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FÁBIO SANTOS MATOS
PLASTICIDADE ANATÔMICA E FISIOLÓGICA DE FOLHAS DE Coffea arabica L. EM
RESPOSTA À IRRADIÂNCIA
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Vegetal, para obtenção
do título de Magister Scientiae
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FÁBIO SANTOS MATOS
PLASTICIDADE ANATÔMICA E FISIOLÓGICA DE FOLHAS DE Coffea arabica L.
EM RESPOSTA À IRRADIÂNCIA
APROVADA: 20 de junho de 2008
_________________________________ __________________________
Profª. Marília Contin Ventrella Prof. Raimundo Santos Barros
(Co-Orientadora) (Co-Orientador)
__________________________________ __________________________
Prof. Marco Aurélio Pedron e Silva Dr. Rogério Ferreira Ribas
_________________________________________
Prof. Fábio Murilo DaMatta
(Orientador)
Dissertação apresentada à
Universidade Federal de Viçosa,
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fisiologia Vegetal, para obtenção
do título de Magister Scientiae
ads:
i
A Osório Matos e Alaide Santos, meus pais, pelo exemplo de vida e dedicação;
A Fabrício, Pedro Henrique e Júlia, meus filhos, por tudo o que significam para mim;
A Grace, minha amada, por todo amor e paciência,
Com amor,
Dedico
A Fagner e Hosana, meus irmãos, pelo carinho;
A Tereza Fonseca, Marcos Cajaíba e Francisca, meus professores, por tudo;
A meus tios Aidê e Pedro e minha sogra Socorro, pela confiança,
Ofereço
ii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa, de maneira especial ao Departamento de
Biologia Vegetal e ao programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal, pela
oportunidade e ajuda para a realização deste curso.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela
concessão da bolsa de estudos.
À antiga Escola de Agronomia-UFBA e a EMBRAPA Mandioca e Fruticultura,
pelos primeiros passos na iniciação científica.
A todos meus tios e tias, primos e primas, por sempre acreditarem em mim.
Ao Prof. Fábio, além de meu Orientador, um grande parceiro, pela orientação,
paciência e exemplo profissional, pelos ensinamentos e pelo enorme empenho e dedicação
na realização deste projeto.
Aos meus amigos Jutair, Hendrickson, Antônio Hélder, Cristovam, Tita, Murilo,
Pino e Eduardo, na Bahia, e Diego e André, em Viçosa, pela infinita amizade e por
tornarem meu mundo mais alegre e divertido.
Aos meus amigos de infância do km 100-Nova Itarana-BA.
Ao Prof. Arlicélio Paiva, José Torquato, Clóvis Peixoto, Élvis Lima,
Maria Angélica
e Manoel Castro pela amizade, apoio e constante incentivo.
Aos professores Marco Aurélio Pedron Silva e Raimundo Santos Barros, pela
amizade, paciência e ensinamentos transmitidos durante este curso.
Aos amigos Ricardo e Fábio Vilela, por toda a amizade e companheirismo que me
dedicaram, meu sincero muito obrigado.
A Elaine Cabrini, pelo carinho, compreensão e amizade.
Aos bolsistas de iniciação científica, Elaine, Ricardo, Fábio e Samuel, pela amizade
e grande dedicação na execução dos experimentos.
Aos funcionários Carlos Raimundo, Cássia, Geraldo, Oswaldo, Reginaldo, Rogério
Gomide, Zé Antônio e Zé Maria, pela ajuda, pelas brincadeiras e pelo carisma.
A toda nação baiana, que me concedeu aparato suficiente para conquista de novos
horizontes.
iii
BIOGRAFIA
FÁBIO SANTOS MATOS nasceu em Itapé, BA, aos 22 dias do mês de novembro
de 1980. Em dezembro de 2000, concluiu o Curso de Técnico em Agropecuária, na Escola
Agrotécnica Federal de Santa-Inês – EAFSI, em Santa-Inês, BA. Em janeiro de 2002,
iniciou o Curso de Engenharia Agronômica, na Universidade Federal da Bahia (UFBA), em
Cruz das Almas, BA, concluindo-o em agosto de 2006. Em outubro do mesmo ano, iniciou
seus estudos no curso de Mestrado em Fisiologia Vegetal, na Universidade Federal de
Viçosa-UFV, em Viçosa, MG.
iv
Índice
Resumo ................................................................................................................. v
Abstract .................................................................................................................vi
1. Introdução ......................................................................................................... 1
2. Materiais & Métodos ........................................................................................ 3
2.1. Material vegetal e desenho experimental ............................................. 3
2.2. Características morfo-anatômicas ......................................................... 4
2.3. Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência ...................................... 4
2.4. Pigmentos fotossintéticos e nitrogênio.................................................. 5
2.5. Enzimas envolvidas no metabolismo antioxidativo .............................. 6
2.6. Índice de plasticidade fenotípica.............................................................6
2.7. Procedimentos estatísticos.......................................................................7
3. Resultado............................................................................................................ 7
4. Discussão........................................................................................................... 18
5. Conclusões ........................................................................................................ 25
6. Referências ....................................................................................................... 26
v
Resumo
MATOS, Fábio Santos, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, junho de 2008.
Plasticidade anatômica e fisiológica de folhas de Coffea arabica L. em resposta à
irradiância Orientador: Fábio Murilo DaMatta. Co-orientadores: Marília Contrin Ventrella
e Raimundo Santos Barros
Examinaram-se parâmetros morfológicos, fisiológicos e bioquímicos, em folhas do
cafeeiro submetidas a diferentes níveis de irradiância (folhas que interceptaram, em média,
ao longo do dia, 30, 75, 300 e 750 µmol fótons m
-2
s
-1
, correspondendo aos tratamentos T
1
,
T
2
, T
3
e T
4
, respectivamente). Morfologicamente, a área foliar unitária e, particularmente, a
área foliar específica (AFE), aumentaram nas folhas mais sombreadas. Sob baixa
irradiância, as folhas do cafeeiro exibiram parênquimas paliçádico e lacunoso menos
desenvolvidos que nas folhas de sol, e maior abundância de espaços intercelulares,
resultando em folhas mais finas e menos densas e, portanto, com maior AFE. A taxa de
assimilação líquida decresceu com a redução da disponibilidade de luz, de 7,2 para 2,3
µmol (CO
2
) m
-2
s
-1
, comparando-se as folhas de T
4
e T
1
. A irradiância de compensação foi,
em média, 88% maior em T
3
e T
4
quando comparadas com as de T
1
e T
2
. A redução da
concentração de clorofilas, nas folhas de T
4
em relação às folhas de T
1
, deve ter auxiliado
na redução da absortância foliar e, reduzido a quantidade total de energia efetivamente
absorvida pelos fotossistemas. As folhas de sol apresentaram maior concentração total de
xantofilas (violaxantina + anteraxantina + zeaxantina), bem como maiores valores do
estado de desepoxidação das xantofilas, indicando uma maior capacidade de dissipação de
energia luminosa nestes tratamentos, em relação às folhas de sombra. As variações na taxa
máxima de carboxilação limitada pela rubisco, taxa de carboxilação máxima limitada pelo
transporte de elétrons e taxa de assimilação líquida de CO
2
sob alta concentração de CO
2
foram mínimas, ou mesmo inexistentes, entre as folhas dos tratamentos analisados. Os
resultados sugerem que o cafeeiro apresenta algumas características morfofisiológicas com
plasticidade fenotípica adequada para lhe permitir ajustar-se à disponibilidade de luz.
Todavia, a capacidade de aclimatação à irradiância parece ocorrer às expensas de uma
alocação ineficiente de recursos, como o nitrogênio.
vi
Abstract
MATOS, Fábio Santos, M.Sc., Universidade Federal de Viçosa, June 2008. Anatomical
and physiological plasticity of leaves of Coffea arabica L. in response to irradiance.
Adviser: Fábio Murilo DaMatta. Co-adviser: Marília Contrin Ventrella and Raimundo
Santos Barros
Morphological, physiological and biochemical parameters were examined in coffee leaves
from different canopy positions. Four classes of leaves were chosen based on the mean
diurnal intercepted photosynthetically active radiation. These classes (treatments)
comprised leaves intercepting 30, 75, 300, 750 μmol photons m
-2
s
-1
, hereafter referred to
T
1
, T
2
, T
3
, and T
4
, respectively. Morphologically, the single leaf area, and particularly the
specific leaf area (SLA), increased in leaves under deep shade. Compared to sunlit leaves,
shade leaves showed less differentiated palisade and spongy parenchyma with greater
abundance of intercellular spaces, leading to thinner and less dense leaves with a higher
SLA. The net carbon assimilation rate decreased with decreasing light availability, from 7.2
(T
4
) to 2.3 (T
1
) μmol (CO
2
) m
-2
s
-1
. The compensating irradiance was on average 88%
higher in T
3
and T
4
leaves as compared with T
1
and T
2
leaves. The smaller chlorophyll
concentration in T
4
leaves relative to T
1
leaves should have led to a lower leaf absorptance
and, thus, leading to reduced amount of energy actually absorbed by the photosystems.
