ads:
!
"#
$
%&&'()*+,- *.('&'/)*0* *- .(-1(*2* 0'
3&4$(*05*+,- '2 *)-6-1%* 0* *7560*0'
0' '0%7%/* 0' -)57*)58 /%9'(&%0*0'
&)*05*6*56%&)*:.*(*-;)'/+,-0-
)<)56-0''&)(''2*)-6-1%*=
8
!!>
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
?
!
"#
Mestrando: Alexandre Domingues
Orientadora: Ana Lúcia Tozzi Spinardi-Barbisan
Co-Orientador: Luís Fernando Barbisan
%&&'()*+,- *.('&'/)*0* *- .(-1(*2 * 0'
3&4$(*05*+,- '2 *)-6-1%* 0* *7560*0'
0' '0%7%/* 0' -)57*)58 /%9'(&%0*0'
&)*05*6*56%&)*:.*(*-;)'/+,-0-
)<)56-0''&)(''2*)-6-1%*=
8
!!>
ads:
!
"#
$% &'' ()* $
+*
,
- .#
'
/
0$123
&# .
!-1
+-*
4-+,(
#
56)
2.78297!
#.
#
,
-
&,)7
4!-:+7
;1+ /
2/
#3
&#-2-0
0-'0!(,<4!
"*27
2-(,=>
)
,-
,2
.6
,;#'?
#-/1.',
7'2$4
/'::**
22)7
+'
,6
+5 "(+"(
/.
2 e Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior, 2"(
'/
+
@
Índice Geral
Índice de Tabelas..................................................................... iii
Índice de Figuras...................................................................... iv
Capítulo I
1. Revisão da Literatura.......................................................... 1
1.1.
Praguicidas: Considerações gerais......................................... 1
1.2. Diuron: Propriedades físico-químicas.................................... 2
1.3. Diuron: Propriedades biológicas e potencial tóxico............... 3
1.4. Imunotoxicidade de xenobióticos...........................................
6
2. Referências Bibliográficas...................................................
12
3. Objetivos
...............................................................................
21
.
Capítulo II
Artigo
Avaliação do potencial imunotóxico do herbicida Diuron em ratos
Wistar machos: estudo de toxicidade de 28 e 90 dias (doses repetidas)
Resumo....................................................................................................
22
Abstract
...................................................................................................
23
1. Introdução...........................................................................................
24
2. Material e Métodos............................................................................
26
2.1. Animais e ambiente de experimentação...........................................
26
2.2. Preparo da ração com Diuron...........................................................
26
2.3. Protocolo Experimental....................................................................
26
2.4. Análise hematológica...................................................................
27
2.5. Dosagens bioquímicas........................................................... ......
27
2.6. Coleta de órgãos e processamento de tecidos..............................
27
2.7. Preparo das células do baço.........................................................
30
2.8. Marcação das células para análise fenotípica..............................
31
2.9. Análise estatística........................................................................
32
.
3. Resultados.....................................................................................
33
3.1. Peso corpóreo, consumo de ração e água e peso de órgãos.........
33
3.2. Parâmetros hematológicos e bioquímicos..................................
34
3.3. Análise histológica.....................................................................
38
3.4. Análise fenotípica das subpopulações de linfócitos...................
43
4. Discussão......................................................................................
44
5. Referências...................................................................................
49
Capítulo III
Artigo
Avaliação do potencial imunotóxico do herbicida Diuron sobre a
atividade de macrófagos peritoneais em ratos Wistar machos
Resumo.........................................................................................
53
Abstract........................................................................................
54
1. Introdução................................................................................
55
2. Material e Métodos..................................................................
57
2.1. Animais e ambiente de experimentação.................................
57
2.2. Preparo e administração de Onco-BCG..................................
57
2.3. Preparo da ração com Diuron.................................................
57
2.4. Protocolo experimental..........................................................
58
2.5. Obtenção das suspensões celulares...........................................
59
2.6. Espraiamento e fagocitose.....................................................
59
2.7. Determinação da liberação de H
2
O
2.
......................................
60
2.8. Determinação da liberação de óxido nítrico..........................
60
2.9.
Análise Estatística..................................................................
61
3. Resultados
............................................................................................. 62
4. Discussão..................................................................................
66
5. Referências
...............................................................................
69
iii
Índice de Tabelas
Capítulo II
Tabela 1 -
Critérios para análise histopatológica de órgãos
linfohematopoiéticos.................................................................
30
Tabela 2 - Peso corpóreo inicial, final e ganho de animais controles e
tratados com Diuron por 28 e 90 dias.......................................
34
Tabela 3 - Consumo médio estimado de ração basal e de Diuron pelos animais
controles e tratados com o herbicida por 28 e 90 dias...............
35
Tabela 4 - Peso relativo do fígado, rins, adrenais, baço e timo de animais
controles e tratados com Diuron por 28 e 90 dias......................
36
Tabela 5 – Análise quantitativa dos esfregaços sanguíneos de animais controles
e tratados com Diuron por 28 e 90 dias......................................
37
Tabela 6 - Parâmetros bioquímicos de animais controles e tratados com Diuron por
28 e 90 dias. ...............................................................................
38
Tabela 7 - Alterações histológicas no baço de ratos Wistar machos expostos ao
Diuron por 28 e 90 dias.............................................................
41
Tabela 8 - Histologia de medula óssea de animais controles e tratados com Diuron
por 28 e 90 dias...........................................................................
42
Tabela 9 - Porcentagem das subpopulações de linfócitos T CD4
+
, CD8
+
e linfócitos
B CD45RA
+
no baço de animais controles e tratados com Diuron por 28
e 90 dias......................................................................................
43
Capítulo III
Tabela 10 -
Peso corpóreo inicial, final e ganho de animais controles e
tratados com Diuron por 14 dias...............................................
66
iv
Índice de Figuras
Capítulo I
Figura 1 -
Estrutura molecular do herbicida Diuron...................................
3
Capítulo II
Figura 2 - Protocolo Experimental............................................................
29
Figura 3 - Esplenomegalia: Comparação entre baços de grupos controle e
tratados aos 28 e 90 dias..........................................................
44
Figura 4 – Suspensões celulares obtidas a partir do baço: Diferenças de
pigmentação entre baços de grupos controle e tratados aos 28 e
90dias......................................................................................
44
Figura 5
- Histologia dos baços de animais dos grupos controle e tratados:
Redução de polpa branca e aumento da deposição de
hemosiderina...........................................................................
44
Capítulo III
Figura 6 – Protocolo Experimental.........................................................
58
Figura 7 - Espraiamento
de macrófagos peritoneais nos grupos controle e
tratados por 28 e 90 dias. A: Animais sem estímulo por Onco-
BCG, B: Animais estimulados por Onco-BCG...................
62
Figura 8 - Avaliação do índice de fagocitose nos grupos controle e tratados
por 28 e 90 dias. A: Animais sem estímulo por Onco-BCG, B:
Animais estimulados por Onco-BCG....................................
63
Figuro 9 - Produção de água oxigenada nos grupos controle e tratados por
28 e 90 dias. A: Animais sem estímulo por Onco-BCG, B:
Animais estimulados por Onco-BCG...................................
64
Figura 10 -
.
Produção de óxido nítrico nos grupos controle e tratados por
28 e 90 dias. A: Animais sem estímulo por Onco-BCG, B:
Animais estimulados por Onco-BCG..................................
65
!$
Revisão de Literatura
1
1. Revisão da literatura
1.1 Praguicidas: Considerações gerais
Os praguicidas são substâncias químicas utilizadas no combate as pragas das
lavouras e áreas urbanas, sendo que nesta designação enquadram-se as classes:
inseticidas - que eliminam insetos; acaricidas – que eliminam ácaros ou carrapatos;
fungicidas – que eliminam fungos parasitas; herbicidas – que combatem ervas daninhas,
e raticidas - que eliminam pequenos roedores (Soares, 1993). A utilização de agentes
químicos como praguicidas vem desde a antiguidade, contudo seu uso se ampliou
consideravelmente durante o século XX com o desenvolvimento da síntese química, ou
seja, o desenvolvimento de moléculas específicas para um propósito (IARC, 1991).
Diversas substâncias químicas utilizadas na agricultura são reconhecidas como
possíveis agentes tóxicos, teratogênicos, mutagênicos e cancerígenos (Feber & Cabral,
1991; IARC, 1991). Apesar de terem como alvo específico algumas pragas, efeitos
adversos em seres humanos e outras espécies ainda não foram devidamente
caracterizados (Weiss, 2004). A determinação e a extensão de doenças relacionadas à
exposição ambiental é difícil de ser calculada. Os riscos potenciais para a saúde humana
associados com a exposição à misturas químicas torna-se uma preocupação crescente
(Carpenter, 2002).
A exposição aos praguicidas não ocorre somente em trabalhadores rurais, que
manipulam diretamente esses compostos através de exposição ocupacional, mas
também na população em geral, através de exposição acidental com resíduos, ingestão
de água e alimentos contaminados. Enquanto a exposição ocupacional afeta um grupo
limitado de trabalhadores, numa faixa de partes por milhão (ppm), as exposições
Revisão de Literatura
2
acidentais, através da água, ar, alimentos e locais de despejo, podem estar na faixa de
partes por bilhão (ppb). Os efeitos de exposições crônicas em baixos níveis sobre a
saúde humana ainda são pouco conhecidos (Levy, 2000).
A avaliação da periculosidade dos praguicidas e a caracterização adequada do
potencial toxicológico podem fornecer informações valiosas para o implemento de
medidas governamentais e de saúde pública que regularizem seu uso segundo níveis
adequados de exposição humana (Morrison et al.,1992; Weisenburger, 1993). As
deficiências na avaliação de risco de praguicidas, incluindo a padronização de
metodologias para tal finalidade, apontam a necessidade do desenvolvimento de
programas para a avaliação da periculosidade dessas substâncias e do implemento de
alternativas ao seu uso (Feldman, 2004).
1.2 Diuron: Propriedades físico-químicas
O Diuron, 3(3,4-diclorofenil) 1,1, dimetil uréia (Figura 1), é um praguicida da
classe feniluréia (derivado dihalogenado da uréia) amplamente utilizado em culturas
agrícolas como cana-de-açúcar, café, citros, soja e alfafa (Figura 1). Sua classificação
toxicológica se enquadra nos níveis II a IV (altamente a moderadamente tóxico) e a
ambiental no nível II (produto muito perigoso), (CD do Sistema de Informações
Toxicológicas Sobre Agrotóxicos - Agência de Vigilância Sanitária, Brasil, 2000). Em
microorganismos e em plantas daninhas atua inibindo a fotossíntese, prevenindo a
produção de oxigênio e a transferência de elétrons na etapa II da fotossíntese (Wessels
et al, 1956). Quanto às suas características, em sua forma pura, o Diuron é um cristal,
não-iônico, com moderada solubilidade em água (42 mg/L a 20
o
C). Apresenta hidrólise
desprezível em pH neutro, aumentando, contudo, em condições mais ácidas ou básicas
(Salvestrini, 2002; Giacomazzi & Cochet, 2004). Devido a sua elevada persistência (um
mês a um ano), o Diuron pode ser uma fonte potencial de contaminação do solo,
sedimentos e ambientes aquáticos (Field et al, 2003).
Revisão de Literatura
3
Fig. 1 – Estrutura molecular do Diuron 3(3,4-diclorofenil) 1,1, dimetil uréia
É importante salientar que os praguicidas, ao sofrerem degradação ambiental,
podem dar origem a compostos intermediários mais tóxicos do que o composto original.
As substâncias da classe N-feniluréia, por exemplo, são degradadas no solo a derivados
como 3,4-dicloroanilina (Gooddy et al, 2002) e, particularmente, herbicidas como o
Diuron (feniluréia halogenados), ao serem expostos a radiação ultravioleta, podem
sofrer fotólise, gerando pelo menos um subproduto com toxicidade mais elevada do que
o composto original (Bonnemoy, 2003). Esta característica é particularmente importante
em países tropicais, onde os níveis de radiação ultravioleta são elevados durante o ano
inteiro. Além disso, durante sua produção são gerados contaminantes, potentes
substâncias “dioxina-like” que podem interferir no potencial de toxicidade do Diuron.
Devido a este fato, a Autoridade de Registro Nacional Australiana (NRA, sigla do
inglês), está revendo a classificação e registro do Diuron segundo a toxicidade destes
compostos (NRA, 2002).
1.3 Diuron: Propriedades biológicas e potencial tóxico
O Diuron é absorvido no trato gastrointestinal e sistema respiratório. Em seres
humanos, é metabolizado pelo fígado por hidroxilação e N-dealquilação, sendo
excretado pela urina. Em ratos e cães foi observada excreção também pelas fezes
(Hayes, 1982). Atua como indutor enzimático do sistema de oxidases mistas (enzimas
Revisão de Literatura
4
do citocromo P450), aumentando o conteúdo enzimático do sistema em
aproximadamente 50%, quando comparado a praguicidas similares (Schoket & Vincze,
1985). É tóxico para mamíferos, contudo os jovens são mais susceptíveis que os adultos
(Hayes, 1982). Em roedores, os herbicidas derivados de uréia apresentam baixa
toxicidade sistêmica, com uma dose letal média (DL50) de 1017 mg/kg em ratos jovens
normais, 437 mg/kg em ratos tratados com dieta deficiente em proteínas e de 2390
mg/kg em ratos tratados com dieta rica em proteínas (Boyd & Krupta, 1970). Apesar
desta baixa toxicidade aguda, é de extrema importância ressaltar que seus produtos
intermediários de degradação (metabólitos e fotoprodutos) podem ser mais tóxicos do
que o herbicida em sua forma original. Por exemplo, a biotransformação do Diuron pela
Arthrobacter sp., N
2
ou outros microorganismos gera metabólitos de elevada toxicidade
(Tixier et al, 2002).
O principal produto de degradação do Diuron , a 3,4-dicloroanilina (3,4-DCA),
apresenta DL50 de 60mg/kg por via inalatória, indicando que esse subproduto é mais
tóxico do que o próprio praguicida. A absorção por via dérmica ou inalatória deste
componente leva à rápida formação de metahemoglobina, causando hipóxia e levando à
sensibilização respiratória (Guilhermino, 1998). O potencial cancerígeno da 3,4-DCA
ainda não está devidamente estabelecido.
Experimentos realizados com ratos Wistar e cães Beagle, expostos ao Diuron em
estudo de toxicidade oral, permitiram detectar a presença de resíduos do herbicida em
diferentes tecidos, sendo os maiores níveis encontrados nos rins e fígado (Hodge et al.,
1967). Efeitos tóxicos, geralmente observados após a ingestão crônica foram perda de
peso, alterações em fígado, baço e distúrbios hematológicos (Hayes, 1982). Nestes
estudos, na concentração de 250 ppm (dose de 6,26 mg/kg em cães e 12,5 mg/kg em
ratos), foram observadas alterações hematológicas, perda de peso, hemosiderose no
fígado e hiperplasia da série eritróide. Não foram observadas evidências de
carcinogenicidade do Diuron. Estudos associando o Diuron ao hexaclorociclohexano
(HCH), um inseticida descrito como hepatocancerígeno, demonstraram alta mortalidade
e perda de peso em ratos machos albinos expostos às concentrações de 2500 ppm e 500
ppm, respectivamente, na ração (Nagasaki et al, 1971; Munir et al, 1983). Em modelos
experimentais, a exposição ao Diuron demonstrou causar irritações oculares e na
mucosa de coelhos (Worthing, 1993).
Revisão de Literatura
5
A avaliação do potencial mutagênico do Diuron ainda não está devidamente
caracterizada, mostrando-se negativo na maioria dos estudos in vitro utilizando
microorganismos, com ou sem ativação metabólica (Grutman et al., 1984). Entretanto,
mutagenicidade positiva foi relatada em testes com Salmonella typhimurium com
ativação metabólica e ensaios de biossíntese de DNA testicular (Seiler, 1978;
Anon,1987). Dois testes in vitro utilizando células de mamíferos, o de mutação gênica
em células de ovário de hamster chinês e o de síntese não-programada de DNA (UDS,
sigla do inglês) em hepatócitos de ratos, obtiveram resultados negativos para o
praguicida (Dupont de Nemours, 1985). Avaliações in vivo de efeitos resultantes da
exposição ao herbicida, demonstraram indução da formação de micronúcleo em medula
óssea de camundongos Swiss (Agrawal et al., 1996), mutações dominantes letais em
camundongos Swiss (Agrawal & Mehrotra, 1997) e efeitos clastogênicos em ratos
(Dupont de Nemours, 1985). Nascimento et al. (2006) não observaram efeitos
genotóxicos do Diuron em células do sangue periférico e da bexiga de ratos Wistar
machos através do teste do cometa, não inferindo potencial iniciador ao herbicida.
Diversas drogas e substâncias químicas estão relacionadas com teratogênese,
ocasionando anomalias congênitas (defeitos morfológicos) com incapacidade funcional
e estética graves, e fetotoxicidade, caracterizada por redução do peso corpóreo e retardo
do desenvolvimento fetal (Finell, 2002). Estudos sobre os efeitos do Diuron sobre a
gestação e a capacidade reprodutiva, utilizando três gerações consecutivas de ratos,
demonstraram que a ingestão do herbicida na dose de 6 mg/kg foi fetotóxica, causando
redução do peso corpóreo nas proles F2 e F3 (segunda e terceira geração). Em doses
diárias de 250 mg/kg de peso corpóreo, não houve evidência de potencial teratogênico,
contudo, fetotoxicidade foi relatada, caracterizando-se por pesos fetais diminuídos,
costelas e estrutura óssea menores. Tais efeitos também foram observados em doses de
125 mg/kg, contudo sua incidência não foi significativa (Khera et al., 1979; EPA, 1987).
