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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: IMPLANTODONTIA
RICARDO HOCHHEIM NETO
ANÁLISE COMPARATIVA DA REGENERAÇÃO ÓSSEA DE
DIFERENTES ARCABOUÇOS EM DEFEITOS
CONFECCIONADOS EM FÊMURES DE COELHOS
FLORIANÓPOLIS
2010
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
RICARDO HOCHHEIM NETO
ANÁLISE DE TESTES REGENERATIVOS DE DIFERENTES
ARCABOUÇOS EM FÊMURES DE COELHOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia, Área de
Concentração Implantodontia, do Centro
de Ciências da Saúde, da Universidade
Federal de Santa Catarina, como requisito
parcial para obtenção do grau de Doutor
em Odontologia.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
FLORIANÓPOLIS
2010
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Ficha catalográfica elaborada pela
Biblioteca Universitária da FURB
H685a
Hochheim Neto, Ricardo
Análise de testes regenerativos de diferentes arcabouços
em fêmures de coelhos / Ricardo Hochheim Neto. –
Florianópolis: 2010.
98 p. : il.
Orientador: Ricardo de Souza Magini.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Santa
Catarina, Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Inclui bibliografia
1. Implantodontia. 2. Estereologia. I. Magini, Ricardo
de Souza. II. Universidade Federal de Santa Catarina,
Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
CDD 617.69
RICARDO HOCHHEIM NETO
ANÁLISE DE TESTES REGENERATIVOS DE DIFERENTES
ARCABOUÇOS EM FÊMURES DE COELHOS
Esta tese foi julgada adequada para obtenção do título de DOUTOR EM
ODONTOLOGIA – ÁREA DE CONCENTRAÇÃO IMPLANTODONTIA e
aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia
da Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianópolis, 27 de maio de 2010.
_____________________________________________
Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade
Federal de Santa Catarina
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Prof. Dr. Ricardo de Souza Magini
Orientador
______________________________________________
Prof. Dr. Cesar Augusto Magalhães Benfatti
Membro
______________________________________________
Prof. Dr. André Luis Zétola
Membro
______________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Tramonte
Membro
______________________________________________
Prof. Dr. Aguedo Aragones
Membro
Dedico este trabalho a meu pai que durante toda sua e minha
vida, incluindo período em que cursei Odontologia na Universidade
Federal de Santa Catarina, e após ter me formado, no convívio durante
momentos de alegria e tristeza, e no período que atuamos
conjuntamente em sua clínica se mostrando um grande mestre e amigo
de enorme destreza e conhecimentos não somente profissionais, que
acresceu a muitas pessoas com sua personalidade, honestidade e
infinitos ensinamentos. Que Deus o tenha.
AGRADECIMENTOS
Inicio meus agradecimentos a minha família. Meu irmão Günther
Jr. que sempre serviu de exemplo e inspiração em meus afazeres,
inclusive na escolha da profissão. Meus pais com extremo destaque por
me trazerem ao mundo e pela educação e exemplos proporcionados.
Minha mãe Renildes ao se formar em Farmácia, na Faculdade de
Farmácia e Odontologia de Santa Catarina já em 1958, pela dedicação
no decorrer da pesquisa com grande apoio e incentivo, e meu pai
Günther em Odontologia na mesma faculdade em 1957, e que me
iniciou na minha profissão em 1981, como grande mestre de grandes
conhecimentos. Meus avós, paterno e materno, Ricardo Hochheim
Sobrinho e Beno Baltazar Wiedercker, já odontólogos formados pelas
escolas politécnicas de Santa Catarina e Rio Grande do Sul, que geraram
respectivamente a Universidade Federal de Santa Catarina e do Rio
Grande do Sul, por momentos de contato com a profissão já durante a
infância.
Aos funcionários do CEPID (Dolores, Gisella e Mirian), pelo
convívio, dedicação e amizade. A secretaria do Programa de Pós-
Graduação em Odontologia Ana pela educação, competência e sempre
prontoatendimento. As queridas amigas Neli e Elizia, Biólogas do
Laboratório de Patologia da Universidade Regional de Blumenau,
responsáveis pelo trabalho de confecção das lâminas histológicas, sob
orientação do professor Doutor Ricardo Tramonte, grande
personalidade, já meu mestre no período da graduação pela amizade e
auxílio na orientação para confecção e interpretação do trabalho
histológico e resultados do trabalho científico.
Ao Dr. Aguedo Aragones por todas as oportunidades e
fornecimento de três biomateriais utilizados nesta pesquisa.
Aos colegas de Doutorado, Cleide, Aline, João Rodrigo e César
(Co-Orientador), todos de capacidade indiscutível, pelo ótimo convívio,
amizade e colaboração mútua.
Aos professores do curso pela sua dedicação.
Nosso coordenador, Doutor Antonio Carlos Cardoso pela sua
capacidade, competência, organização, reconhecimento e conhecimentos
transmitidos tanto nas áreas de Oclusão e Prótese, como na
Implantodontia.
Meu orientador Ricardo de Souza Magini, como amigo sempre
muito humano com sua visão na escolha de seus discípulos e temas a
serem abordados, provando sua inteligência com seu sucesso
profissional, servindo de exemplo e inspiração a todos que o cercam.
Aos amigos Scarso, Dinato e Zétola pelos vastos ensinamentos.
Aos colegas Mestrandos, Gustavo, Pamela, Ernesto, João,
Niltom, Leonardo, Zé e Armando pela amizade, companheirismo e
auxílio no trabalho.
A amiga Norma, funcionária da FURB colaborando em nossa
tese na radiologia.
HOCHHEIM NETO, Ricardo. Análise de testes regenerativos com
diferentes arcabouços em fêmures de coelhos. 2010. 98 p. Tese
(Doutorado em Odontologia) – Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.
RESUMO
Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar histologicamente a
influência de: dois enxertos ósseos bovinos, Orthogen (Baumer) e Bio-
Oss
®
; dois polímeros compositos, PLGA (Boehringer Ingelheim) e
PLGA+HA, (HA Genius-Baumer), osso autógeno e controle negativo de
coágulo, relacionando-os a presença de tecido inflamatório, materiais de
enxerto, osso neoformatado, tecidos conjuntivos e adiposos. Materiais e
métodos: 21 coelhos da raça Nova Zelândia foram utilizados neste
trabalho. Cada animal recebeu 6 enxertos sendo dois grupos de controle
colocados no fêmur direito e esquerdo. Os coelhos sofreram eutanásia
em 3 etapas nos 15, 30 e 60 dias pós-opreratórios. As amostras retiradas
dos animais foram processadas para microscopia óptica e coradas pela
técnica da hematoxilina e eosina (HE). A análise quantitativa foi feita
em cortes nas lâminas seguindo o procedimento para análises
estererológicas segundo os parâmetros estipulados por Mandarin-de-
Lacerda (2003). Os resultados obtidos pela metodologia empregada
indicaram que a regeneração óssea dos enxertos empregados foram
superiores quando comparados ao coágulo. Conclusão: Todos os
substitutos ósseos tiveram melhor resultado em relação ao controle
negativo.
Palavras-chave: Engenharia tecidual óssea. Enxertos Heterógenos.
Enxertos Poliméricos. PLGA. Hidroxiapatita. Estereologia.
HOCHHEIM NETO, Ricardo. Comparative analysis of regenerative
tests which different scaffolds on rabbit’s femurs. 2010. 98 p. Thesis
(Doctorate in Dentistry) - Postgraduate Program of Dentistry, Federal
University of Santa Catarina, Florianópolis, Brazil.
ABSTRACT
Purpose: The goal of this investigation was to evaluate the histological
influences of two bovine bone grafts, Orthogen and Bio-Oss
®
, two
composite polymers, PLGA and PLGA+HA (HA-Genius-Baumer),
autogenous and negative control clot,in relation of inflammatory tissue,
graft tissue, neo formatted bone, conjunctive and adipose tissues.
Materials and methods: one animal sample of 21 rabbits from the New
Zeeland breed was used. Each animal received 6 grafts, 2 groups control
placed in the right and left femurs. The rabbits were divided in 3 groups
and 15, 30 and 60 days for euthanasia. The samples were processed
through the hematoxylin and eosin (he) technique. Quantitative analysis
was made in blades with stereology according Mandarin of Lacerda
(2003). Results: We showed with this methodology high bone
regeneration in all grafted area compared to coagulum defects.
Conclusion: All bone substitutes and autogenous bone had the best
result compared with negative control.
Keywords: Bone tissue engineering. Xenogenous. Grafts. Polimeric
Grafts. PLGA. Hydroxyapatite. Stereology.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 - Osso Xenógeno (Orthogen Baumer) 41
Figura 02 - Bio-Oss
®
41
Figura 03 - Arcabouço PLGA vista lateral 42
Figura 04 - Arcabouço de PLGA+HA vista lateral 42
Figura 05 - Arcabouço PLGA compatível com o diâmetro da trefina
(5 mm) 43
Figura 06 - Equipe cirúrgica da pós-graduação em odontologia
(Centro de Ensino e Pesquisa em Implantes dentários
da UFSC) 44
Figura 07 - Desinfecção e Incisão cutânea 45
Figura 08 - Incisão da fáscia muscular 45
Figura 09 - Exposição do periósteo e acesso direto a estrutura
óssea 46
Figura 10 - Localização da primeira perfuração 46
Figura 11 - Espaçamento dos defeitos 47
Figura 12 - Remoção da estrutura óssea com 5 mm de profundidade
e 5 mm de diâmetro 48
Figura 13 - Primeiro defeito direito preenchido com Bio-Oss
®
48
Figura 14 - Inserção do PLGA no defeito direito 49
Figura 15 - Segundo defeito direito preenchido com PLGA 49
Figura 16 - Preenchimento do terceiro defeito com Orthogen 50
Figura 17 - Obtenção de osso autógeno através de broca trefina 50
Figura 18 - Amostra de enxerto autógeno trefinado 51
Figura 19 - Obtenção de todas as amostras de enxerto autógeno 51
Figura 20 - Triturador de osso 52
Figura 21 - Osso autógeno triturado 52
Figura 22 - Primeiro defeito esquerdo (inserção do arcabouço de
PLGA+HA) 53
Figura 23 - PLGA+HA inserido 53
Figura 24 - Segundo defeito esquerdo (inserção de osso autógeno
triturado) 54
Figura 25 - Enxerto autógeno instalado 54
Figura 26 - Terceiro defeito esquerdo (alvéolo com preservação de
coágulo) 55
Figura 27 - Sutura reabsorvível (Vicryl Ethicon) 55
Figura 28 - Sutura reabsorvível (Vicryl Ethicon) 56
Figura 29 - Sutura do segundo plano com fio não absorvível
(Nylon Ethicon) 56
Figuras 30 a 36 - Fêmur direito - 15 dias 59
Figuras 37 a 40 - Fêmur esquerdo -15 dias 60
Figuras 41 e 42 - Grupo de 30 dias direita e esquerda 61
Figuras 43 a 46 - Fêmur direito - 30 dias 62
Figuras 47 a 50 - Fêmur esquerdo - 30 dias 63
Figura 51 - Grupo de 60 dias direita e esquerda 64
Figuras 52 a 59 - Fêmur direto - 60 dias 65
Figuras 60 a 66 - Fêmur esquerdo - 60 dias 66
Figura 67 - Desenho da sequência de remoção das amostras
indicando o sentido dos cortes realizados no micrótomo
para obtenção das lâminas 67
Figura 68 - Desenho dos cortes microtométricos transversais aos
cilindros das amostras 68
Figura 69 - Amostra da lâmina histológica 68
Figura 70 - Lâminas 15 dias (A com Régua e B com Grelha) 70
Figura 71 - Exemplo PLGA 15 dias 72
Figura 72 - Exemplo de Coágulo 30 dias (Osteócito) 73
Figura 73 - Exemplo de PLGA 30 dias 73
Figura 74 - Exemplo de PLGA+HA 30 dias 74
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - TI - QA em cm
2
75
Gráfico 2 - TI – QA em cm
2
- 15, 30 e 60 dias 75
Gráfico 3 - ME - QA em cm
2
76
Gráfico 4 - ME – QA em cm
2
- 15, 30 e 60 dias 77
Gráfico 5 - ON - QA em cm
2
78
Gráfico 6 - ON - QA em cm
2
- 15, 30 e 60 dias 78
Gráfico 7 - TC - QA em cm
2
79
Gráfico 8 - TC - QA em cm
2
- 15, 30 e 60 dias 80
Gráfico 9 - TA - QA em cm
2
81
Gráfico 10 - TA - QA em cm
2
- 15, 30 e 60 dias 81
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Somatório de perfis de Tecido Inflamatório em cm
2
74
Tabela 2 - Somatório de perfis de Material de Enxerto em cm
2
76
Tabela 3 - Somatório de perfis de Osso Neoformado em cm
2
77
Tabela 4 - Somatório de perfis de Tecido Conjuntivo em cm
2
79
Tabela 5 - Somatório de perfis de Tecido Adiposo em cm
2
80
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BD-i Densidade Óssea Peri-implantar
BIC Contato Osso-Implante
BMP Proteína Morfogenética Óssea
cm Centímetro
CO
2
Gás Carbônico
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
FDA Food and Drug Administration
GF/PL Conformação Gasosa e Partículas por Lixiviação
GPC Permeação Cromatográfica Gel
H
2
O Água
HA Hidroxiapatita
HE Hematoxilina e Eosina
HCAEC Células Endoteriais da Artéria Coronária de Humanos
hESCs Celulas Mesenquimais Indiferenciadas de Embriões
Humanos
hPBDs Células Derivadas de Osso Humano Primário
ISO International Standardization for Organization
KCL Cloreto de Potássio
Kg Quilograma
mg Miligrama
ml Mililitro
µm Micrometro
m/m Massa por Massa
m/v Massa por Volume
ME Material de Enxerto
MET ou TEM Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV ou SEM Microscopia Eletrônica de Varredura
mm Milimetro
MTT Teste de Citotoxicidade
NHA Hidroxiapatita Nanoparticulada
non-HA Hidroxiapatita Nanoparticulada
ON Osso Neoformado
PCL Poli(ε-caprolactona)
OC-hESCs Células Osteogênicas Derivadas de Células
Mesenquimais Indiferenciadas de Seres Humanos
PDLLA Poli(ácido DL-láctico)
PGA Poliácido Glicólico
PLA Poliácido Láctico
PLGA Poli(ácido láctico-co-ácido glicólico)
PLLA Poli(ácido L-láctico)
POE Poliortoesteres
PTFE Politetrafluoretileno
PVA Poliálcool Vinílico
PRP Plasma Rico em Plaquetas
QA Densidade de Perfis
rhBMP-2 Proteína Óssea Morfogenética Humana Recombinante
RPM Rotação Por Minuto
SC/EL Método eg-somatória de Solvente e Partículas
GF/PL Técnica de Conformação Gasosa por Lixiviação
TA Tecido Adiposo
TC Tecido Conjuntivo
TCP Fosfato Tricálcio
TI Tecido Inflamatório
TPS Spray de Plasma de Titânio
UI Unidade Internacional
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 16
2 OBJETIVOS 20
2.1 OBJETIVO GERAL 20
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20
3 REVISÃO DE LITERATURA 21
4 MATERIAIS E MÉTODOS 40
4.1 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS 43
4.2 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS 66
4.3 DENSIDADES DE PERFIS NA ÁREA-TESTE (QA)
EM ESTEREOLOGIA 70
4.3.1 Cálculo da Densidade de Perfis 71
5 RESULTADOS 72
6 DISCUSSÃO 83
7 CONCLUSÃO 88
REFERÊNCIAS 89
16
1 INTRODUÇÃO
A possibilidade de recuperação de defeitos ósseos há muito
tempo desperta o interesse dos pesquisadores em desenvolverem
materiais que possam apresentar características biológicas aceitáveis e
serem usados como substitutos dos tecidos ósseos. De uma maneira
geral, o enxerto autógeno é o material ideal de preenchimento de
defeitos ósseos, visto o potencial osteogênico que o mesmo apresenta,
no entanto, nem sempre a utilização desse material é viável. Para coleta
de osso autógeno há necessidade de procedimentos cirúrgicos com
variados graus de morbidade, sendo este coletado do osso ilíaco, tíbia,
ramo ascendente da mandíbula, calvária ou mento, necessitando muitas
vezes de anestesia geral (BRANEMARK; SVENSSON; VAN
STEENBERGHE, 1995).
