas pela própria empresa,
conforme apresentado na Tabela 3.4.
62
Tabela 3.2: Características do lodo.
Determinações Valores (1ª) e (2ª) amostras
Umidade (amostras secas a 75
o
C) – % 92 96
pH (amostra “in natura”) 5,0 5,0
Carbono orgânico – % 56 46
Nitrogênio (TKN) – % 3,3 3,5
Fósforo total – % 0,21 3,0
Potássio total – % 0,10 0,18
Cálcio total – % 0,13 0,94
Magnésio total – % 0,18 0,25
Enxofre total – % 0,25 0,85
Cobre total – mg/kg 96 66
Zinco total – mg/kg 324 201
Ferro total – % 0,28 0,45
Manganês total – mg/kg 34 62
Sódio total – % 0,11 0,83
Boro total – mg/kg 4,4 54
Chumbo Total – mg/kg 55 29
Níquel Total – mg/kg 27 < 5
Cádmio Total – mg/kg < 2 < 2
Cromo Total – mg/kg 72 38
Mercúrio – mg/kg 0,50 0,74
Tabela 3.3: Composição química da gasolina do posto de combustível (com álcool)
Componentes analisados (% Massa)
Benzeno 0,73
Tolueno 2,79
C
8
Aromático 3,83
C
9+
Aromático 9,25
63
Tabela 3.4: Composição química da gasolina da REFAP fornecida pela empresa.
Grupo de Hidrocarbonetos (% Massa)
Identificação Até C
5
C
6
C
7
C
8
C
9
C
10
+ Total
Parafina Normal 6,51 4,20 3,24 2,54 1,41 0,67 18,57
Parafina c/1 Ramif. 5,78 4,82 3,83 2,60 1,43 1,05 19,50
Parafina c/+1 Ramif. 0,02 0,61 0,33 0,76 0,87 0,20 2,78
Olefina Normal 2,78 1,42 0,92 0,81 0,35 0,12 6,40
Olefina c/1 Ramif. 2,67 1,83 1,78 0,00 0,00 0,00 6,28
Olefina c/+1 Ramif. 0,00 0,10 0,09 0,12 0,00 0,00 0,31
Naftênico Olefínico 0,26 0,74 0,41 0,11 0,52 0,08 2,13
Naftênico Parafínico 0,67 3,87 4,67 3,55 2,53 0,81 16,09
Aromáticos 0,00 0,74 2,89 5,46 7,27 9,57 25,94
Naf.Olef.e/ou Diolefina 0,15 0,09 0,62 0,58 0,42 0,00 1,85
Compostos não ident. 0,15
Total 18,83 18,41 18,77 16,53 14,81 12,50
Identificação (% Massa)
MTBE 0,000
Etanol 0,000
Benzeno 0,739
Tolueno 2,894
Etil-Benzeno 1,012
M-Xileno 2,189
P-Xileno 0,956
O-Xileno 1,307
64
3.5 DIESEL
Inicialmente, durante a realização dos ensaios preliminares, foi selecionado aleatoriamente
um óleo diesel de um posto de combustíveis (Petrobrás) da região metropolitana de Porto
Alegre, RS. Ao término destes ensaios, observou-se que não haveria a disponibilidade de
cromatografias deste material por ausência de cromatógrafos com colunas especifícas para
diesel. Os testes piloto, entretanto, serão apresentados posteriormente no Capítulo 4. Porém,
optou-se, para a continuidade da pesquisa, em não mais utilizar este combustível, mas, sim,
concentrar os estudos com gasolina. Um cromatograma típico de um óleo diesel encontra-se
na Figura 3.3.
Figura 3.3: Cromatograma típico de um óleo diesel metropolitano (Bento, 2001)
3.6 TEMPERATURA E UMIDADE
Apesar de a temperatura externa ao laboratório variar muito durante o período de ensaio, a
climatização do laboratório era praticamente constante, oscilando ao redor dos 20+5ºC. Em
um segundo momento, os ensaios foram realizados com temperatura ambiente para fins de
comparação. A umidade das amostras foi de 11% (w/w), correspondendo a 80% da
capacidade de campo do solo. A umidade ao longo do período dos ensaios foi mantida
65
constante (durante os 180 dias), e medida através da variação do peso do conjunto pote-solo-
contaminante. Toda a água utilizada na pesquisa provinha de destiladores do Laboratório de
Análises de Solo, Águas e Plantas da Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do
Rio Grande do Sul.
3.7 ENSAIOS DE BIORREMEDIAÇÃO
Os experimentos de biorremediação foram desenvolvidos em laboratório utilizando-se
amostras de solo (400g nos testes piloto e 500g posteriormente) contaminado artificialmente
com hidrocarbonetos (gasolina e diesel nos testes piloto, aplicados como 50.000L
contaminante/ha ou 25mL/kg de solo) dispostos em recipientes herméticos de 2L com cinco
replicatas. Aditivos nas formas de fertilizante mineral e de lodo de agroindústria foram
testados. Os processos de biorremediação foram acompanhados por diversas técnicas,
relatadas a seguir.
3.7.1 Liberação de CO
2
A atividade microbiana pode ser observada através da evolução de CO
2
em experimentos com
solo + adições de compostos orgânicos e/ou inorgânicos (Stotzky, 1965; Tedesco et al., 1995;
Paul & Clark, 1996; Öhlinger et al., 1996). De forma geral, considera-se a equação 1, na qual
um composto orgânico é oxidado pela população microbiana, liberando gás carbônico, água e
energia, somando ou não materiais orgânicos à sua biomassa (mineralização ou degradação
completa).
CHO + O
2
Î CO
2
+ H
2
O + biomassa + energia [1]
Uma visão geral dos recipientes herméticos utilizados para a realização dos ensaios pode ser
vista nas Figuras 3.4a e 3.4b. Na Figura 3.4a temos o detalhe de um frasco (microcosmo) e na
3.4b, o conjunto dos primeiros ensaios realizados. As cinco repetições utilizadas nos testes
piloto apresentaram uma baixa dispersão de valores, sendo possível, posteriormente, a
realização de ensaios com apenas três repetições. Os tratamentos foram:
66
a) Solo Controle (sem qualquer adição);
b) Solo + Lodo de Indústria Alimentícia (20 t/ha);
c) Solo + Gasolina (25 mL/kg solo);
d) Solo + Gasolina + Lodo;
e) Solo + Gasolina + Lodo + NPK;
f) Solo + Gasolina + NPK;
g) Solo + Diesel (25 mL/kg solo)(só utilizado nos testes piloto);
h) Solo + Diesel + Lodo (só utilizado nos testes piloto);
(a)
(b)
Figura 3.4: Visão geral dos experimentos: a) pote com solo + adição, mostrando ainda as
lâminas enterradas e o sistema de captação de CO
2
; b) Visão do conjunto
Na execução dos ensaios de CO
2
são necessárias as seguintes soluções:
a) Indicador de fenolftaleína
b) BaCl
2
c) NaOH 0,40M
d) HCl 0,40M
A captura do CO
2
no microcosmo (frasco hermético, de forma a evitar trocas gasosas com o
ambiente – Figura 3.4) era feita através de um pequeno recipiente de vidro contendo 20 mL
de solução NaOH 0,40M. A importância do uso de frascos de vidros ao invés de plásticos
justifica-se na medida em que o plástico se dissolve quando em contato com os hidro-
carbonetos no solo. O CO
2
foi medido inicialmente no tempo 24h, 48h, 72h e então de 3 em 3
67
dias até a sua estabilização aos 180 dias. Para medir o CO
2
, retirava-se o frasco contendo
NaOH do pote hermético e adicionava-se neste 1 mL de BaCl
2
e mais duas gotas do indicador
de fenolftaleína, para que então pudesse ser titulado com HCl 0,40M. Além dos tratamentos,
eram sempre realizadas três provas em branco – solução de NaOH 0,40M em potes sem solo e
sem contaminantes para se analisar isoladamente o CO
2
existente na atmosfera do pote –
descontados posteriormente na titulação dos tratamentos. A quantidade de HCl (mL) utilizada
na titulação para neutralizar a soda restante corresponde ao que não reagiu com o CO
2
e,
portanto, por diferença, obtem-se o CO
2
:
CO
2
(mg/500g solo) = [V
branco(HCl)
– V
amostra(HCl)
]*EqCO
2
*0,40M(HCl)*[HCl]/[NaOH] [2]
3.7.2 Avaliação da População do Solo pelo Método da Lâmina Enterrada (Rossi-
Cholodny)
O objetivo desta avaliação consiste em relacionar a ocorrência de diferentes grupos de
microrganismos com os diferentes tratamentos. Este método permite uma análise qualitativa
através da observação dos microrganismos no habitat natural, podendo-se visualizar as
interações e as inter-relações destes com as partículas de solo (Paul & Clark, 1996; Prescott et
al., 1999; Selbach & Camargo, 2001).
Para a realização dos ensaios, foram enterradas duas lâminas em cada uma das amostras de
solo + tratamento, deixando-se 1/3 da lâmina para fora, de forma a facilitar sua remoção para
análise. Nestas, observou-se o desenvolvimento de fungos, bactérias e actinomicetos,
conforme o esquema da Figura 3.5a.
Para que se possa avaliar corretamente os microrganismos presentes nas lâminas, faz-se
necessário analisar pelo menos três campos (representatividade) em uma região intermediária,
conforme Figura 3.5b. A visualização dos fungos é feita em aumentos de 40 a 100x, e as das
bactérias e hifas de actinomicetos com aumentos de 400 a 1000x. A Tabela 3.5 apresenta
algumas características dos campos a serem observados ao microscópio.
68
Figura 3.5: Método da lâmina enterrada: a) esquema geral da lâmina enterrada; b) escolha das
regiões representativas para as análises
Tabela 3.5: Características do campo no microscópio
O que é observado Característica Tamanho
Partículas de solo* Argilominerais
φ< 2 µm
Bactérias Formas de cocos, eventualmente bacilos
0,5 µm < φ < 2 µm
Fungos Hifas individualizadas
3 µm < φ < 10 µm
Actinomicetos Similares aos fungos, porém mais finos e
tortuosos
* Não foram demonstrados no esquema da Figura 3.5
Quanto aos procedimentos de ensaio, deve-se seguir um padrão: a) retirar a lâmina
comprimindo esta contra um dos lados e puxando para cima, de forma a evitar atrito no lado
oposto, que será o lado utilizado nas observações; b) mergulhar a lâmina em água destilada
para retirar o solo aderido (com cuidado para não perder todo o material); c) com um papel
úmido, limpar o lado oposto ao que será observado; d) fixar com calor brando; e) colorir com
rosa bengala fenólico sobre a chama ou vapor d’água durante 15 minutos; f) retirar excesso de
corante (mergulhar em água), deixar escorrer e secar; g) fazer as observações;
3.7.3 Quantificação de Bactérias e Fungos
O ensaio de quantificação de microrganismos totais do solo foi feito pelo método da diluição
sucessiva em placas de Petri, utilizando-se como meio de culturas o PGY Agar para bactérias
69
e o PCRB para fungos (Tabela 3.6) nos tempos 4, 8, 15, 30, 60, 120 e 180 dias. Os sais eram
diluídos, acrescidos aos açúcares, quando então era colocado o ágar e levado o conjunto à
autoclave. No caso dos fungos, a estreptomicina era colocada no meio de cultura após o
processo de autoclave, visto que o calor e a pressão destroem o antibiótico.
Tabela 3.6: Meios de Cultura utilizados
PGY Ágar PCRB
Glicose 4,00g Glicose 10,00g
Peptona 2,00g Peptona 5,00g
Extrato de Levedura 0,24g KH
2
PO
4
1,00g
K
2
HPO
4
0,16g Rosa Bengala 0,03g
MgSO
4
0,04g MgSO
4
.7H
2
O 0,50g
FeSO
4
0,02g Agar 20,00g
Agar 15,00g H2O 1.000mL
H
2
O 1.000mL Streptomicina 1%
pH 7,0 (0,3mL/100mL)
Realizados os meios de cultura, estes eram dispostos nas placas de Petri, sendo todo o
procedimento realizado em ambiente estéril, dentro da câmara de fluxo. Após a solidificação
do meio, as placas eram colocadas na estufa a 28ºC por 24h para garantir as condições de
assepsia. Se houvesse crescimento microbiano (contaminação), as placas eram desprezadas.
As placas assépticas eram inoculadas com as amostras de solo. O procedimento está descrito
em Alef e Nannipieri (1995) e Maier et al. (2000). Dez gramas de solo úmido (umidade
conhecida) eram introduzidos em uma garrafa de vidro com 95mL de água destilada
previamente autoclavada. O conjunto era agitado por 15 minutos. Deste frasco, pipetava-se
uma alíquota de 1mL para um tubo de ensaio contendo 9mL de água destilada estéril. Após a
homogeneização do tubo, outro 1mL era passado ao tubo seguinte, e assim por diante. As
pipetas eram homogeneizadas antes de se colher o 1mL. Terminado o procedimento de
diluição, escolhiam-se as diluições a serem analisadas e pipetava-se uma alíquota de 0,3mL
70
para as placas de Petri com o meio específico. Três repetições eram feitas de cada diluição. O
liquido era espalhado nas placas por meio de uma alça de Drigalski e incubado com a placa
invertida a 28ºC. Após o tempo necessário ao crescimento dos microrganismos, em torno de
2-3 dias, as placas eram removidas da estufa e as colônias eram contadas por método direto
(Figura 3.6).
Figura 3.6: Metodologia para contagem direta de microrganismos
O ensaio de quantificação dos microrganismos degradadores específicos foi realizado por
meio de contagem do número mais provável (Braddock e Catterall, 1999). O meio de cultura
utilizado foi o meio mineral de Bushnell-Haas (Tabela 3.7), preparado em duas etapas. De
uma solução denominada “A”, previamente feita, eram retirados 400mL, e, então, 100mL da
solução “B”, contendo cloreto de trifenil tetrazolium (TTC), eram adicionados. Após feita a
71
solução “A”, esta era esterilizada a 121ºC por 15 minutos a pressão de uma atmosfera. Os
500mL de solução final eram levados à autoclave.
Tabela 3.7: Meios de Cultura para biodegradadores específicos
Solução “A” Solução “B”
MgSO
4
0,20g TTC 0,025g
CaCl
2
0,02g H
2
O 100mL
KH
2
PO
4
1,00g
K
2
HPO
4
1,00g
NH
4
NO
3
1,00g
FeCl
3
0,05g
H
2
O 1.000mL
pH 7,2
Utilizou-se, neste procedimento gasolina esterilizada. O procedimento de esterilização foi
realizado do seguinte modo: a) um filtro previamente esterilizado (121
o
C por 15 minutos com
pressão de uma atmosfera) de porosidade de 0,22µm era disposto sobre um funil de vidro
equipado com um outro filtro de pedra porosa. O conjunto era acoplado a um “Kitazato”, ao
qual se aplicava vácuo para a passagem da gasolina pelos filtros (Figura 3.7). Todo o conjunto
era previamente esterilizado em autoclave.
O ensaio de enumeração de microrganismos degradadores de gasolina era então realizado,
dispondo-se 250µL do meio de cultura “C” (400mL da solução “A” + 100mL da solução “B”)
em cada um dos poços de placas de Elisa. A esta solução era adicionado 5µL de gasolina e
25µL das correspondentes diluições previamente realizadas para a contagem direta de
microrganismos (10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
). O conjunto final era incubado por 7-15 dias para
observar a ocorrência dos microrganismos degradadores específicos (Figura 3.8). A solução
final é um indicador redox, ou seja, o crescimento microbiano nos poços é detectado pela
mudança de cor do meio mineral, de incolor para róseo (redução do TTC).
72
Figura 3.7: Sistema utilizado para filtrar a gasolina
Figura 3.8: Placas de Elisa (multi-poços) utilizadas para quantificação de microrganismos
degradadores de gasolina
3.7.4 Identificação de Microrganismos
Após a contagem direta dos microrganismos em placas, estes eram selecionados por
representatividade dos solos correspondentes, e isolados para identificação. No caso das
bactérias, estas eram retiradas da placa de Petri por uma alça de platina previamente flambada
e inoculadas em uma nova placa de Petri com meio de cultura específico para bactérias,
73
visando a busca de uma cultura purificada. Após a purificação, as bactérias foram
reinoculadas em um tubo de ensaio e levadas ao Laboratório de Microbiologia do Hospital
São Lucas da PUCRS para identificação por meio de kits tradicionais de identificação.
Os fungos foram transferidos, através da passagem de uma alça sobre os seus conídios, para
um novo meio de cultura (Sabaraud), disposto na quantidade de uma gota sobre uma lâmina,
recoberto por uma lamínula. O conjunto era montado em câmara de fluxo e após terminado,
guardado em uma placa de Petri esterilizada. Após 2-5 dias incubados em estufa a 28ºC, eram
analisados macroscopicamente, num primeiro momento, e sob microscopia óptica em seguida
(Maza et al., 1999; Minami, 2003)(Figura 3.9). No caso do Aspergillus fumigatus (Figura
3.9A), este é unisseriado, isto é, tem somente uma camada de fiálides que cobre o terço da
parte superior da vesícula. As fiálides sustentam as conídias, que saem por expulsão do final
da fiálide. O Aspergillus versicolor e A. niger (Figuras 3.9B e C, respectivamente) são
bisseriados, nos quais a vesícula é coberta com uma camada de uma estrutura de hifas curtas
chamada metula (estruturas sustentando as fiálides) e outra camada consistindo de fiálides. As
metulas e as fiálides de A. niger formam um arranjo irradiado (Figura 3.9C), o que não ocorre
nas espécies de A. versicolor (Figura 3.9B). O Aspergillus flavus pode ter ambas, unisseriadas
e bisseriadas, com a metula e as fiálides cobrindo a vesícula inteira. No caso do Penicillium
sp. (Figura 3.10), as hifas septadas apresentam conidióforos ramificados e não-ramificados.
Estes formam metulas (hifas de estruturas curtas, abaixo das fiálides) que aumentam a forma
de frasco das fiálides. As conídias são redondas, lisas, ou rugosas e não-ramificadas (Maza et
al., 1999; Minami, 2003).
3.7.5 Avaliação do pH e da Condutividade Elétrica do Solo
O procedimento utilizado para medir o pH e a condutividade elétrica do solo é resumido nas
seguintes etapas: a) pesar 10g de solo; b) adicionar 20mL de água destilada; c) homogeneizar
com um bastão; d) aguardar 20 minutos; e) ler os valores. A condutividade elétrica e o pH do
solo foram medidos com um condutivímetro Digimed DM31 e um pHmetro DM20 da mesma
marca.
74
Figura 3.9: Diagrama da estrutura morfológica de Aspergillus sp. (Maza et al., 1999).
Figura 3.10: Diagrama de Penicillium sp. (Maza et al., 1999).
75
3.7.6 Nitrogênio Mineral do Solo
Inicialmente, nos testes piloto, foi realizada uma quantificação pontual de nitrogênio mineral
nas amostras dos diversos tratamentos após a estabilização do CO
2
(180 dias), em que se
verificou as frações de NH
4
+
e NO
3
-
+ NO
2
-
. Posteriormente, nos ensaios com gasolina sem
álcool da REFAP, foram realizadas as análises nos tempos 90 e 180 dias. As reações químicas
que abrangem o processo são (Tedesco et al., 1995):
MgO + H
2
O Î Mg
+2
+ 2OH
-
[3]
NH
4
+
+ OH
-
Î NH
3
+ H
2
O [4]
NO
2
-
+ NO
3
-
+ liga devarda Î NH
4
+
[5]
em que a liga devarda (complexo redutor) contém 50% de Cu, 45% de Al e 5% de Zn. E a
destilação ocorre através da reação:
H
3
BO
3
H
+
ácido
NH
3
+ H
2
O Î NH
4
+
+ H
2
BO
3
-
Î H
3
BO
3
+ (NH
4
)
2
SO
4
[6]
H
2
SO
4
Os procedimentos do ensaio consistem em (Tedesco et al., 1995): a) pesar 5g de solo e
adicionar 50mL de solução KCl 1M, medindo-se a umidade do solo; b) agitar por 20 minutos
e deixar sedimentar por 15 minutos; c) retirar 20mL do sobrenadante para um frasco de
“carga lateral”; d) adicionar 0,2g de MgO; e) destilar de 30 a 35mL (obtenção do NH
4
+
); f)
adicionar 0,2g da liga devarda (obtenção do NO
2
-
e NO
3
-
); g) titular com H
2
SO
4
0,0025M; h)
titular prova em branco para eliminar eventuais contaminantes; i) adicionar 5mL de H
3
BO
3
aos potes que receberão o destilado; Deve-se observar:
a) 1mL H
2
SO
4
0,0025M
b) massa M1 de NH
4
+
= 18g
c) massa M1 de N = 14g
Então: 1mL * 0,0025 * 18 * 14/18 = 0,035 * 2H
+
= 0,07 mg = 70 µg
50mL em um frasco com 20mL Î 2,5
76
N
mineral
(mg/kg) =
(
)
solog
gbrancomLHamostramLH
.5
5,2*70*
µ
++
−
[7]
3.7.7 Cromatografia Gasosa
Todas as amostras de solo contaminado foram analizadas de forma a se detectar a presença de
gasolina e diesel através de ensaios com cromatografia gasosa. Inicialmente, nos testes piloto,
os contaminantes originários de postos de combustíveis foram dosados ao final de 180 dias de
tratamento (Spinelli et al. 2005). Após, nos testes com gasolina originária da REFAP, buscou-
se verificar a biorremediação ao longo de um período maior de tempo, observando-se os
hidrocarbonetos remanescentes no solo nos tempos zero, 2, 4, 8, 15 e 30 dias. Todas as
análises de cromatografia foram gentilmente cedidas pela Copesul S/A. Foram também
realizados ensaios com solo esterilizado a fim de se verificar os efeitos da microbiota sobre os
compostos voláteis. Neste caso, utilizou-se apenas solo contaminado com gasolina com e sem
NPK nos tempos zero, 12 e 26 dias.