Até o momento, poucos trabalhos na literatura voltam-se para o estudo do
potencial cancerígeno do Diuron e os dados ainda se mostram contraditórios. Antony e
colaboradores (1989) demonstraram, através de múltiplas aplicações tópicas (250 mg/kg
pc), que o Diuron é um agente iniciador da carcinogênese de pele em camundongos
Swiss, utilizando-se como agente promotor o 12-O-tetradecanoil phorbol 13-acetato
(TPA). Já em modelo de carcinogênese hepática, quando administrado na dieta (2500
ppm) por um período de 4 ou 8 meses, o Diuron não revelou atividade iniciadora ou
Revisão de Literatura
6
promotora (Agrawal & Kumar, 1999). Somando essas informações ao já citado estudo
de Nascimento et al (2006 os dados revelam um conflito entre o potencial iniciador para
a pele em camundongos e ausência de potencial genotóxico do Diuron.
Em outro estudo, Grassi et al. (2005) demonstraram que o Diuron, administrado
na dieta nas concentrações de 125, 1250 e 2500 ppm, não apresenta atividade promotora
no fígado de ratos Wistar machos iniciados pela dietilnitrosamina. Em estudo cujo alvo
de análise foi o sistema urinário, concentrações de 2500 ppm de Diuron relacionaram-se
com aumento de necrose e estímulo da proliferação celular, levando à hiperplasia
urotelial em ratos Wistar machos (Nascimento et al., 2006). Em ratos Wistar de ambos
os gêneros, os quais receberam por dois anos na ração 2500 ppm de Diuron, foi
observado aumento da incidência de papilomas e carcinomas de bexiga; os ratos machos
apresentaram tendência ao desenvolvimento de papilomas e carcinomas na pelve renal
(Bayer, 1985 apud USEPA, 1997). Dois tumores renais, considerados raros na espécie,
foram observados em ratos Wistar machos expostos a altas concentrações do Diuron.
Contudo, esses estudos não estão disponíveis, pois são propriedades industriais (Anon,
1987). Fêmeas de camundongos da linhagem NMR1 expostas à concentração de 2500
ppm de Diuron apresentaram tendência ao aumento de adenocarcinomas mamários. Este
achado foi considerado maior que a incidência de dados históricos para este tipo de
tumor em fêmeas controles de estudos com a mesma linhagem de camundongos (Iyer,
2001). Assim, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA) está
reavaliando o potencial de carcinogenicidade do Diuron devido a resultados positivos
observados em estudo de longa-duração em roedores.
1.4 Imunotoxicidade de xenobióticos
Contaminantes ambientais, incluindo bifenis policlorados (PCBs), dioxinas,
metais pesados e praguicidas como dieldrin e DDT (diclorodifeniltricloroetano) estão
amplamente distribuídos em ambientes aquáticos e terrestres (Boffetta, 2006). A
persistência desses compostos, sua bioacumulação nos organismos vivos e seu potencial
em causar efeitos adversos, incluindo efeitos sobre o sistema imunológico, geram
preocupação às instituições governamentais e ao público em geral (Gaylor et al., 1997).
Revisão de Literatura
7
Historicamente, a maior preocupação com relação aos possíveis efeitos adversos
de agentes químicos voltava-se principalmente para o estudo de seu potencial
cancerígeno. Contudo, pesquisadores passaram a reconhecer a importância de eventos
adversos não-carcinogênicos, tais como imunotoxicidade e teratogênese, no perfil
tóxico de substâncias as quais a população está exposta (Dean, 2004). Neste sentido, a
Agência de Proteção Ambiental Norte Americana (EPA, sigla do inglês) desenvolveu
um Guia (Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870.7800 Immunotoxicity) para testar
praguicidas e substâncias tóxicas em roedores, com ênfase sobre parâmetros
imunológicos, cuja proposta é melhorar as informações sobre a supressão do sistema
imunológico que pode ocorrer como resultado da exposição repetida a um determinado
xenobiótico (EPA, 1998). Da mesma forma, o Guia para estudo de toxicidade oral de 90
dias em roedores da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico
(OECD, sigla do inglês) acrescentou um adendo com ênfase em parâmetros
imunológicos (OECD 408, 1998).
O conhecimento dos efeitos adversos decorrentes da interação entre
xenobióticos e componentes do sistema imunológico é o principal foco da
Imunotoxicologia (Luster & Rosenthal, 1993). Estes efeitos indesejados podem
resultar da ação direta e/ou indireta
do xenobiótico (e/ou produtos de sua
biotransformação) sobre o sistema imunológico; de uma resposta imunológica do
hospedeiro à substância e/ou seus metabólitos ou de modificações dos antígenos do
hospedeiro pelos próprios compostos ou seus metabólitos (Bennett,1987;).
O resultado
da ação tóxica dos xenobióticos sobre o sistema imunológico pode levar à
disfunção imunológica do hospedeiro facilitando o aparecimento de doenças
auto-imunes e reações de hipersensibilidade, bem como, a susceptibilidade
aumentada ao aparecimento de infecções oportunistas, e ao desenvolvimento de
neoplasias (Descotes et al., 2000; Kimber & Dearman, 2002).
O campo da imunotoxicologia vem crescendo consideravelmente desde a década
de 70 (Descotes, 2004). Os caminhos atuais seguidos por essa ciência abrangem
experimentos de avaliação de toxicidade em roedores, sob condições controladas de
exposição, na tentativa de mimetizar situações as quais os seres humanos estão expostos
(Vohr, 2000). Dados de estudos animais têm sido muito úteis para predizer o potencial
Revisão de Literatura
8
de imunotoxicidade e seus efeitos sobre a resistência do hospedeiro. Alem disso, os
resultados de estudos experimentais estão sendo aplicados em modelos de
paralelogramas para reduzir as incertezas associadas a níveis de organização biológica
cruzada, e extrapolação de dados animais para o homem (Selgrade, 1999). Os resultados
experimentais também auxiliam no discernimento com relação à variabilidade intra-
espécie e a relação entre os efeitos decorrentes de exposição, aguda, sub-aguda e
crônica. Em última instância estes achados podem auxiliar na decisão sobre o risco da
substância para a população humana (Selgrade, 1999).
Apesar de diversos sistemas orgânicos serem afetados por contaminantes
ambientais, dados resultantes de modelos experimentais indicam que o sistema
imunológico é um dos alvos mais sensíveis para a toxicidade induzida por agentes
químicos.
A disfunção imunológica pode ser observada, em estudos
toxicológicos, em roedores submetidos à doses sub-letais de vários agentes
químicos ambientais (
Luster & Rosenthal, 1993; Colosio et al., 2005)
. A atrazina,
um herbicida considerado de baixa toxicidade, alterou parâmetros de função
imunológica mediada por células e reduziu a resistência do hospedeiro, ao
desafio com células de melanoma B16F10, em estudo com camundongos
B6C3F1, tratados por 14 dias (Karrow et al., 2005). Um estudo realizado com
camundongos CBA/N mostrou que a N,N-dietilanilina inibiu a atividade das
células “natural killer” (NK) e dos linfócitos T citotóxicos sem alterar o número
destas células (Li et al., 2000).
Um estudo in vitro utilizando-se células
mononucleares de sangue periférico humano de doadores normais mostrou que o
Diuron, administrado às culturas nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM, inibiu a
produção de IL-5, IFN-γ e TNF-α (Hooghe et al., 2000). Ratas expostas às doses de
250-1000 mg/kg de Diuron na dieta por 14 meses apresentaram aumento do peso do
baço, aumento de hemosiderina e formação de aductos de aminas aromáticas liberadas
do herbicida na molécula de hemoglobina (Wang et al., 1993).
Algumas substâncias,
como selênio, dietilnitrosamina, dióxido clorina e monocloramina, afetam a
atividade e a produção de citocinas pelos macrófagos (Koller, 1985). Os
hidrocarbonetos aromáticos halogenados provocam alterações no epitélio tímico,
na diferenciação de células B e T (Poland & Knutson, 1982; Greenlee et al.,
Revisão de Literatura
9
1985; Luster et al., 1988). Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos provocam
alterações em células T auxiliares, na função de macrófagos e inibem a
blastogênese (Wojdani & Alfred, 1984). Fêmeas Balb/c expostas ao 3-
monocloro-1,2-propanodiol por 14 dias, apresentaram redução da celularidade do
timo e do baço, inibição da resposta imunológica mediada por anticorpos contra
hemáceas de carneiro e diminuição da atividade NK na maior dose (100 mg/Kg)
(Lee et al., 2004). Indivíduos expostos ao asbestos podem apresentar alterações
em número e função de macrófagos e diminuição da atividade NK em células
circulantes (Rosenthal, 1998).
A dinâmica do sistema imunológico, caracterizada pela proliferação e
diferenciação celular, amplificação, transcrição e tradução gênica, faz dele um
importante alvo dos efeitos tóxicos de xenobióticos (Vial, 2002). Dentre os diferentes
órgãos que constituem o sistema imunológico, o timo e a medula óssea, responsáveis
pelos processos de maturação e diferenciação dos componentes do sistema imunológico,
são órgãos centrais para avaliação de imunotoxicidade (Schuurman, 1994). Os efeitos
adversos decorrentes da interação de xenobióticos com componetens do sistema
imunológico geralmente incluem danos estruturais e/ou funcionais em órgãos linfóides
tais como, alteração da celularidade do timo, baço, medula óssea e linfonodos,
proliferação anormal de progenitores na medula óssea, alteração no processo de
maturação das células imunológicas e alterações funcionais das respostas humoral e/ou
celular (Descotes, 1988; Kimber & Dearman, 2002). Essa diversidade de efeitos
resultantes da exposição à agentes químicos, e a possibilidade do desenvolvimento de
eventos adversos tardios, faz da avaliação do potencial imunotóxico de xenobióticos
uma ciência de grande complexidade e revela a necessidade de cautela na interpretação
de dados (Kimber & Dearman, 1993; Descotes, 2000).
A avaliação toxicológica de um composto é acessada por meio de estudos de
doses repetidas, cuja exposição fica em torno de 4 semanas a 3 meses, utilizando-se 3
doses que variam de superdosagem (exercendo toxicidade, mas não mortalidade) a
efeitos adversos não observados - baixas doses (Dean et al., 1989; Barlow et al., 2002).
Estudos de doses repetidas em imunotoxicologia estão tradicionalmente relacionados
aos efeitos de um determinado composto sobre a imunidade celular, com a possível
Revisão de Literatura
10
adição de grupos satélites para avaliação de funções da imunidade humoral (Barlow et
al., 2002).
Em função da complexidade do sistema imunológico, diversos biomarcadores de
toxicidade devem ser avaliados para caracterização do potencial imunotóxico de uma
substância. Para tal,
um painel de testes que abrange a análise histológica de
órgãos linfóides e estudos de função imunológica, como testes de resistência do
hospedeiro e produção de citocinas têm sido proposto (Luster et al., 1988;
Vandebriel, 1998; Schuurman, 1994; Kuper et al., 2000). O primeiro painel
abrange testes não-funcionais onde se enquadram as avaliações de peso corpóreo,
peso e histopatologia de órgãos linfohematopoiéticos, e hematologia. O segundo
painel inclui os testes funcionais, tais como atividade de macrófagos, atividade
NK, marcadores de superfície, resposta proliferativa, ensaios de citotoxicidade,
produção de anticorpos e modelos de resistência do hospedeiro (Luster et al.,
1988). Dentre esses testes, a
observação de achados histopatológicos em órgãos
linfóides primários e secundários é uma ferramenta indispensável na caracterização da
toxicidade de compostos sobre o sistema imunológico (Germolec, 2004; Kuper, 2006).
O desenvolvimento das técnicas histológicas e a associação destas com testes
funcionais, cultura de células e tecidos, permitem uma melhor compreensão dos
mecanismos de imunotoxicidade (Schuurman, 1994). Com o avanço da imunologia
molecular os estudos de modo e mecanismo de ação estão se tornando mais práticos. E,
com isso, a indústria e agências de regulamentação de substâncias estão propondo o uso
de técnicas de expressão gênica para identificar e classificar o potencial imunotóxico de
substâncias. Além disso, diversos estudos de imunotoxicidade publicados sugerem que
a análise por “microarray” é uma prática significativa para explorar as vias que levam a
disfunção imunológica (Luebke et al., 2006).
Além dos tradicionais métodos utilizados in vivo, para avaliação do potencial
imunotóxico, métodos alternativos têm sido propostos no sentido de se reduzir o
número de animais de experimentação na implementação do registro de novos
químicos. Um estudo preliminar realizado por Carfi e colaboradores (2006), avaliou o
potencial imunotóxico de seis substâncias, com conhecidos efeitos imunotóxicos in
vivo, utilizando um conjunto de testes in vitro. Os testes propostos foram ensaios de
citotoxicidade, liberação de citocinas, mielotoxicidade e resposta mitogênica. Todos
Revisão de Literatura
11
eles confirmaram os resultados in vivo do potencial imunotóxico das substâncias
estudadas.
!6
Referências
12
Referências
1. Agrawal RC, Mehrotra NK. Micronucleus induction by Diuron in mouse bone
marrow. Indian J. Exp. Biol. 1997; 35:1256.
2. Agrawal RC,Kumar S. Hepato-toxic effect of Diuron in albino rats.
Indian J Exp Biol. 1999; 37:503-4.
3. Agrawal RC, Kumar S, Mehrotra, NK. Micronucleus induction by Diuron in mouse
bone marrow. Toxicol. Letters. 1996; 86: 1
4. Anon D. Proper. Ind. Mater. Report. 1987; 7 : 49.
5. Antony M, Shukla Y, Mehrotra, NK. Tumour initiatory activity of an herbicide
Diuron on mouse skin. Cancer Lett. 1989; 48:125-8
6. Barlow SM. Hazard identification by methods of animal-based toxicology. Food
Chem Toxicol. 2002 ;40(2-3):145-91
7. Bayer Institute of Toxicology. Diuron: Study for chronic toxicity and carcinogenicity
with NMRL mice (administration in the diet for up to two years). Wuppertal: Bayer
Institute of Toxicology. 1983 (DPR # 106-048).
8. Bayer Institute of Toxicology. Diuron: Study for chronic toxicity and carcinogenicity
with Wistar rats (administration in the diet for up to two years). Wuppertal: Bayer
Institute of Toxicology. 1985 (DPR # 106-035).
9. Bennett E, Mercier M. Preface in Immunotoxicology. Boston:Martinus Nijhoff
Publishers, 1987.
10. Boffetta P. Human cancer from environmental pollutants: the epidemiological
evidence. Mutat Res. 2006;608(2):157-62.
11. Bonnemoy F, Lavedrine B, Boulkamh A. Influence of UV irradiation on the toxicity
of phenylurea herbicides using Microtox test.Chemosphere. 2004;54(8):1183-7.
Referências
13
12. Boyd EM, Krupta V. Protein deficiency diet and Diuron toxicity. J Agric Food
Chem. 1970; 18:1104-1107.
13. Carfi M. In vitro tests to evaluate immunotoxicity: a preliminary study.
Toxicology. 2007 ;229(1-2):11-22
14. Carpenter DO, et al. Understanding the human health effects of chemical mixtures.
Environ Health Perspect. 2002; 110 (suppl A):25.
14. Colosio C, Birindelli S, Corsini E, Galli CL,Maroni M. Low level exposure to
chemicals and immune system. Toxicol Appl Pharmacol. 2005;207(2):320-328.
15. Dean JH, Cornacoff JB, Rosenthal GJ, Luster MI. Immune system: Evaluation of
injury. Principles and Methods of Toxicology .A. W. Hayes, Ed. 1989, p 741-760.
Raven Pres, New York
16. Descotes J, Choquet-Kastylevsky G, Van Ganse E, Vial T. Responses of the
immune system to injury. Toxicol. Pathol. 2000, 28:479-481.
17. Descotes J. Immunotoxicity of chemicals. In: Immunotoxicology of Drugs and
Chemicals. Amsterdam:Elsevier. 1988;297-444.
18. Descotes J. Importance of immunotoxicity in safety assessment: a medical
toxicologist's perspective (Review). Toxicol Lett. 2004 ;149(1-3):103-8.
19. Descotes J. Methods of evaluating immunotoxicity. Expert Drug Opin Drug Metab
Toxicol. 2006; 2(2):249-59.
20. Descotes J. Regulating immunotoxicity evaluation: issues and needs.
Arch Toxicol Suppl. 1998;20:293-9
21. Dupont de Nemours & CO. Mutagenicity studies with Diuron. Salmonella test, No.
HLR 471-84 (7185); CHO/HGPRT forward gene mutation assay, H.R. No. 282-85
(06/28/85); unscheduled DNA synthesis test in primary rat hepatocytes, HLR No.
349-85; and in vivo cytogenetic test, No. 36685
Referências
14
22. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). Health effects test
guidelines: OPPTS 870.7800 Immunotoxicity. 1996.
23. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). Increased incidence of
malignant and combined malignant and benign tumors in male and female rats and
increased incidence of malignant tumors in female mice. 1987
24. Feber A, Cabral R. Toxic epidemics caused by alimentary exposure to pesticides: a
review. Foo Additives Contam.1991; 8:755-776.
