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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM OCEANOGRAFIA
CRESCIMENTO E PROPRIEDADES NUTRICIONAIS DE
Chaetoceros muelleri LEMMERMAN PARA AQÜICULTURA:
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO
Evaldení Guiomar Moreira
Recife
2007
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM OCEANOGRAFIA
Evaldení Guiomar Moreira
CRESCIMENTO E PROPRIEDADES NUTRICIONAIS DE
Chaetoceros muelleri LEMMERMAN PARA AQÜICULTURA:
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO.
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Oceanografia/
Universidade Federal de Pernambuco,
como requisito para obtenção do grau
de Mestre em Oceanografia.
Orientadora: Dra. Maria Luise Koening
Co-Orientador: Dr. Alfredo Matos Moura Junior
Recife
2007
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551.46CDD (22.ed.)
BCTG/2006-047
1. Oceanografia. 2. Aqüicultura. 3. Chaetoceros muelleri
Lemmerman – Composição bioquímica. 4. Chaetoceros muelleri
Lemmerman – Propriedades nutricionais. I. Título.
UFPE
Inclui Bibliografia.
CTG. Oceanografia, 2007.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco.
63 folhas.: il.; fig., tabs.
Crescimento e propriedades nutricionais de Chaetoceros muelleri
Lemmerman para aqüicultura: comparação entre diferentes meios de
cultivo. – Recife: O Autor, 2007.
M838c Moreira, Evaldení Guiomar
Dedico à minha família...
AGRADECIMENTOS
A Deus por me proporcionar viver.
A minha mãe Aldenora Moreira e meu pai Benedito Moreira que apóiam meus
sonhos com tanto cuidado e zelo.
Aos meus irmãos pelo apoio e amizade, em especial minha querida e única irmã
Evaldinólia Moreira.
Aos professores Marco Cutrim e Andréa Azevedo que muito incentivaram minha
vinda a Recife para o mestrado.
A minha amiga e orientadora Profa. Dra. Maria Luise Koening, que acreditou neste
projeto e muito se dedicou para soluções dos vários problemas que enfrentamos e que
proporcionaram a finalização desta dissertação... muito obrigada.
Ao amigo e co-orientador Prof. Dr. Alfredo Matos Moura Junior pela sua
experiência com o assunto e enumeráveis sugestões para o desenvolvimento e
finalização deste trabalho.
Aos membros da banca, professores Drs. Rauquírio André Albuquerque Marinho da
Costa, Lília Pereira de Souza Santos, Alfredo Olivera Gálvez e Enide Eskinazi
Leça, pelas valiosas considerações.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Oceanografia, não só pelas
lições aprendidas em sala de aula, mas também pelas lições de vida, momentos que
marcaram e que não se esquece.
A Profa. Dra. Lucia Gusmão, uma pessoa sem igual, alegre e sempre com uma
palavra de incentivo, sempre preocupada com as pessoas a sua volta e disposta
a
ajudar.
Aos Profs. Dr. Silvio Macêdo, Dr. Fernando Feitosa e Dr. Manuel Flores, por serem
sempre prestativos e atenciosos a qualquer questionamento.
As Profas. Dra. Maria Elizabeth Cavalcante Chaves, Dra. Maria da Paz e
Msc.Vera Cristina Oliveira de Carvalho que disponibilizaram seu tempo e sem elas
não seria possível a finalização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. José Luís de Lima Filho (Diretor do LIKA) pelo apoio logístico.
A Profa. Dra. Edleide Freitas Pires e a Sebastião Camilo de Melo Filho pela
disponibilidade e integração dos departamentos da universidade com seus alunos.
As Profas. Dras. Fátima Queiroz e. Glicia Calazans e o Prof. Dr. Cláudio Câmara
que também contribuíram de forma valorosa.
As amigas Keyla e Iara que nas horas de pequenos imprevistos sempre me
salvaram na hora H.
As amigas Natália e Daniele, que também se dispuseram e contribuíram, para o
andamento deste trabalho.
As pessoas que fazem parte do Departamento de Oceanografia e que sempre estão
prontas para estender a mão a um pedido de ajuda: Paulinho, Beto, Mano, Tiba,
Edleusa, Joaquim e, em especial, nossa amiga de todos os momentos e soluções,
Mirna.
Aos amigos que fiz ao longo desses três anos, os meninos Leandro, Thiago, Sergio,
Jesser, Alexandre, Augusto, Eroni, Neto, Negaum, Jorge e as meninas Fabiana,
Adilma, Lílian, Val, Maristela, Doris, Dani, Renata, Tatiana, Adriane. Se
continuasse essa lista seria realmente imensa ... mas só tenho muito a agradecer ter
encontrado pessoas tão bonitas de alma e sempre com uma palavra amiga para dar
aquela animada nos momentos de desestimulo.
Às amigas Xio, Bel e Pato, grandes amigas ... obrigada por tudo, momentos muito
felizes e verdadeiros. Vocês sempre estarão na minha mente e coração...nada supera
uma amizade, nem mesmo a distância.
AGRADECIMENTOS INSTITUCIONAIS
A CAPES pela concessão de bolsa que possibilitou a realização desta pesquisa.
Ao LIKA – UFPE pelo apoio a este trabalho.
Aos Deptos. de Bioquímica, Nutrição, Antibióticos e Oceanografia – UFPE pelo apoio
logístico.
For want of a nail a shoe was lost,
For want of a shoe a horse was lost,
For want of a horse a rider was lost,
For want of a rider a battle was lost,
For want of a battle the kingdom was lost,
And all for want of a horseshoe nail.
“Trecho de historieta infantil,
afixada no Anglo_American Supply Headquarters – Londres,
segunda guerra mundial”
Tradução livre:
Por falta de um prego perdeu-se uma ferradura,
Por falta de uma ferradura perdeu-se um cavalo,
Por falta de um cavalo perdeu-se um cavaleiro,
Por falta de um cavaleiro perdeu-se uma batalha,
Por falta de uma batalha perdeu-se o reino,
E tudo por falta de um prego de ferradura.
RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo determinar a composição bioquímica de
Chaetoceros muelleri Lemmerman, uma importante espécie para atividades na
aqüicultura, em diferentes meios de cultivo. Os bioensaios foram realizados em duas
etapas e mantidos nas mesmas condições (iluminação constante; 22±1°C; pH de 8 a
9 e salinidade 33 ups). O meio controle utilizado foi F/2 Guillard (F/2) e os meios
alternativos de cultivo foram extrato de esterco de gado (EEG) e de minhoca (EEM).
Na primeira etapa, a diatomácea C. muelleri foi cultivada em 500 mL dos meios de
cultivo, em triplicatas, e determinou-se a densidade celular, taxa diária de
crescimento, clorofila a e biovolume. A fase exponencial foi definida através da curva
de crescimento. A segunda etapa dos bioensaios foi iniciada em garrafão plástico
até o volume final de 20 litros, para cada meio. A cada aumento do volume foram
determinadas a densidade celular e a concentração de clorofila a. As análises
bioquímicas foram realizadas com o material precipitado dos garrafões (20 L),
através de centrifugação (4000 rpm, 15 min). Esse precipitado foi seco em estufa até
peso constante, à temperatura de 40ºC. Foram analisados nitrogênio total,
carboidrato total, proteína total e lipídeo total, em triplicatas. Na primeira etapa dos
bioensaio, as maiores densidades celulares foram de 11,05±1,32 x10
6
céls.mL
-1
, F/2;
no 6
0
dia; de 8,33±0,83 x10
6
céls.mL
-1
,
EEG, no 4
0
dia e de 6,86±0,38 x10
6
céls.mL
-1
,
EEM, 8
0
dia. O valor médio da taxa diária de crescimento celular de C. muelleri, na
fase log, para o meio F/2 foi de 0,65±0,70, enquanto que, para os meios EEG e EEM
foi de 0,97±0,43 e 0,36±0,31, respectivamente. Os teores máximos de clorofila a
foram de 0,34±0,03 pg.cél.
-1
,
no 7
0
dia, meio F/2; de 0,74±0,90 pg.cél.
-1
, no 9
0
dia;
meio EEG e de 2,26±1,70 pg.cél.
-1
, no 12
0
dia, meio EEM. Os maiores valores de
biovolume celular foram de 528,55±321,06 μm
3
, para o meio F/2 e de 515,28±351,87
μm
3
, para o meio EEG, no 5
0
dia, em ambos meios; e, de 534,17±454,13 μm
3
, para
o meio EEM, no 11
0
dia. Na segunda etapa dos bioensaios, para o volume final de
20 L, as concentrações médias da densidade celular para o meio F/2 foi de
21,61±0,24 x10
6
céls.mL
-1
, para o meio EEG de 18,53±0,43 x10
6
céls.mL
-1
e para o
meio EEM de 23,07±0,44 x10
6
céls.mL
-1
. Os teores médios de clorofila a foram de
0,90±0,01 x10
-7
pg.cél.
-1
, para o meio EEG, seguida de 0,79±0,05 x10
-7
pg.cél.
-1
,
para o meio EEM e de 0,73±0,02 x10
-7
pg.cél.
-1
,
para o meio F/2. Quanto ao
nitrogênio total, os valores médios foram 3,35±0.06% de matéria seca, para o meio
EEM; 2,30±0,05% de matéria seca, para o meio F/2 e 1,80±0.05% de matéria seca,
para o meio EEG. Em relação ao valor médio de lipídio total, no meio EEM foi de
0,112±0,001 pg.cél.
-1
; e para os meios F/2, de 0,104±0,001 pg.cél.
-1
e EEG,
0,100±0,001 pg.cél.
-1
. Para a proteína total, o valor médio no meio EEM, foi de
0,226±0,012 pg.cél.
-1
e nos meios F/2, de 0,140±0,014 pg.cél.
-1
e EEG, 0,125±0,001
pg.cél.
-1
. Para o carboidrato total, o valor médio no meio EEM, foi de 36,22±1,53
pg.cél.
-1
,
seguido dos meios EEG, 29,16±0,81 pg.cél.
-1
e F/2, 19,76±0,85 pg.cél.
-1
.
Entre as médias dos dados analisados para os bioensaios (F/2, EEG e EEM), foram
encontradas diferenças significativas (p<0,05). Estatisticamente, em relação aos
parâmetros analisados para a espécie C. muelleri, o meio extrato de esterco de
minhoca demonstrou que pode ser utilizado como fonte nutritiva para o
desenvolvimento algal, podendo substituir meios convencionais como o meio F/2
Guillard.
Palavras-chave: Crescimento; propriedades nutricionais; Chaetoceros muelleri,
meios alternativos; composição bioquímica.
