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INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS – UFAM
PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA TROPICAL E
RECURSOS NATURAIS
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PEIXE ORNAMENTAL
Carnegiella strigata (CHARACIFORMES, GASTEROPELECIDAE) DE TRÊS
RIOS DE ÁGUA PRETA DA AMAZÔNIA CENTRAL
Carlos Henrique Schneider
MANAUS – AM
Abril, 2007
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ii
CARLOS HENRIQUE SCHNEIDER
ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA DO PEIXE ORNAMENTAL
Carnegiella strigata (CHARACIFORMES, GASTEROPELECIDAE) DE TRÊS
RIOS DE ÁGUA PRETA DA AMAZÔNIA CENTRAL
Orientador: Jorge Ivan Rebelo Porto, Dr.
Dissertação apresentada ao Programa
Integrado de Pós-Graduação em Biologia
Tropical e Recursos Naturais do convênio
INPA/UFAM, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva.
MANAUS – AM
Abril, 2007
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
S358 Schneider, Carlos Henrique
Análise da variabilidade genética do peixe ornamental Carnegiella
strigata (Characiformes, Gasteropelecidae) de três rios de água preta da
Amazônia Central / Carlos Henrique Schneider .--- Manaus : [s.n.],
2007.xvi, 72 f. : il.
Dissertação (mestrado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2007
Orientador : Jorge Ivan Rebelo Porto
Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
Sinopse:
Espécimes do peixe ornamental Carnegiella strigata provenientes da bacia dos rios
Negro, Urubu e Uatumã foram estudados mediante análise de seqüências do gene da
ATPase 8/6. As análises filogenéticas e populacionais sugerem a presença de duas
unidades evolutivas e também evidência de uma possível conexão antiga entre a bacia
do rio Negro e Uatumã.
iv
Dedico esta dissertação
aos meus pais João e
Edite, à minhas irmãs
Marielle e Silvia e à
minha esposa Maria
Claudia.
v
“Cada grande passo na
ciência foi precedido por uma
nova audácia da imaginação”
John Dewey
vi
Agradecimentos
Ao Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos
Naturais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e Universidade
Federal do Amazonas (UFAM), curso de Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva.
Ao Laboratório Temático de Biologia Molecular (LTBM) do INPA,
Coordenação de Pesquisas (COPE), onde foi desenvolvida a maior parte deste
trabalho.
Pelo financiamento dos Projetos de Pesquisas Institucionais, do Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Universal Proc.
47.2345/2004-4), Projeto Mariuá (Pronex/FINEP 46.6098/2001-4) e Projeto
Navegabilidade, hidrologia, qualidade de água e biodiversidade do rio Negro
(FINEP/CNPq 3724/04).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
que concedeu a bolsa de estudo durante a realização deste trabalho.
Agradeço a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou
indiretamente, possibilitaram a realização deste trabalho.
Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto, que me ensinou como é interessante a
biologia molecular. Por ter acreditado e confiado no meu trabalho, pelos estímulos,
atenção, pelas dúvidas plantadas na minha cabeça (e que não foram poucas),
pela amizade, conselhos, compreensão e pela força em momentos difíceis, o que
facilitou muito a execução deste trabalho.
À Dra. Eliana Feldberg, que além de ser uma mãe para todos os seus
alunos, ainda o é para os alunos do Jorge. Obrigado pelos conselhos e incentivo.
Além do mais, sem o seu auxílio e o do Jorge eu não poderia ter vindo para
Manaus. Um obrigado especial por todo o apoio na minha vida pessoal, nos
momentos mais complicados.
Ao Dr. Jansen Zuanon e à Dra. Vera Scarpassa, pelas valiosas críticas e
sugestões no meu trabalho.
À MSc. Lucélia Nobre de Carvalho, pelo auxílio com as coletas na bacia do
rio Urubu.
vii
Às amigas do Projeto Pirada (Jacqueline, Kyara, Naiara, Tatiana, Fabíola,
Giselle, Rosa, Luci, Andréa, Iamilli) pelo auxílio no laboratório, bem como nas
soluções dos problemas encontrados. E também pelo bom humor sem o qual o dia
a dia de trabalho ficaria mais cansativo.
Às amigas do LTBM Renata Frederico e Renata Schmitt. Valeu pela força e
pela ajuda sempre que precisei. E à MSc Renata Schmitt, pelo tempo “gasto” no
auxílio das análises do Paup.
Às minhas irmãs científicas Alexandra, Audrey, Rebecca, Maria José e Ana
Fabíola, pela força no laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Genética Animal do INPA: Claudia, Aldaléia,
Leandra, Eduardo, Denise, Jota, Cacá, Marco e Thiago. Obrigado pelas
sugestões, bem como pelas festas no laboratório.
Aos amigos do mestrado do GCBEV-2005, em especial ao Eduardo
(Belugão), Fátima, Luciano, Walfran e Raimundo pelos momentos de
descontração sem os quais o caminho seria mais difícil.
À Hercilia e Alessandra, super secretárias do GCBEV. Sem elas os alunos
iriam sofrer muito.
Ao Sr. Ribeiro pelo auxílio na coleta em Barcelos.
Ao Robertão, Mara, Marcelo, Ernani, Miguel e demais colegas do
Laboratório de Citogenética Animal da Universidade Estadual de Ponta Grossa,
pelo auxílio e por me iniciarem na vida científica.
Aos casais de amigos Leandra e Igor, Waleska e Daniel e Eduardo e Tahisa
pelos ótimos momentos de diversão, bem como pelo apoio nas horas que mais
precisei.
Ao Lineu Gross e Marilda Delfrate Gross, que além de terem me dado a
Claudinha, são mais que sogros e sempre foram grandes amigos. É bom fazer
parte da vida de vocês.
À MSc. Maria Claudia Gross, pelo exemplo profissional, por ser a primeira
revisora de tudo que faço, pelo apoio, pelas críticas e sugestões deste trabalho. E
à minha esposa Maria Claudia, obrigado pelo companheirismo e amizade nas
viii
horas alegres e tristes, sempre com seu amor e carinho me incentivou a seguir
adiante. É maravilhoso ter você ao meu lado.
À Dra. Marielle Cristina Schneider, pelo exemplo de como age um excelente
profissional. E à minha irmã Marielle, pelo incentivo e por mostrar como é
maravilhosa a Biologia e a Genética.
À minha irmã Silvia, a única da família que desertou a biologia e resolveu
escrever a sua própria História. Obrigado pelo apoio e incentivo. E é ótimo ser
irmão e amigo de vocês.
Aos meus pais João Carlos Schneider e Edite Maria Schneider, que são
meus exemplos de vida. Pai, obrigado por você ter feito parte da minha vida, os
altos papos dentro do “Fiatão” jamais serão esquecidos, tudo valeu a pena. Mãe,
obrigado por ter me incentivado a voltar a estudar, você tinha razão, como
sempre. Sem o apoio e incentivo de vocês eu não teria crescido pessoal e
profissionalmente. Amo vocês.
ix
RESUMO
Os peixes ornamentais do gênero Carnegiella são conhecidos vulgarmente
como peixe-borboleta, sendo que Carnegiella strigata é conhecido como peixe-
borboleta rajado. Esta espécie pode ser encontrada na Guiana, Suriname,
Colômbia, Bolívia, Peru e Brasil (bacia Amazônica) e aparentemente tem sua
distribuição limitada a rios de água preta. Este trabalho apresenta preliminarmente
a variabilidade genética de C. strigata, provenientes de três rios de água preta da
Amazônia central. Foram genotipados 69 indivíduos de C. strigata utililizando
seqüencias nucleotídicas dos genes ATPase 8/6 do DNA mitocondrial (646 pb)
sendo que os espécimes foram coletados na bacia do rio Negro (cinco
localidades), na bacia do rio Urubu (uma localidade) e bacia do Uatumã (duas
localidades). Os dados mitocondriais evidenciaram altos níveis de variação
genética que sugerem a presença de mais de uma unidade evolutiva. Um grupo
foi formado por espécimens provenientes de Mauá, Urubaxi, Pixirituba e Tarumã
(bacia do rio Negro) e Urubu (bacia do rio Urubu) e o outro grupo foi formado por
espécimes provenientes do rio Uatumã e Barretinho (bacia do rio Uatumã) e
Cajarizinho (bacia do rio Negro). As árvores gênicas mitocondriais (máxima
parcimônia, máxima verossimilhança e distância genética) e análises de genética
populacional (polimorfismo de DNA, AMOVA, Teste de Mantel) permitiram a
identificação de 13 haplótipos agrupados em dois grupos monofiléticos
segregantes. Cada uma das unidades evolutivas de C. strigata apresentou uma
variação da distância genética distinta uma da outra, sendo que a distância
genética entre as duas unidades evolutivas foi de 11,50%. Ambas unidades
diferiram em 19,70% em relação à espécie irmã, C. marthae. Com base nos dados
moleculares sugere-se uma antiga conexão entre as cabeceiras de alguns
tributários do rio Negro e do rio Uatumã. Se assumirmos que cada uma das
unidades evolutivas encontrada em C. strigata corresponde a uma espécie então
muito provavelmente C. strigata engloba um complexo de espécies. Por outro
lado, se assumirmos que cada uma das unidades evolutivas corresponda a uma
população ou um grupo de populações divergentes geneticamente e
eventualmente isolada reprodutivamente de outras unidades populacionais
x
relacionadas, então se deve aplicar o conceito de Unidades Evolutivas
Significativas (ESU – Evolutionary Significat Units).
xi
ABSTRACT
Ornamental fish species of the genus Carnegiella are commonly known as
hatchetfish and in particular, Carnegiella strigata is known as the marbled
hatchetfish. It is found in Guiana, Suriname, Colombia, Bolivia, Peru and Brazil
(Amazon basin) and apparently is limited to black waters rivers. The present study
is a preliminary assessment of the genetic variability of C. strigata from three black
waters rivers in the Central Amazon. Sixty-nine specimens from five localities in the
Negro river basin, one locality in the Urubu river basin and two localities in the
Uatumã river basin were genotyped using the nucleotide sequence of
mitochondrial ATPase 6/8 genes (646 bp). The mtDNA data resulted in unexpected
high levels of variation that suggest the presence of more than only one
evolutionary unit. Specimens from Mauá, Urubaxi, Pixirituba, Tarumã (Negro
basin) and Urubu (Urubu basin) formed one evolutionary unit, and specimens from
Barretinho and Uatumã (Uatumã basin) and Cajarizinho (Negro basin) formed
another unit. Analyses of mitochondrial gene trees (maximum parsimony,
maximum likelihood and genetic distance) and population genetics (DNA
polymorphism, AMOVA, Mantel Test) allowed the identification of 13 haplotypes
assembled in two monophyletic groups, with genetic segregation between them.
The range of the genetic distance found in each evolutionary unit of the so-called
C. strigata were distinct, and the average genetic distance between the
evolutionary units was 11.50%. When compared to C. marthae, the sister species
of C. strigata, both units showed an average genetic distance of 19.70%. Based on
molecular data we suggest a past connection between the headwaters of some
tributaries from the Negro and the Uatumã river basins. If we assume that each
evolutionary unit detected corresponds to a valid species, then today, what is
known as C. strigata in fact corresponds to a widespread species complex. If we
assume that each evolutionary unit corresponds to a group of specimens which are
genetically divergent and reproductively isolated from other groups of the same
species, then the concept of an evolutionary significant unit (ESU) must be evoked.
xii
SUMÁRIO
1. Introdução ........................................................................................................... 1
1.1 Carnegiella strigata como objeto de estudo genético .................................... 1
1.2 DNA mitocondrial como ferramenta para estudos genéticos ......................... 3
1.3 Considerações sobre as bacias dos rios Negro, Urubu e Uatumã ................ 6
1.4 Objetivos Gerais ............................................................................................ 8
1.4.1 Objetivos Específicos .............................................................................. 8
1.5 Hipóteses ....................................................................................................... 8
2. Material e Métodos .............................................................................................. 9
2.1 Locais de coleta e amostragem ..................................................................... 9
2.2 Análises Moleculares ................................................................................... 12
2.2.1 Extração de DNA ................................................................................... 12
2.3 Análise dos Dados ....................................................................................... 14
2.3.1 Edição e Alinhamento das Seqüências ................................................. 14
2.3.2 Inferências Evolutivas ........................................................................... 15
2.3.3 Análises Populacionais ......................................................................... 16
3. Resultados ........................................................................................................ 18
3.1 Seqüência de DNA ...................................................................................... 18
3.2 Análise e distribuição dos haplótipos ........................................................... 20
3.3 Inferências evolutivas .................................................................................. 21
3.3.1 Máxima Parcimônia (MP) ...................................................................... 21
3.3.2 Máxima Verossimilhança (MV) .............................................................. 21
3.3.3 Agrupamento de vizinhos (NJ) .............................................................. 22
3.4 Análises populacionais ................................................................................ 27
3.4.1 Análises de polimorfismo de DNA ......................................................... 27
3.4.2 Análise de Variância Molecular (AMOVA) e estrutura genética ............ 28
3.4.3 Teste de Mantel .................................................................................... 30
3.4.4 Árvore de haplótipos ............................................................................. 31
4. Discussão .......................................................................................................... 33
xiii
5. Conclusão ......................................................................................................... 43
6. Referências bibliográficas ................................................................................. 44
7. Anexos .............................................................................................................. 53
Anexo 1.............................................................................................................. 53
Anexo 2.............................................................................................................. 54
Anexo 3.............................................................................................................. 55
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Imagens ilustrativas de C. strigata morfotipos strigata (A), forma
intermediária (B) e fasciata (C). ............................................................................... 9
Figura 2 – Exemplares de C. strigata dos diferentes pontos de amostragem. ...... 10
Figura 3 - Localização da área de estudo. Os pontos marcados são referentes às
áreas de amostragem de C. strigata. M=igarapé Mauá, U=rio Urubaxi, Pi= igarapé
Pixirituba, Caj=igarapé Cajarizinho, T=rio Tarumã, Uru=rio Urubu, Uat=bacia do rio
Uatumã e Bar=igarapé Barretinho. ........................................................................ 11
Figura 4 – Esquema da localização dos primers utilizados para amplificação e
seqüenciamento do gene da ATPase 8/6 de C. strigata. ...................................... 13
Figura 5 – Número de substituições (TS-transição, TV-transversão) contra
distância genética HKY+G, para o gene da ATPase. ............................................ 19
Figura 6 – Consenso estrito entre 3 árvores de MP (L = 188; CI = 0,952; RI =
0,972; RC = 0,926) considerando matriz de peso TS1/TV1. Os números acima dos
ramos são valores de bootstrap para 1000 réplicas. No interior dos quadrados
coloridos está o número de indivíduos de cada localidade que apresentam o
haplótipo e as cores representam as localidades. ................................................. 23
Figura 7 – Árvore de MV (Ln = 1630,94823) com os 13 haplótipos de C.strigata.