25. Feldman J. Risk assessment, a community perspective. Pesticides Pediatrics,
2004;113:1030-1036.
26. Fernandes GS, et al. Reproductive effects in male rats exposed to Diuron. Reprod
Toxicol. 2007;23(1):106-12.
27. Field JA, Reed RL, Sawyer TE, Griffith SM, Wigngton PJ Jr. Diuron occurrence
and distribution in soil and surface and ground water associated with grass seed
production. J Environ Qual. 2003; 32(1):171-9
28. Finell, RH et al. Molecular basis of environmentally induced birth defects. Ann Rev
Pharmacol Toxicol. 2002; 42:181
29. Gaylor DW et al. Health risk assessment practices in the U.S. Food and Drug
Administration. Regul Toxicol Pharmacol. 1997; 26(3):307-321.
30. Germolec DR, et al. The accuracy of extended histopathology to detect
immunotoxic chemicals.Toxicol Sci. 2004; 82(2):504-14.
31. Giacomazzi S, Cochet N. Environmental impact of Diuron transformation: a review.
Chemosphere. 2004; 56(11): 1021-32.
32. Gooddy DC, Chilton PJ, Harrison I. A field study to assess the degradation and
transport of Diuron and its metabolites in a calcareous soil. Sci Total Environ. 2002
;297(1-3):67-83
Referências
15
33. Grassi, T. Avaliação da carcinogenicidade do pesticide Diuron em modelo de
carcinogênese de média duração para o fígado de ratos Wistar machos. Tese de
Mestrado. 2006
34. Greenlee WF, Osborne R, Dold KM, Hudson LG, Toscano WA Jr. Toxicity of
chlorinated aromatic compounds in animals and humans: in vitro approaches to
toxic mechanisms and risk assessment. Environ Health Perspect. 1985;60:69-76.
35. Grutman G, Schoofs L, Lontie JF, Van Larebeke N. The mutagenicity in
prokaryotes of herbicides.1984; Residue Rev. 91,1
36. Guilhermino L, Soares AM, Carvalho AP, Lopes MC. Acute effects of 3,4-
dichloroaniline on blood of male Wistar rats. Chemosphere. 1998;37(4):619-32.
37. Hayes WJ Jr. Pesticides studied in man. Williams and Wilkins, Baltimore, MD,
1982; p. 672.
38. Hodge HC, Downs WL, Panner B, Smith D, MaynardE, Clayton J Jr, Rhodes R.
Oral toxicity and metabolism of Diuron in rats and dogs. Food Cosmet. Toxicol.
1967; 5: 513.
39. Hodgson E. Introduction to toxicology. In Hodgson E, Levi PE (eds). Textbook of
modern toxicology. Stamford, CT, Appleton & Lange, 1997, p1-25
40. Hooghe RJ, Devos S, Hooghe EL Effects of selected herbicides on cytokine
production in vitro. Life Sciences. 2000; 66:2519-2525.
41. International Agency for Research on Cancer (IARC).WHO International Life
Sciences Institute. IARC Mongr Eval Carcinog Risks Hum. 1991;53:612.
42. Iyer P. Developmental and Reproductive Toxicology of Pesticides. In Krieger R,
Handbook of Pesticide Toxicology 2
nd
Edition, VI Academic Press, San Diego.
Referências
16
43. Karrow NA. Oral exposure to atrazine modulates cell-mediated immune function
and decreases host resistance to the B16F10 tumor model in female B6C3F1 mice.
Toxicology. 2005;209(1):15-28.
44. Khera .S, Whalen C, Trivett G, Ongers G. Teratogenicity studies on pesticide
formulations of dimethoate, Diuron, and lindane in rats. Bull. Environ. Contam.
Toxicol. 1979; 22: 522.
45. Kimber I, Dearman RJ. Immune response: adverse versus non-adverse effects.
Toxicol. Pathol. 2002; 30:54-58
46. Kimber I, Dearman RJ. Approaches to the identification and classification of
chemical allergens in mice.J Pharmacol Toxicol Methods. 1993;29(1):11-6
47. Koller LD. Effect of chemical sensivity on the immune system. Immunol Allergy
Pract. 2002; 13-25.
48. Kuper CF, Harleman JH, Richtr-Reichelm HB, Vos JG. Histopathologic approaches
to detect changes indicative of immunotoxicity: Review.Toxicol Pathol. 2000;
28:454-66.
49. Kuper FC. General aspects of immunotoxicology including validation issues.
Exp Toxicol Pathol. 2006;57(5-6):363-6
50. Lee JK, et al. Evaluation of the potential immunotoxicity of 3-monochloro-1,2-
propanediol in Balb/c mice. I. Effect on antibody forming cell, mitogen-stimulated
lymphocyte proliferation, splenic subset, and natural killer cell activity.
Toxicology. 2004 ;204(1):1-11.
51. Levy BS, Wegman DH. Occupational health – an overview. In Levy BS, et al:
Occupatonal health. Recognizing and preventing work-related disease and injury, 4
th
ed. Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkin, 2000. p 3-13
Referências
17
52. Li Q, Hirata Y, Piao S, Mami M. Immunotoxicity of N,N-diethylaniline in mice:
effect on natural killer activity, cytotoxic T lymphocyte activity, lymphocyte
proliferation response and cellular components of the spleen. Toxicology.
2000;150(1-3):179-89
53. Luebke RW, et al. Immunotoxicogenomics: the potential of genomics technology in
the immunotoxicity risk assessment process.Toxicol Sci. 2006;94(1):22-7
54. Luster MI, et al. Development of a testing battery to assess chemical-induced
immunotoxicity: National Toxicology Program's guidelines for immunotoxicity
evaluation in mice. Fundam Appl Toxicol. 1988;10(1):2-19
55. Luster MI, Rosenthal GJ. Chemical agents and the immune response. Environ.
Health Perspect. 1993; 100:219-236. Selective effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-
p-dioxin and corticosteroid on in vitro lymphocyte maturation.
J Immunol. 1988 ;140(3):928-35.
56. Morrison HI, Wilkins K, Semenciw R, Mao Y, Wigle D. Herbicides and cancer. J
Natl. Cancer Inst. 1992; 84: 1866-1874.
57. Mumir KM, Soman CS, Bhide SV. Hexachlorocyclohexane-induced tumorigenicity
in mice under different experimental conditions. Tumori., 1983; 31;69(5):383-6.
58. Nagasaki H, Tomii S, Mega T, Marugami M, Ito N. Development of hepatomas in
mice treated with benzene hexachloride. Gann., 1971;62(5):431
59. Nascimento MG et al. Effects of Diuron [3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea]
on the urinary bladder of male Wistar rats. Toxicology. 2006; 224: 6-73
60. NRA. Diuron review scope document. Camberra, Australia. 2002. Disponível em:
http://www.apvma.gov.au/chemrev/diuron_scope.pdf
Referências
18
61. Organization for Economic Cooperation AND Development. OECD Guidelines for
Testing of Chemicals. Guideline 408: Subchronic Oral Toxicity-Rodent: 90-day
Study, 1998.
62. Organization for Economic Cooperation AND Development. OECD Guidelines for
Testing of Chemicals. Guideline 407: Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in
Rodents,1995.
63. Poland A, Knutson JC. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and related halogenated
aromatic hydrocarbons.: examination of the mechanism of toxicity. Ann Rev
Pharmacol Toxicol. 1982; 517-554
64. Roitt IM, Brostoff J, Male DK, eds. Immunology, 2nd ed. New York:Harper & Row
Publishers, 1998.
65. Rosenthal GJ, Corsini E, Simeonova P. Selected new developments in asbestos
immunotoxicity.Environ Health Perspect. 1998;106 (1):159-69.
66. Salvestrini S, Di Cerbo P, Capasso S. Kinetics of the chemical degradation of
diuron. Chemosphere, 2002;48(1):69-73.
67. Schoket B., Vincze I. Induction of rat hepatic drug metabolizing enzymes by
substituted urea herbicides. Acta pharmacol. et toxicol. 1985; 56:283-288.
68. Schuurman HJ, Kuper CF, Vos JG. Histopathology of the immune system as a tool
to assess immunotoxicity. Review. Toxicology. 1994, 7;86(3):187-212.
69. Seiler J.P. Herbicidal phenylalkylureas as possible mutagens. I. Mutagenicity tests
with some urea herbicides. Mutat. Res. 1978; 58: 353.
70. Selgrade MK. Use of immunotoxicity data in health risk assessments: uncertainties
and research to improve the process. Toxicology. 1999; 133:59-72
Referências
19
71. Snodin DJ. Regulatory immunotoxicology: does the published evidence support
mandatory nonclinical immune function screening in drug development?
Regul Toxicol Pharmacol., 2004;40(3):336-55.
72. Soares JL. Dicionário etimológico e circunstanciado de Biologia.São Paulo:
Scipione; 1993.
73. Tixier C. Biotransformation of phenylurea herbicides by a soil bacterial strain,
Arthrobacter sp. N2: structure, ecotoxicity and fate of diuron metabolite with soil
fungi.Chemosphere, 2002;46(4):519-26.
74. Vandebriel RJ, Van Loveren H, Meredith C. Altered cytokine (receptor) mRNA
expression as a tool in immunotoxicology. Toxicol. 1998b; 130:43-67
75. Vial T, Choquet-Kastylevsky G, Descotes J. Adverse effects of
immunotherapeutics involving the immune system. Review. Toxicology. 2002;
174(1):3-11.
76. Vohr HW, Ruhl-Fehlert C. Industry experience in the indetification of the
immunotoxic potential of agrochemicals. Sci Total Environ. 2001; 270(1-3):123-33.
77. Wang SW, Chu C.Y, Wang C.J. Haemotoxic effect of phenylurea herbicides in rats:
role of haemoglobin-adduct formation in splenic toxicity. Food Chem. Toxicol.
1993; 31:285-295.
78. Weisenburger D. Perspective in pathology: human health effects of agrichemical
use. Hum Pathol. 1993, 24: 571-576.
79. Weiss B, Amler S, Amler RW. Pesicides. Pediatrics. 2004; 113(4):1030-6.
80. Wessels JS, Van DER, Veen R. The action of some derivatives of phenylurethan
and of 3-phenyl-1, 1-dimethylurea on the Hill reaction. Biochim Biophys Acta.,
1956;19(3):548-9.
Referências
20
81. Wojdani A, Attarzadeh M, Wolde-Tsadik G, Alfred LJ. Immunocytotoxicity effects
of polycyclic aromatic hydrocarbons on mouse lymphocytes.Toxicology.
1984;31(3-4):181-9.
82. Worthing C S.The pesticide manual, British Crop Protection Council. Lavenhem
Press, Suffolk. 1993; 339.
A/
Objetivo
21
3. Objetivo
Considerando a escassa Literatura sobre o potencial imunotóxico do Diuron e
que vários praguicidas podem afetar o sistema imunológico levando a sua disfunção, o
presente estudo foi dividido em dois trabalhos para avaliar o potencial imunotóxico
desse herbicida:
1. Parâmetros toxicológicos, hematológicos, histologia dos órgãos
linfohematopoiéticos e fenotipagem de linfócitos T CD4, CD8 e CD45,
seguindo critérios estabelecidos pelo “Guideline” OECD 407 e 408 e
“Guideline” OPPTS 870.7800 Immunotoxicity do EPA, foram avaliados em
ratos Wistar machos;
2. A atividade de macrófagos peritoneais de ratos Wistar machos foi avaliada
pela produção de água oxigenada, óxido nítrico, índice de fagocitose e
espraiamento.
2::
Avaliação do potencial imunotóxico do herbicida diuron: estudo de toxicidade de
28 e 90 dias (doses repetidas)
Alexandre Domingues
1
, Maria Aparecida Domingues
1
, João Lauro Viana de Camargo
1
,
Luís Fernando Barbisan
2
, Ana Lúcia Tozzi Spinardi-Barbisan
1*
1
Departamento de Patologia, TOXICAM, Faculdade de Medicina, UNESP, Botucatu,
18618-000, SP, Brazil
2
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, 18618-000,
SP, Brazil.
Auxílio Financeiro
A realização deste estudo foi possível pelo Auxílio Financeiro da CAPES (Coordenação
e Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior) e pela Bolsa de Estudo FAPESP do
Mestrando Alexandre Domingues (Proc: 05/01223-7).
1
Autor correspondente
Departamento de Patologia, TOXICAM, Faculdade de Medicina
UNESP, Botucatu, 18618-000, SP, Brazil
Fone: 55-0-XX-14-3811-6238 / Fax: 55-0-XX-14-3815-2348
e-mail: [email protected]sp.br
Resumo
22
Resumo
Escassas informações são encontradas na literatura a respeito do potencial
imunotóxico do Diuron, um herbicida derivado da uréia, utilizado no Brasil e no mundo
nas lavouras de café, cana-de-açúcar, algodão, abacaxi, citros, alfafa e trigo. Desta
forma, o presente estudo teve por objetivo investigar a toxicidade do Diuron sobre o
sistema imunológico. Para isso, foram avaliados parâmetros gerais de toxicidade,
bioquímicos, hematológicos, histopatologia de órgãos linfohematopoiéticos e
fenotipagem de linfócitos T CD4, T CD8 e B de ratos Wistar machos. Foram utilizados
dois protocolos experimentais: I - toxicidade aguda (28 dias) e II - toxicidade sub-
crônica (90 dias) sendo os animais expostos ao Diuron por via oral (adicionado à ração),
nas concentrações de 125, 1250 e 2500 ppm. A exposição ao Diuron resultou em
diminuição do ganho de peso corpóreo médio nos grupos 1250 e 2500 ppm aos 28 e 90
dias acompanhada pela redução do consumo de ração. O peso relativo do baço e dos
rins foi maior nas três concentrações de Diuron aos 28 dias, e apenas em 2500 ppm, aos
90 dias. O peso relativo do fígado foi maior em 1250 e 2500 ppm aos 28 dias e apenas
em 2500 ppm aos 90 dias. Aos 28 dias, os níveis de albumina e proteína total foram
maiores nos três grupos expostos e os níveis de creatinina e uréia aumentaram apenas no
grupo 2500 ppm. A análise histológica revelou que o Diuron, especialmente na maior
concentração levou à depleção de polpa branca no baço, associada a redução do número
de linfócitos T CD4
+
e aumento de hematopoiese extramedular, deposição de
hemosiderina e hiperplasia eritróide na polpa vermelha. Não foram observadas
alterações hematológicas importantes. Com relação à análise fenotípica das
subpopulações de linfócitos, observamos uma redução de células CD4+. Nas condições
do experimento concluímos que o Diuron exerce efeitos tóxicos sistêmicos e órgão-
especifico nas maiores concentrações.
Palavras-chave:
Diuron, Imunotoxicidade, Órgãos linfóides, Linfócitos, Ratos
Abstract
23
Abstract
Few information is available regarding immunotoxic potential of Diuron, a
phenylurea herbicide widely used in Brazil and around the world on sugar cane, cotton,
coffee, pineapple, citros, alfafa and wheat crops.The objective of the present study was
to evaluate the toxicity of Diuron in the immune system. General parameters of toxicity
were evaluated and biochemistry, hematology, histologic aspects of
lymphohematopoietic organs and CD4
+,
CD8
+
and CD45RA
+
splenic lymphocytes
subpopulations of male Wistar rats. Two experimental protocols were used: I – Acute
toxicity (28 days) and II – Sub-Chronic toxicity (90 days) and the animals were treated
with 125 ppm, 1250 ppm and 2500 ppm of Diuron by feeding. The experimental groups
treated with Diuron at 1250 ppm and 250o ppm, showed decreased body weight gain
after 28 and 90 days of treatment, corresponding with the reduced food intake. The
relative weight of the spleen and kidneys were higher at the three concentrations in the
end of 28 days, and only at 2500 ppm after 90 days. The relative weight of the liver was
higher at 1250 ppm and 2500 ppm to the 28 days, and only at 2500 ppm to the 90 days
of treatment. After 28 days, the albumin and total protein serum levels were higher at
the three treated groups and the creatine and urea higher only at 2500 ppm of Diuron.
The treatment with Diuron at higher doses causes the depletion of the lymphoid white
pulp and increases the hemosiderin deposition in the red pulp. We didn’t observed
significant hematological alterations between the treated and control groups. Regarding
fenotipic analysis of splenic lymphocytes, it was observed a decrease in CD4+
subpopulations at 1250 ppm and 2500 ppm in the end of 28 days, and only at 2500 ppm
after 90 days of treatment compared with the control groups values. Concluding, Diuron
had a systemic toxic effect and also on lymphohematopoietic organs.
Key-Word: Diuron, Immunotoxicity, lymphoid organs, lymphocytes, rats
Introdução
24
1. Introdução
Historicamente, a maior preocupação com relação aos possíveis efeitos adversos
de agentes químicos voltava-se principalmente para o estudo de seu potencial
cancerígeno. Contudo, pesquisadores passaram a reconhecer a importância de eventos
adversos não-cancerígenos, tais como imunotoxicidade e teratogênese, no perfil tóxico
de substâncias as quais a população está exposta em diferentes níveis (Boffetta, 2006).
