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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQÜICULTURA DA UNESP
CAMPUS DE JABOTICABAL
FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE OVÓCITOS DE CURIMBATÁ,
Prochilodus lineatus
BRUNO ESTEVÃO DE SOUZA
Engenheiro de Pesca
Jaboticabal
São Paulo – Brasil
2007
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CENTRO DE AQÜICULTURA DA UNESP
CAMPUS DE JABOTICABAL
FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE OVÓCITOS DE CURIMBATÁ,
Prochilodus lineatus
Bruno Estevão de Souza
Orientadora: Prof
a
. Dra. Elizabeth Romagosa
Co-orientador: Prof. MSc. Robie Allan Bombardelli
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Aqüicultura, do Centro de
Aqüicultura da UNESP, Campus de Jaboticabal,
como parte das exigências para obtenção de
Mestre em Aqüicultura.
Jaboticabal
São Paulo – Brasil
2007
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Souza, Bruno Estevão de
S729f Fertilização artificial de ovócitos de curimbatá, Prochilodus
lineatus / Bruno Estevão de Souza. – – Jaboticabal, 2007
xiii, 63 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Centro
de Aqüicultura, 2007
Orientadora: Elizabeth Romagosa
Banca examinadora: Newton Castagnolli, Antônio Fernando
Gervásio Leonardo
Bibliografia
1. Dosagem inseminante. 2. Sêmen. 3. Ativação. 4. Motilidade. I.
Título. II. Jaboticabal – Centro de Aqüicultura.
CDU 639.3.03
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e
Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
- UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
Dedico este trabalho:
Aos meus pais, José e Neusa.
A meus irmãos, Carlos e Gisele.
Aos meus sobrinhos, Gabriela, Gabriel e Rafael.
Aos meus queridos avos que já partiram, Jordão e Maria, Jozias e Rosa.
A minha amiga e namorada, Rejane.
v
Agradecimentos:
A Deus pela força permanente e eterno amor.
A toda a minha família que me apoiou e incentivou nessa caminhada, em especial:
Aos meus pais: José e Neusa pelos ensinamentos tão preciosos, apoio e amor incondicional
(Amo vocês ...).
A família Anschau pela compreensão e carinho ... me receberem como um filho em sua casa:
Paulo, Marli, Sandra, Claudia e Andréia.
A minha irmã e sobrinha: Gisele e Gabriela por sempre estarem do meu lado e me
receberem tão bem em Sampa enquanto escrevia a dissertação, momentos memoráveis!
Ao meu irmão: Carlos, tia Ro e aos meus sobrinhos: Gabriel e Rafael, pelo carinho, amizade
e força.
A meu tio Ari e tia Neide sempre tão amáveis; aos meus primos: Rodrigo, Adriam, Marcelo,
Marcos e Fernando os quais considero como irmãos.
Ao Mááááááário ... pela amizade e carinho!
A todos meus amigos de São Paulo, Paraná e da Pró-Vida.
Ao Dr. Celso Charuri pelos eternos ensinamentos.
A minha amiga e namorada: Rejane pelo Amor incondicional, carinho e compreensão!
vi
A minha Orientadora Elizabeth Romagosa pela oportunidade, por todos ensinamentos, pela
atenção, carinho, compreensão e amizade adquirida durante a pós-graduação.
Ao meu Co-orientador Robie Allan Bombardelli pela oportunidade, confiança, por todos
ensinamentos, compreensão e amizade.
Aos meus amigos que ajudaram na realização do experimento, sem os quais não seria
possível a realização: Elizabeth Romagosa, Robie A. Bombardelli, Eduardo A. Sanches,
Diego M. Baggio e Pitágoras A. Piana (Foram muitas madrugadas em claro!).
.
Aos professores que participaram da banca do exame geral de qualificação, Teresa Cristina
Ribeiro Dias Koberstein e Alexandre Ninhaus Silveira contribuindo para o aprimoramento
enriquecimento do trabalho.
Aos professores que participaram da “banca final” (Comissão Examinadora), Newton
Castagnolli e Antônio Fernando Gervásio Leonardo contribuindo para o aprimoramento
enriquecimento do trabalho.
Aos professores(as) da pós-graduação que contribuíram direta ou indiretamente com a
minha formação.
Aos colegas da pós-graduação, em especial:
Alexandre, Bruno, Camila, Camilo, Charles, Daniela, Erico, Gabriela, Fabiana, Jaqueline,
Marcelo, Márcia, Maria do Carmo, Marianne, Matheus, Mauricio, Nilson, Paracá, Róberson
e tantos outros.
Aos amigos que fiz durante essa caminhada, em especial:
César, Débora, Djalma, João Paulo, Louise, Marcello, Munir, Luiz Ayroza e Casaca.
Aos professores da UNIOESTE ( pesquisadores do GEMAq) pelo contato com a professora
Elizabeth sem o qual não seria possível tê-la conhecido: Aldi Feiden, Adilson Reidel e
Wilson Rogério Boscolo.
Ao Centro de Aqüicultura da Unesp – CAUNESP, diretoria, professores e funcionários
sempre tão atenciosos e prestativos.
vii
Ao CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pela concessão
da Bolsa de Estudos.
Ao diretor do Centro de Pesquisa em Aqüicultura Ambiental - CPAA/IAP, senhor Eléxio
Vidal por ceder a estrutura física para realização deste trabalho.
A todos funcionários e estagiários do CPAA/IAP, que me receberam tão bem e ajudaram nos
seis meses de trabalho no centro de pesquisa.
A Universidade Estadual do Oeste do Paraná – UNIOESTE por ceder a estrutura física para
realização deste trabalho.
Agradeço a todos que encontrei nessa caminhada, mesmo que não tenha mencionado, e de
alguns nem recordo os nomes, rostos ou atos ...Todos os encontros proporcionaram uma
mudança em minha Vida ...
MUITO OBRIGADO A TODOS!
viii
ÍNDICE
LISTA DE
FIGURAS.................................................................................................................................ix
x
LISTA DE TABELAS.............................................................................................................xi
INTRODUÇÃO GERAL.........................................................................................................1
REVISÃO DA LITERATURA ...............................................................................................3
1.0 CARACTERÍSTICAS DA ESPÉCIE...........................................................................3
2.0 REPRODUÇÃO ARTIFICIAL......................................................................................5
3.0 QUALIDADE DOS GAMETAS....................................................................................7
4.0 DOSE INSEMINANTE .................................................................................................9
5.0 VOLUME DE ÁGUA EMPREGADA NA ATIVAÇÃO DOS
ESPERMATOZÓIDES........................................................................................................9
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................11
OBJETIVOS...........................................................................................................................11
OBJETIVO GERAL ...........................................................................................................20
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...........................................................................................20
ARTIGO I .................................................................................................................................1
MOTILIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN DO CURIMBATÁ, Prochilodus lineatus:
EFEITO DO VOLUME E TEMPERATURA DA SOLUÇÃO ATIVADORA..................1
RESUMO ..............................................................................................................................1
ABSTRACT...........................................................................................................................2
INTRODUÇÃO.....................................................................................................................3
MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................................5
RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................7
CONCLUSÕES.......................................................................................................12
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................13
ARTIGO II................................................................................................................................1
INTERAÇÃO ENTRE O NUMERO DE ESPERMATOZÓIDE.OVÓCITO
-1
E O
VOLUME DE ÁGUA EMPREGADOS NA FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE
OVÓCITOS DE CURIMBATÁ, Prochilodus lineatus .........................................................1
RESUMO ..............................................................................................................................1
ABSTRACT...........................................................................................................................2
INTRODUÇÃO.....................................................................................................................3
MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................4
RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................7
CONCLUSÕES..................................................................................................................11
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................12
ix
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DA LITERATURA
Figura 1. Reprodutor de curimbatá, Prochilodus lineatus utilizado no
experimento.................................................................................................................5
ARTIGO I: MOTILIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN DO CURIMBATÁ,
Prochilodus lineatus: EFEITO DO VOLUME E TEMPERATURA DA SOLUÇÃO
ATIVADORA
Figura 1. Duração da motilidade espermática do curimbatá, Prochilodus lineatus
utilizando-se diferentes relações de volume de sêmen:volume de água para a
ativação dos espermatozóides....................................................................................9
Figura 2. Duração da motilidade espermática dos espermatozóides de curimbatá,
Prochilodus lineatus, ativados utilizando-se água em diferentes temperatura..........10
Figura 3. Vista aérea do Centro de Pesquisas em Aqüicultura Ambiental -
CPAA/IAP – Toledo/PR. Fonte: Google Earth (2007)...............................................17
Figura 4. Laboratório e tanques do CPAA/IAP........................................................ 17
Figura 5. Tanques das matrizes...............................................................................17
Figura 6. Reprodutor de curimbatá, Prochilodus lineatus utilizado no
experimento...............................................................................................................17
Figura 7. Seleção dos reprodutores de curimbatá, Prochilodus lineatus..................17
Figura 8. Laboratório de reprodução........................................................................18
Figura 9. Caixas onde foram acondicionadas as matrizes.......................................18
Figura 10. Coleta de sêmen com auxilio de seringa descartável.............................18
Figura 11. Sêmen (5µL) e água (200µL) utilizados para aferir a motilidade
espermática...............................................................................................................18
Figura 12. Homogeneização do sêmen e água (ativação dos espermatozóides)....18
Figura 13. Coleta do sêmen e água homogeneizados para leitura em microscópio
sob lâmina de vidro....................................................................................................18
x
ARTIGO II: INTERAÇÃO ENTRE O NUMERO DE
ESPERMATOZÓIDE.OVÓCITO
-1
E O VOLUME DE ÁGUA EMPREGADOS NA
FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE OVÓCITOS DE CURIMBATÁ, Prochilodus
lineatus
Figura 1. Projeção tridimensional do modelo de superfície de resposta ajustado
para prever a taxa de fertilização do curimbatá em função do volume de água e do
número de espermatozóides (transformação logarítmica) utilizadas na reprodução
artificial.........................................................................................................................9
Figura 2. Vista aérea do Centro de Pesquisas em Aqüicultura Ambiental -
CPAA/IAP – Toledo/PR. Fonte: Google Earth (2007)...............................................17
Figura 3. Laboratório e tanques do CPAA/IAP.........................................................17
Figura 4. Tanques das matrizes...............................................................................17
Figura 5. Reprodutor de curimbatá, Prochilodus lineatus utilizado no
experimento...............................................................................................................17
Figura 6. Seleção dos reprodutores de curimbatá, Prochilodus lineatus..................17
Figura 7. Laboratório de reprodução........................................................................18
Figura 8. Caixas onde foram acondicionadas as matrizes.......................................18
Figura 9. Coleta de sêmen com auxilio de seringa descartável...............................18
Figura 10. Coleta dos ovócitos em placa de petri.....................................................18
Figura 11. Os ovócitos com suas respectivas doses inseminantes antes da
fertilização..................................................................................................................18
Figura 12. Incubadoras experimentais utilizadas para os ensaios de fertilização....18
xi
LISTA DE TABELAS
ARTIGO I: MOTILIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN DO CURIMBATÁ,
Prochilodus lineatus: EFEITO DO VOLUME E TEMPERATURA DA SOLUÇÃO
ATIVADORA
Tabela 1. Produção seminal e características seminais do “pool” de sêmen
proveniente de 12 machos de curimbatá, Prochilodus lineatus..................................8
Tabela 2. Valores médios de duração da motilidade espermática do “pool” de sêmen
de 12 machos de Prochilodus lineatus submetido a diferentes relações de diluição
durante o processo de ativação...................................................................................9
ARTIGO II: INTERAÇÃO ENTRE O NUMERO DE
ESPERMATOZÓIDE.OVÓCITO
-1
E O VOLUME DE ÁGUA EMPREGADOS NA
FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE OVÓCITOS DE CURIMBATÁ, Prochilodus
lineatus
Tabela 1. Valores médios das características reprodutivas do “pool” realizado com o
sêmen de 30 machos de curimbatá, Prochilodus lineatus..........................................7
1
INTRODUÇÃO GERAL
O curimbatá Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836) encontra-se
distribuído geograficamente na Bacia do Prata e do rio Paraíba do Sul (Castro,
1990). A espécie é reofílica e apresenta importância econômica e social para a
pesca artesanal, de subsistência e esportiva, além de apresentar carne saborosa
(Barbieri et al., 2004).
A piscicultura está estreitamente relacionada com a capacidade de
perpetuação das espécies, produzindo larvas para criação, repovoamento e a
formação de plantéis de reprodutores (Godinho et al., 1984; Antoniutti et al., 1995).
Os primeiros trabalhos em reprodução no Brasil se iniciaram em 1929, quando
Rodolpho Von Ihering e seus colaboradores, coletaram hipófises de rã e induziram
machos à espermiação com dosagens crescentes e sucessivas em intervalos de
seis horas. Posteriormente, apareceram outros estudos de reprodução de peixes no
Nordeste do Brasil (Castagnolli, 1992).
A técnica tradicional de inseminação artificial em peixes ainda é usada em
fazendas, consistindo simplesmente, em homogeneizar os espermatozóides e
ovócitos em um meio externo (água doce ou salgada, ou outras soluções
ativadoras) (Marques, 2001). Entretanto, a eficiência desta técnica é limitada,
particularmente, no que se refere às taxas de fertilização e, a economia de gametas,
pois, o esperma de um único macho pode fertilizar 1 a 5 fêmeas (Bart e Dunham,
1996; Chereguini et al., 1999; Marques, 2001; Shimoda et al., 2007).
Para a utilização racional de machos de curimbatá, quando mantidos em
ambiente confinados e, destinados a reprodução induzida, torna-se importante o
conhecimento da capacidade de produção do material fecundante desses indivíduos
durante o período reprodutivo (Kavamoto et al., 1997), bem como, sua capacidade
de fertilização.
