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Universidade Federal de Juiz de Fora
Instituto de Ciências Exatas
Departamento de Química
Mellina Damasceno Rachid Santos
“Desenvolvimento de método
cromatográfico (HPLC-UV) para a
determinação de ácidos fenólicos extraídos
por ultra-som de forrageiras tropicais”
Dissertação apresentada ao
departamento de Química da
Universidade Federal de Juiz de
Fora como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do
título de Mestre em Química
Orientadora: Profa. Dra. Maria Auxiliadora Costa Matos
Co-orientador: Dr. Jailton da Costa Carneiro
Juiz de Fora
2009
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2
Dedico aos meus pais,
Dedico aos meus pais, Dedico aos meus pais,
Dedico aos meus pais,
ao Luiz Mário e a todos
ao Luiz Mário e a todos ao Luiz Mário e a todos
ao Luiz Mário e a todos
que me incentivaram.
que me incentivaram.que me incentivaram.
que me incentivaram.
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3
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Prof. Dra. Maria Auxiliadora, por ter me dado essa grande
oportunidade de trabalhar e aprender com ela. Agradeço pela amizade,
incentivo, paciência e atenção, além dos conselhos que valerão para minha
vida profissional e pessoal.
Ao Prof. Dr. Renato Camargo
Matos, sempre disposto a ajudar e com o qual
também aprendi muito, agradeço pelas boas conversas, atenção e apoio.
Ao meu co-orientador, Dr. Jailton da Costa Carneiro, pela atenção e
colaboração no desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores do Departamento de Química pelos ensinamentos,
contribuindo para a minha formação profissional.
Aos funcionários Fernando, Serginho, Mariângela, Gedair, Simone e Alice.
À Aline pela amizade, companhia e colaboração em algumas etapas deste
trabalho. Aos amigos Vanézia, Luís e Pollyana que também estavam sempre
dispostos a me ajudar, pelas discussões proveitosas e pelas conversas
descontraídas. Da mesma forma, agradeço também ao Rafael, Michele, Diego,
Adriana, Fernando, Rômulo e João.
Aos amigos Vivi e Rogério pelo carinho, conselhos e boas conversas.
Aos meus pais, Tomé e Marília, por acreditarem na minha capacidade, pelo
amor incondicional, paciência e apoio. Ao Luiz Mário, pelo amor, cumplicidade,
incentivo e compreensão.
Aos demais amigos e colegas que estiveram ao meu lado durante essa
caminhada e que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento deste
trabalho.
À Fapemig e PROPESQ/UFJF pelo apoio financeiro.
4
RESUMO
O desempenho dos bovinos em regime de pastejo pode ser melhorado com o
aumento da digestibilidade da forrageira. Os ácidos p-cumárico e ferúlico estão
associados aos componentes da parede celular através de ligações éster ou
éter, podendo influenciar negativamente na digestibilidade das forrageiras. O
presente trabalho propõe uma metodologia de extração com ultra-som e
separação por HPLC dos ácidos ferúlico, p-cumárico, m-cumárico, o-cumárico,
cafeico e ácido chiquímico, e a quantificação dos ácidos ferúlico e p-cumárico
éster ligados em forrageiras tropicais. A metodologia de análise foi
desenvolvida em um cromatógrafo líquido de alta eficiência com detecção
absorciométrica no UV e coluna de fase reversa C-18. Composição e pH da
fase móvel, programação dos comprimentos de onda de detecção foram
parâmetros estudados na otimização do método. No estudo da composição da
fase móvel, foram testados diferentes solventes orgânicos e soluções aquosas
em diferentes valores de pH, onde a melhor condição foi obtida com eluição
isocrática usando como fase móvel acetonitrila/metanol/solução aquosa H
3
PO
4
pH 2,05 (13:12,5:74,5). A fim de se diminuir o tempo do processo de tratamento
das amostras, foi estudada a extração empregando o ultra-som, que se mostrou
um processo mais rápido e reprodutível se comparado com a extração em banho
ultratermostático. Foi feita a avaliação do método aplicando padronização
externa e padronização interna. A padronização interna usando o ácido m-
cumárico como padrão surrogate e o ácido o-cumárico como padrão interno,
produziu bons resultados, dentre eles limites de detecção de 0,09 e 0,04 mg/L
para os ácidos p-cumárico e ferúlico, respectivamente, e valores de
recuperação que variaram de 83 a 99 %. Sendo assim, a metodologia
implementada foi aplicada a análise de 43 amostras de forrageiras, fornecidas
pela Embrapa Gado de Leite, de quatro espécies: Cynodon nlemfuenses cv.
Florona, Cynodon dactylon cv. Florakirk, Panicum maximum cv. Mombaça e
Brachiaria brizantha cv. Marandu. Foram analisadas as frações caule e folha,
cujas faixas de valores encontrados foram de 3,63 a 9,04 mg/g peso seco para
o ácido p-cumárico e 3,35 a 7,69 mg/g peso seco para o ácido ferúlico.
Palavras-chave: Forrageiras. Ácidos fenólicos. Ultra-som. HPLC.
ABSTRACT
Livestock performance can be improved by increasing the digestibility of forage.
The p-coumaric acid and ferulic acid are associated with the components of the
cell wall by linking ester or ether, which can negatively influence the digestibility
of forage. This paper proposes a method for ultrasound based extraction and
separation by HPLC for ferulic acid, p-coumaric acid, m-coumaric acid, o-
coumaric acid, caffeic acid and shikimic acid, and quantification of ferulic acid
and p-coumaric acid ester linked to cell wall in samples of tropical forages. The
method of analysis was optimized in a high performance liquid chromatography
with UV-VIS detector MWD and a reverse-phase column C-18. Composition
and pH of the mobile phase and wavelengths of detection were parameters
studied in the optimization of the method. In the study of the composition of
mobile phase were tested various organic solvents and aqueous solutions at
different pH values, where the best condition was obtained with isocratic elution
using as mobile phase acetonitrile / methanol /H
3
PO
4
pH 2.05 (13:12 , 5:74,5).
In order to reduce the time in the processing of samples, the extraction was
studied using the ultrasound, where it proved to be a more rapid and
reproducible compared to the bath with programmed temperature. Was the
assessment of method applying external calibration and internal calibration. As
the internal calibration using the o-coumaric acid as internal standard and the
m-coumaric acid as surrogate standard showed good results, including
detection limits of 0.09 and 0.04 mg / L for p-coumaric acid and ferulic acid,
respectively, and the recovery values ranging from 83 to 99%, we chose to
quantify the samples using this method. Thus, the optimized methodology was
applied to 43 samples of forage (supplied by Embrapa Gado de Leite) of four
species: Cynodon nlemfuensis cv. Florona, Cynodon dactylon cv. Florakirk,
Panicum maximum cv. Mombaça and Brachiaria brizantha cv. Marandu. We
analyzed stem and leaves of these samples, the range of values found was
from 3.63 to 9.04 mg / g dry weight for the p-coumaric acid and 3.35 to 7.69 mg
/ g dry weight to ferulic acid.
KEYWORDS: Forage. Phenolic acids. Ultrasound. HPLC.
6
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1.1 Esquema de formação dos álcoois precursores da lignina
adaptado de Soest (1994) por Santana et al. (2006)..............
17
FIGURA 1.2 Estruturas dos ácidos fenólicos estudados.............................
19
FIGURA 2.1 Esquema do preparo das soluções trabalho para o teste de
estabilidade das soluções padrão. FM*: ACN / MeOH /
solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5)..................................
30
FIGURA 2.2 Esquema de representação da extração branda em banho
ultratermostático dos ácidos fenólicos....................................
32
FIGURA 3.1 Gráficos da influencia do pH no tr, na área e na simetria dos
ácidos eluídos com FM composta por solução de ácido ou
tampão e MeOH......................................................................
42
FIGURA 3.2 Aplicação do método de desenvolvimento triangular para a
separação dos quatro ácidos. Cromatogramas da mistura
padrão dos ácidos 10,00 mg/L. Coluna de fase reversa C18
ZORBAX ODS (150,0 mm x 4,6 mm, 5 µm); coluna de
guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6 mm, 5 µm), fluxo de
1mL/min, detecção em 236nm e em diferentes FM................
44
FIGURA 3.3 Cromatograma da mistura padrão dos seis ácidos na
concentração de 20,00 mg/L. Coluna de fase reversa C18
ZORBAX ODS (150,0 mm x 4,6 mm, 5 µm); coluna de
guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6 mm, 5 µm); FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); fluxo:
1mL/min; pressão de trabalho 110 bar...................................
45
FIGURA 3.4 Cromatogramas da mistura padrão dos seis ácidos na
concentração de 20,00 mg/L. A - Sobreposição dos sinais
registrados em 236nm e 316nm. B - Cromatograma obtido
após a leitura com programação de comprimento de onda.
Coluna de fase reversa C18 ZORBAX ODS (150,0 mm x 4,6
mm, 5 µm); coluna de guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x
4,6 mm, 5 µm); FM: ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05
(13:12,5:74,5);Fluxo: 1mL/min................................................
47
7
FIGURA 3.5 Cromatogramas do teste de estabilidade das soluções
padrões. A: solução A; B: solução B; C: solução C; D:
solução D; E: solução E; F: solução F. FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); Fluxo:
1mL/min..................................................................................
50
FIGURA 3.6 Cromatogramas da mistura padrão dos seis ácidos na
concentração de 6,00 mg/L diluida em fase móvel na data
da injeção, solução intermediaria diluída em fase móvel e
solução estoque diluída em metanol. Coluna de fase
reversa C18 ZORBAX ODS (150,0 mm x 4,6 mm, 5 µm);
coluna de guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6 mm, 5
µm); FM: ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05
(13:12,5:74,5); Fluxo: 1mL/min..............................................
51
FIGURA 3.7 Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos ferúlico e p-
cumárico obtidas da extração em ultra-som de 25,0 mg de
Mombaça folha........................................................................
52
FIGURA 3.8 Gráficos do fator de resposta dos ácidos chiquímico,
cafeico, ferúlico, p-cumárico, m-cumárico e o-cumárico por
padronização externa..............................................................
54
FIGURA 3.9 Curvas analíticas por padronização externa obtidas para a
injeção em triplicata da mistura padrão dos ácidos
chiquímico, cafeico, p-cumárico, ferúlico, m-cumárico e o-
cumárico nas concentrações 0,00; 3,00; 6,00; 10,00; 15,00
e 20,00 mg/L...........................................................................
56
FIGURA 3.10 Cromatograma obtido para amostra Mombaça folha
fortificada com os ácidos chiquímico (5,00 mg/L), cafeico
(2,00 mg/L), m-cumárico (3,70 mg/L) e o-cumárico (3,00
mg/L) para estabelecimento do LD e LQ. FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); Fluxo:
1mL/min. ................................................................................
58
FIGURA 3.11 Cromatogramas da réplica 1 da amostra Cynodon. FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5), fluxo:
1mL/min, detecção: a) 236nm, b) 286nm, c) 316nm. ............
59
8
FIGURA 3.12 Cromatogramas dos resultados da recuperação da extração
no banho: a) branco; b) branco fortificado com 10,00 mg/L
de cada ácido; c) amostra Cynodon; d) amostra Cynodon
fortificada com 10,00 mg/L de cada ácido. FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5), fluxo:
1mL/min............................................................................................
60
FIGURA 3.13 Curvas das médias de concentração obtida para cada nível
de fortificação de cada ácido no ultra-som versus no banho..
62
FIGURA 3.14 Gráfico com os percentuais de recuperação obtidos para a
amostra, amostra fortificada e branco fortificado utilizando
padrões interno e surrogate....................................................
64
FIGURA 3.15 Esquema de representação para a extração das amostras
de forrageiras em ultra-som para a quantificação dos ácidos
fenólicos por padronização interna.........................................
65
FIGURA 3.16 Gráficos de fator de resposta dos ácidos chiquímico,
cafeico, ferúlico e p-cumárico por padronização interna.........
67
FIGURA 3.17 Curvas analíticas por padronização interna obtidas para a
injeção em triplicata da mistura padrão dos ácidos
chiquímico, cafeico, p-cumárico e ferúlico nas
concentrações 0,00; 3,00; 6,00; 10,00; 15,00 e 20,00 mg/L...
68
FIGURA 3.18 Gráfico com os percentuais de recuperação obtidos para a
amostra, amostra fortificada e branco fortificado utilizando
padronização interna e externa...............................................
72
FIGURA 3.19 Concentrações dos ácidos p-cumárico e ferúlico
encontradas nas amostras Brachiaria brizantha cv.
Marandu, Cynodon nlemfuenses cv. Florona e Panicum
maximum cv. Mombaça..........................................................
76
9
LISTA DE TABELAS
TABELA 1.1 Ácidos fenólicos de ocorrência natural (adaptada de
Robbins, 2003).................................................................
18
TABELA 1.2 Tratamento dado a diferentes amostras para
quantificação de ácidos fenólicos por HPLC.....................
24
TABELA 2.1 Classificação das amostras de forrageira analisadas....... 40
TABELA 3.1 Valores de λ de leitura do detector programados em
função do tempo de análise...............................................
46
TABELA 3.2 Condição otimizada para análise no HPLC....................... 47
TABELA 3.3 Parâmetros de separação obtidos para mistura padrão
dos seis ácidos (20,0 mg/L)...............................................
48
TABELA 3.4 Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos p-cumárico
e ferúlico para a amostra Mombaça folha extraída em
banho a 20
o
C por 24h e em ultra-som a temperatura
ambiente por 2h.................................................................
53
TABELA 3.5 Limites de detecção e quantificação do método e
repetitividade obtidos para uma massa da amostra
Mombaça folha de 25,0 mg (n = 6)....................................
57
TABELA 3.6 Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos p-cumárico
e ferúlico na amostra Cynodon (25,0 mg) em diferentes
comprimentos de onda......................................................
58
TABELA 3.7 Comparação entre o percentual de recuperação (DPR)
alcançado ao fortificar 25,0 mg da amostra Cynodon
com mistura padrão dos ácidos em 3 níveis de
fortificação (5,00 , 7,50 e 10,00 mg/L)...............................
61
TABELA 3.8 Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos p-cumárico,
ferúlico e recuperação do padrão surrogate para a
amostra Cynodon extraída em ultra-som por 120
minutos, calculadas por padronização interna..................
63
TABELA 3.9 Limites de detecção e quantificação do método e
repetitividade obtidos com padronização externa e
padronização interna.........................................................
69
10
TABELA 3.10
Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos ferúlico e p-
cumárico e recuperação do padrão surrogate obtidos na
análise da amostra Brachiaria brizantha cv. Marandu em
diferentes dias...................................................................
69
TABELA 3.11
Percentuais médios de recuperação e desvios padrãoes
relativos alcançados para a amostra e branco fortificados
com mistura padrão dos ácidos em 3 níveis de
fortificação (5,0 , 7,5 e 10,0 mg/L) e adicionados de
padrão surrogate na concentração final de 10,0 mg/L......
71
TABELA 3.12
Concentrações e intervalo de confiança (α = 0,05),
expressos em mg/g peso seco, dos ácidos ferúlico e p-
cumárico, recuperação do padrão surrogate e
digestibilidade encontrados na repetição 1 (R1) das
amostras Cynodon nlemfuenses cv. Florona , Cynodon
dactylon cv. Florakirk, Panicum maximum cv. Mombaça
e Brachiaria brizantha cv. Marandu...................................
74
TABELA 3.13
Concentrações e intervalo de confiança (α = 0,05),
expressos em mg/g peso seco, dos ácidos ferúlico e p-
cumárico, recuperação do padrão surrogate e
digestibilidade encontrados na repetição 2 (R2) das
amostras Cynodon nlemfuenses cv. Florona , Cynodon
dactylon cv. Florakirk, Panicum maximum cv. Mombaça
e Brachiaria brizantha cv. Marandu...................................
75
TABELA 3.14
Comparação dos níveis de concentração dos ácidos p-
cumárico e ferúlico obtidos em diferentes espécies de
forrageiras..........................................................................
81
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACN Acetonitrila
ASTM American Socity for Testing Materials
Ca Concentração adicionada na amostra
CAF Ácido cafeico
Cal Calibração
CE Eletroforese Capilar
CHI Ácido chiquímico
Cm Concentração medida na amostra
cv. Cultivar
DPR Desvio padrão relativo percentual
FDA Fibras de detergente ácido
FDN Fibras de detergente neutro
FER Ácido ferúlico
FM Fase móvel
GC-MS Cromatografia a gás com espectrômetro de massa
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência
irr. Irrigação
LD Limite de detecção do método
LQ Limite de quantificação do método
M mol/L
m-CUM Ácido m-cumárico
MeOH Metanol
MIX 6 Mistura padrão contendo os 6 ácidos diluídos em metanol ou
acetonitrila, obtendo-se a concentração final de 10 mg/L
MS Espectrômetro de massa
MWD Detector UV-VIS de múltiplos comprimentos de ondas
o-CUM Ácido o-cumárico
p-CUM Ácido p-cumárico
PI Padrão interno
PS Padrão surrogate
PTFE Teflon
12
r Coeficiente de Pearson
R1 Repetição das amostras 1
R2 Repetição das amostras 2
rpm Rotações por minuto
RPS Recuperação percentual do padrão surrogate
T Temperatura
THF Tetraidrofurano
tr Tempo de retenção
tr
r
Tempo de retenção relativo
UPLC Cromatografia líquida de ultra eficiência
US Ultra-som
UV Ultra violeta.
W
1/2
Largura do pico à meia altura
150N Adubação com 150kg/ha de Nitrogênio
300N Adubação com 300kg/ha de Nitrogênio
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................
