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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781): SUSCEPTIBILIDADE
DE CAMUNDONGO E ANTIGENICIDADE DOS PRODUTOS DE
SECREÇÃO E EXCREÇÃO DE LARVAS
LUCIANA RIBEIRO SERAFIM
BELO HORIZONTE, 2009
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LUCIANA RIBEIRO SERAFIM
Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781) :
SUSCEPTIBILIDADE DE CAMUNDONGO E ANTIGENICIDADE DOS
PRODUTOS DE SECREÇÃO E EXCREÇÃO DE LARVAS
Belo Horizonte
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG
2009
Agradecimentos
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Parasitologia, Instituto de
Ciências Biológicas (ICB), Universidade
Federal de Minas Gerais (UFMG), como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Parasitologia.
Área de Concentração: Entomologia
Orientador: Dr. Antônio Cesar Rios Leite
Colaboração: Dra. Cristiane R. Côrrea
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Ao Professor Antônio César, meu orientador, não apenas em assuntos científicos,
mas um exemplo de profissional ético. Obrigada pela oportunidade e ensinamentos
que me tornaram uma pessoa melhor.
Ao Professor Alfredo Góes profissional exemplar que sempre incentiva a todos em
volta a dar o seu melhor. Ao vibrar com cada resultado que obtive, incentivou-me a
prosseguir. Obrigada pela inestimável ajuda.
À Cristiane Côrrea, minha colaboradora, que dividiu alegrias e frustrações durante o
meu mestrado. Obrigada por todos os puxões de orelha que me fizeram crescer.
À minha amiga de longa data e colega de laboratório Maria Fernanda que me ajudou
antes e durante o meu Mestrado. Muito obrigada por tudo.
Aos colegas do Laboratório de Imunologia Molecular e Celular que sempre foram
solícitos. Obrigada a todos que fizeram esta jornada ser menos difícil.
Ao Agenor Valadares por toda a ajuda que me concedeu.
Aos meus colegas de Mestrado que dividiram suas alegrias e tristezas comigo, em
especial Ariadna e Helen que puderam acompanhar mais de perto toda a minha
trajetória.
Aos colegas que fiz no Departamento de Parasitologia: os que ainda permanecem e
aqueles que já seguiram outros caminhos na vida.
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Aos meus familiares que me incentivaram durante toda a minha formação
acadêmica.
Ao Matheus, meu namorado, que me acompanhou em vários finais de semana ao
ICB e que me suportou durante a fase mais difícil do mestrado: quando nada dava
certo.
Aos responsáveis pelo frigorífico Santa Vitória que gentilmente permitiriam a nossa
entrada em suas instalações para a coleta das larvas usadas nos experimentos e
manutenção do ciclo em laboratório.
Ao colegiado e ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação pela oportunidade
de realizar este trabalho.
À Sumara por toda ajuda e intervenção a meu favor, muito obrigada.
A CAPES pela concessão da bolsa.
E, sobretudo, a Deus que atendeu as minhas orações e enviou pessoas tão
especiais nos momentos de provação e que hoje tenho oportunidade de agradecer.
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Resumo
Larvas de Dermatobia hominis são parasitos obrigatórios de tecidos
cutâneos de vários mamíferos, domésticos e silvestres, inclusive humanos, de
ocorrência na região Neotropical. Nos hospedeiros, as larvas determinam a
dermatobiose, miíase furuncular conhecida como berne. Embora afete humanos, a
miíase acarreta grandes prejuízos econômicos à exploração pecuária, sobretudo no
Brasil, em decorrência da diminuição de ganho de peso, produção de leite e
depreciação do couro de animais, principalmente bovinos. A partir de infestação
experimental de camundongos Swiss, com larvas recém-emergidas de D. hominis,
foram obtidas, após biópsia, larvas aos 4, 10, 20 e 25 dias pós-infestação (dpi) e
delas colhidas secreção e excreção (SE) para eletroforese e testes de Western blot.
As SE expressaram moléculas entre 10-200 kDa, sendo as mais abundantes e
antigênicas as de 25,4 e 30,8 kDa. Sob análise de espectrometria de massa, a
molécula de 25,4 kDa não mostrou analogia com qualquer peptídeo já depositados
em bancos de dados, enquanto que a de 30,8 kDa teve similaridade com peptídeo
de albumina bovina. A discussão evoca a importância do uso de camundongos
como modelo experimental da miíase por larva de D. hominis, associada a resposta
humoral desses hospedeiros durante a infestação, além de focalizar o estudo
preliminar sobre proteoma.
Palavras-chave: Oestridae, Dermatobia hominis, miíase, Western Blot, secreção e
excreção.
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Abstrast
Dermatobia hominis larvae are obligatory parasites of the cutaneous
tissues of domestic and wild mammals, including human being, from a Neotropical
region. In the hosts, the larvae cause dermatobiosis, a furuncular myiasis popularly
called torsalo. Although it affects humans, the disease determines great economic
losses to livestock, mainly in Brazil, in consequence of losing of weight, milk
production and depreciation of animas’s hide particularly in cattle production. After
experimental infestation of mice with D. hominis, larvae were collected from these
hosts at 4, 10, 15, 20 and 25 days post-infestation and their secretory-excretory
products (SEP) were processed by electrophoreses and Western blot essays. The
results revealed that the molecules expressed by SEP were of 10-200 kDa, being the
24.4 and 30.8 kDa molecules more abundant and reactive. After analysis by mass
spectrometry, the 30.8 kDa peptides were compared with date-bank NASI and
showed similar homology with bovine albumin. The discussion bears the importance
of the observation using mice as experimental model of D. hominis myiasis. The
host’s humoral immune response during the infestation and the preliminary proteomic
assay were both reported as well.
Key words: Oestridae, Dermatobia hominis, myiases, Western Blot, secretion and
excretion.
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Lista de ilustrações
FIGURA 1 – Esquema do ciclo biológico de Dermatobia hominis (Marcelo
Campos).....................................................................................................................14
FIGURA 2. Sistema digestivo da larva de terceiro estágio de Dermatobia hominis
com 20 dias pós-infestação (Evangelista e Leite,
2003)..........................................................................................................................20
FIGURA 3. Camundongo Swiss sob infestação com larva de Dermatobia hominis em
diferentes fases de desenvolvimento. (A) anestesiado durante a infestação, (B)
detalhe no momento de penetração da larva de primeiro estágio na pele, (C) com
larva de terceiro estágio (L
3
) aos 20 dpi, (D) L
3
emergindo do hospedeiro, (E) detalhe
da L
3
emergindo, (F) L
3
emergida.................................................................................................................... 36
FIGURA 4: Perfil eletroforético das amostras de secreção e excreção de larvas de
Dermatobia hominis, colhidas de camundongos Swiss colhidas aos 4 dias pós-
infestação (dpi), 10, 15, 20 e 25 dpi, em SDS-PAGE a 10% corado por prata (A).
Imagem invertida do mesmo gel (B). PM= padrão molecular. Concentração da
amostra:2µg/canaleta................................................................................................ 38
FIGURA 5 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
1
com 4
dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º di, 15º di, 20º di, 25º di
e de animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa...................................................................................................... 39
FIGURA 6 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
2
com
10 dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa...................................................................................................... 40
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FIGURA 7 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
2
/L
3
com 15 dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros
de camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa...................................................................................................... 41
FIGURA 8 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
3
com
20 dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa.................................................................................................... 42
FIGURA 9 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
3
com
25 dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa..................................................................................................... 43
FIGURA 10- Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção (SE) de
larvas colhidas em rato com 5 dias pós-infestação (dpi), 10, 15 e 20 dpi versus pool
de soro no 25º dia de infestação (di) proveniente de camundongos Swiss. O soro
controle foi incubado com SE de larva com 25 dpi. Foram aplicados 20 µg de
proteína em cada canaleta. Padrão molecular em kDa............................................ 44
FIGURA 11 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
3
proveniente bovinos versus pool de soros de camundongos Swiss colhido no 4º dia
de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de animais controle. Foram aplicados 20
µg de proteína em cada canaleta. Padrão molecular em kDa.................................. 45
FIGURA 12 - (A) Gel SDS-PAGE 10% com perfil eletroforético de secreção (SE) e
excreção de L
1
com 4 dias pós-infestação nas concentrações 5; 7,5; 10 e 15 µg ,
corado por Coomassie Coloidal. (B) Western Blot utilizando como antígeno SE com
4 dpi nas concentrações 5; 7, 5; 10 e 15 µg versus pool de soros colhidos no 25º
dia de infestação. Padrão molecular em kDa........................................................... 47
FIGURA 13. Analise de homologia em banco de dados. Sequência analisada pelo
algoritmo “protein-protein-Blast” da PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).......... 48
FIGURA 14 - Sequência de aminoácidos da albumina bovina depositada em banco
de dados PubMed (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Em vermelho sequência de
peptídeos da proteína de 30, 8 kDa, em sobreposição............................................. 48
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Lista de tabelas
QUADRO 1: Identificação das proteínas de secreção e excreção de L
1
de
Dermatobia hominis colhida aos 4 dpi de camundongos
Swiss......................................................................................................................... 49
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Lista de abreviaturas
ACN: acetonitrila
BLAST : basic local alignment search
BSA: bovine serum albumin
Clt: controle
di: dias de infecção
dpi : dias pós-infecção
dpsl: dias pós-saída da larva
HCl: ácido clorídrico
IgG: imunoglobulina G
kDa: quilodaltons
L
1
: larva de primeiro estágio
L
2
: larva de segundo estágio
L
3
: larva de terceiro estágio
MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption/ionization- time of fly
Ms: massa
Ms/Ms: massa/massa
MSDB: mass spectrometry protein sequence database
NBCI: National Center for Biotechnology Information
NBT/BCIP : 5-Bromo-4-Cloro-3-Indolyl Phosphate/Nitro Blue Tetrazolium
PBS: phospahate buffered saline
PM: Padrão molecular
SE: secreção e excreção
SDS: Sodium dodecyl sufate
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................13
1.1. Glândulas salivares ............................................................................................18
1.2. Tubo digestivo.................................................................................................... 21
1.3. Proteoma .......................................................................................................... 23
2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................... 24
3. OBJETIVOS ......................................................................................................... 25
3.1. Objetivo Geral ................................................................................................... 25
3.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 25
4. METODOLOGIA .................................................................................................. 26
4.1. Manutenção de insetos ..................................................................................... 26
4.2. Animais infestação ........................................................................................... 27
4.2.1. Infestação experimental de camundongos Swiss .......................................... 27
4.2.2. Infestação experimental de camundongos Balb/c.......................................... 28
4.2.3. Infestação experimental de Rattus norvegicus................................................ 28
4.3. Secreção e excreção de larvas ......................................................................... 29
4.4. Dosagem de proteínas ...................................................................................... 30
4.5. SDS-PAGE ...................................................................................................... 30
4.6. Coloração de gel .............................................................................................. 31
4.6.1. Prata ............................................................................................................... 31
4.6.2. Coomassie colloidal…..................................................................................... 31
4.7. Western blot ......................................................................................................32
4.8. Preparação da amostra para sequenciamento em espectrômetro de massa .. 32
4.8.1. Espectrometria de massa ............................................................................... 33
4.8.3. Busca em bancos de dados e análise .das amostras ................................... 34
5. RESULTADOS ..................................................................................................... 35
5.1 Infestação experimental ..................................................................................... 35
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5.2. Eletroforese de secreção e excreção de larvas colhidas de camundongo
Swiss ........................................................................................................... ............37
5.3. Western blot ...................................................................................................... 39
5.3. 1. Secreção e excreção de L
1
(4 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss .................................................................................... 39
5.3. 2. Secreção e excreção de L
2
(10 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss .................................................................................... 40
5.3. 3. Secreção e excreção de L
2
/ L
3
(15 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss ................................................................................... 41
5.3. 4. Secreção e excreção de L
3
(20 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss .................................................................................... 42
5.3. 5. Secreção e excreção de L
3
(25 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss ....................................................................................43
5.3. 6. Secreção e excreção de larvas colhidas em rato (5, 10, 15, 20 e 25 dpi)
versus soro de camundongos Swiss ........................................................................ 44
5.3. 7. Secreção e excreção de L
3
colhidas de bovino versus soro de camundongos
Swiss ........................................................................................................................ 45
5.3.8. MALDI-TOF .................................................................................................... 46
6. DISCUSSÃO ........................................................................................................ 50
7. CONCLUSÃO ...................................................................................................... 54
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 55
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1. INTRODUÇÃO
A Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781), única espécie do gênero
dentre as 151 da família Oestridae
1
(WOOD, 1987), Diptera, exclusivamente
neotropical, isto é, ocorre desde o sul do México (24-26N) até o norte da Argentina
(30-32S), com exceção do Chile (GUIMARÃES e PAPAVERO, 1999).