ABSTRACT
The aim of this work was to determine the biochemical composition of Chaetoceros
muelleri Lemmerman, an important species for aquiculture activities, in different
culture media. Bioassays were developed in two steps and maintained in the same
conditions (constant illumination; 22±1°C; pH from 8 to 9 and salinity 33 psu). Control
medium used was F/2 Guillard (F/2) and alternative media were cattle dung extract
(EEG) and earthworm dung extract (EEM). For the first step. the diatom C. muelleri
was cultivated into 500 mL (n=3), for cellular density, growth rate, chlorophyll a and
biovolume determination. As the exponential phase growth was defined, through the
growth curve. The second step started with species cultivation in plastic carboy, until
20 L, for each medium. Cellular density and chlorophyll a content were determinated
for each increased volume. Total nitrogen, total carbohydrate, total protein and total
lipid were analyzed, in 3 replicates, from dry precipitated alga from carboys (20 L)
(4000 rpm, 15 min). In the first step. cellular density maximum values was
11.05±1.32 x10
6
cells.mL
-1
, in F/2 (6th day); 8.33±0.83 x10
6
cells.mL
-1
, in EEG (4th
day) and 6.86±0.38 x10
6
cells.mL
-1
, in EEM (8th day). Daily rate cellular growth
average value, in log phase, was 0.65±0.70 to F/2, while, to EEG and EEM media
were 0.97±0.43 and 0.36±0.31, respectively. Chlorophyll a maximum content was
0.34±0.03 pg.cell
-1
(7th day) in F/2 medium; 0.74±0.90 pg.cell
-1
(9th day) in EEG
medium and 2.26±1.70 pg.cell
-1
(12th day) in EEM medium. Cellular biovolume
maximum values was 528.55±321.06 μm
3
, to F/2 medium and 515.28±351.87 μm
3
to
EEG medium, in the 5th day, in both media. EEM medium presented 534.17±454.13
μm
3
(11th day). For the second step. the average value cellular density was
21.61±0.24 x10
6
cells.mL
-1
to F/2 medium; 18.53±0.43 x10
6
cells.mL
-1
to EEG
medium and 23.07±0.44 x10
6
cells.mL
-1
to EEM medium. The chlorophyll a average
content was 0.90±0.01 x10
-7
pg.cell
-1
to EEG medium; 0.79±0.05 x10
-7
pg.cell
-1
to
EEM medium and 0.73±0.02 x10
-7
pg.cell
-1
to F/2 medium. Total nitrogen average
value was 3.35±0.06% to EEM medium, followed by 2.30±0.05%, to F/2 medium and
1.80±0.05% to EEG medium. Total lipid average value was determined to EEM
medium, 0.112±0.001 pg.cell
-1
. In F/2 medium, its content was 0.104±0.001 pg.cell
-1
and 0.100±0.001 pg.cell
-1
to EEG medium. As well as for total protein, the average
value determined was to EEM medium, 0.226±0.012 pg.cell
-1
. In F/2 medium,
0.140±0.014 pg.cell
-1
and to EEG medium, 0.125±0.001 pg.cell
-1
. Total carbohydrate
average value was to EEM medium, 36.22±1.53 pg.cell
-1
. In EEG medium, it was
26.16±0.81 pg.cell
-1
and to F/2 medium, it was 19.76±0.85 pg.cell
-1
. Among the
averages of the data analyzed for the bioensaios (F/2, EEG and EEM), were found
significant differences (p <0,05). Statisticaly, in relation to the parameters analyzed
C. muelleri species, the earthworm dung extract media demonstrated that it can be
used as algal development nutritious source, could substitute conventional medium
(F/2 Guillard).
Words-key: Growth; nutritional property; Chaetoceros muelleri, alternative medium;
biochemical composition.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE APÊNDICES
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
15
2 OBJETIVOS............................................................................................................
20
2.1 Objetivo geral................................................................................................... 20
2.2 Objetivos específicos....................................................................................... 20
3 TRABALHOS SOBRE CULTIVO DE MICROALGAS NO BRASIL.......................
21
4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................
23
4.1 Posicionamento taxonômico da espécie cultivada, segundo
Round et al. (1992)......................................................................................................
23
4.2 Chaetoceros muelleri Lemmerman segundo Reink (1984).............................. 23
4.3 Organismo........................................................................................................ 24
4.4 Primeira etapa dos bioensaios........................................................................ 25
4.4.1 Densidade e taxa diária de crescimento celular........................................
26
4.4.2 Clorofila a.......................................................................................................
26
4.4.3 Biovolume celular...........................................................................................
27
4.5 Segunda etapa dos bioensaios........................................................................ 27
4.5.1 Densidade celular..........................................................................................
27
4.5.2 Clorofila a.......................................................................................................
27
4.5.3 Análises bioquímicas...................................................................................
28
4.5.4 Tratamento estatístico.................................................................................
30
4.5.5 Normalização do texto..................................................................................
30
5 RESULTADOS.......................................................................................................
31
5.1 Primeira etapa dos bioensaios....................................................................... 31
5.1.1 Densidade e taxa diária de crescimento celular........................................
31
5.1.2 Clorofila a.......................................................................................................
32
5.1.3 Biovolume celular ........................................................................................
32
5.2 Segunda etapa dos bioensaios...................................................................... 33
5.2.1 Densidade celular.........................................................................................
33
5.2.2 Clorofila a......................................................................................................
34
5.2.3 Análises bioquímicas..................................................................................
34
6 DISCUSSÃO..........................................................................................................
36
6.1 Primeira etapa dos bioensaios....................................................................... 36
6.2 Segunda etapa dos bioensaios...................................................................... 37
7 CONCLUSÕES......................................................................................................
42
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................
43
APÊNDICES................................................................................................................
54
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Frústula vegetativa de Chaetoceros muelleri Lemmerman, em
microscópio de esquadrinhamento de elétron. Escala = 10 μm. Fonte:
Reinke (1984).............................................................................................
23
Figura 2. Concentrações médias da densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) e curvas de
cescimento de Chaetoceros muelleri cultivada nos meios F/2 Guillard
(F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de
minhoca (EEM), durante o período de 12 dias de
cultivo.........................................................................................................
31
Figura 3. Teores médios de clorofila a (pg.cél.
-1
) de Chaetoceros muelleri
cultivada nos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG)
e extrato de esterco de minhoca (EEM), durante o período de 12 dias de
cultivo........................................................................................................
32
Figura 4. Valores médios do biovolume celular (µm
3
) de Chaetoceros muelleri
cultivada nos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG)
e extrato de esterco de minhoca (EEM), durante o período de 12 dias de
cultivo.........................................................................................................
33
Figura 5. Concentrações médias da densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) de
Chaetoceros muelleri cultivada nos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de
esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de minhoca (EEM), até
volume final de 20 L: i – início do cultivo com 2 L......................................
33
Figura 6. Teores médios de clorofila a (10
-7
pg.cél.
-1
) de Chaetoceros muelleri
cultivada nos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG)
e extrato de esterco de minhoca (EEM), até volume final de 20 L: i –
início do cultivo com 2 L............................................................................
34
Figura 7. Concentrações médias da densidade celular média (10
6
céls.mL
-1
),
teores médios de clorofila a (10
-7
pg.cél.
-1
); valores médios de nitrogênio
total (% matéria seca), lípidio total (pg.cél.
-1
), proteína total (pg.cél.
-1
) e
carboidrato total (pg.cél.
-1
) de Chaetoceros muelleri cultivada nos meios
F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de
esterco de minhoca (EEM), analisados para o volume final de 20 L: i –
início do cultivo com 2 L. Letras distintas diferem entre si ao nível de 5%
de significância....................................................................................
35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição e concentrações dos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de
esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de minhoca
(EEM).........................................................................................................
25
Tabela 2. Preparo das soluções padrões para a curva de calibração para
proteína total.............................................................................................
60
Tabela 3. Preparo da curva de calibração para proteína total.................................. 61
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE A – Protocolo da primeira etapa dos bioensaios.................................... 55
APÊNDICE B – Protocolo da segunda etapa dos bioensaios................................... 56
APÊNDICE C – Protocolo para determinação do nitrogênio total (%) segundo o
método de Kjeldahl (Association of Official Analytical Chemists – AOAC,
1990)...........................................................................................................................
57
APÊNDICE D – Protocolo para dosagem de carboidrato total segundo a técnica
fenol – àcido sulfúrico descita por Dubois et al. (1956)..............................................
59
APÊNDICE E – Protocolo para dosagem proteína total segundo o método de
Lowry et al. (1951)......................................................................................................
60
APÊNDICE F – Protocolo para dosagem de lipídio total segundo a técnica descrita
por Frings et al. (1972)...............................................................................................
62
15
1 INTRODUÇÃO
O potencial do Brasil para o desenvolvimento sustentável da aqüicultura é
imenso. Essa atividade, no país tem crescido a uma média de 30% ao ano, índice
superior à média mundial de 10%. O Brasil possui uma longa costa marítima, clima
favorável e crescente demanda por produtos aqüícolas como o pescado, camarão,
ostra, dentre outros. Além desses pontos, pesa nesse setor da economia, o fato de
que a pesca extrativista atingiu o limite máximo sustentável de captura e, não
consegue mais atender às demandas de alimentos geradas pela população mundial.
Com isso, a aqüicultura passou a ser incentivada e muitos pescadores investiram
nessa nova atividade o que lhes garante sobrevivência e melhora na qualidade de
vida (MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO, 2006).
A aqüicultura tem vários objetivos, tais como, a produção de alimento; a
melhoria do estoque natural através do recrutamento e transplante artificial; a
produção de peixes para pesca esportiva; a produção de iscas para uso comercial; a
produção para uso industrial de rações e substâncias coloidais extraída das algas;
ostras para a produção de pérolas; entre outros (BOROWITZKA, 1999).
Entre os objetivos acima citados, a produção de alimento para consumo
humano é o principal objetivo na maioria dos países. Seja para aumentar ou
melhorar o consumo dentro do país ou para exportação, aumentando as divisas e
melhorando a sua balança comercial (FAO, 1977). Para dar suporte à aqüicultura,
um dos fatores importantes é a utilização de alimentação natural (fitoplâncton e
zooplâncton), principalmente nos estágios iniciais de desenvolvimento dos animais
cultivados, em especial nos primeiros dias de vida. Há também, a necessidade de
reproduzir, ao máximo possível, as condições naturais (temperatura, salinidade,
oxigênio dissolvido, dióxido de carbono, etc) da água de seu habitat (DE PAUWN;
PERSOONE, 1988).
A larvicultura é essencial para o sucesso de cultivos de espécies aquáticas,
chegando a atingir 10% ou mais dos custos totais do projeto. Um dos itens que mais
encarecem essa atividade é o alimento fornecido às larvas, ou seja, as microalgas
ou fitoflagelados que são mantidos em meios de cultura elaborados à base de
produtos químicos de altos custos (KLEIN; GONZALEZ, 1993).
16
A alimentação com utilização de microalgas pode ser feita diretamente no
ambiente ou através do isolamento de espécies para cultivo. Dependendo do animal
e do seu estágio de vida, as microalgas são consumidas diretamente, por várias
espécies de herbívoros, ou indiretamente, via cadeia alimentar "alga-zooplâncton",
podendo também, junto com as bactérias, controlar o balanço entre o oxigênio e o
dióxido de carbono nos cultivos (DE PAUWN; PERSOONE, 1988) e os componentes
dos nutrientes dissolvidos, principalmente nitrogênio.
A biotecnologia microalgal ganhou importância considerável nas últimas
décadas e as suas aplicações variam da simples produção de biomassa para
alimentação, como já mencionado, a valiosos produtos para aplicações
farmacêuticas. Para a maioria destas aplicações, o mercado ainda está em
desenvolvimento e seu uso se estendendo a novas áreas. Considerando a enorme
biodiversidade das microalgas e recentes desenvolvimentos em engenharia
genética, este grupo de organismos representa uma das fontes mais promissoras
para novos produtos. Com o desenvolvimento de técnicas sofisticadas de culturas, a
biotecnologia microalgal já responde as altas demandas de alimento e indústrias
farmacêuticas (PULZ; GROSS, 2004).