Várias classes de substâncias podem afetar o sistema imunológico favorecendo o
aparecimento de infecções e aumento da incidência de neoplasias, principalmente
relacionadas à imunossupressão; ou respostas alérgicas e auto-imunes, decorrentes da
estimulação da uma resposta imunológica (Inadera, 2006). Esta disfunção imunológica
pode ser resultado, da ação direta ou indireta do xenobiótico (incluindo seus
metabólitos) sobre o sistema imunológico, da resposta do hospedeiro a uma determinada
substância ou a seus subprodutos, ou ainda da alteração antigênica do hospedeiro pelo
composto ou seus derivados (Kimber & Dearman, 2002). Dentre as substâncias
conhecidamente imunotóxicas estão os compostos bifenis policlorados (PCBs),
dioxinas, praguicidas, metais pesados, entre outras (Luster & Rosenthal, 1993; Voccia
et al., 1999).
Na literatura há poucas informações a respeito do potencial imunotóxico do
Diuron, um praguicida da classe feniluréia amplamente utilizado em culturas agrícolas
como cana-de-açúcar, café, citros, soja e alfafa. O Diuron é um herbicida de
classificação toxicológica II a IV (altamente a moderadamente tóxico) e ambiental nível
II (produto muito perigoso), (Segundo CD do Sistema de Informações Toxicológicas
Sobre Agrotóxicos - Agência de Vigilância Sanitária, Brasil). Sua absorção ocorre no
trato gastrointestinal e sistema respiratório. Em seres humanos, é metabolizado pelo
fígado por hidroxilação e N-dealquilação, sendo excretado pela urina (Hayes, 1982).
Na Literatura os estudos reprodutivos mostram que o Diuron apresenta atividade
fetotóxica (Khera., 1979; EPA, 1987; Fernandes, 2007). Quanto ao potencial de
carcinogenicidade e mutagenicidade os dados são controversos. O Diuron apresentou
atividade mutagênica em alguns testes (Seiler, 1978; Anon,1987, Agrawal & Mehrotra,
1997,Dupont de Nemours, 1985) e atividade cancerígena principalmente para mama e
bexiga de roedores (Iyer, 2002; Nascimento et al, 2004). Quanto ao seu potencial
imunotóxico há poucos trabalhos na Literatura. Um estudo in vitro utilizando-se células
mononucleares de sangue periférico humano de doadores normais mostrou que o
Introdução
25
Diuron administrado às culturas nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM, inibiu a
produção de IL-5, IFN-
γ
e TNF-
α
(Hooghe et al., 2000). Ratas expostas às doses de
250-1000 mg/kg de Diuron na dieta por 14 meses apresentaram aumento do peso do
baço, aumento de hemosiderina e formação de aductos de hemoglobina com aminas
aromáticas liberadas do herbicida (Wang et al., 1993).
Considerando a escassa Literatura sobre o potencial imunotóxico do Diuron e
que vários praguicidas podem afetar o sistema imunológico levando a sua disfunção, no
presente trabalho, utilizando modelos de toxicidade aguda e sub-crônica, avaliamos
como parâmetros de imunotoxicidade aspectos hematológicos, histologia dos órgãos
linfohematopoiéticos e fenotipagem de linfócitos T CD4, T CD8 e B para caracterizar o
potencial imunotóxico do herbicida. Para tal estudo foram seguidos critérios
estabelecidos pelos “Guidelines” da OECD 407 (1995), para testes agudos - 28 dias e
408 (1998), para testes de exposição sub-crônica - 90 dias e “Guideline” OPPTS
870.7800 Immunotoxicity do EPA, 1998.
Material e Métodos
26
2. Material e Métodos
2.1 Animais e ambiente de experimentação
Ratos Wistar machos com cerca de 8 semanas de idade, provenientes do CEMIB
(Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica, Campinas, SP) foram
acondicionados em caixas de propileno com maravalha branca de pinho autoclavada e
mantidos no Biotério do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de
Botucatu, SP, sob condições ambientais controladas (temperatura 22 ± 2°C, umidade
relativa 55 ± 20%, ciclo de luz claro/escuro 12/12h e 4 períodos diários de exaustão). Os
animais receberam ração comercial Nuvilab CR-1 (NUVITAL, PR) e água filtrada
fornecida ad libitum e foram submetidos a um período de aclimatação por 2 semanas
antes do início do experimento. O manuseio dos animais foi realizado de acordo com os
princípios estabelecidos e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal
sob o protocolo de no. 492 (Anexo 1).
2.2 Preparo da ração
A exposição dos animais ao Diuron foi realizada por via oral, sendo o herbicida
adicionado à ração em pó (Nuvilab-CR1), nas concentrações de 125, 1250 e 2500 ppm
e, posteriormente, após completa homogeneização (misturador Weg - Rio Claro, SP),
peletizada (Peletizadora Chavantes, modelo 7,5 c.v - Chavantes, SP) e seca por
ventilação. A ração foi armazenada em sacos devidamente identificados e, mantida,
durante todo o período experimental, em freezer à temperatura – 20
o
C, sendo
manuseada apenas no momento do fornecimento aos animais.
2.3 Protocolo experimental
O delineamento experimental seguiu os protocolos apresentados na Figura 2.
Protocolo de 28 dias (toxicidade aguda): constituído por 4 grupos experimentais, tendo
o grupo I (controle) recebido ração basal e os grupos II a IV ração acrescida de Diuron
nas concentrações de 125, 1250 e 2500 ppm, respectivamente. Protocolo de 90 dias
(toxicidade sub-crônica): constituído por 7 grupos experimentais, sendo os grupos I a IV
Material e Métodos
27
idênticos aos do experimento de 28 dias, mas expostos ao Diuron por 90 dias, o grupo
V, com fornecimento de ração basal pareado ao consumo do grupo 2500 ppm (para
controlar a variável referente ao consumo reduzido de ração no grupo de maior dose,
garantindo a interpretação adequada do possível potencial de imunotoxicidade do
herbicida) e os grupos VI e VII (avaliados ao final de 120 dias) que receberam ração
basal e Diuron 2500 ppm durante 90 dias, respectivamente, para observação da
reversibilidade, persistência ou ocorrência tardia de efeitos tóxicos 30 dias pós-
tratamento. A evolução de peso corpóreo dos animais e os consumos de ração e de água
foram avaliados semanalmente durante todo o período experimental.
2.4. Análise hematológica
As amostras de sangue foram colhidas por punção cardíaca (5-6ml por animal)
após anestesia dos animais com pentobarbital sódico a 4 % (30 mg/kg de peso
corpóreo), aos 28, 90 e 120 dias do início do experimento (conforme apresentado no
item Delineamento experimental). Destas amostras foi realizada a extração do soro para
as análises bioquímicas e sangue para confecção de esfregaços sanguíneos corados com
Leishman para contagem diferencial de células granulocíticas e mononucleares (100
células/lâmina) em microscopia de luz convencional.
2.5. Dosagens bioquímicas
As amostras de soro foram utilizadas para a determinação dos níveis séricos das
enzimas alanina aminotransferase (ALT), aspartato transferase (AST), proteína total,
creatinina e uréia com a utilização de kits comerciais e leitura fotométrica, realizada no
Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
2.6. Coleta de órgãos e processamento de tecidos
Para análise histológica, o fígado, rins, adrenais, baço, timo, linfonodos
mesentéricos e o fêmur direito e esquerdo (para análise histológica e citológica da
medula óssea, respectivamente) foram retirados e fixados em formalina 10 %
Material e Métodos
28
tamponada (tampão fosfato pH = 7,2) por 48 horas. Em seguida, os órgãos foram
mantidos em água por 24 horas para se retirar o excesso de formol e, finalmente,
conservados em álcool 70% até o momento do processamento histológico e inclusão
em parafina. O baço foi dividido em duas porções, uma para histologia e outra para
obtenção de células totais utilizadas para análise de subpopulações de células em
citômetro de fluxo. O fêmur foi descalcificado em solução citrato de sódio + ácido
fórmico durante 10 dias antes do recorte e inclusão em parafina. O processamento
histológico seguiu método convencional e os cortes obtidos foram corados com
hematoxilina e eosina (H&E) para análise histológica.
Cortes histológicos de baço foram corados para hemosiderina de acordo com o
método de Perls (Luna, 1968). Os critérios para análise histológica dos órgãos
linfohematopoiéticos estão apresentados na Tabela 1, seguindo critérios semi-
quantitativos apresentados por Kuper et al. (2000).
Material e Métodos
29
Figura 2 - Protocolo Experimental.
n=10
0
28 dias
n=30
Ração basal
Ração acrescida de de Diuron à 125, 1250 e 2500 ppm
Grupos
I
II ao IV
Protocolo 28 dias
Sacrifício
n=10
0
120
90
dias
n=30
n=10
Ração basal
n=10
n=10
Controle pareado
Ração acrescida
de Diuron à 125, 1250 e 2500 ppm
Ração acrescida de Diuron à 2500 ppm
Grupo
I
II ao IV
V
VI
VII
Protocolo 90 dias
Sacrifício
Material e Métodos
30
Tabela 1. Critérios para análise histopatológica de órgãos linfohematopoiéticos.
Órgãos Alterações nos órgãos
a
Medula óssea
Alterações da celularidade (aumentada ou diminuída,
relação mielóide/eritróide) e da maturação das séries
mielóide e eritróide
Timo
Relação córtex/medula, alterações da celularidade na
córte
x e medula, macrófagos em aspecto de céu estrelado
Baço
Alterações da celularidade na polpa branca (PALS
b
, na
zona marginal, folículos) e da polpa vermelha,
hematopoiese extramedular
Linfonodos mesentéricos
Alterações da celularidade nas áreaa paracortical, cortical
e medular, desenvolvimento de centro germinativo,
formação de roseta eritrocitária, histiocitose,
plasmocitose
a
Baseado em critérios estabelecidos por Kuper et al., 2000 e Spinardi-Barbisan et al., 2004;
b
PALS,
sigla do inglês: bainha linfocítica periarteriolar.
A análise histológica da medula óssea seguiu critérios semi-quantitativos
(“score”) sendo considerado para o grau de maturação das células o valor 0 para
ausência de maturação, 1 leve, 2 moderada e 3 intensa. A relação linfóide/eritróide foi
considerada diminuída quando se apresentava na relação 2:1 (“score” 1), normal na
relação 3:1 e 4:1 (“score” 2) ou aumentada nas relações 5:1 (“score” 3). Os critérios de
avaliação seguiram as padronizações utilizadas na rotina de análises do Departamento
de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu.
2.7. Preparo das células do baço
Material e Métodos
31
Um fragmento de cada baço foi utilizado para a obtenção de células,
desagregadas mecanicamente sobre peneira de náilon, em placas de petri contendo meio
de cultura RPMI-1640 (Cultilab, Campinas, Brasil). As células totais obtidas foram
centrifugadas, resuspendidas em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10%
de soro bovino fetal inativado (Cultilab, Campinas, Brasil) e lavadas duas vezes a 1500
rpm, por 10 minutos. A viabilidade celular foi avaliada pelo azul de tripan,
considerando-a adequada para valores superiores a 90 %. Alíquotas destas suspensões
celulares foram ajustadas em concentrações de 5 x 10
6
células/ml e criopreservadas em
meio RPM-1640 contendo dimetilsulfóxido 10% (DMSO, Carlo Erba Reagents) para
análise das subpopulações de linfócitos.
2.8. Marcação das células e análise em citômetro de fluxo
Suspensões celulares do baço obtidas conforme descrito no item anterior foram
descongeladas em banho-maria a 37
o
C e, em seguida, transferidas para tubos contendo
meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal. Após centrifugação (10
min a 1000 rpm) o pelete celular foi ressuspendido em 3 ml de solução isotônica
(Advia70, Bayer), sendo centrifugadas novamente para se evitar interferências da
fluorescência natural do meio de cultura durante a análise em citômetro de fluxo. O
pelete obtido foi ressuspendido em 1 ml de solução isotônica. A concentração celular foi
ajustada para 1x10
6
células/m e a viabilidade celular avaliada pelo azul de tripan.
Alíquotas de 100 ul das suspensões de linfócitos foram incubadas, com os anticorpos
apropriados, por 30 minutos, ao abrigo da luz. As amostras foram marcadas com
anticorpos anti-rat CD45RA OX-33 (para linfócitos B) e CD4 OX-38 (para linfócitos T)
conjugados com ficoeritrina (PE) e anticorpo anti-rat CD8 OX-8 (para linfócitos T)
conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Pharmingen, City, State) ou com
seus isotipos controles apropriados: mouse IgG1 (FITC), mouse IgG2a (PE).
A análise das células foi avaliada em citômetro de fluxo FACS Calibur
(Beckton Dickinson, USA), sendo 10 mil eventos quantificados. As células do baço
foram caracterizadas conforme critérios de granulosidade e tamanho celular (“Foward
Scatter” (FC) e “Side Scater” (SSC)), com áreas (“gates”) definidas, a fim de se excluir
plaquetas, hemáceas e células mortas. Os dados foram apresentados como porcentagem
de células positivas em seus respectivos “gates”.
Material e Métodos
32
2.9. Análise estatística
O peso corpóreo e dos órgãos, consumo de água e de ração, os dados
bioquímicos e hematológicos foram avaliados pela ANOVA ou Kruskal-Wallis. Para
todas as análises foi considerado nível de significância de p < 0,05.
Resultados
33
3. Resultados
3.1. Peso corpóreo,consumo de ração e água e peso de órgãos
Os resultados das análises de peso corpóreo aos 28 e 90 dias de exposição ao
Diuron estão apresentados na Tabela 2. A exposição ao Diuron resultou em redução
significativa (p < 0,001) do ganho de peso corpóreo médio nos grupos 1250 (- 25 a 30
%) e 2500 ppm (- 46,0 %) quando comparado aos valores dos grupos controle e 125
ppm, aos 28 e 90 dias (Tabela 2). Aos 90 dias de exposição ao herbicida, o grupo 2500
ppm apresentou redução significativa (p < 0,001) do ganho de peso corpóreo médio em
relação aos grupos 1250 ppm e ao grupo controle pareado. Ao final de 90 dias, o grupo
controle pareado apresentou redução significativa (p < 0,001) do peso corpóreo médio
final e do ganho de peso médio quando comparado ao grupo controle (Tabela 2). O
grupo 2500 ppm 30 dias pós-tratamento (90 dias) manteve a redução significativa (p <
0,02) do peso corpóreo final médio e do ganho de peso corpóreo médio (Tabela 2)
acompanhada da redução significativa (p = 0,001) do consumo de ração em relação ao
respectivo grupo controle (Tabela 3). Aos 28 e 90 dias de exposição ao herbicida foi
observada redução significativa (p = 0,002) do consumo de ração, nos grupos 1250 e
2500 ppm quando comparados ao grupo controle (Tabela 3). Na Tabela 3 são mostrados
os valores médios de ingestão do Diuron nos diferentes grupos. Não foram observadas
diferenças significativas no consumo de água entre os diferentes grupos experimentais
em ambos os estudos (dados não mostrados).
O peso relativo do baço e dos rins foi significativamente (0,01 < p <0,001)
maior nas três concentrações de Diuron (125, 1250 e 2500 ppm) aos 28 dias. Aos 90
dias foi observado aumento significativo (0,01 < p <0,001) do baço apenas nos grupos
1250 e 2500 ppm e dos rins no grupo 2500 ppm (Tabela 4). O peso relativo do fígado
foi significativamente (p < 0,001) maior nos grupos 1250 e 2500 ppm aos 28 dias, e
apenas no grupo 2500 ppm aos 90 dias (Tabela 4). Os pesos relativos do timo e das
adrenais não foram alterados em decorrência do tratamento agudo ou sub-crônico com
diuron. Após trinta dias do término da exposição ao Diuron, os animais expostos à
concentração de 2500 ppm apresentaram valores semelhantes de pesos relativos do
fígado, rins e baço quando comparados aos animais do grupo controle (Tabela 4).
Resultados
34
Tabela 2. Peso corpóreo inicial, final e ganho
1
de animais controles e tratados com Diuron
por 28 e 90 dias.
Tratamento
n
o
efetivo
de
animais
Peso Corpóreo (g)
Inicial Final Ganho
Ganho
Relativo
2
28 dias
Controle 10
236,80 ± 20,32
a
358,50 ± 29,94
a
121,70 ± 17,38
a
---
125 ppm 10
235,90 ± 18,78
a
363,80 ± 33,73
a
127,90 ± 21,56
a
+ 5,1
1250 ppm 10
239 90 ± 19,67
a
325,60 ± 32,81
b
85,70 ± 18,26
b
- 29,6
2500 ppm 10
233,30 ± 18,40
a
299,00 ± 27,48
b
65,70 ± 20,40
b
- 46,0
90 dias
Controle 10
215,20 ± 21,58
a
440,10 ± 36,11
a
224,90 ± 39,50
a
---
125 ppm 10
219,10
±
23,98
a
469,80
±
48,20
a
250,70
±
44,16
a
+ 11,5
1250 ppm 10
217,40 ± 21,06
a
386,60 ± 41,11
b
169,20 ± 37,30
b
- 24,7
2500 ppm 10
216,90
±
16,12
a
338,30
±
19,32
c
121,40
±
14,85
c
- 46,0
Controle
Pareado
9
220,60 ± 21,34
a
386,22 ± 27,75
b
164,22 ± 19,13
b
- 27,0
Controle 120
3
10
210,60 ± 18,77
a
461,70 ± 33,08
a*
251,10 ± 39,27
a*
---
2500 ppm 120
4
10
216,20 ± 19,97
a
422,10 ± 37,24
b*
205,90 ± 29,35
b*
-18,0
1
valores expressos em média
±
desvio-padrão;
2
porcentagem
relativa ao grupo controle (Ganho de peso
corpóreo do grupo tratado x 100 / ganho de peso corpóreo do grupo controle);
3
grupo satélite que recebeu
ração basal por 120 dias;
4
grupo satélite tratado por 90 dias com Diuron e avaliado em 120 dias para análise
da reversibilidade, persistência ou ocorrência tardia de efeitos tóxicos 30 dias pós-tratamento;
letras
indicam as diferenças significativas entre os grupos.