A forma larvar desta mosca é parasito obrigatório de tecidos subcutâneos
de vários mamíferos, domésticos e silvestres, inclusive humanos. Nestes
hospedeiros, as larvas do inseto determinam um tipo de miíase nodular conhecida
como berne ou dermatobiose (HALL e WALL, 1995).
Em condições naturais e experimentais, adultos de D. hominis possuem
atividade diurna e após a fertilização das fêmeas, estas capturam e depositam ovos
sobre dípteros que possam servir de foréticos (NEIVA, 1910; NEIVA e GOMES,
1917). Diversos insetos de distintas famílias de dípteros foram reportados como
foréticos: Muscidae, Anthomyiidae, Tabanidae, Sarcophagidae, Culicidae, Simulidae
e Cuterebridae. As espécies Sarcopromusca pruna (Shannon e Del Ponte,1926),
Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758), Musca domestica (Linnaeus, 1758), Fannia
pusio (Wiedemann,1830) foram consideradas as mais importantes (GUIMARÃES e
PAPAVERO, 1999).
Nos foréticos, os ovos são geralmente depositados na região latero-
ventral do abdômen, com o opérculo voltado para baixo. As fêmeas de D. hominis
depositam até 800 ovos, os quais são incubados por 4-6 dias, sob temperatura de
26-28 °C e umidade de 70-95% (KOONE e BANEGAS, 1959; CHAIA et al., 1975).
A infestação
2
dos mamíferos tem início quando os foréticos pousam ou se
alimentam sobre os hospedeiros, com tempo suficiente para que as larvas contidas
nos ovos de D. hominis sofram a ação da termia e dos gases provindos da pele,
quando então, as mesmas recém-emergidas penetram ativamente na pele (FIG.1). A
penetração da larva na pele do hospedeiro é completada em 5-10 minutos (NEIVA e
GOMES, 1917).
________________
1. De acordo com a classificação de Pape (2001).
2. Será adotado o termo infestação em vez de infecção
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A larva não migra pelo hospedeiro como fazem muitos Oestridae
(COLWELL, HALL, SCHOLL, 2006), pois no fundo da derme ocorrem duas
metamorfoses larvais [mudança de primeiro estágio
3
(L
1
) para o segundo (L
2
), e
deste para o terceiro (L
3
)] dentro de uma cavidade contornada por um processo
inflamatório do tipo tumor furunculose (GUIMARÃES e PAPAVERO, 1999). A média
do período de parasitismo, em dias, dos três estágios larvais é de 40-60 em bovinos
e caprinos, 35-50 em cobaias, 25-35 em camundongos, 30-40 em ratos (JOBSEN e
MOURIER, 1972) e 46-54 em humanos (DUNN, 1930).
Cessado o parasitismo, a larva L
3
de D. hominis, que mede cerca de 20
mm de comprimento, sai do hospedeiro, cai no solo e imerge na terra. Onde dois a
três dias após, tem início a fase de pupa. Em temperatura de 27 ºC e umidade
relativa de 70-80%, o período de pupa varia de 23-29 dias (CATTS, 1982). No ato da
saída da imago, o opérculo do pupário é aberto, e o adulto emerge usualmente
durante as horas mais quentes do dia (NEIVA e GOMES, 1917).
FIGURA 1 – Esquema do ciclo biológico de Dermatobia hominis (Campos).
________________
3. Será adotado o termo estágio.
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Experimentalmente, vários hospedeiros foram submetidos à infestação
por larvas de D. hominis: cães (NEIVA e GOMES, 1917), humanos (DUNN, 1930),
cobaias (NEEL et al., 1955), coelhos (LELLO, MOTA, PERAÇOLI, 1980; LELLO e
BOULARD, 1990; LELLO e PERAÇOLI, 1993), bovinos (OLIVEIRA-SEQUEIRA et
al., 1996; SANCHO, CABALLERO, RUÍZ-MARTINEZ, 1996), ratos (JOBSEN e
MOURIER, 1972; DE FILIPPIS e LEITE, 1997; EVANGELISTA e LEITE, 2005,
GONÇALVES et al., 2007) e camundongos (LELLO e ROSIS, 2003).
Quanto à resposta imunológica, os primeiros estudos foram realizados em
coelhos (MOTA, PERAÇOLI, LELLO, 1980; PERAÇOLI, LELLO, MOTA, 1980), cuja
imunização com macerado total de larvas (L
1
+ L
3
) de D. hominis induziram a
produção de anticorpos circulantes (não identificadas). Outros estudos também
utilizando coelhos imunizados (LELLO e BOULARD, 1990), através de macerado
total de L
1
, L
2
e L
3
, foram observados níveis elevados de anticorpos (não identificada
a imunoglobulina) contra os antígenos das larvas. Estes animais, subsequentemente
infestados, permaneceram com altas titulações de anticorpos que decresceram logo
após a saída da larva.
A presença de imunoglobulinas M (IgM) e imunoglobulinas G (IgG) foram
detectadas em tecidos cutâneos de bovinos, que já haviam sido parasitados
naturalmente por D. hominis (OLIVEIRA-SEQUEIRA et al., 1996) e os animais,
quando experimentalmente infestados, tanto IgM como IgG estavam presentes nos
tecidos da reação inflamatória, sendo encontrada IgG aos 1, 2, 7 dias pós-
-infestação (dpi) um fato associado a miíase primária (natural) dos bovinos.
Sob o enfoque imune-celular, coelhos previamente imunizados com
extratos (macerado total de L
1
, L
2
e L
3
) de D. hominis e subsequentemente
infestados, evidenciavam, no local da miíase, uma infiltração de eosinófilos (LELLO
et al.,1980). Grogan et al. (1987) estudando um caso de miíase por D. hominis, em
indivíduo humano, revelou nos tecidos lesados: infiltrado de linfoblastos, eosinófilos,
fibroblastos ativados, histiócitos maduros, mastócitos e células plasmáticas, que
indicou haver uma resposta imunológica complexa do hospedeiro. Também usando
coelhos imunizados com macerado total (L
2
ou L
3
) e posteriormente infestados por
D. hominis (LELLO e PERAÇOLI, 1993), foi demonstrado que os animais
imunizados desenvolveram uma resposta imunológica mais rápida, em função do
grande infiltrado celular da pele, do que em coelhos apenas infestados. Oliveira-
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-Sequeira et al. (1996) infestando experimentalmente bovinos, os quais já haviam
tido miíase natural, observaram na pele grande número de eosinófilos e sugeriram
que tais células eram as mais importantes na lesão causada pela larva; além de
identificarem também basófilos e mastócitos degranulados.
Em ratos de laboratório infestados com larvas de D. hominis (PEREIRA,
LEITE, LEITE, 2001), os achados histopatológicos na pele revelaram: aos dois dpi,
que a larva estava rodeada por uma área inflamada com predominância de
neutrófilos; aos 4 dpi, havia uma fina camada de necrose próxima a larva, além de
um grande número de neutrófilos, linfócitos, macrófagos, e raros eosinófilos e
mastócitos. Sucessivamente, o processo inflamatório continuou crescente com
proliferação de fibroblastos e células endoteliais, e o aparecimento de focos
hemorrágicos. Entre os 18-20 dpi foi observada uma espessa camada de necrose e
produção de fibras colágenas, tendo o infiltrado inflamatório grande concentração de
neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e mastócitos, e poucas células plasmáticas. Aos
25-30 dpi, havia redução da camada necrosada e do número de neutrófilos e
linfócitos, embora ocorresse grande quantidade de eosinófilos, células plasmáticas e
fibras colágenas. Quando as larvas deixaram o hospedeiro, aos 30 dias de
infestação, ocorria uma diminuição da cavidade, onde estava presente a larva e
crescente infiltração de mastócitos e muitas fibras colágenas. E, aos 10 dias pós-
emergência, a pele lesada apresentava cicatrização.