O maior problema associado ao uso das microalgas na aqüicultura é a falta
de conhecimento sobre o seu valor nutricional e os requerimentos essenciais de
seus consumidores. Atualmente, mais de 40 espécies de microalgas já foram
testadas como fonte de alimento para aqüicultura, mas nem todas têm condições de
suprir as exigências nutricionais para o desenvolvimento de animais cultivado para o
consumo humano. Alguns critérios nutricionais que as microalgas devem possuir
para suprir essas exigências são: não serem tóxicas, terem o tamanho apropriado
para serem ingeridas, digestibilidade da parede celular e possuírem os componentes
bioquímicos essenciais (BECKER, 1995; BROWN et al., 1997).
A descoberta do alto valor nutricional das microalgas, ricas em proteínas,
lipídeos e carboidratos, bem como vitaminas e outras moléculas como carotenóides,
clorofilas, enzimas, dentre outras, fez com que houvesse um impulso para o
desenvolvimento de pesquisas relacionadas ao uso das microalgas como alimento
para organismos cultiváveis.
17
O conteúdo bioquímico das algas pode variar com a idade da cultura e com
as mudanças das condições ambientais. O efeito da variação destes parâmetros em
muitas espécies de algas é tema de pesquisas para melhor entender sua fisiologia,
assim como também para responder perguntas específicas e pertinentes ao cultivo
em massa e a nutrição de herbívoros. O efeito de alguns nutrientes, especialmente
nitrogênio, na composição bioquímica das algas foi o assunto de vários documentos.
Os seus resultados permitem a identificação de tendências gerais para o cultivo em
massa de microalgas, quando as condições de cultura estão sujeitas a variações,
embora muitos efeitos pareçam ser espécie-específicos (LOURENÇO et al., 1997).
Os lipídeos, proteínas e carboidratos presentes nas microalgas são as
principais fontes de energia para o crescimento e o desenvolvimento dos animais
utilizados na aqüicultura (FABREGAS et al., 1985; GOLDMAN, 1980; WHYTE, 1987;
FIDALGO et al., 1998).
Lipídeos e ácidos graxos são constituintes de toda célula vegetal, na qual têm
função de constituinte da membrana celular, produto armazenado, metabólitos e
fonte de energia. Mas segundo Becker (1995), as microalgas têm seu melhor
aproveitamento na produção de carboidratos e proteínas, considerando-se que a
percentagem de proteína nesses organismos pode variar de 6 a 71% de matéria
seca, os quais são valores muito superiores, quando comparados ao arroz (8% de
matéria seca), ao leite (26% de matéria seca) e a soja (37% de matéria seca).
Há atualmente interesse na composição dos ácidos graxos e no metabolismo
associado das microalgas marinhas para produção de ácidos graxos poli-insaturados
de cadeia longa (LC-PUFAs), os ácidos docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3) e ácidos
eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3), que nessas combinações são reconhecidos
como tendo várias aplicações farmacêutica (TONON et al., 2002).
Vários estudos recentes realçam a qualidade nutricional e o importante papel
das microalgas no sucesso para os organismos cultivados. Baseado na literatura, o
conteúdo lipídico das diatomáceas nitidamente aumenta quando as culturas
alcançam à fase estacionária devido a um fator limitante como silicato ou níveis de
nitrogênio (PERNET et al., 2003).
18
A descoberta sobre o potencial produtivo das microalgas em relação à
proteína foi um fator essencial para o desenvolvimento da aqüicultura mundial
(BOROWITZKA, 1988). As proteínas e os aminoácidos produzidos pelas microalgas
podem dar origem a outras substâncias químicas e, através do melhoramento
genético, poderá aumentar suas produções (COHEN, 1999).
As microalgas produzem uma ampla variação de carboidratos (glucose,
galactose, manose, etc), os quais em sua maioria, ou são produtos de reserva
(amido, crisolaminarina, paramido) ou atuam no equilíbrio osmótico (glicerol, manitol,
sorbitol). Por possuírem alto valor energético, os carboidratos constituem uma
valiosa fonte de alimento (BOROWITZKA, op.cit.; CHU et al., 1982).
Segundo Braga (2002), os carboidratos, nos oceanos, variam sazonalmente e
geograficamente, diariamente e com a profundidade. A presença dominante de
glucose na água do mar não é um surpresa, uma vez que o glucan (um polímero de
glucose) é a maior forma de reserva de polissacarídeos no fitoplâncton marinho.
O workshop realizado em outubro de 1999 em Porto Seguro (BA), “Avaliação
e ações prioritárias para a conservação da biodiversidade da zona costeira marinha”,
estabeleceu como prioridade: “levantamentos detalhados da ocorrência de espécies
importantes de microalgas como organismos-alimento (microalgas, rotíferos e
artemias) para a aqüicultura e, idealmente, implantar bancos genéticos, com culturas
monoespecíficas e bioensaios para testar qualidade nutricional, taxas de
crescimento, adaptabilidade ao cultivo em massa e produtividade. Essas pesquisas
poderão, por certo, dar maior suporte às atividades de aqüicultura em
desenvolvimento, tendo em vista o grande potencial do Brasil” (YONEDA, 2006).
Entre muitas microalgas, identificadas para propósitos de aqüicultura,
espécies pertencentes ao gênero Chaetoceros são extensivamente usados como
alimento (SIMON, 1978; SMITH et al., 1993). A microalga, C. muelleri, umas das
espécies de alga proeminentes, é usada como recurso alimentar para o crescimento
de algumas espécies comerciais devido ao perfil de seus ácidos graxos, seu
tamanho apropriado como alimento larval e sua valva pouco silicificada oferecendo
pouca resistência (BROWN et al., 1997).
19
A produção de fitoplâncton em grande escala e de boa qualidade para
alimentar diferentes organismos de importância na aqüicultura, resultou na aplicação
de diferentes métodos para o cultivo de microalgas, de tal modo que, às vezes isto é
muito variável. Estabeleceu-se que a composição bioquímica das espécies de
fitoplâncton pode ser modificada sob diferentes condições de cultivo (WEBB; CHU,
1982; FABREGAS et al., 1985). Porém, investigar o uso de meios alternativos como
possível fonte de nutrientes para os cultivos de microalgas pode levar a obtenção de
um decréscimo nos custos de produção, tendo em vista que os meios padrões
exigem substâncias químicas de alto valor comercial (CABRALES: GONZÁLEZ,
2004).
20
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
⇒ Determinar a composição bioquímica de Chaetoceros muelleri
Lemmerman, em diferentes meios de cultivo, de modo a avaliar a possibilidade de
sua aplicação em atividades de aqüicultura.
2.2 Objetivos específicos
⇒ Testar a eficiência do uso de meios alternativos para o cultivo em
laboratório;
⇒ Determinar a densidade celular, a taxa diária e a curva de crescimento
para os diferentes bioensaios;
⇒ Determinar o teor de clorofila a da espécie cultivada;
⇒ Quantificar os teores de nitrogênio total, carboidrato total, lipídio total e
proteína total;
⇒ Comparar os dados da composição bioquímica nos diferentes meios
alternativos testados.
21
3 TRABALHOS SOBRE CULTIVO DE MICROALGAS NO BRASIL
No Brasil, o cultivo de microalgas expandiu-se paralelamente ao
desenvolvimento da aqüicultura, tendo em vista a demanda desses organismos
como alimento direto ou indireto para diversos estágios larvais de espécies
cultiváveis e de valor econômico.
A fim de reduzir os custos dos meios padrões de cultivo realizaram-se alguns
estudos com meios alternativos estando, vários pesquisadores, voltados para
elaboração de um meio eficiente e menos dispendioso. Foram testados diversos
meios dos quais podem ser citados: adubo orgânico (CASTRO, 1979); caldo de
peixe (OLIVEIRA, 1981); produtos químicos e industriais (MAESTRINI; GONZALEZ-
RODRIGUEZ, 1983); fertilizantes agrícolas (GONZALEZ-RODRIGUEZ; MAESTRINI,
1984); fertilizantes orgânicos (OLIVEIRA; KOENING, 1984); meio FeNS artificial e o
meio NH
15
(YAMASHITA; MAGALHÃES, 1984a, 1984b), extrato de lixo residencial,
de esterco de galinha e de lixo urbano (TRIANI et al., 1984, 1986a, 1986b); extratos
de esterco de galinha e de gado; e extrato de macroalgas (PANIAGUA-MICHEL et
al., 1987); vinhoto e fertilizantes orgânicos (KOENING et al., 1988, 1990a); algas
arribadas (MELO et al., 1993); água de matadouro, vinhoto e caldo de peixe (KLEIN;
GONZALEZ, 1993); meio comercial modificado (LOURENÇO et al., 1997); água
residuária (COSTA et al., 2004); efluente suíno sintético (BERTOLIN et al., 2005);
dentre outros.
Trabalhos relacionados a estudos ecofisiológicos e bioecológicos foram
realizados, tais como: crescimento de Phaeodactylum tricornutum (TEXEIRA;
VIEIRA, 1976); cultivo de diversas algas sod diferentes condições de cultivo
(VIEIRA, 1977a, 1977b, 1982a, 1982b, 1983); utilização dos parâmetros de
crescimento no cultivo de microalgas (VIEIRA; TEIXEIRA, 1982); cultivo de
microalgas marinhas (ARAGÃO; VIEIRA, 1986); crescimento de algumas
diatomáceas (NASCIMENTO; PEREIRA, 1988); crescimento de Nitzschia sp
(SOUZA et al., 1993); a influência de diversas concentrações de cloro nas
populações fitoplanctônicas (COSTA et al., 1994); valor nutricional de microalgas
(GÁLVEZ et al., 1994); bioensaio com fitoplâncton marinho (BASSFELD et al., 1999);
cultivo de Spirulina platensis sob diferentes condições (COLLA et al., 2002a, 2002b;
COSTA et al., 2001, 2004a); cultivo de Dunaliella viridis sob diferentes regimes de
22
salinidade (PINHEIRO et al., 2002); atividade extra e intracelular de Tretaselmis
gracilis (RIGOBELLO-MASINI et al, 2003); crescimento da Thalassiosira fluviatilis em
diferentes intensidades de luz e fotoperíodos (NASCIMENTO, 2003); experimento
com Prorocentrum micans e P. obtusum sob diferentes salinidades (GUIMARÃES;
RÖRIG, 2004); crescimento da Thalassiosira pseudonana em diferentes
intensidades de luz e fotoperíodos (PEREIRA NETO, 2004); cultivo de microalgas
marinhas (SILVA et al., 2004); nitrogênio intercelular em algumas microalgas
(LAVÍN; LOURENÇO, 2005); entre outros.
Em relação à composição química das microalgas, pode-se citar alguns
trabalhos: carboidratos em Tetraselmis tetrathele cultivada com fertilizante orgânico
(KOENING et al., 1990b); beta-caroteno em Dunaliella (HENRIQUES et al.,1998);
nitrogênio intracelular e perfil bioquímico de algumas microalgas (LOURENÇO et al.,
1997, 1998, 2002, 2004); lipídios em Spirulina (COSTA; COZZA, 2000); carboidratos
de Peridinium weleii (VIEIRA et al., 2002); ácidos graxos de Spirulina platensis
(COSTA et al., 2004b); proteínas, carboidratos e lipídios de Chaetoceros cf. wighamii
sob efeito de diferentes condições de cultivo (ARAUJO; GARCIA, 2005); extração e
quantificação de proteínas (BARBARINO; LOURENÇO, 2005); carboidratos e
proteínas de microalgas marinhas (MOURA JUNIOR et al., 2006); dentre outros.