Os ensaios foram feitos com um cromatógrafo gasoso AutoSystem XL acoplado a um
Headspace Turbo Matrix 40 da Perkin Elmer com limite inferior de 3 mg/kg para os
compostos de petróleo avaliados (Figura 3.11a). Amostras de 2,000g de solo eram
introduzidas em potes de vidro cilíndricos de 22mL acrescidos de 10mL de água destilada. Os
potes eram selados e colocados no Headspace (Figura 3.11b). O método de amostragem é
pneumático, com pressão balanceada (sem seringas ou loop de gás). Os frascos contendo as
amostras são inicialmente pressurizados com gás. Durante o período de injeção, o fluxo de
gás ao cromatógrafo é substituído pelas amostras já pressurizadas. A rápida transferência dos
compostos é assegurada sem que haja um reequilíbrio nas válvulas ou seringas com
subseqüente perda de material. Então, o benzeno, tolueno, MTBE, aromáticos C
8
e C
9+Total
podem ser analizados (Figura 3.12). A temperatura das amostras era de 80
o
C, temperatura
esta necessária para volatilizar todos os componentes a serem medidos. A coluna utilizada era
feita de silicone com um filme de metil-silicone. A matriz do solo foi misturada inicialmente a
uma solução (MRC) contendo os contaminantes que seriam avaliados em concentrações
conhecidas de forma a se obter um padrão para fins de comparação com todas as amostras de
gasolina a posteriori (Figura 3.13).
77
(a) (b)
Figura 3.11: (a) Visão geral do equipamento mostrando o headspace com amostras de solo e
(b) amostras
Figura 3.12: Sistema de injeção dos voláteis
Figura 3.13: Cromatografia do solo controle com a solução padrão
78
3.7.8 Parâmetros de Contaminação do Solo
Como já foi discutido anteriormente, existem diversas dificuldades para se identificar
contaminações e seus parâmetros em campo (pH e condutividade elétrica do solo). Algumas
técnicas de investigação de campo tem sido utilizadas rotineiramente nas práticas nacional e
internacional, normalmente combinando o cone a medidas de eletrorresistividade, temperatura
e pH (Schnaid, 2000). Nesta pesquisa, o processo de biorremediação foi acompanhado por
medidas pH e condutividade elétrica para verificar sua aplicabilidade em eventual uso “in
situ”. Os procedimentos de ensaios são os mesmos vistos para a medição do pH e a
condutividade elétrica neste Capítulo (Tedesco et al., 1995). Colocava-se o solo, a água e, a
seguir, colocava-se o contaminante nas proporções de 1:2:0,1 (solo:água: contaminante) até
1:2:1 em volume, com incrementos de 0,1.
Todas amostras foram comparados a um solo controle, lembrando que estes parâmetros são
analisados para a condição saturada. Para que fosse possível analisar o efeito do solo no pH e
na condutividade elétrica para as diferentes cargas de contaminação, realizaram-se ensaios
similares, porém apenas com água destilada e o contaminante. Medidas também foram
tomadas da água, do diesel e da gasolina “in natura”.
3.7.9 Ensaios de Agregados
Amostras de solo dos ensaios de biorremediação foram coletadas nos tempos 180 e 256 dias,
secas ao ar, e passadas na peneira de 7,960 mm para homogeneização. Foram pesadas 50g de
cada amostra e colocadas sobre um conjunto de peneiras com malhas de diâmetros iguais a
4,760, 2,000, 1,000, 0,500 e 0,250 mm, submergindo-as por três segundos em água. Após,
colocou-se o conjunto de peneiras com as amostras de solo em um aparelho de oscilação, de
modo que o nível de água ficasse 1 cm acima do fundo da peneira superior, deixando-as
imersas por dez minutos quando então o aparelho, de rotor excêntrico, era acionado por mais
dez minutos (Figura 3.14). O material que ficava retido nas peneiras era transferido para latas
de alumínio através de uma lavagem cuidadosa e levado à estufa a 105°C por 24 horas. A
distribuição percentual dos agregados em diferentes tamanhos (e suas respectivas
classificações) foi obtida pela razão entre a quantidade de material retido em cada peneira e a
79
quantidade total de solo da amostra, expressando-a em termos de diâmetro médio ponderado
(DMP), conforme descrito por Kemper & Chepil (1965) e Volk (2001), em unidades de mm.
(a)
(b)
Figura 3.14: Equipamento utilizado para os ensaios de agregados: a) aparato completo e b)
detalhe do solo submergido
3.7.10 Ensaios de Permeabilidade e Pluviometria
Nesta etapa da pesquisa buscou-se medir a concentração dos compostos da gasolina em
relação à profundidade e sua relação com pluviometria em diferentes estágios de
biorremediação. Para isso, foi adicionado ao solo (solo amolgado, seguindo as mesmas
características dos ensaios de biorremediação) a umidade necessária para que a amostra
80
chegasse aos 11% (80% de sua capacidade de campo). Então, o solo foi disposto em um tubo
de PVC (φ = 50mm x 250mm de altura, conforme a Figura 3.15), com densidade média de
11,2 kN/m
3
. A este tubo, era encaixado através de luvas, um outro tubo de mesmo diâmetro e
comprimento. A outra metade era preenchida pela mesma quantidade de solo úmido e
contaminada artificialmente com gasolina (25 mL/kg solo). Amostras das profundidades zero,
250 e 500mm eram coletadas nos tempos progressivos de zero, 3, 9 e 27 dias. Cada corpo de
prova era destruído após a coleta, todas feitas em triplicatas. Da mesma forma, outros ensaios
foram realizados, porém com pluviometria controlada de 25, 50 e 100mm. A simulação da
pluviometria foi feita através da colocação da água no espaço de 1cm deixado no topo dos
tubos. Adicionava-se cuidadosamente todo o volume calculado (25, 50 e 100mm) aos poucos,
considerando-se a permeabilidade da água no solo. Nestes ensaios, objetivou-se também
coletar o lixiviado após o tempo necessário para a saída do percolado do solo. Havia,
portanto, a possibilidade de se controlar a drenagem. Os ensaios foram realizados todos nos
mesmos tempos dos ensaios sem pluviometria, de forma a se comparar os resultados. Todas
as amostras coletadas foram analisadas por cromatografia gasosa. A Figura 3.15b mostra um
esquema dos ensaios, com suas condições de contorno.
(a) (b)
Figura 3.15: a) visão geral dos tubos utilizados nos ensaios de permeabilidade e pluviometria;
b) esquema dos ensaios com suas condições de contorno
81
3.7.11 Caracterização do Solo em Relação a Metais Pesados
A presente pesquisa verificou a presença de metais pesados no lodo e no solo no início do
período de ensaios. Novas análises de todos os solos tratados foram feitas ao final dos ensaios
(180 dias). Os metais em estudo foram o cádmio, cromo, níquel, chumbo e mercúrio. O
cádmio, cromo, níquel e chumbo foram medidos conforme o método proposto pelo EPA
3050/EAA – chama. O mercúrio foi medido pelo método de oxidação úmida/vapor frio.
3.8 ENSAIOS DE TOXICIDADE E LESÃO CELULAR
Para se analisar os efeitos da toxicidade dos químicos da gasolina, animais da espécie Rattus
norvergicus, também conhecidos como ratos Wistar foram utilizados no estudo experimental
(Figura 3.16). Os animais provinham do biotério da Faculdade de Biociências da PUCRS.
Assim como em estudos realizados no campo da medicina, um mínimo de 6 animais eram
submetidos aos testes. Em uma sala com pouca ventilação (V = 64m
3
, com uma abertura de
0,20 m
2
), 6 gaiolas metabólicas foram dispostas ao redor de um recipiente contendo 4kg de
solo contaminado com gasolina (25mL/kg)(Figura 3.17) e isoladas por papel pardo de forma
que todos os voláteis passassem obrigatoriamente por cada gaiola. Buscou-se estudar os
efeitos da exposição aos gases voláteis durante o período de biorremediação na pior condição,
ou seja, sem qualquer composto bioestimulante. A partir de dados obtidos nas outras etapas
desta pesquisa, observou-se que os compostos benzeno e tolueno não estavam mais presentes
no solo já nos primeiros dias do processo e as frações aromáticas decaiam à metade em
aproximadamente 15 dias. Então buscou-se um estudo que abrangesse este conhecimento,
dispondo os animais em 3 diferentes grupos, passando por diferentes tempos de exposição ao
contaminante. Tentou-se verificar um possível efeito cumulativo. Os grupos/tempos foram:
Tratamento: Nenhum (grupo controle)
A) Grupo A: 6 ratos, no ambiente não contaminado por 24h;
Tratamento: Solo + Gasolina
B) Grupo B: 18 ratos, trocados de 6 em 6 a cada 24h (3 dias de experimento);
C) Grupo C: 6 ratos, retirados do ambiente contaminado em 24h, para “trocas
gasosas” e alimentação, e reintroduzindo-os após 1h (48h totais);
82
Figura 3.16: Rattus norvergicus utilizados na pesquisa
Figura 3.17: Disposição dos animais ao redor do solo contaminado com gasolina (25mL/kg)
Após a exposição ao contaminante pelo período indicado, os animais eram anestesiados com
tiopental e sacrificados através de decaptação. Os fatores em estudo foram o hemograma e as
plaquetas, creatinina sérica e urinária, uréia sérica e urinária, aspartato aminotransferase
(AST), alanina aminotransferase (ALT), gama glutamil transferase (γGT), fosfatase alcalina,
proteínas totais do sangue e macerados e proteinúria, sódio, potássio, glicose e desidrogenase
83
láctea (LDH), creatinoquinase (CPK) e frações (CPK-MB), troponina “I” e cálcio total. A
medula óssea foi analisada por histologia, assim como um dos rins e um pulmão (lâminas
coradas por Hematoxilina-Eosina); além disso, foram realizados ensaios de condutividade
elétrica e pH do outro rim, do pulmão, do sangue e da urina.
3.8.1 Hemograma e Plaquetas
O hemograma e a contagem de plaquetas foi realizada em um analisador eletrônico Coulter
modelo STKS, que efetua a contagem e as diferenciações celulares integrando 3 medidas:
volume (por impedância), condutividade (por rádio-freqüência) e dispersão do raio laser
(Scatter). O aparelho pode medir o sangue total em um tubo de ensaio contendo
antigoagulante (EDTA). Os controles fornecidos pela Coulter são atualizados mensalmente.
Após colhido, o sangue era imediatamente introduzido no tubo de ensaio contendo EDTA e
levado ao aparelho.
Os critérios de rejeição da amostra são amostras lipêmicas, coaguladas, hemolisadas e com
volume abaixo ou acima da marca. Para fins de cálculos, estes são realizados
automaticamente pelo aparelho (específico para eritrograma e leucograma respectivamente).
O equipamento tem como valores críticos o hematócrito menor que 15%, hemoglobina igual
ou menor que 4,5 g/dL, a CHCM (concentração da hemoglobina corpuscular média) deve
estar entre 28 a 35%, que é o limite da saturação, leucograma com valores inferiores a
1500/µL e plaquetas menor que 20.000/µL. Quanto a linearidade e limites de detecção, no
caso do leucograma, os valores ficam alterados pela presença de interferentes na amostra.
Contagem de leucócitos muito elevadas devem ser diluídas. Presença de eritroblastos
(hemácias nucleadas) devem ser descontadas do número de leucócitos.
84
3.8.2 Dosagem da Creatinina e Uréia Sérica e Urinária, AST, ALT, γGT,
Fosfatase Alcalina, Proteínas Totais e Proteinúria, Sódio, Potássio, Glicose,
LDH, CPK, CPK-MB, Troponina “I” e Cálcio Total
O sangue, após retirado dos animais, era centrifugado por 10 minutos a 3.000 rpm. O mesmo
procedimento foi feito com a urina. Então, 1,5mL do sobrenadante eram retirados e inseridos
em um tubo de ensaio plástico, descartável, de 5mL de volume. Os tubos contendo as
amostras eram centrifugados novamente por mais 6 minutos a 3.000 rpm quando então eram
acondicionados em um equipamento de análises automatizado Bayer ADVIA® 1650 (Figura
3.18) com capacidade de realizar 1650 testes/hora. Inicialmente, o equipamento pré-dilui
automaticamente todas as amostras a 1:5 (30 µL amostra + 120 µL solução salina), gerando
15 resultados em média (amostras variam em volume de 2 a 30 µL, sendo que o sistema
utiliza em média 2-3 µL por teste). O fotômetro interno tem a possibilidade de medir 14
comprimentos de onda fixos (340, 410, 451, 478, 505, 545, 571, 596, 658, 694, 751, 805, 845
e 884 µm). Todas as amostras são automaticamente corrigidas com um branco.
1. Amostrador; 2. Reagentes; 3. Probe de amostragem automático; 4. Capacidade livre do sistema (100 canais,
sendo 62 disponíveis para aplicações definidas pelo usuário); 5. Sistema óptico; 6. ADVIA 1650 Universal Rack
Handler (dispositivo automático de carregamento e descarregamento), Bayer (2004).
Figura 3.18: Equipamento utilizado para medir parâmetros no sangue, urina e proteínas dos
rins e pulmões dos animais
85
3.8.3 Histologia da Medula Óssea, dos Rins e dos Pulmões
Ao final do período de ensaio destinado para cada grupo, a medula óssea, um dos rins e um
dos pulmões de cada animal era retirado e acondicionado em um frasco com formalina para
fixação dos órgãos, de forma a evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes no interior
das células (autólise) ou por bactérias e para preservar a estrutura e composição molecular
(Junqueira e Carneiro, 2004).
Para obter secções delgadas com o micrótomo, após terem passado pela fixação, os
fragmentos de tecidos e órgãos devem ser infiltrados com substâncias que lhes proporcionem
uma consistência rígida (Junqueira e Carneiro, 2004). Para tanto, foi utilizada a parafina. O
processo de impregnar o tecidos com parafina é chamado inclusão ou embebição e foi
precedido por duas etapas: desidratação e clareamento. A água é inicialmente extraída
passando os fragmentos por diversos banhos de soluções de concentrações crescentes de
etanol em água (etanol 70% a 100%). Após a desidratação, o etanol presente nos fragmentos
foi substituído por uma substância intermediária miscível tanto em etanol como no meio da
inclusão, ou seja, o xilol. Quando os fragmentos de tecidos são embebidos e satarados com o
solvente orgânico, eles ficam transparentes ou translúcidos. A seguir eram colocados em
parafina previamente derretida em uma estufa a 60ºC. O calor causa a evaporação do solvente
e os espaços existentes dentro dos tecidos são preenchidos com parafina. O tecido embebido
em parafina se torna rígido depois de ter sido tirado da estufa (Junqueira e Carneiro, 2004).
Os blocos rígidos que continham os tecidos eram então levados a um micrótomo, onde eram
seccionados por uma lâmina de aço de modo a fornecer cortes de 1-10 µm de espessura. Após
serem seccionados, os cortes eram colocados para flutuar sobre uma superfície de água
aquecida, de onde eram colocados sobre lâminas de vidro, onde aderem e onde eram
posteriormente corados. Conforme Junqueira e Carneiro (2004), a seletividade com que os
corantes coram os componentes dos tecidos pode ser maior ou menor. A maioria dos corantes
se comporta como compostos ácidos ou básicos, e tende a formar ligações eletrostáticas
(salinas) com radicais ionizados dos tecidos. Os componentes dos tecidos que se coram bem
com corantes básicos são chamados de basófilos, e os que têm grande afinidade por corantes
ácidos são chamados de acidófilos. O azul de toluidina e o azul de metileno são exemplos de
corantes básicos. A hematoxilina comporta-se como um corante básico, ligando-se às
86
estruturas basófilas dos tecidos. Os principais componentes dos tecidos que ionizam e reagem
com corantes básicos o fazem por conter ácidos na sua composição - ácidos nucléicos,
glicosaminoglicanas e glicoproteínas ácidas. Corantes ácidos (por exemplo, orange G, eosina,
fucsina ácida) coram principalmente os componentes acidófilos dos tecidos, como as
mitocôndrias, os grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno (Junqueira e
Carneiro, 2004).
No presente trabalho foi utilizada a combinação de hematoxilina e eosina (HE). A
hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo das células e outras estruturas ácidas (como
porções do citoplasma ricas em RNA e a matriz da cartilagem hialina). A eosina, por outro
lado, cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa (Junqueira e Carneiro, 2004). Pronta a
lâmina, esta era analisada por microscopia óptica (Fiore, 1997; Vegue, 1999).
No caso das medulas ósseas, o processo iniciava pela desmineralização das peças. A solução
corrosiva era feita em duas partes, uma contendo 100mL de HCl a 38% e 400mL de H
2
O
destilada, e a outra contendo 100mL de H
2
NO
3
a 65% e 400mL de H
2
O destilada,
posteriormente unidas em uma única solução de 1000mL. As peças de medulas eram
introduzidas nesta solução por 1h para que ocorresse o processo de desmineralização, quando
então seguiam a rotina anteriormente descrita (impregnação, secção e coloração).
3.8.4 Condutividade Elétrica e pH
Neste trabalho, tentou-se verificar a aplicação de medidas de pH e condutividade elétrica a
fim de identificar células patológicas de rins, pulmão e sangue, além da urina de animais
submetidos a uma atmosfera tóxica de um solo contaminado artificialmente com gasolina, na
concentração de 25mL/kg de solo, por um período mínimo de 24h. Tentou-se correlacionar
estes valores a estados fisiológicos dos animais. A metodologia utilizada na medição da
condutividade elétrica celular não é padronizada para uso em tecidos, sendo este passo inicial
dado na presente pesquisa. Serão necessários novos trabalhos futuros, identificando alterações
deste parâmetro com relação ao tempo, temperatura, etc.
87
3.8.4.1 Condutividade Elétrica e pH Renal e Pulmonar
Enquanto um rim e um pulmão do animal eram enviados à patologia, o outro era pesado e
macerado (Figura 3.19.) com igual peso em água e, então, adicionado em 20mL de água
destilada-deionizada (volume mínimo necessário para que fosse possível a leitura pelo
equipamento) e homogeneizado com um bastão de vidro. O conjunto era selado com
Parafilm© e deixado em um laborátorio com umidade do ar e temperatura controlada (20ºC)
aclimatando-se por 6h. A condutividade elétrica e o pH do conjunto foram medidos com um
condutivímetro Digimed DM31 e um pHmetro DM20 da mesma marca no sobrenadante. Uma
visão geral dos equipamentos utilizados nos ensaios de condutividade elétrica e pH pode ser
vista na Figura 3.20.
Figura 3.19: Visão geral da maceração dos órgãos dos animais
Figura 3.20: Ensaios de condutividade elétrica e pH
88
3.8.4.2 Condutividade Elétrica e pH do Sangue e da Urina
Após a coleta do sangue e da urina, estes eram acondicionados (5mL) em um tubo de ensaio,
vedado com Parafilm©, e levados a uma centrífuga Eppendorff por 10 minutos a uma rotação
de 3.000 rpm. O sobrenadante da urina (1mL) e do sangue (100µL ou 0,1mL) eram retirados e
dispostos em um copo de Becker, onde se adicionava 19mL e 19,9mL de água destilada e
deionizada, à urina e ao sangue, respectivamente. Os 20mL eram selados pelo Parafilm©,
aclimatados a 20ºC por 6h e medidas a sua condutividade elétrica e pH pelos mesmos
equipamentos descritos no item anterior.
