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ALESSANDRA RIBEIRO DE ALBUQUERQUE
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS, CLÍNICOS E DE
DIAGNÓSTICO EM CÃES (Canis familiares) (LINNAEUS,
1758) NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania
(Leishmania) chagasi (CUNHA & CHAGAS, 1937)
RECIFE
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA
ALESSANDRA RIBEIRO DE ALBUQUERQUE
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS, CLÍNICOS E DE
DIAGNÓSTICO EM CÃES (Canis familiares) (LINNAEUS,
1758) NATURALMENTE INFECTADOS POR Leishmania
(Leishmania) chagasi (CUNHA & CHAGAS, 1937)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciência Veterinária da Universidade Federal Rural
de Pernambuco - UFRPE, como parte dos requisitos
para obtenção do grau de Mestre em Ciência
Veterinária.
Orientador
Prof. Dr. Leucio Câmara Alves
RECIFE
2006
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Ficha catalográfica
Setor de Processos Técnicos da Biblioteca Central – UFRPE
A345a
Albuquerque, Alessandra Ribeiro de
Aspectos epidemiologicos, clínicos e de diagnóstico em
cães (canis familiares) (Linnaeus, 1758) naturalmente
infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi (Cunha &
Chagas, 1937)/ Alessandra Ribeiro de Albuquerque;
orientador Prof. Dr. Leucio Câmara Alves. – Recife : o
Autor, 2006.
83 p. : il.
Orientador: Leucio Câmara Alves
Dissertação (Mestrado em Ciência Veterinária) –
Universidade Federal Rural de Pernambuco.
Departamento de Medicina Veterinária.
Inclui bibliografia e anexo.
CDD 636.089 696
1. Parasitologia veterinária
2. Protozoose
3. Trypanosomatidae
4. Leishmaniose visceral canina
5. Calazar canino
6. Imunodiagnóstico
7. Clínica médica
8. Veterinária
I. Alves, Leucio Câmara
II. Título
Marleide Guedes
Bibliotecária
CRB 3511
Dedico a minha mãe pelo exemplo de pessoa e
profissional, e sem a qual nada do que faço seria possível.
Dedico ao meu pai, pelo amor incondicional e força
sempre.
À vocês, a minha gratidão.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por iluminar cada passo em minha vida, encorajando e dando força nos
momentos mais difíceis.
Ao Prof. e amigo Leucio pelos ensinamentos, ajuda,
SUMÁRIO
1INTRODUÇÃO GERAL 01
1.1- Agente etiológico ................................................................................... 01
1.2- Vetor....................................................................................................... 03
1.3- Ciclo biológico........................................................................................
03
1.4- Distribuição geográfica e prevalência ....................................................
03
1.5- Sinais clínicos ........................................................................................ 07
1.6- Diagnóstico ............................................................................................ 09
1.7- Referências ............................................................................................ 11
2 OBJETIVOS
21
2.1- Geral ...................................................................................................... 21
2.2- Específicos ............................................................................................. 21
CAPÍTULO 1
22
3 FREQUENCIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES NA
CIDADE DO RECIFE.
Resumo ..........................................................................................................
23
3.1- Introdução .............................................................................................. 24
3.2- Material e Métodos ................................................................................ 26
3.2.1- Local do estudo ................................................................................... 26
3.2.2- Animais ............................................................................................... 26
3.2.3- Diagnóstico
parasitológico
e
sorológico ....................................................
26
3.3- Resultados e discussão .......................................................................... 27
3.4- Conclusão .............................................................................................. 31
3.5- Referências ............................................................................................ 31
CAPÍTULO 2
38
4 OCORRÊNCIA DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO
MUNICÍPIO DE AMARAJI, ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL.
Resumo ..........................................................................................................
39
4.1- Introdução .............................................................................................. 40
4.2- Material e Métodos ............................................................................... 41
4.2.1- Descrição do paciente ......................................................................... 41
4.2.2- Diagnóstico parasitológico ................................................................. 42
4.2.3- Diagnóstico sorológico ....................................................................... 42
4.3- Resultados e Discussão ......................................................................... 43
4.4- Conclusão ............................................................................................. 44
4.5- Referências ........................................................................................... 44
CAPÍTULO 3
46
5 ASPECTOS CLÍNICOS DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS
POR Leishmania ( Leishmania) chagasi NA REGIÃO METROPOLITANA
DO RECIFE.
Resumo ..........................................................................................................
47
5.1- Introdução .............................................................................................. 48
5.2- Material e Métodos ............................................................................... 49
5.2.1-Animais ................................................................................................ 49
5.2.2- Diagnóstico parasitológico ................................................................. 50
5.2.3- Diagnóstico sorológico ....................................................................... 50
5.3- Resultados e Discussão ......................................................................... 51
5.4- Conclusão .............................................................................................. 54
5.5- Referências ........................................................................................... 55
CAPÍTULO 4
58
6 COMPARISON BETWEEN DIFFERENT DIAGNOSTIC KITS USED
FOR CANINE VISCERAL LEISHMANIASIS
Abstract 59
6.1- Introduction ........................................................................................... 60
6.2- Material and Methods ........................................................................... 61
6.2.1-Animals ................................................................................................ 61
6.2.2- Parasitological Diagnosis ....................................................................
62
6.2.3- Serologic Diagnosis ............................................................................ 62
6.3- Results and Discussion .......................................................................... 63
6.4- Conclusions ........................................................................................... 67
6.5- References ..............................................................................................
67
7 CONCLUSÕES GERAIS ............................................................................ 70
8 REFERÊNCIAS ........................................................................................... 71
ÍNDICE DE TABELAS
Página
CAPÍTULO 3
5- ASPECTOS CLÍNICOS DE CÃES COM DIAGNÓSTICO POSITIVO
PARA LEISHMANIOSE VISCERAL NA REGIÃO METROPOLITANA
DO RECIFE.
Tabela 1. Freqüência absoluta e relativa dos sinais clínicos encontrados
nos animais positivos para LVC na Região Metropolitana do Recife, 2006.
.............. 51
CAPÍTULO 4
6- COMPARISON BETWEEN DIFFERENT DIAGNOSTIC KITS USED
FOR CANINE VISCERAL LEISHMANIASIS
Table 1- Data of EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos
with the parasitological criteria, Recife, 2006
.............. 63
Table 2- . Data of ELISA S7® with the parasitological criteria. Recife,
2006.
............... 64
Table 3- Data of EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos kit
and canine calazar diagnostic ELISA S7® Biogene kit. Recife, 2006
............... 66
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPÍTULO 4 Página
6- COMPARISON BETWEEN DIFFERENT DIAGNOSTIC KITS USED
FOR CANINE VISCERAL LEISHMANIASIS
Figure 1- Optic densities (DO) distribution observed in the different
ELISA systems used in the CVL diagnosis.
.....................65
RESUMO
A Leishmaniose Visceral Zoonótica (LVZ) se encontra distribuída por grande parte do
território brasileiro, predominantemente no Nordeste, tendo como principal reservatório
urbano o cão. A LVZ vem passando por mudanças em seu perfil de transmissão, onde a sua
urbanização torna-se cada vez mais freqüente, principalmente devido a transformações no
ambiente. O presente trabalho teve por finalidade diagnosticar casos de LVZ e avaliar as
características clínicas em cães com infecção natural por Leishmania (L.) chagasi na cidade
do Recife. Além disso, foram comparados sistemas ELISA, com antígenos distintos em
cães para o diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) na Região Metropolitana do
Recife. Foram utilizados 142 cães atendidos no Hospital Veterinário da Universidade
Federal Rural de Pernambuco com suspeita clínica de LVC. O diagnóstico dos animais
positivos foi realizado através do exame clínico, além de exames parasitológico e
sorológico pelo método de ELISA. Dentre os resultados obtidos os sinais clínicos mais
freqüente nos cães atendidos foram as úlceras cutâneas, presentes em 82,80% (29/36),
seguido de onicogrifose em 60,00% (18/36). Os dados revelaram ainda que 88,23% (15/17)
dos animais provenientes da cidade do Recife possuíam anticorpos anti–Leishmania. Com
relação a comparação dos sistemas de ELISA empregados no diagnóstico da LVC, o kit
EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos apresentou sensibilidade de 65,79% e
especificidade de 85,58% (IC 95%), e o kit para o diagnóstico do calazar canino ELISA
S7® Biogene apresentou sensibilidade de 47,37% e especificidade de 89,42% (IC 95%).
