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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - UFC
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
ANA CAROLINE ROCHA DE MELO LEITE
ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO NA MIGRAÇÃO CELULAR
AGUDA NA ARTRITE E PERITONITE INDUZIDAS POR ZYMOSAN OU
LIPOPOLISSACARÍDEO EM MODELOS EXPERIMENTAIS
FORTALEZA
2005
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1
ANA CAROLINE ROCHA DE MELO LEITE
ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO NA MIGRAÇÃO CELULAR
AGUDA NA ARTRITE E PERITONITE INDUZIDAS POR ZYMOSAN OU
LIPOPOLISSACARÍDEO EM MODELOS EXPERIMENTAIS
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Airton Castro da
Rocha
FORTALEZA
2005
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2
L55e Leite, Ana Caroline Rocha de Melo
Estudo da participação do óxido nítrico na migração
celular aguda na artrite e peritonite induzidas por zymosan ou
lipopolissacarídeo em modelos experimentais / Ana Caroline
Rocha de Melo Leite. – Fortaleza, 2005.
69f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Airton Castro da Rocha
Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Ceará.
Curso de Pós-graduação em Farmacologia.
1.Artrite. 2. Óxido nítrico. 3. Migração celular. 4.
Zymosan. 5. Lipopolissacarídeo. I. Título
CDD 616.722
3
ANA CAROLINE ROCHA DE MELO LEITE
ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO NA MIGRAÇÃO CELULAR
AGUDA NA ARTRITE E PERITONITE INDUZIDAS POR ZYMOSAN OU
LIPOPOLISSACARÍDEO EM MODELOS EXPERIMENTAIS
Dissertação submetida à Coordenação do Curso de
Pós-Graduação em Farmacologia, da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Farmacologia.
Aprovada em 20 / 12 / 2005
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Francisco Airton Castro da Rocha (orientador)
Universidade Federal do Ceará - UFC
Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito
Universidade Federal do Ceará - UFC
Prof. Dra. Gisela Costa Camarão
Universidade Federal do Ceará - UFC
4
A Deus, ser onipotente e
onipresente que nos guia
nos caminhos da vida.
A minha família, exemplo
de apóio e compreensão a
ser seguido.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser a força e o amparo em todos os momentos da vida e por nos mostrar as
oportunidades que nos permite a conquista de nossos ideais.
Aos meus pais, Ilsimar e Melo, que sempre depositaram confiança na minha pessoa e que
comigo constroem essa caminhada.
A minha irmã, Karine, pelo companheirismo, auxílio, compreensão e confiança nos
inúmeros momentos da vida.
Ao meu irmão, Junior, pelo exemplo de dedicação e entusiasmo à docência no “mundo” da
Informática.
A minha vovó Anazélia, pela constante torcida.
Ao meu orientador, Dr. Francisco Airton Castro da Rocha, pelo acolhimento e dedicação,
por nos despertar para o “mundo” da pesquisa, pelos momentos de descontração e,
especialmente, por ser um grande pesquisador.
A professora Gerly Anne de Castro Brito, sempre disposta a nos ajudar.
Ao professor Talapala Govindaswamy Naidu, pelo modelo de docente e por me ensinar os
primeiros passos da pesquisa.
A minha amiga e companheira do laboratório LIO, Virgínia, por me ensinar a trilhar o
caminho da experimentação científica, pela sua determinação e pela sua divertida
companhia.
As amigas do laboratório, Patrícia, Isabele, Marcela e Glorinha, pelas brincadeiras,
credibilidade e contribuição na realização desse trabalho.
A colega e amiga Luciana Paim, pelos momentos agradáveis no laboratório e pela sua
alegria contagiante.
6
Aos amigos do laboratório, Rondinelle, Saraiva, Marcus e Bruno, pelo respeito e pela
amizade conquistada a cada dia.
Aos amigos da pós-graduação, Palheta Júnior, Renata, Hellíada, Fernandinha, Isabele e
Janaína, por compartilharmos momentos de alegria e de tensão.
Aos professores da pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos.
As minhas tias, especialmente a tia Conceição e a tia Verene, pelas orações, carinho e
apóio.
A minha querida prima Conceiçãozinha, pela sabedoria, otimismo e pelos inúmeros
conselhos.
As minhas grandes amigas e colegas de profissão, Isabelle e Zuíla, pelo constante apóio,
confiança e amizade.
A Rose, Aurinha e Silvinha, pela ajuda e pelos inúmeros esclarecimentos prestados.
Ao Júnior e a Febe, pela inquestionável gentileza no fornecimento dos animais.
A Geane e ao Anaézio, pelos serviços prestados ao LIO.
Ao CNPq e a CAPES, pelo apóio financeiro.
7
RESUMO
O influxo celular (IC) à sinóvia participa na fisiopatologia da artrite reumatóide (AR). Há
controvérsias sobre o papel do óxido nítrico (NO) na modulação do influxo de neutrófilos
para sítios inflamatórios, seja reduzindo ou estimulando-o. Esse trabalho investigou o efeito
de inibidores de óxido nítrico sintase (NOS) sobre o IC agudo em animais submetidos à
artrite ou peritonite induzida por zymosan (AZy ou PZy) ou lipopolissacarídeo (ALPS ou
PLPS), bem como a participação de leucotrieno B
4
(LTB
4
) e da molécula de adesão
intercelular -1 (ICAM-1). Ratos Wistar receberam 10-1000 µg de Zy ou 1-10 µg de LPS
intra-articular (i.a.). Outros grupos receberam 1 mg de Zy ou 10 µg de LPS intraperitoneal
(i.p.). Camundongos selvagens ou geneticamente manipulados (knock out) para ICAM-1
(ICAM-1
-/-
) receberam 100 µg de Zy i.a. ou i.p. Esquema dos pré-tratamentos (30 minutos
antes da artrite ou peritonite): na AZy, L-NAME (1-30 mg/kg; i.p. ou 0,3-1 µmol; i.a),
1400W (1 mg/kg; i.p.) ou Aminoguanidina (Amino) (50 mg/kg; i.p.) em ratos e
camundongos receberam L-NAME (3-10 mg/kg;i.p.) ou N
G
-nitro-L-arginia (Nitro) (50
mg/kg; i.p.). Na PZy, L-NAME (10-30 mg/kg; s.c. ou i.p.) ou 1400W (1 mg/kg; s.c.) foi
administrado em ratos e camundongos receberam L-NAME (30 mg/kg; s.c.) ou Nitro (50
mg/kg; s.c.). Na ALPS, ratos receberam L-NAME (10-30 mg/kg; i.p) e, na PLPS, L-NAME
(30 mg/kg; s.c.). Controles receberam veículo (grupos NT). Após o sacrifício, foram
quantificados o IC e LTBB
4
nos lavados articulares e peritoneais. Na AZy (10-100 µg) em
ratos, L-NAME (1-3 mg) reduziu o IC (47,4 - 76,6%), quando comparado aos animais NT
(p<0,05). Na AZy 1mg, L-NAME (30 mg), 1400W (1 mg) e Amino (50 mg) diminuíram o
IC (57,4%, 74,8% e 76,6%) (p<0,05). L-NAME (0,3 µmol) i.a. também reduziu o IC
(85,3%) (p<0,05). Semelhante aos ratos, camundongos pré-tratados com L-NAME (3-10
mg) ou Nitro (50 mg) apresentaram diminuição do IC (67,6%, 53,8% e 39,5%) (p<0,05).
Contrariamente, na PZy, L-NAME (10-30 mg) e 1400W (1 mg) aumentaram o IC (566,7%,
495,1% e 470,7%) em ratos e L-NAME (30 mg), em camundongos (155,8%) (p<0,05).
Nesses, Nitro aumentou o IC, mas não significativamente (p>0,05). L-NAME (10 mg) i.p.
também aumentou o IC (747,6%) (p<0,05). Na ALPS, L-NAME (30 mg) diminuiu o IC nas
duas doses de LPS (50,3% e 52,3%) (p<0,05). Na PLPS, L-NAME (30 mg) aumentou o IC
(53,4%) (p<0,05). Os inibidores de NOS não alteraram os níveis de LTB
4
. Animais ICAM-
1 artríticos pré-tratados ou não com Nitro apresentaram redução do IC (57,8% ou
32,1%)(p<0,05). Nos ICAM-1 com peritonite pré-tratados ou não com Nitro, houve uma
redução do IC (9,5% e 22,3%), mas não significativa (p>0,05). O NO, particularmente o
produzido pela NOSi, reduz o IC agudo na articulação, enquanto que o incrementa no
peritôneo. Esse efeito é independente do estímulo, da espécie, da via de administração e da
liberação de LTB
-/-
-/-
4
, além de envolver células residentes e/ou migradas. ICAM-1 parece
participar do IC nesses modelos, especialmente na artrite, com o NO modulando sua
expressão na peritonite.
Palavras-chave: óxido nítrico (NO), neutrófilos, zymosan (Zy), lipopolissacarídeo (LPS),
molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e leucotrieno B
4
(LTB
4
).
8
ABSTRACT
Cell influx (CI) to synovium participates in physiopathology of rheumatoid arthritis (RA).
There are controversies about the nitric oxide (NO) action in modulation of neutrophil
influx to inflammatory sites, with NO decreasing or increasing it. This study investigated
the effect of nitric oxide synthase (NOS) inhibitors on acute CI in animals submitted to
arthritis or peritonitis induced by zymosan (ZyA or ZyP) or lipopolysaccharide (LPSA or
LPSP), and the participation of leukotriene B
4
(LTB
4
) and intercellular adhesion molecule -
1 (ICAM-1). Rats Wistar received Zy (10-1000 µg) or LPS (1-10 µg) intraarticular (i.a.).
Other groups received Zy (1 mg) or LPS (10 µg) intraperitoneal (i.p.). Wild or ICAM-1-
deficient (ICAM-1
-/-
) mice received Zy (100 µg) i.a. or i.p. Animals were pre-treated (30
minutes before arthritis or peritonitis): in ZyA, rats received L-NAME (1-30 mg/kg; i.p. or
0.3-1 µmol; i.a), 1400W (1 mg/kg; i.p.) or Aminoguanidine (Amino) (50 mg/kg; i.p.). Mice
received L-NAME (3-10 mg/kg;i.p.) or N
G
-nitro-L-arginine (Nitro) (50 mg/kg; i.p.). In
ZyP, L-NAME (10-30 mg/kg; s.c. or i.p.) or 1400W (1 mg/kg; s.c.) was administrated in
rats and mice received L-NAME (30 mg/kg; s.c.) or Nitro (50 mg/kg; s.c.). In LPSA, rats
received L-NAME (10-30 mg/kg; i.p) and, in LPSP, they received L-NAME (30 mg/kg;
s.c.). Controls received vehicle (NT groups). After sacrifice, CI was counted and LTB
4
was
measured in articular and peritoneal exudates. In ZyA (10-100 µg), L-NAME (1-3 mg)
reduced CI (47.4 – 76.6%) as compared to NT animals (p<0.05). In ZyA (1mg), L-NAME
(30 mg), 1400W (1mg) and Amino (50 mg) reduced CI (57.4%, 74.8% and 76.6%,
respectively) (p<0.05). L-NAME (0.3 µmol) i.a. also reduced CI (85.3%) (p<0.05).