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística dos dados foi feita através do programa SPSS para Windows v.11. Foi
realizada inicialmente uma análise descritiva e um Teste de Homogeneidade de Variância de
Levene. Quando os dados eram considerados homogêneos, era realizado o Teste de ANOVA,
seguido do Teste de Post Hoc de Tukey ou Bonferroni. O Teste de ANOVA compara a
hipótese nula H
0
:
µ
1
=
µ
2
= .... =
µ
k
, em que k é o número de grupos experimentais ou
amostras, fazendo uma análise de variâncias (Zar, 1999). Conforme o autor, problemas de
comparação múltipla têm recebido atenção na literatura estatística e não há um acordo de qual
o melhor teste para ser rotineiramente empregado. O teste de Tukey, o mais amplamente
aceito e comumente utilizado, era aplicado aos ensaios de solo e o de Bonferroni, mais
comumente utilizado na área médica, aos dos ratos. Os testes consideram a hipótese nula H
0
:
µ
B
=
µ
A
versus a hipótese alternativa H
A
:
µ
B
≠
µ
A
. A significância estatística foi considerada
com P<0,05. Quando os dados não eram homogêneos, uma análise de variância não-
paramétrica era aplicada com o Teste de Kruskal-Wallis, especialmente preferível quando a
amostra não apresenta populações normais, podendo ser aplicável quando as variâncias das
populações são heterogêneas (Krutchkoff, 1988; Zar, 1999). No caso do teste de Kruskal-
Wallis mostrar P>0,05, considerava-se o teste de ANOVA e, caso contrário, aplicava-se o
teste de Mann-Whitney. Em uma pequena parcela das amostras, nas quais as diferenças entre
os grupos eram grandes, nem os testes de Levene/ANOVA e nem os testes de Kruskal-Wallis/
Mann-Whitney puderam ser aplicados, utilizou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov.
CAPÍTULO 4 – RESULTADOS
4.1 ENSAIOS DE BIORREMEDIAÇÃO EM ARENITO BOTUCATU
Neste capítulo são discutidos os resultados obtidos por cada uma das técnicas aplicadas na
pesquisa. Ao final deste bloco será analisado o conjunto dos dados de forma a se entender
todo o processo que envolve a biorremediação. Inicialmente são apresentados os dados
obtidos nos testes piloto, que abrangem o estudo de diesel e gasolina com álcool num período
de 170 dias, com avaliação da microbiologia pelo método da lâmina enterrada.
Posteriormente, modificou-se o método para a quantificação dos microrganismos por
contagem direta em Placas de Petri, e prolongou-se em mais 43 dias o tempo de observação
do CO
2
para se observar melhor a estabilização das curvas. Na segunda etapa, como já
discutido anteriormente, utilizou-se somente a gasolina da REFAP, sem álcool, como fonte de
contaminação.
4.1.1 Liberação de CO
2
No teste piloto, a evolução do CO
2
foi acompanhada por um período de 170 dias, tempo
considerado necessário para a obtenção da estabilização das curvas de CO
2
vistas na Figura
4.1. A quantificação do CO
2
representada pelas curvas pode ser analisada sobre quatro
diferentes categorias: (a) solo controle; (b) solo com contaminantes (gasolina e diesel) e
gasolina com a adição de NPK; (c) solo com lodo e suas adições à gasolina com e sem NPK;
(d) solo com lodo e diesel. Todos os tratamentos foram sistematicamente comparados ao solo
sem tratamento (controle). Os pontos inseridos nas figuras representam uma média de cinco
repetições realizadas de forma a se verificar a reprodutibilidade, que nestes casos não
mostraram praticamente nenhuma dispersão. A incorporação de gasolina e diesel ao solo com
e sem adições produziu alterações na evolução cumulativa de CO
2
quando comparada ao solo
controle. Os valores da ordem de 100 a 200 mg/kg de CO
2
medidos nas amostras controle são
relativamente baixos quando comparados a outros valores de CO
2
de solos utilizados para fins
agrícolas. Testes estatísticos foram aplicados aos 7, 14, 28, 60, 90 e 170 dias do início do
90
experimento para verificar a partir de que momento as diferenças entre os tratamentos foram
significativas.
A adição de NPK ao solo contaminado com gasolina não produziu alterações substanciais nos
padrões observados até 60 dias, quando então tratamento com bioestimulante passou a se
tornar significativo (P=0,008). A bioestimulação com NPK à gasolina não apresentou
significância estatística para contaminações puras com diesel (P>0.05) mesmo ao final dos
170 dias, apresentando, entretanto, significância quando comparadas ao controle (P=0,008).
A adição do lodo ao solo produziu uma significativa quantidade de CO
2
, principalmente por
ser um material rico em carbono (Tabela 3.2), que estimula a atividade microbiana e pode ser
uma importante fonte de (P=0,008 quando comparado ao controle, já desde o início do
tratamento). O mesmo comportamento pode ser visto quando o lodo é adicionado ao solo
contaminado com diesel e gasolina, mostrando um incremento da atividade microbiana
(evolução de CO
2
) quando comparadas com o solo contaminado sem adições. Aparentemente
o lodo elimina/compensa a adaptação inicial da população microbiana por ser uma fonte
prontamente disponível de carbono e energia, claramente observado na Figura 4.1a. A
“bioaugmentação” no diesel apresentou significância estatística (P<0,016) com todos os
tratamentos. Uma maior evolução de CO
2
nos tratamentos contendo lodo foi observada em
todos os experimentos, fator atribuído à disponibilidade de carbono que acaba por contribuir
para a geração de uma intensa atividade microbiana (Figuras 4.1a e 4.1b). Esta observação foi
posteriormente confirmada pela avaliação qualitativa pelo método da lâmina enterrada,
indicando que um aumento na evolução de CO
2
corresponde a um aumento da população
microbiana (Tabela 4.1). É também interessante ressaltar que a adição de NPK às amostras
contendo lodo não trouxeram qualquer benefício (P>0,05) ao processo de biorremediação já
que o lodo por si só contém todos os elementos necessários ao crescimento microbiano
(Figuras 4.1 e 4.2).
Enquanto a gasolina adicionada ao solo e sua bioestimulação com NPK começam a apresentar
diferença significativa do controle aos 60 dias, o diesel adicionado ao solo já apresenta esta
diferença aos 14 dias de tratamento, possivelmente pelo fato de não conter BTEX em sua
composição.
91
0
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
8.000
9.000
10.000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
Tempo (dias)
Evolução de CO
2
(mg.kg
-1
)
Solo Controle
Solo + Lodo
Solo + Diesel
Solo + Diesel + Lodo
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + Lodo
Solo + Gasolina + Lodo + NPK
Solo + Gasolina + NPK
(a)
0
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tempo (dias)
Evolução de CO
2
(mg.kg
-1
)
(b)
Figura 4.1: Liberação de CO
2
durante os testes preliminares: a) ao longo dos 170 dias e b)
visão expandida para 32 dias
92
0
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
8.000
9.000
10.000
Controle Solo +
Gasolina
Solo +
Gasolina +
NPK
Solo +
Diesel
Solo +
Lodo
Solo +
Lodo +
Gasolina
Solo +
Lodo +
Gasolina +
NPK
Solo +
Lodo +
Diesel
CO
2
Acumulado (mg.kg
-1
)
Figura 4.2: CO
2
total acumulado durante o período de ensaio preliminar (170 dias)
Na segunda etapa do trabalho, que envolveu apenas experimentos com gasolina da REFAP, a
evolução do CO
2
foi acompanhada por um período de 213 dias (Figuras 4.3 e 4.4). A
quantificação do CO
2
desta etapa representada pelas curvas das Figuras 4.3a e 4.3b pode ser
analisada sobre cinco diferentes categorias: (a) solo controle; (b) solo com gasolina; (c) solo
com gasolina e NPK; (d) solo com lodo e gasolina com e sem NPK; (e) solo com lodo. Todos
os tratamentos foram sistematicamente comparados ao solo sem tratamento (controle). Os
pontos inseridos nas figuras representam uma média de três replicatas realizadas de forma a
se verificar a repetibilidade, que nestes casos também não mostraram praticamente nenhuma
dispersão. A incorporação de gasolina ao solo com e sem adições produziu alterações na
evolução cumulativa de CO
2
quando comparada ao solo controle. Testes estatísticos foram
aplicados aos 7, 14, 28, 60, 90 e 170 dias do início do experimento.
A adição de NPK ao solo contaminado com gasolina não produziu alterações substanciais nos
padrões observados até 60 dias, quando então tratamento com bioestimulante passou a se
tornar significativo (P=0,009), de forma similar ao teste piloto, no qual se utilizou a gasolina
de posto de combustível . Entretanto, o tratamento de gasolina e solo (“atenuação natural”)
apresentou diferença estatisticamente significativa para o controle apenas aos 170 dias.
93
0
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
4.500
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
Tempo (dias)
Evolução de CO
2
(mg.kg
-1
)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Lodo + Gasolina
Solo + Lodo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + NPK
(a)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1.000
0 2 4 6 8 101214161820222426283032
Tempo (dias)
Evolução de CO
2
(mg.kg
-1
)
(b)
Figura 4.3: Liberação de CO
2
dos ensaios de biorremediação com a gasolina da REFAP: a) ao
longo dos 220 dias e b) visão expandida para 32 dias
94
0
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
4.500
Controle Solo + Lodo Solo + Lodo +
Gasolina
Solo + Lodo +
Gasolina +
NPK
Solo +
Gasolina
Solo +
Gasolina +
NPK
Total CO2 (mg.kg-1)
Figura 4.4: Liberação de CO
2
total acumulado durante o período de ensaio (213 dias)
A adição do lodo ao solo produziu uma significativa quantidade de CO
2
(P<0,001 quando
comparado ao controle, já desde o início do tratamento). O mesmo comportamento pode ser
visto quando o lodo é adicionado ao solo contaminado com gasolina (25mL/kg de solo,
P<0,001)(Figura 4.3a e 4.3b). A discussão da importância do lodo na adaptação inicial da
população microbiana já foi introduzida anteriormente. Da mesma forma que ocorreu nos
testes piloto, nesta etapa envolvendo a gasolina da REFAP, a adição de NPK às amostras
contendo lodo não trouxeram qualquer benefício (P>0,05) ao processo de biorremediação já
que o lodo por si só contém todos os elementos necessários ao crescimento microbiano
(Figuras 4.3 e 4.4).
Um outro fator interessante é a diferença de comportamento dos tratamentos no início do
processo de biorremediação vistos na Figura 4.3b. O lodo já inicia com uma atividade maior,
enquanto a adição da gasolina com e sem NPK ao lodo parece inciar o processo aos 4 dias. O
solo com gasolina com e sem NPK inicia a evolução do CO
2
aos 7 dias, sendo que apenas aos
10 dias o NPK parece fazer algum efeito no tratamento.
A Figura 4.5 mostra uma comparação entre os lodos utilizados na pesquisa. Como já visto e
discutido anteriormente, o lodo coletado em diferentes tempos apresenta diferentes
95
composições quimícas (Tabela 3.2). Aos 7 dias do início do experimento já há uma diferença
estatisticamente significativa (P<0,001) que se mantém até o final dos experimentos. Apesar
de terem diferentes composições químicas e liberarem quantidades distintas de CO
2
, os lodos
apresentam o mesmo comportamento. O solo controle mostra diferenças significativas na
liberação de CO
2
até o 14º dia, talvez devido à população microbiana e ao nitrogênio mineral
do solo (discutido adiante), temperatura, período de coleta, etc. Durante o período de
realização da pesquisa foram feitas duas coletas de solo, uma primeira para os testes
preliminares com a gasolina de posto de combustível (com álcool) e uma segunda para os
testes com a gasolina da REFAP (sem álcool). E isso é importante, uma vez que a
armazenagem do solo pode modificar sua composição microbiológica (Alef e Nannipieri
1995). Por este motivo, o solo é o mesmo físico-quimicamente, identificado por Spinelli et al.
(2005), porém a concentração do nitrogênio mineral pode ser diferente, devido a processos
naturais de mineralização e lixiviação ocorridos na natureza (Alexander 1994, Paul e Clark
1996 e Selbach e Camargo 2001). A partir do 28º dia, entretanto, os solos não apresentaram
diferenças estatisticamente significativas (P>0,05).
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
Tempo (dias)
CO
2
Acumulado (mg.kg
-1
)
Controle (170 dias)
Controle (213 dias)
Solo + Lodo (170 dias)
Solo + Lodo (213 dias)
Figura 4.5: Evolução de CO
2
comparativa entre os dois lodos utilizados
96
Por fim, comparou-se o CO
2
acumulado das duas gasolinas utilizadas na pesquisa (Figuras 4.6
e 4.7). A atividade microbiana medida através da liberação de CO
2
não apresentou diferenças
significativas (P>0,05) ao final do período de tratamento para as gasolinas utilizadas (posto
de combustível e REFAP). Em todas as amostras contendo NPK observou-se um incremento
na atividade microbiana do solo (Figura 4.6). O fertilizante mineral, como já observado em
outros trabalhos (Alexander 1994, Paul e Clark 1996; Spinelli et al. 2005), apresenta uma
importante função pela eliminação de fatores limitantes da atividade microbiana. A resposta
da bioestimulação, através da adição de nutrientes é significativa quando comparamos as
gasolinas com e sem o NPK (P=0,032 para a do posto de combustível e P=0,002 para a da
REFAP), e mais ainda quando comparamos os níveis de CO
2
liberado destes tratamentos com
o do controle (P<0,001). Na Figura 4.7 é apresentado o CO
2
total evoluído ao longo do
período, mostrando as semelhanças de comportamento entre as gasolinas do posto de
combustível e a da REFAP.
0
100
200
300
400
500
600
700
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
Tempo (Dias)
Evolução de CO
2
(mg.kg
-1
)
Controle
Solo + Gasolina (REFAP)
Solo + Gasolina (Posto)
Solo + Gasolina + NPK (REFAP)
Solo + Gasolina + NPK (Posto)
Figura 4.6: Liberação de CO
2
comparativa entre a gasolina de posto de combustível (com
álcool) e a gasolina da REFAP (sem álcool)
97
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
Controle Solo + Gasolina
(REFAP)
Solo + Gasolina
(Posto)
Solo + Gasolina +
NPK (REFAP)
Solo + Gasolina +
NPK (Posto)
CO
2
Total (mg.kg
-1
)
Figura 4.7: Comparativo entre o CO
2
total das gasolinas utilizadas na pesquisa
4.1.2 Avaliação da População do Solo pelo Método da Lâmina Enterrada (Rossi-
Cholodny)
Nos testes preliminares, os microrganismos do solo foram caracterizados qualitativamente
através do método da lâmina enterrada, e observados com microscopia óptica, 90 dias após o
início do experimento. Assim como ocorreu com a avaliação do CO
2
, importantes obser-
vações recaem novamente sobre as adições contendo lodo (Tabelas 4.1). Como já mencionado
anteriormente, o lodo é rico em carbono e nutrientes essenciais, necessário aos
microrganismos do solo para o seu crescimento. Este fato pode ser observado na Tabela 4.1
para os tratamentos onde as adições de lodo ao solo aumentaram a ocorrência de fungos,
actinomicetos e bactérias. Nas amostras contaminadas com gasolina e diesel sem adições, não
houve a ocorrência de fungos, encontraram-se apenas alguns actinomicetos (nenhum na
gasolina) e uma pequena quantidade de bactérias. A abundância de bactérias no solo foi
estimada pela contagem de células nos diversos campos da microscopia óptica nas lâminas
enterradas, enquanto os fungos e actinomicetos pela sua presença macroscópica nas lâminas.
Observando a Tabela 4.1 e a Figura 4.8 é possível identificar a alta abundância dos fungos
(principalmente nos tratamentos com lodo) e actinomicetos nas lâminas de solo contaminado
98
onde o lodo e o fertilizante mineral foram incorporados. Amostras de solo sem adições
mostram diferentes tipos de microrganismos. A adição de lodo produz um aumento
significativo da atividade microbiana, a qual é mantida até mesmo após a adição dos
contaminantes. Uma vez que o procedimento aqui utilizado não quantifica os microrganismos
no solo, ao mesmo tempo tem sua importância para fornecer uma idéa da abundância dos
microrganismos nos solos em teste.
Tabela 4.1. Número de microrganismos avaliados pelo método da lâmina enterrada
Tratamentos Bactérias/campo Fungos/lâmin
a
Actinomicetos/lâmina
Solo Controle 50 a 100 < 5 < 5
Solo + Lodo > 100 > 10 > 10
Solo + Gasolina 10 a 50 N.O. N.O.
Solo + Gasolina + Lodo > 100 5 a 10 5 a 10
Solo + Gasolina + Lodo + NPK > 100 5 a 10 > 10
Solo + Gasolina + NPK 50 a 100 N.O. N.O.
Solo + Diesel 10 a 50 N.O. < 5
Solo + Diesel + Lodo > 100 5 a 10 5 a 10
Nota: N.O.= não observados
4.1.3 Quantificação Microbiana: Bactérias e Fungos
A Figura 4.9 mostra a contagem de fungos realizada durante a segunda etapa de testes (180
dias) para a gasolina da REFAP. É possível identificar uma queda inicial do número de
fungos em todos os tratamentos realizados devido ao novo ambiente (umidade, temperatura,
aeração, etc). No solo natural (controle) e no tratamento com lodo há um rápido crescimento
dos fungos. Em torno do 16º dia do início do experimento, há uma estagnação no crescimento
em função de fatores limitantes e, no caso do solo controle, há uma queda no número de
microrganismos até sua estabilização nos patamares do solo “inicial”. O lodo, por apresentar
99
muita matéria orgânica/nutrientes, e sendo também uma fonte de “bioaugmentação”, mantém
um grande número de fungos.
Figura 4.8: Resultados observados nos testes com lâmina enterrada. A e B são,
respectivamente, aumentos de 100x e 400x. 1) Solo Controle; 2) Solo + Lodo; 3) Solo +
Gasolina; 4) Solo + Gasolina + Lodo; 5) Solo + Diesel; 6) Solo + Diesel + Lodo
Nos solos contendo gasolina há uma grande queda inicial do número de fungos (Figura 4.9).
Após uma estabilização inicial (16º dia) há um aumento no número de fungos nos tratamentos
contendo lodo, sendo que este ultrapassa a quantidade dos microrganismos do solo controle
tanto nos tratamentos com gasolina + lodo como nos com gasolina + lodo + NPK. Quando
comparamos estes tratamentos ao solo com lodo, observamos um efeito deletério nos fungos
efetivado pela gasolina. Entretanto, as condições finais do solo parecem ser boas quando
comparamos ao solo controle, mostrando que a aplicação de um meio orgânico beneficiaria o
solo em um derrame de gasolina no que diz respeito aos fungos. No caso dos tratamentos com
solo e gasolina, e nos casos com bioestimulação com NPK, há a mesma queda no número de
fungos inicialmente (como nos casos com lodo e gasolina com e sem NPK), porém
necessitando de um maior tempo para a aclimatação da população fúngica. O número de
fungos voltou praticamente ao normal (semelhante ao controle) aos 120 dias de tratamento no
caso com bioestimulação e fica um pouco inferior ao controle no caso da “atenuação natural”.
100
0
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
Tempo (dias)
Contagem de Fungos (log UFC)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Lodo + Gasolina
Solo + Lodo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + NPK
7
6
5
4
3
2
1
0
Figura 4.9: Contagem de fungos ao longo do período de observação
A Figura 4.10 apresenta a contagem de bactérias ao longo do período de 180 dias. Observa-se
um rápido crescimento de bactérias no solo controle e no tratamento com lodo já ao início do
período dos ensaios, atingindo valores praticamente constantes. Nos solos com gasolina há
uma queda no número de bactérias em relação à contagem inicial que se recupera entre 4 e 16
dias dependendo do tratamento. O tratamento com gasolina e NPK apresenta uma
estabilização desde o início do tratamento, com um processo de biorremediação mais intenso,
eliminando os BTEX mais rapidamente (como veremos adiante no item de cromatografia) e,
consequentemente, mantendo a concentração de bactérias. O tratamento apenas com gasolina
mostra uma queda na contagem de bactérias que perdura por até 10 dias e, então, inicia sua
recuperação. Maiores quantidades de matéria orgânica retém os BTEX por um maior período
de tempo, apesar deste tempo não ser muito significativo (em torno de 6 dias, ver item de
cromatografia), justificando a maior queda no número de bactérias no início do tratamento,
porém com melhor recuperação a posteriori pelos mesmos motivos.
A avaliação de bactérias degradadoras de gasolina, analisada pelo número mais provável, não
mostrou qualquer quantidade de microrganismos crescendo nos meios de cultura. Conforme
Frankenberger (1992), qualquer solo sem histórico de contaminação apresenta uma relação de
microrganismos degradadores específicos / totais menor que 3%, confirmando os achados.
