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UNIVERSIDADE FEDERAL DE
UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDOS SOBRE A INTERCALAÇÃO DOS CORANTES AZUL
BRILHANTE-FCF E AZUL DE COOMASSIE G-250 EM ÁCIDO
DESOXIRRIBONUCLÉICO (DNA)
CARMEN FABÍOLA OTONI DE QUEIROZ
Uberlândia-MG
Julho/2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE
UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS – GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
ESTUDOS SOBRE A INTERCALAÇÃO DOS CORANTES
AZUL BRILHANTE-FCF E AZUL DE COOMASSIE G-250 EM ÁCIDO
DESOXIRRIBONUCLÉICO (DNA)
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-graduação em Química na Universidade
Federal de Uberlândia-UFU para a obtenção
do título de Mestre em Química, área de
concentração: Química Inorgânica.
CARMEN FABÍOLA OTONI DE QUEIROZ
Orientadora: Profa. Dra. SANDRA TEREZINHA DE FARIAS FURTADO
Uberlândia-MG
Julho/2007
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Q3e
Queiroz, Carmem Fabíola Otoni de, 1975-
Estudos sobre a intercalação dos corantes azul brilhante-FCF e azul de
coomassie G-250 em ácido desoxirribonucléico (DNA) / Carmen Fabíola Otoni
de Queiroz. - 2007.
102 f.. : il.
Orientadora: Sandra Terezinha de Farias Furtado.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Uberlândia,
Programa de Pós-Graduação em Química.
Inclui bibliografia.
1. Química - Teses. 2. Corantes - Teses. I. Furtado, Sandra Terezinha de
Farias. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Gra-duação
em Química. III. Título.
CDU: 54
Elaborado pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
Aos meus pais; Valter e Amélia e aos
meus avós Alzira e Orcalino
(
in memorian
) que estão sempre em
meus pensamentos.
Agradecimentos
Durante quase dois anos, muitas pessoas contribuíram para o desenvolvimento e
concretização deste trabalho, a quem quero expressar o meu sincero agradecimento.
Especialmente à minha orientadora, Professora Dra. Sandra Terezinha de Farias
Furtado, pela orientação, apoio, amizade e ensinamentos valiosos na elaboração deste trabalho
e, sobretudo pela confiança em mim depositada.
Aos professores; Dr.
Antônio Eduardo da Hora Machado, Dra. Rejane Maria Ghisolfi
da Silva e
Dra. Sandra Terezinha de Farias Furtado, que ministraram as disciplinas cursadas
durante o curso.
Aos colegas do Laboratório de Biossegurança e Bioinorgânica do Instituto de
Química-UFU; Juliana, Ana Maria e Batuíra, pelo companheirismo e amizade, sem falar na
imprescindível colaboração para a realização das análises.
Aos funcionários dos laboratórios de ensino, que prontamente sempre nos atenderam,
colaborando com reagentes e equipamentos.
Aos professores; Dr.
Sebastião Eiras e Dr. Ortellado pela contribuição no estudo da
variação do pH dos corantes. Ao doutorando Edmar pela colaboração na plotagem dos dados
na região do UV/Vis.
Ao colega, professor João Ribeiro Franco Neto pela cooperação e amizade nos
momentos de intranqüilidade.
A Dona Maria dos Anjos, minha eterna gratidão, que me hospedou em sua casa com
todo carinho e dedicação, sempre com uma palavra amiga nas horas difíceis.
À Deus, por estar sempre ao meu lado e por ter permitido chegar até aqui.
ÍNDICE GERAL
ASSUNTO Página
Índice de Tabelas .................................................................................................................i
Índice de Figuras ................................................................................................................ii
Índice de Quadros ..............................................................................................................iv
Abreviaturas .......................................................................................................................v
Resumo ..............................................................................................................................vi
Abstract .............................................................................................................................vii
1 Introdução....................................................................................................................2
1.1 Objetivos ............................................................................................................3
1.1.1 Objetivo Geral ........................................................................................3
1.1.2 Objetivos Específicos .............................................................................3
1.2 (DNA) ácido desoxirribonucléico ......................................................................4
1.3 Estrutura do DNA...............................................................................................5
1.4 Dupla Hélice do DNA ........................................................................................8
1.5 Estruturas dinâmicas do DNA ..........................................................................11
1.6 Fenômeno da Intercalação................................................................................13
1.7 Corantes Alimentícios ......................................................................................15
1.7.1 Corante Azul Brilhante - FCF .............................................................17
1.8 Corantes para ensaios bioquímicos ..................................................................19
1.8.1 Corante Azul de Coomassie .................................................................19
2 Parte Experimental ....................................................................................................22
2.1 Materiais...........................................................................................................22
2.2 Equipamentos ....................................................................................................22
2.3 Preparo das Soluções.........................................................................................22
2.3.1 Solução estoque de DNA......................................................................22
2.3.2 Solução estoque do Azul Brilhante e Azul de Coomassie....................23
2.3.3 Solução estoque estoque para curvas de calibração .............................23
2.3.3.1 Curva de Calibração do DNA................................................................23
2.3.3.2 Curva de Calibração do Azul Brilhante................................................ 24
2.3.3.3 Curva de Calibração do Azul de Coomassie .........................................24
2.3.4 Soluções para estudos sobre a variação do pH do meio do Azul
Brilhante e Azul de Coomassie .............................................................24
2.3.5 Soluções para estudos sobre a intercalação.........................................25
2.3.5.1 Soluções para estudos sobre a intercalação do Azul Brilhante em
DNA .....................................................................................................25
2.3.5.2 Soluções para estudos sobre a intercalação do Azul de Coomassie em
DNA.......................................................................................................27
2.3.6 Precipitação do DNA puro para estudos no Infravermelho...................29
2.3.7 Precipitação do DNA com os corantes para estudos no
Infravermelho.........................................................................................29
3 Resultados e Discussão....................................................................................31
3.1 Espectros de UV/Visível das soluções ............................................................31
3.2 Curvas de Calibração ......................................................................................34
3.3 Estudos sobre variação de pH do meio dos corantes.......................................38
3.3.1 Comportamento do Corante Azul Brilhante em meio ácido e básico ...38
3.3.2 Comportamento do Corante Azul de Coomassie em meio ácido
e básico ....................................................................................................................41
3.4 Estudos sobre Intercalação ..............................................................................43
3.4.1 Estudos sobre Intercalação do Corante Azul Brilhante em DNA ....43
3.4.2 Estudos sobre Intercalação do Corante Azul de Coomassie em
DNA.................................................................................................................55
3.5 Alterações na estrutura do DNA por análise espectrofotométrica na região do
Infra vermelho (IV) .........................................................................................67
4 Conclusão ..................................................................................................................75
5 Trabalhos Futuros .....................................................................................................77
6 Apêndice....................................................................................................................79
6.1 Apêndice – A ..................................................................................................79
6.2 Apêndice – B ..................................................................................................89
7 Referências Bibliográficas.........................................................................................96
i
Índice de tabelas página
Tabela – 1: Valores das concentrações de DNA e do Azul Brilhante ( DNA variável
e AZB fixo ) ..................................................................................................................... 26
Tabela – 2: Valores das concentrações de DNA e do Azul Brilhante ( DNA fixo e
AZB variável ) ................................................................................................................. 27
Tabela – 3: Valores das concentrações de DNA e do Azul de Coomassie ( DNA
variável e AZC fixo ) .................................................................................................... 28
Tabela – 4: Valores das concentrações de DNA e do Azul de Coomassie ( DNA fixo e
AZC variável ) .................................................................................................................. 28
ii
Índice de Figuras página
Figura – 1.1: Bases purinas, bases pirimidinas e nucleotídeo .............................................. 6
Figura – 1.2: Ligação fosfodiéster no esqueleto covalente do DNA.................................... 7
Figura – 1.3: Modelo diagramático da dupla hélice do DNA ............................................ 10
Figura – 1.4: Pareamento das bases por ligações de hidrogênio......................................... 10
Figura – 1.5: Estruturas dinâmicas do DNA (A-DNA, B-DNA e Z-DNA)........................ 12
Figura – 1.6: Fórmula estrutural do Corante Azul Brilhante FCF....................................... 18
Figura – 1.7: Fórmula estrutural do Corante Azul de Coomassie G-250............................ 20
Figura – 3.1: Espectro de absorção de DNA 3,42x 10
-5
mol.L
-1
......................................... 31
Figura – 3.2: Espectro de absorção do corante Azul Brilhante-FCF 4x10
-6
mol.L
-1
.......... 32
Figuras– 3.3: Espectro de absorção do corante Azul de Coomassie G-250
2,5x10
-6
mol.L
-1
(
A ): λ
max
601 nm e ( B ): λ
max
260 nm ................................................ 33
Figura – 3.4: Curva de calibração do DNA ( λ
max
260 nm ) ............................................. 34
Figura – 3.5: Curva de calibração do Corante Azul Brilhante FCF (λ
max
630nm) ............. 35
Figura – 3.6: Curva de calibração do Corante Azul de Coomassie (λ
max
602nm) .............. 36
Figura – 3.7: Comportamento do corante Azul Brilhante-FCF 4x10
-5
mol.L
-1
em
função do pH ...................................................................................................................... 39
Figura – 3.8: Comprimento de onda máximo corante Azul Brilhante-FCF
(λ
max
630nm) 4x10
-6
mol.L
-1
em função do pH.................................................................. 40
Figura – 3.9: Comportamento do corante Azul de Coomassie 4x10
-5
mol.L
-1
em
função do pH ..................................................................................................................... 42
Figura – 3.10: Variação da concentração do DNA em função da concentração livre de
corante Azul Brilhante, na mistura ...................................................................................... 46
Figura – 3.11: Espectros de absorção das soluções contendo DNA e corante Azul
brilhante [AZB ] = 6,66 x 10
-6
mol.L
-1
e [P
DNA
] variáveis ............................................ 47
Figura – 3.12: Variação da concentração adicionada do corante Azul Brilhante em
função da concentração do DNA, na mistura ..................................................................... 50
Figura – 3.13: Variação do efeito hipercrômico do corante Azul Brilhante em
função da concentração do DNA, na mistura ...................................................................... 51
Figura – 3.14: Duplo-recíproco da variação da concentração adicionada do corante
Azul Brilhante em função da concentração efetiva do DNA............................................... 54
iii
Figura – 3.15: Variação da concentração do DNA em função da concentração
livre de corante Azul de Coomassie ( 602 nm ) na mistura ................................................. 58
Figura – 3.16: Espectros de absorção das soluções contendo DNA e corante Azul brilhante
[AZC] = 6,66 x 10
-6
mol. L
-1
e [P
DNA
] variáveis ............................................................... 59
Figura – 3.17: Variação da concentração adicionada do corante Azul de Coomassie em
função da concentração do DNA, na mistura........................................................................ 62
Figura – 3.18: Variação do efeito hipocrômico do corante Azul de Coomassie em
função da concentração do DNA, na mistura ...................................................................... 63
Figura – 3.19: Duplo-recíproco da variação da concentração adicionada do corante
Azul de Coomassie em função da concentração efetiva do DNA........................................ 66
Figura – 3.20: Espectro de absorção do IR do DNA
P
........................................................ 70
Figura – 3.21: Espectro de absorção do IR do DNA
prec
com álcool isopropanol ............. 71
Figura – 3.22: Espectro de absorção do IR do DNA/Azul Brilhante .................................. 72
Figura – 3.23: Espectro de absorção do IR do DNA/Azul de Coomassie ........................... 73
Figura – 6.1: Diagrama esquemático do espectro eletromagnético...................................... 80
Figura – 6.2: Níveis de Energia eletrônica molecular........................................................... 84
Figura – 6.3: Principais aplicações da espectrometria no infravermelho ............................. 86
Figura – 6.4: Vibrações de um grupo de átomos .................................................................. 87
iv
Índice de Quadros página
Quadro – 1: Estudos sobre intercalação variando a concentração do DNA fixando a
concentração do corante Azul Brilhante-FCF...................................................................... 44
Quadro – 2: Estudos sobre intercalação variando a concentração do corante Azul
Brilhante FCF fixando a concentração do DNA................................................................ 49
Quadro – 3: Duplo recíproco variação da concentração do Azul Brilhante fixando a
concentração do DNA ........................................................................................................ 53
Quadro – 4: Estudos sobre intercalação variando a concentração do DNA fixando a
concentração do corante Azul de Coomassie ...................................................................... 56
Quadro – 5: Estudos sobre intercalação variando a concentração do corante Azul de
Coomassie fixando a concentração do DNA ...................................................................... 61
Quadro – 6: Duplo recíproco variação da concentração do Azul de Coomassie fixando a
concentração do DNA ......................................................................................................... 65
v
Abreviaturas
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AZB Azul Brilhante
AZC Azul de Coomassie
CI Colour Index
CNNPA Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos
DINAL Divisão Nacional de Vigilância Sanitária de Alimentos
DNA Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucleico)
DNA
p
DNA puro
DNA
prec
DNA precipitado
DNA
AZB
DNA precipitado com Azul Brilhante
DNA
AZC
DNA precipitado com Azul de Coomassie
FAO Food and Agriculture Organization
IDA Ingestão Diária Aceitável
INS International Numbering System (Sistema Internacional de
Numeração)
K
int
Constante de Intercalação
OMS Organização Mundial da Saúde
P
[DNA]
Concentração de grupos fosfatos de DNA
RNA Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico)
S
[DNA]
Concentração de sítios de intercalação de DNA
UV/Vis Ultra violeta / Visível
vi
RESUMO
Este trabalho versa sobre o processo de intercalação de dois tipos de corantes em
DNA, o Azul brilhante FCF, um corante alimentício e o Azul de Coomassie G-250, que
é habitualmente usado em ensaios bioquímicos. Dados obtidos através de ensaios de
espectrofotometria de absorção na região do UV/Vis e de infravermelho com relação ao
complexo formado entre o DNA/Azul Brilhante mostram uma efetiva interação entre o
Azul Brilhante FCF e o DNA, reforçando a possibilidade do corante estar intercalando
entre as bases do DNA, ocupando principalmente o sítio da guanina. Não foram
observadas alterações tão relevantes nas absorções com relação ao complexo formado
entre o DNA/ Azul de Coomassie. Podemos concluir que o Azul de Coomassie pode
estar se ligando através de interação eletrostática na superfície do DNA, ou seja, se
ligando aos grupos fosfatos.
vii
ABSTRACT
This work turns on the process of intercalation of two types of dyes in DNA, the
Brilliant Blue FCF, an food dye and the Coomassie Blue G-250, that is habitually used
in biochemists assays. Data gotten through assays of the spectroscopy of absorption in
the region of the UV/Vis and of infrared with regard to the complex formed between
DNA/ Brilliant Blue show an effective interaction between Brilliant Blue FCF and the
DNA, strengthening the possibility of the dye to be intercalating enter the bases of the
DNA, occupying mainly the site of guanine. So excellent alterations in the absorptions
with regard to the formed complex had not been observed enter the DNA/Coomassie
Blue. We can conclude that the Coomassie Blue G-250 can be binding through
electrostatic interaction in the surface of the DNA, that is, binding to the phosphate
groups.
_____________________________________________________________
1
Dissertação de Mestrado Introdução
INTRODUÇÃO
_____________________________________________________________
2
Dissertação de Mestrado Introdução
1- Introdução
Cada ser vivo que habita a Terra possui uma codificação diferente de instruções em
seu DNA “escritas” na mesma linguagem. Estas diferenças geram as diferenças
orgânicas entre os organismos vivos. A informação genética, armazenada nos
cromossomos e transmitida às células filhas através da replicação do DNA, é expressa
através da transcrição em RNAm (RNA mensageiro) e a tradução subseqüente em
cadeias polipeptídicas. Resumidamente, o código do DNA é transcrito para o RNA
mensageiro, que, então, deixa o núcleo para ser traduzido em proteínas. Vários fatores
afetam diretamente a expressão e/ou a estrutura do DNA, sendo que um dos agentes que
podem interagir com o polímero é o corante.