Similarly, L-NAME (3-10 mg) or Nitro (50 mg) pre-treated mice showed a CI reduction
(67.6%, 53.8% and 39.5%) (p<0.05). In contrast, in ZyP, L-NAME (10-30 mg) and 1400W
(1 mg) increased CI (566.7%, 495.1% and 470.7%, respectively) in rats and L-NAME (30
mg) in mice (155.8%) (p<0.05). In mice, Nitro increased CI, but not significantly (p>0.05).
L-NAME (10 mg) i.p. also increased CI (747.6%) (p<0.05). In LPSA, L-NAME (30 mg)
decreased CI in two LPS doses (50.3% and 52.3%) (p<0.05). In LPSP, L-NAME (30 mg)
increased the influx (53.4%) (p<0.05). NOS inhibitors didn’t change LTBB
4
levels. Arthritic
pre-treated or not with Nitro ICAM-1 animals showed a CI reduction (57.8% or
32.1%)(p<0.05). In peritonitis, pre-treated or not with Nitro ICAM-1 showed a CI
reduction (9.5% and 22.3%), but not significantly (p>0.05). NO, especially that produced
by iNOS, reduces the acute CI in articulation while increases it in the peritoneum. This
effect is independent of stimulus, species, route of administration and LTB
-/-
-/-
4
liberation.
Beyond, it involves resident and/or migrated cells. ICAM-1 appears to participate in CI in
these models, especially in arthritis. Besides, NO modulates the expression of ICAM-1 in
peritonitis.
Keywords: nitric oxide (NO), neutrophils, zymosan (Zy), lipopolysaccharide (LPS),
intercelular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and leukotriene B
4
(LTB
4
).
9
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Esquema ilustrativo da síntese de NO pelas isoformas da enzima óxido
nítrico sintase (NOS), a partir do aminoácido L-arginina e de O
2
, na
presença de NADPH.
16
FIGURA 2- Desenho esquemático das etapas da migração celular numa vênula
pós-capilar.
23
FIGURA 3- Efeito do pré-tratamento com L-NAME, 1400W ou Aminoguanidina
(Amino) sobre o influxo celular à cavidade articular de ratos na
artrite induzida por zymosan (AZy)
35
FIGURA 4- Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo
celular à cavidade articular de camundongos submetidos à indução da
artrite por zymosan (AZy)
36
FIGURA 5- Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à
cavidade articular de ratos submetidos à indução da artrite por
zymosan (AZy)
37
FIGURA 6- Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou 1400W sobre o influxo
celular à cavidade peritoneal de ratos submetidos à indução da
peritonite por zymosan (PZy)
38
FIGURA 7- Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo
celular à cavidade peritoneal de camundongos submetidos à indução
da peritonite por zymosan (PZy)
39
FIGURA 8- Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à
cavidade peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por
zymosan (PZy)
40
FIGURA 9- Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular à
cavidade articular de ratos submetidos à indução da artrite por LPS
(ALPS)
41
FIGURA 10- Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular à
cavidade peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por
LPS (PLPS)
42
FIGURA 11- Liberação de leucotrieno B
4
(LTB
4
) na artrite e peritonite induzidas
por zymosan em ratos
43
FIGURA 12- Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular à cavidade articular 44
10
de camundongos submetidos à artrite induzida por zymosan (AZy)
FIGURA 13- Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular à cavidade peritoneal
de camundongos submetidos à peritonite induzida por zymosan (PZy)
45
11
LISTA DE ABREVIATURAS
1400W - Dihidrocloreto de N-[[3- (aminoetil) fenil] metil] etanimidamida
Amino - Aminoguanidina
AR - Artrite Reumatóide
AZy - Artrite Induzida por Zymosan
Ca
2+
- Cálcio
fMLP - N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
FRDE - Fator de Relaxamento Derivado do Endotélio
GMPc - Guanilato Monofosfato Cíclico
H
2
O
2
- Peróxido de Hidrogênio
i.a. - Via Intra-articular
IA - Incapacitação Articular
IC - Influxo Celular
ICAM - Molécula de Adesão Intercelular
i.d. - Via intradérmica
IFN- γ - Interferon γ
IκB-α - Proteína Inibitória κB-α
IL - Interleucina
i.p. - Via Intraperitoneal
KC - Quimioatraente Neutrofílico Induzido por Citocina
Knock out - Animais Geneticamente Manipulados
L-NAME - N
G
-nitro-L-arginina-metil éster
L-NIL - N-iminoetil-L-lisina
12
LNMMA - N
G
-monometil-L-arginina
LPS - Lipopolissacarídeo
LTB
4
- Leucotrieno B
4
MNCF - Fator Quimiotáxico Neutrofílico Derivado de Macrófago
MIP-2 - Proteína Inflamatória de Macrófago-2
NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo-fosfato Reduzida
NF-κB - Fator Nuclear κB
Nitro - N
G
-nitro-L-arginina
NO - Óxido Nítrico
NO
2
-
- Nitrito
NO
3
-
- Nitrato
NOS - Óxido Nítrico Sintase
NOSe - Óxido Nítrico Sintase Endotelial
NOSi - Óxido Nítrico Sintase Indutível
NOSn - Óxido Nítrico Sintase Neuronal
O
2
- Oxigênio Molecular
O
2
-
- Ânion Superóxido
PAF - Fator de Ativação Plaquetária
PMNs - Polimorfonucleares
s.c. - Via Subcutânea
TGF-β - Fator de Transformação de Crescimento β
TNF- α - Fator de Necrose Tumoral α
V-CAM-1 - Molécula de Adesão Celular e Vascular
Zy - Zymosan
13
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
09
1. INTRODUÇÃO
15
1.1. Óxido nítrico (NO)
15
1.1.1. Conceito
15
1.1.2. Síntese do NO
16
1.2. Artrite reumatóide
17
1.2.1. Definição
17
1.2.2. Etiopatogenia
18
1.2.3. NO nas artropatias infamatórias
18
1.2.4. NO em modelos experimentais de artrite
19
1.2.5. NO em modelo de artrite induzida por zymosan (AZy)
20
1.2.6. NO e modelos experimentais de peritonite
21
1.3. Migração celular
22
1.3.1. Moléculas de adesão intercelular
23
1.3.2. Controle da expressão de moléculas de adesão por NO
25
1.3.3. NO e neutrófilos
26
1.4. Justificativas e objetivos
28
2. MATERIAIS E MÉTODOS
30
2.1. Animais
30
2.2. Soluções, drogas e reagentes
30
2.3. Protocolo experimental
31
2.3.1 Indução da artrite por zymosan (AZy) ou lipopolissacarídeo (ALPS)
31
2.3.2. Coleta do lavado articular
31
2.3.3. Análise da celularidade do lavado articular
32
2.3.4. Indução da peritonite por zymosan (PZy) ou lipopolissacarídeo
(PLPS)
32
2.3.5. Coleta do lavado peritoneal
32
2.3.6. Análise da celularidade do lavado peritoneal
33
3. Modulação farmacológica
33
3.1. Inibidores da óxido nítrico sintase
33
4. Análise estatística
34
3. RESULTADOS
35
3.1. Efeito do pré-tratamento com L-NAME, 1400W ou Aminoguanidina
sobre o influxo celular à cavidade articular de ratos na artrite induzida
por zymosan (AZy)
35
3.2. Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo
celular à cavidade articular de camundongos submetidos à indução da
artrite por zymosan (AZy)
36
3.3. Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à
cavidade articular de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan
(AZy)
37
3.4. Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou 1400W sobre o influxo
celular à cavidade peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite
por zymosan (PZy)
38
14
3.5. Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo
celular à cavidade peritoneal de camundongos submetidos à indução da
peritonite por zymosan (PZy)
39
3.6. Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à
cavidade peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por
zymosan (PZy)
40
3.7. Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular na
artrite por LPS em ratos (ALPS)
41
3.8. Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular à
cavidade peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por LPS
(PLPS)
42
3.9. Liberação de leucotrieno B
4
(LTB
4
) na artrite e peritonite induzidas
por zymosan em ratos
43
4. Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular à cavidade articular de
camundongos submetidos à artrite induzida por zymosan (AZy)
44
4.1. Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular á cavidade peritoneal
de camundongos submetidos à peritonite induzida por zymosan (PZy)
45
4. DISCUSSÃO
46
5. CONCLUSÕES
54
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
55
15
1. INTRODUÇÃO
1.1. Óxido nítrico (NO)
1.1.1. Conceito
Identificado como o fator de relaxamento derivado do endotélio (FRDE)
liberado em resposta à acetilcolina (Furchgott e Zawadzki, 1980; Palmer et al., 1987;
Furchgott, 1988; Ignarro et al., 1988), o óxido nítrico (NO) é um radical livre de meia-vida
curta, sintetizado a partir da L-arginina pela óxido nítrico sintase (NOS) (Miyasaka e
Hirata, 1997). Caracteriza-se por ser uma molécula diatômica simples, cujas propriedades
físico-químicas e biológicas são determinadas pelo seu tamanho reduzido (30Da), ausência
de carga e ter um elétron desemparelhado (Butler et al., 1995; Wink et al., 1996).
O NO apresenta alta afinidade pelo ferro hêmico, grupos tiol e sulfidril, ânion
superóxido (O
2
-
) e oxigênio molecular (O
2
)
(Jang e Murrell, 1998) e, dependendo da sua
concentração e ambiente químico, é rapidamente oxidado a nitritos (NO
2
-
) ou nitratos (NO
3
-
) pelo oxigênio dos fluidos biológicos (Butler et al., 1995; Wink et al., 1996; Stamler,
1994).
Utilizado como um agente tóxico ou de sinalização entre as células, o NO é um
gás sob condições atmosféricas, mas um soluto no interior das células e tecidos, sendo
prontamente difusível nos fluidos e tecidos corporais, atravessando livremente as
membranas celulares (Butler et al., 1995; Wink et al., 1996; Stamler, 1994; Coleman,
2001). Gerado por muitos tipos celulares em uma diversidade de tecidos, ele age como um
relaxante vascular, neurotransmissor e inibidor da agregação plaquetária. Associado a essas
funções fisiológicas, participa das respostas inflamatórias e imunes de forma complexa e
ainda não completamente definida (Moncada et al., 1991; Coleman, 2001; Sautebin, 2000).
16
1.1.2. Síntese do NO
A formação de NO é tida como uma via ubíqua, na qual NO e L-citrulina são
sintetizados a partir da ação da NOS sobre L-arginina e O
2
, em um processo que utiliza
elétrons doados pela nicotinamida adenina dinucleotídeo-fosfato reduzida (NADPH)
(Moncada e Higgs, 1995; Coleman, 2001) (Figura 1).
Figura 1- Esquema ilustrativo da síntese de NO pelas isoformas da enzima óxido nítrico sintase (NOS),
a partir do aminoácido L-arginina e de O
2
, na presença de NADPH.
A NOS é uma enzima que se apresenta sob três isoformas: duas formas
constitutivas, originalmente caracterizadas em neurônios (NOS neuronal, NOSn ou NOS-1)
e em células endoteliais (NOS endotelial, NOSe ou NOS-3), estando presentes em
condições fisiológicas, e uma forma induzível, conhecida como NOS induzível, NOSi ou
NOS-2. Essa última caracteriza-se pela ausência de expressão em células em repouso,
sendo sintetizada em células ativadas (Coleman, 2001).