A expressão de eosinófilos e mastócitos na pele de ratos com miíase por
D. hominis (PEREIRA e LEITE, 2002) foi significativa em número de eosinófilos até
os 10 dpi, e em seguida decrescente até os 28 dpi, data próxima da emergência da
larva do hospedeiro. Os mastócitos foram significativos no início da infestação (4
dpi) e aos 20 dpi. Tais resultados, primeiro a usar uma avaliação estatística,
sugeriram que a expressão de ambas as células, particularmente eosinófilos, têm
uma importante participação na resposta do hospedeiro ao parasito.
Em infestação e reinfestação experimental de camundongos (LELLO e
ROSIS, 2003), a lesão da pele tinha grande número de neutrófilos e raros
eosinófilos. Durante o curso da infestação havia uma área de necrose rodeando a
larva, células inflamatórias e fibroblastos. Na reinfestação, ocorrida após 30 dias da
retirada da larva (com 5 dpi) da primoinfestação, a inflamação na pele foi intensa um
dia após, com presença de grande número de eosinófilos, além de fibroblastos
circundando a área necrosada. Os autores alegaram que um contato prévio com o
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antígeno facilitava a chegada de eosinófilos, provavelmente através de fatores
quimiotáticos liberados pelos mastócitos. Também em camundongos infestados e
reinfestados, subpopulações de linfócitos: CD4 e CD8 (linfócitos T), CD45 (linfócitos
B) foram analisadas (LELLO, 2006). Tanto em animais infestados quanto
reinfestados, o número de células CD4
+
foi significativamente maior que CD8
+
, mas
o número absoluto dessas células foi maior em animais reinfestados. Sobre linfócitos
B ocorreu aumento gradual em ambos os grupos, sendo mais elevado na
reinfestação.
Com ênfase a estudos sobre as alterações hematológicas (BARBOSA,
SANAVRIA, BARBOSA, 2003) foram descritos semelhantes parâmetros (não
significativos) de hemácias, das médias da leucometria, e das contagens absolutas e
relativas de linfócitos, em bovinos infestados experimentalmente com larvas de D.
hominis.
A expressão de leucócitos sanguíneos circulantes foi investigada em ratos
experimentalmente infestados com D. hominis antes, durante [aos 6 (L
1
), 10 e 15
(L
2
), 20 e 28 (L
3
) dpi] e aos 7, 15, 30, 60 dias pós-saída da larva (dpsl) dos
hospedeiros (GONÇALVES et al., 2007). Sob avaliação estatística durante a
infestação, o número total de leucócitos não apresentou diferença marcante quando
comparado todos os grupos de animais. Todavia, diferenças significantes foram
assinaladas quando comparado os grupos entre si, sendo maiores no grupo
controle, 15, 20 ou 28, do que aos 6 dpi. Em relação aos neutrófilos, os ratos com L
3
apresentaram número significativamente maior. Semelhança em números ocorreu
para eosinófilos ou linfócitos totais, exceto a favor de 20 dpi comparando com os
grupos de 6 ou 10 dpi. Nenhuma diferença significativa foi registrada entre o número
total de leucócitos e linfócitos; ocorrendo o contrário para neutrófilos aos 7 ou 15 em
comparação com 30 dpsl e eosinófilos aos 15 versus 60 dpsl.
Na América Latina e, sobretudo no Brasil, a dermatobiose acarreta
grandes prejuízos sócio-econômicos. Neste contexto, o maior impacto da miíase é
sobre a exploração pecuária, em decorrência de perdas por diminuição de ganho de
peso, produção de leite e depreciação do couro de animais, principalmente bovinos
4
.
O prejuízo na América Latina, estimado em décadas passadas, foi avaliado em 260
milhões de dólares anuais (GRISI et al., 2002).
________________
4. Dermatobia hominis é o único Oestridae cuja larva é parasita de bovino na América Latina.
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No Brasil, D. hominis está presente em vários estados, principalmente no
sul e sudeste. Sua ocorrência é maior nos meses de temperatura e umidade relativa
do ar elevada. A espécie está ausente nos estados com clima adverso, por exemplo:
norte e nordeste brasileiro (BRITO e MOYA-BORJA, 2001).
Valores estimados indicaram ser de 36 milhões de dólares/ano, as
perdas econômicas causadas pelo berne a pecuária brasileira (TORTUGA, 1979).
Embora não ocorram dados mais recentes é bem provável que centenas de milhões
de dólares sejam gastos no combate ao berne.
Mesmo considerando os vários esforços para o controle de D. hominis,
inclusive por distintos métodos, usando um vasto arsenal larvicida (GUIMARÃES e
PAPAVERO, 1999), a dermatobiose permanece enzoótica na América Latina.
Métodos alternativos para o controle de D. hominis, como biológicos e físicos tem
resultados ineficientes (MOYA-BORJA, 2003).
Nos últimos 20 anos, estudos de moléculas em processos metabólicos,
associados ao sistema digestivo e anexo (glândula salivar) de larvas biontófagas,
têm sido conduzidos para o controle de miíases, com ênfase maior para uma futura
produção de vacinas. Tais ensaios envolvem extrato total de secreção e excreção de
glândula salivar ou intestino médio (FRUGÈRE et al., 2000). Em adição, moléculas
isoladas da matriz peritrófica - tecido extracelular que reveste o intestino médio de
larvas (TELLAM et al., 2001) - tem apresentado resultados animadores como vacina
(ANGULO-VALADEZ et al., 2007).
É bem provável que em breve o uso de vacina antimiíases alcance
resultados promissores como os que vêm sendo praticados com a vacina contra
carrapatos (WILLADSEN et al., 1989; GORDON e ALLEN, 1987; WILLADSEN et al.,
1996).
1.1. Glândulas salivares
Como anexos do sistema digestivo (FIG.2), as glândulas salivares são
órgãos exócrinos de fundamental importância durante a vida das larvas, insetos
adultos
e de muitos outros artrópodes. Elas sintetizam e secretam moléculas que
podem provocar catálise, paralisia de presas, vaso dilatação, anticoagulação,
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balanço hídrico e reabsorção de íons (RIBEIRO, 1995; RIBEIRO e
FRANCISCHETTI, 2003).
Particularmente em larvas de D. hominis há um par de glândulas
salivares, na porção antero-lateral da cavidade corporal. O seu formato é tubular e
de aparência translúcida. Cada glândula tem um ducto eferente que se fundem
formando um ducto comum (deferente), o qual se insere ao esqueleto cefalofarígeo.
Externamente, as glândulas são revestidas por tecido conjuntivo extracelular
impregnado por células adiposas e ramificações de traqueíolas. O desenvolvimento
das glândulas acompanha o crescimento da larva, ocorrendo ausência delas na
pupa e adultos de D. hominis (VIEIRA e LELLO, 1996).
A glândula é formada por monocamada de células com microvilosidades
para a luz. O formato das células é oval com núcleo central e nucléolo com
cromatina dispersa. As células glandulares repousam sobre uma membrana basal
limítrofe com o tecido conjuntivo. Em geral, as glândulas apresentam no lúmem
substância secretora. A morfologia, histologia e ultra-estrutura das glândulas
salivares de L
1
(EVANGELISTA e LEITE, 2005) L
2
e L
3
(EVANGELISTA e LEITE,
2007) de D. hominis foram objetos de estudos sob microscopia óptica e eletrônica de
transmissão.
Os produtos de secreção e excreção de larvas de dípteros que causam
miíases têm função primordial para o seu desenvolvimento nos hospedeiros,
particularmente na nutrição e escape do sistema imune (TABOURET et al., 2001).
Em geral as proteases presentes nos produtos de secreção e excreção
são usadas para a digestão de nutrientes dentro e fora do tubo digestivo. Estas são
alvos potenciais para diagnóstico e controle, incluindo vacinas ou outros fármacos
que poderiam interromper a penetração ou desenvolvimento das larvas causadoras
de miíases (TELLAM e BOWLES, 1997).
Sobre Oestridae, apenas da espécie Oestrus ovis - cujas larvas causam
miíase nasofaringe em ovinos - foram estudadas moléculas provindas de secreção e
excreção de glândulas salivares e tubo digestivo (INNOCENTI et al., 1995;
TABOURET et al., 2001). Tais moléculas (proteínas) quando oriundas de glândulas
apresentaram maior antigenicidade em comparação com moléculas de extrato bruto
e conteúdo do tubo digestivo.
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De outros Diptera que determinam miíases biontófoga cutânea em
vertebrados, há também um artigo sobre moléculas de glândulas salivares de larvas
da espécie de Sarcophagidae Wohlfahrtia magnifica (Schiner, 1862). Foi provado
que, por teste ELISA, antígenos das glândulas induziram resposta humoral mais
específica em ovinos em comparação com antígenos de macerado: total da larva,
intestino ou cutícula. Por espécies de Caliphoridae, Lucilia cuprina (Wiedemann,
1830) e Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858), moléculas de glândulas foram
também fortemente antigênicas para ovinos (FARKAS, HORNOK, GYURKOUSZKY,
1998).
1.2. Tubo digestivo
Intestino médio
FIGURA 2. Sistema digestivo da larva de terceiro estágio de
Dermatobia hominis com 20 dias pós-infestação (EVANGELISTA e
LEITE, 2003).
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1. 2. Intestino Médio
Em larva de D. hominis, o sistema digestivo (FIG. 2) tem início na
cavidade bucal, seguido pelo intestino anterior
(ou esôfago) se limita com a cárdia
(proventriculo). Este de forma globosa, se conecta ao intestino médio, o qual se
encerra próximo da implantação dos túbulos de Malphigi, onde tem início o intestino
posterior que se finda no ânus (VIEIRA e LELLO, 1996). O sistema digestivo é
externamente banhado pela hemolinfa, revestido de tecido conjuntivo, com presença
de células adiposas e ramificações de traqueíolas.
Particularmente o intestino médio - o mais funcional dos intestinos - é
pavimentado por uma monocamada de células epiteliais, com microvilosidades para
o lúmen e posteriormente alcançam à membrana basal, seguido por tecido
conjuntivo que contem músculo, traqueíolas e uma camada espessa de matriz
extracelular.