................................
16
1.1 ÁCIDOS FENÓLICOS................................................................
................................
18
1.2 LIGNINA E DIGESTIBILIDADE................................
................................
20
1.3 DESCRIÇÃO DAS ESPÉCIES SELECIONADAS PARA ESTUDOS
...........................
21
1.4 TÉCNICAS EMPREGADAS NA DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS
FENÓLICOS ................................................................
................................
22
1.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DOS ÁCIDOS FENÓLICOS
................................
24
1.5.1 APLICAÇÃO DO ULTRA-SOM NA EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS
...........................
25
1.6 OBJETIVOS................................................................
................................
26
1.6.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:................................................................
.........................
26
2 MATERIAL E MÉTODO................................................................
...............................
27
2.1 REAGENTES................................................................
................................
27
2.2 OTIMIZAÇÃO DA ANÁLISE POR HPLC................................
................................
27
2.2.1 ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL................................
........................
27
2.2.1.1 ESTUDO DO pH DA FASE MÓVEL ................................
................................
28
2.2.1.2 ESTUDO DA PROPORÇÃO DO SOLVENTE NA COMPOSIÇÃO
DA FASE MÓVEL................................................................
................................
28
2.2.2 ESTUDO DA ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES PADRÃO
................................
29
2.3 ESTUDO DA EXTRAÇÃO DA AMOSTRA ................................
................................
30
BANHO ULTRATERMOSTÁTICO ................................
................................
31
BANHO ULTRASSÔNICO ................................................................
...........................
31
2.4 AVALIAÇÃO DO MÉTODO ................................................................
........................
33
2.4.1 PADRONIZAÇÃO EXTERNA ................................................................
......................
33
2.4.1.1 ESTUDO DA RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO ................................
......................
33
2.4.1.2 CURVAS ANALÍTICAS................................................................
................................
33
2.4.1.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO E
REPETITIVIDADE................................................................
................................
34
2.4.1.4 SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA OS ÁCIDOS P-CUMÁRICO
E FERÚLICO ................................................................
................................
34
2.4.1.5 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
..........................
35
2.5 PADRONIZAÇÃO INTERNA ................................................................
.......................
35
14
2.5.1 ESTUDOS PARA ESTABELECER O PADRÃO INTERNO E O
PADRÃO SURROGATE................................................................
................................
36
2.5.2 AVALIAÇÃO DO MÉTODO APLICANDO PADRONIZAÇÃO
INTERNA ................................................................................................
......................
37
2.5.2.1 RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO ................................
................................
37
2.5.2.2 CURVAS ANALÍTICAS................................................................
................................
37
2.5.2.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO,
REPETITIVIDADE E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
................................
38
2.5.2.4 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
..........................
38
2.6 AMOSTRAS DE FORRAGEIRAS................................
................................
39
2.6.1 CLASSIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS................................
................................
39
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................
................................
41
3.1 ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL................................
........................
41
3.1.1 ESTUDO DO pH DA FASE MÓVEL ................................
................................
41
3.1.2 ESTUDO DA PROPORÇÃO DO SOLVENTE NA COMPOSIÇÃO
DA FASE MÓVEL................................................................
................................
43
3.1.3 PROGRAMAÇÃO DOS COMPRIMENTOS DE ONDA PARA
DETECÇÃO................................................................
................................
45
3.1.4 CONDIÇÃO OTIMIZADA PARA ANÁLISE NO CROMATÓGRAFO
LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA................................
................................
47
3.2 ESTUDO DA ESTABILIDADE DOS PADRÕES................................
..........................
49
3.3 EXTRAÇÃO DA AMOSTRA ................................................................
........................
52
3.4 AVALIAÇÃO DO MÉTODO APLICANDO PADRONIZAÇÃO
EXTERNA ................................................................
................................
53
3.4.1 RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO ................................
................................
53
3.4.2 CURVAS ANALÍTICAS................................................................
................................
55
3.4.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO E
REPETITIVIDADE................................................................
................................
57
3.4.4 SELETIVIDADE................................................................
................................
58
3.4.5 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
..........................
59
3.5 PADRONIZAÇÃO INTERNA ................................................................
.......................
62
3.5.1 ESTUDOS PARA ESTABELECER O PADRÃO INTERNO E O
PADRÃO SURROGATE................................................................
................................
62
15
3.5.2 AVALIAÇÃO DO MÉTODO APLICANDO PADRONIZAÇÃO
INTERNA ................................................................................................
......................
66
3.5.2.1 RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO ................................
................................
66
3.5.2.2 CURVAS ANALÍTICAS................................................................
................................
67
3.5.2.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO,
REPETITIVIDADE E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
................................
68
3.5.2.4 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
..........................
70
3.6 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS P-CUMÁRICO E FERÚLICO NAS
AMOSTRAS DE FORRAGEIRAS................................
................................
72
3.6.1 ANÁLISE DAS AMOSTRAS ................................................................
........................
77
3.6.1.1 BRACHIARIA BRIZANTHA CV. MARANDU................................
................................
77
3.6.1.2 CYNODON NLEMFUENSE CV FLORONA ................................
................................
78
3.6.1.3 PANICUM MAXIMUM CV. MOMBAÇA ................................
................................
78
3.6.1.4 CYNODON DACTYLON CV. FLORAKIRK................................
................................
79
3.6.2 CONSIDERAÇÕES ................................................................
................................
80
3.6.3 COMPARAÇÃO COM OUTROS ESTUDOS................................
................................
80
4 CONCLUSÃO................................................................
................................
83
5 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS ................................
...........................
84
6 REFERÊNCIAS ................................................................
................................
85
16
1 INTRODUÇÃO
Do ponto de vista qualitativo, algumas características químico-
bromatológicas inerentes às forrageiras tropicais, tais como as elevadas
concentrações de lignina e de parede celular, comprometem o valor nutritivo da
forragem e também contribuem para o baixo desempenho dos bovinos em
regime de pastejo. Para uma melhor caracterização das forrageiras, são
necessárias avaliações que permitam conhecimento detalhado da composição
química de plantas forrageiras.
A parede celular das forrageiras é composta principalmente por celulose,
mas pode estar impregnada com lignina. Segundo Boudet (2000), de uma
maneira geral, nas plantas a lignina é o segundo componente em abundância
depois da celulose e contém cerca de 30% do carbono orgânico na biomassa
vegetal. Estudos mostram que a lignina é o principal fator limitante na
degradação da parede celular pelo rumem, devido ao fato de estar associada
aos carboidratos estruturais, como por exemplo celulose e hemicelulose, da
parede celular [2, 3].
A lignina é um polímero formado por três álcoois, p-coumaril, coniferil e
sinapil, que se interligam numa malha complexa, resistente à hidrólise ácida e
alcalina e a vários complexos enzimáticos, inclusive as enzimas microbianas e
tissulares do trato gastrintestinal dos animais superiores. À medida que as
plantas forrageiras amadurecem, maior é a concentração da lignina, bem como
maior é seu efeito deletério sobre a utilização da parede celular por parte do
rúmen [4]. A lignina tem como funções fortalecer a parede celular e facilitar o
transporte de água, além disso, ela impede a degradação dos polissacarídeos
da parede celular, deste modo, atua como a principal linha de defesa contra
doenças, insetos e outros herbívoros [5].
A lignificação é um processo bioquímico que abrange a biossíntese dos
álcoois p-coumaril, coniferil e sinapil, seu transporte e a polimerização na
parede celular. A FIGURA 1.1 representa o esquema, adaptado de Soest
(1994) por Santana et al. [6], de formação destes álcoois precursores da
lignina.
17
FIGURA 1.1: Esquema de formação dos álcoois precursores da lignina
adaptado de Soest (1994) por Santana et al. (2006).
A definição de lignina pode variar de acordo com o enfoque do trabalho,
devido à grande variedade de maneiras de tratamento para seu isolamento.
Alguns autores trabalham com os conceitos de lignina “core” e lignina “non
core”. A lignina “core”, também conhecida como lignina Klason ou lignina em
detergente ácido, refere-se ao polímero de fenilpropanóide depositado na
parede celular pela polimerização dos álcoois precursores coniferil, sinapil e p-
coumaril, e é determinada rotineiramente nas análises laboratoriais através do
método da lignina insolúvel em ácido sulfúrico 72% [4].
A lignina “non core” consiste de compostos fenólicos de baixo peso
molecular, liberados da parede celular por hidrólise, e está representada por
ácidos p-hidroxicinâmico éster-ligados, dentre eles os ácidos p-cumárico e
ferúlico (e seus dímeros) [7].
Alguns estudos sugerem a existência de alguma correlação negativa
entre esses dois tipos de lignina e o teor de fibras e digestibilidade [2, 3, 8-15].
18
1.1 ÁCIDOS FENÓLICOS
De uma maneira geral, os ácidos fenólicos são fenóis que possuem uma
função ácido carboxílico. No entanto quando se referem aos metabólitos de
plantas, representam um grupo definido de ácidos orgânicos de ocorrência
natural. Dentro dessa classe estão os ácidos hidroxicinâmicos (Xa) e
hidroxibenzóico (Xb), que apresentam o mesmo esqueleto, variando o número
e a posição do grupo hidroxila, e ainda inclui alguns aldeídos análogos (Xc),
como por exemplo a vanilina. Na TABELA 1.1 são mostrados alguns ácidos
fenólicos de ocorrência natural e suas respectivas estruturas [16].
TABELA 1.1: Ácidos fenólicos de ocorrência natural (adaptada de Robbins,
2003).
Estrutura base
Substituinte na posição X
Grupos substituintes Nome do composto
R
2
R
3
R
4
R
5
X
H H H H a Ácido cinâmico
-OH H H H a Ácido o-cumárico
H H -OH H a Ácido p-cumárico
H -OH H H a Ácido m-cumárico
H
-OCH
3
-OH H a Ácido ferúlico
H
-OCH
3
-OH
-OCH
3
a Ácido sinápico
H -OH -OH H a Ácido cafeico
H H H H b Ácido benzóico
-OH H H H b Ácido salicílico
H H -OH H b Ácido p-hidroxibenzóico
H
-OCH
3
-OH H b Ácido vanílico
H
-OCH
3
-OH
-OCH
3
b Ácido siríngico
-OH H H -OH b Ácido gentisico
-OH -OH -OH -OH b Ácido gálico
H
-OCH
3
-OCH
3
H b Ácido veratrico
H
-OCH
3
-OH
-OCH
3
c Siringaldeído
H
-OCH
3
-OH H c Vanilina
Os ácidos fenólicos podem apresentar várias atividades biológicas,
dentre elas antioxidante, antiinflamatória , anticarcinogênica, antibacteriana e
fungicida [17-21]. Eles acumulam-se em várias partes da planta e não
19
apresentam uma distribuição homogênea nos tecidos vegetais. A maior parte
encontra-se associada a componentes estruturais, outros na forma de
flavonóides e uma minoria como ácidos livres [16,22]. Além disto, os estágios
de maturação das plantas influenciam na concentração destes ácidos.
Quanto à associação aos componentes estruturais, eles podem estar
ligados à lignina “core”, aos polissacarídeos ou a ambos simultaneamente
[9,23].
A FIGURA 1.2 mostra a estrutura dos ácidos fenólicos estudados no
presente trabalho, sendo os ácidos p-cumárico e ferúlico os principais ácidos
fenólicos presentes em plantas, onde estes estão associados aos componentes
da parede celular através de ligações éster ou éter. O ácido p-cumárico, em
sua grande maioria está associado à lignina “core”. O ácido ferúlico pode
formar uma ligação cruzada entre a lignina “core” e a hemicelulose,
encontrando-se éter-ligado à lignina e éster-ligado à hemicelulose [9,23,4].
Essa ligação, de acordo com Sun et al. [23] tem influencia sobre o crescimento
da parede celular, suas propriedades mecânicas e biodegradabilidade.
Ácido ferúlico
Ácido p-cumárico
Ácido cafeico
Ácido m-cumárico
Ácido o-cumárico
FIGURA 1.2: Estruturas dos ácidos fenólicos estudados.
20
1.2 LIGNINA E DIGESTIBILIDADE
As primeiras observações de correlação negativa entre o conteúdo de
lignina e a digestibilidade das forrageiras foram realizadas no início do século
XX [25]. A partir de então, os estudos se concentraram, principalmente, no
efeito da lignina “core” sobre a digestibilidade de forrageiras. A partir da década
de 70, iniciaram-se os trabalhos com a lignina “non-core” e sua influência na
digestibilidade [8].
Embora as gramíneas apresentem menores teores de lignina “core” que
as leguminosas, as correlações negativas entre a lignina e a digestibilidade são
mais significativas em gramíneas. A explicação pode estar na maior
concentração de hemicelulose encontrada em gramíneas. Como a lignina se
liga covalentemente à hemicelulose, seu efeito seria mais prejudicial para a
digestibilidade das gramíneas que das leguminosas [4]. Outra possibilidade
reside nas diferenças em composição monomérica da lignina entre gramíneas
e leguminosas.
Jung [9] sugeriu que não somente a quantidade, mas também a
composição da lignina “core” pode influenciar na digestibilidade da fibra.
Apesar desta sugestão, Grabber et al. [26] demonstraram que ligninas com
diferentes proporções das unidades guaiacil, siringil e p-hidroxifenil influenciam
a digestibilidade da parede celular de maneira semelhante, sugerindo que a
composição da lignina não altera significativamente as interações entre a
lignina e outros componentes da parede celular.
Os ácidos fenólicos (lignina “non core”) presentes na parede celular das
forrageiras mereceram maior atenção por parte dos pesquisadores a partir dos
estudos de Hartley [8], que demonstrou que dos ácidos presentes, a
concentração de ácido p-cumárico é a que apresenta maior efeito negativo
sobre a digestibilidade das forrageiras.
O mesmo foi verificado por Komprda et al. [10], que quantificou os
ácidos ferúlico e p-cumárico em diferentes estágios vegetativos da Medicago
sativa. Os autores encontraram correlações negativas entre a concentração de
ácido p-cumárico ligado à parede celular e o teor de fibras de detergente neutro
(FDN) e de detergente ácido (FDA), mas para o ácido ferúlico as correlações
21
não foram significativas. Por outro lado, Casler & Jung [15] encontraram uma
correlação negativa entre a concentração de ácido ferúlico e a digestibilidade
em gramíneas.
A influencia da natureza e a concentração dos ácidos fenólicos, na
digestão da parede celular vegetal por ruminantes também foi demonstrada por
Brito et al. [13]. Neste estudo, a concentração e proporção de ácidos p-
cumárico e ferúlico sugerem diferença de digestibilidade e ao tipo de
condensação da lignina presente nos tecidos vegetais. Tais compostos
apresentaram maior relação com digestibilidade da matéria seca.
1.3 DESCRIÇÃO DAS ESPÉCIES SELECIONADAS PARA ESTUDOS
Os sistemas de pastejo para produção de leite baseiam-se
principalmente na utilização de gramíneas forrageiras tropicais, as quais
possuem elevados potenciais produtivos e bons valores nutritivos. O capim-
elefante (Pennisetum purpureum Schum), juntamente com gramíneas dos
gêneros Brachiaria, Cynodon e Panicum, têm sido as forrageiras mais
utilizadas nestes sistemas [27-32].
O interesse dos pecuaristas pelo gênero Cynodon vem aumentando
ultimamente para compor sistemas de pastejo rotacionado. As gramíneas
pertencentes a este gênero possuem algumas características forrageiras
desejáveis como boa cobertura do solo, crescimento rápido, elevada produção
de matéria seca por área, adaptação ao clima tropical, favorável relação
folha/caule e alto valor nutritivo. As cultivares da espécie Cynodon dactylon ou
grama bermuda mais conhecidas são: Coast-cross 1, Tifton 78, Florakirk e
Tifton 85. Entre as cultivares da espécie Cynodon nlemfuenses ou grama
estrela mais conhecidas destacam-se: Florico, Florona e Africana. A grama
estrela e as gramas bermudas desenvolvem melhor durante a estação quente,
enquanto que a Florico, Florona e Tifton-85, continuam a desenvolver em dias
curtos e frios, desde que tenham condições adequadas de fertilidade e
umidade [33].
A espécie Panicum maximum tem sido utilizada há muito tempo no
Brasil, especialmente em locais com solos de boa fertilidade. Espécie de alto
potencial de produção, boa adaptação a uma grande faixa de climas, conta
22
com várias cultivares, dentre elas o Colonião, Tobiatã, Tanzânia, Vencedor,
Mombaça e Centenário, sendo que muitas ainda não são suficientemente
conhecidas em sua fisiologia [30].
Dentre as forrageiras cultivadas, as gramíneas do gênero Brachiaria são
as mais usadas no Brasil e são largamente utilizadas em pastagens na
América Tropical. Informações citadas por Macedo (1995) indicam que cerca
de 40 milhões de hectares (85% da área dos cerrados com pastagem) são
cobertas por pastagens de Brachiaria formando extensos monocultivos,
especialmente no Brasil Central e Amazônia. É uma forrageira que requer, em
média, precipitação anual de 1000 mm e solos bem drenados, possuindo boa
adaptabilidade em solos de baixa fertilidade natural, tolerando a acidez do solo
[35].
1.4 TÉCNICAS EMPREGADAS NA DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS
FENÓLICOS
Um método bastante empregado na quantificação total de ácidos
fenólicos é o método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu. Neste método, o
reagente Folin-Ciocalteu é adicionado em meio básico, formando um complexo
azul, cuja absorbância é medida em 760nm e a concentração total é dada em
função do ácido gálico. Porém, através deste método não é possível a
identificação individual dos ácidos presentes na amostra [16,19].