A reprodução artificial com sêmen fresco ou congelado revela possibilidades
de limitar o estoque de machos na piscicultura intensiva, propiciando uma
exploração mais racional de reprodutores geneticamente selecionados e uma
redução nos custos de produção (Fogli da Silveira et al., 1988).
2
Thoth et al. (1997) e Lahnsteiner (2000) ressaltaram a importância de se
conhecer as características morfológicas e funcionais dos espermatozóides para
melhorar a produção de qualquer espécie de peixe em cativeiro.
Nos últimos anos, os estudos direcionados para o criação e preservação de
algumas espécies nativas do Brasil têm sido muito relevantes, não só por sua
importância econômica, como também ambiental. Por isso que se faz necessário à
ampliação de conhecimentos básicos que resultem na obtenção de sucesso nos
processos de reprodução e crescimento quando mantidos em cativeiro e ainda, o
desenvolvimento de técnicas de conservação (Mojica, 2004).
Assim, o presente trabalho tem como objetivo conhecer melhor os processos
envolvidos na fertilização artificial do curimbatá, Prochilodus lineatus com intuito de
aumentar as taxas de fertilização artificial e otimizar o uso de gametas e seus
reprodutores.
3
REVISÃO DA LITERATURA
1.0 CARACTERÍSTICAS DA ESPÉCIE
Entre as espécies de peixes de água doce destacam-se as da família
PROCHILODONTIDAE, composta por exemplares de porte médio a grande (27-
44cm), que estão entre as mais importantes na pesca continental, tanto comercial
como de subsistência, nos rios sul-americanos, com exceção do Chile onde não há
representantes (Castro, 1991; Lizama, 2000).
No Brasil ocorrem várias espécies do gênero Prochilodus, que são
amplamente distribuídas pelas bacias hidrográficas, sendo o curimbatá Prochilodus
lineatus (Figura 1) a espécie mais comum na região sudeste, onde comumente é
conhecida como curimba ou curimbatá. A taxonomia desta família foi revista por
Castro (1990), que constatou que o nome Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881) é
sinônimo de Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836).
Prochilodus lineatus é classificado com base em sua aceitação para
consumo, no valor de comércio e na demanda de mercado, como peixe de segunda
ou terceira categoria por pescadores artesanais (Castro e Begossi, 1995) e, é a
terceira espécie comercial mais capturada nos rios do Estado de São Paulo (Santos
et al., 1995) é a segunda espécie mais importante da pesca profissional no
reservatório de Itaipu/Paraná (FUEM-ITAIPU Binacional, 1987).
O curimbatá apresenta corpo moderadamente alto e comprimido, com a
maior altura na origem da nadadeira dorsal. A boca é terminal, com lábios carnosos
equipados com duas séries de pequenos e numerosos destes falciformes ou
espatulares, formando um disco oral quando protraídos (Nakatani et al., 2001).
A espécie quando adulta pode medir cerca de 46,0cm de comprimento total
(Castro, 1990). É um peixe detritívoro, tanto na fase jovem como na adulta
(Companhia Energética de Minas Gerais e Fundação Centro Tecnológico de Minas
Gerais, 2000) e, sua habilidade de explorar esta fonte de alimento confere grande
importância a este grupo devido à sua atuação na ciclagem de nutrientes oriundos
de materiais em decomposição (Ituassú et al, 2005). Segundo Castagnolli (1992) o
4
curimbatá alimenta-se basicamente de detritos orgânicos, fauna bentônica e, aceita
bem ração.
Atenção especial tem-se dado à piscicultura continental, principalmente, nas
regiões sudeste e sul do país, pois, as populações das melhores espécies de peixes
estão em acentuado declínio resultante das modificações ecológicas provocadas
pelo crescimento demográfico, construção de barragens hidrelétricas, destruição
das lagoas marginais, desenvolvimento industrial e intensa sobrepesca, provocando
a queda da produtividade e a inadequação do ambiente, principalmente, das
espécies migradoras (Godinho et al., 1984; Barbieri et al, 2004).
Pelas características alimentares e reprodutivas (Rosa Júnior e Schubart,
1945; Godoy 1959; 1967; 1972; Romagosa et al., 1985 a,b) e de crescimento do
curimbatá, em condições de confinamento, (Cestarolli et al., 1981; Verani, 1987;
Narahara et al., 1990; Ayroza et al., 1992) esta espécie vem despertando grande
interesse para a piscicultura extensiva e semi-intensiva. Mais recentemente, vem
sendo utilizado também, em sistema intensivo (tanques-rede), onde tem papel de
peixe sanitário, promovendo a limpeza de algas, bactérias e matéria orgânica
depositadas nas malhas do tanque (Zaniboni Filho, 1997).
Alguns parâmetros reprodutivos do curimbatá em condições naturais foram
estudados, destacando-se aqueles relativos às migrações reprodutivas
ascendentes, isto é, em direção às cabeceiras dos rios na primavera, portanto,
como espécie reofílica, percorre grande distância no período da maturação gonadal
(Godoy, 1959; 1967; 1972), a fecundidade (Rosa Júnior e Schubart, 1945) e ao tipo
de desova (Romagosa et al., 1985), entre outros. Esta espécie atinge a primeira
maturação gonadal com cerca de 19,7cm de comprimento, cujo período reprodutivo
estende-se de novembro a fevereiro. A desova é do tipo total, sazonal, a
fecundação é externa e não cuidam da prole (Vazzoler, 1996).
Estas migrações com fins reprodutivos estão sincronizadas com flutuações
do nível da água. Tais migrações são disparadas pelo acréscimo da precipitação
pluviométrica e aumento da temperatura e nível das águas, ocasião em que os
machos produzem sons característicos que, provavelmente servem como fator de
agrupamento (Kavamoto et al., 1996; Lowe-McConnell, 1999).
Os ovos são pelágicos e podem apresentar diâmetro médio de 3,92mm, a
diferenciação do embrião inicia-se cerca de 08 horas após a fertilização. A eclosão
das larvas ocorre 16 horas após a fertilização, à temperatura de 25,9ºC, medindo
5
cerca de 3,50mm, a absorção completa do saco vitelino ocorre com cerca de
8,93mm de comprimento total (Nakatani et al., 2001). A temperatura ideal para o
curimbatá garantir o processo reprodutivo encontra-se entre os limites 22 e 28°C
(Godoy, 1975).
A reprodução natural do curimbatá não ocorre em condições de cativeiro,
torna-se necessária à utilização de técnicas de indução hormonal (Fenerich-Verani
et al., 1984; Godinho et al., 1984 e Borsato da Silva, 2000).
Figura 1. Reprodutor de curimbatá (Prochilodus lineatus) utilizado no experimento.
2.0 REPRODUÇÃO ARTIFICIAL
Os primeiros trabalhos visando à reprodução artificial de peixes reofílicos
foram realizadas no Brasil, na década de 30, por Rodolpho von Ihering e seus
colaboradores. Este processo consiste, basicamente, na extração de hormônios
gonadotrópicos da glândula pituitária de peixes doadores e, em seguida, injetados
no músculo de peixes sexualmente maduros, para induzir à ovulação e a desova em
condições artificiais (Castagnolli e Cyrino, 1980). Durante as décadas de 50 e 60, os
trabalhos nesta área restringiram-se às estações do DNOCS - Departamento
Nacional de Obras Contra as Secas (Cyrino et al., 2004).
A reprodução dos peixes é um processo complexo controlado pelo eixo
hipotálamo–hipófise–gônadas (Romagosa, 1991; 1998 e Streit Jr., 2002). Para que
ocorra o processo final da maturação gonadal e a liberação dos gametas há
6
necessidade de realizar a “hipofisação”, uma das técnicas mais utilizadas na
indução hormonal, método que consiste na aplicação do extrato de hipófise
(geralmente de carpas). Para tal, as fêmeas devem apresentar o ventre volumoso,
abaulado e macio e os machos liberarem pequenas quantias de sêmen sobre leve
pressão abdominal (Cyrino et al., 2004).
A reprodução artificial, envolve a intervenção humana no processo de
propagação natural proporcionando vantagens, tais como: aumento da taxa de
fertilização e da eclosão, sobrevivência das larvas, melhores condições de
crescimento e, principalmente, a garantia de não extinção das espécies de peixes
(Cyrino et al., 2004).
Em fêmeas, quando não são induzidas à reprodução, os ovários entram em
processo de degeneração ou atresia folicular (Romagosa, 1991; Romagosa,1998).
Segundo os autores, este processo implica na involução e se caracteriza por uma
série de alterações morfológicas. Romagosa et al. (1985) caracterizaram as
diferentes fases do processo de atresia ovocitária em P. scrofa, provenientes de
ambiente natural e em cativeiro. Estes autores procuraram identificar as mudanças
que ocorrem durante a absorção dos folículos pós-ovulatórios em fêmeas que foram
induzidas por tratamento hormonal.
Em relação aos machos de peixes, estudos da biologia do sêmen
começaram no século XIX. Desde então as características deste foram rapidamente
identificadas, como: imobilidade do espermatozóide em meio hipertônico, duração
do movimento após sua ativação, composição do plasma seminal, a necessidade de
diluição em água para a iniciação do movimento do espermatozóide e, capacidade
para fertilizar (Billard e Cosson, 1992; Rana, 1995).
Para o sucesso tanto técnico, quanto econômico, na aqüicultura ou em
qualquer empreendimento agropecuário, é necessário que a seleção dos
reprodutores “matrizes” seja realizada com gametas de alta qualidade. Todavia,
pouca atenção é dada em relação a esta seleção, principalmente em relação aos
machos (Rurangwa et al., 2004). De acordo com Mojica (2004), o estudo do sêmen
pela determinação do volume coletado, motilidade e concentração de
espermatozóides, pode servir de base para a diluição do material fecundante e,
mede a capacidade de produção do sêmen, de cada reprodutor.
7
3.0 QUALIDADE DOS GAMETAS
A avaliação das características seminais é importante na rotina da
reprodução artificial em qualquer espécie animal (Fogli da Silveira et al., 1988).
A qualidade do sêmen pode ser avaliada em diferentes níveis de
complexidade: espermatócrito, viabilidade espermática, porcentagem de motilidade
espermática, intensidade da motilidade espermática, ultraestrutura dos
espermatozóides, composição química do plasma ou pela capacidade de fertilização
que possuem os espermatozóides (Rurangwa, et al., 2001).
A concentração espermática é uma das medidas quantitativas mais
importantes utilizadas em pesquisas e, a rotina de avaliação do sêmen (fertilização
externa ou interna), permite maximizar o aproveitamento do material fecundante e,
melhorar os resultados referentes às taxas de fertilização e a eclosão das larvas
(Fogli da Silveira et al., 1987).
Os peixes produzem quantidade variável de gametas. Em algumas espécies,
o macho produz 100 bilhões de espermatozóides/ano/kg do peso corporal ou mais
de 1 x 10
9
espermatozóides/g de testículo/dia, o que é 10 vezes maior do que a
produção relatada para mamíferos (Billard, 1990).
Um dos métodos utilizados para a realização das análises de qualidade
espermática é o teste de sobrevivência espermática, que apresenta relação direta
com a motilidade. Este índice é determinado a partir do emprego de soluções de
corantes como à nigrosina e eosina. Neste método, quando o sêmen entra em
contato com o corante, cora em vermelho os espermatozóides mortos, pois, são
permeáveis a eosina, enquanto que, as células vivas permanecem brancas
(Kavamoto e Fogli da Silveira, 1986).
A quantidade de espermatozóides obtida nos testículos é superior à parcela
coletada por massagem abdominal (Kavamoto et al., 1987). A injeção de hormônios
indutores leva a um aumento do volume de sêmen liberado alterando
conseqüentemente a concentração espermática. Isto deve explicar o aspecto mais
fluido do sêmen nos peixes injetados (Kavamoto et al., 1989).
Outro indicador da qualidade do sêmen é a sua coloração, que pode indicar
maior ou menor quantidade de fluído seminal, influenciando diretamente na
concentração de espermatozóides (Andrade-Talmelli et al., 2001).
8
Os espermatozóides de peixes são imóveis e inativos enquanto permanecem
na luz testicular. A motilidade ocorre somente após a espermiação em um meio
aquoso ou, em espécies com fertilização interna, dentro do trato reprodutivo
feminino, sugerindo que a motilidade é inibida por fatores químicos específicos dos
testículos ou do fluído seminal (Morisawa, 1985).
A motilidade é avaliada observando-se a movimentação dos
espermatozóides. Logo após, sua ativação com água ou em solução ativadora
(Marques, 2001). Para determinar a taxa de movimentação é atribuído um valor
para a quantia de espermatozóides em movimento, sendo 0 para nenhum
espermatozóides móvel, um para 25% móvel, dois para 50% móvel, três para 75%
móvel e quatro acima de 75% móvel (Viveiros et al., 2003)
Os fatores mais importantes na determinação da ativação espermática são:
pressão osmótica, composição iônica e o pH, sendo que mudanças na pressão
osmóticas é o fator que mais influência a ativação dos espermatozóides (Billard et
al., 1995).
Além disso, o mecanismo da motilidade pode estar relacionado com a
quantidade de ATP intracelular e, a finalização da motilidade espermática pode
estar associada com a diminuição deste ATP (Billard et al., 1993), apesar de que
este não se exaure totalmente (Billard e Cosson, 1992).
Determinar a qualidade dos ovócitos bem como as características que
determinem sua capacidade de obter sucesso na fertilização tem se mostrado um
problema significativo para os produtores, para as espécies já cultivadas e, para as
novas espécies a serem introduzidas (Bromage et al., 1992).