17
As isoformas constitutivas participam na regulação da homeostase do fluxo
sangüíneo, função plaquetária e transdução de sinais no sistema nervoso central e
periférico. A geração de NO por essas enzimas é rápida e transitória, em pequenas
quantidades (da ordem de picomoles) e dependente de Ca
2+
-calmodulina. O NO por elas
sintetizado nitrosila a enzima guanilato ciclase solúvel, estimulando a produção de
guanilato monofosfato cíclico (GMPc), um efetivo vasodilatador e inibidor da agregação
plaquetária (Förstermann et al, 1986; Arnold et al., 1977; Ignarro, 1991; Murad, 1986;
Radomski et al., 1987).
A NOSi é dependente da taxa de renovação enzimática, com atividade Ca
2+
-
independente devido a sua forte ligação com a calmodulina. A produção de NO por essa
enzima é prolongada, em maior quantidade (na ordem de nanomoles) e após certo período
pós-estímulo. Sua expressão é induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e citocinas,
particularmente fator de necrose tumoral α (TNF- α), interferon γ (IFN- γ), interleucinas
1(IL-1) e 2 (IL-2), enquanto o fator de transformação de crescimento β (TGF-β), IL-4, IL-8,
IL-10, IL-13 e glicocorticóides podem inibir sua expressão. Muitas células são capazes de
expressá-la, tais como: macrófagos, neutrófilos, sinoviócitos, osteoblastos, osteoclastos,
condrócitos, células musculares lisas, fibroblastos, dentre outras (Stichtenoth e Frölich,
1998; Stefanovic-Racic et al., 1993; Jang e Murrell, 1998).
1.2. Artrite reumatóide
1.2.1. Definição
A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica sistêmica que
afeta as articulações, constituindo a mais freqüente artropatia inflamatória crônica em
reumatologia. Sua prevalência é de aproximadamente 1% da população mundial,
18
acometendo principalmente o sexo feminino (Hochberg e Spector, 1990; Markenson, 1991;
Spector, 1990).
1.2.2. Etiopatogenia
Estudos têm sugerido a participação de fatores genéticos, ambientais e
imunológicos no desenvolvimento da AR (Heliovaara et al., 1993; Karlson et al., 1999;
Silman et al., 1996). Sua etiopatogenia é complexa, envolvendo a participação de uma
resposta imuno-inflamatória, com a liberação de mediadores inflamatórios, incluindo
citocinas (TNF- α, IL-1, IL-2 e IL-6) e eicosanóides, que contribuem para a perpetuação e
progressão da sinovite. De fato, estudos mostraram aumento na produção de citocinas por
sinoviócitos e células mononucleares do sangue periférico de pacientes com AR,
espontaneamente ou após estímulo in vitro (Harris, 1990; Brennan et al., 1992). Além
disso, prostaglandinas foram detectadas no líquido sinovial de pacientes com AR e em
modelos animais dessa doença, demonstrando sua participação em doenças articulares
inflamatórias (Paya et al., 1997).
Associado a essas evidências, tem sido sugerido a participação do NO em
artropatias inflamatórias (Stefanovic-Racic et al., 1993; Hobbs et al., 1999; Armour et al.,
1999; Pelletier et al., 2000), com a detecção de elevada concentração de nitrito (um produto
da oxidação do NO) no plasma e fluido sinovial de pacientes com AR (Farrel et al., 1992;
Stichtenoth et al., 1995; Ueki et al., 1996).
1.2.3. NO nas artropatias inflamatórias
Considerando que células residentes articulares, como os sinoviócitos e
condrócitos, além de osteoblastos, bem como células inflamatórias presentes em sinovites,
19
são capazes de liberar NO, quer de forma constitutiva, quer por estímulo de citocinas como
TNF e IL-1, o envolvimento desse radical em doenças articulares tem sido sugerido
(Stefanovic-Racic et al., 1994; Stichtenoth et al., 1995; Evans e Stefanovic-Racic, 1996).
1.2.4. NO em modelos experimentais de artrite
Os modelos experimentais constituem um importante meio de estudo das
patologias humanas, já que dificuldades éticas e técnicas limitam estudos em humanos.
Embora não se disponha de uma forma de artrite reumatóide em animais, a maioria dos
modelos animais de artrite utilizados atualmente apresentam similaridades com a doença
humana, incluindo a hiperplasia sinovial e a lesão da cartilagem articular. Baseado nisso e
nas evidências de que o NO participa do desenvolvimento das artropatias inflamatórias, tem
sido estudada a participação do NO em modelos experimentais de artrite.
Assim, no modelo de artrite por Streptococcus, foi mostrado um aumento na
produção de NO e na síntese de NOSi nas sinóvias inflamadas de ratos, bem como uma
supressão do edema e do infiltrado articular pelo bloqueio na produção de NO por N
G
-
monometil-L-arginina (LNMMA) (McCartney-Francis et al., 1993). Ainda, no modelo de
artrite por adjuvante, houve uma diminuição no desenvolvimento da artrite nos animais
submetidos a inibidores de NOS, N
G
-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) ou LNMMA,
com a administração de L-arginina revertendo essa diminuição (Oyanagui, 1994;
Stefanovic-Racic et al., 1994).
Associado a isso, estudos mostraram também uma diminuição na síntese de
colágeno tipo II e de proteoglicanos na cartilagem articular de coelhos, assim como uma
redução nessa produção de proteoglicanos em ratos, mediada pelo NO (Taskiran et al.,
1994; Jarvinen et al., 1995; Evans e Stefanovic-Racic, 1996). Foi mostrado ainda um
aumento na produção de NO, através do aumento da excreção urinária de nitrato e da
expressão de NOSi nos tecidos sinoviais, em ratos submetidos à artrite induzida por
20
colágeno (Cannon et al., 1996), com a administração de inibidores seletivos de NOSi,
aminoguanidina ou N-iminoetil-L-lisina (L-NIL), inibindo essa produção (Vermeire et al.,
2000).
Apesar das evidências, ainda não está claro a forma de participação do NO na
artrite, já que ele parece promover ações pró-inflamatórias (como o aumento da
permeabilidade vascular, produção de radicais livres capazes de gerar danos teciduais,
indução da ciclooxigenase e de citocinas inflamatórias, dentre outras) (Lander et al., 1993;
McInnes et al., 1996), ao mesmo tempo em que parece exercer ações antiinflamatórias,
como a inibição da adesão plaquetária e neutrofílica ao endotélio e a redução da migração
leucocitária ao sítio inflamado (Kubes et al., 1991; Niu et al., 1994; Victor et al., 2004).
1.2.5. NO em modelo de artrite induzida por zymosan (AZy)
O zymosan (Zy) é um polissacarídeo derivado da parede celular do fungo
Saccharomyces cerevisae. Induz inflamação quando injetado na cavidade peritoneal, pele
ou articulações, por mecanismos múltiplos, incluindo ativação da via alternativa do sistema
complemento, degranulação de mastócitos e estimulação de macrófagos e neutrófilos na
liberação de mediadores inflamatórios (Tadimeti et al., 1994; Ajuebor et al., 1998; Coates e
McColl, 2001; Kolaczkowska et al., 2001).
A fase aguda da artrite induzida por zymosan (AZy) caracteriza-se pelo aumento
da permeabilidade vascular, edema e intenso influxo celular (IC) na cavidade articular, com
posterior sinovite progressiva, infiltrado mononuclear e ativação de fibroblastos,
assemelhando-se ao pannus reumatóide (Gegout et al., 1994). De fato, nosso grupo
mostrou, após 21 dias de indução da AZy em ratos, um intenso infiltrado mononuclear,
proliferação de fibroblastos, presença de células gigantes, neovascularização, perda de
proteoglicanos da cartilagem articular e erosão do osso subcondral (Bezerra et al., 2004).
Mostramos também a participação do NO nesse modelo experimental, através do aumento
21
dos níveis de nitrito nos exsudatos articulares, com o bloqueio dessa participação pela
administração de inibidores de NOS, quer inespecíficos, quer seletivos para NOSi,
administrados profilática (30 min antes do Zy) ou terapeuticamente (2 horas pós Zy), local
ou sistemicamente (Rocha et al., 2002). Posteriormente, mostramos ainda a participação do
NO via GMPc sobre o IC e incapacitação articular (IA) na AZy, através da redução
significativa desses parâmetros inflamatórios, quando azul de metileno, um inibidor de
GMPc, foi administrado localmente (Rocha et al., 2003).
Em face dos resultados obtidos, associado ao seu baixo custo e praticidade, o
modelo de artrite induzida por zymosan foi utilizado nesse trabalho para o estudo da
participação do NO sobre a migração celular aguda.
1.2.6. NO e modelos experimentais de peritonite
Apesar dos dados apontarem para uma modulação positiva do NO sobre o IC
em modelos experimentais de artrite (Mello et al., 1997; Rocha et al., 2003), bolsa de ar
(Paya et al., 1997) e asma (Koarai et al., 2000), há evidências na literatura de que o NO é
capaz de reduzir a migração neutrofílica em modelos experimentais de peritonite. De fato, a
administração de L-NMMA preveniu a diminuição da migração neutrofílica induzida por
TNF-α, IL-8 ou fator quimiotáxico neutrofílico derivado de macrófago (MNCF) na
peritonite por tioglicolato (Tavares-Murta et al., 1998). No modelo de sepse por ligação e
perfuração do ceco, a administração de um inibidor de NOSi, aminoguanidina (Griffiths et
al., 1993), promoveu uma melhora da quimiotaxia de neutrófilos ao foco inflamatório
(Benjamim et al., 2000).
Dessa forma, o NO parece modular positivamente a migração de neutrófilos em
determinados modelos experimentais, ao mesmo tempo em que parece exercer um papel
inibitório em modelos de peritonite.
22
1.3. Migração celular
A migração celular é um processo complexo dependente das populações
celulares envolvidas e de seu estado de ativação, bem como da forma de interação celular
com o endotélio, sendo essa última controlada pela expressão de moléculas de adesão e de
quimiocinas na superfície endotelial. Conforme Seely et. al. (2003), a migração de células
ocorre através de uma seqüência de etapas, assim denominadas: marginação, rolagem e
aderência; transmigração através do endotélio (diapedese) e migração nos tecidos
intersticiais em direção a um estímulo quimiotáxico (quimiotaxia) (Figura 2).
No fluxo sangüíneo normal, leucócitos encontram-se deslocados em direção ao
endotélio devido à disposição dos eritrócitos numa coluna axial central (Schmid-Schonbein
et al., 1980). Esse deslocamento, associado a uma redução na velocidade do fluxo
sangüíneo pelo aumento da permeabilidade vascular na fase inicial da inflamação, permite
que um maior número de leucócitos assuma essa posição periférica, facilitando assim a
marginação leucocitária. Posteriormente, leucócitos rolam lentamente sobre o endotélio, aí
aderindo transitoriamente (rolagem) e, em seguida, aderem firmemente (aderência). Os
leucócitos firmemente aderidos inserem pseudópodos entre as células endoteliais,
transpondo as junções interendoteliais e a membrana basal, atingindo o espaço
extravascular e dirigindo-se ao foco inflamatório (Seely et al., 2003). Além dessa migração
através das junções endoteliais, leucócitos podem migrar para a área inflamada através de
vacúolos endoteliais, em um processo ativo que ocorre em tecidos especializados como o
cérebro e o timo, com crescentes evidências desse processo em outros tecidos.