Sunlit leaves showed greater concentration of xanthophylls (violaxanthin + antheraxanthin
+ zeaxanthin) and higher values of deepoxidation state of xanthophylls, indicating a greater
capacity for energy dissipation in these leaves than in shaded leaves. Changes in maximum
rate of carboxylation limited by rubisco, in maximum rate of carboxylation limited by the
electron transport and in net assimilation rate of CO
2
under elevated CO
2
were minimal, if
any, amongst the leaves examined here. Results suggest that coffee leaves display some
morphophysiological traits with adequate phenotypic plasticity allowing the coffee tree to
adjust itself to the light availability. However, the capacity of acclimation to irradiance
seems to occur at the expense of an inefficient allocation of resources, such as nitrogen.
1
1-Introdução
Modificações nos níveis de luminosidade aos quais uma espécie está aclimatada
podem condicionar diferentes respostas fisiológicas em suas características bioquímicas,
anatômicas e de crescimento (Atroch et al., 2001). As características morfológicas e
fisiológicas foliares variam com a posição na copa, uma vez que diferentes posições estão
associadas a ambientes lumínicos distintos (Hollinger, 1989; Ishida et al., 1999). O
desempenho fotossintético das plantas deve ser, pois, maximizado, mediante modificações
morfológicas e fisiológicas ao ambiente luminoso (Poorter, 2001), desde o nível subcelular
até níveis macroscópicos (Balaguer et al., 2001). Obviamente, não apenas a irradiância
interceptada, mas também a temperatura foliar deve variar ao longo do dossel, com
possíveis reflexos sobre o comportamento estomático e a fotossíntese. Assim, a capacidade
fotossintética varia amplamente em diferentes folhas de uma mesma planta, sendo
freqüentemente limitada por restrições difusivas e bioquímicas (Kozlowski & Pallardy,
1997). Limitações difusivas (e.g., estomáticas e mesofílicas), mas não as limitações
bioquímicas, estão associadas a decréscimos na concentração interna de CO
2
(C
i
), podendo
ser superadas mediante a elevação no suprimento externo de
CO
2
. Além de limitações
difusivas, alterações nas reações fotoquímicas e na atividade das enzimas da fase
bioquímica da fotossíntese, bem como das enzimas do metabolismo dos carboidratos e do
nitrogênio (Foyer et al., 1994; Boyer, 1995; Kanechi et al., 1996; Paul & Driscoll, 1997),
podem afetar significativamente a magnitude das taxas fotossintéticas.
O café é originário de florestas tropicais da África, onde é encontrado em estado
espontâneo como vegetação de sub-bosque, desenvolvendo-se, portanto, permanentemente
sob sombra. A cultura do café expandiu-se e adaptou-se às mais variadas condições
ecológicas da faixa tropical e sub-tropical. No Brasil, por exemplo, os cafezais vêm sendo
conduzidos quase exclusivamente a pleno sol, enquanto em muitos países da América
Central, por exemplo, a espécie é mais freqüentemente cultivada sob sistemas arborizados.
Em café, as irradiâncias de saturação para folhas de sol e sombra são
aproximadamente 600 e 300 µmol de (fótons) m
-2
s
-1
, respectivamente (Kumar & Tieszen,
1980; Fahl et al., 1994). Irradiâncias superiores àquelas necessárias para saturar a
fotossíntese podem causar fotoinibição da fotossíntese. Além disso, freqüentemente,
2
acarretam um decréscimo líquido na taxa de transporte de elétrons através do fotossistema
II (FSII), e um forte incremento na taxa de giro de D
1
, o principal polipeptídio dos centros
de reação do FSII (Malkin & Niyogi, 2000). Não obstante, em função da arquitetura da
copa do cafeeiro, a fotoinibição, quando manifestada, deve concentrar-se na folhagem mais
periférica (Chaves et al., 2008). Registre-se que, em cafezais adultos, a transmitância da
irradiância incidente, da parte superior da copa ao solo, pode atingir proporções muito
baixas, da ordem de 4% (Cannell, 1985), ou mesmo menos (DaMatta, 2004).
Apesar de a grande maioria dos trabalhos indicar que o cafeeiro exibe folhas com
características de sombra, sua fotossíntese pode ser maior a pleno sol que à sombra, desde
que a abertura estomática não seja limitante (DaMatta & Rena, 2002). Na maioria dos
trabalhos em que se observa maior taxa de fotossíntese líquida (A) à sombra que a pleno
sol, menor condutância estomática (g
s
) para folhas expostas parece explicar, pelo menos em
parte, essas observações (e.g. Kumar & Tieszen, 1980; Paiva et al., 2001; Freitas et al.,
2003). Em todo caso, sob condições não-estressantes, o cafeeiro pode exibir outras
características indicativas de aclimatação/adaptação a altas irradiâncias. Sob alta
disponibilidade lumínica, observa-se, comumente, redução da área foliar específica (AFE),
aumento da espessura da cutícula, incrementos na densidade estomática, cloroplastos com
menos grana e menos tilacóides por granum (Fahl et al., 1994) e reversão da fotoinibição
relativamente rápida (DaMatta & Maestri, 1997), todas características adaptativas à plena
irradiância. Por outro lado, em estudos recentes conduzidos em Viçosa, observou-se que,
apesar de o cafeeiro ser capaz de alterar a absorção da energia radiante, mediante a
alteração do ângulo foliar, outras adaptações comuns a baixas irradiâncias (e.g. aumento na
concentração de clorofilas por unidade de massa e na razão clorofila/N, e redução na razão
clorofila a/b) não foram verificadas, demonstrando que a espécie poderia ter baixa
capacidade de aclimatação a ambientes com reduzida disponibilidade de luz, ainda que
tenha evoluído em ambientes sombreados (Dias, 2006; Araújo et al., 2008; Chaves et al.,
2008). As diferenças relativamente pequenas na magnitude das trocas gasosas, da
concentração de pigmentos fotossintéticos, da fotoinibição e da capacidade antioxidante,
aliadas à ocorrência de danos celulares discretos e em extensão muito similar entre folhas
de plantas a pleno sol e sob sombra sugerem que o cafeeiro tenha uma plasticidade
3
fenotípica relativamente baixa de sua maquinaria fotossintética às variações da irradiância
(Araújo et al., 2008; Chaves et al., 2008).
Em espécies evoluídas em ambientes sombreados, é comum observar-se uma alta
plasticidade morfológica, e uma baixa plasticidade fisiológica, da maquinaria fotossintética,
em resposta à disponibilidade de luz (Niinemets, 2007). Essa asserção, pelo menos
aparentemente, é aplicável ao café, conforme especulado por Araújo et al. (2008) e Chaves
et al. (2008). Todavia, nos estudos desses autores, as folhas “de sombra” interceptaram
irradiâncias relativamente elevadas (cerca de 35-50% da fração de luz interceptada pelas
folhas “de sol”). Portanto, folhas sob sombra intensa, comum no interior da copa do
cafeeiro, não têm sido avaliadas e, desse modo, não se tem um quadro claro sobre a real
plasticidade fenotípica do cafeeiro à disponibilidade de luz. Pretendeu-se, portanto, avaliar
uma gama de variáveis fisiológicas e morfológicas em folhas que diferem largamente
quanto à interceptação total da irradiância, com o intuito de se avaliar a plasticidade foliar
do cafeeiro às variações da disponibilidade de luz.
2. Material & Métodos
2.1-Material vegetal e desenho experimental
O experimento foi conduzido em campo, com plantas de café (Coffea arabica L. cv
Catuaí Vermelho IAC 44), com aproximadamente 13 anos de idade, em Cachoeirinha,
Viçosa (20
o
45’S, 42
o
15’W, 650 m de altitude), Minas Gerais. As plantas vêm sendo
cultivadas a pleno sol, sob espaçamento de 3,0 x 1,0 m, com uma planta por cova. O cafezal
foi renovado, por meio de esqueletamento, em setembro de 2006. Inicialmente, em outubro
de 2007, foi feita uma classificação de folhas de 30 plantas, com base na radiação
fotossinteticamente ativa (RFA) soma diurna interceptada (média de cinco dias com
medidas a cada duas horas aproximadamente, começando às 07:00 h e finalizado por volta
das 17:00 h). A RFA foi medida com um fotômetro/radiômetro (Li-185, LI-COR, Lincoln,
EUA), no mesmo ângulo de inserção das folhas totalmente expandidas. Foram avaliados
quatro tratamentos (distribuídos num delineamento inteiramente casualizado), que
corresponderam à RFA média (± desvio padrão) interceptada de 30 ± 5 µmol fótons m
-2
s
-1
,
75 ± 11 µmol fótons m
-2
s
-1
, 300 ± 67 µmol fótons m
-2
s
-1
e 750 ± 179 µmol fótons m
-2
s
-1
.