A morfologia, histologia e ultra-estrutura do intestino médio de L
1
de D.
hominis foram estudadas sob microscopia óptica e eletrônica de transmissão
(EVANGELISTA e LEITE, 2005) e L
3
(EVANGELISTA e LEITE, 2003)
Produtos de secreção e excreção de intestino de larvas têm sido mais
estudados em Hypoderma lineatum (De Villers, 1789) – espécie causadora de
miíase cutânea em bovinos. Desta espécie foram isoladas quatro enzimas
proteolíticas, somente em L
1
denominadas hipodermina A, B, C e D (BOULARD,
1970; BOULARD e GARRONE, 1978; LECROISEY, BOULARD, KEIL, 1979).
Do ponto de vista funcional, a hipodermina A - serino protease, com 27
kDa - induz a depleção da atividade do complemento citolítico em bovinos (TONG,
IMHOFF, LECROISEY, 1981; BOULARD e BENCHARIF, 1984; BOULARD, 1989).
Quanto à hipodermina B (23 kDa), referida como uma protease semelhante à
tripsina (BOULARD, 1970; BOULARD e GARRONE, 1978; LECROISEY et al.,
1979), induz a redução da blastogêneses de leucócitos e linfócitos, assim como a
produção de interleucina-2 e prostaglandina (NICOLAS-GUALARD, MOIRE,
BOULARD, 1995).
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Como a primeira colagenase descrita em metazoário, a hipodermina C é
uma serina protease (25,2 kDa) com atividade de clivar a triplice hélice do colágeno
em uma única região (BOULARD e GARRONE, 1978; LECROISEY et al., 1979).
Em H. lineatum e H. bovis (Linnaeus, 1758), a hipodermina C (TEMEYER
e PRUETT, 1990) compartilha epitopos antigênicos, os quais podem ser detectados,
através de teste ELISA, tanto no soro como no leite de animais. Os antígenos de
hipodermina C têm sido usados em inquéritos epidemiológicos para determinar a
prevalência de hipodermatose.
Schwinghammer et al. (1988) descreveram hipodermina D, enzima que
apresenta propriedades bioquímicas e antigênicas semelhantes à hipodermina B.
Com relação a D. hominis, há apenas um estudo preliminar recente
usando macerado total de L
2
e L
3
, que revelou a presença de serina proteases
(PIRES et al., 2007). Os autores sugerem existir em L
2
e L
3
enzimas similares com
pesos moleculares: 13 e 22 kDa, além de distintas moléculas com 30 kDa (L
3
) e 50
kDa (L
2
).
Sobre outros dípteros não Oestridae, causadores de miíases biontófagas,
ex: Calliphoridae, em especial L. cuprina, parasitos dos tecidos cutâneos de ovinos e
caprinos e Chrysomya bezziana (Villeneuve, 1914) - que causa miíase cutânea em
vários mamíferos do velho mundo - moléculas de secreção e excreção de glândula
salivar e intestino têm sido estudas (MUHARSINI et al., 2000).
Kerlin e East (1992) demonstraram que extrato total de secreção e
excreção de L. cuprina tem a capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos in
vitro e a produção de anticorpos em ovelhas. Testes de diagnóstico utilizando
extrato total de secreção e excreção foi usada para a seleção de ovelhas resistentes
a infestação por L. cuprina (TELLAM e BOWLES, 1997).
Nos produtos de secreção e excreção de larvas de L. cuprina foram
também isoladas moléculas da matriz peritrófica (TELLAM et al., 2000),
particularmente uma glicoproteína denominada peritrofina 95 (antígeno oculto),
capaz de inibir o desenvolvimento das larvas. Desde então e atualmente a
peritrofina-95 é considerada um antígeno candidata à vacina (CASU et al., 1997).
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1.3. Proteoma
O termo proteoma foi cunhado em 1994 por Wilkins, usando partes das
palavras ‘proteína’ e ‘genoma’. Proteoma é o conjunto de todas as proteínas de uma
célula. A definição foi ampliada, incluindo as proteínas sintetizadas por uma célula,
tecido ou estágio de desenvolvimento (WASINGER et al.; 1995, WILKINS, et al.,
1996). A caracterização de proteomas tem sido possível pelos avanços ocorridos em
espectrometria e gel bidimensional.
A espectrometria de massa é o método de escolha para a rápida
identificação de proteínas, por ser capaz de identificar peptídeos em misturas
complexas (ASHTON, CURWEN e WILSON, 2001). A identificação é feita utilizando
as informações obtidas pela fragmentação dos peptídeos e comparação com as
informações depositadas em bancos de dados disponíveis, fazendo uso de software
específicos. No programa MASCOT (www.matrixscience.com), os resultados obtidos
são ordenados de acordo com o escore apresentado. Quanto maior o escore obtido
mais confiável é o resultado (PERKINS et al., 1999).
O ideal é comparar a proteína a ser identificada e dados do genoma da
mesma espécie. Caso ainda não existam informações do genoma da espécie de
interesse depositado, a comparação ocorrerá utilizando sequências de proteínas de
outras espécies que apresentam homologia (ASHTON, CURWEN e WILSON, 2001;
HABERMANN et al., 2004). Para D. hominis as informações depositadas no
Genbank são referentes ao DNA mitocondrial. São estudos baseados em
variabilidade genética e evolução (De AZEREDO-ESPIN e LESSINGER 2006,
NOËL, ANGERS, LAPOITE, 2005). Até o presente momento, não há informações
sobre o genoma de outros Oestridae.
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2. JUSTIFICATIVA
A dermatobiose ocorre em diversos estados brasileiros e acarreta grandes
prejuízos sócio-econômicos, ocasionados pela perda de peso e depreciação do
couro dos animais parasitados, principalmente na pecuária.
A presença de hospedeiros alternativos tanto silvestres quanto selvagens
e o elevado número de espécies de insetos, vetores dos ovos de D. hominis, tornam
o seu controle mais complexo, necessitando do uso freqüente de inseticidas.
A relevância do tema e a necessidade de informações básicas referentes
à reposta imune-humoral do hospedeiro frente à infestação por D. hominis, motivou
o presente estudo. O qual apresenta resultados que poderão fornecer subsídios
úteis para um melhor entendimento da relação do parasito-mamífero e,
consequentemente, servir de base para futuras pesquisas em prol de medidas
altenativas ao controle químico da dermatobiose.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Verificar a susceptibilidade de camundongos como hospedeiros de
Dermatobia hominis e a antigenicidade de suas larvas.
3.2. Objetivos específicos
3.2.1. Determinar a cronologia do desenvolvimento de cada estágio larvar, usando
camundongos como hospedeiros.
3.2.2. Determinar a cronologia do desenvolvimento de cada estágio larvar, usando
ratos como hospedeiros.
3.2.3. Descrever o perfil eletroforético de produtos de secreção e excreção de
larvas de D. hominis em diferentes fases de seu desenvolvimento.
3.2.4. Identificar proteínas antigênicas através de Western blot.
3.2.5.. Sequenciamento e análise de homologia dos antígenos identificados.
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4. METODOLOGIA
A manutenção do ciclo e infestação experimental de roedores com larvas de
D. hominis foram realizados no Laboratório de Entomologia Médica e Veterinária,
Departamento de Parasitologia. Os ensaios de eletroforese e Western blot foram feitos
em colaboração no Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Departamento de
Bioquímica e Imunologia.
4.1. Manutenção de insetos
Larvas de D. hominis foram colhidas de bovinos naturalmente infestados e
abatidos no frigorífico Santa Vitória - localizado no município de Contagem - Minas
Gerais, e usadas para iniciar a criação do inseto em laboratório. Logo após a coleta, as
larvas foram transferidas para frascos, contendo maravalha umedecida com água
destilada, até o transporte para o laboratório do Departamento de Parasitologia do ICB-
UFMG.
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Em laboratório, as larvas foram condicionadas em Becker de 150 ml,
contendo maravalha umedecida diariamente. Os Beckers foram tampados com tela de
nylon, presa com elástico, e mantidos em estufa incubadora B.O.D., sob temperatura de
26C e umidade relativa de 80-90%. Após 48 horas, as pupas formadas foram
removidas do fundo do Becker e parcialmente enterradas na serragem, de maneira que
os espiráculos ficassem voltados para cima. Após a emergência dos adultos, foram
separados por sexo e transferidos, em casais, para tubos de plástico, medindo 2,5 cm
de diâmetro 5,0 cm de comprimento, a fim de ocorrer à cópula. Tão logo efetivada a
cópula, as fêmeas foram colocadas em gaiolas de nylon contendo insetos foréticos
(Musca domestica Linnaeus, 1758) – uma fêmea de D. hominis para cada 10 foréticos -
capturados no campo, nos quais ocorreu a postura dos ovos de D. hominis. Os foréticos
que continham ovos foram mantidos em estufa incubadora B.O.D., sob temperatura de
26C e umidade relativa de 80-90%, durante o período de sete dias de incubação dos
ovos.
Foi necessário estimular por CO
2
, expirado por um indivíduo humano, a
eclosão das larvas. Estas recém-eclodidas foram coletadas com o auxílio de um pincel
e, posteriormente, utilizadas para infestação experimental na região dorso-
-lombar (previamente raspada) de camundongos (Mus musculus) e ratos (Rattus
norvegicus) obtidos no biotério do ICB-UFMG.
4.2. Animais infestados
Os procedimentos experimentais com roedores foram conduzidos em
concordância com o do Comitê de Ética em Experimentação (CETEA) da UFMG,
protocolo número 26/2008.
4.2.1. Infestação experimental de camundongos Swiss
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Foram utilizados 113 camundongos Swiss adultos, machos, com peso médio
de 22 g incluídos em quatro grupos. Os animais, inclusive os controles negativos, foram
mantidos no biotério, em gaiolas de plástico forradas com maravalha, e receberam
ração balanceada (Labina, Purina) e água ad libitum.
O grupo A, contendo oito camundongos, depois de infestados com uma
L
1
/animal, ficou mantido em biotério e após 25 dias foram transferidos para uma gaiola
com fundo adaptado (telado) para a emergência e recuperação das larvas vivas.
Os 66 camundongos do grupo B foram infestados com uma L
1
/animal, e
subdivido em: B1, B2, B3, constituídos por seis roedores por subgrupo; B4 e B5
composto por 24 animais/subgrupo. Houve coleta de larvas (biopsia da pele) e de
sangue (punção cardíaca) aos quatro (grupo B1), 10 (grupo B2), 15 (grupo B3), 20
(grupo B4) e 25 (grupo B5) dias pós-infestação (dpi). O sangue colhido
(aproximadamente 1 ml/animal) foi transferido para tubos de 1,5 ml e centrifugado para
obtenção de alíquotas de soro, aos quais passaram a ser acondicionados em freezer a
-20 ºC ou N
2
líquido.