23
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Posicionamento taxonômico da espécie cultivada, segundo Round et al.
(1992)
Divisão Bacillariophyta
Classe Coscinodiscophyceae
Subclasse Chaetocerotophycidae
Ordem Chaetocerotales
Família Chaetocerotaceae
Chaetoceros muelleri Lemmerman
4.2 Chaetoceros muelleri Lemmerman segundo Reinke (1984)
As frústulas de C. muelleri (Figura 1) não são unidas em filamentos como a
maioria dos Chaetoceros e são retangulares na vista da cintura com longas setas.
As valvas elípticas variam no diâmetro valvar de 4,5 a 20 µm e as valvas
aparentemente não tem ornamentação sob microscópio de luz (ML) e microscópio
de esquadrinhamento de elétron (MEE). Processos centrais ou aberturas de
qualquer grupo não foram observados nas valvas. A seta é circular a subcircular em
secção transversal e varia em comprimento de 15 – 35 µm. A seta esta inserida na
junção manto-valva variando em ângulos de 165 – 180 º e possui fileiras de
pequenos espinhos e ponta fina em um padrão espiral. A seta oca se atenua para
uma suave ponta sem abertura.
Figura 1. Frústula vegetativa de Chaetoceros muelleri Lemmerman, em microscópio de
esquadrinhamento de elétron. Escala = 10 μm. Fonte: Reinke (1984).
24
Os auxósporos de C. muelleri são esféricos, aproximadamente 6 µm em
diâmetro e preso em posição lateral em ambas as valvas da frústula vegetativa. O
auxósporo parece ser mais silicificado que a frústula vegetativa, porém menos que o
esporo de resistência. A parede celular do auxósporo parece não ter ornamentação
sob ML e MEE.
Os esporos de resistência endógenos ou hipnósporos são estruturalmente
diferentes das células vegetativas e aparentemente encontradas no manto da célula
vegetativa, sendo pesadamente silicificados. Setas e faixas são ausentes na cintura,
e aparentemente sem ornamentação sob ML e MEE. O diâmetro dos esporos é
similar ao das células vegetativas.
A espécie C. muelleri tem uma morfologia bem simples quando comparada a
outras espécies marinhas neste gênero. Suas valvas são fracamente silicificadas
sem processos labiados, aberturas simples, processos centrais, espinhos ou
processos suportes. Só a seta tem um padrão punctato e espinhos pequenos.
Embora, C. muellerii, seja espécie marinha, pode ser raramente informada como
espécie de água doce tais como outras espécies de Chaetoceros.
4.3 Organismo
Para os diferentes bioensaios foi utilizada uma cepa da diatomácea
Chaetoceros muelleri Lemmerman, mantida no banco de cultivo do Departamento de
Oceanografia da Universidade Federal de Pernambuco, em tubos de ensaio com o
meio F/2 Guillard (GUILLARD, 1975), gentilmente cedida pelo Laboratório de Cultivo
e Ecotoxicologia (LACE/UFPE).
Para os bioensaios o meio controle utilizado foi F/2 Guillard (F/2) e os meios
alternativos de cultivo foram extrato de esterco de gado (EEG) e de minhoca (EEM)
(Tabela 1).
Os meios alternativos de cultivo foram preparados através da mistura de
250 g de esterco de gado e de minhoca em um litro de água do mar, agitando-se
uma vez por dia, durante 15 dias, com posterior filtragem da solução final em papel
de filtro e autoclavagem em 1 atm durante 15 minutos. As análises dos principais
25
nutrientes (nitrito – NO
2
-
.N; nitrato – NO
3
-
.N; fosfato – PO
4
-
.P; silicato – SiO
2
-
.S e
amônia – NH
3
-
.N) inorgânicos dissolvidos nos meios alternativos foram realizadas no
Laboratório de Química do Departamento de Oceanografia da UFPE, segundo os
métodos descritos por Strickland e Parsons (1972) e Grasshoff et al. (1983).
Os bioensaios foram realizados em duas etapas e mantidos em condição de
iluminação constante (24 horas), utilizando-se de lâmpadas fluorescentes – tipo luz
do dia de 40W cada e temperatura de 22±1°C. O pH variou de 8 a 9 em todos os
meios. A salinidade da água do mar foi 33 ups.
Tabela 1. Composição e concentrações dos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado
(EEG) e extrato de esterco de minhoca (EEM).
F/2 EEG EEM
NUTRIENTES
mg.L
-1
NUTRIENTES
mg.L
-1
NUTRIENTES
mg.L
-1
NaNO
3
75 NH
3
66,92 NH
3
45,43
NaH
2
PO
4
. H
2
O 5 NO
2
34,28 NO
2
93,70
Na
2
SiO
3
. 9H
2
O 30 NO
3
41,03 NO
3
201,28
METAIS TRAÇO
PO
4
901,75 PO
4
629,21
Na
2
. EDTA
+
4,36 SiO
3
1504,65 SiO
3
2742,53
FeCl
3
. 6H
2
O 3,15
CuSO
4
. 5 H
2
O 0,01
ZnSO
4
. 7 H
2
O 0,022
CoCl
2
.6 H
2
O 0,01
MnCl
2
. 4 H
2
O 0,18
NaMoO
4
. 2 H
2
O 0,006
VITAMINAS
Tiamina 0,01
Biotina 0,0005
BB
12
0,0005
4.4 Primeira etapa dos bioensaios
No primeiro bioensaio (Apêndice A), a diatomácea C. muelleri foi cultivada em
500 mL dos meios de cultivo (F/2, EEG e EEM), em erlenmeyer de 1 L, em
triplicatas. Para cada erlenmeyer foi adicionado um tubo de ensaio contendo 30 mL
de cultivo da espécie. A partir deste bioensaio determinou-se a fase log (fase
exponencial) da espécie nos meios referidos.
26
4.4.1 Densidade e taxa diária de crescimento celular
Na primeira etapa do bioensaio foram determinadas a densidade celular e a
taxa diária de crescimento de Chaetoceros muelleri. Para a determinação da
densidade celular retirou-se, diariamente, alíquotas de aproximadamente 1 mL de
cada bioensaio, durante um período de 12 dias.
A contagem do número de células por mL foi realizado em triplicatas, com o
auxílio de Câmara de Neubauer e microscópio binocular Zeiss. Através da curva de
crescimento, observou-se as seguintes fases de crescimento: indução ou lag;
exponencial ou log; redução do crescimento; estacionária; senescente ou de
declínio, nos diferentes meios de cultivo.
A taxa diária de crescimento celular (K) de cada bioensaio foi mensurada
através da seguinte fórmula (GUILLARD, 1973):
K = [3,332/(t
2
– t
1
)] . (logN
2
/N
1
)
Onde:
K – taxa de crescimento diário;
t – tempo;
N – número de células.
4.4.2 Clorofila a
Foram utilizados 10 mL de cada bioensaio, retirados diariamente, para a
determinação da concentração de clorofila a (mg.mL
-1
), e filtrados em filtros
Whatmann GF/F de fibra de vidro, de 47 mm de diâmetro. A extração foi realizada
com acetona a 90% e as leituras efetuadas em espectrofotômetro, adotando-se os
procedimentos descritos em Becker (1995):
Clorofila a = (12,7.A
663
) – (269.A
645
)
Onde:
A
663
– leitura da absorbância da luz em 663 nm;
A
645
– leitura da absorbância da luz em 645 nm;
27
4.4.3 Biovolume celular
Em cada meio, o biovolume das células de C. muellerii foi determinado de
acordo com a metodologia de Edler (1979). A cada dois dias foram medidas 15
células, com auxílio de micrômetro ocular e microscópio binocular Zeiss. Com os
valores obtidos, foi calculado o biovolume médio, tomando-se como base a forma
geométrica da espécie, que foi enquadrada na fórmula geométrica elipsóide:
Biovolume (μm
3
) = π. R. r. h,
Onde:
R – maior raio da valva;
r – menor raio da valva;
h – altura da valva.
4.5 Segunda etapa dos bioensaios
Após a determinação da fase log de C. muelleri, para cada meio de cultivo,
iniciou-se novo bioensaio em um garrafão plástico com capacidade para 20 litros
com aeração (Apêndice B). O segundo bioensaio foi iniciado com volume de dois
litros, aos quais foram adicionados quatro tubos de ensaio contendo 30 mL de C.
muelleri.
O aumento do volume dos meios foi realizado gradualmente com a adição
dos respectivos meios e obteve-se a seguinte seqüência de volume em litros: 2 → 4
→ 8 →12 → 16 → 20
. Cada aumento do volume dos cultivos foi realizado na
fase exponencial da espécie referida e correspondente a cada meio de cultivo.
4.5.1 Densidade celular
Na segunda etapa, a determinação da densidade celular foi realizada em
triplicatas, retirando-se 3 mL para cada bioensaio, e a cada aumento de volume do
cultivo, seguindo a metodologia já citada.
4.5.2 Clorofila a
Devido a concentração celular do cultivo, foram retirados diariamente, em
triplicatas, apenas 1 mL de cada bioensaio para a determinação da clorofila a
(mg.m
-3
) e filtrados em filtros Whatmann GF/F de fibra de vidro, de 47 mm de
diâmetro. A extração foi realizada com acetona a 90% e as leituras efetuadas em
28
espectrofotômetro, adotando-se os procedimentos descritos por Strickland e Parsons
(1972):
Clorofila a = [11,6 • ∆665 - (1,31 • ∆645 + 0,14 • ∆630 + ∆750)] • v • V
-1
• L
-1
Onde:
∆ = leitura da absorbância da luz para os diferentes comprimentos de onda (630,
645, 665 e 750 nm);
v = volume de acetona a 90% (mL);
V = volume da amostra filtrada (L);
L = caminho óptico da cubeta (cm).
4.5.3 Análises bioquímicas
As análises bioquímicas foram realizadas no final do ciclo de cultivo e no final
da fase log encontrado para cada meio de cultivo. O volume final (20 litros), dos três
garrafões, foi centrifugado a 4000 rpm por 15 minutos, em centrífuga Jouan BR-4i
Multfunction – Thermo Electron Corporation, e o material precipitado foi
acondicionado em becker, correspondendo aos meios de cultivo – F/2, EEG e EEM.
Esse precipitado foi seco em estufa até peso constante, à temperatura de 40ºC,
conforme procedimento recomendado por Bezerra Neto et al. (1994). A produção
final em material seco foi de 6,68 g para o meio F/2, 7,89 g para o meio EEG e
9,46 g para o meio EEM.
A determinação do nitrogênio total (%) foi realizada segundo o método de
Kjeldahl (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS – AOAC, 1990).
Do material seco foi pesado 3 g de cada bioensaio (F/2, EEG e EEM) e sua análise
foi efetuada em triplicatas (Apêndice C).