No interior dos quadrados coloridos está o número de indivíduos de cada
localidade que apresentam o haplótipo e as cores representam as localidades. Os
valores entre os ramos indicam a distância genética entre os grupos. ................. 24
Figura 8 – Árvore de distância genética com os 13 haplótipos de C. strigata, obtida
pelo agrupamento de vizinhos, usando o modelo de HKY+G. No interior dos
quadrados coloridos os números de indivíduos de cada localidade que apresenta o
haplótipo. As cores representam as localidades. Os valores entre os ramos
indicam a distância genética entre os grupos........................................................ 25
Figura 9 – Árvore de haplótipos evidenciando as conexões entre os 13 haplótipos
evidenciados em C. strigata. Os círculos pequenos significam haplótipos inferidos,
mas não detectados, *69 número de passos adicionais necessários para conectar
as sub-árvores. Os haplótipos estão distribuidos da seguinte forma: Unidade
xv
evolutiva 1: h1=Urubaxi, Mauá e Pixirituba; h2=Urubaxi; h3=Pixirituba; h4 a
h7=Tarumã, h8=Urubu; e Unidade evolutiva 2: h9 a h12=Cajarizinho e h13=bacia
do rio Uatumã. ....................................................................................................... 32
Figura 10 – Imagem evidenciando os locais de coleta com sobreposição da árvore
de máxima parcimônia. ......................................................................................... 39
Figura 11 – Imagem orbital (radar SRTM) mostrando a região da cabeceira do rio
Uatumã e do rio Apuaú, afluente do rio Negro. Em evidência a região onde poderia
ter ocorrido o contato da bacia do rio Uatumã com a bacia do rio Negro. Fonte
SigLab-INPA, com modificações. .......................................................................... 40
xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Identificação dos locais de coleta de C. strigata .................................. 11
Tabela 2 – Frequência dos haplótipos de C. strigata encontrados entre os 69
indivíduos, evidenciando as localidades onde U=Urubaxi; M=Mauá; Pi=Pixirituba;
Caj=Cajarizinho; T=Tarumã; Uru=Urubu e Uat=bacia do Uatumã. ....................... 20
Tabela 3 – Distância genética entre os haplótipos (em porcentagem) obtida pela
distância p não corrigida. Haplótipos h1 a h8 correspondem à unidade evolutiva 1
e haplótipos h9 a h13 à unidade evolutiva 2. ........................................................ 26
Tabela 4 – Resultados da análise de polimorfismo de DNA, entre os indivíduos de
C. strigata das cinco localidades. Onde: N=número de indivíduos; H=número de
haplótipos; HU=haplótipos únicos; S=sítios polimórficos; ETA=número de
mutações; HD=diversidade haplotípica; PI=diversidade nucleotídica; K=média das
diferenças nucleotídicas par a par. ........................................................................ 27
Tabela 5 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 1, entre e dentro dos
grupos de populações. Unidade evolutiva 1 corresponde a indivíduos das
localidades Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã. Fst : 0,91345. ............................ 28
Tabela 6 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 2, entre e dentro dos
grupos de populações. Unidade evolutiva 2 corresponde a indivíduos das
localidades Cajarizinho e Uatumã/Barretinho. Fst : 0,88377. ................................ 29
Tabela 7 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número
estimado de migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações
par a par. Evidenciados na unidade evolutiva 1. ns= não significativo. ................. 29
Tabela 8 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número
estimado de migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações
par a par. Evidenciados na unidade evolutiva 2. ................................................... 29
Tabela 9 – Matriz de distância em quilômetros, considerando o leito do rio. ........ 30
Tabela 10 – Valores obtidos no teste de Mantel. .................................................. 30
1
1. Introdução
1.1 Carnegiella strigata como objeto de estudo genético
O gênero Carnegiella pertence à família Gasteropelecidae na qual existem dois
outros gêneros: Gasteropelecus e Thorachocarax. O gênero Carnegiella possui quatro
espécies: C. marthae; C. myersi; C. schereri e C. strigata (Weitzman & Palmer, 2003).
Segundo Weitzman (1960) as espécies do gênero Carnegiella são formas neotênicas
derivadas de Gasteropelecus, seu grupo irmão.
O gênero Carnegiella distingue-se dos demais gêneros da família pela ausência
de nadadeira adiposa e também pelo seu tamanho relativamente menor em relação aos
outros gasteropelecídeos e a exemplo dos demais representantes da família as
espécies de Carnegiella também possuem a região peitoral fortemente pronunciada e
as nadadeiras peitorais alongadas e posicionadas para o alto (Weitzman & Palmer,
2003).
As modificações nas nadadeiras e região peitoral permitem a estes peixes dar
pequenos saltos acima da lâmina d’água durante a fuga de predadores e na busca de
alimento (Wiest, 1995; Weitzman & Palmer, 1996). Por esta razão são conhecidas
vulgarmente como peixe-borboleta.
Uma das espécies de Gasteropelecidae de maior apelo comercial, dado o bonito
padrão morfológico, é Carnegiella strigata (Günther). Este peixe é comumente
conhecido como peixe-borboleta rajado e é intensamente explorado comercialmente
como peixe ornamental, estando entre as 15 espécies de maior destaque no ramo da
aquariofilia amazônica. Somente entre os anos de 1998 e 1999 foram exportados
aproximadamente 600.000 indivíduos (Chao, 1998, 2001). Dados mais recentes
indicam que de todos os peixes ornamentais destinados à exportação, 2,4%
correspondem ao gênero Carnegiella, incluindo C. strigata (Anjos, no prelo).
Carnegiella strigata pode ser encontrada na Guiana, Suriname, Colômbia,
Bolívia, Peru e Brasil (bacia Amazônica). Seu habitat está associado a áreas
sombreadas de áreas alagadas e de pequenos igarapés. Essa espécie vive em
2
cardumes e sua alimentação é basicamente insetívora, mas com estratégias
alimentares generalistas, baseadas no consumo oportunista de itens alimentares
disponíveis no ambiente, normalmente na superfície da água. O formato da boca só
permite que ele coma alimentos na superfície. Seu tamanho médio quando adulto é de
4 a 5 cm. Seu corpo é de cor prateada, às vezes castanho dourado, com quatro listras
marrons escuras, que lhe dão um aspecto marmóreo. A parte dorsal é num tom mais
escuro e uma faixa amarela em sentido longitudinal se prolonga das brânquias até o
começo da cauda. As nadadeiras pélvicas são tão pequenas que quase não são
notadas. Seu corpo curto e achatado lateralmente apresenta a região anterior em
formato de quilha de navio, de onde partem suas desenvolvidas nadadeiras peitorais
que são largas e em forma de asas e que medem quase a metade de seu corpo
(Weitzman, 1954; Géry, 1973; Weitzman & Palmer, 2003; Géry, 1977; Nelson, 1994;
Santos, 2005).
Desde que Carnegiela strigata foi descrita por Günther (1864), a partir de dois
exemplares de origem desconhecida, a delimitação taxonômica dessa espécie tem
suscitado debates. Atualmente ela é considerada sinônima sênior de pelo menos sete
espécies nominais e por várias vezes foi dividida em subespécies (Géry, 1973;
Weitzman & Palmer, 2003).
Géry (1973) realizou uma análise nomenclatural bem como uma análise dos tipos
morfológicos de C. strigata provenientes de diversos rios. Ele separou C. strigata em
dois morfotipos: strigata e fasciata.
De acordo com Géry (1973), C. strigata morfotipo strigata ocorre na Guiana (alto
rio Suriname), no Suriname (rio Maroni, rio Cottica), Peru (rio Tigre e quebrada
Yanayacu) e provavelmente no Brasil (rio Purus, Codajás e Lago Saracá na boca do rio
Urubu). Já C. strigata morfotipo fasciata ocorre predominantemente no Brasil (de
Tabatinga a Belém), no Peru (Iquitos, Yurimaga e Pevas), na Colômbia (rio Caqueta).
Desta maneira é possível que entre Manapuru e Lago Saracá os morfotipos strigata e
fasciata sejam simpátricos.
Géry (1973) descreve C. strigata tipo strigata com um corpo alongado, possuindo
de 25 a 30 raios na nadadeira anal, apresentando a terceira listra corporal dividida a
3
partir da borda do tórax. Já C. strigata tipo fasciata apresenta um corpo mais alto, com
26 a 32 raios na nadadeira anal, e com a terceira listra corporal não dividida antes da
base da nadadeira peitoral (Figura 1).
Este mesmo autor chama atenção para algumas amostras que ele chamou de
intermediárias, e que ocorrem no alto rio Meta (bacia do Orinoco), rio Xeruini (médio rio
Negro) e no rio Negro (perto de Manaus). Em tais exemplares o espaço entre os dois
ramos da listra 3 não é apagada, assemelhando-se portanto a listra 3 do tipo
morfológico fasciata porém mais larga.
Weitzman & Palmer (2003) na obra Check list of the freshwater fishes of South
and Central America apresenta de maneira sintética uma revisão sobre a nomenclatura
dos gasteropelecídeos. Porém, estes autores não reconhecem a divisão de C. strigata
em subespécies.
Considerando a importância econômica de C. strigata para a economia do
Amazonas, a provável existência de diferentes morfotipos explotados sob uma mesma
denominação taxonômica, e o fato dos morfotipos habitarem rios de águas pretas
normalmente separados por rios de água branca, observa-se que o estudo genético
molecular propiciando conhecimentos sobre a estrutura da população e delimitação
taxonômica pode ser de capital importância para o estabelecimento de estratégias de
uso e conservação deste recurso pesqueiro.
Os estudos genéticos em C. strigata estão restritos a descrição do cariótipo
(Terencio et al., no prelo) onde foi observado que a espécie possui 50 cromossomos
autossômicos (4 metacêntricos, 4 submetacêntricos, 2 subtelocêntricos e 40
acrocêntricos).
1.2 DNA mitocondrial como ferramenta para estudos genéticos
A genética de peixes na região amazônica teve seu início no final da década de
70, sendo empregadas técnicas de citogenética e isoenzimas. Mais recentemente,
seqüências de DNA têm sido usadas para entender relações evolutivas em alguns
grupos de peixes (Alves-Gomes et al., 1995; Farias et al., 1999). Porém, tratando-se de
4
peixes ornamentais, dados sobre filogeografia, estrutura genética de populações e
capacidade de sustentação são pobremente conhecidos (Porto et al., 2001).
Na última década tornou-se comum a utilização de marcadores mitocondriais em
estudos genéticos de animais, uma vez que essa organela possui genoma próprio
(DNAmt) e geralmente pequeno (15 a 20 kb), com grande número de variação
nucleotídica e estrutura simples de organização, além de apresentar herança
uniparental materna e ausência de recombinação. Estas características fazem com que
um haplótipo mitocondrial possa servir para traçar uma genealogia ou até mesmo uma
filogenia materna, o que muitas vezes pode ajudar a entender o modo de dispersão de
muitos organismos (Avise, 1994, 2000; Ballard & Whitlock, 2004).
O DNA mitocondrial possui 37 genes. Desses 13 codificam proteínas, dois RNAs
ribossomais (12 S e 16 S), 22 RNAs transportadores e uma região não codificante
chamada de região controle (Boore, 1999).
Dentre estes genes, destaca-se o da ATPase, o qual tem sido utilizado para
inferências sobre aspectos evolutivos, populacionais e filogeográficos de espécies de
peixes (Bermingham & Martin, 1998; Sivasundar et al., 2001; Perdices et al., 2002;
Hughes & Hillyer, 2006; Reeves & Bermingham, 2006).
A ATPase constitui uma família de enzimas que catalisam a hidrólise do ATP
(adenosina trifosfato) para originar ADP (adenosina difosfato) e fosfato inorgânico, com
liberação de energia. Estas enzimas são processadas a partir de duas subunidades
gênicas, ATPase 8/6 (Alberts et al., 2002).
De acordo com Zardoya & Meyer (1996) o gene da ATPase se enquadra na
categoria dos pobremente apropriado para estudos filogenéticos, mas um dos mais
recomendados para estudos filogeográficos e de diversidade genética (Bermingham &
Martin, 1998; Martin & Bermingham, 2000; Reeves & Bermigham, 2006).
Com base em uma análise no banco de dados do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) as seqüências disponíveis de ATPase de Characiformes
restringem-se a 37 de Roeboides, 21 de Prochilodus, 2 de Semaprochilodus, 37 de
Bryconamericus, 54 de Brycon, 2 de Astyanax, 1 de Chalceus e 1 de Phenacogrammus.
Dos casos acima, duas espécies relacionam-se a estudos com mitogenomas (Saitoh et
5
al., 2003) e as demais com filogeografia ou com sistemática molecular (Bermingham &
Martin, 1998; Sivasundar et al., 2001; Machordom & Doadrio, 2001a; Reeves &
Bermingham, 2006).
De acordo com os dois mitogenomas de Characiformes já publicados, Chalceus
macrolepidotus e Phenacogrammus interruptus (Saitoh et al., 2003), a subunidade 8 da
ATPase possui 168 nucleotídeos que, quando traduzidos, codificam 56 aminoácidos; e
a subunidade 6 da ATPase possui 228 nucleotídeos que codificam 76 aminoácidos.
Convém destacar que, a exemplo de outros dois pares de genes mitocondriais, as
ATPases 8/6 se sobrepõem em dez nucleotídeos.
Considerando-se a diversidade ictiofaunística da região amazônica, estudos
abordando a diversidade genética de peixes limitam-se aos seguintes gêneros:
Prochilodus (família Prochilodontidae); Potamorrhaphis, Belonion e Pseudotylosurus
(família Belonidae); Paracheirodon (família Characidae); Hypopygus (família
Rhamphycthyidae); Brachyplatystoma (família Pimelodidae) Mylesinus (família
Serrasalmidae); Arapaima (família Arapaimidae) (Porto, 1999; Lovejoy & de Araújo,
2000; Harris & Petry, 2001; Sivasundar et al., 2001; Batista & Alves-Gomes, 2006;
Formiga-Aquino, 2004; Turner et al., 2004; Hrbek et al., 2005; Schmitt, 2005). Na
maioria destes estudos verificou-se uma forte relação entre a estrutura genética das
populações e os locais de amostragem, excetuando os grandes migradores, sendo a
vicariância o principal evento responsável por essa diversificação.