Esses tratamentos serão doravante designados, respectivamente, como T
1
, T
2
, T
3
e T
4
. As
4
variáveis foram submetidas à análise de variância segundo delineamento inteiramente
casualizado, com seis repetições por tratamento.
2.2-Características morfo-anatômicas
Foram calculadas as áreas específica e unitária e densidade de folhas do terceiro ou
quarto par a partir do ápice de ramos plagiotrópicos. Folhas foram também coletadas e
posteriormente fixadas em FAA
50
, por 48 h (Johansen, 1940) e estocadas em etanol 70%.
Desse material, amostras da região mediana foram incluídas em metacrilato (Historesin-
Leica), segundo as recomendações do fabricante, procedendo-se ao corte transversal em
micrótomo de avanço automático, com 7 μm de espessura, e corados com azul de toluidina
(O’Brien et al. 1965). Para a determinação das características anatômicas em seção
transversal, as imagens foram digitalizadas e analisadas mediante o software Image Pro-
Plus (Version 4.5, Media Cybernetics, Silver Spring, EUA). Foram avaliadas as espessuras:
(i) da lâmina foliar; (ii) dos parênquimas paliçádico (PP) e lacunoso (PL); (iii) da epiderme
nas faces abaxial e adaxial, além da área dos espaços intercelulares.
2.3-Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência
Curvas de resposta da taxa de assimilação liquida de carbono (A) à irradiância (curva
A/RFA) foram obtidas em laboratório, em folhas de ramos coletados no início da manhã,
utilizando-se de um analisador de gases a infravermelho (LCpro+, Analytical Development
Company, Hoddesdon, Reino Unido), variando-se a RFA de 0 a 1400 µmol (fótons) m
-2
s
-1
,
a 25ºC, e concentração de CO
2
constante de 380 µmol mol
-1
(Iio et al., 2005). Antes de se
aplicar a RFA às folhas, foi fornecida uma concentração inicial de CO
2
igual a 50 µmol
mol
-1
, por 3 min, para induzir a abertura dos estômatos. O rendimento quântico aparente
(Φ
a
) foi estimado por meio da regressão linear da porção inicial da curva [0 ≤ RFA ≤ 100
µmol (fótons) m
-2
s
-1
]. As respostas de A à concentração interna de CO
2
(curva A/C
i
) foram
determinadas a 25ºC, sob 1000 µmol (fótons) m
-2
s
-1
, um valor saturante, mas não
fotoinibitório (Araújo et al., 2008), variando-se a concentração de CO
2
ambiente, de 50 a
1600 µmol mol
-1
(Habermann et al., 2003; Iio et al., 2005). Técnicas de regressão não-
linear, baseadas nas equações de Farquhar et al. (1980), modificadas por Sharkey (1985) e
Harley & Sharkey (1991), foram usadas para calcular a taxa máxima de carboxilação
5
limitada pela rubisco (V
cmax
), taxa de carboxilação máxima limitada pelo transporte de
elétrons (J
max
) para cada curva A/C
i
obtida. As estimativas das taxas de assimilação líquida
de CO
2
limitada pela rubisco e pelo transporte de elétrons foram obtidas a partir do ajuste
das curvas A/C
i,
baseando-se nas equações de Long & Bernacchi (2003).
Os parâmetros de fluorescência da clorofila a foram determinados ao longo da
manhã, em laboratório, nos mesmos ramos utilizados para a mensuração das trocas gasosas,
por meio de um fluorômetro com pulso modulado (FMS2, Hansatech, Norfolk, Reino
Unido). Foram avaliadas as respostas de diversos parâmetros de fluorescência, em função
do nível de irradiância, objetivando-se observar a capacidade de utilização fotoquímica e de
dissipação não-fotoquímica da energia luminosa, sob condições controladas. Após serem
adaptadas ao escuro por 30 min, as folhas foram inicialmente expostas a um fraco pulso de
luz vermelho-distante (1-2 µmol m
-2
s
-1
), para a determinação da fluorescência inicial (F
0
).
Em seguida, um pulso de luz saturante, com uma irradiância de 6000 µmol(fótons) m
-2
s
-1
e
duração de 1 s, foi aplicado para estimar-se a fluorescência máxima (F
m
).
Subsequentemente, as folhas foram irradiadas com luz actínica durante 300 s, às
intensidades de 10, 25, 120, 300 e 600 µmol(fótons) m
-2
s
-1
, para obtenção da fluorescência
constante (F
s
). Em seguida, foi aplicado um pulso de luz saturante 6000 µmol (fótons) m
-2
s
-1
para cada nível de irradiância, por 1 s, para obtenção de fluorescência máxima sob luz
(F
m
’
). A luz actínica foi desligada e as amostras foram irradiadas com luz vermelho-
distante, para a obtenção da fluorescência mínima adaptada à luz (F
0
’). Foram estimados,
então, o coeficiente de extinção fotoquímica (
q
P
), eficiência de captura de energia de
excitação pelos centros de reação abertos do FSII (F
v
’/F
m
’), coeficiente de extinção não-
fotoquímica (NPQ) e o rendimento quântico do transporte de elétrons do FSII (Φ
FSII
). A
eficiência fotoquímica máxima do FSII (F
v
/F
m
) nas amostras aclimatadas à obscuridade foi
também determinada.
2.4-Pigmentos fotossintéticos e nitrogênio
Para a quantificação da concentração das xantofilas, dois discos foliares (1,4 cm de
diâmetro) foram coletados às 12:00 h e homogeneizados em acetona 90%, a 4ºC. O
homogenato foi transferido para um microtubo, e expurgado com N
2
gasoso, por 2 min.
Após 30 min de repouso, os microtubos foram centrifugados a 15000 g, por 10 min, a 4ºC.
6
O sobrenadante obtido foi filtrado através de um filtro com diâmetro de poro de 0,45 μm.
Os pigmentos foram analisados em um cromatógrafo líquido de alto desempenho de fase
reversa (Hewlett Packard, serie 1050, EUA), utilizando-se de uma coluna C
18
, Spherisorb
ODS-2 (250 x 4,6 mm), com diâmetro de poro de 5 μm. Os compostos foram identificados
mediante seus espectros de absorção e tempos de retenção (Johnson et al. 1993). A
detecção e quantificação individual dos carotenóides foi obtida pela proporcionalidade
entre a área integrada dos cromatogramas, obtidas a 440 nm, e as áreas dos cromatogramas
dos respectivos padrões (VKI, Horsholm, Dinamarca), registrados naquele comprimento de
onda, de acordo com método descrito em Ramalho et al. (1997). Clorofilas e carotenóides
(Car) totais foram quantificados espectrofotometricamente (Lichthenthaler 1987).
Amostras foliares foram coletadas e determinadas as diferenças de N orgânico e N
nítrico, conforme descrito por Cataldo et al (1974, 1975). A soma das duas frações
representa o N-total.
2.5-Enzimas envolvidas no metabolismo antioxidativo
Quatro discos (1,4 cm de diâmetro) foliares foram coletados às 12:00 h e
determinadas as atividades da dismutase do superóxido (SOD; EC 1.15.1.1) (Giannopolitis
& Ries, 1977; Lima et al., 2002), da catalase (CAT; EC 1.11.1.6) (Havir & McHale, 1987;
Lima et al., 2002), e da peroxidase do ascorbato (APX; EC 1.11.1.11) (Nakano & Asada,
1981; Lima et al., 2002).
2.6- Índice de plasticidade fenotípica
Calculou-se o índice de plasticidade (IP) fenotípica associado com os parâmetros
bioquímicos, fisiológicos e morfo-anatômicos. Esse índice, que varia de 0 a 1, foi calculado
baseado na distância relativa (RD) entre os valores dos tratamentos (RDPI), de acordo com
Valladares et al. (2006). Para cálculo do RDPI utilizou-se da seguinte fórmula:
RDPI=∑(d
ij
i’j’/(x
i’j’
+ x
ij
))/n
Em que i, j, n referem-se aos tratamentos, repetições e número total de repetições
respectivamente. d
ij
i’j’ é a distância relativa entre os tratamentos com os valores das
7
repetições tomados aos pares com i diferente de i’ (dois tratamentos submetidos a
diferentes níveis de irradiância) e valor absoluto obtido pela diferença
x
i’j’
–
x
ij
. Portanto, a
distancia relativa, rd
ij i’j’
é definida como d
ij
i’j’/(x
i’j’
+ x
ij
) para todos os pares de
repetições dos tratamentos associados aos diferentes níveis de irradiância.