*
diferença significativa quando comparado ao grupo
controle 120.
Resultados
35
Tabela 3. Consumo médio estimado de ração basal e de Diuron pelos animais controles e
tratados com o herbicida por 28 e 90 dias
1
.
Tratamento
2
n
o
efetivo
de
animais
Consumo de
ração
(g/rato/dia)
Consumo de
Diuron
(mg/rato/dia)
Consumo de
Diuron
(mg/Kg/dia)
28 dias
Controle
10 25,23± 1,24
a
- -
Diuron 125 ppm
10 27,35 ± 1,45
a
3,42 ± 0,11 9,4 ± 0,36
Diuron 1250 ppm
10 21,05 ± 1,27
b
26,30 ± 2,61 79,58 ± 0,27
Diuron 2500 ppm
10 20,50 ± 3,58
b
51,25 ± 2,12 172,38 ± 0,73
90 dias
Controle
10 26,47 ± 1,38
a
- -
Diuron 125 pm
10 27,05 ± 2,05
a
3,38 ± 0,19 7,19 ± 0,92
Diuron 1250 ppm
10 23,69 ± 1,52
b
29,61 ± 3,54 76,59 ± 5,67
Diuron 2500 ppm
10 20,88 ± 2,61
b
52,2 ± 2,33 154,30 ± 0,20
Controle Pareado
9 22,07 ± 1,55
b
- -
Controle 120
2
10 26,84 ± 1,48
a*
- -
Diuron 2500 ppm 120
3
10 22,92 ± 3,40
b*
52,95 ± 1,75 151,50 ± 9,31
1
Valores apresentados na forma de média ± SD;
2
grupo satélite que recebeu ração basal por 120 dias;
3
grupo
satélite tratado por 90 dias com Diuron e avaliado em 120 dias para análise da
reversibilidade, persistência
ou ocorrência tardia de efeitos tóxicos 30 dias pós-tratamento;
letras indicam as diferenças
significativas entre os grupos.
*
diferença significativa quando comparado ao grupo controle 120.
Resultados
36
Tabela 4. Peso relativo
1
do fígado, rins, adrenais, baço e timo de animais controles e
tratados com Diuron por 28 e 90 dias.
Tratamento
n
o
efetivo
de
animais
Fígado
Rins
4
Adrenais
4
Baço
Timo
28 dias
Controle 10
3,85
±
0,35
a
0,31
±
0,02
a
0,008
±
0,002
a
0,39
±
0,03
a
0,15
±
0,02
a
125 ppm 10
4,22 ± 0,38
a
0,33 ± 0,03
b
0,009 ± 0,002
a
0,44 ± 0,06
b
0,17 ± 0,03
a
1250 ppm 10
4,66
±
0,34
b
0,35
±
0,03
c
0,009
±
0,002
a
0,51
±
0,05
c
0,15
±
0,02
a
2500 ppm 10
4,53 ± 0,43
b
0 34 ± 0,04
c
0,009 ± 0,002
a
0,75 ± 0,07
d
0,15 ± 0,03
a
90 dias
Controle 10
3,30 ± 0,20
a3
0,30 ± 0,02
a
0,006 ± 0,002
a
0,31 ± 0,05
a
0,11 ± 0,02
a
125 ppm 10
3,58
±
0,18
a
0,31
±
0,03
a
0,007
±
0,002
a
0,31
±
0,06
a
0,10
±
0,02
a
1250 ppm 10
3,43 ± 0,57
a
0,32 ± 0,02
a
0,006 ± 0,002
a
0,44 ± 0,08
b
0,10 ± 0,02
a
2500 ppm 10
3,99 ± 0,21
b
0,36 ± 0,02
b
0,007 ± 0,002
a
0,61 ± 0,06
c
0,11 ± 0,02
a
Controle
Pareado
9
2,91
±
0,39
a
0,30
±
0,02
a
0,005
±
0,001
a
0,35
±
0,06
a
0,09
±
0,02
a
Controle 120
2
10
3,34 ± 0,46
a
0 30 ± 0,02
a
0,005 ± 0,002
a
0,34 ± 0,05
a
0,10 ± 0,02
a
2500 ppm 120
3
10
3,61 ± 0,40
a
0,32 ± 0,03
a
0,005 ± 0,001
a
0,39 ± 0,06
a
0 10 ± 0,03
a
1
peso relativo: calculado a partir do peso absoluto do órgão em relação ao peso do animal x 100, valores
expresso em média
±
SD;
2
grupo satélite que recebeu ração basal por 120 dias;
3
grupo satélite tratado por
90 dias com Diuron e avaliado em 120 dias para análise da
reversibilidade, persistência ou ocorrência
tardia de efeitos tóxicos 30 dias pós-tratamento
;
4
valores médios dos rins e das adrenais direita e
esquerda; Letras diferentes representam diferença estatística (0,01 < P <0,001).
3.2. Parâmetros hematológicos e bioquímicos
Não foram observadas alterações significativas dos parâmetros
hematológicos avaliados através da porcentagem de células mononucleares e
polimorfonucleares do sangue periférico nos grupos expostos às diferentes
Resultados
37
concentrações de Diuron nos delineamentos de exposição aguda (28 dias) e sub-
crônica (90 dias) (Tabela 5). No tratamento agudo, foi observado aumento
significativo (0,01 < p <0,001) dos níveis de proteína total nos grupos expostos as
três diferentes concentrações de Diuron e dos níveis ALT e albumina nos grupos
expostos as concentrações de 1250 e 2500 ppm. Os valores de creatinina e uréia,
aos 28 dias de exposição foram maiores apenas em 2500 ppm. Animais expostos
por 90 dias ao praguicida não revelaram alterações significativas nos níveis séricos
dos marcadores pesquisados (Tabela 6).
Tabela 5. Análise quantitativa dos esfregaços sanguíneos de animais controles e tratados
com Diuron por 28 e 90 dias.
1
Tratamento
n
o
efetivo
de
animais
Granulócitos (%)
2
Neutrófilos Eosinófilos
Agranulócitos (%)
Linfócitos Monócitos
28 dias
Controle 10
13,10 ± 4,91ª
1,00 ± 1,18ª
85,50 ± 4,84ª 0,50 ± 0,50ª
125 ppm 10
10,50
±
4,94ª
1,20
±
1,08ª
86,90
±
4,74ª 0,80
±
0,87ª
1250 ppm 10
7,80 ± 4,45ª
1,30 ± 1,10ª
89,50 ± 4,67ª 0,80 ± 0,98ª
2500 ppm 10
9,30 ± 2,76ª
1,40 ± 0,66ª
87,90 ± 3,11ª 1,40 ± 1,20ª
90 dias
Controle 10
12,80 ± 6,53ª 1,10 ± 1,10ª
84,40 ± 6,42ª
1,40 ± 1,51ª
125 ppm 10
12,20
±
3,58ª
1,00
±
1,05ª
85,60
±
4,38ª
1,20
±
1,23ª
1250 ppm 10
11,40 ± 4,17ª
0,60 ± 0,70ª
86,00 ± 4,99ª
2,00 ± 1,70ª
2500 ppm 10
12,00 ± 4,57ª
0,90 ± 0,99ª
86,30 ± 4,79ª
0,80 ± 1,03ª
Controle pareado
9
13,00
±
4,14ª
0,90
±
0,99ª
85,30
±
3,86ª
0,80
±
0,63ª
Controle 120
3
10
13,00 ± 4,47ª 0,60 ± 0,70ª 85,80 ± 4,54ª
0,60 ± 0,70ª
2500 ppm 120
4
10
13,22 ± 3,07ª 0,78 ± 0,83ª
85,00 ± 4,18ª
1,00 ± 1,12ª
1
valores expressos em média
±
SD;
2
não foram incluídas as contagens de basófilos (freqüência baixa);
3
grupo satélite que recebeu ração basal por 120 dias;
4
grupo satélite tratado por 90 dias com Diuron e
avaliado em 120 dias para análise da
reversibilidade, persistência ou ocorrência tardia de efeitos
tóxicos 30 dias pós-tratamento
.Valores normais de referência:
Hemopoietic System – Jones, 1990
Resultados
38
Tabela 6. Parâmetros bioquímicos
1
de animais controles e tratados com Diuron por 28 e 90 dias.
Tratamento
n
o
efetivo
de
anima
is
ALT
AST
Albumina
Proteína
Total
Creatinina
Uréia
28 dias
Controle
10
38,70 ± 2,45
a
98,67± 16,86
a
2,75 ± 0,21
a
5,50 ± 0,38
a
0,39 ± 0,03
a
51,79 ± 3,45
a
125 ppm 10
40,22 ± 2,99
a
97,44± 19,67
a
3,08 ± 0,23
a,b
5,95 ± 0,40
b
0,38 ± 0,06
a,b
55,17 ± 4,92
a
1250 ppm 10
44,50 ± 4,72
b
92,29± 24,78
a
3,16 ± 0,09
b,c
5,94 ± 0,16
b
0,44 ± 0,05
a,b
53,91 ± 4,17
a
2500 ppm 10
43,10
±
4,68
b
93,00
±
16,98
a
3,32
±
0,15
c
6,03
±
0,28
b
0,46
±
0,07
b
55,19
±
4,83
b
90 dias
Controle 10
55,30± 5,72
a
133,50± 38,49
a
2,87 ± 0,13
a
5,82 ± 0,13
a
0,49 ± 0,06
a
59,02 ± 6,15
a
125 ppm 10
57,00± 8,08
a
165,50± 58,16
a
3,09 ± 0,15
a
5,98 ± 0,16
a
0,59 ± 0,11
a
58,13 ± 10,11
a
1250 ppm 10
52,50± 7,00
a
138,10± 56,48
a
2,80 ± 0,18
a
5,39 ± 0,23
a
0,58 ± 0,08
a
48,22 ± 10,02
a
2500 ppm 10
50,76
±
7,82
a
129,70
±
22,72
a
2,86
±
0,19
a
5,54
±
0,29
a
0,51
±
0,07
a
49,96
±
5,97
a
Controle pareado
9
54,78± 10,40
a
143,50 ± 58,51
a
2,78 ± 0,25
a
5,44 ± 0,34
a
0,50 ± 0,12
a
47,37 ± 6,69
a
Controle 120
2
10
57,44± 10,93
a
137,80 ± 45,86
a
2,77 ± 0,23
a
5,68 ± 0,37
a
0,52 ± 0,06
a
52,98 ± 3,96
a
2500 ppm 120
3
10
61,00 ± 7,38
a
138,38 ± 37,09
a
2,78 ± 0,17
a
5,62 ± 0,48
a
0,51 ± 0,09
a
53,06 ± 3,89
a
1
Valores apresentados na forma de média ± SD;
2
grupo satélite que recebeu ração basal por 120 dias;
3
grupo satélite
tratado por 90 dias com Diuron e avaliado em 120 dias para
análise da reversibilidade, persistência ou ocorrência
tardia de efeitos tóxicos 30 dias pós-tratamento
;
3
Letras diferentes representam diferença estatística (0,01 < P
<0,001).
3.3. Análise histológica
Alterações histológicas relevantes foram observadas no baço dos animais
expostos ao Diuron (Tabela 7). Os baços dos grupos tratados apresentaram
esplenomegalia e as supensões celulares obtidas pigmentação alterada, pela maior
concentração de hemossiderina (Figura 3). As alterações foram mais expressivas nos
animais tratados com a concentração de 2500 ppm de Diuron, tanto aos 28 como aos 90
Resultados
39
dias. Na polpa branca foi observada redução do número de compartimentos, bem como
de sua celularidade (principalmente na bainha linfocítica periarteriolar) (). Na polpa
vermelha foi observado hiperplasia eritróide, aumento de hematopoiese extramedular e
deposição de hemosiderina. Tais alterações se mantiveram 30 dias após o término da
exposição dos animais ao Diuron (animais sacrificados ao final de 120 dias). A análise
semi-quantitativa da deposição de hemosiderina (coloração de Perls) no baço dos
animais expostos mostrou aumento dose-dependente (Figura 2). Não foram encontradas
alterações histológicas relevantes nos rins, adrenais, timo, medula óssea e linfonodos
mesentéricos. No fígado, principalmente nas concentrações de 1250 e 2500 ppm, 30 a
50 % e 60 a 70 % dos animais desenvolveram hipertrofia centrolobular discreta, aos 28
e 90 dias, respectivamente. Na histologia da medula óssea, a celularidade global,
compartimentalização e proporção de tecido adiposo nos diferentes grupos expostos ao
Diuron não revelaram diferenças significativas. As variações entre os grupos
mantiveram-se dentro da normalidade observada em medulas ósseas sadias. A análise
das populações eritróide e mielóide demonstrou retardo de maturação leve nos grupos
expostos a 1250 ppm e 2500 ppm, para série vermelha, e 2500ppm para série branca,
aos 28 dias. Aos 90 dias, foi observado retardo de maturação leve nos grupos expostos a
125 ppm, 1250 ppm e 2500 ppm, para série vermelha, e apenas no grupo 2500 ppm para
linhagem mielóide. A relação mielóide:eritróide, aos 28 dias, apresentou-se reduzida no
grupo exposto a 2500 ppm e, aos 90 dias, no grupo exposto a 2500 ppm (Tabela 8). O
retardo de maturação da linhagem mielóide e a relação mielóide:eritróide reduzida foi
mantida 30 dias pós-tratamento (grupo 2500 ppm 120 dias). Não foram encontradas
alterações histológicas relevantes nos rins, adrenais, timo e linfonodos mesentéricos.
Resultados
40
Figura 3. A: Baço de animal tratado com 2500 ppm de Diuron e controle, evidenciando
esplenomegalia nas maiores concentrações. B: Aumento de pigmentação observado a
partir de suspensões celulares obtidas de animais do grupo controle e tratado com
2500 ppm de Diuron.
Figura 2. Cortes histológicos de baço corados por H&E (A e B – 10x) ou pelo Mé
todo
de Perls (C e D – 20x). (A) e (C): baç
o de animal do grupo controle, (B) e
(D): baço de animal do grupo de 2500 ppm. (A) e (B): PB -
Polpa Branca, PV
-
Polpa Vermelha
, ZM
-
Zona Marginal, P
-
PALS, F
-
Fol
í
culo
PB
PB
PV
PV
PB
PB
PV
PV
ZM
P
F
A
B
Resultados
41
Tabela 7. Alterações histológicas no baço de ratos Wistar machos expostos ao Diuron por 28 e
90 dias.
Baço Grupos no.
efetivo
de
animais
Diminuição da
celularidade
da PALS
1
Diminuição da
celularidade
da ZM
2
Aumento da
celularidade
da PV
3
Hematopoiese
extramedular
aumentada
28 dias
Controle 10 0 0 0 0
125 ppm 9 0 0 2 (22 %) 1 (11 %)
1250 ppm 10 5 (50 %) 1(10 %) 9 (90 %) 8 (80 %)
2500 ppm 9 9 (100 %) 6 (67 %) 9 (100 %) 9 (100 %)
90 dias
Controle 9 0 0 0 0
125 ppm 8 0 0 0 4 (50 %)
1250 ppm 9 0 0 0 4 (44 %)
2500 ppm 8 5 (62 %) 0 1 (12 %) 7 (87 %)
Controle Pareado
4
8 0 0 0 2 (25 %)
Controle 120
5
8 0 0 0 0
2500 ppm 120 8 8 (100 %) 2 (25 %) 0 8 (100 %)
1
PALS, sigla do ingles:bainha linfocítica periarteriolar;
2
Zona marginal;
3
Polpa vermelha;
4
fornecimento de ração basal pareado ao consumo do grupo 2500 ppm (para controlar a variável
referente ao consumo reduzido de ração no grupo de maior dose);
5
grupo satélite tratado por 90
dias com Diuron e avaliado 30 dias pós-tratamento para análise da reversibilidade, persistência ou
ocorrência tardia de efeitos tóxicos.
Resultados
42
Tabela 8. Histologia de medula óssea de animais controles e tratados com Diuron por
28 e 90 dias.
Alterações histológicas
Tratamento
n
o
efetivo
de
animais
Retardo de Maturação
Vermelha Branca
Relação L/E
Celularidade
28 dias
Controle
10
- - 2 80%
Diuron 125 ppm
10
- - 2 84%
Diuron 1250 ppm
10
+ - 2 88%
Diuron 2500 ppm
10
+ + 1 90%
90 dias
Controle 10 - -
3
76%
Diuron 125 ppm
10
+ - 3 78%
Diuron 1250 ppm
10
+ - 2 86%
Diuron 2500 ppm
10
+ + 1 82%
Controle pareado
9
- - 3 74%
Controle 120 dias
10
- - 3 70%
Diuron 2500 ppm
120 dias
10
+ + 1 78%
2
grupo satélite que recebeu ração basal por 120 dias;
3
grupo satélite tratado por 90 dias com
Diuron e avaliado em 120 dias para análise da reversibilidade, persistência ou ocorrência tardia
de efeitos tóxicos 30 dias pós-tratamento; Retardo maturativo: Score – Normal ( - ), Retardo leve
( + ) , Retardo moderado ( ++ ). Relação L/E reduzida (Score 1), normal (Scores 2 e 3) e
aumentada (Score 4). Celularidade global: avaliação da celularidade e compartimentos da
medula óssea.