Após o extravasamento, leucócitos são atraídos para o sítio inflamatório por um
processo de quimiotaxia, definido como uma locomoção orientada ao longo de um
gradiente químico. Através de quimioreceptores localizados na membrana plasmática
leucocitária, essas células respondem à quimiotaxia, migrando em direção ao local de maior
concentração desses agentes quimiotáxicos (Seely et al., 2003). Dentre as moléculas
quimiotáxicas primárias para neutrófilos, eosinófilos e monócitos, destacam-se: produtos
23
bacterianos; componentes do sistema complemento (C5a e C3a); calicreína e ativador de
plasminogênio; fibrinopeptídeos; produtos de degradação da fibrina; produtos da via da
lipoxigenase, principalmente leucotrieno B
4
(LTBB
4
); fatores quimiotáxicos de neutrófilo e
eosinófilo liberados de mastócitos; fator quimiotáxico liberado de neutrófilo e, por último,
citocinas, particularmente aquelas da família das quimiocinas. Embora não seja
quimiotáxica per se, a histamina pode facilitar a quimiotaxia (McCance e Huether, 1998).
Vênula pós-capilar
Marginação
Rolagem
Aderência
Transmigração
Quimiotaxia
Figura 2- Desenho esquemático das etapas da migração celular numa vênula pós-capilar. Fonte:
Hickey, Clinical Science, 2001.
1.3.1. Moléculas de adesão intercelular
As moléculas de adesão intercelular são proteínas de membrana que permitem a
interação entre as células. Essas moléculas freqüentemente atravessam a membrana, ligam-
se ao citoesqueleto, permitindo que a célula as utilize como meio de tração ou fixação em
outras células ou na matriz extracelular.
A aderência e a transmigração leucocitárias, anteriormente descritas, ocorrem
por meio da ligação de moléculas de adesão complementares nas superfícies endoteliais e
de leucócitos. Essas moléculas permitem a interferência de mediadores químicos, que
24
modulam a sua expressão e avidez (Springer, 1994), e são representadas pelas selectinas,
imunoglobulinas e integrinas.
As selectinas são moléculas transmembranas que possuem propriedades
semelhantes à lectina (razão de sua denominação), ligando-se a açúcares. Elas incluem a E-
selectina (presente no endotélio), P-selectina (presente no endotélio e plaquetas) e L-
selectina (presente em muitos tipos leucocitários). A ligação das selectinas a seus ligantes
reduz a velocidade das células circulantes no interior das vênulas, permitindo que
leucócitos recebam sinais de migração do endotélio. Dessa forma, essas moléculas de
adesão são responsáveis pela interação inicial e de baixa afinidade entre leucócitos e
endotélio, manifestada como comportamento de rolagem (Carvalho et al., 2001).
As imunoglobulinas são representadas pela molécula de adesão intercelular-1
(ICAM-1), molécula de adesão intercelular-2 (ICAM-2), molécula de adesão celular e
vascular-1 (VCAM-1), dentre outras. Todos os membros dessa família são expressos ou
induzíveis no endotélio vascular. De fato, ICAM-1 e VCAM-1 são induzidas por citocinas
inflamatórias, enquanto ICAM-2 é constitutivamente expressa, sendo regulada
negativamente por citocinas inflamatórias. Essa família de moléculas interage com as
integrinas expressas nos leucócitos (Dustin et al., 1988; Staunton et al., 1989; Pober e
Cotran, 1990; Seely et al., 2003) e são responsáveis pelas etapas de adesão e transmigração
leucocitárias.
As integrinas constituem o principal grupo de moléculas de adesão, presentes
em muitas células, inclusive leucócitos. Cada membro dessa família consiste em dois
peptídeos α e β ligados não covalentemente, ambos capazes de atravessar a membrana.
Apresentam-se divididas em três famílias principais: β
1
-integrinas, envolvidas na ligação
das células à matriz extracelular; β
2
-integrinas, envolvidas na adesão dos leucócitos ao
endotélio ou a outras células imunes e β
3
-integrinas, envolvidas nas interações das
plaquetas e neutrófilos nos sítios inflamatórios ou nos locais de dano vascular (Granger e
Kubes, 1994; Seely et al., 2003). Assim como as imunoglobulinas, participam da adesão e
transmigração celular.
25
As β
2
-integrinas consistem de três subunidades α distintas (CD11a, CD11b e
CD11c) ligadas a uma subunidade β comum (CD18). Elas são importantes moléculas
superficiais presentes em polimorfonucleares e linfócitos, interagindo com células
endoteliais, C3bi, microrganismos e matriz extracelular. Polimorfonucleares expressam
CD11a/CD18 (LFA-1), CD11b/CD18 (MAC-1 ou CR3) e CD11c/CD18 (p150/95),
enquanto linfócitos expressam somente CD11a/CD18 (Arnaout, 1990).
1.3.2. Controle da expressão de moléculas de adesão por NO
Conforme dados da literatura, tem sido mostrado que o NO é capaz de inibir a
adesão leucocitária (Kubes et al., 1991; Tsao et al., 1994) através da redução na expressão
de moléculas de adesão (CD11b/CD18, L-, P-, E-selectina, ICAM-1 e VCAM-1) (Lefer e
Lefer, 1996; Spiecker et al., 1998; Armstead et al., 1997; Sato et al., 1999; Pruefer et al.,
1999). Associado a isso, um estudo mostrou uma diminuição da adesão leucocitária pela
inibição de um fator nuclear, o NF-κB, por NO (Peng et al., 1995). Ativado por inúmeros
estímulos, o fator NF-κB regula inúmeros genes e funções que parecem envolver a
participação de espécies reativas de oxigênio (estresse oxidativo) (O’Neill e Kaltschmidt,
1997; Glezer et al., 2000). Encontra-se no citoplasma ligado a uma proteína inibitória (IκB)
que impede a sua translocação para o núcleo e, a posterior, transcrição gênica. Assim, a
fosforilação e a degradação do IκB são necessárias para que ocorra a sua translocação
(Baeuerle e Baltimore, 1996; Baldwin, 1996).
Muitas evidências sugerem que o NO modula o IκB. De fato, foi mostrado que o
NO, por permitir a ativação de fosfatases em células mononucleares sangüíneas periféricas,
é capaz de inibir NF-κB por promover a desfosforilação do IκB. Associado a isso, o NO, ao
reagir com o ânion superóxido, pode evitar a formação de peróxido de hidrogênio e, assim,
impedir a ativação de NF-κB (Gaboury et al., 1993; Fraticelli et al., 1996). Ainda, o NO
pode em determinadas circunstâncias agir como um antioxidante, como N-acetilcisteína e
26
ditiocarbonato de pirrolidina, inibindo a ativação de NF-κB por prevenir a dissociação do
complexo NF-κB/IκB (Peng et al., 1995).
1.3.3. NO e neutrófilos
Neutrófilos são os primeiros e mais numerosos leucócitos a se dirigirem ao sítio
infeccioso ou inflamatório, sendo capazes de promover a fagocitose, liberar grânulos
contendo enzimas destrutivas, metabolizar ácido araquidônico e gerar produtos do
metabolismo do O
2
e citocinas pró-inflamatórias (Korchak et al., 1984; Beaulieu et al.,
1987; Tiku et al., 1986; McColl et al., 1992; Wipke e Allen, 2001). Dessa forma,
utilizando-se desses recursos, neutrófilos são capazes de promover a destruição do agente
agressor, ao mesmo tempo, em que podem provocar injúria tecidual (Seely et al., 2003).
Assim, essas células podem exercer ações contraditórias na defesa do organismo. De fato,
estudos têm mostrado a sua participação na patofisiologia de inúmeras doenças, dentre elas
às desordens inflamatórias (Bainton, 1992; Gallin, 1992; Armstrong, 2001). Nesse sentido,
foi demonstrada uma superprodução de neutrófilos imaturos, apresentando atividade de
mieloperoxidase, bem como uma destruição óssea e de fibras colágenas mediada por essas
células, na AR (Stavaru et. al., 1999; Nada et al., 1999; Bauerova e Bezek, 1999; Lefkowitz
et al., 1999).
Tomando-se como base as evidências de que neutrófilos participam no
desenvolvimento de doenças inflamatórias (artrite reumatóide, glomerulonefrite, doença
intestinal inflamatória, dentre outras) (Weissmann e Korchak, 1984; Holdsworth e
Bellomo, 1984; Wandall, 1985), assim como o NO (artrite reumatóide, sepse e outras)
(Stichtenoth et al., 1995; Benjamim et al., 2000), e de que essas células são capazes de
produzir NO (McCall et al., 1991), estudos têm investigado a participação do NO sobre a
migração neutrofílica em modelos experimentais. De fato, nosso grupo mostrou uma
27
inibição dose-dependente da migração celular, quando inibidores de NOS (aminoguanidina
e L-NAME) foram administrados em ratos submetidos à AZy (Rocha et al., 2003).
Resultado semelhante foi obtido em camundongos tratados com 1400W, um inibidor
seletivo de NOSi, no modelo de inflamação das vias aéreas (Koarai et al., 2000). Dessa
forma, os dados obtidos sugerem uma modulação positiva do NO sobre o influxo celular
em modelos experimentais.
Entretanto, conforme descrito anteriormente, no modelo de ligação e perfuração
do ceco em camundongos, foi demonstrada uma redução na migração neutrofílica à
cavidade peritoneal mediada pelo NO, com o aumento dessa migração quando
aminoguanidina foi administrada (Benjamim et al., 2000). De forma semelhante, o NO
promoveu uma inibição da migração neutrofílica no modelo de endotoxemia (Tavares-
Murta et al., 2001) e sepse induzida por Staphylococcus aureus (Crosara-Alberto et al.,
2002). Ainda, no modelo de pleurite por carragenina em ratos, foi mostrada uma redução
do influxo celular mediado pelo NO (Ialenti et al., 2000). Em um estudo anterior,
semelhante inibição foi observada, sendo mediada através da diminuição do ânion
superóxido (O
2
-
) pelo NO (Kubes et al., 1993). Tomados juntos, esses estudos sugerem uma
ação inibidora do NO sobre a migração leucocitária através de mecanismos que interferem
na adesão de leucócitos ao endotélio.
De fato, foi sugerido que o NO, ao interagir com o O
2
-
liberado pelas células
endoteliais, reduz a reação de dismutação sofrida por esse ânion e, portanto, a síntese de
peróxido de hidrogênio. Esse é responsável pela adesão leucocitária ao endotélio através da
formação do fator de ativação plaquetária (PAF) e aumento da expressão de moléculas de
adesão (P-selectinas e ICAM-1). Além disso, o O
2
-
estimula a liberação de substâncias pró-
adesivas (PAF e citocinas) por mastócitos, aumentando a adesão leucócito-endotélio
(Benjamim, 2001).