Estudos sobre a intercalação de corantes em DNA foram realizados mostrando que
essas substâncias intercalam entre seus pares de bases. Dados sobre a intercalação dos
corantes Eritrosina, Tartrazina, Vermelho – 40 e Amaranto em DNA, já foram obtidos
no laboratório Biossegurança e Bionorgânica da Profa. Sandra Terezinha de Farias
Furtado, Instituto de Química/UFU. Estes resultados comprovaram a intercalação dos
corantes citados e foram objetos de duas teses de mestrado (BARBOSA, 2002 e
GIACOMELLI, 2003).
_____________________________________________________________
3
Dissertação de Mestrado Introdução
1.1 - Objetivos
1.1.1 - Objetivo Geral
Verificar os efeitos dos corantes: Azul Brilhante-FCF e Azul de Coomassie
G-250 no DNA e as possíveis mudanças estruturais no polinucleotídeo, através de
métodos espectroscópicos.
1.1.2 – Objetivos Específicos
Estudar os efeitos dos corantes Azul brilhante FCF e Azul de Coomassie G-250 no
DNA. Estes estudos abrangem o coeficiente de extinção molar dos corantes e o
coeficiente de extinção molar do DNA; o efeito da variação do pH do meio dos
corantes; variação da concentração do DNA na intercalação com os corantes, testes
realizados na região do UV/Visível e precipitação do DNA com isopropanol e a
posterior análise espectrofotométrica na região do infravermelho.
_____________________________________________________________
4
Dissertação de Mestrado Introdução
1.2- ( DNA ) ácido desoxirribonucléico
Os nucleotídeos possuem uma variedade de papéis no metabolismo celular. Eles
são a moeda energética nas transições metabólicas, os elos químicos essenciais na
resposta das células aos hormônios e outros estímulos extra celulares, e os componentes
estruturais de uma coleção de co-fatores enzimáticos intermediários metabólicos. Eles
são os constituintes dos ácidos nucléicos: ácido desoxirribonucléico – DNA e ácido
ribonucléico – RNA. O DNA é a molécula repositória da informação genética e da
estrutura de cada proteína. Cada biomolécula de componente celular é um produto da
informação programada na seqüência nucleotídica dos ácidos nucléicos da célula. A
seqüência de aminoácidos de cada proteína em uma célula e a seqüência de cada
molécula de RNA é especificada pela seqüência do DNA da célula. Um segmento de
DNA que contém informações necessárias para síntese de um produto biológico
funcional, seja proteína ou RNA, é referido como um gene. A habilidade de armazenar e
transmitir informação genética de uma geração para a próxima é uma condição
fundamental para a vida (STRYER, 1996; LEHNINGER, 2002).
_____________________________________________________________
5
Dissertação de Mestrado Introdução
1.3 - Estrutura do DNA
O DNA é um polímero de unidades desoxirribonucleotídeas; um nucleotídeo
consiste numa base nitrogenada ligada a uma ose e a um ou mais grupamentos fosfatos.
A ose em um desoxirribonucleotídeo é a desoxirribose. O prefixo desoxi indica que
nesta ose falta um átomo de oxigênio que está presente na ribose, o composto original.
A base nitrogenada é um derivado de purina ou pirimidina. (STRYER, 1996).
A figura 1.1 ilustra as bases constituintes dos ácidos nucléicos; as bases
encontradas no DNA são as purinas; ( Adenina
(a) e Guanina (b) ) e as pirimidinas
( Timina
(c) e Citosina (d) ); no RNA a base Timina do DNA é substituída pela Uracila
(e). Em resumo para o DNA as bases são: adenina, guanina, citosina e timina e para o
RNA as bases são: adenina, guanina, citosina e uracila. A unidade monomérica que
representa o nucleotídeo (f) é formada pela pentose que se liga a uma das bases e, por
último, ao grupo fosfato.
A base de um nucleotídeo une-se covalentemente pelo N-1 das pirimidinas e
pelo N-9 das purinas por meio de uma ligação N–β-glicosídica, ao carbono-1’ da
pentose; o fosfato está esterificado ao carbono-5’(STRYER, 1996). Os nucleotídeos
sucessivos do DNA são ligados covalentemente por meio de “pontes” de grupos fosfato,
em que o grupo 5’–hidroxila de uma unidade nucleotídica une-se ao grupo 3’-hidroxila
do nucleotídeo seguinte por ma ligação fosfodiéster (figura 1.2). Todas as ligações
fosfodiéster possuem a mesma orientação ao longo da cadeia, conferindo a cada fita
linear do ácido nucléico uma polaridade especifica e distinta nas extremidades 5’ e 3’
( LEHNINGER et al., 2002).
_____________________________________________________________
6
Dissertação de Mestrado Introdução
N
N
NH
N
NH
2
N
NH
NH
N
NH
2
O
( a ) ( b )
NH
NH
O
O
CH
3
N
NH
NH
2
O
NH
NH
O
O
( c ) ( d ) ( e )
O
O
OH
OH
OH
O
P
( f )
Figura: 1.1-
As bases purinas; adenina(a), guanina(b), e as
bases pirimidinas; timina (c), citosina(d), uracila(e), nucleotídeo(f)
(ATKINS e
LORETTA 1997).
6
7
6 5 1
7
5
8
1
2
8
2
4
4
9
9 3
3
4
4
4
5
6
5
6
5
3
2
3
6
1
3
3
2
2
1 1
Base
5’
1’
4’
3’
2’
_____________________________________________________________
7
Dissertação de Mestrado Introdução
Figura: 1.2 - Ligação fosfodiéster no esqueleto covalente do DNA. A
extremidade 5’ da macromolécula não possui nucleotídeo na posição 5’
e a extremidade 3’ não possui nucleotídeo na posição 3’.
(
DEVLIN, 1997)
ligação N-β-gliosídica entre
desoxirribose e a base
Terminação 5’
ligação 3’-5’
fosfodiéster
ligação 3’-5’
fosfodiéster
ligação 3’-5’
fosfodiéster
Terminação 3’
_____________________________________________________________
8
Dissertação de Mestrado Introdução
1.4 - Dupla Hélice do DNA
A elucidação da dupla hélice do DNA estabelecida por Watson e Crick foi
baseada em importantes informações obtidas por outros pesquisadores relatados a
seguir. Nos últimos anos da década de 1940, Erwin Chargaff concluiu que as bases
adenina e timina (A
T) e guanina e citosina (G
C) estão presentes em quantidades
equimolares e a partir dessas relações segue-se que a soma dos resíduos das purinas
iguala-se à soma dos resíduos de pirimidina. A difração de raios-X em fibras de DNA
foi método usado por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins; eles descobriram um padrão
de difração de raios-X característico. A partir desse padrão deduziram que os polímeros
de DNA são helicoidais com duas periodicidades ao longo do seu eixo maior, uma de
3,4 Å e outra de 34 Å. O problema então era formular um modelo tridimensional da
molécula do DNA que poderia considerar não apenas os dados da difração de raios X,
mas também as equivalências de bases específicas (LEHNINGER, 2002). A estrutura
do sal de ácido desoxirribonucléico, (figura 1.3) foi proposta por Watson e Crick é
descrita em artigo na revista Nature em 1953.
“
Fizemos as suposições químicas usuais, ou seja, que cada cadeia consiste de
grupos fosfato diester que ligam resíduos de β-D-desoxirribofuranose com ligações 3’,
5’. As duas cadeias (mas não suas bases) estão ligadas por um par (díade) perpendicular
ao eixo da fibra. Ambas as cadeias seguem hélices que giram no sentido dextrógiro,
mas, por causa do par, as seqüências dos átomos nas duas cadeias vão em direções
opostas, isto é, as bases estão do lado de dentro da hélice e os fosfatos na parte
externa. o açúcar sendo aproximadamente perpendicular à base ligada. Há um resíduo
em cada cadeia a cada 3,4 Å na direção z. Fizemos a suposição de um ângulo de 36
o
entre resíduos adjacentes na mesma cadeia, de modo que a estrutura se repete depois
de 10 resíduos em cada cadeia, isto é, após 34 Å. A distância de um átomo de fósforo do
eixo do filamento é de 10 Å. Como os fosfatos estão na parte externa, cátions têm
acesso fácil a eles. A estrutura é aberta, e seu teor de água é bastante alto.
_____________________________________________________________
9
Dissertação de Mestrado Introdução
A característica nova da estrutura é a maneira pela qual as duas cadeias são mantidas
juntas pelas bases purina e pirimidina. Os planos das bases são perpendiculares ao eixo
do filamento. Elas estão unidas aos pares, sendo que uma única base de uma cadeia
está conectada, por ligação de hidrogênio, a uma única base da outra cadeia, de modo
que as duas jazem lado a lado com coordenadas z idênticas. Um dos pares deve ser uma
purina e o outro uma pirimidina para que a ligação possa ocorrer. As ligações de
hidrogênio são feitas como se segue: purina posição 1 para pirimidina posição 1; purina
posição 6 para pirimidina posição 6. Foi observado experimentalmente (Chargaff, Wyatt,
1952) que a razão entre as quantidades de adenina e timina, e a razão entre guanina e
citosina são sempre muito próximas da unidade para o ácido desoxirribonucléico. É
provavelmente impossível construir essa estrutura com um açúcar ribose no lugar da
desoxirribose, porque o átomo extra de oxigênio levaria a um contato de Van der Waals
muito próximo. Os dados de raios-X sobre o ácido desoxirribonucléico previamente
publicado (Atsbury, 1947; Wilkins e Randall, 1953) são insuficientes para um teste
rigoroso de nossa estrutura. Até onde podemos afirmar, ela é aproximadamente
compatível com os dados experimentais, mas isso deve ser considerado como não
comprovado até que tenha sido verificado com dados mais precisos. Não escapou à
nossa observação que o pareamento específico que postulamos sugere imediatamente
um possível mecanismo de cópia para o material genético” (WATSON e CRICK, 1953).
O DNA nativo consiste em duas cadeias antiparalelas num arranjo de duplas
hélices enroladas no sentido da mão direita, representado na figura 1.4. O pareamento
das bases complementares de cada fita se dá de maneira padronizada (A
T e
G
C), sendo que adenina forma duas ligações de hidrogênio com a timina e a
citosina forma três ligações com a guanina (VOET e VOET, 1990). A superfície do
DNA é composta por duas regiões distintas que se diferenciam pela geometria,
denominadas sulco maior e sulco menor, uma cavidade menor e a outra maior
(SCHABERLE, 2002).
_____________________________________________________________
10
Dissertação de Mestrado Introdução
Figura: 1.3 - Modelo diagramático
da dupla hélice do DNA
forma B
(VOET e VOET, 1990)
Figura: 1.4 - Pareamento das
Bases por ligações de
hidrogênio, fita dupla de DNA
(
CONN e STUMPF, 1980)
Sulco
Maior
Sulco
Menor
_____________________________________________________________
11
Dissertação de Mestrado Introdução
1.5 - Estruturas dinâmicas do DNA
O DNA é uma molécula estruturalmente dinâmica que pode existir em uma
variedade de formas helicoloidais: A-DNA, B-DNA e Z-DNA. A forma B-DNA é a
fisiológica mais encontrada, onde as interações com as bases nitrogenadas promovem a
formação da dupla hélice com rotação para a direita e das fendas menor e maior; seu
comprimento é de 34 Å e o diâmetro de aproximadamente 20 Å, com espaçamento entre
os pares de base de 3,4 Å, e 92% de grau de hidratação. A forma A-DNA é a isoforma
do DNA que está presente em meio com baixa concentração de água, apresentando
diâmetro de aproximadamente 26 Å e espaçamento entre os pares de base de 2,7 Å e
apresenta um grau de hidratação equivalente a 75%; nesta forma os pares de bases não
são perpendiculares ao eixo da hélice, mas inclinados de 20°, o passo ficando reduzido
para 28 Å com 11 pares por volta. A forma Z-DNA possui a rotação da hélice para a
esquerda, sendo bem diferente das outras duas isoformas (KRUGH, 1994;
BARICATTI, 1995; STRYER, 1996).
_____________________________________________________________
12
Dissertação de Mestrado Introdução
A-DNA B-DNA Z-DNA
Figura: 1.5 - Estruturas dinâmicas do DNA: A-DNA parcialmente
desidratado, hélice mais curta e larga; B-DNA sob condições
fisiológicas e Z-DNA com polímeros ricos em G:C, com purinas e
pirimidinas alternadas na mesma fita, hélice menos torcida com
movimento em zig-zag do esqueleto ose-fosfato.
(http://en.wikipedia.org/wiki/Image:A-B-Z-DNA_Side_View.png)
_____________________________________________________________
13
Dissertação de Mestrado Introdução
1.6 - Fenômeno da intercalação do DNA com algumas substâncias
Dentre as diversas substâncias com propriedade intercalantes no DNA,
ressaltam-se algumas, como: antibióticos, acridinas, cloroquina, brometo de etídeo,
iodeto de propídeo, antibióticos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, corantes, entre
outros (BARICATTI, 1995; ALMEIDA et al., 2005). A interação de alguns compostos
com o DNA depende de características como hidrofobicidade, carga e a estrutura
espacial (tamanho em particular). Os compostos hidrofóbicos ou anfifílicos, de tamanho
adequado, podem intercalar entre as bases nitrogenadas do DNA, ou, se possuem carga
positiva, podem se ligar através da interação eletrostática na superfície do DNA, onde
os grupos fosfatos têm carga negativa para esta região (KURODA e TANAKA, 1994).
Agentes intercalantes antineoplásicos têm como alvo principal a fenda menor do
B-DNA, por um mecanismo de ação que se baseia na intercalação nos pares de base
nitrogenada CG (citosina e guanina). A intercalação apresenta uma componente
eletrostática relacionada à interação do tipo π, existente entre os intercalantes e as bases
CG, além de complexos de transferência de elétrons. Devido a esta característica, os
intercalantes são constituídos por anéis aromáticos fundidos, apresentando alta
densidade eletrônica. Os antibióticos naturais tipos: antraciclina, como a doxorrubicina
e a daunorrubicina, como citado, também costumam ser classificadas como agentes
intercalantes. A presença de anéis aromáticos fundidos constituindo o arcabouço
molecular também permite observar outra característica relacionada ao mecanismo de
ação, que é o espaçamento das bases nitrogenadas do DNA. Os intercalantes interagem
com as bases nitrogenadas CG provocando um espaçamento devido ao volume
molecular, formando um ângulo de aproximadamente 90
o
em relação ao eixo do DNA
_____________________________________________________________
14
Dissertação de Mestrado Introdução
(ALMEIDA et al, 2005). A intercalação geralmente altera a estrutura do B-DNA, com o
aumento no espaçamento dos pares de base CG de 3,4 Å para cerca de 7 Å. É descrito
que o mecanismo de ação desta classe baseia-se na formação de um trímero constituído
pelo intercalante, DNA e topoisomerase II. Este trímero seria estabilizado e
interromperia a separação das bases nitrogenadas do DNA, necessária à transcrição
(para os ligantes na fenda menor também seria observada esta característica). Algumas
destas moléculas foram descritas como ativas, tendo como alvo biológico as
topoisomerases I e II, entretanto a correlação entre a intercalação e a interação com a
topoisomerase II ainda não foi definida, sendo objeto de diversos estudos recentes
(POOT e KILLER, 1995).