A região amazônica é a mais rica em espécies de peixes de todo o mundo,
contudo informações sobre sua diversidade e os processos evolutivos que a geraram
são pobremente conhecidos. Descrever os padrões e entender os processos que
produziram esta imensa diversidade é importante, ainda mais pelo fato de poder-se
analisar a variabilidade genética de uma espécie de peixe ornamental altamente
explorada, como é o caso de Carnegiella strigata, oriunda de bacias de drenagem de
água preta próximas de Manaus (centro exportador), como a bacia do rio Negro, do
Uatumã e do Urubu.
6
1.3 Considerações sobre as bacias dos rios Negro, Urubu e Uatumã
Os rios amazônicos podem ser classificados em: rios de águas brancas, com
coloração barrenta, possuindo muitos sedimentos em suspensão; rios de águas claras
que têm suas cabeceiras nos Escudos do Brasil Central e das Guianas e que drenam
áreas onde existe pouca erosão; e rios de águas pretas (Sioli, 1990; Santos & Ferreira,
1999).
Os rios de águas pretas têm sua origem no platô das Guianas, que consiste
numa área de formação geológica muito antiga e erodida, datando do período Pré-
Cambriano. Estes rios não transportam material em suspensão em grande quantidade.
Porém, encontram-se na sua área de captação enormes florestas inundáveis (igapós) e
o material orgânico produzido pela floresta, tais como folhas e galhos, caem na água e
decompõe-se parcialmente. Vários produtos de decomposição são solúveis e de
coloração marrom, provocando a coloração escura da água (Junk, 1983).
Muitas destas substâncias possuem características ácidas (ácidos húmicos e
fúlvicos), contribuindo para baixar o pH da água, que pode atingir valores ao redor de
quatro. Este tipo de água é extremamente pobre em sais minerais (Junk, 1983;
Goulding et al.,1988).
Nas proximidades de Manaus, destacam-se três bacias de drenagens de água
preta: o rio Negro, rio Urubu e rio Uatumã. Os padrões ecológicos desses sistemas de
águas pretas podem ser caracterizados como acentuada oligotrofia, baixa produtividade
de biomassa vegetal e animal, recursos pesqueiros concentrados nas suas florestas
inundadas e diversidade biológica alta.
O rio Negro é o maior tributário do rio Amazonas, com 1700 km de extensão.
Este rio drena três principais formações geológicas: o escudo das Guianas, a região
dos sedimentos terciários e a região sedimentar quaternária da bacia Amazônica,
totalizando cerca de 750.000 km
2
. Corredeiras são encontradas apenas na região mais
alta do seu curso. O nível da água é amplamente influenciado pelo regime de chuvas na
Amazônia como um todo, sendo que no período de cheia alguns tributários podem
conectar-se formando uma planície de inundação (Junk, 1983; Goulding et al., 1988;
7
Santos & Ferreira, 1999).
O rio Urubu e o rio Uatumã drenam regiões geológicas dos períodos terciário e
quaternário. As atividades neotectônicas, durante este último período, originaram
inúmeras corredeiras e cachoeiras no leito de seus tributários (Nogueira & Sarges,
2001; Ibanez, 2006). Devido a este relevo acidentado, no rio Uatumã está localizada a
hidrelétrica de Balbina, a qual iniciou seu funcionamento no final da década de 80.
Os rios Negro, Urubu e Uatumã são paralelos entre si e são afluentes da margem
esquerda do rio Amazonas, cujas águas são brancas e ricas em sedimentos. Como C.
strigata, aparentemente tem sua distribuição limitada a rios de água preta, a realização
de uma amostragem nestes rios, associado ao um estudo genético, pode ser uma real
contribuição para uma melhor compreensão da história evolutiva de C. strigata nessas
bacias fluviais.
8
1.4 Objetivos Gerais
Analisar a variabilidade genética do peixe ornamental Carnegiella strigata em três
rios de água preta da Amazônia central.
1.4.1 Objetivos Específicos
• Estimar a variabilidade genética em populações de Carnegiella strigata;
• Testar a presença de fluxo gênico entre as localidades das bacias dos rios Negro,
Urubu e Uatumã;
• Inferir o grau de diferenciação entre as populações das diferentes bacias de
drenagem;
• Relacionar os agrupamentos encontrados com a distribuição geográfica das
populações amostradas.
1.5 Hipóteses
H0
1
- Não existe divergência genética entre as populações de Carnegiella strigata de
diferentes rios de água preta na Amazônia central.
H0
2
- Fluxo gênico entre as populações não é influenciado pela distância geográfica.
H0
3
- Não há diferenças quanto ao grau de variabilidade genética entre as amostras.
9
2. Material e Métodos
2.1 Locais de coleta e amostragem
Para a identificação dos morfotipos strigata, fasciata e intermediário utilizou-se o
trabalho de Géry (1973), observando-se o padrão da listra 3 localizada no meio do
corpo que se origina na base do coracóide e que se prolonga até a listra abaixo da
dorsal (Figura 1).
Exemplares de Carnegiella strigata (Figura 2) foram coletados, com auxílio de
puçás, redinhas e rapichés, em tributários da bacia do rio Negro, próximo às cidades de
Santa Isabel do rio Negro (na margem direita: rio Urubaxi – U e na margem esquerda:
igarapé Mauá – M), Barcelos (na margem direita: o igarapé Cajarizinho – Caj e na
margem esquerda: o igarapé Pixirituba - Pi) e Manaus (na margem esquerda: o rio
Tarumã). Na bacia do rio Urubu no igarapé Ajuricaba – Uru. Na bacia do rio Uatumã, o
igarapé Barretinho – Bar, à jusante do lago de Balbina e em um igarapé no rio Uatumã
– Uat, à montante do lago de Balbina. (Figura 2). Os oito pontos amostrados foram
georeferenciados com auxílio de um GPS e espécimes testemunhos encontram-se
depositados no Laboratório de Genética da Coordenação de Pesquisas em Biologia
Aquática do INPA (Tabela 1).
Figura 1 - Imagens ilustrativas de C. strigata morfotipos strigata (A), forma intermediária
(B) e fasciata (C).
10
Figura 2 – Exemplares de C. strigata dos diferentes pontos de amostragem.
11
Figura 3 - Localização da área de estudo. Os pontos marcados são referentes às áreas
de amostragem de C. strigata. M=igarapé Mauá, U=rio Urubaxi, Pi= igarapé Pixirituba,
Caj=igarapé Cajarizinho, T=rio Tarumã, Uru=rio Urubu, Uat=bacia do rio Uatumã e
Bar=igarapé Barretinho.
Tabela 1 – Identificação dos locais de coleta de C. strigata
Bacia Local de coleta Número amostral Coord. S-N Coord. W-E
rio Negro
rio Urubaxi (U) 7 0°34'15" S 64°49'55" W
igarapé Mauá (M) 6 0°21'21" S 65°09'33" W
igarapé Cajarizinho (Caj) 14 1°04'25" S 62°58'16" W
igarapé Pixirituba (Pi) 15 0°53'52"S 62°41'11"W
rio Tarumã (T) 15 2°42'36"S 60°02'57,50"W
rio Uatumã
igarapé Barretinho (Bar) 6 1°58'19" S 59°29'48" W
Uatumã (Uat) 4 1°28'23"S 60°16'11"W
rio Urubu
igarapé Ajuricaba (Uru) 2 2°06'58,8" S 59°56'7,8" W
12
2.2 Análises Moleculares
2.2.1 Extração de DNA
Para extração do DNA foram descartadas as vísceras e as escamas, utilizando-se
somente o tecido muscular. Este foi obtido da região peitoral do peixe, por meio de um
pequeno corte com material esterilizado. O protocolo de extração de DNA utilizado foi o
descrito por Sambrook & Russell (2001), com algumas modificações. Foi utilizado o
tampão de lise (Tris-HCl pH 8,0 em 10 mM, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS
1%) de Estoup et al. (1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente foram
acrescentados: 15 μL de proteinase K (10 mg/mL) e 6 μL de RNAse (10 mg/mL). As
amostras foram incubadas para que o tecido fosse totalmente digerido.
A seguir foram feitas lavagens sucessivas com fenol, fenol clorofórmio, álcool
isoamílico e clorofórmio hidratado (500 μL de cada um destes reagentes).
Após a lise, o DNA foi separado das proteínas por precipitação salina juntamente
com centrifugação a 14000 rpm. O sobrenadante foi então precipitado com um volume
de isopropanol 100%, também com o auxílio de centrifugação. Ao final, o DNA foi
hidratado com aproximadamente 100 μL de água milli-Q, dependendo do tamanho do
pellet (DNA precipitado) formado.
Para possibilitar a análise da quantidade e integridade do material, o DNA extraído
foi quantificado por comparação com marcador de concentração conhecida, em
eletroforese padrão (com tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40
minutos) em gel de agarose 0,8% e corado com brometo de etídio (EtBr – 0,5 g/mL). A
visualização e análise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Eagle Eye
(Stragene), o qual possui acoplado um transluminador de ultravioleta (260 nM).
13
2.2.2 Amplificação do DNA
O gene mitocondrial da ATPase 8/6 foi amplificado por Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR - Saiki et al., 1988), utilizando os seguintes oligonucleotídeos
iniciadores (primers): ATP8.2-L8331 5’-AAAGCRTYRGCCTTTTAAGC-3’ e CO3.2-
H9236 5’-GTTAGTGGTCAKGGGCTTGGRTC-3’, descritos por Lovette et al. (1998)
(Figura 4).
As reações de PCR foram feitas em um termociclador Ependorff - Mastercycler
Gradient, para volume final de 25 μL (~100 ng de DNA genômico; Tampão 1X; 0,5
unidades de Taq DNA Polimerase; 0,2 mM de cada dNTP – dATP, dCTP, dTTP, dGTP;
0,2 μM de cada primer; 2,0 mM de cloreto de magnésio e água mili-Q para completar o
volume) em 30 ciclos sendo: desnaturação a 93°C por 1 minuto, anelamento a 60°C por
1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos. Após os 30 ciclos uma
extensão final a 72°C por 5 minutos.
Depois de amplificado, os produtos de PCR foram verificados em eletroforese em
gel de agarose 1,0% corado com EtBr (0,5 μg/mL). As visualizações e documentações
dos géis de agarose foram realizadas no fotodocumentador Eagle Eye (Stragene).
A purificação dos produtos de PCR foi realizada com uso do kit GFX PCR DNA
Kit (GE HealthCare), seguindo o protocolo sugerido pelos fabricantes.
Figura 4 – Esquema da localização dos primers utilizados para amplificação e
seqüenciamento do gene da ATPase 8/6 de C. strigata.
14
2.2.3 Seqüenciamento do DNA
O seqüenciamento do DNA foi realizado pelo método de Sanger et al. (1977),
com terminadores marcados com fluorescência. Para a realização das reações de
seqüenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (GE
HealthCare), no qual cada dideoxinucleotídeo (terminador) é marcado com fluoresceína
(responsável pela ativação do segundo elemento) e um dos quatro tipos de rodamina,
cuja fluorescência é captada pelo seqüenciador automático de DNA.
As reações de seqüenciamento foram realizadas em placas de 96 poços,
utilizando-se entre 150 e 300 ng do produto de PCR purificado; 5pmol de cada primer
em reações separadas; 4 μL do premix (kit) e água mili-Q para completar o volume de
10 μL. Essas reações foram feitas em um termociclador Ependorff - Mastercycler
Gradient, em 30 ciclos sendo: desnaturação a 95°C por 20 segundos, anelamento a
50°C por 15 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto e 30 segundos. Os primers
utilizados no seqüenciamento foram os mesmos utilizados para o PCR. Depois de
seqüenciado, os fragmentos foram submetidos a um tratamento de precipitação para a
eliminação de produto não incorporado durante a reação de seqüenciamento. Logo
após foi realizada a leitura automática do fragmento no seqüenciador automático de
DNA MegaBACE 1000 (GE HealthCare), nas condições de injeção e corrida
recomendadas pelo fabricante.
2.3 Análise dos Dados
2.3.1 Edição e Alinhamento das Seqüências
As amostras seqüenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do
seqüenciador para outro computador. As seqüências geradas foram comparadas com
seqüências depositadas no banco de dados público na Internet, GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), através de uma procura realizada com o programa
BLAST. Este procedimento foi realizado para determinar se o fragmento seqüenciado
15
realmente correspondia ao gene de interesse. Depois de conferidas, todas as
seqüências foram alinhadas utilizando-se o programa de alinhamento múltiplo Clustal W
(Thompson et al., 1994), que está incluso no BioEdit v. 5,0,6 (Hall, 1999). O
alinhamento gerado foi manualmente conferido e editado no mesmo programa.
2.3.2 Inferências Evolutivas
As relações evolutivas entre as populações de C. strigata foram estimadas
através dos métodos de Máxima Parcimônia (Hennig, 1966), Máxima Verossimilhança
(Felsenstein, 1981), e Agrupamento de Vizinhos (Saitou & Nei, 1987) com o emprego
do modelo evolutivo adequado. A busca do modelo foi realizada com o programa
ModelTest 3.7 (Posada & Crandall, 1998). Estas análises foram realizadas no programa
PAUP* 4.0 (Swofford, 1999). A espécie Carnegiella marthae foi utilizada para enraizar
as árvores encontradas.
A Máxima Parcimônia (MP) utiliza um algorítimo que realiza uma busca entre
todas as topologias mais prováveis de conter a árvore mais parcimoniosa, ou seja,
determina a topologia que apresenta o menor número de passos e, conseqüentemente,
o cladograma de menor tamanho para explicar as diferenças observadas nos terminais.
Foram estimados o comprimento em número de passos (L=Lenght), o índice de
consistência (CI=Consistence Index) e o índice de retenção (RI=Retention Index). Visto
que três árvores foram igualmente parcimoniosas, foi realizado o consenso estrito e a
regra de maioria entre todas as árvores. A robustez de cada nó interno foi
implementada através da análise de bootstrap, realizada com 1000 replicatas.