A cirurgia de enxerto ósseo reconstrutiva do esqueleto
maxilofacial é apropriada para ser usada na reabilitação funcional da
maxila, e pode ser usada para reparar defeitos traumáticos, atróficos ou
congênitos (JENSEN; SINDET-PEDERSEN; ENEMARK, 1998).
O enxerto de ossos é realizado para colocar implantes endósseos
em pacientes com defeitos maxilares resultantes de ressecamento
tumoral ou em pacientes com séria reabsorção óssea do processo
alveolar maxilar (DARLE, 1999 apud HOCHHEIM NETO, 2002).
A instalação de implantes para reabilitação protética na maxila
em pacientes com extensiva perda óssea e de tecidos moles é ainda um
desafio.
Frequentemente, estes pacientes seriam idealmente tratados
com enxertos aposicionais ou levantamento do assoalho do seio maxilar
e ou nasais (SCHRAMM et al., 1999; TRIPLETT; SCHOW; LASKIN,
2000; WEISCHER; SCHETTLER; MOHR, 1997).
Neste contexto, em função da necessidade de reabilitar pacientes
totalmente edêntulos, foram desenvolvidos os implantes odontológicos.
Tal empreitada obteve tamanho índice de sucesso que com o decorrer
dos anos fez surgir uma especialidade na área odontológica, sucedendo-
se alternativas de reabilitações parciais, unitárias, etc. Assim sendo,
devido ao alto índice de sucesso seu uso nos tratamentos de próteses
unitárias, parciais fixas, pacientes endentados totais, fissurados palatais
e submetidos à hemimaxilectomias, promove o restabelecimento das
funções do sistema estomatognático como estética, fonética, função
mastigatória e condição emocional do paciente. Em função da polêmica
em relação aos enxertos em seios maxilares, a alta porcentagem de
insucesso e da necessidade da obturação de comunicações bucossinusais
17
o Professor Per Ingvar Branemark e sua equipe desenvolveram o
implante zigomático, e o primeiro paciente foi tratado no ano de 1989.
Estes implantes foram desenvolvidos com finalidade de ancoragem no
osso zigomático para solução em reabilitações orais em ressecções de
maxilas e fissurados palatinos, sendo atualmente aplicadas nas maxilas
posteriores atrésicas (HOCHHEIM NETO, 2002).
Estes obstáculos encontrados pela implantodontia têm feito com
que pesquisadores procurem alternativas para minimizar o trauma para
resolução de determinados casos. Entre as técnicas atuais podemos citar
os osteótomos de Summers, distração óssea, fatores de crescimento
ósseo, plasma enriquecido, materiais aloplásticos modernos associados a
membranas lentamente absorvíveis e as novas superfícies dos implantes
(TRIPLETT; SCHOW; LASKIN, 2000).
A base de uma reabilitação oral com implantes dentários
representa uma presença óssea suficiente nas dimensões horizontal
como vertical. Nisso, parece evidente que exatamente a manutenção do
osso maxilar depois da extração dentária no âmbito de um atendimento
imediato da ferida de extração merece uma consideração central. Uma
compensação de processos de atrofia, que se instalam regularmente no
decorrer da regeneração óssea dinâmica dos alvéolos pós-extração,
possibilitaria uma inserção de implante mais simples, e com isso, mais
previsível, sem a necessidade de processos adicionais de terapia
reconstrutiva. Isso é especialmente importante com respeito à duração
da terapia, mas também com relação à estética e a carga mastigatória
para o paciente (ROTHAMEL et al., 2007).
A reabsorção óssea ao redor dos dentes resulta em perda dentária,
criando uma situação comprometedora para restauração de implantes
osseointegrados. Enxerto ósseo é um procedimento cirúrgico comum
desenvolvido para regenerar o rebordo alveolar. O enxerto ósseo
autógeno é considerado “Padrão ouro” para enxerto em defeitos ósseos
orais. Um material de enxerto ideal tem que favorecer a produção de
osso por meios viáveis de osteoblastos transplantados, pela osteoindução
de células mesenquimais, ou por osseocondução pela superficie celular.
Isso matém o osso maduro no decorer do tempo sem perda de função e
evita ao mínimo o risco de infecção e antigenicidade. Deve ter a
capacidade de incorporar dentro do osso sadio e estar disponível em
grande quantidade. Futuramente estas estruturas terão que estabilizar
implantes (AGHALOO; MOY; FREYMILLER, 2004).
A previsibilidade dos implantes universalizou a osseointegração
para o tratamento dos edêntulos totais, parciais e unitários. Todavia, os
procedimentos cirúrgicos pré-implantes, frequentemente, são
18
necessários para permitir o posicionamento ideal (estética e função) e o
comprimento e diâmetro adequados dos implantes. Logo, o
planejamento reverso é imprescindível para visualizar a exigência da
reconstrução (vertical e horizontal) de maxilares atróficos (MAGINI;
GOMES JUNIOR, 2007).
Métodos diversos são utilizados para essa finalidade, tais como:
enxertos ósseos (por meio da osteogênese, osteoindução e
osteocondução); substitutos de enxertos ósseos (por meio de
osteoindução e/ou osteocondução); regeneração óssea guiada (utilização
de membranas para exclusão tecidual, estabilização do coágulo e
manutenção do espaço, com consequente neoformação óssea); e
distração osteogênica (tração lenta e contínua de fragmento ósseo
fraturado cirurgicamente) (MAGINI; GOMES JUNIOR, 2007).
Desde a década de 60, implantes temporários, confeccionados de
polímeros biorreabsorvíveis, ganharam uma importância crescente na
área médica, sendo utilizados em um amplo número de aplicações no
corpo humano, tais como: suturas cirúrgicas, sistemas para liberação
controlada de drogas, stents e dispositivos ortopédicos. Atualmente
fazem parte do cotidiano dos centros cirúrgicos no mundo inteiro
(STARES, 2007; VALIMAA; LAAKSOVIRTA, 2004).
A década de 70 marcou o início do uso mais intenso de materiais
cerâmicos com propriedades que possibilitam a sua classificação como
biocerâmicas (ROSENBERG et al., 2006; STARES, 2007).
O uso de polímeros bioabsorvíveis como o material de sutura
iniciou aproximadamente 50 anos atrás. O ácido poliglicólico (PGA)
tem sido usado mundo afora como material de sutura biodegradável
desde 1970 (MÄKELÄ et al., 2008).
Com relação à dimensão dos poros, Hulbert et al. (1970)
demonstrou inicialmente que poros interconectados com diâmetro
mínimo de 100 µm eram necessários para o crescimento adequado do
osso. O mesmo concluiu que tamanhos menores de poros permitiriam a
mineralização incompleta do tecido infiltrado (STARES, 2007).
Diversos tipos de biomateriais, sejam de origem biológica ou
sintética, vêm sendo utilizados na prática da bioengenharia tecidual com
finalidades de regeneração ou formação de novos tecidos. A
bioengenharia tecidual compila conhecimentos de grandes áreas da
ciência como a biologia, medicina e engenharia. Os biomateriais
escolhidos para tal prática devem estimular a adesão, diferenciação e
proliferação celular, e ainda promover a produção de moléculas
específicas do tecido em questão. Vários destes biomateriais se
encontram em testes em diferentes estágios, enquanto outros estão
19
liberados para uso clínico, por exemplo, os implantes para usos
ortopédicos e odontológicos (ANDRADE; DOMINGUES, 2006;
STARES, 2007).
20
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
A presente pesquisa tem o propósito de testar arcabouços de
copolímero de PLGA+HA, PLGA, dois ossos xenógenos (Orthogen-
Baumer
®
, BIO-OSS
®
), osso autógeno (Padrão Ouro) e Coágulo. Estes
foram analizados histologicamente com Microscopia Óptica após
instalação em fêmures de coelhos Nova Zelândia.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A
Apresentar resultado de exame histomorfométrico (Microscopia
Óptica) com avaliacão estereológica das amostras e compará-las com o
grupo controle no seguinte quisito:
a) Avaliação da Densidade de Perfis de cada um dos elementos
presentes dentro da área do enxerto (QA) segundo os princípios
de Cavalieri citados por Mandarim-de-Lacerda. Foram
observadas as seguintes estruturas retiradas do centro das
amostras:
• Tecido inflamatório;
• Materiais enxertados;
• Osso neoformado;
• Tecido conjuntivo;
• Tecido adiposo.
21
3 REVISÃO DE LITERATURA
Dentre os polímeros sintéticos biorreabsorvíveis encontram-se os
poli(α-hidróxi ácidos), representantes de uma classe de poliésteres
alifáticos sintéticos, os quais fazem parte o poli(ácido glicólico) (PGA),
poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido láctico-co-ácido glicólico)
(PLGA), poli(ε-caprolactona) (PCL), seus copolímeros e outros. Os
mesmos são aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA). Um
material conveniente para implantes ósseos seria aquele que funciona
como suporte para o crescimento tecidual, além de favorecer a migração
das células da borda de um defeito em direção ao implante, sustentando
o crescimento celular. Destes polímeros sintéticos biorreabsorvíveis o
PLA tem um tempo médio de degradação de 6 a 12 meses, e o PGA de 1
a 2 meses (ATTAWIA; HERBERT; LAURENCIN, 1995 apud
STARES, 2007).
Polímeros bioabsorvíveis de poli(α-hidroxila) ácidos, como por
exemplo, polilactida ou poliglicolida, podem apresentar estabilidades
diferentes conforme sua espessura, estrutura e composição química
(HUTMACHER; HÜRZELER; SCHLIEPHAKE, 1996; KOHAL et al.,
1998).
Esse copolímero no formato de suportes porosos apresentou
respostas de células osteoblásticas que o mostram como material
conveniente para aplicações em tecido ósseo (ISHAUG et al., 1997,
ISHAUG-RILEY et al., 1998).
Peter e colaboradores (1998) descrevem um compósito formado
de partículas de PLGA moídas e moldadas por compressão com
partículas de hidroxiapatita (HA) o qual aumentou a resistência à
compressão do material compósito.
O trabalho “análise histológica, radiográfica e do perfil de
imunoglobulinas após implantação de enxerto de osso esponjoso bovino
desmineralizado em bloco em músculo de ratos” teve como objetivo
avaliar a biocompatibilidade de blocos de enxerto de osso bovino
esponjoso acelular e desmineralizado (GenOx
®
, Baumer S.A.). Um
bloco cilíndrico (5x12 mm) de material de enxerto foi implantado em
músculo abdutor da coxa de 30 ratos, sendo os animais sacrificados 3, 7,
14, 21 e 28 dias (n=6) após as cirurgias. Após a tomada das radiografias,
as peças foram removidas para o processamento histológico. A análise
histológica mostrou que nos períodos de 3 e 7 dias foi evidenciado um
processo inflamatório agudo, caracterizado pela presença de neutrófilos,
reabsorção do coágulo sanguíneo e angiogênese. Entre 14 e 21 dias,
22
verificou-se a reabsorção da matriz implantada por células
mononucleadas, raras células gigantes e sua substituição por tecido
conjuntivo fibroso rico em vasos e células. Aos 28 dias, na maioria dos
casos, observaram-se apenas pequenos fragmentos de matriz implantada
envoltos por tecido conjuntivo característico da região.
Radiograficamente não se notou evidências de mineralização. Com base
nos resultados obtidos concluiram que o enxerto de matriz de osso
esponjoso bovino desmineralizado em bloco é biocompatível quando
implantado em tecido conjuntivo intramuscular de ratos, sendo
absorvido e substituído por tecido conjuntivo característico da região,
sem qualquer indício de ocorrência de osteogênese ectópica (SANADA
et al., 2003).