Muito pouco é conhecido sobre o que determina a qualidade dos ovócitos,
por outro lado, muitos fatores tem sido implicados como possíveis agentes
causadores, como: qualidade da água, condições de cultivo, dieta e seleção dos
reprodutores, métodos de reprodução, estresse, manipulação dos ovócitos
(Bromage, 1995).
Apesar das análises anteriormente descritas indicarem a qualidade dos
gametas, a mensuração das taxas de fertilização são mais determinantes, no
sentido de incrementar a produção por reprodutor e conseqüentemente, elevar a
produtividade por área, tornando-se necessária a realização de testes de fertilização
para o conhecimento da potencialidade dos gametas (Kavamoto et al., 1987).
9
4.0 DOSE INSEMINANTE
A técnica tradicional de inseminação artificial em peixes ainda é usada em
fazendas, consistindo simplesmente, em homogeneizar os espermatozóides e
ovócitos juntos em um meio externo (água doce ou salgada, ou outras soluções
ativadoras) (Marques, 2001). Entretanto, a eficiência desta técnica é limitada,
particularmente no que se refere às taxas de fertilização e a economia de gametas,
pois o esperma de um único macho pode fertilizar 1 a 5 fêmeas (Bart e Dunham,
1996; Chereguini et al., 1999; Marques, 2001; Shimoda et al., 2007).
Fogli da Silveira et al., (1988) e Morshbacher, (2004) enfatizaram a grande
importância dos estudos que utilizam um número mínimo de espermatozóides para
fertilizar o máximo de ovócitos. O conhecimento da correta relação espermatozóide:
ovócito tem sido investigado devido a sua importância principalmente em relação
aos programas de criopreservação (Denniston et al., 2000).
A reprodução artificial com sêmen fresco ou congelado também revela
possibilidades de limitar o estoque de machos na piscicultura intensiva, propiciando
uma exploração mais racional dos reprodutores geneticamente selecionadas e, uma
redução nos custos de produção (Fogli da Silveira et al., 1988; Suquet et al., 1995;
Lahnsteiner et al., 2003).
Além da redução dos custos e a economia de gametas, o conhecimento da
dosagem inseminante determina a quantidade exata do sêmen para evitar menores
percentuais de fertilização (Shimoda et al., 2007).
5.0 VOLUME DE ÁGUA EMPREGADA NA ATIVAÇÃO DOS ESPERMATOZÓIDES
A diluição do sêmen e o número de ovócitos que podem ser fertilizados com
um determinado volume de sêmen tem sido objeto de investigação. Trabalhos
utilizando água como meio de diluição, a exemplo de Erdahl e Graham (1987)
obtiveram poucos resultados na fertilização devido ao curto tempo de duração da
motilidade celular dos espermatozóides na água.
Soluções salinas também têm sido, extensivamente testadas como diferentes
meios de diluição e geralmente, mostram resultados favoráveis, mas o tempo limite
10
da motilidade da célula espermática restringe-se à eficácia das soluções salinas
(Erdahl e Graham, 1987).
Outro fator importante é o volume de solução ativadora a ser adicionada,
pois, a inclusão de volumes elevados desta solução pode causar a diluição do
sêmen diminuindo a possibilidade dos espermatozóides encontrarem a micrópila no
momento da fertilização. Da mesma forma, a inclusão de volumes de solução
ativadora insuficiente, reduz o sucesso na fertilização artificial, pois pode causar a
obstrução da micrópila pelo muco ovariano ou até mesmo pelo contato entre
ovócitos, além de prejudicar a ativação dos espermatozóides (Woynarovich e
Horváth, 1983; Ninhaus-Silveira et al., 2000; Shimoda et al., 2007; Zaniboni-Filho e
Weingartner, 2007).
A duração da motilidade espermática e a distância percorrida pelos
espermatozóides após a ativação são curtas e variam para cada espécie (Billard,
1992).
Segundo Baldisserotto e Gomes (2005) a quantidade recomendada de água
para a ativação dos espermatozóides do P. lineatus é de 10 a 20% do volume de
ovos. Os mesmos autores sugerem para o Salminus brasiliensis aproximadamente
1g de óvulos para cada 1 mL de água. A água utilizada no processo de fertilização
poderá ser a mesma utilizada nas incubadoras. A utilização de um grande volume
de água recomendado pelos autores mostra a necessidade de estudos mais
refinados que determinem o volume ideal de água para a fertilização de ovócitos de
diferentes espécies de peixes migradores.
11
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANDRADE-TALMELLI, E. F.; KAVAMOTO, E. T.; FENERICH-VERANI, N.
Características seminais da piabanha, Brycon insignis (Steindachner, 1876), após
estimulação hormonal. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 27, n. 2, p.
149 - 154, 2001.
AYROZA, L. M. S.; ROMAGOSA, E.; ANDRADE, E. F. Produção de alevinos de
curimbatá, Prochilodus scrofa, na região do Vale do Ribeira, SP. In: Reunião Anual
do Instituto de Pesca, Resumo. São Paulo: Instituto de Pesca, 1992, 41p.
BALDISSEROTTO, B. e GOMES, L. C. Espécies nativas para a piscicultura no
Brasil Santa Maria: Ed. UFSM, 2005. 468 p.
BARBIERI, G.; SALLES, F. A.; CESTAROLLI, M. A.; TEIXEIRA-FILHO, A. T.
Estratégias reprodutivas do dourado, Salminus maxillosus e do curimbatá,
Prochilodus lineatus no Rio Mogi Guaçu, Estado de São Paulo, com ênfase nos
parâmetros matemáticos da dinâmica populacional. Unidade de Pesquisa e
Desenvolvimento de Pirassununga. Acta Scientiarum - Biological Sciences,
Maringá, v. 26, n. 2, p. 169-174, 2004.
BART, A. N. e DUNHAM, R. A. Effects of sperm concentration and egg number on
fertilization efficiency with channel catfish (Ictalurus punctatus eggs and blue catfish
(I. furcatus) spermatozoa. Theriogenology. v. 45, p. 673-682, 1996.
BILLARD, R. Artificial Insemination. In: Fish Physiology of Reproduction.
Endinburgh, London, Melbourne and New York, 1990. v. 4, Chapter 9, p. 870-887.
BILLARD, R. e COSSON, M. P. Some problems related to the assessment of sperm
motility in freshwater fish. J. Exp. Zoo. v. 261, p. 122-131, 1992.
12
BILLARD, R., COSSON, J., LAURENCE, W. C. Motility of fresh and aged halibut
sperm. Aquat. Living Resour., v.6, p.67-75, 1993.
BILLARD, R.; COSSON, M. P.; PERCHEC, G.; LINHART, O. Biology of sperm and
artificial reproduction in carp. Aquaculture, Amsterdam, v. 129, p. 95-112, 1995.
BORSATO DA SILVA, E. Avaliação comparativa da utilização do sêmen
criopreservado e fresco na fertilização dos óvulos de curimbatá (Prochilodus
lineatus) (Valenciennes, 1836). Florianópolis: Universidade Federal de Santa
Catarina, 2000. 58p. Dissertação (Mestrado em aqüicultura) – Universidade Federal
de Santa Catarina, 2000.
BROMAGE, N.; JONES, J; RANDALL, C.; THURSH, M.; SPRINGATE, J.; BARKER,
G.; Broodstock management, fecundity, egg quality and timing of egg production in
the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, Amsterdam, v. 100, p. 66-
141, 1992.
BROMAGE, N. In: Broodstock Manegement and Egg and Larval Quality.
Broodstock Manegement and Seed Quality – Geral Considerations. Oxford:
Blackwell Science Ltd, p. 23-52, 1995.
CASTAGNOLLI, N. e CYRINO, J. E. P. Desova induzida do Curimbatá, Prochilodus
scrofa Steindachner 1881 (Pisces, Prochilodontidae). Ciência e Cultura, v. 32 n. 9,
p. 1245-1253, set. 1980.
CASTAGNOLLI, N. Piscicultura de água doce. Jaboticabal: FUNEP. 1992. 189p.
CASTRO, R. M. C. Revisão Taxonômica da Família Prochilodontidae
(Ostariophysi: Characiformes). 1990. 293 f., il. + 43 figs. Tese (Doutorado em
Ciências) – Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1990.
13
CASTRO, R. M. C. 1991. Sistemática e distribuição geográfica da família
Prochilodontidae (Ostariophysi, Characiformes). In: Encontro Brasileiro de
Ictiologia, IX. Maringá, Pr, 1991. Resumos. Maringá. SBI/NUPELIA, p.128.
CASTRO, R. M. C.; BEGOSSI, A. Ecology of fishing on the Grande river (Brazil):
techenology and territorial rights. Fisheries Research, p. 1-14, 1995.
CESTAROLLI,M. A.; ROMAGOSA, E.; CIPOLI, M. N.; BASILE-MARTINS, M. A.;
VERANI, J. R. 1981. Observações sobre o cultivo de curimbatá Prochilodus scrofa
Steind., 1881, em tanques adubados, Pirassununga, SP. Ciênc. e Cult., 33 (7,
supl.):6.
CHEREGUINI, O.; DE LA BANDA, I. G.; RASINES, I. et al. Artificial fertilization in
turbot, Scopothalmus maximus, (L.): different methods and determination of the
optimal sperm-egg ratio. Aquaculture Research, Amsterdam,
v.30, p.319-324,
1999.
COMPANHIA ENERGÉTICA DA MINAS GERAIS, FUNDAÇÃO CENTRO
TECNOLÓGICO DE MINAS GERAIS. Guia ilustrado de peixes da bacia do rio
Grande. Belo Horizonte: CEMIG/CETEC, 2000. 144p.
CYRINO, J. E. P.; URBINATI, E. C.; FRACALOSSI, D. M.; CASTAGNOLLI, N.
Reprodução de peixes de água doce In: Tópicos especiais em piscicultura de
água doce tropical intensiva. São Paulo: TecArt, 2004. p 45-74.
DENNISTON. R. S.; MICHELET, S.; GODKE, R. A. Principles of Cryopreservation.
In: TIERSCH, T.R.; MAZIK, P.M. (Eds.). Cryopreservation in aquatic species.
Morgantown: The World Aquaculture Society, 2000. p.59-74.
ERDAHL, A. W. e GRAHAM, E. F. Fertility of Teleost Semen as Affected by Dilution
and Storage in Seminal Plasma-Mimicking Medium. Aquaculture, Amsterdam, v.
60, p. 311-321. 1987.
14
FENERICH-VERANI, N.; GODINHO, H. M. The size composition of the eggs of
Curimbatá Prochilodus scrofa Staindachner 1881, induced to spawn with human
chorionic gonadotropin (HCG). Aquaculture, Amsterdam, v. 42, p. 37-41, 1984.
FOGLI DA SILVEIRA, W; KAVAMOTO, E. T.; RIGOLINO, M. G.; TABATA, Y. A. O
método espectrofotométrico na avaliação da concentração de espermatozóides da
truta arco-íris, Salmo irideus Gibbons. Boletim Instituto de Pesca, São Paulo, v.
14, p. 69-73, 1987.
FOGLI DA SILVEIRA, W., KAVAMOTO, E. T.; RIGOLINO, M. G. Fertilidade do
sêmen de truta arco-íris, Salmo irideus gibbons, em diferentes concentrações de
espermatozóides por óvulo. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v.15, n. 1,
p.51-54, 1988.
FUEM-ITAIPU BINACIONAL. Relatório do projeto “Ictiofauna e Biologia
Pesqueira” – março/85 a fevereiro de 1986. Maringá, v.2, 1987, 638 p.
GODINHO, H.M.; ROMAGOSA, E.; CESTAROLLI, M. A. et al. Reprodução induzida
de curimbatá Prochilodus scrofa Steind., 1881 sob condições de cultivo
experimental. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, v.8, n.2,
p.113-119, 1984.
GODOY, M. P. 1959. Age, growth, sexual maturity, behavior, migration, tagging and
transplantation of the curimbatá, Prochilodus scrofa Steind., 1881) of the Mogi-
Guassú river, SP state, Brazil. An. Acad. Bras. Ciênc., Rio de Janeiro, 31 (3): 447-
77.
GODOY, M. P. Dez anos de observações sobre periodicidade migratória de peixes
do rio Mogi-Guaçu. Rev. Bras.Biol., Rio de janeiro, v. 27, n. 1, p. 1-12, 1967.
GODOY, M. P. Brazilian tagging experiments, fishes migration and upper Paraná
river basin ecosytem. Rev. Bras. Biol., Rio de Janeiro, v. 32, n. 4, p. 473-84, 1972.
15
GODOY, M. P. Brazilian tagging experiments, fishes migration and upper Paraná
river basin ecosytem. Rev. Bras. Biol., Rio de Janeiro, v. 32, n. 4, p. 473-84, 1972.
GODOY, M. P. Peixes do Brasil – Subordem Characoidei. Editora Franciscana, v.
1, p. 629-874, 1975.
ITUASSÚ, R. D.; CAVERO, B. A. S.; FONSECA, F. A. L.; BORDINHON, A. M.
Cultivo de curimatã (Prochilodus spp) in: Espécies nativas para piscicultura no
Brasil. Santa Maria: editora UFSM, 2005. p.67-80.
KAVAMOTO, E. T. e FOGLI DA SILVEIRA, W. Características físicas, químicas e
microscópicas do sêmen do bagre, rhamdia hilarri (Valenciennes, 1840) em
condições de campo. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v.13, n. 1, p.95-
100, 1986.