O método de Máxima Verossimilhança MV (Felsenstein, 1981) considera a
árvore mais verossímil aquela que apresenta a maior probabilidade de explicar a
natureza dos dados observados através de um dado modelo evolutivo. Este modelo foi
o HKY+G, escolhido pelo ModelTest 3.7 (Posada & Crandall, 1998). A procura pela
árvore mais verossímil foi realizada pela busca heurística com adição randômica de
táxons com 1000 réplicas.
16
O método de Agrupamento de Vizinhos (Neighbour Joining = NJ) tem como
princípio encontrar pares de unidades taxonômicas operacionais (OTUs = vizinhos) que
minimizam o comprimento total dos ramos em cada estágio do agrupamento com base
na em dados de distância evolutiva (Saitou & Nei, 1987). Utilizando este método foi
gerada uma árvore de distância corrigida pelo modelo HKY+G e outra pela distância p.
Para ser possível a comparação com outros trabalhos que utilizam a ATPase como
marcador, uma matriz de distância genética para estimativa da divergência entre as
unidades evolutivas foi obtida pela distância p não corrigida considerando os 13
haplótipos de C. strigata.
2.3.3 Análises Populacionais
As análises populacionais foram realizadas posteriormente às inferências
evolutivas em C. strigata. Cada local de coleta (igarapé) foi considerado como uma
população, exceto as localidades de Urubaxi e Mauá que foram agrupadas como uma
só, bem como as do Uatumã e Barretinho. Considerando a baixa amostragem no rio
Urubu, esta localidade foi excluída das análises populacionais. As estimativas de
variabilidade e diferenciação genética calculadas foram:
(1) H - número de haplótipos;
(2) HU - haplótipos únicos;
(3) ETA - número de mutações;
(4) K - média das diferenças nucleotídicas par a par;
(5) HD – diversidade gênica (haplotípica), que é definida como a probabilidade de dois
alelos escolhidos ao acaso em uma população serem diferentes – calculada pelo
método Nei (1987);
(6) PI − diversidade nucleotídica, a média de diferenças nucleotídicas por sítio
amostrados aleatoriamente entre duas seqüências de DNA (Li & Graur, 1991);
(7) S – número de sítios polimórficos;
(8) Nm – número de migrantes entre populações;
(9) Fst – índice de fixação.
17
Estas análises de variabilidade foram realizadas nos programas ARLEQUIN 3.1
(Schneider et al., 2006) e DnaSP 4.0 (Rozas et al., 2003).
A Análise de Variância Molecular - AMOVA (Excoffier et al., 1992), inclusa no
programa ARLEQUIN 3.1 (Schneider et al., 2006), foi utilizada para testar a significância
da variabilidade encontrada dentro e entre as populações amostradas. Esta análise
utiliza as informações de uma matriz de distância entre as seqüências para medir dois
componentes da variância total que são:
(1) o número de mutações entre as diferentes populações;
(2) o número de mutações entre os diferentes haplótipos de cada população. Estes
componentes foram utilizados para o cálculo dos índices de fixação. Por se tratar de
uma análise hierárquica, foi possível agrupar os indivíduos dentro de populações e as
populações dentro de grupos, determinando, dessa maneira, a estrutura a ser testada
(Schneider et al., 2006). Foram testadas as diferenças dentro e entre cada local de
coleta.
O Teste de Mantel é um método estatístico que testa a significância da relação
entre duas matrizes de similaridade, utilizando o valor de Fst. Neste trabalho foi
utilizado para estimar a significância da relação entre a distância genética e distância
geográfica que foi calculada com base na distância pelo leito dos rios. Esta análise foi
realizada no programa ARLEQUIN 3.1 (Schneider et al., 2006).
A árvore de haplótipos foi obtida a partir do programa TCS 1.21 (Clement et al.,
2000), um software que agrupa seqüências dentro de haplótipos, calcula a freqüência
destes nas populações amostradas e estima relações genealógicas entre elas. Este
programa foi utilizado para estimar cladogramas não enraizados de haplótipos com o
critério da máxima parcimônia (95%).
18
3. Resultados
3.1 Seqüência de DNA
A amplificação com os primers para a ATPase 8/6, resultou em um fragmento de
646 pb em Carnegiella strigata. Estas seqüências foram comparadas com outras
disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov
) e o segmento correspondia à
ATPase de Characiformes.
Ao todo foram seqüenciados 69 indivíduos de C.strigata, sendo que 561 sítios
foram constantes e 85 variáveis. A média da composição nucleotídica calculada foi de
32,11% para Adenina, 23,44% para Citosina, 10,27% para Guanina e 34,18% para
Timina. A taxa de transição/transversão foi de 4,3, sendo que dos 646 pb foram
observadas 86 substituições nucleotídicas, 85 sítios polimórficos, dos quais 70 eram
transições e 16 transversões. Não foi visualizada saturação para transições ou
transversões quando a distância genética HKY+G foi plotada contra os dois tipos de
mutação (Figura 5).
19
Gráfico de saturação
0
10
20
30
40
50
60
70
0
%
5
%
1
0
%
1
5
%
2
0
%
2
5
%
3
0
%
Distância genética
Número de substituições
TS
TV
Figura 5 – Número de substituições (TS-transição, TV-transversão) contra distância
genética HKY+G, para o gene da ATPase.
20
3.2 Análise e distribuição dos haplótipos
No total foram obtidas 69 seqüências completas da ATPase, correspondentes a
sete no rio Urubaxi, seis no igarapé Mauá, 15 no Pixirituba, 14 no igarapé Cajarizinho,
15 no rio Tarumã, dois no rio Urubu e 10 no rio Uatumã. Estas apresentaram 13
haplótipos diferentes, sendo dois no Urubaxi (h1 e h2), um no Mauá (h1), dois no
Pixirituba (h1 e h3), quatro no Tarumã (h4, h5, h6 e h7), um no Urubu (h8), quatro no
Cajarizinho (h9, h10, h11 e h12) e um para as duas localidades da bacia do rio Uatumã
(h13), havendo compartilhamento de haplótipos entre as localidades de Urubaxi (cinco
indivíduos), Mauá (seis indivíduos) e Pixirituba (14 indivíduos) (Tabela 2).
Tabela 2 – Frequência dos haplótipos de C. strigata encontrados entre os 69 indivíduos,
evidenciando as localidades onde U=Urubaxi; M=Mauá; Pi=Pixirituba; Caj=Cajarizinho;
T=Tarumã; Uru=Urubu e Uat=bacia do Uatumã.
Haplótipos
rio Negro rio Urubu rio Uatumã
Total
U M Caj Pi T Uru Uat
h1 5 6 - 14 - - - 25
h2 2 - - - - - - 2
h3 - - - 1 - - - 1
h4 - - - - 9 - - 9
h5 - - - - 2 - - 2
h6 - - - - 3 - - 3
h7 - - - - 1 - - 1
h8 - - - - - 2 - 2
h9 - - 9 - - - - 9
h10 - - 2 - - - - 2
h11 - - 1 - - - - 1
h12 - - 2 - - - - 2
h13 - - - - - - 10 10
Total 7 6 14 15 15 2 10 69
21
3.3 Inferências evolutivas
3.3.1 Máxima Parcimônia (MP)
A análise de máxima parcimônia (MP), considerando-se pesos iguais entre
transição e transversão (TS/TV) gerou três árvores igualmente parcimoniosas. Ao total
foram 85 sítios variáveis e destes 82 foram informativos para a parcimônia. Para a
visualização de apenas uma árvore foram feitos o consenso estrito e a regra da maioria
(≥ 50%). Os resultados dessas topologias foram semelhantes separando C. strigata em
duas unidades evolutivas, suportada cada uma por um bootstrap de 100. A primeira,
englobas as localidades do Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã e Urubu, sendo que esta
unidade evolutiva é separada em dois grupos irmãos: um agrupando as localidades do
médio rio Negro (Urubaxi, Mauá e Pixirituba – haplótipos de h1 a h3) e outro
englobando as localidades do baixo rio Negro (Tarumã – haplótipos de h4 a h7) e bacia
do rio Urubu (haplótipo h8). A segunda unidade evolutiva agrupa a localidade de
Cajarizinho (bacia do rio Negro – haplótipos h9 a h12) como grupo irmão de Uatumã
(bacia do rio Uatumã – haplótipo h13). A árvore que melhor representa os dados é
mostrada na figura 6.
3.3.2 Máxima Verossimilhança (MV)
Dentre os 56 modelos evolutivos testados, o que melhor se adequou às
seqüências foi o modelo de HKY+G, a partir do teste de verossimilhança implementado
no ModelTest, sendo que o programa indicou parâmetro Gamma =0,2220, taxa de ts/tv
= 7,3621 e freqüência de bases nucleotídicas A= 0,3211, C= 0,2344, G = 0,1027 e
T=0,3418. A partir destes parâmetros foi obtida uma árvore de máxima verossimilhança
com Ln= 1630,94823. Da mesma forma como a árvore de MP, houve a separação de
C. strigata em duas unidades evolutivas. A diferença entre as árvores de MP e MV foi
22
na unidade evolutiva 1 onde o grupo formado por indivíduos das localidades do médio
rio Negro (Urubaxi, Mauá e Pixirituba – haplótipos h1 a h3) estariam mais relacionados
com alguns indivíduos da localidade do baixo rio Negro (Tarumã – haplótipos h4 e h5)
(Figura 7).
3.3.3 Agrupamento de vizinhos (NJ)
As árvores de distância geradas pelo o método do agrupamento de vizinhos
segundo o modelo de HKY+G e distância p, foram semelhantes. As duas unidades
evolutivas evidenciadas pela MP e MV também foram demonstradas pelo método de
agrupamento de vizinhos. Novamente a diferença entre as árvores resultantes dos
diferentes métodos (MP, MV e NJ) encontra-se na unidade evolutiva 1, onde o grupo
formado pelos indivíduos do médio rio Negro (Urubaxi, Mauá e Pixirituba – haplótipos
h1 a h3) manteve-se constante, porém indíviduos do baixo rio Negro (Tarumã –
haplótipo h6) foram considerados basais para esta unidade (Figura 8).
A matriz de distância genética par a par foi determinada pela distância p não
corrigida (Tabela 3). A distância p entre Carnegiella strigata e Carnegiella marthae
(grupo externo) variou de 17,80 a 19,70%, enquanto que a distância genética entre os
haplótipos de C. strigata variou de 0,20 a 11,50%. Evidenciou-se uma variação genética
separando C. strigata em duas unidades evolutivas com uma elevada distância genética
entre elas, variando de 10,80 a 11,50%, aproximadamente a metade encontrada para o
grupo externo. Com relação à distância genética encontrada dentro das unidades, esta
variou de 0,20 a 2,00% para unidade evolutiva 1 (haplótipos h1 a h8) e de 0,20 a 0,60%
para a unidade evolutiva 2 (haplótipos h9 a h13). A tabela 3 apresenta as distâncias
encontradas entre os haplótipos de C. strigata.
23
Figura 6 – Consenso estrito entre 3 árvores de MP (L = 188; CI = 0,952; RI = 0,972; RC
= 0,926) considerando matriz de peso TS1/TV1. Os números acima dos ramos são
valores de bootstrap para 1000 réplicas. No interior dos quadrados coloridos está o
número de indivíduos de cada localidade que apresentam o haplótipo e as cores
representam as localidades.
24
Figura 7 – Árvore de MV (Ln = 1630,94823) com os 13 haplótipos de C.strigata. No
interior dos quadrados coloridos está o número de indivíduos de cada localidade que
apresentam o haplótipo e as cores representam as localidades. Os valores entre os
ramos indicam a distância genética entre os grupos.
25
Figura 8 – Árvore de distância genética com os 13 haplótipos de C. strigata, obtida pelo
agrupamento de vizinhos, usando o modelo de HKY+G. No interior dos quadrados
coloridos os números de indivíduos de cada localidade que apresenta o haplótipo. As
cores representam as localidades. Os valores entre os ramos indicam a distância
genética entre os grupos.
26
Tabela 3 – Distância genética entre os haplótipos (em porcentagem) obtida pela distância p não corrigida. Haplótipos h1 a
h8 correspondem à unidade evolutiva 1 e haplótipos h9 a h13 à unidade evolutiva 2.
h1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h9 h10 h11 h12 h13 Cm
h1
h2
0,20%
h3
0,20% 0,30%
h4
1,10% 1,20% 1,20%
h5
1,20% 1,40% 1,40% 0,20%
h6
1,20% 1,40% 1,40% 0,20% 0,30%
h7
1,50% 1,70% 1,70% 0,50% 0,60% 0,30%
h8
1,90% 2,00% 2,00% 0,80% 0,90% 0,60% 0,90%
h9
11,10% 11,30% 11,00% 11,10% 11,00% 11,00% 11,30% 11,30%
h10
11,30% 11,50% 11,10% 11,30% 11,10% 11,10% 11,50% 11,50% 0,20%
h11
11,30% 11,50% 11,10% 11,30% 11,10% 11,10% 11,50% 11,50% 0,20% 0,30%
h12
11,30% 11,50% 11,10% 11,30% 11,10% 11,10% 11,50% 11,50% 0,20% 0,30% 0,30%
h13
11,00% 11,10% 10,80% 11,00% 10,80% 10,80% 11,10% 11,10% 0,50% 0,60% 0,60% 0,60%
Cm
19,50% 19,70% 19,30% 18,70% 18,90% 18,60% 18,60% 19,00% 18,00% 18,00% 18,10% 17,80% 18,10%
cm = Carnegiella marthae
27
3.4 Análises populacionais
3.4.1 Análises de polimorfismo de DNA
Para a unidade evolutiva 1 (Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã) a maior
diversidade haplotípica foi evidenciada na população de Tarumã (baixo rio Negro), e a
menor em Pixirituba (médio rio Negro). A diversidade nucleotídica e a média das
diferenças nucleotídicas par a par, seguiu este mesmo padrão.
Na unidade evolutiva 2 (Cajarizinho e Uatumã/Barretinho) a população de
Cajarizinho apresentou as maiores diversidade haplotípica, diversidade nucleotídica e
média de diferenças par a par.
Quando analiza-se os índices de polimorfismo de DNA totais, comparando as
duas unidades evolutivas, a segunda apresenta maiores valores de diversidade
nucleotídica, enquanto a unidade evolutiva 1 possui valores mais elevados para
diversidade nucleotídica e média das diferenças nucleotídicas par a par. Todos os
valores encontram-se na Tabela 4.
