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FERNANDA BOVO
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE ROFA E DE MATERIAIS
PARTICULADOS PROVENIENTES DA QUEIMA DE
BIOMASSA NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL DE
CAMUNDONGOS
LONDRINA
2007
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FERNANDA BOVO
AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE ROFA E DE MATERIAIS
PARTICULADOS PROVENIENTES DA QUEIMA DE BIOMASSA
NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL DE CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada para obtenção
do título de Mestre em Patologia
Experimental, da Universidade Estadual
de Londrina
Orientador: Prof. Dr. Mario Augusto Ono
Londrina
2007
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AVALIAÇÃO DA AÇÃO DE ROFA E DE MATERIAIS
PARTICULADOS PROVENIENTES DA QUEIMA DE
BIOMASSA NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL DE
CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada para obtenção
do título de Mestre em Patologia
Experimental, da Universidade Estadual
de Londrina.
Comissão Examinadora
______________________________________
Prof. Dr. Mario Augusto Ono
Universidade Estadual de Londrina
_____________________________________
Prof Dra Maria Angélica Ehara Watanabe
Universidade Estadual de Londrina
______________________________________
Prof. Dr.Paulo Hilário Nascimento Saldiva.
Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo
Londrina
2007
4
Aos meus pais, José Adolfo Bovo e
minha mãe Maria Quessada Bovo, e
minha irmã Andréa Emília Bovo, pelo
apoio e dedicação em todas as
etapas da minha vida.
5
AGRADECIMENTOS
A meus pais José Adolfo Bovo e Maria Quessada, por nunca terem
medido esforços para educação. A minha irmã Andréa Emília Bovo, pela dedicação
e carinho que sempre teve comigo.
Ao meu orientador, prof. Dr Mário Augusto Ono, pelos
conhecimentos e ensinamentos que foram transmitidos a mim durante os seis anos
em que me orientou, os quais serão muito úteis durante a minha vida profissional.
Ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação, Mestrado em
Patologia Experimental, pelos ensinamentos e conhecimentos a nós transmitidos
durante o curso.
Ao prof. Dr Emerson Venâncio pela ajuda nos momentos de dúvidas,
pelos conselhos e pela amizade.
Ao prof. Dr Rubens Cecchini, Dra Sueli Fuemi Yamada Ogatta e a
prof Dra Eiko Itano pelo empréstimo de equipamentos.
A todos os meus colegas de laboratório, em especial a Tatiana
Petroni e Raquely Moreira Lemos, que de alguma forma colaboraram para que este
trabalho fosse concretizado, agradeço a todos vocês a atenção, a amizade e o
companheirismo durante todo o tempo em que estivemos juntos.
A todos da minha turma de mestrado o meu muito obrigada,
especialmente a Cristiane Akemi e Eliana de Vito, pela ajuda durante os
experimentos.
Agradeço aos técnicos Jesus Antônio Vargas e Pedro Sebastião
Dionízio Filho, pela ajuda na realização dos experimentos.
A todos do laboratório de poluição ambiental da faculdade de
Medicina de São Paulo, em especial a Dra Mariângela Macchione, Dra Eliane Tigre
e ao Dr Paulo Hilário Saldiva pela atenção e pelo fornecimento dos materiais
particulados.
A CAPES, CNPq e UEL obrigada pelo apoio financeiro, sem este a
realização desse trabalho não seria possível.
6
“É melhor lançar-se à luta em busca do
triunfo, mesmo expondo-se ao
insucesso, que formar fila com os
pobre de espírito, que nem sofrem
muito nem gozam muito”.
Roosevelt.
7
RESUMO
A poluição ambiental constitui um dos maiores problemas de saúde pública mundial.
Diversos estudos epidemiológicos têm demonstrado associação entre altos níveis de
materiais particulados (M.P.) e aumento de morbidade e mortalidade. Residual Oil
Fly Ash (ROFA) e materiais provenientes de combustão de biomassa têm sido
largamente utilizados em estudos experimentais com o intuito de elucidar o
mecanismo de toxicidade induzido por poluição atmosférica. O objetivo deste
trabalho foi avaliar o efeito de partículas provenientes de queima de Biomassa e
ROFA (proveniente de incinerador e de uma siderúrgica), no sistema imune humoral
de camundongos. Foram avaliados níveis de anticorpos da classe IgG e IgM, e
ativação do sistema complemento. Os resultados obtidos mostraram aumento de
IgG sérica total no grupo exposto a ROFA após o 21 dia de exposição bem como
aumento da ativação do sistema complemento pelas vias clássicas e alternativas
nos soros expostos a todos M.P, sendo esta ativação dose dependente (exceto pela
ROFA de incinerador na via alternativa). Os resultados obtidos sugerem que estes
MP materiais exercem efeitos no sistema imune e que a composição das partículas,
bem como a dose e o tempo de exposição, podem ser fatores importantes na
ativação do sistema complemento e na resposta imune humoral de camundongos.
Palavras –chave: ROFA , Biomassa e Resposta Imune Humoral
8
Abstrat
The ambient pollution is one of the biggest problems of world-wide public health.
Several epidemiological studies have demonstrated associations between high levels
of particulate matter (MP) and increase of morbidity and mortality. Residual Oil Fly
Ash (ROFA) and matter result from biomass burning have been widely used in
experimental studies, with the aim of elucidate the mechanism of toxicity induced by
atmospheric pollution. The aim of this work was to evaluate the effect of matter from
combuston of Biomass and ROFA (provide from a incinerator and from a steel
company), in the humoral immune system of mice. It was evaluated levels of
antibodies IgG and IgM, and activation of the complement system. The results
showed an increase on sera IgG in the group exposed to ROFA after the 21º day of
exposition, as well as increase on activation of classical and alternative pathway of
complement in the serum samples treated with all MP, being this activation
dependent dose (except for the ROFA of incinerator in the alternative pathway). This
data suggests that these MP may influence the immune system and that the
composition of particles, as well as the dose and the time of exposition, may be
important factors in the activation of the complement system and in the humoral
immune of mice.
Key words - ROFA , Biomass and Humoral Immune Response.
9
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .....................................................................................................09
OBJETIVOS..........................................................................................................20
MATERIAIL E MÉTODOS....................................................................................21
RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................31
CONCLUSÕES ...................................................................................................41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................42
10
1- INTRODUÇÃO
1.1 – A Poluição do Ar
A poluição ambiental constitui um dos maiores problemas da humanidade,
não somente em decorrência da influência nas mudanças climáticas global, mas
também por sua ação prejudicial à saúde humana (ROCHA, 2005).
O meio ambiente sofre constantes modificações em virtude da agressão
causada pela poluição. A maioria dos poluentes inaláveis presentes hoje na
atmosfera são os materiais particulados (MP), que são capazes de provocar reações
químicas ou fotoquímicas as quais contribuem para modificar o clima global e local
(FITZGERALD, 1991 e AUSSET et al., 1994).
Entretanto, de acordo com BELL et al. (2004), é na saúde que dados
epidemiológicos mostram os maiores malefícios destes produtos, mesmo em doses
abaixo das preconizadas como seguras pela maioria dos órgãos de controle de ar
ambiental.
Uma associação clara tem sido demonstrada entre altas concentrações de
MP, especialmente partículas com diâmetros menores que 10 µm (MP10), e a
exacerbação de doenças respiratórias e cardiovasculares crônicas. Como no caso
da exposição experimental humana por 2 horas a PM, onde foi encontrado
aumentou neutrófilos no lavado brônquico alveolar (BELL et al., 2004 e HARDER et
al.,2001).
A correlação existente entre MP e determinadas doenças como as
cardiovasculares e asma, entre outras, relatada em estudos epidemiológicos é
confirmada por ensaios toxicológicos experimentais em voluntários e animais.