O grupo C, com 36 camundongos foi subdivido em: C1, com 22
camundongos infestados com 10 L
1
/animal; C2, composto por seis camundongos
infestados com quatro L
1
/animal e C3, composto de oito camundongos infestados com
duas L
1
/animal. As larvas foram coletadas após biopsia da pele aos quatro (C1), dez
(C2) e 15 dpi (C3), repectivamente.
O grupo D, com três animais, foi usado como controle.
Para infestação, coleta de sangue e larvas, os roedores foram anestesiados,
via intraperitonial, com 1,25 ml/kg (solução de cloridrato de xilazina 23 mg/ml e
cloridrato de ketamina 50 mg/ml).
As larvas foram visualizadas em estereomicroscópio para a identificação do
estágio, de acordo com características morfológicas descritas por JOBSEN e MOURIER
(1972).
4.2.2. Infestação experimental de camundongos Balb/c
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Um grupo E, com nove camundongos Balb/c adultos, machos, com peso médio
de 22 g foram infestados com L
1
recém-emergida, depositada na região dorso-lombar
(previamente raspada). Cada roedor do grupo foi anestesiado pela via intraperitonial
com a dosagem de 1,25 ml/kg de solução de xilazina e ketamina (solução de cloridrato
de xilazina 23 mg/ml e cloridrato de ketamina 50 mg/ml). Cada animal infestado
recebeu identifição, ficou condicionado e alimentado ad libitum. Os animais infestados
foram identificados, condicionados em gaiolas plásticas e alimentados ad libitum. Após
20 dias, os camundongos Balb/c foram transferidos para uma gaiola com fundo
adaptado (telado) para a recuperação das larvas.
4.2.3. Infestação experimental de Rattus norvegicus
Foram infestados 13 ratos, linhagem Wistar, machos, com peso médio de 90
g, divididos em dois grupos. Os ratos ficaram mantidos no biotério, em gaiolas de
plástico forradas com maravalha, e receberam ração balanceada (Labina, Purina) e
água ad libitum.
O grupo A era formado por seis ratos infestados com uma L
1
e mantidos em
biotério até a emergência natural das larvas.
A infestação de cada rato do grupo B obedeceu ao seguinte critério: dois
animais com 20 L
1
, sendo as larvas coletadas aos cinco dpi; dois animais com dez L
1
,
tendo sido as larvas colhidas aos 10 dpi, e três com cinco L
1
. Estas larvas foram
coletadas, de cada roedor, aos 15, 20 e 25 dpi, respectivamente.
Durante a infestação, cada rato foi anestesiado, pela via intraperitonial, com
1,25 ml/kg (solução de cloridrato de xilazina 23 mg/ml e cloridrato de ketamina 50
mg/ml). Para a coleta de larvas nos animais, realizou-se a eutanasia com sobredose de
anestésico.
As larvas foram visualizadas no estereomicroscópio para a identificação do
estágio, tendo como base, a morfologia externa de acordo com JOBSEN e MOURIER
(1972).
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4.3. Secreção e excreção de larvas
As secreções e excreções (SE) foram obtidas de larvas colhidas pós-
-biopsia de pele de camundongos Swiss artificialmente infestados: 220 L
1
(4 dpi), 30
L
2
(10 dpi), 22 L
2
/ L
3
(15 dpi), 24 L
3
(20) e 24 L
3
25 dpi). Dos ratos artificialmente
infestados coletou-se: 40 L
1
(5 dpi), 20 L
2
(10 dpi), 5 L
2
(15 dpi), 5 L
3
(20 dpi) e 5 L
3
(25dpi). Também obtidas SE de 12 L
3
, colhidas de bovinos naturalmente infestados.
As larvas, previamente lavadas em água destilada, foram transferidas para
um tubo de polietileno com o meio de cultura RPMI 1640 (Sigma) preparado de acordo
com orientações do fabricante, contendo penicilina, estreptomicina e gentamicina, sem
soro fetal bovino. E larvas, separadas de acordo com hospedeiro e fase de
desenvolvimento, foram incubadas em estufa com atmosfera de 5% de CO
2
e
temperatura de 37ºC, durante 24 horas.
Transcorrido o tempo de incubação, as larvas foram retiradas, o volume de 4
ml/tubo centrifugado a 14.000 rpm por 3 minutos, e o sobrenadante transferido para
tubos de 1,5 ml, liofilizado overnight e ressuspenso em água deionizada. As alíquotas
foram acondicionadas e mantidas em freezer -20 °C para subsequente uso
.
4. 4. Dosagem de proteínas
As concentrações de proteínas presentes nas amostras de SE colhidas aos
4, 10, 15, 20 e 25 dpi (larvas de camundongos) e 5, 10, 15, 20 (larvas de ratos) foram
estimadas conforme método descrito por Bradford (1976). A cada poço de uma placa
de microtitulação (Nunc) ocorreu a adição de 20 µl da amostra a ser dosada e 180 µl de
reagente de Bradford [Coomassie brilliant blue R-250 0,1% (m/v) em solução aquosa
com etanol 5% (v/v) e ácido fosfórico 10% (v/v), filtrado em papel filtro número 1)]
(BioAgency). Sobre os poços foi acrescentado solução padrão contendo 0,5-2 µg de
albumina sérica bovina - fração VI (Sigma) em 20 µl de água Mili-Q. A leitura aconteceu
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em um leitor de ELISA (Elx 800, Bio-tek Instruments Inc.) com o comprimento de onda
de 595 nm, e a equação da curva padrão, calculada pelo programa estatístico Microcal
Origin V. 5.0 (Microcal Software®).
4. 5. Eletroforese em gel de poliacrilamida
A eletroforese em gel de poliacrilamida foi realizada em condições redutoras
e desnaturantes (LAEMMLI,1970).
O gel de separação foi preparado a 10% a partir de 1,7 ml de solução
estoque 29:1 acrilamida/bisacrilamida (BioAgency), 1,3 ml de tris HCl 1 M, pH 8,8 e 0,05
ml de SDS 10%, mais 2 ml de H
2
O deionizada. O gel a 3% de empacotamento foi
preparado a partir de 500 µl de solução de acrilamida, 380 µl de tris HCl 1M pH 6,8 e 30
µl de SDS 10%, além de 2,1 ml de H
2
O deionizada. A reação de polimerização, de
ambos os tipos de géis, ocorreu pela adição de persulfato de amônio e TEMED (N, N,
N’, N’-Tetramethylethylenediamine, Sigma) nas concentrações finais de 0,1% (p/v) e
0,1% (v/v), respectivamente. As SE foram diluídas em tampão (de amostra) contendo
SDS 2% e 2-mercaptoetanol a 5%, homogeneizadas e fervidas durante 5 minutos para
completar a desnaturação e redução. Estas foram aplicadas no gel de poliacrilamida,
imerso em tampão de corrida (tris/glicina 0,125 M contendo SDS 0,1%) e submetidos a
corrente continua de 80 v durante aproximadamente 80 minutos.
4.6. Coloração de gel
4.6.1. Prata
Após a eletroforese, o gel foi retirado do suporte e descartado o gel de
empacotamento. O gel de separação foi incubado em solução fixadora (solução de
metanol 50% e ácido acético 12%) pelo tempo mínimo de 30 minutos e posteriormente,
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lavado três vezes em solução de etanol 50%, sendo 20 minutos cada lavagem. Em
seguida, o gel foi incubado por 60 segundos em solução de tiosulfato de sódio (0.2 g/l)
e após lavado com H
2
O destilada.
O gel foi incubado com a solução de nitrato de prata (2 g/l) e formaldeído
(0,75 ml/l) por 20 minutos, sob agitação constante. Foram feitas 3 lavagens com água
destilada para a retirada do excesso de nitrato de prata. Para revelar a reação, utilizou-
se a solução de carbonato de sódio anidro (60 g/l) e formaldeído (0,5 ml/l). A reação foi
interrompida assim que alcançado a intensidade e o contraste desejados, descartando
a solução e lavando o gel em água destilada.
O gel foi incubado em solução fixadora por 10 minutos, sob agitação e em
seguida, transferido para solução de metanol a 50% e condicionado em geladeira a
4°C.
4.6.2. Coomassie coloidal
Após a eletroforese, o gel foi retirado do suporte e descartado o gel de
empacotamento. O gel de separação foi incubado na solução fixadora 1 [ácido fosfórico
2% (v/v), etanol 30% (v/v)] sob agitação constante por 90 minutos, e com troca da
solução a cada 30 minutos. Posteriormente, o gel foi incubado com a solução de
fixadora 2 [ácido fosfórico 2% (v/v)] por 30 minutos, e a solução substituida a cada 10
minutos. O gel permaneceu na solução fixadora 3 [ácido fosfórico 2% (v/v), etanol 18%
(v/v) sulfato de amônio 12% (p/v)], durante 30 minutos. Findo o tempo, 5ml/l de
Coomassie brilliant blue G-250 2% (m/v) em solução aquosa foi acrescida à solução
fixadora 3. Todo processo ocorreu sob agitação constante, até alcançar a intensidade
de coloração desejada.
4.7. Western blot
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O protocolo de Towbin et al. (1979) foi seguido para os ensaios: após a
corrida eletroforética das amostras, o gel SDS-PAGE a 10% (não corado) foi colocado
sobre membrana de nitrocelulose (Sigma) e submetido à corrente constante de 100 v,
durante 1 hora, à 4ºC. A membrana foi corada com Ponceau, cortada (com lâmina de
bisturil estéril) e individualizada nas canaletas. Em seguida realizado o bloqueio com
BSA 2% em PBS 0,05 M contendo Tween 20 a 0,05% à temperatura ambiente, sob
agitação constante por 1 hora.
Foram realizadas três lavagens em PBS 0,15 M contendo Tween 20 a
0,05%. As amostras de soro foram diluídas 1:50 em BSA 0,25% com solução de PBS
0,05 M contendo Tween 20 a 0,05%. Cada parte da membrana foi incubada overnight a
4°C, sob agitação, com soro controle negativo e soros teste (soro de camundongo
Swiss infestados com uma larva D. hominis, em distintas datas, isto é, dias de
infestação).