Tabela 4 – Resultados da análise de polimorfismo de DNA, entre os indivíduos de C.
strigata das cinco localidades. Onde: N=número de indivíduos; H=número de
haplótipos; HU=haplótipos únicos; S=sítios polimórficos; ETA=número de mutações;
HD=diversidade haplotípica; PI=diversidade nucleotídica; K=média das diferenças
nucleotídicas par a par.
Rios Localidades N H HU S ETA HD PI K
rio Negro
Urubaxi/Mauá 13 2 0 1 1 0,2821+/- 0,1417 0,0004 +/- 0,0005 0,2820 +/- 0,3215
Pixirituba 15 2 1 1 1 0,1333 +/- 0,1123 0,0002 +/- 0,0003 0,1333+/- 0,2098
Tarumã 15 4 1 4 4 0,6190 +/- 0,1196 0,0014 +/- 0,0011 0,9333+/- 0,6789
Cajarizinho 14 3 1 3 3 0,5906 +/- 0,1185 0,0010 +/- 0,0009 0,6900 +/- 0,5473
rio Uatumã Uatumã/Barretinho 10 1 0 0 0 0,0000 +/- 0,0000 0,0000 +/- 0,0000 0,0000 +/- 0,0000
Total Unidade Evolutiva 1 43 7 0 13 13 0,6224 +/- 0,0709 0,0058 +/- 0,0033 3,7497 +/- 1,9288
Total Unidade Evolutiva 2 24 5 0 6 6 0,6993 +/- 0,0599 0,0029 +/- 0,0019 1,9239 +/- 1,1331
28
3.4.2 Análise de Variância Molecular (AMOVA) e estrutura genética
Por meio da Análise de Variância Molecular verificou-se que 91,35% da variância
total foi observada entre as populações e 8,65% distribuídas dentro delas (Fst =
0,91345, P=0.01) para unidade evolutiva 1 (Tabela 5). Este mesmo padrão ocorre ao
analisar-se a unidade evolutiva 2, sendo que a variâcia total observada entre
populações foi de 88,38% enquanto 11,62% foi verificado dentro delas (Fst= 0,8377,
P=0.01) (Tabela 6).
Com relação a valores do índice de fixação (Fst), a unidade evolutiva 1
apresentou valores significativos apenas entre a população do baixo rio Negro (Tarumã)
com as do médio rio Negro (Urubaxi/Mauá e Pixirituba). O fluxo gênico estimado à partir
do número de migrantes por geração (Nm) foi elevado entre Urubaxi/Mauá e Pixirituba
(7,41864 migrantes por geração), enquanto entre estas populações e Tarumã o fluxo
gênico é extremamente restrito (Tabela 7).
Para unidade evolutiva 2 o Fst foi significativo entre Cajarizinho e
Uatumã/Barretinho, que também apresentaram número de migrantes extremamente
baixo (Tabela 8).
Tabela 5 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 1, entre e dentro dos grupos de
populações. Unidade evolutiva 1 corresponde a indivíduos das localidades
Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã. Fst : 0,91345.
Fonte da variância
Componentes
da variância
Porcentagem de variação
Entre populações 2,41664 91,35%
Dentro da população 0,22897 8,65%
Total 2,64562 100,00%
29
Tabela 6 – Valores da AMOVA para a unidade evolutiva 2, entre e dentro dos grupos de
populações. Unidade evolutiva 2 corresponde a indivíduos das localidades Cajarizinho e
Uatumã/Barretinho. Fst : 0,88377.
Fonte da variância
Componentes
da variância
Porcentagem de variação
Entre populações 1,50598 88,38%
Dentro da população 0,19805 11,62%
Total 1,70404 100,00%
Tabela 7 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número estimado de
migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações par a par.
Evidenciados na unidade evolutiva 1. ns= não significativo.
Urubaxi/Mauá Pixirituba Tarumã
Urubaxi/Mauá
0,06314
ns
0,91792
Pixirituba
7,41864 0,92982
Tarumã
0,04471 0,03774
Tabela 8 - Valores do índice de fixação (Fst) acima da diagonal e número estimado de
migrantes por geração (Nm) abaixo da diagonal, entre as populações par a par.
Evidenciados na unidade evolutiva 2.
Cajarizinho Uatumã/Barretinho
Cajarizinho
0,88377
Uatumã/Barretinho
0,06576
30
3.4.3 Teste de Mantel
A correlação entre distância geográfica (Tabela 9) e distância genética, obtida
pelo teste de Mantel, não foi significativa tanto para a unidade evolutiva 1
(Urubaxi/Mauá, Pixirituba e Tarumã) como para a unidade evolutiva 2
(Uatumã/Barretinho e Cajarizinho), indicando assim que a distância genética
encontrada entre as populações de cada unidade evolutiva não está relacionada com a
distância geográfica (Tabela 10).
Tabela 9 – Matriz de distância em quilômetros, considerando o leito do rio.
Urubaxi/Mauá Pixirituba Tarumã Cajarizinho Uatumã/Barretinho
Urubaxi/Mauá
0,00
Pixirituba
284,39 0,00
Tarumã
744,14 47,05 0,00
Cajarizinho
557,88 285,79 505,88 0,00
Uatumã/Barretinho
1349,06 1076,97 2701,08 1110,80 0,00
Tabela 10 – Valores obtidos no teste de Mantel.
Unidade Evolutiva 1 Unidade Evolutiva 2
r
0,8014 0,9916
p
0,3351
ns
0,3415
ns
r = coeficiente de correlação; ns = valores não significativos
31
3.4.4 Árvore de haplótipos
Para a construção do cladograma foi utilizado o princípio de máxima parcimônia,
de forma que os haplótipos tivessem probabilidade maior ou igual a 95% de se conectar
parcimoniosamente, obtendo-se assim duas sub-árvores, sendo estas correspondentes
às unidades evolutivas. Para que houvesse a conexão entre as sub-árvores foram
necessários 69 passos mutacionais (Figura 9).
32
h1
h2
h3
h8
h7
h5
h4
h6
h13
h10
h9
h11
h12
* 69
Figura 9 – Árvore de haplótipos evidenciando as conexões entre os 13 haplótipos
evidenciados em C. strigata. Os círculos pequenos significam haplótipos inferidos, mas
não detectados, *69 número de passos adicionais necessários para conectar as sub-
árvores. Os haplótipos estão distribuidos da seguinte forma: Unidade evolutiva 1:
h1=Urubaxi, Mauá e Pixirituba; h2=Urubaxi; h3=Pixirituba; h4 a h7=Tarumã, h8=Urubu;
e Unidade evolutiva 2: h9 a h12=Cajarizinho e h13=bacia do rio Uatumã.
33
4. Discussão
Aproximadamente 70% dos estudos genéticos utilizam o DNA mitocondrial como
ferramenta de análise (Avise, 2000) e os estudos realizados na Amazônia seguem este
mesmo padrão, sendo que a caracterização da estrutura genética e da história evolutiva
por meio de técnicas moleculares é uma importante informação na genética da
conservação. Porém, na bacia Amazônica os trabalhos sobre genética de peixes
ósseos e cartilaginosos ainda são escassos, mas estão em franca expansão podendo-
se destacar os trabalhos com: Mylesinus (Porto, 1999), Potamorrhaphis, Belonion,
Pseudotylosurus (Lovejoy & de Araújo, 2000), Prochilodus (Sivasundar et al., 2001;
Turner et al., 2004), Paracheirodon (Harris & Petry, 2001), Hypostomus (Montoya-
Burgos, 2003) Brachyplatystoma (Formiga-Aquino, 2004; Batista & Alves-Gomes,
2006), Arapaima (Hrbek et al., 2005), Hypopygus (Schmitt, 2005), Paratrygon
(Frederico, 2006), Cichla (Andrade et al., 2001, Renno et al., 2006), Symphysodon
(Ready et al., 2006) e Colossoma (Santos et al., 2007).
Os fragmentos de C. strigata seqüenciados neste trabalho iniciaram-se na
posição 8.064 de Chalceus macrolepidotus, de acordo com seqüência disponível no
GenBank, mais precisamente no 100º nucleotídeo da ATPase 8, o qual traduz para o
aminoácido treonina, e finalizaram-se na posição 8713, confirmando assim a homologia
dos fragmentos.
A composição nucleotídica das seqüências de ATPase 8/6 de C. strigata foi de
32,11%, 10,27%, 23,44% e 34,18% para adenina, guanina, citosina e timina,
respectivamente. De acordo com Meyer (1993), animais pecilotérmicos apresentam
menores quantidades de guanina e citosina que animais endotérmicos. Este fato
também pode ser verificado ao se analisar a composição nucleotídica da ATPase de
outros Characiformes, disponíveis no GenBank, como ocorre em Astyanax, o qual
apresenta 29,22% de adenina, 24,82% de citosina, 12,95% de guanina e 33,02% de
timina (Machordom & Doadrio, 2001b).
As 86 substituições nucleotídicas observadas nas seqüências de ATPase 8/6 de
C. strigata resultaram na presença de 55 aminoácidos variáveis, distribuídas nos 13
34
haplótipos (anexo 1). Deste total 13 foram sinônimas e as demais não sinônimas, sendo
que as diferenças entre os aminoácidos podem ser percebidas entre as populações
(anexo 2).
Um resultado semelhante foi encontrado por Cohen (2002) ao analisar
molecularmente o complexo de histocompatibilidade (MHc) de diferentes populações do
peixe Fundulus heteroclitus (Ciprinodontidae), provenientes de estuários de
Massachusetts (EUA), onde foi verificado que os aminoácidos eram habitat-específicos
e correspondiam a diferentes pressões ambientais.
De acordo com Yang & Bielawski (2000), a média das trocas dos aminoácidos
somente é maior que as mutações sinônimas quando estas oferecem uma vantagem
seletiva, sendo então fixadas nas populações. Provavelmente isto possa estar
ocorrendo com as populações de peixe-borboleta analisadas neste trabalho, uma vez
que as mutações não sinônimas prevaleceram.
Com base no fragmento da ATPase 8/6, as análises filogenéticas utilizando os
princípios metodológicos da máxima parcimônia (Figura 6) e da máxima
verossimilhança (Figura 7) indicam a existência de dois grupos monofiléticos para C.
strigata. O primeiro engloba as populações de Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã (todos
da bacia do rio Negro) e Urubu (bacia do Urubu), enquanto o segundo as populações
de Cajarizinho (bacia do rio Negro) e da bacia do Uatumã.
A variação entre as duas árvores (MP e MV) é dada pela mudança na posição
dos haplótipos h4, h5, h6, h7 e h8. Na árvore de máxima parcimônia todos estes
haplótipos formavam um grupo monofilético irmão dos haplótipos h1, h2 e h3. Porém,
na árvore de máxima verossimilhança este grupo não se manteve. Nesta árvore os
haplótipos h1, h2 e h3 formam um grupo monofilético irmão dos haplótipos h4 e h5, e
este um grupo irmão de h6, h7 e h8. Embora a topologia das árvores não seja
exatamente igual, isto não modifica a inferência principal de que existe uma segregação
genética entre os dois grandes grupos, corroborado por um alto valor de bootstrap e
também pela distância genética (Figura 8).
Porto (1999), utilizando a região controle do DNAmt de Mylesinus
paraschomburgkii dos rios Uatumã, Trombetas e Jarí, sugeriu que a segregação
35
genética dá-se em função da bacia de drenagem, sendo isto observado nas árvores de
máxima parcimônia e distância genética. Para C. strigata isto não foi observado, uma
vez que os indivíduos do Cajarizinho (bacia do rio Negro) são mais relacionados aos da
bacia do Uatumã. Da mesma forma, que os do rio Tarumã (bacia do rio Negro), são
mais próximos geneticamente dos exemplares do rio Urubu (bacia do rio Urubu), do que
de outros da mesma bacia a qual eles pertencem.
Um resultado similar ao encontrado para C. strigata foi evidenciado em
Potamorrhaphis, utilizando o Citocromo b como ferramenta (Lovejoy & de Araújo, 2000).
Esta espécie de peixe, que também apresenta pequeno porte e não é migradora,
apresentou maior similaridade entre diferentes bacias de drenagem (bacia do Orinoco e
bacia do rio Negro), que dentro delas. Os autores sugeriram que durante o final do
Mioceno poderia ter havido uma ligação entre as duas bacias, por meio de uma região
alagada que estaria próxima ao alto rio Branco.
A distância genética encontrada entre os haplótipos de C. strigata variou de 0,20
a 2,00% entre indivíduos das localidades de Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã e Urubu
(unidade evolutiva 1), e de 0,20 a 0,6% entre espécimes de Cajarizinho e Uatumã
(unidade evolutiva 2). Porém, a distância genética entre as duas unidades evolutivas
variou de 10,80 a 11,50%. Com relação ao grupo externo esta distância varia de 17,80
a 19,70%.
Sivasundar et al. (2001), analisando espécies de Prochilodus de diferentes
bacias de drenagem, entre elas bacia do rio Negro, Orinoco e Amazonas, por meio de
seqüências da ATPase 8/6, encontraram uma variação na distância genética p não
corrigida de 0 a 5% entre quatro diferentes espécies do gênero. Quando estes foram
comparados a um grupo externo (Semaprochilodus) esta variou de 12,5 a 16%.
Considerando estes dados e analisando as seqüências publicadas de ATPase 8/6 de
Characiformes, as quais estão disponíveis no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), a
distância genética p variou de 0 a 9,8% entre espécies e de 12 a 27% entre gêneros
(Bermingham & Martin, 1998; Sivasundar et al., 2001; Machordom & Doadrio, 2001a, b;
Reeves & Bermingham, 2006). Até o momento nenhum trabalho descreveu para
Characiformes uma distância genética tão elevada dentro da mesma espécie como a
36
encontrada em C. strigata. Os dados aqui encontrados sugerem a existência de dois
grupos distintos, corroborando as árvores filogenéticas obtidas, os quais devem no
mínimo ser considerados como duas unidades evolutivas, que devem ser mais bem
investigadas morfológica e sistematicamente para verificar se C. strigata seria um
complexo de espécies.
De acordo com Waples (1998), a análise da estrutura populacional das espécies
e a identificação de unidades evolutivas são extremamente importantes para a
identificação de unidades de conservação, prevenindo não apenas a extinção dos
organismos, mas também a perda irreversível do material genético.