Os resultados indicam que não há sinal patognomônico na LVC e que esta zoonose
encontra-se em processo de urbanização na cidade do Recife.
SUMMARY
Zoonotic Visceral Leishmaniasis (ZVL) is a widespread disease in Brazil, particularly in
the Northeast area having the dog as its main reservoir. ZVL has shown environmental
changes in its transmission pattern through urbanization. The goal of this paper was to
diagnose and evaluate clinical features in dogs naturally infected by Leishmania
(Leishmania) chagasi in Recife City. In addition, two Enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA) made with different antigens for the diagnosis of the canine ZVL in the
metropolitan region of Recife have been compared . For this purpose 142 animals which
were submitted to the Veterinary Hospital of the Universidade Federal Rural de
Pernambuco presenting clinical signs suggestive of ZVL were used. The diagnosis of
positive animals was performed through clinical examination, parasitological and serologic
exams. The most frequent clinical signs were ulcers, present in 82.8% (29/36) animals
followed by onicogriphosis in 60% (18/36). It was also observed that 88.23% (15/17)
animals from Recife city were positive for anti–Leishmania antibodies. As for the
comparison between the different ELISA systems used in the ZVL diagnosis, EIE-
Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos kit presented sensibility of 65.79% and
specificity of 85,58% (IC 95%),and ELISA S7® Biogene kit presented sensibility of
47.37% and specificity of 89.,42% (IC 95%). Results suggest the absence of a
pathognomonic sign in CVL and an urbanization process of this zoonosis in Recife City.
1 INTRODUÇÃO GERAL
A Leishmaniose Visceral (LV) ou calazar é uma doença parasitária de caráter
zoonótico de distribuição cosmopolita, situada entre as seis endemias consideradas prioritárias
no mundo (WHO, 1996). Atualmente cinco países agregam 90% dos casos de LV, dentre eles
o Brasil (DAVIDSON, 1999) onde das 27 unidades federativas, 19 já relataram casos da
doença (BRASIL, 2004).
Essa enfermidade que, inicialmente, apresentava características rurais no Brasil, vem
demonstrando mudanças importantes em seu padrão de transmissão, atingindo mais
recentemente centros urbanos (ARIAS et al.,1996) e o cão se apresenta como principal
reservatório da infecção humana (BRASIL, 2004).
Apesar das divergências quanto à espécie de Leishmania que infecta os canídeos no
Brasil, a espécie Leishmania (Leishmania) chagasi tem sido considerada sinonímia de
Leishmania (Leishmania) infantum com base em perfis isoenzimáticos (MAURÍCIO, 2000).
No que se refere à transmissão entre hospedeiros susceptíveis, insetos vetores
psicodídeos (DAVIDSON, 1999), do gênero Lutzomyia sp desempenham importante papel no
ciclo biológico.
1.1 - Agente etiológico
As espécies do gênero Leishmania sp. são parasitas intracelulares de macrófagos e
possuem duas formas. A primeira denominada amastigota, encontrada no hospedeiro
vertebrado medindo entre 2 a 5 µm, podendo em sua célula ser diferenciado o citoplasma e o
2
cinetoplasto (SUNDAR e RAI, 2002), e a segunda denominada promastigota com 10 a 15 µm
que se encontra no inseto vetor (NOLI, 1999).
Segundo Levine et al., (1980) o agente etiológico do calazar possui a seguinte posição
taxonômica:
Reino: Protista Haeckel, 1866
Sub-Reino: Protozoa Goldfuss, 1817
Filo: Sarcomastigophora Honigberg & Balamuth, 1963
Sub-Filo: Mastigophora Deising, 1866
Classe: Zoomastigophorea Calkins, 1909
Ordem: Kinetoplastida Honigberg, 1963 emend. Vickerman, 1976.
Sub-Ordem: Trypanosomatina Kent, 1880.
Família: Trypanosomatidae Dofein, 1901, emend Grobben 1905.
Gênero: Leishmania Ross, 1903.
Sub-Gênero: Leishmania Saf’yanova, 1982
Espécie: Leishmania (Leishmania) chagasi Cunha & Chagas, 1937, sinonímia
Leishmania (Leishmania) infantum (MAURÍCIO, 2000).
Do ponto de vista molecular, o tamanho do genoma da Leishmania sp varia de 10
7
a
10
8
pares de bases e a organização cromossômica é polimórfica em tamanho (270 a 2600
kilobases) e em número (24 a 36). O genoma da Leishmania (L.) chagasi tem 36 cromossomos
com grupos de ligação altamente conservados em diferentes linhagens (ALEXANDRINO,
2001).
3
1.2- Vetor
Os vetores são dípteros pertencentes à família Psychodidae, sub-família
Phlebotominae, (ROSÁRIO et al. 2005), gênero Lutzomyia no novo mundo, sendo a espécie
Lutzomyia longipalpis incriminada como principal vetor do calazar no Brasil (LAINSON e
RANGEL, 2005).
A ocorrência da doença em uma determinada área depende basicamente da presença
de um vetor competente para a transmissão do parasita e de um hospedeiro / reservatório
igualmente susceptível (GONTIJO e MELO, 2004).
1.3- Ciclo Biológico
Segundo ALVES e FAUSTINO (2005), o protozoário completa seu ciclo biológico
em dois hospedeiros a saber: um vertebrado e outro invertebrado. A forma amastigota do
parasito ocorre nos mamíferos onde a Leishmania spp encontra-se dentro dos macrófagos. Os
flebótomos ingerem o parasito ao exercer o repasto sanguíneo no hospedeiro infectado. No
inseto vetor, o protozoário transforma-se na forma promastigota que é inoculada na pele de um
novo hospedeiro vertebrado no momento do hematofagismo.
1.4- Distribuição Geográfica e Prevalência
Com um total estimado de 200 milhões de pessoas sob o risco de adquirir a infecção
e uma estimativa de 500.000 novos casos anualmente, a LV apresenta distribuição cosmopolita
4
ocorrendo em 88 países e atualmente é endêmica em 65 destes. Aproximadamente 90% dos
casos ocorrem na Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil (WHO, 1996).
Nos últimos anos o perfil epidemiológico da Leishmaniose Visceral Americana (LVA)
no Brasil vem sofrendo profundas modificações. As alterações ambientais forçaram a
adaptação do vetor ao ambiente urbano além da migração de uma grande parte da
população rural para as grandes cidades (BRASIL, 2003).
Dentre as unidades federativas brasileiras que já relataram a presença da doença, o
maior número de casos tem sido observado no Nordeste (ALVES e FAUSTINO, 2005), região
que registra os maiores coeficientes de incidência desde a década de 90 (CAMARGO-NEVES,
2005).
Vale salientar que na região Nordeste, a ausência de uma política voltada à saúde
pública, a ocorrência da fome, que se agrava nos períodos de estiagem, assim como a
densidade de insetos vetores, e a presença do reservatório canino infectado (BADARÓ et al.
1996), geram entre outros problemas a subnutrição e a pobreza, condições estas fundamentais
para instalação da LVA.
Sendo assim, os cães considerados principais reservatórios fora do ambiente silvestre
são de grande importância na manutenção do ciclo da doença, em virtude destes animais
apresentarem uma maior quantidade de parasitos na pele do que o homem, fato que favorece a
infecção dos vetores (SANTA ROSA e OLIVEIRA, 1997) e sua transmissão para população
canina e humana.
A região Nordeste é a maior detentora dos casos de LVA com 89% de notificações,
seguida do Sudeste (6%), Norte (4%) e Centro Oeste (1%) (MONTEIRO et al. 1994). No
Estado de Roraima, na região Norte, num inquérito realizado por Guerra et al. (2004), 10,4%
5
(392/3773) dos cães apresentaram anticorpos anti-Leishmania sp através da ação de
Imunofluorescência Indireta (RIFI). No município de Araguaína, Estado de Tocantins, o perfil
da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) foi bem documentado por Gomes et al. (2005). Esses
autores relataram a prevalência da infecção em cães domiciliados no período de 2001 a 2004, e
observaram, índices de 1,6% em 2001, atingindo um nível máximo de 6,5% em 2002 e 2,4%
em 2004. Nesta mesma região, Galvão et al. (2005) registraram uma taxa de infecção na zona
urbana e rural que variou de 4,0% a 4,5% respectivamente.