De acordo com estudos hidrodinâmicos e de difração de raios-X, Lerman (1961)
verificou as primeiras evidências sobre a intercalação em compostos derivados da
acridina. O difratograma indicou um aumento na separação entre os pares de base do
DNA. A intercalação ocorreu entre as bases adjacentes e foram observadas as seguintes
variações na estrutura do DNA: aumento do comprimento da dupla hélice, distorção da
cadeia açúcar – fosfato e deformação da estrutura helicoloidal, nas proximidades dos
sítios vizinhos de intercalação, tornando-os impróprios à intercalação.
Segundo Baricatti (1998) a intercalação destas substâncias com o DNA pode ser
acompanhada por métodos espectroscópicos: que fornecem informações sobre a
intensidade e a posição das bandas de absorção ou emissão. Em virtude do sistema
cromóforo do agente intercalante, suas propriedades espectrais são alteradas quando
interagem com o DNA. É evidenciado um aumento na absorção do DNA na região do
ultravioleta , no pico máximo de 260nm, característico do polímero, fato que justifica-
se pela diminuição ligações de hidrogênio, que coloca as bases mais expostas à luz.
_____________________________________________________________
15
Dissertação de Mestrado Introdução
1.6 - Corantes Alimentícios
Corantes são aditivos alimentares definidos como toda substância que confere,
intensifica ou restaura a cor de um alimento. Conforme Resolução da Comissão
Nacional de Normas e Padrões para Alimentos (CNNPA) nº 44/77(Apêndice B), aditivo
é qualquer ingrediente adicionado intencionalmente aos alimentos com o objetivo de
modificar suas características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais, sem o
propósito de nutrir. A manutenção da cor natural do alimento constitui-se em um fator
fundamental para o marketing do produto, (CONSTANT, STRINGHETA, SANDI,
2002).
Atualmente, tem-se manifestado uma consciência crescente em torno das
características possivelmente tóxicas de muitos corantes. Essa tendência reflete em
alguns países mediante o ajuste gradativo na sua utilização em produtos alimentares,
cosméticos e medicinais. Segundo Schvartsman (1982) o uso do corante Amaranto foi
proibido nos Estados Unidos e em outros países, devido a relatados de efeitos
carcinogênicos em testes com animais.
Antes de serem liberados para consumo, os corantes passam por uma análise de risco
por especialistas da Organização Mundial da Saúde (OMS) e da Organização para a
Alimentação e Agricultura (FAO), organismos da Organização das Nações Unidas
(ONU) que definem se podem ser usados nos alimentos, em que produtos podem ser
usados e suas quantidades. Também definem a chamada Ingestão Diária Aceitável (IDA),
ou seja, quanto pode ser ingerido por dia, por uma pessoa em relação ao seu peso, sem
que haja risco para a saúde. Apesar de terem a aprovação OMS/FAO, não significa que
alguns deles não possam trazer riscos à saúde para determinadas pessoas que
_____________________________________________________________
16
Dissertação de Mestrado Introdução
apresentem alguma doença ou sensibilidade no organismo. Portanto, no caso dos
aditivos, uma regra deve ser seguida: quanto menos, melhor.
No Brasil, em 28.01.87, a Divisão Nacional de Vigilância Sanitária de
Alimentos (DINAL/MS) pela Portaria Nº 17 (Apêndice B), proibiu a utilização dos
corantes sintéticos: Amarelo Ácido, Azul de Indatreno, Vermelho Sólido E, Escarlate
GN e Laranja GCN, fato que foi justificado pela ausência de informações toxicológicas
seguras, o que representava risco potencial a saúde pública.
No Brasil, a regulamentação
do uso de aditivos para alimentos, inclusive corantes, é realizada pela Agência Nacional
de Vigilância Sanitária (ANVISA). Pela legislação atual, através das resoluções nº 382 a
389/1999(Apêndice B) da ANVISA é permitido o uso de onze corantes artificiais,
que
são identificados por um Sistema Internacional de Numeração de Aditivos Alimentares,
“
International Numbering System”(INS) elaborado pelo Comitê do Codex; sendo eles:
Tartrazina(INS-102), Amarelo Crepúsculo (INS-110), Amaranto (INS-123), Ponceau
4R (INS-124), Eritrosina (INS-127), Vermelho 40 (INS-129), Azul Patente V(INS-131),
Indigotina (INS-132), Azul Brilhante (INS-133), Verde Rápido (INS-143) e Azorubina
(INS-122).
O controle de qualidade e/ou toxicológico dos corantes, com relação a sua
concentração nos alimentos é usualmente realizado por métodos cromatográficos ou
espectrofotométricos. No caso dos métodos cromatográficos, características como alto
custo e envolvimento de várias etapas de extração dificultam a obtenção de uma análise
rápida. Já os métodos espectrofotométricos, embora mais acessíveis, apresentam
limitada seletividade (KAPOR, et al., 2001). A literatura científica é farta em apontar
cuidados com a ingestão dos sintéticos e revela reações adversas que podem causar a
ingestão desses aditivos, como; alergias, disritmias cardíacas, problemas circulatórios,
_____________________________________________________________
17
Dissertação de Mestrado Introdução
gástricos e oftalmológicos, distúrbios da tiróide, câncer e mutações gênicas,
(ANTUNES e ARAÚJO, 2000). Os corantes presentes nos alimentos podem ter efeitos
mutagênicos e/ou carcinogênicos, isto é, podem induzir mutações no DNA e/ou podem
favorecer o desenvolvimento de tumores. Acredita-se que cerca de (l/3) um terço de
todos os cânceres humanos possam estar relacionados com o hábito alimentar (AMES,
1983; RENNER, 1990).
1.6.1 - Corante Azul Brilhante-FCF
O corante Azul Brilhante FCF é descrito como um sal dissódico com
nomenclatura oficial: Sal dissódico de etil [4-[etil(m-sulfobenzil)amino]-2,5-
ciclohexadieno–1-ilideno](m-sulfobenzil)Hidróxido de Amônio. O corante também é
conhecido por, Erioglaucina, Blue Acid 9, Food Blue Nº 1 (Japão). Tem a fórmula
molecular C
37
H
34
N
2
O
9
S
3
Na
2
, peso molecular 792,84 g/mol e C.I. (Color Index) 42090;
sua fórmula é representada na figura 1.6 (MAGA e TU , 1994). O azul brilhante FCF, é
um corante sintético derivado da classe do trifenilmetano, tem a aparência de um pó
avermelhado-azul; o lâmbda máximo da luz absorvida para o azul brilhante FCF
corresponde a 630nm, em solução aquosa; em pH ácidos ocorre uma variação
irrelevante deslocando para 629nm e em pH básicos não ocorre uma variação no
lâmbda máximo. Em todos os pH apresenta um pico na região entre 400nm a 410nm
(Committee Food Chemicals Codex, 1986).
O azul brilhante FCF é encontrado em bebidas, produtos de laticínio, doces em
geral, produtos de higiene pessoal, farmacêuticos e cosméticos, combinado com
eritrosina e/ou tartrazina. Tem a capacidade de induzir reações alérgicas, pode causar
_____________________________________________________________
18
Dissertação de Mestrado Introdução
hiperatividade em crianças, eczema e asma; recomenda-se a eliminação desse corante
na dieta das crianças (CALIL e AGUIAR, 1999).
Figura: 1.6 - Fórmula estrutural do Corante Azul Brilhante FCF
(MAGA e TU, 1994)
S O
3
-
B
C
N
CH
2
CH
2
CH
3
S
D
C
E
+
N
CH
CH
2
2
S
F
3
CH
O
3
O
N
a
3
N
a
_____________________________________________________________
19
Dissertação de Mestrado Introdução
1.7 Corantes para ensaios bioquímicos
Muitos métodos espectrofotométricos, ao longo dos anos, foram propostos para
a determinação de proteínas totais, mas não existe uma metodologia considerada de uso
universal para todos os meios. Os métodos geralmente mais utilizados são o do Biureto,
de Lowry, do “Coomassie brilliant blue” G-250 ou reagente de Bradford. O método de
Bradford é mais rápido e sensível que o de Lowry e é utilizado para a determinação de
proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro sangüíneo, saliva humana, produtos
alimentícios, leite humano, tecidos de plantas, entre outros (ZAIA, ZAIA, LICHTIG,
1998).
1.7.1 - Corante Azul de Coomassie G-250
O corante Azul de Coomassie G-250, C.I: 42655 apresenta peso molecular igual
a 854,04 g/mol e fórmula C
47
H
48
N
3
NaO
7
S
2
. A figura 1.7 representa sua fórmula
estrutural. É frequentemente utilizado em ensaios bioquímicos para identificar proteínas
no processo de eletroforese; é um dos regentes do método de Bradford (RAUF,
ASHRAF, ALHADRAMI, 2005).
O método de Bradford é uma técnica baseada na interação entre o corante e
macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou
aromáticas. A reação entre o corante/proteína provoca um deslocamento da solução
ácida do Azul de Coomassie G-250, das formas protonadas com um pico máximo de
465nm, para 595nm quando o corante se liga à proteína (BRADFORD, 1976; ZAIA,
ZAIA, LICHTIG, 1998). As interações hidrofóbicas e iônicas estabilizam a forma
_____________________________________________________________
20
Dissertação de Mestrado Introdução
iônica do corante, causando uma mudança visível da cor, ou seja, acentuando a
tonalidade azul causando uma mudança visível da cor, ou seja, acentuando a tonalidade
azul (CASSIANO, et al., 2002). Este corante também é usado em processos de
degradação fotocatalítica na presença de H
2
O
2
(RAUF, ASHRAF, ALHADRAMI,
2005).
Figura: 1.7 - Fórmula estrutural do Corante Azul de Coomassie
G-250
(RAUF, ASHRAF, ALHADRAMI, 2005)
SO
3
-
N
H
C
N
CH
2
CH
2
C H
3
CH
3
H
3
C
S
O
3
N
a
+
N
CH
2
CH
2
CH
3
S
F
O
3
-
E
B
C
C'
D
CH
3
C H
2
O
B' A'
A
_____________________________________________________________
21
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
PARTE
EXPERIMENTAL
_____________________________________________________________
22
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
2 - Parte Experimental
2.1 – Materiais
Os reagentes utilizados foram: DNA de timo de bezerro (Calf Tymus) – Sigma
Chemical; corante Azul Brilhante/ FCF – Sigma Aldrich , PM: 792,8 g/mol; corante
Azul de Coomassie G-250- Sigma Chemical,, PM: 854 g/mol; HCl-Vetec - 32%;
NaOH – Vetec-PA; KBr–Vetec PA; álcool Isopropanol–Synth PA; NaCl – Vetec PA;
peneiras Moleculares. Todas as soluções foram preparadas com água desionizada.
2.2 – Equipamentos
Os equipamentos utlizados foram: espectrofotômetro UV / VISÍVEL – Hach;
Balança analítica - Ohaus; micro balança Sartorius M2P; pHmetro – EPL 358;
desionizador – Milli – Q Plus – Milipore; Epectrômetro IV 1000 FT–IR Paragon 1000
da Perkin Elmer; micropipetas automáticas.
2.3 - Preparo das soluções
2. 3.1 - Solução estoque de DNA
Foi transferido 4,3 mg de DNA para um balão volumétrico de 25 mL e
adicionou-se água desionizada e resfriada até completar o volume do balão, para obter
uma solução 172 µg.mL
-1
. O balão foi agitado lentamente até não mais observar-se
resíduos do DNA e haver completa homogeneização. Para garantir a homogeneização
_____________________________________________________________
23
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
da solução, esta foi monitorada, fazendo leituras das absorções na região do ultravioleta
(λ
max
de 260 nm) de amostras coletadas na superfície e no fundo do balão, até que as
absorções fossem as mesmas. A solução foi envolvida em papel alumínio e mantida na
geladeira durante todos os procedimentos.
2.3.2 - Soluções estoque dos corantes Azul Brilhante-FCF e Azul
Coomassie G-250
As soluções estoque de cada corante foram preparadas pesando 39,64 mg do
corante Azul Brilhante
e 42,70 mg do corante Azul de Coomassie. As massas foram
quantitativamente transferidas para os balões volumétricos de 100 mL e o volume
completado com água desionizada . A concentração final de ambos os corantes foi de
5 x 10
-4
mol.L
-1
.
2.3.3- Soluções para curvas de calibração
2.3.3.1-
Curva de Calibração do DNA
Para a construção da curva de calibração do DNA foram preparadas, por diluição
da solução estoque, as soluções nas seguintes concentrações: 5 ; 10 ; 20 ; 40 e
60µg.mL
-1
. Em seguida, as leituras de absorção em 260 nm (figura 3.1, pág. 31) foram
registradas e traçada a curva de calibração com as concentrações: 2,27; 2,81; 4,66;
5,1 e 9,9x10
-5
mol.L
-1
(figura 3.4, pág. 34).
_____________________________________________________________
24
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
2.3.3.2-
Curva de Calibração do corante Azul Brilhante-FCF
As soluções diluídas para o corante azul brilhante-FCF foram preparadas da
mesma forma que no item 2.3.3.1, nas seguintes concentrações: 4; 5; 6; 7;
8 x 10
-6
mol.L
-1
. As leituras de absorção λ
max
do corante (630 nm) (figura 3.2,
pág. 32) foram registradas e traçada a curva de calibração (figura 3.5, pág. 35).
2.3.3.3 - Curva de Calibração do corante Azul de Coomassie
Soluções diluídas da solução estoque do corante azul de coomassie foram
preparadas com água desionizada, nas seguintes concentrações: 1; 1,5; 2 ; 2,5;
3 x 10
-6
mol.L
-1
. Foram registradas as leituras de absorção no λ
max
do corante (601 nm)
e em (260 nm) outro pico característico do corante (figuras 3.3, pág. 33) e traçada a
curva de calibração (figura 3.6, pág. 36).
2.3.4 - Soluções para estudos sobre variação de pH do meio dos
corantes Azul Brilhante e Azul de Coomassie
Preparou-se inicialmente 25 mL de cinco soluções de cada corante, a partir da
solução estoque, com concentração final de 4 x 10
-6
mol.L
-1
e pH 1, 3 , 7 , 9 e 12.
Foram preparadas sete soluções de cada corante com concentração final igual a
4 x 10
-5
mol.L
-1
e pH de 0,72 a 13,33, as soluções mais concentradas tiveram a
finalidade de se observar a variação dos picos característicos dos corantes. As soluções
_____________________________________________________________
25
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
ácidas de pH 0,72 a 3 foram preparadas completando-se o volume do balão volumétrico
com HCl 1 x 10
-1
, 1 x 10
-2
e 1 x 10
-3
mol.L
-1
, respectivamente. As soluções básicas
com pH 7,95 a 13,33 foram preparadas completando-se o balão com NaOH 1 x 10
-6
,
1 x 10
-5
e
1x 10
-2
mol.L
-1
. As soluções de HCl e NaOH foram preparadas com água
desionizada. A solução neutra de pH 7 foi obtida completando-se o volume do balão
apenas com água desionizada , os valores de pH foram controlados com o pHmetro –
EPL 358.
2.3.5- Soluções para estudos sobre a intercalação
2.3.5.1- Soluções para estudos sobre a intercalação do Azul Brilhante em
DNA
A partir das soluções estoques de DNA e do corante foram preparadas várias
soluções do sistema DNA / Azul Brilhante usando o seguinte procedimento:
a-
Fixando a concentração de corante Azul Brilhante
Foram adicionados volumes constantes da solução estoque do corante, em
frascos de ependorf de 1,5 mL. A cada um destes frascos adicionou-se
concentrações variadas do DNA, completando-se o volume de 1,5 mL, com água
desionizada, os dados sobre as concentrações obtidas encontram-se na Tabela 1.