Resultados
43
3.4. Fenotipagem de células do baço
Os resultados da fenotipagem de células do baço de ratos expostos ao Diuron
estão apresentados na Tabela 9. O principal efeito decorrente da exposição ao Diuron
ocorreu na população de linfócitos T CD4
+
, onde uma diminuição significativa (p <
0,03) foi observada no grupo exposto a 2500 ppm, tanto aos 28 como aos 90 dias. Não
foram observadas diferenças significativas nas porcentagens de células T CD8
+
e de
linfócitos B nos diferentes grupos tanto aos 28 como aos 90 dias de exposição ao
Diuron.
Tabela 9. Porcentagem de linfócitos T CD4
+
, T CD8
+
e B CD45RA
+
no baço de animais
controles
1
e tratados com Diuron por 28 e 90 dias.
Linfócitos Tratamento
n
o
efetivo
de animais
CD4 CD8 CD45RA
28 dias
Controle 10
18,50
±
4,84ª
11,53
±
3,04ª
18,40
±
10,03ª
125 ppm 10
13,30 ± 4,74
b
15,34
± 9,97ª
21,02
± 12,43ª
1250 ppm 10
15,97
±
6,11
ab
13,82
±
4,97ª
27,33
±
12,22ª
2500 ppm
10 13,28
± 6,17
b
10,18
± 4,96ª
20,38
± 14,33ª
90 dias
Controle
10 19,34
±
8,84ª
12,29
±
5,76ª
21,12
±
5,91ª
125 ppm
10 18,28
± 8,44ª
11,00
± 4,84ª
21,66
± 10,44ª
1250 ppm
10 15,06
± 6,26ª
12,47
± 5,84ª
23,30
± 14,86ª
2500 ppm
10 11,27
±
4,88
b
9,86
±
4,98ª
23,85
±
13,95ª
Controle Pareado
9 20,02
± 7,58ª
16,71
± 6,89ª
21,60
± 10,15ª
Controle 120
2
10 16,17
± 5,91ª
11,27
± 3,07ª
21,49
± 10,00a
2500 ppm 120
3
10 15,77
±
5,58ª
11,69
±
3,85ª
28,35
±
14,57ª
Valores expressos em porcentagem de linfócitos CD4, CD8 e CD45RA
±
SD.
1
grupo controle
que recebeu ração basal durante 28 e 90 dias
2
grupo satélite que recebeu ração basal por 120
dias;
3
grupo satélite tratado por 90 dias com Diuron e avaliado em 120 dias para análise da
reversibilidade, persistência ou ocorrência tardia de efeitos tóxicos 30 dias pós-tratamento
Discussão
44
4. Discussão
A análise do potencial imunotóxico deve ser estruturada em modelos de
toxicidade aguda, sub-crônica ou crônica seguindo os procedimentos usados pelas
agências de regulamentação de substâncias (De Jong & Van Loveren, 2007). O
potencial imunotóxico pode ser obtido a partir de teste hematológico padrão, e pela
avaliação estrutural e funcional de órgãos e tecidos linfohematopoiéticos tais como
baço, timo, medula óssea, linfonodos e tecidos linfóides associados à mucosa (Haley et
al., 2005). A análise histopatológica destes órgãos é um requerimento necessário nos
“guidelines” para testes sub-crônicos no mundo (OECD, 1998).
O intrincado balanço característico do sistema imunológico, o torna susceptível
a ação de substâncias incluindo praguicidas, que podem causar alterações estruturais e
funcionais para o sistema (Voccia et al., 1999). Embora, vários praguicidas sejam
conhecidos por exercer atividade imunossupressora, poucos estudos avaliam o potencial
imunotóxico do Diuron, um herbicida amplamente utilizado em culturas agrícolas no
Brasil e no mundo.
Neste contexto, no presente estudo, avaliamos a histopatologia de órgãos
linfohematopoiéticos e a fenotipagem de linfócitos para caracterizar o potencial
imunotóxico do Diuron em modelo experimental de toxicidade aguda e sub-crônica.
Os resultados mostram que o Diuron, após exposição aguda ou sub-crônica,
exerce efeito deletério dose-dependente, principalmente sobre o baço, causando
aumento do seu peso, redução dos compartimentos de polpa branca e de sua
celularidade, aumento na celularidade da polpa vermelha, aumento da hematopoiese
extramedular e da deposição de hemosiderina, em ratos Wistar machos. Resultados
semelhantes aos nossos foram relatados em estudos seguindo a exposição a praguicidas
como 2,4-diclorofenoxiacético e clorprofam (Kaioumova et al., 2001; Fujitani et al.,
2001). A exposição aguda e sub-crônica ao Diuron também resultou em redução
significativa do ganho de peso corpóreo médio nas maiores concentrações, e, aumento
do peso relativo do fígado e hipertrofia centrolobular hepática, na maior concentração.
A redução do peso corpóreo pode estar diretamente relacionada às reduções do
consumo de ração, conforme observado em nosso estudo nos grupos expostos às
concentrações de 1250 e 2500 ppm. No entanto, no estudo sub-crônico, o
Discussão
45
monitoramento da ingestão da ração basal equiparada ao consumo do grupo exposto a
2500 ppm de Diuron, mostra que nesta concentração, embora ambos os grupos (2500
ppm e ração basal pareada) tenham consumido a mesma quantidade de ração, o ganho
de peso corpóreo foi menor nos animais tratados com 2500 ppm. Estes resultados
demonstram, portanto, que o Diuron exerce efeito sistêmico deletério dose-resposta,
com maior efeito adverso na concentração de 2500 ppm. É importante destacar que esta
alteração foi mantida 30 dias pós-tratamento, quando observamos que o grupo 2500
ppm comparado ao seu respectivo controle manteve a redução do peso corpóreo,
acompanhada pela redução significativa do consumo de ração.
No presente estudo, baseando-se no consumo médio de ração, as doses nédias de
ingestão de diuron foram cerca de 0,24%, 2,29%, 4,80% da DL
50
para as concentrações
de 125, 1250 e 2500 ppm, respectivamente (média dos estudos de 28 e 90 dias). Estes
resultados mostram que os níveis de exposição ao Diuron ficaram bem abaixo da dose
letal a 50% (DL
50
) oral estabelecida como sendo cerca de 3400 mg/kg (dose aguda, 14
dias) em ratos Wistar machos (Hodge et al., 1967). Embora os níveis de exposição ao
Diuron tenham sido bem baixos, os grupos expostos as maiores concentrações (1250 e
2500 ppm) apresentaram redução do ganho de peso corpóreo acompanhada de redução
do consumo de ração e esplenomegalia. Estes resultados estão de acordo com estudos
anteriores que apresentam tais alterações, associadas à diminuição dos valores de
hematócrito e contagem de eritrócitos, em ratos expostos a altas concentrações de
Diuron na ração (igual ou superior a 2500 ppm) (Hodge et al., 1967; Wang et al., 1993).
Se tomarmos como referência a dose máxima tolerada (DMT), utilizada em estudos
sub-crônicos de 90 dias, calculada a partir da dose na qual ocorre diminuição de ganho
de peso corpóreo em torno de 10% (Reno, 1997), a diminuição de ganho de peso
corpóreo nos grupos expostos as maiores concentrações de Diuron foi acima de 27%
para 1250 ppm e acima de 46% para 2500 ppm. Além disso, vale ressaltar que 30 dias
pós-tratamento, o peso corpóreo se manteve abaixo do grupo controle, mas, em especial,
o peso relativo do baço, retornou a valores semelhantes aos de seu respectivo grupo
controle.
Embora o peso relativo do baço tenha se restabelecido pós-tratamento, as
alterações histológicas ainda foram observadas 30 dias após o término da exposição ao
Diuron. Estes achados mostram que as alterações ocorridas não foram restauradas por
completo neste período. Dados da Literatura mostram que a reversão das lesões em
órgãos linfóides após o término da exposição a compostos como glicocorticóides e
Discussão
46
organotinas pode ser possível, sendo que a regeneração tecidual poderia ocorrer dentro
de um período relativamente curto de 3 a 4 semanas (Schuurman and Kuper, 1995).
Em nosso estudo, os parâmetros hematológicos não mostraram alterações
significativas após a exposição ao Diuron, tanto aguda como sub-crônica. Os valores
observados estão de acordo com os padrões de normalidade para ratos machos conforme
apresentado por Jones(1990). Por outro lado, foi observado aumento do número de
eritrócitos (hiperplasia eritróide) na medula óssea e aumento dose-dependente no baço,
principalmente no grupo exposto a maior concentração de Diuron. Associado a estes
achados foi observado aumento dose-dependente do peso relativo do baço, deposição de
hemosiderina e hematopoiese extramedular caracterizada pelo aumento de agregados
eritropoiéticos difusos na polpa vermelha do baço. No rato, o baço funciona como um
órgão hematopoiético adicional durante períodos de estresse o que pode levar ao
aumento da hematopoiese extramedular, caracterizada pela presença no baço de células
normalmente encontradas na medula óssea (Lomax et al., 1990). Além disso, a
prevalência desses precursores eritróides no baço pode ocorrer secundariamente a um
processo hemorrágico ou destruição de hemáceas (anemia hemolítica ou auto-imune).
Da mesma forma, a deposição aumentada de hemosiderina no baço pode ser uma
conseqüência da fagocitose de eritrócitos que foram danificados, provavelmente, pela
exposição ao Diuron, sugerindo que este herbicida apresente atividade hemolítica. A
anemia hemolítica e metahemoglobinemia podem ocorrer em decorrência de efeitos
tóxicos ocasionados pela exposição a diversas substâncias, entre elas, as drogas
arilaminas (Wang et al., 1993). A formação de metahemoglobina é o efeito tóxico
dominante observado em animais de laboratório e seres humanos expostos a compostos
amino e nitro aromáticos (Wang et al., 1993). Os herbicidas feniluréia, como o Diuron,
são derivados da arilamina. Por exemplo, a formação de metahemoglobina é mostrada
em animais de laboratório expostos à classe dos herbicidas feniluréia em decorrência
das aminas hidrolisadas destes compostos (McMillan et al., 1990). Portanto, parâmetros
mais apurados, como dosagem de metahemoglobina e contagem de células vermelhas
no sangue devem ser realizados para afirmar a possível relação entre a exposição ao
Diuron e a anemia hemolítica.
O baço é considerado um importante órgão-alvo para avaliação de
imunotoxicidade em decorrência de suas funções. Por se tratar de um órgão linfóide
secundário, que contém cerca de um quarto dos linfócitos do organismo e iniciar a
resposta imunológica aos antígenos, o baço é considerado um bom indicador de resposta
Discussão
47
do hospedeiro frente à agressão por substâncias. A polpa branca é subdividida em
PALS, folículos e zona marginal e é composta por linfócitos, macrófagos, células
dendríticas, plasmócitos, arteríolas e capilares. Em especial, na PALS, composta
predominantemente por pequenos linfócitos é que se concentram as células T CD4
+
. Em
nosso estudo foi observada redução do número de linfócitos T CD4
+
no baço dos
animais expostos às diferentes concentrações de Diuron. Estes resultados se relacionam
com a redução do número de compartimentos de polpa branca, bem como de sua
celularidade (principalmente na PALS) observada na análise histológica tanto no estudo
agudo como sub-crônico. Estas alterações foram mais expressivas na maior
concentração (2500 ppm). As lesões degenerativas não-proliferativas espontâneas como
a redução da polpa branca, polpa vermelha ou de ambas, é mais comum em ratos ou
camundongos velhos (Suttie, 2006). Entretanto, tais alterações podem ocorrer como
efeito direto relacionado ao tratamento ou efeito secundário ao reduzido ganho de peso
corpóreo ou perda de peso (Suttie, 2006).
As alterações histológicas não foram restritas aos órgãos linfóides. Elas foram
também observadas no fígado dos animais expostos ao Diuron, principalmente nas
maiores concentrações (1250 e 2500 ppm). O fígado é o principal órgão-alvo de
toxicidade química. Isto ocorre devido ao fato de muitas substâncias serem
metabolizadas no fígado antes de serem eliminadas do organismo, freqüentemente
através da bile. As células centrolobulares são geralmente as mais susceptíveis a
toxicidade pelo fato de apresentarem maior quantidade de enzimas de Fase I e menor
quantidade das enzimas de Fase II quando comparadas às células periportais
(Jacobson, 2001) Alterações morfológicas prévias podem ser identificadas através de
resultados da química clínica. Normalmente a injúria hepatocelular é associada com
aumento nos níveis das enzimas ALT, AST e sorbitol dehidrogenase (SDH)
(Jacobson, 2001). Em estudos agudos, sub- crônicos ou crônicos de toxicidade oral do
diuron em ratos, as alterações hepáticas descritas foram restritas apenas ao aumento de
pigmentação em células de Kupffer, necrose e esteatose hepatocítica (Hodge et al.,
1967; Boyd & Krupa, 1970; Agrawal & Kumar,1999). Em nosso estudo, a exposição
aguda e sub-crônica ao diuron induziu hipertrofia centrolobular hepática principalmente
nas concentrações de 1250 e 2500 ppm associado ao aumento do peso relativo do
fígado. Resultados similares foram relatados em estudos anteriores (Grassi et al., 2006,
Fernandes et al., 2006). Estes achados estão relacionados à característica do Diuron de
apresentar atividade indutora de enzimas do sistema P450 hepático (Schoket et al.,
Discussão
48
1987; Schoket e Vincze, 1985,1990). Vários estudos mostraram que este herbicida
induz aumento no conteúdo do citocromo P450 e da NADPH-citocromo redutase e a
atividade das enzimas benzo(a)pireno monooxigenase, 7-etoxicoumarina O-deetilase,
aminopirina N-demetilase, epóxido hidrolase, UDP-glicoroniltransferase e glutationa S-
transferase (Schoket et al., 1987; Schoket e Vincze, 1985,1990).
Em resumo, os resultados do presente estudo mostram que a exposição de ratos
Wistar machos ao Diuron exerce efeito tóxico sistêmico dose-resposta e órgão
específico, atuando preferencialmente no baço. Além disso, é possível que exerça
atividade hemolítica, conforme demonstrado pelo aumento de hemosiderina,
hematopoiese extramedular e a presença de hiperplasia eritródie, na polpa vermelha.
Tais alterações não foram reversíveis no período de recuperação avaliado, sugerindo a
significância das lesões observadas no baço frente a exposição ao Diuron. Para
determinar o quanto as alterações estruturais observadas interferem sobre o desempenho
do sistema imunológico parâmetros funcionais devem ser avaliados.
Referências
49
Referências
1. Agrawal RC, Mehrotra NK. Micronucleus induction by Diuron in mouse bone
marrow. Indian J. Exp. Biol. 1997; 35:1256
2. Anon D. Proper. Ind. Mater. Report. 1987; 7 : 49.
3. Bayer Institute of Toxicology. Diuron: Study for chronic toxicity and carcinogenicity
with Wistar rats (administration in the diet for up to two years). Wuppertal: Bayer
Institute of Toxicology. 1985 (DPR # 106-035).
4. Boffetta P. Human cancer from environmental pollutants: the epidemiological
evidence. Mutat Res. 2006;608(2):157-62
5. Boyd EM, Krupta V. Protein deficiency diet and Diuron toxicity. J Agric Food Chem.
1970; 18:1104-1107.
6. De Jong WH, Van Loveren H. Screening of xenobiotics for direct immunotoxicity in
an animal study.Methods. 2007;41(1):3-8.
7. Dupont de Nemours & CO. Mutagenicity studies with Diuron. Salmonella test, No.
HLR 471-84 (7185); CHO/HGPRT forward gene mutation assay, H.R. No. 282-85
(06/28/85); unscheduled DNA synthesis test in primary rat hepatocytes
8. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). Health effects test
guidelines: OPPTS 870.7800 Immunotoxicity. 1996.
9. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). Increased incidence of
malignant and combined malignant and benign tumors in male and female rats and
increased incidence of malignant tumors in female mice. 1987
10. Fernandes GS, et al. Reproductive effects in male rats exposed to diuron. Reprod
Toxicol. 2007;23(1):106-12.
Referências
50
11. Fujitani T, Tada Y, Noguchi AT, Yoneyama M. Effects of chlorpropham (CIPC) on
the hemopoietic system of rats.Food Chem Toxicol. 2001;39(3):253-9.
12. Grassi, T. Avaliação da carcinogenicidade do pesticide Diuron em modelo de
carcinogênese de média duração para o fígado de ratos Wistar machos. Tese de
Mestrado. 2006
13. Haley P. STP position paper: best practice guideline for the routine pathology
evaluation of the immune system.Toxicol Pathol. 2005;33(3):404-7
14. Hayes WJ Jr. Pesticides studied in man. Williams and Wilkins, Baltimore, MD,
1982; p. 672.
15. Hodge HC, Downs WL, Panner B, Smith D, MaynardE, Clayton J Jr, Rhodes R.
Oral toxicity and metabolism of Diuron in rats and dogs. Food Cosmet. Toxicol. 1967;
5: 513.
16. Hooghe RJ, Devos S, Hooghe EL Effects of selected herbicides on cytokine
production in vitro. Life Sciences. 2000; 66:2519-2525.
17. Inadera H. The immune system as a target for environmental chemicals:
Xenoestrogens and other compounds.Toxicol Lett. 2006 14;164(3):191-206
18. Jones TC, Ward JM, Mohr U, Hunt RD. Hemopoietic System.
Springer-Verlag. In Lomax L, Keyes DG, Kociba RJ. Extramedullary
Hemopoiesis, Spleen, Rat.