4.5.3.1. Preparação do extrato
Para as determinações bioquímicas de carboidrato total, proteína total e
lipídeo total foram pesados 0,6 g do material seco, de cada bioensaio, e preparado o
extrato segundo a metodologia abaixo:
a) Adicionou-se tampão fosfato salino (PBS; pH = 7,4) ao material seco, em
ependorff, nas seguintes diluições: 6 mL para o meio F/2 e 7ml para os meios
EEG e EEM;
b) O material foi conservado em banho de gelo nas etapas posteriores;
29
c) O material foi sonicado por um período de 300 s, com auxilio de ultra-som
Bioblock – Scientific – Vibra-cell, para quebrar as paredes celulares;
d) Separou-se 1 mL do extrato, em ependorff, o qual foi mantido em freezer a
-20ºC, para posteriores dosagens em triplicatas.
4.5.3.2. Preparação do material para dosagem
A) Carboidrato total:
a. Após descongelamento e homogeneização do extrato, foi
retirada alíquotas de 50 μL, para cada meio, e diluída a 1:100
(50:5000 μL), com água destilada e agitada, para homogeneizar
a amostra.
A dosagem colorimétrica foi baseada na técnica Fenol – Ácido Sulfúrico de
acordo com o método de Dubois et al. (1956) (Apêndice D).
B) Proteína total: separação, precipitação e purificação:
a. Após descongelamento e homogeneização do extrato, foi
retirada uma alíquota de 500 μL, para cada bioensaio, e diluída
com 4500 μL de PBS (1:5 v/v) e agitada em OMNI-MIXER;
b. Centrifugou-se (centrifuga KUBOTA/KN-70) a 2000 rpm por 15
min., a temperatura ambiente;
c. O sobrenadante-Sb1 foi retirado e reservado em tubos de
ensaio e o precipitado foi lavado com 2000 μL de PBS, agitado e
recentrifugado, obtendo-se o sobrenadante-Sb2;
d. Aos sobrenadantes Sb1 e Sb2 foi adicionado 1500 μL de ácido
tricloroacético (TCA - 10%) para precipitar as proteínas e foram
centrifugadas a 3000 rpm por 15 min.;
e. Ressuspendeu-se o precipitado de proteínas em 1000 μL de
tampão PBS, para posterior análise.
A dosagem colorimétrica foi realizada segundo o método de Lowry et al.
(1951) (Apêndice E).
C) Lipídio total: obtenção do extrato segundo Folch et al. (1957), descrito a seguir:
30
a. Após descongelamento e homogeneização do extrato, foi
adicionado ao 1 mL do extrato 40 mL da solução de clorofórmio-
metanol (2:1, v/v), na seguinte seqüência: acrescentou-se 7 mL
de metanol a amostra e agitou-se (Vortex Phoenix AP 56);
depois adicionou-se 14 ml de clorofórmio.
b. Novamente foi agitado e esperou-se 20 min. para precipitação
das proteínas; depois foi filtrado em proveta utilizando papel de
filtro para retirar o precipitado;
c. O tubo utilizado e o papel de filtro foi lavado com clorofórmio-
metanol (2:1, v/v) até completar o volume de 40 mL;
d. Adicionou-se 10 mL da solução cloreto de potássio (KCl - 0,05
M) ao filtrado, agitando-se por inversão, para purificação do
extrato. O extrato se divide em substâncias solúveis em água,
como os íons e metanol, que permanecem na fase aquosa e
lipídios, que ficam na fase clorofórmica.
e. Acondicionou-se as amostras em freezer a -20ºC, por 12 horas;
f. Após, deixar as amostras à temperatura ambiente, mediu-se o
volume inferior clorofórmico (o volume final para cada bioensaio
foi de 28,5 mL); desprezando a fase superior aquosa;
g. A solução foi mantida em freezer a -20ºC, para posterior análise.
Para a dosagem colorimétrica seguiu-se o método descrito por Frings et al.
(1972) (Apêndice F).
4.5.4 Tratamento estatístico
No tratamento estatístico dos dados empregou-se uma análise de variância
(ANOVA) com nível de significância de α=0,05, com posterior aplicação do teste de
Tukey, com o auxílio do programa SANEST (SARRIÉS et al., 1992).
4.5.5 Normalização do texto
Este trabalho foi elaborado de acordo com as instruções normativas da
Associação Brasileira de Normas Técnicas: NBR 10520 (ABNT, 2002a); NBR6023
(ABNT, 2002b); NRB 6024 (ABNT, 2003a); NBR 6027(ABNT, 2003b) NBR 6028
(ABNT, 2003c).
31
5 RESULTADOS
5.1 Primeira etapa dos bioensaios
5.1.1 Densidade e taxa diária de crescimento celular
As concentrações médias da densidade celular no meio F/2 variaram de
1,14±0,03 a 11,05±1,32 x10
6
céls.mL
-1
, sendo observado o valor máximo no 6
0
dia
de cultivo. Já no meio EEG, variou de 1,11±0,12 a 8,33±0,83 x10
6
céls.mL
-1
e no
meio EEM, variou de 1,22±0,13 a 6,86±0,38 x10
6
céls.mL
-1
, com valor máximo no 4
0
e 8
0
dias, respectivamente (Figura 2).
Na curva de crescimento da espécie estudada, apresentada na figura 2, a
fase lag ocorreu do primeiro para o segundo dia. Já no segundo dia foi observado o
início da fase log ou exponencial. O final dessa fase variou para os meios F/2, EEG
e EEM ocorrendo no 6
0
, 4
0
e 8
0
dia, respectivamente. Na fase log, a taxa diária de
crescimento celular (K) foi de 0,97±0,43 no meio EEG, seguido por 0,65±0,70 no
meio F/2 e demonstrou crescimento mais lento, com uma taxa média de 0,36±0,31
para o meio EEM. A fase estacionária começou a partir desses dias referidos e vai
até o 9
0
dia para o meio F/2 e o 10
0
dia para o meio EEG; não foi observado essa
fase para o meio EEM. A fase de senescência ou declínio começou no 9
0
, 8
0
e 10
0
dia, para o meios F/2, EEG e EEM, respectivamente.
11,05
8,33
6,86
0
3
6
9
12
123456789101112
Dias de cultivo
Densidade celular
(10
6
céls.mL
-1
)
F2 EEG EEM
Figura 2. Concentrações médias da densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) e curvas de cescimento de
Chaetoceros muelleri cultivada nos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e
extrato de esterco de minhoca (EEM), durante o período de 12 dias de cultivo.
32
5.1.2 Clorofila a
Os teores de clorofila a não apresentaram grandes variações. Os valores
máximos médios de clorofila a foram de 0,34±0,03 pg.cél.
-1
,
no 7
0
dia, no meio F/2.
No meio EEG foi de 0,74±0,90 pg.cél.
-1
, no 9
0
dia; e no meio EEM de 2,26±1,70
pg.cél.
-1
, no 12
0
dia (Figura 3).
0
1
2
3
4
123456789101112
Dias de cultivo
Clorofila a (pg.cél.
-1
)
F/2 EEG EEM
Figura 3. Teores médios de clorofila a (pg.cél.
-1
) de Chaetoceros muelleri cultivada nos meios F/2
Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de minhoca (EEM), durante o
período de 12 dias de cultivo.
5.1.3 Biovolume celular
O tamanho da célula de C. muelleri, neste experimento, variou em altura (H)
de 2,05 a 12,3 μm; e, na vista valvar apresenta forma elipsóide, com suas medidas
variando de 4,1 a 12,3 μm (R: raio maior) e de 2,05 a 12,3 μm (r: raio menor).
Para o primeiro dia de cultivo, os valores médios do biovolume celular de C.
muelleri foram de 813,07±1409,68; 560,45±347,36 e 796,97±658,07 μm
3
,
correspondentes aos meios F/2, EEG e EEM. No entanto, esses dados estão
relacionados às células iniciais dos bioensaios que estavam sendo mantidas em
tubos de ensaios.
Durante o bioensaio os valores médios do biovolume celular variaram de
395,18±273,87 a 528,55±321,06 μm
3
, para o meio F/2, e 402,83±162,36 a
515,28±351,87 μm
3
para o meio EEG, apresentando valores máximos no 5
0
dia,
para os dois meios. Porém, o meio EEM apresentou variação de 407,28±207,08 a
534,17±454,13 μm
3
, com valores máximos no 11
0
dia (Figura 4).
33
0
600
1200
1800
2400
123456789101112
Dias de cultivo
Biovolume (µm
3
)
F2 EEG EEM
Figura 4. Valores médios do biovolume celular (µm
3
) de Chaetoceros muelleri cultivada nos meios F/2
Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de minhoca (EEM), durante o
período de 12 dias de cultivo.
meios F/2
Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de minhoca (EEM), durante o
período de 12 dias de cultivo.
5.2 Segunda etapa dos bioensaios 5.2 Segunda etapa dos bioensaios
5.2.1 Densidade celular 5.2.1 Densidade celular
As concentrações médias da densidade celular para o meio F/2 variaram de
1,82±0,16 a 21,61±0,24 x10
6
céls.mL
-1
. Já para o meio EEG variou de 1,24±0,31 a
18,53±0,43 x10
6
céls.mL
-1
e para o meio EEM de 1,92±0,09 a 23,07±0,44 x10
6
céls.mL
-1
(Figura 5). O aumento da densidade celular de C. muelleri foi proporcional
ao aumento do volume do cultivo, para todos os meios testados (Figura 5) e, no
volume final (20 L) houve diferenças significativas da densidade celular entre os
meios de cultivo (ANOVA: p= 0,0001 e Tukey: p<0,05).
As concentrações médias da densidade celular para o meio F/2 variaram de
1,82±0,16 a 21,61±0,24 x10
6
céls.mL
-1
. Já para o meio EEG variou de 1,24±0,31 a
18,53±0,43 x10
6
céls.mL
-1
e para o meio EEM de 1,92±0,09 a 23,07±0,44 x10
6
céls.mL
-1
(Figura 5). O aumento da densidade celular de C. muelleri foi proporcional
ao aumento do volume do cultivo, para todos os meios testados (Figura 5) e, no
volume final (20 L) houve diferenças significativas da densidade celular entre os
meios de cultivo (ANOVA: p= 0,0001 e Tukey: p<0,05).
21,61
18,53
23,07
0
6
12
18
24
i 2 4 8 12 16 20
Aumento em volume do cultivo (L)
Densidade celular
(10
6
céls.mL
-1
)
F2 EEG EEM
Figura 5. Concentrações médias da densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) de Chaetoceros muelleri
cultivada nos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de
minhoca (EEM), até volume final de 20 L: i – início do cultivo com 2 L.
Figura 5. Concentrações médias da densidade celular (10
6
céls.mL
-1
) de Chaetoceros muelleri
cultivada nos meios F/2 Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de
minhoca (EEM), até volume final de 20 L: i – início do cultivo com 2 L.
34
5.2.2 Clorofila a
Os teores celulares de clorofila a variaram de 0,73±0,02 a 7,80±0,61 x10
-7
pg.cél.
-1
para o meio F/2. Para o meio EEG variou de 0,90±0,01 a 12,10±3,02 x10
-7
pg.cél.
-1
e para o meio EEM de 0,79±0,05 a 8,07±0,10 x10
-7
pg.cél.
-1
. Os valores de
clorofila a encontrados na figura 6 são inversamente proporcionais a densidade
celular e, para o volume final (20 L) houve diferenças significativas entre os meios de
cultivo (ANOVA: p=0,0008 e Tukey: p<0,05).