101
0
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
100000000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180
Tempo (dias)
Contagem de Bactérias (log UFC)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Lodo + Gasolina
Solo + Lodo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + NPK
33
8
7
6
5
2
1
0
4
3
Figura 4.10: Contagem de bactérias ao longo do período de observação
4.1.4 Identificação de Microrganismos
Durante o período de ensaios foram realizados testes complementares visando a identificação
dos microrganismos do solo. As bactérias não identificadas por testes bioquímicos
comercialmente utilizados em análises clínicas foram genericamente classificadas por Gram e
morfologia. Os resultados da identificação dos microrganismos são apresentados na Tabela
4.2. A Pseudomonas sp. foi encontrada em todas as amostras de solo tratado, sendo observada
inicialmente no solo natural (controle). O Aspergillus sp., espécie natural do solo, não foi
encontrado de maneira significativa nas amostras de solo coletadas após a introdução dos
contaminantes ou mesmo estimulantes. Na análise do lodo, foi possível a observação de um
rico consórcio de microrganismos, uma vez que este contém muita matéria orgânica, além de
Penicillium sp. e diversos tipos de bacilos gram-positivos. A gasolina proveniente da REFAP
continha Pseudomonas sp. Combinações de gasolina e diesel com solo, especialmente na
“atenuação natural”, aparentemente eliminaram alguns microrganismos, principalmente nos
primeiros dias e, especialmente, os fungos, talvez devido a fatores limitantes e competição. A
102
observação não é aplicável quando consideramos a bioestimulação e a “bioaugmentação”.
Deve-se ressaltar que os kits utilizados não contemplam microrganismos de solos.
Tabela 4.2: Microrganismos encontrados no lodo puro e no solo sob diferentes tratamentos ao
final dos ensaios
Solo Controle Pseudomonas sp., Aspergillus sp.,
Penicillium sp.
Solo + Lodo Pseudomonas sp., Bacilos Gram+ ,
Penicillium sp.
Solo + Gasolina Pseudomonas sp., Bacilos Gram+
Solo + Gasolina + Lodo Pseudomonas sp., Bacilos Gram+ ,
Penicillium sp.
Solo + Gasolina + Lodo + NPK Pseudomonas sp., Bacilos Gram+,
Penicillium sp.
Solo + Gasolina + NPK Pseudomonas sp., Bacilos Gram+,
Penicillium sp.
Solo + Diesel Pseudomonas sp., Bacilos Gram+
Penicillium sp.
Solo + Diesel + Lodo Pseudomonas sp., Bacilos Gram+,
Penicillium sp.
Lodo “in natura” Bacilos Gram+ , Penicillium sp.
4.1.5 Condutividade Elétrica e pH do Solo
Inicialmente, nos testes piloto, não foi considerada a condutividade elétrica do solo, passando
a ser avaliada somente nos ensaios com gasolina sem álcool. Serão analisados primeiro os
testes piloto, que envolveram a gasolina e o diesel de um posto de combustíveis.
103
O pH do solo, como fator limitante aos microrganismos, é um importante parâmetro a ser
monitorado. Apesar do fato de muitas espécies poderem sobreviver em pHs extremos, a
maioria dos microrganismos requer um ambiente neutro. O solo “in natura” e o lodo
utilizados apresentam pHs médios de 4.5 e 5.0, respectivamente. Matematicamente pode ser
observada significância estatística em alguns testes (P<0,05). Entretanto, por estas variações
serem extremamente pequenas entre os grupos quando se trata de pH (∆pH com
aproximadamente 0,4), e por haver alguma oscilação em suas medidas da mesma ordem de
grandeza, considerou-se que a adição dos contaminantes ao solo não produziu variação
significativa de pH para fins práticos, com valores em 65 e 95 dias de tratamento na faixa de
4.5 a 5.0 sem qualquer tendência específica de aumento ou diminuição com o tempo (Figura
4.11). Aparentemente a capacidade de cargas do solo e das misturas contendo lodo
mantiveram o pH durante o período dos experimentos. Snyder et al. (1976), citado por
Frankenberger (1992), considerou que sob biodegradação de óleos, muito pouca variação de
pH no solo ocorre com o tempo. A análise do pH a princípio, baseada nos testes piloto e nos
tempos de medição efetuados, não traz qualquer informação fundamental para este estudo
exeto por mostrar que a biorremediação de solos pode ser efetiva até mesmo em ambientes
ácidos. Frankenberger (1992) relata que a variação de pH ideal para promover a
biodegradação de solos está na faixa do neutro para levemente alcalino. A maioria dos seus
estudos indicam que o pH de 7 a 8 é o ideal para a degradação de hidrocarbonetos. Entretanto,
neste trabalho, o pH do solo não foi corrigido durante os testes de laboratório, uma vez que se
esperava avaliar o pH no seu estado natural.
A análise do pH na segunda etapa dos ensaios, medida nos tempos 9, 44, 114 e 180 dias,
mostra que há uma tendência de queda ao final do período – acidificação (Figura 4.12) – para
praticamente todos os tratamentos. E este é um fato novo, uma vez que os ensaios anteriores
mostravam que não havia tendências de aumento ou queda. Entretanto, se analisarmos mais
cuidadosamente os resultados, veremos que as medidas de pH colhidas anteriormente (65 e 95
dias) estão sobrepostas às curvas da Figura 4.12. A acidificação do solo controle e dos
tratamentos com gasolina com e sem NPK parece iniciar em torno do 100º dia de tratamento.
É interessante observar que estes tratamentos apresentam um pH bastante próximo, com
variação de pH em torno de 0,1 ao final do tratamento (180 dias). Estatisticamente, os
tratamentos com lodo e gasolina com e sem NPK são os únicos que não apresentam diferença
estatística significativa (P>0,05) até os 180 dias. Entre 44 e 180 dias todos os demais
104
tratamentos apresentam diferença significativa, apesar de na prática isso significar uma
variação de pH de 0,3, dentro da faixa de oscilação do equipamento. Ao final do tratamento,
não há diferença significativa entre o solo controle e os tratamentos com gasolina com e sem
NPK (P>0,05), assim como entre os com lodo e gasolina com e sem NPK (P>0,05). A
variação de todos estes parâmetros é pequena e ocorre numa faixa menor que 1,0.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Solo
Controle
Solo +
Lodo
Solo +
Gasolina
Solo +
Diesel
Solo +
Gasolina +
Lodo
Solo +
Diesel +
Lodo
Solo +
Gasolina +
Lodo +
NPK
Solo +
Gasolina +
NPK
pH
pH aos 65 dias
pH aos 95 dias
Figura 4.11: Medidas de pH do solo aos 65 e 95 dias nos ensaios preliminares com gasolina e
óleo diesel provenientes de um posto de combustível
Nos ensaios realizados com a gasolina da REFAP procurou-se monitorar também a
condutividade elétrica do solo e suas variações durante o processo de biorremediação. A
contaminação por gasolina pura tende a manter estável a condutividade elétrica do solo ao
longo do período de biorremediação, e diminui com a adição de NPK (que possui maior
condutividade inicialmente), como se observa na Figura 4.13. No solo controle, ao contrário,
observa-se uma tendência natural de aumento da condutividade, em uma relação inversamente
proporcional ao pH, visto anteriormente. De forma geral, observa-se uma faixa de oscilação
de condutividade elétrica entre 20 e 40µS na qual faz parte o solo natural e o solo
contaminado por gasolina com e sem NPK em diferentes etapas de biorremediação.
Estatisticamente, não há qualquer diferença significativa entre o grupo controle e os
tratamentos com gasolina com e sem NPK para qualquer que seja o tempo de medição
105
(P>0,05). Este dado é importante, uma vez que se busca estudar solos contaminados através
de investigações de campo com o cone ambiental, no qual um dos parâmetros analisados é a
condutividade elétrica (Schnaid, 2000). Neste caso específico, e somente através deste
parâmetro, esta análise seria inviável.
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Tempo (dias)
pH
Controle
Solo + Lodo
Solo + Lodo + Gasolina
Solo + Lodo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.12: Medidas do pH do solo nos ensaios com gasolina sem álcool
No caso dos tratamentos com lodo, observa-se também uma tendência de aumento de
condutividade elétrica com o tempo, idem ao solo controle. Fato semelhante ocorre também
com o solo com lodo e gasolina. Quando consideramos o solo com lodo, gasolina e NPK
vemos que há uma relação inversa, ou seja, o NPK parece causar uma redução da
condutividade elétrica ao longo do tempo neste tratamento, principalmente nos primeiros 44
dias, mantendo-se então praticamente constante. Estatisticamente, não há qualquer diferença
significativa entre os tratamentos com lodo e gasolina com e sem NPK para qualquer que seja
o tempo de medição (P>0,05). Da mesma forma, o solo com lodo só apresenta diferença
significativa (P<0,001) no tempo 114 para os tratamentos com gasolina com e sem NPK.
106
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Tempo (dias)
Condutividade Elétrica (
µ
S)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Lodo + Gasolina
Solo + Lodo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.13: Medidas da condutividade elétrica nos ensaios com gasolina sem álcool
4.1.6 Nitrogênio Mineral do Solo
O nitrogênio mineral do solo é um fator importante que permite uma avaliação complementar
da atividade microbiana. O ensaio de nitrogênio inorgânico foi realizado aos 170 dias de
experimento com gasolina e diesel de postos de combustíveis e em dois momentos, aos 65 e
170 dias, para os testes com gasolina da REFAP. Nos ensaios com gasolina e diesel oriundos
do posto de combustível, as maiores taxas na forma de amônia ocorreram principalmente nos
tratamentos com a adição de nutrientes (lodo e NPK) com diferenças significativas quando
comparados às amostras controle (P<0,05), como ilustrado na Figura 4.14. E esta é uma
indicação de que a disponibilidade de nutrientes nestes tratamentos melhoram as condições da
atividade microbiana, podendo tornar mais eficaz os processos de biorremediação.
Nos ensaios com a gasolina da REFAP, agora mensurados em 65 e 170 dias (Figura 4.15),
observa-se basicamente o mesmo anteriormente avaliado, ou seja, as condições onde se
utilizou compostos orgânicos apresentam melhores condições de amônia ao final dos 170 dias
de tratamento (P<0,05), apesar de neste caso – gasolina da REFAP – o NPK não modificar a
107
condição final do nitrogênio mineral. A novidade desta análise está na avaliação do nitrogênio
mineral aos 65 dias de tratamento, não realizada nos ensaios piloto. O lodo puro apresenta as
melhores condições de nitrogênio mineral, principalmente com relação à amônia. É um
material rico em nutrientes, além de ter intensa atividade microbiana e não apresentar níveis
de contaminação. Quando adicionamos este a uma condição de vazamento de gasolinas,
observamos que os microrganismos necessitam muito da amônia nos primeiros momentos do
processo de biorremediação, não havendo então amônia em abundância como no lodo puro,
porém não havendo diferenças significativas para o solo controle (P<0,05).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Solo
Controle
Solo + Lodo Solo +
Gasolina
Solo +
Diesel
Solo +
Gasolina +
Lodo
Solo +
Diesel +
Lodo
Solo +
Gasolina +
Lodo + NPK
Solo +
Gasolina +
NPK
Nitrogênio Mineral (mg.kg
-1
)
NH4+
NO2-, NO3-
Figura 4.14: nitrogênio mineral do solo nos tratamentos com a gasolina de posto de
combustível (170 dias)
4.1.7 Cromatografia Gasosa
Nos testes piloto, com ensaios envolvendo gasolina com álcool, a cromatografia gasosa foi
aplicada a todos os tratamentos, incluindo o solo controle, somente aos 170 dias após feitas as
misturas, para confirmar a ausência de benzeno, tolueno, MTBE, C
8
e C
9+total
aromáticos de
todas as amostras de solo. A cromatografia obtida de todas as amostras de solo ao final dos
170 dias de tratamento não mostrou qualquer sinal de contaminação (todos os contaminantes
em concentração menor que 3 mg/kg).
108
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
Solo Controle Solo + Lodo Solo + Lodo +
Gasolina
Solo + Lodo +
Gasolina + NPK
Solo + Gasolina Solo + Gasolina
+ NPK
Nitrogênio Mineral (mg.kg
-1
)
NH4+ 65 dias
NO2-, NO3- 65 dias
NH4+ 170 dias
NO2-, NO3- 170 dias
Figura 4.15: nitrogênio mineral do solo nos tratamentos com a gasolina da REFAP aos 65 e
170 dias
A seguir, para a segunda etapa com a gasolina sem álcool, foi feita uma análise preliminar
com cromatografia gasosa em microcosmos estéreis e não-estéreis nos tempos zero, 12 e 26
dias para fins de verificação dos dos efeitos da microbiota nos compostos voláteis. Os testes
foram realizados apenas nos tratamentos com gasolina com e sem o NPK. De forma geral, os
dados obtidos mostram um significante efeito da microbiota (P<0,05) na biorremediação dos
hidrocarbonetos analisados. O solo controle, não apresentado nas figuras, não contem
qualquer nível de contaminação, observando-se os compostos analisados. As Figuras 4.16 e
4.17 apresentam as diferenças de comportamento ocorridas nos tratamentos do benzeno e
toluneno durante um período de 26 dias. Apesar da volatilização destes compostos ser intensa,
observa-se uma importante contribuição da microbiota, quando vemos que nos solos contendo
os microrganismos já não há mais estes hidrocarbonetos no tempo de aproximadamente 24h
do início dos experimentos. As medições não foram realizadas exatamente no tempo zero,
pois as misturas foram efetuadas ao redor do meio-dia e transportadas à Copesul, sendo
processadas na manhã do dia seguinte. Entretanto, quando consideramos o solo esterilizado,
ainda há uma quantia razoável no solo com bioestimulante e maior ainda na condição de
“atenuação natural”. Aos 12 dias de ensaio, só há benzeno no tratamento sem bioestimulação
e, no caso do tolueno, houve uma redução significativa na condição com NPK, sendo que
109
praticamente não houve redução no tratamento com “atenuação natural”. Os solos foram
inicialmente preparados em condições estéreis, e o fato do bioestimulante ter efeito nos
tratamentos esterilizados provavelmente ocorra por haver algum grau de contaminação do
solo por microrganismos na abertura dos potes, no início das medições, ou, ainda, por reação
química dos compostos, acelerando a saída dos voláteis.
A análise da Figura 4.18 mostra o mesmo padrão observado anteriormente para o benzeno e o
tolueno, com efeito importante da microbiota e com degradação / volatilização bem mais
intensa. No tempo zero, praticamente só o solo esterilizado na condição com gasolina pura
apresenta o contaminante MTBE. Aos doze dias, não encontramos mais este contaminante no
solo.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tempo (Dias)
Benzeno (mg.kg
-1
)
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina Esterilizada
Solo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina + NPK Esterilizado
Figura 4.16: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um bioestimulante (NPK)
em relação à esterilização do solo e efeitos da microbiologia para o Benzeno
110
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
0 2 4 6 8 10121416182022242628303234
Tempo (dias)
Tolueno (mg.kg
-1
)
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina Esterilizada
Solo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina + NPK Esterilizado
Figura 4.17: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um bioestimulante (NPK)
em relação à esterilização do solo e efeitos da microbiologia para o Tolueno
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0123456789101112
Tempo (dias)
MTBE (mg.kg
-1
)
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina Esterilizada
Solo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina + NPK Esterilizado
Figura 4.18: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um bioestimulante (NPK)
em relação à esterilização do solo e efeitos da microbiologia para o MTBE
111
A Figura 4.19 ilustra o comportamento do C
8
aromático do solo. Idem ao estudo feito
anteriormente para o benzeno e o tolueno, a microbiota ajuda a remover rapidamente este
hidrocarboneto já nas primeiras 24h. O fato novo desta figura consiste em haver um
incremento de C
8
aromáticos aos 12 dias de tratamento, provavelmente pelo desdobramento
de outros hidrocarbonetos em C
8
aromáticos ou muito similares nas curvas cromatográficas
durante sua degradação.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
0 2 4 6 8 10121416182022242628303234
Tempo (dias)
C
8
Aromáticos (mg.kg
-1
)
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina Esterilizada
Solo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina + NPK Esterilizado
Figura 4.19: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um bioestimulante (NPK)
em relação à esterilização do solo e efeitos da microbiologia para o C
8
aromático
A Figura 4.20 ilustra o comportamento do C
9+
aromático do solo. Ao contrário dos outros
componentes da gasolina, as frações C
9+
são mais difíceis de serem degradadas levando maior
período de tempo para removidas dos solos. Similar a análise feita para os C
8
aromáticos, há
também um incremento de C
9+
aromáticos aos 12 dias de tratamento provavelmente pelo
desdobramento de outros hidrocarbonetos em C
9+
aromáticos ou muito similares nas curvas
cromatográficas durante sua degradação. A bioestimulação novamente pode ser considerada
nos tratamentos esterilizados por contaminação das amostras durante procedimentos de
abertura dos frascos. Diferentemente das demais análises, os C
9+
aromáticos ainda perduraram
no solo após 26 dias.
112
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 2 4 6 8 10121416182022242628303234
Tempo (dias)
C
9+
Aromáticos (mg.kg
-1
)
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina Esterilizada
Solo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina + NPK Esterilizado
Figura 4.20: Curvas comparativas entre o solo com gasolina e com um bioestimulante (NPK)
em relação à esterilização do solo e efeitos da microbiologia para o C
9+
aromáticos
Nas Figuras 4.21 e 4.22 são ilustradas a biorremediação do benzeno e tolueno de todos os
tratamentos realizados nesta pesquisa. Nesta etapa, o solo não foi esterilizado, de forma a
simular uma situação mais próxima à encontrada na natureza e os tempos de medição foram
zero, 14, 22, 36 e 70 dias. A linha de base é o limite inferior de contaminação de 3mg/kg de
solo. A consideração mais importante a ser feita é o fato de o lodo industrial, importante fonte
de matéria orgânica, reter os hidrocarbonetos em sua matriz por um período maior de tempo.
A redução aos mesmos níveis encontrados para os demais tratamentos leva em torno de 6 dias
a mais para ocorrer, ficando ainda uma parcela residual até o 35º dia.
A Figura 4.23 apresenta as alterações na biorremediação do MTBE em relação ao tempo.
Observamos que o tratamento com bioestimulação é eficiente na remoção do contaminante do
solo, quando comparado com a “atenuação natural” já ao início do tratamento. Praticamente
não há mais contaminação nas primeiras 24h de tratamento. Entretanto, o lodo, material rico
em matéria orgânica, mantém o contaminante por um período maior de tempo em sua matriz,
aparentemente por 25 dias. E este é um fator relevante na decisão da descontaminação, uma
vez que o solo fica com mais nutrientes e microrganismos ao final do tratamento, mas às
custas de uma retenção por maior período de tempo do contaminante.
113
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (dias)
Benzeno (mg.kg
-1
)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + Lodo
Solo + Gasolina + Lodo + NPK
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.21: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em relação ao Benzeno
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (dias)
Tolueno (mg.kg
-1
)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + Lodo
Solo + Gasolina + Lodo + NPK
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.22: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em relação ao Tolueno
114
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (Dias)
MTBE (mg.kg
-1
)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + Lodo
Solo + Gasolina + Lodo + NPK
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.23: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em relação ao MTBE
A Figura 4.24 mostra as curvas obtidas da biorremediação de C
8
aromáticos. Novamente se
observa o maior tempo de remoção de hidrocarbonetos de solos tratados com o lodo industrial
e a maior dificuldade de remoção de hidrocarbonetos aromáticos, em especial os com cadeias
maiores (Figura 4.25). Até o período de 70 dias foi possível praticamente a completa remoção
dos hidrocarbonetos C
8
aromáticos e em quase todos os tratamentos no caso de C
9+
aromáticos, enquanto que nos compostos contendo lodo ainda havia consideráveis
quantidades deste último.
115
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (dias)
C
8
Aromáticos (mg.kg
-1
)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + Lodo
Solo + Gasolina + Lodo + NPK
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.24: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em relação ao C
8
aromático
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Tempo (dias)
C
9+
Aromáticos (mg.kg
-1
)
Controle
Solo + Lodo
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + Lodo
Solo + Gasolina + Lodo + NPK
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.25: Curvas comparativas dos ensaios de biorremediação em relação aos C
9+
aromáticos
116
4.1.8 Parâmetros de Contaminação do Solo
Como já foi discutido anteriormente, existem diversas dificuldades para se identificar
contaminações e seus parâmetros. Então, realizou-se um estudo complementar, independente
dos tratamentos estudados até o momento, buscando-se alguns parâmetros que pudessem
identificar a presença dos contaminantes e suas concentrações, no caso o pH e a
condutividade elétrica. Foram realizados ensaios com solo e água contaminados com várias
concentrações de gasolina com álcool, conforme descrito no Capítulo 3.
