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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E EVOLUÇÃO
Estrutura populacional e padrão espacial da variabilidade genética em bandos de
Tayassu pecari (Link, 1795) do Parque Nacional das Emas
Elisângela de Albuquerque Sobreira Lage
GOIÂNIA
Estado de Goiás - Brasil
Agosto– 2006
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E EVOLUÇÃO
Estrutura populacional e padrão espacial da variabilidade genética em bandos de Tayassu
pecari (Link, 1795) do Parque Nacional das Emas
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ecologia e Evolução da
Universidade Federal de Goiás, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Ecologia e Evolução.
Aluna: Elisângela de Albuquerque Sobreira Lage
Orientadora: Dra. Mariana Pires de Campos Telles
GOIÂNIA
Estado de Goiás - Brasil
Agosto– 2006
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iii
“ Receio que os animais vejam o homem como um
semelhante que perigosamente perdeu a sadia razão
animal – como o animal delirante, o animal ridente, o
animal plangente, o animal infeliz.”
Friedrich Nietzsche, Gaia Ciência.
iv
AGRADECIMENTOS
Ao término de um trabalho que exigiu muita reflexão e dedicação, vivencia-se, mais uma vez,
a oportunidade de aprendizado gerado pela percepção da dicotomia dos sentimentos:
realização e liberdade; contracenado com o desejo de continuidade e comprometimento. Ao
analisar o antagonismo dessas emoções, encontra-se a justificativa na lembrança daqueles,
que de uma forma significativa, fizeram-se presentes ao longo dessa caminhada. Assim, quero
agradecer de todo o coração:
À Deus, pelo seu amor e principalmente pelo dom da vida;
Aos meus pais Oscarito e Rosângela que sempre me incentivaram e apoiaram, mostrando-me
que as vitórias se conquistam com muito empenho.
As minhas irmãs: Patrícia e Tarciana, que são a minha fortaleza nos momentos difíceis;
Aos meus filhos Gabriel, Rafael e Victória, por seus carinho, amor e compreensão nos
momentos em que o trabalho exigia dedicação em tempo integral.
À Moacir, pelo carinho, amor, amizade e companheirismo
Em especial, a minha orientadora, Professora Doutora Mariana Pires Campos Telles, pela
confiança em mim depositada e pela colaboração prestada durante todo o tempo em que
decorreu este trabalho e principalmente pela amizade, paciência, carinho e companheirismo
durante toda esta difícil jornada.
À Universidade Federal de Goiás, pela organização e profissionalismo em que conduziu este
Curso de Mestrado.
Aos Professores do Mestrado em Ecologia e Evolução da Universidade Federal de Goiás.
À Equipe de Pesquisadores do Parque Nacional das Emas (Dra. Anah Tereza de Almeida
Jácomo e Dr. Leandro Silveira) que foram os responsáveis pela coleta das amostras no
campo.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Genética e Melhoramento da Universidade Católica
de Goiás que, com prestatividade, contribuíram com a coleta dos dados moleculares para o
desenvolvimento deste trabalho.
A Pró Reitoria de Pós Graduação e Pesquisa da UCG pelo apoio logístico.
A Conservation International e Ao Fundo para a conservação da Onça Pintada (Jaguar
Conservation Fund) pelo apoio financeiro.
v
SUMÁRIO
Pág.
LISTA DE TABELAS......................................................................................................... vi
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... vii
RESUMO............................................................................................................................. ix
ABSTRACT.......................................................................................................................... x
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................... 5
3.1. Caracterização da espécie Tayassu pecari.................................................................... 5
3.2. Biologia da Conservação e ecologia molecular............................................................ 15
3.3. Marcadores RAPD em estudos populacionais com animais........................................ 24
4. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 27
4.1.Caracterização da Área de Estudo.................................................................................... 27
4.2.Obtenção dos dados moleculares..................................................................................... 29
4.2.1. Coleta do Material biológico....................................................................................... 29
4.2.2. Extração do DNA e análise com os primers RAPD .................................................. 30
4.3. Análise dos dados.......................................................................................................... 32
4.3.1 Variabilidade genética dentro e entre bandos de queixada.......................................... 32
4.3.2. Divergência genética e padrão espacial...................................................................... 35
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 39
5.1. Caracterização da variabilidade genética dentro e entre bandos de queixada .............. 39
5.2. Divergência genética e padrão espacial da variabilidade genética em bandos de
queixada............................................................................................................................ 45
6. CONCLUSÕES.................................................................................................................. 51
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 52
APÊNDICES
vi
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Esperanças matemáticas dos quadrados médios [E(QM)] para populações
(P), indivíduos dentro populações (I/P) ......................................................... 34
Tabela 2. Relação dos primers, suas seqüências de bases e o número de locos (NL),
obtidos nos oito bandos de Tayassu pecari...................................... 39
Tabela 3. Relação da Diversidade genética de Nei (He), número de locos
polimórficos (NLP) e porcentagem de locos polimórficos (%LP), por
bando de Tayassu pecari. ......................................................................... 42
Tabela 4. Quadro de Análise de Variância Molecular para os 8 bandos de Tayassu
pecari, com base em 129 locos RAPD. ....................................................
43
Tabela 5. Valores de Φ
ST
par a par entre oito bandos de Tayassu pecari, com base em
locos RAPD......................................................................................... 44
Tabela 6. Distância geográfica (km) entre oito bandos de Queixada (Tayassu pecari).
....................................................................................................... 44
vii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Tayassu pecari....................................................................................... 7
Figura 2. Parque Nacional das Emas..................................................................... 28
Figura 3 - Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
primer OPC-06 com alguns indivíduos do bando de Tayassu pecari. As
colunas M 100bp, indicam o marcador de peso molecular (100 bp
ladder, Pharmacia)................................................................................ 40
Figura 4 - Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
primer OPC-08 com alguns indivíduos do bando de Tayassu pecari. As
colunas M 100bp, indicam o marcador de peso molecular (100 bp
ladder, Pharmacia).................................................................................. 40
Figura 5 - Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
primer OPC-11 com alguns indivíduos do bando de Tayassu pecari. As
colunas M 100bp, indicam o marcador de peso molecular (100 bp
ladder, Pharmacia)................................................................................. 41
Figura 6. Distribuição dos valores de He dos 129 locos analisados nos bandos de
Tayassu pecari................................................................................... 42
Figura 7. Padrão de divergência genética entre os 8 bandos de Tayassu pecari,
definido pelo agrupamento por UPGMA, com base nas distâncias
genéticas (Φ
ST
). Correlação cofenética igual a 0,714................................ 47
Figura 8. Análise bi-dimensional mostrando a posição relativa dos 8 bandos de
Queixada no espaço genético (Φ
ST
) reduzido por uma análise de
escalonamento multidimensional não métrico (NMDS). Valor de estresse
= 0,16447...................................................................................... 47
Figura 9. Relação entre as distâncias genéticas obtidas na AMOVA e as distâncias
geográficas (r = -0,0154; P = 0,4979 com 5000 permutações do teste de
Mantel), para os 8 bandos de Queixada..................................................... 49
Figura 10. Correlograma de Mantel construído com base nas distâncias genéticas
(Φ
ST
) entre 8 bandos de Tayassu pecari, ao longo de cinco classes de
distâncias geográficas. A linha tracejada mostra a correlação esperada
sob a hipótese nula de ausência de padrão espacial. Os números indicam
a probabilidade de erro tipo I obtida usando 5000 permutações pelo teste
de Mantel.................................................................................................
50
viii
RESUMO
A região do Parque Nacional das Emas (PNE) apresenta uma grande biodiversidade e está
sofrendo um intenso processo de destruição pela ação do Homem, provocando a fragmentação
da vegetação nativa, reduzida a pequenas ilhas no meio das lavouras extensivas. A
sobrevivência de muitas espécies de plantas e animais deste hotspot de diversidade é
seriamente ameaçada, e tem se generalizada a percepção de que algo deve ser feito para
preservar esta biodiversidade. Neste sentido, o ponto de partida é a intensificação de pesquisas
que proporcionem um melhor conhecimento das espécies, sob os aspectos genéticos e
ecológicos. A análise da variabilidade genética possui hoje um papel de destaque na definição
das estratégias de conservação e manejo de populações naturais. Nesse contexto, o objetivo
deste trabalho foi avaliar os padrões de variabilidade genética nos bandos de queixada
(Tayassu pecari) do Parque Nacional das Emas, utilizando marcadores do tipo RAPD. O DNA
de 182 indivíduos, distribuídos em oito bandos, foi extraído e utilizado para a amplificação via
PCR de dez primers previamente selecionados. Os dados foram utilizados para estimar a
magnitude e a distribuição da variabilidade entre e dentro dos bandos por meio da Análise de
Variância Molecular (AMOVA). A fim de se analisar, de forma explícita, os padrões de
variação espacial, foi estimado o coeficiente de correlação de Pearson (r) entre a matriz de
distâncias genéticas e geográficas entre os bandos, considerando o centro da sua área de vida,
estimado a partir de dados de telemetria. Com base nos dez primers foram obtidos 129 locos,
dos quais 88% (114) foram polimórficos, variando entre 37% e 78% nos bandos. O valor do
φ
ST
obtido pela AMOVA foi igual a 0,11 (P < 0,0001 - 10000 permutações), um valor elevado
considerando que trata-se, a princípio, de uma única população local distribuída em escala
regional. As distâncias entre os pares de bandos (φ
ST
) variaram entre 4% e 29%, ilustrando a
heterogeneidade da variabilidade nessa escala espacial. O agrupamento dessas distâncias
reflete essa heterogeneidade, mas é de difícil interpretação sem que mais informações
ecológicas dos bandos estejam disponíveis. No caso, é interessante relacionar os padrões de
variabilidade genética aos dados disponíveis para a telemetria desses bandos, onde foi obtida a
posição central de cada bando na região, de modo que a matriz de distância geográfica entre
estes possa ser relacionada às distâncias genéticas. O valor da correlação matricial (r) neste
modelo foi igual a –0,3338 (P = 0,009 - 5000 permutações). Assim, há uma tendência de que
grupos próximos sejam diferentes e que bandos mais distantes no espaço geográfico sejam
mais similares geneticamente. Embora este padrão espacial não seja freqüentemente
observado, ele seria esperado considerando determinados modelos demográficos. Um modelo
no qual há dispersão dos machos para distâncias relativamente longas, de modo que estes
contribuem para a composição genética do bando que os recebe. Além disso, em função de
reconhecimento individual, evitando endogamia, ou em função do efeito da própria distância
criado no momento da dispersão, os bandos geneticamente próximos (ligados “via” macho)
não se sobrepõem no espaço, e a coexistência só existe entre bandos de origens distintas.