KAVAMOTO, E. T.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; RIGOLINO, M. G.; TABATA, Y. A.,
CAMPOS, B. E. S. Produção espermática e teste de fertilização do sêmen de Truta
Arco-Íris, Salmo irideus gibbons no primeiro ciclo reprodutivo. Boletim do Instituto
de Pesca, São Paulo, v. 14, p. 51-62, 1987.
KAVAMOTO, E. T.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; GODINHO, H. M.; ROMAGOSA, E.
Fertilização em Prochilodus scrofa Steindachner 1881, com sêmen criopreservado
em nitrogênio liquido. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 16, n.1, p. 29-
36, 1989.
KAVAMOTO, E. T.; NARAHANA, M. Y.; MAINARDES-PINTO, C. S. R.; ANDRADE-
TALMELLI, E. F.; ROMAGOSA, E.; FERRAZ, E. M.; Efeito do HCG na produção de
sêmen do curimbatá Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881). Revista Ceres, v. 43,
n. 245, p. 76-85, 1996.
LAHNSTEINER , F. Introduction to the special issue on cryopreservation of gametes
in aquatic species. Aquaculture Research, Amsterdam,
v. 31, p. 229, 2000.
16
LIZAMA, M. A. P. Estimativa do parâmetros de crescimento, recrutamento e
mortalidade de Prochilodus lineatus da planície de inundação do Alto Rio Paraná,
Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v.26, n. 2, 121-128, 2000.
LOWE-MCCONNELL, R. H. Estudos ecológicos de comunidades de peixes
tropicais. São Paulo; Edusp; 1999, 534 p.
MARQUES, S. Preservação a curto prazo do sêmen de teleósteos neotropicais
de água doce. Belo Horizonte: Pontifícia Universidade Católica, 2001. 98p.
Dissertação (Mestrado de Zoologia de Vertebrados) - Pontifícia Universidade
Católica de Minas Gerais, 2001.
MOJICA, C. A. P. Analise ultraestrutura e avaliação do sêmen de peixes
neotropicais, Brycon orbignyanus, Rhamdia quelen e Brycon hilarii (Pisces,
Teleostei). 2004. 75 f. Dissertação (Mestrado em Aqüicultura) – Centro de
Aqüicultura, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2004.
MORISAWA, M. Initiation mechanism of sperm at spawning in teleosts. Zool. Sci. v.
2., p. 605-615, 1985.
MORSHBACHER E. F. Dose inseminante para fertilização artificial de ovócitos
de jundia cinza Rhandia quelen. Universidade Estadual do Oeste do Paraná,
Toledo, 2004.
NAKATANI, K.; AGOSTINHO, A. A.; BAUMGARTNER, G. et al. Ovos e Larvas de
Peixes de Água Doce. Maringá: EDUEM, 2001. 378p.
NARAHARA, M. Y.; ROMAGOSA, E.; CESTAROLLI, M. A.; KAVAMOTO, E. T.;
ANDRADE, E. F.; GODINHO, H. M.; GUILHERME, M. C. M.; VERRISSIMO, R.
1990. Análise do desempenho de reprodutores de curimbatá, Prochilodus scrofa,
em diferentes condições de cultivo. In: Simpósio Brasileiro de aqüicultura,
Natal/RN, 1990. Resumos. Natal/ABRAQ, p.68.
17
NINHAUS-SILVEIRA, A. Caracterização espermática, preservação criogênica e
fertilidade do matrinchã, Brycon cephalus Gunther, 1860 (Teleostei,
Characidae).. 2000. 47 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas (Genética)
- Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.
RANA, K. In: In: Broodstock Manegement and Egg and Larval Quality.
Preseration of Gametas, 1995, p. 53-75.
ROSA Jr. H.; SCHUBART, O. 1945. Anotações sobre a biologia do curimbatá
(Prochilodus) do rio Mogi-Guaçu, SP. Rev.Bras.Biol., Rio de Janeiro, 5 (4): 541-55.
ROMAGOSA, E.; NARAHARA, M. Y.; GODINHO, H. M. Tipo de desova do curimatã,
Prochilodus scrofa Staind. 1881, do rio Mogi-Guaça, Pirassununga, São Paulo.
Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 12, n. 4, p. 1-5, 1985.
ROMAGOSA, E.; NARAHARA, M. Y.; GODINHO, H. M. Tipo de desova do
curimbatá, Prochilodus scrofa Steind., 1881, do Rio Mogi-Guaçu, Pirassununga, SP.
Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 12, n. 4, p. 1-5, 1985a.
ROMAGOSA, E.; NARAHARA, M. Y.; GODINHO, H. M.; STORFER, E. B. 1985b.
Regressão ovariana de curimbatá, Prochilodus scrofa Steind., 1881, sob condições
de cultivo intensivo. In: Congresso brasileiro de Zoologia, 12, Campinas-SP,
1985b. Resumos. Campinas, SBZ/UNICAMP, p. 203-204.
ROMAGOSA, E. 1991. Mudanças morfológicas(microscopia de luz e eletrônica)
das gônadas do pacu, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887),durante o
ciclo reprodutivo, em condições de confinamento. Rio Claro. 177p. (Dissertação
de Mestrado. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”).
ROMAGOSA, E. 1998 Desenvolvimento gonadal (morfologia; ultra-estrutura) e
indução da reprodução do matrinxã, Brycon cephalus (Günther, 1869) em
cativeiro. Vale do Ribeira, São Paulo. São Carlos. 211p. (Tese de Doutoramento.
Universidade Federal de São Carlos).
18
RURANGWA, E; VOLCKAERT, F. A. M.; HUYSKENS; KIME, G. D. E.; OTLEVIER,
F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer assisted
sperm analysis (casa), viable staining standardized fertilization in african catfish
(Clarias gariepinus). Theriogenology, v. 55, p. 751-769, 2001.
RURANGWA, E.; KIME, D. E.; OLLEVIER, F.; NASH, J. P. The measurement of
sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture,
Amsterdam, v. 234, p.1 –28, 2004.
SANTOS, R. A.; CÂMARA, J. J. C.; CAMPOS, E. C.; JUNIOR, H. V.; GIAMAS, M.
T. D. Considerações sobre a pesca profissional e a reprodução pesqueira em águas
continentais do estado de São Paulo. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, n.
19, 32 p, 1995.
SHIMODA, E.; ANDRADE, D. R.; VIDAL JÚNIOR, M. V.; GODINHO, H. P.; YASUI,
G. S. Determinação da razão ótima de espermatozóides por ovócitos de piabanha
Brycon insignis (pisces - characidae). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte,
v. 59, n. 4, p. 877-882, 2007.
STREIT JR., D. P. Extrato de hipófise de frango e de Coelho como indutores
gonadais de pacu (Piaractus mesopotamicus) macho e fêmea, em comparação
com extrato de carpa. Maringá: Universidade Estadual de Maringá, 2002. 38p.
Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Universidade Estadual de Maringá, 2002.
SUQUET, M.; BILLARD, R.; COSSON, J.; NORMANT, Y.; FAUVEL, C. Artificial
insemination in turbot (Scophthalmus maximus) : determination of the optimal sperm
to egg ratio and time of gamete contact. Aquaculture, Amsterdam , v. 133, p. 83-
90, 1995.
VAZZOLER, A. E. M. de M. 1996. Biologia da reprodução de peixes teleósteos:
teoria e prática. Maringá, EDUEM, 169p.
19
VERANI, J. R. 1987. Análise quantitativa aplicada em experimento de cultivo
intensivo e semi-intensivo do curimbatá, Prochilodus scrofa, Steind., 1881
(Characiformes, Prochilodontidae). São Carlos, Universidade Federal de São
Carlos-UFSCar. 123p. (Tese de Doutorado).
VIVEIROS, A. T. M.; JATZKOWSKI, A.; KOMEN, J. Effects of oxytocin on semen
release response in african catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology, v. 59, p.
1905- 1917. 2003.
WOYNAROVICH, E.; HORVATH, L. A propagação artificial de peixes de águas
tropicais: manual de extensão. Brasília: Escopo. 1983. 220p. Tradução de Vera
Lucia Mixtra Chama de “The Artificial Propagation of Warm - Water Fin fishes – A
Manual for Extension”.
ZANIBONI FILHO, E. Apostila: Piscicultura das espécies nativas de água doce.
UFSC, Florianópolis, 10p., 1997.
ZANIBONI FILHO,E. e WEINGARTNER, M. Técnicas de indução da reprodução de
peixes migradores. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte,
v.31, n.3, p.367-373, 2007.
20
OBJETIVOS
Objetivo geral
Este trabalho foi conduzido com o objetivo de conhecer os processos
envolvidos na fertilização artificial do curimbatá, Prochilodus lineatus e otimizar o
uso de gametas e seus reprodutores.
Objetivos específicos
I – Definir a qualidade espermática dos “pool’s” a serem utilizados nos experimentos
II – Observar a influência que a relação, volume de sêmen:volume de água exerce
sobre a ativação dos espermatozóides (duração da motilidade)
III – Definir a temperatura ideal da solução ativadora
IV – Determinar a melhor relação entre o número de espermatozóides.ovócito
-1
e o
volume ideal de água empregados na fertilização artificial
1
ARTIGO I
MOTILIDADE ESPERMÁTICA DO SÊMEN DO CURIMBATÁ, Prochilodus
lineatus EM RELAÇÃO AO VOLUME E A TEMPERATURA DA SOLUÇÃO
ATIVADORA
RESUMO
A motilidade espermática é um fator chave para a determinação da qualidade
do sêmen e sua capacidade de fertilização. Vários fatores influenciam a motilidade
espermática como: espécie estudada, qualidade dos gametas, tipo, volume,
temperatura e pH da solução ativadora. Assim sendo, o presente trabalho objetivou
avaliar o efeito que a temperatura da solução ativadora e, a relação volume de
sêmen:água exercem sob a duração da motilidade espermática. Foram utilizados 12
machos de curimbatá, Prochilodus lineatus com peso e comprimento padrão médio
de 405,83 ± 134,20 g, 25,63 ± 3,19cm, respectivamente. Os reprodutores receberam
duas doses de extrato de hipófise de carpa (dose inicial de 0,5 mg.kg
-1
e final de 5,0
mg.kg
-1
). Do sêmen dos 12 machos foi realizado um “pool” e, analisada a
concentração e o índice de sobrevivência espermática, bem como, a duração da
motilidade espermática. Para o primeiro ensaio foi utilizado um delineamento
experimental inteiramente casualizado e os tratamentos foram compostos pelos
volumes de sêmen provenientes do “pool” e a água nas proporções de: 1:1, 1:2,
1:20, 1:200, 1:2000, 1:20000 e 1:100000µL, respectivamente. O segundo ensaio
utilizou um delineamento experimental inteiramente casualizado os tratamentos
foram constituídos por alíquotas de 5µL do “pool” de sêmen e, adicionadas a 200µL
de solução ativadora nas seguintes temperaturas: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 e
50°C. A duração da motilidade espermática do curimbatá, P. lineatus teve um
comportamento linear ascendente em função do aumento da diluição a partir de
1:2µL sêmen:água (23,04s), até atingir o valor máximo estudado que foi de
1:100.000µL sêmen:água, com a duração da motilidade espermática de 28,83s Os
melhores resultados de duração da motilidade espermática em função da
temperatura da solução ativadora foram obtidos à temperatura de 20°C, a qual
proporcionou uma duração média da motilidade de 22,51 ± 0,79 segundos.
Palavras-chave: machos, ativação, espermatozóides, diluição
2
ABSTRACT
Sperm motility is a key element to qualify semen and its fertilization capacity.
Several factors act on sperm motility such as studied species, gametes quality, kind,
volume, temperature and pH of activation swimming solution. That way, this study
had as a goal evaluate the efect that the temperature of active solution and
semen:water volume roll exert on the sperm motility duration. Twelve male
curimbatás, Prochilodus lineatus with average weight and medium standard length of
405,83 ± 134,20 g, 25,63 ± 3,19cm, respectively were used. Reproducers got two
doses of pituitary extract from carp (initial dose of 0,5 mg.kg
-1
and final of 5,0 mg.kg
-
1
). Whit the semen of those 12 male animals was made a pool and analysed its
concentration and spermatic survival index and also sperm motility duration. For the
first analysis it was utilized an experimental design entirely randomized and
treatments were compound by semen volume deriving from that pool and the water
on the proportion of 1:1, 1:2, 1:20, 1:200, 1:2000, 1:20000 e 1:100000µL,
respectively. The second analysis utilized an experimental delineation entirely
randomized, treatment were composed by 5µL from the pool of the semen and
added to a 200µL active solution on the following temperatures: 5, 10, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45 e 50°C. Sperm motility duration of “curimbatá”, P. lineatus had an
ascendent linear behavior in function of dilution increasing from 1:2µL semen:water
(23,04s), until it gets the maximum studied value that was 1:100.000µL semen:water
with the sperm motility duration of 28,83s. Best results of sperm motility duration in
function of active solution temperature were gotten in temperature of 20°C wich
provided a medium duration of motility of 22,51 ± 0,79 seconds.
Key words: male animals, active, spermatozoids, dilution
3
INTRODUÇÃO
O curimbatá, Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1836) é conhecido também
pelos nomes comuns de curimba, corimba, curimbatá e corimbatá, pertencente à
Ordem dos Characiformes, à Família Prochilodontidae e ao Gênero Prochilodus
(Nakatani et al., 2001). Sua distribuição geográfica ocorre nas Bacias do Prata e do
rio Paraíba (Castro, 1990).
Por ser uma espécie reofílica, realiza migrações com fins reprodutivos. Estas
migrações são sincronizadas com flutuações do nível da água e são disparadas
pelo acréscimo da precipitação pluviométrica e aumento da temperatura e nível das
águas (Kavamoto et al., 1996; Lowe-McConnell, 1999).