Paralelamente ao padrão encontrado nas árvores filogenéticas, também foram
observadas na rede haplotípica duas sub-árvores correspondentes à unidade evolutiva
1 (populações das bacias do rio Negro, exceto Cajarizinho, e rio Urubu) e à unidade
evolutiva 2 (populações de Cajarizinho e da bacia do Uatumã). Para forçar a conexão
entre as sub-árvores foram necessários 69 passos mutacionais, tamanha a distância
genética entre elas.
Apesar do peixe-borboleta ser um peixe de pequeno porte e apresentar
características migratórias restritas, ou seja, migrações laterais e reprodutivas, esta
espécie apresentou uma estruturação populacional. Na unidade evolutiva 1 foram
evidenciados altos valores de Fst (Tabela 7) entre as populações do médio rio Negro
(Urubaxi/Mauá e Pixirituba) e a população do baixo rio Negro (Tarumã), enquanto na
unidade evolutiva 2 foram evidenciados altos valores de Fst (Tabela 8) entre a
população da bacia do rio Uatumã (Uatumã/Barretinho) e a população do médio rio
Negro (Cajarizinho).
Assunção (2006), ao utilizar marcadores microssatélites para estudar o cardinal
(Paracheirodon axelrodi) um peixe ornamental altamente explorado, não verificou uma
estruturação populacional, sendo que o rio Negro não foi uma barreira para a dispersão
deste peixe, que apresentou de 1 a 9 migrantes por geração. Além disso, foi
evidenciado um grande fluxo de migrantes entre igarapés de uma mesma margem,
provavelmente ocasionados durante a época da cheia quando estes extravasam e
conectam-se com igarapés vizinhos.
37
Analisando-se o número de migrantes dentro de cada unidade evolutiva de C.
strigata é possível constatar que, para a unidade evolutiva 1, o rio Negro em sua porção
média, não constituiu uma barreira ao fluxo gênico entre indivíduos de margens opostas
ou da mesma margem (Urubaxi/Mauá e Pixirituba), pois mesmo estando distantes entre
si em vários quilômetros (284 km) o número de migrantes é elevado (7,41864 migrantes
por geração). Segundo Frankham et al. (2002), localidades que apresentem valores de
número de migrantes superior a dois por geração podem ser consideradas como uma
mesma população. Porém o fluxo gênico entre populações do médio rio Negro com a
população do baixo rio Negro (Tarumã) é restrito (< 0,05 migrantes por geração). Na
unidade evolutiva 2 o rio Amazonas constituiu uma barreira ao fluxo gênico entre
populações distantes entre si em vários quilômetros (Uatumã/Barretinho e Cajarizinho)
visto o baixo número de migrantes entre as localidades.
A variância molecular evidênciada em C. strigata foi maior entre do que dentro
das populações amostradas (Tabela 5 e 6), para ambas unidades evolutivas, mostrando
novamente que, exceto as populações de Urubaxi/Mauá e Pixirituba (unidade evolutiva
1), C. strigata apresenta populações estruturadas do ponto de vista genético.
A correlação entre a distância genética e geográfica não foi significativa para
nenhuma das unidades evolutivas de C. strigata (Tabela 10). Dessa forma, a distância
geográfica parece não ser o fator potencial para explicar a distância genética
encontrada, não podendo assim ser rejeitada a hipótese nula.
Frederico (2006), estudando a ATPase 8/6 de Paratrygon aireba (raias de água
doce), dos rios Negro, Tapajós, Xingu, Araguaia e Tocantins, evidenciou uma
variabilidade genética entre 0,5 a 1%, observando também que não existe correlação
entre as distâncias genéticas e geográficas.
Outra espécie que apresentou ampla variabilidade na bacia do rio Negro foi
Hypopygus lepturus (Schmitt, 2005). Estes pequenos peixes elétricos foram coletados
em vários tributários entre São Gabriel da Cachoeira e Barcelos, tendo sido observado
que os haplótipos encontrados (utilizando a região controle do DNA mitocondrial) estão
agrupados em clados cujos indivíduos podem estar formando um complexo de
espécies, tamanha é a diferença encontrada entre eles (7% em média).
38
De acordo com Lundberg et al. (1998) a maioria da diversidade dos peixes de
água doce é produto de mudanças paleohidrológicas que promoveram a dispersão
seguida de divergência alopátrica, sendo proposto que as maiores alterações ocorreram
no final do Período Terciário e durante o Quaternário, hipóteses estas que ainda estão
sendo revistas. Estas mudanças também influenciaram de alguma forma a distribuição
de outros táxons, como insetos (Hall & Harvey, 2002), plantas (Pennington et al., 2004),
pássaros (Nores, 1999), anfíbios (Noonan & Wray, 2006), entre outros. Contudo, é
notório que a região Neotropical exibe um complexo padrão biogeográfico, não
associado apenas a estas alterações climáticas (Hubert & Renno, 2006).
Porém, sabendo-se que a bacia do rio Negro respondeu significativamente a
trocas ambientais por meio de alterações do seu leito e sentido de seu curso durante o
final do Pleistoceno e Holoceno, principalmente associados com as últimas glaciações e
eventos de neotectônica (Costa et al., 2001; Latrubesse & Franzinellli, 2005) e
verificando este intrigante padrão genético encontrado em C. strigata, ao se sobrepor a
árvore de máxima parcimônia ao mapa das localidades de coleta de C. strigata (Figura
10) uma questão vem à tona: Por que a população de Cajarizinho é mais próxima
geneticamente das populações da bacia do rio Uatumã, do que de populações
pertencentes à própria bacia do rio Negro?
39
Figura 10 – Imagem evidenciando os locais de coleta com sobreposição da árvore de
máxima parcimônia.
A relação que existe entre os haplótipos do rio Tarumã e do rio Urubu poderia ser
explicada pela maior proximidade geográfica, apesar de tratar-se de duas bacias
diferentes. Mas como explicar a relação mais próxima de Cajarizinho do rio Uatumã que
atualmente distam mais de 1000km? Existiu em algum momento uma conexão entre as
cabeceiras de tributários do rio Uatumã e as cabeceiras de tributários do rio Negro
abaixo do rio Branco?
Estudos recentes têm indicado que a paisagem Amazônica é composta por
blocos estruturais que apresentam uma segmentação orientada alternadamente nas
direções NW-SE e NE-SW, sendo estes blocos separados por extensos sistemas de
falhas. Estes blocos se moviam independentemente no passado e continuam se
ajustando lentamente, alterando feições da paisagem e curso de alguns rios da
Amazônia Central (Forsberg et al., 2000; Nogueira & Sarges, 2001; Costa et al., 2001;
Almeida-Filho et al., 2005).
40
A conexão entre a cabeceira do rio Uatumã e afluentes da margem esquerda do
rio Negro (abaixo do rio Branco), pode ter acontecido na região de depressão periférica
à noroeste da bacia do rio Uatumã (Figura 11), durante o final do terciário e no
quaternário, época que também ocorreu o surgimento das cachoeiras e corredeiras no
leito do rio Uatumã (Nogueira & Sarges, 2001; Müller & Carvalho, 2005; Ibanez, 2006;
Arnaldo Carneiro, comunicação pessoal 2007).
Além disso, Costa (2002) sugere que um sistema de falhas com direção NW-SE
foi responsável pelo alinhamento dos rios Negro, Preto da Eva e Urubu, bem como pelo
deslocamento do leito de outros rios ao longo do rio Amazonas, o que reforça as
evidências da instabilidade tectônica desta região.
Figura 11 – Imagem orbital (radar SRTM) mostrando a região da cabeceira do rio
Uatumã e do rio Apuaú, afluente do rio Negro. Em evidência a região onde poderia ter
ocorrido o contato da bacia do rio Uatumã com a bacia do rio Negro. Fonte SigLab-
INPA, com modificações.
Uma alternativa para comprovar tal hipótese seria analisar indivíduos de C.
strigata da região abaixo do rio Branco ao rio Tarumã, para verificar se os indivíduos
41
provenientes desta região realmente seriam mais próximos geneticamente aos do
Uatumã e do Cajarizinho.
Outra hipótese possível é que C. strigata constitua um complexo de espécies.
Géry (1973), analisando a morfologia externa evidenciou duas formas para C. strigata,
tendo como característica marcante o padrão de bandas: C. strigata tipo strigata (tipo S)
e C. strigata tipo fasciata (tipo F). A distribuição geográfica do tipo S seria na Guiana,
Suriname e algumas localidades da calha amazônica. Enquanto a do tipo F estaria
dominando a bacia Amazônica, de Iquitos (Peru) a Belém (Brasil) incluindo ainda o rio
Caquetá (Colômbia). Segundo o autor, as duas formas seriam simpátricas entre
Manacapuru e o rio Urubu. Adicionalmente no rio Negro e rio Orinoco, haveria um tipo
morfológico intermediário que o autor chamou de tipo SF.
Observando-se o padrão de bandas nos indivíduos analisados no presente
trabalho (Figura 2), pode-se perceber que os indivíduos da unidade evolutiva 2 seriam
mais relacionados com o tipo morfológico S (localidades de Cajarizinho e bacia do rio
Uatumã), enquanto os unidade evolutiva 1 com a forma intermediária SF (localidades
de Pixirituba, Mauá, Urubaxi, Tarumã e rio Urubu). Dessa forma é necessário obter
seqüências do tipo morfológico F bem como realizar uma revisão taxonômica em C.
strigata para comprovar se o número de espécies está subestimado. Vale destacar que
Weitzman & Palmer 2003 colocaram em sinônimia todas as espécies e subspécies em
uma única espécie válida, C. strigata.
Visto que duas unidades evolutivas foram evidenciadas no presente trabalho e
apesar de não ter sido utilizado relógio molecular nas inferências, a separação das duas
grandes unidades evolutivas pode ter ocorrido em torno de 5 milhões de anos (final do
Terciário), enquanto que a separação de Carnegiella marthae (grupo externo) e
Carnegiella strigata provavelmente ocorreu em torno de 9 milhões de anos,
considerando-se que a taxa de evolução do gene mitocondrial da ATPase é descrita na
literatura como sendo de, em média, 2% por milhão de anos (Machordom & Doadrio,
2001b).
Assim sendo, políticas de conservação e manejo para Carnegiella strigata não
devem considerá-la como sendo um único estoque pesqueiro. Este dado é
42
extremamente importante, ainda mais porque esta espécie é amplamente explorada
como peixe ornamental no rio Negro, o principal centro exportador de peixes
ornamentais do Brasil. Se um único plano de manejo for proposto para a espécie,
certamente implicará na perda de diversidade genética, mesmo que a extinção da
espécie esteja sendo evitada.
43
5. Conclusão
Os resultados obtidos para C. strigata, por meio da análise do gene da ATPase
8/6, permitiu chegar as seguintes conclusões:
1) Duas unidade evolutivas foram evidenciadas, uma composta pelas localidades de
Urubaxi, Mauá, Pixirituba, Tarumã e Urubu, e a outra por Cajarizinho, Uatumã e
Barretinho.
2) Houve uma correspondência entre as unidades evolutivas e o padrão morfológico
descrito por Géry (1973), sendo que a unidade evolutiva 1 é composta por indivíduos da
forma intermediária e a unidade evolutiva 2 por indivíduos da forma strigata.
4) A distância genética evidenciada entre as duas unidades evolutivas de C. strigata foi
elevada quando comparada com outras espécies de Characiformes, podendo
corresponder a espécies distintas.
5) Detectou-se uma estruturação populacional, com baixos índices de fluxo gênico entre
as localidades, exceto entre Urubaxi/Mauá e Pixirituba (bacia do rio Negro).
6) O rio Negro não constitui uma barreira para as populações de sua porção média na
unidade evolutiva 1 e o rio Amazonas atua como barreira ao fluxo gênico entre as
populações da unidade evolutiva 2.
7) Na unidade evolutiva 1 maior diversidade genética foi encontrada na população de
Tarumã baixo rio Negro e na unidade evolutiva 2 Cajarizinho apresentou os maiores
indíces de diversidade.
8) C. strigata não pode ser tratada para fins de manejo como um único estoque, nem
mesmo na bacia do rio Negro, tendo em vista o elevado grau de diferença entre as
unidades evolutivas.
44
6. Referências bibliográficas
Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. 2002. Molecular
Biology of the Cell Garland Science, 4ª ed. 1463p.
Almeida-Filho, R.; Miranda, F. P.; Beisl, C. H. 2005. Evidência de uma mega captura
fluvial no rio Negro (Amazônia) revelada em modelo de elevação digital da SRTM.
Anais XII Simpósio Brasileiro de Sensoriamento Remoto: 1701-1707.
Alves-Gomes, J. A.; Orti, G.; Haygood, M.; Heiligenberg, W.; Meyer, A. 1995.
Phylogenetics analysis of the South American eletric fishes (order Gymnotiformes)
and the evolution of their electrogenic system: a synthesis based on morphology,
electrophysiology, and mitochondrial sequence data. Molecular Biology Evolution 12
(2): 298-318.
Andrade, F.; Schneider, H.; Farias, I.; Feldberg, E.; Sampaio, I. 2001. Análise
filogenética de duas espécies simpátricas de tucunaré (Cichla, Perciformes), com
registro de hibridização em diferentes pontos da bacia Amazônica. Revista Virtual de
Iniciação Acadêmica da UFPA 1:1-11.
Anjos, H. D. B.; Siqueira, J. A.; Amorim, R. M. S. . Comércio de peixes ornamentais do
Estado do Amazonas, Brasil. Boletim Sociedade Brasileira de Ictiologia, no prelo.
Asahida, T.; Kobayashi, T.; Saitoh, K.; Nakayama, I. 1996. Tissue preservation and total
DNA extraction from fish stored at ambient temperature using buffers containing high
concentration of urea. Fisheries Science 62(5):727-730.
Assunção, A. A. A. 2006. Estudo da variabilidade genética do cardinal (Ostariophysi,
Characiformes) na bacia do rio Negro. Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas.
82pp.
Avise, J. C. 1994. Molecular markers, natural history and evolution. Chapman & Hall,
New York. 511pp.
Avise, J. C. 2000. Phylogeography: The history and formation of species. Harvard
University Press, London. 447pp.
Ballard, J. W. O.; Whitlock, M. C. 2004. The incomplete natural history of mitochondria.
45
Molecular Ecology 13: 729-744.
Batista, J. S.; Alves-Gomes, J. A. 2006. Phylogeography of Brachyplatystoma
rousseauxii (Siluriformes – Pimelodidae) in the Amazon Basin offers preliminary
evidence for the first case of “homing” for an Amazonian migratory catfish. Genetics
and Molecular Research 5 (4): 723-740.