Exposições por inalação mostram que MP10 tem efeito inflamatório agudo nas vias
aéreas em humanos, resultando em ativação de mastócitos e de neutrófilos, bem
como, no aumento destes últimos (SALVI et al., 1999 e STENFORS et al., 2004).
11
As principais fontes de poluição são produzidas por tráfego de veículos e por
grandes empresas, tais como as siderúrgicas entre outras. A queima de biomassa
(incêndios florestais, queima de lenha ou palha de açúcar) mais freqüente em
centros rurais, também compõe uma parcela importante dos agentes poluidores, o
que mostra que a poluição não se encontra restrita a grandes centros urbanos
(ARBEX et al, 2004).
Estudos sobre os níveis de poluição, em grandes centros urbanos, mostram
concentrações muito elevadas de material particulado atmosférico, com média anual
de 200 a 600 µg/m
3
e pico de concentração exercendo 1000 µg/m
3
(U.N.ENVIROMENT PROGRAM AND WORLD HEALTH ORGANIZATION). Para um
adulto, assumindo um volume total inalado de 20 m
3
em 24 horas, mais de 20000 µg
de partículas podem ser inaladas durante um pico de poluição do material
particulado (NEMMAR et al., 2003).
Figura 1 - Classificação das médias diárias para PTS na estação de
monitoramente “Santa Casa”em Curitiba no ano de 2005.
Fonte: Relatório IAP, 2005.
12
O Instituto Ambiental do Paraná (IAP), vem monitorando regularmente a
qualidade do ar de Curitiba e região metropolitana, desde 1985. Os estudos feitos
pelo IAP mostram que a média de Partículas Totais em suspensão em Curitiba foi de
71,3
e 66,8 µg/m
3
(2004 e 2005 respectivamente) e Araucária 39,7 e 13,53 µg/m
3
(2004 e 2005 respectivamente). Dados deste órgão mostram que no ano de 2005,
houve meses em que a média das concentrações diárias de Partículas Totais em
Suspensão (PTS) apresentou níveis regulares por mais da metade do mês (meses
de maio, junho e julho - figura 1), o que mostra a importância e necessidade do
monitoramento ambiental rígido neste estado.
No estado de São Paulo a Companhia de Saneamento Ambiental é o órgão
responsável pelo monitoramento da qualidade do ar deste estado. Dados deste
órgão mostram que no bairro de Cerqueira César (SP), os principais agentes
responsáveis pela poluição ambiental nos anos de 1996 e 1997 são os veículos
(37%), Carbono secundário (30%) Sulfatos secundários (20%) entre outros, dados
(figura 2).
13
Figura 2 - Contribuição relativa das fontes de poluição do ar (MP 2,5) na cidade de
São Paulo, bairro de Cerqueira César, em 1996/1997.
Fonte: Relatório da CETESB, 2005
Apesar de um grande número de estudos acerca dos efeitos provocados por
estes materiais, tanto na saúde quanto na qualidade de vida, o verdadeiro
mecanismo das alterações provocadas pela poluição, seja por curtos ou longos
períodos de exposição, continua incerto.
1.2 - Classificação e propriedades dos poluentes
Os poluentes atmosféricos são formados por diversos elementos ou
compostos químicos e podem apresentar-se sob a forma gasosa, sólida ou
líquida. Os compostos sólidos constituem o material particulado que podem ser de
fontes naturais (spray marinho, solo, vegetação e erupções vulcânicas) ou
antrópicas, como é o caso da combustão industrial, doméstica e dos veículos
automotores, especialmente aqueles movidos a óleo diesel (BERUBE et al.,
1999).
14
15
Tabela 2 - Fontes, característica e efeitos dos principais poluentes na atmosfera.
Fonte:
CETESB, 2005
16
Os principais poluentes atmosféricos em São Paulo e Região Metropolitana,
bem como suas fontes , segundo a CETESB, estão resumidos na tabela 2.
Trabalhos demonstram que as características químicas do MP são
dependentes de um grande número de fatores tais como: condições atmosféricas
(luminosidade, temperatura, velocidade dos ventos), fontes de emissão e o tamanho
das partículas. Apesar da diversidade nas propriedades das diferentes amostras de
MP, vários constituintes comuns são identificados incluindo o carbono elementar,
alguns compostos orgânicos, traços de metais, Sulfatos e Nitratos em forma de
aerossol e material biológico (CARNELLEY e LE., 2001).
Partículas Totais em Suspensão (PTS) ou MP compreendem partículas de
qualquer tamanho suspensas no ar, sendo que as maiores que 30 - 70 µm
permanecem pouco tempo em suspensão antes de serem depositadas. Esses
materiais podem ser classificados de acordo com seu diâmetro aerodinâmico: MP 10
bruto (menor que 10 µm ), MP 2,5 fino (menor que 2,5 µm ) e Ultrafinas (UF) ou
nanopartículas (menor que 0,1 µm). Eles penetram no trato respiratório sendo
capazes de passar através da barreira sanguínea (SEATON et al., 1995).
O tamanho das partículas inaladas é um fator importante na determinação do
efeito que essas irão exercer nos organismos, uma vez que as partículas maiores
que 10 µm ficam depositadas nas vias aéreas superiores e são removidas pela
atividade ciliar. As menores que 10 µm, especialmente as com diâmetros menores
que 2,5 µm, geralmente resultantes da oxidação incompleta de materiais de carbono
(GHIO et al., 2002) têm potencial para serem depositadas nos alvéolos e parecem
ser as maiores responsáveis pelos efeitos provocados por esses poluentes. É sabido
ainda, que exposições crônicas às partículas finas estão altamente associadas com
aumentos no índice de doenças crônicas, incluindo câncer pulmonar e problemas
cardiovasculares (POPE et al., 2002).
O sistema de clearance mucociliar é uma das defesas individuais mais
importantes contra agentes inalados (MACCHIONE et al., 1995 e WARNNER et al.,
1996). Este sistema é baseado no transporte contínuo do muco das vias áreas para
a orofaringe pelo batimento ciliar (MACCHIONE et al, 1999). Os poluentes podem
provocar irritação da mucosa nasal com edema e alteração das características do
18
muco (SALDIVA et al., 1992 e 1994) o que pode provocar obstrução nasal crônica e
infecção (TREVINO, 1996).
Os diversos poluentes emitidos no ar pela queima de biomassa para obtenção
de energia e de outros materiais pelas indústrias, contêm muitos metais como
Vanadio(V), Ferro(Fe), Níquel(Ni), e Zinco (Zn); (RENDALL et al., 1994). Para
estudos dos efeitos desses componentes na saúde dos indivíduos, diversos MP têm
sido utilizados, porém, um dos grandes problemas está em reproduzir as condições
do ar inalado em ambientes poluídos, em laboratórios experimentais. Assim, o MP
Residual Oil Fly Ash (ROFA) tem sido largamente utilizado para verificar efeitos
toxicológicos em animais e humanos, devido à sua rica composição em diversos
metais e à baixa presença de compostos orgânicos, o que apresenta-se de grande
utilidade em estudos para hipótese de efeitos biológicos mediados especialmente
por metais(GHIO et al., 2002).
Há poucos dados sobre quais características das partículas seriam
responsáveis pelos efeitos à saúde, ou seja, qual a influência de características
como, tamanho do material, área de superfície e componentes químicos e biológicos
na patogenia da poluição.
Estudos recentes têm investigado os mecanismos de ação do MP e, embora
poucos dados estejam disponíveis sobre o assunto, acredita-se que estresse
oxidativo, reação inflamatória e efeitos moduladores do sistema imune estejam
envolvidos (AMARANTE, 2003).