Após a incubação a membrana foi lavada (três vezes) em PBS 0,15 M
contendo Tween 20 a 0,05%. Posteriormente, as mesmas foram incubadas por 1 hora
em anticorpo anti-IgG total de camundongo conjugado à fosfatase alcalina (Sigma). A
membrana então incubada foi novamente lavada, como descrito acima, e revelada com
solução de NBT/BCIP, de acordo com especificações do fabricante. Para interromper a
coloração, as membranas foram lavadas com água destilada.
4.8. Preparação da amostra para sequenciamento em Espectrômetro de Massa
A amostra, de SE 4 dpi foi aplicada nas concentrações de 5; 7,5; 10 e 15 µg;
em gel SDS-PAGE 10% para eletroforese conduzida sob voltagem constante de 100 v.
Em seguida, o gel foi dividido ao meio, sendo uma parte corada por Coomassie coloidal
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e a outra metade usada no testes de Western blot. Após a transferência, houve
bloqueio e lavagens em PBS 0,15 M contendo Tween 20 a 0,05%. A membrana foi
incubada com soro de 25 di. Depois de revelada, ela foi sobreposta ao gel corado e as
bandas, correspondentes à região da reação, foram excisadas assim como uma banda
do padrão de 50 kDa (Fermentas) usada como controle positivo. Com a utilização de
uma lâmina de bisturi estéril, as bandas foram recortadas. Após o corte, o gel foi
transferido para um tubo de 1,5 ml e dividido em pedaços menores (1mm
3
).
Para descolaração, a banda do gel excisada foi imersa em solução de
acetonitrila (ACN) a 50% contendo bicarbonato de amônia a 25 mM, pH 8,0. Em
seguida lavado três vezes em 400 µl da solução, durante 15 minutos. O tubo contendo
a mistura foi agitado no vórtex até que os fragmentos do gel aparecessem translúcidos
e acrescentado 200 µl de ACN, por 5 minutos.
O sobrenadante presente nos tubos de 600 µl foi secado no SpeedVac de
modo a permanecer apenas o gel. Para digestão das proteínas foram adicionados 10
µl da solução de tripsina diluída em cada tubo, e incubado por 10 minutos em banho de
gelo. Em seguida, adicionou-se 20 µl de bicarbonato de amônio 50 mM e os tubos
foram transferidos para banho-maria a 37 °C onde permaneceram overnight.
Para a extração de peptídeos foi acrescido ao sobrenadante obtido, 30 µl da
solução de ácido fórmico a 5 % e ACN a 50 %, por 30 minutos, sob agitação constante
(vórtex) ao tubo que continha os fragmentos de gel. Novamente retirou-se o
sobrenadante e transferiu-o para tubos novos. A extração foi repetida 4 vezes,
combinando todos os extratos da mesma amostra em um único tubo. Estas foram
concentradas em speed vac até o volume de 10 µl.
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4. 8. 1. Espectrometria de massa
As amostras foram concentradas e desalinizadas utilizando micro colunas C
18
Zip Tip (Millipore) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. As colunas
foram lavadas em 10 µl de solução de acetonitrila a 50% (ACN), por três vezes,
desprezando o líquido ao final e 10 µl de ácido trifluoroacético 0,1% (TFA 0,1%)
também por três vezes, desprezando o líquido. Depois de equilibrada a coluna, a pipeta
foi introduzida na amostra, aspirando e desprezando o líquido dentro do mesmo tubo de
600 µl, por dez vezes. Para romper com as ligações de baixa afinidade, foi feita a
lavagem da pipeta com 10 µl de TFA 0,1%, por três vezes, com descarte do líquido ao
final do procedimento. A eluição da amostra foi feita em tubo de 600 µl contendo ACN
a 50% e TFA a 0,1%, por dez vezes.
As amostras foram aplicadas em uma placa (Anchorchip® 600), juntamente
com a matriz alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA), na concentração de 10
mg/ml em solução de ACN A 50% e TFA A 0,3%. A placa foi analisada no
Espectrômetro de Massa Autoflex III Smartbeam (Bruker Daltonics), localizado no
Núcleo de Estrutura e Função de Biomoléculas, Departamento de Bioquímica e
Imunologia, do ICB-UFMG.
As amostras foram analisadas em modo refletido e os peptídeos observados
foram fragmentados e analisados nos programas: Flex analisys 3.0 (Bruker Daltonics) e
Bio tools 3.0 (Bruker Daltonics).
4.8.3. Busca em bancos de dados e análise das amostras
As sequências de peptídeos derivadas das amostras estudadas sob análises
de massa (Ms) e massa/massa (Ms/Ms) foram confrontadas com os registros de bancos
de dados MSDB, SWISS PROT e NBCI pelo programa MASCOT
(www.matrixscience.com). As sequências obtidas foram também analisadas pelo
algoritmo blastp (protein-protein-BLAST) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
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5. Resultados
5.1. Infestação experimental
5.1.1. Camundongos Swiss
Dos animais do grupo A (sem ocorrência de mortes), 70% foram susceptíveis
a infestação. Nestes, a lesão cutânea começou a ser observada macroscopicamente a
partir do 5º dia pós-penetração da L
1
. As L
3
emergiram do hospedeiro entre 25-32 dias
e estas deram origem a pupas e adultos férteis, cujos ovos depositados pelas fêmeas
originaram larvas infestantes para outros hospedeiros (FIG. 2). Após a saída das larvas,
os camundongos, foram mantidos no biotério por mais de seis meses sem aparentes
sinais ou sintomas clínicos, à semelhança dos roedores controles.
Dos grupos infestados (B e C), sem ocorrência de morte dos hospedeiros, as
larvas de D. hominis coletadas durante a biospsia de pele, foram identificadas como: L
1
(4 dpi), L
2
(10 dpi), 50% L
2
e 50% L
3
(15 dpi), L
3
(20 dpi) e L
3
(25 dpi). As larvas
com
15 dpi preservavam externamente a cutícula de L
2
e, abaixo desta, por transparência,
era evidente a cutícula da L
3.
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5.1.2. Camundongos Balb/c
Dos 9 camundongos Balb/c (grupo E) infestados com uma L
1
, 5 animais
morreram: um no 18º di, dois no 21º di e dois pós-saída da larva (dpsl). O primeiro aos
7 dpsl e o segundo aos 60 dpsl. As larvas emergidas dos animais, entre 23 e 28 dias,
deram origem a pupas e adultos. As fêmeas acasaladas depositaram ovos férteis cujas
larvas emergidas foram infestantes para camundongos. Os quatro roedores infestados
(sobreviventes) apresentaram sinais clínicos tais como: perda progressiva de peso, pelo
FIGURA 3. Camundongo Swiss sob infestação com larva de Dermatobia hominis
em diferentes fases de desenvolvimento. (A) anestesiado durante a infestação,(B)
em detalhe no momento de penetração da larva de primeiro estágio na pele,
(C):com larva de terceiro estágio (L
3
) aos 20 dpi, (D) L
3
emergindo do hospedeiro,
(E) detalhe da L
3
emergindo, (F) L
3
emergida.
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eriçado e mucosas pálidas após emergência da larva, mesmo quando mantidos em
biotério, por até seis meses.
5.1.3. Rattus norvegicus
Em ratos, o período de parasitismo foi de 30-41 dias. As larvas de D. hominis
colhidas durante as biospia de pele dos animais infestados foram identificadas como: L
1
(4dpi), L
2
(10 e 15 dpi) e L
3
(20 e 25 dpi).
5.2. Eletroforese de secreção e excreção de larvas colhidas de camundongo
Swiss
A migração das proteínas da SE das larvas (em diferentes idades ou estágio
larvar) provindas de camundongos Swiss , ocorre em toda extensão do gel,
apresentando pesos moleculares entre 10-200 kDa, inclusive acima desta última
(FIG.3).
Na SE de L
1
(4 dpi), as proteínas tinham peso entre 10-60 kDa. Sendo as
mais evidentes de 25,4 e 30,8 kDa. Abaixo de 25 kDa foram visualizadas 4 bandas,
duas próximas a 15 kDa e duas próximas a 20 kDa. As demais proteínas apresentam
peso: uma mais de 40 kDa, duas bandas com pesos próximos a 50 kDa e a quarta de
60 kDa.
A maioria das proteínas na SE de L
2
(10 dpi) estavam dispostas entre 10-50
kDa, e uma vista próximo a 200 kDa. Abaixo de 25 kDa não foi possível distinguir com
nitidez as bandas. As proteínas mais evidentes foram de 25,4 e 30,8 kDa.
Na SE de L
2
/ L
3
(15 dpi) a maior expressão de proteínas foram assinaladas
entre 10-50 kDa, sendo as mais expressivas de 25,4 e 30,8 kDa. Não é possível
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distinguir as bandas formadas abaixo de 25 kDa. Próximo a 200 kDa é visualizada uma
banda.
A distribuição das proteínas na SE de L
3
(20 dpi) foi mais frequente entre 10-
60 kDa. Foram também visualizadas, um conjunto de bandas formadas entre 10-15
kDa, uma banda com peso próximo a 15 kDa e outra próxima a 20 kDa. As proteínas
mais marcantes foram de 25,4 e 30,8 kDa. Acima de 30,8 kDa ocorrem duas bandas de
coloração nítida. Proteínas com pesos próximos a 50 e 60 kDa são visualizadas com
coloração intensa. As demais observadas, forma um conjunto de bandas com pesos
próximos a 200 kDa.
O perifl das moléculas em SE de L
3
(25 dpi). A maioria das proteínas está
distribuídas entre 10-85 kDa, as demais estão próximo a 200 kDa e acima deste valor.
Entre 10-15 kDa é observada um conjunto de proteínas. A proteína mais intensa desta
SE apresenta peso superior a 30,8 kDa. Entre 40-60 kDa ocorre um conjunto de
bandas. Acima de 60 kDa as bandas estão mais espaçadas e nítidas.
6
0
kDa
PM 4 10 15 20 25
200 kDa
40 kDa
50 kDa
70 kDa
85 kDa
100 kDa
12
0
kDa
150 kDa
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FIGURA 4: Perfil eletroforético das amostras de secreção e excreção de larvas de
Dermatobia hominis, colhidas de camundongos Swiss colhidas aos 4 dias pós-
infestação (dpi), 10, 15, 20 e 25 dpi, em SDS-PAGE a 10% corado por prata.
