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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
TATIANY OLIVEIRA DE ALENCAR MENEZES
“AVALIAÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE
ÓLEOS ESSENCIAIS E EXTRATOS DE PLANTAS PRESENTES
NA REGIÃO AMAZÔNICA SOBRE CEPA DE Candida albicans”
Belém
2008
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TATIANY OLIVEIRA DE ALENCAR MENEZES
Avaliação in vitro da atividade antifúngica de óleos essenciais e
extratos de plantas presentes na região Amazônica sobre cepa de
Candida albicans
Dissertação apresentada ao Instituto
de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Pará, para
obtenção do título de Mestre em
Odontologia.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Ana Cláudia
Braga Amoras Alves
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Belém
2008
Catalogação-na-Publicação
Biblioteca Prof. Dr. Francisco Gemaque Álvaro
Curso de Odontologia da UFPA
M541 Menezes, Tatiany Oliveira de Alencar
Avaliação in vitro da atividade antifúngica de óleos essenciais e extratos de plantas presentes na
região Amazônica sobre cepa de Candida albicans. / Tatiany Oliveira de Alencar Menezes; orientadora:
Ana Cláudia Braga Amoras Alves.- Belém, 2008.
91 p.: il. 30cm.
Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Instituto de Ciências da Saúde. Universidade Federal
do Pará.
1. Boca- Microbiologia bucal 2. Antimicóticos- Amazônia 3. Candida albicans
CDD 617.632052
18
FOLHA DE APROVAÇÃO
Menezes TOA.
Avaliação in vitro da atividade antifúngica de óleos
essenciais e extratos de plantas presentes na região amazônica sobre cepa
de Candida albicans. [Dissertação de Mestrado]. Belém: Curso de
Odontologia da Universidade Federal do Pará; 2008.
Banca Examinadora
1) Dr. Edvaldo Carlos Brito Loureiro
Titulação__________________________________________________
Julgamento_______________________Assinatura_________________
2) Profa. Dra. Antonia Benedita Rodrigues Vieira
Titulação__________________________________________________
Julgamento________________________Assinatura________________
3) Prof. Dr. José Maria dos Santos Vieira
Titulação__________________________________________________
Julgamento________________________Assinatura________________
19
DEDICO,
A Deus, razão do meu existir;
A meus pais que me proporcionaram os primeiros
ensinamentos;
Ao meu marido Sílvio e meu filho Victor, pelo
amor, dedicação e companheirismo durante todos os
momentos da minha caminhada.
20
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por me conceder força, coragem e, acima de tudo, saúde que
possibilitaram a concretização de mais este sonho.
Ao meu marido Sílvio Menezes e ao meu filho Victor Menezes, pelo amor e
compreensão quando precisei estar ausente. Agradeço a Deus por ter me dado a graça
de tê-los ao meu lado nesta jornada, comemorando as vitórias e auxiliando nas
dificuldades. MUITO OBRIGADA!
Aos meus pais Geraldo e Graça Alencar que sempre estiveram ao meu lado,
torcendo pelo meu sucesso e por mais esta vitória.
Aos meus irmãos Érika e Geraldo Júnior, pelas palavras de incentivo e apoio.
À minha orientadora Prof
a
Dr
a
Ana Cláudia Braga Amoras Alves, pela constante
atenção, apoio e orientação durante a elaboração desta dissertação. Obrigada por
acreditar que eu era capaz, mesmo gestante e depois com um bebezinho, de cumprir
com as minhas obrigações.
À EMBRAPA, nas pessoas do Dr. Sérgio de Mello Alves e Regina Célia Viana
Martins da Silva pelo apoio fundamental na seleção e identificação dos óleos e extratos
utilizados na pesquisa.
21
Ao prof. Dr. José Maria dos Santos Vieira, pela sua cordial atenção e
contribuição durante a realização desta pesquisa, juntamente com sua equipe, em
especial a Farmacêutica - bioquímica Lúcia Carla de Vasconcelos Mendonça,
possibilitaram o acesso ao laboratório de Microbiologia do Departamento de Farmácia
da Universidade Federal do Pará.
Ao Dr. José Antônio Maués, diretor do laboratório Maués, pela valiosa amizade
e oportunidade de desenvolver parte da dissertação em seu laboratório.
À equipe de professores do programa de mestrado, pela dedicação e discussões
interessantes que contribuíram para o meu crescimento profissional.
A todos os colegas do curso de mestrado pela amizade, atenção e aprendizagem.
À funcionária Mara Gorett, pela colaboração e apoio durante os dois anos de
curso.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para realização desta
pesquisa.
22
23
“Só quem tenta o impossível,
alcança o absurdo”
(Sílvio Menezes)
Menezes T.O.A. Avaliação in vitro da atividade antifúngica de óleos essenciais e
extratos de plantas presentes na região Amazônica sobre cepa de Candida albicans.
[Dissertação de Mestrado]. Belém: Curso de Odontologia da Universidade Federal do
Pará; 2008.
RESUMO
A candidíase é uma doença fúngica oportunista causada pela proliferação de
espécies de Candida, principalmente a Candida albicans, sendo a espécie mais
patogênica em humanos. Muitos antifúngicos existentes no mercado apresentam efeitos
colaterais indesejáveis ou podem induzir a resistência fúngica, principalmente em
indivíduos imunodeprimidos. Em odontologia, as pesquisas com produtos naturais têm
aumentado nos últimos anos, devido à busca por novos produtos com maior atividade
farmacológica, com menor toxicidade e mais acessíveis à população. Dentro dessa
perspectiva, o objetivo desta pesquisa foi avaliar in vitro a atividade antifúngica de
óleos e extratos vegetais presentes na região Amazônica e determinar a concentração
inibitória mínima das espécies que apresentaram atividade antifúngica frente à cepa
padrão de Candida albicans (ATCC 90028). A atividade antifúngica dos óleos
essenciais Copaifera multijuga, Carapa guianenses, Piper aduncum e Piper
hispidinervum foi realizada pelo método de difusão em meio sólido utilizando cavidades
em placa “in natura” e em diluições de 32 a 2% para determinação da concentração
inibitória mínima. Os extratos Annona glabra, Azadiractha indica, Bryophyllum
24
calycinum, Eleutherine plicata, Mammea americana, Psidium guajava e Syzygium
aromaticum foram testados nas concentrações de 500mg/mL, 250mg/mL, 125mg/mL e
62,5 mg/mL e a atividade antifúngica foi realizada pelo método de difusão em meio
sólido utilizando discos de papel filtro. Os óleos testados, não apresentaram efeito
antifúngico sobre a cepa de Candida albicans, e dos extratos testados somente os
extratos de Eleutherine plicata, Psidium guajava e Syzygium aromaticum apresentaram
atividade antifúngica com concentração inibitória mínima, respectivamente, de
250mg/mL, 125mg/mL e 62,5mg/mL Diante dos resultados apresentados, os extratos de
Eleutherine plicata, Psidium guajava e Syzygium aromaticum apresentam potencial
efeito inibitório para crescimento de Candida albicans, servindo de guia para a seleção
de plantas com atividades antifúngicas para futuros trabalhos toxicológico e
farmacológico.
Palavras- Chave: Candida albicans- Antifúngicos- Plantas medicinais
25
Menezes TOA. In vitro evaluation of the anti-fungii activity of essential oils and plant
extracts present in the amazon region about the strain of candida albicans. [Dissetação
de mestrado]. Belém: Curso de Odontologia da Universidade Federal do Pará,; 2008.
ABSTRACT
Candidiasis is an opportunistic fungus disease caused by the proliferation of
Candida species, mainly Candida albicans, what seems to be the most pathogenic one
to humans. Several anti-fungii drugs available in the market present undesirable side
effects or develop resistance, mainly in immune-depressed individuals. In dentistry,
researches with natural products have increased in the last years due to the search for
new products with a greater pharmacologic activity, lower toxicity and more
accessibility to the population. Hence, the aim of this paper was to evaluate in vitro the
anti-fungii activity of vegetal oils and extracts present in the Amazon region and to
determine the minimal inhibitory concentration of such species that have presented anti-
fungii activity against the pattern strain of Candida albicans (ATCC 90028). The anti-
fungii activity of the essential oils Copaifera multijuga, Carapa guianenses, Piper
aduncum and Piper hispidinervum was determined through the method of difusion in a
solid means using the cavities in plaque “in natura” and in dilutions of 32 to 2% in order
26
to determine its minimal inhibitory concentration. The extracts Annona glabra,
Azadiractha indica, Bryophyllum calycinum, Eleutherine plicata, Mammea americana,
Psidium guajava and Syzygium aromaticum have been tested under the concentrations
of 500mg/mL, 250mg/mL, 125mg/mL and 62,5 mg/mL and the anti-fungii activity was
determined through the method of difusion in a solid means using discs of filter paper.
The tested oils did not present any anti-fungii effect on the strain of Candida albicans
and, from the extracts tested, only Eleutherine plicata, Psidium guajava and Syzygium
aromaticum have presented anti-fungii activity with minimal inhibitory concentrations,
respectively, 250mg/mL, 125mg/mL and 62,5mg/mL With the results presented, the
extracts of Eleutherine plicata, Psidium guajava and Syzygium aromaticum present a
potential inhibitory effect to the growth of Candida albicans, acting as a guide for the
selection of plants with anti-fungii activities for further papers on a toxicologic and
pharmacologic.
Key-words: Candida albicans- anti-fungii- medicinal plants.
27
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
28
Figura 1- Folhas de Copaífera multijuga (copaíba)
Figura 2- Folhas de Carapa guianensis (andiroba)
Figura 3- Folhas de Piper aduncum (pimenta de macaco)
Figura 4- Folhas de Piper hispidinervum (pimenta longa)
Figura 5- Folhas de Annona glabra (araticum do brejo)
Figura 6- Folhas de Azadiractha indica (nim indiano)
Figura 7- Folhas de Bryophyllum calycinum (pirarucu)
Figura 8- Folhas de Eleutherine plicata (Marupazinho)
Figura 9- Folhas de Mammea americana (abricó)
Figura 10- Folhas de Psidium guajava (goiabeira)
Figura 11- Cravo-da- índia obtido do mercado público (Belém-Pará)
Figura 12- Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans
do óleo de Copaifera multijuga.
Figura 13- Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans
do óleo de Carapa guianensis.
Figura 14- Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans
do óleo de Piper aduncum.
Figura 15- Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans
do óleo de Piper hispidinervum.
Figura 16- Halo de inibição de 12mm do extrato das folhas de Eleutherine
plicata frente à cepa de Candida albicans.
Figura 17- Halo de inibição de 17mm do extrato das folhas de Psidium
guajava frente à cepa de Candida albicans.
Figura 18- Halo de inibição de 18mm do extrato de Syzygium aromaticum
frente à cepa de Candida albicans.
Figura 19- Ausência de halo de inibição do extrato de Annona glabra sobre
a cepa de Candida albicans.
Figura 20- Ausência de halo de inibição do extrato de Azadiractha indica
sobre a cepa de Candida albicans.
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71
29
Figura 21- Ausência de halo de inibição do extrato de Bryophyllum
calycinum sobre a cepa de Candida albicans.
Figura 22- Ausência de halo de inibição do extrato de Mammea americana
sobre a cepa de Candida albicans.
Figura 23- Discos contendo nistatina (controle positivo) com halo de
inibição frente à cepa de Candida albicans
72
72
73
30
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Critérios para aceitação da atividade antifúngica de extratos
brutos de plantas segundo Holets et al. (2002).
Tabela 2- Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de
Copaífera multijuga, Carapa guianensis, Piper aduncum e Piper
hispidinervum contra Candida albicans.