1.3 - ROFA
ROFA é o termo utilizado para o Material Particulado produzido pela queima
de combustíveis fósseis (GHIO et al., 2002)
Esse MP apresenta uma composição peculiar, rica em metais e pobre em
compostos orgânicos (BYRNE e KOSTA., 1978) e, devido a sua composição, tem
19
sido largamente utilizado experimentalmente em estudos que avaliam a resposta
imune aos diversos MP, bem como, na hipótese de serem, os compostos metálicos
presentes no ar, os maiores responsáveis pelos efeitos verificados na imunidade dos
indivíduos expostos à poluição (GHIO et al., 2002).
MIYABARA et al (1998) e FUJIEDA (1998) em experimentos com animais e
humanos, respectivamente, demonstraram que ROFA e outros produtos da
combustão de diesel, podem agir como adjuvantes no sistema imune, além de
promovendo o aumento da inflamação alérgica
DREHER et al.; GAVETT et al. (1997) e KODAVANTI et al. (1998), em
estudos sobre os mecanismos de toxicidade, sugeriram a possibilidade dos metais
de transição solúveis atuar como um dos fatores determinantes na injúria pulmonar
produzida após exposição à ROFA. Além disso, segundo SAMET et al.(1998) e i et
al.(1998), interleucina 6 (IL-6), interleucina 8 (IL-8) e Fator de Necrose Tumoral (
TNF-α) são produzidos por células epiteliais respiratórias quando desafiadas com
ROFA.
Experimentos em animais instilados com ROFA têm demonstrado estresse
oxidativo nos pulmões, que pode ser reproduzido com tratamento com Vanádio
(KADIISKA et al, 1997). Além disso, a inalação ou instilação de concentrações
equivalentes de ROFA provoca respostas inflamatórias semelhantes nos pulmões, o
que mostra que a exposição dos animais por inalação ou por instilação podem ser
utilizadas experimentalmente, uma vez que mostram resultados semelhantes
(COSTA et al., 1998) e esta inflamação persiste por mais de 96 horas, além disso, a
reversão acontece lentamente (PRITCHARD et al., 1996).
Biomassa
O Brasil é o maior produtor de cana – de – açúcar do mundo. Atualmente, 4,5
milhões de hectares do território nacional são utilizados para o plantio de cana,
20
representando um por cento das terras cultiváveis ou o espaço equivalente a duas
vezes o Estado do Piauí (EMBRAPA, 2004).
A queima deliberada ou acidental de vegetação e a fumaça gerada decorrente
dessa queima, causam um impacto importante sobre a saúde das populações
expostas. Esse impacto inclui aumento da mortalidade, das admissões hospitalares,
das visitas à emergência e da utilização de medicamentos, devido a doenças
respiratórias e cardiovasculares, além de diminuição da função pulmonar (WHO,
1999).
A combustão é um processo químico pelo qual um material reage
rapidamente com o oxigênio do ar produzindo luz e calor intenso e, no caso da
biomassa, faz-se em três estágios: ignição, combustão com chama e combustão
com ausência de chama (ARBEX et al., 2004).
A incineração de biomassa (qualquer matéria de origem vegetal ou animal
utilizada como fonte de energia) é a maior fonte doméstica de energia nos países
em desenvolvimento (WHO, 2000). Cerca de 80% da combustão de biomassa
ocorre nos trópicos. Ela é a maior fonte de produção de gases tóxicos, material
particulado e gases do efeito estufa no planeta (CRUTZEN e ANDRAE, 1990),
influenciando química e fisicamente a atmosfera, produzindo espécies químicas que
mudam significativamente o pH da água da chuva (LACAUX et al., 1992; LOSNO et
al., 1991) e afetando o balanço térmico da atmosfera pela interferência na
quantidade de radiação solar refletida para o espaço (WARD et al., 1992).
Vários estudos epidemiológicos mostraram associação entre o nível de
poluição atmosférica e efeitos na imunidade dos indivíduos. Porém, apesar dos
estudos experimentais com o intuito de propor um mecanismo imunológico para tais
efeitos, não se pode afirmar ao certo qual ou quais as principais células e eventos
imunes são os principais responsáveis por estes danos.
21
2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivos Gerais
· Avaliar o efeito de ROFA e de Materiais Particulados provenientes da Queima de
Biomassa na Resposta Imune Humoral de camundongos.
2.2 - Objetivos específicos
· Avaliar o efeito in vivo de ROFA e de Materiais Particulados provenientes da
Queima de Biomassa sobre os níveis de anticorpos séricos da classe IgG e IgM
em camundongos.
· Avaliar o efeito in vitro de ROFA e de Materiais Particulados provenientes da
Queima de Biomassa nas vias Clássica e Alternativa do complemento de
camundongos.
22
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1. - Caracterização das Partículas
Esta fase do experimento foi realizada em parceria com o Laboratório de Poluição
Experimental (LPAE) do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo
3.1.1 - Experimento com ROFA
Foram utilizados dois tipos de poluentes neste experimento. As partículas
designadas de ROFA HU representam o MP obtido do incinerador movido por óleo
diesel do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo. As partículas
denominadas ROFA SID representam MP retido no precipitador eletrostático
instalado em uma grande siderúrgica no Brasil. Para controle do experimento, foi
utilizada água destilada estéril.
Os elementos componentes das ROFA HU e SID foram determinados por Medeiros
Jr et al. (2004) pelo método ativação com Nêutrons e encontram-se na Tabela 1.
23
Tabela 1 - Concentrações dos elementos químicos nas ROFA SID e HU
determinadas por análise da ativação de Nêutrons com as médias e
correspondentes desvios padrões (Fe em percentagem).
Elemento Químico ROFA HU ROFA SID
As mg g
-1
9,3 ± 10 61,0 ± 1,0
Br mg g
-1
8,7 ±- 0,6 1482 ± 19
Ce mg g
-1
51,1 ± 0,4 16,3 ± 0,3
Co mg g
-1
122,9 ±- 3,1 9,90 ± 0,25
Cr mg g
-1
32,4 ±- 0,4 107,7 ± 1,4
Fe (%) 3,28 ±-0,07 44,6 ± 0,1
La mg g
-1
972 ± 12 10,3 ± 0,1
Mn mg g
-1
1977 ± 14 3884 ± 24
Rb mg g
-1
11,4 ±- 1,1 719,7 ± 1,0
Sb mg g
-1
39,8 ±- 0,7 2,27 ± 0,09
Se mg g
-1
20,5 ±- 0,2 154,4 ± 0,8
V mg g
-1
1816 ± 220 35 ± 4
Zn mg g
-1
115,7 ± 1,5 491,9 ± 3,1
A ROFA HU apresentou altas concentrações de Ce, Co, La e V, enquanto que
44,6% da composição ROFA SID foi de Ferro.
Os outros elementos encontrados em alta concentração foram Br, Cr, Mn, Rb, Se e
Zn. Quase todas as partículas tiveram diâmetros menores que 10 mm, sendo que a
média e desvio padrão foram de 1,2 ± 2,18 mm para ROFA HU e 1,2 ± 2,24 mm
para ROFA SID.
Aproximadamente 98% das ROFA HU e SID apresentaram diâmetros menores que
2,5 mm.
24
3.1.2 - Experimentos com partículas de queima de Biomassa
Foram colhidas Partículas Totais em Suspensão na cidade de Araraquara no
Sudeste do Brasil durante 497 dias; dentre os quais 175 dias não havia queima de
cana-de-açúcar e 318 dias com queima de cana. A concentração diária das PTS
(mg/m
3
) foram obtidas utilizando o equipamento Handi-Vol.