Estudos efetuados por longo período de tempo têm mostrado que
a hidroxiapatita começa a ser reabsorvida gradualmente após 4 ou 5
anos de implante. A reabsorção é uma característica desejada para um
biomaterial em alguns tipos de implantes, nos quais o processo de
degradação é concomitante com a reposição do osso em formação
(KAWACHI et al., 2000 apud STARES, 2007).
O material precisa ainda ser capaz de reproduzir síntese para
garantir formato consistente no final; deve ser versátil para uma
variedade de técnicas de processamento de polímeros; deve reter
resistência suficiente em todo o tempo para ser efetivo na terapia clínica;
durante o período em que o material está no organismo, ele não deve
sustentar reações inflamatórias ou resposta a corpo estranho que
necessitem sua remoção; deve ser completamente reabsorvido sem
deixar evidências histológicas de resíduos; e além da reabsorção
completa do material ele deve ser pequeno, para que sua presença no
organismo seja neutra (PIETRZAK; SARVER; VERSTYNEN, 1996).
As diferenças no metabolismo final dos polímeros são
relativamente desprezíveis, mas as taxas de degradação variam. O
critério geral para a seleção de um polímero para uso como biomaterial é
comparar as propriedades mecânicas e o tempo de degradação
necessário após a implantação. O polímero ideal para uma aplicação
deve ter as seguintes propriedades: não provocar resposta inflamatória
ou tóxica desproporcional ao efeito benéfico; ser metabolizado no
organismo após ter efetuado seu propósito sem deixar resquícios; ser
facilmente processado na forma final do produto; e ser facilmente
esterelizado (MIDDLETON; TIPTON, 2000).
Mecanicamente a reabsorção ocorre em duas fases:
Primeiramente a água infiltra o polímero e ataca as cadeias do polímero,
causando divisão da cadeia via hidrólise. Isto geralmente ocorre in vivo,
23
independentemente da atividade enzimática. Fatores que afetam a
acessibilidade da água ao polímero podem ter significante efeito na
reabsorção. O processo de degradação primária é mediado pela
hidrólise. Assim, os produtos da quebra devem ser solúveis em água,
para que as altas concentrações destes produtos possam se difundir.
Segundo, como a massa do polímero perde a forma e consistência
devido à redução do peso molecular podendo formar partículas que
podem ser fagocitadas pelos macrófagos. A última digestão celular (via
macrófagos) dos produtos quebrados deve ocorrer juntamente com os
caminhos estabelecidos dentro da célula para que o produto final da
oxidação ocorra naturalmente, assim como água e dióxido de carbono,
os quais são excretados pelos rins e pulmões (BUCHOLZ et al., 1994).
As taxas de degradação e o grau de reação a corpo estranho são
determinados pelo peso molecular inicial e composição química do
material. Quando uma célula viva entra em contato com um biomaterial,
ela responde de uma maneira específica que é determinada pela natureza
física da superfície do material e pelo ambiente local. A natureza da
resposta celular decidirá se o implante será encapsulado com tecido
fibroso, ou se iniciará o crescimento ósseo. Existem quatro possíveis
respostas que podem ocorrer: morte do tecido (material tóxico),
formação de tecido fibroso (material inerte), formação interfacial de
osso (material bioativo) ou reposição por tecido circunvizinho (material
biodegradável) (AN et al., 1994 apud STARES, 2007; DI SILVIO;
DALBY; BONFIELD, 2002).
Os poli(α-hidróxi ácidos), em especial o PLA, PGA e seus
copolímeros são frequentemente usados para a fabricação de
dispositivos biorreabsorvíveis em reparos de tecidos moles e duros.
Biodegradabilidade e bioatividade são combinações desejáveis para um
biomaterial otimizado. Os materiais compósitos oferecem uma
vantagem excepcional e permitem o desenvolvimento de implantes
biorreabsorvíveis e bioativos com propriedades físicas e mecânicas
otimizadas. Além disso, os materiais compósitos podem ser projetados
de tal maneira que sua taxa de reabsorção combine com a taxa de
formação do tecido novo. Atualmente, partículas de HA e TCP são
combinadas com arcabouços porosos de polímeros biodegradáveis como
enxertos em reparos ósseos (ROETHER et al., 2002).
Sanada e colaboradores, em 2003, fizeram análise histológica,
radiográfica e do perfil de imunoglobulinas após implantação de enxerto
de osso esponjoso bovino desmineralizado em bloco em músculo de
ratos com o objetivo de avaliar a biocompatibilidade de blocos de
enxerto de osso bovino esponjoso acelular e desmineralizado (GenOx
®
,
24
Baumer S.A.). Um bloco cilíndrico (5x12 mm) de material de enxerto
foi implantado em músculo abdutor da coxa de 30 ratos, sendo os
animais sacrificados 3, 7, 14, 21 e 28 dias (n=6) após as cirurgias. Após
a tomada das radiografias, as peças foram removidas para o
processamento histológico. A análise histológica mostrou que nos
períodos de 3 e 7 dias foi evidenciado um processo inflamatório agudo,
caracterizado pela presença de neutrófilos, reabsorção do coágulo
sanguíneo e angiogênese. Entre 14 e 21 dias, verificou-se a reabsorção
da matriz implantada por células mononucleadas, raras células gigantes
e sua substituição por tecido conjuntivo fibroso rico em vasos e células.
Aos 28 dias, na maioria dos casos, observaram-se apenas pequenos
fragmentos de matriz implantada envolto por tecido conjuntivo
característico da região. Radiograficamente não se notou evidências de
mineralização. Com base nos resultados obtidos concluiram que o
enxerto de matriz de osso esponjoso bovino desmineralizado em bloco é
biocompatível quando implantado em tecido conjuntivo intramuscular
de ratos, sendo absorvido e substituído por tecido conjuntivo
característico da região, sem qualquer indício de ocorrência de
osteogênese ectópica.
Rossi, Weinfeld e Miranda (2005) pesquisaram enxerto de osso
bovino tipo “cone alveolar” em
alvéolos de humanos
. Os autores
avaliaram a eficácia do osso bovino do tipo “cone alveolar” na
estimulação da neoformação óssea em alvéolos dentários de humanos.
Foram executadas 15 exodontias, com enxertia do osso bovino nos
alvéolos envolvidos. Realizaram dois tipos de avaliações radiográficas
da região enxertada com auxílio da computação: mensuração entre dois
pontos determinados e histograma dos valores da densidade óptica a
cada mês até completar 6 meses. Decorrido esse período, os alvéolos
foram reabertos e o conteúdo da porção central colhido para ser
submetido a estudo histológico. Verificou-se que no período de 6 meses
a matriz mineral bovina apresentou-se sem vitalidade, radiograficamente
sua densidade óptica não comprovou a neoformação óssea e, por meio
de mensuração entre dois pontos, não ocorreu reabsorção óssea alveolar
estatisticamente significante. Esses fatos não comprovaram a eficiência
do uso do enxerto para melhorar o leito receptor de futuro implante.
Utilizaram análise de variância por postos de Friedman. Foi constatada
pequena diminuição na altura, porém, não houve diferença significante
entre os períodos estudados.
Os materiais compósitos sólidos são os quais contém dois ou
mais materiais constituintes distintos. Os materiais bioabsorvíveis mais
comumente utilizados em técnicas de reparo ósseo incluem o poliácido
25
lático (PLA) e o poliácido glicólico (PGA) e seus copolímeros (PARK;
BRONZINO, 2003 apud STARES, 2007; PYLES, 2003).
Wei e Ma (2004) investigaram um novo compósito formado de
nanopartículas de HA incorporados em arcabouços porosos de PLLA
usando técnicas de separação de fase induzidas termicamente para o uso
na liberação de BMPs. Os mesmos demonstraram que as nanopartículas
de HA foram incorporadas com sucesso nos arcabouços de PLLA. A
incorporação das nanopartículas de HA melhorou as propriedades
mecânicas e a adsorção de proteínas.
Segundo Rossi, Weinfeld e Miranda (2005) a atrofia fisiológica
do rebordo alveolar decorrente de perdas dentárias é progressiva e
irreversível, constituindo problema de difícil solução para a
reconstrução protética e para a instalação de implantes osseointegrados.
Assim, várias soluções têm sido propostas para reconstrução do osso
perdido, como o uso de enxertos ósseos autógenos, substitutos ósseos
alógenos, enxertos xenógenos, enxertos aloplásticos, regeneração óssea
guiada, distração osteogênica, fatores de crescimento e combinações
dessas alternativas. Estudos clínicos e experimentais prévios
demonstraram a eficácia da osteointegração entre tecido ósseo do
hospedeiro e o tecido ósseo enxertado em cirurgias maxilofaciais em
humanos, em coelhos, em cães, em ratos e em macacos. Dentre os vários
materiais existentes de origem bovina, o “cone alveolar” é considerado
um material de enxerto xenógeno anorgânico com propriedades
osteocondutoras, que funcionaria como um arcabouço para permitir o
crescimento de capilares, de tecido perivascular e de células
osteoprogenitoras oriundas do leito receptor 5, sendo indicado na
preservação da dimensão óssea da crista alveolar para uma posterior
reabilitação com implantes osseointegrados.
Com o objetivo de acelerar a cura de um defeito pode-se cultivar
células ósseas sobre o suporte de biomaterial, sem que seja preciso,
assim, esperar o tempo de migração de células osteoblásticas na região
de implante. Além disso, deve apresentar propriedades mecânicas
similares ao tecido ósseo, ser osteoindutivo e osteocondutivo a fim de
sustentar e induzir a formação de um neotecido ósseo e osteointegrativo
para que haja uma boa fixação biológica do suporte com o osso
(LEONG; JIANG; LU, 2006).
A obtenção de um biomaterial que atraia interesse para ser usado
como substituto ósseo deve ter características tais como, gerar uma
resposta inflamatória mínima (biocompatibilidade) e ser degradado pelo
organismo (biodegradabilidade) (KUMARASURIYAR et al., 2005).
26
Dall’Antonia et al. (2006) comentaram a observância
considerável do desenvolvimento tecnológico dos biomateriais e
importância da evolução dos métodos e conhecimentos da fisiologia
óssea. Desta forma, tornou-se possível influenciar seletivamente a
formação óssea, controlando a qualidade e a quantidade de osso no
interior das estruturas bucais. Entretanto, a pesquisa sobre material de
implante ideal para substituição do enxerto ósseo autógeno ainda
persiste como um dos grandes desafios da odontologia moderna.
Três são as estratégias utilizadas para este fim: a condução, o
transplante de células e/ou tecidos e a indução na diferenciação celular.
No método de transplante de células o veículo não só transporta as
células ou tecido como serve de guia para o crescimento de novo tecido.
E no método de indução emprega o arcabouço para transporte e
sustentação de proteínas indutivas (KAIGLER; MOONEY, 2001).
Ekholm e colaboradores, em 2006, efetuaram estudo histológico e
imuno-histoquímico da reação de tecidos a poliortoesteres sólidos em
coelhos. Em muitos casos apenas a presença temporária de um
biomaterial é necessária no suporte, aumento ou reposição tecidual.
Nesses casos materiais biodegradáveis são melhores alternativas que os
bioestáveis. Atualmente, polímeros biodegradáveis são amplamente
utilizados no campo da cirurgia bucomaxilofacial em suturas, artifícios
de fixação de fraturas e membranas absorvíveis. Os polímeros mais
frequentes utilizados são os poliésteres alifáticos, como ácido
poliglicólico (PGA) e polilático (PLA). Poliortoester é a superfície
erosionada do polímero que vem sendo desenvolvida desde 1970, mas é
usada somente em sistemas com formas semissólidas para liberação de
drogas. O intuito desse estu do foi a evolução da reação de tecidos a
poliortoesteres (POE) sólidos histologicamente e imuno-
histoquimicamente. Tempo de reabsorção e efeito de dois diferentes
métodos de exterilização (radiação gama e óxido etileno) em relação à
reabsorção também foram avaliados. O material foi introduzido na tíbia
e subcutaneamente no ramo mandibular em 24 coelhos. O
acompanhamento foi feito em 1-10, 14 e 24 semanas. Estudos
histológicos mostraram que POE induzem uma inflamação moderada
aos tecidos ósseos e moles. Em 24 semanas a inflamação foi suave em
tecidos moles e moderada na estrutura óssea. Nos estudos imuno-
histoquímicos nenhuma grande camada fluorecente de tenascina e
fibronectina foi achada adjacente ao implante. A reabsorção das rodas
foi mais rápida quando esterilizada com raios gama do que com gás
óxido de etileno. A reabsorção completa foi além de 24 semanas em
ambos os grupos. Clinicamente a cicatrização foi diferenciada e os
27
implantes foram bem tolerados pelo tecido vivo. Isto encorajou os
autores a continuarem estudos com este interessante novo material para
encontrar uma resposta ideal para o preenchimento ósseo e fixação de
fraturas.
A construção de arcabouços tridimensionais de polímeros
biodegradáveis por vapor solvente baseados em adesão celular foi
estudada por Ryu et al. (2007), tornando-se importante para controlar o
crescimento com arcabouços artificiais. Tecidos com a pele, vasos
sanguíneos e cartilagem possuem multileitos estruturais com diferentes
células em cada conteúdo. Com o artifício tecnológico de
microfabricação um método modelo de arcabouço para polímeros
biodegradáveis como ácido polilático (PLA), ácido poliglicólico (PGA)
e o copolímero polilático-co-glicólico (PLGA) foi desenvolvido para
construir arcabouços micronanométricos. O método enfatiza
interconexões microfluidas entre leitos com arcabouços e manutenção
de alta resolução geométrica durante o processo de adesão para
desenvolvimento dos mais variados tecidos. Micro-orifícios (10-100
um), microfluidos e microcavitados são todos criados por
micromodelagem e adesão baseada por vapor solvente de leitos
micromodelados preservando estruturas de tamanhos necessários.