Palavras-chave: Tayassu pecari, RAPD, padrão espacial
ix
ABSTRACT
The region of Emas National Park presents a great biodiversity and is suffering an intense
process of destruction through the men’s actions, causing a native vegetation fragmentation,
which has been reduced to small islands among extensive crops. The survivor of many species
of plants and animals of this diversity hotspot are seriously threaten, and it leads to a idea that
something must be done to preserve this biodiversity. Thus, the start point is the intensification
of research that allows the increase of species knowledge, under genetics and ecological
aspects. Nowadays, the analysis of genetic variability has a highlighted roll in the definition of
conservation strategies and natural populations management. In this context, the goal of this
study was to evaluate the pattern of genetic variability on Tayassu pecari groups from Emas
National Park, using RAPD markers. DNA from 182 individuals, distributed among eight
groups, were extracted and used to amplify 10 primers previously selected through PCR. The
obtained Data were used to estimate the magnitude and distribution of variability within and
among the groups using AMOVA. Aiming to analyze, on a explicit way, the patterns of spatial
variation patterns, Pearson corelation coefficient (r) was estimated between the matrix of
genetic distances and geographic among the groups, considering their central area of life,
estimated from telemetry data. From the ten primers were obtained 129 loci, which 88% (114)
were polymorphic, ranging between 37% and 78% in the groups. The value of φ
ST
obtained
from AMOVA was equal to 0,11 (P < 0,0001 - 10000 permutations); a high value considering
the only one local population distributed in regional scale. Distances among pares of groups
(φ
ST
) ranged between 4% and 29%, illustrating the heterogeneity of variability on spatial scale.
The grouping of these distances reflects this heterogeneity, but is hard to interpret without
further ecological information available from the groups. In this case, is interesting to correlate
the patterns of genetic variability with available data to the telemetry of these groups, where it
was obtained the central position of each group in the region, so the geographic distance
matrix in between, may be correlated to the genetic distances. The value of the matritial
correlation in this model was equal to –0.3338 (P = 0.009 - 5000 permutations). Therefore,
there is a tendency that the closer groups are different and that distant groups in the geographic
area are genetically more similar. Although this spatial pattern is not frequently observed, it
would be expected considering certain demographic models. On a model for which there is no
dispersion of males for relatively long distances, so they may contribute to the genetic
composition of the receiver group. Because of the individual recognize, avoiding endogamy,
or as a consequence of the distance created in the moment of the dispersion, the genetically
closer groups (linked “through” male) do not overlap in space, and the coexistence only exists
among groups with distinct origens.
Key words: Tayassu pecari, RAPD, spatial pattern
1
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é um país extremamente rico em diversidade animal. Os primeiros registros
de estudos da fauna brasileira datam do Século XVII, com a viagem dos naturalistas
holandeses Pizo e Macgraf, durante uma missão científica. Após essa expedição outras
contribuições foram descritas, estabelecendo o grande potencial dos recursos naturais
presentes no Brasil (Curry, 1972; Caldeiron, 1992; Frankham, et al., 2003).
Várias espécies sofrem o risco de serem extintas, devido a extensas queimadas e
principalmente, ao desmatamento para a expansão de áreas agrícolas, desrespeitando as áreas
de reserva legal e proteção permanente (March, 1996; Primack & Rodrigues, 2001). O
desmatamento ocasiona a fragmentação, que nada mais é do que a transformação de uma
grande extensão de habitats em numerosas manchas menores isoladas uma das outras, imersas
em uma matriz circundante (Chiarello, 1999). A fragmentação de habitats tornou-se um sério
problema atual, pois existe um grande número de espécies sendo perdido antes de se ter seu
conhecimento. Para evitar tal situação é importante a proteção e a recuperação destas áreas.
Deste modo, o estudo das espécies presentes nos fragmentos ainda existentes, ajuda a definir
estratégias de conservação e de uso sustentado dos recursos naturais (Meffe & Carrol, 1994;
Diniz-Filho & Telles, 2002; Fahring, 2003; Michalski & Peres, 2005).
Apesar do processo de fragmentação do Cerrado ter começado a partir de 1960, os
estudos do comportamento das espécies, fluxo gênico, migração e extinção são recentes e
escassos. É recomendável que se conheça a variabilidade genética existente nas espécies que
estão nos remanescentes, e que se saiba se estão sofrendo um processo de erosão genética que
poderá levar a um comprometimento da viabilidade populacional em longo prazo.
Informações moleculares sobre a variabilidade e a estrutura genética de populações naturais
2
podem auxiliar no esclarecimento da condução de programas de conservação genética (Solé-
Cava, 2001; Escudero et al., 2003; Hansson & Richardson, 2005; Louis Jr. et al., 2005; Stow
& Briscoe, 2005; Vidya et al., 2005).
O surgimento dos marcadores moleculares possibilitou a ampliação dos
conhecimentos sobre as populações naturais. Os marcadores RAPD (Random Amplified
Polymorfic DNA) são usados como ferramenta para responder a diversas questões sobre a
variabilidade genética, divergência genética e fluxo gênico (Oliveira et al., 2001; Roca et al.,
2001; Telles et al., 2001; Telles et al., 2003; Moreira, 2004). Eles apresentam grandes
vantagens por tornarem o processo de análise de marcadores moleculares rápido e de custo
relativamente reduzido, tornando-o bastante acessível.
O Parque Nacional das Emas (PNE) possui uma área de 131.800 ha e está localizado
no extremo sudoeste do Estado de Goiás, próximo às divisas com o Mato Grosso e Mato
Grosso do Sul. Representa uma das mais importantes Unidades de Conservação do Cerrado
devido à sua extensão e integridade de habitats, riqueza faunística e presença de espécies raras
e ameaçadas de extinção, sendo que foi recentemente incluído nas Ações prioritárias para
Conservação da Biodiversidade do Cerrado e Pantanal (MMA, 1998) como área de
importância biológica extremamente alta.
Os Queixadas (Tayassu pecari) são mamíferos frugívoros/onívoros comuns e
abundantes no Cerrado. Estudos recentes têm demonstrado que seu papel como predadores de
frutos e dispersores de sementes afeta a biodiversidade de alguns habitats ( Fragoso, 1998;
Jácomo, 2004). Os queixadas são os únicos ungulados que formam grandes grupos (50 a 300
indivíduos) e, portanto, a extinção desta espécie certamente levaria a alterações desses
habitats, além de perdas de biodiversidade. Infelizmente, extinções locais de queixada têm
sido relatadas ao longo de sua vasta área de ocorrência geográfica (Kiltie & Terborgh, 1983;
3
Glanz, 1990; Peres, 1996; Cullen Jr., 1997; Fragoso, 1997a; Fragoso, 1997b; Fragoso, 1998;
Fragoso, 1999; Jácomo, 2004). Justificando desta maneira a urgente necessidade de entender
como está estruturada a variabilidade genética nesta espécie e qual o reflexo desta estruturação
na persistência dos bandos em médio e longo prazo.
4
2. OBJETIVO
O objetivo geral do trabalho foi avaliar os padrões de variabilidade genética nos
bandos de queixadas encontrados no Parque Nacional das Emas, utilizando marcadores
moleculares do tipo RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA). Mais especificamente,
procurou-se:
1. Avaliar a magnitude da variabilidade genética entre os bandos;
2. Analisar a distribuição da variabilidade e a divergência genética entre os bandos;
3. Estimar o fluxo gênico entre os bandos;
4.Testar padrões espaciais explícitos da divergência genética ao longo da distribuição
geográfica em que foram encontrados os bandos no PNE.
5
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Caracterização da espécie Tayassu pecari
Em relação aos outros animais da Classe Mammalia, os porcos-do-mato pertencem à
Ordem Artiodactyla, Sub-ordem Nonruminantia, Superfamília Suoidea e à Família
Tayassuidae (Schimidt, 1988; Nowak, 1991). São também conhecidos como “pecaris”, nome
indígena de origem tupi-guarani, cujo significado é animal que faz muitos caminhos na mata.
A palavra “tayassu” também de origem indígena significa aquele que rói a taya (planta com
raiz suculenta) (Sowls, 1997; Aguirre et al., 2002).
Apesar da semelhança, os tayassuídeos diferem dos suídeos, em importantes
características morfológicas, tais como a presença de cauda vestigial, ausência de vesícula
biliar, estômago completo (quatro câmaras), presença de 38 dentes, rádio e ulna fundidos,
metacarpos e metatarsos médios fundidos , presença de no máximo três dedos nos membros
pélvicos e presença de glândula de cheiro na região dorsal próximo à cauda, cuja secreção tem
odor forte e coloração esbranquiçada. Tal secreção tem as funções de demarcação de território,
reconhecimento social entre animais do mesmo grupo e manutenção da proximidade dos
membros do grupo em áreas com vegetação mais densa (Sowls, 1984; Fowler, 1993). São
nativos do Novo mundo, enquanto os suídeos são nativos do Velho mundo.