As partículas obtidas foram incubadas em estufa a 50 ºC até que suas massas,
após repetidas pesagens, ficasse constante em decorrência da eliminação de toda
a água retida nos filtros. Com isto, foi possível determinação da massa do Material
Particulado (MP) + massa do filtro (F). Uma vez que tínhamos a massa do filtro sem
partícula (F), pode-se determinar a massa do MP, pela equação:
Massa de MP + F - massa de F = a massa de MP ou PTS
3.2 - Grupos experimentais
Em cada um dos experimentos foram utilizados 30 camundongos suíços, machos,
com peso entre 20-30 g, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual
de Londrina, os quais foram mantidos sob ambientalização no biotério setorial do
Centro de Ciências Patológicas da Universidade Estadual de Londrina, por 7 dias
antes do início dos experimentos com água e ração comercial ad libitum. Os 30
animais foram distribuídos em 5 grupos (6 animais em cada grupo) e receberam
tratamento com diferentes MP por instilação nasal, diariamente durante os 28 dias
de experimento.
3.2.1 - Experimento com ROFA
Grupo Controle - grupo exposto apenas à água destilada estéril
25
Grupo ROFA HU 1 - grupo exposto a 1 mg/dia de ROFA HU
Grupo ROFA HU 10 - grupo exposto a 10 mg/dia de ROFA HU
Grupo ROFA SID 1 - grupo exposto a 1 mg/dia de ROFA SID
Grupo ROFA SID 10 - grupo exposto a 10 mg/dia de ROFA SID
3.2.2.-.Experimento com Partículas de Queima de Biomassa
Grupo Controle - grupo exposto apenas à água destilada estéril.
Grupo Queima 1 - grupo exposto a 1 mg/dia de partículas de queima de biomassa.
Grupo Queima 10 - grupo exposto a 10 mg/dia de partículas de queima de biomassa.
Grupo Não Queima 1 - grupo exposto a 1 mg/dia de MP provenientes de períodos
sem queima biomassa.
Grupo Não Queima 10 - grupo exposto a 10 mg/dia de MP proveniente de períodos
sem queima biomassa.
3.3 – Imunizações
Em ambos os experimentos os camundongos foram submetidos a três imunizações
com antígeno (eritrócitos de carneiro 2%) via intraperitonial (IP), nos dias 0, 7 e 14.
O antígeno inoculado foi preparado pela adição de eritrócitos de carneiro (lavadas
três vezes com salina 0,85%) a solução de Tampão Fosfato-Salina (PBS) estéril, na
concentração final de 2%. Foram inoculados 200mL desta suspensão em todos os
camundongos.
26
3.4- Preparo das suspensões de Poluentes
Nos experimentos com ROFA HU e SID, as partículas foram preparadas segundo
Medeiros Jr et al. (2004), tendo sido modificado o veículo descrito (salina), por água
destilada. As partículas foram pesadas e diluídas em água destilada estéril, na
concentração de 1 mg/mL. Para o experimento com partículas de queima de
biomassa, o MP retido em filtros foram retiradas do filtro e diluído em água destilada
estéril, na concentração de 1 mg/mL. Essas suspensões foram submetidas ao
sonicador durante três tempos de 20 minutos, aliquotadas em tubos do tipo
eppendorf e estocadas sob refrigeração. Para a concentração de 0,1 mg/mL,
efetuou-se a diluição da solução estoque em mesmo veículo estéril. Antes das
instilações diárias, as suspensões eram submetidas a vigorosas agitações.
Para os experimentos de avaliação de hemólise pelo sistema complemento, as
concentrações de 1 µg/ µL e 10 µg/ µl das suspensões dos MP acima tiveram suas
concentrações de NaCl alteradas para 0,85%.
3.5 - Administração dos poluentes
A administração do poluentes foi efetuada segundo a técnica descrita por Medeiros
Jr et al. (2004) Foram administrados, com micropipeta, 10 mL das suspensões
citadas no item 3.4 em uma das narinas do animal acordado, diariamente pelo
período de 28 dias. Essa instilação provoca um reflexo de apnéia seguida de uma
profunda inspiração que leva o líquido até os pulmões.
3.6 - Obtenção das amostras de soro
Nos dois experimentos realizados as amostras de soros foram colhidas
imediatamente antes à primeira imunização (dia 0), e nos dias 7, 14, 21 e 28 dos
27
experimentos, tendo sido realizado no 28º dia, sangria total por punção cardíaca,
com posterior sacrifício dos animais.
Para a obtenção dos soros, os animais foram anestesiados com éter etílico e 50 mL
de sangue foi colhido pela veia caudal com imediata cauterização do local.
O sangue obtido foi centrifugado a 4000 rpm por 5 minutos, o soro separado e
armazenado a –20ºC.
Dia 0
Dia 7
Dia 14
Dia 21
Dia 28
Retirada de sangue
Inoculação de eritrócito de
carneiro 2% (1º dose)
Instilação de 10uL
de MP diariamente
Instilação de 10uL
de MP diariamente
Retirada de sangue
Inoculação de eritrócito de
carneiro 2% (2º dose)
Retirada de sangue
Inoculação de eritrócito de
carneiro 2% (3º dose)
Instilação de 10uL
de MP
diariamente
Retirada de sangue
Sacrifício com sangria total
Instilação de 10uL de
MP diariamente
28
Figura 1- Delineamento do experimento da avaliação do efeito de MP na resposta
imune humoral (IgM e IgG) de camundongos imunizados com eritrócitos de carneiro.
3.7. - Avaliação da Resposta Imune Humoral de camundongos tratados com
MP provenientes de poluição atmosférica.
3.7.1. - Preparação do Antígeno de membrana de Eritrócitos de carneiro
A preparação do antígeno foi efetuada conforme a técnica descrita por Dodge et al.
(1963) e modificada por Ladics (2006).
Foram colhidos, por punção venosa, 20 mL de sangue de carneiro em tubos
plásticos contendo o mesmo volume da solução anticoagulante Alsever. O material
foi incubado overnight a 4 ºC e centrifugado por 15 minutos a 1000 g. O
sobrenadante foi retirado e o precipitado, após três lavagens com salina 0,9%, foi
ressuspendido em 32 mL de solução TRIS-HCl (0,15 M) com EDTA (0,1 mM, pH
7,6).
A suspensão foi novamente centrifugada a 4 ºC por 30 minutos à 25000g. O
precipitado obtido foi diluído em 38 mL do mesmo tampão, centrifugado e, esse
processo foi repetido até que toda a hemoglobina visível fosse retirada. A solução
sem hemoglobina visível obtida foi filtrada e novamente submetida à centrifugação,
nas mesmas condições anteriores, sendo que este último pellet foi ressuspendido
em solução SDS 0,1 %. Foram feitas alíquotas de 1 mL e estocadas à -20ºC.
A concentração de proteínas foi dosada pelo método de Bradford (1976)
3.7.2- Ensaio de ELISA
Microplacas de poliestireno de 96 cavidades (COSTAR
R
) foram sensibilizadas com
100 ml do antígeno de membrana de eritrócitos de carneiro (1mg/mL) (item 3.7.1) em
tampão Carbonato (pH 9,6) e incubadas a 4 ºC durante 18 horas. As placas foram
lavadas com solução de Tampão Fosfato Salina (PBS) - Tween 20 % por três vezes
e bloqueadas com 150 ml de solução PBS - Leite desnatado 1 % por uma hora. A
29
seguir as placas foram novamente lavadas com PBS - Tween e incubadas por 1
hora a 25 ºC com os soros diluídos 1:100 em PBS-Leite 1%. Novas lavagens com
PBS - Tween foram realizadas e adicionou-se 100 ml de substrato, anti- IgG ou anti -
IgM de camundongo e incubou-se por mais uma hora. O mesmo procedimento de
lavagem foi realizado e em seguida 100 ml de substrato (10 ml de tampão acetato de
sódio 0,1 M; 100 µl de peróxido de oxigênio e 100 µl de Tetrametilbenzidina (TMBZ)
foi incubado por quinze minutos, a reação foi bloqueada pela adição de 50 ml de
Ácido Sulfúrico 1N, sendo a absorbância determinada em Multi-Skan a 450nm.