0
4
8
12
16
i 2 4 8 12 16 20
Aumento em volume do cultivo (L)
Clorofila a (10
-7
pg.cél.
-1
)
F/2 EEG EEM
Figura 6. Teores médios de clorofila a (10
-7
pg.cél.
-1
) de Chaetoceros muelleri cultivada nos meios F/2
Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de minhoca (EEM), até volume
final de 20 L: i – início do cultivo com 2 L.
5.2.3 Análises bioquímicas
Os valores descritos a seguir correspondem apenas ao volume final de 20 L
dos bioensaios.
Os valores médios de nitrogênio total celular foram de 3,35±0.06% de matéria
seca para o meio EEM, seguido por 2,30±0,05% de matéria seca, para o meio F/2 e
de 1,80±0.05% de matéria seca, para o meio EEG, havendo diferenças significativas
entre os meios testados (ANOVA: p=0,0000 e Tukey: p<0,05) (Figura 7).
Em relação ao valor médio de lipídio total celular, o meio EEM foi maior,
0,112±0,001 pg.cél.
-1
; que os meios F/2 e EEG, com valores muito próximos,
0,104±0,001 e 0,100±0,001 pg.cél.
-1
, respectivamente, havendo diferenças
significativas entre os meios testados (ANOVA: p=0,0273). O teste de Tukey
detectou diferenças significativas entre os meios alternativos (p<0,05) embora estes
35
não sejam diferentes do meio convencional (p>0,05) (Figura 7).
No meio EEM, as células, apresentaram o maior valor médio de proteína total,
0,226±0,012 pg.cél.
-1
, seguido pelos meios F/2, 0,140±0,014 pg.cél.
-1
e EEG,
0,125±0,001 pg.cél.
-1
, com diferenças significativas entre os meios testados
(ANOVA: p=0,0039). Já, o teste de Tukey detectou diferenças significativas apenas
para o meio EEM (p<0,05) (Figura 7).
Da mesma forma, o valor médio de carboidrato total celular foi maior para o
meio EEM, 36,22±1,53 pg.cél.
-1
,
seguido dos meios EEG, 29,81±0,81 pg.cél.
-1
e F/2,
19,76±0,85 pg.cél.
-1
. Para esse parâmetro houve diferanças significativas entre os
meios testados (ANOVA: p=0,0025 e Tukey: p<0,05) (Figura 7).
b
a
a
0
0,07
0,14
0,21
0,28
F/2 EEG EEM
Meios de cultivo
Proteínas (pg.cél.
-1
)
c
b
a
0
6
12
18
24
F/2 EEG EEM
Densidade celular
(10
6
céls.mL
-1
)
c
b
a
0
0,25
0,5
0,75
1
F/2 EEG EEM
Clorofila a
(10
-7
pg.cél.
-1
)
c
b
a
0
1
2
3
4
F/2 EEG EEM
Nitrogênio
(% matéria seca)
b
a
a,b
0
0,03
0,06
0,09
0,12
F/2 EEG EEM
Lipídios (pg.cél.
-1
)
c
b
a
0
10
20
30
40
F/2 EEG EEM
Meios de cultivo
Carboidratos (pg.cél.
-1
)
Figura 7. Concentrações médias da densidade celular média (10
6
céls.mL
-1
), teores médios de
clorofila a (10
-7
pg.cél.
-1
); valores médios de nitrogênio total (% matéria seca), lípidio total (pg.cél.
-1
),
proteína total (pg.cél.
-1
) e carboidrato total (pg.cél.
-1
) de Chaetoceros muelleri cultivada nos meios F/2
Guillard (F/2), extrato de esterco de gado (EEG) e extrato de esterco de minhoca (EEM), analisados
para o volume final de 20 L: i – início do cultivo com 2 L. Letras distintas diferem entre si ao nível de
5% de significância.
36
6 DISCUSSÃO
6.1 Primeira etapa dos bioensaios
A densidade celular de C. muelleri, no meio F/2, mostrou-se mais elevada que
a dos meios alternativos, extrato de esterco de gado (EEG) e de minhoca (EEM),
como observado na curva de crescimento. Além disso, para o meio EEG foi
observado um menor período para alcançar seu pico de crescimento, isto é, o final
da fase log. O que é interessante em termos de menor tempo de produção
microalgal. No entanto, o valor nutricional é outro fator importante e decisivo na
escolha da espécie de microalga utilizada como alimento na aqüicultura.
Os valores de densidade celular obtidos neste estudo foram maiores que os
encontrados por Størseth et al. (2005), para C. muelleri (3,6 x10
6
céls.mL
-1
) cultivada
em 200 L de meio F/2. No entanto, o final da fase log coincidiu no 6
o
dia, para ambos
os bioensaios.
Na pesquisa de Göksan et al. (2003) com C. muelleri, os valores das
concentrações celulares foram maiores (49,08 x10
6
céls.mL
-1
) e alcançaram o final
fase log no sétimo dia. Isso se deve, possivelmente, a área e forma do recipiente de
cultivo (20 x 50 cm) e diferentes intensidades de luz que proporcionam menor
agrupamento das células.
A determinação da curva de crescimento é importante para todo experimento
com cultivo, visto que as fases de crescimento estão diretamente relacionadas à
produção de muitos compostos das microalgas, tanto em quantidade como em
qualidade. De acordo com Brown (1991); Brown et al. (1997) e Renaud et al. (1999),
no final da fase log as espécies tendem a acumular carboidratos, como resposta a
limitação do nitrogênio utilizado durante a fase log para a síntese de proteína.
No presente trabalho, observou-se para o meio EEM uma relação inversa
entre os altos valores de biovolume celular e os baixos valores da taxa diária de
crescimento. Já nos meios F/2 e EEG, a espécie C. muelleri manteve altos valores
de biovolume celular, porém altos valores da taxa diária de crescimento. Phatarpekar
et al. (2000) estudando a espécie Chaetoceros calcitrans, com diâmetro de 8 μm,
também encontraram essa relação, ou seja, altos valores de biovolume celular
(267,95 μm
3
) e baixos valores da taxa diária de crescimento (0,48). No entanto, com
a espécie Isochrysis galbana, de diâmetro 4 μm, foram observados baixos valores
37
de biovolume (33,49 μm
3
) e altas taxas diárias de crescimento (1,20).
Essas associações, segundo Fogg (1965), podem ser atribuídas à diferença
em tamanho comparativamente entre as espécies, isto é, espécies de tamanhos
menores crescem mais rápidas que as de tamanhos maiores, devido à relação
superfície-volume das células, o que facilita a assimilação de nutrientes mais
rapidamente por espécies de tamanho menores. No entanto, esse fator não foi
observado para os meios F/2 e EEG, o que se deve provavelmente por outros
fatores como diferentes concentrações dos nutrientes nos meios.
6.2 Segunda etapa dos bioensaios
Vários autores, estudando a mesma espécie deste trabalho, em meio F/2, na
fase exponencial, registraram valores menores de concentrações celulares. Parrish
et al. (1998), cultivando de 4 a 85 L, encontraram concentrações celulares de
7,1±2,6 x10
6
céls.mL
-1
, em meio semi-contínuo entre 25 e 26ºC, por 28 dias e Liang
et al. (2006), cultivando 2 L em diferentes fontes de nitrogênio encontrou uma
variação de 6,65 a 7,01 x10
6
céls.mL
-1
, a 18ºC.
López-Elías et al. (2005) obtiveram também densidades celulares menores,
cultivando por 42 h, 300L da mesma espécie, em recinto fechado (2,02 x10
6
céls.mL
-1
), entre 21 e 27ºC e, ao ar livre (2,94 x10
6
céls.mL
-1
), entre 13 e 37ºC; e
tanques de 3000 L em recinto fechado (0,97 x10
6
céls.mL
-1
) e ao ar livre (1,75 x10
6
céls.mL
-1
). Essas diferentes concentrações celulares, nas pesquisas citadas, com a
mesma espécie, podem ocorrer devido a um fator ou a combinação de muitos
fatores, como temperatura, nutrientes, luz, tempo de cultivo, fase de crescimento da
microalga, dentre outros.
Embora não se tenha encontrado trabalhos com C. muelleri cultivada em
meios alternativos, os valores obtidos para os meios EEG e EEM foram maiores,
quando comparados com Yamashita e Magalhães (1984b) que encontraram 1,7 x10
6
céls.mL
-1
para Tetraselmis chuii, em meio alternativo adubo foliar (2 gotas em 1 L de
água do mar) a 22-29ºC; Klein e Gonzalez (1993), cultivando a espécie T. chuii,
observaram densidades de 2,01 x10
6
céls.mL
-1
em meio caldo de peixe (5 mL em 1 L
de água do mar) e de 1,52 x10
6
céls.mL
-1
em meio vinhoto (5 mL em 1 L de água do
mar), a 24ºC.
38
Na mesma temperatura, Koening et al. (1990b) encontraram 0,61 x10
6
céls.mL
-1
para Tetraselmis tetrathele, em meio água residual de matadouro (280 mL
em 1 L de água do mar). Do mesmo modo, como observado para o meio
convencional (F/2), nos meios alternativos foram determinadas diferentes
densidades celulares, demonstrando a mesma complexidade já citada. Para os
meios alternativos a concentração correta de nutrientes torna-se o fator mais
importante para o melhor desenvolvimento das microalgas. E, assim como foram
necessários muitas pesquisas para se obter os meios convencionais é indispensável
mais estudos com os meios alternativos.
A determinação da clorofila a é um dos componentes celulares que auxilia
para calcular a biomassa da microalga em cultura e pode ser usada para medir o
crescimento microalgal (VALENZUELA-ESPINOZA et al., 2002).
O trabalho de Nelson et al. (1992) foi o único encontrado que pesquisou a
clorofila a e composição bioquímica da espécie C. muelleri, em meio F/2 e no final
da fase exponencial, a 30ºC. Os autores encontraram valores de clorofila a em baixa
irradiação (0,82 pg.cél.
-1
) e alta irradiação (0,60 pg.cél.
-1
), os quais foram maiores
que os relatados neste trabalho.
Em relação aos meios alternativos testados, os teores de clorofila a foram
menores que os registrados por Valenzuela-Espinoza et al. (2002), para a espécie
Isochrysis galbana, cultivada no período de 8 dias em meio fertilizante orgânico (0,41
pg.cél.
-1
), na fase log, a 20ºC e por Lourenço et al. (1997), para Tetraselmis gracilis,
em 4,5 L de meio comercial modificado, a 21ºC, com valores de 2,35 pg.cél.
-1
, na
metade da fase log; de 1,53 pg.cél.
-1
, no final da fase log; e de 1,22 pg.cél.
-1
, na fase
estacionária.
No presente estudo não se observou relação direta ou indireta da densidade
com a clorofila a, como relataram López –Muñoz et al. (1992) e Saoudis-Helis et al.
(1999), os quais afirmam que quanto maior a densidade, tanto maior serão os teores
de clorofila a, pois a alta concentração de células diminui a irradiação dentro do
recipiente de cultivo, fazendo com que as células produzam mais clorofila.
No entanto, os valores de clorofila a celular nos meios EEG e EEM foram
39
maiores que no meio F/2, e isso se deve provavelmente a quantidade de partículas
nos meios alternativos que diminui a irradiação, concordando com a afirmação acima
que relaciona a irradiação e a produção de clorofila.