2.7- Procedimentos estatísticos
Os dados de plasticidade fenotípica foram transformados para seguir uma distribuição
normal, usando-se, para isso, o teste de Kolmogorov-Smirnov. Diferenças entre as médias
dos tratamentos foram analisadas pelo teste de Newman-Keuls, a 5% de probabilidade,
enquanto as diferenças no índice de plasticidade fenotípica para as variáveis mensuradas foi
analisado utilizando-se do teste de Scott-Knott, também a 5% de probabilidade.
3-Resultados
3.1- Características morfo-anatômicas
As variáveis morfo-anatômicas analisadas são mostradas na Tabela 1. A área foliar
unitária foi menor (~21%) nas plantas de T
4
em relação à das plantas dos outros
tratamentos, enquanto a AFE se reduziu com o aumento de irradiância, porém sem
diferença estatística entre plantas de T
3
e T
4
. Uma resposta inversa foi observada para a
densidade foliar, que aumentou, portanto, com o incremento da irradiância interceptada. As
espessuras das epidermes adaxial e abaxial das folhas foram significativamente diferentes,
sendo a primeira mais espessa em folhas submetidas às maiores irradiâncias (T
4
), enquanto
a segunda foi mais espessa nas folhas mais sombreadas (T
1
). A espessura do parênquima
paliçádico foi maior nas folhas de T
4
(~78 μm) em comparação com as de T
1
(~39 μm), ao
passo que as folhas de T
2
e T
3
mostraram valores intermediários. Diferenças na espessura
do parênquima paliçádico estiveram associadas com o maior comprimento das células, sem
haver aumento do número de camadas (Figura 1). O parênquima lacunoso, que ocupou
aproximadamente 2/3 do volume do mesofilo, apresentou espessura similar entre os
tratamentos analisados. Portanto, variações na espessura total da lâmina foliar foram,
fundamentalmente, decorrentes de variações na espessura do parênquima paliçádico.
Ressalte-se, ainda, que a área de espaços de ar foi maior (~19%) nas folhas de T
1
em
relação à das folhas dos demais tratamentos.
8
Tabela 1. Características morfo-anatômicas [área foliar unitária, área foliar específica (AFE), densidade foliar,
espessura das epidermes adaxial e abaxial, espessuras do parênquima paliçádico (PP), lacunoso (PL) e total da
lâmina foliar, razão PP / PL e área de espaços intercelulares no PL] de folhas de Coffea arabica L. distribuídas
em quatro tratamentos, correspondendo à irradiância média interceptada de 30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75
µmol fótons m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e 750 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
4
).
Tratamentos
Parâmetros
T
1
T
2
T
3
T
4
Área foliar unitária (cm
2
)
56,83 ± 3,30
A
57,15 ± 5,90
A
53,13 ± 3,93
A
44,14 ± 5,50
B
AFE (m
2
kg
-1
)
20,79± 0,77
A
16,31 ± 1,23
B
12,90 ± 0,80
C
12,12 ± 0,48
C
Densidade foliar (kg m
-3
) 216,91 ± 9,85
B
250,69± 10,50
AB
297,09 ± 7,15
A
299,21 ± 9.80
A
Espessura da epiderme adaxial (μm)
25,53 ± 1,19
B
27,55 ± 0,53
AB
28,00 ± 1,27
AB
30,11 ± 0,48
A
Espessura da epiderme abaxial (μm)
25,03 ± 1,98
A
19,06 ± 0,80
B
15,79 ± 0,75
B
15,06 ± 0,65
B
Espessura parênquima paliçádico (μm)
38,92 ± 2,62
C
54,10 ± 7,27
B
65,16 ± 2,80
AB
78,40 ± 3,18
A
Espessura Parênquima lacunoso (μm)
135,88 ± 10,33
A
144,04 ±5,15
A
152,52 ± 9,13
A
154,05 ± 5,99
A
Espessura total (μm)
224,18 ± 6,68
C
244,57± 4,97
AB
261,49 ± 11,70
AB
277,63 ± 2,33
A
PP/PL 0,29 ± 0,02
B
0,37± 0,03
AB
0,43 ± 0,01
AB
0,51 ± 0,03
A
Espaços intercelulares no PL (μm
2
)
425,10 ± 4,50
A
359,39± 3,14
B
353,64 ± 6,15
B
343,35 ± 12,62
B
Valores representam a média ± erro-padrão (n=6). Médias seguidas por uma mesma letra dentro de cada linha não diferem entre si,
a
5% de probabilidade, pelo teste de Newman-Keuls.
Figura 1. Epidermes adaxial e abaxial, parênquima paliçádico e lacunoso, feixe vascular,
estômato e epiderme abaxial em seção transversal de folhas de Coffea arabica L.
distribuídas em quatro tratamentos, correspondendo à irradiância média interceptada de 30
µmol fótons m
-2
s
-1
(A), 75 µmol fótons m
-2
s
-1
(B), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(C) e 750 µmol
fótons m
-2
s
-1
(D). (EAD) epiderme adaxial, (PP) parênquima paliçádico, (FV) feixe
vascular, (PL) parênquima lacunoso, (E) estômato, (EAB) epiderme abaxial. Barra = 100
µm.
9
3.2 – Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência
3.2- Trocas gasosas e parâmetros de fluorescência
A irradiância de compensação (I
c
) foi, em média, 88% maior em T
3
e T
4
quando
comparada com a de T
1
e T
2
, variando de 2,7 a 27,5 µmol (fótons) m
-2
s
-1
(Tabela 2). No
entanto, a irradiância de saturação (I
s
) foi semelhante, independemente dos tratamentos
(Tabela 2), ficando em torno de 470 µmol (fótons) m
-2
s
-1
. A respiração foi, em média, 32%
maior nas folhas de T
3
e T
4
quando comparada com folhas de T
1
e T
2
. A taxa de
assimilação líquida do carbono saturada pela luz (A
RFA
) decresceu com a redução da
disponibilidade de luz, de 7,2 para 2,3 µmol (CO
2
) m
-2
s
-1
, ao compararem-se as folhas de
T
4
e T
1
, enquanto Φ
a
reduziu-se à metade nas folhas de T
4
quando comparadas com as
folhas dos outros tratamentos, nas quais Φ
a
não variou significativamente. As respostas de
A à C
i
mostraram que, apesar de V
cmax
, J
max
e a razão J
max
/ V
cmax
terem variado entre os
tratamentos, a taxa de assimilação líquida de carbono máxima obtida a partir das curvas
A/C
i
(A
CO2
) não foi significativamente afetada pela disponibilidade lumínica (Figura 2).
Verificou-se, ainda, que, mesmo a C
i
≥ 1000 μmol mol
-1
(C
a
≈ 1600 μmol mol
-1
), não houve
saturação de A entre as folhas dos tratamentos analisados.
A razão F
v
/F
m
foi superior a 0,82 em todos os tratamentos, indicando não ter havido
fotoinibição da fotossíntese (dados não mostrados). Observou-se, para o coeficiente de
extinção fotoquímica (qP) e o rendimento quântico do transporte de elétrons do FSII
(Φ
FSII
), uma redução similar entre os tratamentos, com o aumento da irradiância, a partir de
25 µmol (fótons) m
-2
s
-1
(Figura 3). As folhas dos tratamentos T
1
e T
2
puderam ser
conjuntamente confrontadas com relação às de T
3
e T
4
no que respeita à eficiência de
captura de energia de excitação pelos centros de reação abertos do FSII (F
v
’/F
m
’) (em
média 19% maior no primeiro grupo) e ao NPQ (em média 41% maior no segundo grupo),
quando submetidas à irradiância de 600 µmol (fótons) m
-2
s
-1
(Figura 3).
10
Tabela 2. Irradiância de compensação [I
c
, μmol (fótons) m
-2
s
-1
], irradiância de saturação [I
s,
μmol
(fótons) m
-2
s
-1
], rendimento quântico aparente [Φ
a
, mol (CO
2
)
mol
-1
(fótons)], respiração [R
d
μmol m
-2
s
-
1] e taxa de assimilação líquida de carbono saturada pela luz [A
RFA
, μmol (CO
2
) m
-2
s
-1
] obtidas a
partir de curvas A/RFA de folhas de Coffea arabica L. distribuídas em quatro tratamentos,
correspondendo à irradiância média interceptada de 30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e 750 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
4
).