É um peixe bem consumido, principalmente nas cidades do interior paulista,
devido ao maior percentual de captura e sabor de sua carne (Romagosa et al,
1985). Apresenta importância econômica e social para a pesca artesanal de
subsistência e esportiva, além de apresentar carne saborosa (Barbieri et al., 2004).
Dentre as espécies de peixes com potencial para a aqüicultura, o curimbatá
apresenta boa perspectiva de criação em cativeiro. Porém, tratando-se de uma
espécie que não se reproduz naturalmente em ambientes estanques, necessita de
ser induzida à reprodução através do emprego de hormônios gonadotrópicos
(Borsato da Silva, 2000).
Apesar da tecnologia da reprodução do curimbatá estar praticamente
dominada, há necessidade de alguns estudos relacionados com o método de
fertilização artificial, a qualidade dos gametas e suas relações com o sucesso da
fertilização artificial ainda devem ser realizados.
A motilidade espermática é um dos parâmetros mais comuns e mais
utilizados para se avaliar a qualidade dos espermatozóides. A simples estimativa
visual do sêmen fresco, com auxílio de um microscópio é suficiente para avaliação
parcial da qualidade do material fecundante (Kavamoto et al., 1986).
Em geral, o espermatozóide deve apresentar motilidade para efetivar a
fertilização, embora em alguns casos possam apresentar motilidade mas não serem
férteis. Normalmente, o espermatozóide é imóvel na região genital e é ativado em
um meio externo após a diluição com um diluente apropriado (Billard et al., 1995).
4
Muitos fatores influenciam a duração da motilidade espermática, tais como o
protocolo utilizado, a espécie estudada, tipo, volume, pH e temperatura da solução
ativadora sendo que estes fatores variam de espécie para espécie (Billard et al.,
1995).
A diluição é um fator determinante na caracterização da motilidade
espermática, sendo a concentração e o volume do diluente os desencadeadores da
ativação do sêmen (Marques, 2001). Níveis insuficientes ou irregulares de diluição
não permitem aferir precisamente a duração da motilidade espermática (Billard et al,
1995).
A diluição seminal é um fator chave para o sucesso da reprodução artificial
de peixes, pois, influência a performance da motilidade espermática (Alavi e
Cosson, 2005) a qual esta diretamente ligada ao sucesso da fertilização (Alavi et al.,
2007).
Estudos recentes têm demonstrado que a taxa de diluição dos
espermatozóides tem influencia sob a fertilização, pois, causa mudanças nos
parâmetros da motilidade espermática como: velocidade, porcentagem de
espermatozóides móveis e duração da motilidade espermática (Alavi et al., 2007).
Billard e Cosson (1992) constataram que o aumento ou decréscimo da
temperatura influência diretamente à duração da motilidade espermática, causando
maior ou menor atividade celular, levando ao aumento ou decréscimo do consumo
das reservas energéticas dos espermatozóides (Alavi e Cosson, 2005).
Com intuito de conhecer o efeito que a solução ativadora pode causar sobre
a duração da motilidade espermática do curimbatá, Prochilodus lineatus, este
experimento foi realizado em três fases: (1) definir à qualidade espermática do
“pool” a ser utilizado no experimento; (2) avaliar os efeitos de diferentes relações de
diluição do sêmen ou volume de sêmen:volume de água sobre a duração da
motilidade espermática; e (3) definir a temperatura ideal da solução ativadora.
5
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado com reprodutores de curimbatá, Prochilodus
lineatus (Valenciennes, 1836) (Figura 6), no Laboratório de Tecnologia da
Reprodução dos Animais Aquáticos Cultiváveis - UNIOESTE, instalado no Centro de
Pesquisas em Aqüicultura Ambiental - CPAA/IAP – Toledo/PR (Figuras 3 e 4), no
mês de novembro de 2006.
Os peixes provenientes do Rio Paraná foram estocados durante o ano de
2005, no Centro de Pesquisa, em tanques escavados (em terra) de 200m
2
(Figura 5)
e, renovação de água somente para compensar a perda por evaporação e
infiltração. Os peixes foram alimentados com ração comercial extrusada com 32%
de PB, duas vezes ao dia, às 8:00hs e 17:00hs.
Foram selecionados dentro do próprio tanque 12 machos de curimbatá que
liberavam pequenas quantidades de sêmen sob leve pressão abdominal (Figura 7)
(Kavamoto et al., 1986a). Os animais selecionados foram transportados ao
laboratório de reprodução (Figura 8).
Os reprodutores foram individualmente pesados, marcados e acondicionados
em caixa d’água circular (1000L) e, renovação de água constante (Figura 9). Após
este procedimento aplicou-se intraperitonealmente uma dose de 0,5mg de extrato
de hipófise de carpa (EHC).kg de reprodutor
-1
. Doze horas após a primeira
aplicação, foi aplicada uma segunda dose de 5mg EHC.kg de reprodutor
-1
. Após as
aplicações a temperatura da água foi monitorada de hora em hora (Woynarovich e
Horvath, 1983).
Os machos de curimbatá, P. lineatus apresentaram valores médios de peso e
comprimento padrão de 405,83 ± 134,20 g, 25,63 ± 3,19cm, respectivamente.
Fase 1: Qualidade espermática do “pool”
A coleta dos gametas masculinos foi realizada após um período de 160
horas-grau ou unidades térmicas acumuladas (Woynarovich & Horvath, 1983). Os
machos foram contidos e secos com panos e papel toalha e, aplicada massagem na
região ventral do animal no sentido céfalo-caudal. A primeira gota de sêmen foi
desprezada para evitar possível contaminação e, o restante foi com o auxilio de uma
seringa descartável, com graduação de 0,1mL, para mensuração do volume de
6
sêmen liberado e da produção relativa de sêmen (Figura 10) (Bombardelli et al.,
2006).O sêmen colhido dos 12 machos foi homogeneizado em um “pool” e
armazenado sob resfriamento à 15°C.
Em seguida, foi mensurada a concentração espermática do sêmen. Para
tanto, retirou-se uma amostra de 5µL de sêmen do “pool” descrito anteriormente,
que foi diluído em 5mL de formol salina tamponado, resultando em uma diluição de
1:1000. Do material diluído e fixado anteriormente foi realizado o procedimento de
contagem de células espermáticas em câmara hematimétrica de Neubauer
(Mylonas et al.,1997).
Também, foi aferida a duração da motilidade espermática do “pool” de
sêmen. Para a mensuração desta variável foi misturado 5µL de sêmen a 200µL de
água e, concomitantemente a este evento, foi iniciada a contagem do tempo
necessário para que aproximadamente 50% dos espermatozóides perdessem o
movimento. Esta avaliação foi realizada por meio de microscópio óptico em objetiva
40X (Figura 11, 12 e 13).
Deste mesmo “pool” de sêmen foi determinado o índice de sobrevivência dos
espermatozóides, a partir do método de coloração de nigrosina-eosina (Kavamoto e
Fogli da Silveira, 1986). Para a mensuração do índice de sobrevivência, após a
mistura e homogeneização do sêmen e os corantes, foram confeccionados dois
esfregaço, em lâminas separadas. De cada lâmina foram contados pelo menos 400
espermatozóides, em microscópio de óptico (40x), sendo considerados vivos
aqueles com coloração branca (impermeáveis ao corante) e, mortos, com vermelha
ou rosada (permeáveis ao corante).
Fase 2: Efeito do volume do sêmen:volume de água na duração da motilidade
espermática
Foi utilizado um delineamento experimental inteiramente casualizado
composto por sete tratamentos e três repetições. Os tratamentos foram compostos
pelas relações entre volume de sêmen e volume de água empregada como solução
ativadora de: 1:1, 1:2, 1:20, 1:200, 1:2000, 1:20000 e 1:100000 µL, respectivamente.
Foi considerada como uma unidade experimental um recipiente plástico de 200mL,
contendo sêmen ativado pelos diferentes volumes de solução ativadora.
7
Simultaneamente, à homogeneização do sêmen e da solução ativadora foi
realizada a mensuração do tempo de ativação espermática, conforme descrito
anteriormente.
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e de
regressão à nível de 5% de significância. O software utilizado para a realização das
análises estatísticas foi Statistica
©
(Statsoft, 2005).
Fase 3: Efeito da temperatura da solução ativadora na duração da motilidade
espermática
Foi utilizado um delineamento experimental inteiramente casualizado
composto por dez tratamentos e três repetições. Os tratamentos foram constituídos
por alíquotas de 5µL do “pool” de sêmen (descrito anteriormente) e, adicionadas a
200µL de solução ativadora nas seguintes temperaturas: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45 e 50°C.
Após a mistura do sêmen e da solução ativadora foi mensurado o tempo de
ativação espermática, conforme metodologia descrita anteriormente.
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e de
regressão à nível de 5% de significância. O software utilizado para a realização das
análises estatísticas foi o Statistica
©
(Statsoft, 2005).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Fase 1: Qualidade espermática do “pool”
A tabela 1 expressa os valores médios da produção seminal, concentração
espermática, motilidade espermática, sobrevivência espermática e produção relativa
de sêmen dos machos.
8
Tabela 1. Produção seminal e características seminais do “pool” de sêmen
proveniente de 12 machos de curimbatá, Prochilodus lineatus
Parâmetros Média ± DP
Produção seminal (mL) 0,51 ± 0,35
Concentração de espermática (SPZ.mL-1) 2,95x1010 ± 2,0x109
Motilidade espermática (s) 23,47 ± 0,86
Sobrevivência espermática (%) 97,5 ± 0,07
Produção relativa de sêmen (mL.g-1) 0,0013 ± 0,0007
Fase 2: Efeito do volume do sêmen:volume de água na duração da motilidade
espermática
A Tabela 2 mostra os valores médios de duração da motilidade espermática
do “pool” realizado com sêmen de 12 machos de curimbatá, P. lineatus submetidos
a diferentes relações de diluição durante o processo de ativação.
Tabela 2. Valores médios de duração da motilidade espermática do “pool” de
sêmen de 12 machos de P. lineatus submetido a diferentes relações de
diluição durante o processo de ativação
Relações entre os
volume de sêmen:volume de água
Duração da motilidade
espermática (s) ± DP
1:100000 28,83 ± 1,27
1:20000 27,02 ± 0,33
1:2000 28,51 ± 2,31
1:200 23,72 ± 1,24
1:20 22,62 ± 0,22
1:2 23,04 ± 0,67
1:1 -----
Os valores de duração da motilidade espermática (s) e as diferentes relações
de volume de sêmen:volume de água utilizadas na ativação dos espermatozóides
de curimbatá estão expressos na Figura 1.
9
Figura 1. Duração da motilidade espermática do curimbatá,
Prochilodus lineatus utilizando-se diferentes relações de sêmen do
volume de sêmen:volume de água para a ativação dos
espermatozóides
Na menor diluição, 1:1µL sêmen:água não foi possível aferir a duração da
motilidade espermática devido a não ativação de todos espermatozóides. Segundo
Billard e Cosson (1992) é necessária uma diluição relativamente alta (acima de
1:1000) para que ocorra sincronizadamente a ativação de todos os
espermatozóides.
Sob baixas diluições, não são ativados todos os espermatozóides e a
ativação vai ocorrendo progressivamente por alguns minutos após a diluição. Este
fato dificulta aferir corretamente a duração da motilidade espermática e pode
explicar muitas discrepâncias encontradas na literatura (Billard et al., 1995).
Os resultados do presente experimento mostram uma relação diretamente
proporcional (P<0,05) entre o tempo de ativação espermática e as relações de
diluição seminal a partir do uso da água como solução ativadora (Figura 1).
A partir da diluição de 1:2µL sêmen:água (23,04s), a duração da motilidade
espermática aumentou proporcionalmente com aumento da diluição até atingir o
valor máximo estudado que foi de 1:100.000µL sêmen:água, com a duração da
motilidade espermática de 28,83s.
Outros autores também estudaram o efeito da diluição do sêmen sob a
motilidade espermática. Alavi et al. (2007) avaliaram as diluições de 1:25, 1:50 e
1:100µL sêmen:diluente para a Perca fluviatilis, encontrando os melhores resultados
na diluição de 1:50µL sêmen:diluente. Alavi e Cosson (2005) avaliaram as diluições
10
de 1:10, 1:50 e 1:200µL sêmen:diluente para o esturjão persa, Acipenser persicu
encontrando os melhores resultados nas diluições de 1:50 e 1:200µL
sêmen:diluente. Gallis et al, (1991) que também estudaram o efeito da diluição
sobre a motilidade espermática observaram um aumento na motilidade e na diluição
de 1:6 para 1:100 para o esturjão siberiano, Acipenser baeri.
As espécies de peixes acima citados quando comparadas aos peixes
tropicais como, por exemplo, o curimbatá apresenta motilidade sob baixas diluições
devido às baixas concentrações de cátions inorgânicos no seu sêmen (Alavi et al.,
2004).
Fase 3: Efeito da temperatura da solução ativadora na duração da motilidade
espermática
Os valores de duração da motilidade espermática (s), utilizando-se água
como solução ativadora em diferentes temperaturas na ativação dos
espermatozóides de curimbatá, P. lineatus podem ser vistos na Figura 2.
y = -0.0094x
2
+ 0.3259x + 18.535
R
2
= 0.9114
9
11
13
15
17
19
21
23
25
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Temperatura da solução ativadora (°C)
Duração da Motilidade
Espermática (s)
Figura 2. Duração da motilidade espermática dos espermatozóides
de curimbatá, P. lineatus ativados, utilizando-se água em diferentes
temperaturas
Os resultados de duração da motilidade espermática apresentaram um
comportamento quadrático (P<0,05), com máximo desempenho teórico em termos
de tempo de motilidade espermática para a temperatura de 17,34
o
C, promovendo
uma duração da motilidade espermática de 21,36s (Figura 2).