Amostras de arcabouços são construídas com propósitos de canais
direcionados para crescimento de células com tamanhos de necessidade
específica. Além disso, extensões destas técnicas para criar trabalhos
microvasculares com entreleitos são possíveis. Cultivando células
endoteriais da artéria coronária de humanos (HCAECs) em amostras de
arcabouços, demonstraram a biocompatilidade do desenvolvimento do
processo e a grande influência da alta resolução microgeométrica no
crescimento de células endoteriais da artéria coronária de seres humanos
(HCAECs).
O termo biorreabsorvível refere-se a dispositivos sólidos de
materiais poliméricos que são passíveis de degradação pela diminuição
da cadeia macromolecular, cujos subprodutos são reabsorvidos in vivo,
isto é, eles são quebrados em moléculas que podem ser encaminhadas
para rotas metabólicas. Assim sendo, o poli(L-ácido lático-co-ácido
glicólico) PLGA é degradado pela quebra das ligações ésteres que
produzem, como último subproduto, moléculas de ácido glicólico
dirigidas ao ciclo de Krebs (BARBANTI; ZAVAGLIA; DUEK, 2005;
MESSIAS et al., 2009; SANTOS JUNIOR.; WADA, 2007).
Num primeiro momento, os biomateriais eram criados com a
intenção de gerarem o mínimo de resposta inflamatória ou imunológica,
isto é, que eles fossem inertes. Porém, atualmente, buscam-se estratégias
28
que incentivam respostas teciduais favoráveis, como a proliferação e
diferenciação de células de tecido lesado. O PLGA é largamente
investigado como suporte para cultura de células. Suportes desse
polímero foram capazes de sustentar adesão e proliferação de células
osteoblásticas, bem como, a síntese de colágeno tipo I e a produção de
matriz mineralizada (SANTOS JUNIOR; WADA, 2007 apud MESSIAS
et al., 2009).
Diversos estudos mostram que suportes enriquecidos com
hidroxiapatita acrescem as funções de células osteoblásticas in vitro, tais
como, crescimento celular e síntese de fosfatase alcalina (HUANG;
MIAO, 2007; KIM et al., 2006).
Outros materiais que vêm recebendo atenção são: o Poliácido
lático, o poliácido glicólico, hidroxiapatita ou a mistura dos mesmos aos
fatores de crescimento. Com intuito de suprir as limitações de técnica e
tentar alcançar a excelência biológica do osso autógeno vem se
empregando uma quantidade significativa de materiais aloplásticos (AL
RUHAIMI, 2001).
A aplicabilidade desses materiais em organismos humanos
depende de suas propriedades biológicas, químicas, físicas e mecânicas
(ALIZADEH; MARGUSSIAN, 2002 apud CRUZ, 2004; BRANDA et
al., 2002; COSTA et al., 2003).
Rothamel e colaboradores, em 2007, examinaram alterações
dimensionais do osso maxilar depois do atendimento de feridas de
extração com réplicas de raiz de β-TCP de encaixe exato em
comparação com alvéolos não preenchidos. Num total de dez cães, foi
colocada imediatamente depois da extração do primeiro pré-molar, uma
réplica de raiz de encaixe perfeito de grânula de β-TCP reticulado de
polilactida nos alvéolos. Alvéolos de extração não tratados no lado
oposto serviam de controle split-mouth. Depois de três e seis meses,
respectivamente, foram sacrificados cinco animais e os correspondentes
setores maxilares examinados histológica e histomorfometricamente.
Rimondini e colaboradores utilizaram o método de injeção gasosa
em 2005, realizando estudo experimental in vivo de regeneração óssea
em defeitos críticos usando copolímero de PLA/PGA biodegradável. O
assentamento foi feito em osso saudável padrão após implantação de
PLA/PGA 50%/50% dispersado em solução aquosa de PGA e dextrano
usando como substituto ósseo em modelo animal. Dois grupos de cinco
coelhos foram usados. Em ambos os côndilos femurais foram realizados
defeitos críticos de 6x10 mm. No lado direito PLA/PGA foi inserido, e
no lado esquerdo permaneceu vazio, em 30 e 90 dias após a cirurgia os
animais foram sacrificados. Os defeitos do lado esquerdo não
29
preenchidos mostraram uma cicatrização não espontânea após 30 e 90
dias. Concluiram que o copolímero de PLA/PGA em meio hidrosolúvel
induz crescimento ósseo em defeitos críticos através de teste de Wilcox.
Teste de Mann-Witney foi utilizado para comparação de mensurações
entre os sítios e osso normal em 30 e 90 dias.
Têm-se verificado que a utilização do colágeno como carreador
não é satisfatória, em decorrência da baixa resistência à pressão dos
tecidos moles. Por sua vez, outros carreadores, como as hidroxiapatitas
apresentam elevada resistência mecânica, todavia, ou não são
absorvíveis ou o são em intervalos muito longos de tempo. Suportes
porosos de hidroxiapatita são também muito estudados como
biomaterial para engenharia de tecido ósseo atualmente, apresentando,
porém, o inconveniente de possuírem propriedades mecânicas aquém
das compatíveis com o osso. Materiais cerâmicos possuem alta
fragilidade, além de serem difíceis de moldar. Por isso, aliando
polímeros biodegradáveis em suportes enriquecidos com biocerâmica
podem vencer tais limitações, criando compósitos altamente
biocompatíveis. Os materiais baseados em fosfatos de cálcio, tais como,
hidroxiapatita (HA), fosfato tricálcio (TCP) e cimentos de fosfato de
cálcio, têm atraído à atenção dos pesquisadores como biomaterial para a
engenharia de tecido ósseo, graças à excelente biocompatibilidade,
osteocondutividade e taxas variadas de degradação, além de estimular a
diferenciação de células-tronco mesenquimais em células osteoblásticas
(HUANG; MIAO, 2007; MÜLLER et al., 2008; OLIVEIRA et al.,
2005).
Soren Schou e colaboradores (2003b) estudaram a preparação da
superfície do implante em tratamento cirúrgico experimental de peri-
implantite, com enxerto de osso autógeno e membrana de
politetrafluoretileno expandidas (PTFE) e avaliação estereológica em
macacos cinomólogos. Os métodos foram jato de pó abrasivo único +
ácido cítrico, jato de pó abrasivo único, gaze embebida em solução
salina + ácido cítrico e gaze embebida alternativamente em clorexidine e
solução salina:
a) Unidade de ar pó abrasiva + ácido cítrico (Ap+Ci): a superfície
do implante foi preparada com a mistura de bicarbonato de
sódio (profjetdentisplay, USA), solução salina e ar por cinco
minutos na unidade de ar pó abrasiva (cavitron) a uma distância
de 1 mm, de acordo com a recomendação do fabricante.
Finalmente a solução saturada de ácido cítrico em cotonetes foi
aplicada por 2 minutos após vinte vezes irrigado com soro;
30
b) Unidade de ar pó abrasiva (Ap): o mesmo procedimento
descrito em “a” foi usado, porém, sem ácido cítrico.
Consequentemente, a superfície do implante foi preparada pela
unidade de ar pó abrasiva por 5 minutos e irirrigada 20 vezes
com solução salina;
c) Gaze embebida em solução salina + ácido cítrico (Ci): a
superfície do implante foi limpa por 5 minutos com gaze
embebida em solução salina. O ácido cítrico foi então aplicado
por 2 minutos seguido por 20 irrigações salinas;
d) Alternativa de gaze embebida em clorexidine e solução salina
(Ch): a superfície do implante foi limpa por 5 minutos por gaze
embebida em clorexidine aquosa a 0,1% e solução salina, e
finalmente irrigada alternativamente 20 vezes pela mesma
solução. Todos os defeitos foram preenchidos com partículas de
osso autógeno embebidas em sangue autógeno depois de
confecção de múltiplas perfurações na superfície óssea.
Um total de 64 implantes com tratamento de superfície com
spray de plasma de titânio (TPS) foi instalado em 8 macacos (Macaca
fascicularis). Depois de um período de três meses com controle de
placa, peri-implantite experimental foi induzida. A perda óssea de 4 a 6
mm foi estabilizada após 9 a 17 meses e o controle de placa foi
reimplementado. Os defeitos peri-implantares foram cirurgicamente
expostos, o tecido de granulação foi removido, e cada superfície
implantar foi preparada por um dos procedimentos acima mencionados.
Os defeitos foram então preenchidos com enxerto de osso autógeno
particulado e cobertos por uma membrana de PTFE. Os animais foram
sacrificados depois de 6 meses. Os parâmetros de evolução clínica,
radiográfica incluindo subtração radiográfica digital quantitativa,
histologia e estereologia. Não revelando significante diferença entre os
métodos. Porém, a regeneração óssea total e considerável
osseoreintegração foi obtida independente do método aplicado. A média
de contato ósseo ao implante observado foi de 39 a 46% dentro dos
defeitos. O método de análise esterológica usado no presente estudo é
um ótimo meio de obtenção de estimativas não pré-dispostas de contato
osso-implante (BIC), e densidade óssea peri-implantar (BD-i) em
sessões osso-implante.
Soren Schou e colaboradores (2003a), trabalharam também da
mesma forma com osso mineral anorgânico poroso de origem bovina
(Bio-Oss
®
) e membrana de PTFE no tratamento de peri-implantite em
macacos cinomólogos.A evolução do efeito osso mineral anorgânico
poroso de origem bovina (Bio-Oss
®
) e membrana de PTFE no
31
tratamento de peri-implantite foi por eles estudado. Um total de 64
implantes com tratamento de superfície com spray de plasma de titânio
(TPS) foi instalado em 8 macacos (Macaca Fascicularis). Depois de um
período de cicatrização de três meses com controle de placa, peri-
implantite experimental caracterizada por perda óssea de 4 a 6 mm foi
induzida durante um período de 9 a 18 meses. O tratamento cirúrgico
envolvendo Bio-Oss
®
+ membrana, Bio-Oss
®
, membrana, ou a
confecção apenas de um retalho convencional (controle) foi
confecionado. Os animais foram sacrificados 6 meses depois do
tratamento. A evolução dos parâmetros clínicos, radiográficos incluindo
subtração radiográfica digital quantitativa, histologia, e estereologia
demonstraram tecido peri-implantar saudável independente da técnica
cirúrgica aplicada. Porém, a quantidade de reosseointegração e a
quantidade total de osso (Bio-Oss
®
e Osso regenerado) foi
significantemente maior em defeitos tratados com membrana cobrindo
Bio-Oss
®
quando comparado com os três procedimentos terapêuticos e a
média de contato com osso implante de 36% foi obtida junto aos
defeitos tratados com membrana recobrindo Bio-Oss
®
. Os valores
correspondentes dos três outros procedimentos terapêuticos foram de 13
a 23%. As partículas de Bio-Oss
®
foram em geral superiormente
integradas com osso regenerado, mas as partículas na parte oclusal dos
defeitos foram inteiramente circundadas por tecido conectivo não
respectivo da membrana de cobertura. O presente estudo demonstra que
o tratamento cirúrgico envolvendo Bio-Oss
®
recoberto por uma
membrana de PTFE e uma modalidade de tratamento viável de peri-
implantite experimental ao redor de implantes com o tratamento de
superfície por plasma spray de titânio (TPS) em macacos cinomólogos.
Porém, o tratamento não vem a ser encorajador observando-se o
resultado obtido com enxerto ósseo autógeno particulado e membrana
de cobertura documentado no mesmo tipo de estudo experimental.
A estereologia
foi
uma boa alternativa para obtenção de resultados
destas duas pesquisas.
A perda de elementos dentários por trauma gera reabsorções
rápidas nos alvéolos, principalmente nas tábuas ósseas vestibulares,
levando inevitavelmente os pacientes à necessidade de reconstruções
com materiais de enxerto. A atrofia fisiológica do rebordo alveolar é
progressiva e irreversível (ROSSI; WEINFELD; MIRANDA, 2005).
Aghaloo, Moy e Freymiller (2004) pesquisaram o plasma rico em
plaquetas (PRP) conjuntamente com autógeno, xenográfico no osso oral
e maxilofacial e cirurgias reconstrutivas para implantes. Esse estudo
compara a cicatrização óssea e a formação em defeitos em crânios de
32
coelhos com osso autógeno, xenógeno e xenógeno com PRP, com grupo
sem enxerto como controle. Quinze coelhos Nova Zelândia foram
incluidos nesta pesquisa. Quatro defeitos idênticos, com 4 mm de
diâmetro, foram
criados no crânio de cada coelho e imediatamente
enxertados com todos os materiais. Cinco
coelhos foram
acompanhados 1 mês, 5 coelhos por 2 meses e 5 por 4 meses.
Radiografias mostram um crescimento em densidade óssea do Bio-Oss
®
,
osso autógeno e Bio-Oss
®
+ PRP do que o defeito controle em todos os
tempos de avaliação, porém, clinicamente e difícil determinar o quanto
esses materiais aparecem densos na radigrafia. Histomorfometria
mostrou que o incremento ósseo na área dos defeitos autógenos e
poliméricos compostos foi significantemente superior que o visto com
outros materiais de enxerto ou defeito controle.
Rimondini e colaboradores em estudo experimental in vivo de
regeneração óssea em defeitos críticos, usando copolímero de PLA/PGA
biodegradável injetado, em 2005, observaram que o assentamento foi
feito em osso saudável padrão após implantação de PLA/PGA 50%/50%
dispersado em solução aquosa de PGA e dextrano usando como
substituto ósseo em modelo animal. Dois grupos de cinco coelhos foram
usados. Em ambos os
côndilos femurais foram realizados defeitos
críticos de 6x10 mm.
No lado direito PLA/PGA foi inserido e no lado
esquerdo permaneceu vazio. A perda de elementos dentários por trauma
gera reabsorções rápidas nos alvéolos, principalmente nas tábuas ósseas
vestibulares, levando inevitavelmente os pacientes à necessidade de
reconstruções com materiais de enxerto. Após 30 e 90 dias da cirurgia
os animais foram sacrificados. Os defeitos do lado esquerdo, não
preenchidos, mostraram uma cicatrização não espontânea após 30 e 90
dias. Sítios preenchidos com material experimental mostraram novo
osso com extensão de 11,46% e 76,82% após 30 dias, e 75,98% e
95,34% após 90 dias. A histomorfometria mostrou incremento de osso
maturado entre os 30 e 90 dias nos sítios experimentais aos 90 dias, não
houve diferença estatística em se comparando com o osso normal.