Tabela 3- Atividade antifúngica dos extratos das espécies Annona glabra,
Azadiractha indica, Bryophyllum calycinum, Eleutherine plicata, Mammea
americana, Psidium guajava, Syzygium aromaticum frente à cepa de
Candida albicans
64
65
68
31
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 A Candida NA CAVIDADE ORAL
2.2 PRESENÇA DE CANDIDA SP NAS DIVERSAS ESPECIALIDADES
ODONTOLÓGICAS
2.3 TRATAMENTO DA CANDIDÍASES COM ANTIFÚNGICOS
CONVENCIONAIS
2.5 TRATAMENTO DA CANDIDÍASE COM PLANTAS MEDICINAIS
3 OBJETIVO
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 LOCAL DE ESTUDO
4.2 MATERIAL BOTÂNICO E OBTENÇÃO DA MATÉRIA PRIMA
4.2.1 Óleos essenciais
4.2.2 Extratos vegetais
4.3 ESPÉCIE FÚNGICA
4.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E DA
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA DOS EXTRATOS E ÓLEOS
ESSENCIAIS
4.4.1 Inóculo
4.4.2 Avaliação da atividade antifúngica dos óleos essenciais
4.4.3 Avaliação da atividade antifúngica dos extratos
5 RESULTADOS
6 DISCUSSÃO
7 CONCLUSÃO
15
18
18
20
23
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46
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47
47
47
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59
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63
72
78
79
32
REFERÊNCIAS
1 INTRODUÇÃO
33
A microbiota normal da boca é bastante diversificada, com mais de 700
espécies de microrganismos identificadas, das quais muitas ainda não foram
formalmente descritas. Fazendo parte dessa vasta e complexa ecologia microbiana da
cavidade bucal humana, encontram-se, pelo menos, vinte gêneros e, aproximadamente,
noventa espécies de leveduras isoladas e classificadas, dentre as quais oito espécies do
gênero Candida foram consideradas patogênicas, a saber: Candida albicans, Candida
guilliermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida
parapsilosis, Candida viswanathii e Candida glabrata (MCLNTYRE, 2001).
Dentre as espécies do gênero Candida, a Candida albicans é a mais
frequentemente isolada da cavidade bucal. Entretanto, a presença desse fungo não é
necessariamente indicativa de doença, pois pode ser isolada em cerca de 40% de
indivíduos saudáveis em diversas faixas etárias e, em algumas situações, podem
comportar-se como patógenos oportunistas originando infecções como a candidíase
(CAMPISI; PIZZO; MILICI, 2002).
A Candida albicans é um fungo dimórfico com duas fases de crescimento:
1) a forma de levedura presente na boca e inofensiva à mucosa; 2) forma de hifa que
ocorre quando o epitélio sofre alteração por meio de trauma mecânico, fatores
hormonais ou imunossupressão e invadem o tecido conjuntivo adjacente produzindo
enzimas hidrolíticas, consideradas pelo organismo como fatores patogênicos capazes de
desencadear a candidíase (AL KARAAWI; MANFREDI; WAUGH, 2002).
Portanto, os fatores predisponentes da candidíase bucal podem ser de
origem sistêmica ou local. Dentre os fatores sistêmicos destacam-se as condições do
estado imunológico (gestantes, crianças, idosos, HIV positivos, corticoterapia e drogas
citotóxicas); desordens endócrinas (diabetes, hipotireoidismo) e neoplasias malignas. Já
os fatores locais incluem o uso de próteses dentárias e aparelhos ortodônticos fixos,
34
devido ao trauma mecânico, deficiência na higienização desses aparatos e quantidade e
qualidade de saliva (CAMPAGNOLI, 2004; DUARTE, 2005; WINGETTER;
GUILHERMETTI; SHINOBU, 2007).
No que diz respeito ao tratamento da candidíase, grande quantidade de
fármacos obtidos por meio da síntese orgânica têm sido utilizados no tratamento de
infecções micóticas, como os antissépticos à base tintura de iodo, violeta de genciana,
ácido salicílico e benzóico, derivados sulfamídicos, corantes, quinonas e antifúngicos
poliênicos (nistatina, anfotericina). Além desses, utilizam-se também antifúngicos como
os azóis (cetoconazol, econazol, sulconazol, miconazol, clotrimazol, fluconazol) e
anfotericina B. Porém, as infecções fúngicas são de difícil tratamento, fato relacionado à
elevada resistência da Candida frente à ação de alguns antifúngicos convencionais
(ARAÚJO et al., 2004).
Devido à ocorrência de fatores indesejáveis como o surgimento de
resistência de algumas cepas aos antifúngicos convencionais, principalmente em
indivíduos imunodeprimidos e, à presença de efeitos tóxicos destes, o estudo de plantas
com propriedades terapêuticas, abrangendo aquelas com atividade antimicótica, tem
crescido consideravelmente, não apenas por se constituir em recurso terapêutico
alternativo, mas ainda devido às perspectivas de isolar substâncias que apresentem
eficácia significativa, com menor índice de desvantagens.
Desta forma, um número satisfatório de produtos vegetais da região
Amazônica tem revelado substâncias com atividade antifúngica sobre leveduras de
Candida, podendo atuar seletivamente sobre esses microrganismos (MICHELIN et al.,
2005; ALVES et al., 2006).
35
Neste contexto, é válida a investigação de meios terapêuticos alternativos
com comprovada evidências in vitro e in vivo da atividade antifúngica, as quais poderão
ser aplicadas na prevenção e tratamento das infecções fúngicas com eficácia, custos
baixos e menores efeitos colaterais.
36
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1
A Candida albicans na cavidade oral
A candidíase bucal tem sido reconhecida clinicamente desde os tempos de
Hipócrates. Porém, somente em 1839 foi identificado um organismo condizente com a
Candida albicans e, em 1846, Berg associou a candidíase com o “sapinho”. Essa
infecção, desencadeada pelas espécies de Candida, por muito tempo foi nomeada de
monilíase, mas esse termo deixou de ser utilizado a partir de 1981, quando se adotou o
termo candidose ou candidíase (LYNCH, 1994). Trata-se de uma doença fúngica
oportunista causada pela proliferação de espécies de Candida, principalmente a
Candida albicans, a qual parece ser a espécie mais patogênica em humanos, formando
parte da microbiota anfibiôntica bucal, identificada em aproximadamente de 30 a 50%
em indivíduos sem evidência clínica de infecção (CAMPISI et al., 2002).
O desenvolvimento da candidíase constitui um mecanismo complexo
baseado na relação hospedeiro-parasita. A patogenicidade do fungo é medida por
múltiplos fatores que, apesar de serem determinados geneticamente, são expressos pelos
microrganismos apenas quando existem condições locais e/ou sistêmicas adversas à
ecologia microbiana, podendo variar de hospedeiro para hospedeiro e entre sítios de
colonização de um mesmo indivíduo (HOFLING et al., 2004).
A patogênese, segundo Mcculloug (2005) pode ser resultado de várias
alterações no microambiente bucal, tais como modificações na microbiota promovidas
pela quimioterapia ou pela imunossupressão, além de alterações epiteliais que
37
favorecem a aderência da C. albicans, sua proliferação e interação com outras bactérias
do meio bucal.
Al Karaawi; Manfredi; Waugh (2002), estudando a Candida albicans,
descreveu que a forma presente na cavidade bucal é a leveduriforme, sendo esta uma
forma inofensiva à mucosa. Porém, quando o epitélio sofre alteração por meio de
trauma mecânico, fatores hormonais ou imunossupressão, dentre outros, ocorre uma
invasão no tecido conjuntivo subjacente pelas leveduras, que adquirem a forma de hifas.
Estas produzem enzimas hidrolíticas (proteinases e fosfolipases) que são consideradas,
pelo organismo, como fatores patogênicos, desencadeando, assim, a candidíase.
Clinicamente, a candidíase apresenta-se sob diferentes formas: 1) a
pseudomembranosa, caracterizada pela formação de placa esbranquiçada que, ao ser
removida, deixa uma superfície eritematosa; 2) a forma crônica hiperplásica, que exibe
o aspecto de placa esbranquiçada; 3) a candidíase eritematosa, caracterizada pela
presença de eritema local ou difuso e, 4) a queilite angular, constituída por lesões
eritematosas e/ou ulceradas nas comissuras labiais (MCCULLOUG, 2005).
A candidíase pode ocorrer em indivíduos saudáveis, principalmente em
usuários de próteses dentárias e aparelhos ortodônticos fixos, devido a traumas e
deficiência na higienização, porém os pacientes mais acometidos são os
imunossuprimidos ou imunocomprometidos como pacientes diabéticos, HIV positivos e
os pacientes que realizam corticoterapia (FLAITS, 2000; CAMPAGNOLI et al., 2004;
WINGETTER; GUILHERMETTI; SHINOBU, 2007).
2.2 Presença de Candida spp nas diversas especialidades odontológicas
38
Segundo Soysa et al. (2008) a candidíase associada à estomatite protética
não é de fácil tratamento e, geralmente, recidivas ocorrem após a interrupção da terapia,
ainda que o trauma causado pela prótese tenha sido eliminado por meio de substituição
por nova prótese. Esses problemas representam um desafio na prática estomatológica,
face à sua ocorrência e ao elevado número de resistência fúngica.
Em 2006, Davies; Brailford; Beighton realizaram estudo comparativo entre
indivíduos dentados e usuários de próteses totais e ressaltaram que o uso de próteses
dentais removíveis pode favorecer a colonização da cavidade bucal por leveduras. Os
autores relataram maior frequência de C. albicans nos portadores de próteses (78,3%)
em relação ao grupo controle (36,8%). Os sítios mais densamente colonizados foram: a
língua, palato e mucosa jugal, para os dentados, e as superfícies superior e inferior, nos
portadores de próteses.
Moreira et al. (2001) realizaram um estudo com o objetivo de verificar a
ocorrência de candidíases em usuários de próteses atendidos no ambulatório de
Estomatologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia. Para o
diagnóstico microbiológico, foram realizados o exame direto e a cultura do material
coletado nas lesões e nas próteses dos pacientes. Os resultados obtidos evidenciaram
cultura positiva para Candida sp em 84,8 % dos pacientes e, em 55% dos pacientes com
estomatite protética, o isolamento de Candida foi positivo apenas na cultura da prótese.
Os autores ressaltaram que as possíveis rugosidades superficiais presentes nas próteses
podem favorecer a implantação de leveduras.
A candidíase também tem sido relatada em pacientes com aparelho
ortodôntico, pois a presença de Candida leva a mudanças quantitativa e qualitativa da
39
microbiota anfibiôntica e à suscetibilidade de doenças como cáries e doença
periodontal, aumentando o compromisso do profissional de não só planejar oclusão
adequada, mas, fundamentalmente, de evitar o surgimento de patologia bucal,
orientando o paciente quanto à higiene bucal (ALVIANO, 2004).
Em 2002, Columbano realizou um estudo para avaliar a colonização de
Streptococcus mutans, Lactobacillus spp e Candida albicans na superfície de “brackets”
metálicos e cerâmicos. Para isso, realizaram duas coletas de placa bacteriana antes e
após a colagem. As amostras foram semeadas em meios de cultura específicos para o
isolamento de cada tipo de microrganismos. Baseados nos resultados, o autor concluiu
que o Streptococcus mutans foi a espécie predominante na microbiota sobre a superfície
de “brackets”, sendo sucedida, em ordem decrescente, pelos Lactobacillus spp e
Candida albicans.
Para avaliar a colonização dos mesmos microrganismos no aparelho
ortodôntico fixo, Campbell (2003) realizou a contagem do número de colônias em doze
pacientes, antes e após a colocação do aparelho. Foram coletadas cinco amostras de
saliva total estimulada. Os resultados mostraram que a presença dos acessórios
ortodônticos é um fator de alteração da microbiota bucal, promovendo um aumento
significativo no número de colônias de Streptococcus mutans e Lactobacillus spp e que,
embora não tenha havido um aumento quantitativo na contagem de Candida albicans,
houve uma alteração qualitativa de leveduras do gênero Candida.