Associado a isso, estudos em animal “knock out” estão sendo realizados a fim
de se observar a participação do NO, especialmente o produzido pela NOSi, na migração
neutrofílica. Dessa forma, estudo em camundongos selvagem e “knock out” para NOSi
28
mostrou um recrutamento de neutrófilos para a cavidade peritoneal de ambos animais, com
um papel regulatório bifásico da NOSi na migração celular (na 1ª hora pós-estímulo, houve
um aumento do influxo celular, com diminuição desse influxo na 2ª-4ª hora em animal
“knock out”) (Ajuebor et al., 1998). No entanto, a administração intraperitoneal (i.p.) de
carragenina em camundongos deficientes para NOSi aumentou significativamente a
migração neutrofílica (4ª hora pós-estímulo), quando comparada aos animais selvagens.
(Secco et al., 2003).
Assim, os estudos têm mostrado papéis controversos do NO sobre a migração
celular e sugerido que a capacidade desse radical em promover o recrutamento leucocitário,
ao mesmo tempo em que reduz a síntese de moléculas de adesão, suprimi a ativação celular
e induz apoptose em células inflamatórias (Ross e Reske-Kunz, 2001), parece depender de
sua concentração. Dessa forma, ainda não está claro o papel do NO nessa migração.
1.4. Justificativas e objetivos
Baseado na importância terapêutica de se prevenir o recrutamento leucocitário
em doenças inflamatórias e no papel controverso do NO como modulador desse processo e
mediador inflamatório nessas doenças, tem-se a necessidade de se compreender os
mecanismos pelos quais o NO age sobre a migração celular em modelos experimentais,
buscando-se contribuir com o desenvolvimento de tratamentos que alterem o curso
evolutivo dessas patologias.
Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar o papel do NO na
migração celular aguda em modelos experimentais de artrite e peritonite induzidas por
zymosan ou LPS, em ratos e camundongos, como forma de se avaliar a influência do NO
nessa migração sob diferentes tecidos, estímulos inflamatórios e espécies. Por fim,
estudamos a liberação de leucotrieno B
4
(LTB
4
) e a expressão da molécula de adesão
29
intercelular-1 (ICAM-1) como possíveis vias de atuação do NO sobre essa migração
celular.
Essa participação do NO sobre a migração celular aguda nos modelos
experimentais aqui estudados foi investigada através da modulação farmacológica com
inibidores da óxido nítrico sintase (NOS), em animais selvagens e geneticamente
modificados (knock out) para ICAM-1.
Para tanto, foram realizadas:
- Avaliação do influxo celular na articulação e cavidade peritoneal inflamadas por zymosan
ou LPS, em ratos e camundongos;
- Observação do efeito de inibidores de NOS sobre a migração celular na artrite e peritonite
induzidas por zymosan ou LPS;
- Investigação dos mecanismos envolvidos nos efeitos dos inibidores de NOS sobre o
recrutamento celular nos modelos experimentais aqui estudados através da utilização de
animais selvagem e “knock out” para ICAM-1 e dosagem de LTB
4
.
30
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Animais
Ratos Wistar machos, pesando entre 180 e 200 gramas, e camundongos Swiss
machos, pesando entre 25 e 30 gramas, foram utilizados durante a execução do trabalho. Os
animais foram fornecidos pelo biotério central do Campus do Pici-UFC e mantidos no
biotério setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, em condições controladas
de temperatura (21ºC), sob um ciclo de claro/escuro de 12/12 horas, com livre acesso à
água e alimentação. Todos os procedimentos foram realizados seguindo as diretrizes
preconizadas pelo Manual sobre Cuidados e Usos de Animais de Laboratório (Colégio
Brasileiro de Experimentação Animal, 2003), com inúmeros esforços sendo feitos para
minimizar o número e o sofrimento dos animais utilizados. O projeto científico desse
trabalho foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Federal do Ceará, recebendo o n° 31/04.
Os camundongos geneticamente manipulados (knock out) para ICAM-1,
pesando entre 18 a 20 gramas, foram providos e utilizados no Departamento de
Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - Ribeirão Preto
(USP-RP), tendo sido adquiridos da The Jackson Laboratory (Maine, USA).
2.2. Soluções, drogas e reagentes
Todos os reagentes utilizados apresentavam grau de pureza e propriedades
analíticas adequadas e as drogas utilizadas foram: Hidrato de cloral (REAGEN - Brasil);
N
G
-nitro-L-arginina-metil éster (L-NAME), Zymosan A, N
G
-nitro-L-arginina (Nitro),
Aminoguanidina (Amino) e Lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS) (SIGMA St.
31
Louis, MO., USA); dihidrocloreto de N-[[3- (aminoetil) fenil] metil] etanimidamida
(1400W) e kit ELISA de leucotrieno B
4
(CAYMAN CHEMICAL Co., USA) e Heparina
(Cristália- Brasil).
2.3. Protocolo experimental
2.3.1. Indução da artrite por zymosan (AZy) ou lipopolissacarídeo (ALPS)
Sob leve anestesia com éter etílico, os ratos foram submetidos à indução da AZy
ou ALPS por meio da injeção intra-articular, no joelho direito, de 10-1000 µg de zymosan
ou 1-10 µg de LPS, dissolvidos em 50 µL de solução salina estéril, apirogênica. Sob as
mesmas condições, os camundongos foram submetidos à indução da AZy através da
injeção intra-articular, no joelho direito, de 100 µg de Zy, diluído em 25 µL de solução
salina estéril. O grupo controle (NAIVE) foi submetido apenas à administração de salina no
joelho direito. Após 6 horas de artrite e sob anestesia com hidrato de cloral (400 mg/kg;
i.p.), os animais foram sacrificados por exsangüinação.
2.3.2. Coleta do lavado articular
Os animais foram sacrificados, sob anestesia (hidrato de cloral – 400 mg/kg;
i.p.), por exsangüinação, com posterior lavagem da cavidade articular. Essa foi realizada
através de duas injeções intra-articulares, seguidas de aspiração, de 0,2 mL ou 50 µL de
salina estéril apirogênica, contendo 5 UI/mL de heparina, em ratos ou camundongos,
respectivamente. A conservação do lavado aspirado foi realizada em banho de gelo.
32
2.3.3. Análise da celularidade do lavado articular
Uma amostra do lavado articular foi diluída no líquido de Turk a 10% para
contagem da celularidade em câmara de Neubauer. Em seguida, o lavado foi centrifugado a
3000 g, a 4ºC, por 10 minutos e o sobrenadante obtido foi estocado a -20ºC para posterior
análise.
2.3.4. Indução da peritonite por zymosan (PZy) ou lipopolissacarídeo (PLPS)
Após leve anestesia com éter etílico, os ratos foram submetidos à indução da
PZy ou PLPS por meio da injeção intraperitoneal de 1 mg de Zy ou 10µg de LPS,
dissolvido em 0,5 mL de solução salina estéril. Sob as mesmas condições, os camundongos
foram submetidos à indução da PZy através da injeção intraperitoneal de 100 µg de Zy,
diluído em 100 µL de solução salina estéril. O grupo controle (NAIVE) foi submetido
apenas à administração de salina intraperitoneal. Após 4 horas de peritonite e sob anestesia
(hidrato de cloral – 400 mg/kg; i.p.), os animais foram sacrificados por exsangüinação.
2.3.5. Coleta do lavado peritoneal
Os animais foram sacrificados, sob anestesia (hidrato de cloral – 400 mg/kg;
i.p.), por exsangüinação, com posterior lavagem da cavidade peritoneal. Essa foi realizada
através da incisão e desbridamento da pele abdominal, seguidos da injeção de 7 mL ou 2
mL de salina estéril apirogênica, contendo 5 UI/mL de heparina, em ratos ou camundongos,
respectivamente. Posteriormente, o lavado foi aspirado com pipeta Pasteur e conservado em
banho de gelo.
33
2.3.6. Análise da celularidade do lavado peritoneal
Uma amostra do lavado peritoneal foi diluída no líquido de Turk a 10% para a
contagem da celularidade em câmara de Neubauer. Em seguida, o lavado foi centrifugado a
3000 g, a 4ºC, por 10 minutos e o sobrenadante obtido foi estocado a -20ºC para posterior
análise.
3. Modulação farmacológica
3.1. Inibidores da óxido nítrico sintase
Os grupos de animais foram tratados da seguinte forma:
L-NAME: dissolvido em solução salina estéril (0,9%). Os ratos ou camundongos
receberam doses de 1-30 mg/kg (i.p. ou s.c.) ou 0,3-1 µmol intra-articular, 30 minutos antes
da indução da artrite ou peritonite por Zy ou por LPS.
1400W: dissolvido em solução salina estéril (0,9%). Os ratos receberam dose de 1 mg/kg
(i.p. ou s.c.), 30 minutos antes da indução da artrite ou peritonite por Zy.
N
G
-nitro-L-arginina (Nitro): dissolvido em solução salina estéril (0,9%). Os
camundongos receberam dose de 50 mg/kg (i.p. ou s.c.), 30 minutos antes da indução da
artrite ou peritonite por Zy.
Aminoguanidina (Amino): dissolvido em solução salina estéril (0,9%). Os ratos
receberam dose de 50 mg/kg (i.p.), 30 minutos antes da indução da artrite por Zy.
34
4. Análise estatística
Para comparações múltiplas entre médias, foi utilizada a análise de variância
univariada (ANOVA). Na presença de significância, aplicou-se o teste de Tukey, adotando-
se o nível de significância de 5% (alfa = 0,05). Os resultados foram expressos como média
± e.p.m.
35
3. RESULTADOS
3.1. Efeito do pré-tratamento com L-NAME, 1400W ou Aminoguanidina sobre o
influxo celular à cavidade articular de ratos na artrite induzida por zymosan (AZy)
A figura 3 ilustra o efeito da administração profilática do inibidor não seletivo
de NOS, L-NAME (1-30 mg/kg; i.p.), sobre o influxo celular coletado após 6 horas da
injeção do zymosan em diferentes concentrações (10-1000 µg). Observa-se que,
independentemente da dose de zymosan, o tratamento com L-NAME inibiu de forma
significativa (p<0,05) o influxo celular, quando comparado aos animais que receberam
apenas o zymosan intra-articular e o veículo da diluição do L-NAME. De maneira
semelhante, a administração profilática de inibidores seletivos de NOSi, o composto
1400W (1 mg/kg; i.p.) ou aminoguanidina (50 mg/kg; i.p.), reduziu de forma significativa o
influxo celular na AZy.
Figura 3- Efeito do pré-tratamento com L-NAME, 1400W ou Aminoguanidina (Amino) sobre o influxo
celular à cavidade articular de ratos na artrite induzida por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam
uma injeção intra-articular de zymosan (10-1000 µg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após
6h da indução da AZy. L-NAME (1-30 mg/kg; i.p.), 1400W (1 mg/kg; i.p.) ou Aminoguanidina (50 mg/kg;
i.p.) foi administrado 30 minutos antes da AZy. A contagem total de células foi realizada no lavado articular.
O grupo NAIVE representa animais que receberam salina intra-articular. Grupos não tratados (-, = e ≡)
representam animais artríticos que não receberam qualquer tratamento farmacológico. Os dados representam a
média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por grupo. *p<0,001 quando comparado ao grupo não
tratado (-); #p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado (=) e +p<0,01 quando comparado ao grupo não
tratado (≡) (ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
36
3.2. Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo celular à
cavidade articular de camundongos submetidos à indução da artrite por zymosan
(AZy)
De maneira semelhante ao obtido em ratos, a administração profilática dos
inibidores não seletivos de NOS, L-NAME (3-10 mg/kg; i.p.) ou Nitro (50 mg/kg, i.p.), 30
minutos antes da indução da AZy (Zy 100 µg) em camundongos, reduziu de forma
significativa (1120 ± 326,2; 1600 ± 392,4 e 2095,5 ± 567,4 células/mm
3
para L-NAME 3,
10 e Nitro, respectivamente) (p<0,05) o influxo de leucócitos à cavidade articular desses
animais, quando comparado ao grupo que recebeu apenas o zymosan intra-articular e salina
intraperitoneal (-) (3460 ± 429,6 células/ mm
3
) (fig. 4).