Copolímeros de PLA/PGA dispersados em matriz hidrossolúvel
parecem um material osteocondutivo apropriado em defeitos ósseos de
tamanho crítico. Testes de Wilcoxon foram utilizados entre os 30 e 60
dias para acessar o ganho ósseo. Teste de Man Whitney com método de
Monte Carlo para probabilidade computadorizada foi usado para
comparar as mensurações entre os sítios cicatriciais aos 30, 60 dias e o
osso normal com microscopia eletrônica de varredura.
33
Kim e colaboradores trabalharam com arcabouços compósitos de
PLGA+HA para engenharia tecidual em 2006. Segundo os autores,
arcabouços compósitos biocerâmicos poliméricos biodegradáveis podem
ultrapassar as limitações de substitutos ósseos cerâmicos convencionais
sobre fragilidade e dificuldade de modelagem. Frequentemente métodos
convencionais de fabricação de arcabouços poliméricos biocerâmicos
compósitos, muitas vezes usam solventes orgânicos (método eg-
somatória de solvente e partículas) (SC/EL) levando efeito nocivo às
células teciduais. Além disso, as soluções poliméricas cobrem as
cerâmicas e retardam sua exposição a superfícies dos arcabouços,
causando interferências na probabilidade que as células osteogênicas
venham a (semear) contatar com as cerâmicas bioativas. Neste estudo,
um método modelo de fabricação de arcabouço compósito biocerâmico
nanopolimérico com alta exposição das biocerâmicas nas superfícies dos
arcabouços foi desenvolvido para uma engenharia tecidual óssea
eficiente. Arcabouços de PLGA-HA foram fabricados pela técnica de
conformação gasosa e partículas por lixiviação (GF/PL) sem uso de
solventes orgânicos. Este método expõe significativamente mais as
nanopartículas de HA nos arcabouços do que a técnica convencional
(SC/PL). Os arcabouços de GF/PL apresentam estrutura porosa
interconectada, sem assentamento superficial e exibindo superfície com
propriedades mecânicas de entrelaçamento superiores a todos os
arcabouços fabricados pelo método SC/PL. Vários tipos de arcabouços
foram cultivados in vitro com células osteoblásticas e calvária de ratos,
ou implantados subcutaneamente por várias semanas. Os arcabouços de
GF/PL mostraram crescimento celular significativamente maior,
atividade de fosfatase alcalina e mineralização in vitro comparados com
arcabouços de SC/PL. Os arcabouços de GF/PL tiveram resultado de
maior exposição das nanopartículas de HA na superfície do arcabouço
comparado com o método convencional. Análise de DNA, quantidade
de cálcio, microscopia eletrônica de varredura, implantação subcutânea
em ratos com microscopia óptica tendo como análise estatística de
variância (ANOVA, SAS Institute Inc., Cary, NC) e p<0.05.
Sargis Sedrakyan e colaboradores desenvolveram trabalho
científico em 2006 com engenharia tecidual do pequeno osso da mão
denominado planax, através de arcabouços de polímeros, ácido
polilático e poliglicólico. O PLGA foi processado pelo método da
lixiviação do arcabouço com solvente a base de cloreto de sódio em uma
forma do pequeno osso distal do dedo (planax). A mistura determinada
como adequada foi de 85% de PLA e 15% de PGA para a confeccão da
forma e tamanho adequados para o planax. As porosidades variaram de
34
250-425-micrometros. Os arcabouços foram todos revestidos por
periósteo bovino. Condrócitos foram injetados nas terminações
articulares. Seis arcabouços foram inseridos cirurgicamente no tecido
subcutâneo dorsal em ratos alcoolizados. Depois de 8 (n=2) ou 16
semanas (n=4) todos os implantes demonstraram de osso e cartilagem
em tamanho e forma do osso planax, que foi mantido em todo período
do estudo. A evolução histológica mostrou a presença homogênea de
osso e cartilagem com diferenciação progressiva e produção de matriz
de 8 a 16 semanas, formando um osso endocondral igualitariamente
neste periodo. Analisaram as amostras morfologicamente,
histologicamente e análise molecular do RNA. Essas descobertas
sugerem que o polímero poroso de PLGA e uma técnica efetiva como
material sintético biodegradável no crescimento tecidual ósseo e
cartilagenoso articular na forma do planax humano. Rossi, Weinfeld e
Miranda (2005) pesquisaram enxerto de osso bovino tipo “cone
alveolar” em
alvéolos de humanos
. Os autores avaliaram a eficácia do
osso bovino do tipo “cone alveolar” na estimulação da neoformação
óssea em alvéolos dentários de humanos. Foram executadas 15
exodontias, com enxertia do osso bovino nos alvéolos envolvidos.
Realizaram dois tipos de avaliações radiográficas da região enxertada
com auxílio da computação: mensuração entre dois pontos determinados
e histograma dos valores da densidade óptica a cada mês até completar 6
meses. Decorrido esse período, os alvéolos foram reabertos e o conteúdo
da porção central colhido para ser submetido a estudo histológico.
Verificou-se que no período de 6 meses a matriz mineral bovina
apresentou-se sem vitalidade, radiograficamente sua densidade óptica
não comprovou a neoformação óssea e, por meio de mensuração entre
dois pontos, não ocorreu reabsorção óssea alveolar estatisticamente
significante. Esses fatos não comprovaram a eficiência do uso do
enxerto para melhorar o leito receptor de futuro implante. Utilizaram
análise de variância por postos de Friedman. Foi constatada pequena
diminuição na altura, porém, não houve diferença significante entre os
períodos estudados.
Dall´Antonia et al. desenvolveram pesquisa com implante de
osso cortical bovino inorgânico liofilizado (Gen-Ox
®
) em alvéolos
dentais e
avaliação microscópica em ratos,
publicando em 2006. Para
tanto, foram empregados 32 ratos divididos em 2 grupos com 16
(controle e experimental). Os animais foram sacrificados aos 3, 7, 15 e
30 dias após o ato cirúrgico. As peças obtidas contendo as hemimaxilas
foram fixadas, desmineralizadas e incluídas em parafina para
35
microtomia. Os cortes semisseriados obtidos foram corados em
hematoxilina e eosina para análise em microscópio óptico. Os resultados
obtidos mostram que o material é bem aceito pelo organismo, sendo
lentamente.
Eeva Mäkelä e colaboradores, em 2007, desenvolveram um
trabalho com rodas compósitas de ácido polilático poliglicólico (80%
/20) autorreforçados com 2 mm de diâmetro e 36 mm em comprimento
sendo implantados no tecido subcutâneo do dorsal de 20 coelhos.
Osteotomias em distal de fêmur foram fixadas com estes cilindros
(12x15 mm) nos coelhos. O acompanhamento variou entre 3 e 4
semanas. Depois de 6 meses as propriedades mecânicas foram reduzidas
significantemente, mas as osteoteotomias cicatrizaram normalmente. A
presente investigação mostra que as propriedades de fixação mecânica
do SR-Polilático-glicólico (80/20) são viáveis para fixação de
osteotomias em coelhos desde que técnica cirúrgica seja correta.
Kim e colaboradores em 2008 reportaram formação de osso em
vivo a partir de células derivadas de embriões humanos em células
osteogenicas em arcabouços de ácido poli(D,L-lactico-coglicolico) /
hidroxiapatita (PLGA) / HA e a eficiência da diferenciação de células
mesenquimais indeferenciadas de embriões humanos (hESCs) por co-
cultura com células derivadas de osso humano primário (hPBDs) com
uso de fatores xexógenos. Nesse estudo exploraram células osteogenicas
derivadas de (hESCs); (OC-hESCs) usando método reportado previsível
que seria capaz de regeneração óssea tecidual em vivo. Arcabouços
compositos tridimencionais porosos de PLGA/HA foram utilizados com
veículos de liberação celular. Implantação em vivo de (OC-hESCs)
semeadas em arcabouços mostraram formação óssea significante em
sites subcutâneos de ratos imunodificientes em 4 e 8 semanas depois da
implantação. Entre tanto implantação de controle de arcabouços sem
células ou arcabouços com fibroblastos da pele não demonstraram nem
um novo osso formado. Em adição a presença de 1 ug de BMP 2 em
arcabouço acresceu nova formação óssea em termos de mineralização e
expressão gênica de marcadores ósseos específicos. De acordo com
análise de Fish, implantação de OC-hESCs resulta em regeneração das
lojas, sugerindo que a implantação de células participa na formação de
novo osso. Concluindo, OC-hESCs regeram com sucesso quando
implantados in vivo, e esta regeneração pode ser favorecida pela
incrementação da administração de BMP 2. Estes resultados sugerem a
possibilidade clínica do OC-hESCs como boa alternativa para origem de
células para regeneração óssea. A cultura celular sobre biomateriais
compõe um passo importante no entendimento de respostas diretas de
36
células de tecidos específicos, funcionando como ferramenta
imprescindível na Engenharia Tecidual. Por meio dessa técnica é
possível compreender fenômenos como adesão, proliferação e
diferenciação celular induzidas por tais biomateriais.
A porosidade é um aspecto importante para o crescimento celular,
pois o meio de cultura e os fatores de crescimento difundem-se
livremente para o interior do biomaterial. O tamanho dos poros, sua
distribuição e a interconectividade são características importantes em
um suporte. Uma porosidade adequada – considerando tamanho, forma,
morfologia da parede – para semeadura de células, adesão, crescimento
e formação de tecido novo e para transporte de nutrientes e de resíduos
metabólicos do implante, bem como, o estímulo à vascularização são
importantes considerações. Na literatura é geralmente citado que poros
numa faixa que varia de 100 a 400 µm são adequados para a
regeneração óssea (MESSIAS et al., 2009; MIAO et al., 2008;
SARAZIN; ROY; FAVIS, 2004; TANG; HUNT, 2006).
No método de transplante de células, o veículo não só transporta
as células ou tecido, como serve de guia para o crescimento de novo
tecido. E no método de indução emprega o arcabouço para transporte e
sustentação de proteínas indutivas. As características desejadas de um
material ósteo-substituto são: biocompatibilidade, previsibilidade e
aplicação clínica sem riscos transoperatórios e sequelas pós-operatórias
mínimas, além da aceitação por parte do paciente (SICCA et al., 2000).
A busca incansável do homem por padrões de vida superiores e
longevidade tem gerado cada vez mais a necessidade de alternativas
para o reparo e substituição de tecidos vivos vitimados por traumas ou
patogenias. A necessidade por novos materiais que substituam tecidos
humanos tem levado pesquisadores de diferentes áreas a investigar
diversos materiais com características favoráveis ao processo de
recuperação (STARES, 2007).
Ryu e colaboradores em 2007 realizaram trabalho importante
para controlar o crescimento celular dentro e com arcabouços artificiais.
Tecidos como a pele, vasos sanguíneos e cartilagem possuem multileitos
estruturais com diferentes células em cada conteúdo. Com o artifício
tecnológico de microfabricação um método modelo de arcabouço para
polímeros biodegradáveis como ácido polilático (PLA), ácido
poliglicólico (PGA) e o copolímero polilático-co-glicólico (PLGA) foi
desenvolvido para construir arcabouços multileitos microfluidos. O
método enfatiza interconexões microfluidas entre leitos com arcabouços
e manutenção de alta resolução geométrica durante o processo de adesão
para criação de arcabouços multileitos variando entre 10-100 um
37
baseado por vapor solvente. Amostras de arcabouços são construídas
com propósitos de canais direcionados para crescimento de células com
tamanhos de necessidade específica.
Je Yong Choi et al. (2007) realizaram estudo por inibição do
crescimento ósseo cicatricial com pamidronato em defeitos criados na
calvária de coelhos usando PLGA como material liberador de drogas.
Na análise histológica a formação óssea teve diferenciação entre os
grupos em uma semana, porém, ela se tornou mais lenta nos grupos do
pamidronato que nos controles apenas com PLGA depois de duas
semanas.
Em relação à localização do implante, deve-se levar em conta a
vascularização local e a solicitação mecânica. Se um polímero
biorreabsorvível é implantado num local de alta vascularização (grande
atividade vital), sua velocidade de degradação será mais rápida em
relação a uma região menos vascularizada, de funções passivas. Locais
de grande solicitação mecânica também têm sido descritos como
aceleradores da degradação (HOLLINGER; BATTISTONE, 1986 apud
STARES, 2007).
No ambiente local da implantação, uma alta taxa de metabolismo
tecidual local e uma excelente circulação poderiam facilitar a
degradação do material. Por outro lado, uma baixa taxa de metabolismo
local e pobre circulação poderiam levar a uma reabsorção retardada
(PIETRZAK et al., 1996).
Li Yao et al. (2008) explicaram o efeito funcional de
micromoldes de PLGA no crescimento guiado de inervação. Quando a
coadaptação é impossível no reparo de injúrias nervosas, uma ponte de
biomaterial em forma de arcabouço promove um suporte estrutural para
o crescimento de células neurológicas e re-estabelecimento do nervo.
Para tal, esses microarcabouços foram fabricados com filmes de PLGA
usando um método a laser. Este estudo indicou que a superfície do
micromolde conjugado com moléculas funcionais podem ser usados
para regeneração nervosa.
Em estudo in vitro realizado em 2009 por Messias e
colaboradores, foram realizadas observações morfológicas das células
sobre os suportes de PLGA e PLGA+HA. Celulas foram submetidas a
testes de citotoxicidade e adesão. Adicionalmente a morfologia foi
observada em microscopia de varredura e síntese de colágeno
mensurados pelo método colorimétrico de Sinus Red. Os resultados
mostraram que o material não foi citotóxico e a hidroxiapatita acresceu a
adesão celular. Por meio de microscopia eletrônica de varredura além de
testes de adesão e citotoxicidade pela atividade mitocondrial de
38
metabolização de MTT obtiveram os resultados. A produção de
colágeno também foi investigada como indício de produção de matriz
extracelular por meio do teste colorimétrico Sirius Red. Os resultados
revelam que as células com morfologia osteoblástica, as quais puderam
se aderir e espraiar pelos arcabouços. Além disso, o material não
apresentou toxicidade às células, sendo que a combinação com a
hidroxiapatita não afetou a viabilidade celular comparada aos
arcabouços sem hidroxiapatita. Todavia, os resultados demonstram que
a adição de partículas de hidroxiapatita inferiores a 1000 µm aumentou a
taxa de adesão celular conforme nosso estudo in vivo através de
estereologia com relação ao PLGA+HA no quisito de neoformação
óssea.