Além da associação dos aparatos protéticos e ortodônticos com a
colonização de espécies de Candida, devido ao traumatismo mecânico causado por
esses aparelhos, o que facilita a etiopatogenia da candidíase, essas espécies também tem
sido investigadas como participantes da microbiota envolvida na instalação e progressão
de infecções endodônticas, periodontais e na cárie dental.
40
Rodrigues (2001) e Ogude; Akerede (2005) ressaltaram que microrganismos
estão intimamente ligados à etiologia das lesões perirradiculares e à sua persistência
após tratamento endodôntico. Os microrganismos mais isolados dos canais radiculares
de dentes com lesões persistentes são categorizados oportunistas, como é o caso da
Candida albicans. Assim, microrganismos provenientes do canal radicular podem
invadir os tecidos periapicais e, em determinadas situações, estabelecerem–se
extrarradicularmente, mantendo uma infecção de difícil tratamento.
Em 2007, Delgado avaliou in vitro a viabilidade de Enterococcus faecalis e
Candida albicans nos túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio e
clorexidina gel 2%, pois seus fatores de virulência são responsáveis pelo
desenvolvimento e persistência da periodontite apical de origem endodôntica. Para
tanto, 120 raízes de dentes humanos foram padronizadas e autoclavadas, sendo
posteriormente divididas em 2 grupos (n=60) para contaminação com E. faecalis e C.
albicans por 21 dias e em seguida foram divididas em 8 grupos (n=15) para aplicação
das substâncias antimicrobianas no canal radicular. Os resultados mostraram maior
capacidade de penetração intratubular para E. faecalis quando comparado a C. albicans
e, a medicação que apresentou melhor desempenho foi a clorexidina gel 2%,
justificando seu uso como medicação intracanal.
Para avaliar a presença de leveduras do gênero Candida em bolsa
periodontal de pacientes com periodontite crônica, Martins et al. (2002) realizaram um
estudo com 88 indivíduos. O material coletado foi semeado em ágar sabouraud
dextrose com cloranfenicol e os isolados de Candida identificados através de provas
bioquímicas. Os autores concluíram que leveduras do gênero Candida foram isoladas da
cavidade bucal em 31,82% dos pacientes e a Candida albicans foi a espécie mais
frequentemente encontrada, podendo originar um quadro de superinfecção.
41
Em 2005, Gonçalves ressaltou que, em função da imunossupressão,
microrganismos atípicos, tais como: Staphylococcus epidermidis, Candida albicans,
Enterococcus faecalis e Clastridium difficile podem ser encontrados na microbiota
subgengival. Entretanto, a presença, em altos níveis, de citocinas inflamatórias liberadas
por esses microrganismos, no fluido gengival, pode resultar em maior destruição
periodontal.
No que diz respeito à presença de C. albicans em lesões de cárie, Carvalho
et al. (2007) ressaltaram que a cavidade oral de crianças é colonizada, principalmente,
por C albicans e que a presença desse microrganismo pode, de uma forma pacífica,
favorecer o aparecimento de cáries em crianças. Porém, há necessidade de mais
trabalhos para elucidar cientificamente, visto a etiologia da cárie ser mutifatorial.
Como relatado, a Candida albicans parece participar das diversas infecções
da cavidade bucal. Entretanto, a colonização por Candida na população saudável não
desencadeia uma candidíase grave, como pode ocorrer em indivíduos enfermos,
principalmente quando submetidos a tratamentos prolongados com antibióticos,
corticosteróides, drogas imunossupressoras ou radioterapia, levando a um risco maior
de candidíases sistêmicas a partir de lesões bucais (FLAITZ; BAKER, 2000).
2.3 Tratamento da candidíase com antifúngicos convencionais
A violeta de genciana foi um dos primeiros medicamentos a serem
utilizados para o tratamento da candidíase. Seu emprego na forma tópica mostrou-se
bastante eficaz até o final da década de 40, embora o seu mecanismo de ação ainda não
42
estivesse completamente esclarecido. Na década de 50, foi substituído por agentes
antifúngicos (ANDRADE, 2006).
O grande impulso da terapia antifúngica teve início com a introdução dos
antifúngicos poliênicos como a nistatina utilizada para o tratamento da candidíase
superficial e, principalmente, da anfotericina B utilizada para o tratamento de micoses
profundas. Esses antifúngicos recebem esse nome em razão da habilidade de atuarem
nos meios ácido e básico. Entretanto, novas substâncias sintéticas ativas contra
leveduras vêm merecendo destaque especial, como a 5-flucitosina e os derivados
azólicos, entre os quais o miconazol, clotrimazol, cetoconazol, fluconazol e itrazonazol
(SALLES, 2000; TAVARES, 2001; SOYSA; SAMARANAYKE; ELLEPOLA, 2008).
Segundo Andrade (2006), com a descoberta dos azóis, um grande avanço foi
dado à terapia antimicótica. Esses são considerados menos tóxicos que a anfotericina B,
apresentam largo espectro de atividade e alguns deles podem ser administrados por via
oral para exercer ação sistêmica. São bastante utilizados os imidazólicos de primeira e
de segunda geração, como, respectivamente, o miconazol e cetoconazol, porém o
miconazol, sob a forma injetável, tem uso restrito, devido à toxicidade que acarreta
reações colaterais em diversos graus, sendo recomendado empregar o miconazol na
forma de gel oral.
Como o objetivo de avaliar a eficácia “in vitro” das drogas anfotericina B,
cetoconazol, miconazol e itraconazol frente às cepas de Candida albicans, Costa et al.
(1999) estudaram pacientes com câncer, submetidos ou não à radioterapia, e realizaram
a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e da Concentração Fungicida
Mínima (CFM). Os autores concluíram que a anfotericina B apresentou melhor
atividade antifúngica para cepas de C. albicans de qualquer dos grupos. Contudo,
43
ressaltaram que tratamentos com antifúngicos poliênicos podem causar efeitos tóxicos,
mesmo em doses necessárias para se atingir bons resultados com os antifúngicos.
Em 2005, Branenkamp et al. estudaram leveduras do gênero Candida na
cavidade bucal frente aos antifúngicos fluconazol, 5- fluorocitosina e cetoconazol. Para
isso, selecionaram pacientes com candidíase e compararam com 50 indivíduos- controle
pareados quanto a sexo, idade e condições bucais. As amostras de saliva estimulada
foram semeadas em ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol e incubadas a 37º C por
48 horas. Os resultados mostraram que a prevalência de Candida foi similar entre os
grupos testados e todos os isolados foram sensíveis ao fluconazol.
Portanto, os antifúngicos existentes no mercado, atualmente, possuem
limitações terapêuticas, principalmente quando considerado os efeitos colaterais como a
nefrotoxicidade e a hepatotoxicidade. E o fato de alguns antifúngicos apresentarem ação
fungistática e não fungicida (azóis), pode contribuir para o surgimento de cepas
resistentes (RANG; DALE; RITTER, 1997; ZACCHINO et al., 2003).
Em 2007, Nascimento et al. ressaltou que o crescente aumento dos casos de
candidíase de uma forma geral, acompanhado de altas taxas de morbidade, é,
principalmente, devido a numerosos casos de resistência observados frente às drogas
sintéticas e presença de efeitos tóxicos. Desta forma, muitos estudos têm sido realizados
com ênfase na busca de novos produtos naturais possuidores de atividade antifúngica
atrelada a uma menor toxicidade ao hospedeiro.
44
2.4 Tratamento da candidíase com plantas medicinais
A fitoterapia pode ser historicamente definida como a ciência que trata dos
problemas de saúde, utilizando os vegetais (fitocomplexos), sendo contemporânea ao
início da civilização. As plantas são tradicionalmente usadas por populações de todos os
continentes no controle de doenças e pragas. Algumas das espécies que eles utilizavam
continuam empregadas até os dias de hoje, tais como: Papaver somniferum (papoula),
Scilla maritima (scila), Aloe Vera (babosa) e Ricinus communis (óleo de rícino)
(LAVABRE, 1993).
O comércio de ervas medicinais, no Brasil, começou com os índios e,
atualmente, em qualquer cidade, é possível comprar plantas, pós e ungüentos em
mercados populares. Essa alternativa é utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na
medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos, pelo fato de essas plantas serem
fontes importantes de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais
constituem modelos para a síntese de um grande número de fármacos, revelando nesses
produtos alta diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-química e
biológica (WALL e WANI, 1996)
Na década de 1970, a Organização Mundial de Saúde reconheceu os
benefícios da medicina chinesa (paradigma oriental à base de extratos de plantas), onde
surgem pesquisas e desenvolvimento de medicamentos obtidos de fontes naturais.
Levantamentos realizados no período de 1981 a 2002 pela Annual Reports
of Medicinal Chemistry demonstraram que, dentre 90 novas substâncias com potencial
farmacológico analisadas, 61 delas eram derivadas semi-sintéticas de plantas e eram
oriundas de produtos naturais (SIXEL e PECINALLI, 2002; NEWMAN et al., 2003).
45
Apesar do aumento dos estudos sobre plantas medicinais, somente de 15 a
17% destas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal. Considerando a grande
biodiversidade das regiões Norte e Nordeste brasileiros e o uso popular indiscriminado
de plantas medicinais, esse número poderia ser bem maior (RABELO, 2003).
Dentre os principais produtos de origem vegetal com atividade
antimicrobiana, pode-se referir as proteínas de origem vegetal, óleos essenciais e
extratos. Destes, muitos óleos essenciais e extratos isolados de plantas exercem
atividades biológicas in vitro, o que justifica a caracterização das atividades dessas
plantas (PHONGPAICHIT; SUBHADHIRASAKUL; WATTANAPIROMSAKUL,
2005; LIMA et al., 2006).
2.4.1 Óleos essenciais e Extratos vegetais
Os óleos essenciais (OE) presentes na fragância dos vegetais são
metabólitos secundários de plantas e, de uma forma geral, são misturas complexas de
substâncias voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Apresentam
propriedades físico-químicas, como, por exemplo, a de serem geralmente líquidos de
aparência oleosa à temperatura ambiente, advindo daí a designação de óleo. Sua
principal característica, entretanto, é a volatilidade, diferindo dos óleos fixos, misturas
de substâncias lipídicas, obtidos geralmente de sementes. Outra característica
importante é o aroma agradável e intenso, sendo por isso chamados de essências
(BRUNETON, 1995; SIMÕES; SPITZER, 1999).
Esses produtos são extraídos de plantas por vários processos, sendo o mais
utilizado a destilação por arraste em vapor d’água. As plantas têm um conteúdo de óleo
46
essencial em torno de 0,1 a 0,5% e, raramente, de 1 a 5% do peso verde (CRAVEIRO et
al. 1976; BRUNETON, 1995).
Segundo Souza et al. (2005) e Oliveira et al. (2006), os óleos essenciais
constituem os elementos contidos em muitos órgãos vegetais e estão relacionados com
diversas funções necessárias à sobrevivência vegetal, exercendo papel fundamental na
defesa contra microrganismos. Cientificamente, cerca de 60% dos óleos essenciais
possuem propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas.
LIMA; PASTORE; LIMA (2000) analisaram a atividade antimicrobiana do
óleo essencial presente na casca da castanha de caju sobre microrganismos da cavidade
oral: Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Candida albicans e Candida utilis.
A amostra demonstrou potente atividade do óleo sobre bactérias Gram-positivas, porém
baixa atividade contra os fungos.
Almeida et al. (2006) avaliaram o óleo essencial de Bowdichia virgilioides
Kunt, popularmente conhecida no nordeste brasileiro como “sucupira”, quanto à sua
eficácia sobre cepas de Candida albicans, Candida guilliermondii e Candida
stellatoidea. O estudo foi realizado pelo método de cavidades em meio sólido. Os
autores concluíram que o óleo de Bowdichia virgilioides teve fraca atividade
antimicrobiana contra os microrganismos testados.