Na identificação e quantificação destes ácidos em diferentes matrizes
são empregadas técnicas como eletroforese capilar (CE) com detecção
eletroquímica [36] e detecção fotométrica no UV [37-39]; biossensores [40],
cromatografia a gás com espectrômetro de massa (GC-MS)
[14,17,19,24,41,42]; cromatografia líquida de ultra eficiência (UPLC) com
detecção UV [43] e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com
detectores MS [18,44,45], UV-Vis [11,12,20,42,43,46-55] e eletroquímico
[48,56]. Onde GC e HPLC são as técnicas mais difundidas.
A vantagem da análise destes compostos por HPLC em relação a
cromatografia a gás é que no primeiro não há a necessidade de derivação
química dos analitos [45,57]. Porém o emprego de detectores com
23
espectrômetros de massa melhora a identificação dos componentes presentes
nas amostras.
Poucos trabalhos são encontrados na literatura aplicando HPLC na
quantificação de ácidos fenólicos em forrageiras. Jung & Shalita-Jones [46]
quantificaram por HPLC os ácidos ferúlico e p-cumárico em três amostras de
forrageiras (Medicago sativa, Bromus inermis e Panicum uirgatum) a fim de
avaliar diferentes condições de extração. Jung [12] aplicou a mesma
metodologia de separação para quantificar os ácidos ferúlico e p-cumárico éter
e éster-ligados em amostras de milho (Zea mays l.)
Casler & Jung [15] aplicaram a metodologia de separação proposta por
Jung & Shalita-Jones [46] para quantificar os ácidos ferúlico e p-cumárico em
amostras de Bromus inermis Leyss, Dactylis glomerata L. e Phalaris
arundinacea L., com o objetivo de determinar correlações entre lignina Klason,
ácidos fenólicos e fibra de detergente neutro e ainda verificar sua influencia na
digestibilidade dessas três espécies de forrageiras.
Também com o intuito de verificar correlações entre concentrações dos
ácidos fenólicos e componentes químico-bromatológicos de seis espécies de
forrageiras cultivadas em Portugal (Festuca rubra L., Holcus mollis L, Holcus
lanatus L., Agrostis setacea Curtis, Lolium perenne L. e Bromus inermis Leyss),
Rodrigues e colaboradores [55] aplicou a separação por HPLC com eluição por
gradiente para determinar as concentrações dos ácidos ferúlico e p-cumárico.
Já Komprda et al. [10], utilizando da mesma técnica, quantificou os
ácidos ferúlico e p-cumárico em amostras de Medicago sativa, L. em diferentes
estágios de maturação e no líquido ruminal em diferentes tempos de
incubação.
No Brasil, Deschamps & Ramos [11] e Brito et al. [13] quantificaram por
HPLC os ácidos ferúlico e p-cumárico em amostras cultivadas no estado de
Santa Catarina. Deschamps & Ramos [11] otimizaram uma metodologia de
separação para sete ácidos fenólicos e a aplicou em amostras de bagaço de
cana, de capim-elefante cv. Empasc-307-Testo (acesso IJ-7136) e de
mandioca cv. Pernambucana. Brito et al. [13], através da mesma metodologia
analítica quantificou os mesmos ácidos em amostras de Brachiaria brizantha e
Brachiaria humidicola.
24
1.5 MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DOS ÁCIDOS FENÓLICOS
Certas amostras requerem algum tipo de tratamento para eliminar
possíveis interferentes ou no caso de plantas, para liberar os ácidos que
possam estar ligados a algum componente da parede celular. Dentre os
métodos de extração estão a extração com solventes orgânicos, hidrólise
alcalina e hidrólise ácida, onde esta última libera somente parte dos compostos
ligados à parede celular [10]. Na TABELA 1.2 são mostrados exemplos de
tratamento dado a alguns tipos de matrizes para a quantificação dos ácidos
fenólicos por HPLC.
TABELA 1.2: Tratamento dado a diferentes amostras para quantificação de
ácidos fenólicos por HPLC.
MATRIZ Tratamento dado à amostra Referência
Vegetais Hidrólise ácida [45]
Cereais
Extração com metanol/água
(50:50)
[53]
Cereais
Hidrólise alcalina
(Extração severa e branda)
[23]
Hidrólise alcalina
(Extração severa e branda)
[12]
Forrageiras
Hidrólise alcalina
(Extração branda)
[11]
Vinho
Filtro de membrana PTFE 0,20µm
[50]
Azeite de Oliva Extração com metanol/água (80:20) [49]
A hidrólise alcalina é o principal tipo de extração aplicado a amostras de
forrageira na quantificação de ácidos fenólicos. Essa extração permite
quantificar os ácidos fenólicos totais, os éster ligados e os éter ligados
separadamente, devido ao fato de se poder realizar dois tipos de hidrólise, que
são os seguintes [11,23]:
Extração branda: a amostra é tratada com uma solução de NaOH
1M, a 20°C por 24 h, que quebra somente as ligações éster.
25
Extração severa: a amostra é tratada com uma solução de NaOH
4 M a 170°C por 2 h, que quebra tanto as ligações éster quanto as ligações
éter.
Sendo assim, a extração severa permite a quantificação dos ácidos
fenólicos totais, e a diferença entre a concentração de ácidos fenólicos totais e
a concentração de ácidos fenólicos éster ligados, fornece a concentração de
ácidos fenólicos éter ligados.
1.5.1 APLICAÇÃO DO ULTRA-SOM NA EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS
A irradiação de ultra-som em soluções aquosas induz o fenômeno de
cavitação acústica no meio líquido, que se trata da formação, crescimento e
implosão de bolhas de gás. A energia liberada durante a cavitação acústica
fornece excelentes perspectivas para o preparo e tratamento de amostras e
para descontaminação de efluentes, devido às modificações físicas e químicas
resultantes deste processo, o que tem impulsionado novas estratégias de
preparo de amostras. Em sistemas heterogêneos, o tratamento é favorecido
devido a fenômenos de emulsão nas interfaces de sistemas líquido-líquido,
lixiviação na superfície em sistemas sólido-líquido, erosão, fragmentação e
aumento da área superficial de partículas sólidas em decorrência das ondas de
choque originadas da implosão das micro-bolhas, e a diminuição do gradiente
de concentração pelo aumento do transporte de massas ocasionado pela
turbulência e micro-jatos [58-60].
Recentemente, tem-se aplicado o ultra-som como uma alternativa de
métodos tradicionais de extração, devido à simplicidade de operação,
diminuição no tempo de extração, condições mais seguras para o analista, uma
vez que os métodos possibilitam a operação à pressão e temperatura
ambientes, além da redução do uso de ácidos e oxidantes, o que também
minimiza as perdas de elementos voláteis e gera menos resíduos a serem
descartados [60-62].
Há um grande número de estudos aplicando o banho ultrassônico no
tratamento de amostras de solos e sedimentos [63-67], biológicas [68-70],
alimentícias [71-73] e de óleos derivados de petróleo [74, 75]. Porém, no que
26
diz respeito a amostras de forrageiras, nenhum trabalho foi encontrado na
literatura aplicando esse tipo de extração na quantificação de ácidos fenólicos.
1.6 OBJETIVOS
Otimização e aplicação da metodologia analítica por HPLC para
determinação dos ácidos fenólicos precursores da lignina, ácido ferúlico e ácido
p-cumárico e isômeros, em amostras de forrageiras tropicais utilizadas na
alimentação de ruminantes.
1.6.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Otimização dos parâmetros de separação e determinação simultânea
dos ácidos fenólicos por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção
no UV.
2. Otimização das etapas de tratamento e extração das amostras de
forrageiras aplicando banho ultratermostático.
3. Desenvolvimento de uma metodologia para extração dos ácidos p-
cumárico e ferúlico em amostras de forrageiras por tratamento alcalino brando
e banho ultrassônico.
4. Comparação dos métodos de extração por banho ultratermostático e
ultra-som.
5. Avaliação da aplicação dos ácidos m-cumárico e o-cumárico como
padrão interno e padrão surrogate.
6. Aplicação da metodologia proposta para quantificação dos ácidos p-
cumárico e ferúlico em quatro espécies de forrageiras (folha e caule).
27
2 MATERIAL E MÉTODO
2.1 REAGENTES
Nas análises e no preparo dos padrões e amostras foram utilizados
reagentes (ácido fosfórico 85%, ácido acético glacial e fosfato monobásico de
potássio) e solventes grau HPLC (Tedia Company Inc., USA). Os padrões de
ácido ferúlico, cafeico, chiquímico, p-cumárico, o-cumárico e m-cumárico foram
adquiridos da Sigma-Aldrich. Demais reagentes (fosfato monobásico de sódio,
acetato de sódio, hidróxido de sódio, ácido clorídrico) foram adquiridos da
Vetec. No preparo de soluções foi utilizada água destilada e deionizada
produzida em um ultrapurificador (Milli-Q – Quantum Ex).
2.2 OTIMIZAÇÃO DA ANÁLISE POR HPLC
A metodologia de análise foi desenvolvida em um cromatógrafo líquido
de alta eficiência (HPLC Agilent 1100 Series), equipado com o software Agilent
Chemistation LC Systems, empregando uma coluna de fase reversa C18
ZORBAX ODS (4,6 mm x 150,0 mm, 5 µm), coluna de guarda ZORBAX ODS
(4,6 mm x 12,5 mm, 5 µm), injetor manual com alça de amostragem de 20 µL e
detector fotométrico na região do UV-VIS de múltiplos comprimentos de ondas
(MWD).
A identificação dos compostos foi baseada nos respectivos tempos de
retenção obtidos para injeção de padrões externos dos ácidos estudados, bem
como a comparação dos sinais obtidos em diferentes comprimentos de onda.
2.2.1 ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL
Os estudos foram baseados nos trabalhos descritos por: Komprda et al.
[10]; Deschamps & Ramos [11]; Jung [12]; Sun et. al. [23].
28
Durante o desenvolvimento da metodologia, foram avaliados alguns
parâmetros cromatográficos, dentre eles: tempo de retenção (tr), fator de
simetria
1
, resolução, sensibilidade e tempo de análise.
Os testes iniciais envolveram a otimização da separação dos ácidos
chiquímico (CHI), cafeico (CAF), p-cumárico (p-CUM) e ferúlico (FER)
empregando uma fase móvel (FM) composta por um ou mais solventes
orgânicos e por uma solução de ácido ou tampão. Para tanto, foram testados
diferentes solventes orgânicos (metanol, acetonitrila, tetraidrofurano) e
soluções de ácidos e soluções tampão em diferentes valores de pH (soluções
de ácido fosfórico, ácido acético, tampão acetato e tampão fosfato).
2.2.1.1 ESTUDO DO pH DA FASE MÓVEL
A fim de se definir o pH da fase móvel (FM), testou-se as seguintes
soluções e valores de pH:
soluções de ácido fosfórico pH=2,05 e 2,20.
solução de ácido acético pH=3,00.
tampão fosfato pH=2,05; 2,15; 2,50 e 3,00.
tampão acetato pH=3,50; 4,00 e 4,55.
Para cada valor de pH foram testadas condições de separação por
eluição isocrática e por gradiente com cada um dos solventes orgânicos:
metanol, acetonitrila e tetraidrofurano. Assim, para cada sistema, realizou-se
um gradiente exploratório, e a partir deste foram selecionadas as condições
iniciais para a otimização da separação isocrática.
2.2.1.2 ESTUDO DA PROPORÇÃO DO SOLVENTE NA COMPOSIÇÃO DA
FASE MÓVEL
Para definir a proporção do solvente na fase móvel foi aplicado o
diagrama triangular para a separação dos ácidos. Esse método é geralmente
1
O fator de simetria dos picos calculado conforme (AGILENT, 2001) e leva em consideração a
altura do pico, a altura dos pontos de inflexão e 4 valores de áreas parciais dois antes e dois
após o ápice do pico. Este cálculo envolve diversas expressões e foi obtido pelo software
Agilent Chemistation usado para aquisição dos dados durante as análises.
29
aplicado na otimização da separação de compostos utilizando uma fase móvel
composta por solução aquosa de ácido e dois ou três solventes orgânicos. O
desenvolvimento desse diagrama envolveu as seguintes etapas [77]:
1. Otimização da separação utilizando a FM composta por acetonitrila e
solução aquosa de ácido fosfórico pH=2,05.
2. Otimização da separação utilizando a FM composta por metanol e
solução aquosa de ácido fosfórico pH=2,05.
3. Otimização da separação utilizando a FM composta por
tetraidrofurano e solução aquosa de ácido fosfórico pH=2,05.
4. A otimização da separação com uma mistura de dois dos três
solventes numa proporção de 1:1.
5. A separação com uma mistura 1:1:1 dos três solventes.
Após definir a melhor condição de separação para os ácidos chiquímico,
cafeico, p-cumárico e ferúlico, foram incluídos os ácidos m-cumárico e o-
cumárico, ajustando a proporção da fase móvel para se obter a separação
destes seis ácidos.
Otimizada a condição de separação, partiu-se para a programação do
detector de múltiplos comprimentos de onda na região do UV, dessa forma foi
possível obter melhoria da sensibilidade de detecção dos compostos
estudados, sendo um método mais eficiente que a leitura em apenas um único
comprimento de onda.
2.2.2 ESTUDO DA ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES PADRÃO
Foram preparadas soluções estoque 1000,0 mg/L de cada padrão de
ácido em metanol e estocadas a 4
o
C. No dia da análise, partindo das soluções
estoque, preparou-se uma solução intermediária contendo os seis ácidos na
concentração de 100,0 mg/L e, a partir desta, preparou-se as soluções trabalho
nas concentrações desejadas para a análise no HPLC.
A fim de se saber por quanto tempo as soluções poderiam ser estocadas
a 4
o
C e qual o solvente mais apropriado para a diluição das soluções estoque,
intermediária e de trabalho, foi realizado um estudo da estabilidade dos analitos
nestas soluções.
30
Desta forma, foram preparadas as soluções estoques 1000,0 mg/L de
cada padrão de ácido em metanol (MeOH) e acetonitrila (ACN), e a partir
destas, preparou-se as soluções conforme mostrado no esquema da FIGURA
2.1, onde MIX 6 é uma solução padrão mistura composta pelos seis ácidos.
FIGURA 2.1: Esquema do preparo das soluções trabalho para o teste de
estabilidade das soluções padrão.
*FM: ACN / MeOH / solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5).
As soluções A, B, C, D, E e F foram preparadas e injetadas no HPLC no
dia do preparo e em seguida foram estocadas com as soluções estoques a
4
o
C. Novas soluções C e F foram preparadas a partir das soluções estoques
armazenadas por 1, 7 e 17 dias, respectivamente. Essas soluções foram
analisadas no HPLC no dia do preparo, juntamente com as soluções C e F
preparadas no primeiro dia.
2.3 ESTUDO DA EXTRAÇÃO DA AMOSTRA
Nesta etapa foram estudadas duas técnicas para extração das amostras:
ultra-som e banho ultratermostático. O procedimento adotado foi selecionado
com base no tempo de análise e eficiência da extração obtida através da
recuperação de amostras fortificadas pelas duas técnicas e que será abordado
no item 2.4.1.5.
A F D
C B E
Solução intermediária
100,0 mg/L em
MeOH
Solução intermediária
100,0 mg/L
em FM*
Solução estoque
1000,0
mg/L em MeOH
MIX 6
6,0 mg/L
em MeOH
MIX 6
6,0 mg/L
em FM*
MIX 6
6,0 mg/L
em FM*
Solução intermediária
100,0 mg/L
em ACN
Solução intermediária
100,0 mg/L
em FM*
Solução estoque
1000,0
mg/L em
ACN
MIX 6
6,0 mg/L
em ACN
MIX 6
6,0 mg/L
em FM*
MIX 6
6,0 mg/L
em FM*
A F D C B E
31
BANHO ULTRATERMOSTÁTICO
O principal método de extração aplicado na quantificação dos ácidos
fenólicos éster ligados à parede celular é a extração branda. A metodologia
empregada para extração das amostras por esta técnica (FIGURA 2.2) foi
baseada nos procedimentos descritos por Deschamps & Ramos [11]. A
amostra Mombaça folha (25,0 mg) foi tratada com uma solução de NaOH 1M, a
20°C por 24 h em banho ultratermostático Cientec, modelo CT282.
BANHO ULTRASSÔNICO
A fim de se propor um método alternativo e mais rápido de extração, foi
realizado um estudo para extração em ultra-som, substituindo o banho (20°C
por 24 h). Neste estudo foi utilizado um banho ultrassônico Unique, modelo
USC2850, com dois cristais piezelétricos, operando a freqüência de 25 kHz e
potência de 120 W. As amostras foram posicionadas acima dos cristais
piezelétricos e em seguida foi colocada água suficiente para cobrir 2/3 dos
tubos, de forma que o volume de amostra dentro destes ficasse submerso.
Desta forma a amostra Mombaça folha (25,0 mg) foi extraída a
temperatura ambiente com uma solução de NaOH 1M em diferentes tempos de
sonicação: 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 e 300 min. Este estudo
foi realizado em triplicata e os resultados obtidos foram comparados com os da
extração usual, estabelecendo-se o tempo ideal para a sonicação das amostras
(FIGURA 2.2).
32
FIGURA 2.2: Esquema de representação da extração branda em banho
ultratermostático dos ácidos fenólicos.