Os Queixadas são suiformes e possuem morfologia reprodutiva semelhante ao dos
demais suídeos. Nos pecaris o escroto localiza-se ventralmente ao ânus, projetando-se na
superfície corporal, contornando os órgãos que contém, testículos e epidídimos. A pele do
escroto apresenta pigmentação, como no restante do corpo, porém está desprovida dos pêlos
típicos dos Tayassuideos, caracteristicamente longos e espessos, possuindo apenas alguns
pêlos mais delicados. Quando o animal jovem é suspenso pelos membros pélvicos, os
6
testículos “desaparecem” sob a pele e sua identificação é possível pela palpação e pela pele
modificada do escroto. Esta característica é tão mais evidente quanto mais jovem for o animal.
Apesar dos queixadas serem mencionados muitas vezes como porcos-do-mato ou porcos
selvagens (wild pigs) eles não são suínos verdadeiros, mas sim possuem um ancestral comum
com estes, colocando-os lado a lado na Superfamília Suoidea (Carroll 1988, Sowls 1984). As
estimativas baseadas em seqüências de DNA do citocromo mitocondrial b sugerem que estas
duas famílias, Suidae e Tayassuidae, divergiram uma da outra a mais ou menos 33-37 milhões
de anos atrás e que há fortes indícios de que o Cateto e o Queixada pertençam a gêneros
diferentes (Theimer & Keim, 1998). Com algumas espécies já extintas e três vivendo nos dias
atuais os tayassuideos mantiveram muitas semelhanças com os suínos do velho mundo ao
longo dos processos evolutivos.
A Família Tayassuidae é representada por dois gêneros e três espécies: o Porco-dos-
chacos ou Taguá, Catagonus wagneri, o Cateto, Tayassu tajacu, e o Queixada, Tayassu
pecari. O Queixada, a maior entre as três espécies (30 a 50 kg) possui uma distribuição
geográfica mais restrita, sendo atualmente descontínua e fragmentada em relação à sua área
original. Sua distribuição se estende por 19 países da América Latina (March, 1996), onde
sobrepõe totalmente a área de ocorrência do queixada chaquenho (Catagonus wagneri), no
Grande Chaco da América do Sul-Central e parte da distribuição geográfica do cateto
(Tayassu tajacu) (Schaller, 1983; Mayer & Wetzel, 1987; Emmons, 1990). Populações
remanescentes de algumas subespécies como T. p. ringens e T. p. spiradens, do Sul do México
e América Central estão ameaçadas, ou já foram extintas como, por exemplo o caso de T. p.
ringens em El Salvador (March, 1996; Sowls, 1997).
Com exceção de diferenças encontradas em crânios e esqueletos (Sowls, 1997,
Margarido, 2001), porcos-do-mato, como um todo, não apresentam dimorfismo sexual
7
aparente, com exceção da presença do saco escrotal que pode ser observado a curtas distâncias
(Mayer & Wetzel, 1987; Sowls, 1997, Nogueira-Filho & Lavorenti, 1997; Keuroghlian, 2003)
e não são polígamos. Os Catetos (2n=30) e os Queixadas (2n=26) podem produzir híbridos
(2n=28), no entanto estes são inférteis e nos machos, por exemplo, há formação dos túbulos
seminíferos; os machos possuem libido, mas são completamente inférteis (Andrea et al. 2001).
A coloração da pelagem do adulto varia de marrom escura a negra, com a região do queixo
branco, medindo de 0,95 a 1,40 metro de comprimento e de 0,40 a 0,53 metro de altura, em
cativeiro pode atingir o peso de 30 até 45 Kg, como mostrado na Figura 1.
Figura 1. Tayassu pecari.
Fonte: Citesorg(2006)
A temperatura normal do corpo dos queixadas varia de 38,33°C a 39,17°C. A pulsação
varia de 110 a 121 por minuto. A pressão arterial é em torno de 139 mmHg. A taxa
8
respiratória varia de 12 a 20 por minuto, mas estes valores podem elevar em dias mais quentes.
A hematologia e os valores químicos do sangue são similares aos de suínos domésticos. O
sangue venoso é coletado da veia cava anterior, veia jugular ou veia femoral. O volume diário
da urina varia de 2 a 6 litros. A gravidade específica da urina varia de 1,010 a 1,05, com uma
média de 1,012 (Fowler, 1983; Aguirre et al., 2002; Fowler & Miller, 2003).
Os Queixadas são ativos principalmente à noite. Vocalizações consistem de guinchar
ou de grunhidos (Fowler, 1993; Fowler & Miller, 2003).
Têm fama de serem animais agressivos e ferozes, mas na realidade, batem os dentes
como uma das formas para espantar os predadores e alertar os outros membros do bando que
tem perigo próximo. Em condições naturais, são muito aptos a se defenderem dos predadores
naturais e por este motivo a sua caça sempre foi muito valorizada, por mostrar o valor e a
valentia do caçador (Fowler, 1983; Nogueira Filho, 1999; Fowler & Miller, 2003;
Keuroghlian, 2003; Tavares, 2003).
Os Queixadas são poliéstricos anuais, isto é, o comportamento de cópula e o
nascimento dos filhotes ocorrem durante o ano todo, não existindo um sazonalidade na
reprodução. O ciclo estral dura de 17 a 25 dias, com duração média do estro de um a cinco
dias. A ovulação ocorre de 36 a 48 horas após o estro. O estro pode ser induzido entre 39°e
65° dias da lactação pela administração de 700 a 1500 IU de gonadotrofina sérica eqüina. O
período de gestação varia de 142 a 149 dias. Em média nascem de dois a três filhotes. O
período de lactação dura de três a seis meses, dependendo da disponibilidade de oferta de
alimentos (Fowler & Miller, 2003).
A exigência protéica é baixa, em torno de 0,82 grama de nitrogênio por Kg de peso
metabólico ao dia e seu requerimento energético é de 148,5 Kcal/Kg ao dia. Possuem um pré-
9
estômago, semelhante ao rúmen dos bovinos, onde ocorre a fermentação microbiana, que
permite a esses animais o aproveitamento de alimentos volumosos, o que pode reduzir
bastante o custo de sua criação em cativeiro (Comizzoli et al., 1997; Nogueira Filho, 1999).
Em florestas tropicais úmidas e florestas tropicais decíduas, uma grande quantidade de
frutas, sementes e castanhas caem das árvores e constituem os principais alimentos do
Queixada que vive nesses locais (Kiltie, 1981; Bodmer, 1991; Barreto et al., 1997). Grandes
quantidades de larvas de besouros freqüentemente infestam os endocarpos das nozes caídas e
aumentam o valor nutricional deste alimento.
Os Queixadas mastigam as sementes completamente, apenas algumas sementes
minúsculas (ex. Rubiaceae e pequenas Brosimum) escapam da destruição e passam pelo
sistema digestivo sem alteração (Bodmer, 1991). Portanto, os Queixadas são, principalmente
predadores de sementes, em vez de dispersores. Eles dispersam sementes maiores apenas
quando as cospem durante a mastigação (Bodmer, 1991).
Quando comparado ao Cateto, em virtude do maior tamanho, o Queixada consegue
triturar sementes e castanhas mais duras com a mandíbula (Kiltie, 1982). Por exemplo, em
testes de alimentação realizados no Zoológico de Lima, no Peru, Kiltie constatou que os
Catetos não conseguiam triturar e comer castanhas das palmeiras Iriartea ventricosa e
Socratea exorrhia. Entretanto, os Queixadas do mesmo zoológico conseguiam triturar e comer
essas castanhas duras.
Com relação ao forrageamento nas florestas úmidas, Kiltie & Terborgh (1983)
constataram que o Queixada escava os primeiros centrímetros da camada do solo e da camada
humífera utilizando o focinho mais como um arado do que como uma pá. Geralmente vários
animais se movem para frente, ombro a ombro, empurrando a camada humífera para frente.
Os Queixadas raramente fizeram escavações profundas.
10
Na caatinga brasileira, os Queixadas se alimentam principalmente de raízes e
tubérculos, ao invés de frutas. Por exemplo, no Parque Nacional da Serra da Capivara no
Piauí, Olmos (1993) constatou que a dieta do Queixada compreendia 79% de raízes, 6% de
tubérculos, 14% de sementes e 1% de cipós suculentos. Olmos (1993) indica que na caatinga
as raízes e tubérculos são uma fonte de alimento mais confiável do que frutas e folhas, uma
vez que os últimos são produzidos apenas quando há pluviosidade adequada. Durante secas
prolongadas, que ocorrem nessa região, os pecarídeos sobrevivem porque cavam e se
alimentam das raízes e tubérculos.
Na Caatinga, Olmos (1993) constatou uma sobreposição da dieta dos dois pecarídeos,
os Queixadas e os Catetos. Por exemplo, uma árvore abundante, Manihot caerulescens
(Euphorbiaceae), era importante para ambos, pois suas raízes e sementes muito duras
forneciam 33% do alimento dos Queixadas e 21% dos Catetos. Todavia, também constatou
uma separação nos hábitos alimentares. Por exemplo, as raízes de uma das árvores mais
comuns da área, a Thiloa glaucocarpa (Combretaceae), constituía 48% da dieta do Queixada,
mas apenas 7% da dieta do Cateto. Além disso, 53% dos alimentos consumidos pelo Cateto
eram raízes e tubérculos de espécies de plantas de que o Queixada não se alimentava (i.e.
Boerhaavia coccinea Nyctaginaceae, Swarzia flammengii Caesalpinoideae e Pentalostelma sp.
Asclepiadaceae).
Na Amazônia, o Queixada prefere florestas de várzea (Bodmer, 1990). Em ambas
florestas (de várzea e de terra firme), o Queixada freqüenta habitats mais úmidos (Bodmer,
1991). Segundo Bodmer (1990), na Amazônia Peruana os Queixadas que utilizam as florestas
de várzea extensivamente e distribuem-se em grandes extensões, reagem à inundação ao
migrarem para distantes florestas de várzea, porém não alteram a dieta.