Figura 4- Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo celular à cavidade articular
de camundongos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Camundongos Swiss receberam
uma injeção intra-articular de zymosan (100 µg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h
da indução da AZy. L-NAME (3-10 mg/kg; i.p.) ou Nitro (50 mg/kg; i.p.) foi administrado 30 minutos antes
da AZy. A contagem total de células foi realizada no lavado articular. O grupo NAIVE representa animais que
receberam salina intra-articular. Grupo não tratado (-) representa animais artríticos que não receberam
qualquer tratamento farmacológico. Os dados representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6
animais por grupo. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado (ANOVA univariada seguida de teste de
Tukey).
37
3.3. Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à cavidade
articular de ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy)
A administração local (intra-articular) do L-NAME (0,3 µmol/animal)
promoveu uma inibição significante (p<0,05) do influxo celular à cavidade articular na
artrite por zymosan em ratos (7100 ± 1625,4 células/mm
3
), quando comparado ao grupo
que recebeu zymosan e salina intra-articular (-) (48200 ± 10013,3 células/mm
3
) (fig. 5).
Figura 5- Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à cavidade articular de
ratos submetidos à indução da artrite por zymosan (AZy). Ratos Wistar receberam uma injeção intra-
articular de zymosan (1mg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h da indução da AZy.
L-NAME (0,3-1 µmol; i.a.) foi administrado 30 minutos antes da AZy. A contagem total de células foi
realizada no lavado articular. O grupo NAIVE representa animais que receberam salina intra-articular. Grupo
não tratado (-) representa animais artríticos que não receberam qualquer tratamento farmacológico. Os dados
representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por grupo. *p<0,05 quando comparado
ao grupo não tratado (ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
38
3.4. Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou 1400W sobre o influxo celular à
cavidade peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por zymosan (PZy)
De maneira oposta ao que ocorreu na artrite por zymosan, a administração
profilática de L-NAME (10-30 mg/kg; s.c.) ou 1400W (1 mg/kg; s.c.) aumentou
significativamente (566,7%; 495,1% e 470,7% para L-NAME 10, 30 e 1400W,
respectivamente) (p<0,05) a migração de leucócitos à cavidade peritoneal desses animais,
quando comparado ao grupo que recebeu apenas zymosan intra-peritoneal e salina
subcutânea (-) (fig. 6).
Figura 6- Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou 1400W sobre o influxo celular à cavidade
peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por zymosan (PZy). Ratos Wistar receberam uma
injeção intraperitoneal de zymosan (1 mg), sendo sacrificados, sob anestesia, após 4h da indução da PZy. L-
NAME (10-30 mg/kg; s.c.) ou 1400W (1 mg/kg; s.c.) foi administrado 30 minutos antes da PZy. A contagem
total de células foi realizada no lavado peritoneal. O grupo NAIVE representa animais que receberam salina
intraperitoneal. Grupo não tratado (-) representa animais com peritonite que não receberam qualquer
tratamento farmacológico. Os dados representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por
grupo.*p<0,05 quando comparado ao grupo NAIVE; #p<0,001 quando comparado ao grupo não tratado
(ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
39
3.5. Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo celular à
cavidade peritoneal de camundongos submetidos à indução da peritonite por zymosan
(PZy)
De maneira semelhante ao observado em ratos, a administração profilática de L-
NAME (30 mg/kg; s.c.) promoveu aumento significante (155,8%) (p<0,05) do influxo
celular à cavidade peritoneal, quando comparado ao grupo que recebeu apenas zymosan
intraperitoneal e salina subcutânea (-) (fig. 7).
Figura 7- Efeito do pré-tratamento com L-NAME ou Nitro sobre o influxo celular à cavidade peritoneal
de camundongos submetidos à indução da peritonite por zymosan (PZy). Camundongos Swiss receberam
uma injeção intraperitoneal de zymosan (100 µg), sendo sacrificados, sob anestesia, após 4h da indução da
PZy. L-NAME (30 mg/kg; s.c.) ou Nitro (50 mg/kg; s.c.) foi administrado 30 minutos antes da PZy. A
contagem total de células foi realizada no lavado peritoneal. O grupo NAIVE representa animais que
receberam salina intraperitoneal. Grupo não tratado (-) representa animais com peritonite que não receberam
qualquer tratamento farmacológico. Os dados representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6
animais por grupo. *p<0,05 quando comparado ao grupo NAIVE; #p<0,001 quando comparado ao grupo não
tratado (ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
40
3.6. Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à cavidade
peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por zymosan (PZy)
De maneira semelhante ao observado na artrite por zymosan, a administração
local (intraperitoneal) de L-NAME (10 mg/kg) também promoveu aumento significante do
influxo celular (13900 ± 2464 células/mm
3
), quando comparado ao grupo que recebeu
apenas zymosan intraperitoneal e salina subcutânea (-) (1640 ± 397 células/mm
3
) (p<0,05)
(fig. 8).
Figura 8- Efeito do pré-tratamento local com L-NAME sobre o influxo celular à cavidade peritoneal de
ratos submetidos à indução da peritonite por zymosan (PZy). Ratos Wistar receberam uma injeção
intraperitoneal de zymosan (1 mg), sendo sacrificados, sob anestesia, após 4h da indução da PZy. L-NAME (10
mg/kg; i.p.) foi administrado 30 minutos antes da PZy. A contagem total de células foi realizada no lavado
peritoneal. O grupo NAIVE representa animais que receberam salina intraperitoneal. Grupo não tratado (-)
representa animais com peritonite que não receberam qualquer tratamento farmacológico. Os dados
representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por grupo. *p<0,05 quando comparado ao
grupo NAIVE; #p<0,001 quando comparado ao grupo não tratado (ANOVA univariada seguida de teste de
Tukey).
41
3.7. Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular na artrite por LPS
em ratos (ALPS)
A administração profilática de L-NAME (30 mg/kg; i.p.), um inibidor não
seletivo de NOS, em ratos submetidos à artrite induzida pela injeção intra-articular de LPS
(ALPS) (LPS 1-10 µg), independente da concentração do estímulo, reduziu de forma
significante (1333,3 ± 290,6 e 1133,3 ± 84,3 células/mm
3
para L-NAME em LPS 1µg e
10µg, respectivamente) (p<0,05) o influxo celular à cavidade articular dos animais, quando
comparado ao grupo que recebeu apenas LPS intra-articular e salina intraperitoneal (2685 ±
271,6 e 2375 ± 193,1 células/mm
3
para LPS 1 e 10µg, respectivamente) (fig. 9).
Figura 9- Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular à cavidade articular de ratos
submetidos à indução da artrite por LPS (ALPS). Ratos Wistar receberam uma injeção intra-articular de
LPS (1-10 µg) no joelho direito, sendo sacrificados, sob anestesia, após 6h da indução da ALPS. L-NAME
(10-30 mg/kg; i.p.) foi administrado 30 minutos antes da ALPS. A contagem total de células foi realizada no
lavado articular. O grupo NAIVE representa animais que receberam salina intra-articular. Grupo não tratado
(-) representa animais artríticos que não receberam qualquer tratamento farmacológico. Os dados representam
a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por grupo. *p<0,05 quando comparado ao grupo não
tratado (-); #p<0,001 quando comparado ao grupo não tratado (=) (ANOVA univariada seguida de teste de
Tukey).
42
3.8. Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular à cavidade
peritoneal de ratos submetidos à indução da peritonite por LPS (PLPS)
Em animais submetidos à peritonite pela injeção intraperitoneal de LPS, a
administração profilática de L-NAME (30 mg/kg, s.c.) aumentou significativamente (2700
± 238 células/mm
3
) (p<0,05) o influxo celular, quando comparado ao grupo que recebeu
apenas LPS intraperitoneal e salina subcutânea (-) (1760 ± 204 células/mm
3
) (fig. 10).
Figura 10- Efeito do pré-tratamento com L-NAME sobre o influxo celular à cavidade peritoneal de ratos
submetidos à indução da peritonite por LPS (PLPS). Ratos Wistar receberam uma injeção intraperitoneal de
LPS (10 µg), sendo sacrificados, sob anestesia, após 4h da indução da PLPS. L-NAME (30 mg/kg; s.c.) foi
administrado 30 minutos antes da PLPS. A contagem total de células foi realizada no lavado peritoneal. O
grupo NAIVE representa animais que receberam salina intraperitoneal. Grupo não tratado (-) representa
animais com peritonite que não receberam qualquer tratamento farmacológico. Os dados representam a média
± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por grupo. *p<0,05 quando comparado ao grupo não tratado (-)
(ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
43
3.9. Liberação de leucotrieno B
4
(LTB
4
) na artrite e peritonite induzidas por zymosan
em ratos
A determinação dos níveis de LTB
4
nos lavados articulares ou peritoneais dos
animais submetidos à AZy ou PZy, respectivamente, não sofreu alteração que alcançasse
significância estatística pelo pré-tratamento com L-NAME (30 mg/kg; i.p. e 10 mg/kg; s.c.
para AZy e PZy, respectivamente) (fig. 11).
Figura 11- Liberação de leucotrieno B
4
(LTB
4
) na artrite e peritonite induzidas por zymosan em ratos.
Ratos Wistar receberam uma injeção intra-articular ou intraperitoneal de zymosan (1 mg), sendo sacrificados,
sob anestesia, após 6 ou 4h da indução da AZy ou PZy, respectivamente. L-NAME (10-30 mg/kg; i.p. ou s.c.)
foi administrado 30 minutos antes da AZy ou PZy. Os níveis de leucotrieno B
4
(LTB
4
) nos lavados articular e
peritoneal foram medidos através do ELISA. Grupos não tratados (- e =) representam animais com artrite ou
peritonite que não receberam qualquer tratamento farmacológico. Os dados representam a média ± EPM da
quantidade de LTB
4
(pg/mL) de 6 animais por grupo. Não houve diferença significante entre os grupos
(ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
44
4. Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular à cavidade articular de
camundongos submetidos à artrite induzida por zymosan (AZy)
A figura 10 mostra a comparação do influxo celular na artrite por zymosan em
animais selvagens e “knock out” para ICAM-1. Observa-se diminuição significante
(32,1%) do influxo nos animais “knock out” para ICAM-1 (ICAM-1
-/-
) (=), em comparação
aos animais selvagens submetidos à artrite (-) (p<0,05). O pré-tratamento dos animais com
inibidor não seletivo de NOS, Nitro (50 mg/kg; i.p.), reduziu significativamente (39,4% e
57,8% para animais selvagens e ICAM-1
-/-
, respectivamente) (p<0,05) o influxo celular,
quando comparado aos animais que receberam apenas zymosan, quer fossem selvagens (-),
quer ICAM-1
-/-
(=) (fig. 12).