No Nordeste, a maioria (66%) dos casos de LVA notificados ocorre nos Estados do
Maranhão, Ceará, Bahia e Piauí (BRASIL, 2004). No Estado do Maranhão, incluído pelo
Ministério da Saúde (BRASIL, 2004) como área prioritária para o controle da LVA, a infecção
canina foi registrada nos municípios de São José de Ribamar (GUIMARÃES et al. 2005) e de
Imperatriz, (BRAGA et al. 2005) onde a soroprevalência encontrada foi 23% e 46,6%
respectivamente.
Estudos sobre a distribuição da LVC no Estado do Ceará revelaram a evolução da
endemia, quando Alencar et al. (1956) observaram 8,2% dos cães infectados e Evans et al.
(1992) detectaram 39% dos cães do município de Itapipoca, no mesmo Estado. Recentemente
um estudo revelou que 2,26% dos cães do município de Fortaleza foram reagentes ao
sorológico (FACO et al. 2005).
Apesar de relatos da freqüência do calazar canino na Região Metropolitana da
Cidade do Recife (RMR) (SILVA et al. 1999), até 2001, somente existiam estudos
soroepidemiológicos (LIMA JR et al. 2000) sem descrição de casos autóctones da doença em
cães provenientes da Cidade do Recife.
Vários têm sido os relatos da LVC em áreas silenciosas para infecção humana. Desta
forma, Paiva Cavalcanti et al. (200
6
Cidade do Recife, assim como Albuquerque et al. (2005), que descreveram a LVC no
município de Amaraji, microrregião Mata Meridional, do Estado de Pernambuco.
No município de São Vicente Ferrer, localizado na Mesorregião do Agreste,
Microrregião do Médio Capibaribe do Estado, a prevalência da infecção canina variou de 4,8%
a 33,3%, utilizando-se métodos sorológicos e moleculares respectivamente (CARVALHO et
al. 2005). Neste mesmo Estado, França et al. (2003) obtiveram a freqüência de 35,93% de
positividade para LVC por meio da RIFI.
Segundo Lima et al. (2003) a distribuição da LVC na cidade de Maceió não esta restrita
apenas as áreas litorâneas, como Riacho Doce e Ipioca, encontrando-se atualmente em
processo de urbanização (COSTA et al. 2003).
A infecção canina também tem sido assinalada por Melo et al, (2004) na Cidade de
Aracaju, Estado de Sergipe onde as taxas variaram entre 25% a 15,29% pelo ensaio
imunoenzimático e RIFI respectivamente. Ainda na região Nordeste, em Jequié na Bahia, a
freqüência da infecção em cães por meio do ensaio imunoenzimático foi de 23,5%
(PARANHOS-SILVA et al. 1996).
Em se tratando da região Centro Oeste, a prevalência do calazar canino variou de
7,8% em Poxoréo, MT (AZEVEDO et al. 2004), a 23,7% no município de Bonito (NUNES et
al. 2001).
No Estado de São Paulo, região Sudeste do Brasil, Iverson et al. (1983) encontraram
uma prevalência na população canina de 2,5%. Coutinho et al. (1985) detectaram a prevalência
de 4,3% da infecção canina no Estado do Rio de Janeiro, utilizando a RIFI e Cabrera et al.
(2003) observaram que a soroprevalência da infecção canina em Barra de Guaratiba, área
periurbana, situada no litoral da cidade do Rio de Janeiro após 12 meses de estudo, foi de
25,0%.
7
Baseado nos índices encontrados na literatura, a prevalência da LVC no Brasil variou
de 2,5 % a 46,6% sendo que as taxas de infecção variaram na dependência das condições
socioeconômicas, e perfil de transmissão em cada uma das regiões brasileiras.
1.5 – Sinais Clínicos
A LVC é uma enfermidade sistêmica severa e em alguns casos fatal
(ALEXANDRINO, 2001), sendo considerada como doença imunomediada devido às
alterações na atividade das células T e B, o que provoca uma grande formação de
imunocomplexos circulantes que se depositam nas paredes dos vasos sanguíneos causando
sinais clínicos como vasculite, uveíte, glomerulonefrite e artrite (GARCIA-ALONSO et al.,
1996; NOLI, 1999). Contudo, segundo Marzochi et al. (1984) apenas uma parcela dos cães
infectados desenvolvem doença clínica, na dependência da competência imunológica
(MORENO et al., 1999) desses animais.
Em alguns cães uma resposta imune celular protetora controla a infecção, em outros
uma doença lenta e progressiva se desenvolve (FERRER, 1999). Estes dois processos distintos
dependem de fatores inerentes do parasito como a cepa, e aqueles referentes ao hospedeiro
vertebrado como a constituição genética, estado nutricional e imunitário (EZQUERRA, 2001).
A imunidade à infecção dá-se através de duas populações de linfócitos distintos, T e
B (LESER et al. 1985). A presença da resposta humoral está associada à doença clínica,
enquanto que a resposta celular tem sido observada em animais assintomáticos (MORENO et
al. 1999). Desta forma a resposta das células T pelo hospedeiro é decisiva para evolução da
infecção (BIAZZONO, 2003). As células T auxiliar 1(Th1) iniciam a imunidade celular e as
8
células T auxiliar 2 (Th2) mediam a imunidade humoral cuja resposta imune efetiva a infecção
é regulada pelos efeitos dos linfócitos Th1 (BIAZZONO, 2003).
O quadro clínico dos cães infectados apresenta um espectro de características que
varia do aparente estado sadio a um severo estágio final (FERRER., 1999). Sendo assim, os
animais podem ser classificados em assintomáticos, oligossintomáticos ou sintomáticos
(BRASIL., 2004).
Classicamente os animais com LVC apresentam hepatoesplenomegalia, lesões de
borda de orelha e focinho, acinesia e onicogrifose (ALBUQUERQUE et al., 2005). Entre as
alterações dermatológicas mais comuns, tem-se a alopecia local ou generalizada, lesões como
dermatite esfoliativa e ulcerações crostosas em geral no focinho, orelhas e nas extremidades,
descamação furfurácea (ALVES e FAUSTINO., 2005) hiperqueratose (BRASIL., 2004;
BONATES., 2003), ceratite intersticial, despigmentação cutânea e pelame seco (SANTA
ROSA e OLIVEIRA., 1997) entre outros sinais.
As oftalmopatias vem ocupando importante papel dentre os sinais clínicos da LVC
onde o animal pode apresentar lesão uni ou bilateral (BRITO, 2004), ceratoconjuntivite
(BRASIL, 2004), ceratoconjutivite seca, ceratite ulcerativa e corioretinite (BRITO, 2004),
blefarite, conjuntivite, ceratite, uveíte anterior e glaucoma secundário (FERRER, 1999).
Nas fases mais adiantadas da doença observa-se com grande freqüência apatia, atrofia
muscular particularmente da cabeça, coriza, linfoadenopatia, onicogrifose, edema de patas
(BRASIL, 2004), edema do focinho
1
, problemas articulares como a poliartrite autoimune,
polimiosite e lesões ósseas (DENEROLLE, 1996).
Outros sinais como linfadenomegalia, epistaxe, caquexia (FERRER et al. 1995),
cardiopatias, disfunções respiratórias e digestivas, também tem sido assinaladas em animais
1
Alves, L.C. Comunicação pessoal
9
com LVC, sendo a insuficiência renal, a principal causa de óbito (FERRER et al. 1995;
RIBEIRO, 2005; BARROIUM-MELO et al, 2005).
1.6 – Diagnóstico
O diagnóstico da LVC é complexo devido às suas características clínicas serem
semelhante a várias outras doenças comuns, muitas inclusive que podem co-existir. Ainda,
segundo Ferrer (2002), mais de 50% dos animais se mostram assintomáticos ao exame clínico.
As dificuldades na determinação da doença clínica direcionam o diagnóstico para os
métodos laboratoriais, onde estão disponíveis métodos parasitológicos, sorológicos e
moleculares. O método parasitológico baseia-se na demonstração do parasita a partir de
material coletado proveniente de biópsia de medula óssea, raspados de pele, ou aspirados de
baço e fígado (CARVALHO-NETA, 2004).
Ainda pode ser realizado o isolamento do agente em meio de cultura mediante
diluição do material aspirado de medula óssea, baço e fígado em solução salina e inoculação
no meio Novy, Mc Neal e Nicolle (NNN) e Liver Infusion Triptofane (LIT), ou a inoculação
intraperitoneal em animais de laboratório (SANTA-ROSA e OLIVEIRA, 1997).
Apesar da presença de uma única forma amastigota ser confirmatório para o
diagnóstico da LVC, esse método além de ser pouco sensível, é invasivo e traumático,
requerendo técnico treinado para a realização do isolamento, e leitura microscópica (SUNDAR
e RAI, 2002).