11
Geralmente, espécies que habitam áreas de florestas vivem em pequenos grupos ou são
solitárias, ao passo que as espécies de ambientes abertos vivem em grandes grupos. Queixadas
distinguem-se dos demais ungulados neotropicais por formarem grandes grupos, podendo
chegar a centenas de animais (Kiltie & Terborgh, 1983). Isto se mostra como uma das
principais características da espécie ao longo de toda sua área de distribuição geográfica, seja
habitando áreas de floresta tropical úmida, floresta secundária, floresta subtropical seca, áreas
úmidas como o Pantanal e Chaco Paraguaio, semiáridas como a Caatinga, áreas abertas como
as savanas da Venezuela, e até áreas desérticas (Kiltie & Terborgh, 1983; Schaller, 1983;
Mayer & Wetzel, 1987; Bodmer, 1990; Olmos, 1993; Sowls, 1997; Fragoso, 1998; Fragoso,
1999; Margarido, 2001; Carrillo, et al., 2002; Keuroghlian, 2003). No estudo de Jácomo
(2004), realizado na região Parque Nacional das Emas, mostra tamanhos de grupos de
Queixadas variando entre 15 e 150 indivíduos, com um tamanho médio de 83 indivíduos por
grupo. O número de grupos estudados nos permite concluir que este corresponda ao padrão
encontrado para a região. Kiltie & Terborgh (1983) sugerem que, em grandes grupos, os
queixadas são mais eficientes contra os ataques de predadores, em função de uma maior
vigilância dos membros do grupo e também acreditam que animais inexperientes possam
seguir e aprender com os mais velhos a encontrar fontes de alimento, e evitar visitas adicionais
a áreas já super exploradas.
Dados publicados sugerem que, a razão sexual encontrada para o queixada é 1:1 no
nascimento e fase adulta (Fragoso, 1998; Gottdenker e Bodmer, 1998). No entanto, Fragoso
(1998), Margarido (2001) e Keuroghlian, (2003) encontraram razão sexual em animais
adultos, variando de 1,4 a 2,7 fêmeas para cada macho adulto, baseando-se em dados de
captura e observação direta. Na região do PNE, a razão sexual encontrada para os animais
12
adultos, de em média 1.99 fêmeas para cada macho, corrobora as descritas pelos três autores
acima (Jácomo, 2004).
Na região do Parque Nacional das Emas, as menores porcentagens de registros de
filhotes coincidiram com os períodos de menor disponibilidade de recurso (lavoura)
correspondentes aos meses de fevereiro-março e agosto-setembro, períodos entre o ciclo de
safra e safrinha onde ocorrem as colheitas e a diminuição de recurso (Jácomo, 2004). Os
queixadas são considerados bons pais, o motivo pelo qual é recomendado que os filhotes
permaneçam com as fêmeas durante todo o período da lactação (Fowler & Miller, 2003).
As três espécies da Família Tayassuidae têm a destruição de seus habitats e a caça,
como as principais ameaças à sua conservação (Mayer & Wetzel, 1987, Eisenberg, 1989;
Redford, 1992; Peres, 1996; Cullen Jr.,1997; Nogueira Filho & Lavorenti, 1997; Sowls, 1997;
Gottdenker & Bodmer, 1998; Margarido, 2001; Keuroghlian, 2003 e Jácomo, 2004).
Os principais predadores dos pecarídeos são: a onça pintada (Panthera onca), puma ou
suçuarama (Puma concolor) e os seres humanos (Homo sapiens) (Kiltie & Terborgh, 1983). O
cateto apresenta maior tolerância à caça por seres humanos e às alterações do habitat
provocadas pelo homem do que o Queixada e, portanto, sobrevive melhor do que a última
espécie em áreas onde a fixação humana é mais numerosa (Altrichter & Boaglio, 2004).
Apesar de estudos apontarem o queixada como uma das espécies de mamíferos de
grande porte mais ameaçadas da Região Neotropical, em função da caça e destruição de
habitats (Redford, 1992; Peres, 1996; Cullen Jr.,1997; Nogueira Filho & Lavorenti, 1997;
Gottdenker & Bodmer, 1998; Margarido, 2001; Gippoliti & Amori, 2002; Keuroghlian, 2003),
ela não consta na Lista de espécies ameaçadas de extinção do (IBAMA) Instituto Brasileiro do
Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis (IBAMA, 2003). Todavia a espécie é citada
no Apêndice II da (Convenção sobre o Comércio Internacional das espécies da Fauna e flora
13
Selvagem em Perigo de Extinção). No Estado de Minas Gerais é citada como em perigo
(Machado et al., 1998), e na Lista Vermelha de Espécies Ameaçadas no Paraná consta como
vulnerável (Paraná, 1995).
Os queixadas são animais gregários e rústicos que produzem carne e couro de excelente
qualidade, para os quais existe grande demanda internacional. Os principais países
importadores de couro são Itália, Alemanha e França, que o industrializam na forma de artigos
de luxo como calçados finos, carteiras e cintos (Slows, 1984). No Brasil tem-se percebido um
aumento no número de restaurantes que oferecem pratos preparados com carnes de animais
selvagens, como por exemplo, Jacaré, Ema, Capivara, Cateto e o Queixada, devido à grande
procura pela carne destas espécies. Atualmente, essa demanda tem sido atendida através da
caça predatória e ilegal desses animais em vários países Sul-americanos, principalmente no
Brasil (Nogueira Filho & Lavorenti, 1997).
Foram realizados alguns estudos envolvendo o Queixada, como por exemplo: uma
comparação do suprimento arterial do estômago do Queixada com o do Cateto; avaliação da
disgestibilidade do Queixada e Cateto com a utilização de concentrados e fibras em suas
dietas; a relação materno-fetal em Queixadas e Catetos; estudo dos níveis séricos de
progesterona e estradiol e da estrutura do trato genital feminino de Queixadas criadas em
cativeiro; estudo com órgão reprodutor masculino; comparação do ganho de peso de animais
manejados em sistema extensivo (em liberdade) e em sistema semi-extensivo (restritos a uma
área de 15 ha), entre outros (Comizzoli et al.,1997; Cavalcante Filho et al.,1998; Santos &
Miglino, 2000; Mangini, 2000; Figueira et al., 2003; Sonner et al.,2004).
A área de vida de um animal é definida como o espaço ou local onde o mesmo
desenvolve todas as suas atividades normais de forragear, acasalar e criar sua prole (Burt,
1943; Fragoso, 1998; Keuroglian et al., 2004). Os Queixadas são conhecidos por viajarem
14
longas distâncias (Kiltie & Terborgh, 1983; Emmons, 1990; Sowls, 1997). Alguns autores têm
tratado os deslocamentos no contexto de mudanças sazonais, como migratórios (Mendez,
1970; Bodmer, 1990). Outros sugerem que suas movimentações são irregulares ou nômades,
dentro de uma grande área de vida, em função da imprevisibilidade das visitas repetidas na
mesma área (Kiltie & Terborgh, 1983; Peres, 1996). Estudos sobre Queixadas em áreas
contínuas de florestas têm atribuído as suas amplas áreas e seus movimentos, a repostas a
mudanças na disponibilidade e abundância de manchas de frutos (Mendez, 1970; Kiltie &
Terborgh, 1983; Bodmer, 1990; Sowls, 1997). Apesar de sua importância ecológica, há
poucos estudos que descrevem as áreas de vida de queixadas. Kiltie & Terborgh (1983),
estimaram as áreas de vida de grupos de Queixadas, na Amazônia peruana, baseando-se em
taxas de encontros com grupos não marcados entre 6.000 a 20.000 ha. Em um estudo com
queixadas, realizado na Amazônia, utilizando a metodologia do Mínimo Polígono Convexo
(MPC) calculado com 100% das localizações, Fragoso (1998) encontrou áreas de vida de
1.627 (grupo A) e 9.855 hectares (grupo B) com média de 5.741 hectares para os dois grupos.
Outro trabalho com esta mesma espécie conduzido por Carrillo e colaboradores (2002) na
Costa Rica, encontrou uma média de 3.533 hectares de área de vida para um grupo
monitorado em área de floresta. Keuroghlian (2003), trabalhando com Queixadas da Mata
Atlântica, estimou áreas de vida que variaram entre 1.624 a 2.691 hectares (média de 2.095),
para quatro grupos monitorados .
Fragoso (1998) cita que encontrou sobreposição nas áreas de vida entre os dois grupos
monitorados, onde a área de vida de seu grupo B cobriu em 100% a área de vida de seu grupo
A, indicando que eles não mantêm territórios exclusivos. Keuroghlian (2003) também
encontrou sobreposição entre as áreas de vida dos quatro grupos de Queixadas monitorados.
Como exemplo, foi registrada uma sobreposição de área de vida de 6%, utilizando 70% das
15
localizações. Considerando a sazonalidade e utilizando 90% das localizações, foram
registradas 70% de sobreposição na estação seca e 54% na estação chuvosa. Diferentemente
do que foi encontrado por Keuroghlian (2003), as maiores sobreposições de áreas de vida
entre os 13 grupos monitorados na região do PNE (Jácomo, 2004) ocorreram durante a estação
chuvosa, iniciando com 50% de sobreposição para 95% das localizações, e decrescendo para
28, 24 e 10% de sobreposição, utilizando-se 60, 30 e 10% das localizações, respectivamente.
3.2. Biologia da Conservação e Ecologia Molecular
Biologia da Conservação é a ciência que estuda a biodiversidade, o uso e o manejo
sustentável dos recursos naturais. Ela procura entender a distribuição e abundância da fauna e
flora, como esses organismos são mantidos pelos processos naturais e como o homem pode
utilizá-los de maneira sustentável (Solé-Cava, 2001; Primack & Rodrigues, 2001).