As microalgas são usadas como uma fonte de alimento para estágios larvais
de muitas espécies de interesse comercial para aqüicultura. O valor alimentar de
cada espécie de microalga depende da interação entre sua composição e as
exigências metabólicas e nutricionais do organismo consumidor (HOLF; SNELL1999;
LORA-VILCHIS; DOKTOR, 2001).
De acordo com Poulet e Marsot (1978) e Huntley et al. (1983) o zooplâncton é
capaz de discriminar células entre uma mistura alimentar com diferentes espécies de
algas. Isso nos leva a afirmar a importância de estudos sobre as propriedades
nutricionais das microalgas.
No meio EEM, C. muelleri apresentou valor de nitrogênio total igual ao
de I. galbana (3,35% de matéria seca), cultivada em 2 L de meio Conway por
Barbarino e Lourenço (2005), em ciclo de luz:escuro (12:12), a 23 e 20ºC,
respectivamente. Nesse mesmo estudo, a espécie Skeletonema costatum
apresentou valores maiores (3,41% de matéria seca) que os desta pesquisa. O
nitrogênio tem papel importante na constituição das microalgas, pois este é matéria
prima para seu metabolismo, sendo, componente das proteínas, assim como, do
DNA, dentre outros.
Webb e Chu (1983) revisaram o papel dos componentes bioquímicos no
fitoplâncton e concluíram que o lipídio é o mais importante para larva de bivalve.
Porém, o teor de lipídio de microalga parece ser altamente variável e relacionado às
condições de cultivo.
A produção e armazenamento de lipídios, com respeito a fatores ambientais,
são específicas para espécies de microalga, dificultando fazer generalizações.
Porém, baseado na literatura, o conteúdo lipídico de diatomáceas aumenta quando
culturas alcançam a fase estacionária, devido a um fator limitante, como silicato ou
níveis de nitrogênio (PERNET et al., 2003).
40
Dentre os lipídios, os glicolipídios e fosfolipídios são componentes essenciais
da tilacóide e membrana celular em microalgas. E outros, como os triglicérides, têm
função de armazenar energia celular (CHAUTON et al., 2004).
Em relação aos lipídios, os valores encontrados no presente trabalho foram
muito próximos e baixos, quando comparados com os dados obtidos, para a
microalga C. muelleri, por Nelson et al. (1992), sob baixa irradiação (4,18 pg.cél.
-1
) e
alta irradiação (6,57 pg.cél.
-1
).
Valores de lipídios igualmente inferiores foram encontrados por Valenzuela-
Espinoza et al. (2002), para a espécie I. galbana, 10,6 pg.cél.
-1
, no meio fertilizante
orgânico, na transição da fase lag para log e por Lourenço et al. (1997), para a
microalga T. gracilis que apresentou valores de lipídios de 44,42 pg.cél.
-1
, na metade
da fase log; de 41,10 pg.cél.
-1
, no final da fase log; e de 33,12 pg.cél.
-1
, na fase
estacionária.
As proteínas são componentes principais das células durante a fase
exponencial de crescimento, no entanto na fase estacionária, elas são substituídas
por produtos de armazenamento (STRICKLAND, 1965; MYKLESTAD E HAUG,
1972; HEALEY, 1973; DORTCH et al., 1984; UTTING, 1985).
Os teores de proteína, em C.muelleri, foram menores que os valores relatados
por Nelson et al. (1992) sob baixa irradiação (13,42 pg.cél.
-1
) e alta irradiação (0,60
pg.cél.
-1
), durante a fase exponencial.
Nos meios alternativos, os teores de proteína, também, foram menores que
os valores registrados por Valenzuela-Espinoza et al. (2002), para a espécie
I. galbana, que encontraram 7,6 pg.cél.
-1
, no meio fertilizante orgânico, na fase log; e
por Lourenço et al. (1997), para T. gracilis com valores de 179,61 pg.cél.
-1
, na
metade da fase log; de 229,81 pg.cél.
-1
, no final da fase log; e de 108,07 pg.cél.
-1
, na
fase estacionária.
Diferentemente dos lipídios e proteínas, para C. muelleri, as quantidades de
carboidratos por célula, neste estudo, foram maiores que as encontradas por Nelson
et al. (1992) sob baixa irradiação (3,36 pg.cél.
-1
) e alta irradiação (4,97 pg.cél.
-1
).
41
Em relação aos meios alternativos, os valores de carboidrato total, também,
foram superiores àqueles registrados por Valenzuela-Espinoza et al. (2002), para a
espécie I. galbana, de 10,5 pg.cél.
-1
, no meio fertilizante orgânico, na transição da
fase lag para log; e menores que os de Lourenço et al. (1997), para T. gracilis, de
110,84 pg.cél.
-1
, na metade da fase log; de 77,13 pg.cél.
-1
, no final da fase log; e de
119,10 pg.cél.
-1
, na fase estacionária.
Os valores obtidos para os carboidratos foram maiores em relação aos de
proteínas e lipídios, o que caracteriza o final da fase log e início da fase estacionária,
como já foi referenciado. Essa relação também pode ser observada na pesquisa de
Nelson et al. (1992), na qual os maiores valores são dos carboidratos (baixa
irradiação) ou lipídios (alta irradiação).
No trabalho de Valenzuela-Espinoza et al. (2002), observou-se a relação do
decréscimo na produção de carboidratos e lipídios, na fase log e o aumento em
proteínas, característico dessa fase. Lourenço et al. (1997), examinaram as fases log
e estacionária, constatando a relação das fases de crescimento com a composição
bioquímica: na metade da fase log as proteínas são maiores que os carboidratos e
lipídios; no final da fase log, a produção de proteínas aumenta e os carboidratos e
lipídios diminuem e na fase estacionária, ocorre uma inversão, ou seja, a produção
de carboidratos cresce e a de proteínas, decresce. Esses aspectos validam a
seriedade da necessidade de mais pesquisas relacionadas à composição bioquímica
e sua variação ao longo das fases de crescimento das microalgas.
Além das diferenças significativas do meio alternativo extrato de esterco de
minhoca (EEM) em relação ao meio convencional (F/2) houve um ganho de
produtividade para os parâmetros estudados, com exceção apenas ao lipídio que
não teve diferenças significativas. Já o meio alternativo extrato de esterco de gado
(EEG) teve uma maior produção em relação ao meio convencional (F/2) somente
quanto aos parâmetros clorofila a e carboidratos, apresentando diferenças
significativas. Dessa forma, entre os meios analisados o meio EEM é o mais
indicado para substituir o meio convencional, pois foi o mais produtivo dos meios;
com ressalva apenas na produção de lipídios, porém, mesmo sem diferenças
significativas, apresentou maior valor que o meio convencional (F/2).
42
7 CONCLUSÕES
ª Para a diatomácea Chaetoceros muelleri, evidenciou-se que em diferentes
meios de cultivo obtêm-se diferenças quanto ao final da fase exponencial, isto é, o
dia de máximas concentrações celulares.
ª Os teores dos compostos bioquímicos analisados, tanto nos meios alternativos
(extrato de esterco de gado e extrato de esterco de minhoca) como no meio
convencional (F/2 Guillard), apresentaram relação entre si, correspondendo ao
esperado para o final da fase exponencial, como referido em literatura especializada.
ª Os maiores valores de clorofila a celular nos meios EEG e EEM em relação ao
meio F/2, demonstram que existe uma relação entre a irradiação e a produção de
clorofila, visto que isso se deve provavelmente a quantidade de partículas nos meios
alternativos que diminui a irradiação fazendo com que as células produzam mais
clorofila.
ª A avaliação da densidade celular, clorofila a e composição bioquímica,
demonstrou que o meio extrato de esterco de minhoca obteve os maiores valores
confirmados pelas diferenças significativas (p < 0,05) dos parâmetros testados em
relação ao meio F/2 Guillard. Assim, o meio alternativo, extrato de esterco de
minhoca, pode ser utilizado como fonte nutritiva para o desenvolvimento algal e
substituir meios convencionais diminuindo os custos da produção de grandes
volumes de microalgas.
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«http://www.bdt.org.br/workshop/costa/plancton/diagn», acessado em 19 de
novembro de 2006.
54
APÊNDICES
55
APÊNDICE A – PROTOCOLO DA PRIMEIRA ETAPA DOS BIOENSAIOS
Esterco de Gado
Esterco de Minhoca
F/2 Guillard
Esterco de Gado
Esterco de Minhoca
F/2 Guillard
Retirar diariamente
alíquotas (1 mL),
período de 12 dias
Biovolume (EDLER,
1979)
Retirar diariamente alíquotas
(
10 mL
),
p
eríodo de 12 dias
Curva de crescimento e
determinação da fase
exponencial ou log
Densidade celular e taxa
diária de crescimento
(Câmara de Neubauer e
microscópio binocular Zeiss)
Clorofila a (BECKER,
1995)
Retirar a cada dois
dias alíquotas (1 mL),
período de 12 dias
Cultivo de 500mL (Erlenmeyer - 1L) de Chaetoceros muelleri, em triplicatas dos
meios F2 Guillard (F2) e extrato de esterco de gado (EEG) e de minhoca (EEM)
Cada Erlenmeyer – 1 tubo de ensaio com 30 mL da espécie:
Condições de cultivo (iluminação constante -24 horas- lâmpadas fluorescentes – tipo luz do
dia 40W; temperatura de 22,8 ± 0,87°C; pH - 8 a 9; salinidade da água do mar - 33 ups)
56
APÊNDICE B – PROTOCOLO DA SEGUNDA ETAPA DOS BIOENSAIOS
Após a determinação da fase log de C. muelleri, para cada meio de cultivo.
Novo bioensaio em garrafão plástico (20 litros) e aeração. O volume inicial foi de dois litros, nos quais foram
adicionados quatro tubos de ensaio contendo 30 mL de C. muelleri. O aumento do volume dos meios foi
realizado na fase exponencial da espécie referida.
Extrato de Minhoca
2L 4L 8L 12L 16L 20L
Extrato de Gado
2L 4L 8L 12L 16L 20L
F2 Guillard
2L 4L 8L 12L 16L 20L
Extrato de Minhoca
2L 4L 8L 12L 16L 20L
Extrato de Gado
2L 4L 8L 12L 16L 20L
F2 Guillard
2L 4L 8L 12L 16L 20L
Extrato de Minhoca
2L 4L 8L 12L 16L 20L
Extrato de Gado
2L 4L 8L 12L 16L 20L
F2 Guillard
2L 4L 8L 12L 16L 20L
Retirar três alíquotas (1 mL),
a cada aumento do volume
dos meios, para cada meio
Análise de Nitrogênio total, Carboidrato
total, Lipídio total e Proteína total
Retirar três alíquotas (1 mL), a
cada aumento do volume dos
meios, para cada meio
Densidade celular
(Câmara de Neubauer e
microscópio binocular
Zeiss)
Clorofila a (Strickland e
Parsons, 1972)
A
nálises Bioquímicas ocorreram no final
do ciclo de cultivo, na fase log e em
triplicatas. Os três garrafões (20 L) foram
centrifugados a 4000 rpm - 15 min. Material
precipitado foi acondicionado em becker e
seus respectivos meios de cultivo – F2,
EEG e EEM. Esse precipitado foi seco em
estufa até peso constante, à temperatura
de 40ºC, segundo Bezerra Neto et al.