25,0 mg
AMOSTRA
NaOH 1 M
Filtro de fibra de vidro
*Banho ultratermostático
T = 20°
°°
°C por 24 h
HPLC
Filtro membrana PTFE 0,45
µ
m
RESÍDUO
250,0
µ
µµ
µ
L
SOBRENADANTE
Diluição em fase móvel
Balão volumétrico 1,0 mL
Ajuste de
pH=2,50 com HCl
RESÍDUO
SÓLIDO
DESCARTE
SOLUÇÃO
Balão volumétrico 10,0 mL
CENTRÍFUGA
4000 rpm, 15 min
T = 4
°
°°
°
C, 24h
*
Na metodologia proposta
o banho a 20º C por 24 h foi
substituído pelo ultra-som
33
2.4 AVALIAÇÃO DO MÉTODO
Para a quantificação das amostras foram avaliados o método da
padronização externa e a padronização interna.
2.4.1 PADRONIZAÇÃO EXTERNA
A avaliação do método otimizado foi feita através da análise de alguns
parâmetros, dentre eles: resposta linear; limite de detecção; limite de
quantificação; repetitividade; seletividade e exatidão (recuperação) do método.
Todos os estudos foram realizados com análise em réplica e branco da análise.
2.4.1.1 ESTUDO DA RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO
A resposta linear corresponde à capacidade do método em fornecer
resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame,
dentro de uma determinada faixa de aplicação [78].
De acordo com Ribani et al. [78], um coeficiente de Pearson (r) maior
que 0,999 é considerado somente como uma evidência de um ajuste ideal dos
dados para a linha de regressão. Desta forma, a resposta linear do método foi
verificada também através dos gráficos de fator de resposta em função da
concentração dos analitos [78,79]. A faixa de resposta linear estudada variou
entre 3,00 e 30,00 mg/L, para tanto, foi construída uma curva de calibração,
para os seis ácidos com os seguintes níveis de concentração: 3,00; 6,00;
10,00; 15,00; 20,00; 25,00 e 30,00 mg/L.
2.4.1.2 CURVAS ANALÍTICAS
Para a quantificação dos compostos foram construídas curvas analíticas
para cada analito. Foram injetados 20 µL das soluções padrões trabalho da
mistura dos seis ácidos fenólicos na faixa de concentração de 3,00 a 20,00
mg/L diluídos a partir da solução intermediária 100,00 mg/L. Para construção
da curva analítica foram utilizados os níveis de concentração dentro da faixa de
resposta linear do método e da faixa estimada para os níveis de concentração
das amostras (3,00; 6,00; 10,00; 15,00 e 20,00 mg/L).
34
2.4.1.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO E
REPETITIVIDADE
O limite de detecção do método (LD) representa a menor quantidade ou
concentração do analito na amostra que pode ser confiavelmente distinguida
de zero. Um dos métodos recomendados para a validação de uma metodologia
propõe que o LD seja calculado como 3 vezes o desvio padrão da análise de
pelo menos seis amostras com baixa concentração dos analitos [80].
O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração da
substância em exame que pode ser medida, utilizando um determinado
procedimento experimental [78]. O seu valor pode ser determinado como 10
vezes o desvio padrão da análise de pelo menos seis amostras com baixa
concentração dos analitos.
Já a repetitividade envolve várias medições da mesma amostra, em
diferentes preparações e pode ser expressa através da estimativa do desvio
padrão relativo (RSD) [78].
Para se determinar a repetitividade e os limites de detecção e
quantificação do método, seis réplicas da amostra Mombaça folha (25,0 mg)
foram submetidas à extração em banho ultratermostático com uma solução de
NaOH 1M, a 20°C por 24 h. Esse tipo de tratamento permite extrair da amostra
somente os ácidos p-cumárico e ferúlico éster ligados. Logo, as amostras
foram fortificadas com os demais ácidos (chiquímico, cafeico, m-cumárico e o-
cumárico).
2.4.1.4 SELETIVIDADE DO MÉTODO PARA OS ÁCIDOS p-CUMÁRICO E
FERÚLICO
De acordo com Thompson et al. [80] a seletividade é a capacidade de
um método de quantificar precisamente um analito na presença de
interferentes. Desta forma optou-se por quantificar os ácidos ferúlico e p-
cumárico nos comprimentos de onda de 236 e 286 nm e comparar os
resultados com os obtidos no comprimento de onda de 316 nm, que foi o
selecionado para a quantificação destes ácidos na programação de
comprimento de onda. Não havendo diferenças significativas entre as
35
concentrações encontradas nos diferentes comprimentos de onda, garante-se
que os picos de resposta são exclusivamente dos compostos de interesse.
2.4.1.5 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
A exatidão do método foi avaliada através de ensaios de recuperação no
processo de extração da amostra Cynodon dactylon cv. Coast-cross, da
mesma fortificada, do branco da amostra e do branco fortificado com uma
mistura padrão dos ácidos.
Desta forma, foi realizada a extração da amostra e da mesma fortificada
com os seis ácidos em três níveis de concentração: 5,00; 7,50 e 10,00 mg/L.
Cada nível de concentração foi analisado em triplicata, aplicando a extração
em banho ultratermostático e em ultra-som. Foi avaliada também a
recuperação do branco da análise, sem adição de amostra, fortificado com os
seis ácidos na concentração de 10,00 mg/L, em cinco repetições para as duas
técnicas de extração estudadas.
2.5 PADRONIZAÇÃO INTERNA
O padrão interno (PI) e o padrão surrogate (PS) são utilizados para
controle do desempenho do método e no auxílio da quantificação dos analitos.
Tanto o PI, quanto o PS, são compostos que devem apresentar características
semelhantes às dos compostos estudados, ter tempo de retenção próximo ao
dos analitos, não reagir com o analito ou outro componente da matriz, não
fazer parte da amostra e, quando cromatografada, ficar separada de todas as
demais substâncias presentes na amostra [78,79].
O padrão interno é adicionado à amostra antes da injeção no HPLC, ele
é utilizado para compensar as flutuações de sinal e de tempo de retenção ao
longo das análises cromatográficas e para calcular a recuperação do padrão
surrogate.
O padrão surrogate deve ser submetido a todo o processo de tratamento
da amostra, desta forma, ele é adicionado à amostra antes da extração logo
após a sua pesagem. Sua recuperação é calculada através da equação 3.2,
36
onde o critério para valores de recuperação estabelecido neste trabalho foi de
75% a 120%.
(
)
PSR%
= Cm(PS)x Ca(PI) x100
Cm(PI)x Ca(PS)
[Equação2.2]
Sendo:
Cm a concentração medida na amostra
Ca a concentração adicionada na amostra
PS padrão surrogate
PI padrão interno
Aplicando a padronização interna, o padrão surrogate é utilizado no
cálculo das concentrações dos analitos, onde são comparadas as razões das
áreas e as razões das concentrações entre os padrões e as amostras.
Calculada desta forma, a concentração obtida é corrigida em função da
recuperação do padrão surrogate.
2.5.1 ESTUDOS PARA ESTABELECER O PADRÃO INTERNO E O
PADRÃO SURROGATE
No presente trabalho, dois compostos podem desempenhar ambas
funções, que são os ácidos o-cumárico e m-cumárico. Logo, a fim de se
determinar qual será utilizado como PI e qual será o PS, foram realizados dois
estudos:
I. Quantificação (em triplicata) da amostra Cynodon dactylon cv. Coast-
cross utilizando os ácidos o-cumárico como PI e m-cumárico como PS:
foi realizada a extração em ultra-som da amostra, da amostra
fortificada e do branco fortificado, ambos adicionados os ácidos
ferúlico, p-cumárico e m-cumárico (PS) na concentração de 10,00
mg/L. Antes da injeção de cada amostra, foi adicionado o ácido o-
cumárico na concentração de 10,00 mg/L (PI).
II. Quantificação (em triplicata) da amostra Cynodon dactylon cv. Coast-
cross utilizando os ácidos m-cumárico como PI e o-cumárico como PS:
foi realizada a extração em ultra-som da amostra, da amostra
fortificada e do branco fortificado, ambos adicionados os ácidos
ferúlico, p-cumárico e o-cumárico (PS) na concentração de 10,00 mg/L.
37
Antes da injeção de cada amostra, foi adicionado o ácido m-cumárico
na concentração de 10,00 mg/L(PI).
Para cada estudo, foi calculado o percentual de recuperação dos
analitos (ácidos ferúlico e p-cumárico) e do PS na amostra e no branco
fortificados. Optou-se por usar como padrão surrogate o ácido que
proporcionou maiores valores percentuais de recuperação.
2.5.2 AVALIAÇÃO DO MÉTODO APLICANDO PADRONIZAÇÃO INTERNA
Assim como foi feito para a padronização externa, procedeu-se a
avaliação do método otimizado aplicando a padronização interna, onde os
parâmetros analisados neste caso foram: resposta linear; limite de detecção;
limite de quantificação; repetitividade, precisão intermediária e exatidão
(recuperação) do método. Da mesma forma, todos os estudos foram realizados
com a análise em réplica e branco da análise.
2.5.2.1 RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO
Foi construída uma curva de calibração, em triplicata, para os ácidos
ferúlico, p-cumárico, cafeico e chiquímico com os seguintes níveis de
concentração: 3,00; 6,00; 10,00; 15,00; 20,00; 25,00 e 30,00 mg/L. A todos os
pontos da curva foram adicionados os ácidos m-cumárico (PS) e o-cumárico
(PI) na concentração final de 10,00 mg/L cada. O comportamento linear foi
avaliado através dos gráficos de fator de resposta em função da concentração
dos analitos análise e do coeficiente de Pearson (r), onde adotou-se a condição
de r > 0,999.
2.5.2.2 CURVAS ANALÍTICAS
Curvas analíticas foram construídas para cada um dos analitos. Foram
injetados 20 µL de soluções padrões trabalho da mistura dos seis ácidos
fenólicos na faixa de concentração de 3,00 a 20,00 mg/L para os ácidos
ferúlico, p-cumárico, cafeico e chiquímico e 10,00 mg/L para o PI e o PS,
diluídos a partir de uma solução intermediária 100,00 mg/L.
38
2.5.2.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO,
REPETITIVIDADE E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
Para se determinar a repetitividade e os limites de detecção e
quantificação do método, seis réplicas da amostra Cynodon dactylon cv. Coast-
cross (15,0 mg), adicionadas com o m-cumárico (PS) na concentração final de
10mg/L, foram submetidas à extração em ultra-som por 2h. Como citado no
tópico 2.4.1.3, esse tipo de tratamento permite extrair da amostra somente os
ácidos p-cumárico e ferúlico éster ligados, logo, as amostras foram fortificadas
com os ácidos chiquímico e cafeico.
Os limites de detecção e de quantificação foram calculados
respectivamente como 3 e 10 vezes o desvio padrão das análises [78, 80].
A avaliação da precisão intermediária foi realizada através da análise de
uma mesma amostra em dias diferentes [78], onde utilizou-se neste estudo
uma amostra de Brachiaria brizantha cv. Marandu. A precisão intermediária e
repetitividade foram avaliadas através da estimativa do desvio padrão relativo
(RSD) das análises [78].
2.5.2.4 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
Assim como no tópico 2.4.1.5, a avaliação da exatidão do método foi
realizada através da recuperação no processo de extração da amostra
Cynodon dactylon cv. Coast-cross, da mesma fortificada, branco e do branco
fortificados com uma mistura padrão dos ácidos. Porém neste caso, o estudo
foi realizado aplicando somente a extração em ultra-som na condição final
estabelecida no método.
Desta forma, foi realizada a extração de 25,0 mg da amostra e da
mesma fortificada (em triplicata) com os padrões dos ácidos ferúlico, p-
cumárico, cafeico e chiquímico em três níveis de concentração: 5,00; 7,50 e
10,00 mg/L, onde em todas as amostras foram adicionadas solução padrão de
m-cumárico (PS) obtendo-se a concentração final de 10,00 mg/L. Foi avaliada
também a recuperação do branco da análise e do branco fortificado com os
39
mesmos padrões obtendo-se a concentração final de 10,00 mg/L para todos,
em cinco repetições.
2.6 AMOSTRAS DE FORRAGEIRAS
As gramíneas foram semeadas em novembro de 2001, na Estação
Experimental da Agência Rural, no município de Anápolis-GO. As amostras
foram oriundas do período das águas (outubro, dezembro, janeiro e fevereiro)
dos anos 2004 e 2005. As amostras foram colhidas a cada 30 dias
manualmente, com o auxílio de cutelo, secas em estufas de ventilação forçada
a 55 ºC por 72 horas, moídas em moinho tipo faca de 1 mm e armazenadas em
frascos de polietileno para posterior análise.
2.6.1 CLASSIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS
As amostras de forrageira foram fornecidas pela Embrapa Gado de Leite.
No total foram 44 amostras de quatro espécies: Cynodon nlemfuenses cv.
Florona , Cynodon dactylon cv. Florakirk, Cynodon dactylon cv. Coast-cross,
Panicum maximum cv. Mombaça e Brachiaria brizantha cv. Marandu. As
amostras foram classificadas e separadas em função do gêreno, cultivar,
fração (caule e folha), repetição (R1 ou R2), adubação (doses de Nitrogênio:
150 ou 300 kg/ha de N) e irrigação (com ou sem) (TABELA 2.1).
Como não existe amostra de referência para os compostos estudados
em matriz de forrageira, para a avaliação do método foram empregadas
amostras de Mombaça folha e de Cynodon dactylon, cv Coast-cross (folha e
caule). Sendo esta última, amostra controle empregada pelo Laboratório de
Nutrição Animal da Embrapa Gado de Leite para controle de qualidade de suas
análises.
Como o interesse deste trabalho foi avaliar as concentrações de ácidos
fenólicos no caule e na folha, separadamente, a amostra Cynodon dactylon, cv
Coast-cross foi utilizada somente para avaliação do método devido ao fato de
ser uma mistura das duas frações.
40
TABELA 2.1: Classificação das amostras de forrageira analisadas.
Amostra Fração
Dose de N Irrigação
repetição
CÓDIGO
R1 A1
com
R2 A2
R1 B1
150
sem
R2 B2
R1 C1
com
R2 C2
R1 D1
caule
300
sem
R2 D2
com R1 E1
R1 F1
150
sem
R2 F2
R1 G1
com
R2 G2
Brachiaria brizantha
cv. Marandu
folha
300
sem R1 H1
R1 I1
caule 150 com
R2 I2
R1 J1
Cynodon dactylon
cv. Florakirk
folha 300 com
R2 J2
R1 K1
150 sem
R2 K2
R1 L1
caule
300 com
R2 L2
R1 M1
com
R2 M2
150
sem R1 N1
R1 O1
Cynodon
nlemfuenses cv.
Florona
folha
300 com
R2 O2
R1 P1
com
R2 P2
R1 Q1
150
sem
R2 Q2
R1 R1
com
R2 R2
R1 S1
caule
300
sem
R2 S2
R1 T1
com
R2 T2
R1 U1
150
sem
R2 U2
R1 V1
com
R2 V2
R1 X1
Panicum maximum
cv. Mombaça
folha
300
sem
R2 X2
41
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DA FASE MÓVEL
Valores não adequados de fator de simetria comprometem a
reprodutibilidade do tempo de retenção, aumentam a imprecisão da
quantificação, além de interferir nos cálculos da resolução e do número de
pratos teóricos, portanto é conveniente que seus valores estejam entre 0,9 e
1,3. Além disso, valores de fator de simetria maiores que 1,5 podem indicar a
necessidade de se trocar a coluna cromatográfica [79].
A análise dos valores de resolução (Equação3.1) entre os pares de
compostos devem ser acompanhados quando se pretende obter uma medida
quantitativa da separação realizada [79]. De acordo com Collins et al.[81],
valores de resolução superiores a 1,25 são suficientes para a quantificação.
ba
WW
trtr
R
ab
2/12/1
))(2/35.2(
+
−
=
[Equação3.1]
Onde tr
b
e tr
a
são os tempos de retenção do segundo e primeiro
compostos a eluir, respectivamente; W
1/2a
e W
1/2b
são a largura do pico à meia
altura para o primeiro e segundo composto a eluir respectivamente [82].
Inicialmente realizou-se um gradiente exploratório em diferentes valores
de pH com cada um dos solventes orgânicos: metanol, acetonitrila e
tetraidrofurano. E, a partir dos gradientes foram selecionadas as condições
iniciais para a otimização da separação isocrática.
3.1.1 ESTUDO DO pH DA FASE MÓVEL
Para cada solvente orgânico (metanol, acetonitrila e tetraidrofurano) e
cada valor de pH foi otimizada a melhor separação isocrática dos ácidos
chiquímico, cafeico, p-cumárico e ferúlico, empregando uma fase móvel (FM)
composta pelo solvente orgânico e por uma solução de ácido ou tampão,
dependendo do valor de pH. Porém, em alguns casos, a melhor condição
alcançada não proporcionou total separação dos ácidos.
42
A partir destes resultados, foram construídos gráficos dos tempos de
retenção (tr) em função do pH, área em função do pH e simetria em função do
pH para as condições otimizadas para cada um destes solventes, onde na
FIGURA 3.1 são mostrados esses gráficos para as condições otimizadas com o
metanol (MeOH). Pela análise desses gráficos foi possível avaliar, juntamente
com os cromatogramas, qual o valor de pH que proporcionou melhores
parâmetros de separação (tr, área, simetria, resolução, etc).
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
0
5
10
15
20
25
Gráfico Tr x pH
chiquimico
cafeico
cumarico
ferulico
Tr
pH
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
chiquimico
cafeico
cumarico
ferulico
Gráfico área x pH
Área
pH
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
Gráfico simetria x pH
chiquimico
cafeico
cumarico
ferulico
Simetria
pH
FIGURA 3.1: Gráficos da influência do pH no tr, na área e na simetria dos
ácidos eluídos com FM composta por solução de ácido ou tampão e MeOH.