19. Kaioumova D, Kaioumov F, Opelz G, Susal C. Toxic effects of the herbicide 2,4-
dichlorophenoxyacetic acid on lymphoid organs of the rat.Chemosphere. 2001;43(4-
7):801-5.
20. Khera .S, Whalen C, Trivett G, Ongers G. Teratogenicity studies on pesticide
formulations of dimethoate, Diuron, and lindane in rats. Bull. Environ. Contam.
Toxicol. 1979; 22: 522.
Referências
51
21. Kimber I, Dearman RJ. Immune response: adverse versus non-adverse effects.
Toxicol. Pathol. 2002; 30:54-58
22. Luster MI, Rosenthal GJ. Chemical agents and the immune response.
Environ Health Perspect. 1993;100:219-26
23. McMillan DC, McRae TA, Hinson JA. Propanil-induced methemoglobinemia and
hemoglobin binding in the rat.Toxicol Appl Pharmacol. 1990 ;105(3):503-7.
24. Organization for Economic Cooperation AND Development. OECD Guidelines for
Testing of Chemicals. Guideline 407: Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in
Rodents,1995.
25. Organization for Economic Cooperation AND Development. OECD Guidelines for
Testing of Chemicals. Guideline 408: Subchronic Oral Toxicity-Rodent: 90-day Study,
1998.
26. Schoket B, Vincze I. Dose-related induction of rat hepatic drug-metabolizing
enzymes by diuron and chlorotoluron, two substituted phenylurea herbicides. Toxicol
Lett. 1990;50(1):1-7
27. Schoket B, Vincze I. Induction of rat hepatic drug metabolizing enzymes by
substituted urea herbicides. Acta Pharmacol Toxicol (Copenh). 1985;56(4):283-8
29. Schuurman HJ, Kuper CF. Pathology of the thymus: changes induced by
xenobiotics and gene targeting. APMIS. 1995:103(7-8):481-500
30. Seiler J.P. Herbicidal phenylalkylureas as possible mutagens. I. Mutagenicity tests
with some urea herbicides. Mutat. Res. 1978; 58: 353.
31. Suttie AW. Histopathology of the spleen.Toxicol Pathol. 2006;34(5):466-503
32. Voccia I, Blakley B, Brousseau P, Fournier M. Immunotoxicity of pesticides: a
review. Toxicol Ind Health. 1999;15(1-2):119-32
Referências
52
33. Wang SW, Chu C.Y, Wang C.J. Haemotoxic effect of phenylurea herbicides in rats:
role of haemoglobin-adduct formation in splenic toxicity. Food Chem. Toxicol. 1993;
31:285-295.
34. Wang SW, Chu C.Y, Wang C.J. Haemotoxic effect of phenylurea herbicides in rats:
role of haemoglobin-adduct formation in splenic toxicity. Food Chem. Toxicol. 1993;
31:285-295
2:::
Efeitos do herbicida Diuron sobre macrófagos peritoneais de ratos Wistar machos
Alexandre Domingues
1
, Priscila Raquel Martins
1
, João Lauro Viana de Camargo
1
, Luís
Fernando Barbisan
2
, Ana Lúcia Tozzi Spinardi-Barbisan
1*
1
Departamento de Patologia, TOXICAM, Faculdade de Medicina, UNESP, Botucatu,
18618-000, SP, Brazil
2
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, 18618-000,
SP, Brazil.
Auxílio Financeiro
A realização deste estudo foi possível pelo Auxílio Financeiro da CAPES (Coordenação
e Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior) e pela Bolsa de Estudo FAPESP do
Mestrando Alexandre Domingues (Proc: 05/01223-7).
1
Autor correspondente
Departamento de Patologia, TOXICAM, Faculdade de Medicina
UNESP, Botucatu, 18618-000, SP, Brazil
Fone: 55-0-XX-14-3811-6238 / Fax: 55-0-XX-14-3815-2348
e-mail: a[email protected]
Resumo
53
Resumo
Os efeitos do Diuron, um herbicida derivado da uréia, foram avaliados sobre
macrófagos peritoneais de ratos Wistar machos após exposição in vivo. Para tal, os
animais, previamente estimulados ou não com BCG, foram expostos às concentrações
de 125, 1250 e 2500 ppm de Diuron incorporado à ração por 14 dias consecutivos.
Foram avaliados parâmetros como atividade fagocítica, produção de óxido nítrico (NO)
e água oxigenada (H
2
O
2
). A exposição ao Diuron resultou em diminuição significativa
do espraiamento de macrófagos de animais estimulados ou não com BCG e expostos as
três concentrações de Diuron. Foi observada redução significativa do peso corpóreo dos
animais expostos às concentrações de 1250 e 2500 ppm de Diuron. O Diuron não
exerceu efeito sobre a fagocitose e liberação de NO e H
2
O
2
. Os resultados permitem
concluir que o Diuron não afeta a atividade de macrófagos. Outros parâmetros devem
ser avaliados para determinar seu potencial imunotóxico.
Palavras-chave: Diuron, Imunotoxicidade, Macrófagos, Rato
Abstract
54
Abstract
The effects of Diuron, a phenylurea herbicide, were evaluated, on peritoneal
macrophages of male Wistar rats, after in vivo treatment. The animals, stimulated or not
by Onco-BCG, were treated with Diuron at concentrations of 125 ppm, 1250 ppm and
2500 ppm, by feeding, for 14 days. It were evaluated NO and H
2
O
2
production
,
spreading and phagocytosis, Animals treated with Diuron, stimulated or not by Onco-
BCG, exhibited reduction of macrophage spreading. Body weight reduction was also
observed in the animals treated with 1250 ppm and 2500 ppm of Diuron for 14 days.
Diuron did not affected the phagocytosis and NO e H
2
O
2
production. It was conclude
that Diuron did not affect the macrophages activity. Other parameters should be
evaluated to elucidate the immunotoxical potential of this herbicide,
Key-Words: Diuron, Immunotoxicity, Macrophages, Rats
Introdução
55
I. Introdução
Diversas substâncias químicas utilizadas na agricultura são reconhecidas como
agentes tóxicos, teratogênicos, mutagênicos e cancerígenos (Feber & Cabral, 1991;
IARC, 1991). Dentre estas substâncias, alguns praguicidas têm mostrado efeitos
imunotóxicos, no entanto, para o Diuron, pouca informação é relatada a respeito de seus
efeitos sobre o sistema imunológico. Historicamente, a maior preocupação com relação
aos possíveis efeitos adversos de agentes químicos voltava-se principalmente para o
estudo de seu potencial cancerígeno. Contudo, pesquisadores passaram a reconhecer a
importância de eventos adversos não-carcinogênicos, tais como imunotoxicidade e
teratogênese, no perfil tóxico de substâncias as quais a população está exposta em
diferentes níveis (Dean, 1989).
O Diuron é um herbicida derivado da uréia cuja aplicação se dá principalmente
nas lavouras de café, cana-de-açúcar, algodão, abacaxi, citros, alfafa e trigo, sendo
prontamente absorvido pelas raízes e folhas das plantas daninhas, mostrando ação de
contato e residual. Este herbicida na forma pura apresenta coloração cristalina, é um
composto não-iônico com moderada solubilidade em água (42 mg/L a 20
o
C). Sua
hidrólise é desprezível em pH neutro, mas aumenta em algumas condições em que o pH
se torna fortemente ácido ou alcalino. Devido a sua alta persistência, que pode variar de
um mês a um ano, o Diuron pode ser uma potencial fonte de contaminação para o solo,
sedimentos e água, (Giacomazzi & Cochet, 2004).
A absorção do Diuron se dá no trato gastrointestinal e no sistema respiratório.
No homem é metabolizado no fígado por hidroxilação e N-dealquilação, sendo em
seguida excretado pela urina (Hayes, 1982). Em ratos e cães foi observada excreção
também pelas fezes. O Diuron pertence à classe dos indutores enzimáticos do sistema de
oxidases mistas (enzimas do citocromo P450), aumentando o conteúdo enzimático do
sistema em aproximadamente 50%, quando comparado à praguicidas similares (Schoket
& Vincze, 1985).
Na Literatura os estudos reprodutivos mostram que o Diuron apresenta atividade
fetotóxica (Khera et al., 1979; EPA, 1987.). Quanto ao potencial de carcinogenicidade e
mutagenicidade os dados são controversos. O Diuron apresentou atividade mutagênica
em alguns testes (Seiler, 1978; Anon,1987, Agrawal & Mehrotra, 1997 ) e atividade
Introdução
56
cancerígena principalmente para mama e bexiga de roedores (Iyer, 2002, Nascimento et
al., 2006). Considerando a complexidade do sistema imunológico, os macrófagos
ativados representam um componente chave da resposta imunológica celular. O
processo de ativação dos macrófagos envolve diversas alterações morfológicas,
funcionais e metabólicas. Tais células, quando ativadas, tornam-se fagocíticas e aptas a
secretar diversas substâncias biologicamente ativas, além de participar nas etapas de
processamento e apresentação de antígenos para os linfócitos. Na Literatura, há poucos
estudos mostrando o papel do Diuron sobre componentes do sistema imunológico,
especialmente para os macrófagos. Um estudo in vitro utilizando-se células
mononucleares de sangue periférico humano de doadores sadios mostrou que o Diuron,
administrado às culturas nas concentrações de 0,01, 0,1 e 1
µ
M, inibiu a produção de
IL-5, IFN-
γ
e TNF-
α
(Hooghe et al., 2000). Ratas expostas ao Diuron em doses de 250,
500 e 1000 mg/kg na ração por 14 meses apresentaram aumento do peso do baço,
aumento da deposição de hemossiderina e formação de aductos entre hemoglobina e as
aminas aromáticas liberadas metabolicamente do herbicida (Wang et al., 1993). Em
estudo recente realizado por nosso grupo foi observado que o Diuron, administrado na
dieta na concentração de 2500 ppm, levou ao aumento da deposição de hemosiderina e
diminuição do tamanho e da celularidade da polpa branca no baço, além do retardo no
processo de maturação da linhagem mielóide observada na medula óssea de ratos Wistar
machos em modelo de hepatocarcinogênese química (Grassi et al., 2006).
Considerando a escassa Literatura sobre os possíveis efeitos imunotóxicos do
Diuron e que alterações no sistema imunológico podem afetar a integridade do
organismo levando ao desenvolvimento de doenças, no presente trabalho, objetivamos
avaliar os efeitos desse herbicida sobre a atividade de macrófagos peritoneais através da
avaliação do índice de fagocitose, espraiamento, produção de óxido nítrico (NO) e
liberação de água oxigenada (H
2
O
2
).
Material e Métodos
57
2. Material e Métodos
2.1. Animais e ambiente de experimentação
Ratos Wistar machos, com 6 semanas de idade, provenientes do Centro
Multidisciplinar para Investigação Biológica - CEMIB-UNICAMP (Campinas-SP)
foram submetidos à aclimatação por 2 semanas e mantidos em gaiolas de polipropileno
opacas com tampa de aço inox na forma de grade, forradas com maravalha branca de
pinho autoclavada, em sala com temperatura (22 + 2
o
C), umidade relativa do ar (55 +
20 %), ciclo de exaustão de ar e período de luz (12/12h claro/escuro) controlados.
Todos os animais receberam água filtrada e ração comercial Nuvilab-CR1 (Nuvital,
PR) ad libitum. O manuseio dos animais e procedimentos seguiram os critérios de
aprovação pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu sob o protocolo
de no. .(Anexo 2)
2.2.Preparo e administração de Mycobacterium bovis (Onco-BCG)
Ampolas de Mycobacterium bovis (Onco-BCG - Instituto Butantã, SP, Brasil),
uma substância classicamente reconhecida como ativadora de macrófagos peritoneais
(Rappolee & Werb, 1990), foram reconstituídas em solução fisiológica estéril e
administradas aos animais intraperitonealmente (i.p.). Os animais dos grupos II e VI a
VIII, receberam duas doses do Onco-BCG, uma dose de 0,50 ml e a segunda de 0,25
ml, com intervalo de 5 dias entre elas, sendo a avaliação realizada após 7 dias da
primeira administração (Ver Figura 1 – Delineamento experimental) (Fonseca et al.,
2002, com modificação).
2.3.
Preparo da ração com Diuron
A exposição dos animais ao Diuron (CASNR 330-54-1, Sigma - EUA) foi
realizada por via oral, sendo o herbicida incorporado à ração em pó (Nuvilab-CR1) nas
concentrações de 125, 1250 e 2500 ppm e, posteriormente, após completa
Material e Métodos
58
homogeneização (misturador Weg - Rio Claro, SP), peletizada (Peletizadora Chavantes,
modelo 7,5 c.v - Chavantes, SP) e seca por ventilação.
2.4. Protocolo experimental
Os animais foram distribuídos em grupos (n = 10) conforme o Delineamento
apresentado na Figura I: Grupo I: animais não-tratados que receberam ração basal;
Grupo II: animais tratados com Onco-BCG que receberam ração basal; Grupos III a V:
animais não-tratados que receberam ração acrescida de Diuron nas concentrações de
125, 1250 e 2500 ppm, respectivamente; Grupos VI a VIII: animais tratados com Onco-
BCG que receberam ração acrescida de Diuron nas concentrações de 125, 1250 e 2500
ppm, respectivamente. Todos os grupos foram avaliados após 14 dias do início do
experimento. Durante o experimento foi realizada a pesagem dos animais e registrado o
consumo médio estimado de ração e de água pelos animais.
Ao final de 14 dias de experimento foram coletados macrófagos peritoneais
utilizados para avaliar o índice de fagocitose e o espraiamento de macrófagos, a
detecção da liberação de água oxigenada (H
2
O
2
) espontânea e estimulada com acetato
miristato de forbol (PMA, sigla do inglês)
e a produção de óxido nítrico (NO).
Figura
14
dias
Grupo
s
I
I
I
III a
V
VI a
VIII
Ração
basal
Diuron 125, 1250 e 2500 ppm incorporado na ração
Onc
o
-
BCG, 0,5 e 0,25
m
l
,
i
p
,
respectivamente
S
S
S
S
S
Sacrifício
n =
n = 10
n =
n =
12
7
14
dias
Grupo
s
I
I
I
III a
V
VI a
VIII
Ração
basal
Onc
o
-
BCG, 0,5 e 0,25
m
l
,
ip respectivamente
i
p
S
S
S
S
S
n = 10
n =
n = 30
n = 30
12
7
Material e Métodos
59
2.5. Obtenção das suspensões celulares
Os animais foram sacrificados em câmara com CO
2
, e, em seguida, realizada a
coleta dos macrófagos peritoneais mediante a inoculação de 20 ml de solução salina
tamponada (PBS, pH = 7,1-7,4) gelada na cavidade peritoneal. Após o inóculo, o
abdômen foi massageado cerca de 60 vezes e, com o auxílio de uma seringa, o líquido
peritoneal colhido e transferido para tubos estéreis (mantidos sob refrigeração). Este
procedimento foi repetido duas vezes e as suspensões celulares centrifugadas sob
refrigeração por 10 minutos a 200g. As células obtidas foram ressuspendidas em meio
RPMI 1640 suplementado com 10 % de soro bovino fetal. A contagem dos macrófagos
foi avaliada com vermelho neutro e a concentração ajustada para 2 x 10
6
/ml, sendo
utilizadas suspensões com viabilidade acima de 90 % e predominância de macrófagos
superior a 90%, quando comparados a outros tipos celulares.
2.6. Espraiamento e fagocitose
O método utilizado para estudar o efeito do Diuron sobre o espraiamento e
fagocitose dos macrófagos foi baseado naquele descrito por Fonseca et al. (2002).
Foram utilizados macrófagos peritoneais, obtidos conforme descrito anteriormente, de
todos os grupos experimentais. Para o espraiamento de macrófagos, 200 µl de cada
suspensão celular foram plaqueados em duplicata (monocamadas) em lamínulas de
vidro. Vinte minutos após, os poços foram lavados com PBS gelado, adicionado 1 ml
de meio RPMI 1640 e as placas incubadas a 37
o
C por 1 h. Após a incubação as células
foram novamente lavadas com PBS gelado e as células aderentes fixadas com 0,5 % de
glutaraldeído por 10 minutos. Foram contadas 200 células (redondas ou espraiadas) em
microscópio óptico comum na objetiva de 40 x. O índice de espraiamento foi calculado
da seguinte forma:
SI = (número de macrófagos espraiados x 100)/200 células aderentes, isto é, SI = %
de macrófagos espraiados.
Para o índice de fagocitose foi utilizado o mesmo método acima, sendo
adicionado 1 mg de zimosan (2,5 mg/ml de solução) a cada poço da placa antes do
Material e Métodos
60
período de incubação de 1 h. O índice de fagocitose foi determinado conforme a
fórmula abaixo:
IF = (número de macrófagos com atividade fagocítica x 100)/200 células aderentes
,
isto é, IF = % de macrófagos com partículas de zimosan fagocitadas.
Também foi avaliada a intensidade de fagocitose que consiste na contagem de
quantas partículas de zimosan o macrófago fagocitou. Por exemplo, dos macrófagos
que efetuaram fagocitose (mensurado anteriormente), quantos destes fagocitaram uma,
duas, três ou mais partículas de zimosan.