Tratamentos
Parâmetros
T
1
T
2
T
3
T
4
I
c
2,65 ± 0,14
B
3,35 ± 0,665
B
21,71 ± 0,73
A
27,46 ± 1,16
A
I
s
470,13 ± 6,80
A
478,53 ± 5,04
A
475,22 ± 1,37
A
467,67 ± 2,80
A
Φ
a
0,039 ± 0,001
A
0,040 ± 0,002
A
0,047 ± 0,001
A
0,020 ± 0,002
B
R
d
0,81±0,020
B
0,94±0,031
B
1,14±0,023
A
1,44±0,041
A
A
RFA
2,33 ± 0,36
C
3,58 ± 0,03
B
6,92 ± 0,41
A
7,16 ± 0,27
A
* Estatística conforme Tab. 1
3.3- Nitrogênio total e pigmentos
A concentração foliar de nitrogênio total, em base de massa, foi, em média, 13,5%
maior nas folhas de T
1
quando comparada com a das folhas dos demais tratamentos. No
entanto, em base de área, observou-se uma resposta inversa, sendo a concentração de N em
T
4
, em média, 38% maior que em T
1
. A concentração de clorofilas totais, em base de
massa, foi significativamente maior nas folhas de T
1
em relação à dos demais tratamentos,
enquanto em base de área não foram observadas diferenças na concentração de clorofilas.
As concentrações de carotenóides totais (em base de massa) foram similares,
independentemente da irradiância interceptada, porém maiores (em base de área) nas
plantas sob maiores irradiâncias (T
3
e T
4
). As razões clorofilas totais/N e clorofilas/Car
foram relativamente maiores nas folhas de T
1
em relação às de T
4
, mas sem diferir
estatisticamente com relação às folhas dos demais tratamentos, fatos explicáveis,
principalmente, em função da maior concentração de clorofilas totais em T
1.
Em todo o
caso, a razão clorofila a/b não respondeu aos tratamentos aplicados (Tabela 3).
11
0 200 400 600 800 1000 12000 200 400 600 800 1000 1200
10
0
10
20
30
-
10
0
10
20
30
V
cmax
= 28,34
AB
± 0,64
J
max
= 80,31
AB
± 0,58
J
max
/V
max
= 2,84
B
± 0,05
A
CO2
= 26,96
A
± 0,91
V
cmax
= 26,15
B
± 0,63
J
max
= 77,61
B
± 0,61
J
max
/V
max
= 2,97
B
± 0,06
A
CO2
= 25,99
A
± 1,15
V
cmax
= 23,69
C
± 0,28
J
max
= 82,90
A
± 1,97
J
max
/V
max
= 3,50
A
± 0,07
A
CO2
= 25,60
A
± 0,84
T
1
T
2
T
3
T
4
A (µmol CO
2
m
-2
s
-1
)
C
i
(µmol
CO
2
mol
-1
)
V
cmax
= 30,63
A
± 1,2
J
max
= 78,21
AB
± 0,93
J
max
/V
max
= 2,57
C
± 0,08
A
CO2
= 25,85
A
± 0,70
Figura 2. Taxa de assimilação líquida limitada pela rubisco (○-○-○), taxa de assimilação
líquida limitada pelo transporte de elétrons (•−•−•) e taxa de assimilação líquida de carbono
(
- - ), obtidas a partir de curvas de resposta da taxa de assimilação líquida da CO
2
[A,
µmol (CO
2
)
m
-2
s
-1
] à concentração interna de CO
2
[C
i
, µmol (CO
2
) mol
-1
] de folhas de Coffea
arabica L. distribuídas em quatro tratamentos, correspondendo à irradiância média interceptada de
30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e 750 µmol
fótons m
-2
s
-1
(T
4
). As médias dos parâmetros (taxa de carboxilação máxima [V
cmax
, µmol
(CO
2
) m
-2
s
-1
], taxa de carboxilação máxima limitada pelo transporte de elétrons [J
max
, µmol
(CO
2
) m
-2
s
-1
], razão J
max
/V
cmax
e taxa de assimilação líquida de carbono máxima obtida a
partir das curvas A/C
i
[A
CO2
, µmol (CO
2
)
m
-2
s
-1
]) acompanhadas de diferentes letras são
estatísticamente diferentes entre si, a 5% de probabilidade, pelo teste de Newman-Keuls.
12
10 25 120 300 600
RFA (µmol fótons m
-2
s
-1
)
NPQ
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
10 25 120 300 600
RFA (µmol (fótons) m
-2
s
-1
)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
10 25 120 300 600
RFA (µmol fótons m
-2
s
-1
)
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0
,
9
10 25 120 300 600
RFA (µmol fótons m-
2
s
-1
)
qP
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
F
v
’/F
m
’
ФFII
T
1
T
2
T
3
T
4
Figura 3. Coeficiente de extinção fotoquímica (qP), rendimento quântico do transporte de
elétrons do FSII (Φ
FSII
), eficiência de captura de energia de excitação pelos centros de reação
abertos do FSII (F
v
’/F
m
’) e coeficiente de extinção não-fotoquímica (NPQ), em resposta a
radiação fotossinteticamente ativa (RFA) de folhas de Coffea arabica L. distribuídas em quatro
tratamentos, correspondendo à irradiância média interceptada de 30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75 µmol
fótons m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e 750 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
4
). Valores representam
a média ± erro-padrão (n=6).
13
Tabela 3. Concentrações foliares de N-total, clorofilas (Cl) totais (a+ b) e carotenóides totais (Car), e
razões Cl/N, Cl a/ Cl b (Cl a/b) e Cl/Car de folhas de Coffea arabica L. distribuídas em quatro
tratamentos, correspondendo à irradiância média interceptada de 30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75 µmol
fótons m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e 750 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
4
).
Tratamentos
Parâmetros
T
1
T
2
T
3
T
4
N total, g kg
-1
MS
34,17± 0,41
A
28,82 ± 0,38
B
30,3 ± 0,24
B
29,56 ± 0,47
B
N total, g m
2
1,65± 0,053
B
1,82 ± 0,10
B
2,40 ± 0,15
A
2,45 ± 0,10
A
Cl (a+b), g kg
-1
MS
6,63± 0,29
A
4,55 ± 0,52
B
4,73 ± 0,43
B
3,84 ± 0,17
B
Cl (a+b), mg m
2
318,90± 17,51
A
279,00 ± 28,40
A
366,66 ± 30,03
A
318,00± 16,01
A
Car, mg kg
-1
MS
715,78± 26
A
643,51 ± 85
A
734,59 ± 62
A
694,05 ± 66
A
Car, mg m
2
34,52± 1,16
B
39,67 ± 5,10
B
57,52 ± 5,06
A
57,56 ± 5,78
A
Cl/N, mmol mol
-1
3,18 ± 0,13
A
2,55 ± 0,28
AB
2,56 ± 0,24
AB
2,12 ± 0,12
B
Cl a/b
2,75 ± 0,17
A
2,94± 0,40
A
2,94 ± 0,27
A
2,35 ± 0,26
A
Cl/Car
9,33 ± 0,55
A
7,10 ± 1,08
AB
6,40 ± 0,55
B
5,56 ± 0,57
B
* Estatística conforme Tab. 1
A concentração de xantofilas e de carotenos, em base de massa, é mostrada na Tabela
4. Independentemente dos tratamentos, a luteína foi o principal carotenóide acumulado nas
plantas, com uma concentração, em média, 16% maior nas folhas de T
3
e T
4
quando
comparadas às de T
1
e T
2
. O teor dos demais carotenóides variou, de forma que a
violaxantina foi o segundo principal carotenóide, com uma concentração média de 41%
maior nas folhas de T
1
e T
2
em relação às de T
3
e T
4
. A zeaxantina foi detectada apenas nas
folhas de T
3
e T
4
, com concentrações significativamente maiores nas últimas. As
concentrações relativas dos demais carotenóides variaram sobremodo, de sorte que os
níveis de neoxantina decresceram com o aumento da disponibilidade de luz, sendo, em
média, 28% maior nas folhas de T
1
em comparação com as de T
4
; de forma contrária, o teor
de anteraxantina foi maior em maiores irradiâncias, aproximadamente 71% maior em folhas
de T
4
em relação às de T
1
. Os teores de α-caroteno e β-caroteno comportaram-se de forma
dicotômica, observando-se maior teor de α
−caroteno sob menores irradiâncias, ocorrendo o
contrário com o β-caroteno. A soma de violaxantina, anteraxantina e zeaxantina (V+A+Z)
foi, em média, 17% maior nas folhas de T
4
quando comparada com a de T
1
, enquanto o
estado de desepoxidação dos carotenóides do ciclo das xantofilas (DEPS) foi, em média,
91% maior nas folhas de T
3
e T
4
quando comparado com o de T
1
e T
2
. Em base de
14
clorofila (Tabela 5), as concentrações de anteraxantina, luteína, zeaxantina e β-caroteno
foram maiores nas folhas de T
4
, que apresentaram menor razão α/β-caroteno devido à
queda mais acentuada nos níveis de α-caroteno que nos de β-caroteno.