Avaliando esses gráficos e os cromatogramas notou-se que para os três
solventes, os valores mais baixos de pH apresentaram melhores perfis
cromatográficos. Observou-se que o aumento de pH implicou num maior tempo
de retenção dos compostos, logo, maior tempo de corrida (FIGURA 3.1).
Além disso, os ácidos ferúlico e p-cumárico apresentaram uma
diminuição de área, devido ao aumento da área do pico secundário desses
43
compostos. Isso pode ser explicado pelo fato dos estudos envolverem
compostos fracamente ácidos (FIGURA 1.2), onde de uma maneira geral, os
ácidos fenólicos apresentam valores de pKa em torno de 4,5 e 9,5 [83]. Desta
forma optou-se em trabalhar com pH=2,05, pois neste valor de pH tem-se a
supressão da ionização.
Para o valor de pH 2,05, foram otimizadas duas condições de separação,
uma utilizando tampão fosfato, e outra utilizando solução aquosa de ácido
fosfórico. Observou-se que os cromatogramas obtidos para essas duas
condições não apresentaram diferenças consideráveis. Devido a esse fato,
optou-se por trabalhar com a solução aquosa de ácido fosfórico em pH=2,05,
pois o preparo da solução é mais simples e evita-se a cristalização de sais na
coluna cromatográfica.
3.1.2 ESTUDO DA PROPORÇÃO DO SOLVENTE NA COMPOSIÇÃO DA
FASE MÓVEL
A maior dificuldade enfrentada na otimização das condições de
separação dos compostos foi alcançar a separação dos ácidos ferúlico, cafeico
e p-cumárico de seus respectivos picos secundários. Como citado no tópico
2.2.1.2, no estudo da composição da fase móvel foi aplicado o diagrama
triangular para a separação dos ácidos.
Inicialmente, foi estabelecida a melhor condição de separação para cada
sistema, onde a fase móvel foi composta de solução aquosa de ácido fosfórico
pH=2,05 e cada um dos três solventes orgânicos selecionados para o estudo
(metanol, acetonitrila e tetraidrofurano). Neste caso foram estudados três
sistemas, onde os cromatogramas nos vértices do triângulo (FIGURA 3.2.A,
3.2.B, 3.2.C) correspondem às condições otimizadas em cada sistema com a
fase móvel composta pela solução aquosa de ácido fosfórico pH=2,05 e
solventes, onde esses resultados representam as três primeiras etapas da
otimização da separação através do diagrama triangular. Nas três condições os
perfis cromatográficos não foram satisfatórios, ou por apresentar alargamento
de banda (FIGURA 3.2.A), ou por apresentar coeluição dos compostos com
seus respectivos picos secundários (FIGURA 3.2.B, 3.2.C), desta forma optou-
se por testar a separação com uma mistura de solventes.
44
A) ACN/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (18:82);
B) MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (25:75);
C) THF/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (20:80);
D) ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (10:12,5:77,5);
E) MeOH/THF/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (14:13:73);
F) ACN/THF/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (9:18:73);
G) ACN/MeOH/THF/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (6:8:7:79).
FIGURA 3.2: Aplicação do método de desenvolvimento triangular para a
separação dos quatro ácidos. Cromatogramas da mistura padrão dos ácidos
10,00 mg/L. Coluna de fase reversa C18 ZORBAX ODS (150,0 mm x 4,6 mm, 5
µm); coluna de guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6 mm, 5 µm), fluxo de
1mL/min, detecção em 236nm e em diferentes FM.
Sendo assim, o segundo passo evolveu a otimização da separação com
uma mistura de dois dos três solventes (FIGURA 3.2.D, 3.2.E, 3.2.F) e
finalmente a separação com a mistura dos três solventes (FIGURA 3.2.G).
Onde a melhor separação foi proporcionada pela fase móvel composta por
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (10:12.5:77.5), a um fluxo de 1 mL/min e
pressão de trabalho em torno de 100 bar (FIGURA 3.2.D).
min
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
mAU
0
5
10
15
20
25
30
35
CAF
C
HI
P
-
CUM
FER
D
min
0
5
10
15
20
25
mAU
0
10
20
30
40
50
CAF
C
HI
P
-
CUM
FER
B
min
0
2
4
6
8
10
12
14
16
mAU
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
CAF
C
HI
P
-
CUM
FER
C
min
0
1
2
3
4
5
6
mAU
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
P
-
CUM
FER
CAF
C
HI
E
min
0
2
4
6
8
10
12
14
16
mAU
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
P
-
CUM
FER
CAF
C
HI
G
min
0
2
4
6
8
10
12
mAU
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
P
-
CUM
FER
CAF
C
HI
F
min
0
2
4
6
8
10
mAU
-20
0
20
40
60
80
CAF
C
HI
p
-
CUM
FER
A
THF
MeOH
ACN
45
Definida a condição de separação dos quatro ácidos (chiquímico,
cafeico, p-cumárico e ferúlico), foram incluídos os ácidos m-cumárico e o-
cumárico. Com a inclusão desses ácidos, foi necessária uma pequena
alteração na composição da fase móvel, conduzindo a uma melhor resolução
do cromatograma, chegando-se a seguinte condição final: ACN/MeOH/solução
H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5) (FIGURA 3.3).
FIGURA 3.3: Cromatograma da mistura padrão dos seis ácidos na
concentração de 20,00 mg/L. Coluna de fase reversa C18 ZORBAX ODS
(150,0 mm x 4,6 mm, 5 µm); coluna de guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6
mm, 5 µm); FM: ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); fluxo:
1mL/min; pressão de trabalho 110 bar.
3.1.3 PROGRAMAÇÃO DOS COMPRIMENTOS DE ONDA PARA
DETECÇÃO
Parâmetros como comprimento de onda para análise (λ
análise
), largura da
banda e até mesmo ajuste de linha base podem ser estabelecidos a fim de se
aumentar a sensibilidade da analise e evitar interferências de compostos
indesejáveis na detecção.
O detector de múltiplos comprimentos de onda permite monitorar
simultaneamente até cinco comprimentos de onda distintos, com larguras de
bandas diferentes ou não, obtendo-se assim cinco cromatogramas com sinais
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
-50
0
50
100
150
200
250
300
CHI
CAF
p-CUM
FER
m-CUM
o-CUM
46
diferentes para a mesma separação obtida para uma única injeção da amostra.
Além do monitoramento contínuo em um único λ durante o tempo total para
eluição da amostra, outro recurso é a programação dos parâmetros do detector
(λ
análise
, largura da banda e ajuste de linha base) em função do tempo de
retenção dos compostos de interesse e possíveis interferentes.
Essa variação dos comprimentos de onda para detecção conforme o
tempo de eluição proporciona o aumento da intensidade do sinal. Logo,
melhora a sensibilidade, melhorando os limites de detecção e quantificação do
método. Isso porque, a programação empregada para o detector leva em
consideração os comprimentos de onda onde há máxima absorção dos
analitos. Os comprimentos de onda e os respectivos intervalos selecionados
para as análises são mostrados na TABELA 3.1.
TABELA 3.1: Valores de λ de leitura do detector programados em função do
tempo de análise.
Compostos eluídos no intervalo Intervalo (min) λ (nm)
Ácido chiquímico 0 a 3,0 236
Ácidos cafeico, p-cumárico e ferúlico 3,0 a 9,1 316
Ácidos m-cumárico e o-cumárico 9,1 a 15 236
A FIGURA 3.4 A mostra a sobreposição dos cromatogramas registrados
nos comprimentos de onda 236 nm e 316 nm, e a FIGURA 3.4 B mostra o
cromatograma registrado com programação de comprimento de onda.
Observa-se que ao utilizar a programação de comprimentos de onda foi
possível obter incrementos de sinal para os ácidos cafeico, ferúlico e p-
cumárico ao se comparar com a medição em comprimento de onda fixo em 236
nm, no qual inicialmente os estudos foram realizados.
47
FIGURA 3.4: Cromatogramas da mistura padrão dos seis ácidos na
concentração de 20,00 mg/L. A - Sobreposição dos sinais registrados em 236
nm e 316 nm. B - Cromatograma obtido após a leitura com programação de
comprimento de onda. Coluna de fase reversa C18 ZORBAX ODS (150,0 mm x
4,6 mm, 5 µm); coluna de guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6 mm, 5 µm);
FM: ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); Fluxo: 1mL/min.
3.1.4 CONDIÇÃO OTIMIZADA PARA ANÁLISE NO CROMATÓGRAFO
LÍQUIDO DE ALTA EFICIÊNCIA
A condição otimizada para análise no cromatógrafo líquido de alta
eficiência está esquematizada na TABELA 3.2.
TABELA 3.2: Condição otimizada para análise no HPLC.
Condição estabelecida
Coluna
C18 ZORBAX ODS (150,0 mm x 4,6 mm, 5 µm)
Coluna de guarda
ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6 mm, 5 µm)
Fase móvel
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5)
Fluxo da fase móvel
1mL/minuto
Tempo total da análise
15 minutos
Detecção
Programação do detector: 0 a 3 min: 236 nm; 3 a 9,1 min:
316 nm; 9,1 a 15 min: 236 nm
min
0
2
4
6
8
10
12
14
mAU
0
50
100
150
200
250
300
min
0
2
4
6
8
10
12
14
mAU
0
50
100
150
200
250
300
CHI
FER
CAF
o-CUM
m-CUM
p-CUM
236nm
316nm
A
B
316nm
236nm
236nm
48
Os parâmetros cromatográficos e a respectiva ordem de eluição obtidos
para análise em HPLC dos seis ácidos estudados nas condições otimizadas
estão dispostos na TABELA 3.3. Onde, tempo de retenção relativo (tr
r
) é um
parâmetro que deve variar pouco no decorrer das análises, sendo assim um
parâmetro de controle do desempenho do método, podendo ser aplicado na
identificação de picos.
TABELA 3.3: Parâmetros de separação obtidos para mistura padrão dos seis
ácidos (20,0 mg/L).
ANALITO
Tempo de
retenção (min)
Resolução Simetria tr
r
Ácido chiquímico 1,660 - 0,91 -
Ácido cafeico 4,214 10,95 0,86 -
Ácido p-cumárico 7,037 9,03 0,95 1,670
Ácido ferúlico 8,133 1,76 0,96 1,930
Ácido m-cumárico 9,520 3,28 0,99 2,259
Ácido o-cumárico 13,382 7,02 1,05 3,176
Tempo de retenção relativo (tr
r
) = tr
analito
/ tr
ácido cafeico
Vale ressaltar que a resolução do ácido ferúlico foi calculada
considerando o pico secundário do ácido p-cumárico, que elui entre os dois
compostos.
Conforme citado, Deschamps & Ramos [11] otimizaram um método de
separação para sete ácidos fenólicos, dentre eles os ácidos cafeico, ferúlico, p-
cumárico, o-cumárico e m-cumárico por padronização externa, onde o último
composto a eluir foi o ácido o-cumárico, apresentando um tempo de retenção
acima de 36 min, resultando em um tempo total de corrida de 45 min. Já no
presente trabalho, o mesmo ácido apresenta um tempo de retenção de 13,382
min (TABELA 3.3), assim, cada corrida tem a duração de 15 min, que
representa um grande ganho no tempo de análise se comparado com o método
proposto por Deschamps & Ramos (2002).
A vantagem deste método sobre os demais trabalhos citados no item
1.4, é que foi possível otimizar a separação dos compostos estudados
utilizando um eluição isocrática e fluxo de 1mL/min. Isso porque os demais
autores trabalharam com fluxos de 1,5 e 3 mL/min ou com eluição por
gradiente [10,12,15,46,55].
49
3.2 ESTUDO DA ESTABILIDADE DOS PADRÕES
Durante os estudos da FM, observou-se que os ácidos cafeico, p-
cumárico e ferúlico apresentaram um pequeno pico secundário além do pico
principal. Esse pico mostrou-se quase imperceptível quando as soluções foram
preparadas e injetadas no dia do preparo das soluções estoques de 1000,0
mg/L. Porém, quando as soluções injetadas (soluções trabalho) foram
preparadas alguns dias após o preparo da solução estoque, observou-se um
aumento na área desses picos secundários, o que poderia comprometer as
análises.
Como citado no item 2.3.2, as soluções utilizadas neste estudo foram
preparadas conforme mostrado no esquema da FIGURA 2.1, onde MIX 6 é
uma solução padrão mistura composta pelos seis ácidos.
A FIGURA 3.5 apresenta o resultados obtidos para as soluções estoque,
intermediária e trabalho preparadas e analisadas no mesmo dia, sendo os
cromatogramas referentes às injeções das soluções trabalho A, B, C, D, E e F.
Observou-se que as soluções estoque, intermediária e trabalho diluídas em
MeOH (solução B) ou ACN (solução E) não apresentaram resultados
satisfatórios. Aparentemente o solvente empregado na diluição da solução
trabalho foi o que mais influenciou no perfil do cromatograma, onde fica
evidente que a melhor condição foi obtida através da diluição da solução
trabalho em fase móvel, independente do solvente (MeOH, ACN ou FM)
empregado para a diluição da solução intermediária.
50
FIGURA 3.5: Cromatogramas do teste de estabilidade das soluções padrões.
A: solução A; B: solução B; C: solução C; D: solução D; E: solução E; F:
solução F. FM: ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); Fluxo:
1mL/min.
No caso das soluções preparadas a partir da estoque 1000,00 mg/L
diluída em metanol, observou-se que na solução C (solução intermediária e
solução trabalho diluídas em FM) os ácidos cafeico e p-cumárico apresentaram
sinal um pouco maior se comparado com a solução A (solução intermediária
diluída em MeOH e solução trabalho diluída em FM).
Já para a solução estoque 1000,00 mg/L diluída em acetonitrila,
observou-se que o cromatograma da solução F (solução intermediária e
solução trabalho diluídas em FM) não apresentou diferenças significativas
frente ao cromatograma da solução D (solução intermediária diluída em ACN e
solução trabalho diluída em FM).
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
25
50
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
25
50
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
25
50
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
25
50
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
25
50
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
25
50
E
B
A
C
D
F
CHI
CAF
p-CUM
FER
m-CUM
o-CUM
51
Frente a esses resultados, escolheu-se realizar os testes de estabilidade
com as soluções C e F. Assim, novas soluções C e F foram preparadas e
injetadas 1, 7 e 17 dias após o preparo das soluções estoque. Estas amostras
foram injetadas juntamente com as soluções C e F do primeiro dia.
Foi possível observar que as soluções C e F não foram estáveis de um
dia para o outro, pois os picos secundários dos ácidos cafeico, p-cumárico e
ferúlico apresentaram um aumento considerável em suas áreas.
Na FIGURA 3.6 estão os cromatogramas obtidos para a solução C
injetada no dia do preparo da solução estoque e 1, 7 e 17 dias após. Foi
possível observar um aumento considerável nas áreas dos picos secundários
após uma semana, acarretando numa diminuição de 31 e 21% nas áreas dos
picos principais dos ácidos p-cumárico e ferúlico, respectivamente. Vale
ressaltar que a solução F apresentou o mesmo tipo de comportamento,
concluindo-se que as soluções estoque 1000,00 mg/L foram estáveis por uma
semana, onde a variação das áreas dos picos secundários foi mínima.
FIGURA 3.6: Cromatogramas da mistura padrão dos seis ácidos na
concentração de 6,00 mg/L diluída em fase móvel na data da injeção, solução
intermediaria diluída em fase móvel e solução estoque diluída em metanol.
Coluna de fase reversa C18 ZORBAX ODS (150,0 mm x 4,6 mm, 5 µm);
coluna de guarda ZORBAX ODS (12,5 mm x 4,6 mm, 5 µm); FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); Fluxo: 1mL/min.
52
Notou-se que não houve diferenças entre os cromatogramas das
soluções trabalho cuja solução estoque foi preparada em metanol ou em
acetonitrila. Logo a condição selecionada foi com a diluição da solução estoque
em metanol, solução intermediária em fase móvel e trabalho em fase móvel.
3.3 EXTRAÇÃO DA AMOSTRA
Os estudos de extração em ultra-som (US) foram realizados extraindo a
amostra (25,0 mg) a temperatura ambiente com uma solução de NaOH 1M nos
seguintes tempos de sonicação: 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270 e
300 min (item 2.4)
As análises foram realizadas em triplicata e para avaliar o tempo ideal de
sonicação, foi construído um gráfico das médias das concentrações dos ácidos
p-cumárico e ferúlico em função do tempo de sonicação (FIGURA 3.7).
Observa-se que os tempos de sonicação entre 15 a 90 minutos não foram
suficientes para extrair completamente os ácidos éster ligados, sendo que a
concentração máxima foi alcançada na faixa entre 120 e 150 min de sonicação.
Após 150 minutos de sonicação, houve uma queda nas concentrações,
possivelmente devido a degradação dos analitos.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
15 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300
Tempo, min
Concentração, mg/g
[p-CUM] mg/g
[FER] mg/g
FIGURA 3.7: Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos ferúlico e p-
cumárico obtidas da extração em ultra-som de 25,0 mg de Mombaça folha.
53
Comparando-se as concentrações obtidas para o tempo de sonicação
de 120 min com as concentrações obtidas na extração em banho
ultratermostático (TABELA 3.4), observou-se que o ultra-som apresentou
menores valores de desvio-padrão, indicando menor dispersão dos dados,
mostrando que este método é mais reprodutível.
TABELA 3.4: Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos p-cumárico e
ferúlico para a amostra Mombaça folha extraída em banho a 20
o
C por 24 h e
em ultra-som a temperatura ambiente por 2 h.