Devido ao crescente impacto das atividades humanas, tem-se observado uma
alarmante perda da biodiversidade presente em nosso planeta, causando uma constante
destruição, alteração e fragmentação de ambientes naturais. Para minimizar, ou mesmo
reverter, os efeitos desse processo é necessário envolver iniciativas integradas por campos
diversos como o da economia, política, ciências sociais e muitas áreas das ciências biológicas
(Avise, 1996; Wayne & Morin, 2004). Neste contexto, a Biologia da Conservação, uma
ciência relativamente nova, começou a tomar força no início da década de 1980 (Soulé &
Wilcox, 1980), composta por um variado arranjo de disciplinas, entre as quais se destaca a
biologia de populações, que envolve aspectos ecológicos, demográficos e genéticos, incluindo
tanto estudos empíricos, quanto o desenvolvimento de modelos teóricos (Avise, 1996; Reed &
Frankham, 2003; Spear et al., 2005).
16
O arcabouço teórico da Biologia da Conservação se baseia amplamente nos preceitos
da ecologia, da genética de populações e da genética quantitativa, estando claramente
interligado à Biologia Evolutiva (Futuyma, 2002). O uso de marcadores moleculares no
campo da Biologia da Conservação é hoje extremamente difundido (Avise & Nelson, 1989;
Cotrim & Pais, 1998; Solé-Cava, 2001; Frankham et al. 2003; Beebee & Rowe, 2004), sendo
em grande parte responsável pela recente possibilidade de se estudar populações ameaçadas
em condições naturais (Telles et al., 2003), surgindo daí a denominação de Ecologia
Molecular, que nada mais é que, a área que investiga a variação da herdabilidade e do meio
ambiente entre indivíduos nas populações naturais (Beebee & Rowe, 2004).
A Ecologia Molecular desempenha diversos papéis na conservação, variando desde
estudos de endocruzamento em pequenas populações, até estudos de padrão espacial da
variação genética na natureza, como problemas de fluxo gênico, hibridização e sistemática
(Avise, 1996). O objetivo central da Ecologia Molecular é o estudo da biodiversidade
molecular nas populações naturais das espécies sob impacto antropogênico (Solé-Cava, 2001;
Frankham et al. 2003). A biodiversidade a ser preservada (ultimamente, o objeto de interesse
no estudo da conservação), neste contexto, é a “diversidade genética”, e a magnitude e padrão
desta diversidade pode agora ser examinado em diversos organismos, em níveis hierárquicos
variando desde escalas micro a macroevolutivas (Beebee & Rowe, 2004).
Os dados genéticos empíricos (revelados por técnicas moleculares e outros métodos)
são interpretados usando ferramentas analíticas de genética de populações e sistemática, que
permitem a estimativa de parâmetros que freqüentemente permitem resolver diversas questões,
tais como: níveis de diversidade genética dentro das populações, padrões de escolha do
macho, parentesco e ancestralidade biológica, magnitude de fluxo de gênico entre populações,
níveis de introgressão entre espécies híbridas, natureza de espécies “limites” e
17
relacionamentos filogenéticos entre altos níveis taxonômicos (Avise, 1996). Diversos estudos
têm demonstrado o importante papel da genética na Biologia da Conservação (Avise, 1996;
Sole-Cava, 2001; Frankham et al., 2003; Beebe & Rowe, 2004).
A variabilidade genética, ou seja, a biodiversidade molecular, pode ser usada pelos
ecólogos e sistematas de diversas formas, a fim de se estabelecer estratégias para a
conservação (Sole-Cava, 2001). De acordo com Beebe & Rowe (2004) a estrutura genética de
uma população determina sua capacidade para responder tanto à seleção natural, quanto à
seleção artificial e, portanto, é uma consideração primária na formulação de estratégias de
coleta e conservação da biodiversidade. A estrutura populacional é controlada por vários
fatores tais como a forma de vida, os sistemas reprodutivos e o tamanho efetivo populacional.
Esses fatores geralmente refletem pressões de seleção passadas e toda a natureza da influência
e manutenção da variação genética tanto dentro como entre populações, em alguns casos,
podem mesmo ser sujeitos da determinação genética. Portanto, na conservação da
biodiversidade a base do controle genético da variabilidade é de fundamental importância para
determinar as estratégias mais apropriadas (Sole-Cava, 2001; Frankham et al., 2003; Beebe &
Rowe, 2004).
Assim sendo, um dos objetivos da biologia da conservação é avaliar os níveis de
diversidade existentes e promover a manutenção destes. A variabilidade é um pré-requisito
necessário a qualquer modificação adaptativa e evolução. Estarão em maior risco de extinção,
espécies às quais falte um adequado nível de variabilidade genética. A redução da
variabilidade corresponde a uma diminuição do nível de polimorfismo genético, podendo
constituir o resultado de uma alteração das proporções em que os alelos se repartem pelas
populações de uma população alargada. Em situações extremas e em pequenas populações, a
perda de polimorfismo poderá gerar o fenômeno de depressão endogâmica. Neste caso, o
18
fluxo gênico pode diminuir a perda da adaptabilidade ecológica pré-existente por aumento da
heterozigosidade. A manutenção da variabilidade genética é também essencial nos casos de re-
introdução na natureza ou introdução de espécies em novos habitats e sua evolução adaptativa
(Cotrim & Pais, 1998; Oliveira et al., 2001; Frankham et al., 2003).
Os mecanismos evolucionários determinam a distribuição da variabilidade genética no
tempo e no espaço. Existem basicamente três tipos de implicações desses mecanismos para
uma eficiente conservação. Primeiro, a coleta eficiente de germoplasma diverso para
conservação ex situ depende do conhecimento da distribuição espacial da variabilidade
genética. Inevitavelmente não é possível conhecer a localização exata de cada genótipo. No
entanto, um bom conhecimento dos fatores que controlam a distribuição da variabilidade
genética é necessário para planejar estratégias de coleta que maximizem a variabilidade
amostrada (Frankham et al., 2003). Segundo, em adição a uma construção eficiente de uma
coleção ex situ, a sua manutenção eficiente também do bom entendimento dos fatores que
controlam a distribuição da variabilidade genética, no caso de mudanças genéticas que
ocorrem quando a população é amostrada, subamostrada ou regenerada. Em terceiro, uma
conservação in situ eficiente depende de um bom conhecimento da distribuição da
variabilidade genética no espaço e no tempo e dos fatores que controlam essa distribuição. Em
particular, uma área ou uma rede de áreas de conservação in situ pode ter um tamanho,
heterogeneidade e estrutura que maximizem a variância genética mantida pela evolução. O
alcance eficiente desses objetivos primários requer conhecimento da natureza genética da
variabilidade, da estrutura populacional, da distribuição da variabilidade e dos fatores que as
controlam (Telles et al., 2003; Moreira, 2004)
O objetivo fundamental da conservação de recursos genéticos é a manutenção de
ampla variabilidade genética dentro de cada espécie com um valor potencial conhecido para
19
assegurar a disponibilidade para exploração nas gerações presentes e futuras. Devido aos
processos de erosão genética, há a necessidade de se mensurar o germoplasma conservado de
tal maneira que ocorra perdas mínimas na variabilidade genética da população. Portanto,
conservação implica não somente em minimizar a ação de fatores deletérios através da
alocação de recursos limitados a prioridades definidas, em parte, em função da
disponibilidade, acurácia e precisão de informações em geomorfologia, climatologia,
sistemática, biogeografia, ecologia e evolução, mas também em assegurar a continuidade do
máximo de biodiversidade existente durante períodos evolutivamente mais significativos
(Frankham et al., 2003). Neste sentido, conservação in situ é o método mais eficaz para se
manter intacta a complexa estrutura e dinâmica das interações entre espécies e, em
conseqüência, a continuidade dos processos evolutivos que originam e mantêm a
biodiversidade (Santos-Filho, 1995; Eding & Meuwissen, 2003). Assim, a conservação in situ
proporciona a capacidade para proteger uma gama de recursos genéticos de diferentes espécies
e os processos adaptativos que estão ocorrendo naturalmente nas populações destas espécies.
Assim sendo, a seleção de estratégias de conservação varia dependendo dos objetivos e
prioridades, sendo importantes ambos os meios ex situ e in situ, e mais recentemente in vitro
(Bertolini et al., 1994; Coscione et al., 2001; Lopes et al., 2001; Forell et al., 2004; Rodrigues
et al., 2004; Baptista et al., 2005). Estes meios são considerados complementares e podem
constituir uma parte integral do programa para maximizar a utilização dos recursos genéticos
disponíveis na natureza (Rodrigues & Rodrigues, 2000; Primack & Rodrigues, 2001; Beebe &
Rowe, 2004). Além da aplicação na determinação de tamanho de áreas necessárias para
conservação in situ, o conhecimento da estrutura genética das populações naturais tem grande
impacto na determinação de estratégias de amostragem. Através do conhecimento dos padrões
de variabilidade genética das populações podem-se formular as melhores estratégias de
20
amostragem de modo a maximizar a variabilidade genética a ser coletada. Para a maioria das
espécies, entretanto, esse tipo de conhecimento ainda não está disponível. Muitas espécies
exibem variação geográfica extensiva e, sobreposta a essa variação, existe a variação dentro de
populações. A variação dentro de populações, especialmente em nível local, depende da
interação entre o sistema de cruzamento da espécie e as forças pelas quais a variação é
mantida. Então, os métodos de amostragem podem ser utilizados para assegurar que uma
coleção seja representativa da variação que ocorre dentro de populações, bem como dos
padrões de variação geográfica associados (Primack & Rodrigues, 2001; Diniz-Filho & Telles,
2002)
A conservação da variabilidade genética tem sido uma preocupação mundial durante
as últimas décadas, devido aos elevados níveis de erosão genética que vem ocorrendo na
natureza e nos bancos de germoplasma. Ao mesmo tempo, as modernas tecnologias
apresentam um cenário com potencial capaz de oferecer retornos sócio-econômicos para a
sociedade. Porém, existe uma série de barreiras a serem superadas tanto para conservar
adequadamente quanto para utilizar a variação genética existente. Para tanto é importante
considerar na organização de coleções de germoplasma que: a) as mesmas devem possuir o
máximo da diversidade genética existente. b) os procedimentos de coleta e de conservação do
germoplasma devem ser estruturados sob um enfoque genético-ecológico e, c) as amostras
populacionais utilizadas para coleta e regeneração do germoplasma devem ser estabelecidas
considerando-se o tamanho efetivo populacional e a frequência alélica (Primack & Rodrigues,
2001) .