Bermingham, E.; Martin, A. P. 1998. Comparative mtDNA phylogeography of neotropical
freshwater fishes: testing shared history to infer the evolutionary landscape of lower
Central America. Molecular Ecology 7: 499-517.
Boore, J. L. 1999. Animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Reseach 27 (8): 1767-
1780.
Chao, N. L. 1998. A draft list of brazilian freshwater fishes for the hobby a proposal to
IBAMA. Ornamental Fish International Journal Issue 23: 6-14.
Chao, N. L. 2001. The fishery, diversity and conservation of ornamental fishes in the
Rio Negro Basin, Brazil – A Review of Project Piaba (1989-1999). In: Chao, N. L.;
Petry, P.; Prang, G.; Sonneschien, L. e Tlusty, M. (Eds). Conservation and
Management of ornamental fish Resources of the rio Negro Basin. Amazonia, Brazil
– Project Piaba. Editora da Universidade do Amazonas, Manaus, Amazonas. p.
161-204.
Clement, M.; Posada, D.; Crandall, K. A. 2000. TCS: a computer program to estimate
gene genealogies. Molecular Ecology 10:1657-1660.
Cohen, S. 2002. Strong Positive Selection and Habitat-Specific Amino Acid Substitution
Patterns in Mhc from an Estuarine Fish Under Intense Pollution Stress. Molecular
Biology Evolution 19 (11):1870–1880.
Costa, A. R. A. 2002. Tectônica Cenozóica e movimentação salífera da Bacia do
Amazonas e suas relações com a geodinâmica das placas da América do Sul,
Caribe, Cocos e Nazca. Dissertação de Mestrado em Geologia e Geoquímica Centro
de Geociências Universidade Federal do Pará, Belém. 238pp.
Costa, J. B. S.; Bemerguy, R. L.; Hasui, Y.; Borges, M. S. 2001. Tectonics and
paleogeography along Amazon river. Journal of South American Earth Sciences
14:335-347.
46
Estoup, A.; Presa, P.; Krieg, F.; Vaiman, D.; Guyomard, R. 1993. (CT)n and (GT)n
microsatellites: a new class of genetic markers for Salmo trutta L. (brown trout).
Heredity 71:488-496.
Excoffier, L.; Smouse, P.; Quattro, J. 1992. Analysis of molecular variance inferred from
metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA
restriction data. Genetics 131: 479-491.
Farias, I. P.; Orti, G.; Sampaio, I.; Schneider, H.; Meyer, A. 1999. Mitochondrial DNA
phylogeny of the family Ciclhidae: monophyly and fast molecular evolution of the
Neotropical assemblage. Journal of Molecular Evolution 48:709-711.
Frankham, R.; Ballou, J. D.; Briscoe, D. A. 2002. Introduction to Conservation Genetics,
Cambridge University Press. 617pp.
Felsenstein, J. F. 1981. Evolutionary tree from DNA sequences: a maximum likelihood
approach. Journal of Molecular Evolution 17: 368-376.
Formiga-Aquino, K. 2004. Filogeografia da piramutaba (Brachyplatystoma vaillantii) na
Bacia Amazônica. Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 80pp.
Forsberg, B. R.; Hashimoto,Y.; Rosenquist, A.; Miranda, F. P. 2000. Tectonic fault
control of wetland distributions in the Central Amazon revealed by JERS-1 radar
imagery Quaternary International 72:61 – 66.
Frederico, R. G. 2006. Filogeografia de Paratrygon aiereba Müller & Henle, 1841
(Chondrichthyes: Potamotrygonidae) na região Amazônica. Dissertação de Mestrado.
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do Amazonas.
Manaus, Amazonas. 64pp.
Géry, J. 1973. Sur la nomenclature et les types de livrée de Carnegiella strigata
(Günther). Aquarama 7 (21): 16-19.
Géry, J. 1977. Characoids of the World. T. F. H. Publications, Inc., New Jersey, U.S.A.
672 pp.
Goulding, M.; Carvalho, M. L.; Ferreira, E. G. 1988. Rio Negro Rich life in poor water
SPB Academic Publishing bv, Netherlands. 200pp.
Hall, T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
47
analysis program for Windows 95/96/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41:95-98.
Hall, J. P. W.; Harvey D. J. 2002. The phylogeography of amazonia revisited: new
evidence from riodinid butterflies. Evolution 56(7):1489–1497.
Harris, P.; Petry, H. 2001. Preliminary report on the genetic population structure and
phylogeography of cardinal tetra (Paracheirodon axelrodi) in the rio Negro basin. In:
Chao, N. L.; Petry, P.; Prang, G.; Sonneschien, L. e Tlusty, M. (Eds). Conservation
and Management of ornamental fish Resources of the rio Negro Basin. Amazonia,
Brazil – Project Piaba. Editora da Universidade do Amazonas, Manaus, Amazonas. p.
205-225.
Hennig, W. 1966. Phylogenetic systematics. University of Illinois Press Urbana. 263pp.
Hughes, J. M.; Hillyer, M. J. 2006. Mitochondrial DNA and allozymes reveal high
dispersalabilities and historical movement across drainage boundaries in two species
of freshwater fishes from inland rivers in Queensland, Australia. Journal of Fish
Biology 68, 270–291.
Hubert, N.; Renno, J. F. 2006. Historical biogeography of South American freshwater
fishes. Journal of Biogeography 33, 1414 – 1436.
Hrbek, T.; Farias, I. P.; Crossa, M.; Sampaio, I.; Porto, J. I. R.; Meyer, A. 2005.
Population genetic analysis of Arapaima gigas, one of the largest freshwater fishes of
the Amazon basin: implications for this conservation. Animal Conservation 8: 297-
308.
Ibanez, D. M. 2006. Integração de dados de sensoriamento remoto (srtm e Radarsat-1),
geologia, gravimetria e magnetometria para estudo morfoestrutural da área do rio
Uatumã, bacia do Amazonas. Dissertação de Mestrado em Sensoriamento Remoto.
Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais. São José dos Campos. 158pp.
Junk, W. 1983. As águas da região amazônica. In: Salati, E.; Junk, W.; Schubart, H. O.
R.; Oliveira, A. E.; (Eds) Amazônia: desenvolvimento, integração e ecologia. Editora
Brasiliense, CNPq. 328 pp.
Latrubesse, E. M.; Franzinelli, E. 2005. The late Quaternary evolution of the Negro
River, Amazon, Brazil: Implications for island and floodplain formation in large
anabranching tropical systems. Geomorphology 70:372– 397.
48
Li, W. H.; Graur, D. 1991. Fundamentals of Molecular Evolution. Sinauer Associates.
Sunderland, Massachusetts.
Lovejoy, N. R.; de Araújo, M. L. G. 2000. Molecular systematics, biogeography and
population structure of neotropical freshwater needlefishes of the genus
Potamorrhaphis. Molecular Ecology 9: 259-268.
Lovette, I. J.; Bermingham, E.; Seutin, G.; Ricklets, R. E. 1998. Evolutionary
differentiation in three endemic West Indian warblers. The Auk 115: 890–903.
Lundberg, J. G.; Marshall, L. G.; Guerrero, J.; Horton, B.; Malabarba, M. C. S. L.;
Wesselingh, F. 1998. The stage of neotropical fish diversification: A history of tropical
south America rivers. In: Malabarba, L.R., Reis, R.E., Vari, R.P., Lucena, Z.M.,
Lucena, C.A. (Eds). Phylogeny and Classification of Neotropical Fishes. EDIPUCRS,
Porto Alegre. p.13 – 48.
Machordom, A.; Doadrio, I. 2001a. Evolutionary history and speciation modes in the
cyprinid genus Barbus. Proceeding Royal Society of London 268 (1473): 1297-1306.
Machordom, A.; Doadrio, I. 2001b. Evidence of a Cenozoic Betic–Kabilian connection
based on freshwater fish phylogeography (Luciobarbus, Cyprinidae). Molecular
Phylogenetics and Evolution 18(2):252–263.
Martin, A. P.; Bermingham, E. 2000. Regional endemism and cryptic species revealead
by molecular and morphological analysis of a widespread species of neotropical
catfish. Proceedings of Royal Society of London 267:1135-1141.
Meyer, A. 1993. Evolution of mitochondrial DNA in fishes. Biochemistry and Molecular
Biology of Fishes, 2: 1–38.
Montoya-Burgos, J. I. 2003. Historical biogeography of the catfish genus Hypostomus
(Siluriformes: Loricariidae), with implications on the diversification of Neotropical
ichtyofauna. Molecular Ecology 12:1855-1867.
Müller, A. J.; Carvalho, A. S. 2005. Uso de produtos CERBS para o zoneamento
geoambiental de Presidente Figueiredo no Amazonas. Anais XII Simpósio Brasileiro
de Sensoriamento Remoto. 9pp.
Nei, M. 1987. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York,
NY, USA. 512 pp.
49
Nelson, J. 1994. Fishes of the world. 3nd Edition. A Wiley – Intersciense Publications,
Jonh Wiley & Sons, Inc. New York, NY, U.S.A. 600 pp.
Nogueira, A. C. R.; Sarges, R. R. 2001. Characterization and genesis of waterfalls of the
Presidente Figueiredo region, northeast State of Amazon, Brazil. Academia Brasileira
de Ciências 73(2):287-301.
Noonan, B. P.; Wray, K. P. 2006. Neotropical diversification: the effects of a complex
history on diversity within the poison frog genus Dendrobates. Journal of
Biogeography 33:1007–1020.
Nores, M. 1999. An alternative hypothesis for the origin of Amazonian bird diversity.
Journal of Biogeography 26:475–485.
Pennington, R. T.; Lavin, M.; Prado, D. E.; Pendry, C. A.; Pell, S. K.; Butterworth, C. A.
2004. Historical climate change and speciation: neotropical seasonally dry forest
plants show patterns of both Tertiary and Quaternary diversification. The Royal
Society London 359, 515–537.
Perdices, A.; Bermingham, E.; Montilla, A.; Doadrio, I. 2002. Evolutionary history of the
genus Rhamdia (Teleostei: Pimelodidae) in Central America. Molecular Phylogenetics
and Evolution 25: 172–189.
Porto, J. I. P.; Alves-Gomes, J. A.; Farias, I. P.; Feldberg, E. 2001. Using molecular
biology techniques to characterize the diversity of amazonian ornamental fishes. In:
Chao, N. L.; Petry, P.; Prang, G.; Sonneschien, L. e Tlusty, M. (Eds). Conservation
and Management of ornamental fish Resources of the rio Negro Basin. Amazonia,
Brazil – Project Piaba. Editora da Universidade do Amazonas, Manaus, Amazonas. p.
227-244.
Porto, J. I. R. 1999. Análises cariotípicas e sequenciamento de mtDNA de populações
de “Mylesinus paraschomburgkii” (Characiformes, Serrasalmidae) da bacia
Amazônica. Tese de Doutorado. Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 120 pp.
Posada, D.; Crandall, K. A. 1998. MODELTEST: testing the model of DNA substitution.
Bioinformatics 14: 817-818.
Ready, J. S.; Ferreira, E. J. G.; Kullander S. O. 2006. Discus fishes: mitochondrial DNA
50
evidence for a phylogeographic barrier in the Amazonian genus Symphysodon
(Teleostei: Cichlidae). Journal of Fish Biology 69:200–211.
Reeves, R. G.; Bermingham, E. 2006. Colonization, population expansion, and lineage
turnover: phylogeography of Mesoamerican characiform fish. Biological Journal of the
Linnean Society 88: 235–255.
Renno, J. F.; Hubert, N.; Torrico, J. P.; Duponchelle, F.; Nunez Rodriguez, J.; Garcia
Davila, C.; Willis, S. C.; Desmarais, E. 2006. Phylogeography of Cichla (Cichlidae) in
the upper Madera basin (Bolivian Amazon). Molecular Phylogenetics and Evolution
41:503-510.
Rozas, J.; Sánchez-DelBarrio, J. C.; Messeguer, X.; Rozas, R. 2003. DnaSP, DNA
polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics
19:2496-2497.
Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.; Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, K.
B.; Erlich, H. A. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491.
Saitoh, K.; Miya, M.; Inoue, J. G.; Ishiguro, N. B.; Nishida, M. 2003. Mitochondrial
genomics of ostariophysan fishes: perspectives on phylogeny and biogeography.
Journal of Molecular Evolution 56 (4): 464-472.
Saitou, M.; Nei, M. 1987. The Neighbor-joining Method: A New Method for
Reconstructing Phylogenetic Trees. Molecular Biology and Evolution 4 (4): 406-425.
Sambrook, J.; Russell, D. W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual. Vol. I. Cold
Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. NY.
Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, A. R. 1977. DNA Sequencing with chain terminating
inhibitors. Proceedings of National Academy of Science 74: 5463-5467.
Santos, M. C. F.; Ruffino, M. L.; Farias, I. P. 2007. High levels of genetic variability and
panmixia of the tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1816) in the main
channel of the Amazon River. Journal of Fish Biology 71: 33–44.
Santos, S. M. 2005. Relações tróficas entre “Carnegiella marthae” Myers, 1927, “C.
strigata” (Günther, 1864) e “Gnathocharax steindachneri” Fowler, 1913
(Ostheichthyes: Characiformes) em igarapés próximo ao lago Amanã – Amazonas –
51
Brasil. Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 52 pp.
Santos, G. M.; Ferreira, E. J. G. 1999. Peixes da Bacia Amazônica. In: Lowe-McConnel,
R.H.(Ed.). Estudos ecológicos de comunidades de peixes tropicais. EDUSP, São
Paulo, Brasil. p. 345-373.
Schmitt, R. 2005. Filogeografia de “Hypopygus lepturus” Hoedeman, 1962
(Gymnotiformes: Rhamphycthyidae) ao longo do médio rio Negro, Amazônia.
Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Universidade
Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 156pp.
Schneider, S.; Roessli, D.; Excoffier, L. 2006. Arlequin Version 3.1: a software for
population genetic data analysis. Obtido de: http:// anthropologie. Unige.ch/arlequin.
Sioli, H. 1990. Amazônia: fundamentos da ecologia da maior região de florestas
tropicais. Editora Vozes, Petrópolis, Brasil. 73 pp.
Sivasundar, A.; Bermingham, E.; Ortí, G. 2001. Population structure and biogeography
of migratory freshwater fishes (Prochilodus: Characiformes) in major South American
rivers. Molecular Ecology 10: 407-417.