No mesmo ano, Nunes et al. avaliaram a atividade antimicrobiana do óleo
essencial de Sida cordifolia L. (malva- branca), encontrada de norte a sul do Brasil,
contra quatro diferentes cepas de bactérias e nove fungos, incluindo Candida albicans,
Candida guilliermondii, Candida stellatoidea, Candida krusei e Candida tropicalis. A
partir do método de difusão em meio sólido com cavidades em placas os autores
47
concluíram que a atividade antimicrobiana do óleo de Sida cordifolia L foi satisfatória
contra as bactérias e os fungos testados.
Quanto aos extratos, esses são produtos obtidos pelo tratamento de
substâncias vegetais, por um solvente apropriado, o qual é evaporado até a consistência
desejada. E o conhecimento sobre o potencial terapêutico dos vegetais tem despertado o
interesse científico, buscando, nesse conhecimento, novos caminhos para o controle e
tratamento de diversas doenças (COUTINHO et al., 2004).
Em 2007, Botelho et al. ressaltaram que espécies vegetais brasileiras são
usualmente utilizadas como antifúngicos e que o Brasil, devido à sua diversidade
vegetal, é um país conhecido mundialmente pela variedade de produtos com ação
medicinal, largamente utilizados nas diversas regiões do país.
Na região Norte do Brasil, tem-se uma das maiores biodiversidades, com
um número satisfatório de óleos essenciais e extratos utilizados, popularmente, no
tratamento de infecções fúngicas. Dentre as diversas espécies, muitas já vêm sendo
estudadas na Universidade Federal do Pará (UFPA), EMBRAPA Amazônia Oriental e
Museu Paraense Emílio Goeldi, e algumas merecem destaque:
a) Copaifera multijuga (copaíba)
A origem do nome copaíba parece vir do tupi cupa-yba, a árvore de
depósito, ou que tem jazida, em alusão clara ao óleo que guarda em seu interior.
Chamado de copaíva ou copahu pelos indígenas (do tupi: Kupa'iwa e Kupa'ü,
respectivamente), e cupay, na Argentina e no Paraguai (guarani), o óleo de copaíba e
suas propriedades medicinais eram bastante difundidos entre os índios latino-
48
americanos à época em que aqui chegaram os primeiros exploradores europeus, no
século XVI. Esse conhecimento, tudo indica, veio da observação do comportamento de
certos animais que, quando feridos, esfregavam-se nos troncos das copaibeiras para
cicatrizarem suas feridas, como observou o holandês Gaspar Barléu
(SALVADOR,
1975; LÉRV, 1993).
Popularmente conhecidas como copaibeiras, as copaíbas são encontradas
facilmente nas Regiões Amazônica e Centro-oeste do Brasil. Entre as espécies mais
abundantes, destacam-se: C. officinalis L. (norte do Amazonas, Roraima, Colombia,
Venezuela e San Salvador), C. guianensis Desf. (Guianas), C. reticulata Ducke, C.
multijuga Hayne (Amazônia), C. confertiflora Bth (Piauí), C. langsdorffii Desf. (Brasil,
Argentina e Paraguay), C. coriacea Mart. (Bahia), C. cearensis Huber ex Ducke (Ceará)
(LEITE, 1993; PERROT, 1994).
Segundo Van den Berg (1992), as copaibeiras são árvores de crescimento
lento, alcançam de 25 a 40 metros de altura, podendo viver até 400 anos. O tronco é
áspero, de coloração escura, medindo de 0,4 a 4 metros de diâmetro. As folhas são
alternadas, pecioladas e penuladas. Os frutos contêm uma semente ovóide envolvida por
um arilo abundante e colorido. As flores são pequenas, apétalas, hermafroditas e
arranjadas em panículos axilares.
Todas as variedades produzem uma resina, chamada óleo de copaíba, obtida
por incisão no seu tronco. Por isso, a árvore é conhecida também como "pau-de-óleo",
"árvore milagrosa" e "árvore do óleo diesel”. Esse óleo já foi muito exportado durante a
época da borracha e ainda hoje é vendido para a França, Alemanha e Estados Unidos.
Em 1984, a exportação do óleo de copaíba alcançou 120 toneladas e a produção é
estimada em 200 toneladas ao ano (PAIVA et al., 2003; MORAES et al., 2004).
49
O óleo de copaíba é um líquido transparente, terapêutico, viscoso, de sabor
amargo, com uma cor entre amarelo até marrom claro. Pelas propriedades químicas e
medicinais, o óleo é bastante procurado nos mercados regionais, nacionais e
internacionais e é amplamente utilizado na medicina popular, principalmente na região
Norte e Nordeste, devido a suas propriedades medicinais como antiinflamatório,
antibacteriano, anestésico, tratamento de infecções fúngicas, infecções pulmonares e
bronquite crônica (BRANDÃO et al., 2006).
De acordo com Veiga e Pinto (2002), a disseminação da indústria de
produtos naturais em todo mundo e no Brasil, nos últimos anos, levou à comercialização
extensiva do óleo de copaíba pelos laboratórios farmacêuticos. Das pequenas cidades do
interior da Amazônia, os óleos de copaíba são transportados para as cidades de Manaus
e Belém, de onde são exportados para a Europa e América do Norte ou enviados para a
região sudeste, para serem vendidos pelas farmácias que comercializam produtos
naturais.
Uma das áreas em que se vem pesquisando intensamente a utilização do
óleo de copaíba, atualmente, é a odontológica. Bandeira et al (1999) estudaram a
composição do óleo essencial, separado da resina do óleo de Copaifera multijuga e sua
compatibilidade biológica em molares de rato, associados ao hidróxido de cálcio, como
veículo, e às atividades bactericida e bacteriostática das duas frações frente ao óleo
bruto. Os estudos de atividade antibacteriana mostraram maiores atividades bactericida
e bacteriostática do óleo de Copaifera multijuga, frente à Streptococcus mutans,
enquanto o óleo essencial apresentou melhor ação bactericida e a resina apresentou-se
apenas bacteriostática.
Em 2007, Santos et al. avaliaram a atividade do óleo de copaíba obtido de
diferentes espécies frente a diversas bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e contra
50
os fungos Candida albicans, Candida tropicalis e Candida parapsilosis. Os resultados
mostraram atividade pronunciada contra as bactérias Gram–positivas, porém o óleo de
copaíba não exibiu atividade contra as bactérias Gram-negativas e nem contra os fungos
testados.
b) Carapa guianensis Aubl. (andiroba)
A carapa guianensis é uma árvore de grande porte, que chega a atingir 55
metros de altura. A casca é grossa, tem sabor amargo e se desprende facilmente em
grandes placas. As flores têm cor creme e o fruto é uma cápsula que se abre quando cai
no chão, liberando quatro a seis sementes. De agosto a outubro, floresce na Amazônia e
frutifica, de janeiro a maio (FERRAZ, 2002 e COSTA et al., 2007).
Dentre as espécies nativas da Amazônia, a madeira da andiroba é uma das
mais estudadas, sendo considerada nobre e sucedânea do mogno. O óleo contido na
amêndoa da andiroba é amarelo-claro e extremamente amargo, quando submetido a
temperatura inferior a 25
0
C, solidifica-se, adquirindo consistência parecida com a da
vaselina. É utilizado na preparação de sabão e de cosméticos, entretanto, alguns grupos
indígenas e populações tradicionais utilizam o óleo como repelente de insetos e no
tratamento de artrite, distensões musculares, alterações dos tecidos cutâneos e como
antibacteriano (CLAY, 2000).
Segundo Martins (1989), na Amazônia, o óleo de andiroba tem emprego
muito amplo; os aborígenes costumam usá-lo sobre a pele, buscando afugentar
mosquitos durante a execução de trabalhos na mata, além de aplicá-lo sobre ferimentos
externos e em colutórios, em casos de amigdalite, faringite e afecções da boca.
51
Para avaliar a eficácia de plantas da ilha do Marajó, região Norte do Brasil,
Hammer e Johns (1993) incluíram, no estudo, quatro plantas medicinais (Carapa
guianensis, Elephanropus scaber, Piper umbellatum, Stachytarpheta cayenensis)
utilizadas pelos moradores da região e anotaram o modo de preparo e o uso medicinal.
No laboratório, os extratos das plantas foram submetidos a análises e estabelecidos seus
componentes químicos. Os autores concluíram que as quatro plantas estudadas
apresentaram eficácia medicinal.
Em 2007, Packer e Luz avaliaram a eficácia antifúngica e antibacteriana dos
óleos de andiroba, copaíba, alecrim, alho e melaleuca frente às cepas de Staphylococcus
aureus (ATCC 6538), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 9027) e Candida albicans (ATCC 10231). O método de escolha foi o de ágar
com orifício modificado. Os melhores resultados foram obtidos com os óleos de
melaleuca e alecrim que apresentaram atividade bacteriostática e fungistática para as
quatro cepas em questão, enquanto que os óleos de andiroba, copaíba e alho não
apresentaram atividade frente aos microrganismos testados.
c) Piper aduncum (pimenta de macaco) e Piper hispidinervum (pimenta
longa)
O gênero Piper é um dos maiores da família Piperaceae, com pelo menos
1000 espécies distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais. As espécies do gênero
Piper (Piperaceae) são amplamente aplicadas na medicina popular em função das
propriedades microbianas exibidas por seus constituintes (WADT; EHRINGHAUS;
KAGEYAMA, 2004).
52
A coleção de germoplasma de Piper da Embrapa Acre conta com duas
espécies: P. hispidinervum (Pimenta longa) e P. aduncum (Pimenta de macaco). Dentre
essas espécies, a pimenta longa é nativa da Amazônia Brasileira, pioneira de ocorrência
em áreas do Estado do Acre, sendo encontrada, espontaneamente, em áreas do tipo
climático. No seu habitat natural, vegeta em solos de baixa fertilidade, por isso é
indicada para cultivo em áreas modificadas da Amazônia (BARROS e OLIVEIRA,
1997).
Na década de 70, um grupo de pesquisadores, trabalhando com óleos
essenciais no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), identificou a
pimenta longa (Piper hispidinervum) como grande produtora de óleo essencial rico em
safrol (87 a 97%), um fenil éter que ocorre como componente volátil em algumas
espécies de plantas. Essa substância é utilizada como precursora na fabricação de
inseticidas biodegradáveis, de cosméticos e de produtos farmacêuticos e apresenta
excelente atividade antifúngica (LUNZ et al., 1996; ESTRELA et al., 2006).
A outra espécie chamada de Piper aduncum (pimenta- de- macaco) é uma
planta nativa da região Amazônica, com alto teor de óleo essencial 2,5 a 4%, rico em
Dilapiol e vem sendo testado, em estudos fitopatológicos, com excelente atividade
fungicida, acaricida, bactericida e larvicida, com a vantagem de ser um produto
biodegradável, preservar o meio ambiente e proteção à saúde do consumidor (BASTOS
e ALBUQUERQUE, 2004; CASTRO et al., 2006).
É uma planta de ocorrência espontânea em pastagens e margens de estradas
e matas. O chá ou infusão alcoólica de suas folhas, raízes e frutos são amplamente
utilizados na medicina popular como tônico e antiespasmódico e o dilapiol, um dos
principais constituintes do óleo essencial extraído de suas folhas, apresenta uma
excelente atividade antibacteriana e antifúngica (BASTOS e BENCHIMOL, 2006).