3.7.3 - Avaliação in vitro da influência dos MP na ativação do Sistema
Complemento de camundongos
Para avaliar a habilidade dos vários materiais particulados em ativar o sistema
complemento de camundongos, foi obtido uma mistura de soros (sangria por punção
cardíaca de 20 animais) de camundongos suíços não infectados. Os soros obtidos
foram aliquotados e armazenados a -20ºC até a realização do ensaio.
Para a avaliação da hemólise foram utilizadas suspensões de eritrócitos de carneiro
(via clásica) e de coelho (via alternativa).nestes experimentos.
Para o preparo da suspensão de eritrócitos de carneiro foram colhidos, por punção
venosa, 5 mL de sangue de carneiro em tubos plásticos contendo o mesmo volume
da solução anticoagulante Alsever. O material foi incubado overnight a 4 ºC e
centrifugado por 15 minutos à 1000 g. Os eritrócitos do pellet foram lavados três
vezes com tampão HEPES e após a centrifugação final, ressuspendidas no mesmo
tampão na concentração final de 0,6%.
Para o preparo da suspensão de eritrócitos de coelho foram colhidos, por punção
cardíaca, 5 mL de sangue de coelho em tubos plásticos contendo o mesmo volume
da solução anticoagulante Alsever. O material foi incubado overnight a 4 ºC e
centrifugado por 15 minutos à 1000 g. Os eritrócitos do pellet foram lavados três
vezes com Tampão HEPES Mg
+2
/EGTA
após a centrifugação final, ressuspendidas
no mesmo tampão na concentração final de 0,6%.
30
3.7.3.1 - Avaliação da ativação da Via Alternativa
Foram incubados 100 µl da mistura de soros de camundongos, com 10 µl da
suspensão de 0,1 e 1 mg/mL das partículas (ROFA HU, ROFA SID, Queima e Não
Queima de Biomassa), por 90 minutos a 37ºC em microplacas de 96 cavidades de
fundo chato. Adicionou-se em seguida, 50 µl da suspensão de eritrócitos de coelho
0,6%, seguido da adição de 50 µl do tampão diluente. As placas foram incubadas
durante 90 minutos sendo o volume transferido para tubos tipo eppendorf, os quais
foram centrifugados à 2000 rpm por 3 minutos e o sobrenadante transferido para
placas de fundo chato para posterior leitura à 405 nm.
3.7.3.2 Avaliação da Via Clássica
Obtenção de Anticorpos Anti - hemácias de carneiro
Foram inoculados IP em camundongos suíços com peso entre 20-30g, 200 µl de
suspensão estéril, de eritrócitos de carneiro 2% e obteve-se o soro desses animais
seis dias após a inoculação. O soro obtido foi incubado a 50ºC por 30 minutos para
inativação do complemento.
Realização do Ensaio
Foram incubados 80 µl da mistura de soros de camundongos (item 3.7.3), com 10 µl
da suspensão de 0,1 e 1 mg/mL das partículas (ROFA HU, ROFA SID, Queima e
Não Queima de Biomassa), por 90 minutos a 37ºC em microplacas de fundo chato
de 96 cavidades. Adicionou-se em seguida, 50µl da suspensão de eritrócitos de
carneiro 0,6% em Tampão Hepes e ainda 50 µl de anticorpo anti-eritrócitos de
carneiro diluído 1/10 em mesmo tampão. As placas foram incubadas por 90 minutos
e o volume transferido para tubos tipo eppendorf, que foram centrifugados a 2000
rpm por 3 minutos e o sobrenadante transferido para placas de fundo chato para
leitura a 405 nm.
31
Como controles foram utilizados os respectivos tampões e um segundo controle foi
realizado com suspensão de partículas de grafite na concentração de 1mg/dL(nos
mesmo volumes dos poluentes)
3.8 - Análise Estatística
As amostras foram analisadas estatisticamente pelo teste Tuckey sendo
considerado significativo o resultado, quando p< 0,05.
32
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
A imunotoxicidade pode ser definida como os efeitos adversos de agentes ou
produtos químicos no Sistema Imune (KAROL, 1998). Existem quatro tipos de
efeitos adversos que podem ser imunomediados: imunossupressão,
imunoestimulação, hipersensibilidade e autoimunidade (DESCOTES, 2006).
Diversos agentes têm sido associados com imunossupressão em animais,
incluindo agentes químicos, bioaeresóis e agentes físicos como luz ultra-violeta
(SIPES et al., 1997). Imunoestimulação pode ser resultado de exposição química.
Uma das mais importantes doenças alérgicas, no contexto da exposição ocupacional
e ambiental, é a hipersensibilidade respiratória, que é causada por baixas
concentrações de moléculas de baixa massa molecular e por altas concentrações de
moléculas de alta massa molecular (GRAHAN et al., 1997).
Apesar da descrição de inúmeros modelos de ensaios toxicológicos
empregados para a avaliação imunotoxicológica de elementos ou compostos
químicos, não há um consenso do melhor ensaio a ser empregado. Vários fatores,
entre eles as propriedades da própria substância, tamanho, solubilidade entre
outros, devem ser levados em conta para a escolha do melhor ensaio a ser utilizado.
A análise imunotoxicológica da Reposta Imune Humoral geralmente é
realizada por ensaio de Células Formadoras de Placa (PFC) que detecta Anticorpo
IgM para eritrócitos de carneiro (SBRC). É um teste bastante sensível dentre os
empregados para avaliar efeitos imunotoxicológicos em exposições a agentes
químicos (TEMPLE et al.,1993).
Outro ensaio mais recentemente utilizado em análises imunotoxicológicas da
Resposta Imune Humoral é o ELISA para detecção de anticorpos IgM contra
eritrócitos de carneiro (LADICS, 2006).
33
Estudos com vários agentes químicos imunotóxicos demonstraram que ELISA
para detecção de anticorpos IgM para hemácias foi pelo menos tão sensível quanto
o método de PFC (TEMPLE et al., 1993 e 1995).
O ensaio de ELISA, por outro lado, apresenta várias vantagens sobre o
método de PFC. Pode ser processado em horas, enquanto PFC requer vários dias,
além disso, ELISA diminui o número de animais empregados por estudo, uma vez
que os animais não precisam ser sacrificados para a obtenção das amostras de
soro. As amostras de soro obtidas podem ser otimizadas e empregadas na dosagem
de outras classes de anticorpos (JOHNSON et al., 2000) como é o caso desse
trabalho, onde além de IgM, anticorpos da classe IgG também foram analisadas.
Todos os anos milhões de pessoas morrem ou sofrem sérios danos à saúde,
causado pela poluição do ar. Fortes evidências epidemiológicas emergiram,
especialmente na última década, demonstrando a associação entre a concentração
de M.P. ambiental e o aumento da morbidade e mortalidade, os indivíduos
portadores de doenças respiratórias (asma, e doenças obstrutivas crônicas), e
aqueles portadores de doenças cardiovasculares são especialmente atingidos
(ARBEX et al, 2004).
Apesar do aumento de estudos a respeito dos efeitos desses poluentes à
saúde, os verdadeiros mecanismos biológicos envolvidos ainda não estão bem
definidos, não está esclarecido quais características e componentes dos poluentes
são os responsáveis por seus efeitos tóxicos ao organismo, o que mostra a
importância de trabalhos nesta área (MUDWAY et al, 2004 e OLIVEIRA et al, 2006).
As duas classes de imunoglobulinas componentes da Resposta Imune
avaliadas neste trabalho são moléculas de grande importância na defesa aos
variados antígenos, e por este motivo foram escolhidas. Os anticorpos da classe IgM
são os que aparecem no início da resposta imune humoral, e tendem a apresentar
níveis mais elevados nas primeiras semanas após o contato com os antígenos. As
imunoglobulinas da classe IgG, aparecem mais tardiamente em relação as IgM, e
têm seus títulos mais elevados após as primeiras semana de contato com o
antígeno.