BANHO
(20º C por 24h)
US
(t
ambiente
por 2h)
Réplica
p-CUM
(mg/g peso seco)
FER
(mg/g peso seco)
p-CUM
(mg/g peso seco)
FER
(mg/g peso seco)
1 4,48 4,75 4,08 4,93
2 4,39 4,52 4,09 4,93
3 4,20 4,42 4,05 4,88
média 4,35 4,56 4,07 4,91
Sd 0,14 0,17 0,03 0,03
DPR 3,
2
3,
7
0,6 0,7
p-CUM = ácido p-cumárico; FER = ácido ferúlico; Sd = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo
Aplicando o teste t entre os dois métodos de extração, obteve-se os
valores de t = 3,52 e t = 3,38 para os ácidos ferúlico e p-cumárico,
respectivamente. Como o valor tabelado de t, a 95% de confiança, é de 4,30,
conclui-se que não há diferenças entre os dois métodos de extração. Desta
maneira, optou-se por substituir a extração descrita na literatura (20º C por 24
h) pela extração por ultra-som a temperatura ambiente, sendo o tempo de 120
minutos de sonicação ideal para extração das amostras.
Além da melhor reprodutibilidade, o método proposto utilizando o ultra-
som é mais rápido, sendo necessário apenas 2h para tratamento das amostras,
enquanto que a extração no banho ultratermostático leva 24 h.
3.4 AVALIAÇÃO DO MÉTODO APLICANDO PADRONIZAÇÃO EXTERNA
3.4.1 RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO
Foi construída uma curva de calibração para os seis ácidos e para cada
um deles foi determinado o fator de resposta dos pontos da curva, que é dado
pela razão entre a área e a concentração do analito. Por fim, plotou-se o gráfico
54
de fator de resposta em função da concentração para os seis ácidos (FIGURA
3.8). Esses gráficos são geralmente construídos em função do logaritmo da
concentração, mas como neste caso, o estudo da resposta linear não envolve
uma faixa muito ampla de concentração, é válido traçar gráfico do fator de
resposta em função da concentração do analito [79].
Ácido chiquímico
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
0 5 10 15 20 25 30
Concentração, mg/L
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido cafeico
0
40
80
120
160
0 5 10 15 20 25 30
Concentração, mg/L
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido p-cumárico
0
40
80
120
160
200
0 5 10 15 20 25 30
Concentração, mg/L
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido ferúlico
0
50
100
150
0 5 10 15 20 25 30
Concentração, mg/L
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido m-cumárico
0,0
30,0
60,0
90,0
120,0
0 5 10 15 20 25 30
Concentração, mg/L
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido o-cumárico
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25 30
Concentração, mg/L
Fator de resposta
105%
média
95%
FIGURA 3.8: Gráficos do fator de resposta dos ácidos chiquímico, cafeico,
ferúlico, p-cumárico, m-cumárico e o-cumárico por padronização externa.
Também foram traçadas nos gráficos, as linhas horizontais paralelas
referentes à média dos valores de fator de resposta e à 95 e 105% dessa
55
média. Para que o método seja linear, os valores de fator de resposta devem
ser independentes da concentração, e devem estar entre as linhas horizontais
referentes a 95 e 105% da média dos valores de fator de resposta, podendo
interceptá-las [78, 79]. E é o que observou-se na FIGURA 3.8, levando à
conclusão de as curvas de calibração são lineares na faixa estudada.
3.4.2 CURVAS ANALÍTICAS
Como critério, as curvas analíticas devem apresentar coeficientes de
correlação r ≥ 0,999. Neste caso, os coeficientes de correlação para os 6
compostos variaram entre 0,99935 (ácido p-cumárico) e 0,99999 (ácido o-
cumárico). A FIGURA 3.9 mostra as curvas analíticas para os 6 compostos
conforme a ordem de eluição.
56
Ácido chiquímico
Y = 13,652 X + 2,3094
r = 0,99984
0
50
100
150
200
250
300
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Concentração, mg/L
Área
Ácido cafeico
Y = 156,49 X - 43,313
r = 0,99995
0
700
1400
2100
2800
3500
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Concentração, mg/L
Área
Ácido p-cumárico
Y = 89,478 X - 4,8028
r = 0,99935
0
500
1000
1500
2000
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Concentração, mg/L
Área
Ácido ferúlico
Y = 110,72 X - 15,203
r = 0,99973
0
500
1000
1500
2000
2500
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Concentração, mg/L
Área
Ácido m-cumárico
Y = 89,478 X- 4,8028
r = 0,99991
0
500
1000
1500
2000
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Concentração, mg/L
Área
Ácido o-cumárico
Y = 53,189 X+ 1,601
r = 0,99999
0
200
400
600
800
1000
1200
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00
Concentração, mg/L
Área
FIGURA 3.9: Curvas analíticas por padronização externa obtidas para a
injeção em triplicata da mistura padrão dos ácidos chiquímico, cafeico, p-
cumárico, ferúlico, m-cumárico e o-cumárico nas concentrações 0,00; 3,00;
6,00; 10,00; 15,00 e 20,00 mg/L.
57
3.4.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO E
REPETITIVIDADE
Os valores dos limites de detecção do método (LD) e de quantificação
do método (LQ) calculados para a matriz estão dispostos na TABELA 3.5, onde
é possível observar que somente os ácidos p-cumárico, ferúlico, m- cumárico e
o-cumárico apresentaram resultados.
TABELA 3.5: Limites de detecção e quantificação do método e repetitividade
obtidos para uma massa da amostra Mombaça folha de 25,0 mg (n = 6).
Analito LD (mg/L) LQ (mg/L) DPR (%)
Ácido chiquímico - - -
Ácido cafeico - - -
Ácido p-cumárico 0,33 1,11 4,
3
Ácido ferúlico 0,33 1,12 4,
1
Ácido m-cumárico 0,38 1,28 3,
5
Ácido o-cumárico 0,41 1,36 4,
4
LD = limite de dectecção do método; LQ = limite de quantificação do
método; DPR = desvio padrão relativo percentual
Apesar de ser detectado, o ácido chiquímico não foi quantificado na
amostra fortificada, pois apresentou coeluição com componentes presentes na
amostra e também provenientes dos reagentes adicionados durante o processo
de extração (FIGURA 3.10). Também foi possível verificar que o ácido cafeico
é instável às condições de extração, pois nenhum sinal foi detectado no tempo
de retenção do composto (FIGURA 3.10). Por esses motivos, não foram
estabelecidos os limites de detecção e quantificação para os ácidos chiquímico
e cafeico.
Já os resultados referentes à repetitividade são satisfatórios
considerando-se as etapas de tratamento e transferências envolvidos, bem
como as características das amostras como, por exemplo, tamanho das
partículas. Os valores encontrados estão em conformidade com os relatados
por Dey et al. [52], que considera aceitável uma variação de até 10%.
58
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
FIGURA 3.10: Cromatograma obtido para amostra Mombaça folha fortificada
com os ácidos chiquímico (5,00 mg/L), cafeico (2,00 mg/L), m-cumárico (3,70
mg/L) e o-cumárico (3,00 mg/L) para estabelecimento do LD e LQ. FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5); Fluxo: 1mL/min.
3.4.4 SELETIVIDADE
A amostra Cynodon (25,0 mg) foi extraída em triplicata em banho
ultratermostático e os ácidos p-cumárico e ferúlico foram quantificados em três
comprimentos de onda diferentes (236, 286 e 316 nm). Para avaliar quaisquer
diferenças entre os valores de concentrações calculados nos três
comprimentos de onda, aplicou-se o teste t entre as concentrações
encontradas em 236 nm e 316 nm e entre 286 nm e 316 nm (TABELA 3.6).
TABELA 3.6: Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos p-cumárico e
ferúlico na amostra Cynodon (25,0 mg) em diferentes comprimentos de onda.
p-CUM (mg/g peso seco) FER (mg/g peso seco)
236nm 286nm 316nm 236nm 286nm 316nm
Réplica 1 5,69 5,70 5,70 4,94 4,92 4,93
Réplica 2 6,06 6,07 6,03 4,84 4,83 4,86
Réplica 3 5,60 5,60 5,60 4,80 4,78 4,80
média 5,78 5,79 5,77 4,86 4,84 4,86
DPR (%) 4,
2
4,
3
3,
9
1,
4
1,
5
1,
3
t
236/316
0,045 - - 0,041 - -
t
286/316
- 0,082 - - 0,415 -
p-CUM = ácido p-cumárico; FER = ácido ferúlico; DPR = desvio padrão relativo percentual
CHI
p-CUM
FER
m-CUM
o-CUM
59
Observou-se que para todos os casos, o t
calculado
foi menor que o t
tabelado
(2,776), concluindo que não houve diferenças significativas (95% de confiança)
entre os valores encontrados, o que mostra que os ácidos foram quantificados
sem interferência de outros compostos presentes na matriz. Na FIGURA 3.11
tem-se os cromatogramas da amostra 1 nos três comprimentos de onda, onde
é possível observar que não houve sinal de outros compostos que possam ter
sido co-extraídos, mostrando interferência mínima na quantificação dos ácidos
p-cumárico e ferúlico nos λ analisados.
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
-5
0
5
10
15
20
25
30
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
-5
0
5
10
15
20
25
30
min
0 2 4 6 8 10 12 14
mAU
-5
0
5
10
15
20
25
30
FIGURA 3.11: Cromatogramas da réplica 1 da amostra Cynodon. FM:
ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5), fluxo: 1mL/min, detecção:
a) 236nm, b) 286nm, c) 316nm.
3.4.5 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
Conforme citado no item 3.4.3 o ácido cafeico é instável às condições de
extração, seja no banho ultratermostático ou no ultra-som. Na análise do
branco fortificado, além da ausência de sinal referente ao ácido cafeico,
nenhum pico adicional foi detectado além dos constituintes adicionados
(FIGURA 3.12 B). E o ácido chiquímico não pôde ser quantificado, tanto na
amostra fortificada quanto no branco fortificado, devido à sua co-eluição com
B
A
C
p-CUM
FER
60
compostos presentes na matriz e no branco (FIGURAS 3.12 B e 3.12 D).
Sendo assim, na TABELA 3.7 estão somente os resultados de recuperação dos
ácidos ferúlico, p-cumárico, m-cumárico e o-cumárico.
min
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
20
40
60
80
100
120
min
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
20
40
60
80
100
120
min
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
20
40
60
80
100
120
min
0 2 4 6 8 10 12
mAU
0
20
40
60
80
100
120
FIGURA 3.12: Cromatogramas dos resultados da recuperação da extração no
banho: a) branco; b) branco fortificado com 10,00 mg/L de cada ácido; c)
amostra Cynodon; d) amostra Cynodon fortificada com 10,00 mg/L de cada
ácido. FM: ACN/MeOH/solução H
3
PO
4
pH=2,05 (13:12,5:74,5), fluxo: 1mL/min
CHI
p-CUM
FER
m-CUM
o-CUM
B
A
C
D
61
TABELA 3.7: Comparação entre o percentual de recuperação (DPR)
alcançado ao fortificar 25,0 mg da amostra Cynodon com mistura padrão dos
ácidos em 3 níveis de fortificação (5,00 , 7,50 e 10,00 mg/L).
Percentual médio de recuperação,%
(desvio padrão relativo, %)
Analito Amostra
Níveis de
Fortificação,
mg/L
banho Ultra-som
5,00 88 (3,
2
) 85 (4,
1
)
7,50 91 (4,
5
) 82 (3,
9
)
Amostra fortificada
10,00 94 (5,
9
) 86 (4,
4
)
Ác. p-cumárico
Branco fortificado 10,00 82 (3,
9
) 85 (3,
0
)
5,00 89 (5,
8
) 85 (0,8)
7,50 91 (4,
8
) 82 (2,
4
)
Amostra fortificada
10,00 93 (3,
6
) 89 (5,
3
)
Ac. ferúlico
Branco fortificado 10,00 89 (3,
3
) 85 (3,
0
)
5,00 86 (2,
6
) 84 (1,
1
)
7,50 88 (5,
8)
83 (2,
7
)
Amostra fortificada
10,00 91 (2,
4
) 91 (2,
0
)
Ac. m-
cumárico
Branco fortificado 10,00 95 (3,
0
) 95 (3,
2
)
5,00 92 (4,
6
) 90 (6,
0
)
7,50 93 (6,
0
) 85 (3,
1
)
Amostra fortificada
10,00 93 (3,
1
) 91 (4,
1
)
Ac. o-cumárico
Branco fortificado 10,00 93 (4,
2
) 94 (2,
4
)
DPR = desvio padrão relativo percentual
Os valores de recuperação obtidos para a extração em ultra-som
variaram de 82 a 91 %, sendo o valor médio de 86 % com DPR de 4 %. Já o
banho apresentou maiores percentuais de recuperação, onde os valores
variaram de 86 a 94 %, sendo o valor médio de 91 % com DPR de 3 %.
Embora a recuperação obtida no ultra-som tenha apresentado uma
maior dispersão dos resultados, a sua distribuição foi aleatória em relação aos
níveis de concentração. Já no caso do banho, notou-se que a recuperação
média aumentou discretamente conforme o nível de fortificação da amostra.
Esse aumento foi de 3% entre os níveis de fortificação para os ácidos p-
cumárico e m-cumário e de 2% para o ácido ferúlico.
Como mostra a FIGURA 3.13, foram construídas curvas com as médias
de concentração de cada nível de fortificação de cada ácido no ultra-som em
62
função das médias de concentração de cada nível de fortificação de cada ácido
no banho, a fim de se avaliar a correlação entre os valores obtidos nos dois
tipos de extração. Analisando as curvas, em todos os casos, os valores do
coeficiente de Pearson (r)
e da inclinação se aproximam de um, e os valores
dos interceptos aproximam-se de zero, indicando a existência de uma
correlação entre os valores.
Ácido p-cumárico
Y = 0,8954X - 0,0273
r = 0,9955
0,0
4,0
8,0
12,0
0,0 5,0 10,0 15,0
Concentração banho, mg/L
Concentração US, mg/L
Ácido ferúlico
Y = 0,9369X - 0,0078
r = 0,9995
0,0
4,0
8,0
12,0
0,0 5,0 10,0 15,0
Concentração banho, mg/L
Concentração US, mg/L
Ácido m-cumárico
Y = 0,971X + 0,1092
r = 0,9972
0,0
3,0
6,0
9,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0
Concentração banho, mg/L
Concentração US, mg/L
Ácido o-cumárico
Y = 0,9325X + 0,0429
r = 0,9992
0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0
Concentração banho, mg/L
Concentração US, mg/L
FIGURA 3.13: Curvas das médias de concentração obtida para cada nível de
fortificação de cada ácido no ultra-som versus no banho.
3.5 PADRONIZAÇÃO INTERNA
3.5.1 ESTUDOS PARA ESTABELECER O PADRÃO INTERNO E O
PADRÃO SURROGATE
A fim de se determinar qual dos compostos se comporta melhor como
padrão interno (PI) e como padrão surrogate (PS), foram realizados dois
63
estudos. Em cada condição testada foram analisadas, em triplicata, amostra,
amostra fortificada e branco fortificado:
ESTUDO 1: O ácido o-cumárico foi usado como PI e m-cumárico como PS.
ESTUDO 2: O ácido m-cumárico foi usado como PI e o-cumárico como PS.
Na TABELA 3.8 são apresentados os resultados obtidos para a amostra
Cynodon dactylon cv. Coast-cross aplicando a padronização interna, usando
cada um dos ácidos como PS. Observa-se que o ácido m-cumárico apresentou
maior percentual de recuperação, o que mostra que este ácido é menos
suscetível a perdas durante o processo de extração.
TABELA 3.8: Concentrações (mg/g peso seco) obtidas dos ácidos p-cumárico,
ferúlico e recuperação do padrão surrogate para a amostra Cynodon extraída
em ultra-som por 120 minutos, calculadas por padronização interna.
o-CUM como PS m-CUM como PS
p-CUM
(mg/g peso seco)
FER
(mg/g peso seco)
RPS
(%)
p-CUM
(mg/g peso seco)
FER
(mg/g peso seco)
RPS
(%)
Réplica 1 6,73 6,31 76 6,19 6,20 104
Réplica 2 6,75 6,40 72 6,33 6,13 104
Réplica 3 6,56 6,57 74 6,36 6,25 100
Média 6,68 6,43 74 6,29 6,19 103
Sd 0,10 0,13 1,9 0,09 0,06 2,2
DPR (%) 1,
6
2,
0
2,
6
1,
4
0,9 2,
0
o-CUM = ácido o-cumárico; m-CUM = ácido m-cumárico; p-CUM = ácido p-cumárico; FER = ácido ferúlico; PS =
padrão surrogate; RPS = recuperação do padrão surrogate; Sd = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo
percentual
Tal comportamento também foi observado para a amostra e o branco
fortificados, onde na maioria dos resultados, tanto o padrão surrogate, quanto
os ácidos ferúlico e p-cumárico apresentaram maiores percentuais médios de
recuperação quando o m-cumárico desempenhou a função de padrão
surrogate (FIGURA 3.14). Além disso, quando o ácido o-cumárico foi usado
como PS, obteve-se maiores valores de desvio padrão relativo das análises.
64
0,0
15,0
30,0
45,0
60,0
75,0
90,0
105,0
120,0
PS
p-CUM
FER
P
S
p-CUM
FER
PS
Amostra pura Amostra fortificada Branco fortificado
Analitos
R ecu peração, %
PS: o-CUM
PS: m-CUM
FIGURA 3.14: Gráfico com os percentuais de recuperação dos analitos obtidos
para a amostra, amostra fortificada e branco fortificado utilizando padrões
interno e surrogate.