53
No mesmo ano, Souza et al. realizaram um estudo para avaliar in vitro o
efeito fungistático ou fungitóxico dos óleos essenciais de Piper hispidinervum (pimenta
longa), Piper aduncum (pimenta de macaco), Carapa guianensis (andiroba) e
Copaifera sp (copaíba) sobre o fungo Colletotrichum gloeosporioides (agente causal da
antracnose do côco). Os óleos foram utilizados na concentração de 100, 200, 500, 700 e
1000 ppm em meio BDA (batata, dextrose e ágar). Os autores concluíram que o óleo de
P. hispidinervum foi o mais eficiente, inibindo o crescimento micelial em torno de 80%,
seguido dos óleos de P. aduncum e de copaíba que, na concentração de 1000 ppm,
inibiram o crescimento em 67% e 49,65%, respectivamente. O óleo de andiroba não
teve efeito na inibição do fungo.
d) Annona glabra L. (Araticum do brejo)
O araticunzeiro do brejo (Annona glabra) é uma espécie nativa da região
tropical com ampla distribuição geográfica. No Brasil, ocorre, espontaneamente, desde a
Amazônia até o Estado de Santa Catarina, ocupando, com maior freqüência, áreas
periodicamente inundadas. Os frutos, embora comestíveis, não têm tanto valor
comercial, no entanto, o araticunzeiro tem recebido a atenção de pesquisadores por ser
utilizado na medicina popular como inseticida e antimicrobiano (CARVALHO, 2001).
e) Azadirachta indica A. Juss (Nim indiano)
O Nim indiano, também conhecido por Melia indica Brandis, é uma planta
pertencente à família Meliacea. Apresenta folhas verde-escuras, compostas e
54
imparipenadas, com freqüência aglomeradas nos extremos dos ramos, simples e sem
estípulas. As flores são de coloração branca, aromáticas, reunidas em inflorescências
densas, com estames crescentes formando um tubo, pentâmeras e hermafroditas. O fruto
é uma baga ovalada, com 1,5 a 2 cm de comprimento e, quando maduro, apresenta
polpa amarelada e casca branca dura, contendo um óleo marrom no interior de uma
semente ou, raramente, em duas (ARAÚJO et al., 2000).
A planta é originária de clima tropical, com diâmetro entre 25 e 30 cm. A
madeira, com densidade variando de 0,56 a 0,85g/cmm
3
, apresenta uma coloração
avermelhada, dura e resistente ao ataque de cupins, desenvolve-se bem em temperaturas
acima de 20
o
C, em solos bem drenados, não ácidos, com altitudes abaixo de 700m. Do
Nim preparam-se extratos aquosos ou alcoólicos das folhas, das sementes e da casca e
na prensagem das sementes obtém-se o óleo. Todos esses produtos apresentam maior ou
menor ação repelente e antifúngica, sendo biodegradáveis (SAIRAM, 2000).
Vários produtos antifúngicos e repelentes a insetos são extraídos do óleo de
nim. O princípio ativo nesses produtos é o “azadiractin”, substância usada como
ingrediente na preparação de vários produtos farmacêuticos, tais como: ungüentos,
cosméticos, cremes, loções, tônico capilar e creme dental devido apresentar
propriedades antivirais e antibacterianas. É também, importante no controle de pragas,
pois tem largo espectro de ação, não tem ação fitotóxica, é praticamente atóxica ao
homem e não agride a natureza (BISWAS et al., 1995).
Segundo Subapriya e Nagini (2005), a Azadirachta indica, tem atraído o
interesse do mundo inteiro. Mais de 140 componentes têm sido isolados de diferentes
partes do Nim e todas as partes, como caule, folhas, frutos e raízes vêm sendo
tradicionalmente utilizadas para o tratamento de inflamações, febre, infecções, doenças
da pele e infecções odontológicas.
55
Biswas et al. (2002) ressaltaram que o extrato da folha de Nim, o óleo de
Nim e as sementes são efetivas contra certos fungos incluindo: Trichophyton,
Epidermophyton, Microsporum, Trichosporon, Geotricum e Candida. A alta atividade
antimicótica com extratos de diferentes partes do Nim tem sido muito reportada na
literatura.
Gualtieri et al. (2004) realizaram um estudo com o objetivo de avaliar a
atividade antimicrobiana do extrato de Azadirachta indica sobre vários
microorganismos como: S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853, C. krusei
ATCC 6258 e C. albicans ATCC 90028. Os autores concluíram que o extrato, na
concentração de 0,02g/ml, apresentou ação antifúngica e antibacteriana contra S. aureus
ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853, C. krusei ATCC 6258, porém não
apresentou atividade contra cepa de C. albicans ATCC 90028.
Darães et al. (2005) verificaram a suscetibilidade de C. albicans aos extratos
alcoólico e aquoso de Azadirarachta indica (nim), usada há séculos na Índia, na
manutenção da saúde bucal. O método utilizado foi o de difusão em ágar e suspensões
de C. albicans (ATCC 18804 e selvagem) foram cultivadas a 24h, semeadas em àgar
sabouraud e discos estéreis embebidos em 15µl de cada extrato foram colocados sobre o
ágar. Para o controle, foram utilizados nistatina, álcool e água destilada estéril. Os
autores concluíram que as amostras de nim testadas não apresentaram eficácia na
inibição do crescimento in vitro de C. albicans, em comparação com os controles
nistatina e etanol.
56
f) Bryophyllum calycinum Salisb. (pirarucu)
Dentro da família Crassulaceae, apenas um gênero, exótico, tem uma
espécie muito usada na medicina popular que é o Bryophyllum e, deste gênero pertence
uma espécie ornamental e bastante aproveitada na medicina caseira: Bryophyllum
calycinum Salisb. (VAN DEN BERG, 1982).
A planta Bryophyllum calycinum é conhecida popularmente como pirarucu,
folha da fortuna, saião, São Raimundo, erva- da -costa, folha–da-costa, folha- grossa e
orelha -de–monge, e pertencente à família Crassulaceae e ao gênero Bryophyllum (VAN
DEN BERG, 1982).
É uma planta nativa da África tropical e largamente disseminada no Brasil,
com até 50 cm de altura, de ramos herbáceos cobertos de penugem, ereto, com haste
suculenta e bastante enrijecida. Possui folhas vivíparas opostas, pinadas, com um a
cinco folíolos muito suculentos, com ápice arredondado, base arredondada, nervação
imersa, brilhosas e com aspecto sedoso. As suas flores de coloração rósea apresentam-se
em cachos no ápice dos ramos, as folhas são ovais, arredondadas na base e serrilhadas
nas bordas. Os frutos são constituídos de pequenas cápsulas contendo sementes
(LORENZI e MATOS, 2002).
Segundo Almeida et al (2000), as folhas frescas de pirarucu são amplamente
utilizadas na medicina popular para o tratamento de feridas, contusões, queimaduras,
doenças do trato respiratório e picadas de insetos. São descritas também as seguintes
propriedades medicinais: analgésica, antialérgica, antiartrítica, antibacteriana,
antidiabética, antifúngica, antisséptica, bactericida e diurética (NASSIS; HAEBISCH;
GIESBRECHT, 1992).
57
g) Eleutherine plicata Herb. (Marupazinho)
A Eleutherine plicata, é uma planta herbácea, rizomática e bulbosa, de
bulbos avermelhados. As folhas são simples, inteiras, plissadas longitudinalmente, de
cerca de 25 cm de comprimento, com nervuras longitudinais, inflorescência em
panículas de flores rosas, no ápice de um escapo, que se abrem apenas ao por do sol e
pertence à família das Iridaceae (VIEIRA, 1992).
O princípio ativo da E. plicata é a sapogenina esteroidal e é comumente
encontrada na Região Amazônica, pelo nome de Marupazinho, sendo também
encontrada, em outras localidades, com os nomes de Coquinho, Marupa-ú e Marupari
(ALBUQUERQUE, 1989).
A Eleutherine plicata e várias outras plantas, que podem ser encontradas
com freqüência, na região Amazônica, vem, ultimamente, sendo estudada de forma
mais abrangente, para que se tenha um maior embasamento científico a respeito de sua
utilização pelas populações ribeirinhas e que, muitas vezes, podem trazer avanços no
campo das terapias que utilizam fitomedicamentos para o combate de doenças. Pois não
há dados na literatura científica que validem este ou qualquer outro uso tradicional da
planta (SCHULTES, 1990).
Segundo Mors (2000), a E. plicata é amplamente utilizada na medicina
popular em quase todo o país, principalmente na região Amazônica. É empregada
contra diarréia, histeria e vermes intestinais, porém, não há comprovação científica de
sua eficácia e nem da sua preparação.
58
Os indígenas das Guaianas empregam seus bulbos para o preparo de
emplastro em aplicações externas contra contusões e ferimentos, visando acelerar a
cicatrização, já o suco é usado como medicação interna contra epilepsia. O extrato é
potencialmente útil no tratamento de doenças coronárias por suas propriedades
antimicrobianas (GONÇALVES, 2005).
h) Mammea americana L (Abricó)
O gênero Mammea pertencente à família Cluseaceae e a espécie Mammea
americana é encontrada na América tropical e Caribe onde é conhecida também como
Abricó, Abricó-de-são-domingos, Abricó-do-pará e Abricoteiro (FENNER, 2006).
O abricó é produto de uma árvore muito frondosa e grande, de forma
piramidal, podendo atingir até 15 metros de altura. As folhas são pecioladas, verde-
escuras, nernicosas, medindo até 14 cm de comprimento. As flores são brancas e
perfumadas. É cultivada em toda parte do Brasil, especialmente no Estado do Pará. O
fruto, muito gostoso, apresenta uma massa cor de abóbora, podendo ir à mesa no estado
natural. As sementes possuem propriedades vermífugas (MOURÃO, 2000).
i) Psidium guajava var. (goiabeira)
A espécie Psidium guajava pertence à família Myrtaceae. É conhecida, na
região Amazônica, como Goiabeira, Araçá- goiaba, Araçá–guaiaba, Araçá–guaçú,
Guaiaba, Guaiava, Araçá-vaçu no Rio Grande do Sul e Goiabeira Branca em Minas
59
Gerais. Apresenta excelentes condições para exploração em escala comercial, em
função de seus frutos atingirem bons preços no mercado e serem muito apreciados pelas
suas características, tanto para o consumo em mesa como para a fabricação de produtos
industrializados (LOZOYA et al., 2002).
Segundo Martinez (1997), a Psidium guajava é uma árvore de pequeno
porte, galhada, com caule tortuoso. Trata-se de um arbusto de quase 7,0 metros de
altura, apresentando folhas aromáticas opostas, de textura coriácea de 4-8 cm de
comprimento por 3-6 cm de largura. Apresenta flores alvas, vistosas, solitárias e frutos
de tamanho e forma variada, com baga amarela de polpa abundante. Há duas variedades
mais comuns, a de frutos com polpa vermelha (P. guajava var. pomífera) e a de polpa
branca (P. guajava var. pyrifera).
Na região Amazônica, as folhas de P. guajava são empregadas
popularmente no tratamento caseiro de desordens gastrintestinais, em bochechos no
tratamento de inflamações da boca e da garganta (MATOS, 2002). Adicionalmente
comprovaram atividade antimicrobiana (JAIARJ et al., 1999), sedativa (LUTTERODT,
1988) e antioxidante (MARTIN et al.,1998; WANG, 2000; NADERI et al., 2003).
Martinez et al. (1997) estudaram a atividade antimicrobiana do extrato
fluido a 40% de Psidium guajava frente a cepas de microrganismos Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e a levedura
Candida albicans. Os resultados mostraram uma excelente atividade do extrato contra
as bactérias testadas, porém não apresentaram atividade antifúngica.
Em 2003, Pessini et al. avaliaram a atividade antimicrobiana e antifúngica
de extratos de plantas utilizadas na medicina popular. Dos 13 extratos avaliados contra
cepas de S. aureus, B. subtilis, E. coli, P aeruginosa, C.albicans, C. krusei, C.
60
parapsilosis e C. tropicalis, o extrato de Psidium guajava (goiabeira) foi o que
apresentou melhor atividade antifúngica e atividade moderada em bactérias Gram-
positivas.
Ruiz (2006) avaliou a atividade antifúngica de doze extratos de plantas
medicinais contra cepas de Candida albicans (ATCC 10231), isolados clínicos e contra
o fungo filamentoso Aspergillus niger (ATCC 16404). Dos extratos avaliados, a
Psidium guajava apresentou atividade significativa contra Candida albicans com halo
de inibição > 18mm, porém não mostrou atividade contra isolados clínicos de Candida
albicans e nem contra Aspergillus niger.