34
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Absorvância 450 nm
0 7 14
dias
Controle
ROFA HU 1
ROFA HU 10
ROFA SID 1
Figura 1: Perfil da Resposta Imune - Níveis de Anticorpos da classe IgM em soros
de camundongos expostos e não expostos in vivo a ROFA HU e SID, detectados
pelo Método de ELISA .
35
Figura 2: Perfil da Resposta Imune - Níveis de Anticorpos da classe IgG classe em
soros de camundongos expostos e não expostos in vivo a ROFA HU e SID,
detectados pelo Método de ELISA .
Os resultados obtidos mostram que nos grupos de camundongos expostos a
ROFA não houve diferenças significativas estatisticamente entre os animais do
grupo controle e os tratados com M.P., embora tenha sido observado uma tendência
dos grupos HU e SID, em ambas as doses, a apresentarem níveis mais elevados de
imunoglobulinas da classe IgM em relação ao grupo controle (figura 1).
A figura 2 mostra a resposta imune produzida por camundongos imunizados
com eritrócitos de carneiro e expostos por 28 dias a ROFA. A partir do 14º dia há um
aumento nos níveis de anticorpos da classe IgG Esta imunoestimulação foi
significativa estatisticamente, no grupo de animais expostos a ROFA SID 1µg em
relação ao grupo de animais não expostos a MP, no 28º dia de experimento (figura
2).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Absorvância 450 nm
0 7 14 21 28
dias
Controle
ROFA HU 1
ROFA HU 10
ROFA SID 1
ROFA SID 10
*
*
36
Foi verificado ainda, uma tendência em todos os grupos expostos a ROFA a
apresentarem maiores níveis destes anticorpos em relação ao grupo controle (figura
2).
Estes dados estão de acordo com LEONARDI et al (2000), que relataram
aumento de linfócitos B (dosados por citometria de fluxo) bem como de IgG total em
crianças de 9 a 11 anos, expostas a MP na Bulgária, República Tcheca, Hungria,
Polônia, Romênia e Eslováquia.
WINKLER et al. (1996) também relataram aumento nos níveis plasmáticos de
anticorpos da classe IgG no soro de mulheres que habitavam ambientes poluídos na
Alemanha, quando comparadas a mulheres que habitavam áreas não poluídas.
Considerando-se que em nosso trabalho o tempo de exposição e as doses
utilizadas para as duas ROFA foram iguais, os resultados de diferentes níveis de
anticorpos obtidos, sugerem que a composição e a origem da ROFA são fatores
importantes no efeito destes materiais na resposta imune humoral.
Outros trabalhos mostram que a composição das partículas, incluindo a
acidez e os metais de transição, o conteúdo de hidrocarbonetos além da
biodisponibilização destes tóxicos, são fatores considerados importantes na
determinação da atividade biológica das partículas.(Mudnay et al., 2004 e OLIVEIRA
et al., 2005).
Os dados aqui obtidos sugerem que há uma imunoestimulação provocada
pelas partículas provavemmente, desviando para uma Reposta tipo TH
2
. Porém,
ensaios com dosagens de citocinas ou subclasses de IgG são necessários para
avaliar o perfil de resposta predominante.
No Brasil, a utilização de álcool hidratado como combustível de veículos
automotores, ou mistura álcool/gasolina, trouxe benefícios para o meio ambiente e
para a saúde da população. Porém, esse aumento na utilização do álcool provocou
um substancial aumento da área utilizada para cultivo de cana-de-açúcar no Brasil.
Nas regiões em que há cultivo e colheita de cana, a qualidade do ar foi prejudicada
37
devido o aumento na quantidade de cana queimada, o que gera aumento de
poluentes atmosféricos (ARBEX et al., 2004; DUCLOS, 1990).
Estudos a respeito do efeito de materiais particulados provenientes da queima
de biomassa no sistema imune são escassos. No Brasil, onde esta cultura agrícola
apresenta grande importância ambiental e econômica, estudos sobre os possíveis
impactos na saúde de indivíduos freqüentemente expostos a esses materiais são de
fundamental importância.
Figura 3: Perfil da Resposta Imune - Níveis de Anticorpos da classe IgM em soros
de camundongos expostos in vivo a partículas de queima e não-queima de
biomassa detectados pelo Método de ELISA.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
Absorvância 450 nm
0 7 14
dias
Controle
Queima 1
Queima 10
Não Queima 1
Não Queima 10
38
Figura 4: Perfil da Resposta Imune – Níveis de Anticorpos da classe IgG em soros
de camundongos expostos in vivo a partículas de queima e não- queima de
biomassa detectados pelo Método de ELISA.
Os resultados obtidos mostram que nos grupos de camundongos expostos a
partículas de queima de biomassa não houve diferenças significativas
estatisticamente nos níveis de anticorpos destes animais em relação ao grupo
controle, embora tenha sido observado uma tendência a maiores níveis de IgM em
todos os grupos expostos aos M.P. quando comparado ao grupo não exposto(figura
3). Esta tendência também pode ser visualizada nos níveis de imunoglobulinas da
classe IgG, nos grupos expostos a maiores doses de MP (figura 4).
Estes dados sugerem que os efeitos na saúde provenientes da queima de
cana-de-açúcar podem permanecer mesmo após os períodos de combustão. E que
a queima de biomassa é pelo menos tão tóxica quanto o M.P. emitido por empresas
da
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Absorvância 450 nm
0 7 14 21 28
dias
Controle
queima 1
queima 10
n. queima 1
n. queima 10
39
Considerando que o sistema complemento é um dos principais mecanismos
efetores do sistema imune (KIRSCHFINK e MOLLNES, 2003), neste trabalho
avaliou-se o efeito dos diferentes materiais particulados no sistema complemento de
camundongos.
O efeito dos MP no sistema complemento foi avaliado por meio de incubações
dos materiais de queima de biomassa e de ROFA SID e ROFA HU, com soros de
camundongos. A percentagem de hemólise dos eritrócitos em cada grupo foi
calculada e comparada com a hemólise obtida no grupo controle.
0
20
40
60
80
100
120
Sid 0.1 Sid1 Hu 0.1 HU 1 cana0.1 cana 1 controle cont.
graf.
Material Particulado
% de Lise
Figura 5: Análise da Via Clássica do sistema complemento em soros de
camundongos expostos in vitro a materiais particulados.
C
D
B
C
C
F
A
A
40
0
20
40
60
80
100
120
Sid 0.1 Sid1 Hu 0.1 HU 1 cana0.1 cana 1 controle cont.
graf
Materiais Particulados
% de Lise
Figura 6: Análise da Via Alternativa do sistema complemento em soros de
camundongos expostos in vitro a materiais particulados.
Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que as partículas provenientes
de queima de biomassa, ROFA SID e ROFA HU são capazes de ativar a cascata do
complemento tanto pela via clássica quanto pela via alternativa, uma vez que houve
diminuição significativa na lise dos eritrócitos em todos os grupos expostos aos
poluentes quando comparado ao controle sem partículas (figuras 5 e 6) e ao controle
co partículas de carbono.
Estes dados estão de acordo com trabalhos em crianças no Japão (SHIMA et
al.,1999) e adultos (HADNAGY et al., 1996), que mostram que indivíduos expostos a
poluição atmosférica podem apresentar aumentos nas concentrações séricas de
produtos da ativação do complemento.
WINKLER et al (1996), na Alemanha, obteve valores de percentagem de
componentes do sistema complemento acima dos normais no soro, comparando
populações de mulheres de ambientes poluídos com não poluídos.