As estratégias mais recentes de conservação in situ centram-se no objetivo de definir
um tamanho de população mínima viável (MVP). Este valor indica quais populações
necessitam de medidas de conservação para assegurar a sobrevivência em longo prazo
21
(Primack & Rodrigues, 2001). O tamanho de uma população mínima viável para os propósitos
de conservação pode ser definido através de análises de viabilidade populacional (PVA). Estas
análises são usadas para definir, dado à suposição de um risco máximo a ser tolerado, a
população mínima viável, através de análises determinísticas e estocásticas. Neste sentido,
uma série de populações mínimas viáveis considerando diferentes cenários e suposições
alternativos pode ser útil por proporcionar alvos para manejo e focalizarem esforços em
populações potencialmente viáveis (Boyce, 1992; Brook et al., 2000; Primack & Rodrigues,
2001; Akçakaya, 2002; Brook et al., 2002). O tamanho de uma população mínima viável
depende de vários fatores tais como o sistema de cruzamento, ecologia e a habilidade de
propagação e usualmente considera-se que varia entre 50 e 2500 indivíduos (Brook et al.,
2000; Primack & Rodrigues, 2001; Akçakaya, 2002).
A fragmentação de ecossistemas é um dos problemas cruciais em conservação no
Brasil. A destruição, alteração, e fragmentação antropogênica de habitats estão causando uma
taxa de extinção global da ordem de 10
4
espécies por ano (Santos-Filho, 1995). Tão extensa é
a destruição de habitats que há suspeita de que processos evolutivos estejam alterados de
forma irreversível, suspensos temporariamente e até mesmo cessando (Myers et al., 2000). A
conservação in situ é um método mais eficaz para se manter intactas a complexa estrutura e
dinâmica das interações entre as espécies e, em conseqüência, a continuidade dos processos
evolutivos que originam e mantém a biodiversidade (Forman & Godron, 1981; Godinho &
Godinho, 1994; Santos-Filho, 1995). A fragmentação de habitats produz três efeitos:
modificações geomorfoclimáticas em várias escalas, destruição de indivíduos e subdivisão de
populações. A ação antrópica tem sido bastante intensa no Cerrado. O pastoreio, as práticas de
queimadas, as carvoarias, os assentamentos urbanos e especialmente a conversão de Cerrado
em área de agricultura, estão reduzindo drasticamente a vegetação nativa nestas unidades
22
(Santos-Filho, 1995; Klink & Machado, 2005). Viana (1995) diz que este processo de
fragmentação deu origem a fragmentos de diferentes áreas, formas, graus de isolamento, tipos
de vizinhança e histórias de perturbação. Este autor define fragmento como qualquer área de
vegetação natural contínua, interrompida por barreiras antrópicas (estradas, culturas agrícolas,
etc.) ou naturais (lagos, outras formações vegetais, etc.) capazes de diminuir
significativamente o fluxo de animais, pólen e/ou sementes. O tamanho, forma, grau de
isolamento, tipo de vizinhança e histórico de perturbações são fatores que afetam a diversidade
biológica e a sustentabilidade dos fragmentos.
É preciso entender a dinâmica das populações nos fragmentos e sua interação com os
elementos da paisagem para que as práticas de manejo e conservação sejam eficientes. Por
enquanto, sabe-se pouco sobre o impacto causado pela fragmentação sobre a variabiliade
genética natural das espécies silvestres. Alguns trabalhos têm mostrado que a fragmentação de
habitats, provoca uma redução no tamanho da população (Hansson & Richardson, 2005;
Woodroffe & Frank, 2005).
A fragmentação de habitat pode causar a perda da variação genética populacional de
duas maneiras. Primeiramente, a brusca redução do tamanho populacional (bottlenecks), pode
resultar em uma perda de alelos de baixa freqüência, devido aos indivíduos remanescentes
conter apenas uma pequena amostra do “pool” gênico original (Wayne & Morin, 2004; Louis
et al., 2005). A extensão no qual isto ocorrerá depende da extensão da perda do cerrado e da
estrutura genética das populações naturais presente no momento da fragmentação, a imediata
perda na heterozigosidade será evidente apenas se o tamanho populacional apresentar uma
grande redução (Louis et al., 2005). Após a perda alélica inicial, as populações remanescentes,
que permanecem isoladas e com reduzido fluxo gênico por várias gerações, continuam a
23
perder alelos devido à deriva genética e à endogamia, reduzindo a diversidade genética nos
fragmentos (Wayne & Morin, 2004; Louis et al., 2005).
Hansson & Richardson (2005), mostraram que um grande número de populações
selvagens apresentaram uma associação positiva entre o tamanho efetivo da população e a
variação genética, com o aumento da porcentagem de locos polimórficos, do número de alelos
e heterozigosidade em populações maiores. Outros trabalhos têm mostrado que a
fragmentação provoca a redução significativa da riqueza alélica, mas não detectam uma
diminuição na heterozigosidade (White et al., 1999). Isso provavelmente deve-se ao fato de
que alelos com frequências moderadas contribuem mais na determinação da heterozigosidade
que os alelos de baixas frequências, sendo estes os mais propícios a serem perdidos em
populações pequenas (White et al., 1999; Ruiz-Garcia, 1997). Outros estudos revelaram que
os efeitos da redução na variação genética em função da redução no tamanho populacional e
isolamento populacional, em 3 espécies devem-se mais ao efeito “bottlenecks” do que a deriva
genética (Myers et al., 2000). O efeito “bottlenecks” contribui para a perda de alelos,
especialmente os raros (ou de baixa frequência), e isto é muito mais efetivo que a perda de
heterozigosidade (Beebe & Rowe, 2004).
A perda da diversidade genética tem implicações quanto à persistência de espécies e
populações. Com baixos níveis de variação genética, elas tornam-se vulneráveis a extinção
devido a fatores estocásticos e a redução da adaptação (fitness), que diminui a capacidade das
espécies em responder adaptativamente as mudanças ambientais futuras (Frankhan, 1996;
Wayne & Morin, 2004).
Uma outra consequência da fragmentação em relação à variabilidade genética é que as
espécies têm sua sobrevivência comprometida devido a alterações nos padrões de trocas de
genes. Beebe & Rowe (2004) afirma que a entrada constante e alta de genes em uma
24
população através do fluxo gênico é o fator mais importante na manutenção da coesão
genética entre as populações de uma espécie. A redução do fluxo gênico devido ao aumento
do grau de isolamento entre populações pequenas provoca a divergência genética entre elas
(Cockerham, 1969; Beebe & Rowe, 2004). O isolamento age negativamente na riqueza ao
diminuir a taxa ou o potencial de imigração ou de colonização, e depende das distâncias e das
áreas de todos os fragmentos vizinhos, do arranjo espacial dos fragmentos de habitat, assim
como das características do ambiente entre os fragmentos. Em programas de conservação e
manejo de populações é importante conhecer as variações de diversidade genética e do fluxo
gênico em populações causadas por fatores ecológicos e antrópicos (Wayne & Morin, 2004;
Ruiz-Garcia et al., 1997; Stow & Briscoe, 2005).
3.3 Marcadores RAPD em estudos populacionais com animais
A utilização de marcadores genéticos é uma ferramenta com imenso potencial, tanto
para pesquisa básica ou para caracterização de populações e preservação de recursos
genéticos, quanto para técnicas aplicadas ao melhoramento e sanidade animal (Ferreira &
Grattapaglia, 1998).
A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da polimerase) foi
desenvolvida por Kary Mullis, nos anos 80 . Tal método permite a amplificação in vitro de
milhões de cópias de um segmento específico de DNA, usando-se oligonucleotídeos que
hibridizam com as fitas complementares de DNA, em regiões que flanqueiam o segmento a
ser amplificado (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Baseado na técnica de PCR, foi proposto por diferentes laboratórios
independentemente (Welsh & Mccleland et al., 1990; Willians et al., 1990; Caetano-Anólles,
1991), uma metodologia que ficou mais conhecida como RAPD (Random Amplified
25
Polymorphic DNA). Esta variação da técnica de PCR, também foi chamada de AP-PCR
(arbitrarily primed polymerase chain reaction) e DAF (DNA amplification fingerprinting) e
permite a detecção de seqüências polimórficas no genoma, em ensaios de amplificação de
DNA, usando oligonucleotídeos (iniciadores) de seqüência arbitrária . A metodologia
requerida nos estudos dos marcadores RAPD é altamente sensível, rápida, de baixo custo e
pouco intensiva em mão-de-obra, fornecendo uma poderosa ferramenta para investigação da
variação genética (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Além disso, permite a detecção de qualquer
alteração do DNA e elimina a necessidade de conhecimento prévio do genoma a ser estudado.
Na reação em questão um único oligonucleotídeo de seqüência arbitrária, liga-se ao DNA
genômico em locais diferentes nas fitas opostas do DNA molde. Com a ligação do
oligonucleotídeo novas fitas de DNA são então amplificadas. É um método simples, eficiente
e abriu uma perspectiva inteiramente nova para a análise de estrutura genética de indivíduos e
populações (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Entretanto, o RAPD também tem limitações significantes quando comparados com
marcadores codominantes. Os marcadores RAPD possuem caráter dominante, limitando seu
uso na estimação de parâmetros genéticos, além de apresentar problemas de reprodutibilidade
(Ferreira & Grattapaglia, 1998)
A técnica de RAPD é altamente acessível, pois democratizou a utilização de
marcadores moleculares em análise genética, particularmente no âmbito da análise de variação
genética. Apresenta um bom conteúdo informativo devido à sua alta capacidade em amostrar o
genoma em vários locos ao mesmo tempo. Esses fatores, conferem à técnica uma boa
aceitação para análises relacionadas à diferenciação de linhagens, estimativa da variabilidade
em banco de germoplasma, estudo de estrutura genética de populações, identificação de
variedades, acompanhamento de populações segregantes, geração de dendrogramas de
26
parentescos filogenéticos, análise da estrutura e diversidade genética em populações naturais,
construção de mapas genéticos, localização de genes de interesse, estimativa de parâmetros
genéticos, dentre outros (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
A análise de DNA, utilizando-se marcadores RAPD, tem sido utilizada por inúmeros
estudos relacionados a diferentes espécies animais (Beebee & Rowe, 2004). Para exemplificar,
a técnica tem sido utilizada na determinação do sexo (Rodrigues & Rodrigues, 2000), na
identificação de animais (Moreira, 2004), em estudos de variabilidade e diversidade genética
em populações (Telles et al., 2001; Telles et al., 2003; Moreira, 2004 ; Godoy et al., 2005,
Telles, 2005), no mapeamento genômico (Oliveira et al., 2001) e no monitoramento de
espécies em extinção (Wasko et al., 2004; Oliveira et al., 2001, Rodrigues, 2005).