Neste trabalho, suportes tridimensionais porosos de poli(L-ácido
lático-co-ácido glicólico) PLGA, 82/18 (m/m) dissolvidos em
clorofórmio (Merck) (10%w/v), contendo ou não partículas de
hidroxiapatita (HA) que adicionada após dissolução em sacarose
(Shynth) (30%w/v) nos arcabouços de PLGA+HA foram adicionadas as
partículas de cerâmica de hidroxiapatita (Genius-Baumer) (20% m/v).
Tais soluções foram vertidas em moldes cúbicos de silicone medindo
cerca 5 cm de diâmetro por 5 cm de comprimento em forma de cilindro.
Após evaporação do solvente em temperatura ambiente, removeu-se a
sacarose usando poliálcool vinílico (PVA). A sacarose se solubiliza em
PVA deixando espaços que constituem os poros (inferiores a 1000 µm).
Cada amostra foi modelada em cilindros de 5 mm de diâmetro por 5 de
comprimento para a utilização nos experimentos. A esterilizacão foi
efetuada com Plasma de Peróxido de Hidrogênio em invólucro
específico Johnson and Johnson utilizados na Tese de Conclusão de
Curso de André Dutra Messias, do Laboratório de Biomateriais, Centro
de Ciências Médicas e Biológicas, PUC-SP sob orientação de Aguedo
Aragones, Eliana Aparecida de Rezende Duek que foram testados in
vitro.
Para o resultado deste trabalho usamos estes arcabouços e os
citados nos ojetivos tendo os princípios de Cavalieri para avaliação em
microscopia óptica, para determinar parâmetros quantitativos
tridimensionais de estruturas anatômicas a partir de cortes
bidimensionais. O matemático Bonaventura Cavalieri propôs cortar um
objeto em cortes paralelos com uma distância conhecida e medir as
áreas dos cortes do objeto. Conjunto de linhas ou pontos que devem ser
sobrepostos à imagem observada ao microscópio para a contagem
estereológica. Técnica do século passado, muito laboriosa, criada em
1883 por Born, técnico no laboratório do anatomista Whilhem His, é um
39
exemplo de modelo tradicional de Reconstrução Anatômica. Trata-se
basicamente de estudar uma determinada amostra de cortes aleatórios de
uma estrutura tridimensional sem que isto diminua a acurácia do método
de contagem (MANDARIM-DE-LACERDA, 2003).
40
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Para testarmos o potencial regenerativo dos arcabouços foram
criados 6 defeitos considerados críticos de 5 mm de diâmetro nos
fêmures direito e esquerdo (3 defeitos em cada fêmur) de 21 coelhos
machos, da linhagem Nova Zelândia, com um ano de idade, pesando de
2 a 4 kg, procedentes do Biotério UNISUL, subdivididos em 6 grupos:
• Grupo I: preenchido com coágulo (grupo controle);
• Grupo II: osso autógeno (retirado durante preparo dos sítios dos
defeitos e triturado);
• Grupo III: osso xenógeno (Orthogen Baumer) (Fig. 1);
• Grupo IV: Bio-Oss
®
(Fig. 2);
• Grupo V: PLGA (Fig. 3);
• Grupo VI: PLGA+HA (Fig. 4).
Os seis grupos foram comparados em 3 períodos: “A” (15 dias),
“B” (30 dias) e “C” (60 dias) do pós-operatório, para verificação dos
quesitos citados nos objetivos acima.
O protocolo apresentado abaixo será o utilizado neste trabalho. O
sentido de rotação será horário, ou seja, as amostras vão sendo
modificadas de local, o que é necessário, pois, a qualidade (circulação
sanguínea) próxima ao joelho e no centro dos fêmures dos coelhos é
mais pobre do que próxima a cabeça do quadril.
A técnica para a confecção dos arcabouços de PLGA e
PLGA+HA usados foi a de evaporação de solvente e, para a produção
de poros, o método de lixiviação de porógenos. A partir do copolímero
na forma de pó, foram preparadas soluções de poli(L-ácido lático-co-
ácido glicólico) PLGA (Böehringer Ingelheim) nas proporções 82/18
(m/m) pela diluição em clorofórmio (Merck) (10% m/v). Após completa
dissolução do copolímero, foi adicionada sacarose (Synth) (30% m/v)
com granulometria inferior a 1000 µm.
41
Figura 01 - Osso Xenógeno (Orthogen Baumer)
Figura 02 - Bio-Oss
®
42
Figura 03 - Arcabouço PLGA vista lateral
Figura 04 - Arcabouço de PLGA+HA vista lateral
43
Figura 05 - Arcabouço PLGA compatível com o diâmetro da trefina
(5 mm)
* PLGA+HA compatível com a altura da primeira marcação da broca trefina (5
mm).
4.1 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
Os coelhos foram devidamente anestesiados por um veterinário
habilitado. Previamente aos procedimentos cirúrgicos os coelhos foram
novamente pesados na sala do pré-operatório.
Após a pesagem e obedecendo a sequência estabelecida para
cirurgia, cada coelho recebeu uma injeção, via intramuscular de 1:1
tiletamina + zolazepam 33 mg/kg + 0,5 mg/kg de morfina + 1 mg/kg de
xilazina, na mesma seringa.
Havendo necessidade durante o procedimento cirúrgico, fez-se
um reforço anestésico com a metade da dose-mãe. Manteve-se acesso
venoso, durante o mesmo ato, com solução fisiológica a 0,9%,
possibilitando a hidratação e administração de outras drogas, caso
houvesse necessidade. Estes procedimentos foram realizados pelos
médicos veterinários Geraldo J. S. Bernardes e Sandro Melim Sgrott. O
ato cirúrgico foi realizado em ambiente cirúrgico com protocolo de
esterilização. Antibioticoterapia profilática e medicação anti-
44
inflamatória foram administradas 40.000 UI/kg de penicilina benzatina
+ triancenolona 0,02 mg/kg, previamente ao procedimento cirúrgico.
Inicialmente, os fêmures dos animais (aproximadamente 2 cm acima da
articulação do joelho) foram tricotomizados, e então, realizada a
antissepsia com iodopovidona.
A cirurgia foi realizada em ambiente cirúrgico com protocolo de
esterilização, com auxílio da equipe de alunos de Mestrado e Doutorado
da Universidade Federal de Santa Catarina (Fig. 06). Antibioticoterapia
profilática e medicação anti-inflamatória (40.000 UI/kg de penicilina
benzatina + triancenolona 0,02 mg/kg) foram administradas previamente
ao ato cirúrgico.
Figura 06 - Equipe cirúrgica da pós-graduação em odontologia
(Centro de Ensino e Pesquisa em Implantes dentários
da UFSC)
O bisturi (Bard-Parker nº 3) munido de lâmina número 15 foi
introduzido perpendicularmente à pele e aprofundado pelo tecido
subcutâneo, fáscia, camadas musculares e periósteo, até alcançar o plano
ósseo.
Isto possibilitou a elaboração do retalho total e o descolamento do
periósteo com descolador (FREER), com o objetivo de proporcionar o
acesso e visão necessária à área operatória para a criação dos três
defeitos semicríticos de 5 mm em cada fêmur, totalizando 6 defeitos por
45
coelho, sendo regenerados com algum tipo de biomaterial e grupo
controle conforme descrito anteriormente.
Figura 07 – Desinfecção e Incisão cutânea
Figura 08 - Incisão da fáscia muscular
46
Figura 09 - Exposição do periósteo e acesso direto a estrutura óssea
A área de criação do defeito foi demarcada com uma broca
trefina de 5 mm de diâmetro, sendo que a distância mínima entre o
centro das duas marcações foi de 14 mm, preservando no mínimo 3 mm
entre as perfurações. Esta penetrou a cortical atingindo o osso medular
subjacente, aprofundando por 5 mm.
Figura 10 - Localização da primeira perfuração
47
As perfurações foram realizadas a 1.600 rpm (com um motor
específico para este fim), com irrigação abundante com soro fisiológico,
com intuito de dissipar o calor proveniente do atrito da broca com o
tecido ósseo. Foram casualizadas as áreas onde os diferentes enxertos
foram realizados de tal forma que se eliminará a variável qualidade
óssea, pois o osso vai se tornando mais medular conforme aproxima da
cabeça do fêmur. Ao final foram confeccionados e regenerados 126
defeitos em 21 coelhos.
Os defeitos (semi) críticos foram confeccionados montando um
espaçamento de três a quatro milímitros entre os mesmos para
preservação da resistência óssea dos fêmures.
Figura 11 - Espaçamento dos defeitos
48
Figura 12 - Remoção da estrutura óssea com 5 mm de profundidade
e 5 mm de diâmetro
Neste coelho operado, a ordem de instalação dos arcabouços
seguindo a rotação horária prevista pela mudança de qualidade óssea na
região próxima ao joelho (mais cortical), em direção ao quadril (mais
esponjoso), na perna direita, com o primeiro defeito sendo preenchido
com Bio-Oss
®
(Fig. 13), o segundo com PLGA, e o terceiro com osso
xenógeno da Baumer (Orthogen) visto na figura 16.
Figura 13 - Primeiro defeito direito preenchido com Bio-Oss
®
49
Figura 14 - Inserção do PLGA no defeito direito
Figura 15 - Segundo defeito direito preenchido com PLGA
50
Figura 16 - Preenchimento do terceiro defeito com Orthogen
O osso obtido durante a confecção dos defeitos com broca trefina
foi particulado com um triturador específico e enxertado no grupo II. Os
defeitos dos demais grupos foram preenchidos conforme citado
anteriormente, para tal, sempre iniciamos a cirurgia no lado oposto ao
enxerto autógeno para maior obtenção de quantidade do mesmo (Figs.
17-19).
Figura 17 - Obtenção de osso autógeno através de broca trefina
51
Figura 18 - Amostra de enxerto autógeno trefinado
Figura 19 - Obtenção de todas as amostras de enxerto autógeno
52
Figura 20 - Triturador de osso
O protocolo cirúrgico para o fêmur esquerdo deste coelho foi o
preenchimento do primeiro defeito próximo ao joelho com PLGA+HA
(Figs. 22 e 23), o segundo com osso autógeno (Figs. 24 e 25) e o
terceiro preservando o coágulo com o grupo controle (Fig. 26).
Figura 21 - Osso autógeno triturado
53
Figura 22 - Primeiro defeito esquerdo (inserção do arcabouço de
PLGA+HA)
Figura 23 - PLGA+HA inserido
54
Figura 24 - Segundo defeito esquerdo (inserção de osso autógeno
triturado)
Figura 25 - Enxerto autógeno instalado
55
Figura 26 - Terceiro defeito esquerdo (alvéolo com preservação de
coágulo)
A sutura foi realizada com porta-agulhas Mayo Regar e fio de
sutura reabsorvível.
Figura 27 - Sutura reabsorvível (Vicryl Ethicon)
56
Figura 28 - Sutura reabsorvível (Vicryl Ethicon)
Figura 29 - Sutura do segundo plano com fio não absorvível (Nylon
Ethicon)
Durante o período do experimento e permanência no Biotério
Central da UFSC, os animais receberam dieta padrão uma vez ao dia,
sem limitações no regime de ingestão de água. Os procedimentos
57
veterinários pré, trans e pós-operatórios dos animais, bem como a rotina
de tratamento, foram realizados e supervisionados por Médicos
Veterinários
Após os procedimentos operatórios, os coelhos foram mantidos
em boxes e medicados sob protocolos de antibioticoterapia e alívio da
sintomatologia dolorosa, além de receberem terramicina a cada 7 dias
que atuou como antibiótico. Os animais receberam um agente analgésico
e anti-inflamatório, administrado por injeção intramuscular, na dose de 1
ml/5 kg (Ketoprofeno 1%) ao longo dos três dias subsequentes, com o
objetivo de controlar a dor e o edema da área operada. Também
receberam antibiótico (Pentabiótico) durante sete dias por via
intramuscular na dose de 40.000 UI/kg de penicilina benzatina por dia,
bem como, uso tópico diário de Rifocina spray por sete dias. Os animais
receberam tetraciclina, na proporção de 25 mg/kg, intramuscular, nos
primeiros 15 dias.
Após o sacrifício, os fêmures foram recolhidos, fixados em
formal tamponado 10%, desidratados e descalcificados. Os espécimes
foram incluidos em paraplast, cortados longitudinalmente e corados com
Hematoxilina e Eosina. Após foi feito o preparo para observação em
microscopia confocal de varredura a laser e microscopia óptica de luz.
As imagens de cada campo visível foram capturadas digitalmente e
combinadas para ilustrar o conjunto.
Nos períodos pré-determinados: “A” (15 dias), “B” (30 dias) e
“C” (60 dias) os animais foram sacrificados através do procedimento de
eutanásia com aprofundamento anestésico seguido de injeção
endovenosa de Cloreto de Potássio (KCL) 19,1%, as amostras foram
armazenadas em solução de formol 10% e após 72 horas as peças foram
cortadas e radigrafadas. A primeira eutanásia foi realizada após 15 dias,
a segunda aos 30 dias e a terceira aos 60 dias; as peças fixadas em
formol 10% em H
2
O destilada sendo obtidas as peças inteiras, que após
72 horas submersos neste produto foram seccionadas
perpendicularmente ao longo eixo de peça óssea e separadas as amostras
preservando mais ou menos 2 a 3 mm de osso sadio ao lado das
amostras.