Tabela 4. Concentrações foliares de xantofilas e carotenos, soma de violaxantina, anteraxantina e
zeaxantina (V+A+Z) e estado de desepoxidação dos carotenóides do ciclo das xantofilas (DEPS) de
folhas de Coffea arabica L. distribuídas em quatro tratamentos, correspondendo à irradiância média
interceptada de 30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e
750 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
4
). Os valores são expressos em mg kg
-1
MF e representam a média ± EP (n
= 6).
Tratamentos
Parâmetros
T
1
T
2
T
3
T
4
Neoxantina
89,04 ± 1,81
A
84,33 ± 0,80
B
70,05 ± 0,76
C
63,67± 1,69
D
Violaxantina
123,32 ± 1,05
A
107,65 ± 1,00
B
90,74 ± 2,05
C
44,43 ± 1,43
D
Anteraxantina
8,60 ± 0,74
C
12,25 ± 0,63
B
28,33 ± 0,63
A
29,86± 0,96
A
Luteína
196,26 ± 2,13
C
201,73 ± 3,11
C
218,82 ± 3,06
B
252,39 ± 3,31
A
Zeaxantina - -
22,82 ± 0,75
B
84,23 ± 1,62
A
α-Caroteno
119,15 ± 0,97
A
101,50± 1,49
B
83,46± 2,55
C
62,11± 1,47
D
β-Caroteno
99,93 ± 1,23
C
100,10 ± 1,52
C
126,10 ± 2,09
B
135,31± 2,17
A
α / β-Caroteno
1,19 ± 0,015
A
1,02 ± 0,034
B
0,66 ± 0,025
C
0,46 ± 0,013
D
V+A+Z
131,92 ± 1,51
C
119,91 ± 1,57
D
141,90 ± 2,10
B
158,53 ± 3,22
A
DEPS
0,032 ± 0,00
D
0,051 ± 0,00
C
0,26 ± 0,01
B
0,63 ± 0,01
A
Estatística conforme Tab. 1
15
Tabela 5. Concentrações foliares de xantofilas e carotenos, e soma de violaxantina, anteraxantina e
zeaxantina (V+A+Z) de folhas de Coffea arabica L. distribuídas em quatro tratamentos,
correspondendo à irradiância média interceptada de 30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e 750 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
4
). Os valores são expressos em g kg
-1
de
clorofila (a+b) e representam a média ± EP (n = 6).
Tratamentos
Parâmetros
T
1
T
2
T
3
T
4
Neoxantina
47,80 ± 1,68
A
49,13 ± 1,24
A
48,91 ± 2,94
A
43,94± 1,53
A
Violaxantina
66,21 ± 2,10
A
62,69 ± 1,45
A
63,28 ± 3,73
A
30,79 ± 1,79
B
Anteraxantina
4,66 ± 0,48
C
7,13 ± 0,39
B
19,72 ± 0,99
A
20,66± 1,04
A
Luteína
105,31 ± 2,99
C
117,36 ± 4,14
C
152,50 ± 8,03
B
174,54 ± 6,82
A
Zeaxantina
- -
15,91 ± 0,99
B
58,15 ± 1,90
A
α-Caroteno
64,00 ± 2,22
A
59,13± 1,76
A
58,16± 3,41
A
43,00± 2,14
B
β-Caroteno
53,65 ± 1,76
B
58,31 ± 1,71
B
87,60 ± 3,71
A
93,42± 2,94
A
V+A+Z
70,87 ± 2,54
B
69,83 ± 1,73
B
98,91± 5,30
A
109,60 ± 4,69
A
Estatística conforme Tab. 1
3.4- Sistema antioxidante
As atividades das enzimas do sistema antioxidativo são mostradas na Figura 4.
Avaliaram-se três enzimas importantes na remoção de espécies reativas de oxigênio: SOD,
CAT e APX. A atividade da SOD foi, em média, 43% maior nas folhas de T
3
e T
4
quando
comparada com a das folhas de T
1
e T
2
. A atividade da CAT foi, em média, 59% maior nas
folhas de T
2
, T
3
e T
4
quando comparada à das folhas de T
1
, enquanto a da APX foi, em
média, 21% maior nas folhas de T
3
e T
4
quando comparada com as folhas de T
1
e T
2
.
3.5- Índice de plasticidade fenotípica
O índice de plasticidade das variáveis bioquímicas foi, em média, 13% e 48% maior
quando comparado com as fisiológicas e morfo-anatômicas respectivamente (Tabela 6). No
entanto a plasticidade das variáveis fisiológicas foi, em média, 40% maior em relação às
morfo-anatômicas. Algumas variáveis mostraram-se altamente plásticas em resposta aos
diferentes níveis de irradiância: dentre as características bioquímicas, fisiológicas e
morfológicas, as mais plásticas foram, respectivamente, a zeaxantina (~0,76), irradiância de
compensação (~0,60) e espessura do parênquima paliçádico (~0,20). Como um todo, as
variáveis associadas à dissipação do excesso de irradiância (concentração de zeaxantina
DEPS e NPQ) foram as que mais responderam aos tratamentos aplicados.
16
APX (U g
-1
MF)
0
20
40
60
80
100
120
BB AA
CAT (U g
-1
MF)
0
2
4
6
8
10
A
AAB
SOD (U g
-1
MF)
0
500
1000
1500
2000
2500
AABB
T
1
T
2
T
3
T
4
Figura 4. Atividade da dismutase do superóxido
(SOD), catalase (CAT) e peroxidase do ascorbato
(APX) em folhas de Coffea arabica L. distribuídas em
quatro tratamentos, correspondendo à irradiância média
interceptada de 30 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
1
), 75 µmol fótons
m
-2
s
-1
(T
2
), 300 µmol fótons m
-2
s
-1
(T
3
) e 750 µmol fótons
m
-2
s
-1
(T
4
). Médias acompanhadas de diferentes letras
são estatisticamente diferentes entre si (Newman-
Keuls, p< 0,05).
18
4-Discussão
A ocorrência de dois tipos de folhas, i.e., folhas de “sol” e de “sombra”, numa mesma
planta, pode ser considerada como um caso particular de aclimatação (Rhizopoulou et al.,
1991), conforme observado no presente experimento. Os resultados aqui apresentados não
corroboram as conclusões de Araújo et al. (2008) e Chaves et al. (2008), que propuseram
que existiria, no cafeeiro, uma baixa plasticidade foliar em resposta à disponibilidade
lumínica, ao compararem folhas que interceptaram, em média, 200-300 contra 600-800
µmol fótons m
-2
s
-1
. Registre-se, não obstante, que aqueles autores não analisaram folhas
sob sombreamento excessivo, porém essas folhas, conforme ora se demonstra, possuem
algumas características (especialmente bioquímicas e fisiológicas) altamente plásticas que
lhes devem permitir um balanço positivo de carbono, mesmo sob irradiâncias tão baixas
quanto 30 µmol fótons m
-2
s
-1
, valor equivalente a cerca de 1,5% da irradiância máxima
incidente sobre a copa. Como um todo, os resultados demonstram que o cafeeiro, uma
espécie originada de ambientes sombreados e classificada por muitos como “espécie de
sombra” (DaMatta et al., 2004), pode aclimatar-se, via alterações morfo-fisiológicas da
folhagem, à disponibilidade de luz. Essa capacidade de aclimatação, conforme discutido a
seguir, parece explicar, em certa extensão, o sucesso do cultivo de cafezais a pleno sol,
como no Brasil, e em sistemas agroflorestais, como no México e na Índia, ainda que a
produção de frutos, nesses sistemas, seja sobremodo reduzida, em função do sombreamento
excessivo (DaMatta et al., 2007).
4.1. Aclimatação a baixas irradiâncias
A área foliar unitária e, particularmente, a AFE, aumentaram nas folhas mais
sombreadas. O incremento da superfície foliar pode ser atribuído tanto ao aumento do
número de células, devido ao aumento das divisões celulares, quanto ao maior volume
celular (Fahn et al., 1990). Nesse sentido, nas folhas das plantas cultivadas à sombra, a
expansão celular pode ter sobrepujado as divisões celulares que acarretam aumento do
número de células. Apesar do fato de o número de divisões celulares ser controlado
geneticamente (Nadeau & Sack, 2003), o ambiente pode exercer forte pressão e alterar esse
padrão; dessa forma, folhas sombreadas, freqüentemente, apresentam incremento do
número de divisões celulares, como forma de aumentar a área foliar, conforme descrito
19
para Populus sp. (Ceulemans et al., 1995). Em alguns casos, tanto o número de divisões
celulares quanto a área média das células podem ser aumentados com a diminuição da
intensidade luminosa (Salisbury, 1927; Friend & Pomeroy, 1970; Yano & Terashima,
2001).