27
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Caracterização da área de estudo
O Parque Nacional das Emas (PNE) foi criado pelo Decreto n° 49874 de 11 de Janeiro
de 1961, assinado pelo então pelo Presidente da República Juscelino Kubitschek, com o
objetivo de proteger uma amostra representativa do bioma Cerrado (Figura 2). Localiza-se no
sudoeste do Estado de Goiás, e ocupa uma área de 131.800 ha, nos limites entre os Estados do
Mato Grosso e Mato Grosso do Sul a 180° 19’S e 520° 45’ W, numa das regiões de maior
produção agrícola do Estado .Os limites do Parque coincidem com os divisores de águas das
Bacias Araguaia-Tocantins, do Paraná, e do Paraguai. Sua altitude varia de 650 a 1000m e
possui uma fisiografia determinada pela rede de drenagem dos rios Jacuba e Formoso, que
correm para a Bacia do rio Prata. A região possui duas estações climáticas bem definidas:
quente e chuvosa, entre outubro e março, e fria e seca de abril a setembro, quando as
temperaturas podem atingir a marca dos 0ºC e, em tal circunstância, é comum a ocorrência de
geadas (IBAMA, 2003). O Parque é conhecido pela abundância e diversidade de fauna de
grandes mamíferos (MMA, 1998).
A denominação de Parque Nacional das Emas é decorrente da presença, na região, de
grande quantidade dessas aves (Rhea americana). Sua área protege populações de pelo menos
16 espécies de mamíferos ameaçadas de extinção, entre elas a onça-pintada (Panthera onca), o
cervo-do-pantanal (Blastocerus dichotomus), cachorro-vinagre (Speothos venaticus) e o lobo-
guará (Chrysocyon brachyurus), e espécies com alto potencial cinegético, como o queixada
(Tayassu pecari), o cateto (T. tajacu) e a anta (Tapirus terrestris) ( IBAMA, 2003; Jácomo,
2004).
28
Figura 2. Parque Nacional das Emas
Fonte: Amadeusturismo(2005)
Em sua extensão são identificados dez tipos de habitats: mata ciliar, campo úmido,
campo de murunduns, vereda, mata mesofítica de interflúvio, campo limpo, campo sujo,
campo cerrado, cerrado “strictu sensu ”, e cerradão (MMA, 1998). Sua drenagem é formada
pelos rios Jacuba, Formoso e seus afluentes. Apesar de sua área representar um dos últimos
grandes refúgios de cerrado de campos das chapadas, seu entorno, em contraste, representa
uma das mais produtivas áreas de agricultura do País, desde a década de 70. A partir desta
29
década, com os incentivos do Governo Federal aos Programas de expansão agrícola
(POLOCENTRO), a região foi colonizada por produtores rurais, em sua maioria, vindos do
sul do Brasil, para desenvolverem atividades de agricultura e pecuária (MMA, 1998).
O cerrado original local foi rapidamente substituído por extensas áreas de lavoura e
pastagem, obrigando a fauna nativa remanescente a se ajustar à fragmentação de seus habitats
naturais e, ao mesmo tempo, a recursos alimentares exóticos como o milho e a soja. As
propriedades rurais que fazem limites com o Parque são constituídas de latifúndios compostos
por extensas áreas planas, hoje exaustivamente utilizadas para o cultivo de grãos, e áreas de
furnas, representadas por um mosaico de manchas de cerrado e pastagem, utilizadas para a
criação extensiva de gado (MMA, 1998; Jácomo, 2004).
4.2.Obtenção dos dados moleculares
4.2.1. Coleta do Material biológico
Captura dos animais e coleta de sangue
Os Queixadas foram capturados pela equipe de pesquisadores do PNE, utilizando-se
chiqueiros de tela de alambrado (25m lineares), com postes de eucalipto e gaiolas de ferro.
Antes da construção dos chiqueiros as áreas eram previamente identificadas como áreas que
eram utilizadas pela espécie. Os locais foram cevados, com sal e milho, até o condicionamento
do grupo ao local. A fim de se aumentar a eficiência de captura, cada chiqueiro teve duas
portas tipo guilhotina em extremidades opostas armadas de forma a se desarmarem
simultaneamente.
30
Os chiqueiros foram cevados com sal branco e milho e vistoriados diariamente para a
confirmação de captura e reposição de milho e sal. Oito chiqueiros foram construídos em
propriedades rurais do entorno do PNE (região do Araguaia) e quatro dentro da reserva
(regiões do Jacuba, Glória e Formoso) . Os esforços de captura foram somados utilizando-se
gaiolas de ferro próximas às áreas de lavouras de milho que estavam sendo utilizadas pelos
queixadas. As gaiolas também foram cevadas com milho e sal.
Indivíduos de Queixadas de grupos distintos na região do Parque Nacional das Emas
foram capturados para o levantamento de dados sobre a composição do grupo (tamanho, razão
sexual, estágio etário (baseado em coloração da pelagem e tamanho), marcação dos animais
com brincos (cores diferentes por grupos, machos marcados nas orelhas esquerdas e fêmeas
nas orelhas direitas), coleta de dados biométricos e monitoramento por radiotelemetria
(Jácomo, 2004).
Os Queixadas foram capturados com o auxílio de puçás de contenção e foram
anestesiados, utilizando-se seringas descartáveis contendo Tiletamina + Zolazepan (Zoletil ®).
Dos animais capturados foram coletados sangue com o auxílio de um vacouteiner contendo
EDTA. Depois de coletado o sangue foi acondicionado em um volume igual de um tampão
denominado Easy Blood, a fim de auxiliar na conservação do material até chegar ao
laboratório para a extração do DNA.
4.2.1. Extração do DNA e análise com os primers RAPD
A coleta de dados moleculares do presente estudo foi realizada no Laboratório de
Genética e Melhoramento do Departamento de Zootecnia/ITS da Universidade Católica de
Goiás (UCG).
31
O DNA foi extraído do sangue de 208 indivíduos de Tayassu pecari utilizando o kit de
purificação de DNA GFX fornecido pela Amersham pharmacia biotch (Apêndice 1). Após a
extração, o DNA foi quantificado a fim de determinar a quantidade a ser usada nas reações de
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). Para a quantificação, utilizou-se 3 µl de DNA e 3 µl
do marcador Low DNA Mass (Fornecido pela GIBO BRL) com 3 µl de tampão de
carregamento em todas as amostras, determinando a quantidade de DNA e a diluição ideal
para uso. Estes DNA’s foram submetidos à eletroforese horizontal, utilizando-se gel de
agarose 1% com tampão de corrida TBE 0,5X, e o DNA corado com brometo de etídeo para
serem visualizados com transiluminador de luz ultravioleta. Em seguida, os géis foram
fotografados para posterior análise, com o auxílio do fotodocumentador KODAK EDAS 120.
Dos 208 indivíduos coletados, foram utilizados os DNA’s de 182 distribuídos em 8
bandos, cuja informação sobre as suas áreas de vida foi disponibilizada pelos pesquisadores do
PNE. A partir dessas amostras de DNA foram processadas as amplificações de 10 dos onze
primers previamente selecionados do marcador RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA) para Tayassu pecari por Telles et al. (2003).
As reações de PCR para um sistema com o volume final de 20µl foram montadas da
seguinte forma: 3µl de DNA (~3ng/µl); 1,5µl de primer (~10ng/µl); 2,6µl tampão da enzima
(10X); 0,78µl de MgCl
2
(50mM); 2,08µl de d’NTP (2,5mM); 0,2µl da enzima Taq-
Polimerase (5 unidades/µl - fornecida pela Amersham Pharmacia Biotech
) e completando o
volume com 9,84µl de H
2
O Milli-Q. A amplificação dos fragmentos de DNA via reação em
cadeia da polimerase (PCR), no termociclador MJ, foi feita utilizado um programa com os
seguintes passos: (1º) desnaturação do DNA a 94ºC por 2 minutos e (2º) a 92ºC por 1 minuto e
30 segundos; (3º) anelamento do primer a 37ºC por 1 minuto; extensão da molécula pela
32
enzima Taq polimerase a 72ºC por 2 minutos e 30 segundos; (5º) 40 ciclos seguindo do 2º ao
4º passo; (6º) passo final de extensão de 5 minutos a 72ºC para finalizar os produtos
amplificados.
Os fragmentos de DNA obtidos (bandas), para os 10 primers nos 8 bandos, foram
analisados pela técnica de eletroforese em gel de agarose 1,5% com a utilização de um tampão
TBE (Tris Borato EDTA – 1X) e, em seguida, corados com brometo de etídio, visualizados
com o auxílio de um transiluminador de luz ultravioleta e fotografados para as análises
posteriores (Ferreira & Grattapaglia 1998). Os géis foram codificados considerando a presença
(1) e ausência (0) da banda em cada amostra, nos diferentes locos de cada primer.