_____________________________________________________________
26
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
b - Fixando a concentração de DNA
Foram adicionados volumes constantes da solução estoque do DNA em frascos
ependorf de 1,5 mL. A cada um destes frascos adicionaram-se concentrações
variadas do corante. O volume para 1,5 mL foi completado com água desionizada.
Os dados sobre os volumes adicionados e concentrações respectivas, encontram-se
na Tabela 2.
Tabela-1 Valores das concentrações do Azul Brilhante e DNA
( DNA variável e AZB fixo )
Solução estoque
[DNA]= 24 µg.mL
-1
3,42.10
-5
mol.L
-1
Solução estoque
[AZB] 1.10
-4
mol.L
-1
Volume (mL)
[DNA] na
Mistura /
mol.L
-1
Volume (mL)
[AZB] na
Mistura /
mol.L
-1
0,0 0 0,1 6,66 x 10
-6
0,1 0,228 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,2 0,456 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,3 0,684 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,4 0,912 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,5 1,140 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,6 1,368 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,7 1,596 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,8 1,824 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,9 2,052 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
_____________________________________________________________
27
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
Tabela -2 Valores das concentrações de DNA e do Azul Brilhante
( DNA fixo e AZB variável )
Solução estoque
[DNA] = 24 µg.mL
2.3.5.2 - Soluções para estudos sobre a intercalação do Azul de Coomassie
em DNA
Os procedimentos para os estudos sobre a intercalação do Azul de Coomassie e
DNA foram realizados como no item 2.3.5.1 a e b, trocando-se o corante Azul Brilhante
por Azul de Coomassie. Os dados obtidos com as concentrações fixas do corante Azul
de Coomassie e os dados obtidos com as concentrações fixas do DNA encontram-se nas
Tabelas 3 e 4 respectivamente.
-1
3,42.10
-5
mol.L
-1
Solução estoque
[AZB] /
1.10
-4
mol.L
-1
Volume (mL)
[DNA] na
Mistura /
mol.L
-1
Volume (mL)
[AZB] na
Mistura /
mol.L
-1
1,0 2,28 x 10
-5
0 0
1,0 2,28 x 10
-5
0,04 2,66 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,06 4,00 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,08 5,33 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,10 6,66 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,12 8,00 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,14 9,33 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,16 10,60 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,18 12,00 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,20 13,33 x 10
-6
_____________________________________________________________
28
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
Tabela-3 Valores das concentrações do Azul de Coomassie e de DNA
( DNA variável e AZC fixo )
Tabela-4 Valores das concentrações de DNA e Azul de Coomassie
( DNA fixo e AZC variável )
Solução estoque
[DNA]= 24 µg.mL
-1
3,42.10
-5
mol.L
-1
Solução estoque
[AZB] 1.10
-4
mol.L
-1
Volume (mL)
[DNA] na
Mistura /
mol.L
-1
Volume (mL)
[AZB] na
Mistura /
mol.L
-1
0,0 0 0,1 6,66 x 10
-6
0,1 0,228 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,2 0,456 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,3 0,684 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,4 0,912 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,5 1,140 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,6 1,368 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,7 1,596 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,8 1,824 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
0,9 2,052 x 10
-5
0,1 6,66 x 10
-6
Solução estoque
[DNA] = 24 µg.mL
-1
3,42.10
-5
mol.L
-1
Solução estoque
[AZB] 1.10
-4
mol.L
-1
Volume (mL)
[DNA] na
Mistura /
mol.L
-1
Volume (mL)
[AZB] na
Mistura /
mol.L
-1
1,0 2,28 x 10
-5
0 0
1,0 2,28 x 10
-5
0,04 2,66 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,06 4,00 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,08 5,33 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,10 6,66 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,12 8,00 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,14 9,33 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,16 10,60 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,18 12,00 x 10
-6
1,0 2,28 x 10
-5
0,20 13,33 x 10
-6
_____________________________________________________________
29
Dissertação de Mestrado Parte Experimental
2.3.6 - Precipitação do DNA puro para estudos no Infravermelho
Preparou-se 25 mL de uma solução aquosa de DNA de concentração
464 µg.mL
-1
. Desta solução foram retiradas alíquotas de 5 mL e à elas adicionou-se 0,5
mL da solução 0,1mol.L
-1
de cloreto de sódio (NaCl). A esta solução foi adicionado
5mL do álcool isopropanol (C
3
H
8
O) e homogeneizou-se até a formação do precipitado.
Lavou-se o pelete do DNA com o referido álcool e o mesmo foi colocado em um vidro
de relógio, coberto por papel alumínio, e posto na geladeira. Deixou-se secar lentamente
por uma semana. Após o período de secagem registraram-se os espectros de absorção no
infravermelho.
2.3.7 - Precipitação do DNA com os corantes para estudos no
Infravermelho
Retirou-se 5 mL da solução de DNA preparada no item 2.3.6, adicionou-se
1 mL das soluções aquosas dos corantes Azul Brilhante e Azul de Coomassie,
respectivamente, com concentração 5.10
-4
mol.L
-1
. Em seguida adicionou-se 0,5 mL
cloreto de sódio (NaCl) às soluções. Para a precipitação do DNA com os corantes,
utilizou-se o procedimento para precipitar o DNA da solução sem os corantes. Os
espectros de absorção no infravermelho foram registrados, após o período de secagem.
______________________________________________________________
30
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO
______________________________________________________________
31
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
3 - Resultados e Discussão
3.1 - Espectros de UV/Visível das soluções
As figuras 3.1, 3.2 e 3.3 A e B mostram os espectros de absorção na região do
UV/Visível, das soluções de DNA, Azul Brilhante-FCF e Azul de Coomassie,
respectivamente.
Figura: 3.1 - Espectro de absorção de DNA 3,42x 10
-5
mol.L
-1
/
24
µg.mL
-1
em solução aquosa pH = 7
______________________________________________________________
32
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.2- Espectro de absorção do corante Azul Brilhante-FCF
4x10
-6
mol.L
-1
em solução aquosa pH = 7
______________________________________________________________
33
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figuras: 3.3 - Espectros de absorção do corante Azul de Coomassie
G-250, 2,5x10
-6
mol.L
-1
em solução aquosa pH = 7; (A):
λ
max
601 nm e (B): λ
max
260 nm
A
B
______________________________________________________________
34
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
3.2 - Curvas de Calibração
Nas figuras 3.4, 3.5 e 3.6 encontram-se as curvas de calibração do DNA, Azul
Brilhante-FCF e Azul de Coomassie G-250, respectivamente.
Figura: 3.4- Curva de calibração do DNA ( λ
max
260 nm ) em
solução aquosa, nas concentrações: 2,27; 2,81; 4,66; 5,1 e
9,9x10
-5
mol.L
-1
01234567891011
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
y = 0,06608.x
R
2
= 1
Absorbância
[DNA] / 10
-5
mol.L
-1
______________________________________________________________
35
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.5- Curva de calibração do corante Azul Brilhante
(λ
max
630nm) em solução aquosa nas concentrações: 4; 5; 6;
7; e 8x10
-6
mol.L
-1
012345678
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
Y = 0,06482.x
R
2
= 0,99405
Absorbância
[Azul Brilhante] / 10
-6
mol.L
-1
______________________________________________________________
36
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.6- Curva de calibração do corante Azul de Coomassie
(λ
max
602 nm) em solução aquosa, nas concentrações: 1; 1,5;
2; 2,5 e 3x10
-6
mol.L
-1
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
y = 0,0338.x
R
2
= 0,99365
Absorbância
[Azul de Coomassie] / 10
-6
mol.L
-1
______________________________________________________________
37
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
As discussões a seguir referem-se à técnica espectroscópica de absorção no
UV/Visível. O coeficiente de extinção molar (ε) encontrado para o DNA é 6.608 mol
-1
.
L.cm
-1
, como mostra a figura 3.4, com coeficiente de regressão(R) de 1,0000. Este
valor foi calculado pela inclinação da curva de calibração e expressa em termos de
concentração molar, dos grupos fosfatos do ácido nucléico (BARICATTI, 1998). O
valor experimental do coeficiente de extinção molar do DNA está muito próximo do
valor de ε em soluções aquosas de DNA da literatura que é de 6.600 mol
-1
L.
cm
-1
(KUBISTA, AKERMAN, NORDÉN, 1987; KURE, SANO, HARADA,
YASUNAGA, 1988). A figura 3.5 mostra a curva de calibração do corante Azul
Brilhante e o coeficiente de extinção molar (ε) experimental é de 64.820 mol.
-1
.L.cm
-1
,
com coeficiente de regressão linear (R) de 0,99751. Segundo a curva de calibração
ilustrada na figura 3.6, o coeficiente de extinção molar (ε) do corante Azul de Coomassie
tem o valor de 33.800 mol
-1
L.cm
-1
e coeficiente de regressão linear (R) de 0,99365.
Para se verificar a pureza, quanto a proteínas, e a integridade do DNA
estabeleceu-se uma relação entre A
260
/A
280
( 0,226 / 0,121 ). Esta relação representa a
razão entre a absorbância do DNA no seu comprimento de onda característico (260 nm)
e o valor do comprimento de onda característico da presença de proteínas (280 nm). O
valor obtido foi de 1,87, estando dentro dos valores considerados na literatura (1,8-2,0) e
sendo aceito em estudos sobre intercalação entre compostos químicos e DNA
(VORLÍČKOVÁ, KYPR , SKLENÁŘV, 2005).
______________________________________________________________
38
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
3.3 - Estudos sobre variação de pH do meio dos corantes
3.3.1 - Comportamento do Corante Azul Brilhante em meio ácido e
básico
No estudo feito sobre o comportamento do corante Azul Brilhante sob a
influência da acidez do meio (figura 3.7), observou-se que os espectros de absorção
(λ
max
630 nm) do corante azul brilhante FCF não sofreu nenhuma alteração em relação
variação do pH (
HEINS e FLURY, 2000). Traçou-se o gráfico do comprimento de
onda máximo do corante (630 nm) em função do pH (figura 3.8) e verifica-se que o
corante manteve-se na forma monoprotonada, independente do meio ser ácido, básico ou
neutro. Portanto, os estudos com a intercalação do corante Azul Brilhante-FCF em DNA
foram realizados em pH 7, ou seja pH fisiológico, considerando-se que o corante está na
forma monoprotonada.
______________________________________________________________
39
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.7- Comportamento do corante Azul Brilhante-FCF
4x10
-5
mol.L
-1
em função do pH. pH 1,32;
pH 2,41; pH 3,62; pH 7,64 ;
pH 7,95; pH 8,79 ; pH 13,33
240 280 320 360 400 440 480 520 560 600 640 680 720 760 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
ABSORBÂNCIA
COMPRIMENTO DE ONDA/nm
______________________________________________________________
40
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.8- Comprimento de onda máximo corante Azul Brilhante-
FCF (λ
max
630nm), 4x10
-6
mol.L
-1
em função do pH , : 1, 3, 7,
9, 12.
024681012
560
580
600
620
640
660
680
700
λ
máx
do Azul Brilhante
pH
______________________________________________________________
41
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
3.3.2 - Comportamento do Corante Azul de Coomassie em
meio ácido e básico
No estudo feito sobre o comportamento do corante Azul de Coomassie sob a
influência da acidez do meio, observou-se a presença de dois picos: em pH 0,72 (λ
máx
460 nm e 651 nm) e pH 1,6 (λ
máx
440 nm e λ
máx
630 nm). Entre os pH 2,55 e 12,55, o
corante apresentou um único lâmbda máximo com o valor entre 590nm a 610nm; estes
dados estão registrados na figura 3.9. Observa-se, portanto, não apenas o deslocamento
do pico na região de 600 nm, mas o desaparecimento do pico 460 nm presente em meio
muito ácido. Este comportamento sugere a presença de espécie triprotonada em pH 0,72,
espécie diprotonada na região do pH 1,60, espécie monoprotonada na região de pH 6,0 e
neutra em pH 12,55. Segundo a molécula do corante Azul de Coomassie (figura 1.7) em
meio muito ácido (pH 0,72) é possível que as regiões A', B' , C' estejam protonadas; em
pH 1,60 estão protonadas as regiões A' e B'; na região de pH 6,0 está protonada a região
A' e em pH básico, não existe protonação. É provável que o corante, em meio básico,
esteja deslocando o equilíbrio da água, captando hidroxila, uma vez que o pH da solução
inicial em 13,80 foi deslocado para 12,55. Considerou-se que a espécie do corante
trabalhada com o DNA, em pH neutro foi a monoprotonada.
______________________________________________________________
42
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.9- Comportamento do corante Azul de Coomassie
4x10
-5
mol.L
-1
em função do pH, pH 0,72;
pH 1,6 ; pH 2,55 ; pH 5,80;
pH 6,10; pH 6,55; pH 12,55
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
0,00
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
Absorbância
Comprimento de Onda / nm
______________________________________________________________
43
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
3.4 - Estudos sobre Intercalação
3.4.1 - Estudos sobre a intercalação do Azul Brilhante em DNA
Para a discussão destes resultados, foi considerado como concentração
adicionada, aquela obtida pelos cálculos estequiométricos, considerando-se o volume
pipetado e adicionado no ependorf, de volume 1,5 mL. Foi considerado como
concentração efetiva, a obtida pelos valores de absorbância registrados nos espectros
UV/Visível.
Pelo Quadro 1 e figura 3.10 e figura 3.11, observa-se que à medida que aumenta
a concentração de DNA na mistura, diminui a concentração de corante livre na solução,
indicando que os sítios de intercalação aumentam com o aumento da concentração do
DNA, ou seja, aumenta a possibilidade de intercalação do corante quando a
concentração do DNA é aumentada (ANIKOVSKY, TATIKOLOV, KUZMIN, 1999). A
figura 3.10, demonstra a relação inversamente proporcional entre o aumento da
concentração de DNA, que está relacionada com o aumento dos sítios de intercalação, e
a concentração livre de corante na mistura.
No Quadro 1, na coluna referente ao número de pares de bases intercaladas R,
observa-se a relação entre os sítios de intercalação (S
DNA
) e a concentração livre do
corante Azul brilhante na mistura. O número de bases intercaladas aumenta com o
aumento de sítios do DNA disponíveis para a intercalação, indicando que ainda há
corante no meio reacional para ser intercalado (corante não esgotado).