Figura 12- Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular à cavidade articular de camundongos
submetidos à artrite induzida por zymosan (AZy). Camundongos Swiss selvagens ou “knock out” para
ICAM-1 (ICAM-1
-/-
) receberam uma injeção intra-articular de zymosan (100 µg) no joelho direito, sendo
sacrificados, sob anestesia, após 6h da indução da AZy. Nitro (50 mg/kg; i.p.) foi administrado 30 minutos
antes da AZy. A contagem total de células foi realizada no lavado articular. Os grupos NAIVE e NAIVE’
representam animais selvagens e ICAM-1
-/-
, respectivamente, que receberam salina intra-articular. Grupos
não tratados (- e =) representam animais selvagens e ICAM-1
-/-
artríticos que não receberam qualquer
tratamento farmacológico. Os dados representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por
grupo. #p<0,01 quando comparado ao grupo não tratado (-); *p<0,05 quando comparado aos respectivos
grupos não tratados (ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
45
4.1. Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular á cavidade peritoneal de
camundongos submetidos à peritonite induzida por zymosan (PZy)
A administração i.p. de zymosan (100 µg) em camundongos ICAM-1
-/-
(=)
promoveu uma diminuição do influxo celular (1968,7 ± 710,3 células/mm
3
), quando
comparado aos animais selvagens submetidos à peritonite por zymosan (-) (2533,3 ± 312,7
células/mm
3
). Entretanto, essa redução no influxo (22,3%) não alcançou significância
estatística. Como esperado, o pré-tratamento dos animais selvagens com Nitro (50 mg/kg)
aumentou (3299,25 ± 866,7 células/mm
3
) o influxo celular, comparado aos que receberam
apenas zymsoan i.p. (-). Entretanto, o tratamento profilático com Nitro (50 mg/kg) dos
animais ICAM-1
-/-
não alterou o influxo celular (1781 ± 457,5 células/mm
3
), quando
comparado aos animais ICAM-1
-/-
que receberam apenas zymosan i.p. (1968,75 ± 710,3
células/mm
3
) (=) (fig. 13).
Figura 13- Participação de ICAM-1 sobre o influxo celular à cavidade peritoneal de camundongos
submetidos à peritonite induzida por zymosan (PZy). Camundongos Swiss selvagens ou “knock out” para
ICAM-1 (ICAM-1
-/-
) receberam uma injeção intraperitoneal de zymosan (100 µg), sendo sacrificados, sob
anestesia, após 4h da indução da PZy. Nitro (50 mg/kg; i.p.) foi administrado 30 minutos antes da PZy. A
contagem total de células foi realizada no lavado peritoneal. Os grupos NAIVE e NAIVE’ representam
animais selvagens e ICAM-1
-/-
, respectivamente, que receberam salina intraperitoneal. Grupos não tratados (-
e =) representam animais selvagens e ICAM-1
-/-
com peritonite que não receberam qualquer tratamento
farmacológico. Os dados representam a média ± EPM do número de células/mm
3
de 6 animais por grupo
(ANOVA univariada seguida de teste de Tukey).
46
4. DISCUSSÃO
Nesse trabalho, nós investigamos a participação do óxido nítrico (NO) na
migração celular aguda em modelos experimentais de artrite e peritonite. Com o intuito de
se estudar essa possível participação, observamos o efeito de inibidores da óxido nítrico
sintase (NOS) sobre a migração leucocitária em ratos e camundongos submetidos à artrite
ou peritonite induzida por zymosan (Zy) ou lipopolissacarídeo (LPS). Além disso,
investigamos a possível influência da liberação de leucotrieno B
4
(LTB
4
) sobre o efeito do
NO nessa quimiotaxia, bem como a participação de moléculas de adesão nessa migração
celular através de animais geneticamente manipulados (knock out) para ICAM-1.
Em estudos anteriores, nosso grupo e outros autores demonstraram que a
administração de inibidores de NOS, em animais submetidos à artrite experimental,
promovia efeito antiinflamatório associado à inibição da migração celular (Rocha et al.,
2002; Ajuebor et al., 1999; Cuzzocrea et al., 1997). Além disso, animais geneticamente
modificados, não expressando a enzima NOSi, apresentaram uma redução na migração
celular às articulações inflamadas, no modelo de artrite induzida por colágeno. Entretanto,
conforme exposto na introdução desse trabalho, dados da literatura mostram que a
administração de inibidores de NOS potencia a migração celular nos modelos de peritonite
séptica ou por injeção de LPS na cavidade abdominal de ratos ou camundongos.
Os resultados do presente estudo mostraram de forma inequívoca que a
administração profilática sistêmica (intraperitoneal) de inibidores não seletivos de NOS (L-
NAME ou Nitro-L-arginina), de forma significante e dose dependente, reduziu a migração
de polimorfonucleares (PMNs) à cavidade articular na artrite induzida por zymosan.
Observamos ainda uma inibição dessa quimiotaxia quando L-NAME foi administrado
localmente (intra-articular). Dessa forma, os dados apontam para um efeito modulador do
NO sobre as células residentes e/ou migradas para o foco inflamatório articular, além de
sugerirem uma independência da via de administração sobre essa modulação. Resultados
semelhantes foram obtidos quando administramos dois inibidores seletivos de NOSi,
47
1400W ou aminoguanidina, sugerindo-se uma participação dessa isoenzima nesse
fenômeno.
Corroborando esses achados, mostramos, em estudos anteriores, uma associação
entre níveis elevados de nitrito (um produto da oxidação de NO) e o aumento da migração
celular no lavado articular de animais submetidos à AZy (Rocha et al., 1999; Rocha et al.,
2002). Essa maior liberação de NO foi também associada a um aumento na expressão de
NOSi na sinóvia daqueles animais, particularmente nas células sinoviais, bem como em
neutrófilos e macrófagos presentes na sinovite, promovido pela administração intra-
articular de zymosan. Semelhante participação do NO foi observada em ratos submetidos à
administração intradérmica (i.d.) de zymosan (Greenacre et al., 2002).
Saliente-se ainda que a redução na concentração de zymosan administrado na
articulação dos animais, conforme mostrado nos resultados desse trabalho, não alterou o
efeito dos inibidores de NOS, sugerindo-se que esses compostos são capazes de inibirem a
migração celular aguda no modelo de AZy, de forma independente da dose. Ainda, a
indução da artrite por zymosan com concentração à comumente padronizada se deveu à
possibilidade, aventada nos estudos com peritonite (Ajuebor et al., 1999), de que altas
concentrações de zymosan promoveriam uma migração celular exacerbada, de modo a
prejudicar a demonstração de uma potenciação desse fenômeno inflamatório pela
administração de inibidores de NOS. Nossos dados, portanto, descartam essa possibilidade
e apontam para uma diferença no efeito desses compostos na artrite induzida por zymosan.
Diante dos resultados obtidos, algumas possibilidades foram aventadas, a saber: diferença
do estímulo inflamatório, da espécie estudada e/ou das características próprias do local
inflamado.
Com o intuito de elucidar essas hipóteses, submetemos camundongos à artrite
induzida por zymosan, além de utilizarmos LPS como um diferente estímulo inflamatório
para a artrite. Os resultados obtidos demonstraram, à semelhança do ocorrido na AZy em
ratos, que, em camundongos, a administração de inibidores de NOS promovia a inibição da
migração celular. Associado a isso, na artrite induzida por LPS, os inibidores de NOS
48
promoveram também uma inibição significante da quimiotaxia de PMNs. Em conjunto, os
dados nos permitem sugerir que o efeito da inibição da NOS, provavelmente da NOSi, em
modelos de artrite, é promover uma redução da migração celular aguda de forma
independente do estímulo e da espécie estudada.
Resultados semelhantes aos nossos foram obtidos em cobaias pela co-
administração intradérmica de plasma ativado por zymosan e L-NAME, promovendo uma
inibição significativa da acumulação de polimorfonucleares (neutrófilos e eosinófilos).
Além disso, houve uma reversão dessa inibição quando um doador de NO, o nitroprussiato
de sódio, foi administrado (Faccioli et al., 1991; Teixeira et al., 1993). No modelo de artrite
induzida por antígeno em coelhos, observou-se uma redução do recrutamento de PMNs
pela administração de L-NAME (Mello et al., 1997) e, ainda, na artrite induzida pela parede
de Streptococcus, a administração de L-NMMA inibiu o influxo celular para a cavidade
articular dos animais artríticos (McCartney-Francis et al., 1993). Ademais, a administração
do composto L-NAME em ratos promoveu a diminuição da migração de eosinófilos no
modelo de pleurite provocado pela injeção de bradicinina, PAF, LPS ou carragenina
(Ferreira et al., 1996).
Essa redução da migração celular observada quando a síntese de NO é
bloqueada, especialmente quando NOSi é inibida, pode estar relacionada com a possível
participação do NO na produção de quimiocinas CXC, como proteína inflamatória de
macrófago-2 (MIP-2) e quimioatraente neutrofílico induzido por citocina (KC), cujas ações
quimiotáxicas para PMNs já estão bem estabelecidas (Ajuebor et al., 1998; Haelens et al.,
1996; Rollins, 1997; Luster, 1998).
De fato, apesar das controvérsias, há evidências na literatura de que o NO e o
GMPc agem como mediadores endógenos da quimiotaxia neutrofílica, conforme mostrado
em um estudo em que tanto inibidores de NOS (L-NMMA, L-NAME e L-canavanina)
quanto inibidor de guanilato ciclase (LY-83583) bloquearam a quimiotaxia de neutrófilos
induzida por fMLP (Armstrong, 2001). Associado a isso, a supressão do efeito
vasodilatador do NO, pela administração de inibidores de NOS, pode promover uma
49
vasoconstrição e, dessa forma, contribuir para uma redução da migração celular. Entretanto,
essa possibilidade nos parece improvável pelo fato da sinóvia ser um tecido ricamente
irrigado, no qual, em situações inflamatórias, há vasodilatação e angiogênese, com essa
última sendo detectada a partir do 7º dia de artrite induzida por zymosan (Bezerra et al.,
2004), sugerindo-se a inexistência de déficit na irrigação desse tecido. Corroborando essa
idéia, em um estudo anterior, mostramos que a aminoguanidina, apesar de não alterar a
pressão arterial dos animais, sugerindo não estar agindo sobre a NOS constitutiva,
promoveu uma redução no influxo celular na artrite por zymosan (Rocha et al., 2002).
Assim, considerando que uma vasoconstrição significativa deveria levar a alterações da
resistência periférica e, portanto, da pressão arterial dos animais, parece-nos improvável
que esse fenômeno vasoconstritor, ainda que ocorra, tenha repercussão fisiopatológica
significativa a ponto de ser responsável pela redução do influxo celular à sinóvia inflamada
promovida pela inibição de NOSi.