A variação do pH é apresentada na Figura 4.26 para o arenito com diversas doses de
contaminantes, neste caso utilizando gasolina e diesel de postos de combustível. Todos os
dados foram comparados com o solo controle, lembrando que estes parâmetros são analisados
para a condição saturada. Para o caso da gasolina, observa-se que o pH aumenta com o
incremento do contaminante, atingindo um patamar aos 6mL/20mL água em 4,9.
Estatisticamente é observado diferenças entre os níveis de contaminação, podendo-se dividir
em grupos de 1 a 2, 3 a 5 e 6 a 10 mL gasolina/20mL água destilada. Entretanto, para fins
práticos, novamente temos diferenças de valores muito pequenas, na ordem de 0,3 entre os
tratamentos e 0,6 para o controle.
No caso do diesel não há qualquer variação quando se aumenta ou diminui a quantidade do
contaminante. Entretanto, há um aumento no pH quando comparamos os grupos
contaminados com o solo controle, também muito pequeno para ser utilizado com finalidade
prática, na ordem de 0,1.
Para que se pudesse analisar o efeito do solo no pH para as diferentes cargas de
contaminação, foram realizados ensaios similares, porém apenas com água destilada e o
contaminante (Figuras 4.27). Diversas medidas foram feitas da água, do diesel e da gasolina
“in natura”.
Comparando-se as Figuras 4.26 e 4.27, observamos que o solo é o principal responsável pela
variação do pH em presença de gasolina. Íons de hidrogênio são introduzidos na solução pelo
solo, que por sua vez parece ionizar a solução de água e gasolina com o incremento do
contaminante, aumentando o pH. No caso da contaminaçã por diesel, não há qualquer
117
interação aparentemente significativa entre o solo e a solução água/diesel quando analisamos
o pH.
4,0
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
4,7
4,8
4,9
5,0
5,1
A
ren
i
to Botuca
tu
+
1mL
Gas
olina
+ 2mL
G
asolina
+ 3mL
Ga
solina
+ 4
mL
Gaso
l
ina
+ 5mL
Ga
solina
+
6
mL
Gas
oli
n
a
+ 7mL
G
asolina
+ 8mL
Gas
olina
+ 9m
L
Gasolina
+ 10
mL G
as
oli
n
a
+ 1m
L
Diesel
+ 2mL Dies
e
l
+ 3
mL Di
e
s
el
+ 4mL Diesel
+
5
m
L Dies
el
+ 6mL Diesel
+ 7mL Dies
el
+ 8m
L D
ie
s
el
+ 9mL Dies
e
l
+ 1
0m
L D
ie
sel
pH
Figura 4.26: Alteração do pH com o grau de contaminação com gasolina e diesel
0
1
2
3
4
5
6
7
H2
O
Gasolina
1
m
L
2
m
L
3
m
L
4 mL
5 mL
6
m
L
7
m
L
8
m
L
9
mL
10 mL
Diesel
1
m
L
2
m
L
3
m
L
4 mL
5 mL
6
m
L
7
m
L
8
m
L
9
mL
10 mL
pH
Figura 4.27: Alteração do pH na água com o grau de contaminação com gasolina e diesel
118
A variação da condutividade elétrica do solo contaminado por gasolina e diesel é apresentada
na Figura 4.28. Na avaliação da variação da condutividade elétrica na gasolina, podemos
observar que há, inicialmente, um aumento da condutividade, que decai com o incremento do
contaminante até 6mL/10g solo. A partir deste ponto, a condutividade aumenta, mas muito
pouco. Observa-se, então, que o eletrodo fica instável, quando a gasolina passa a se apresentar
dividida do solo. Caso tal derrame ocorresse em campo, seria possível separar fisicamente a
gasolina livre da contida no solo. Poderíamos considerar então uma curva exponencial
decrescente até 6mL/10g solo, a partir de onde a condutividade é constante. A análise
estatística mostra que a adição de 1mL de gasolina ao solo é diferente de 2 e 3mL, quando
qualquer contaminação não tem mais diferença significativa. Se considerássemos apenas este
parâmetro como indicador de contaminação por gasolina, seria muito difícil a identificação de
uma contaminação por 2mL/10g solo, uma vez que não há diferença estatística significativa
entre este e o grupo controle. A sensibilidade dos equipamentos de medição em campo
necessitam ser bastante precisas para detectarem tais variações.
No caso do diesel, temos uma exponencial decrescente até 8mL/10g solo, a partir de onde a
condutividade elétrica se torna constante em 8µS. Da mesma forma analisada anteriormente,
contaminações de até 3mL/10g solo poderiam ser confundidas com o solo controle.
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
A
ren
i
to Botuca
tu
+
1mL
Gas
olina
+ 2mL
G
asolina
+ 3m
L
Ga
solina
+ 4
mL
Gaso
l
ina
+ 5mL
Ga
solina
+
6
mL
Gas
oli
n
a
+ 7m
L
G
asolina
+ 8m
L
Gas
olina
+ 9m
L
Gasolina
+ 10
mL G
as
oli
n
a
+ 1mL
Diesel
+ 2mL Dies
e
l
+ 3
mL Di
e
s
el
+ 4mL Diesel
+
5
mL Dies
el
+ 6mL Diesel
+ 7mL Dies
el
+ 8m
L D
ie
s
el
+ 9mL Dies
e
l
+ 1
0m
L D
ie
sel
Condutividade (
µ
S)
Figura 4.28: Alteração da condutividade com o grau de contaminação com gasolina e diesel
119
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
H2O
G
a
s
o
lina
1 mL
2
mL
3
mL
4
mL
5
mL
6 m
L
7 mL
8 mL
9 mL
10 mL
Di
esel
1
mL
2
mL
3
mL
4 m
L
5 mL
6 mL
7 mL
8
mL
9
mL
10
m
L
Condutividade Elétrica (
µ
S)
Figura 4.29: Alteração da condutividade elétrica na água com o grau de contaminação com
gasolina e diesel
Também neste caso, para que fosse possível analisar o efeito do solo na condutividade elétrica
com diferentes níveis de contaminação, foram realizados ensaios apenas com água destilada e
o contaminante (Figuras 4.29). Para fins de comparação, foram feitas medidas com a água, o
diesel e a gasolina “in natura”.
A comparação das Figuras 4.28 e 4.29 mostra algo interessante. Tanto a gasolina como o
diesel têm condutividade elétrica próxima a zero (Figura 4.29). Quando colocamos a gasolina
na água, observamos um grande aumento de condutividade, devido à solubilização de alguns
compostos, aqui não identificados. Com níveis crescentes de gasolina em água, notamos uma
queda inicial na condutividade, que aumenta novamente após 9 mL. Provavelmente estamos
diante de um efeito de tamponamento. A água provavelmente vai neutralizando os íons até 8
mL, quando não há mais cargas disponíveis, aumentando novamente a condutividade elétrica
para maiores cargas de contaminação. Quando o solo está presente, temos a ajuda das cargas e
íons deste no tamponamento. No caso da gasolina em água, os efeitos práticos desta
observação são muito pequenos, justamente pelo fato de haver variações mínimas de
incrementos/decréscimo de apenas 0,5µS.
No caso do diesel em água parece não haver tamponamento, com aumento constante na
condutividade elétrica, talvez porque o contaminante libere maior quantidade de cargas. Da
120
mesma forma anteriormente considerada na gasolina, para o diesel também há pouca variação
de condutividade elétrica para fins práticos, na ordem de 1,5µS. Quando o solo está presente,
ocorre uma diminuição da condutividade elétrica, uma vez que o solo consegue tamponar de
uma forma mais eficaz o contaminante. Neste caso, pode ser que haja um efeito de diluição
simultaneamente, contribuindo para a queda rápida da condutividade.
4.1.9 Ensaios de Agregados
As Figuras 4.30 e 4.31 apresentam as percentagens de solo retido em cada peneira para todos
os tratamentos realizados. Pode-se observar que há um aumento significativo da formação de
agregados de solo durante os processos de biorremediação, claramente observados após 180 e
240 dias de tratamento. Todos os tratamentos (“bioaugmentação” e bioestimulação) e até
mesmo o solo com “atenuação natural” mostraram agregação de solo, com correspondente
diminuição das partículas mais finas. Nos tratamentos com “bioaugmentação”, este aumento
chega a ser maior que 100%. A gasolina por si só é uma fonte de carbono (compostos
alifáticos e aromáticos – ver Capítulo 3, item gasolinas) para os microrganismos, assim como
o lodo, contendo 46% de carbono orgânico e nutrientes como P e K. Na Figura 4.30
(agregação de partículas aos 180 dias), pode-se observar que o tratamento com
“bioaugmentação” promoveu a maior formação de agregados, seguido pelo solo com o lodo,
bioestimulação e pelo controle. Praticamente isso corresponde ao controle < solo + gasolina <
solo + lodo. O tratamento com gasolina com NPK teve um maior efeito aos 180 dias e
diminuiu aos 240 talvez por diminuição da disponibilidade de nutrientes.
A Figura 4.31 mostra que a cimentação natural perde um pouco de suas propriedades de
agregação após a estabilização de um novo ambiente no microcosmo, definido pela
estabilização da evolução de CO
2
(Spinelli et al., 2005) aos 180 dias de tratamento. Aos 240
dias, apenas o lodo continua tendo um aumento de agregação, provavelmente por não conter
gasolina nas amostras. Todos os tratamentos contendo lodo apresentaram um maior efeito na
formação de agregados devido a melhor disponibilidade de substratos para a microbiota. O
aumento de microrganismos é um fator importante na agregação de solo, principalmente
devido a efeitos mecânicos de hifas de fungos e exopolisacarídeos de bactérias. Devido ao
fato da agregação de partículas ter componentes biológicos, físicos e químicos, sugere-se um
121
acompanhamento destes efeitos através de microscopia eletrônica, além de medidas de sucção
em futuros trabalhos.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Peneira (mm)
Solo retido em 180 dias
Solo Controle
Solo + Lodo
Solo + Lodo + Gasolina
Solo + Lodo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.30: Alteração da granulometria do solo com o grau de contaminação aos 180 dias
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Peneira (mm)
Solo retido em 240 dias
Solo Controle
Solo + Lodo
Solo + Lodo + Gasolina
Solo + Lodo + Gasolina + NPK
Solo + Gasolina
Solo + Gasolina + NPK
Figura 4.31: Alteração da granulometria do solo com o grau de contaminação aos 240 dias
122
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
Solo Controle Solo + Lodo Solo + Lodo +
Gasolina
Solo + Lodo +
Gasolina + NPK
Solo + Gasolina Solo + Gasolina
+ NPK
Diâmetro médio padrão (MWD)
MWD 180
MWD 240
Figura 4.32: Alteração do MWD no solo com o grau de contaminação aos 180 e 240 dias
O aumento de resistência e estabilidade de cimentação intra-agregados e produtos orgânicos
pode promover estabilidade dos agregados por reduzir a trabalhabilidade e expansibilidade.
Alguns materiais orgânicos são hidrofóbicos, ou se tornam assim que desidratam, então o
complexo orgânicos-argila podem ter reduzida sua afinidade pela água (Khonke, 1968; Hillel,
1998).
A Figura 4.32 apresenta o diâmetro médio padrão (MWD) de agregados de solos para cada
um dos tratamentos nos tempos 180 e 240 dias. Quando comparamos os mesmos tratamentos
em diferentes tempos, observamos que o lodo continua agregando o solo aos 240 dias com
significância estatística (P<0,001) para o período anterior (180 dias de tratamento), enquanto
os outros tratamentos não se alteram. Quando os processos de biorremediação são
comparados ao controle, é possível observar que o tratamento com lodo é o mais efetivo na
agregação de partículas de solo, e o solo com lodo + gasolina não apresenta significância
estatística quando comparado ao lodo + gasolina + NPK (P>0,05), assim como quando
comparado ao lodo puro aos 240 dias. O solo + gasolina não apresenta significância
estatística (P>0,05) para o solo + gasolina + NPK ou para o controle (P>0,05), mas possui
para o tratamento com lodo (P<0,001). É possível se observar o efeito cumulativo do solo +
123
gasolina e solo + lodo no MWD, mostrando uma melhor resposta dos tratamentos contendo
gasolina + lodo na agregação do solo.
Há necessidade de ensaios de laboratório que reproduzam as condições de campo no projeto
de estruturas como camadas impermeáveis. A temperatura, o tipo de solo e o controle de
nutrientes nas atividades biológicas têm importantes conseqüencias na agregação de solos e
suas propriedades mecânicas.
4.1.10 Ensaios de Percolação e de Pluviometria
Conforme discutido anteriormente no item 3.7.10, buscou-se avaliar as condições de
contaminação durante um processo de biorremediação, onde houvesse interferências da
pluviometria. O esquema proposto com suas condições de contorno foi mostrado na Figura
3.15b. Nas figuras que seguem, identificou-se como a, b, c, d o controle com 0mm (a) e as
pluviometrias de 25, 50 e 100mm (b, c, d, respectivamente), observando-se os tempos. E, nas
figuras e, f, g, os grupos foram ilustrados por tempo, ou seja, 3, 9 e 27 dias, observando-se a
pluviometria. É importante salientar que os gráficos, devido à dispersão dos resultados nos
diferentes tempos, não estão na mesma escala, e as linhas tracejadas são apenas uma forma de
melhor visualização dos processos ocorridos.
A Figura 4.33 apresenta tendências de alterações das concentrações do benzeno em diferentes
regimes pluviométricos (a, b, c e d) e em diferentes profundidades (e, f e g) em relação ao
tempo. Na Figura 4.33a é possível identificar que quando não há regime pluviométrico
estabelecido (0mm), as concentrações de benzeno caem praticamente ao limite de detecção
em 9 dias na profundidade de 25 cm, enquanto que não há qualquer traço do contaminante na
camada superficial já aos 3 dias. Na ausência de chuvas, portanto, a biorremediação ocorre de
maneira intensa na superfície, favorecida pela volatilização, evoluindo para um solo sem
contaminação por benzeno a maiores profundidades (25 cm) num período de 9 dias. Em
momento algum a contaminação atingiu os 50 cm.
A Figura 4.33b ilustra um regime pluviométrico de 25mm e mostra que a biorremediação do
benzeno se torna mais dificultada na presença de maiores umidades do solo (inicialmente
colocado a 80% da capacidade de campo, ou 11% w/w). As concentrações superficiais
124
diminuem mais lentamente, e ainda há contaminantes na superfície aos 9 dias. Da mesma
maneira vista para o regime de 0mm, não há contaminação na profundidade de 50 cm em
qualquer tempo. Entretanto, pequena parte do benzeno parece migrar além dos 25 cm, à
medida que a água vai permeando o solo, mostrando um aumento de concentração nesta
profundidade em 9 dias, mas com biorremediação completa aos 27 dias. A volatilização se
torna mais difícil pela diminuição da aeração.
As Figuras 4.33c, d mostram que quando há um regime pluviométrico mais intenso (50 e
100mm), há uma grande migração de benzeno da superfície para a profundidade, mantendo
maiores concentrações superficiais e em profundidade (25 cm), que são retidas no solo por
maior tempo, em condição pior com 100mm. O processo de biorremediação é dificultado com
maiores umidades (Frankenberger, 1992; Alexander, 1994; Courseuil et al., 1998), mas ainda
assim não atinge a profundidade de 50 cm. Com regimes de 100mm ainda encontramos
benzeno no solo a 25 cm, com razoáveis níveis de contaminação, aos 27 dias (2,5 vezes a
concentração inicialmente encontrada no tempo zero). A frente de contaminação desce muito
lentamente, lixiviando os contaminantes e dificultando volatilização.
As Figuras 4.33e, f, g mostram, de certa forma, um resumo das observações anteriormente
feitas, agora ilustradas em função do tempo. Os regimes pluviométricos de 50 e 100mm,
como já analisados, mantém o benzeno na profundidade de 25 cm por mais tempo pela maior
dificuldade de volatilização/biorremediação. Para chuvas de 100mm ainda encontramos o
contaminante no solo aos 27 dias de tratamento em 25 cm em grandes concentrações.
A Figura 4.34 apresenta tendências de alterações das concentrações do tolueno em diferentes
regimes pluviométricos (a, b, c e d) e em diferentes profundidades (e, f e g) em relação ao
tempo. Na Figura 4.34a é possível identificar que quando não há regime pluviométrico
estabelecido (0mm), as concentrações de tolueno caem praticamente ao limite de detecção
somente em 27 dias na profundidade de 25 cm, enquanto que não há qualquer traço do
contaminante na camada superficial já aos 3 dias. Ao contrário do benzeno visto
anteriormente, o tolueno permanece no solo por um maior período de tempo. Inclusive, parece
haver uma pequena migração para a profundidade, que retorna aos 25 cm em 3 dias. Na
ausência de chuvas, portanto, a biorremediação ocorre de maneira intensa na superfície,
favorecida pela volatilização, evoluindo para um solo sem contaminação por tolueno a
125
maiores profundidades (25 cm) num período de 27 dias. Em momento algum, para este
parâmetro, a contaminação atingiu os 50 cm.
(a)
(b)
(c)
(d)
126
(e)
(f)
(g)
Figura 4.33: Alteração das concentrações de Benzeno nas diferentes profundidades em
relação ao tempo e ao regime pluviométrico aplicado
127
A Figura 4.34b ilustra um regime pluviométrico de 25mm e mostra que a biorremediação do
tolueno também se torna mais dificultada na presença de maiores umidades do solo. As
concentrações superficiais diminuem mais lentamente, e ainda há contaminantes na superfície
aos 9 dias. Da mesma maneira vista para o regime de 0mm, não há contaminação na
profundidade de 50 cm em qualquer tempo. Pequena parte do benzeno parece migrar além
dos 25 cm, à medida que a água vai permeando o solo, mostrando um aumento de
concentração nesta profundidade em 9 dias, mas com biorremediação completa aos 27 dias.
As Figuras 4.34c, d mostram que quando há um regime pluviométrico mais intenso (50 e
100mm), há uma grande migração de tolueno da superfície para a profundidade, mantendo
maiores concentrações do contaminante na superficie e em profundidade (25 cm), retidas no
solo por maior tempo, em condição pior com 100mm. No caso de um regime pluviométrico
de 100mm, observamos que o contaminante atinge a profundidade de 50 cm aos 9 dias,
aumentando um pouco até 27 dias. O excesso de água no solo, causando uma diminuição do
O
2
, piorou de forma considerável a biorremediação do tolueno. Se observarmos de forma
mais detalhada a Figura 4.35d, veremos que o tolueno migrou à profundidades maiores que 25
cm no tempo 9 dias, e por não ter por onde volatilizar, retornou aos 25 cm em 27 dias, com
contaminação de 5 vezes o valor inicialmente encontrado no tempo zero.
As Figuras 4.34e, f, g mostram o resumo das observações anteriormente feitas, agora
ilustradas em função do tempo. Os regimes pluviométricos de 50 e 100mm, como já
analisados, mantém o tolueno na profundidade de 25 cm por mais tempo, além de ter uma
migração maior e atingir a profundidade de 50 cm no tempo 9 dias para 100mm. Para chuvas
de 100mm encontramos o contaminante no solo aos 27 dias de tratamento em 25 e 50 cm.
A Figura 4.35 apresenta tendências de alterações das concentrações do MTBE em diferentes
regimes pluviométricos (a, b, c e d) e em diferentes profundidades (e, f e g) em relação ao
tempo. Na Figura 4.35a é possível identificar que quando não há regime pluviométrico
estabelecido (0mm), ou quando é de 25mm, as concentrações de MTBE caem praticamente ao
limite de detecção já aos 3 dias tanto na profundidade de 25 cm quanto na camada superficial.
Portanto, na ausência de chuvas e regimes pequenos (25mm), a biorremediação ocorre de
maneira intensa, favorecida pela volatilização, evoluindo para um solo sem contaminação por
MTBE já aos 3 dias.
128
(a)
(b)
(c)
(d)
129
(e)
(f)
(g)
Figura 4.34: Alteração das concentrações de Tolueno nas diferentes profundidades em relação
ao tempo e ao regime pluviométrico aplicado
130
A Figura 4.35b ilustra um regime pluviométrico de 50mm e mostra que a biorremediação do
MTBE se torna mais dificultada na presença de maiores umidades do solo. As concentrações
superficiais diminuem mais lentamente, e ainda há contaminantes na superfície aos 9 dias. Da
mesma maneira vista para o regime de 0 e 25mm, não há contaminação na profundidade de 50
cm em qualquer tempo. Pequena parte do benzeno parece migrar além dos 25 cm, à medida
que a água vai permeando o solo, mostrando um aumento de concentração nesta profundidade
em 3 dias, mas com biorremediação completa aos 27 dias. No caso de 100mm (Figura 4.35c)
ocorre a mesma coisa, porém com maior migração de contaminantes, mostrando grandes
concentrações aos 3 dias em profundidade (25mm). Então, aos 9 dias, grande parte do
contaminante já biorremediou, sendo que ainda encontramos concentrações semelhantes aos 9
dias em 27 dias, provavelmente por dificuldades de melhores taxas de biorremediação em
função de umidade, ou retorno do MTBE de maiores profundidades à superfície.