A LVC é caracterizada por uma marcada estimulação policlonal de linfócitos B, o
que resulta na grande produção de imunoglobulinas. Sendo assim, a detecção de anticorpos
10
circulantes através dos métodos sorológicos tem seu uso facilitado por serem menos invasivos
e mais prático (GONTIJO e MELO, 2004).
Entre os métodos sorológicos destaca-se a reação de imunofluorescência indireta
(RIFI), ensaio imunoenzimático (ELISA), fixação do complemento (FC), teste de aglutinação
direta (TAD) (BRASIL, 2003), Imunoeletroforese (FEITOSA et al. 2000), Immunoblot e
Imunocromatografia (LIRA, 2005). Apesar de ser o método diagnóstico mais difundido, a RIFI
apresenta reações cruzadas com outras doenças e possui baixa sensibilidade.
Apesar de apresentar baixa sensibilidade, a RIFI tem sido o teste recomendado para
confirmação dos animais suspeitos (BRASIL, 2004), sendo considerada como padrão ouro
tanto na LVA quanto na LVC (GRANDONI, 1999).
Por outro lado, o teste de ELISA é rápido e de fácil execução e leitura sendo um
pouco mais sensível e um pouco menos específico que a RIFI (GONTIJO e MELO, 2004),
ainda possui maior reprodutibilidade (MANCIANTI et al. 1995).
A especificidade do ensaio imunoenzimático depende do antígeno utilizado
(SUNDAR e RAI, 2002) podendo este ser originado de culturas de promastigotas ou proteínas
recombinantes (BADARÓ et al. 1996). Neste sentido, antígenos brutos de promastigotas ou
seus extratos solúveis limitam a padronização dos testes e reprodutibilidade dos resultados
(HOMMEL, 1978) enquanto que antígenos recombinantes específicos do parasita vêm
mostrando elevada sensibilidade e especificidade para o diagnóstico da LVC (SCALONE et al.
2002).
Um fator importante que deve ser levado em consideração na escolha do teste
sorológico para LVC, é a evolução do quadro clínico dos cães infectados, o antígeno, além da
subclasse da imunoglobulina a ser utilizado na realização do teste.
11
Segundo Mettler et al. (2005) o ensaio imunoenzimático tem sido capaz de detectar
animais sororreagentes tanto naqueles com sinais clínicos aparentes como inaparentes,
enquanto a RIFI detectou uma maior parcela de animais com clínica aparente do que aqueles
onde não foram observados sinais característicos da doença
Apesar dos métodos moleculares serem mais modernos, e possuirem maior
sensibilidade e especificidade, do que a RIFI e o ELISA (ROSYPAL et al, 2005), estes são
normalmente complexos e laboriosos, não estando disponível para rotina clínica veterinária
sendo apenas aplicados na pesquisa científica (IKONOMOPOLUS, 2003).
1.7- Referências
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20
21
2 - OBJETIVOS
2.1 - GERAL
Estudar os aspectos clínicos, epidemiológicos e de diagnóstico em cães
naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi.
2.2 - ESPECÍFICOS
• Diagnosticar casos de LVC na cidade do Recife.
• Relatar a ocorrência da LVC em Amaraji.
• Avaliar as características clínicas de cães com diagnóstico positivo para LVC
na região metropolitana do Recife.
• Comparar dois sistemas ELISA no diagnóstico do calazar canino.
22
CAPÍTULO 1
FREQUÊNCIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES NA
CIDADE DO RECIFE.
23
FREQUENCIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES NA
CIDADE DO RECIFE.
RESUMO
A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma importante zoonose que pode apresentar
grande contingente de animais assintomáticos. Até o presente, apenas uma ocorrência
autóctone desta parasitose tem sido relatada na zona sul da Cidade do Recife. O objetivo
deste trabalho foi diagnosticar casos de LVC neste município, empregando-se exames
parasitológico e sorológico pelo ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA). Dentre os 17
cães utilizados, 88.23% eram positivos, indicando um processo de expansão e urbanização
desta enfermidade nesta cidade.
ABSTRACT
Canine Visceral Leishmaniasis is an important zoonosis which may present a large number
of asymptomatic animals. Currently, one autoctone report of this parasitose was registered in
the south area of Recife. The aim of this work was to diagnose CVL cases in this
municipality using parasitological and serologic exams trough the enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA). A positive result was observed in 88.23% (15/17) dogs
indicating an expansion and urbanization process in Recife City.
24
FREQUENCIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES NA CIDADE DO
RECIFE
1- Introdução
A leishmaniose visceral (LV) é uma zoonose de distribuição cosmopolita com um
total estimado de 200 milhões de pessoas sob o risco de adquirir a infecção. No Brasil a
doença encontra-se relatada em 19 unidades federativas, sendo que o maior número de casos
foi observado no Nordeste do país (ALVES e BEVILACQUA, 2004).
Duas décadas após o registro da primeira epidemia urbana em Teresina PI, o
processo de urbanização se intensificou com a ocorrência de importantes epidemias em
várias cidades da região Nordeste (São Luís, Natal, Aracaju, Fortaleza, Salvador), Norte
(Boa Vista, Palmas, Santarém), Sudeste (Belo Horizonte e Montes Claros) e Centro Oeste
(Cuiabá e Campo Grande) (BRASIL, 2004).
Do ponto de vista epidemiológico, a infecção canina é mais importante que a
infecção humana, pois as precede, além de ser mais prevalente e apresentar grande
contingente de animais assintomáticos albergando parasitos na derme (BONATES, 2003).
Sendo assim, em áreas endêmicas para Leishmaniose Visceral Americana (LVA), os cães
domésticos representam o principal reservatório para a infecção por Leishmania sp
(PARANHOS-SILVA et al, 1996).
Em Pernambuco, os dados mostraram que o perfil epidemiológico do calazar
humano também tem mudado durante os últimos anos, onde era uma doença praticamente
exclusiva das áreas rurais e atualmente vem se difundindo e tornando-se cada vez mais
comum em áreas urbanas (DANTAS-TORRES e BRANDÃO-FILHO, 2005).
25
Apesar de relatos da freqüência da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) na região
metropolitana do Recife (SILVA et al., 1999), até 2001, somente existiam estudos
soroepidemiológicos na cidade do Recife (LIMA Jr. et al. 2000).
Em 2002, foi relatada a ocorrência autóctone da LVC na zona sul da Cidade do
Recife (PAIVA CAVALCANTI et al., 2002), o que mostra a expansão da doença para área
urbana. Entretanto, a caracterização do agente foi demonstrada mais tarde através de
anticorpos monoclonais (BRITO et al., 2005).
O diagnóstico de confirmatório na LVC é confuso sendo o método mais seguro o
parasitológico através da detecção do parasita. Entretanto, este método esbarra na falta de
praticidade e baixa sensibilidade. Por outro lado, os métodos moleculares de diagnóstico
apesar de possuir alta sensibilidade e especificidade, são normalmente utilizados apenas em
instituições de pesquisa. A sensibilidade do exame parasitológico torna os métodos
sorológicos essenciais no diagnóstico da LVC. Apesar do teste de imunofluorescência
indireta (RIFI) ser o método recomendado pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2003) para
confirmar animais suspeitos, o teste de imunoadsorção enzimática (ELISA) vem sendo
utilizado na rotina veterinária pela sua automação e praticidade (ROSÁRIO et al. 2005).
Em virtude do crescente número de casos nesta região, o objetivo deste trabalho foi
diagnosticar casos de LVC na cidade do Recife, utilizando-se o método parasitológico e
sorológico.
26
2 - Material e Métodos
2.1 - Local do estudo
A cidade do Recife localiza-se a 8°04’48’’ Sul da Latitude Meridional e a 34°55’11’’
Oeste de Greenwich (VESPEL et al, 1997), possui clima tropical quente-úmido, com
temperatura anual na faixa de 25,4° C e amplitude de oscilação em torno de 2,8° C (ATLAS
AMBIENTAL DA CIDADE DO RECIFE, 2000).
2.2 – Animais
Foram utilizados 142 cães de ambos os sexos, de raças e idades variadas,
domiciliados na cidade do Recife, atendidos no ambulatório de Leishmaniose do Hospital
Veterinário (LHV) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) no período de
fevereiro a novembro do ano de 2005.
Inicialmente foi realizada anamnese, com obtenção de dados referentes ao seu
estado geral, raça, sexo, idade, porte e evolução do processo bem como dados referentes ao
proprietário e ao animal. Realizou-se ainda exame físico de rotina através da inspeção da
pele e anexos e palpação de linfonodos regionais.