A eficácia do extrato de Psidium guajava (goiabeira) também foi avaliada,
in vitro, sobre leveduras do gênero Candida da cavidade oral. Para avaliação
antimicrobiana, foi utilizado o método de difusão em meio sólido. Diante dos
resultados, os autores concluíram que o extrato da folha da Psidium guajava apresentou
atividade antifúngica bastante satisfatória sobre as leveduras de C. albicans, C.
tropicalis, C. stelatoidea e C. krusei, podendo ser utilizado topicamente como meio
alternativo no tratamento da candidíase oral (ALVES et al., 2006).
Em 2007, Nair e Chanda avaliaram a atividade antimicrobiana in vitro de
três extratos de Psidium guajava (metanol, acetona e dimetilformaldeído) contra 91
cepas patogênicas de importância clínica. Os três extratos foram igualmente ativos
contra bactérias Gram-negativas, porém, o extrato preparado com acetona foi altamente
eficaz contra bactérias Gram-positivas e cepas de fungos, sendo ativo em 74,72% do
total das 91 cepas estudadas.
61
j) Syzygium aromaticum L. (cravo-da-índia)
O cravo-da-índia é originário do Sudeste da África, região das Ilhas
Moluscas, e chegou ao Brasil com os colonizadores portugueses. Séculos atrás, era tão
disputado, que países europeus, como Holanda e França, costumavam entrar em
disputas comerciais por sua posse. No começo do século XIX, plantas de cravo da índia
foram levadas a países tropicais, dentre eles, o Brasil que, atualmente, desenvolve
muitos trabalhos devido a suas propriedades populares de disfarçar o mau hálito, ter
ação antisséptica, aliviar os gases, combater as náuseas, estimular o aparelho digestivo e
reduzir a dor de dente (SCHIPER, 1999; FECURY, 2006).
Segundo Delespaul et al. (2000) e Raina et al. (2001), o cravo-da-índia é a
gema seca, sendo usado principalmente como condimento na culinária, devido ao seu
marcante aroma e sabor, conferido por um composto fenólico volátil, o eugenol. Nas
folhas, ele chega a representar aproximadamente 95% do óleo extraído e no cravo 70 a
85%. Na odontologia, o eugenol é muito utilizado como componente de seladores e
outros produtos antissépticos de higiene bucal, tendo comprovado efeito bactericida,
nematicida, anti-viral e fungicida.
O eugenol é um fenol e se encontra largamente distribuído no reino vegetal,
apresentando efeitos antiinflamatório, cicatrizante e analgésico. É um composto
comumente utilizado como antimicrobiano e antifúngico, com amplo espectro de ação
contra Aspergillus niger, Sacchacomyces cerevisae, Candida albicans, Streptococus
mutans, Mycoderma sp. Lactobacillus acidophilus e Bacilus cereus, entre outras
espécies de fungos, bactérias e leveduras (BOAVENTURA et al., 2006).
62
Nascimento et al. (2000) avaliaram atividade antifúngica e antimicrobiana
do cravo da índia e fitofármacos frente a microorganismos sensíveis e resistentes a
antibióticos. O método utilizado foi o de difusão em ágar e utilizadas 14 amostras de
microrganismos, entre eles, a Candida albicans. Os resultados da utilização de extratos
em casos de resistência a antibióticos mostraram sinergismo. Porém, os autores
ressaltaram que ainda há necessidade de trabalhos mais detalhados sobre o uso
terapêutico das plantas, principalmente sobre microrganismos resistentes.
Salvaterra et al. (2005) avaliaram a ação antimicrobiana, in vitro, de
produtos naturais como: sálvia, romã, agrião, gengibre, própolis, copaíba e óleo do
cravo-da-índia, para uso rotineiro na microbiota oral em comparação com o Periogard.
O óleo do cravo da índia, o própolis e o gengibre, quando testados puros, resultaram em
halo de inibição de 100%, já o óleo de copaíba e o agrião não apresentaram ação
inibitória. Os autores concluíram que o extrato de própolis e o óleo essencial do cravo
da índia apresentaram boa ação inibitória in vitro da microbiota oral, comparável à do
produto Periogard.
Amaral e Bara (2005) relataram que produtos naturais com ação antiséptica,
antiinflamatória e/ou antimicrobiana têm sido alternativamente utilizados. Baseados
nesses achados, os autores realizaram um estudo com o objetivo de avaliar a eficácia
antifúngica do óleo essencial do cravo da índia sobre sementes de arroz, soja, milho e
feijão acometidos por doenças fúngicas. Os resultados mostraram que o cravo-da-índia
demonstrou 100% de inibição sobre o crescimento dos fungos, indicando que os
princípios ativos do cravo possuem o mesmo mecanismo de ação do antifúngico
convencional atuando sobre a parede celular do fungo.
No mesmo ano, Taguchi et al. realizaram um estudo para avaliar o efeito do
cravo-da-índia administrado por duas diferentes vias em camundongos infectados com
63
Candida albicans. Quando a preparação do cravo foi administrada no interior da
cavidade oral dos camundongos, os sintomas orais foram melhorando e o número de
células viáveis de Candida foram diminuindo. Entretanto, quando a administração foi
intragástrica, os sintomas orais não diminuíram. Esses achados demonstram que a
ingestão oral do cravo pode suprimir o crescimento de C albicans no trato alimentar,
incluindo a cavidade oral.
Hem et al. (2007) avaliaram a eficácia e toxicidade, in vitro, do eugenol
contra C. albicans, devido aos níveis significativos de resistências do microrganismo
frente os agentes antifúngicos convencionais. Investigaram os efeitos do eugenol na
formação do biofilme, aderência das células de C. albicans e na formação subseqüente
do biofilme e células de C. albicans. Os resultados indicaram que o eugenol inibiu o
crescimento de células de C. albicans e, em eritrócitos humanos, mostrou baixa
atividade hemolítica. Os autores concluíram que o eugenol apresenta potente atividade,
in vitro, contra C. albicans com baixa citotoxicidade, permitindo concluir que tem
excelente aplicação terapêutica em infecções associadas com Candida.
64
3 OBJETIVO
• Avaliar in vitro a atividade antifúngica de óleos essenciais e extratos,
presentes na região Amazônica, sobre a cepa padrão de Candida
albicans.
• Determinar a concentração inibitória mínima dos óleos e extratos que
apresentarem atividade antifúngica.
• Realizar um screening para servir como guia na seleção de plantas com
atividade antifúngica para futuros trabalhos toxicológicos e
farmacológicos.
65
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de estudo
A pesquisa experimental foi realizada no Laboratório de Microbiologia do
Faculdade de Farmácia do Instituto de Ciências da Universidade Federal do Pará
(UFPA).
4.2 Material botânico e obtenção da matéria prima
A seleção das espécies vegetais incluídas no estudo foi baseada em
pesquisas que vêm sendo desenvolvidas no Museu Paraense Emílio Goeldi, no
Laboratório de Fitopatologia da EMBRAPA Amazônia Oriental e no Laboratório de
Microbiologia da Universidade Federal do Pará (UFPA), as quais foram previamente
selecionadas de acordo com a utilização e crença da população da região Norte
brasileira.
Os óleos essenciais das espécies estudadas foram identificados e extraídos
no Laboratório de Agroindústria da EMBRABA Amazônia Oriental, pela técnica de
Arraste a vapor (SOARES; SOUSA; PIRES, 1988).
Os extratos foram preparados segundo a metodologia utilizada pelo
Laboratório de Fitoquímica do Departamento de Farmácia (BARBOSA; PINTO, 2004).
4.2.1. Óleos essenciais
Os óleos que tiveram sua atividade antifúngica avaliada foram provenientes
de quatro espécies vegetais presentes na região Amazônica, dentre eles:
66
• Copaifera multijuga (copaíba)
As folhas de copaíba foram coletadas no plantio experimental da
EMBRAPA Amazônia Oriental de Santarém (oeste do Pará) e identificadas no
Laboratório de Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário
IAN da EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 1).
Figura 1- Folhas de Copafiera multijuga (copaíba). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da
EMBRAPA- Amazônia Oriental.
67
• Carapa guianensis (andiroba)
As folhas de andiroba foram coletadas no plantio experimental da
EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará e identificadas no Laboratório de
Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário IAN da
EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 2).
Figura 2- Folhas de Carapa guianensis (andiroba). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da
EMBRAPA- Amazônia Oriental.
68
• Piper aduncum (Pimenta de macaco)
As folhas da pimenta de macaco foram coletadas no plantio experimental
da EMBRAPA Amazônia Oriental de Tomé-Açú e identificadas no Laboratório de
Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário IAN da
EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 3).
Figura 3- Folhas de Piper aduncum (Pimenta de macaco). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica
da EMBRAPA- Amazônia Oriental.
69
• Piper hispidinervum (Pimenta longa)
As folhas da pimenta longa foram coletadas no plantio experimental da
EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará e identificadas no Laboratório de
Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário IAN da
EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 4).
Figura 4- Folhas de Piper hispidinervum (Pimenta longa). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica
da EMBRAPA- Amazônia Oriental.
70
4.2.2. Extratos vegetais
Os extratos que tiveram sua atividade antifúngica avaliada foram
provenientes de sete espécies vegetais presentes na região Amazônica, dentre elas:
• Annona glabra (Araticum do brejo)
As folhas de Annona glabra foram coletadas no plantio experimental da
EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará e identificadas no Laboratório de
Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário IAN da
EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 5).
Figura 5- Folhas de Annona glabra (Araticum do brejo). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da
EMBRAPA- Amazônia Oriental.
71
• Azadirachta indica (Nim)
As folhas de Azadirachta indica foram coletadas no plantio experimental da
EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará e identificadas no Laboratório de
Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário IAN de
EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 6).
Figura 6- Folhas de Azadirachta indica (Nim indiano). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da
EMBRAPA- Amazônia Oriental.
72
• Bryophyllum calycinum (Pirarucu)
As folhas de Bryophyllum calycinum (Pirarucu) foram coletadas no plantio
experimental da EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará e identificadas no
Laboratório de Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário
IAN da EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 7).
Figura 7- Folhas de Bryophyllum calycinum (Pirarucu). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da
EMBRAPA- Amazônia Oriental.
73
• Eleutherine plicata (Marupazinho)
O bulbo de marupazinho foi coletado no Horto do EMAÚS localizado no
bairro do Benguí em Belém do Pará. A identificação foi realizada no Departamento de
Botânica do Museu Paraense Emílio Goeldi (Figura 8).
Figura 8- Folhas de Eleutherine plicata (Marupazinho). Exsicata preparada e identificada no
Departamento de Botânica do Museu Paraense Emílio Goeldi.
74
• Mammea americana (abricó)
As folhas de Mammea americana (abricó) foram coletadas no plantio
experimental da EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará e identificadas no
Laboratório de Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário
IAN da EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 9).
Figura 9- Folhas de Mammea americana (abricó). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da
EMBRAPA- Amazônia Oriental.
75
• Psidium guajava (goiabeira)
As folhas de Psidium guajava (goiabeira) foram coletadas no plantio
experimental da EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará e identificadas no
Laboratório de Botânica desta Instituição, sendo uma exsicata depositada no Herbário
IAN da EMBRAPA Amazônia Oriental (Figura 10).
Figura 10- Folhas de Psidium guajava (goiabeira). Exsicata doada pelo Laboratório de Botânica da
EMBRAPA- Amazônia Oriental.
76
• Syzygium aromaticum (cravo-da-índia)
O cravo foi obtido no mercado público da cidade de Belém Estado do Pará.
A identificação e extração foram realizadas no laboratório de Agroindústria da
EMBRAPA Amazônia Oriental de Belém- Pará (Figura 11).