As Figuras 4.35d, e, f mostram o resumo das observações anteriormente feitas, agora
ilustradas em função do tempo. Os regimes pluviométricos de 50 e 100mm, como já
analisados, mantém o MTBE na profundidade de 25 cm por mais tempo, além de ter uma
migração maior. Para chuvas de 100mm, ainda encontramos o contaminante no solo aos 27
dias de tratamento na profundidade de 25cm.
A Figura 4.36 apresenta tendências de alterações das concentrações do C
8
aromático em
diferentes regimes pluviométricos (a, b, c e d) e em diferentes profundidades (e, f e g) em
relação ao tempo. Na Figura 4.36a é possível identificar que quando não há regime
pluviométrico estabelecido (0mm), as concentrações de C
8
aromático continuam altas até os
27 dias na profundidade de 25 cm, enquanto que não há qualquer traço do contaminante na
camada superficial já aos 3 dias. Da mesma maneira como ocorre com o tolueno, o C
8
aromático permanece no solo por um maior período de tempo em 25 cm. O C
8
aromático
também não atinge os 50 cm com 0mm.
131
(a)
(b)
(c)
(d)
132
(e)
(f)
Figura 4.35: Alteração das concentrações de MTBE nas diferentes profundidades em relação
ao tempo e ao regime pluviométrico aplicado
A Figura 4.36b ilustra um regime pluviométrico de 25mm e mostra que a biorremediação do
C
8
aromático, como com os demais contaminantes, torna-se mais dificultada na presença de
maiores umidades do solo. As concentrações superficiais diminuem lentamente, e ainda há
contaminantes na superfície aos 9 dias. Da mesma maneira vista para o regime de 0mm, não
há contaminação na profundidade de 50 cm em qualquer tempo. O contaminante sofre um
processo de biorremediação mais lento com 25mm, porém contínuo, e apresenta níveis de
contaminação significativos ainda aos 27 dias em 25 cm.
As Figuras 4.36c e d mostram que quando há um regime pluviométrico mais intenso (50 e
100mm), há uma migração de C
8
aromático da superfície para a profundidade, mantendo
maiores concentrações do contaminante na superficie e em profundidade (25 cm), retidas no
solo por maior tempo, em condição pior com 100mm. Com 50 mm observamos que o
contaminante vai migrando naturalmente, aumentando sua concentração em 3 dias, e continua
migrando aos 9 dias, quando notamos uma concentração menor em 25 cm. Então, em um
133
dado momento, o contaminante volta a migrar para a superfície, aumentando novamente sua
concentração em 27 dias em 25 cm. No caso de um regime pluviométrico de 100mm,
observamos que o contaminante atinge a profundidade de 50 cm aos 9 dias, apesar de ser em
pequena quantidade, aumentando um pouco até 27 dias. Da mesma forma vista para 50mm,
observamos que o C
8
aromático migrou à profundidade, aumentando sua concentração em 3
dias, continuando sua migração aos 9 dias, quando notamos uma concentração menor em 25
cm. Então, o contaminante volta a migrar para a superfície, aumentando novamente sua
concentração em 27 dias em 25 cm. Neste momento, a contaminação por C
8
aromático é 2,5
vezes o valor inicialmente encontrado no tempo zero.
As Figuras 4.36e, f, g mostram o resumo das observações anteriormente feitas, agora
ilustradas em função do tempo. Os regimes pluviométricos de 50 e 100mm, como já
analisados, mantém o C
8
aromático em profundidade por mais tempo, além de ter uma
migração maior e atingir a profundidade de 50 cm no tempo 9 dias. Para qualquer regime
pluviométrico encontramos o contaminante no solo aos 27 dias de tratamento em 25 cm e em
baixas concentrações em 50 cm para 100mm.
A Figura 4.37 apresenta tendências de alterações das concentrações do C
9+
aromático em
diferentes regimes pluviométricos (a, b, c e d) e em diferentes profundidades (e, f e g) em
relação ao tempo. Na Figura 4.37a é possível identificar que quando não há regime
pluviométrico estabelecido (0mm), mesmo assim as concentrações de C
9+
aromático
continuam altas até os 27 dias na profundidade de 25 cm, enquanto ainda há contaminante na
camada superficial aos 3 dias. Da mesma maneira como ocorreu com o tolueno e C
8
aromático, o C
9+
aromático permanece no solo por um maior período de tempo em 25 cm. O
C
9+
aromático também não atinge os 50 cm com 0mm.
A Figura 4.37b ilustra um regime pluviométrico de 25mm. As concentrações superficiais
diminuem lentamente, e ainda há contaminantes na superfície aos 9 dias. Da mesma maneira
vista para o regime de 0mm, não há contaminação na profundidade de 50 cm em qualquer
tempo. O contaminante sofre um processo de biorremediação lento e contínuo com 25mm e
apresenta níveis de contaminação significativos ainda aos 27 dias em 25 cm.
134
(a)
(b)
(c)
(d)
135
(e)
(f)
(g)
Figura 4.36: Alteração das concentrações de C
8
aromático nas diferentes profundidades em
relação ao tempo e ao regime pluviométrico aplicado
136
As Figuras 4.37c e d mostram que quando há um regime pluviométrico mais intenso (50 e
100mm), há uma migração de C
9+
aromático da superfície para a profundidade, mantendo
maiores concentrações do contaminante na superficie e em profundidade (25 cm), retidas no
solo por maior tempo, em condição pior com 100mm. Com 50 mm observamos que o
contaminante vai migrando naturalmente, e vai reduzindo sua concentração em 9 dias em 25
cm, e então o contaminante volta a migrar para a superfície, aumentando novamente sua
concentração em 27 dias em 25 cm, neste caso todas concentrações inferiores ao tempo zero.
No caso de um regime pluviométrico de 100mm, observamos que o contaminante atinge a
profundidade de 50 cm somente aos 27 dias. Da mesma forma vista para 50mm, observamos
que o C
9+
aromático vai migrando naturalmente, e vai reduzindo sua concentração até os 9
dias em 25 cm, quando então volta a migrar para a superfície, aumentando novamente sua
concentração em 27 dias em 25 cm, neste caso superior ao tempo zero. Neste momento, a
contaminação por C
9+
aromático é um pouco maior que o valor inicialmente encontrado no
tempo zero para 25 cm.
As Figuras 4.37e, f, g mostram o resumo das observações anteriormente feitas, agora
ilustradas em função do tempo. Os regimes pluviométricos de 50 e 100mm, como já
analisados, mantém o C
9+
aromático em profundidade por mais tempo, além de ter uma
migração maior e atingir a profundidade de 50 cm no tempo 27 dias. Para qualquer regime
pluviométrico encontramos o contaminante no solo aos 27 dias de tratamento em 25 cm e em
baixas concentrações em 50 cm para 100mm no tempo 27 dias. Não houve eliminação do
contaminante na superfície para qualquer tempo.
De forma geral, estes ensaios nos mostram a dinâmica dos contaminantes no solo em função
do grau de umidade. Existe uma tendência natural de volatilização dos contaminates, que se
torna dificultada pelo incremento da pluviometria em uma relação diretamente proporcional.
Em condições de campo, este é um parâmetro que inviavelmente deverá ser contabilizado,
principalmente ao considerarmos climas tropicais e subtropicais.
137
(a)
(b)
(c)
(d)
138
(e)
(f)
(g)
Figura 4.37: Alteração das concentrações de C
9+
aromáticos nas diferentes profundidades em
relação ao tempo e ao regime pluviométrico aplicado
139
4.1.11 Presença de Metais Pesados no Solo
A análise de metais pesados no solo foi um outro fator considerado no presente estudo, uma
vez que estes componentes inibem/ alteram o funcionamento celular. Foram avaliados os
metais cádmio, níquel, chumbo, cromo e mercúrio nos tratamentos realizados. O cádmio
apresentou em todos os tratamentos concentrações inferiores a 1 mg/kg, assim como o níquel
inferior a 5 mg/kg e o chumbo inferior a 10 mg/kg. Os valores citados são o limite inferior de
detecção do equipamento de análise. O cromo oscilou em 5,7
±
0,6 a 6,7± 1,2 mg/kg nos
diversos tratamentos, e foi encontrado inicialmente tanto no solo “in natura” como no lodo
originado da agroindústria. E o mercúrio oscilou em 0,01
±
0,01 mg/kg nos diversos
tratamentos, sendo 0,01 mg/kg o valor mínimo de detecção. Considerando os valores mínimos
destes metais nos solos, recomendados pelo EPA, observamos que todos estes valores
encontram-se dentro da faixa de normalidade.
4.2 ENSAIOS EM MODELO ANIMAL
4.2.1 Cromatografia Gasosa do Solo Utilizado nos Ensaios com Modelo Animal
Como já considerado no Capítulo 3, o solo utilizado nos experimentos com modelo animal foi
analisado ao longo dos ensaios, sendo medidas as concentrações de hidrocarbonetos. A Figura
4.39 mostra as concentrações dos diferentes hidrocarbonetos medidos durante uma exposição
de 24h, num período total de 72h. Observamos que as concentrações de benzeno, tolueno e
MTBE decaem para valores mínimos (< 3 mg/kg solo) já nas primeiras 24h do início dos
ensaios, fato similar ocorrendo com o C
8
aromático. Os C
9+
aromáticos, por possuírem
cadeias maiores, perduram por mais tempo no solo, apresentando teores menores que 50% da
concentração inicial com 72h. Uma vez que diversos trabalhos mostram os BTEX, em
especial o benzeno e tolueno como os hidrocarbonetos mais tóxicos da gasolina, poderíamos
esperar poucos efeitos biológicos, ou até mesmo nenhum, a partir de 24 – 48h de ensaios. As
Figuras 4.38 e 4.39 serão alvos de comparação para todos os ensaios realizados em modelo
animal.
140
Em um segundo momento, buscou-se avaliar os efeitos cumulativos da exposição de animais
a uma pior condição, sendo considerado o dobro do tempo previsto inicialmente, ou seja, 48h
(Figura 4.39). Na ocasião, foi obtida uma nova amostra de gasolina da REFAP, que
apresentou concentrações iniciais dos hidrocarbonetos medidos superiores a 3,5x a amostra
utilizada anteriormente. Desta forma, não se pode inferir aumentos ou diminuições de algum
fator analisado ao tempo de exposição exclusivamente, uma vez que, se houvesse alguma
variação, poderia ser considerada também pela maior concentração. Entretanto, o fato de não
haver alterações significativas poderia sugerir que o fator em estudo não se alteraria por
aumentos de concentração ou tempo de exposição.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
Benzeno Tolueno MTBE C8 Aromático C9+ Aromáticos
Concentração (mg.kg
-1
)
0h
24h
48h
72h
Figura 4.38: Concentração dos diferentes contaminantes no solo contaminado nos diversos
tempos de estudo
4.2.2 Hemograma e Plaquetas
A Figura 4.40 apresenta as variações encontradas na contagem de células brancas (White
Blood Cells), sendo possível se observar um amplo desvio padrão (valores ± 1SD). O grupo
de animais exposto às primeiras 24h ao solo contaminado sofreu um aumento de WBC
significativo em relação ao controle (P=0,011), fato que não ocorreu com os demais grupos
141
de animais expostos aos contaminantes (P>0,05). Entretanto, como discutido no item
anterior, o grupo exposto a 48h cumulativas pode ter tido suas WBCs aumentadas nas
primeiras 24h e ter retornado aos valores basais a seguir. Neste sentido, a exposição aos
hidrocarbonetos poderia acarretar alterações reversíveis no que se refere a este parâmetro. O
aumento nas células brancas, ou leucocitose, na maioria das vezes está relacionado a um
processo inflamatório, sendo o principal diagnóstico diferencial da leucocitose a leucemia
(Friedman, 1996). Leucócitos maduros usualmente indicam processo reativo ou leucemia
crônica. A presença de blastos, ao contrário, é sugestiva de leucemia aguda. A presença de
blastos no hemograma não foi contemplada no presente estudo. Entretanto, a histologia da
medula óssea, que permite o diagnóstico de leucemia aguda, é vista no item 4.2.5 – Histologia
da medula óssea, rins e pulmões. A leucocitose, de forma geral, pode ser associada a
infecções agudas, intoxicações, hemorragia aguda, processo hemolítico agudo, doenças
mieloproliferativas, necrose tissular e estados fisiológicos (exercícios físicos, estresse
emocional, menstruação e parto)(Friedman, 1996; Guyton e Hall, 2002; Faillace, 2003;
Wallach, 2000).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
Benzeno Tolueno MTBE C8 Aromático C9 + Aromáticos
Concentração (mg.kg
-1
)
0h
48h
Figura 4.39: Concentração dos diferentes contaminantes no solo contaminado nos tempos
inicial e com 48h
142
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
WBC (x10
3
/mm
3
)
*
Figura 4.40: Alterações no WBC dos animais durante o período de ensaios (P=0,011 para o
controle)
A análise das células vermelhas (Red Blood Cells, Figura 4.41), da hemoglobina (Hb, Figura
4.42), do volume corpuscular médio (VCM, Figura 4.44), da hemoglobina corpuscular média
(HCM, Figura 4.45) e da concentração hemoglobínica corpuscular média (CHCM, Figura
4.46) não mostrou qualquer alteração significativa (P>0,05) para qualquer que seja o grupo
em estudo. Da mesma forma, não há qualquer efeito cumulativo em relação a estes
parâmetros. Aparentemente, nem mesmo um maior período de exposição a um processo de
biorremediação ou maiores concentrações causaria alguma alteração e, caso tenha causado,
voltou aos valores basais no tempo de coleta (incluindo o grupo exposto por 48h), tempo este
em que não há mais benzeno, tolueno e C
8
aromáticos.
O hematócrito (Hct, Figura 4.43) sofreu uma redução significativa (P<0,02) nas primeiras
48h nos grupos expostos à gasolina em processo de biorremediação em relação ao grupo
exposto no período 48-72h. De fato foi observada uma diminuição no volume de urina dos
animais neste período (analisado posteriormente), podendo justificar o ocorrido por
hemodiluição. As alterações, entretanto, apesar de significativas estatisticamente, não o são
fisiologicamente, pois não acarretam modificações hemodinâmicas (Goldman e Bennett,
2001; Guyton e Hall, 2002; Faillace, 2003). Inclusive, estas alterações não apresentam
143
diferenças estatisticamente significativas para o controle (P>0,05). Conforme Friedman
(1996), os valores de hemoglobina e hematócrito encontram-se normais ou próximos da
normalidade na leucocitose reativa e nas leucemias crônicas.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
RBC (x10
6
/mm
3
)
Figura 4.41: Alterações no RBC dos animais durante o período de ensaios
A Figura 4.47 mostra as alterações que ocorrem com as plaquetas no grupo de animais
expostos nas primeiras 24h ao experimento (P=0,01). A redução de plaquetas foi
acompanhada por alterações medulares, vistas na histologia adiante. No grupo exposto por
48h cumulativas, parece que o organismo dos animais conseguiu reverter o quadro ao final do
período de exposição, visto que se pode observar uma leve redução nas plaquetas sem
diferenças significativas para o grupo controle (P>0,05), mostrando que mesmo uma maior
concentração pode ser eliminada do organismo sem efeitos permanentes em uma exposição
aguda.
144
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Hb (g/dL)
Figura 4.42: Alterações na hemoglobina dos animais durante o período de ensaios
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Hct (%)
*
*
Figura 4.43: Alterações no hematócrito dos animais durante o período de ensaios (P<0,02
para o grupo 48-72h)
145
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
VCM (x10
-15
L)
Figura 4.44: Alterações no VCM dos animais durante o período de ensaios
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
HCM (x10
-12
g)
Figura 4.45: Alterações no HCM dos animais durante o período de ensaios
146
0
5
10
15
20
25
30
35
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
CHCM (g/dL)
Figura 4.46: Alterações no CHCM dos animais durante o período de ensaios
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Plaquetas (x10
3
/mm
3
)
*
Figura 4.47: Alterações nas plaquetas dos animais durante o período de ensaios (P=0,010
para grupo 48-72h e controle)
147
A redução de plaquetas em um organismo, ou plaquetopenia, pode ser causada por toxicidade
direta à produção de plaquetas (Friedman, 1996). Sangramento pode ocorrer com contagens
muito baixas ou muito altas de plaquetas. Essas aderem ao endotélio vascular avariado através
do contato com o colágeno subendotelial. A adenosina difosfato (ADP) formada a partir dos
grânulos citoplasmáticos das plaquetas participa na indução da agregação e coesão. Ao
mesmo tempo, os fosfolipídeos (fator 3 plaquetário) e outros constituintes celulares
secretados ativam o fator XII de Hageman, que por sua vez, ativa a via intrínseca da cascata
de coagulação (Friedman, 1996; Goldman e Bennett, 2001; Guyton e Hall, 2002; Nelson e
Cox, 2002). A plaquetopenia pode também estar relacionada a efeitos de agregação
plaquetária, causadas pela gasolina, talvez causando uma síndrome do tipo resposta
inflamatória sistêmica. Futuros trabalhos poderiam contemplar esta consideração.
De forma inversa, a Figura 4.48 mostra o aumento no número de linfócitos que ocorre no
grupo de animais expostos nas primeiras 24h ao experimento (P=0,031). No grupo exposto
por 48h cumulativas, parece que o organismo dos animais conseguiu manter o número de
linfócitos ao final do período de exposição, sem diferenças significativas para o grupo
controle (P>0,05), mostrando que, de forma similar ao que ocorre com as plaquetas, mesmo
uma maior concentração de hidrocarbonetos pode ser eliminada do organismo sem efeitos
permanentes em uma exposição aguda.
O aumento de linfócitos em um organismo, ou linfocitose, é mais comum em crianças e é
usualmente um achado não-específico associado a infecções virais. Nos adultos, a linfocitose
tem uma especificidade maior e consequentemente um maior valor diagnóstico. Os
mecanismos da linfocitose não são bem conhecidos
(Friedman, 1996; Goldman e Bennett,
2001; Wallach, 2000). Pode ter como causas infecções virais (varicela, rubéola, herpes
simples, influenza, mononucleose infecciosa, hepatite infecciosa, citomegalovírus),
bacterianas (tuberculose, pertussis), síndromes pós-transfusão, toxoplasmose, indução por
drogas (ácido para-amino salicílico, difenil-hidantoína, mefentoína) ou ainda outras, como
leucemia linfocítica crônica (Friedman, 1996; Wallach, 2000).
148
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Linfócitos (x10
3
/mm
3
)
*
Figura 4.48: Alterações nos linfócitos dos animais durante o período de ensaios (P=0,031
para o grupo controle)
4.2.3 Creatinina e Uréia Sérica e Urinária, AST, ALT, γGT, Fosfatase Alcalina,
Proteínas Totais e Proteinúria, Sódio, Potássio, Glicose, LDH, CPK, CPK-MB,
Troponina “I” e Cálcio Total
Antes de iniciar as análises dos parâmetros acima mencionados, é interessante observar que
os animais ensaiados, os ratos Wistar, não apresentaram qualquer nível de gama-glutamil
transferase (γGT) detectável, até mesmo em grupos expostos aos contaminantes, ficando este
parâmetro, portanto, fora das análises.
A Figura 4.49 apresenta o estudo da creatinina sérica dos animais nos tempos de ensaios.
Como se pode observar, não houve qualquer variação significativa (P>0,05) entre os grupos,
mostrando que a creatinina sérica não se modifica em exposição aguda aos hidrocarbonetos
estudados. Não há, portanto, alteração da função renal significativa. O estudo complementar
por histologia mostrará que existem pequenas alterações celulares nos grupos expostos ao
pior tempo de contaminação, ou seja, nas primeiras 24h.
149
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Creatinina (mg.L
-1
)
Figura 4.49: Alterações na creatinina sérica dos animais durante o período de ensaios
A Figura 4.50 mostra as alterações que ocorrem na creatinina urinária ao longo do período de
ensaios. A análise estatística não foi considerada neste grupo porque houve problemas na
coleta de urina nos primeiros grupos. No tempo 24h tivemos duas coletas e no tempo 24-48h
apenas uma coleta foi possível. Considerando a imensa variação deste parâmetro, vista pelo
tempo 48-72h, infelizmente esta variável não pode ser considerada para estudo. A Figura fica,
entretanto, para uso em novas pesquisas, que adicionem novos valores a estes. A média
normal destes ratos é 45 mg/L.