2.3 - Diagnóstico Parasitológico e Sorológico
O exame parasitológico foi realizado através de biópsia de medula óssea, onde após
antisepsia foi realizada punção na crista do osso esterno utilizando-se seringas
1
e agulhas
27
descartáveis
2
. Deste material obtido, foram confeccionados esfregaços em lâminas de vidro
os quais foram corados pelo método Panótico e observadas à microscopia ótica.
Para o exame sorológico foi realizada coleta de sangue através da venopunção da
veia cefálica, com o auxílio de uma agulha 25 x 7 mm
3
acoplada a uma seringa de 5 mL
4
O
soro obtido foi acondicionado em tubos plásticos previamente identificados e armazenado a
temperatura de -20°C.
O teste de ELISA foi realizado através do kit EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–
Bio-Manguinhos, lote 053El0027 utilizando o antígeno solúvel de formas promastigotas de
Leishmania major-like, segundo as instruções do fabricante, no Laboratório de
Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas Aggeu
Magalhães / Fundação do Instituto Oswaldo Cruz (Cpqam/FIOCRUZ).
2 - Resultados e Discussão
Dos 142 animais atendidos no ambulatório, 11,97% (17/142) eram provenientes da
cidade do Recife e foram então incluídos neste estudo, sendo o restante proveniente da
Região Metropolitana do Recife ou outras cidades do interior do Estado. As analises
parasitológicas mostraram a presença de formas amastigotas de Leishmania sp. nos
esfregaços do material obtido através da biópsia de medula óssea em 23,52% (04/17) destes
animais. Esse método assegura a identificação direta do parasito livre ou no interior de
macrófagos (LOSOS, 1986; FERRER, 1999) e, se realizado de maneira apropriada e (
VIDE PG 27 SALVO SEPARADO ).
28
minuciosa, torna-se altamente específico (HAMIDAH et al
.
1995). A principal
desvantagem do método parasitológico é a baixa sensibilidade para amostras colhidas de
medula óssea, além de ser invasivo (SUNDAR e RAI, 2002).
Os resultados parasitológicos aqui obtidos foram superiores aqueles registrados
por P
29
amostra populacional. Deve-se ainda
considerar que, Segundo Mettler et al (2005) o ensaio
imunoenzimático apresenta a capacidade de detectar animais sororreagentes,
independentemente da fase de evolução da doença.
Quando comparado o diagnóstico parasitológico e sorológico, o índice kappa
encontrado no presente trabalho foi de 0,505, a sensibilidade de 65,78% e especificidade de
85,57%, com intervalo de confiança de 95%. A discrepância entre os resultados
parasitológico e sorológico, representada pelo baixo índice kappa, pode decorrer da alta
sensibilidade apresentada pelo teste imunológico. Desse modo, o método parasitológico
não é adequado para diagnóstico individual (FERRER, 1999), sendo os testes imunológicos
mais utilizados, pois a LVC é caracterizada por uma grande estimulação policlonal de
linfócitos B e como conseqüência, grande produção de anticorpos (MELO, 2004).
Os 15 animais positivos apresentados neste estudo residiam em diferentes áreas da
cidade do Recife, sendo três provenientes da Região Político Administrativa (RPA)
noroeste, nove provenientes da RPA oeste e três provenientes da RPA Sul (Figura 1).
RPA Centro
RPA Sul
RPA Norte
RPA Sudoeste
RPA Oeste
RPA Noroeste
Figura 1. Localização das áreas com diagnóstico da Leishmaniose visceral canina na Cidade
do Recife. Recife, 2004. Fonte
30
A RPA Noroeste acolhe 20 % da população do município do Recife, tendo uma
população de 1.422.905 habitantes com sua geografia caracterizada pela presença de morros.
A RPA Oeste é a menos pobre das RPAs é composta por 18% da população. A RPA Sul é a
mais populosa com 25% da população.
A expansão da LVC em Recife fica evidente quando se avalia o número de casos
observados em 2002 e compara-se aos casos de 2005.Após a primeira descrição de caso
autóctone de calazar canino na cidade do Recife, em um intervalo de aproximadamente três
anos houve um significante aumento(PAIVA CAVALCANTI et al., 2002). É provável que
tanto esta elevação do número de casos de LVC e sua expansão se deram em virtude da
modificação do padrão de transmissão, antes restrita a zonas rurais (GONTIJO e MELO,
2004).
As taxas de urbanização da doença têm aumentado sem que ocorra a diminuição das
taxas nas zonas rurais. Pelo fato da urbanização ser um fenômeno relativamente novo, pouco
se sabe da epidemiologia do calazar nos focos urbanos. As relações entre os componentes da
cadeia de transmissão no cenário urbano, parecem ser mais complexas que no rural (MELO,
2004).
Vale salientar ainda que o inseto transmissor é encontrado com mais freqüência em
lugares com abundancia de rochas. Ele invade facilmente o peri-domicílio, o interior de
residências humanas e abrigos de animais domésticos, adaptando-se a variadas temperaturas
(BRASIL, 2003).
Em Pernambuco, apesar de mais de 30 espécies, terem sido encontradas, apenas a
Lutzomyia longipalpis é apontada na transmissão do calazar (ANDRADE et al, 1999).
Contudo, apesar da descrição de um exemplar de L. longipalpis macho (OLIVEIRA, 1978),
até o momento não foi registrada a presença do vetor da LVC na cidade do Recife.
31
4 - Conclusão
Os dados obtidos permitem sugerir que a LVC também se encontra em processo de
expansão e urbanização na cidade do Recife, seguindo a tendência nacional.
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CAPÍTULO 2
OCORRÊNCIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO MUNICÍPIO DE
AMARAJI, ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL.
39
OCORRÊNCIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO MUNICÍPIO DE
AMARAJI, ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL.
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi relatar o caso de um cão fêmea, da raça Pointer, com
diagnóstico parasitológico positivo para Leishmaniose visceral, proveniente do município de
Amaraji, Litoral Sul do Estado de Pernambuco. Baseado nos achados clínicos e no
diagnóstico parasitológico sugere-se avaliar a situação epidemiológica do município.
ABSTRACT
The aim of this work was to report a case of a female pointer, with positive diagnosis for
zoonotic visceral leishmaniasis (ZVL), from the Amaraji County, in the south cost of
Pernambuco state. According to the clinical findings and parasitological diagnosis,
epidemiological situation of American Visceral Leishmaniasis in this county must be
evaluated.
40
OCORRÊNCIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO MUNICÍPIO DE
AMARAJI, ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL.
1 - Introdução
A Leishmaniose Visceral Americana (LVA) ou calazar é uma antropozoonose de
distribuição cosmopolita com ocorrência em 88 países dos quais 72 fazem parte do grupo
em estado de desenvolvimento. Aproximadamente 500 mil pessoas padecem da doença
com 90% dos casos concentrados em Bangladesh, Sudão, Índia, Nepal e Brasil.
Atualmente aproximadamente 1600 municípios brasileiros apresentam transmissão
autóctone (WHO, 2002; BRASIL, 2003).
A infecção é causada por protozoários pertencentes ao complexo Leishmania
donovani, que nas Américas é ocasionada pelas espécies Leishmania (Leishmania) infantum
e Leishmania (Leishmania) chagasi (BRASIL, 2003). Entretanto, com base nos perfis
isoenzimáticos as diferenças entre as duas espécies são tão pequenas que não permitem
identificá-las como espécies distintas (MAURÍCIO et al., 2000).
As características epidemiológicas da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) no
Brasil têm mostrado diferentes perfis associados ou não a problemas sócio-econômicos e
sanitários, o que diferencia sensivelmente a região nordeste das outras regiões como sudeste
e centro-oeste. Ainda, alterações no perfil de transmissão tem sido observadas na
epidemiologia do calazar canino, inicialmente predominadas por características de
41
ambientes rurais e periurbanas e mais recentemente em alguns centro urbanos aonde os cães
vem atuando como principal rsrbatório desta zoonose (PARANHOS-SILVA, et al. 1996).
Não obstante o perfil epidemiológico da doença, os sinais clínicos da LVC iniciam-
se geralmente de forma inespecífica por alterações dermatológicas e fâneros
(CIARAMELLA et al. 1997; FEITOSA et al. 2000), seguido por linfoadenomegalia,
epistaxe, caquexia (FERRER et al. 1995) além de distúrbios renais, hepáticos,
gastrintestinais e locomotores (FEITOSA et al. 2000).