Estas foram descalcificadas em EDTA 10% Merk em recipientes
plásticos separados e rotulados. Foram feitas 5 trocas de 2 e 2 dias e
posteriormente, mais no mínimo, 3 trocas semanais até total
descalcificação das mesmas testadas por instrumento perfurante e
radiografias onde não se observa estruturas calcificadas em suas
imagens (radiografias quase totalmente radiolúcidas).
58
Estão dispostas nas imagens deste coelho operado segundo as
amostras após fixação sequenciadas nas figuras seguintes:
• No fêmur direito, PLGA+HA, Autógeno e Coágulo com 15 dias
(Figs. 30 a 36);
• No fêmur 15 dias esquerdo, Bio-Oss
®
, PLGA e Orthogen (Figs.
37 a 40);
• No fêmur direito no período de 30 dias (Figs. 41 e 42);
• No fêmur direito, 30 dias, Autógeno, PLGA+HA, Orthogen
(Figs. 43 a 46);
• No fêmur esquerdo, 30 dias, Coágulo, Bio-Oss
®
, PLGA (Figs.
47 a 50);
• Fêmures de 60 dias, peça inteira (Fig. 51);
• No fêmur direito, PLGA+HA, Orthogen, PLGA aos 60 dias
(Figs. 52 a 59);
• No fêmur esquerdo aos 60 dias, Bio-Oss
®
, Coágulo, Autógeno
(Figs. 60 a 66).
59
15 dias direito
Figuras 30 a 36 - Fêmur direito - 15 dias
*
* Figuras 31, 33, 34, 35 e 36 – vista de inserção; figuras 32 – vista lateral
60
15 dias esquerdo
Figuras 37 a 40 - Fêmur esquerdo -15 dias
61
30 dias
Figuras 41 e 42 - Grupo de 30 dias direita e esquerda
62
30 dias direito
Figuras 43 a 46 - Fêmur direito - 30 dias
63
30 dias esquerdo
Figuras 47 a 50 - Fêmur esquerdo - 30 dias
64
60 dias
Figura 51 - Grupo de 60 dias direita e esquerda
65
60 dias direito
Figuras 52 a 59 - Fêmur direto - 60 dias
*
* Figura 55 – vista lateral
66
60 dias esquerdo
Figuras 60 a 66 - Fêmur esquerdo - 60 dias
4.2 PROCEDIMENTOS HISTOLÓGICOS
As lâminas obtidas foram submetidas à análise estereológica
segundo os seguintes parâmetros:
As amostras progressivas de 5 mm instaladas nos fêmures dos
coelhos foram cortadas transversalmente (Fig. 67) em 21 coelhos sendo
6 defeitos semicríticos de 5 mm de diâmetro e profundidade, 3 em cada
fêmur, finalizamos 126 amostras ósseas que foram microtomizadas a
cada 1 mm com 0,5 micras de espessura (Fig. 68), totalizando 630
amostras dispostas em lâminas para escolha aleatória de 90 lâminas, 5
lâminas de cada grupo de 5 tecidos ou materiais, totalizando 350 tecidos
e amostras.
67
Figura 67 - Desenho da sequência de remoção das amostras
indicando o sentido dos cortes realizados no micrótomo
para obtenção das lâminas
Em nosso trabalho fotografamos as lâminas através da utilização
de Microscopia Óptica com um aumento de 400X para visualizarmos
toda a amostra do enxerto e as corticais presentes em uma área situada
dentro do implante. Dentro desta área vamos quantificar os diversos
elementos presentes em cinco regiões distintas, localizados próximos ao
centro da amostra.
As peças foram descalcificadas em EDTA 10% Merk em
recipientes plásticos separados e rotulados.
Foram feitas 5 trocas de 2 e 2 dias e posteriormente, mais no
mínimo, 3 trocas semanais até total descalcificação das mesmas testadas
por instrumento perfurante e radiografias onde não se observa estruturas
calcificadas, ou seja, de suas imagens (radiografias quase totalmente
radiolúcidas).
As peças ósseas foram levadas ao processo de inclusão em
parafina por um aparelho histotécnico. Foram então incluídas em
parafina e microtomizadas em espessura de 0.5 micrometros, obtendo-se
cortes semisseriados das peças a cada 1 mm em Micrótomo Microm
(Zeiss-Germany) totalizando 5 cortes (Fig. 69). Os cortes foram
efetuados longitudialmente ao osso e perpendicularmente as amostras,
partindo da base da peça em direção ao defeito realizado.
68
Figura 68 - Desenho dos cortes microtométricos transversais aos
cilindros das amostras
*
* Obs.: Figura 55.
Figura 69 - Amostra da lâmina histológica
As lâminas obtidas foram coradas pelo método de coloração
utilizando-se Hematoxilina e Eosina. Observamos então em microscopia
óptica de luz, uso de grelha pré-determinada no MOtic Image e réguas
no sentido vertical e horizontal com 1.000 um. As lâminas foram
retiradas aleatoriamente das amostras e cada campo visível foi capturado
digitalmente e combinado para avaliar QA.
A análise das lâminas foi realizada segundo o princípio de
Cavalieri para determinar parâmetros quantitativos tridimensionais de
estruturas anatômicas a partir de cortes bidimensionais (MANDARIM-
DE-LACERDA, 2003).
As lâminas, para avaliação microscópica e análise estereológica,
e morfométrica, com base nos princípios acima estipulados, seguiram as
seguintes etapas:
69
• As lâminas foram fotografadas através da utilização de
Microscópio óptico (Labophot II – NiKon), acoplado a um sistema
de captura de imagem (MOthic Image). Com a objetiva de 400X,
foram obtidas fotos para visualizarmos toda a amostra do enxerto
em uma área situada dentro do enxerto ósseo. Dentro desta área
foram localizados 4 pontos próximos aos extremos (grelha), com
espaçamentos da amostra centralizada localizada no centro dos
enxertos. Para tal usamos um sistema teste calibrado para fotos de
400X dessas regiões previamente demarcadas nas fotografias
digitais, com base nos princípios acima citados.
• Visualisamos e calculamos o número de amostras de cada tecido
acima citado (objetivos específicos) dentro de uma área de 15
quadrados de grelha, tendo cada um 0,00397 mm², totalizando
0,059 mm², e área total de 0,29775 mm
2
sendo a Área Teste;
• Selecionamos 90 lâminas aleatoriamente, totalizando 5 lâminas de
cada grupo, das quais foi numerada a quantidade dos 5 tecidos ou
materiais nos 3 períodos de tempo estipulados nos objetivos
totalizando 1050 amostras.
Para tal usamos este sistema-teste calibrado para fotos de 400X,
para favorecer a avaliação dessas regiões que estarão previamente
demarcadas nas fotografias digitais nos seguintes quisitos:
a) Avaliação da área ocupada por cada um dos elementos
presentes nos enxertos segundo os princípios de Cavalieri,
através de parâmetros de área de perfis, número de perfis e
número de objetos dentro de uma área conhecida;
b) Avaliação da Densidade de Perfis de cada uma dos elementos
presentes dentro da área do enxerto. Verifica quanto de um
determinado volume é ocupado dentro de uma área-teste
delimitada pelo sistema-teste. Avaliação da Densidade de Perfis
de cada uma dos elementos presentes dentro da área delimitada
no espaço das amostras dos 15 quadrados de grelha e avaliações
histológicas excluindo as linhas de intersecções das amostras
com as linhas limítrofes direita e inferior (linhas proibidas).
Verifica quanto de um determinado volume é ocupado dentro
de uma área-teste delimitada pelo sistema-teste de cada tecido
ou material citado nos objetivos segundo os princípios de
Cavalieri citados por Mandarim-de-Lacerda (2003).
Densidades de perfis na área-teste (QA) representada pela
quantidade de imagens da estrutura em uma determinada área-teste,
70
delimitada pelo sistema-teste e calculada tendo em conta o aumento do
microscópio. Isto vai calcular a densidade de perfis de sistema-teste
através da fórmula abaixo:
QA = Σperfis 1/cm
2
AT
4.3 DENSIDADES DE PERFIS NA ÁREA-TESTE (QA) EM
ESTEREOLOGIA
Figura 70 - Lâminas 15 dias (A com Régua e B com Grelha)
*
* Grupo A -BIO-OSS
®
em microscopia óptica delimitando a “Área-Teste”.
Setas azuis indicam os limites da área-teste. Setas vermelhas as “linhas
proibidas”.
71
Representa a quantidade de imagens da estrutura em uma
determinada área-teste, delimitada pelo sistema-teste e calculada tendo
em conta o aumento do microscópio. Um quadrado de grelha
corresponde a 0,00397 mm
2
. Totalizamos 0,00397x15 quadrados de
grelha analisados em cada lâmina = 0,05955 mm
2
. Valor área de 5
amostras = 0.29775 mm
2
em aumento de 400X.
4.3.1 Cálculo da Densidade de Perfis
QA = Σperfis 1/cm
2
AT =0.29775 mm
2
Aplicabilidade – Determinação direta para calcular números de
estruturas em uma imagem. Como no exemplo abaixo:
Ex.: QA-PLGA+HA-TI-60 dias = 7perfis 1/cm
2
= 2,350 cm
2
AT =0.29775 mm
2
QA-PLGA+HA-TI-60 dias = 7/cm
2
divididos por 0,29775 mm
2
=
23.50 mm
2
= 2.350 cm
2
72
5 RESULTADOS
Este trabalho conseguiu avaliação da reparação óssea dos defeitos
criados e preenchidos com biomateriais em relação aos dos grupos
controle,
tecido conjuntivo, tecido inflamatório e tecido adiposo, e matérias
de enxerto foram calculados
aos 15, 30 e 60 dias através de estereologia
após contagem dos tecidos encontrados dentro do centro das lâminas
digitalizadas, excluindo aqueles em contato com as linhas direita e
inferior dos limites da grelha, denominadas linha proibida, segundo os
princípios de Cavalieri.
Figura 71 - Exemplo PLGA 15 dias
*
* Seta superior - tecido conjuntivo; seta inferior - tecido inflamatório.
73
Figura 72 - Exemplo de Coágulo 30 dias (Osteócito)
Figura 73 - Exemplo de PLGA 30 dias
*
* Seta superior - células adiposas; seta inferior - material de enxerto.
74
Figura 74 - Exemplo de PLGA+HA 30 dias
*
* Seta superior - material de enxerto; seta inferior - osso neoformado.
Tabela 1 - Somatório de perfis de Tecido Inflamatório em cm
2
15 Dias
30 Dias 60 Dias
Coágulo 1,679 7,388 0,671
Autógeno 1,443 0,338 1,443
Orthogen 2,35 5,037 2,35
Bio-Oss
®
0 0,268 5,037
PLGA 4,03 1,343 4,03
PLGA+HA 5,709 4,701 2,35
75
Gráfico 1 - TI - QA em cm
2
Gráfico 2 - TI –
QA em cm
2
-
15, 30 e 60 dias
O tecido inflamatório mostrou aumento insignificante aos 15 dias
e moderado aos 30 e 60 dias, em se tratando do grupo controle coágulo
negativo. No grupo controle positivo (autógeno) mostrou aumento
insignificante em todos os três períodos. No enxerto xenógeno
76
Orthogen, aumento desprezível aos 15 e 60 dias e insignificante aos 30
dias. Com o xenógeno Bio-Oss
®
, aumento desprezível aos 15 e 30 dias e
insignificante aos 60. O polímero de PLGA apresentou infiltrado
inflamatório desprezível aos 15, 30 e 60 dias. O polímero composto de
PLGA+HA apresentou uma redução em volume aos 15 e 30 dias,
tornando-se insignificante nos 60 dias.
Tabela 2 - Somatório de perfis de Material de Enxerto em cm
2
15 Dias 30 Dias 60 Dias
Coágulo 0 0 0
Autógeno 23,5 14,1 22,83
Orthogen 22,166 22,539 12,426
Bio-Oss
®
38,226 22,839 21,83
PLGA 38,226 22,839 21,83
PLGA+HA 21,158 26,868 26,632
Gráfico 3 - ME - QA em cm
2
77
Gráfico 4 - ME –
QA em cm
2
- 15, 30 e 60 dias
Em nosso estudo, na análise dos materiais de enxerto, no grupo
controle negativo, não apresenta resultados estatísticos por estar
preenchido por coágulo. No enxerto autógeno o mesmo particulado
encontra-se moderadamente em todos os períodos de acompanhamento.
No enxerto xenógeno Orthogen, quantidade moderada se acha aos 15 e
30 dias, sofrendo pequena diminuição (reabsorção) aos 60 dias. No
enxerto xenógeno Bio-Oss
®
está em maior quantidade aos 15 dias,
reabsorvendo leve e lentamente nos outros tempos. Com o polímero
composto de PLGA, está mais presente aos 15 dias, sofrendo leve e
gradativa reabsorção nos períodos seguintes. O grupo PLGA+HA em
todos os períodos sem diferença significativa, confirmado por estudos,
de que mostram a presença de HA até 44 meses após sua instalação.
Tabela 3 - Somatório de perfis de Osso Neoformado em cm
2
15 Dias 30 Dias 60 Dias
Coágulo 15,449 21,58 23,854
Autógeno 17,8 19,815 25,188
Orthogen 8,732 6,381 25,86
Bio-Oss
®
17,464 25,86 24,817
PLGA 3,022 18,136 24,85
PLGA+HÁ 24,85 28,547 26,532
78
Gráfico 5 - ON - QA em cm
2
Gráfico 6 - ON - QA em cm
2
-
15, 30 e 60 dias
O tecido ósseo neoformado no grupo coágulo teve aumento
gradativo nos três períodos, sendo superior no enxerto autógeno (Padrão
ouro). No osso liofilizado xenógeno Orthogen obtivemos aumento
moderado nos primeiros 30 dias, com aumento significante aos 60 dias.
No xenógeno Bio-Oss
®
obtivemos um crescimento inicial considerável
com aumento gradativo aos 60 dias. No grupo PLGA, pequeno
crescimento ósseo aos 15 dias, aumentando consideravelmente aos 30 e
60 dias. O grupo PLGA+HA, obteve um crescimento ósseo acentuado e
equilibrado nos três períodos.