A Figura 4.51 mostra as alterações da uréia excretada pela urina. Da mesma forma que a
creatinina uriária, este parâmetro também não pode ser avaliado, uma vez que houve
dificuldes de coleta de urina, principalmente nos primeiros grupos, com média no grupo
controle de 2700 mg/dL.
A Figura 4.52 mostra uma dimunuição da uréia sérica no grupo exposto a 48h cumulativas ao
processo de biorremediação. Novamente, pode ser considerado que a variável pode ter
reduzido não apenas pelo tempo de exposição, mas pela maior concentração da gasolina.
150
0
10
20
30
40
50
60
70
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Creatinina Urinária (mg.L
-1
)
Figura 4.50: Alterações na creatinina urinária dos animais durante o período de ensaios
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Uréia Urinária (mg.dL
-1
)
Figura 4.51: Alterações na uréia excretada pela urina dos animais durante o período de
ensaios
151
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Uréia (mg.dL
-1
)
*
Figura 4.52: Alterações na uréia sérica dos animais durante o período de ensaios (P<0,02 para
grupo controle)
A produção catabólica de amônia tem uma séria repercussão bioquímica, porque é muito
tóxica. As bases moleculares dessa toxicidade não são inteiramente compreendidas. Nos seres
humanos, a uremia pode causar manifestações gastrointestinais (anorexia, náuseas, vômitos,
diarréias), manifestações do sistema nervoso central (desde alterações do sensório até coma),
alterações cardiovasculares e pulmonares (Friedman, 1996; Nelson e Cox, 2002). No presente
estudo parece haver uma excreção maior de uréia pelo organismo, uma vez que já existem
outros tóxicos séricos provindos da gasolina. Entretanto, considerando a variação dos outros
grupos e a pequena variação fisiológica (50 – 65 mg/dL), a alteração encontrada no grupo
exposto por 48h não parece ter um significado importante do ponto de vista fisiológico.
As Figuras 4.53 e 4.54 mostram as variações da AST e da ALT nos animais durante os
ensaios. A AST possui uma menor dispersão de valores, e é possível se observar que o grupo
exposto por 48h cumulativas apresentou um aumento da variável (P<0,05) em relação aos
grupos 0-24h e 48-72h, mas não em relação ao grupo controle (P>0,05). Muitos
hidrocarbonetos são degradados no fígado e excretados pela urina. No caso de uma maior
concentração ou maior tempo de exposição poderia-se esperar uma sobrecarga dos
contaminantes para o fígado metabolizar, acarretando lesões nos hepatócitos. Entretanto, a
152
Figura 4.54 mostra que a ALT possui uma grande dispersão da normalidade, não ocorrendo
qualquer alteração significativa entre os grupos (P>0,05).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
AST (U.L
-1
)
*
Figura 4.53: Alterações na AST dos animais durante o período de ensaios (P<0,05 para
grupos 0-24h e 48-72h)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
ALT (U.L
-1
)
Figura 4.54: Alterações na ALT dos animais durante o período de ensaios
153
A AST é encontrada nos seguintes órgãos em ordem de concentrações decrescentes: coração,
fígado, músculo esquelético, rim e pâncreas. A ALT, apesar de distribuída por todo o
organismo, é predominantemente confinada ao fígado, sendo mais específica para doenças
deste órgão. Ambos os testes são indicadores sensíveis da necrose hepatocelular. De forma
geral, valores 10 vezes maiores que o limite superior do normal indicam lesão hepatocelular,
como nos casos de hepatite viral, hepatite induzida por drogas ou outros tóxicos, doenças
isquêmicas do fígado ou colangite (Friedman, 1996; Wallach, 2000). Elevações inferiores são
menos específicas, podendo, no caso deste estudo, ser até mesmo fisiológico, ou ainda indicar
o início de lesão do coração, músculo esquelético, rim ou pâncreas pelo aumento da AST.
As Figuras 4.55, 4.56, 4.57, 4.58 e 4.59 apresentam os estudos de fosfatase alcalina, proteínas
totais no soro, proteínas urinárias, sódio e potássio, respectivamente. Em nenhuma destas
análises ocorreram diferenças significativas entre os grupos de estudo (P>0,05). Em relação a
figura que apresenta proteínas urinárias, devemos fazer as mesmas considerações já feitas
para creatinina e uréia urinária, por problemas de amostragem, não podendo-se excluir futuras
análises desta variável. Pequenas variações ocorreram dentro de cada grupo, todas de caráter
fisiológico, dentro da normalidade.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Fosfatase Alcalina (U.L
-1
)
Figura 4.55: Alterações na fosfatase alcalina dos animais durante o período de ensaios
154
5,0
5,2
5,4
5,6
5,8
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Proteínas Totais no Soro (g.dL
-1
)
Figura 4.56: Alterações nas proteínas totais no soro dos animais durante o período de ensaios
0
20
40
60
80
100
120
140
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Proteínas Urinárias (mg.dL
-1
)
Figura 4.57: Alterações nas proteínas urinárias dos animais durante o período de ensaios
155
140
141
142
143
144
145
146
147
148
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Na (mEq.L
-1
)
Figura 4.58: Alterações do sódio dos animais durante o período de ensaios
0
1
2
3
4
5
6
7
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
K (mEq.L
-1
)
Figura 4.59: Alterações do potássio dos animais durante o período de ensaios
A Figura 4.60 ilustra as variações ocorridas para a glicose nos diferentes grupos.
Aparentemente, os animais expostos à aspiração de hidrocarbonetos de gasolina utilizam mais
156
glicose no seu metabolismo, principalmente quando observamos que os animais submetidos
por 48h cumulativas diminuem significativamente (P<0,05) a sua glicemia. De forma geral,
apesar do grupo exposto às primeiras 24h não diminuir sua glicose com significância
estatística, é possível se observar uma diminuição em relação aos grupos controle e 48-72h.
Foi pensada a possibilidade de se medir concomitantemente o lactato e o bicarbonato, de
forma a se verificar acidose/alcalose metabólicas associadas à falta de glicose disponível
durante a metabolização dos hidrocarbonetos, fato que não foi possível porque não havia
disponibilidade de equipamentos de gasometria. Fica a idéia para futuros trabalhos.
0
25
50
75
100
125
150
175
200
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Glicose (mg.dL
-1
)
*
*
Figura 4.60: Alterações da glicose dos animais durante o período de ensaios (P<0,05 para
grupo controle)
A Figura 4.61 apresenta a variação de lactato desidrogenase (LDH) nos diversos grupos e
períodos de tratamento. O único grupo que apresentou diferença significativa para os demais
(P<0,02) foi o grupo de animais expostos por 48h cumulativas. A mesma consideração
anteriormente relatada continua valendo, ou seja, a maior concentração ou o maior tempo de
exposição causam, neste caso, lesão celular. A LDH é responsável pela conversão de lactato a
piruvato no citosol, auxiliada pela NAD+ que se converte em NADH + H (Nelson e Cox,
2002), como já visto no Capítulo 2, sendo um bom indicativo de lesão celular. Como o
miocárdio possui transaminases, LDH, creatinaquinase e frações (CPK e CPK-MB) e
157
proteínas específicas (troponina “I”), poderíamos considerar o aumento da LDH, da AST e
leucocitose um indicativo de que possa ter ocorrido lesão do miocárdio nos animais,
sugerindo-se a investigação de CK, CK-MB e troponina “I”. Os três parâmetros foram
analisados e não foram encontradas quaisquer diferenças significativas entre os grupos
(P>0,05), mostrando que aparentemente não há lesão cardíaca (Figuras 5.62, 5.63 e 5.64).
Além do infarto do miocárdio, a LDH em humanos encontra-se aumentada em anemia
perniciosa, crise de células falciformes, hepatite em fase precoce, linfoma maligno, lúpus
eritematoso sistêmico, dermatomiosites, câncer de próstata e embolia e infarto pulmonar
(Friedman, 1996; Goldman e Bennett, 2001; Guyton e Hall, 2002; Wallach, 2000).
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
LDH (U.L
-1
)
*
Figura 4.61: Alterações da LDH dos animais durante o período de ensaios (P<0,02 para
grupo controle)
158
0
500
1000
1500
2000
2500
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Creatinaquinase (U/L)
Figura 4.62: Alterações da Creatinaquinase dos animais durante o período de ensaios
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Creatinaquinase - Fração MB (U/L)
Figura 4.63: Alterações das Frações MB dos animais durante o período de ensaios
159
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Troponina "I" (ng/mL)
Figura 4.64: Alterações da Troponina “I” dos animais durante o período de ensaios
A Figura 4.65 apresenta as alterações do cálcio sérico total para os diferentes grupos nos
períodos de ensaios. Observa-se que há uma tendência de aumento do cálcio nas primeiras
24h de exposição à gasolina, diminuindo sua concentração nas horas consecutivas até atingir
o valor controle no terceiro dia de exposição. O primeiro grupo apresenta uma alteração
significativa para o grupo controle (P<0,02) e o grupo exposto por 48h cumulativas (P<0,02).
No caso do grupo exposto por 48h cumulativas, parece que o animal se reestabelece após as
primeiras 24h do início dos experimentos, sem que haja qualquer alteração residual. Como já
observado anteriormente, por ser este um grupo exposto a uma concentração inicial maior,
observa-se que não há correlação entre concentração inicial de hidrocarbonetos e cálcio total
ao final de 48h. Conforme Wallach (2000), o cálcio está aumentado em hiperparatireoidismo
devido a hiperplasia ou adenoma das paratireóides, excesso de ingestão de vitamina D, tumor
ósseo, osteoporose aguda, hipofosfatemia infantil, hipertireoidismo, hiperproteinemia. Para a
correta interpretação do cálcio no soro, devemos conhecer a proteinemia total, que no
presente trabalho não mostrou qualquer alteração entre os grupos. Friedman (1996) relata
haver ainda hipercalemia em leucocitose, hemólise e trombocitose, além de acidose
metabólica.
160
0
2
4
6
8
10
12
14
0 - 24 24 - 48 48 - 72 0 - 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Cálcio Total (mg/dL)
*
Figura 4.65: Alterações do Cálcio Total dos animais durante o período de ensaios (P<0,02
para grupo 0-48h e controle)
4.2.4 Condutividade Elétrica e pH Celular
4.2.4.1 Condutividade Elétrica e pH Renal e Pulmonar
A Figura 4.66 ilustra as alterações no pH do macerado renal nos diferentes grupos e dias de
tratamento. Observa-se que os grupos expostos no primeiro momento de contaminação,
incluindo o grupo com efeito cumulativo, apresentam acidificação do macerado renal em
relação ao controle e ao grupo exposto mais tardiamente, com significância estatística
(P<0,04). Infelizmente não foi possível a verificação dos parâmetros responsáveis pelo
ocorrido, visto que a creatinina, proteínas e uréia urinária não puderam ser analisadas,
enquanto não houve alterações nas condições séricas.
161
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
pH Rim
*
*
Figura 4.66: Alterações do pH do macerado de rim dos animais durante o período de ensaios
(P<0,04 para grupo controle)
A Figura 4.67 apresenta um estudo da condutividade elétrica normalizada por peso de rim. Os
testes normalizados não mostraram significância estatística (P>0,05) entre os grupos.
Entretanto, a Figura 4.68 mostra a condutividade elétrica normalizada pela relação peso de
rim sobre peso de proteínas renais para todos os grupos, onde é possível se observar que esta
relação normalizada diminui significativamente (P<0,04) nos grupos sujeitos à aspiração de
hidrocarbonetos de gasolina. Foi feita uma tentativa em se analisar quais foram os
fatores/variáveis contribuintes para este fenômeno. A creatinina e uréia séricas não mostraram
significância estatística (P>0,05) em todos os grupos quando comparadas ao controle (visto
anteriormente), assim como o sódio e potássio (P>0,05). Apesar do potássio não ter
apresentado significância estatística, os valores séricos deste íon diminuíram nas primeiras
24-48h, assim como o sódio no período cumulativo de 48h, talvez contribuindo para as
alterações na excreção de íons e consequentemente diminuindo a relação da condutividade
elétrica normalizada do rim. Guyton e Hall (2002) e Nelson e Cox (2002) discutiram a
importância fisiológica dos organismos em manterem o pH sérico, parâmetro que foi
eficientemente mantido pelos animais nos experimentos. A resposta inflamatória do
organismo por meio de citocinas, α-TNF, óxido nítrico, etc pode influenciar as modificações
na atividade elétrica das células e pode ser contemplada em trabalhos futuros.
162
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Condutividade/Peso Rim (
µ
S.cm
-1
.g
-1
)
Figura 4.67: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de rins dos animais
normalizada por peso de rim durante o período de ensaios
0
200
400
600
800
1000
1200
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Condutividade/(Peso/Proteínas) (
µ
S.cm
-1
/g.mg
-1
)
*
Figura 4.68: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de rins dos animais
normalizada por peso de rim e por proteínas dos diversos períodos de ensaios (P<0,04 para o
grupo controle)
163
A Figura 4.69 ilustra as alterações no pH do macerado pulmonar nos diferentes grupos e dias
de tratamento. Para todos os tratamentos realizados, observa-se que não há significância
estatística (P>0,05) entre os grupos, mostrando que se houve alguma alteração, não foi
relacionada a íons de hidrogênio.
6,0
6,5
7,0
7,5
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
pH Pulmão
Figura 4.69: Alterações do pH dos macerados de pulmão dos animais durante o período de
ensaios
A Figura 4.70 apresenta um estudo da condutividade elétrica normalizada por peso de
pulmão. Os testes normalizados mostraram que há significância estatística (P=0,032) do
grupo exposto nas primeiras 24h em relação aos expostos por 48-72h. O grupo controle não
apresentou diferença significativa para o grupo de 24h (P>0,05), apesar deste último mostrar
uma tendência de diminuição do parâmetro normalizado. Sugere-se novos estudos com
grupos contendo maior quantidade de indivíduos a fim de se estabelecer um padrão.
A Figura 4.71 mostra a condutividade elétrica normalizada pela relação peso de pulmão e
peso de proteínas renais para todos os grupos, onde é possível se observar que esta relação
normalizada diminui significativamente (P<0,004) no grupo sujeito à aspiração de
hidrocarbonetos de gasolina nas primeiras 24h. Novamente, apesar de haver uma tendência de
dimuição do parâmetro normalizado nas primeiras 24h, devemos considerar a realização de
novos estudos para quantificar melhor as variáveis.
164
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Condutividade / Peso Pulmão (
µ
S.cm
-1
.g
-1
)
*
Figura 4.70: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de pulmão dos animais
normalizada por peso de pulmão durante o período de ensaios (P=0,032 para grupo 48-72h)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Condutividade/(Peso/Proteína) (
µ
S.cm
-1
/(g.mg
-1
))
*
Figura 4.71: Alterações da condutividade elétrica dos macerados de pulmão dos animais
normalizada por peso de pulmão e por proteínas durante o período de ensaios (P<0,004 para
grupo controle)
165
Poderia se supor que a estabilidade do pH está baseada nas alterações iônicas. A importância
dos íons pode ser explicada da seguinte maneira: quando há lesão de membrana, íons e
moléculas passam em ambas as direções. As alterações da microvasculatura também são um
fator importante que deve ser considerado, causando uma resposta inflamatória do organismo.
A molécula de oxigênio produz reações nas células, formando radicais livres e induzindo a
peroxidação de lipídeos de membrana, alterando sua integridade e aumentando sua fluidez e
permeabilidade (Kumar et al., 2005).
4.2.4.2 Condutividade Elétrica e pH do Sangue e da Urina
As Figuras 4.72 e 4.73 ilustram o pH e a condutividade elétrica do plasma normalizada por
peso de proteínas. Observa-se que o organismo dos animais consegue manter ambos os
parâmetros em qualquer condição de exposição sem diferença significativa entre os grupos
(P>0,05), apesar de haver uma acidificação do pH na condição de 48h cumulativas. Como já
discutido anteriormente, foi feita uma tentativa em se analisar quais foram os fatores/
variáveis contribuintes para este fenômeno. Guyton e Hall (2002) e Nelson e Cox (2002)
discutiram a importância fisiológica dos organismos em manterem o pH sérico, parâmetro que
foi eficientemente mantido pelos animais nos experimentos.
Nas Figuras 4.74 e 4.75 tentou-se avaliar as alterações de pH e condutividade elétrica urinária
normalizada por proteínas urinárias, parâmetros que não puderam ser analisados com maior
acuidade por problemas de coleta de urina nos ensaios com contaminantes.
166
6,0
6,2
6,4
6,6
6,8
7,0
7,2
7,4
7,6
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
pH Plasma
Figura 4.72: Alterações do pH do plama dos animais durante o período de ensaios
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Condutividade/Proteínas Plasma (mS.cm
-1
.g
-1
)
Figura 4.73: Alterações da condutividade elétrica do plasma dos animais normalizada por
proteínas durante o período de ensaios
167
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
pH urinário
Figura 4.74: Alterações do pH urinário dos animais durante o período de ensaios
0
5
10
15
20
25
30
35
0 - 24 24 - 48 48 - 72 48 Controle
Tempo de Exposição (h)
Condutividade / Proteinúria (mS.cm
-1
.g
-1
)
Figura 4.75: Alterações da condutividade elétrica da urina dos animais normalizada por
proteínas urinárias durante o período de ensaios
168
4.2.5 Histologia da Medula Óssea, Rins e Pulmões
As Figuras 4.76a e b mostram uma medula óssea normal, dos ratos controle, com distribuição
normal dos elementos medulares, com 50x e 400x de aumento. Na Figura 4.76c e d observa-
se necrose e apoptose difusa, mostrando lesão irreversível dos elementos medulares para o
grupo exposto nas primeiras 24h para 50x e 400x. Há uma medula hiperpopulada com reação
leucemóide. Da mesma forma, encontramos exatamente a mesma lesão e reações para os
grupos expostos até 72h (Figura 4.76e, f, g e h). O fato mostra que independentemente dos
voláteis e de sua concentração, além da presença dos demais hidrocarbonetos, há uma reação
da medula devido à intoxicação, causando lesão. Surpreendentemente, no grupo exposto por
48h cumulativas (Figura 4.76i e j), a histologia mostra uma medula de aspecto morfológico
normal, com apenas leve diminuição da série branca. A partir desta observação é possível se
pressupor a existência de um mecanismo de agressão e recuperação da medula óssea que
independe do grau de contaminação e do tempo de exposição. Aparentemente, há uma intensa
lesão medular nas primeiras 24h de exposição ao contaminante e, com o passar do tempo,
apesar de continuar exposto, o animal consegue reverter o quadro. O fato pode explicar
porque frentistas e outros trabalhadores de refinarias, etc conseguem manter suas atividades
diárias sem que haja maiores conseqüências, uma vez que a medula óssea sofre um processo
de adaptação nas horas seguintes à exposição. Isso não se aplica a longo prazo.
A histologia dos pulmões nos diferentes grupos pode ser vista na Figura 4.77. A Figura 4.77a
e b mostram o grupo controle, com espaços alveolares aerados, com ausência de edema ou
reação inflamatória. As Figuras 4.77c e d apresentam o grupo exposto às primeiras 24h,
mostrando infiltrado com polimorfonucleares e mononucleares (linfócitos) em espaço
perialveolar com espessamento alveolar importante, congestão venular e células apoptóticas.
Observa-se ainda pneumonite descamativa e secreção brônquica, além de intenso enfisema.
Nas Figuras 4.77e e f observa-se o mesmo padrão para o grupo submetido no período de 24 –
48h, com o aparecimento de restos celulares e hemorragia. No grupo exposto durante o
período de 48 – 72h (Figura 4.77g e h) observa-se um pouco de melhora do quadro do dia
anterior, com lesões próximas principalmente aos brônquios mais calibrosos. O grupo de 48h
cumulativas apresenta o mesmo padrão do anteriormente descrito (Figura 4.77i e j). Observa-
se que da mesma forma que a medula, não importa o grau ou o período exposto à
contaminação, a lesão sempre ocorre. Entretanto, o pulmão não consegue se regenerar como a
169
medula óssea no tempo de 48h cumulativas, possivelmente necessitando de um período bem
maior. Ao contrário do que se poderia esperar, os BTEX não são os principais causadores de
lesão aguda tanto na medula como nos pulmões, pois observa-se sempre o mesmo padrão,
inclusive em um período onde estes contaminantes não estão mais presentes no solo.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
170
(g)
(h)
(i)
(j)
Figura 4.76: Alterações histológicas da medula óssea em aumentos de 50x (coluna da
esquerda) e 400x (coluna da direita), para o grupo controle (a, b), 0 – 24h de exposição (c, d),
24 – 48h (e, f), 48 – 72h (g, h) e 48h cumulativas (i, j)
Por fim, a Figura 4.78 mostra a histologia dos rins nos diferentes grupos. A Figura 4.78a e b
mostram o grupo controle, com glomérulos normais e alça de Henle normais, sem edema ou
reação inflamatória. Há diminuta vacuolização do epitélio tubular, com predomínio de células
da cortical. Na Figura 4.78c e d observa-se que há um aumento da vacuolização do epitélio
dos túbulos renais, mantendo o predomínio de células da cortical, sem demais alterações.