Ainda tem que se considerar que os aspectos clínicos observados estão diretamente
relacionados com a resposta imune, particularmente da interação de linfócitos T e suas sub
populações (Cluster of Differentiaton Antigen 4- CD 4) e evidenciando que animais com
decréscimo de linfócitos T auxiliar 2 (Th2) apresentam maior susceptibilidade a infecção e
conseqüentemente quadro clínico aparente (MORENO et al. 1999; PINELLI et al. 1994).
Assim como em outras áreas brasileiras, o calazar canino encontra-se em expansão
no Estado de Pernambuco (DANTASn62( )-202.316.71693(9)6.56299(9)-3.6o5-9.83821(s)-1.63635( )-140..3173(z)1.965( )-140B6.56299(9)316.71693(9A)2.40434(N)2.40434(D)-7.87559(Ã)2.40434(O)2.40432(-)-16.5166(F)11.1634(I)]TJ322.022 0 Td[(L)14.7648(H)-7.87559(O)2.40434(,)-17.2771( )-192.036(2)-3.71693(0)-3.71693(0)6.56299(5)-3.71693())715(n)-, odavia a
ausência de estudos epidemiológicos principalmente na área litorânea dificultam um plano
de controle mais efetivo do calazar.
42
Um animal fêmea da raça pointer, adulta, proveniente do Município de Amaraji,
localizado no litoral sul do Estado de Pernambuco (Latitude 8° 24' 0'' Sul e longitude 35°27'
0'' Oeste), foi atendido, no Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de
Pernambuco com sinais clínicos sugestivos de LVC.
Procederam-se inicialmente a anamnese com obtenção de dados referentes ao local
de procedência e possíveis condutas terapêuticas. Ato contínuo realizou-se o exame físico
observando-se a presença ou não de alterações clínicas sugestivas de LVC. O exame
oftálmico foi procedido seguindo a semiotécnica oftálmica rotineira.
2.2- Diagnóstico Parasitológico
A pesquisa parasitológica foi realizada através da biópsia de medula óssea por
punção esternal, além de raspados de pele integra e lesionada com auxílio de lâminas de
bisturi
1
. Foram feitos esfregaços do material obtido em lâminas de vidro para microscopia
que após secagem foram fixados em álcool metílico e corados pelo método de coloração
rápida panótico
2
e examinados em microscópio óptico.
2.3- Diagnóstico Sorológico
Foi colhi3.71443(e)-8.3173( )250]TJ-281(d)6.5629ógmn61.969263.909 3431(e)1.96262(r)4.0432((')5.240(á)12.2425(21(v)6.56232((')5.240(l)0.441715(o)6.56299(n)-13.9966388(m)-3.26(e)1.96388(n)]TJ264.33( )-120.076(r)48492(s)-1.63761(t)0.4410047(i)0.446262(r)4.04r)0.4417)50070.441715(l)t)0.4411.027 0 Td[(d)6.5629n(l)0.441715(o)-3.716p33( )-120.076(r)48498(n)]TJ2649(m)7.0047( )140.636(m)-3.27522(e)tleto Vas ioanóico
43
3 - Resultados e Discussão
Ao exame clínico, áreas de alopecia, úlceras cutânea, além de onicogrifose,
44
a exaustão da resposta imune, notadamente aqueles relacionados com linfócitos T e CD4
sejam responsáveis pela supressão da resposta imune.
4 - Conclusão
Como os casos humanos são precedidos pelo calazar canino faz-se necessário
inquéritos epidemiológicos na população canina e humana para adoção de medidas de
controle no município de Amaraji.
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CAPÍTULO 3
ASPECTOS CLÍNICOS DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania (Leishmania) chagasi
NA REGIÃO METROPOLITANA DO
RECIFE
47
ASPECTOS CLÍNICOS DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania (Leishmania) chagasi
NA REGIÃO METROPOLITANA DO
RECIFE
RESUMO
Neste trabalho foram descritos os achados clínicos observados em 36 cães naturalmente
infectados por Leishmania sp. da Região Metropolitana do Recife. Os animais foram
submetidos a exames parasitológico e sorológico pelo ensaio de imunoadsorção enzimática
(ELISA). Os sinais clínicos mais freqüentes foram as úlceras cutâneas, seguido de
onicogrifose, perda de peso, linfadenomegalia e oftalmopatias. Sugere-se que em áreas
endêmicas para Leishmaniose visceral canina (LVC), os animais que apresentam esses
sinais clínicos devam ser investigados quanto à infecção por Leishmania (Leishmania)
chagasi.
ABSTRACT
The clinical findings observed in 36 naturally infected by Leishmania sp. from the
Metropolitan region of Recife are described. The animals were submitted to parasitological
and serological exams through the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).The most
frequent clinical findings were onycogryphosis, weight loss, lymphadenomegaly and
48
ophthalmopathies. It is suggested that in Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) endemic
areas, animals presenting these symptoms must be investigated for Leishmania
(Leishmania) chagasi infection.
ASPECTOS CLÍNICOS DE CÃES NATURALMENTE INFECTADOS POR
Leishmania (Leishmania) chagasi
NA REGIÃO METROPOLITANA DO
RECIFE
1 – Introdução
A Leishmania (L.) chagasi é o agente da Leishmaniose Visceral Americana (LVA)
também conhecida como calazar (WHO, 1990), cuja espécie canina é considerada o
principal reservatório urbano deste parasito (ASHFORD et al. 1998). No Brasil, a
prevalência da Leishmaniose Visceral Canina (LVC) varia de 2,5% a 46,6% em áreas
endêmicas (ALBUQUERQUE et al. 2006). Entretanto, estudos prévios levam à conclusão
de que a prevalência e incidência tenham sido até hoje subestimadas (CABRAL et al. 1998).
Cães infectados por L. chagasi podem apresentar manifestações clínicas diversas
sendo que a resposta imune do hospedeiro determina o tipo de síndrome resultante da
infecção. Desta forma é possível classificar os cães como assintomáticos, oligosintomáticos
ou sintomáticos (SANTA-ROSA e OLIVEIRA, 1997).
Classicamente a LVC apresenta sinais inespecíficos como lesões cutâneas,
principalmente descamação, eczema, alopecia, úlceras de pele, pêlos sem brilho, nódulos
subcutâneos, emagrecimento, apatia, febre irregular, coriza, ceratoconjuntivite, onicogrifose,
linfoadenopatia, edema, diarréia, hemorragia intestinal, esplenomegalia e hepatomegalia,
49
entre outros (CIARAMELLA et al. 1997; SANTA ROSA e OLIVEIRA, 1997; NOLI, 1999;
FEITOSA et al. 2000; BONATES, 2003; BRASIL, 2004; PAIVA CAVALCANTI et al.
2005).
Esta ampla variedade de sinais clínicos torna o diagnóstico clínico difícil, sendo necessário o auxílio de
outros métodos diagnósticos, quer seja parasitológicos, sorológicos ou moleculares para a sua segura realização do
diagnóstico (FERRER, 1999).
O objetivo deste trabalho foi relatar as características clínicas de cães com diagnóstico positivo LVC na
Região Metropolitana do Recife (RMR).
2 - Material e Métodos
2.1- Animais
Foram utilizados neste estudo, 142 cães de raças e idades variadas, de ambos os sexos e domiciliados na
Região Metropolitana do Recife. Estes cães foram submetidos a uma avaliação clínica por médicos veterinários de
clínicas particulares ou do Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e ao
apresentarem suspeita de calazar eram encaminhados ao ambulatório de Leishmaniose do referido hospital para
realização do exame.
Inicialmente foi realizada anamnese de cada animal, c78.5237(o)78.5237( )85astaaçã de c hoerefefaetoaeo
50
2.3- Diagnóstico sorológico
Para o exame sorológico foi realizada coleta de sangue através da venopunção da veia cefálica, com o
auxílio de uma agulha
4
25 x 7 mm acoplada a uma seringa
5
de 5 ml. O soro obtido foi
acondicionado em tubos plásticos
6
previamente identificados e congelados a temperatura de
-20°C. A pesquisa de Anticorpos anti-Leishmania foi realizado através dos testes de ELISA
pelo kit EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos, lote 053El0027 que utiliza
antígeno solúvel de formas promastigotas de Leishmania major-like. O teste foi realizado no
Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas
Aggeu Magalhães, Fundação do Instituto Oswaldo Cruz (Cpqam/FIOCRUZ).