Figura 11 – Cravo-da-índia obtido no mercado público (Belém- Pará).
77
4.3 Espécie fúngica
Foi utilizada como microrganismo teste, a cepa de Candida albicans ATCC
90028, responsável por várias formas de infecções fúngicas em humanos e
recomendada como cepa padrão para testes de susceptibilidade antifúngica. Foi cedida
pela disciplina de Microbiologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba-
UNICAMP e mantida em meio de cultura específico para crescimento de levedura
(Batata, Dextrose e Ágar – BDA- MERCK).
4.4 Determinação da atividade antifúngica e da concentração inibitória
mínima dos óleos essenciais e extratos vegetais.
4.4.1. Inóculo
Foram realizados repiques de Candida albicans em caldo Brain Heart
Infusion- MERCK (BHI), incubado a 36
o
C, durante 18 horas; em seguida, foi
observada, microscopicamente, a morfologia celular em esfregaços das culturas coradas
pelo método de Gram, para confirmação de cultura pura.
O inoculo foi preparado utilizando 100µl de suspensão fúngica na
concentração de 10
6
UFC/mL, padronizado de acordo com a turbidez 0,5 da escala de
McFarland e confirmado em espectofotômetro com densidade óptica de 530nm (LIMA,
2006), em placas de Petri (15x 90mm), contendo 20mL de meio de cultura específico
(Batata, dextrose e ágar). O inóculo foi disperso, com uma alça de Drigalski, por toda a
dimensão da placa.
78
4.4.2 Avaliação da atividade antifúngica dos óleos essenciais
Os óleos foram testados “in natura” (100%) e em diluições de 32%, 16%,
8%, 4% e 2% para determinação da concentração inibitória mínima (CIM), de acordo
com Lima et al. (2006).
A solução a 32% foi preparada com 1,6 mL de óleo + 0,04 mL de Tween 80
(agente emulsificador) e água destilada esterilizada suficiente para completar 5mL. Em
seguida, essa emulsão foi homogeneizada em agitador Vortex (FANEM), por 15
minutos e as demais concentrações foram obtidas mediante diluições seriadas.
A atividade antifúngica foi realizada pelo método de difusão em meio sólido
utilizando cavidades em placa (LIMA et al., 2006). Foram confeccionadas cavidades no
meio de cultura previamente semeado com suspensão de Candida albicans, com auxílio
de cânulas de vidro estéreis (6mm de diâmetro), onde foram inoculados 50µl de cada
diluição dos óleos testados. O sistema foi incubado a 36
0
C, por 48 horas, em estufa
bacteriológica. Foram realizadas duas leituras do halo de inibição; a primeira, após 24
horas de incubação e a segunda, após 48 horas. Todo o experimento foi realizado em
duplicata.
Após, foi considerado o CIM a concentração do óleo capaz de desenvolver
um halo de inibição do crescimento fúngico maior ou igual a 8 mm de diâmetro, medido
por uma régua milimetrada (PAREKH e CHANDA, 2007; SANTOS et al., 2007).
Para o controle da viabilidade da cepa padrão de Candida albicans 90028,
foi utilizada uma solução contendo apenas Tween 80 (negativo) e, como controle
positivo, foi utilizada solução de Nistatina, um antifúngico convencional, na
concentração de 50µg/mL.
79
4.4.3 Avaliação da atividade antifúngica dos extratos
Os extratos liofilizados foram testados nas concentrações de 500mg/mL,
250mg/mL, 125mg/mL e 62,5 mg/mL dissolvidos em Dimetil-Sulfóxido (DMSO).
A avaliação da atividade antifúngica foi realizada pelo método de difusão
em meio sólido, utilizando discos de papel filtro (Whartman - tipo 3) de 6 mm de
diâmetro, impregnados com 10 µl de cada concentração dos extratos das plantas
testadas (SANTOS et al., 2007). Em seguida, os discos foram colocados em placas de
Petri, previamente inoculadas com 100µl de suspensão fúngica, em meio de cultura
específico (BDA).
O sistema foi incubado a 36
0
C, por 48 horas, em estufa bacteriológica.
Foram realizadas duas leituras do halo de inibição; a primeira, após 24 horas de
incubação e a segunda, após 48 horas. Todo o experimento foi realizado em duplicata.
Foi considerado o halo de inibição igual ou acima de 8mm de diâmetro, de
acordo com os critérios de Parekh e Chanda (2007). Para o controle da viabiliadade da
cepa padrão de Candida albicans 90028, foi utilizada uma solução contendo apenas
DMSO (controle negativo) e, como controle positivo, foi utilizada solução de Nistatina,
um antifúngico convencional, na concentração de 50µg/mL.
Os extratos testados que apresentaram atividade antifúngica (halo igual ou
acima de 8mm) foram submetidos à determinação da concentração inibitória mínima
(CIM) pela técnica de microdiluição em caldo (CLSI, 2003; BERTINI et al., 2005;
LIMA et al., 2006; SANTOS et al., 2007).
80
Os testes foram realizados em caldo Muller Hinton contidos em placa
“Sensitive microtier” 96 poços e analisados pelo leitor de ELISA (Enzime Linked
Immunosorbent Assay). Para esse teste, uma alíquota de 10µl de cada extrato nas
concentrações de 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 15,63mg/mL foi depositada em cada poço
da placa contendo caldo Muller Hinton e suspensão de microrganismo padronizada para
um volume final de 200µL de cada poço. Foi realizado controle dos extratos, do caldo
Muller Hinton, do microrganismo, do DMSO e da nistatina.
As placas foram incubadas a 36
o
C por 24 horas e a leitura foi realizada em
no comprimento de onda de 650nm em leitor de ELISA (LIMA et al., 2006). Foi
considerada como CIM a menor concentração do extrato capaz de inibir o crescimento
antifúngico, segundo os critérios sugeridos por Holetz et al. (2002) (Tabela 1).
Tabela 1- Critérios para aceitação da atividade antifúngica de extratos brutos de plantas,
segundo Holets et al. (2002).
CIM* DO EXTRATO RESULTADO
_____________________________________________________
Abaixo de 100 mg/mL Boa atividade antifúngica
Entre 101 e 500 mg/mL Moderada atividade antifúngica
Entre 501 e 1000 mg/mL Fraca atividade antifúngica
Acima de 1001 mg/mL Inativo
____________________________________________________________
* Concentração inibitória mínima
81
5 RESULTADOS
5.1 Atividade antifúngica dos óleos essenciais
Os óleos testados de Copaífera multijuga (figura 12), Carapa guianensis
(figura 13), Piper aduncum (figura 14) e Piper hispidinervum (figura 15) não
apresentaram efeito antifúngico em nenhuma das concentrações testadas frente à cepa
de Candida albicans ATCC 90028 (Tabela 2).
Tabela 2- Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Copaífera
multijuga, Carapa guianensis, Piper aduncum e Piper hispidinervum sobre cepa
de Candida albicans.
_______________________________________________________________
ESPÉCIE VEGETAL NOME POPULAR CONCENTRAÇÕES ZONA DE INIBIÇÃO
DE CRESCIMENTO
(mm)
________________________________________________________________
Copaífera multijuga Copaíba 100% NI
32% NI
16% NI
8% NI
4% NI
2% NI
Carapa guianensis Andiroba 100% NI
32% NI
16% NI
8% NI
4% NI
2% NI
Piper aduncum Pimenta de macaco 100% NI
32% NI
16% NI
8% NI
4% NI
2% NI
Piper hispidinrvum
Pimenta longa 100% NI
32% NI
16% NI
8% NI
4% NI
2% NI
NI = não ocorreu inibição do crescimento do fungo.
82
100%
32%
Figura 12 - Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans do óleo de Copaífera
multijuga (copaíba) nas duas maiores concentrações (100% e 32%).
100%
32%
Figura 13- Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans do óleo de Carapa
guianensis (andiroba) nas duas maiores concentrações (100% e 32%).
83
100% 100%
32 %
Figura 14- Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans do óleo de Piper
aduncum (Pimenta de macaco) nas duas maiores concentrações (100% e 32%).
100%
32%
Figura 15- Ausência de halo de inibição frente à cepa de Candida albicans do óleo de Piper
hispidinervum (pimenta longa) nas duas maiores concentrações (100% e 32%).
84
5.2 Atividade antifúngica dos extratos
Dos sete extratos testados três apresentaram atividade antifúngica frente à
levedura Candida albicans (Tabela 3)
Tabela 3- Atividade antifúngica dos extratos das espécies Annona glabra,
Azadiractha indica, Bryophyllum calycinum, Eleutherine plicata, Mammea
americana, Psidium guajava, Syzygium aromaticum frente à cepa de Candida
albicans.
________________________________________________________________
ESPÉCIE VEGETAL NOME POPULAR ZONA DE INIBIÇÃO
DE CRESCIMENTO
(mm)
________________________________________________________________
Annona glabra Araticum do brejo NI
*
Azadiractha indica Nim indiano NI
Bryophyllum calycinum Pirarucu NI
Eleutherine plicata Marupazinho 12mm
Mammea americana Abricó NI
Psidium guajava Goiabeira 17mm
Syzygium aromaticum Cravo-da-índia 18mm
NI= não ocorreu inibição do crescimento do fungo.
O extrato das folhas de Eleutherine plicata foi capaz de inibir o crescimento
da Candida albicans com a formação de um halo de inibição de 12mm. Na
determinação da concentração inibitória mínima (CIM), o extrato foi ativo até a
concentração de 250mg/mL (Figura 16).
85
FIGURA 16- Halo de inibição de 12 mm do extrato das folhas de Eleutherine plicata (Marupazinho)
frente à cepa de Candida albicans.
Na avaliação da atividade antifúngica com o extrato das folhas de Psidium
guajava foi observada a formação de um halo de inibição de 17 mm frente à cepa
padrão de Candida albicans. Na determinação da concentração inibitória mínima
(CIM), o extrato foi ativo até a concentração de 125mg/mL frente ao fungo testado
(Figura 17).
FIGURA 17- Halo de inibição de 17 mm das folhas de Psidium guajava (goiabeira) .frente à cepa
padrão de Candida albicans.
86
Com o extrato do Syzygium aromaticum, houve a formação de halo de
inibição de 18 mm frente à cepa de Candida albicans (Figura 18) e a concentração
inibitória mínima (CIM) foi de 62,5 mg/mL sobre o fungo testado.
Figura 18- Halo de inibição de 18 mm frente à cepa de Candida albicans do extrato de Syzygium
aromaticum (cravo-da-índia).
Os demais extratos (Annona glabra, Azadiractha indica, Bryophyllum
calycinum e Mammea americana) não apresentaram atividade contra a Candida
albicans, mesmo na maior concentração 500mg/mL, uma vez que, em concentrações
mais altas, as soluções dos extratos não permitiram uma absorção total nos discos
(Figuras 19, 20, 21 e 22).
87
Figura 19- Ausência de halo de inibição do extrato de Annona glabra (abricó) sobre a cepa
padrão de Candida albicans.
Figura 20- Ausência de halo de inibição do extrato de Azadiractha indica (Nim) sobre a cepa
padrão de Candida albicans.
88
Figura 21- Ausência de halo de inibição do extrato de Bryophyllum calycinum (pirarucu) sobre a
cepa padrão de Candida albicans
.
Figura 22- Ausência de halo de inibição do extrato de Mammea americana (araticum do brejo)
sobre a cepa padrão de Candida albicans.
89
Discos com nistatina (antifúngico convencional) foram utilizados como
controle positivo. Houve formação de um halo de inibição de 12mm. Para avaliar a
viabilidade do DMSO (dimetil-sulfóxido), foram utilizados discos contendo apenas
DMSO, sendo considerado o controle negativo (Figura 23).
N= nistatina DMSO= dimetil-sulfóxido
Figura 23- Discos contendo nistatina (controle positivo) com halo de inibição de 12mm frente à
cepa de Candida albicans e discos contendo DMSO (controle negativo) com ausência de halo de
inibição
.