11
A duração da motilidade espermática de P. lineatus aumentou
proporcionalmente à temperatura da solução ativadora, a partir dos
5°C (19,34s)
alcançando o ponto máximo aos 20°C (22,51s), depois, estes valores diminuem e
passam a ter um comportamento inversamente proporcional ao aumento dos
valores de temperatura da solução ativadora aos 50°C (11,77s).
Este comportamento da duração da motilidade ocorrer inversamente
proporcional ao aumento da temperatura também foi registrado por Billard e Cosson
(1992) para a truta arco-íris, Vladic e Jarvi (1997) para truta parda e salmão do
Atlântico por Jezierska e Witeska (1999) para carpa comum e prateada e por Williot
et al., (2000) para esturjão siberiano.
Segundo Billard e Cosson (1992) o aumento ou decréscimo da temperatura
da solução ativadora tem influência direta na duração da motilidade espermática.
Isto se deve ao fato que, à reserva energética dos espermatozóides dos peixes é
limitada e conseqüentemente, o aumento da atividade celular espermática causado
pelo aumento da temperatura da solução ativadora induz à uma redução na duração
da motilidade espermática. Entretanto, uma redução na temperatura da solução
ativadora resultará em um aumento da duração da motilidade espermática em
função também, da redução no metabolismo celular dos espermatozóides (Alavi e
Cosson, 2005).
Existem muitos outros fatores que influenciam a duração da motilidade
espermática como a espécie estudada, a qualidade dos gametas, o tipo, volume e
pH da solução ativadora e o protocolo utilizado, sendo que estes fatores ainda
variam de espécie para espécie (Billard et al., 1995).
12
CONCLUSÕES
A razão de diluição que proporcionou a maior duração da motilidade
espermática do sêmen do curimbatá, P. lineatus foi de 1:100.000µL sêmen:água,
com a duração da motilidade espermática de 28,83s.
A temperatura da solução ativadora que proporcionou a maior duração da
motilidade espermática do curimbatá, P. lineatus foi de 20°C, a qual proporcionou
uma duração média da motilidade de 22,51 ± 0,79 segundos.
13
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALAVI, S. M. H.; COSSON, J.; KARAMI, M.; AMIRI, B. M.; AKHOUNDZADEH, M. A.
Spermatozoa motility in the Persian sturgeon, Acipenser persicus: effects of pH,
dilution rate, ions and osmolality, Reproduction, v. 128, p. 819–828, 2004.
ALAVI, S. M. H. e COSSON, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and
pH: a review, Cell Biology International, v. 29, p. 101-110, 2005.
ALAVI, S. M. H.; RODINA, M.; POLICAR, T.; KOZAK, P.; PSENICKA, M.; LINHART,
O. Semen of Perca fluviatilis L.: Sperm volume and density, seminal plasma indices
and effects of dilution ratio,ions and osmolality on sperm motility, Theriogenology,
v. 68, p. 276–283, 2007.
BARBIERI, G.; SALLES, F. A.; CESTAROLLI, M. A.; TEIXEIRA-FILHO, A. T.
Estratégias reprodutivas do dourado, Salminus maxillosus e do curimbatá,
Prochilodus lineatus no Rio Mogi Guaçu, Estado de São Paulo, com ênfase nos
parâmetros matemáticos da dinâmica populacional. Unidade de Pesquisa e
Desenvolvimento de Pirassununga. Acta Scientiarum - Biological Sciences,
Maringá, v. 26, n. 2, p. 169-174, 2004.
BILLARD, R. e COSSON, M. P. Some problems related to the assessment of sperm
motility in freshwater fish. J. Exp. Zoo. v. 261, p. 122-131, 1992.
BILLARD, R.; COSSON, M. P.; PERCHEC, G.; LINHART, O. Biology of sperm and
artificial reproduction in carp. Aquaculture, Amsterdam, v. 129, p. 95-112, 1995.
BOMBARDELLI, R. A.; MÖRSCHBÄCHER, E. F.; CAMPAGNOLO, R. et al. Dose
inseminante para fertilização artificial de ovócitos de jundiá Rhamdia quelen (Quoy e
Gaimardm, 1824). Revista Brasileira de Zootecnia, Viscosa, v.35, n.4, p.1251-
1257, 2006.
14
BORSATO DA SILVA, E. Avaliação comparativa da utilização do sêmen
criopreservado e fresco na fertilização dos óvulos de curimbatá (Prochilodus
lineatus) (Valenciennes, 1836). Florianópolis: Universidade Federal de Santa
Catarina, 2000. 58p. Dissertação (Mestrado em aqüicultura) – Universidade Federal
de Santa Catarina, 2000.
CASTRO, R. M. C. Revisão Taxonômica da Família Prochilodontidae
(Ostariophysi: Characiformes). 1990. 293 f., il. + 43 figs. Tese (Doutorado em
Ciências) – Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1990.
GALLIS J. L.; FEDRIGO, E.; JATTEAU, P.; BONPUNT, E.; BILLARD R. Siberian
sturgeon spermatozoa: effects of dilution, pH, osmotic pressure, sodium and
potassium ions on motility. In: Williot P, editor. Acipenser. Bordeaux: Cemagref; p.
143-51, 1991.
JEZIERSKA B. e WITESKA M. 1999. THE EFFECT OF TIME AND TEMPERATURE
ON MOTILITY OF SPERMATOZOA OF COMMON AND GRASS CARP Electronic
Journal of Polish Agricultural Universities, Fisheries, Volume 2, Issue 2.
Available Online
http://www.ejpau.media.pl/series/volume2/issue2/fisheries/art-04.html
KAVAMOTO, E. T. e FOGLI DA SILVEIRA, W. Características físicas, químicas e
microscópicas do sêmen do bagre, rhamdia hilarri (Valenciennes, 1840) em
condições de campo. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v.13, n. 1, p.95-
100, 1986.
KAVAMOTO, E. T.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; GODINHO, H. M. Características
seminais do curimbatá Prochilodus scrofa, Steindachner 1881. Boletim do Instituto
de Pesca, São Paulo, v.13, n. 2, p 45-50, 1986a.
KAVAMOTO, E. T.; NARAHANA, M. Y.; MAINARDES-PINTO, C. S. R.; ANDRADE-
TALMELLI, E. F.; ROMAGOSA, E.; FERRAZ, E. M.; Efeito do HCG na produção de
sêmen do curimbatá Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881). Revista Ceres, v. 43,
n. 245, p. 76-85, 1996.
15
LOWE-MCCONNELL, R. H. Estudos ecológicos de comunidades de peixes
tropicais. São Paulo; Edusp; 1999, 534 p.
MARQUES, S. Preservação a curto prazo do sêmen de teleósteos neotropicais
de água doce. Belo Horizonte: Pontifícia Universidade Católica, 2001. 98p.
Dissertação (Mestrado de Zoologia de Vertebrados) - Pontifícia Universidade
Católica de Minas Gerais, 2001.
MYLONAS, C. C.; GISSIS. A.; MAGNUS, Y. et al. Hormonal changes in male white
bass (Morone chysops) and evaluation of milt quality after treatment with a
sustained-release GnRHa delivery system. Aquaculture, The Netherlands, v.153,
p.301-311, 1997.
NAKATANI, K.; AGOSTINHO, A. A.; BAUMGARTNER, G. et al. Ovos e Larvas de
Peixes de Água Doce. Maringá: EDUEM, 2001. 378p.
ROMAGOSA, E.; NARAHARA, M. Y.; GODINHO, H. M. Tipo de desova do curimatã,
Prochilodus scrofa Staind. 1881, do rio Mogi-Guaça, Pirassununga, São Paulo.
Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 12, n. 4, p. 1-5, 1985.
STASOFT. INC. Statistica (data analysis software system). version 7.1. Tulsa,
USA, 2005.
VLADIC, T. e JARVI, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon
and brown trout—the effect of water temperature, Journal of Fish Biology, v. 50, p.
1088–1093, 1997.
WILLIOT, P.; KOPEIKA, E. F.; GONCHAROV, B. F. Influence of testis state,
temperature and delay in semen collection on spermatozoa motility in the cultured
Siberian sturgeon (Acipenser baeri Brandt). Aquaculture, v. 189 p. 53-61, 2000.
16
WOYNAROVICH, E.; HORVATH, L. A propagação artificial de peixes de águas
tropicais: manual de extensão. Brasília: Escopo. 1983. 220p. Tradução de Vera
Lucia Mixtra Chama de “The Artificial Propagation of Warm - Water Fin fishes – A
Manual for Extension”.
17
FIGURAS
Figura 3. Vista aérea do Centro de Pesquisas em Aqüicultura Ambiental - CPAA/IAP – Toledo/PR.
Fonte: Google Earth (2007).
Figura 4. Laboratório e tanques do CPAA/IAP Figura 5. Tanques das matrizes
Figura 6. Reprodutor de curimbatá Figura 7. Seleção dos reprodutores de
curimbatá (Prochilodus lineatus) utilizado curimbatá
no experimento
18
Figura 8. Laboratório de reprodução Figura 9. Caixas onde foram acondicionadas
as matrizes
Figura 10. Coleta de sêmen com auxilio de Figura 11. Sêmen (5µL) e água (200µL)
seringa descartável utilizados para aferir a motilidade espermática
Figura 12. Homogeneização do sêmen e água Figura 13. Coleta do sêmen e água
(ativação dos espermatozóides) homogeneizados para leitura em microscópio
sob lâmina de vidro
1
ARTIGO II
INTERAÇÃO ENTRE O NÚMERO DE ESPERMATOZÓIDE.OVÓCITO
-1
E O
VOLUME DE ÁGUA EMPREGADO NA FERTILIZAÇÃO ARTIFICIAL DE
OVÓCITOS DE CURIMBATÁ, Prochilodus lineatus
RESUMO
Estudos sobre a fertilização artificial de curimbatá, Prochilodus lineatus
visando à otimização do uso de reprodutores e técnicas que permitam a máxima
eficiência deste processo vêm sendo desenvolvidos no Brasil desde a década de
70. Deste modo, o presente trabalho objetivou determinar a melhor relação entre
número de espermatozóides.ovócito
-1
e volume ideal de água empregados no
momento da fertilização artificial do curimbatá. Foram utilizados 30 machos e 30
fêmeas de curimbatá com peso médio e comprimento padrão médio de 895,00 ±
431,00 g e 32,07 ± 6,25 cm e 1046,33 ± 417,50 g e 33,87 ± 5,41 cm,
respectivamente. Machos e fêmeas receberam duas doses de extrato de hipófise de
carpa (dose inicial de 0,5 mg.kg-1 e final de 5,0 mg.kg-1). Do sêmen dos machos foi
realizado um “pool” do qual foi analisado a concentração e o índice de sobrevivência
espermática bem como a duração da motilidade espermática. No ensaio de
fertilização, utilizou-se um delineamento experimental em estrutura fatorial 5X5X2,
sendo os tratamentos constituídos pelas relações de número de
espermatozóides.ovócito
-1
de 6x10
3
, 6x10
4
, 6x10
5
, 6x10
6
, 10x10
6
espermatozóides.ovócito
-1
e os volumes de água de 1, 25, 50, 75, 100 e 125 mL de
água.2ml de ovócitos
-1
, respectivamente. Após 8 horas de incubação, foram
analisadas as taxas de fertilização para cada tratamento. As variáveis quantidades
de água e de espermatozóides não apresentaram interação significativa entre si e o
período de coleta também não teve influencia significativa. A relação de
espermatozóide.ovócito
-1
para o curimbatá, P. lineatus, que proporcionou a melhor
taxa de fertilização foi de 1.007.660 espermatozóide.ovócito
-1
e, o volume ideal de
água foi de 105,5mL de água.2mL de ovócitos
-1
, produzindo taxas máximas de
94,77% de fertilização.
Palavras-chave: dosagem inseminante, sêmen, ativação, motilidade
2
ABSTRACT
Studies about “curimbatá” artificial fertilization, Prochilodus lineatus aiming
optimization of reproducers use and technics than allow maximum efficiency of this
process are being developed in Brazil since the 70’s. This study aimed establish the
best relation between spermatozoa.egg
-1
number and ideal water volume used in the
moment of “curimbatá” artificial fertilization. It was used 30 malesw and 30 females
of “curimbatá” with médium weight and medium standard length of 895,00 ± 431,00
g and 32,07 ± 6,25 cm e 1046,33 ± 417,50 g e 33,87 ± 5,41 cm, respectively. Males
na females got two doses of pituitary extract from carp (inicial dose of ,5 mg.kg-1
and final of 5,0 mg.kg-1). From male semen it was made a pool wich was analyzed
the concentration and spermatic survival index such as sperm motility duration. In
fertilization analysis it was utilized an experimental delineation in factorial
arrangement 5X5X2, being the treatments compound by relation of numbers of
spermatozoa.egg
-1
of 6x10
3
, 6x10
4
, 6x10
5
, 6x10
6
, 10x10
6
spermatozoa.egg
-1
and
the water volume of 1, 25, 50, 75, 100 e 125 mL of whater.2ml of egg
-1
, respectively.
Fertilization rates for each treatment were analyzed after 8 hours of incubation. Both
amount of water and spermatozoids did not show significative interaction and the
period of semen collection also did not have significative influence.
Epermatozoa.egg
-1
relation for “curimbatá”, P. lineatus, that provided the best
fertilization rates was 1.007.660 spermatozoa.egg
-1
and the ideal water volume
were 105,5mL of water.2mL de egg
-1
, producing maximum fertilization rates of
94,77%.