D
E
E
E
B
C
A
A
41
Trabalhos com MP provenientes de fumaça de cigarro e também com
partículas de combustão de diesel, mostraram que esses materiais ativam a via
alternativa do complemento (ROBBINS et al., 1991 ; KANIMITSU et al., 1998).
Os dados apresentados na Figura 5 mostram que a diminuição provocada na
lise de eritrócitos do carneiro pela via clássica do complemento, pode ser dose
dependente, uma vez que as maiores doses de MP apresentaram menores
percentagens de lise.
Na Via Alternativa (figura 6), a diminuição na hemólise obtida, não foi dose
dependente nos grupos expostos as partículas provenientes da queima de biomassa
e HU, uma vez que não houve diferenças significativas estatisticamente entre as
doses testadas destes grupos. Apenas os grupos expostos às partículas ROFA SID
mostraram diminuição dose dependente de hemólise (figura 6).
Estes dados estão de acordo com BEUKELMAN et al. (1986) que mostraram
que a atividade do complemento sofre depressão dose-dependente em
camundongos expostos a partículas de poeira doméstica na via clássica porém não
na via alternativa do complemento
Considerando a freqüência com que indivíduos podem estar expostos a MP
proveniente de grandes centros urbanos e industriais, ou ainda a MP oriundos de
áreas de queima de biomassa é importante que estudos a respeito dos efeitos
induzidos por poluentes no sistema imune sejam realizados.
Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os MPs avaliados podem
interferir na resposta imune humoral de camundongo.
O impacto de poluentes do ar no sistema imune continuará a ser estudado em
nosso laboratório em busca dos possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos
observados neste estudo.
42
5 - CONCLUSÕES
· ROFA proveniente da siderúrgica induziu aumento nos níveis de anticorpos
da classe IgG em camundongos expostos por mais de 21 dias a estes
materiais.
· Os materiais particulados provenientes da queima de biomassa bem como
ROFA ativam o sistema complemento pelas Vias Clássicas e Alternativas.
· A ativação das Vias Clássicas e Alternativas do complemento foram dose
dependentes nos animais expostos a materiais particulados provenientes da
queima de biomassa e ROFA (exceto pela ROFA HU na via alternativa).
43
6 - REFERÊNCIAS
AMARANTE, A.P.C. Associação entre M.P. atmosférico e hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos e sintomas respiratórios em pacientes com asma
brônquica na cidade de São Paulo - Tese Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo. 2003
AUSSET, P.; Lefevre R.; Philippon, J.et al. Présence constante de cendres volantes
industrielles dans les croûtes noires d’altération superficielles de monuments français
em calcaire compact. Acad. Sci.Paris., 318(2): 493-499, 1994.
ARBEX,M.A.; Cançado J.E.D.; Pereira L.A.A. Queima de Biomassa e efeitos na
saúde.J.Bras Pneumol. 30(2) 158-175, 2004.
BELL, M.L.; Samet, JM; Dominici, F. Time-series studies of particulate matter. Annu
Rev Public Health., 25: 247-280, 2004.
BERUBE, K.A; Jones, T.P; Williamson ,B.J. et al Physicochemical characterisation of
diesel exhaust particles: Factors for assessing biological activity. Atmospheric
Environment. 33:1599-1614, 1999.
BEUKELMAN, C.J.; Radmaker, P.M. et al. House dust allergen activates the
classical Complement pathway in mouse serum Imunology Letters. 13:159-164,
1986.
44
BRADFORD, M. M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72:
248-254, 1976.
BYRNE, A.R.; Kosta, L. Vanadium in foods and in human body fluids and tissues. Sci
Total Environ., 10: 17-30, 1978.
CARNELLEY, T.; Le C. Correlation between chemical characteristics and biological
reactivity of particulate matter in ambient air. Environmental Sciences Division
Alberta. 2001.
CETESB (Companhia de tecnologia de Saneamento Ambienta). Relatório de
qualidade do ar do estado de São Paulo. - Secretaria do Estado do Meio
Ambiente. São Paulo: CETESB, 2005. Disponível em url:http//:www.cetesb.sp.gov.br
COSTA, D.L.; Lehmann, J.R. ; Jaskot, R.W. et al. Pulmonary Toxicity of residual oil
fly ash in the rat: inhalation versus intratracheal installation. Toxicol Sci 42: 404,
1998.
CRUTZEN, P.J.; Andreae, M.O. Biomass burning in the tropics; impacts on
atmospheric chemistry and biogeochemical cycles. Science., 250: 1669-78, 1990.
DESCOTES, J. Methods of evaluating immunotoxicity Expert Opinion on Drug
Metabolism & Toxicology 2(2): 249-259, 2006.
45
DODGE, J.T.; Mitchell, C.; Hanahan, D.J. The preparation and chemical
characteristics of hemoglobin-free ghosts of human eryhrocytes. Arch Biochem.
100: 119-130, 1963.
DREHER, K.L.; Jaskot R.H.; Lehmann J.R. et al. Soluble transition metals mediate
residual oil fly ash induced acute lung injury. J.Toxicol Environ Health 50:285-305,
1997.
DUCLOS, P.; Sanderson L.M., Lipsett M. The 1987 Forest Fire Disaster in California:
assessment of emergency room visits. Environ Health. 45:53-8.
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Agroecologia da
cana-de-açúcar. Disponível em <http://www.cana.cnpm.embrapa.br/agroeco.html
acessado em 8 de janeiro de 2004
FITZGERALD, J.W. Marine aerosols: a review, Atmos.Environ. 25: 533-545, 1991.
FUJIEDA, S. ; SANCHEZ, D.D.; SAXON A. Combined Nasal Challenge with Diesel
Exhaust Particles and Allergen Induces In Vivo IgE Isotype Switching. American
Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 19(3): 507-512, 1998
GAVETT, SH, Madison, SL, Dreheer, K.L. et al Metal and sulfate composition of
residual oil fly ash determines airway hyperreactivity and lung injury in rats., Environ
Res 72:162-172, 1997.
46
GHIO, A.J.; Silbajoris, R.; Carson, J.L. et al. Biologic effects of oil fly ash., Environ.
Health Perspectives. 110(1): 89-94., 2002.
GRAHAM, C.; Rosenkranz, H.S.; Karol, M.H. Structure-activity model of chemicals
that cause human respiratory sensitization. Regul Toxicol Pharmacol 26:296-306.,
1997.
HADNAGY, W.; R. Stiller-Winkler; H.Idel. Immunological alterations in sera of
persons living in areas with different air pollution. Toxicol. Lett. 88:147-153, 1996.
HANAHAN, D.J.; Ekholm, J.E. The preparation of red cell ghosts (membranes).
Methods in Enzymology; Biomembranes. 31: 168-172, 1974.
HARDER, S.D.; Soukup J.M.; Ohio A.J. et al. Inhalation of PM2.5 does not modulate
host defense or immune parameters in blood or lung of normal human subjects.
Environ Health Perspect. 109:599-604, 2001.
IAP ( Instituto Ambiental do Paraná). Relatório anual da qualidade do ar de
Curitiba e Região Metropolitana, 2005. Disponível na página
http://www.pr.gov.br/meioambiente/iap.
JOHNSON, C.W.; Willians, C.B.; Copeland, M.J. Sensitivity of the SRBC PFC assay
versus ELISA for detection of immunosupression by TCDD and TCDD-like
congeners. Toxicology 156: 1-11, 2000.
47
KADIISKA; M.B.; Mason, R.P.; Dreher KL. et al. In vivo evidence of free radical
formation in the rat lung after exposure to an emission source air pollution particle.
Chem Res Toxicol 10:1104-1108, 1997.
KANIMITSU, H.; Nagasawa, S.; Sagai, M. et al Complement activation by diesel
exhaust particles (DEP). Biol.Pharm.Bull. 21:129-132, 1998.