(1994).
57
APÊNDICE C – PROTOCOLO PARA DETERMINAÇÃO DO NITROGÊNIO TOTAL
(% matéria seca) SEGUNDO O MÉTODO DE KJELDAHL (ASSOCIATION OF
OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS – AOAC, 1990)
FUNDAMENTO
O método de Kjeldahl é usado para determinar o conteúdo de nitrogênio de
substâncias orgânicas e inorgânicas. Embora modificada, consideravelmente,
durante os últimos 100 anos, os princípios básicos introduzidos por Johan Kjeldahl
forma mantidos até hoje.
O método de Kjeldahl consiste em três passos principais:
Digestão - a decomposição de nitrogênio em amostras orgânicas que utilizam uma
solução ácida concentrada. Isto é realizado fervendo uma amostra homogênea em
ácido sulfúrico concentrado. O resultado final é uma solução de sulfato de amônio.
Destilação - acrescentando excesso de base à mistura ácida de digestão
convertemos NH
4
+
para NH
3
, seguiu-se fervendo e levando a condensação do gás
NH
3
em uma solução receptora.
Titulação - quantificar o amônio na solução receptora.
A quantidade de nitrogênio em uma amostra pode ser calculada a partir da
quantidade de íons de amônia na solução receptora.
Digestão:
H
2
SO
4
/catalisador
Matéria orgânica SO
2
+ CO
2
+ H
2
O + R-NH
2
Δ =400ºC
H
2
SO
4
R-NH
2
+ H
2
O 2NH
3
+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
Δ
Destilação:
(NH
4
)
2
SO
4
+
2NaOH 2NH
4
OH + Na
2
SO
4
Δ
NH
4
OH NH
3
+ H
2
O
Δ
NH
3
+ H
3
BO
3
NH
4
H
2
BO
3
58
Titulação:
NH
4
H
2
BO
3
+ HCL (0,1 N) H
3
BO
3
+ NH
4
Cl
fator= 0,9894
MATERIAL E REAGENTES
Balança analítica; espátula de aço inox; digestor elétrico comum; aparelho
destilador de kjeldahl; haste de ferro com suporte para bureta; balão de Kjeldahl de
100 ml para digestor comum; erlenmeyer de 250 mL; becker de 20 mL; pipeta
volumetricra de 1, 5 e 10 mL; bureta de 25 mL; catalizador: mistura catalítica Merck:
mistura reagente de selênio – PA: sulfato de coppes, sulfato de sódio; selênio; ácido
sulfúrico concentrado; solução de ácido bórico a 3,5%; solução indicadora (indicador
misto amoníaco); hidróxido de sódio a 40%; solução de ácido clorídrico a 0,1N; água
destilada e papel livre de nitrogênio.
PROCEDIMENTO
Pesar cerca de 1 g, em triplicatas para cada bioensaio, em papel vegetal
(isento de nitrogênio) e transferir para o balão digestor de Kjeldahl, em seguida
acrescentar 0,5 a 1 g da mistura catalítica e 10 mL de ácido sulfúrico concentrado e
aclopar ao sistema de digestão. Digerir até que se obtenha um líquido claro. Esfriar
até temperatura ambiente. Aclopar o tubo com a amostra digerida ao destilador e
transferir 40 mL de água e 40 mL de hidróxido de sódio 40% . Em um erlenmeyer
(250 mL) adicionar 30 mL da solução de ácido bórico a 3,5% e adicionar duas gotas
da solução indicadora (indicador misto amoníaco). Destilar durante 15 min. até obter
aproximadamente o volume de 150 mL. Desligar o destilador e titular a amostra com
ácido clorídrico (HCl 0,1N) fatorado. Anotar a quantidade de ácido clorídrico titulado
e calcular o nitrogênio total (% ou g/100g).
FÓRMULA
% Nitrogênio = Vol. de HCl x fator = 0,9894 x 0,14g
Peso da amostra (g)
59
APÊNDICE D – PROTOCOLO PARA DOSAGEM DE CARBOIDRATO TOTAL
SEGUNDO A TÉCNICA FENOL – ÁCIDO SULFÚRICO
DESCRITA POR Dubois et al. (1956)
PROCEDIMENTO
Preparar o reagente dissolvendo o fenol em água (5%), Adicionar 500 μL de
fenol nos tubos de ensaio a serem analisados e depois adicionar 500 μL da amostra
já diluída, do branco e dos padrões. Agitar imediatamente as soluções. Logo depois,
acrescentar rapidamente 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado diretamente a
superfície das soluções sem permitir que ela toque as paredes do tubo. Deixar
esfriar e no máximo em 30 minutos efetuar as leituras espectrofotométricas em 490
nm, ajustando o erro do aparelho com o branco.
A curva padrão de glicose (1 mg.mL
-1
) é feita nas seguintes concentrações: 8,
12, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, e 70 μg.mL
-1
. Construir a curva de calibração de
regressão no Excel e calcular a concentração de carboidrato total nas amostras, pela
fórmula:
x = (y - A)/B
onde:
A e B = valores fornecidos pela formula da curva de calibração de regressão;
y = valor das amostras lidas em 490 nm.
O valor de R deve ser o mais próximo possível de 1.
Para as amostras aqui analisadas a fórmula resultante da curva de calibração
de regressão para o cálculo de carboidrato total foi x = ( y - 0,0559)/0,0082.
60
APÊNDICE E – PROTOCOLO PARA DOSAGEM DE PROTEÍNA TOTAL
SEGUNDO O MÉTODO DE Lowry et al. (1951)
SOLUÇÕES ESTOQUES
1. Tártaro duplo de sódio e potássio a 2% (p/v) – estocar na geladeira;
2. Sulfato de cobre a 1% (p/v) – estocar na geladeira;
3. Carbonato de sódio anidro a 2% (p/v) em NaOH 0,1M – estocar na
temperatura ambiente em recipiente plástico;
4. Albumina do soro bovino (BSA) 500 μg/mL.
SOLUÇÕES DE USO
1. solução A:
9 1 mL da solução de tártaro de sódio e potássio a 2%;
9 1 mL da solução de sulfato de cobre a 1%;
9 Completar o volume para 1000 mL com a solução de carbonato de
sódio a 2% em NaOH.
2. solução B:
9 5 mL do Reagente de Folin;
9 5 mL de água deionizada.
CURVA DE CALIBRAÇÃO
Tabela 2. Preparo das soluções padrões para a curva de calibração de proteína total.
TUBOS μg de BSA/ 500 μL sol. Sol. de BSA Água deionizada
1 20 400 4600
2 40 800 4200
3 60 1200 3800
4 70 1400 3600
5 80 1600 3400
6 100 2000 3000
7 120 2400 2600
Obs: guardar os tubos de vidro com tampa em freezer. Usar 500 μL de cada
solução na preparação da curva.
61
Tabela 3. Preparo da curva de calibração para proteína total.
TUBOS
SOLUÇÕES
PADRÕES
ÁGUA
DEIONIZADA
SOLUÇÃO
A
SOLUÇÃO
B
B - 500 μL 2,5 mL 500 μL
B - 500 μL 2,5 mL 500 μL
B - 500 μL 2,5 mL 500 μL
20 500 μL - 2,5 mL 500 μL
40 500 μL - 2,5 mL 500 μL
60 500 μL - 2,5 mL 500 μL
70 500 μL - 2,5 mL 500 μL
80 500 μL - 2,5 mL 500 μL
100 500 μL - 2,5 mL 500 μL
120 500 μL - 2,5 mL 500 μL
Misturar em vortex e ler a 750 nm após uma hora.
DOSAGEM DAS AMOSTRAS
ª Fazer as dosagens em triplicatas usando quantidades de proteína entre 20 e
80 μg;
ª Adicionar água deionizada aos tubos para completar o volume de 500 μL;
ª Adicionar 2,5 mL da solução A e 250 μL da solução B a cada um dos tubos;
ª Misturar no vortex e ler a 750 nm após uma hora;
ª Construir a curva de calibração de regressão no Excel e calcular a
concentração de proteína total nas amostras dosadas, pela fórmula:
x = (y - A)/B
onde:
A e B = valores fornecidos pela formula da curva de calibração de regressão;
y = valor das amostras lidas em 750 nm.
O valor de R deve ser o mais próximo possível de 1.
Para as amostras aqui analisadas a fórmula resultante da curva padrão para o
cálculo de proteína total foi x = (y - 0,05573)/0,00401.
62
APÊNDICE F – PROTOCOLO PARA DOSAGEM DE LIPÍDIO TOTAL
SEGUNDO A TÉCNICA DESCRITA POR Frings et al. (1972)
FUNDAMENTO
Os lipídios quando aquecidos com ácido sulfúrico concentrado são oxidados;
os produtos tratados com fosfovanilina fornecem um complexo de coloração rósea, A
reação passa por três etapas;
ª Os componentes insaturados reagem com ácido sulfúrico formando o íon
“carbonium”;
ª A vanilina reage com o ácido fosfórico para produzir um éster fosfórico
(fosfovanilina);
ª O íon “carbonium” reage com o grupo carbonila da fosfovanilina, produzindo
um complexo de coloração rósea, cuja intensidade é diretamente proporcional à
concentração de lipídios totais existentes na amostra.
REATIVOS
ª Ácido sulfúrico concentrado;
ª Reativo cromogênico:
Vanilina p.a. 152 mg
Ácido fosfórico a 85% 76 mL
Água destilada q.s.p. 100 mL
Armazenar em fraco âmbar, este reativo é estável à temperatura ambiente,
ª Padrão de lipídios (700 mg/dL):
Trioleína p.a.;
Etanol absoluto q.s.p.
Armazenar em frasco âmbar na geladeira.
A curva padrão de trioleína foi realizada nas seguintes concentrações: 0,125;
0,25; 0,375; 0,5; 0,625 e 0,75 mg.
Construir a curva de calibração de regressão no Excel e calcular a
concentração de lipídio total nas amostras dosadas, pela fórmula:
63
x = (y - A)/B
onde:
A e B = valores fornecidos pela formula da curva de calibração de regressão;
y = valor das amostras lidas em 530 nm.
O valor de R deve ser o mais próximo possível de 1.
PROCEDIMENTOS
1) Adicionar 0,05 mL das amostras, de cada meio de cultivo – F/2, EEG e EEM,
em tubos de ensaio, em triplicas, Pipetar 0,05 mL das concentrações do padrão de
trioleína e 0,05 mL de água destilada para fazer o branco;
2) Adicionar em cada um dos tubos 2 mL de ácido sulfúrico concentrado, agitada
e aquecer em banho de água fervente durante 10 minutos, Esfriar sob água
corrente;
3) Transferir para outros tubos de ensaio igualmente marcados, 0,1 mL das
respectivas misturas obtidas acima;
4) Adicionar a cada tubo 3 mL do reativo cromogênico e mantê-los em um banho
de água a 37ºC durante 10 minutos. Esperar esfriar;
5) Efetuar as leituras espectrofotométricas em 530 nm, ajustando o erro do
aparelho com o branco.
Para as amostras aqui analisadas a fórmula resultante da curva padrão para o
cálculo de lipídio total foi x = (y - 0,053)/ 0,7371.
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