Key words: activation swimming solution, semen, active, motility
3
INTRODUÇÃO
Apesar da tecnologia da reprodução do curimbatá estar praticamente
dominada, muitos são os fatores limitantes durante o processo reprodutivo, dentre
eles, a qualidade do material fecundante (Rurangwa et al., 2004), o emprego
adequado das relações de número de espermatozóides.ovócito
-1
(Bombardelli et al.,
2006; Shimoda et al., 2007) e o volume de água empregado no processo de
fertilização artificial (Chereguini et al., 1999).
A técnica de inseminação artificial tradicionalmente empregada para espécies
de peixes nativos brasileiro em fazendas, consiste simplesmente, na
homogeneização dos espermatozóides e ovócitos em um meio externo (água doce
ou salgada, ou outras soluções ativadoras) (Marques, 2001). Entretanto, a eficiência
desta técnica é limitada, particularmente, no que se refere à estimativa das taxas de
fertilização e à economia de gametas, pois, o esperma de um único macho pode
fertilizar 1 a 5 fêmeas (Bart e Dunham, 1996; Chereguini et al., 1999; Marques,
2001; Shimoda et al., 2007).
A relação ótima de espermatozóides.ovócitos
-1
pode ser utilizada para
determinar o numero ideal de machos e fêmeas necessários para a fertilização
artificial (Tarnbasen-Cheong et al., 1995) proporcionando assim à otimização do
número de reprodutores (Marques, 2001).
Outro fator importante é o volume de solução ativadora a ser adicionada,
pois, a inclusão de grandes volumes de solução ativadora pode causar a diluição do
sêmen diminuindo assim, a possibilidade dos espermatozóides encontrarem a
micrópila, no momento da fertilização. Da mesma forma, a inclusão de volumes de
solução ativadora insuficientes, reduz o sucesso na fertilização artificial, pois, pode
causar a obstrução da micrópila pelo muco ovariano ou até mesmo pelo contato
entre ovócitos além de, prejudicar a ativação dos espermatozóides (Woynarovich e
Horváth, 1983; Ninhaus-Silveira et al., 2000; Shimoda et al., 2007; Zaniboni-Filho e
Weingartner, 2007).
Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo determinar a melhor
relação entre o número de espermatozóides.ovócito
-1
e o volume ideal de água
empregados na fertilização artificial do curimbatá, Prochilodus lineatus bem como
avaliar os efeitos e as possíveis interações.
4
MATERIAIL E MÉTODOS
O experimento foi realizado com reprodutores de curimbatá, Prochilodus
lineatus (Valenciennes, 1836) (Figura 5), no Laboratório de Tecnologia da
Reprodução dos Animais Aquáticos Cultiváveis - UNIOESTE, instalado no Centro de
Pesquisas em Aqüicultura Ambiental - CPAA/IAP – Toledo/PR (Figuras 2 e 3), nos
meses de novembro e dezembro de 2006.
Os peixes provenientes do Rio Paraná foram estocados durante o ano de
2005, no Centro de Pesquisa, em tanques escavados (em terra) de 200m
2
(Figura 4)
e, renovação de água somente para compensar a perda por evaporação e
infiltração. Os peixes foram alimentados com ração comercial extrusada com 32%
de PB, duas vezes ao dia as 8:00hs e 17:00hs.
Foram selecionadas, 30 fêmeas que apresentavam abdômen abaulado e
macio (Figura 6), papila urogenital avermelhada e levemente proeminente e ovócitos
de tamanhos homogêneos (Godinho et al., 1984) e 30 machos que liberavam
pequenas quantias de sêmen sob leve pressão abdominal (Kavamoto et al., 1986a).
Os animais selecionados foram transportados para o laboratório de reprodução
(Figura 7).
Os reprodutores foram individualmente pesados, marcados e separados por
sexo, em caixas d’água circular (1000L) e, renovação de água constante (Figura 8).
A 1ª dosagem (0,5mg de extrato de hipófise de carpa (EHC).kg de reprodutor
-1
) e a
2ª dose (5,0mg de EHC.kg de reprodutor
-1
) foram aplicadas intraperitonealmente,
para as fêmeas e machos, respectivamente. O intervalo entre as duas doses foi de
12h. Após as aplicações hormonais a temperatura da água foi monitorada de hora
em hora (UTA=hºC) (Woynarovich e Horvath, 1983).
Os machos e fêmeas de P. lineatus apresentaram valores médios de pesos e
comprimentos padrão de 895,00±431,00g, 32,07±6,25cm e 1046,33±417,50g,
33,87±5,41cm, respectivamente.
Assim, após 160 horas-grau, os machos foram contidos e secos com panos e
papel toalha e, aplicada massagem na região ventral do animal no sentido encéfalo-
caudal. A primeira gota de sêmen foi desprezada para evitar possível contaminação
e, o restante foi coletado com auxilio de seringa descartável, com graduação de
5
0,1mL, para mensuração do volume de sêmen liberado e da produção relativa de
sêmen (Figura 9) (Bombardelli et al., 2006).
O sêmen colhido dos 3 machos foi homogeneizado em um “pool” e
armazenado sob resfriamento à 15°C.
Em seguida, foi mensurada a concentração espermática do sêmen. Para
tanto retirou-se uma amostra de 5µL de sêmen do “pool” descrito anteriormente, que
foi diluído em 5mL de formol salina tamponado, resultando em uma diluição de
1:1000. Do material diluído e fixado anteriormente foi realizado o procedimento de
contagem de células espermáticas em câmara hematimétrica de Neubauer
(Mylonas et al.,1997).
Também, foi aferida a duração da motilidade espermática do “pool” de
sêmen. Para a mensuração desta variável foi misturado 5µL de sêmen a 200µL de
água e, concomitantemente a este evento, foi iniciada a contagem do tempo
necessário para que aproximadamente 50% dos espermatozóides perdessem o
movimento. Esta avaliação foi realizada por meio de microscópio óptico em objetiva
40X.
Deste mesmo “pool” de sêmen foi determinado o índice de sobrevivência dos
espermatozóides, a partir do método de coloração de nigrosina-eosina (Kavamoto e
Fogli da Silveira, 1986). Para a mensuração do índice de sobrevivência, após a
mistura e homogeneização do sêmen e os corantes, foram confeccionados dois
esfregaços, em lâminas separadas. De cada lâmina foram contados pelo menos 400
espermatozóides, em microscópio óptico (40x), sendo considerados vivos aqueles
com coloração branca (impermeáveis ao corante) e, mortos com coloração
vermelha ou rosada (permeáveis ao corante).
As fêmeas de P. lineatus apresentaram a produção total e relativa de
ovócitos de 182.186 ± 56.853 e 166,17 ± 30,64ovos.g
-1
, respectivamente.
Após 160 UTA, as fêmeas foram extrusadas de forma idêntica aos machos e
seus ovócitos coletados em placas de petri (Figura 10). Logo após, foram colhidas e
contadas três amostras de 0,1mL de ovócitos não hidratados para se estimar o
número total de ovócitos utilizados em cada unidade experimental.
Após determinar o número relativo de ovócitos e a concentração espermática
do “pool” de sêmen, foram colhidas, separadamente, cinco amostras de 2mL de
ovócitos não hidratados e sobre estes adicionadas às respectivas doses
inseminantes para realização dos ensaios de fertilização.
6
As desovas foram realizadas em grupos (3 machos e 3 fêmeas) em esquema
fatorial. Assim, por desova foram utilizados 10mL de ovócitos não hidratados, os
quais foram misturados ao sêmen, fertilizados e distribuídos em 5 incubadoras
experimentais confeccionadas em PVC, com formato cônico e de volume útil de
2,5L (Figura 12).
Utilizou-se um delineamento experimental em estrutura fatorial 5X5X2, sendo
os tratamentos constituídos pelas doses inseminantes ou relações de número de
espermatozóides.ovócito
-1
de 6x10
3
, 6x10
4
, 6x10
5
, 6x10
6
, 10x10
6
espermatozóides.ovócito
-1
e os volumes de água de 1, 25, 50, 75, 100 e 125mL de
água, respectivamente.
Foi considerado como uma unidade experimental um recipiente plástico de
250mL de volume útil contendo 2mL de ovócitos não hidratados e fertilizados com
as respectivas relações espermatozóides.ovócitos
-1
e volumes de água.
As fertilizações foram realizadas seqüencialmente em recipientes plásticos
descartáveis de 250mL onde foram colocadas às amostras de ovócitos e sêmen
(Figura 11) até receberem a solução ativadora (água da incubadora, proveniente de
poço artesiano). Após a adição da água os copos eram movimentados em sentido
circular por um minuto para a homogeneização do material fertilizante. Em seguida,
foi completado o volume total dos recipientes com água, onde os ovos fertilizados
permaneceram por um período de três minutos para sofrerem a hidratação.
A água das incubadoras foi mantida aquecida em 27,0±1,0ºC com o auxílio
de resistência elétrica e termostato. As taxas de fertilização foram mensuradas 8
horas após fertilização dos ovos, em microscópio (10X), utilizando-se
aproximadamente 380 ovos de cada unidade experimental, amostra esta superior
ao mínimo (260 ovos) recomendado por Zaniboni Filho (1992).
Após inspeção gráfica dos resultados, as possíveis influências do período de
coleta (T), da quantidade de água (A) e de espermatozóides (Log
10
(E)) sobre a
fertilização (F) dos ovos de curimbatá foram avaliadas através do protocolo de
regressão do modelo de superfície de resposta do software Statistica
©
(Statsoft,
2005):
F =
α
0
+
α
1
T +
α
2
A +
α
3
Log
10
(E) +
α
4
A* Log
10
(E) +
α
5
Log
10
(A) +
α
6
[Log
10
(E)]
2
+
µ
7
onde
α
i
são os parâmetros e
µ
~ N(0, σ
2
), sendo removidos progressivamente os
termos de ordens superiores não significativos (p > 0,05) pelo método backward
stepwise. Os pressupostos foram checados nos resíduos conforme sugerido em
Myers (1990).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 1 mostra os valores médios das características de qualidade
espermática do “pool” de sêmen.
Tabela 1. Valores médios das características reprodutivas do “pool” realizado
com o sêmen de 30 machos de curimbatá, Prochilodus lineatus
Variável Média ± DP
Produção seminal (mL) 3,32 ± 2,69
Concentração de espermática (SPZ.mL
-1
) 2,21x10
10
± 5,57x10
9
Duração da motilidade espermática (s) 23,92 ± 3,23
Sobrevivência espermática (%) 97,91 ± 1,36
Produção relativa de sêmen (mL.g
-1
) 0,0037 ± 0,0019
Neste estudo a concentração espermática do “pool” ficou acima dos valores
encontrados por Streit Jr. et al., (2004) de 1,40x10
10
SPZ.mL
-1
e Kavamoto et al.
(1989) de 1,95x10
10
SPZ.mL
-1
e, inferiores aos valores citados por Kavamoto et al.
(1997) de 3,29x10
10
SPZ.mL
-1
e Kavamoto et al. (1986a) de 3,06x10
10
SPZ.mL
-1
.
São muitos os fatores que podem influenciar a concentração espermática dos
peixes tropicais de água doce, dentre eles, a aplicação ou não de hormônios
indutores (Kavamoto et al., 1989), tipo de hormônio aplicado (Streit Jr. et al., 2004),
número de doses hormonais (Kavamoto et al., 1996), intervalo de tempo entre as
aplicações de hormônio (Castagnolli e Cyrino, 1980), período de coleta dos gametas
(Kavamoto et al., 1997), idade dos reprodutores (Kavamoto et al., 1996a), entre
outros.
A duração da motilidade espermática do P. lineatus verificadas neste
experimento, contradiz os mencionados por Murgas et al., (2007) que foram de 85 ±
11,18 segundos, quando analisaram a mesma espécie mas, utilizaram um protocolo
diferenciado para aferir este parâmetro. Os autores utilizaram como solução
ativadora, água destilada e aferiram à duração da motilidade espermática quando
8
10% das células espermáticas apresentavam motilidade enquanto, nosso estudo
utilizou água da incubadora (proveniente de nascente) e considerou 50% destas
células, tornando-se praticamente impossível compará-los.
Além do protocolo utilizado, outros fatores que podem influenciar à duração
da motilidade espermática são: espécie estudada, tipo, volume temperatura e pH da
solução ativadora (Billard et al., 1995).
Os valores encontrados para a sobrevivência espermática de Prochilodus
lineatus foram superiores aos encontrados por Kavamoto et al., (1996) de 93,84 ±
1,86 % e Kavamoto et al., (1996a) de 93,73 ± 1,95 % que também, avaliaram o
curimbatá.
As diferentes quantidades de água e de espermatozóides empregados na
fertilzação artificial dos ovócitos de P. lineatus influenciaram significativamente (p <
0,0001) na fertilização, de forma quadrática (Figura 1). Contudo, as variáveis em
estudo não apresentaram efeito interativo (P>0,05), ou seja, o efeito que o volume
de água exerceu sobre a taxa de fertilização independe da quantidade de
espermatozóides utilizados e, vice-versa.
Além disso, o intervalo de tempo entre os protocolos de fertilização ou o
período de coleta no experimento não apresentou efeito significativo (p > 0,05).
Assim, os dois grupos de dados foram submetidos ao mesmo modelo estatístico
que, responderam por 92 % da variabilidade total observada e, apresentada na
Figura 1.
9
Figura 1. Projeção tridimensional do modelo de superfície de
resposta ajustado para prever a taxa de fertilização do curimbatá em
função do volume de água e do número de espermatozóides
(transformação logarítmica) utilizadas na reprodução artificial.
Pontos vazados representam os tratamentos.