______________________________________________________________
44
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
QUADRO 1 : Estudos sobre intercalação variando a concentração do
DNA fixando a concentração do corante Azul Brilhante-FCF
A concentração dos íons fosfatos [ P
DNA
] foi obtido pelas absorbâncias na região do
UV/Visível no lâmbda máximo característico (260nm) nas soluções aquosas de DNA,
(BARICATTI, 1998) obedecendo a equação de Lambert-Beer, onde a concentração da
espécie absorvente é proporcional à sua absorbância ( A ) segundo a relação:
A = ε.b.c
A é a absorbância do DNA com o valor igual a 0,226 para [DNA] de 24 µg.mL
-1
ε é a absortividade molar do DNA, sendo igual a 6.600 mol
-1
L.cm
-1
b é o caminho óptico com o valor de 1cm
c é a concentração da espécie em mol L
-1
Variação da concentração do DNA em função da concentração do Corante Azul
Brilhante-FCF na mistura VA (volume adicionado / mL ) e [AZB] e [P
DNA
] / mol.L
-1
VA
AZB/
mL
[AZB]
adicionada
na mistura
[AZB] livre
na mistura
VA
DNA /
mL
[ P
DNA
] teórica
na mistura
[ P
DNA
] efetiva
na mistura
Sítios de
Intercalação
(S
DNA
)
R ( Nº
pares de
bases
intercaladas)
0,1 6,66 x 10
-6
7,41 x 10
-6
0,0 0 0 0 0
0,1 6,66 x 10
-6
6,93 x 10
-6
0,1 0,228 x 10
-5
1,29 x 10
-5
0,64 x 10
-5
0,93
0,1 6,66 x 10
-6
6,72 x 10
-6
0,2 0,456 x 10
-5
1,50 x 10
-5
0,75 x 10
-5
1,11
0,1 6,66 x 10
-6
6,66 x 10
-6
0,3 0,684 x 10
-5
1,81 x 10
-5
0,90 x 10
-5
1,35
0,1 6,66 x 10
-6
6,46 x 10
-6
0,4 0,912 x 10
-5
1,97 x 10
-5
0,98 x 10
-5
1,52
0,1 6,66 x 10
-6
6,26 x 10
-6
0,5 1,140 x 10
-5
2,12 x 10
-5
1,06 x 10
-5
1,69
0,1 6,66 x 10
-6
5,37 x 10
-6
0,6 1,368 x 10
-5
2,21 x 10
-5
1,11 x 10
-5
2,07
0,1 6,66 x 10
-6
4,44 x 10
-6
0,7 1,596 x 10
-5
2,64 x 10
-5
1,32 x 10
-5
2,97
0,1 6,66 x 10
-6
3,96 x 10
-6
0,8 1,824 x 10
-5
2,89 x 10
-5
1,45 x 10
-5
3,65
0,1 6,66 x 10
-6
3,39 x 10
-6
0,9 2,052 x 10
-5
3,12 x 10
-5
1,56 x 10
-5
4,60
______________________________________________________________
45
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Portanto a concentração da solução estoque do DNA usada para os cálculos de
intercalação com o corante Azul Brilhante é:
[P
DNA
] = 3,42 x10
-5
mol.L
-1
Cálculos para concentração dos Sítios de intercalação [S
DNA
]
[S
DNA
] = [P
DNA
] / 2 ( a cada dois grupos fosfatos corresponde um sítio de intercalação )
Cálculos para o valor de R ( número de pares de bases por molécula de
intercalador )
R = [S
DNA
] / [ Corante livre na mistura ]
Cálculos para o valor da [ Corante AZB livre na mistura ]
De acordo com a equação da Lambert-Beer:
A = ε.b.c
A é a absorbância do corante AZB com o valor igual a 0,480 (λ
max
630nm)
ε é a absortividade molar do corante , sendo igual a de 64.820 mol.
-1
.L.cm
-1
b é o caminho óptico com o valor de 1cm
c é a concentração da espécie em mol L
-1
O valor abaixo corresponde a primeira concentração do corante relacionada no
Quadro 1. As demais concentrações do corante são calculadas da mesma forma.
[ Corante AZB livre na mistura ] = 7,41 x 10
-6
x 10 mol.L
-1
______________________________________________________________
46
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.10 - Variação da concentração do DNA em função da
concentração livre de corante Azul Brilhante, na mistura
3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Variação da Concentração efetiva do
DNA / 10
-5 -1
Concentração efetiva do corante
Azul Brilhante / 10
-6
mol.L
-1
mol.L
______________________________________________________________
47
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.11- Espectros de absorção das soluções contendo DNA e
corante Azul brilhante [AZB] = 6,66x10
-6
mol.L
-1
e [P
DNA
] =
0,00; 1,29; 1,50; 1,81;
1,97; 2,12; 2,21; 2,64;
2,89; 3,12 x10 mol.L
-5 -1
240 320 400 480 560 640 720 800
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
ABSORBÂNCIA
COMPRIMENTO DE ONDA (630nm e 260nm)
______________________________________________________________
48
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Pelo Quadro 2 e gráficos 3.12 e 3.13, observa-se que à medida em que aumenta a
concentração do corante Azul Brilhante, mantendo-se fixa a concentração adicionada de
DNA, atinge-se a saturação dos sítios de intercalação do DNA, numa concentração do
corante adicionado de 8,00x10
-6
mol.L
-1
. A concentração efetiva do corante neste ponto é
8,75x10
-6
mol.L
-1
, devido ao efeito hipercrômico do mesmo. Este efeito hipercrômico do
corante indica a formação de um complexo de transferência de carga na intercalação
corante/DNA (MONTANARI, MONTANARI,
VELOSO, BEEZER, MITCHELL,
1998; ALMEIDA, LEITÃO, REINA, MONTANARI, DONNICI, LOPES, 2005). A
relação [P
DNA
]/[corante] para atingir a saturação é 4,16, ou seja, a concentração do
corante precisa ser 4,16 vezes maior que a concentração do DNA para saturar os seus
sítios de intercalação.
______________________________________________________________
49
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
QUADRO 2 : Estudos sobre intercalação variando a concentração do
corante Azul Brilhante-FCF fixando a concentração do DNA
Variação da concentração do Corante Azul Brilhante-FCF em função da concentração do
DNA na mistura VA (volume adicionado / mL ) e [AZB] e [P
DNA
] / mol.L
-1
VA
DNA/
mL
[P
DNA
]
adicionada
na mistura
[P
DNA
]
efetiva na
mistura
V.A.
AZB/
mL
[AZB]
teórica na
mistura
Efeito
hipercrômico
do AZB na
mistura
Sítios de
Intercalação
(S
DNA
)
R ( nº pares
de bases
intercaladas
)
1,0 2,28 x 10
-5
2,32 x 10
-5
0 0 0 0 0
1,0 2,28 x 10
-5
2,42 x 10
-5
0,04 2,66 x 10
-6
3,32 x 10
-6
1,21 x 10
-5
4,54
1,0 2,28 x 10
-5
2,80 x 10
-5
0,06 4,00 x 10
-6
4,97 x 10
-6
1,40 x 10
-5
3,50
1,0 2,28 x 10
-5
2,86 x 10
-5
0,08 5,33 x 10
-6
6,29 x 10
-6
1,43 x 10
-5
2,68
1,0 2,28 x 10
-5
2,97 x 10
-5
0,10 6,66 x 10
-6
7,43 x 10
-6
1,48 x 10
-5
2,22
1,0 2,28 x 10
-5
3,33 x 10
-5
0,12 8,00 x 10
-6
8,75 x 10
-6
1,66 x 10
-5
2,07
1,0 2,28 x 10
-5
3,33 x 10
-5
0,14 9,33 x 10
-6
9,27 x 10
-6
1,66 x 10
-5
1,78
1,0 2,28 x 10
-5
3,30 x 10
-5
0,16 10,60 x 10
-6
9,67 x 10
-6
1,65 x 10
-5
1,56
1,0 2,28 x 10
-5
3,33 x 10
-5
0,18 12,00 x 10
-6
10,35 x 10
-6
1,66 x 10
-5
1,38
1,0 2,28 x 10
-5
3,23 x 10
-5
0,20 13,33 x 10
-6
10,44 x 10
-6
1,61 x 10
-5
1,21
______________________________________________________________
50
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.12- Variação da concentração adicionada do corante Azul
Brilhante em função da concentração do DNA, na mistura.
02468101214
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
Concentração efetiva de
DNA / 10
-5
mol.L
-1
Concentração adicionada do corante
Azul Brilhante / 10
-6
mol.L
-1
______________________________________________________________
51
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.13- Variação do efeito hipercrômico do corante Azul
Brilhante em função da concentração do DNA, na mistura
024681012
2,2
2,4
2,6
2,8
3,0
3,2
3,4
Concentração efetiva de
DNA / 10
-5
mol.L
-1
Efeito hipercrômico do corante
Azul Brilhante / 10
-6
mol.L
-1
______________________________________________________________
52
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Fazendo-se uma analogia com o gráfico obtido para a cinética enzimática de
Michaelis-Menten, observa-se que as figuras 3.12 e 3.13 apresentam o mesmo aspecto,
atingindo um nível de saturação. Baseado nesta analogia, fêz-se o gráfico duplo
recíproco para variação da concentração adicionada do corante Azul Brilhante em
função da concentração efetiva do DNA (Quadro 3 e figura 3.14). Encontrou-se o valor
de β (intersecção com o eixo y) de 2,68 mol.L
-1
e que pode corresponder à concentração
do corante que reduz os sítios de DNA para metade de seu valor inicial. O valor -0,21
(interseção com o eixo x) corresponde à negativa da constante de intercalação K
int
do
corante no DNA, ou seja, a K
int
para o corante azul brilhante é 0,21 (FURTADO, 1982).
int
int
DNAbrilhanteazulcoranteDNA
K
⎯⎯→⎯+
______________________________________________________________
53
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
QUADRO 3: Duplo recíproco variação da concentração do Azul
Brilhante fixando a concentração do DNA
1 / [DNA] EFETIVA mol.L
-1
com o corante 1/ [Azul
Brilhante] (adicionada) na mistura mol.L
-1
[DNA] EFETIVA mol.L
1
na mistura
com Azul Brilhante
[Azul Brilhante] (adicionada) na
mistura mol.L
-1
4,31 x 10
4
∞
4,13 x 10
4
3,76 x 10
5
3,57 x 10
4
2,50 x 10
5
3,49 x 10
4
1,88 x 10
5
3,36 x 10
4
1,50 x 10
5
3,00 x 10
4
1,25 x 10
5
3,00 x 10
4
1,07 x 10
5
3,03 x 10
4
0,94 x 10
5
3,00 x 10
4
0,83 x 10
5
3,09 x 10
4
0,75 x 10
5
______________________________________________________________
54
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.14- Duplo-recíproco da variação da concentração adicionada
do corante Azul Brilhante em função da concentração efetiva
do DNA.
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 3,6 4,0
2,7
3,0
3,3
3,6
3,9
4,2
1 / concentração efetiva
do DNA / 10
-5
mol.L
-1
1 / concentração do corante Azul
Brilhante / 10
-6
mol.L
-1
K
int
para o AZB = 0,21
β (intersecção com o
eixo y) de 2,68 mol.L
-1
______________________________________________________________
55
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
3.4.2 - Estudos sobre a intercalação do Azul de Coomassie em DNA
Para estas discussões foi considerado como concentração efetiva, a obtida pelos
valores de absorbância registrados nos espectros UV/Visível e foi considerado como
concentração adicionada, aquela obtida pelos cálculos estequiométricos, considerando-se
o volume pipetado e adicionado no ependorf, de volume 1,5 mL.
Pelo quadro 4 e figuras 3.15 e 3.16 observa-se um comportamento semelhante
ao corante Azul Brilhante, ou seja, à medida que a aumenta a concentração de DNA na
mistura diminui a concentração de corante livre. Foi observado que a quantidade de
grupos fosfatos no DNA que absorvem é menor na mistura do DNA com o corante Azul
de Coomassie em relação a mistura do DNA com o corante Azul Brilhante.
Conseqüentemente, o numero de sítios de intercalação foi menor, assim como os valores
de R. Este resultado pode indicar que o corante Azul de Coomassie não está
intercalando, mas ligando-se na superfície externa do DNA. Na coluna referente ao
número de pares de bases intercaladas R (Quadro 4), observou-se a relação entre os
sítios de intercalação (S
DNA
) e a concentração livre do corante Azul de Coomassie na
mistura (BARICATTI, 1998). Os resultados indicam que o número de bases que
poderiam ser intercaladas aumenta com o aumento de sítios do DNA disponíveis para a
intercalação, indicando que ainda há corante livre no meio reacional (corante não
esgotado). É provável que o corante Azul de Coomassie, ao se ligar na superfície externa
do DNA, torna os sítios de intercalação indisponíveis, o que explica os valores
encontrados de R.
______________________________________________________________
56
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Os espectros do corante Azul de Coomassie em solução aquosa registraram um
pico em 260nm. Para os cálculos da concentração do P
DNA
(grupos fosfatos) dados
mostrados no Quadro 4, fez-se a subtração da absorbância registrada no pico em 260nm
do corante em solução aquosa, cujo o valor registrado foi de 0,05, das absorbâncias
referentes à mistura DNA/Corante.
QUADRO 4:
Estudos sobre intercalação variando a concentração do
DNA fixando a concentração do corante Azul de Coomassie
Variação da concentração do DNA em função da concentração do Corante Azul de
Coomassie na mistura VA (volume adicionado / mL ) e [AZC] e [P
DNA
] / mol.L
-1
VA
AZC/
mL
[AZC]
adicionada
na mistura
[AZC] livre
na mistura
λ
max
602nm
VA
DNA/
mL
[P
DNA
] teórica
na mistura
[P
DNA
]
efetiva
na mistura
Sítios de
Intercalação
(S
DNA
)
R ( Nº
pares de
bases
intercaladas)
0,1 6,66 x 10
-6
4,55 x 10
-6
0,0 0 0 0 0
0,1 6,66 x 10
-6
4,46 x 10
-6
0,1 0,228 x 10
-5
0,33 x 10
-5
0,16 x 10
-5
0,35
0,1 6,66 x 10
-6
4,29 x 10
-6
0,2 0,456 x 10
-5
0,54 x 10
-5
0,27 x 10
-5
0,63
0,1 6,66 x 10
-6
4,11 x 10
-6
0,3 0,684 x 10
-5
0,68 x 10
-5
0,34 x 10
-5
0,83
0,1 6,66 x 10
-6
4,00 x 10
-6
0,4 0,912 x 10
-5
1,04 x 10
-5
0,52 x 10
-5
1,30
0,1 6,66 x 10
-6
3,90 x 10
-6
0,5 1,140 x 10
-5
1,35 x 10
-5
0,67 x 10
-5
1,72
0,1 6,66 x 10
-6
3,87 x 10
-6
0,6 1,368 x 10
-5
1,65 x 10
-5
0,82 x 10
-5
2,11
0,1 6,66 x 10
-6
3,80 x 10
-6
0,7 1,596 x 10
-5
1,77 x 10
-5
0,89 x 10
-5
2,34
0,1 6,66 x 10
-6
3,70 x 10
-6
0,8 1,824 x 10
-5
1,93 x 10
-5
0,96 x 10
-5
2,60
0,1 6,66 x 10
-6
3,55 x 10
-6
0,9 2,052 x 10
-5
2,12 x 10
-5
1,06 x 10
-5
2,98
______________________________________________________________
57
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
A concentração dos íons fosfatos [P
DNA
] , os cálculos da concentração da solução
estoque do DNA usada para a intercalação com o corante Azul de Coomassie, a
concentração dos sítios de intercalação [S
DNA
] e o cálculo para o R ( número de pares
de bases por molécula de intercalador ) são idênticos aos citados no item 3.4.1.
Cálculos para o valor da [ Corante AZC livre na mistura ]
De acordo com a equação da Lambert-Beer:
A = ε.b.c
A é a absorbância do corante AZC com o valor igual a 0,154 (λ
max
602nm) .
ε é a absortividade molar do corante , sendo igual a de 33.800 mol
-1
L.cm
-1
.
b é o caminho óptico com o valor de 1cm
c é a concentração da espécie em mol L
-1
O valor abaixo corresponde a primeira concentração do corante relacionada no
Quadro 4. As demais concentrações do corante são calculadas da mesma forma.
[ Corante AZC livre na mistura ] = 4,55 x 10
-6
x 10 mol.L
-1
______________________________________________________________
58
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.15- Variação da concentração do DNA em função da
concentração livre de corante Azul de Coomassie (602 nm) na
mistura
3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
Variação da Concentração efetiva do
DNA / 10
-5
mol.L
-1
Concentração efetiva do corante
Azul de Coomassie / 10
-6
mol.L
-1
______________________________________________________________
59
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.16-
Espectros de absorção das soluções contendo DNA e
corante Azul de Coomassie [AZC] = 6,66x10
-6
mol.L
-1
e
[P
DNA
]= 0,0; 0,33; 0,54; 0,68
1,04; 1,35; 1,65;
1,77;
1,93; 2,12x10 mol.L
-5 -1
0,00
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
ABSORBÂNCIA
COMPRIMENTO DE ONDA ( 260nm 602nm)
______________________________________________________________
60
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
De acordo com o Quadro 5 e figura 3.17, constatou-se que a partir da sexta
amostra da mistura DNA/Azul de Coomassie, obteve-se a saturação, ou seja, a
capacidade de intercalação se esgotou, por mais que se adicione corante não há mais
sítios disponíveis para intercalação, sendo atingido a saturação dos sítios de intercalação
do DNA, numa concentração do corante adicionado de 8,00x10
-6
mol.L
-1
e de
concentração do corante efetiva de 4,23x10
-6
mol.L
-1
, quando se considera o efeito
hipocrômico do mesmo. A relação [P
DNA
]/[corante] para atingir a saturação é 3,25, ou
seja, a concentração do corante precisa ser 3,25 vezes maior que a concentração do DNA
para tornar os seus sítios de intercalação indisponíveis.