KAROL, M.H. Target Organs and System:Methodologies to Asses Imune System
106:533-540, 1998.
KIRSCHFINK, M;MOLLNES, T.E. Modern Complement Analysis. Clinical and
Diagnostic Laboratory Immunology. 10: 982-989, 2003.
KODAVANTI, U.P.; Hauser, R; Chritiani, DC. et al. Pulmonary responses to oil fly ash
particles in the rat differ by virtue of their specific soluble metals. Toxicol Sci
43:204-212, 1998.
LACAUX, J.P.; Loemba-Ndembi, J, Lefeivere, B. Biogenic emissions and biomass
burning influences on the chemistry of the fogwater and stratiform precipitations in
the African equatorial Forest. Atmospheric Environment. 26: 541-51, 1992.
LADICS, G.S. Use of SRBC antibody response for immunotoxicity testing. Methods.
41: 9-19, 2006.
48
LEONARDI, G.S.; Houthuijs, D; Steerenbrg, P.A. IMMUNE BIOMARKERS IN
RELATION TO EXPOSURE TO PARTICULATE MATTER: A Cross-Sectional Survey
in 17 Cities of Central Europe. Inhalation Toxicology.12: 1-14, 2000.
LOSNO R., Bergametti G., Gartier, P., et al. Major ions in marine rainwater with
attention to sources of alkaline and acidic especies. Atmospheric Environment;
25:763-70, 1991
LUSTER, M.I.; Munson, A.E.; Thomas, P.T.et al. Development of a testing battery to
assess chemical-induced immunotoxicity. Fund. Appl. Toxicol 10:2-19, 1988
MACCHIONE, M; Oliveira, A P Gallafrio; C T., et al. Acute effects of inhalable
particles on the frog palate mucociliary epithelium. Environ Health Perspect 107(10):
829–833, 1999.
MACCHIONE, M.; Guimarães, E.T., Saldiva, P.H.N. et al. Methods for studyng
respiratory mucus and mucus clearance. Br . J. Med. Biol. Res. 28: 1347-1355,
1995.
MEDEIROS Jr, N.; Riviero, D.H.R.F.; Kasahara, D.I., et al. Acute pulmonary and
hematological effects of two types of particle surrogates are influenced by their
elemental composition. Env. Research 95: 62-70, 2004.
MIYABARA, Y; Yanagisawa R.; Shimojo N. et al Murine strain differences in airway
inflammation caused by diesel exhaust particles. Eur. Respir. J .11: 291-298, 1998.
49
MUDWAY, I.S.; Stenfors N., Duggan S.T., et al. An in vitro and in vivo investigation of
the effects of diesel exhaust on human airway lining fluid antioxidants. Archives of
Biochemistry Biophysics. 423:200-212., 2004
NEMMAR, A.; HOET, P., et al. Diesel exhaust particles in lung acutely enhance
experimental peripheral thrombosis. Circulation. 107(8) 1202-1208, 2003.
OHTOSHI, T; Takizawa H., Okazaki H. et al. Diesel exhaust particles stimulate
human airway epithelial cells to produce cytokines relevant to airway inflammation in
vitro. J Allergy Clin Immunol. 101:778-85, 1998.
OLIVEIRA, R.C.; Saiiki, M; Pires, R.C.N. , et al. Anti- oxidants reduce the acute
adverse effects of Residual oil fly ash on the frog palate mucociliary ephitelium.
Environmental Research 98:349-354, 2005.
POPE, C.A.; Burnett, R. T.; Thun, M.J. et al Lung cancer, cardiopulmonary mortality
and long term exposure to fine particulate air pollution. JAMA 2897: 1132-
1141,.2002.
PRITCHARD, R.J.; Ghio, A.J; Lehmann, J.R. et al. Oxidant generation and lung
injury after particulate air pollution exposure increase with the concentrations of
associated metals. Inhal Toxicol 8:457-477, 1996.
50
RENDALL, R. E. G., , PHILLIPS, J. I.; RENTON, K. A. Death following exposure to
fine particulate Nickel from a metal arc process. Ann Occup. Hyg. 38(6): 921-930,
1994.
RICHTER, J. H.; Hughes H.G. Marine atmospheric effects on electro-optical systems
performance. Optical Engineering. 30: (11) 1804-1820, 1991.
ROBBINS, R. A., NelsonK.J.; Gossman G.L. et al. Complement activation by
cigarette smoke. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 260: 254-259, 1991.
ROCHA, F.M.N Relação da poluição atmosférica com a citologia nasal em
pacientes com rinite alérgica, residentes na cidade de São Paulo, nas
diferentes estações do ano Tese Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo. 2005.
SALDIVA, P.H.N.; King, M.; Delmonte, V.L.C. et al. Respiratory alterations due to
urban air pollution: an experimental study in rats. Environ. Res. 57: 19-33, 1992.
SALDIVA, P.H.N.; Lichtenfels, A.J.F.C.; Paiva, P.S.O. et al Association between air
pollution and mortality due to repiratory diseases in children in São Paulo, Brazil: a
preliminary report. Environ. Res. 65: .218.-225, 1994.
SALVI, S.; BLOMBERG,A.; RUDELL,B. et al Acute Inflammatory Responses in the
Airways and Peripheral Blood After Short-Term Exposure to Diesel Exhaust in
Healthy Human Volunteers Am J Respir Crit Care Med 159: 702 - 709, 1999.
51
SAMET, J.M.; Graves, L.M; Quay, J. et al Activation of MAPKs inhuman bronchial
epithelial cells exposed to metals. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 19: 551-
558, 1998.
SEATON, A.; Macnee, W.; Donaldson, K. et al. Particulate air pollution and acute
health effects. Lancet. 345: 176-178, 1995.
SHIMA, M.; Adachi M.; Tanaka T. et al. Serum complement levels in children in
communities with different levels of air pollution in Japan. Arch. Environ. Health 54:
264-270,1999.
SIPES, I.G.; McQueen, C.A.; Gandolfi, A.J. et al Comprehensive Toxicology.
Toxicology of the Immune System Oxford: Pergamon 1997
STENFORS,N; Nordenhall,N.C.; SALVI, S.S. et al. Different airway inflammatory
responses in asthmatic and healthy humans exposed to diesel. European
Respiratory Journal. 23: 82-86, 2004
TEMPLE, L.; Kawabata, T.T.; Munson, A.E. et al Comparison of ELISA and plaque
forming cell assay (PFC) for measuring the response to SRBC in rats and mice
treated with benzo(a)pyrene or cyclophosphamide. Fund.Appl. Toxicol. 21: 412-
419, 1993
52
TEMPLE,L.; Butterworth, L.; Kawabata, T.T. et al. ELISA to measeure SRBC-specific
IgM: method and data evaluation. Methods in Immuntoxicology, 2: 137-157, 1995.
TREVINO, R. J. Air pollution and its effect on the upper respiratory tract and on
allergic rhinosinusitis. Otolaryngol Head Neck Surg. 114(2):239-41, 1996
U.N.ENVIRONMENT PROGRAM AND WORLD HEALTH ORGANIZATION. Air
pollution in the Word’s megacities: A report from UN Environment Programme
and WHO Environment. New York, NY: United Nations 36: 5-37.
WARNER, A; Salathé M.; O’ Riordan T.G. Mucocilliary clearence in the airways. Am.
J. Respir. Crit. Care Med. 154: 1868-1962, 1996.
WARD, D.E.; Susott, R.A.; Kauffmann, J.B. et al. Smoke and fire characteristics for
cerrado and deforestation burns in Brazil - Base-B Experiment. Journal of
Geophysical Research. 97:14601-19, 1992.
WINKLER-STILLER, R.; Idel,H.; Leng, G. Influence of air pollution on Humoral
Immune Response. J.Clin Epidemiol. 49(5): 527-534, 1996.
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