A relação de espermatozóide.ovócito
-1
que proporcionou a melhor taxa de
fertilização foi de 1.007.660 (1,0x10
6
)
e, o volume ideal de água foi de 105,5mL de
água.2mL de ovócitos
-1
, o que produziu taxa máxima de fertilização de 94,77%.
Borsato da Silva (2000), utilizou sêmen criopreservado de curimbatá para
estimar a capacidade de fertilização e, verificou que 0,06 mL de sêmen foi suficiente
para fertilizar 15g de ovócitos. Entretanto, quando foi utilizado 20g de ovócitos
fertilizados com a mesma quantidade de sêmen pode-se verificar uma redução
significativa das taxas de fertilização. Segundo o autor, este resultado sugere a
existência de uma relação ideal entre número de espermatozóide.ovócitos
-1
a serem
utilizados durante o processo de fertilização a fim de se obter melhores resultados.
Outras pesquisas também foram realizadas visando otimizar o emprego dos
reprodutores no processo de fertilização artificial encontrando doses inseminantes
ideais para as espécies, como 1,25x10
5
espermatozóides.ovócito
-1
para o bagre do
canal (Ictalurus sp.) com aproximadamente 80% de fertilização (Bart e Dunham,
1996), 15x10
3
espermatozóide.ovócito
-1
para o bagre africano (Clarias garienpinus)
com aproximadamente 80% de fertilização (Rurangwa et al., 1998), acima de 9x10
3
F = -393,035 -0,237*A +25,014*log
10
(A) +153,985*E -12,825*E
2
R
2
= 92 %
L
o
g
(
E
s
p
e
r
m
a
t
o
z
ó
i
d
e
)
(
E
)
V
o
l
u
m
e
d
e
Á
g
u
a
(
A
)
T
a
x
a
d
e
F
e
r
t
i
l
i
z
a
ç
ã
o
(
%
)
100
84
64
44
24
4
10
espermatozóide.ovócito
-1
para turbot (Scopothalmus maximus) com fertilização
acima de 70% (Chereguini et al., 1999), 23,67x10
3
espermatozóides. ovócito
-1
para
a carpa comum (Ciprinus carpio) com fertilização acima de 80% (Linhart et al.,
2003), 8,95x10
4
espermatozóide.ovócito
-1
, para jundiá-cinza (Rhamdia quelen) com
fertilização de 86,68% (Bombardelli et al., 2006), 314,428x10
3
espermatozóides.
ovócito
-1
para a piabanha (Brycon insignis) com fertilização de 88% (Shimoda et al.,
2007).
Devido à alta concentração de células espermáticas em um pequeno volume
de sêmen, fertilizar um grande número de óvulos é muitas vezes dificultado com o
sêmen não diluído Borsato da Silva (2000). Bart e Dunham (1996) que estudaram a
influência do volume de água empregado na ativação de ovócito do bagre do canal,
Ictalurus punctatus e, observaram que essa relação quando empregada
corretamente acarreta no aumento das taxas de fertilização.
Weingartner e Zaniboni (2006) estudaram a influência do volume da água na
ativação do espermatozóide no momento da fertilização dos óvulos de dourado,
Salminus maxillosus, e desenvolveram um novo protocolo que gerou um aumento
significativo nas taxas de fertilização.
Baldisserotto e Gomes (2005) recomendam para o curimbatá a quantidade
de água de 10 a 20% do volume de ovos que se deseja fertilizar, valor este muito
inferior ao encontrado no presente trabalho.
Kavamoto et al., (1986a) sugeriram que as diferenças encontradas entre os
resultados obtidos para P. lineatus em relação a outras, devam-se talvez ao caráter
específico de cada uma, sua posição taxonômica, idade e a fatores ambientais,
sugerindo, que se desenvolvam estudos durante todo o ciclo de vida de cada
espécie e, particularmente, em indivíduos adultos de idade conhecida, para melhor
selecionar bons reprodutores.
11
CONCLUSÕES
A relação de espermatozóide.ovócito
-1
para o curimbatá, Prochilodus lineatus,
que proporcionou a melhor taxa de fertilização foi de 1.007.660 (1,0x10
6
)
espermatozóide.ovócito
-1
e, o volume ideal de água foi de 105,5mL de água.2mL de
ovócitos
-1
, produzindo taxas máximas de 94,77% de fertilização.
12
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BALDISSEROTTO, B. e GOMES, L. C. Espécies nativas para a piscicultura no
Brasil Santa Maria: Ed. UFSM, 2005. 468 p.
BART, A. N. e DUNHAM, R. A. Effects of sperm concentration and egg number on
fertilization efficiency with channel catfish (Ictalurus punctatus eggs and blue catfish
(I. furcatus) spermatozoa. Theriogenology. v. 45, p. 673-682, 1996.
BILLARD, R.; COSSON, M. P.; PERCHEC, G.; LINHART, O. Biology of sperm and
artificial reproduction in carp. Aquaculture, Amsterdam, v. 129, p. 95-112, 1995.
BOMBARDELLI, R.A.; MÖRSCHBÄCHER, E.F.; CAMPAGNOLO, R. et al. Dose
inseminante para fertilização artificial de ovócitos de jundiá Rhamdia quelen (Quoy e
Gaimardm, 1824). Revista Brasileira de Zootecnia, Viscosa, v.35, n.4, p.1251-
1257, 2006.
BORSATO DA SILVA, E. Avaliação comparativa da utilização do sêmen
criopreservado e fresco na fertilização dos óvulos de curimbatá (Prochilodus
lineatus) (Valenciennes, 1836). Florianópolis: Universidade Federal de Santa
Catarina, 2000. 58p. Dissertação (Mestrado em aqüicultura) – Universidade Federal
de Santa Catarina, 2000.
CASTAGNOLLI, N. e CYRINO, J. E. P. Desova induzida do Curimbatá, Prochilodus
scrofa Steindachner 1881 (Pisces, Prochilodontidae). Ciência e Cultura, v. 32 n. 9,
p. 1245-1253, set. 1980.
CHEREGUINI, O.; DE LA BANDA, I.G.; RASINES, I. et al. Artificial fertilization in
turbot, Scopothalmus maximus, (L.): different methods and determination of the
optimal sperm-egg ratio. Aquaculture Research, Amsterdam,
v. 30, p. 319-324,
1999.
13
GODINHO, H.M.; ROMAGOSA, E.; CESTAROLLI, M.A. et al. Reprodução induzida
de curimbatá Prochilodus scrofa Steind., 1881 sob condições de cultivo
experimental. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, v. 8, n.
2, p. 113-119, 1984.
KAVAMOTO, E. T. e FOGLI DA SILVEIRA, W. Características físicas, químicas e
microscópicas do sêmen do bagre, rhamdia hilarri (Valenciennes, 1840) em
condições de campo. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 13, n. 1, p. 95-
100, 1986.
KAVAMOTO, E. T.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; GODINHO, H. M. Características
seminais do curimbatá Prochilodus scrofa, Steindachner 1881. Boletim do Instituto
de Pesca, São Paulo, v. 13, n. 2, p. 45-50, 1986a.
KAVAMOTO, E. T.; FOGLI DA SILVEIRA, W.; GODINHO, H. M.; ROMAGOSA, E.
Fertilização em Prochilodus scrofa Steindachner 1881, com sêmen criopreservado
em nitrogênio liquido. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 16, n.1, p. 29-
36, 1989.
KAVAMOTO, E. T.; NARAHANA, M. Y.; MAINARDES-PINTO, C. S. R.; ANDRADE-
TALMELLI, E. F.; ROMAGOSA, E.; FERRAZ, E. M.; Efeito do HCG na produção de
sêmen do curimbatá Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881). Revista Ceres, v. 43,
n. 245, p. 76-85, 1996.
KAVAMOTO, E. T.; FERRAZ, E. M.; ANDRADE-TALMELLI, E. F.; MAINARDES-
PINTO, C. S. R.; ROMAGOSA, E.; NARAHANA, M. Y.; BARNABE, V. H.; CAMPOS,
B. E. S. Estimulação da espermiação em curimbatá Prochilodus scrofa
(Steindachner) através de aplicações de HCG (Ostheichthyes, Characiformes,
Prochilodontidae). Revista Brasileira de Zoologia, Viçosa, v. 13, n. 1, p. 27-38,
1996a.
KAVAMOTO, E. T.; MAINARDES-PINTO, C. S. R.; ANDRADE-TALMELLI, E. F.;
CAMPOS, B. E. S. Produção espermática do curimbatá Prochilodus scrofa
Steindachner, 1881. Boletim do Instituto de Pesca, v. 24, p. 73-78, 1997.
14
LINHART, O.; RODINA, M.; GCLA, D. et al. Improvement of common carp artificial
reproduction using enzyme for elimination of eggs stickiness. Aquatic Living
Resources, n. 16, p. 450-456, 2003.
MARQUES, S. Preservação a curto prazo do sêmen de teleósteos neotropicais
de água doce. Belo Horizonte: Pontifícia Universidade Católica, 2001. 98p.
Dissertação (Mestrado de Zoologia de Vertebrados) - Pontifícia Universidade
Católica de Minas Gerais, 2001.
MURGAS, L. D. S.; MILIORINI, A. B.; FREITAS, R. T. F.; PEREIRE, G. J. M. P.
Criopreservação do sêmen de curimba (Prochilodus lineatus) mediante adição de
diferentes diluidores, ativadores e crioprotetores. Revista Brasileira de Zootecnia,
Visçosa, v.36, n.3, p.526-531, 2007.
MYERS, R.H. Classical and modern regression with applications. 2ª ed.,
Belmont: Duxbury Press, 1990.
MYLONAS, C. C.; GISSIS. A.; MAGNUS, Y. et al. Hormonal changes in male white
bass (Morone chysops) and evaluation of milt quality after treatment with a
sustained-release GnRHa delivery system. Aquaculture, The Netherlands, v.153,
p.301-311, 1997.
NINHAUS-SILVEIRA, A. Caracterização espermática, preservação criogênica e
fertilidade do matrinchã, Brycon cephalus Gunther, 1860 (Teleostei,
Characidae).. 2000. 47 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas (Genética)
- Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.
RURANGWA, E.; ROCLANTS, I.; HUYSKENS, G. et al. The minimum effective
spermatozoa:egg ratio for artificial insemination and the effects of mercury on sperm
motility and fertilization ability in (Clarias gariepinus). Journal of Fish Biology,
v.53, p.402-413, 1998.
15
RURANGWA, E.; KIME, D. E.; OLLEVIER, F.; NASH, J. P. The measurement of
sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture,
Amsterdam, v. 234, p.1 –28, 2004.
SHIMODA, E.; ANDRADE, D. R.; VIDAL JÚNIOR, M. V.; GODINHO, H. P.; YASUI,
G. S. Determinação da razão ótima de espermatozóides por ovócitos de piabanha
Brycon insignis (pisces - characidae). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte,
v. 59, n. 4, p. 877-882, 2007.
STASOFT. INC. Statistica (data analysis software system). version 7.1. Tulsa,
USA. 2005.
STREIT JR., D.P.; MORAES, G.V.; RIBEIRO, R.P. et al. Comparação do sêmen de
Curimbá (Prochilodus lineatus) induzido por extrato de hipófise de frango, coelho ou
carpa, Brazilian Journal of Veterinary and Animal Science, v.41, p.147-153,
2004.
TARNBASEN-CHEONG, M. V. P., TAN-FERMIN, J. D., GARCIA, L. M.,
BALDEVARONA, R. B. M Milt-egg ratio in artificial fertilization of the Asian
freshwater catfish, Clarias macrocephalus, injected salmon gonadotropin-releasing
hormone analogue and domperidone. Aquatic Living Resources, v. 8, p. 303-307,
1995.
WEINGARTNER, M.; ZANIBONI FILHO, E. Influência do volume da água de
ativação do sêmen na fertilização de óvulos de dourado Salminus brasiliensis. In:
CONGRESSO AQUACIÊNCIAS, 2006, 2., 2006, Bento Gonçalves, Anais...Bento
Gonçalves: AQUABIO [2006] (CD-ROM).
WOYNAROVICH, E.; HORVATH, L. A propagação artificial de peixes de águas
tropicais: manual de extensão. Brasília: Escopo. 1983. 220p. Tradução de Vera
Lucia Mixtra Chama de “The Artificial Propagation of Warm - Water Fin fishes – A
Manual for Extension”.
16
ZANIBONI FILHO, E. Incubação, larvicultura e alevinagem do tambaqui
(colossoma macropomum Cuvier 1818). São Carlos: Universidade Federal de
São Carlos, 1992. 202p. Tese (Doutorado em Ecologia de Recursos Naturais) –
Universidade Federal de São Carlos, 1992.
ZANIBONI FILHO, E. e WEINGARTNER, M. Técnicas de indução da reprodução de
peixes migradores. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte,
v.31, n.3, p.367-373, 2007.
17
FIGURAS
Figura 2. Vista aérea do Centro de Pesquisas em Aqüicultura Ambiental - CPAA/IAP – Toledo/PR.
Fonte: Google Earth (2007).
Figura 3. Laboratório e tanques do CPAA/IAP Figura 4. Tanques das matrizes
Figura 5. Reprodutor de curimbatá Figura 6. Seleção dos reprodutores
curimbatá (Prochilodus lineatus) utilizado no
experimento
18
Figura 7. Laboratório de reprodução Figura 8. Caixas onde foram acondicionadas
as matrizes
Figura 9. Coleta de sêmen com auxilio de Figura 10. Coleta dos ovócitos em placa de petri
seringa
Figura 11. Os ovócitos com suas respectivas Figura 12. Incubadoras experimentais
doses inseminantes antes da fertilização utilizadas para os ensaios de fertilização
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