5.3. Western blot
5.3. 1. Secreção e excreção de L
1
(4 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss
O reconhecimento de proteínas antigênicas presentes na amostra de SE de
L
1
(4 dpi) ou antígeno (Ag), ocorre no soro sanguíneo de camundongos Swiss a partir
do 10º di e até o 25º di (FIG.4). Esta molécula tem peso de 25,4 kDa. A proteína com
peso de 30,8 kDa foi reativa com os soros do 20º e 25º di. Outra proteína, próxima de
48 kDa, mostra reação positiva para soro do 15º, 20º e 25º di. As reações inespecíficas
observadas na membrana incubada com soro do 4º di foram sutis. As membranas
incubadas com soro negativo (controle = Ctl), com SE de L
1
e anticorpo secundário anti-
IgG de camundongo marcado, isto é, Ag +2º Ac marcado, ou com Ag sozinho não
apresentaram reações evidentes.
10
kDa
1
5 kDa
2
0
kDa
25 kDa
30 kDa
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FIGURA 5 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
1
com 4
dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º di, 15º di, 20º di, 25º di e
de animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa.
5.3. 2. Secreção e excreção de L
2
(10 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss
Reações para a proteína de 25,4 e 48 kDa ocorreu em todas as membranas,
com exceção da incubada apenas com o Ag (FIG.5). Duas proteínas com peso entre
34-48 kDa foram reconhecidas pelos soros do 20º e 25º di. O reconhecimento de uma
proteína com aproximadamente 48 kDa foi marcante no soro aos 15º, 20º e 25º di.
Também foram positivas as amostras dos 15º, 20º e 25º di com proteinas entre 48 kDa
e 117 kDa, e acima de 117 kDa.
19 kDa
26 kDa
34 kDa
48 kDa
85 kDa
117 kDa
PM
4º
di
10º
di
15º
di
20º
di
25º
di
Ctl
Ag+
2ºAc
Ag
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FIGURA 6 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
2
com 10
dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa.
19 kDa
26 kDa
34 kDa
48 kDa
85 kDa
117 kDa
PM
4º
di
10º
di
15º
di
20º
di
25º
di
ctl
Ag+
2ºAc
Ag
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5.3. 3. Secreção e excreção de L
2
/ L
3
(15 dpi) colhidas de camundongo Swiss
versus soro de camundongos Swiss
A SE das larvas de 15 dpi mostraram positividade para proteína de 25,4 e
48 kDa em todas as membranas, com exceção da incubação apenas com o Ag (FIG. 6).
Foram também reconhecidas proteínas com peso molecular entre 34-48 kDa, além de
proteínas entre 85- 117 kDa nos soros do 15º, 20º e 25º di.
FIGURA 7 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
2
/L
3
com
15 dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa.
19 kDa
26 kDa
34 kDa
48 kDa
85 kDa
PM
4º
di
10º
di
15º
di
20º
di
25º
di
Ctl Ag
Ag+
2ºAc
117 kDa
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5.3. 4. Secreção e excreção de L
3
(20 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss
As proteínas reativas de SE de larvas com 20 dpi ocorreram para os soros do
15º, 20º e 25º di (Fig. 7): uma proteína com peso entre 34 e 48 kDa e outra acima de 48
kDa e uma proteína acima de 117 kDa. A membrana incubada apenas com Ag
apresentou reação negativa.
FIGURA 8 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
3
com 20
dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa.
PM
4º
di
10º
di
15º
di
20º
di
25º
di
ctl Ag +
2ºAc
Ag
19 kDa
26 kDa
34 kDa
48 kDa
85 kDa
117 kDa
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5.3. 5. Secreção e excreção de L
3
(25 dpi) colhidas de camundongo Swiss versus
soro de camundongos Swiss
Nos ensaios com SE de L
3
(25 dpi) foram assinalados resultados positivos
em todas as canaletas para as proteínas de 25,4 kDa e entre 34-48kDa, exceto para a
membrana incubada apenas com Ag (FIG. 8). Uma proteína com 30,8 kDa apresentou-
se reativa com maior intensidade na membrana incubada com soro do 20º di. São
também observadas reações para as proteínas com peso próximo de 85 kDa nas
membranas incubadas com os soros do 4º, 10º, 15º, 20º e 25º di. Além destas
proteínas, foram visualizadas reações para proteínas com 117 kDa e acima deste
tamanho pelos soros do 20º e 25º di.
FIGURA 9 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
3
com 25
dias pós-infestação proveniente de camundongo Swiss versus pool de soros de
camundongos Swiss colhido no 4º dia de infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de
animais controle. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada canaleta. Padrão
molecular em kDa.
19 kDa
26 kDa
34 kDa
48 kDa
85 kDa
117 kDa
PM 4º
di
10º
di
15º
di
20º
di
25º
di
ctl
Ag
Ag+
2ºAc
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5.3.6. Secreção e excreção de larvas colhidas em rato (5, 10, 15, 20 e 25 dpi)
versus soro de camundongos Swiss
Na SE de L
1
(5 dpi), de L
2
(10 e 15 dpi) e L
3
(20 dpi) foram reconhecidas as
proteínas de 25,4 kDa e 30,8 kDa (FIG. 9). A mesma reação foi visualizada na SE de L
2
(10 e 15 dpi) e L
3
(20 dpi).
Na SE de L
2
(10 dpi) foram também reconhecidas duas proteínas com peso
próximo a 48 kDa e três acima de 117 kDa. A SE de L
2
(15 dpi) foi positiva para duas
proteínas com peso próximo a 48 kDa. Adicionalmente, as proteínas de 25,4-30,8 kDa
foram reconhecidas pela SE de L
3
(20 dpi), além de três outras entre 34-48 kDa e uma
com aproximadamente 117 kDa.
Não foi observada reação positiva na membrana incubada com o soro ctl.
FIGURA 10 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção (SE) de larvas
colhidas em rato com 5 dias pós-infestação (dpi), 10, 15 e 20 dpi versus pool de soro no
26 kDa
34 kDa
48 kDa
85 kDa
117 kDa
19 kDa
PM
5
dpi
10
dpi
15
dpi
20
dpi
ctl
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25º dia de infestação (di) proveniente de camundongos Swiss . O soro controle foi
incubado com SE de larva com 25 dpi. Foram aplicados 20 µg de proteína em cada
canaleta. Padrão molecular em kDa.
5.3.7. Secreção e excreção de L
3
colhidas de bovino versus soro de
camundongos Swiss
A SE L
3
proveniente de bovinos reconheceu uma proteína com 25,4 kDa pelo
pool de soro do 10º, 15º, 20º, 25º di (FIG. 10). A coloração mais intensa foi marcante no
25º di. Além desta, uma proteína com 30,8 kDa é reativa para o soro do 20º di. As
reações inespecíficas observadas são sutis ou quase inexistentes.
Não foram observadas reações nas membranas incubadas com soro ctl,
apenas Ag ou Ag + 2º Ac marcado.
FIGURA 11 - Western blot utilizando como antígeno secreção e excreção de L
3
proveniente bovinos versus pool de soros de camundongos Swiss , colhido no 4º dia de
19 kDa
26 kDa
34 kDa
48 kDa
85 kDa
117 kDa
4 º
di
10º
di
15º
di
20º
di
25º
di
ctl Ag
PM
Ag+
2ºAc
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infestação (di), 10º, 15º, 20º e 25º di e de animais controle. Foram aplicados 20 µg de
proteína em cada canaleta. Padrão molecular em kDa.
5.3.8 MALDI-TOF
As duas proteínas mais evidentes de 25,4 e 30 kDa de L
1
(4 dpi) da amostra
de SE, proveniente de camundongo Swiss , juntamente com uma proteína controle de
50 kDa (padrão molecular) estão indicadas no gel SDS-PAGE a 10% (FIG. 11).
O segmento das duas moléculas de SE de L
1
(Fig. 12 e 13), tendo como
base de homologia os registros dos bancos de dados (NBCI e MSDB) permitiu
identificar a proteína de 30,8 kDa como albumina bovina, enquanto que a proteína de
25,4 kDa não apresentou escore significativo.
O escore da proteína de 30,8 kDa foi de 136 (MSDB), com a probabilidade
de significância de p< 0,05, indicando identidade ou extensa homologia com os dados
dos bancos (QUADRO 1).
A homologia da proteína albumina bovina, no banco de dados do NBCI
apresentou escore (bits) de 1243 e E-value 0.0 (FIG. 11) quando alinhada com outras
sequências do banco de dados utilizando o programa Blast. A sobreposição dos
peptídeos da proteína de 30,8 kDa com a sequência da proteína depositada no banco
de dados foi de 6% (FIG. 12).
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FIGURA 12 - (A) Gel SDS-PAGE a 10% com perfil eletroforético de secreção (SE) e
excreção de L
1
com 4 dias pós-infestação nas concentrações 5; 7,5; 10 e 15 µg ,
corado por Coomassie Coloidal. (B) Western blot utilizando como antígeno SE com 4
dpi nas concentrações 5; 7, 5; 10 e 15 µg versus pool de soros colhidos no 25º dia de
infestação. Padrão molecular em kDa.
FIGURA 13. Análise de homologia em banco de dados. Sequência analisada pelo
algoritmo “protein-protein-Blast” da PubMed www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
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FIGURA 14 - Sequência de aminoácidos da albumina bovina depositada em banco de
dados (PubMed www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Em vermelho sequência de peptídeos
da proteína de 30, 8 kDa identificada em sobreposição a sequência da albumina bovina.
Quadro1
Identificação das proteínas de secreção e excreção de L
1
de Dermatobia hominis
colhida aos 4 dpi de camundongos Swiss
Banda
excisada
Nome
Espécie
escore
Nº de acesso
no NBCI
25,4 kDa
30,8 kDa
50 kDa
Não identificada
Albumina bovina
Aspartato quinase
-----------
Bos taurus
Escherichia coli
<53
136
564
------------
AAI02743
KIECD3
As proteínas listadas foram identificadas com a probabilidade de significância de p< 0,05
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6. Discussão
O uso universal de roedores como modelo experimental de enfermidades
têm contribuído para decisivos avanços científicos (SUCKOW, WEISBROTH,
FRANKLIN, 2006). Este contexto foi determinante para o presente estudo experimental,
o que também se configura como um modelo susceptível e de baixo custo. A
característica única entre os Oestridae de exercer parasitismo em múltiplos hospedeiros
(de diferentes ordens) praticado por larvas de D. hominis, não poupou, em natureza, até
espécies de pequenos roedores. Provavelmente, este fato tivera início desde o
Paleoceno, há 60 milhões de anos atrás, período que registra a presença do inseto na
América como fóssil (TOWNSEND, 1942), e que corresponde ao surgimento de
roedores primitivos (ZUMPT, 1957), e, também de outros mamíferos pré-históricos de
bovídeos, equídeos, primatas e marsupiais (KOWALSKI, 1981).