Observou-se também um efeito hipocrômico, figura 3.18, do corante livre na
mistura, quando comparado com a concentração do corante adicionado. Este efeito
reflete a diminuição da concentração do corante Azul de Coomassie livre para absorver e
que deve estar ligada nos grupos fosfatos do DNA. Como visto na seção 3.4.1 o efeito
do corante Azul Brilhante foi correspondente a formação de uma complexo de
transferência de carga, enquanto que no coomassie este tipo de complexo não deve ser
formado.
O DNA tem um efeito hipercrômico com os dois corantes o Azul Brilhante e
Azul de Coomassie, semelhante ao comportamento do DNA com o corante acridina. O
corante acridina tem um efeito hipocrômico semelhante ao corante Azul de Coomassie
que se refere a interação de empilhamento entre a acridina e as nucleobases; Adenina e
Timina. O anel acridina numa simples fita pode estar empilhado em todas as
nucleobases, numa conformação mais favorável porque a estrutura da simples fita é mais
flexível (FUKUI K, 1996).
______________________________________________________________
61
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
QUADRO 5: Estudos sobre intercalação variando a concentração do
corante Azul de Coomassie fixando a concentração do DNA
Variação da concentração do Corante Azul de Coomassie em função da concentração do DNA, na
mistura VA (volume adicionado / mL ) e [Azul de Coomassie ] e [P
DNA
] / mol.L
-1
VA
DNA/
mL
[P
DNA
]
adicionada
na mistura
[P
DNA
]
efetiva na
mistura
VA
AZC/
mL
[AZC ] teórica
na mistura
Efeito
hipocrômico do
AZC na mistura
λ
max
602nm
Sítios de
Intercalação
(S
DNA
)
R ( Nº
pares de
bases
intercaladas)
1,0 2,28x 10
-5
2,32 x 10
-5
0 0 0 0 0
1,0 2,28 x 10
-5
2,53 x 10
-5
0,04 2,66 x 10
-6
0,80x 10
-6
1,26 x 10
-5
4,73
1,0 2,28 x 10
-5
2,57 x 10
-5
0,06 4,00 x 10
-6
1,48 x 10
-6
1,29 x 10
-5
3,22
1,0 2,28 x 10
-5
2,60 x 10
-5
0,08 5,33 x 10
-6
2,36 x 10
-6
1,30 x 10
-5
2,43
1,0 2,28x 10
-5
2,62 x 10
-5
0,10 6,66 x 10
-6
2,99 x 10
-6
1,32 x 10
-5
1,98
1,0 2,28 x 10
-5
2,60 x 10
-5
0,12 8,00 x 10
-6
4,23 x 10
-6
1,31 x 10
-5
1,63
1,0 2,28 x 10
-5
2,62 x 10
-5
0,14 9,33 x 10
-6
5,09 x 10
-6
1,32 x 10
-5
1,41
1,0 2,28 x 10
-5
2,60 x 10
-5
0,16 10,60 x 10
-6
5,41 x 10
-6
1,31 x 10
-5
1,23
1,0 2,28 x 10
-5
2,59 x 10
-5
0,18 12,00 x 10
-6
5,77 x 10
-6
1,30 x 10
-5
1,08
1,0 2,28 x 10
-5
2,59 x 10
-5
0,20 13,33 x 10
-6
5,83x 10
-6
1,30 x 10
-5
0,97
______________________________________________________________
62
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.17- Variação da concentração adicionada do corante Azul
de Coomassie em função da concentração do DNA, na
mistura.
02468101214
2,30
2,35
2,40
2,45
2,50
2,55
2,60
2,65
2,70
Concentração efetiva de
DNA / 10
-5
mol.L
-1
Concentração adicionada do corante
Azul de Coomassie / 10
-6
mol.L
-1
______________________________________________________________
63
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.18- Variação do efeito hipocrômico do corante Azul de
Coomassie em função da concentração do DNA, na mistura.
0123456
2,30
2,35
2,40
2,45
2,50
2,55
2,60
2,65
2,70
Concentração efetiva de
DNA / 10
-5
mol.L
-1
Efeito hipocrômico do corante
Azul de Coomassie / 10
-6
mol.L
-1
______________________________________________________________
64
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Observando-se que as figuras 3.17 e 3.18 apresentaram o mesmo aspecto,
atingindo um nível de saturação, da mesma forma como com o corante Azul Brilhante,
fez-se uma analogia com o gráfico obtido para a cinética enzimática de Michaelis-
Menten,. Baseado nesta analogia traçou-se o gráfico duplo recíproco para variação da
concentração adicionada do corante Azul de Coomassie em função da concentração
efetiva do DNA (Quadro 6 e figura 3.19). Encontrou-se o valor de β de 3,81mol.L
-1
que
pode corresponder à concentração do corante que reduz os sítios de DNA para metade de
seu valor inicial. O valor -0,38 (interseção com o eixo x) corresponde à negativa da
constante de intercalação
K
int
do corante no DNA, ou seja, a K
int
para o corante Azul de
Coomassie é 0,38 (FURTADO, 1982).
int
int
DNAcoomassiedeazulcoranteDNA
K
⎯⎯→⎯+
______________________________________________________________
65
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
QUADRO 6: Duplo recíproco variação da concentração do Azul
de Coomassie fixando a concentração do DNA
1 / [DNA] EFETIVA mol.L
-1
com o corante [Azul de
Coomassie ] (adicionada) na mistura mol.L
-1
[DNA] EFETIVA mol.L
-1
na mistura
com Azul de Coomassie
[Azul de Coomassie] (adicionada)
na mistura mol.L
-1
4,31 x 10
4
∞
3,95 x 10
4
3,76 x 10
5
3,89 x 10
4
2,50 x 10
5
3,85 x 10
4
1,88 x 10
5
3,83 x 10
4
1,50 x 10
5
3,85 x 10
4
1,25 x 10
5
3,83 x 10
4
1,07 x 10
5
3,85 x 10
4
0,94 x 10
5
3,86 x 10
4
0,83 x 10
5
3,86 x 10
4
0,75 x 10
5
______________________________________________________________
66
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3
omassie em função da
concentração efetiva do DNA.
.19- Duplo-recíproco da variação da concentração
adicionada do corante Azul Co
-0,38 0,00 0,38 0,76 1,14 1,52 1,90 2,28 2,66 3,04 3,42 3,80 4,18
3,78
3,81
3,84
3,87
3,90
3,93
3,96
1 / concentração efetiva
do DNA / 10
-5
mol.L
-1
1 / concentração do corante Azul de
Coomassie / 10
-6
mol.L
-1
K
in
t
p
ara o AZB = 0
,
38
β (intersecção com o eixo
y) de 3,81 mol.L
-1
______________________________________________________________
67
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
A análise espectrofotométrica na
As discussões a seguir referem-se a técnica espectroscópica de absorção na
região infra-vermelha. Considerando que a metodologia para a precipitação do DNA
utilizou álcool isopropílico, fez-se necessário comparar o espectro IV do DNA puro (não
precipitado) com o DNA precipitado com álcool isopropílico.
A atribuição das bandas para o DNA foi realizada segundo Andrushchenko e
Hackl (1997) e Dyer (1969). Os espectros do DNA, com corante e sem corante, foram
obtidos após tratamento com álcool isopropílico, exceto o espectro do DNA
puro
que foi
obtido com o DNA sem qualquer tratamento. Considerando que a metodologia para a
precipitação do DNA utilizou álcool isopropílico, fez-se necessário comparar o espectro
IV(infravermelho) do DNA puro (não precipitado - DNA
puro
) com o DNA precipitado
com álcool isopropílico (DNA
prec
). Os espectros na região infravermelho do DNA
puro
,
DNA
prec
, DNA
AZB
e DNA
AZC
encontram-se nas figuras 3.20, 3.21, 3.22 e 3.23
respectivamente. Observou-se um alargamento na forma das bandas do DNA
prec
na
região de absorção do grupo OH, entre 3430 e 3450 cm
-1
, em relação ao DNA
puro
. Este
alargamento foi atribuído à maior exposição dos grupos OH, em decorrência da
mudança conformacional do DNA, causada pela presença do álcool isopropanol. As
bandas de vibração assimétricas (1297,03 cm
-1
) e simétricas (um ombro - 1095,70 cm
-1
)
atribuídas aos grupos PO
2-
no DNA
puro
foram deslocadas para 1238,19 e 1091,01 cm
-1
no DNA
prec
, com considerável aumento na absorção, indicando maior exposição dos
grupos fosfatos para absorção. Andrushchenko e Hackl (1997) atribuíram a banda da
ribose em 1053 cm
-1
; neste artigo, a banda da ribose no DNA
puro
é atribuída em 1079,74
3.5 - Alterações na estrutura do DN
região do Infravermelho (IV)
______________________________________________________________
68
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
cm
-1
. A banda atribuída ao P=O alifático da ribose, também sofre variações no seu
formato. Esta banda da ribose, no DNA
puro
, foi deslocada para 1051,79 (um ombro) no
DNA
prec
. Este fato reforça que o álcool isopropanol causa uma alteração na conformação
do DNA, deixando os grupos fosfatos e ribose mais expostos para absorver. Atribui-se
que o DNA
puro
encontra-se na forma B e que o DNA
prec
encontra-se na forma A, sendo
esta mudança atribuída ao tratamento com o álcool isopropílico. Em função das
modificações que o álcool isopropílico causa no DNA quando da sua precipitação com o
mesmo, as comparações dos espectros IV do DNA com os corantes serão feitas,
principalmente, em relação ao DNA
prec
e DNA
puro
.
Quando se compara o espectro do DNA
puro
, DNA
prec
e DNA com o corante Azul
Brilhante (DNA
AZB
) , observa-se um alargamento da banda na região de 3.400 cm
-1
para
o DNA
AZB
(3.427,69 cm
-1
para DNA
puro
, 3.433,80 cm
-1
para DNA
prec
e 3.428,57 cm
-1
para DNA
AZB
). Da mesma forma como discutido para DNA
prec
, houve uma mudança na
conformação do DNA; é provável que o DNA
AZB
encontra-se na forma A, uma vez que
apresenta um alargamento semelhante a banda do DNA
prec
, característico da forma A. A
região entre 890 cm
-1
e 550 cm
-1
do DNA
AZB
apresenta modificações tanto com relação
ao DNA
puro
quanto em relação ao DNA
prec
. As bandas em 836,72 cm
-1
DNA
puro
e 832,75
cm
-1
DNA
pre
, atribuídas a ligação NH (DYER, 1969) passam a ser um ombro
em 829,9 cm
-1
no espectro IV do DNA
AZB
, indicativo de que o corante ligou-se nas
bases do DNA. A banda em 1089,10 para DNA
AZB
apresenta um alargamento e um
ligeiramente deslocamento (comparada com a banda em 1091,01 do DNA
prec
) e a banda
em 1233,57 está deslocada e ligeiramente mais larga, em relação ao DNA
puro
. Este
alargamento da banda em 1233,57 para DNA
AZB
indica uma sobreposição das bandas
dos grupos PO
2-
e da banda da ribose, um ombro em 1062,79 que atribuímos à banda da
c
______________________________________________________________
69
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
ribose, deslocado em relação ao DNA
prec
. Estes dados indicam maior exposição dos
grupos PO
2-
e ribose, em relação ao DNA
prec
e maior interação do corante Azul Brilhante
com o DNA. A banda em 832,75 cm
-1
DNA
prec
atribuída NH das bases, é deslocada para
826,75 no DNA
AZB
; atribuímos este deslocamento à intercalação do corante Azul
brilhante nas bases do DNA.
Os espectros do DNA
prec
e do DNA com o corante Azul de Coomassie (DNA
AZ
)
apresentam muitas semelhanças, principalmente na região entre 890 cm
-1
e 550 cm
-1
,
região de absorção das bases do DNA. As bandas atribuídas a ligação NH das bases
apresentam o mesmo valor, 832,75; esta observação indica que este corante não
intercala entre as bases do DNA. As bandas atribuídas aos grupos fosfatos no DNA
prec
foram deslocadas para 1234,09 e 1089,47 no DNA
AZC
, mas apresentam o mesmo valor
que DNA
AZB
. O ombro em 1060,94, atribuído à ribose no DNA
AZC
, é um valor bem
próximo do atribuído ao corante Azul Brilhante. Estes resultados indicam que, embora o
corante Azul de Coomassie não intercale nas bases do DNA, ele interage nos grupos
fosfatos e ribose; esta ligação pode ser a interação eletrostática na superfície do DNA,
onde os grupos fosfatos têm carga negativa para esta região, citada por Kuroda e Tanaka,
(1994). Estes resultados obtidos com os corantes Azul Brilhante e Azul de Coomassie
são corroborados pelos estudos em nosso laboratório utilizando a técnica ultravioleta-
visível (a ser publicado). O corante Azul de Coomassie não intercala nas bases do DNA,
provavelmente, devido a dois fatores: a) aos grupos CH
3
ligados aos carbonos 1’ dos
anéis aromáticos aqui designados como C e E (figura 1.7); estes grupos devem estar
causando um impedimento estérico; b) a presença do anel aromático assinalado como
A no corante Azul de Coomassie e ausente no Azul Brilhante (figura 1.6).
C
______________________________________________________________
70
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
igura: 3.20- Espectro de absorção do IR do DNA
P
Espectro de absorção do IR do DNA
puro
F
Figura: 3.20-
______________________________________________________________
71
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
igura: 3.21- Espectro de absorção do IR do DNA
precipitado
com álcool
isopropanol
F
______________________________________________________________
72
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
igura: 3.22- Espectro de absorção do IR do DNA/Azu
Figura: 3.22- Espectro de absorção do IR do DNA precipitado/AZB
F l Brilhante
829,9
______________________________________________________________
73
Dissertação de Mestrado Resultados e Discussão
Figura: 3.23- Espectro de absorção do IR do DNA
precipitado/AZC
_____________________________________________________________
74
Dissertação de Mestrado Conclusão
CONCLUSÃO
_____________________________________________________________
75
Dissertação de Mestrado Conclusão
4 – Conclusão
Estudos preliminares constataram o valor do coeficiente de extinção molar para
o DNA, o qual foi coerente com a literatura. Encontrou-se também os coeficientes de
extinção molar dos corantes para calcular a concentração dos corantes livres na mistura.
Após a variação do pH do meio dos corantes, o estudo da intercalação foi feito em pH
neutro (fisiológico) e os corantes se apresentaram na forma monoprotonada. A
precipitação do DNA com álcool isopropanol induziu a mudança conformacional do
DNA da forma B (DNA
puro
) para a forma A (DNA
prec.
).
Os resultados deste trabalho indicam que o corante alimentício Azul Brilhante
FCF, pode intercalar entre as bases do DNA. Esta intercalação pode ser observada pelas
mudanças nos espectros de absorção na região do UV-Vis, considerando o lâmbda
máximo do corante Azul Brilhante e do DNA. Os resultados observados nos espectros
de absorção na região UV-Vis foram confirmados nos espectros do infravermelho do
complexo DNA/Azul Brilhante, onde se constatou uma alteração nas bandas do espectro
na região característica das ligações N-H das bases do DNA.