Conforme os resultados apresentados nesse trabalho, a administração dos
inibidores de NOS promoveram um aumento significante da migração celular aguda na
peritonite induzida por zymosan (PZy) em ratos, de forma dose-dependente. Ainda, esse
efeito foi também observado em camundongos submetidos à PZy e, quando administramos
LPS como estímulo inflamatório, os resultados mostraram-se semelhantes aos obtidos com
o zymosan. Esses resultados concordam com dados obtidos anteriormente no modelo de
peritonite induzida por LPS, na sepse por lesão intestinal ou ainda pela administração
intraperitoneal de Staphylococcus aureus (Tavares-Murta et al., 1998; Benjamim et al.,
2000; Crosara-Alberto et al., 2002). Corroborando esses achados, foi mostrado ainda um
aumento significativo da migração neutrofílica em animais pré-tratados com Nitro (50
mg/kg; s.c.) ou aminoguanidina (50 mg/kg; s.c.) submetidos à peritonite por carragenina
(30 µg/1 mL) ou por LPS (20 ng/1mL), com a administração de L-arginina (500 mg/kg)
revertendo aquele aumento (Secco et al., 2003). Em conjunto, nossos resultados mostram
que a variação do local inflamatório, mas não da espécie ou do estímulo empregado, é um
determinante na modulação exercida pelo NO sobre a migração de PMNs nas articulações e
na cavidade peritoneal.
50
Estudos em animais geneticamente manipulados (knock out) para NOSi, em
diferentes modelos experimentais, mostraram um aumento no recrutamento leucocitário
para o sítio inflamatório, quando comparado aos animais selvagens, sugerindo a
participação do NO sintetizado por aquela enzima na redução da migração celular em
modelos experimentais (Secco et al., 2003; Hickey et al., 1997; Benjamim et al., 2002).
Entretanto, foi demonstrada, em animais “knock out” para NOSi submetidos à peritonite
induzida por zymosan (0,2 mg), uma diminuição significativa do influxo celular no lavado
peritoneal daqueles animais (Ajuebor et al., 1998). Os autores associaram essa supressão do
influxo aos baixos níveis de MIP-2 e IL-10 detectados no lavado peritoneal dos animais.
Sugeriram ainda que, apesar da IL-10 suprimir a infiltração de PMNs às áreas inflamadas
(Mosmann, 1994; Cassatella et al., 1993; Perretti et al., 1995; Haskó et al., 1998), a
modulação de sua produção pela NOSi não se mostrou tão relevante, nas condições
experimentais utilizadas, a ponto de interferir significativamente na migração celular. Essa
aparente discrepância do NO sobre a migração celular aguda apresentada em nossos
experimentos pode refletir as diferentes ações que o NO exerce sobre a quimiotaxia
neutrofílica, conforme descrito na literatura. De fato, estudos in vitro mostraram uma
diminuição da quimiotaxia mediada pelo fMLP, quando um inibidor de NOS (L-NMMA)
foi utilizado (Kaplan et al., 1989), bem como uma indução da quimiotaxia neutrofílica na
presença de NO exógeno (Beauvais et al., 1995). Contrapondo-se a esses estudos, foi
sugerido que o NO ou compostos doadores é capaz de inibir aspectos da ativação
neutrofílica, incluindo a quimiotaxia (Clancy et al., 1992). Dessa forma, existe a
possibilidade de que variações nas concentrações de NO sejam capazes de alterar o seu
efeito sobre a quimiotaxia de neutrófilos, uma vez que há estudos sugerindo que baixas
concentrações de NO promoveriam a migração neutrofílica, ao passo que altas
concentrações a inibiriam (Wanikiat et al., 1997; Van Ufflelen et al., 1996). No presente
estudo, essa possibilidade nos parece remota, uma vez que, na artrite induzida por zymosan,
a redução da concentração dos inibidores de NOS reproduziu os resultados obtidos com as
maiores concentrações ou não os alterou, sugerindo-se um efeito dose-dependente.
Entre os diversos mediadores lipídicos envolvidos na migração celular aguda, o
leucotrieno B
4
(LTB
4
) tem sido implicado nos fenômenos de quimiotaxia, particularmente
51
para polimorfonucleares. Em estudos anteriores, nosso grupo, além de outros autores,
demonstrou um aumento na liberação de LTB
4
em modelos de artrite, bem como inibição
da migração de PMNs pela administração de antagonistas ou inibidores da síntese de LTB
4
(Rocha et al., 1996; Oliveira et al., 1997; Crooks e Stockley, 1998; Rocha et al., 2004). In
vitro, em leucócitos do sangue periférico de portadores de artrite reumatóide, demonstrou-
se a inibição da expressão das moléculas de adesão CD11b/CD18 após a administração oral
de um antagonista de LTB
4
(Alten et al., 2004). Com o intuito de se demonstrar um
possível efeito modulador do NO sobre a liberação de leucotrienos, determinamos os níveis
de LTB
4
na articulação e na cavidade peritoneal dos animais. Reproduzindo achados
anteriores, obtivemos aumento nos níveis de LTBB
4
tanto na artrite quanto na peritonite por
zymosan. Entretanto, a administração dos inibidores de NOS não alterou esses níveis,
independentemente do local inflamado, sugerindo que a participação do NO no processo de
migração celular aguda nos modelos de artrite ou peritonite induzida por zymosan parece
ser independente da liberação de LTB
4
B em nível local.
Além da atuação do NO sobre a quimiotaxia de neutrófilos, vários são os
possíveis mecanismos responsáveis pela inibição da migração celular mediada por aquele
radical. Dentre esses, encontra-se o envolvimento do NO na inibição do rolamento e da
adesão neutrofílica ao endotélio (Secco et al., 2003), assim como da transmigração
leucocitária (Grisham et al., 1998). Reforçando essa idéia, estudos demonstraram um rápido
aumento no rolamento e na adesão leucocitária em vênulas pós-capilares não inflamadas,
quando se inibiu a produção de NO endógeno (Davenpeck et al., 1994; Kubes et al., 1991),
com a reversão do processo pela administração de L-arginina ou de doadores de NO (Kubes
e Granger, 1992). Tem sido proposta ainda, como outro possível mecanismo de ação, uma
diminuição na expressão de moléculas de adesão (V-CAM-1, E-selectina e P-selectina)
mediada pelo NO. Essa diminuição ocorreria através da atuação do NO sobre a liberação de
citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, IL-6 e IL-8) ou a ativação de NF-κB, promovendo a
inibição desses dois processos (Gauthier et al., 1994; De Caterina et al., 1995; Khan et al.,
1996; Hickey et al., 1997). De fato, tem sido mostrado que inibidores de NOS aumentam,
enquanto que doadores de NO diminuem, a expressão de moléculas de adesão
CD11b/CD18, L-, P-, E-selectinas, ICAM-1 e VCAM-1 (Lefer e Lefer, 1996; Spiecker et
52
al., 1998; Gauthier et al., 1994; Armstead et al., 1997; Sato et al., 1999; Pruefer et al.,
1999).
Com relação à NF-κB, esse fator nuclear é tido como um dos principais fatores
de transcrição na resposta inflamatória, estando envolvido na expressão de moléculas de
adesão e de citocinas pró-inflamatórias (Baeuerle e Henkel, 1994). Sua relação com o NO
está associada com o fato de que ele inibe a sua ativação através da indução e estabilização
de IκB-α, uma proteína reguladora que inibe a translocação de NF-κB para o núcleo (Peng
et al., 1995). Dessa forma, o NO pode impedir a expressão de moléculas de adesão e de
mediadores inflamatórios, interferindo assim no processo de migração celular.
Associado a esses possíveis mecanismos, sugere-se ainda que o NO pode agir
como um antioxidante, induzindo proteínas protetoras (ferritina, hemeoxigenase e
superóxido dismutase) contra o estresse oxidativo, uma condição ativadora de NF-κB e
promotora de injúria tecidual (Kim et al., 1995; Nunoshiba et al., 1993). Além disso, o NO
pode reagir com o ânion superóxido (O
2
-
), impedindo a formação de peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
), composto envolvido na adesão leucocitária por promover a expressão
de moléculas de adesão através da ativação de NF-κB ou pela formação de PAF
(Benjamim, 2001).
Por fim, a evidência de que o NO modula a função do citoesqueleto (estrutura
essencial para leucócitos ativados realizarem a adesão, migração, fagocitose e
degranulação), através da regulação da polimerização e despolimerização da actina, pode
contribuir para a redução na infiltração celular mediada por aquele radical (Downey, 1994).
De fato, estudos mostraram que o NO exógeno inibiu a polimerização da actina em
neutrófilos humanos, reduzindo a sua habilidade em aderir à fibronectina (Sato et al., 1999;
Clancy et al., 1995). Ainda, foi mostrada uma diminuição no número de projeções de
microvilos na superfície celular e uma redução na capacidade leucocitária em iniciar
interações com P e E-selectinas no rolamento, quando houve uma interrupção no
citoesqueleto leucocitário (Finger et al., 1996).
53
Diante do exposto, decidimos investigar o papel de moléculas de adesão
endotelial sobre a modulação exercida pelo NO no influxo celular naqueles modelos
experimentais. Para tanto, utilizamos animais “knock out” para ICAM-1 (ICAM-1
-/-
), um
ligante de superfície endotelial que contribui para a adesão leucocitária ao endotélio
vascular (Diamond et al., 1990; Marlin e Springer, 1987). Os resultados mostraram uma
redução do influxo celular ao sítio inflamatório nos animais ICAM-1
-/-
submetidos à AZy
ou PZy, quando comparado aos animais selvagens. Essa redução só alcançou significância
estatística nos animais submetidos à artrite. Esse resultado pode indicar uma maior
participação de ICAM-1 na modulação da migração leucocitária na sinóvia, quando
comparado ao peritôneo.
A administração do inibidor não seletivo de NOS, Nitro-L-arginina (Nitro),
promoveu uma redução no influxo celular na artrite por zymosan, tanto nos animais
selvagens quanto naqueles ICAM-1
-/-
. Entretanto, a administração de Nitro não modificou o
influxo celular nos animais ICAM-1
-/-
submetidos à peritonite por zymosan, diferentemente
ao aumento observado quando se administrou Nitro-L-arginina em animais selvagens
submetidos à peritonite por zymosan. Como exposto acima, ICAM-1 é tido como uma
molécula presente na superfície endotelial que participa do processo de adesão de
neutrófilos, macrófagos e linfócitos ao endotélio (Diamond et al., 1990; Marlin e Springer,
1987) e que cuja expressão parece estar diminuída na presença de NO (Lefer e Lefer,
1999). Em conjunto, os nossos resultados obtidos com os animais geneticamente
manipulados mostram a participação de ICAM-1 na modulação do influxo celular na
cavidade articular e peritoneal. Ainda, a diferença do efeito dos inibidores de NOS sobre o
influxo celular em ambas as cavidades, promovendo aumento da migração no peritôneo
está associado à modulação da expressão dessa molécula de adesão pelo NO produzido a
partir da ativação de NOSi.
54
5. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos nos modelos de artrite e peritonite animais
apresentados nesse trabalho, concluímos:
- O óxido nítrico (NO), particularmente o produzido pela óxido nítrico sintase
induzível (NOSi), modula a migração celular aguda de forma dependente do sítio
inflamatório, mas independente do estímulo, da espécie e da via de administração;
- A modulação mediada pelo NO envolve a participação de células residentes
e/ou migradas nos modelos experimentais de artrite e peritonite;
- Em ambos os modelos animais, o NO modula essa migração por uma via
independente da liberação de leucotrieno B
4
(LTB
4
);
- A molécula de adesão intercelular ICAM-1 participa da migração celular nos
modelos experimentais estudados, principalmente no modelo de artrite;
- No modelo de peritonite induzida por zymosan (PZy), o NO age sobre a
migração celular através de uma via dependente de ICAM-1.
55
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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