Sob baixa irradiância, a folha do cafeeiro exibe características típicas de folhas de
sombra, com parênquimas paliçádico e lacunoso menos desenvolvidos que em folhas de
sol, e com maior abundância de espaços de ar, resultando em folhas mais finas e menos
densas e, portanto com maior AFE, i.e., aumento da área por unidade de massa. A
espessura do parênquima paliçádico, que variou em aproximadamente 100%, quando se
confronta as folhas sob menor e maior nível de irradiância, é uma evidência anatômica de
que as folhas do cafeeiro possuem alta plasticidade a diferentes níveis de irradiância.
Saliente-se que, em café, o aumento da AFE com o aumento do sombreamento tem sido
relatado por outros autores (e.g., Morais et al., 2004; Araújo et al., 2008). Em todo o caso, a
maior proporção de parênquima lacunoso nas folhas de sombra concorre para aumentar o
espalhamento interno da luz no mesofilo e, pois, aumentando a absortância foliar (Lambers
et al., 1998) e, em última instância, aumentando a eficiência do uso da irradiância.
Fisiologicamente, a baixa I
c
deve permitir a obtenção de um balanço positivo de
carbono sob irradiâncias extremamente baixas. Os valores reduzidos de I
c
observados nas
folhas mais sombreadas situam-se no limite inferior da faixa de valores de I
c
registrados em
café (2 µmol fótons m
-2
s
-1
; Rena et al., 1994). Isso esteve provavelmente associado com
uma menor taxa respiratória, maior concentração de clorofilas totais em base de massa e
maior razão Cl/N. A maior razão Cl/N naquelas folhas indica maior alocação de N para
produção de pigmentos fotossintéticos em detrimento de compostos diretamente envolvidos
na fixação do CO
2
(Evans, 1989; Ellsworth & Reich, 1993). Por outro lado, esperar-se ia
uma redução na razão Cl a/b – uma das principais respostas observadas em plantas (folhas)
desenvolvidas à sombra (Walters, 2005). Contudo, a razão Cl a/b não foi afetada pelas
variações da irradiância. Essa razão é um indicador da proporção de complexos coletores de
luz associados ao FSII (CCL-II) em relação a outros complexos contendo clorofilas
(Murchie & Horton, 1997). Sugere-se, então, que, independentemente da irradiância
interceptada, as folhas não alteraram a proporção relativa de CCL-II. Uma evidência
adicional de que não houve alterações em CCL-II provém da constância da concentração de
20
neoxantina, um carotenóide associado exclusivamente ao CCL-II (Strock et al. 2008).
Como conseqüência, espera-se uma constância da razão FSII/FSI e, portanto, a aclimatação
à baixa disponibilidade de luz deve ter ocorrido sem uma otimização da alocação de N,
especialmente porque um aumento em CCL-II está fortemente associado ao aumento da
eficiência fotossintética do uso do N (Walters, 2005). Em todo o caso, o elevado índice de
plasticidade da I
c
permite, por exemplo, que o café se aclimate a condições lumínicas bem
distintas (e.g., sob sombreamento comum em sistemas agroflorestais e em plantios
adensados, e pleno sol).
Apesar de não ter havido variação na razão Cl a/b, a razão α/β-Caroteno aumentou
progressivamente com a redução da disponibilidade de luz, o que pode ser interpretado
como uma resposta de aclimatação às baixas irradiâncias (Logan et al., 1996). Nesse
contexto, a baixa concentração de anteraxantina, e níveis não detectados de zeaxantina,
refletem a falta de necessidade de as folhas dos tratamentos T
1
e T
2
investirem em
capacidade de dissipação térmica, um fato facilmente explicável em função da baixa
irradiância interceptada (Horton et al., 2008). Porém, a capacidade de fotoproteção
daquelas folhas deve ser limitada quando expostas a irradiâncias relativamente elevadas,
conforme se depreende pelo menor nível de NPQ sob 600 µmol fótons m
-2
s
-1
(Figura 3).
Registre-se que, independentemente da base de expressão, o estoque de violaxantina +
anteraxantina + zeaxantina foi apenas ligeiramente inferior (17-35%) nas folhas de T
1
em
relação às de T
4
, enquanto os valores absolutos de NPQ nas últimas foram quase 100%
maiores. Estes resultados sugerem que a conversão de violaxantina a anteraxantina, e desta
a zeaxantina, deve ser limitada nas folhas mais sombreadas, possivelmente em função de
uma menor atividade da desepoxidase da violaxantina (VDE). Isso poderia explicar, em
parte, o porque de mudas de café, quando transferidas de viveiros sombreados para o
campo (ou quando o interior da copa é abruptamente exposto a altas irradiâncias, como
ocorre após podas severas), exibirem, usualmente, sintomas típicos de escaldadura (danos
fotooxidativos).
4.2. Aclimatação a altas irradiâncias
As plantas podem apresentar diversos meios para se protegerem contra irradiâncias
potencialmente fotoinibitórias. Neste trabalho, a redução da concentração de clorofilas, nas
21
folhas de T
4
em relação às folhas de T
1
, deve ter auxiliado na redução da absortância foliar
e, associada com os menores valores da eficiência de captura de energia de excitação pelos
centros de reação abertos do PSII (F
v
’/F
m
,’) reduzido a quantidade total de energia
efetivamente absorvida pelos fotossistemas. Decréscimos na concentração de clorofilas
totais em folhas submetidas a maiores níveis de irradiância podem estar associados a
processos fotoxidativos (e.g., Krause, 1988), ou estar relacionado com alterações na
organização dos fotossistemas, de modo a servir como um mecanismo fotoprotetor (e.g.,
Elvira et al., 1998; Ottander et al., 1995). A segunda hipótese é mais provável, uma vez que
não houve qualquer indício de dano oxidativo (razão F
v
/F
m
≥ 0,82), apesar da grande
diferença (25 vezes) da irradiância interceptada entre as folhas dos tratamentos mais
contrastantes. Conforme esperado, houve um decréscimo na razão Cl/Car nas folhas sob
maiores níveis de luz, de modo a permitir-lhes um aumento na capacidade de dissipação da
energia de excitação, principalmente via ciclo das xantofilas (Demmig-Adams & Adams,
1996a; Ma et al., 2003). Com efeito, a elevação na concentração de carotenóides e/ou uma
redução da concentração de clorofilas pode auxiliar as plantas a minimizarem a
fotooxidação (Corcuera et al., 2005).
Os menores valores de F
v
’/F
m
’, nas folhas sob maiores irradiâncias, indicam uma
redução na eficiência de captura de energia de excitação pelos centros de reação abertos do
PSII. Reduções em F
v
’/F
m
’provavelmente estiveram associadas com o aumento no NPQ.
Aumentos em NPQ estão linearmente relacionados com a dissipação da energia de
excitação na forma de calor pelo complexo-antena associado ao FSII (Demmig-Adams et
al., 1996a), e o mecanismo de dissipação da energia luminosa do CCL-II está estritamente
associado com a interconversão dos pigmentos do ciclo das xantofilas (Morosinotto et al.,
2003; Horton et al., 2008). As folhas dos tratamentos T
3
e T
4
apresentaram maior
concentração de violaxantina, anteraxantina e zeaxantina, bem como maiores valores do
estado de desepoxidação (DEPS), envolvendo os componentes do ciclo das xantofilas,
indicando uma maior capacidade de dissipação de energia luminosa nestes tratamentos, em
comparação com as folhas dos tratamentos T
1
e T
2.
O grau de desepoxidação depende de
quatro fatores: (i) tamanho do pool de violaxantina, (ii) fração de violaxantina que está
disponível para desepoxidação, (iii) pH do lúmen e (iv) presença de ascorbato. O pool de
violaxnatina depende da espécie e condição de crescimento, e geralmente aumenta sob alta
22
irradiância ou quando outro estresse afeta a atividade fotossintética (Thayer & Bjorkman,
1990; Bilger et al., 1990: Demmig-Adams & Adams, 1996b; Verhoeven et al., 1996).
Geralmente, a acidificação do lúmen para a desepoxidação ocorre quando a intensidade de
luz excede a capacidade fotossintética. A concentração de ascorbato é aparentemente alta
em plantas aclimatadas a altas irradiâncias para suportar a atividade da VDE (Logan et al.,
1998). Provavelmente, sob alta irradiância, a taxa de transporte de elétrons foi elevada, com
conseqüente acidificação do lúmen, devido ao armazenamento momentâneo de prótons, de
modo a estabelecer-se um gradiente de pH favorável à atividade da VDE. A pressumível
maior atividade da VDE sob maiores irradiâncias estaria intimamente relacionada com a
maior concentração de zeaxantina, particularmente nas folhas de T
4
. Além dos
componentes do ciclo das xantofilas, o β-caroteno e a luteína, cujas concentrações
(independentemente da base de expressão usada) aumentaram com o aumento da
irradiância interceptada, parecem importantes como um mecanismo de fotoproteção em
café. Registre-se que o β-caroteno é um potente extintor de clorofila tripleto nos
complexos-antena (Trebest et al., 2002) e, portanto, o incremento de sua concentração
indica uma maior capacidade de fotoproteção das folhas de sol. Aparentemente, a luteína
pode desempenhar um papel na dissipação térmica, mas se desconhece o mecanismo pelo
qual isso ocorre (Pogson et al., 1998). Os resultados aqui apresentados corroboram com os
de Ramalho et al. (2000), no que diz respeito à aclimatação a altas irradiâncias, com
exceção do padrão de resposta da luteína que, diferentemente deste experimento, não foi
alterado em resposta à irradiância do referido estudo.