Sendo assim, optou-se em utilizar o ácido o-cumárico como padrão
interno e o ácido m-cumárico como padrão surrogate.
A FIGURA 3.15 esquematiza o processo final de extração da amostra
aplicando a padronização interna para a quantificação dos ácidos ferúlico e p-
cumárico nas amostras de forrageiras.
65
FIGURA 3.15: Esquema de representação para a extração das amostras de
forrageiras em ultra-som para a quantificação dos ácidos fenólicos por
padronização interna.
Ajuste de
pH=2,50 co
m HCl
RESÍDUO
SÓLIDO
DESCARTE
SOLUÇÃO
Balão volumétrico 10,0 mL
CENTRÍFUGA
4000 rpm, 15 min
T = 4
°
°°
°
C, 24h
25,0 mg
AMOSTRA
NaOH 1 M
Filtro de fibra de vidro
ULTRA
-
SOM
por 2 h
m
-
CUM (PS)
HPLC
Filtro membrana PTFE 0,45
µ
m
RESÍDUO
250,0
µ
µµ
µ
L
SOB
RENADANTE
Diluição em fase móvel
Balão volumétrico 1,0 mL
o
-
CUM (PI)
66
3.5.2 AVALIAÇÃO DO MÉTODO APLICANDO PADRONIZAÇÃO INTERNA
3.5.2.1 RESPOSTA LINEAR DO MÉTODO
A resposta linear do método foi verificada através dos gráficos de fator
de resposta em função da razão da concentração dos analitos e concentração
do padrão surrogate, na faixa de concentração dos analitos entre 3,00 e 30,00
mg/L. Neste caso, por se tratar de padronização interna, o fator de resposta é
dado pela equação 3.1.
Fator de resposta = A
analito
/A
PS
C
analito
/C
PS
[Equação 3.1]
Sendo:
A
analito
a área do analito
A
PS
a área do padrão surrogate
C
analito
a concentração do analito
C
PS
a concentração do padrão surrogate
A FIGURA 3.16 mostra os gráficos dos fatores de resposta obtidos para
os ácidos chiquímico, cafeico, ferúlico e p-cumárico. É possível verificar que os
valores se encontram entre as linhas horizontais referentes a 95 e 105% do
valor médio, logo, as curvas de analíticas são lineares na faixa estudada.
67
Ácido chiquímico
0
0,1
0,2
0,3
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Razão concentração
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido cafeico
0
0,5
1
1,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Razão concentração
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido p-cumárico
0
0,7
1,4
2,1
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Razão concentração
Fator de resposta
105%
média
95%
Ácido ferúlico
0
0,5
1
1,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Razão concentração
Fator de resposta
105%
média
95%
FIGURA 3.16: Gráficos de fator de resposta dos ácidos chiquímico, cafeico,
ferúlico e p-cumárico por padronização interna.
3.5.2.2 CURVAS ANALÍTICAS
Adotou-se como critério coeficientes de correlação r ≥ 0,999 para as
curvas analíticas. Os coeficientes de correlação para os 4 compostos
resolvidos variou entre 0,99970 (ácido ferúlico) e 0,99989 (ácido cafeico). A
FIGURA 3.17 mostra as curvas analíticas para os compostos conforme a
ordem de eluição.
Sendo:
Razão área = Área do analito
Área do PS
Razão concentração = Concentração do analito
Concentração do PS
[Equação 3.2]
[Equação 3.3]
68
Ácido chiquímico
Y = 0,2031X - 0,0008
r = 0,99975
0
0,14
0,28
0,42
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Razão concentração
Razão área
Ácido cafeico
Y = 1,2673X + 0,0037
r = 0,99989
0
0,7
1,4
2,1
2,8
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Razão concentração
Razão área
Ácido p-cumárico
Y = 1,7601X + 0,0018
r = 0,99980
0
0,9
1,8
2,7
3,6
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Razão concentração
Razão área
Ácido ferúlico
Y = 1,1284X + 0,0172
r = 0,99970
0
0,6
1,2
1,8
2,4
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Razão concentração
Razão área
FIGURA 3.17: Curvas analíticas por padronização interna obtidas para a
injeção em triplicata da mistura padrão dos ácidos chiquímico, cafeico, p-
cumárico e ferúlico nas concentrações 0,00; 3,00; 6,00; 10,00; 15,00 e 20,00
mg/L.
3.5.2.3 LIMITES DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO MÉTODO,
REPETITIVIDADE E PRECISÃO INTERMEDIÁRIA
Pelas razões já mencionadas, não foi possível quantificar os ácidos
chiquímico e cafeico, sendo assim, a tabela a TABELA 3.9 apresenta os
resultados de limites de detecção e de quantificação e repetitividade somente
dos ácidos p-cumárico e ferúlico. Para fins de comparação, a TABELA 3.9
mostra os valores obtidos por padronização externa (citados no item 3.4.3), e
observou-se que a padronização interna forneceu menores valores de LD, LQ e
DPR. Tais resultados são atribuídos a utilização do padrão interno e do padrão
surrogate que corrigem flutuações entre cada injeção e perdas durante o
processo de extração e tratamento das amostras, resultando em menor desvio
69
padrão relativo das análises e, consequentemente, menores valores de LD e
LQ.
TABELA 3.9: Limites de detecção e quantificação do método e repetitividade
obtidos com padronização externa e padronização interna.
Padronização externa Padronização interna
Analito
LD
(mg/L)
LQ
(mg/L)
DPR (%)
LD
(mg/L)
LQ
(mg/L)
DPR (%)
Ácido p-cumárico 0,33 1,11 4,
3
0,09 0,28 1,
4
Ácido ferúlico 0,33 1,12 4,
1
0,04 0,15 0,7
LD = limite de dectecção do método; LQ = limite de quantificação do método; DPR = desvio padrão relativo percentual
Outro estudo realizado foi da precisão intermediária, que consistiu na
análise da amostra Brachiaria brizantha cv. Marandu em quatro dias diferentes.
Na TABELA 3.10 estão dispostos os resultados obtidos de concentração dos
ácidos ferúlico e p-cumárico, recuperação do padrão surrogate, juntamente
com seus valores de desvios padrões relativos.
TABELA 3.10: Concentrações (mg/g peso seco) dos ácidos ferúlico e p-
cumárico e recuperação do padrão surrogate obtidos na análise da amostra
Brachiaria brizantha cv. Marandu em diferentes dias.
Datas
p-CUM
(mg/g peso seco)
FER
(mg/g peso seco)
RPS (%)
7/10/2008 7,62 6,54 94,2
8/10/2008 7,49 6,54 95,0
9/10/2008 7,26 6,46 97,4
15/10/2008 7,00 5,79 96,5
MÉDIA 7,34 6,33 95,2
Sd 0,27 0,36 1,20
DPR 3,
7
5,
8
1,
3
p-CUM = ácido p-cumárico; FER = ácido ferúlico; RPS = recuperação do padrão
surrogate; Sd = desvio padrão; DPR = desvio padrão relativo percentual
Como discutido no tópico 3.2, as soluções padrão dos ácidos ferúlico e
p-cumárico são estáveis por no máximo uma semana. E o mesmo
comportamento foi observado para a amostra (TABELA 3.10). Esta foi extraída,
estocada a 4° C e 1, 2, 3 e 9 dias após a extração, uma alíquota foi diluída em
fase móvel e injetada no HPLC. Observou-se uma diminuição dos valores das
70
concentrações obtidas para os dois ácidos na análise do dia 15/10/2008 (9 dias
após a extração), se comparados com as concentrações obtidas nas análises
realizadas na semana da extração da amostra. Excluindo os valores de
concentração desta análise, obtêm-se desvios padrões relativos iguais a 0,1%
e 1% para os ácidos ferúlico e p-cumárico, respectivamente. Já o ácido m-
cumárico mostrou-se estável no período das análises, apresentando um DPR
de 1%.
3.5.2.4 ESTUDO DE RECUPERAÇÃO DAS AMOSTRAS FORTIFICADAS
Assim como na padronização externa, no estudo da recuperação foram
analisadas, em replicas, amostra, amostra fortificada, branco e branco
fortificado com os ácidos ferúlico, p-cumárico, cafeico e chiquímico em três
níveis de concentração: 5,00; 7,50 e 10,00 mg/L, onde todas as amostras e o
branco foram adicionados o ácido m-cumárico (PS) obtendo-se a concentração
final de 10mg/L.
A TABELA 3.11 mostra os resultados de recuperação obtidos para os
ácidos ferúlico, p-cumárico e m-cumárico. Vale ressaltar que a amostra e o
branco também foram fortificados com os ácidos chiquímico e cafeico, porém,
não foi possível obter resultados para estes compostos conforme discutido no
item 3.4.3.
71
TABELA 3.11: Percentuais médios de recuperação e desvios padrões relativos
alcançados para a amostra e branco fortificados com mistura padrão dos
ácidos em 3 níveis de fortificação (5,0 , 7,5 e 10,0 mg/L) e adicionados de
padrão surrogate na concentração final de 10,0 mg/L.
Analito Amostra
Níveis de
Fortificação (mg/L)
Percentual médio de
recuperação (%)
DPR(%)
5,00 98 1,
6
7,50 98 1,
5
Amostra fortificada
10,00 99 1,
2
Ác. p-cumárico
Branco fortificado 10,00 91 2,
4
5,00 88 2,
1
7,50
89 2,
0
Amostra fortificada
10,00 91 2,
0
Ac. ferúlico
Branco fortificado 10,00 83 1,
5
Amostra 93 2,
6
5,00 92 3,
6
7,50
92 1,
0
Amostra fortificada
10,00 91 1,
1
PS
Branco fortificado 10,00 97 2,
8
DPR = desvio padrão relativo pecentual; PS= padrão surrogate
A FIGURA 3.18 ilustra um gráfico com os percentuais médios de
recuperação para a amostra extraída em ultra-som por 2 h, obtidos por
padronização interna e por padronização externa. O gráfico mostra que a
padronização interna apresentou melhores valores de recuperação,
principalmente para o ácido p-cumárico. Esses valores variaram de 83 a 99%
para padronização interna, sendo o valor médio de 92%, e para padronização
externa, variaram de 82 a 91%, com valor médio de 86%. Onde, a
quantificação por padronização interna apresentou também menores desvios
padrões relativos das análises.
72
0
20
40
60
80
100
p
-
C
U
M
F
E
R
p
-
C
U
M
F
E
R
p
-
C
U
M
F
E
R
p
-
C
U
M
F
E
R
Amostra fortificada
5,00 mg/L
Amostra fortificada
7,50 mg/L
Amostra fortificada
10,00 mg/L
Branco
fortificado
10,00 mg/L
Analitos
Rcuperação (%)
Padronização
interna
Padronização
externa
FIGURA 3.18: Gráfico com os percentuais de recuperação obtidos para a
amostra, amostra fortificada e branco fortificado utilizando padronização interna
e externa.
3.6 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS p-CUMÁRICO E FERÚLICO NAS
AMOSTRAS DE FORRAGEIRAS
Os estudos aplicando padronização interna apresentaram bons
resultados, logo, optou-se por quantificar as amostras aplicando essa técnica.
Desta forma, as concentrações das amostras foram calculadas comparando-se
as razões das áreas (área analito/área padrão surrogate) e as razões das
concentrações (concentração analito/concentração surrogate) entre os padrões
e as amostras, empregando o ácido o-cumárico como padrão interno e o ácido
m-cumárico como padrão surrogate.
As TABELAS 3.12 (repetições R1) e 3.13 (repetições R2) mostram as
concentrações dos ácidos ferúlico e p-cumárico, e seus respectivos desvios
padrões relativos, obtidos para a análise em triplicata das amostras de quatro
espécies de forrageiras. A concentração final expressa em mg/g peso seco foi
calculada de acordo com a massa de amostra extraída (25 mg).
Vale ressaltar, que as repetições R1 e R2 referem-se a amostras de uma
mesma espécie de forrageira, submetidas a mesma condição de adubação e
irrigação, porém plantadas em dois blocos diferentes, podendo haver variações
no solo onde foram cultivadas.
As tabelas mostram também a recuperação média do padrão surrogate
entre as réplicas das amostras e os resultados de digestibilidade in vitro da
matéria seca. Conforme foi descrito no item 2.6, estipulou-se trabalhar com
73
valores entre 75 a 120% de recuperação. Sendo analisados dados das
amostras cuja recuperação do PS estava compreendida no intervalo
estipulado. Desta forma, os valores médios de recuperação do padrão
surrogate (RPS) nas análises variaram entre 75 e 97 %, onde 79 % das
amostras apresentaram valores acima de 80 % de RPS.
Para uma melhor discussão dos dados, também foram construídos
gráficos com as concentrações médias dos ácidos p-cumárico e ferúlico
determinadas para cada repetição das amostras de Braquiária, Florona e
Mombaça (FIGURA 3.19). Esta figura não apresenta gráficos para a amostra
Florakirk, pois foram analisadas somente quatro amostras dessa cultivar.
74
TABELA 3.12: Concentrações e intervalo de confiança (α = 0,05), expressos em mg/g peso seco, dos ácidos ferúlico e p-cumárico
e recuperação do padrão surrogate encontrados na repetição 1 (R1) das amostras Cynodon nlemfuenses cv. Florona , Cynodon
dactylon cv. Florakirk, Panicum maximum cv. Mombaça e Brachiaria brizantha cv. Marandu.
RPS = recuperação do padrão surrogate; DPR = desvio padrão relativo percentual
Concentração (mg/g pseo seco)
Amostra Fração
Dose de N Irrigação
p-cumárico
DPR (%)
ferúlico
DPR (%)
RPS
(%)
DPR (%)
caule 150 com
9,04 ± 0,11
0,5
7,50 ± 0,30
1,
6
83 5,
1
sem
7,62 ± 0,38
2,
0
5,55 ± 0,18
1,
3
88
1,
5
300 com
7,99 ± 0,20
1,
0
5,41 ± 0,25
1,
9
88
5,
7
sem
7,23 ± 0,41
2,
3
4,60 ± 0,12
1,
1
88
3,
4
folha 150 com
6,71 ± 0,28
1,
7
7,69 ± 0,35
1,
8
81
3,
2
sem
6,00 ± 0,39
2,
6
6,49 ± 0,69
4,
2
79
1,
8
300 com
5,98 ± 0,18
1,
2
5,63 ± 0,12
0,8 80
1,
4
Brachiaria brizantha
cv. Marandu
sem
5,45 ± 0,14
1,
0
4,99 ± 0,09
0,7 86
3,
2
caule 150 com
8,71 ± 0,01
0,0
4,58 ± 0,07
0,7 87
5,
4
Cynodon dactylon
cv. Florakirk
folha 300 com
8,75 ± 0,25
1,
1
4,51 ± 0,16
1,
5
84
5,
3
caule 150 sem
6,00 ± 0,25
1,
7
4,17 ± 0,04
0,4 90
1,
1
300 com
6,38 ± 0,20
1,
4
3,89 ± 0,07
0,7 97
2,
0
folha 150 com
4,57 ± 0,15
1,
3
3,96 ± 0,15
1,
5
88
5,
6
sem
6,01 ± 0,07
0,5
5,56 ± 0,03
0,2 82
0,9
Cynodon
nlemfuenses cv.
Florona
300 com
5,82 ± 0,13
0,9
5,22 ± 0,12
0,9 84
4,
0
caule 150 com
6,61 ± 0,29
1,
8
3,77 ± 0,03
0,3 85 2,
0
sem
6,70 ± 0,08
0,5
5,13 ± 0,10
0,8 86
2,
1
300 com
7,74 ± 0,33
1,
7
4,19 ± 0,10
1,
0
93
3,
2
sem
7,85 ± 0,32
1,
6
4,52 ± 0,12
1,
0
85
0,5
folha 150 com
5,11 ± 0,05
0,4
4,33 ± 0,08
0,7 79
2,
6
sem
4,19 ± 0,13
1,
3
4,94 ± 0,14
1,
2
84
4,
9
300 com
4,36 ± 0,14
1,
3
3,35 ± 0,17
2,
0
77
1,
7
Panicum maximum
cv. Mombaça
sem
3,63 ± 0,13
1,
4
3,59 ± 0,20
2,
3
84
3,
1
75
TABELA 3.13: Concentrações e intervalo de confiança (α = 0,05), expressos em mg/g peso seco, dos ácidos ferúlico e p-cumárico
e recuperação do padrão surrogate encontrados na repetição 2 (R2) das amostras Cynodon nlemfuenses cv. Florona , Cynodon
dactylon cv. Florakirk, Panicum maximum cv. Mombaça e Brachiaria brizantha cv. Marandu.
Concentração (mg/g pseo seco)
Amostra Fração Dose de N Irrigação
p-cumárico
DPR (%)
ferúlico
DPR (%)
RPS
(%)
DPR (%)
caule 150 com
7,79 ± 0,39
2,
0
6,40 ± 0,34
2,
1
92 2,
3
sem
7,56 ± 0,14
0,8
5,22 ± 0,19
1,
4
84 5,
8
300 com
8,56 ± 0,03
0,1
5,29 ± 0,16
1,
2
85 5,
8
sem
7,72 ± 0,00
0,0
6,20 ± 0,10
0,6 82 5,
0
folha 150 sem
6,65 ± 0,20
1,
2
6,47 ± 0,22
1,
4
75 1,
4
Brachiaria brizantha
cv. Marandu
300 com
6,01 ± 0,15
1,
0
5,57 ± 0,12
0,8 83 2,
0
caule 150 com
7,89 ± 0,21
1,
1
4,28 ± 0,07
0,7 81 4,
2
Cynodon dactylon cv.