90
6 DISCUSSÃO
Um recurso promissor para a descoberta de novos agentes antifúngicos com
menores efeitos colaterais são as plantas, usadas na medicina popular, para tratamento
de infecções fúngicas, onde os óleos e extratos obtidos há muito tempo têm servido de
base para diversas aplicações terapêuticas.
Vários estudos têm apontado excelentes propriedades terapêuticas dos óleos
essenciais. Entretanto, nos ensaios sobre a atividade antifúngica, in vitro, dos óleos, é
possível verificar uma variedade de metodologias propostas, o que torna a comparação
com esses estudos problemática.
Neste estudo, observou-se que os métodos comumente utilizados para
avaliar a ação de óleos e extratos vegetais são o de difusão em disco, difusão utilizando
cavidades feitas no ágar e diluição em caldo para determinação da concentração
inibitória mínima- CIM. Porém, segundo Nascimento et al. (2007), esses métodos são
padronizados pela CLSI (National Committee for Clinical Laboratory Standards) e
desenvolvido para analisar agentes antimicrobianos, como os antibióticos.
Foi constatado, durante a pesquisa que, nos testes para avaliar a atividade
antifúngica de óleos essenciais, a metodologia proposta pelo CLSI não poderia, de fato,
ser seguida à risca, corroborando com as citações de Nascimento et al. (2007), devido
às propriedades químicas que estes apresentam, como: serem voláteis, insolúveis em
água, viscosos e complexos, resultando em difusão irregular dos componentes lipófilos
dos óleos e, consequentemente, concentrações desiguais do óleo no ágar.
Visando melhorar a qualidade dos procedimentos com óleos essenciais,
tornou-se comum a utilização de solventes, detergentes ou emulsificadores, a exemplo
91
do Tween 20, Tween 80, DMSO (dimetil-sulfóxido) e etanol, para facilitar a dispersão
dos mesmos no meio de cultura (BRUNI et al., 2004; BAYDAR et al., 2004). Baseado
nesses achados, optou-se por uma metodologia utilizando cavidades feitas no ágar e
difusão em meio sólido, com o auxílio de um agente emulsificador (Tween 80), o qual
apresentou melhores resultados, concordando com LIMA et al., 2006 e NUNES et al.,
2006.
É lícito ressaltar que, devido à falta de padronização e dificuldade de
difusão dos óleos essenciais, estes sejam menos estudados do que os extratos vegetais,
apesar de ser constatado, cientificamente, que cerca de 60% dos óleos possuem
propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (OLIVEIRA et al.
2006).
No presente estudo, nenhum dos óleos testados apresentaram atividade
antifúngica frente à cepa de Candida albicans, porém fatores importantes como a
técnica utilizada, o meio de crescimento, o microrganismo, o material botânico,
colheita, técnica de extração e variações genéticas de uma mesma espécie vegetal,
podem alterar o teor de princípio ativo presente no óleo. Não invalidando, dessa forma,
novos estudos de cunho farmacológico e microbiológico dessas espécies vegetais.
O óleo de copaíba, possui um princípio ativo chamado de beta carofileno,
que tem ação germicida (VEIGA e PINTO, 2002) e, portanto, deveria provocar um
resultado positivo (produção de halo de inibição), pois a maior ou menor atividade
biológica dos óleos essenciais tem se mostrado dependente da composição de seus
constituintes químicos como; citral, pineno, cineol, cariofileno, elemento furanodieno,
inoneno, eugenol, eucaliptol, carvacrol e outros, que são responsáveis pelas
propriedades antissépticas, antibacterianas, antifúngicas e antiparasitárias (CRAVEIRO;
ALENCAR; CABANES, 1981; SOUZA et al., 2005).
92
Entretanto, a ausência de atividade antifúngica do óleo de copaíba está de
acordo com os resultados encontrados por Santos et al. (2007), que avaliaram a eficácia
do óleo de copaíba frente a diversas bactérias e à Candida albicans. Os resultados
mostraram uma excelente atividade do óleo sobre as bactérias, porém não exibiram
atividade contra o fungo.
Resultados similares foram registrados por Packer e Luz (2007) que,
analisando a eficácia antibacteriana e antifúngica de vários óleos essenciais, inclusive o
de andiroba e copaíba, não observaram atividade frente aos microrganismos testados.
Com relação à atividade antifúngica dos óleos de Piper aduncum e Piper
hispidinervum, não houve formação de halo de inibição frente à cepa de Candida
albicans. Entretanto, não foi encontrada, na literatura consultada, qualquer referência
quanto à atividade antifúngica dessas espécies frente aos microrganismos presentes na
cavidade oral, apesar de vários estudos demonstrarem excelente potencial dessas
espécies como fungicidas (LUNZ et al., 1996; BASTOS et al., 2004; ESTRELA et al.,
2006; BASTOS e BENCHIMOL, 2006; SOUZA et al., 2006).
No que diz respeito à avaliação dos extratos, não existe um consenso sobre
o nível aceitável, quando comparado com os antimicrobianos padrões (OLIVEIRA et
al., 2006). O critério adotado neste estudo foi sugerido por Holetz et al. (2002), baseado
nos resultados de CIM.
O extrato das folhas de Annona glabra (araticum do brejo) não apresentou
atividade antifúngica frente à cepa testada e, embora essa espécie tenha recebido a
atenção de pesquisadores por ser utilizada na medicina popular como inseticida e
antimicrobiano (CARVALHO; NASCIMENTO; MULLER, 2001), não foram
93
encontradas na literatura consultada, pesquisas avaliando o efeito da Annona glabra
contra microrganismos de um modo geral e em especial contra Candida albicans.
O extrato de Azadiractha indica, apesar de apresentar um princípio ativo
chamado de azadiractin, substância muito utilizada em cosméticos, cremes, loções e
creme dental, devido apresentar propriedades anti - virais e anti- bacterianas (BISWAS,
2005) e ser relatado por vários autores como um bom fungicida (SAIRAM, 2000;
ARAÚJO et al., 2000; SUBAPRIYA e NAGINI, 2005; FECURY et al., 2006), no
presente estudo, não apresentou efeito antifúngico contra Candida albicans.
Esses achados estão de acordo com os encontrados no estudo de Gualtieri et
al. (2004), que avaliaram o efeito antimicrobiano do extrato de Azadiractha indica sobre
vários microrganismos, inclusive sobre a cepa padrão de Candida albicans (90028) e
não apresentou atividade e no estudo de Darães et al. (2005), que também utilizaram
cepa padrão não apresentaram eficácia na inibição do crescimento, in vitro, de Candida
albicans.
Na verificação da atividade antifúngica do extrato de Bryophyllum
calycinum (pirarucu), não foi observada a formação de halo de inibição sobre a cepa de
Candida albicans. Entretanto, Nassis et al. (1992); Da Silva et al. (1999) e Sousa et al.
(2005) relataram várias propriedades medicinais do Bryophyllum calycinum, como:
analgésica, antibacteriana, antifúngica e antisséptica, o que justifica a continuação de
estudos microbiológicos, com outras cepas, na tentativa de obter resultados que possam
contribuir para busca de novos fitoterápicos antimicrobianos.
Na avaliação antifúngica do extrato das folhas de Eleutherine plicata
(marupazinho), foi observada a formação de um halo de inibição de 12mm, com uma
94
concentração inibitória mínima de 250 mg/mL, sendo considerado de acordo com o
critério adotado (HOLETZ et al. 2002), um extrato com moderada atividade antifúngica.
Esses achados corroboram com as citações feitas por (ALBUQUERQUE,
1989; VIEIRA, 1992; MORS, 2000 e GONÇALVES, 2005) que ressaltaram a ampla
utilização dessa planta na medicina popular, em quase todo o país, principalmente na
região Amazônica, sem comprovação científica de sua eficácia.
O extrato das folhas da Mammea americana (abricó) não apresentou
eficácia antifúngica sobre a cepa de Candida albicans. Entretanto, em 2000, Mourão
relatou excelente propriedade vermífuga do abricó, além de outras propriedades citadas
por Araújo (2007), como para o tratamento de afecções cutâneas, o que justifica a
continuação do estudo dessa planta com outros microrganismos.
Na avaliação antifúngica do extrato de Psidium guajava (goiabeira), foi
constatada uma boa atividade antifúngica frente à cepa de Candida albicans, pois exibiu
um halo de inibição de 17 mm e uma concentração inibitória mínima de 125 mg/mL.
Esse resultado está de acordo com os achados por Pessini (2003), Ruiz (2006), Alves et
al. (2006) e Nair e Chanda (2007), que avaliaram a atividade do extrato de Psidium
guajava sobre cepas padrões de Candida albicans e descorda dos achados por Martinez
et al. (1997) em que o extrato não apresentou atividade antifúngica.
Mesmo sendo diferentes cepas, concentrações, metodologia e origem das
plantas utilizadas nos trabalhos acima citados, os resultados são aceitáveis, devido à
falta de padronização dos testes de suscetibilidade antifúngica.
O extrato de Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) que apresentou um halo
de inibição de 18mm frente à cepa de Candida albicans e uma concentração inibitória
95
mínima (CIM) de 62,5 mg/mL, sendo considerado um extrato com boa atividade
antifúngica, segundo os critérios adotados na pesquisa.
A inibição do crescimento apresentou-se homogênea, de acordo com o grau
de concentração do extrato da planta, havendo uma diminuição proporcional dos halos à
medida que a concentração do extrato foi diminuindo.
Vários trabalhos (NASCIMENTO et al. 2000; SALVATERRA et al. 2005;
TAGUCHI et al. 2005) e, mais recentemente, o de Hem et al. (2007), que avaliaram a
eficácia antifúngica do Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) frente à cepa de Candida
albicans, encontraram resultados similares reforçando a boa atividade antifúngica desse
extrato.
Sabe-se que o principal princípio ativo do Syzygium aromaticum é o
eugenol, que é um composto fenólico muito utilizado na odontologia como componente
de seladores e outros produtos antissépticos de higiene bucal (DELESPAUL et al. 2000;
RAINA et al., 2001). Entretanto, em 2007, Hem et al., preocupados com a toxicidade do
eugenol na cavidade oral, realizaram um estudo, in vitro, para investigar os efeitos na
formação do biofilme. Concluíram que o eugenol apresenta potente atividade, in vitro,
contra Candida albicans e com baixa citotoxicidade.
Há necessidade de busca de novos produtos com efeito antifúngico devido
ao crescente aparecimento de cepas resistentes aos antifúngicos convencionais e,
principalmente, devido aos indesejáveis efeitos colaterais. Os resultados aqui
apresentados indicam um potencial efeito antifúngico dos extratos de Eleutherine
plicata (Marupazinho), Psidium guajava (goiabeira) e Syzygium aromaticum (cravo-da-
índia).
96
7 CONCLUSÃO
Com base nos resultados encontrados, conclui-se que:
1. Os óleos essenciais de Copaifera multijuga, Carapa guianensis, Piper
aduncum e Piper hispidinervum não apresentaram atividade antifúngica
sobre a levedura de Candida albicans.
2. O extrato de Syzygium aromaticum (cravo-da-índia) apresentou uma boa
atividade antifúngica frente à cepa padrão de Candida albicans.
3. O extrato de Psidium guajava (goiabeira) e de Eleutherine plicata
(marupazinho) apresentaram moderada atividade antifúngica.
4. Os demais extratos testados (Annona glabra, Azadiractha indica,
Bryophyllum calycinum e Mammea americana) não apresentaram atividade
antifúngica frente à cepa padrão de Candida albicans.
Dessa forma, os dados obtidos nesta pesquisa se mostram promissores e podem
servir como guia na seleção de plantas com atividades antifúngicas para futuros
trabalhos para determinados efeitos toxicológicos e farmacológicos, na perspectiva de
uma possível aplicação terapêutica desses produtos.
97
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