Comparando-se as folhas dos tratamentos T
3
e T
4
, observou-se pouca diferença na
extensão do NPQ a 300 ou a 600 µmol fótons m
-2
s
-1
(Figura 3). Entretanto, as
concentrações de zeaxantina (tanto em base de área como de massa) foram quase 300%
maiores nas folhas mais iluminadas. Apesar da apregoada relação entre NPQ e zeaxantina
(Demmig-Adams et al., 1996b), alguns estudos com mutantes deficientes em zeaxantina
têm demonstrado que apenas uma fração relativamente pequena do estoque de zeaxantina é
de fato necessária para o desenvolvimento da completa capacidade de extinção não-
fotoquímica associada com a zeaxantina (Niyogi et al., 1998; Horton et al. 2008). Tomados
em conjunto, essas informações suportam a sugestão de que níveis elevados de zeaxantina
podem estar relacionados com outros processos fotoprotetores além do NPQ (Baroli et al.,
23
2003; Niinemets et al., 2003). Possivelmente, a zeaxantina, per se, pode atuar diretamente
como um antioxidante no cloroplasto, especialmente protegendo componentes altamente
insaturados das membranas dessa organela (Havaux e Niyogi, 1999; Baroli et al., 2003).
Isso auxiliaria na fotoproteção das folhas de T
4
, que permanecem, provavelmente, sob
maior pressão de excitação (taxas fotossintéticas similares, porém sob maiores irradiâncias)
que as folhas de T
3
. Caso ocorrente, essa fotoproteção adicional se tornaria particularmente
importante, na medida em que não se detectou nenhuma diferença nas atividades de três das
principais enzimas do metabolismo antioxidante, ao compararem-se aquelas folhas.
Quando a capacidade de dissipação do excesso de energia de excitação é saturada, a
atuação eficiente do sistema enzimático antioxidativo pode ser de fundamental importância
na proteção celular, limitando a ocorrência do estresse oxidativo. Enquanto a SOD é
distribuída em vários compartimentos celulares (e.g. mitocôndria, cloroplasto), a APX é
tipicamente cloroplastídica (Bray et al., 2000), enquanto a CAT se restringe basicamente
aos peroxissomos (Buchanan & Wolosiuk, 2006). Neste trabalho, a atividade das enzimas
antioxidantes diferiu entre os tratamentos em extensão relativamente alta. Sugere-se,
portanto, uma elevada capacidade de ajustamento do sistema enzimático antioxidante do
cafeeiro, em resposta à variabilidade espacial da irradiância. É digno de nota o fato de o
índice de plasticidade associado à CAT ter sido maior que aquele associado à SOD e APX.
Registre-se que a CAT é a principal enzima responsável pela remoção de H
2
O
2
produzido
na fotorrespiração (Buchanan & Wolosiuk, 2006) e, portanto, a maior plasticidade dessa
enzima deve refletir, pelo menos indiretamente, variações na magnitude da taxa de
fotorrespiração na copa do cafeeiro.
4.3. Desempenho fotossintético das folhas de sombra e de sol em resposta à
disponibilidade de luz
Diferentemente do esperado, as variações em J
max
, V
cmax
e ACO
2
foram mínimas, ou
mesmo inexistentes, entre as folhas dos tratamentos analisados. Em função das diferenças
na concentração de N por unidade de área, e também de diferenças de AFE entre as folhas
dos tratamentos, a quantidade de maquinaria fotossintética por unidade de área foliar deve
também ter variado. Por conseguinte, comparando-se as folhas de T
1
e T
4
, os valores de
ACO
2
, se expressos em base de massa ou em base de N, seriam 73% e 50%,
24
respectivamente, maiores nas folhas mais sombreadas. Aparentemente, estes resultados são
consistentes com um padrão de aclimatação da maquinaria bioquímica de plantas de sol, e
que esse padrão não se modificaria, mesmo quando uma folha está sob irradiâncias
substancialmente inferiores à sua irradiância de saturação. Com efeito, Araújo et al. (2008)
propuseram que variáveis fisiológicas diretamente envolvidas com o ganho de carbono do
cafeeiro não se ajustariam à disponibilidade de luz; todavia, aqueles autores não avaliaram
folhas tão intensamente sombreadas como as deste estudo. Em todo o caso, a baixa
capacidade de o cafeeiro ajustar a sua maquinaria bioquímica da fotossíntese à
disponibilidade de luz parece traduzir-se numa estratégia de alocação ineficiente de
recursos. Isso representa uma desvantagem do ponto de vista agronômico, devido
principalmente aos elevados custos metabólicos/energéticos para manutenção de uma
maquinaria fotossintética robusta em folhas submetidas a baixíssimos níveis de irradiância.
Uma questão intrigante emerge ao se compararem os dados da Tabela 2 e Figuras 2 e
3: por que as folhas mais sombreadas, tendo a mesma capacidade de utilização fotoquímica
da irradiância absorvida (evidenciado pelo padrão similar de resposta de qP e Ф
FSII
à luz) e
a mesma capacidade metabólica para utilizar o CO
2
(pelo menos quando em alta
concentração), exibiram diferenças tão marcantes em A
RFA
? Usualmente, menor A
RFA
em
folhas de sombra tem sido atribuído a um menor investimento dessas folhas em enzimas e
outros componentes da maquinaria fotossintética associados à fixação e redução do CO
2
(Walters, 2005; Niinemets, 2007). Essa explicação, pelas razões supramencionadas, não
justifica os dados presentes. A única explicação plausível para o fato de as folhas mais
sombreadas exibirem menor A
RFA
sob níveis normais de CO
2
(38 Pa) deve estar associada a
uma baixa condutância mesofílica. Apesar de essas folhas serem mais finas e com mais
espaços intercelulares, o que favoreceria a difusão gasosa até o cloroplasto (componente
físico da condutância mesofílica) (Warren et al., 2003), tem-se relatado, sistematicamente,
que o sombreamento leva a uma menor condutância mesofílica associada a componentes
metabólicos (e.g., atividade de aquaporinas e da anidrase carbônica) (Flexas et al., 2008).
Em todo o caso, independentemente da irradiância, tem-se demonstrado que o cafeeiro
exibe baixa condutância mesofílica (Hanba et al., 2003; Araújo et al., 2008), mas uma
capacidade fotossintética potencial relativamente elevada (30-40 µmol O
2
m
-2
s
-1
; DaMatta
et al., 2007), o que largamente explica as baixas taxas de fotossíntese normalmente
25
encontradas (Silva et al., 2004; Araújo et al., 2008; Chaves et al., 2008; DaMatta et al.,
2008) e a baixa eficiência fotossintética do uso do N (Araújo et al., 2008). Os dados ora
apresentados parecem suportar a baixa eficiência fotossintética do cafeeiro, em nível de
dossel, caracterizada por um investimento desnecessário em formar uma maquinaria
bioquímica robusta, porém com baixas taxas de fotossíntese.
5-Conclusões Gerais
Os resultados sugerem que o cafeeiro possui algumas características com alta
plasticidade fisiológica/bioquímica e anatômica à disponibilidade de luz, particularmente a
I
c
, que deve estar intimamente relacionada com a aclimatação do café a baixas irradiâncias,
e a capacidade fotoprotetora (concentrações de zeaxantina, DEPS e NPQ), estreitamente
associada com a dissipação do excesso de energia radiante na forma de calor, evidenciando
uma aclimatação adequada a altos níveis de luz, o que se traduz pela ausência de
fotoinibição mesmo na folhagem mais exposta à irradiância. Em síntese, o cafeeiro
apresenta algumas características morfofisiológicas com plasticidade fenotípica adequada
para lhe permitir ajustar-se à disponibilidade de luz. Todavia, a capacidade de aclimatação
à irradiância parece ocorrer às expensas de uma alocação ineficiente de recursos, como o N.
Tomados em conjunto, estes resultados explicam, em boa extensão, o sucesso do cultivo da
espécie à sombra ou a pleno sol, ainda que tenha evoluído em ambientes tipicamente de
sombra, e explicam, em parte, também, a necessidade de aplicação de altas doses de
adubos, particularmente os nitrogenados, para suportar altas produções de frutos.
26
6-Referências
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