3 - Resultados e Discussão
Dos 142 animais atendidos no ambulatório de leishmaniose da UFRPE, 25,35% (36/142) apresentaram
um ou mais sinais clínicos sugestivos de LVC e foram então incluídos neste estudo. O restante dos cães
apresentavam-se assintomáticos no momento do exame clínico. Os sinais clínicos apresentados por cada animal
encontram-se na Tabela 1. Neste estudo foram diagnosticados 50,0% (18/36) de animais positivos ao teste
parasitológico e 77,7% (28/36) positivos no teste sorológico.
Tabela 1. Freqüências absoluta e relativa dos sinais clínicos encontrados nos animais positivos para Leishmaniose
Visceral Canina na Região Metropolitana do Recife, 2006
Sinal clínico Freqüência absoluta Freqüência relativa (%)
Úlcera Cutânea 29 80,6
Onicogrifose 21 58,3
Descamação Cutânea 02 5,6
Nódulo 01 2,8
Perda de Peso 18 50,0
Oftalmopatia 16 44,4
Linfoadenopatia 14 38,9
51
Epistaxe 06 16,7
Artropatia 05 13,9
Edema 01 2,8
Os sinais clínicos mais freqüentes foram as úlceras cutâneas, seguido de onicogrifose, perda de peso,
linfadenomegalia e oftalmopatias, o que corrobora com Albuquerque (2005) e Alves e Faustino (2005), que
asseguram ser as dermatopatias e onicogrifose sinais observados em animais com LVC, assim como Morais et al.
(2003) que descreveram a perda de peso, lesões de pele e oftalmopatia em cães da RMR como principais sinais
clínicos, embora esses autores não tenham registrado a freqüência, o que dificulta uma comparação com os dados
do presente estudo.
Da mesma forma os dados referentes à presença de úlceras na pele aqui observados, são próximos
daqueles resultados descritos por Almeida et al. (2005), que relataram a freqüência de 80% desta dermatopatia em
cães no Estado de Pernambuco. Contudo, a freqüência desta lesão cutânea observada no presente estudo foram
inferiores aquelas observadas por Ciaramella et al. (1997), Marzochi et al. (1985) e Natami et al. (2000) que
relataram lesões dermatológicas em 40%, 3% e 8% respectivamente dos animais com infecção natural por
Leishmania sp. Apesar da úlcera cutânea não ser um sinal clinico patognomônico da LVC, a razão para o
aparecimento das úlceras pode ser devido à resposta do hospedeiro vertebrado à infecção, além da ação direta do
parasito e a vasculite necrosante causada por deposição de imunocomplexos (NOLI, 1999). Sendo assim, a
multiplicação das formas amastigotas produz um processo inflamatório com atração de novas células para o sitio da
infecção gerando um infiltrado inflamatório composto por linfócitos e macrófagos o que leva à formação e
aparecimento de um nódulo. O processo se expande pela multiplicação do parasita em novas células, agravando o
processo inflamatório, levando à ulceração superficial da pele. Segue-se necrose da epiderme e da membrana basal
que culmina com uma lesão úlcero crostosa (RIBEIRO, 2005).
Analisando os dados aqui encontrados referentes à onicogrifose, observa-se que o crescimento das unhas
esteve presente 58,3% (21/36) dos animais deste estudo. Segundo Marzochi et al. (1985), a onicogrifose dá-se
52
devido ao estímulo pelo parasita à matriz ungueal, mas também deve ser considerado que a hipertrofia se deva ao
menor uso das unhas por causa da apatia apresentada pelo animal, sendo este sinal não considerado patognomônico.
Os achados de onicogrifose nos animais com infecção natural por Leishmania sp, variam muito
(MARZOCHI et al. 1985; CIARAMELLA, et al. 1997; FEITOSA et al. 2000; NATAMI et al. 2000;
ALMEIDA et al. 2005; PAIVA CAVALCANTI et al. 2005), notadamente de acordo com a fase de evolução da
doença, sendo impreciso sua comparação com outros achados na literatura.
As oftalmopatias aqui relatadas (44,4%) são superiores aos achados encontrados na literatura, a citar
33,3%, 29% 19%, 15%, 16%, e relatados por Paiva Cavalcanti et al. (2005), Feitosa et al. (2000), Barrouin-Melo et
al. (2006), Natami et al. (2000) e Ciaramella, et al. (1997) respectivamente. Os diferentes achados na literatura
podem provir da não uniformidade do exame oftálmico.
Com relação à perda de peso, 50,0% (18/36) dos cães do presente estudo apresentaram esse sinal. Estes
dados são superiores a vários descritos na literatura como Marzochi et al. (1985) que observaram perda de peso em
6%, dos animais acometidos por LVC, Ciaramella et al. (1997) e Natami et al. (2000) que observaram 17% e 32 %
de cães com calazar que apresentavam emagrecimento, além de Feitosa et al. (2000) e Barrouin-Melo et al.(2006)
que registraram redução no peso em 47% dos animais com LVC. Contudo, dados relativos ao emagrecimento
deste estudo foram inferiores aqueles descritos
por Paiva Cavalcanti et al (2005) que identificaram a perda de
peso em 63,9% em cães na
RMR. Da mesma forma que comentado anteriormente para outros sinais clínicos, a
razão para estas diferenças pode ser devido a fase de evolução doença.
No que se refere a epistaxe, 16,7% (6/36) dos animais apresentaram este tipo de sangramento, sendo a sua
presença reportada por Feitosa et al (2000), em apenas 3% de animais em seu estudo. Apesar da literatura reportar
trombocitopenia em cães com doença clínica severa (CIARAMELLA et al., 1997) e conseqüente episódios de
epistaxe, deve-se considerar que a associação da presença , nienariterdo) a oe soo t i% o) psr
53
Neste trabalho, a linfoadenopatia associado a LVC foi observada em 38,9% (14/36) dos animais. O
achado de infartamento ganglionar nos animais com infecção natural por Leishmania sp variam muito
(MARZOCHI et al., 1985; CIARAMELLA et al., 1997; NATAMI et al., 2000; PAIVA CAVALCANTI et al.,
2005; FEITOSA et al., 2000), na dependência da reação individual ao agente etiológico, devido há uma proliferação
da zona B e uma depleção das células T. Nesta ocasião os gânglios linfáticos aparecem muito reativos com
presença de células plasmáticas, eosinófilos e macrófagos e alguns com presença de forma amastigotas (NOLI,
1999).
4- Conclusão
Em áreas endêmicas para LVC, os animais que apresentam dermatopatias,
onicogrifose e linfoadenopatia devem ser investigados quanto a infecção por Leishmania
(Leishmania) chagasi.
5- Referências
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57
CAPÍTULO 4
COMPARISON BETWEEN DIFFERENT DIAGNOSTIC KITS USED FOR CANINE
VISCERAL LEISHMANIASIS
58
COMPARISON BETWEEN DIFFERENT DIAGNOSTIC KITS USED FOR CANINE
VISCERAL LEISHMANIASIS
ABSTRACT
The definitive diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) is obtained through the
demonstration of the parasite in bone marrow, spleen, liver and lymph nodes smears, but
this diagnostic method is invasive, limited and frequently inconclusive. These
disadvantages render serologic methods to be essential to CVL diagnosis. The aim of this
work was to compare two ELISA systems with different antigens for CVL diagnoses. The
evaluation in series presented an increase on sensibility and the assessment of the
association in parallel showed an increase in specificity, allowing safer results due to the
reduction on false negative and false positive cases.
59
COMPARISON BETWEEN DIFFERENT DIAGNOSTIC KITS USED FOR CANINE
VISCERAL LEISHMANIASIS
1 - Introduction
Increasing geographic expansion and urbanization of American Visceral
Leishmaniasis (AVL) in Brazil require efficient control measures, mainly concerning the
dog as its major reservoir which maintains focus in endemic areas. Therefore the correct
identification of infected dogs becomes an important AVL control measure (MELO, 2004).
Clinical diagnosis in the dog is complex because this zoonosis may present clinical
signs which are common to other diseases in endemic areas (GONTIJO and MELO, 2004).
Such difficulties demand a confirmatory diagnosis through parasitological, immunological
and molecular methods (CARVALHO-NETA, 2004).
In spite of being a simple and certain, the parasitological method is invasive, and has
a low sensibility in detecting the parasite. In contrast, the immunological methods have its
use facilitated for being less invasive, more practical and for detecting specific
immunoglobulins (CARVALHO-NETA, 2004). Hence, there are a great range of serologic
tests such as Indirect Immunofluorescence (IFAT), Western Blot (WB), Direct agglutination
test (DAT) and immunosorbent immuno assay (ELISA) (SUNDAR and RAI, 2002).