79
Tabela 4 - Somatório de perfis de Tecido Conjuntivo em cm
2
15 Dias 30 Dias 60 Dias
Coágulo 14,77 9,739 17,128
Autógeno 11,083 4,701 0,671
Orthogen 18,136 17,464 3,358
Bio-Oss
®
25,188 7,724 4,03
PLGA 19,143 7,724 2,015
PLGA+HA 13,769 6,381 3,694
Gráfico 7 - TC - QA em cm
2
80
Gráfico 8 - TC - QA em cm
2
-
15, 30 e 60 dias
O tecido conjuntivo esteve presente em todos os grupos com
redução gradativa igualitária com exceção do grupo controle negativo
(coágulo), que teve aumento aos 60 dias.
Tabela 5 - Somatório de perfis de Tecido Adiposo em cm
2
15 Dias
30 Dias 60 Dias
Coágulo 6,381 4,366 8,396
Autógeno 11,418 5,037 2,015
Orthogen 4,701 8,06 8,396
Bio-Oss
®
10,075 7,052 13,098
PLGA 8,396 2,686 7,724
PLGA+HA 8,06 2,015 6,381
81
Gráfico 9 - TA - QA em cm
2
Gráfico 10 - TA - QA em cm
2
- 15, 30 e 60 dias
Com relação ao tecido adiposo, esteve presente aos 15 dias desde
forma similar em todos os grupos. Aos 30 dias apresentou-se em maior
quantidade nos ossos xenógenos, tendo aumento significativo em todos
os grupos, pela grande quantidade de gordura na medular dos fêmures
dos coelhos avaliados segundo os princípios estereológicos de Cavalieri,
citados por Mandarim-de-Lacerda em 2004. Avaliação de tecido
inflamatório, tecidos conjuntivo, remanescente de material de enxerto e
tecido adiposo ainda não tinham sido observados em outros estudos por
Estereologia. O tecido adiposo apresenta células mesenquimais
82
indiferenciadas que irão se transformar no tecido requerido pelo local de
sua presença.
83
6 DISCUSSÃO
A incidência da perda de implantes em maxila posterior, com
reabsorção acentuada após enxerto ósseo gira em torno de 15%
(BRANEMARK; SVENSSON; VAN STEENBERGHE, 1995).
A cirurgia de enxerto ósseo reconstrutiva do esqueleto
maxilofacial é apropriada para ser usada na reabilitação funcional da
maxila e pode ser usada para reparar defeitos traumáticos, atróficos ou
congênitos. Entretanto, cirurgiões orais e maxilofaciais podem ter sérios
problemas ao atender pacientes se o enxerto ósseo é rejeitado (DARLE,
1999 apud HOCHHEIM NETO, 2002).
Instalação de implantes pode ter um efeito dramático na
estabilidade e retenção de próteses em pacientes edêntulos por
maxilarectomia. Na ausência de dentes e falta de elementos de apoio
para uma prótese a estabilidade é frequentemente inadequada e resultará
em estética e funcionamentos insatisfatórios (IZZO et al., 1994;
ROMANAS et al., 1997 apud HOCHHEIM NETO, 2002).
A necessidade de desenvolvimento de biomateriais poliméricos
para reconstrução de defeitos ósseos periodontais, em reconstruções
para implantodontia e em defeitos provocados nos tecidos peri-
implantares, é imprescindível na odontologia atual, pela redução da
morbidade dos procedimentos. A associação com células-tronco
embrionárias desenvolvidas em meios de cultura em arcabouços pré-
moldados, a partir de vários tecidos coletados do indivíduo é uma
realidade (KIM et al., 2008).
Kim e colaboradores (2008) utilizaram arcabouços de PLGA+HA
técnica de conformação gasosa, demonstrando exposição superior de
partículas de HA do que na técnica com uso de solventes orgânicos.
Trabalho realizado por Rossi, Weinfeld e Miranda (2005)
comprovou que a substituição do osso bovino tipo “cone alveolar” por
osso natural é um processo lento, todavia, há relatos de partículas
remanescentes em casos de enxertos de outros tipos de osso bovino
mesmo após um período de 44 meses.
Aghaloo, Moy e Freymiller, em 2004, comprovaram que o osso
autógeno e substitutos têm resultados similares estatisticamente e
superiores ao grupo controle, conforme nosso estudo, utilizando
estereologia.
Soren Schou e colaboradores (2003a, 2003b) estudando
reconstituições ósseas em macacos concluíram que a estereologia
foi
uma boa alternativa para obtenção de resultados destas duas pesquisas.
84
Reconstruções ósseas foram feitas da mesma forma que em nosso
estudo com algumas modificações utilizando osso autógeno e Bio-Oss
®
,
porém, com resultados similares com relação ao crescimento ósseo.
Aghaloo, Moy e Freymiller (2004) pesquisaram o plasma rico em
plaquetas (PRP) conjuntamente com enxerto alográfico e xenográfico no
osso oral e maxilofacial e cirurgias recontrutivas para implantes. Esse
estudo compara a cicatrização óssea e a formação em defeitos em
crânios de coelhos com osso autógeno, xenógeno e xenógeno com PRP,
com grupo sem enxerto como controle. Quinze coelhos Nova Zelândia
foram inclusos nesta pesquisa. Quatro defeitos idênticos, com 8 mm de
diâmetro, foram criados
no crânio de cada coelho e imediatamente
enxertados com todos os materiais.
Cinco
coelhos foram
acompanhados 1 mês, 5 coelhos por 2 meses e 5 por 4 meses. A
histomorfometria mostrou que o incremento ósseo na área dos defeitos
autógenos e xenógenos, foram significantemente superiores que o grupo
controle. Comparando estes resultados com nosso estudo, verifica-se
que embora a localização e a metodologia das pesquisas realizadas,
sejam semelhantes, os enxertos apresentam resultados similares, quando
analisados por ANOVA.
Rimondini e colaboradores em estudo experimental in vivo de
regeneração óssea em defeitos críticos, usando copolímero de PLA/PGA
biodegradável injetado, em 2005, observaram que o assentamento foi
feito em osso saudável padrão após implantação de PLA/PGA 50%/50%
dispersado em solução aquosa de PGA e dextrano usando como
substituto ósseo em modelo animal. Dois grupos de cinco coelhos foram
usados. Em ambos os
côndilos femurais foram realizados defeitos
críticos de 6x10 mm
.
No lado direito PLA/PGA foi inserido e no lado
esquerdo permaneceu vazio. Após 30 e 90 dias da cirurgia os animais
foram sacrificados. Os defeitos do lado esquerdo não preenchidos
mostraram uma cicatrização não espontânea após 30 e 90 dias. Sítios
preenchidos com material experimental mostraram novo osso com
extensão de 11,46% e 76,82% após 30 dias, e 75,98% e 95,34% após 90
dias. A histomorfometria mostrou incremento de osso maturado entre os
30 e 90 dias nos sítios experimentais aos 90 dias, não houve diferença
estatística em se comparando com o osso normal. Copolímeros de
PLA/PGA dispersados em matriz hidrossolúvel parecem um material
osteocondutivo apropriado em defeitos ósseos de tamanho crítico.
Testes de Wilcoxon foram utilizados entre os 30 e 60 dias para acessar o
ganho ósseo. Teste de Man Whitney com método de Monte Carlo para
probabilidade computadorizada foram usados para comparar as
85
mensurações entre os sítios cicatriciais aos 30, 60 dias e o osso normal
com microscopia eletrônica de varredura. Apesar da metodologia de
pesquisa, concentrações e localização favorável pela nutrição os
enxertos apresentam resultados similares ao do nosso estudo mesmo
com a utilização de outras metodologias.
Eeva Mäkelä e colaboradores, em 2007, desenvolveram um
trabalho com rodas compósitas de ácido polilático poliglicólico (80%
/20) autorreforçados com 2 mm de diâmetro e 36 mm em comprimento
sendo implantados no tecido subcutâneo do dorsal de 20 coelhos.
Osteotomias em distal de fêmur foram fixadas com estes cilindros
(12x15 mm) nos coelhos. O acompanhamento variou entre 3 e 4
semanas. Depois de 6 meses as propriedades mecânicas foram reduzidas
significantemente, mas as osteoteotomias cicatrizaram normalmente. A
presente investigação mostra que as propriedades de fixação mecânica
do SR-Polilático-glicólico (80/20) são viáveis para fixação de
osteotomias em coelhos desde que técnica cirúrgica seja correta. Turkey
e ANOVA foram utilizados na estatística. Nos períodos de tempo
existentes em nossa pesquisa as concentrações do polímero composto
foram parecidas em porcentagem, apesar de metodologia de pesquisa
diferente. O trabalho de Mäkelä e colaboradores mostrou resultados
similares aos nossos indicando que o método estereológico mesmo
quando comparado a outros tipos de abordagem possibilitam obtenção
de resultados morfométricos acurados.
Em nosso trabalho empregamos enxertos de PLGA, PLGA+HA,
Bio-Oss
®
, Orthogen, Autógeno (Controle Positivo) e Coágulo (Controle
Negativo), avaliados através de Microscopia Óptica por estereologia e
analisados tecido infamatório, material de enxerto, osso neoformado,
tecidos conjuntivo e adiposo em 15, 30 e 60 dias.
Em relação ao tecido inflamatório observamos aumento
insignificante aos 15 dias e moderado aos 30 e 60 dias, em se tratando
do grupo controle coágulo negativo com resutados similares a Huang e
colaboradores (2008). No Autógeno, considerado “padrão ouro”, o
tecido inflamatório teve aumento insignificante em todos os três
períodos confirmando resultados de outros estudos. No enxerto
xenógeno Orthogen a presença de tecido inflamatório foi desprezível
aos 15 e 60 dias e insignificante aos 30 dias mostrando-se um excelente
material neste quesito. Com o xenógeno Bio-Oss
®
o tecido inflamatório
desprezível aos 15 e 30 dias e insignificante aos 60 confirmando
pequena presença de tecido inflamatório. O polímero de PLGA
apresentou infiltrado inflamatório desprezível aos 15, 30 e 60 Dias.
Estes nossos resultados quando comparados a outras publicações que
86
também utilizaram o PLGA tiveram resultados semelhantes. Os
resultados com o polímero composto de PLGA+HA aos 15 e 30 dias
relativos à quantidade de tecido inflamatório foram diminuindo,
tornando-se insignificantes aos 60 dias. Isto significa que este nos
parece ser também um excelente material.
Segundo Huang e colaboradores (2008) a observação histológica
da resposta tecidual (1 a 9 semanas após a implantação) mostrou uma
resposta inflamatória desprezível conforme artigo citado demonstrando
processo de subtituição.
Em nosso estudo, na análise dos materiais de enxerto, no grupo
controle negativo, não apresenta resultados estatísticos por estar
preenchido por coágulo. No enxerto autógeno particulado encontra-se
moderadamente em todos os períodos de acompanhamento pelo
processo de substituição por osteoclastos e regenerando por
osteoindução, condução e osteogênese. No enxerto xenógeno Orthogen,
quantidade moderada se acha aos 15 e 30 dias, sofrendo pequena
diminuição (reabsorção) aos 60 dias não perdendo significativamente
aos outros materiais. No enxerto xenógeno Bio-Oss
®
está em maior
quantidade aos 15 dias, reabsorvendo leve e lentamente nos outros
tempos conforme citações. O polímero composto de PLGA está mais
presente aos 15 dias, sofrendo leve e gradativa reabsorção nos períodos,
porém, não perdendo para as outras técnicas. O grupo PLGA+HA em
todos os períodos sem diferença significativa discutido por estudos que
mostram a presença de HA até 44 meses após sua instalação
demostrando clinicamente aumento em altura confome imagens e
revisão citadas.
O tecido ósseo neoformado no grupo coágulo demonstrou
aumento gradativo nos três períodos, sendo superior no enxerto
autógeno (Padrão ouro). O osso liofilizado xenógeno Orthogen pareceu
ser um excelente material pelo aumento moderado nos primeiros 30
dias, com aumento significante aos 60 dias. No xenógeno Bio-Oss
®
obtivemos um crescimento inicial considerável com aumento gradativo
até os 60 dias. No grupo PLGA, pequeno crescimento ósseo aos 15 dias,
aumentando consideravelmente aos 30 e 60 dias. Discutindo o grupo
PLGA+HA, o crescimento ósseo acentuado e equilibrado nos três
períodos. Várias análises estatísticas de artigos citados tiveram
resultados similares com relação à utilização dos mais variados
biomateriais.
O tecido conjuntivo esteve presente em todos os grupos com
redução gradativa igualitária com exceção do grupo controle negativo
87
(coágulo), que teve aumento aos 60 dias, provavelmente conforme visto
em outros estudos pela falta de ostocondutividade do biomateriais.
Com relação ao tecido adiposo, esteve presente aos 15 dias desde
forma similar em todos os grupos. Aos 30 dias apresentou-se em maior
quantidade nos ossos xenógenos, tendo aumento significativo em todos
os grupos sendo pela grande quantidade de gordura na medular dos
fêmures dos coelhos e não instalação de implantes osseointegráveis.
Avaliação de tecido inflamatório, tecidos conjuntivo, remanescente de
material de enxerto e tecido adiposo ainda não tinham sido observados
em outros estudos por Estereologia demonstrando acurácia, rapidez,
menor número de amostras necessárias facilitando um trabalho de
pesquisa mais abrangente, avaliando segundo os princípios
estereológicos de Cavalieri, citados por Mandarim-de-Lacerda em 2003.
88
7 CONCLUSÃO
Concluímos que empregando esta metodologia em coelhos Nova
Zelândia, utilizando os princípios estereológicos de Cavalieri citados por
Mandarim-de-Lacerda (2003), conseguimos resultados similares e
comparáveis a outros estudos e análises estatísticas, com excelentes
resultados sobre os grupos controles. Todos os substitutos ósseos e osso
autógeno tiveram resultados superiores comparados ao grupo controle
negativo. Pudemos avaliar seis enxertos em três tempos e obtendo
resultado mais rápido, fácil e acurado.
89
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