Um dos primeiros ensaios experimentais tendo camundongo como
hospedeiro de larvas de D. hominis, foi reportado por Jobsen e Mourier (1972). Nele, os
autores apenas mencionam o período de pré-patência (25-35 dias), o qual é
semelhante ao agora descrito em camundongos das linhagens Swiss ou Balb/c.
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Estudos em vertebrados têm suportado a hipótese que animais inbred
podem ser mais susceptíveis a parasitos e patogenos (KELLER e WALLER, 2002), fato
verificado em nossos experimentos utilizando camundongos Balb/c, mesmo infestado
com uma larva de D hominis. A morte de 50% dos animais infestados e os marcantes
sinais clínicos (perda de peso, pelo eriçado e mucosas pálidas), mesmo após
emergência da larva, contrasta com a não mortalidade e oligosinais clínicos dos animais
Swiss outbred, incluindo os subgrupos que receberam múltiplas larvas.
São recentes e escassos os estudos sobre moléculas de larvas de D.
hominis sob eletroforese. O uso de extrato total (macerado) de L
2
e L
3
de D. hominis em
SDS-PAGE a 15% (sem imagens ilustrativas) foram referidas oito frações protéicas
(citando apenas o peso molecular da menor delas) entre 60-97 kDa (FERNANDES et
al., 2007). Não obstante, somente a proteína identificada, de 60 kDa, tem analogia com
os resultados desta dissertação, para L
1
e L
2
. Quanto as outras proteínas, não é
possível induzir comparação. A partir de sobrenadante de macerado total de larvas de
D. hominis - em SDS-PAGE a 12% corado por prata - foram reveladas proteínas entre
14-94 kDa em L
2
e 21-63 kDa em L
3
(PIRES et al, 2007), as quais poderão ser similares
às expressas em SE tanto em L
2
como em L
3
do presente estudo, distribuídas entre 10-
20 kDa.
Sendo considerada a intensidade de coloração das bandas das moléculas,
entre 10-200 kDa (nesta dissertação), como concentração de proteínas, as mais
intensas, de 25,4 e 30,8 kDa, ocorrem nos SE de 4, 10, 15 e 20 dpi, embora ausentes
no SE de 25 dpi. Este fato poderá estar relacionado com a fase final de parasitismo da
L
3
no hospedeiro, isto é, a larva estava prestes a emergir e sofrer metamorfose para
pupa. Deve-se corroborar com esta previsão o distinto perfil protéico da SE aos 25 dpi
em comparado com as demais idades estudadas.
Um marcante parâmetro de similaridade das bandas de proteínas ocorreu
entre as SE aos 10 e 15 dpi. Esta última idade continha larvas típicas de L
2
e de L
2
em
metamorfose para L
3
. Neste período de muda, que corresponde a repouso alimentar, as
SE expelidas provavelmente contêm produtos ainda provindos da fase de L
2
.
A comparação entre o perfil de migração de SE de larvas de D. hominis aos
4, 10, 15, 20 e 25 dpi, provavelmente indica haver estágio específico, sugerindo
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diferenças na composição do metabolismo da larva e propriedades antigênicas como foi
observado para larvas de L
2
e L
3
de Gasterophilus intestinalis – causadora de miíase
intestinal de equidios (ROELFSTRA et al., 2009).
Nos ensaios utilizando Western blot, envolvendo tanto larvas como soro
provindos de camundongos, a primeira proteína de L
1
, de 25,4 kDa, foi reconhecida
pelo soro de 10º di; seguida pela proteína de 30,8 kDa e uma outra com
aproximadamente 48 kDa. Os aparentes reativos backgrounds no soro ctl+Ag+2° Ac e
na banda Ag+2° Ac foi de difícil superação, pois no inicio da infestação, aos 4 dias, os
camundongos provavelmente não teriam ainda produzido IgG anti-SE da L
1
.
Intensidades de coloração mais reativa, em função da idade da larva, ocorreram
progressivamente com SE de L
2
(10 dpi); L
2
/L
3
(15 dpi); L
3
(20 e 25 dpi) versus soro
ctl+Ag+2° Ac ou Ag + 2° Ac, sugerindo que, a associação das idades das larvas e das
infestações, poderia induzir a presença de imunoglobulinas ou fragmentos destas nas
SE, provindas no alimento ingerido pelas larvas durante o parasitismo nos
camundongos. Em contraste, nos testes utilizando SE de larvas provenientes de ratos
versus soro de camundongo, ocorreu resultados negativos na membrana contendo soro
Ctl. Este resultado é confirmado quando SE de L
3
de bovinos foi usado, inclusive para
nos testes de Ag+2° Ac. Eisemann et al. (1993) demonstraram a presença de
anticorpos de ovinos em diferentes partes do intestino e hemolinfa de L
2
e L
3
de L.
cuprina que parasitavam tais hospedeiros, os que tinham sido previamente imunizados
com mioglobinas de eqüino. Em larvas cultivadas in vitro, meio de cultura acrescida de
soro de ovelhas, os resultados foram semelhantes. IgG de bovinos parasitados com L
1
de H. lineatum - cujo estágio larvar migra durante seis meses dentro do hospedeiro - foi
identificada como Ac na luz do intestino médio da larva do referido Oestridae
(COLWELL e LEGGETT, 2004). Em adição, é pertinente ressaltar que produtos de SE
de parasitos têm sido envolvidos na relação dele com o hospedeiro, tanto a partir do
momento de contato como de penetração e sobrevivência, usando de estratégias de
evasão (clivagem de IgG), subversão (imunossupressão através de H
2
O
2
agindo sobre
linfócitos T) e defesa (lançando superóxido transmutase para detoxicar O
2
produzido
por eosinófilos e neutrófilos) contra o sistema imune do hospedeiro (JEFFERIES et al.,
2001).
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É provável que as reações observadas no controle negativo e nas amostras
incubadas, apenas com anti-IgG de camundongo e SE colhidas aos 10, 15 , 20 e 25 dpi
de larvas que se desenvolveram em camundongos, estariam ocorrendo entre o 2º Ac e
imunoglobulinas ou fragmentos destas presentes nas SE.
Como resultado, observamos reação contra uma proteína 25,4 kDa para
pool de soro colhido no 10º, 15º, 20º e 25º di de camundongos. O soro do 20º di foi o
único que reconheceu uma proteína de 30,8 kDa. Não são observadas reações na
membrana incubada com soro controle ou com 2º Ac, demonstrando que estas
proteínas antigênicas são provavelmente oriundas dos produtos de SE das larvas de D.
hominis. O perfil de resposta obtido com a L
3
de bovino foi semelhante à reposta que
ocorre aos 25 dpi (L
3
). Neste último as reações inespecíficas relatadas para 10, 15 e 20
dpi permaneceram as mesmas.
Com relação à identidade proteômica aqui apresentada, envolvendo duas
proteínas que mais expressivas em larvas de D. hominis (exceto em SE de L
3
, 25 dpi),
apenas a de 30,8 kDa apresentou escore de significância de 136 analisado no
MASCOT e homologia com albumina bovina. Moléculas do parasito semelhantes à
albumina do hospedeiro já foram encontradas em parasitos: adultos de Dirofilaria
immitis (KADIPASAOGLU e BILGE, 1989); adultos e microfilárias de Dracundulus
medinensis (BLOCH et al., 1999); adultos, microfilárias e larva infectante (L
3
) de
Wuchereria bancroft (PEIXOTO et al., 1999; SILVA et al., 2006); adultos e
esquitossomulos de Schistosoma mansoni (SAYAD et al., 2006; WILLIAMS et al.,
2006) e, recentemente, albumina bovina identificada em SE de L
2
e L
3
de G.
intestinalis (ROELFSTRA, et al., 2009) e no helminto Fasciola hepatica (MORPHEW, et
al., 2007). É prudente ressaltar, que os resultados pertinentes a S. mansoni (acima
referidos) foram contestados por DeMarco et al., (2007) quando provaram,
experimentalmente, ser originária de hamster (não do próprio S. mansoni) a albumina
encontrada no Trematoda, sendo os registros dos então autores provavelmente
decorrentes de contaminação. No entanto, DeMarco et al (2007) não foram capazes de
explicar a presença da albumina do hospedeiro presente dentro dos ovos de S.
mansoni.
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Quanto a proteína de 25,4 kDa não foi possível fazer sua identificação por
ter apresentado baixo escore. Como alternativa, foi feito o sequeciamento de novo e
obtido 5 aminoácidos quantia insuficiente para análise comparativa de alinhamento com
sequências de peptídeos já depositados no NBCI. Também não está excluída a
possibilidade de que a molécula de 25,4 kDa seja elucidada em ensaios futuros sobre
proteoma de D. hominis.
7. Conclusão
A exposição de dados retrospectivos e inovadores revelados nos estudos
preliminares desta Dissertação de Mestrado permitiu sumariamente inferir:
8.1. O camundongo Swiss é um modelo experimental adequado para infestações por
D. hominis, pois suporta a infestação com uma a três larvas. Em contraste, os
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camundongos Balb/c apresentam alta mortalidade o que desencoraja o seu uso em
ensaios paralelos.
8.2. O perfil eletroforético das proteínas da SE das larvas mostrou ser estágio
específico.
8.3. Os testes de Western blot com SE de larvas e soro, ambos coletados de
camundongos Swiss (hosdepeiro homólogo), revelaram marcante positividade, as
reações inespecíficas observadas só foram efetivamente comprovadas quando os
resultados negativos ocorrem nos ensaios com SE de larvas coletadas de hospedeiros
heterólogos (ratos e bovinos).
8.4. De ocorrência inusitada, a identidade da proteína de 30,8 kDa com a sequência de
peptídeos similar ao da albumina bovina é um regitro já verificado em outros parasitos
(não de bovinos).
8.5. As informações sobre o sequênciamente da proteína de 25,4 kDa não foram
suficientes para a sua nominção em analogia com os bancos de dados disponíveis.
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