2.7. Determinação da liberação de H
2
O
2
Liberações espontâneas ou induzidas de H
2
O
2
foram determinadas em
monocamadas de macrófagos estimulados ou não com PMA seguindo o método
descrito por Pick e Mizel (1981). Suspensões celulares obtidas conforme descrito
anteriormente, na concentração de 2 x 10
6
/ml, foram distribuídas em placas de 96 poços
e incubadas por 2h a 37
o
C. Em seguida as células não-aderentes foram removidas e a
monocamada de macrófagos incubada novamente a 37
o
C por 24h. Após este período, o
sobrenadante foi coletado e reservado para a dosagem de NO, e, à monocamada de
macrófagos foi adicionado 100 µl de solução de vermelho fenol contendo 140 mM de
NaCl, 10 mM de K
2
HPO
4
, 5,5 mM de dextrose, 0,5 mM de vermelho fenol e
peroxidase de raiz forte tipo II (0,01 mg/ml). A reação foi interrompida 1h após o início
com 10 µl de NaOH 1 M e a absorbância foi determinada em leitor Elisa a 620 nm. Os
resultados foram expressos em nmoles de H
2
0
2
/2 x 10
5
células, comparando-se a D.O.
de uma curva-padrão com concentrações conhecidas.
2.8. Determinação da liberação de óxido nítrico
Foi determinada em sobrenadante de cultura de macrófagos (obtido conforme
descrito anteriormente) pelo método colorimétrico baseado na reação de Griess. Para
cada 50 µl do sobrenadante foi adicionado 50 µl do reagente de Griess e a absorbância
das amostras foi avaliada em leitor Elisa no comprimento de onda de 540 nm. A
Material e Métodos
61
concentração de NO foi calculada a partir de uma curva-padrão conhecida e os níveis de
absorbância expressos em
µ
mols/2 x 10
5
células.
2.9.Análise Estatística
Os resultados obtidos foram avaliados pela ANOVA. As diferenças foram
consideradas significativas para p < 0,05.
Resultados
62
3. Resultados
Animais estimulados ou não com BCG e expostos ao Diuron (125, 1250 e 2500
ppm) po14 dias apresentaram redução significativa (p < 0,001) do espraiamento de
macrófagos peritoneais (Figura 6).
A - Espraiamento de macrófagos - Sem estímulo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ctrl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
% MO espraiados
Ctrl
125 ppm
1250 ppm
2500 ppm
B - Espraiamento de macrófagos - Sem estímulo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ctrl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
% MO espraiados
Ctrl
125 ppm
1250 ppm
2500 ppm
Figura 6. Espraiamento de macrófagos peritoneais nos grupos controle e tratados por 28 e 90
dias. A: Animais sem estímulo por Onco-BCG, B: Animais estimulados por Onco-BCG
O Diuron foi inapto a modificar o índice de fagocitose (Figura 7), a liberação de
NO (Figura 8) e a liberação de H
2
O
2
espontânea ou induzida por PMA(Figura 9) após
exposição in vivo por 14 dias.
Resultados
63
A - Índice Fagocitose - Sem estímulo por Onco-BCG
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Crtl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
Índice de Fagocitose
Crtl
125 ppm
1250 ppm
2500 ppm
B - Índice Fagocitose - Estímulo por Onco-BCG
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Crtl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
Índice de Fagocitose
Crtl
125 ppm
1250 ppm
2500 ppm
Figura 7. Avaliação do índice de fagocitose nos grupos controle e tratados por 28 e 90 dias. A:
Animais sem estímulo por Onco-BCG, B: Animais estimulados por Onco-BCG
Resultados
64
A - Produção de Água Oxigenada - Estímulo por Onco BCG
0
0,025
0,05
0,075
0,1
0,125
0,15
0,175
0,2
Ctrl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
Água Oxigenada
Sem estímulo
Estímulo por PMA
B - Produção de Água Oxigenada - Estímulo por Onco BCG
0
0,025
0,05
0,075
0,1
0,125
0,15
0,175
0,2
Ctrl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
Água Oxigenada
Sem estímulo
Estímulo por PMA
Figura 8. Produção de água oxigenada nos grupos controle e tratados por 28 e 90 dias. A:
Animais sem estímulo por Onco-BCG, B: Animais estimulados por Onco-BCG
Resultados
65
Produção de NO - Sem estímulo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Ctrl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
NO
Ctrl
125 ppm
1250 ppm
2500 ppm
Produção de NO - Estímulo por Onco-BCG
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
Ctrl 125 ppm 1250 ppm 2500 ppm
Grupos / Tratamento
NO
Ctrl
125 ppm
1250 ppm
2500 ppm
Figura 9. Produção de óxido nítrico nos grupos controle e tratados por 28 e 90 dias. A: Animais
sem estímulo por Onco-BCG, B: Animais estimulados por Onco-BCG
Os resultados das análises de peso corpóreo durante 14 dias de exposição ao
Diuron estão apresentados na Tabela e Figura . A exposição ao Diuron por 14 dias
resultou em redução significativa (p < 0,001) do ganho de peso corpóreo médio nos
grupos 1250 (- 11 a 38 %) e 2500 ppm (- 40 a 61 %) quando comparados aos grupos
controle e 125 ppm (Tabela 10). Os consumos de água e de ração não foram alterados
neste período.
Resultados
66
Tabela 10. Peso corpóreo inicial, final e ganho
1
de animais controles e tratados com Diuron
por 14 dias.
Tratamento
n
o
efetivo
de
animais
Peso Corpóreo (g)
Inicial Final Ganho
Ganho
Relativo
2
Sem BCG
Controle 10
221,6
287
65,4 ± 9,19
---
125 ppm 10
226,2
295
69
±
17,25
5,5 %
1250 ppm 10
215,7
273,6
57,9 ± 0,42
-11,47%
2500 ppm 10
200
239,4
39,4
±
2,55
-39,75%
Com BCG
Controle 10
217,9
288,6
70,70
±
10,63
---
125 ppm 10
219
283,6
64,60 ± 12,26
- 9,0 %
1250 ppm 10
215,5
259,5
44,00
±
6,04
- 38,0 %
2500 ppm 10
216,5
244
27,50 ± 11,25
- 61,0 %
1
valores expressos em média
±
desvio-padrão;
2
porcentagem
relativa ao grupo controle (Ganho de peso
corpóreo do grupo tratado x 100 / ganho de peso corpóreo do grupo controle); letras indicam as diferenças
significativas entre os grupos.
Discussão
66
4. Discussão
Na Literatura os estudos reprodutivos mostram que o Diuron apresenta atividade
fetotóxica (Khera., 1979; EPA, 1987; Fernandes, 2007). Quanto ao potencial de
carcinogenicidade e mutagenicidade os dados são controversos. O Diuron apresentou
atividade mutagênica em alguns testes (Seiler, 1978; Anon,1987, Agrawal & Mehrotra,
1997,Dupont de Nemours, 1985) e atividade cancerígena principalmente para mama e
bexiga de roedores (Bayer, 1985 apud USEPA, 1997; Anon, 1987; Iyer, 2002,
Nascimento et al., 2006). Quanto ao seu potencial imunotóxico há poucos trabalhos na
Literatura. Um estudo in vitro utilizando-se células mononucleares de sangue periférico
humano de doadores normais mostrou que o Diuron administrado às culturas nas
concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mM, inibiu a produção de IL-5, IFN-γ e TNF-α (Hooghe
et al., 2000). Ratas expostas às doses de 250-1000 mg/kg de Diuron na dieta por 14
meses apresentaram aumento do peso do baço, aumento de hemosiderina e formação de
aductos de hemoglobina com aminas aromáticas liberadas do herbicida (Wang et al.,
1993). Neste contexto, este é o primeiro estudo que avalia o efeito do Diuron sobre a
atividade de macrófagos.
Estudo recente realizado por nosso grupo mostrou que Diuron exerce efeito
tóxico órgão-específico, afetando principalmente o baço. Em tal estudo foi observado
esplenomegalia, hiperplasia eritróide, aumento de hemosiderina e hematopoiese
extramedular. Além disso, foi observada diminuição dos compartimentos de polpa
branca e da celularidade do baço principalmente da bainha linfocítica periarteriolar
(PALS) associada a diminuição dos linfócitos T CD4
+
. Devido a complexidade do
sistema imunológico, uma bateria de testes imunológicos foi desenvolvida para
determinar o potencial imunossupressor de compostos (Gore, 2006). Desta forma, este
Discussão
67
estudo foi desenvolvido para verificar o papel do Diuron sobre a atividade de
macrófagos. O potencial imunotóxico do Diuron em ratos machos foi avaliado pela
análise da atividade fagocítica, incluindo espraiamento, índice e intensidade de
fagocitose, liberação de NO e H
2
O
2
espontânea ou estimulada com PMA.
Os resultados do presente estudo mostram que o Diuron diminui o espraiamento
de macrófagos sem alterar o índice de fagocitose e a liberação de NO e H
2
O
2
, após 14
dias de exposição in vivo. A eficiência do estímulo com BCG foi significativa tanto para
o espraiamento como para a fagocitose mostrando índices de ativação maiores em
relação aos animais não-estimulados. O número de macrófagos obtidos após o estímulo
com BCG representaram 90 % das células do lavado peritoneal, cujos dados estão de
acordo com aqueles relatados anteriormente por Rigui e Palermo-Neto (2005).
A ativação de macrófagos vem sendo estudada há várias décadas (Adams &
Hamilton, 1984; Arai et al., 1990; Massoco & Palermo-Neto, 2003). Este processo de
ativação é caracterizado por alterações morfológicas, funcionais e metabólicas quando
comparado às células não-ativadas. Os macrófagos ativados constituem um componente
chave da resposta imunológica celular, uma vez que estão envolvidos no processamento
e apresentação de antígenos para as células linfóides. O espraiamento é um processo
ativo que representa uma das alterações ocorridas durante a ativação de macrófagos.
Embora seu papel na fagocitose possa ser controverso, vários estudos recentes têm
mostrado diferenças no espraiamento (Rigui & Palermo-Neto, 20050). Nossos dados
mostram que a exposição ao Diuron diminui o espraiamento nas três concentrações em
animais estimulados ou não com BCG, após 14 dias. Por outro lado, a fagocitose e a
liberação de NO e H
2
O
2
não foram alteradas.
Embora tenha sido observada redução significativa do ganho de peso corpóreo
sugerindo toxicidade sistêmica em decorrência da exposição ao Diuron, o tratamento
Discussão
68
não modificou a atividade de macrófagos peritoneais. Como não foi observada
formação de rosetas eritrocitárias, é possível inferir que os macrófagos estão realizando
sua atividade normal de fagocitose.
Os resultados do presente estudo permitem concluir que o Diuron não afeta a
atividade de macrófagos peritoneais após exposição in vivo por 14 dias.
.
Referências
69
Referências
1. Adams DO, Hamilton TA. The cell biology of macrophage activation.
Annu Rev Immunol. 1984; 2:283-318
2. Agrawal RC, Mehrotra NK. Micronucleus induction by Diuron in mouse bone
marrow. Indian J. Exp. Biol. 1997; 35:1256.
3. Anon D. Proper. Ind. Mater. Report. 1987; 7 : 49.
4. Arai S, et al. Enhancement of cytotoxicity of active macrophages by mycoplasma:
role of mycoplasma-associated induction of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) in
macrophages.Microbiol Immunol. 1990;34:231-43.
5. Bayer Institute of Toxicology. Diuron: Study for chronic toxicity and carcinogenicity
with Wistar rats (administration in the diet for up to two years). Wuppertal: Bayer
Institute of Toxicology. 1985 (DPR # 106-035).
6. Dean, JH, Cornacoff, JB, Rosenthal, GJ, Luster MI. Immune system: Evaluation of
injury. Principles and Methods of Toxicology .A. W. Hayes, Ed. 1989, p 741-760.
Raven Pres, New York
7. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). Increased incidence of
malignant and combined malignant and benign tumors in male and female rats and
increased incidence of malignant tumors in female mice. 1987
8. Fernandes GS, et al. Reproductive effects in male rats exposed to diuron. Reprod
Toxicol. 2007;23(1):106-12.
9. Fonseca ES, Massoco CO, Palermo-Neto J. Effects of prenatal stress on stress-
induced changes in behavior and macrophage activity of mice.Physiol Behav.
2002;77(2-3):205-15.
Referências
70
10. Giacomazzi S, Cochet N. Environmental impact of Diuron transformation: a review.
Chemosphere. 2004; 56(11): 1021-32.
11. Gore ER. Immune function tests for hazard identification: a paradigm shift in drug
development.Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2006;98(4):331-5.
12. Grassi, T. Avaliação da carcinogenicidade do pesticide Diuron em modelo de
carcinogênese de média duração para o fígado de ratos Wistar machos. Tese de
Mestrado. 2006
13. Hayes WJ Jr. Pesticides studied in man. Williams and Wilkins, Baltimore, MD,
1982; p. 672.
14. Hooghe RJ, Devos S, Hooghe EL Effects of selected herbicides on cytokine
production in vitro. Life Sciences. 2000; 66:2519-2525.
15. Khera .S, Whalen C, Trivett G, Ongers G. Teratogenicity studies on pesticide
formulations of dimethoate, Diuron, and lindane in rats. Bull. Environ. Contam.
Toxicol. 1979; 22: 522.
16. Massoco C, Palerm—Neto J. Effects of midazolam on equine innate immune
response: a flow cytometric study.Vet Immunol Immunopathol. 2003;95(1-2):11-9.
17. Pick E, Mizel D. Rapid microassays for the measurement of superoxide and
hydrogen peroxide production by macrophages in culture using an automatic enzyme
immunoassay reader.J Immunol Methods. 1981;46(2):211-26.
18. Righi DA, Palermo-Neto J. Effects of type II pyrethroid cyhalothrin on peritoneal
macrophage activity in rats. Toxicology. 2005 Sep 1;212(2-3):98-106
19. Schoket B., Vincze I. Induction of rat hepatic drug metabolizing enzymes by
substituted urea herbicides. Acta pharmacol. et toxicol. 1985; 56:283-288.
20. Seiler J.P. Herbicidal phenylalkylureas as possible mutagens. I. Mutagenicity tests
with some urea herbicides. Mutat. Res. 1978; 58: 353.
Referências
71
21. Wang SW, Chu C.Y, Wang C.J. Haemotoxic effect of phenylurea herbicides in rats:
role of haemoglobin-adduct formation in splenic toxicity. Food Chem. Toxicol. 1993;
31:285-295.
1. Agrawal RC, Mehrotra NK. Micronucleus induction by Diuron in mouse bone
marrow. Indian J. Exp. Biol. 1997; 35:1256.
2. Anon D. Proper. Ind. Mater. Report. 1987; 7 : 49.
3. Bayer Institute of Toxicology. Diuron: Study for chronic toxicity and carcinogenicity
with Wistar rats (administration in the diet for up to two years). Wuppertal: Bayer
Institute of Toxicology. 1985 (DPR # 106-035).
4. Dean, JH, Cornacoff, JB, Rosenthal, GJ, Luster MI. Immune system: Evaluation of
injury. Principles and Methods of Toxicology .A. W. Hayes, Ed. 1989, p 741-760.
Raven Pres, New York
5. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). Increased incidence of
malignant and combined malignant and benign tumors in male and female rats and
increased incidence of malignant tumors in female mice. 1987
6. Fernandes GS, et al. Reproductive effects in male rats exposed to diuron. Reprod
Toxicol. 2007;23(1):106-12.
7. Fonseca ES, Massoco CO, Palermo-Neto J. Effects of prenatal stress on stress-
induced changes in behavior and macrophage activity of mice.Physiol Behav.
2002;77(2-3):205-15.
Referências
72
8. Giacomazzi S, Cochet N. Environmental impact of Diuron transformation: a review.
Chemosphere. 2004; 56(11): 1021-32.
9. Grassi, T. Avaliação da carcinogenicidade do pesticide Diuron em modelo de
carcinogênese de média duração para o fígado de ratos Wistar machos. Tese de
Mestrado. 2006
10. Hayes WJ Jr. Pesticides studied in man. Williams and Wilkins, Baltimore, MD,
1982; p. 672.
11. Hooghe RJ, Devos S, Hooghe EL Effects of selected herbicides on cytokine
production in vitro. Life Sciences. 2000; 66:2519-2525.
12. Khera .S, Whalen C, Trivett G, Ongers G. Teratogenicity studies on pesticide
formulations of dimethoate, Diuron, and lindane in rats. Bull. Environ. Contam.
Toxicol. 1979; 22: 522.
13. Pick E, Mizel D. Rapid microassays for the measurement of superoxide and
hydrogen peroxide production by macrophages in culture using an automatic enzyme
immunoassay reader.J Immunol Methods. 1981;46(2):211-26.
14. Righi DA, Palermo-Neto J. Effects of type II pyrethroid cyhalothrin on peritoneal
macrophage activity in rats. Toxicology. 2005 Sep 1;212(2-3):98-106
15. Schoket B., Vincze I. Induction of rat hepatic drug metabolizing enzymes by
substituted urea herbicides. Acta pharmacol. et toxicol. 1985; 56:283-288.
16. Seiler J.P. Herbicidal phenylalkylureas as possible mutagens. I. Mutagenicity tests
with some urea herbicides. Mutat. Res. 1978; 58: 353.
17. Wang SW, Chu C.Y, Wang C.J. Haemotoxic effect of phenylurea herbicides in rats:
role of haemoglobin-adduct formation in splenic toxicity. Food Chem. Toxicol. 1993;
31:285-295.
Referências
73
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