Observa-se que o padrão encontrado na Figura 4.78c e d se mantém em e, f, g e h, voltando à
condição basal, ou seja, idem ao controle, em i e j.
Alterações tubulares vacuolares ou hidrópicas ocorrem nas células tubulares em uma ampla
variedade de condições. Tais alterações são freqüentemente referidas como nefrose osmótica,
pois representam um distúrbio das relações osmóticas normais dentro da célula. Em alguns
casos, estas alterações histológicas estão relacionadas à administração intravenosa de
substâncias como a sucrose, dextrano ou manitol. Também são observadas em cadáveres
171
doadores de rim, e algumas vezes na hipocalemia (Meadows, 1973; Junqueira e Carneiro,
2004). A vacuolização, por ser uma reação inespecífica, explica o fato de não ter havido
qualquer alteração de creatinina sérica.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
172
(g)
(h)
(i)
(j)
Figura 4.77: Alterações histológicas do pulmão em aumentos de 50x (coluna da esquerda) e
400x (coluna da direita), para o grupo controle (a, b), 0 – 24h de exposição (c, d), 24 – 48h (e,
f), 48 – 72h (g, h) e 48h cumulativas (i, j)
4.2.6 Considerações Finais sobre Toxicidade e Lesão Celular
Conforme o EPA (2005), o biomonitoramento de compostos orgânicos voláteis é difícil de ser
obtido, pois estes gases não persistem por muito tempo no organismo. Por esta razão, dados
de biomonitoramento são indicativos de exposição recente. O ATSDR (2005) sugere como
estudos de rotina de laboratório a verificação do hemograma com plaquetas, glicose e
eletrólitos em populações expostas agudamente. No caso de inalações mais severas, sugere a
realização de eletrocardiograma (ECG), testes de função renal, raio-X de tórax e
monitorização do paciente por oximetria de pulso. O órgão dos EUA relata ainda que a
identificação, ou medidas diretas dos hidrocarbonetos no sangue não tem aplicação clínica,
apesar destes testes serem utilizados para documentar a exposição. No Brasil, o Ministério da
173
Saúde, através da Norma 7 (NR7), preconiza a investigação de fenol, carboxi-hemoglobina,
ácido hipúrico, ácido metil-hipúrico e ácido trans-trans-mucônico em populações expostas a
hidrocarbonetos. A presente pesquisa mostra a importância da realização de hemograma com
plaquetas, uréia, AST, eletrólitos (potássio e cálcio iônico, ou cálcio total com proteínas),
glicose, LDH e exame comum de urina para a monitorização de populações expostas a
hidrocarbonetos, compatível com as sugestões do ATSDR (2005).
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
174
(g)
(h)
(i)
(j)
Figura 4.78: Alterações histológicas do rim em aumentos de 50x (coluna da esquerda) e 400x
(coluna da direita), para o grupo controle (a, b), 0 – 24h de exposição (c, d), 24 – 48h (e, f),
48 – 72h (g, h) e 48h cumulativas (i, j)
4.3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente trabalho abrange um estudo integrado que busca as relações existentes entre
processos de biorremediação e alterações das condições fisiológicas dos organismos que
habitam os locais contaminados. Observou-se que materiais orgânicos melhoram as
características gerais dos solos ao final dos tratamentos ao mesmo tempo retém o
contaminante por um maior período de tempo. Existe uma clara influência dos
microrganismos nos processos de biorremediação da gasolina e diesel analisados. A umidade
retém e auxilia na mobilização de contaminantes nos solos, identificados por cromatografia
gasosa. Quanto aos testes em modelo animal, observou-se alterações importantes no seu
metabolismo/fisiologia/histologia e, em especial, identificou-se um novo exame que pode
175
auxiliar na análise fisiopatológica de órgãos. Uma perfeita integração entre as áreas de
engenharia geotécnica, agronomia, medicina, biologia e farmácia e bioquímica foi obtida,
provando a necessidade de projetos multidisciplinares no futuro da pesquisa.
“Não se pode conhecer o todo sem as partes e nem as partes sem o todo”
(Blaise Pascal, 1623-1662)
CAPÍTULO 5 – CONCLUSÕES
A seguir são apresentadas as conclusões desta pesquisa, divididas em biorremediação do solo,
toxicidade e lesão celular em modelo animal e sugestões para futuros trabalhos.
5.1 BIORREMEDIAÇÃO DO SOLO
A incorporação de gasolina e diesel ao solo com e sem adições produziu alterações na
evolução cumulativa de CO
2
quando comparada ao solo controle. O processo de remediação
com lodo inicia com um grande incremento de CO
2
, enquanto a adição da gasolina com e sem
NPK ao lodo parece inciar o processo somente alguns dias após a mistura. O solo com
gasolina com e sem NPK tem uma evolução de CO
2
mais lenta, sendo que apenas aos 10 dias
o NPK parece fazer algum efeito no tratamento. A adição de NPK às amostras contendo lodo
não trouxe qualquer benefício ao processo de biorremediação já que o lodo por si só contém
todos os elementos necessários ao crescimento microbiano.
A atividade microbiana medida através da liberação de CO
2
não apresentou diferenças
significativas ao final do período de tratamento para as gasolinas utilizadas (posto de
combustível e REFAP). A resposta da bioestimulação, através da adição de nutrientes é
significativa quando comparamos as gasolinas com e sem o NPK, e mais ainda quando
comparados aos níveis de CO
2
liberado destes tratamentos com o controle.
A análise pelo método da lâmina enterrada mostrou que, nas amostras contaminadas com
gasolina e diesel sem adições, não houve a ocorrência de fungos, sendo encontrados apenas
alguns actinomicetos (nenhum na gasolina) e uma pequena quantidade de bactérias. A adição
de lodo produz um aumento significativo da atividade microbiana, a qual é mantida até
mesmo após a adição dos contaminantes.
A análise microbiana por contagem direta mostrou que há uma queda inicial do número de
fungos em todos os tratamentos realizados contendo gasolina, em função da estabilização do
microcosmo ao novo ambiente. No solo natural (controle) e no tratamento com lodo há um
aumento do número de fungos. No caso dos tratamento com solo e gasolina (“atenuação
177
natural”) e nos casos com bioestimulação com NPK também há a mesma queda no número de
fungos no inicio do processo de remediação, porém necessitando de um maior tempo para a
aclimatação da população fúngica. Ao considerar a contagem bacteriana, observa-se um
rápido crescimento no caso do solo controle e do lodo já ao início dos tratamentos, passando
por períodos de oscilação e atingindo um patamar. Nos solos com gasolina há uma queda no
número de bactérias em relação à contagem inicial. E o tratamento com gasolina e NPK
apresenta uma estabilização desde o início do tratamento.
A Pseudomonas sp. foi encontrada em todos os tratamentos. O Aspergillus sp. não foi
encontrado de maneira significativa em qualquer um dos tratamentos após sua contaminação
ou mesmo estimulação. Na análise do lodo, foi possível a observação de um rico consórcio de
microrganismos, contendo Penicillium sp. e diversos tipos de bacilos gram-positivos.
Na primeira etapa da pesquisa, observou-se que a adição dos contaminantes ao solo não
produziu variação significativa de pH ao longo do tempo. Entretanto, a análise do pH na
segunda etapa dos ensaios mostra que há uma tendência de queda ao final do período –
acidificação – para praticamente todos os tratamentos. A variação total é pequena e ocorre
numa faixa menor que 1,0.
A contaminação por gasolina pura no solo tende a manter estável a condutividade elétrica do
solo ao longo do período de biorremediação, e diminui com a adição de NPK. No solo
controle, ao contrário, observa-se uma tendência natural de aumento da condutividade, em
uma relação inversamente proporcional ao pH. No caso dos tratamentos com lodo, observa-se
também uma tendência de aumento de condutividade elétrica com o tempo. Ao consider-se o
solo com lodo, gasolina e NPK verifica-se uma relação inversa, ou seja, o NPK parece causar
uma redução da condutividade elétrica ao longo do tempo.
Nos ensaios com gasolina e diesel oriundos do posto de combustível, as maiores taxas na
forma de amônia ocorreram principalmente nos tratamentos com a adição de nutrientes (lodo
e NPK) com diferenças significativas quando comparados às amostras controle. E nos ensaios
com a gasolina da REFAP, observa-se basicamente o mesmo.
Foi feita uma análise por cromatografia gasosa em microcosmos estéreis e não-estéreis para
fins de verificação dos efeitos da microbiota nos compostos voláteis. Os testes foram
realizados apenas com a contaminação de gasolina sem NPK e com NPK. De forma geral, os
178
dados obtidos mostram um significante efeito da microbiota na biorremediação dos
hidrocarbonetos analisados.
Apesar da volatilização do benzeno e toluneno ser intensa, observa-se uma importante
contribuição da microbiota, quando vemos que nos solos contendo os microrganismos já não
há mais estes hidrocarbonetos no tempo de aproximadamente 24h do início dos experimentos.
Idem ao estudo feito anteriormente para o benzeno e o tolueno, a microbiota ajuda a remover
rapidamente o C
8
já nas primeiras 24h. Ao contrário dos outros componentes da gasolina, as
frações C
9+
são mais difíceis de serem degradadas levando maior período de tempo para
serem removidas dos solos. Diferentemente das demais análises, os C
9+
aromáticos ainda
perduram no solo após 26 dias.
O lodo industrial retém os hidrocarbonetos em sua matriz por um período maior de tempo. A
redução aos mesmos níveis encontrados para os demais tratamentos leva em torno de 6 dias a
mais para ocorrer, ficando ainda uma parcela residual até o 35º dia. Apesar de trazer uma
condição ambiental melhor ao final dos tratamentos, este pode ser um fator crucial para a
saúde pública de populações que vivam ao redor de vazamentos de combustíveis.
A variação do pH do solo com a concentração de gasolina mostrou que o pH aumenta com o
incremento do contaminante, atingindo um patamar aos 6mL/20mL água em 4,9. Entretanto,
para fins práticos, as diferenças de valores são muito pequenas. No caso do diesel não houve
qualquer variação quando se aumenta ou diminui a quantidade do contaminante.
Na avaliação da variação da condutividade elétrica na gasolina, observou-se que há,
inicialmente, um aumento da condutividade, que decai com o incremento do contaminante.
No caso do diesel, temos uma exponencial decrescente até 8mL/10g solo, a partir de onde a
condutividade elétrica se torna constante em 8µS. Contaminações de até 3mL/10g solo
poderiam ser confundidas com o solo controle.
Há um aumento significativo da formação de agregados de solo durante os processos de
biorremediação. Todos os tratamentos mostraram agregação de solo, com correspondente
diminuição das partículas mais finas. Nos tratamentos com “bioaugmentação”, este aumento
chega a ser maior que 100%.
179
Há uma influência significativa dos regimes pluviométricos na percolação de contaminantes
no solo. Quando não há regime pluviométrico estabelecido, as concentrações dos
contaminantes avaliados caem ao limite de detecção em um período menor de tempo. Com
regimes pluviométricos, a biorremediação se torna mais dificultada e as concentrações
superficiais diminuem mais lentamente. A volatilização se torna mais difícil pela diminuição
da aeração no solo. Em regimes pluviométricos mais intensos (50 e 100mm), há uma maior
migração de contaminantes da superfície para a profundidade. A ordem de biorremediação
ocorre primeiramente para o benzeno, seguido pelo tolueno, C
8
aromático, C
9+
aromático
A análise de metais pesados no solo mostrou uma baixa concentração dos elementos
avaliados. Considerando os valores mínimos destes metais nos solos, recomendados pelo
EPA, observou-se que todos os valores encontravam-se dentro da faixa de normalidade.
5.2 TOXICIDADE E LESÃO CELULAR EM MODELO ANIMAL
Nos experimentos em modelo animal, observou-se que as concentrações de benzeno, tolueno
e MTBE decaem para valores mínimos (< 3 mg/kg solo) já nas primeiras 24h do início dos
ensaios. O C
8
aromático também diminuiu sua concentração durante o período de ensaios,
mas somente chega ao limite de detecção em 72h. Os C
9+
aromáticos, por possuírem cadeias
maiores, perduram por mais tempo no solo, apresentando teores de até 50% da concentração
inicial com 72h.
O grupo de animais exposto às primeiras 24h ao solo contaminado sofreu um aumento de
células brancas (White Blood Cells) significativo em relação ao controle, fato que não
ocorreu com os demais grupos de animais expostos aos contaminantes. A análise das células
vermelhas (Red Blood Cells), da hemoglobina (Hb), do volume corpuscular médio (VCM), da
hemoglobina corpuscular média (HCM) e da concentração hemoglobínica corpuscular média
(CHCM) não mostrou qualquer alteração significativa para qualquer que seja o grupo em
estudo. O hematócrito (Hct) sofreu uma redução significativa nas primeiras 48h nos grupos
expostos à gasolina. As alterações, entretanto, apesar de significativas estatisticamente, não o
são fisiologicamente, pois não acarretam modificações hemodinâmicas. Houve plaquetopenia
no grupo de animais expostos às primeiras 24h do experimento. A redução de plaquetas foi
acompanhada por alterações medulares, vistas na histologia. E houve um aumento no número
180
de linfócitos no grupo de animais expostos nas primeiras 24h ao experimento. Nos grupos
expostos por 48h cumulativas, parece que o organismo dos animais consegue reverter o
quadro ao final do período de exposição.
Não houve alterações da creatinina sérica entre os grupos, mostrando que a creatinina sérica
não se modifica em exposição aguda aos hidrocarbonetos. No caso da creatinina urinária, a
análise estatística não foi considerada porque houve problemas na coleta de urina nos
primeiros grupos. E houve uma dimunuição da uréia sérica no grupo exposto por 48h
cumulativas. Entretanto, considerando a variação dos outros grupos e a pequena variação
fisiológica (50 – 65 mg/dL), a alteração encontrada no grupo exposto por 48h não parece ter
um significado importante do ponto de vista fisiológico.
A AST possui pouca dispersão de valores, e é possível se observar que o grupo exposto por
48h cumulativas apresentou um aumento da variável. No caso de uma maior concentração ou
maior tempo de exposição poderia-se esperar uma sobrecarga dos contaminantes para o
fígado metabolizar, acarretando lesões nos hepatócitos. Entretanto, a ALT possui uma grande
dispersão da normalidade, não ocorrendo qualquer alteração significativa entre os grupos
(P>0,05). Os ratos Wistar não apresentaram qualquer nível de gama-glutamil transferase
(γGT) detectável, até mesmo em grupos expostos aos contaminantes, ficando este parâmetro,
portanto, fora das análises.
A fosfatase alcalina, as proteínas totais no soro e proteínas urinárias, o sódio e o potássio não
apresentaram diferenças significativas entre os grupos de estudo. Da mesma forma, a
creatinaquinase e frações (CPK e CPK-MB) e proteínas específicas (troponina “I”) foram
analisadas, sem que fosse encontrada qualquer diferença significativa entre os grupos,
mostrando que, aparentemente, não há lesão cardíaca.
Os animais expostos à aspiração de hidrocarbonetos de gasolina necessitam de mais glicose
para suas atividades metabólicas. De forma geral, apesar do grupo exposto às primeiras 24h
não diminuir sua glicose com significância estatística, é possível se observar uma diminuição
em relação aos grupos controle e 48-72h.
A lactato desidrogenase (LDH) mostrou uma diferença significativa do grupo exposto por 48h
cumulativas para os demais grupos. E com relação ao cálcio sérico total, observou-se que há
181
uma tendência de aumento nas primeiras 24h de exposição à gasolina, diminuindo sua
concentração nas horas consecutivas até atingir o valor controle no terceiro dia de exposição.
Observou-se que os grupos expostos no primeiro momento de contaminação, incluindo o
grupo com efeito cumulativo, apresentam acidificação do macerado renal em relação ao
controle e ao grupo exposto mais tardiamente. O estudo da condutividade elétrica
normalizada por peso de rim não mostrou significância estatística entre os grupos. Entretanto,
a condutividade elétrica normalizada pela relação peso de rim sobre peso de proteínas renais
mostra que esta relação normalizada diminui significativamente nos grupos sujeitos à
aspiração de hidrocarbonetos de gasolina.
O pH do macerado pulmonar nos diferentes grupos e dias de tratamento não mostrou
alterações. E o estudo da condutividade elétrica normalizada por peso de pulmão mostrou que
há significância estatística do grupo exposto nas primeiras 24h em relação aos expostos por
48-72h e 48h cumulativas. O grupo controle não apresentou diferença significativa para o
grupo de 24h, apesar do último mostrar tendência de diminuição do parâmetro normalizado. E
a condutividade elétrica normalizada pela relação peso de pulmão e peso de proteínas renais
mostrou que a relação normalizada diminui significativamente no grupo sujeito à aspiração de
hidrocarbonetos de gasolina nas primeiras 24h.
O pH e a condutividade elétrica do plasma normalizada por peso de proteínas mostrou que
não há diferença significativa entre os grupos (P>0,05), apesar de haver uma acidificação do
pH na condição de 48h cumulativas. Os parâmetros urinários não puderam ser avaliados.
Nos animais expostos aos hidrocarbonetos por 24h, a medula óssea apresentou necrose e
apoptose difusas, mostrando lesão irreversível dos elementos medulares, uma medula
hiperpopulada com reação leucemóide. No grupo exposto por 48h cumulativas, a histologia
mostrou uma medula de aspecto morfológico normal, com apenas leve diminuição da série
branca. A partir desta observação foi possível pressupor a existência de um mecanismo de
agressão e recuperação da medula óssea que independe do grau de contaminação e do tempo
de exposição.
A histologia dos pulmões nos diferentes grupos expostos à gasolina mostrou um infiltrado
com polimorfonucleares e mononucleares (linfócitos) em espaço perialveolar com
espessamento alveolar importante, congestão venular e células apoptóticas. Observou-se
182
ainda pneumonite descamativa e secreção brônquica, além de intenso enfisema, piorando nas
horas seguintes com o aparecimento de restos celulares e hemorragia. Ao contrário do que se
poderia esperar, os BTEX não são os principais causadores de lesão aguda tanto na medula
como nos pulmões, pois observa-se sempre o mesmo padrão, inclusive em um período onde
estes contaminantes não estão mais presentes no solo.
Nos rins dos animais expostos por 24h observou-se uma vacuolização do epitélio dos túbulos
renais, mantendo o predomínio de células da cortical, sem demais alterações, voltando ao
padrão normal em 48h cumulativas.
Por fim, sugere-se um protocolo para exames de rotina de populações expostas a
hidrocarbonetos composto de hemograma com plaquetas, creatinina e uréia, exame comum de
urina, aspartato aminotransferase, eletrólitos (potássio e cálcio iônico, ou cálcio total com
proteínas séricas), glicose e lactato desidrogenase.
183
SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS
• Estudar os processos de biorremediação em outros tipos de solos, em especial argilas,
que são solos predominantes nos ambientes tropicais e subtropicais;
• Avaliar a biorremediação através de cromatografia em intervalos mais curtos de
tempo, analisando de forma detalhada a volatilização;
• Estudar os processos de biorremediação com cepas específicas em solos esterilizados;
• Estudar percolação e biorremediação em diferentes profundidades, com novas
condições de contorno e em corpos de prova com outros diâmetros, associando-se à
uma técnica de elementos finitos e fractais;
• Avaliar formação de biofilmes por microscopia eletrônica;
• Estudar agregação em diferentes tempos e em outros solos contaminados, avaliando
sua resistência ao cisalhamento e permeabilidade;
• Avaliar macerados de outros órgãos e aumentar o número de animais, obtendo-se
curvas para futuras avaliações patológicas;
• Estudar diferentes respostas biológicas de animais expostos por diferentes tempos e
efeitos cumulativos, isolando-se por compostos químicos específicos, buscando-se
identificar os reais causadores de lesão;
• Avaliar a sobrevida dos animais após serem retirados do ambiente contaminado;
• Avaliar fatores de agregação plaquetária, resposta inflamatória, relações de glicose
com o lactato, o bicarbonato e o cortisol, além de uma melhor avaliação da urina com
o exame comum de urina;
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