Com relação à interação do corante Azul de Coomassie G-250, verificou-se que
este corante se ligou na superfície do polímero de DNA, mais propriamente nos grupos
fosfatos, conforme dados obtidos na região UV-Vis e infravermelho. Os testes feitos na
região do infravermelho do complexo DNA/Azul de Coomassie, não registraram
alteração na região das bases do DNA, bandas características das ligações N-H.
Conclui-se, portanto, que o corante azul brilhante pode estar intercalando nas
bases do DNA, enquanto que o Azul de Coomassie pode estar interagindo na superfície
do DNA.
_____________________________________________________________
76
Dissertação de Mestrado Trabalhos Futuros
TRABALHOS
FUTUROS
_____________________________________________________________
77
Dissertação de Mestrado Trabalhos Futuros
5 - Trabalhos Futuros
Para elucidar a estrutura formada no complexo DNA-AZB / DNA-AZC e
considerando as propostas dos membros da banca do exame de qualificação sugerimos
para a continuidade deste trabalhado os estudos a seguir:
1.
Estudo sobre a estrutura do DNA envolvendo difração de Raios-X
( XANES e EXAFS ) sendo indicados para explicações mais detalhadas
quanto a forma como os corantes interagem com o DNA.
2.
Estudo da força iônica para verificar a possível formação de dímeros dos
corantes na superfície externa do DNA e as características eletrostáticas da
interação.
3.
Estudos de Corantes de Antocianina na intercalação com DNA, verificar a
estabilidade do DNA, comparar com os dados obtidos do corante Azul
brilhante e propor a substituição do corante sintético pelas Antocianinas.
4.
Estudos sobre a viabilidade da aplicação desses corantes na terapia
fotodinâmica.
5.
Verificar a intercalação dos corantes em DNA bacteriano e teste com a ação
da DNase sobre DNA .
6.
Verificar a ação dos corantes numa cultura celular para observar a
modificação no empacotamento cromossômico.
_____________________________________________________________
78
Dissertação de Mestrado Apêndice
APÊNDICE
_____________________________________________________________
79
Dissertação de Mestrado Apêndice
6.1 - Apêndice (A)
6.1.1 - Métodos de análise
6.1.1.1 – Espectrometria
A espectrometria é o processo analítico-instrumental baseado nas propriedades
de absorção, emissão e reflexão de energia eletromagnética em região específica do
espectro (PAVIA, 1996; SILVERSTEIN, 1987). Uma das propriedades mais
importantes da luz é a dualidade de sua natureza: a luz pode ser tratada como matéria e
como onda. A emissão e absorção da energia radiante podem ser quantizadas (fóton),
esta propriedade é importante para explicar como a radiação eletromagnética que
interage com a matéria. A energia de cada fóton é proporcional à freqüência da radiação
e é dada pela seguinte relação:
E = hν
(1)
E = energia do fóton (unidade é ergs molécula
-1
)
ν = freqüência em ciclos por segundo (unidade é o Hz=1 c.p.s.)
h = constante de Planck (6,626 x 10
-27
erg’s)
A luz também tem natureza ondulatória e possui certa freqüência (ν) uma onda
que também pode ser descrita por se comprimento de onda λ, definido como a distância
entre dois picos da onda. A relação entre a freqüência e o comprimento de onda é dado
por:
ν = c / λ (2)
ν = freqüência em ciclos por segundo (unidade é o Hz=1 c.p.s)
c = velocidade de propagação da onda no vácuo (essencialmente igual à velocidade de
propagação da luz, 2,998x10
10
cm s
-1
)
λ = comprimento de onda (unidade é o cm)
_____________________________________________________________
80
Dissertação de Mestrado Apêndice
O espectro eletromagnético pode ser desmembrado em várias partes de acordo com a
energia do fóton e do seu efeito sobre a estrutura da matéria. A figura 6.1 representa o
diagrama esquemático do espectro eletromagnético.
Figura: 6.1 - Diagrama esquemático do espectro eletromagnético
(http://www.geog.ufpr.br/disciplinas/espectro1.doc)
6.1.1.2 - Ultravioleta e Visível
Medidas de absorção baseadas em radiação ultravioleta e visível encontram
vasta aplicação para identificação e determinação de uma miríade de espécie
inorgânicas e orgânicas. Os métodos de absorção molecular talvez, sejam os mais
amplamente usados dentre todas as técnicas de análise quantitativa em laboratórios
químicos e clínicos em todo o mundo. A espectroscopia absorção UV-Visível
compreende a região do espectro eletromagnético de comprimentos de onda entre
_____________________________________________________________
81
Dissertação de Mestrado Apêndice
200nm a 800nm As intensidades das bandas são expressas como transmitância (T) ou
absorbância (A). A transmitância é a razão entre a energia radiante transmitida por uma
amostra e a energia radiante que nela incide. A absorbância é o logaritmo, na base 10,
do recíproco da transmitância, isto é, A=log
10
(1/T) (SILVERSTEIN, 1979).
O método utilizado para determinar de um modo quantitativo a concentração de
substâncias em solução que absorvem radiação, é usando a
Lei de Beer-Lambert. A
tradução matemática desta lei implica a definição dos parâmetros: a Absorbância (A) e a
Transmitância (T). A percentagem de radiação que atravessa uma solução homogênea é
designada por transmitância (Equação 3) e apresenta unidades (%). Contudo, os
resultados espectrofotométricos são expressos geralmente em absorbância (Equação 4)
que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância. Este parâmetro é desprovido
de unidades e apresenta sobre a transmitância a vantagem de variar linearmente com a
concentração das amostras desde que se trabalhe em condições que não tenham outros
fatores interferindo na absorção das moléculas, segundo a lei de Beer-Lambert
(VOGEL, 1992). Estas expressões, extremamente úteis do ponto de vista prático,
deixam em aberto a relação entre radiação absorvida e concentração, que foi
condensada na expressão de Beer-Lambert (Equação 5)( SILVERSTEIN, 1979; e
SKOOG, 2002) .
T = I (3)
I
0
Onde T é a transmitância, I
0
é a luz incidente na amostra, I é a luz que atravessou
a amostra.
Log 10
I = kcb = A (4)
I
0
_____________________________________________________________
82
Dissertação de Mestrado Apêndice
Onde:
k = a constante característica do soluto
c = concentração do soluto
b = comprimento da cubeta
A = absorbância
= absortividade molar
A = bc (5)
A absorção de radiação ultravioleta ou visível por uma espécie atômica ou
molecular M pode ser considerada um processo de duas etapas, a primeira das quais
envolve excitação eletrônica, como mostrada pela equação (SKOOG, 2002).
M + hv
Æ
M*
O produto da reação entre M e o fóton hv é uma espécie excitada
eletronicamente, simbolizada por M*. O tempo de vida da espécie excitada é breve
(10
-8
a 10
-9
s), sendo sua existência terminada por um dos vários processos de
relaxação. O tipo mais comum de relaxação envolve conversão da energia da excitação
em calor, isto é,
M* Æ M + calor
A absorção de radiação ultravioleta ou visível geralmente resulta da excitação de
elétrons de ligação; como conseqüência, os comprimentos de onda dos picos de
absorção podem ser correlacionados com os tipos de ligações nas espécies em estudo. A
espectroscopia de absorção molecular, portanto, valiosa para identificar grupos
funcionais em uma molécula. Mais importantes, no entanto, são as aplicações da
_____________________________________________________________
83
Dissertação de Mestrado Apêndice
espectroscopia de absorção ultravioleta e visível na determinação quantitativa de
compostos contendo grupos absorventes. A maioria dos compostos que absorvem na
região do Ultravioleta-Visível, possuem um ou mais grupos insaturados na sua
estrutura, estes grupos são caracterizados por seus elétrons π, facilmente deslocados,
isto é, exigem menos energia para se promoverem (SKOOG, 2002).
Para esta discussão, é útil reconhecer três tipos de transições eletrônicas e
categorizar as espécies nessa base. Essas três transições envolvem: elétrons π, σ e n;
elétrons de f e transferência de carga. A absorção de radiação visível e de ultravioleta de
maior comprimento de onda está restrita a um número limitado de grupos funcionais
(chamados cromóforos) que contém elétrons de valência com energias de excitação
relativamente baixas (SKOOG, 2002).
A figura 6.2 mostra os níveis de energias dos tipos de orbitais moleculares que
diferem significativamente. Quase sempre o nível de energia de um elétron não-ligante
situa-se entre os níveis de energia dos orbitais σ e π ligantes e antiligantes. As
transmissões eletrônicas entre certos níveis de energia podem ocorrer por absorção de
radiação. Quatro tipos de transmissões dão possíveis: σ Æ σ*, nÆ σ*, n Æπ* e π Æ π*
(SKOOG,2002).
Transições: σ Æ σ*: em relação a outras transições possíveis, a energia
necessária para induzir uma transição σ Æσ* é alta, correspondendo à freqüência na
região ultravioleta de vácuo.
Transições n Æ σ* : essas transições requerem menor energia que o tipo
σ Æ
σ* e podem ser produzidas por radiação na região entre 150 e 250 nm, com a maior
parte dos picos aparecendo abaixo de 200 nm.
_____________________________________________________________
84
Dissertação de Mestrado Apêndice
Transições n Æ π* e π Æ π* : A maioria das aplicações da espectroscopia de
absorção, a composição orgânicos está baseada em transições de elétrons n e π para o
estado excitado π*, porque as energias necessárias para essas processos situam-se em
uma região espectral experimentalmente conveniente (200nm a 700 nm) (VOGEL, 1992
e SKOOG,2002). Ambas as transições requerem a presença de um grupo funcional
insaturado para fornecer os orbitais π. Precisamente, é a estes centros de absorção
insaturados que o termo cromóforo se aplica.
Figura: 6.2 – Níveis de Energia eletrônica molecular (Skoog, 2002)
Termos frequentemente utilizados na discussão de espectros
eletrônicos:
CROMÓFORO: grupo insaturado covalente, responsável pela absorção eletrônica (por
exemplo: C=C, C=O, ou NO
2
).
AUXÓCROMO: grupo saturado que, quando ligado a um cromóforo altera tanto o
comprimento de onda com a intensidade de absorção (exemplo: OH, NH
2
e Cl).
Antiligante
Não-ligante
ligante
ligante
σ Æ σ*
π Æ π*
π Æ σ*
n Æπ *
π
*
n
π
σ
σ
*
Antiligante
ener
g
ia
_____________________________________________________________
85
Dissertação de Mestrado Apêndice
DESLOCAMENTO BATOCRÔMICO: É o deslocamento de uma absorção para um
comprimento de onda maior devido a efeitos de substituição ou dissolvente (isto é,
deslocamento para a região do vermelho).
DESLOCAMENTO HIPSOCRÔMICO: É um deslocamento de uma absorção para um
comprimento de onda menor devido a efeitos de substituição ou de solvente, isto é, um
deslocamento para a região do azul.
EFEITO HIPERCRÔMICO: É um aumento da intensidade de absorção.
EFEITO HIPOCRÔMICO: É uma diminuição na quantidade de absorção.
6.1.1.3 - Infravermelho
O espectro no infravermelho fornece um rico agregado de bandas de absorção, a
espectrometria de infravermelho mede a transição entre estados vibracionais que
ocorrem quando uma molécula absorve energia na região do infravermelho do espectro
eletromagnético. Os diferentes grupos funcionais e os seus tipos de ligações têm
freqüências e intensidades de absorção distintas no infravermelho.
Tanto o comprimento de onda (µ) como número de onda (cm
-1
) são usados para
medir a posição de uma determinada absorção de infravermelho. A espectroscopia de
infravermelho (IV) compreende a região do espectro eletromagnético de comprimentos
de onda se estendem de 2,5 a 15µ (4000 a 667 cm
-1
); a região entre 0,8 a 2,5µ (12,500 a
4,000 cm
-1
) é chamada infravermelho próximo e a região de 15 a 200mµ (667 a 50cm
-1
)
é chamada infravermelho afastado. Como no caso da espectroscopia ultravioleta
absorções que ocorrem em comprimentos de onda menores (maior freqüência) são as de
maior energia. (MILMAN, 2006; SKOOG, 2002). O número de ondas é diretamente
_____________________________________________________________
86
Dissertação de Mestrado Apêndice
proporcional a energia absorvida (K = E/hc) é o comprimento de onda inversamente
proporcional a energia absorvida (λ = hc/E); (λ = 1/k).
Absorções de energia desta magnitude provocam perturbações nas freqüências
específicas das diferentes ligações químicas. Ou seja, a freqüência de cada ligação
corresponde a um nível vibracional e depende da superfície de energia potencial da
molécula, da geometria molecular, das massas dos átomos e eventualmente do
acoplamento vibrônico (MILMAN, 2006; SKOOG, 2002).
A partir de 1980 a técnica de infravermelho evoluiu bastante, destacando-se a
substituição gradual de espectrômetros dispersivos, por espectrômetros com
transformada de Fourier (FTIR) e o desenvolvimento de aplicações na região do
infravermelho próximo e distante, (Figura 6.3) (KAROUI, 2006; BODECCHI, 2005;
BAULSIR, 1996).
Figura 6.3 – Principais aplicações da espectrometria no infravermelho
Os diferentes grupos funcionais e os seus tipos de ligações têm freqüências e
intensidades de absorção distintas no infravermelho. As ligações C-H na moléculas
absorvem energia num comprimento de onda específico resultando em vibrações
moleculares. Há dois modos fundamentais de vibração das moléculas: estiramento, em
_____________________________________________________________
87
Dissertação de Mestrado Apêndice
que a distância entre dois átomos aumenta ou diminui, mas os átomos ficam no mesmo
eixo de ligação, e deformação, em que a posição do átomo muda em relação ao eixo
original da ligação. As vibrações de estiramento e de deformação de uma ligação apenas
ocorrem em freqüências quantizadas. Quando incide na molécula luz infravermelha de
mesma freqüência, há absorção de energia e aumento de amplitude daquela vibração,
Dyer(1969). Algumas entre as vibrações de estiramento e de deformação que podem
existir em uma molécula estão esquematizadas na figura 6.4.
Figura 6.4 - Vibrações de um grupo de átomos (+ e - significam
vibrações perpendiculares ao plano do papel) (
Dyer , 1969).
Segundo Dyer (1969), um valor aproximado para a freqüência do estiramento
(ν, em cm
-1
) de uma ligação é relacionado às massas dos dois átomos (M e M, em
gramas), à velocidade da luz (c), e constante de força da ligação (k, em dina/cm):
(6)
_____________________________________________________________
88
Dissertação de Mestrado Apêndice
Ligações simples, duplas e triplas têm constantes de força que são
aproximadamente 5,10 e 15 x 105 dina/cm, respectivamente. O valor do coeficiente de
extinção molar na espectroscopia infravermelha varia de quase zero até ao redor de
2.000. O valor é proporcional ao quadrado da variação do momento dipolar na molécula
causado por uma determinada vibração. Picos de absorção devidos à vibração de
estiramento são geralmente os picos mais intensos do espectro (DYER,1969).
Talvez a mais poderosa finalidade da espectroscopia no infravermelho seja a de
estabelecer com segurança a identidade de duas amostras que apresentam o mesmo
espectro quando determinado do mesmo modo. A região de 7-11µ (1430 - 910cm
-1
)
contém muitas absorções causadas por vibrações de deformação assim como absorções
causadas por vibrações de estiramento C-C, C-O e C-N. Como a muitas mais vibrações
de deformação do que de estiramento em uma molécula, esta região do espectro é muito
rica em bandas de absorções e inflexões. Ajuda a identificação o fato de que de a
molécula tem, comumente, uma série complexa de bandas de absorção em uma
determinada faixa de comprimento de onda, essa região é chamada região de impressões
digitais do espectro, mas sua presença a substância por comparação do espectro com
uma coleção de espectros (DYER, 1969; ATKINS, 2002).