Swofford, D. L. 1999. PAUP: Phylogenetics analysis using parsimony, version 4.0.
Sinauer Associates, Sunderland.
Terencio, M. L.; Schneider, C. H.; Gross, M. C.; Silva, A. M.; Feldberg,
,
E.; Porto, JIR.
Cytogenetics of two species in the genus Carnegiella (Characiformes,
Gasteropelecidae): considerations on the presence of sex chromosomes in the
genus. Genetics and Molecular Biology, no prelo.
Thompson, J. D.; Higging, D. G.; Gibson, T. J. 1994. ClustalW : Improving the sensitivity
of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position
specific gap penalties and matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673-4680.
Turner, T. F.; McPhee, M. V.; Campbell, P.; Winemiller, K. O. 2004. Phylogeography
and intraspecific genetic variation of prochilodontid fishes endemic to rivers of
northern South America. Journal of Fish Biology 64: 186-201.
Waples, R. S. 1998. Evolutionary significant units, distinct population segments, and
endangered species act: reply to Pennock and Dimmick. Conservation Biology 12(3):
52
718-721.
Weitzman, S. H. 1954. The osteoology and the relationship of the South American
characid fishes of the the subfamily Gasteropelecidae. Standord Ichthiological Bulletin
4(4): 213-263.
Weitzman, S. H. 1960. Further notes on the relationships and classification of the South
American characid fishes of the subfamily Gasteropelecinae. Stanford Ichthyological
Bulletin 7: 217-239.
Weitzman, S. H.; Palmer, L. 1996. Do Freshwater hatchetfishes really fly? Tropical Fish
Hobbyist 45 (1): 195-206.
Weitzman, S. H.; Palmer, L. 2003. Family Gasteropelecidae In: Reis, R. E.; Kullander, S.
O.; Ferraris Jr, C. J. (Eds). Check list of the freshwater fishes of south and central
America. Editora da Pontifícia Universidade Católica, Porto Alegre, Brasil. p.101-103.
Wiest, F. C. 1995. The specialized locomotory apparatus of the freshwater hatchetfish
family Gasteropelecidae. Journal Zoology 236: 571-592.
Yang, Z.; Bielawski, J. P. 2000. Statistical methods for detecting molecular adaptation.
Tree 15 (12):496-504.
Zardoya, R.; Meyer, A. 1996. Phylogenetic performance of mitochondrial protein-coding
genes in resolving relationships among vertebrates. Molecular Biology and Evolution
13(7):933-942.
53
7. Anexos
Anexo 1
Sítios variáveis nas seqüências da ATPase 8/6 de Carnegiella strigata
1111111111111111122222222222233333333333333333444444444455555555555
1111222333440023334445567888912455566778800012223445577899012344678912333345669
80269018456161923470692578689581212769561403670692474918035105237768428035602036
#H1 GCCTATCGTCCTCCTACTCTCCTTTGAGGTACTAAAACACTTCACAAATTGCTCTATAACATGTCGCTCTCAATGTCTAT
#H2 .........................................................................A......
#H3 A.TCTCAACTTCTT..TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.T.TGG.ACTC..
#H4 A.TCTCAACTTCTTC.TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.T.TGG.ACTC..
#H5 A.TCTCAACTTCTT..TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.T.TGG.ACTCG.
#H6 A.TCTCAACTTCTT..TCTA.TCCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCGCT.ATCTCTAT.T.TGG.ACTC..
#H7 .................................................................A..............
#H8 ....................T.............................A....G..G.G...T..............C
#H9 ....................T.............................A....G..G.G...T..............C
#H10 ....................T..........T..................A....G..G.G...T..............C
#H11 ...............T....T............C................A....G..G.G...T..............C
#H12 A.TCTCAACTTCTT..TCTA..CCCAGAACGTC.GTGT.ACATGTCCCCCATCTCG.T.ATCTCTAT.TCTGG.ACTC..
#H13 .T..................T.................G...........A..T.G..G.G...T..C...........C
66666
02233
30902
#H1 TTTCG
#H2 .....
#H3 CCCTA
#H4 CCCTA
#H5 CCCTA
#H6 CCCTA
#H7 .....
#H8 .....
#H9 ....A
#H10 .....
#H11 ....A
#H12 .CCTA
#H13 ....A
54
Anexo 2
Aminoácidos variáveis nas seqüências da ATPase 8/6 de Carnegiella strigata
111111111111111111111111111222222222
3334444467778888889001112222244444455667788999011223444
6790357970890234593674792357802348937050519268412012034
#H1 SLSIESIPTFLSLSSFLVVNSLQDEPYLLDYLMRPPVFQELICSLSLECLDLLLC
#H2 ................................................S......
#H3 ..........................................Y............
#H4 .............F...................Q....RG...........P...
#H5 .............F......L............Q....RG...........P...
#H6 .............F...................Q....RG...........P..Y
#H7 .............F........P..........Q....RG...........P..Y
#H8 .F...........F............C......Q.L..RG....S......P..Y
#H9 N.PSKLTSI.SFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.L.GYP..PPY
#H10 N.PSKLTSI.SFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.L.GYPG.PPY
#H11 N.PSKLTSILSFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.L.GYP..PPY
#H12 N.PSKLTSI.SFH.FSPAMSLP.VGL.PHASPTQLLAS.VPTYF.L.GYP..PPY
#H13 N.PSKLTSI.SFH..SPAMSLP.VGL.PHASPTQLLA..VPTYF.LSGYP..PPY
55
Anexo 3
Seqüências do gene da ATPase 8/6 de 69 indivíduos de Carnegiella strigata
1111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs1U ---------------------------------------------------------------------------------------------------A
#Cs2U ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs3U ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs4U ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs5U ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6U ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs9U ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs1M ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6M ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs8M ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs10M ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs17M ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs23M ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs1Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs3Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs4Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs5Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs7Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs8Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs9Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs10Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs11Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs12Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs13Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs14Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs17Caj ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs4Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs5Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs7Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs15Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs16Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs17Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
56
1111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs22Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs25Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs23Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs26Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs27Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs34Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs35Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs7225Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs7240Pi ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs1T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs2T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs3T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs4T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs7T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs9T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6957T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6959T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6960T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6963T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6964T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6965T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6966T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6967T ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs2Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs3Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs4Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs7Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs8Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6502Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6503Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6504Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs6505Bar ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs1Uru ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Cs2Uru ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#ge ---------------------------------------------------------------------------------------------------.
#Chalceus ATGCCCCAATTAAATCCCGCCCCATGATTTGCCATCCTAGTATTTTCTTGACTAATCTTCCTGACAATCGTCCCATCCAAAGTACTTAAACATACTTTT.
57
ATPase 8
ATPase 6
1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111112
0000000001111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs1U CTAACAGCCTCTCTTCTATCAAAACCGAAAAATCCACAATTACCCCTTGAAACTGACCATGGCACTAAATTTTTTTGACCAATTTATATCCCCCACATAC
#Cs2U ....................................................................................................
#Cs3U ....................................................................................................
#Cs4U ....................................................................................................
#Cs5U ....................................................................................................
#Cs6U ....................................................................................................
#Cs9U ....................................................................................................
#Cs1M ....................................................................................................
#Cs6M ....................................................................................................
#Cs8M ....................................................................................................
#Cs10M ....................................................................................................
#Cs17M ....................................................................................................
#Cs23M ....................................................................................................
#Cs1Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs3Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs4Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs5Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs6Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs7Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs8Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs9Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs10Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs11Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs12Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs13Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs14Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs17Caj ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs4Pi ....................................................................................................
#Cs5Pi ....................................................................................................
#Cs7Pi ....................................................................................................
#Cs15Pi ....................................................................................................
#Cs16Pi ....................................................................................................
#Cs17Pi ....................................................................................................
#Cs22Pi ....................................................................................................
58
1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111112
0000000001111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs25Pi ....................................................................................................
#Cs23Pi ....................................................................................................
#Cs26Pi ....................................................................................................
#Cs27Pi ....................................................................................................
#Cs34Pi ....................................................................................................
#Cs35Pi ....................................................................................................
#Cs7225Pi ....................................................................................................
#Cs7240Pi ....................................................................................................
#Cs1T ....................................................................................................
#Cs2T ....................................................................................................
#Cs3T ....................................................................................................
#Cs4T ....................................................................................................
#Cs6T ....................................................................................................
#Cs7T ....................................................................................................
#Cs9T ....................................................................................................
#Cs6957T ....................................................................................................
#Cs6959T ....................................................................................................
#Cs6960T ....................................................................................................
#Cs6963T ....................................................................................................
#Cs6964T ....................................................................................................
#Cs6965T ....................................................................................................
#Cs6966T ....................................................................................................
#Cs6967T ....................................................................................................
#Cs2Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs3Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs4Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs6Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs7Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs8Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs6502Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs6503Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs6504Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs6505Bar ......A...T...C..TCA......A.....CTT....C....T......................................................T
#Cs1Uru ........T...........................................................................................
#Cs2Uru ........T...........................................................................................
#ge ....T.AT.C...CA.CT.A.....TA.......T.T..C........................T....C...........G...........T.T..TT
#Chalceus A...TGAA.C.A.AA.CC...GCGTA......C.T.A..C.GAA..C..............A......GC..C..............GAG.........T
59
2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222223
0000000001111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs1U TTAGGTGTTCCATTAATTATAATCGCCTTAACTTTCCCTTGAATCTTCTTTCCTTCTCCATCAAGTCGATGACTAAGTAATCGAATGGTTACATTACAAA
#Cs2U ....................................................................................................
#Cs3U ....................................................................................................
#Cs4U ....................................................................................................
#Cs5U ....................................................................................................
#Cs6U ....................................................................................................
#Cs9U ....................................................................................................
#Cs1M ....................................................................................................
#Cs6M ....................................................................................................
#Cs8M ....................................................................................................
#Cs10M ....................................................................................................
#Cs17M ....................................................................................................
#Cs23M ....................................................................................................
#Cs1Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs3Caj .......C.......................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs4Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs5Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs6Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs7Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs8Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs9Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs10Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs11Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs12Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs13Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs14Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs17Caj ...............................TC..T..A........T..C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs4Pi ....................................................................................................
#Cs5Pi ....................................................................................................
#Cs7Pi ....................................................................................................
#Cs15Pi ....................................................................................................
#Cs16Pi ....................................................................................................
#Cs17Pi ....................................................................................................
#Cs22Pi ....................................................................................................
#Cs25Pi ....................................................................................................
#Cs23Pi ....................................................................................................
#Cs26Pi ....................................................................................................
#Cs27Pi ....................................................................................................
60
2222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222222223
0000000001111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs34Pi ....................................................................................................
#Cs35Pi ....................................................................................................
#Cs7225Pi ....................................................................................................
#Cs7240Pi ....................................................................................................
#Cs1T ............................................T.......................................................
#Cs2T ............................................T.......................................................
#Cs3T ............................................T.......................................................
#Cs4T ............................................T.......................................................
#Cs6T ............................................T.......................................................
#Cs7T ............................................T.......................................................
#Cs9T ............................................T.......................................................
#Cs6957T ............................................T.......................................................
#Cs6959T ....................T.......................T.......................................................
#Cs6960T ............................................T.......................................................
#Cs6963T ............................................T.......................................................
#Cs6964T ............................................T.......................................................
#Cs6965T ............................................T.......................................................
#Cs6966T ............................................T.......................................................
#Cs6967T ............................................T.......................................................
#Cs2Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs3Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs4Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs6Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs7Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs8Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs6502Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs6503Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs6504Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs6505Bar ...............................TC..T..A...........C..C...........C..........A.......G.AA.....C......
#Cs1Uru ............................................T.......................................................
#Cs2Uru ............................................T.......................................................
#ge ......A.C.........T.T..T......GT...T........TC.T.A...C..C..T....A.......T...A..........AC....C.G....
#Chalceus C....CA.....C.....GCC.....TC.G..AC.T..A.....TC.A.AC..A..C.......AC........T.A......GC.TA....CC.T...G
61
3333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333334
0000000001111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs1U ACTGATTTATTGGACAATTCACACGTCAACTTCTTCAACCTCTTAATACAAATGGACACAAATGAGCCCTTATACTAACTTCTTTAATAATTTTTCTTCT
#Cs2U ....................................................................................................
#Cs3U ....................................................................................................
#Cs4U ....................................................................................................
#Cs5U ....................................................................................................
#Cs6U ....................................................................................................
#Cs9U ....................................................................................................
#Cs1M ....................................................................................................
#Cs6M ....................................................................................................
#Cs8M ....................................................................................................
#Cs10M ....................................................................................................
#Cs17M ....................................................................................................
#Cs23M ....................................................................................................
#Cs1Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs3Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs4Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs5Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs6Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs7Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs8Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs9Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs10Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs11Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs12Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs13Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs14Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs17Caj ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs4Pi ....................................................................................................
#Cs5Pi ....................................................................................................
#Cs7Pi ....................................................................................................
#Cs15Pi ....................................................................................................
#Cs16Pi ....................................................................................................
#Cs17Pi ....................................................................................................
#Cs22Pi ....................................................................................................
#Cs25Pi ....................................................................................................
#Cs23Pi ....................................................................................................
#Cs26Pi ....................................................................................................
#Cs27Pi ....................................................................................................
62
3333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333334
0000000001111111111222222222233333333334444444444555555555566666666667777777777888888888899999999990
1234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890123456789012345678901234567890
#Cs34Pi ....................................................................................................
#Cs35Pi ....................................................................................................
#Cs7225Pi ....................................................................................................
#Cs7240Pi ....................................................................................................
#Cs1T ....................................................................................................
#Cs2T ....................................................................................................
#Cs3T ....................................................................................................
#Cs4T ....................................................................................................
#Cs6T ....................................................................................................
#Cs7T ....................................................................................................
#Cs9T ...................T................................................................................
#Cs6957T ....................................................................................................
#Cs6959T .................................................C..................................................
#Cs6960T ....................................................................................................
#Cs6963T ...................T................................................................................
#Cs6964T ....................................................................................................
#Cs6965T ....................................................................................................
#Cs6966T ....................................................................................................
#Cs6967T ....................................................................................................
#Cs2Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs3Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs4Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs6Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs7Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs8Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs6502Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs6503Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs6504Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs6505Bar ................G..T....................C.........G....T........G..T......A....C..A...............T.
#Cs1Uru .........................................................................G..........................
#Cs2Uru .........................................................................G..........................
#ge G.........G..C......G...................C....GCCT.G.A..C..T........TT.A...T.C..C.........G.....T.AT.
#Chalceus G..........AAT.G......C.AA.....G..C.TT..C.....CC.CGCC..C..T........A..A......G.A...C.......C..C..A..
63
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