Indirect Immunofluorescence test has been widely used in the CVL diagnosis
because of its easy preparation and antigen acquirement, and low price. However, cross
reactions (CARVALHO-NETA, 2004), its tedious execution and difficulty in using for
epidemiologic surveys (MANCIANTI et al. 1995), have been limiting to the use of this
technique.
60
The ELISA test described by Engvall et al. (1971) was introduced by Hommel
(1976) in the diagnosis of calazar using as antigen sources intact, lysed parasites or
recombinant antigens, increasing its sensibility (CARVALHO-NETA, 2004).
Some authors have demonstrated the possibility of using these recombinant antigens
or antigens excreted by promastigotes forms cultured in a protein free chemical medium, for
CVL diagnosis (SOUZA et al., 2004).
According to Scalone et al. (2002), the use of these antigens improves sensibility and
specificity of the technique and also facilitates its acquisition. Nevertheless, cross reactions
with diseases caused by other tripanossomatides may still occur (ALVES e BEVILAQUA,
2004) as described by Lira (2005), who observed cross reaction with demodicosis and
erlichiosis.
In this work two ELISA systems performed with distinct antigens were compared for
its use in CVL diagnosis.
2 - Material and Methods
2.1- Animals
Dogs (n=142) of varied breeds and ages, of both genders, residing ins s63.7123.71693(f)4.0432( )-u95 -26.88 Td[Mretroolitan region of Recie we e included Iiti lly in this stdy, the ogs uderent
clinicl evalation y veterinrians from private7123.71693 linis r from the eterinary Hosital f
the Uierside eeral ural de P6ernambco (UE ) an were sent to ths63.7123.71693(f)4.043202.6912 -26.88 Td[(L)14.7642(e)1.96325itshmanasis lini of the ertamento de ediin eterinri of the E
61
Following the animals arrival, anamneses was conducted and data from general
condition, breed, gender, age, and the process evolution as well as data concerning its
residence and possible journeys were taken. In addition, routine physical examination
through skin inspection and regional lymph nodes palpation was carried out.
2.2- Parasitological diagnosis
The parasitological examination was performed through bone marrow biopsy.
Following antisepsis iliac crest bone puncture using disposable syringes
1
and needle
2
was
conducted. Using the material obtained, smears stained by the panoptic
3
method were
confectioned and observed under optic microscopy.
2.3- Serological diagnosis
The serological exam was performed through blood samples collected at the cephalic
vein using disposable syringes
4
and needles
5
. Following blood clotting, sera was removed
and placed in previously identified plastic tubes
6
frozen at a -20
0
C for posterior use.
Two ELISA systems were used in the present work : EIE-Leishmaniose-Visceral-
Canina–Bio-Manguinhos
6
, batch 053El0027 which uses soluble promastigotes forms of
Leishmania major-like and by the Kit of canine calazar ELISA S7®
7
, batch 02/05 which
uses recombinant peptide of Leishmania chagasi.Tests were conducted according to the
manufactures instructions , at the Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de
62
Imunologia do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães Cpqam/FIOCRUZ and the
Laboratório da Biogene Indústria e comércio Ltda.
For the comparison between the achieved results in both ELISAs, kappa concordance
index was used (SOUZA et al, 2004).
3- Results and Discussion
The parasitological test results revealed amastigotes presence in 26% (38/142) of the
examined animals. EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos kit with the
parasitological diagnosis is summarized in Table 1.
Table 1. Data of EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos with the
parasitological criteria, Recife, 2006
TEST BONE MARROW BIOPSY
positive negative TOTAL
SEROLÓGIC positive 25 15 40
negative 13 89 102
TOTAL 38 104 142
The results obtained in EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos test
with the parasitological criteria revealed sensibility of 65.79% and specificity of 85.58% (CI
95%). The positive and negative predictive values were 62.50% and 87.25% respectively. At
the concordance analysis the kappa index value was 0.505 meaning a reasonable
concordance.
63
According to Gontijo and Melo (2004), in spite of the different techniques for the
diagnosis of CVL, none presents 100% specificity and sensibility where a definite diagnosis
depends on the parasite demonstration through the parasitological methods.
Using the same EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos kit Lira (2005)
found a higher sensibility (72%) and specificity (87%) compared to results obtained in this
work. The results obtained trough the canine calazar ELISA S7®kit with the parasitological
diagnosis are demonstrated on Table 2.
Table 2. Data of ELISA S7® with the parasitological criteria. Recife, 2006
TEST BONE MARROW BIOPSY
positive negative TOTAL
SEROLOGIC
positive 18 11 29
negative 20 93 113
TOTAL 38 104 142
The analyses performed using the canine calazar diagnostic ELISA S7®kit showed
sensibility of 47.37% and specificity of 89.42% (CI 95%). The positive and negative
predictive values were 62.07% and 82.3% respectively. At the concordance analysis the
kappa index value was 0,398 meaning a regular concordance. The distribution of the optic
densities obtained in both tests is demonstrated at Figure 1.
The results obtained trough the EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos
kit and compared with canine calazar diagnostic ELISA S7®kit are shown in table 3.
64
Gráfico das DOs obtidas através da
técnica de ELISA
Placa 1 Placa 2 Placa 1 Placa 2
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
1.00
1.05
1.10
1.15
1.20
1.25
1.30
1.35
1.40
1.45
1.50
1.55
Placa 1
Placa 2
Bio-Manguinhos
Biogene
Placa 2
Placa 1
DO 450nm
Figure 1- Optic densities (DO) distribution observed in the different ELISA
systems used in the CVL diagnosis.
Plate 1
Plate2 Plate 1 Plate2
Plate 1
Plate 2
Plate 1
Plate 2
65
Table 3. Data of EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina–Bio-Manguinhos kit and canine
calazar diagnostic ELISA S7® Biogene kit. Recife, 2006
TEST EIE-LVC
Positive negative TOTAL
ELISA S7®
positive 23 06 29
negative 17 96 113
TOTAL 40 102 142
A better sensibility was observed when EIE-LVC kit was evaluated alone. The
specificity on the other hand was lower when compared to ELISA S7®. When comparing
the results obtained by the two ELISA systems using the total canine sera (n = 142) a regular
concordance was observed (kappa=0,563).
These results are inferior to that found by Souza et al. (2004) who observed Kappa=
0, 62 when comparing two ELISAs with different Leishmania chagasi proteic preparations,
and also lower than those findings of Scalone et al. (2002) who observed 0,89for the same
index when carried out a concordance between an ELISA and a Immunofluorescence test.
Aiming to reduce the number of false-negative and false –positive results, both tests
were analyzed associated in series and then in parallel. At the parallel association of both
tests, sensibility of 81.99%, specificity of 76.53%, with positive predictive value of 56.07%
and negative predictive value of 92.08 % was observed. A positive result in a parallel
association is achieved, when only one of the tests is reactive, whilst in a series association
66
both tests must be reactive (PFEIFFER, 2002). As for the series association of both tests, a
sensibility of 31.16%, specificity of 98.47%, with positive predictive value of 88.19% and
negative predictive value of 79.65%was observed.
In this study, the use of these associations resulted in an increase of the sensibility
when using a parallel analysis and 98.47% when using a series analyses, even though the use
of both tests in association must be considered due to its advantages and disadvantages,
particularly cost wise.
4- Conclusions
The evaluation of ELISA kits in association for the CVL diagnosis increase of the
sensibility when evaluated in parallel and increase of the specificity when evaluated in
series. The consequences are safer results due to reduction of false positive and false
negative results.
5- Referencies
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69
7-CONCLUSÕES GERAIS
1- Seguindo a tendência nacional, a LVC também se encontra em processo de urbanização
na cidade do Recife;
2- Como os casos humanos são precedidos pelo calazar canino faz-se necessário inquéritos
epidemiológicos na população canina e humana para adoção de medidas de controle no
município de Amaraji;
3- Em áreas endêmicas para LVC, os animais que apresentam dermatopatias, onicogrifose e
linfoadenopatia devem ser investigados quanto a infecção por Leishmania (Leishmania)
chagasi;
4-
A avaliação dos Kits ELISA em associação para o diagnóstico da leishmaniose visceral
canina aumentam a sensibilidade quando avaliados em paralelo e aumentam a especificidade
quando avaliados em série apresentando como conseqüências resultados mais seguros
devido a redução no número de falso positivos e falso negativos.
70
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