_____________________________________________________________
89
Dissertação de Mestrado Apêndice
6.2 – Apêndice (B)
6.2.1 – Resoluções
Portaria nº 02-DINAL/MS, de 28 de janeiro de 1987
(D.O. de 09.02.87)
O Diretor da Divisão Nacional de Vigilância Sanitária de Alimentos/DINAL da
Secretaria Nacional de Vigilância Sanitária, no uso das atribuições que lhe confere o
item III do Artigo nº 39 da Portaria nº 270/Bsb, de 19 de julho de 1978, e considerando:
1- Que as informações toxicológicas sobre os corantes Amarelo Ácido ou Amarelo
Sólido (13015) Azul de Indantreno ou Azul de Alizarina (69.800) Laranja GGN (15980)
Vermelho Sólido e (16045) e Escarlate GN (14815), usados como aditivos em
alimentos, são insuficientes para uma avaliação do grau de risco toxicológico,
especialmente quanto ao metabolismo, efeitos sobre a reprodução, embriotoxidade,
carcinogenicidade, mutagencidade e teratogenicidade;
2- Que o Grupo de Peritos em Aditivos Alimentares da FAO/OMS (JECFA) não
estabeleceu IDA (Ingestão Diária Aceitável) para os referidos corantes (aditivos) tendo
em vista a insuficiência de dados para se concluir quanto ao risco toxicológico que estes
apresentam;
3- Que a ausência de informações toxicológicas representa risco potencial a saúde
pública;
Resolve:
I- Excluir da Tabela I do Decreto 55871/65, os corantes Amarelo Ácido ou Amarelo
Sólido (13015) Azul de Indantreno ou Azul de Alizarina (69800) Laranja GGN (15980)
Vermelho Sólido E (16045) E Escarlate GN (14815) para uso em alimentos.
II- Conceder o prazo de 60 (sessenta) dias a partir da data de publicação desta Portaria
para as Empresas requererem junto a DINAL a substituição dos Corantes proibidos por
sucedâneos permitidos na Tabela I do Decreto 55871/65.
III- Fica estabelecido o prazo de 180 (cento e oitenta) dias a partir da data de publicação
desta Portaria para definir as averbações de substituições dos corantes proibidos, bem
como as alterações necessárias nos rótulos.
IV- Decorrido o prazo de 180(cento e oitenta) dias da data de publicação desta Portaria,
ficam proibidos os corantes citados no item I, para uso em alimentos.
V- Esta Portaria entrará em vigor na data de sua publicação revogadas as disposições
em contrário.
________________________________
_____________________________
90
Dissertação de Mestrado Apêndice
Resolução - CNNPA nº 44, de 1977
Publicada DOU - Seção I, 01/02/78 e 24/04/78
A Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos, do Ministério da Saúde, em
reunião realizada em 25 de novembro de 1977, com fundamento nos artigos 5º, item 1 e
10º, do Decreto-Lei nº 986, de 21 de outubro de 1969, resolveu estabelecer as condições
gerais de elaboração, classificação, apresentação, designação, composição e fatores
essenciais de qualidade dos corantes empregados na produção de alimentos(e bebidas).
1. DEFINIÇÃO
Para os efeitos desta Resolução, considera-se corante a substância ou a mistura de
substâncias que possuem a propriedade de conferir ou intensificar a coloração de
alimento(e bebida).
1.1. Excluem-se da definição acima, os sucos e/ou os extratos de vegetais e outros
ingredientes utilizados na elaboração de alimentos (e bebidas) que possuem coloração
própria, salvo se adicionados com a finalidade de conferir ou intensificar a coloração
própria do produto.
2. CLASSIFICAÇÃO
Os corantes serão classificados como:
2.1. Corante orgânico natural - aquele obtido a partir de vegetal, ou eventualmente, de
animal, cujo princípio corante tenha sido isolado com o emprego de processo
tecnológico adequado.
2.2. Corante orgânico sintético - aquele obtido por síntese orgânica mediante o emprego
de processo tecnológico adequado.
2.2.1. Corante artificial - é o corante orgânico sintético não encontrado em produtos
naturais.
2.2.2. Corante orgânico sintético idêntico ao natural - é o corante orgânico sintético cuja
estrutura química é semelhante à do princípio ativo isolado de corante orgânico natural.
2.3. Corante inorgânico - aquele obtido a partir de substâncias minerais e submetido a
processos de elaboração e purificação adequados a seu emprego em alimento.
2.4. Caramelo - o corante natural obtido pelo aquecimento de açúcares à temperatura
superior ao ponto de fusão.
2.5. Caramelo (processo amônia) - é o corante orgânico sintético idêntico ao natural
obtido pelo processo amônia, desde que o teor de 4-metil, imidazol não exceda no
mesmo a 200mg/kg (duzentos miligramas por quilo).
_____________________________________________________________
91
Dissertação de Mestrado Apêndice
RESOLUÇÃO Nº 388, DE 5 DE AGOSTO DE 1999
O Diretor-Presidente da Agência Nacional de Vigilância Sanitária -. ANVISA,
no uso de suas atribuições e considerando: a necessidade de constante aperfeiçoamento
das ações de controle sanitário na área de alimentos visando a proteção à saúde da
população; a importância de compatibilizar a legislação nacional, com base nos
instrumentos harmonizados no Mercosul relacionados a aditivos alimentares (Resolução
GMC nº54/98); que é indispensável o estabelecimento de regulamentos técnicos sobre
aditivos em alimentos, com vistas a minimizar os riscos à saúde humana; que é
necessário aprovar o uso de Aditivos Alimentares, estabelecendo suas Funções e seus
Limites Máximos para a Categoria de Alimentos 19 : Sobremesas, resolve:
Art. 1º Aprovar o "REGULAMENTO TÉCNICO QUE APROVA O USO DE
ADITIVOS ALIMENTARES, ESTABELECENDO SUAS FUNÇÕES E SEUS
LIMITES MÁXIMOS PARA A CATEGORIA DE ALIMENTOS 19 -
SOBREMESAS", constante do Anexo desta Resolução. .
Art. 2º O descumprimento desta Resolução constitui infração sanitária sujeitando os
infratores às penalidades da Lei n.º 6.437, de 20 de agosto de 1977 e demais disposições
aplicáveis.
Art. 3º Revogam-se as disposições em contrário, especialmente, os itens da Tabela I -
Aditivos Intencionais por Classe Funcional anexa da Resolução CNS/MS n.º de
24/11/88, da Portaria DINAL/MS n.º 38 de 15/12/89, da Portaria DETEN/MS n.º 13 de
11/01/96, referentes aos seguintes alimentos: sobremesas de gelatina, outras sobremesas
e seu pós para preparo, pudins e flans e seus pós para o preparo.
Art. 4º Esta Resolução entrará em vigor na data de sua publicação.
GONZALO VECINA NETO
ANEXO
"REGULAMENTO TÉCNICO QUE APROVA O USO DE ADITIVOS
ALIMENTARES, ESTABELECENDO SUAS FUNÇÕES E SEUS LIMITES
MÁXIMOS PARA A CATEGORIA DE ALIMENTOS 19 - SOBREMESAS”
_____________________________________________________________
92
Dissertação de Mestrado Apêndice
GRUPO 19 - Sobremesas
Número FUNÇÃO / NOME Limite máximo
INS
g/100g
19.1. sobremesas de gelatina
19.1.1. PRONTAS PARA O CONSUMO
CORANTE
100 i Curcumina, cúrcuma 0,015 (como)
curcumina)
101 i Riboflavina
quantum satis
101 ii Riboflavina 5'- fosfato de sódio
quantum satis
102 Tartrazina 0,015
110 Amarelo crepúsculo 0,01
120 Carmim/cochonilha/Ácido carmínico 0,015
122 Azorrubina 0,01
123 Amaranto, Bordeaux S 0,01
124 Ponceau 4 R 0,01
127 Eritrosina 0,005
129 Vermelho 40 0,015
131 Azul patente V 0,015
132 Indigotina 0,015
133 Azul brilhante FCF 0,015
140 i Clorofila
quantum satis
140 ii Clorofilina
quantum satis
141 i Clorofila cúprica
quantum satis
141 ii Clorofilina cúprica
quantum satis
143 Verde rápido FCF 0,015
150 a Caramelo l - Simples
quantum satis
150 b Caramelo II - processo sulfito cáustico
quantum satis
150 c Caramelo III - processo amônia
quantum satis
150 d Caramelo IV - processo sulfito amônia
quantum satis
160 a i Caroteno: beta - caroteno sintét ico
quantum satis
160 a ii Carotenos naturais (alfa, beta e gama)
quantum satis
160 b Urucum/bixina/norbixina 0,001 (como bixina)
160 c Páprica/capsorubina/capsantina
quantum satis
160 e Beta-apo-8?carotenal 0,015
160 f Éster etílico ou metílico do ácido beta-apo-
8?carotenóico
0,015
162 Vermelho de beterraba, betanina
quantum satis
163 i Antocianinas
quantum satis
171 Dióxido de titânio
quantum satis
_____________________________________________________________
93
Dissertação de Mestrado Apêndice
RESOLUÇÃO Nº 389, DE 5 DE AGOSTO DE 1999
O Diretor-Presidente da Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, no
uso de suas atribuições e considerando: a necessidade de constante aperfeiçoamento
das ações de controle sanitário na área de alimentos visando a proteção à saúde da
população; que é indispensável o estabelecimento de regulamentos técnicos sobre
aditivos em alimentos, com vistas a minimizar os riscos à saúde humana; que é
necessário aprovar o uso de Aditivos Alimentares, estabelecendo suas Funções e seus
Limites Máximos para a Categoria de Alimentos 16: Bebidas - Subcategoria 16.2.2 -
Bebidas Não Alcoólicas Gaseificadas e Não Gaseificadas, resolve:
Art. 1º Aprovar o "REGULAMENTO TÉCNICO QUE APROVA O USO DE ADITIVOS
ALIMENTARES, ESTABELECENDO SUAS FUNÇÕES E SEUS LIMITES MÁXIMOS PARA A
CATEGORIA DE ALIMENTOS 16: BEBIDAS - SUBCATEGORIA 16.2.2 - BEBIDAS NÃO
ALCOÓLICAS GASEIFICADAS E NÃO GASEIFICADAS", constante do Anexo desta
Resolução.
Art. 2º O descumprimento desta Resolução constitui infração sanitária sujeitando os
infratores às penalidades da Lei n.º 6.437, de 20 de agosto de 1977 e demais
disposições aplicáveis.
Art. 3º Revogam-se as disposições em contrário, especialmente, os itens da Tabela I -
Aditivos Intencionais por Classe Funcional anexa da Resolução CNS/MS n.º 04 de
24/11/88 e da Portaria DETEN/MS n.º 97 de 06/03/96, referentes aos seguintes
alimentos: preparados para refrescos e refrigerantes, bebidas não alcoólicas
gaseificadas ou não gaseificadas e seus pós para preparo.
Art. 4º Esta Resolução entrará em vigor na data de sua publicação.
GONZALO VECINA NETO
ANEXO
REGULAMENTO TÉCNICO QUE APROVA O USO DE ADITIVOS ALIMENTARES,
ESTABELECENDO SUAS FUNÇÕES E SEUS LIMITES MÁXIMOS PARA A CATEGORIA DE
ALIMENTOS 16 : BEBIDAS - SUBCATEGORIA 16.2.2 - BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS
GASEIFICADAS E NÃO GASEIFICADAS
_____________________________________________________________
94
Dissertação de Mestrado Apêndice
CATEGORIA 16 - BEBIDAS
Número FUNÇÃO / NOME Limite máximo
INS
g/100mL
16.2.2. BEBIDAS NÃO ALCOÓLICAS GASEIFICADAS E NÃO GASEIFICADAS
16.2.2.1 PRONTAS PARA O CONSUMO
CORANTE
100 i Curcumina, cúrcuma 0,01
101 i Riboflavina
quantum satis
101 ii Riboflavina 5'- fosfato de sódio
quantum satis
102 Tartrazina 0,01
110 Amarelo crepúsculo 0,01
120 Carmim/cochonilha/ácido carmínico 0,01
123 Amaranto, Bordeaux S 0,005
124 Ponceau 4R 0,005
127 Eritrosina 0,001
129 Vermelho 40 0,01
131 Azul patente V 0,005
132 Indigotina 0,01
133 Azul Brilhante FCF 0,01
140 i Clorofila
quantum satis
140 ii Clorofilina
quantum satis
141 i Clorofila cúprica
quantum satis
141 ii Clorofilina cúprica
quantum satis
143 Verde rápido FCF 0,005
150 a Caramelo I - simples
quantum satis
150 b Caramelo II - processo sulfito cáustico
quantum satis
150 c Caramelo III - processo amônia
quantum satis
150 d Caramelo IV - processo sulfito-amônia
quantum satis
160 a i Caroteno: beta - caroteno sintético
quantum satis
160 a ii Carotenos naturais (alfa, beta e gama)
quantum satis
160 b Urucum/bixina/norbixina 0,005
160 c Páprica/capsorubina/capsantina
quantum satis
160 d Licopeno 0,01
160 e Beta-apo-8?carotenal 0,01
160 f Éster etílico ou metílico do ácido beta-apo-
8?carotenóico
0,01
161 b Luteína 0,01
162 Vermelho de beterraba, betanina
quantum satis
163 i Antocianinas
quantum satis
171 Dióxido de titânio
quantum satis
_____________________________________________________________
95
Dissertação de Mestrado Referências Bibliográficas
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
_____________________________________________________________
96
Dissertação de Mestrado Referências Bibliográficas
7 – Referências Bibliográficas
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C.L., LOPES M. T. P.; Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e
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ANDRUSHCHENKO, V.V., KORNILOVA, S.V., KAPINOS, L.E., HACKL, E.V.,
GALKIN, V.L., GRIGORIEV, D.N., BLAGOI, Yu P.; IR - Spectroscopic Studies Of
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moderna e o meio ambiente, 1.ed, Porto Alegre: Artmed, p.195, 2002.
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_____________________________________________________________
97
Dissertação de Mestrado Referências Bibliográficas
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CALIL R., AGUIAR A., Aditivos nos Alimentos, São Paulo, Ed. do autor,
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Viçosa-Mg, v. 30, n. 1, p. 19-24, 2006.
CASSIANO, N. M. CASS Q.B., DEGANI A.L., WAINER I.W.; Determination of the
plasma levels of metyrapone and its enantiomeric metyrapol metabolites by direct
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vol.14, p. 731-735, 2002.
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99
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2+
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SCHVARTSMAN S.; Aditivos alimentares: Pediatria (São Paulo) Departamento de
Pediatria da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, vol. 4 (3) p.202-210,
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SILVERSTEIN, R.M., BASSLER, G.C., MORRILL, T.C.; Identificação
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SMITH. E. L., Bioquímica: aspectos gerais, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro,p.
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STRYER L.; Bioquímica, 4ª edição,Ed. Guanabara Koogan S/A ,Rio de Janeiro – RJ,
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VOET
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VOGEL, A. I.; Análise Química Quantitativa, 6ª. ed. Rio de Janeiro: Editora LTC,
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VORLÍČKOVÁ M., KYPR J. SKLENÁŘV.;Nucleic Acids: Spectroscopic Methods,
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102
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http://en.wikipedia.org/wiki/Image:A-B-Z-DNA_Side_View.png acesso em 14.02.2007.
http://www.geog.ufpr.br/disciplinas/espectro1.doc acesso em 16.02.2007.
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