Florakirk
folha 300 com
8,60 ± 0,41
1,
9
4,11 ± 0,21
2,
1
88 0,7
caule 150 sem
5,91 ± 0,10
0,7
5,91 ± 0,10
0,7 84 3,
7
300 com
6,62 ± 0,18
1,
1
4,21 ± 0,12
1,
1
92 2,
0
folha 150 com
4,45 ± 0,10
0,9
4,45 ± 0,28
2,
6
89 5,
6
Cynodon nlemfuenses
cv. Florona
300 com
5,30 ± 0,26
2,
0
4,48 ± 0,23
2,
0
82 1,
8
caule 150 com
7,68 ± 0,13
0,7
4,87 ± 0,20
1,
6
83 4,
9
sem
6,95 ± 0,45
2,
6
4,45 ± 0,08
0,7 89 6,
1
300 com
7,44 ± 0,44
2,
4
3,92 ± 0,09
0,9 91 1,
0
sem
7,57 ± 0,08
0,4
4,44 ± 0,05
0,5 79 7,
4
folha 150 com
4,39 ± 0,32
3,
0
4,42 ± 0,38
3,
4
79 1,
5
sem
3,85 ± 0,17
1,
7
4,24 ± 0,11
1,
1
80 2,
2
300 com
4,89 ± 0,20
1,
6
3,67 ± 0,04
0,4 78 2,
9
Panicum maximum cv.
Mombaça
sem
3,63 ± 0,25
2,
8
3,53 ± 0,24
2,
7
77 1,
9
RPS = recuperação do padrão surrogate; DPR = desvio padrão relativo percentual
76
Braquiária- R1
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
150 N 300 N 150 N 300 N
colmo folha
Concentração, mg/g
p-CUM (mg/g)
FER (mg/g)
Florona - R1
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
sem irr. com irr. com irr. sem irr. com irr.
150 N 300 N 150 N 300 N
colmo folha
Concentração, mg/g
p-CUM (mg/g)
FER (mg/g)
Mombaça - R1
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
150 N 300 N 150 N 300 N
colmo folha
Concentração, mg/g
p-CUM (mg/g)
FER (mg/g)
Braquiária - R2
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
com irr. sem irr. com irr. sem irr. sem irr. com irr.
150 N 300 N 150 N 300 N
colmo folha
Concentração, mg/g
p-CUM (mg/g)
FER (mg/g)
Florona - R2
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
sem irr. com irr. com irr. com irr.
150 N 300 N 150 N 300 N
colmo folha
Concentração, mg/g
p-CUM (mg/g)
FER (mg/g)
Mombaça - R2
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
com
irr.
sem
irr.
150 N 300 N 150 N 300 N
colmo folha
Concentração, mg/g
p-CUM (mg/g)
FER (mg/g)
FIGURA 3.19: Concentrações dos ácidos p-cumárico e ferúlico encontradas nas amostras Brachiaria brizantha cv. Marandu,
Cynodon nlemfuenses cv. Florona e Panicum maximum cv. Mombaça.
77
3.6.1 ANÁLISE DAS AMOSTRAS
As amostras analisadas apresentaram concentrações de ácido p-
cumárico e ferúlico acima do limite de quantificação estabelecido para o
método. As concentrações expressas em mg/g peso seco variaram de 3,63 a
9,04 para ácido p-cumárico e de 3,35 a 7,69 para o ácido ferúlico.
Observa-se nas TABELAS 3.12 e 3.13 que 79% das análises
apresentaram DPR ≤ 2 %, fato relevante devido as várias etapas de tratamento
da amostra e da variabilidade no tamanho de partícula.
3.6.1.1 Brachiaria brizantha cv. Marandu
Nas amostras desta espécie (n=14), as concentrações (TABELA 3.12 e
3.13 e FIGURA 3.19) variaram de 5,45 a 9,04 mg/g peso seco para ácido p-
cumárico e de 4,60 a 7,69 mg/g peso seco para o ácido ferúlico.
Com relação à dose de Nitrogênio, as faixas de concentrações na fração
folha para 150N dos ácidos ferúlico e p-cumárico foram, respectivamente, 6,47
a 7,69 mg/g peso seco e 6,00 a 6,71 mg/g peso seco. E para a dose de 300N,
foram de 5,45 a 6,01 mg/g peso seco para ácido p-cumárico e de 4,99 a 5,63
mg/g peso seco para o ácido ferúlico (TABELA 3.12 e 3.13).
Na fração caule, as amostras tratadas com 150N apresentaram
concentrações (mg/g peso seco) que variaram de 7,56 a 9,04 para ácido p-
cumárico e de 5,22 a 7,50 para o ácido ferúlico. Já as amostras tratadas com
300N, os valores (mg/g peso seco) variaram de 7,23 a 8,56 para ácido p-
cumárico e de 4,60 a 6,20 para o ácido ferúlico (TABELA 3.12 e 3.13).
Nas amostras da fração folha submetidas à irrigação, as concentrações
(mg/g peso seco) variaram de 5,98 a 6,371 para ácido p-cumárico e de 5,57 a
7,69 para o ácido ferúlico. Já nas amostras sem irrigação, os valores (mg/g
peso seco) obtidos variaram de 5,45 a 6,65 para ácido p-cumárico e de 4,99 a
6,49 para o ácido ferúlico (TABELA 3.12 e 3.13).
Para a fração caule, nas amostras submetidas à irrigação, as
concentrações (mg/g peso seco) variaram de 7,79 a 9,04 para ácido p-
cumárico e de 5,29 a 7,50 para o ácido ferúlico. Enquanto que as amostras
sem irrigação apresentaram valores (mg/g peso seco) que variaram de 7,23 a
78
7,72 para ácido p-cumárico e de 4,60 a 6,20 para o ácido ferúlico (TABELA
3.12 e 3.13).
3.6.1.2 Cynodon nlemfuense cv Florona
As amostras de C. nlemfuense cv Florona (n=9) apresentaram
concentrações que variaram de 4,45 a 6,62 mg/g peso seco para ácido p-
cumárico e de 3,89 a 5,91 mg/g peso seco para o ácido ferúlico (TABELA 3.12
e 3.13).
Para a fração caule foram analisadas 3 amostras com irrigação e 300N e
2 amostras sem irrigação e 150N. Onde as concentrações (mg/g peso seco)
das amostras com irrigação e 300N variaram de 5,30 a 6,62 para ácido p-
cumárico e de 3,89 a 4,21 para o ácido ferúlico. Já nas amostras sem irrigação
e 150N, os valores de concentração obtidos foram de 5,91 e 6,00 mg/g peso
seco para ácido p-cumárico e de 5,91 e 4,17 mg/g peso seco para o ácido
ferúlico.
Na fração folha, quatro amostras com irrigação foram analisadas cujas
concentrações (mg/g peso seco) variaram de 4,45 a 5,82 para ácido p-
cumárico e de 3,95 a 5,22 para o ácido ferúlico. Somente uma amostra sem
irrigação foi quantificada, apresentando valores de concentrações para os
ácidos p-cumárico e ferúlico de 6,01 e 5,56 mg/g peso seco, respectivamente.
Com relação à adubação para esta mesma fração, as faixas de
concentrações para a dose de 150N (n = 4) foram de 4,45 a 6,01 mg/g peso
seco para ácido p-cumárico e de 3,96 a 5,56 mg/g peso seco para o ácido
ferúlico. Somente duas amostras adubadas com 300N foram quantificadas,
cujos valores de concentração obtidos foram de 5,30 e 5,82 mg/g peso seco
para ácido p-cumárico e de 4,48 e 5,22 mg/g peso seco para o ácido ferúlico.
3.6.1.3 Panicum maximum cv. Mombaça
Dentre as amostras analisadas para essa espécie (n=16), as
concentrações variaram de 3,63 a 7,85 mg/g peso seco para ácido p-cumárico
e de 3,35 a 5,13 mg/g peso seco para o ácido ferúlico (TABELA 3.12 e 3.13).
79
Nas amostras da fração folha submetidas à irrigação (n = 4), as
concentrações (mg/g peso seco) variaram de 4,36 e 5,11 para ácido p-
cumárico e de 3,35 a 4,42 para o ácido ferúlico. E as amostras sem irrigação (n
= 4) apresentaram valores (mg/g peso seco) que variaram de 3,63 e 4,19 para
ácido p-cumárico e de 3,53 a 4,94 para o ácido ferúlico.
Nesta mesma fração, o ácido p-cumárico apresentou faixas de
concentrações de 3,85 a 5,11 mg/g peso seco para a adubação com 150N (n =
4) e de 3,63 a 4,89 mg/g peso seco para a adubação com 300N (n = 4). E as
faixas de concentrações para o ácido ferúlico foram de 4,24 a 4,94 mg/g peso
seco para a adubação com 150N e de 3,35 a 3,67 mg/g peso seco para a
adubação com 300N.
Na fração caule, os valores de concentrações do ácido p-cumárico
variaram entre 6,61 e 7,74 mg/g peso seco para as amostras com irrigação, e
entre 6,70 e 7,85 mg/g peso seco para as amostras sem irrigação. Enquanto
que para o ácido ferúlico, os valores de concentrações variaram entre 3,77 e
4,87 mg/g peso seco para as amostras com irrigação, e entre 4,44 e 5,13 mg/g
peso seco para as amostras sem irrigação.
Com relação à dose de Nitrogênio, as faixas de concentrações para a
dose de 150N (n = 4) foram de 6,61 a 7,68 mg/g peso seco para ácido p-
cumárico e de 3,77 a 5,13 mg/g peso seco para o ácido ferúlico. Enquanto que
para as amostras adubadas com 300N (n = 4), os valores de concentração
obtidos foram de 7,44 a 7,85 mg/g peso seco para ácido p-cumárico e de 3,92
a 4,52 mg/g peso seco para o ácido ferúlico.
3.6.1.4 Cynodon dactylon cv. Florakirk
Somente quatro amostras desta espécie foram quantificadas, duas para
fração folha e duas para a fração caule, sendo que todas foram submetidas à
irrigação.
As amostras da fração folha foram adubadas com 300N, onde as
concentrações obtidas para o ácido p-cumárico foram 8,75 e 8,60 mg/g peso
seco e para o ácido ferúlico foram 4,51 e 4,11 mg/g peso seco.
80
No caso da fração caule, as amostras foram adubadas com 150N, cujas
concentrações do ácido p-cumárico foram 8,71 e 7,89 mg/g peso seco e do
ácido ferúlico foram 4,58 e 4,28 mg/g peso seco.
3.6.2 CONSIDERAÇÕES
De acordo com as TABELAS 3.12 e 3.13 e os gráficos da FIGURA 3.19,
nota-se, que de uma maneira geral, as amostras possuem maiores
concentrações de ácido p-cumárico em relação ao ácido ferúlico. Tal
comportamento foi observado em 84% das amostras analisadas, onde a
repetição R1 apresentou maior freqüência que a repetição R2.
Com exceção da C. dactylon cv. Florakirk, as concentrações mais altas
dos ácidos p-cumárico e ferúlico, tanto no caule como na folha, ocorreram entre
as amostras de B. brizantha. As concentrações mais baixas de ácido p-
cumárico ocorreram entre as amostras de C. nlemfuense cv Florona para
fração caule e P. maximum cv. Mombaça para a fração folha. O ácido ferúlico
apresentou a mesma tendência de concentração nas duas frações analisadas.
Para este ácido uma ordem decrescente dos níveis de concentração entre as
espécies é dada por: B. brizantha, C. nlemfuense cv Florona, P. maximum cv.
Mombaça (FIGURA 3.19).
3.6.3 COMPARAÇÃO COM OUTROS ESTUDOS
Conforme citado no item 1.4 somente dois trabalhos, referentes a
quantificação de ácidos fenólicos em amostras de forrageiras tropicais
cultivadas no Brasil foram publicados na literatura [11,13]. Ambos empregaram
a cromatografia líquida de alta eficiência com eluição isocrática. Em relação a
outros países, alguns autores também aplicaram a mesma técnica para a
quantificação destes ácidos em amostras de forrageiras de diferentes espécies
e origens.
A TABELA 3.14 compara os resultados obtidos neste trabalho com
valores citados por outros autores referentes a forrageiras cultivadas em solos
no Brasil e em outros países. Vale ressaltar que os estudos apresentam
81
diferenças nos métodos de extração e análise aplicados às amostras, bem
como das espécies e frações das plantas estudas.
TABELA 3.14: Comparação dos níveis de concentração dos ácidos p-cumárico
e ferúlico obtidos em diferentes espécies de forrageiras.
Faixa de concentração
Referência Amostras estudadas
p-CUM FER
[11] Bagaço de cana,
capim-elefante e
mandioca
0,33 a 20,33
µg/mg/MS
0,27 a 5,36
µg/mg/MS
[13] Brachiaria brizantha e
Brachiaria humidicola
6,26 a 13,21
µg/mg/MS
2,52 a 4,43 µg/mg/MS
B
R
A
S
I
L
Presente trabalho
(2008)
Cynodon nlemfuenses
cv. Florona , Cynodon
dactylon cv. Florakirk,
Panicum maximum cv.
Mombaça e Brachiaria
brizantha cv. Marandu
3,63 a 9,04
m
g/g peso seco
3,35 a 7,69
m
g/g peso seco
[46]
Medicago sativa,
Bromus inermis e
Panicum uirgatum
0,04 a 7,03 m
g/g MO
0,06 a 5,62 m
g/g MO
[15] Bromus inermis Leyss,
Dactylis glomerata L. e
Phalaris arundinacea
L.
2,17 a 3,91
g/Kg FDN
2,69 a 6,10
g/Kg FDN
O
U
T
R
O
S
[55] Festuca rubra L.,
Holcus mollis L,
Holcus lanatus L.,
Agrostis setacea
Curtis, Lolium perenne
L. e Bromus inermis
Leyss
1,3 a 6,5 m
g/g FDN
1,9 a 4,9 m
g/g FDN
p-CUM = ácido p-cumárico; FER = ácido ferúlico; MO = matéria orgânica; MS = matéria seca; FDN = fibra de
detergente neutro
O presente trabalho, juntamente com os trabalhos publicados por
Deschamps & Ramos [11] e de Brito et al. [13], quantificaram os mesmos
ácidos em amostras de forrageiras tropicais. Desta maneira, comparando os
três estudos, observa-se que as faixas de concentrações dos ácidos obtidos
em nossos estudos estão em conformidade com os valores relatados por estes
autores. As variações entre as faixas de concentrações destes trabalhos
podem ser relacionadas às diferentes espécies estudadas por cada autor, além
das diferenças de condições de cultivos.
82
Assim como Brito et al.[13], o presente trabalho quantificou os ácidos
ferúlico e p-cumárico no gênero Brachiaria, cujas concentrações (TABELA 3.12
e 3.13 e FIGURA 3.19) variaram de 5,45 a 9,04 mg/g peso seco para ácido p-
cumárico e de 4,60 a 7,69 mg/g peso seco para o ácido ferúlico. Nota-se que
as faixas de concentrações dos ácidos relatadas por Brito et al.[13] (TABELA
3.14) foram mais amplas que as encontradas por nós para o mesmo gênero.
As faixas de concentrações obtidas em nosso estudo, também são
comparáveis aos valores reportados referentes a outros países.
83
4 CONCLUSÃO
No presente trabalho foi desenvolvida e aplicada uma metodologia de
extração, separação e quantificação por HPLC de cinco ácidos fenólicos:
ferúlico, p-cumárico, m-cumárico, o-cumárico e cafeico, além do ácido
chiquímico, que é um ácido orgânico intermediário do processo de formação
dos ácidos fenólicos.
A condição de separação no cromatógrafo foi obtida com eluição
isocrática usando como fase móvel acetonitrila/metanol/solução aquosa H
3
PO
4
pH 2,05 (13:12,5:74,5), fluxo de 1mL/min, tempo de corrida de 15 minutos e
detecção por programação de comprimento de onda.
No processo de extração da amostra, foi proposto um novo método de
extração aplicando o ultra-som, onde a amostra foi extraída a temperatura
ambiente por 2 h. Este método mostrou-se mais rápido e reprodutível se
comparado com a extração a temperatura programada utilizando o banho
ultratermostático, que é o principal método reportado para tratamento de
amostras de forrageiras.
Foram realizados testes para avaliação do método, aplicando
padronização externa e padronização interna, dentre eles avaliação da
resposta linear, limites de detecção e quantificação, repetitividade, precisão
intermediária e recuperação.
A padronização interna, aplicando o ácido m-cumárico como padrão
surrogate e o ácido o-cumárico como padrão interno, apresentou menores
valores de limites de detecção e quantificação, além de maiores valores de
recuperação da amostra fortificada. Sendo assim, as 43 amostras de 4
espécies de forrageiras, folha e caule, foram quantificadas aplicando a
padronização interna, onde todas as amostras analisadas apresentaram
concentrações de ácido p-cumárico e ferúlico acima do limite de quantificação
estabelecido para o método.
Desta forma, de acordo com os resultados apresentados, pode-se
concluir que a metodologia analítica implementada mostrou-se eficiente e
reprodutível para análise dos ácidos ácidos ferúlico e p-cumárico em amostras
de forrageira.
84
5 PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS
O método desenvolvido no presente trabalho mostrou-se eficaz na
extração e quantificação dos ácidos ferúlico e p-cumárico, podendo ser
aplicado em outras amostras de forrageiras, bem como em outras espécies de
vegetais.
Aplicando essa metodologia a outras amostras de forrageiras, pretende-
se correlacionar as concentrações dos ácidos ferúlico e p-cumárico
encontradas nestas amostras com componentes químico-bromatológicos,
digestibilidade e carboidratos estruturais.
85
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