4.3. Análise dos dados
4.3.1 Variabilidade genética dentro e entre bandos de queixada
Os dados binários (presença ou ausência de bandas nos indivíduos) obtidos a partir do
RAPD foram utilizados para estimar as freqüências alélicas, com base na metodologia
proposta por Lynch & Milligan (1994). Essa metodologia é a teoria matemática desenvolvida
para estimar parâmetros populacionais a partir de dados de RAPD que parte de dois
pressupostos básicos: 1) as bandas são inequivocadamente identificadas no gel e cada banda
pode ser associada a um loco com dois alelos, sendo que o caráter “dominante” do marcador
impede a distinção entre os genótipos heterozigoto e homozigoto “dominante”. 2) As
populações devem estar em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A partir desses parâmetros, a
freqüência do alelo “nulo” q
ˆ
, pode ser estimada por:
1
2
21
ˆ
8
)
ˆ
(
1
ˆˆ
−
−=
x
xVar
xq ,
33
onde x
ˆ
é a proporção dos N indivíduos analisados na população que não apresentam
banda para o locos, sendo
(
)
N
xx
xVar
ˆ
1
ˆ
)
ˆ
(
−
= .
Essa correção minimiza o viés na estimativa de “q” devido a tamanhos amostrais
pequenos, mas pode ser grande se o alelo for raro (x < 0,1). Assim, Lynch & Milligan (1994)
recomendam que o valor de q
ˆ
seja obtido apenas para x > 1-(3/N), que é o caso da maior
parte das bandas nos bandos de Queixada. As freqüências alélicas foram então utilizadas para
o cálculo das medidas de variabilidade para cada população, conforme sugerido por Alfenas et
al. (1991, 1998) e Weir (1996).
A avaliação da estruturação da variabilidade genética foi realizada com base na
Análise de Variância Molecular (AMOVA) (Excoffier et al., 1992), que permite desdobrar a
distância entre e dentro de bandos, utilizando uma estratégia semelhante à realizada na
ANOVA convencional, mas parte de uma matriz de distância euclidiana calculada entre
indivíduos com base na presença e ausência das bandas RAPD. Indivíduos podem também ser
agrupados, de acordo com estes critérios não genéticos tal como geográficos, ecológicos e
ambientais. O modelo matemático, apropriado para análise é dado por
)(ijiij
xX
β
α
+
+
=
onde,
x = constante do modelo
α = é o efeito da população com variância ,
2
α
σ
β = é o efeito do indivíduo com variância ,
2
β
σ
34
Note-se que os efeitos são hierarquizados. A análise de variância obedece ao esquema
da Tabela 1.
Tabela 1. Esperanças matemáticas dos quadrados médios [E(QM)] para populações (P),
indivíduos dentro populações (I/P), conforme Excoffier et al. (1992).
Fonte de Variação Grau de liberdade SQ
1
QM
1
E(QM)
Populações (Bandos) (P)
P - 1 S
a
Q
a
22
2
ab
σσ
+
Indivíduo (I)/P N - P S
b
Q
b
2
b
σ
Total N - 1 S
T
O componente de variância inter-populacional é extraído por equações das esperanças
de quadrado médio (QMD), conforme a análise de variância convencional das freqüências
alélicas, utilizadas para estimar o F
ST
(Cockerham 1969, 1973). O mesmo procedimento pode
ser empregado com base no desdobramento da soma de quadrado entre as distâncias,
utilizando as chamadas estatísticas-Φ. Neste caso, ;
222
ba
σσσ
+=
ST
Φ é interpretado como a
correlação de haplótipos aleatórios dentro de populações, relativo a cada par aleatório de
haplótipos puxado do total da espécie. Como na ANOVA convencional, pode-se reescrever
essas equações em termos das estatísticas
Φ
entre as populações locais, de modo que:
,
22
2
ba
a
ST
σσ
σ
+
=Φ
Para obter uma distribuição nula dessas estatísticas, foram utilizados procedimentos de
aleatorização, por permutações aleatórias das fileiras (e colunas correspondentes) da matriz de
distâncias quadráticas (Mantel, 1967). Os componentes de variância foram estimados para
cada uma das matrizes permutadas (cerca de 5000 permutações).
35
Os valores obtidos nas estimativas de avaliação da estruturação da variabilidade
genética fornecem um método indireto para se calcular o fluxo gênico entre os bandos, que foi
proposto por Slatikin (1995). Essa propriedade só é valida em populações em equilíbrio
quanto à endogamia. Sob equilíbrio, a proporção m de migrantes ou o seu número, Nm,
podem ser estimados a partir das seguintes equações:
4.3.2. Divergência genética e padrão espacial
A divergência genética entre os bandos foi avaliada com base na matriz de distância
genética obtida pela AMOVA, uma metodologia de análise desenvolvida para marcadores
dominantes como o RAPD, que é a que apresenta um menor número de pressupostos em
relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, tamanho amostral e padrão de herança do marcador.
Após a estimativa da divergência genética, vários métodos multivariados podem ser aplicados.
Neste estudo, a matriz de distâncias genéticas foi analisada, inicialmente, a partir de uma
análise de agrupamento tipo UPGMA (unweighted pair-group method by arithmetic
averages), que produz um arranjo hierárquico de classificação dos bandos, representado por
um dendrograma. A representatividade deste dendrograma foi testada por meio da correlação
entre as distâncias genéticas originais e as distâncias entre os bandos no dendrograma
(correlação cofenética).
Apesar de o agrupamento pelo método do UPGMA ser uma das técnicas mais
utilizadas neste tipo de estudo, ele tem sido criticado baseado no fato de que os processos
evolutivos nem sempre produzem um padrão hierárquico de variação ao nível de população
( )
Nm41
1
F
ST
+
=
−= 1
F
1
4
1
Nm
ST
36
(Lessa, 1990; Rodrigues & Diniz-Filho, 1998). Este tipo de agrupamento hierárquico pode não
representar adequadamente as distâncias genéticas, indicando um falso arranjo hierárquico
entre os bandos, quando existe entre eles, de fato, um padrão contínuo ou reticulado.
Em função desses problemas, as distâncias genéticas também foram analisadas por
uma técnica de ordenação que visa representar graficamente a dissimilaridade entre as
populações. Segundo Lessa (1990) a técnica mais apropriada para este tipo de trabalho é o
escalonamento multidimensional não-métrico (non-metric multidimensional scaling). Esta
técnica parte de uma configuração inicial de pontos (populações) alocados ao acaso em um
número reduzido de dimensões, normalmente 2-D ou 3-D. Com base na distribuição ao acaso
das populações são calculadas novas distâncias e estas são comparadas com as distâncias
genéticas originais, através de um procedimento iterativo, com o objetivo de minimizar as
diferenças entre as matrizes. A configuração inicial pode ser aleatória, definindo para cada
população um par ordenado X, Y de números aleatórios, ou baseada em escores de outras
análises multivariadas, tais como uma análise de componentes principais. Essa minimização é
mensurada, ao longo do processo iterativo, por uma estatística denominada estresse (S)
(Kruskall, 1964), dado por:
(
)
( )
∑
∑
−
−
=
2
**
2
*
ˆ
ijij
ijij
dd
dd
S
onde
*
ij
d são as distâncias entre os bandos no espaço de dimensão reduzida,
ij
d
ˆ
são
as distâncias esperadas por um modelo de regressão monotônica das distâncias no espaço
de dimensão reduzida sobre as distâncias originais,
*
ij
d é a distância média no espaço de
dimensão reduzida. O somatório é feito ao longo dos pares i, j, mas com i < j. Quanto mais
37
próximo de zero for o valor de S, menor a distorção e, portanto, melhor a
representatividade das distâncias genéticas. Neste estudo, a matriz inicial de distâncias
entre os bandos foi estabelecida em um espaço de duas dimensões, definidas
aleatoriamente.
A fim de se analisar os padrões de variação espacial em um contexto multivariado,
foi inicialmente feita a estimativa do coeficiente de correlação de Pearson (r) entre as
matrizes de distâncias genéticas e as distâncias geográficas entre as populações. O
estimador do coeficiente de correlação simples (Epperson, 2003), no caso entre duas
matrizes X e Y, é dado por:
∑∑
∑
==
=
=
n
ji
ij
n
ji
ij
n
ji
ijij
yx
yx
r
1,
2
1,
2
1,
onde XXx
ijij
−= e YYy
ijij
−= . A significância dessa correlação matricial não
pode ser testada pelos testes estatísticos usuais, por apresentar problemas de independência
entre os elementos nas matrizes. Nesse sentido, a estatística Z de Mantel (1967) tem sido
freqüentemente utilizada, a fim de se testar a significância da associação entre matrizes
contendo diferentes tipos de distâncias entre pares de observações (Smouse et al., 1986;
Manly, 1997). O valor Z de Mantel é dado por:
∑
=
=
n
1j,i
ijij
YXZ
38
onde
ij
X e
ij
Y são elementos das matrizes X e Y a serem comparadas (no caso, as
matrizes de distância geográfica e genética, respectivamente). A significância do Z pode ser
obtida comparando-se esse valor observado com valores de uma distribuição nula, construída
recalculando-se os valores de Z diversas vezes, aleatorizando, em cada uma delas, a ordem dos
elementos de uma das matrizes (Manly, 1997). A estatística Z possui uma relação monotônica
com o r de Pearson calculado entre matrizes (correlação matricial), de modo que ela pode ser
utilizada para testar a significância de r (Manly, 1986). Neste trabalho, 5000 permutações
aleatórias foram utilizadas para se testar a significância das correlações matriciais.
As correlações matriciais e o teste de Mantel foram também utilizados para avaliar o
padrão multivariado de estrutura espacial entre os bandos. Foram calculados coeficientes de
correlação matricial entre as distâncias genéticas e 4 matrizes de conectividade espacial, com
valor 1,00 indicando pares de populações “ligadas”, se a distância geográfica entre elas se
encontra em cada uma das classes de distância previamente definidas. Essas classes de
distância geográfica foram estabelecidas de modo a manter o mesmo número de conexões
entre bandos e os seus limites superiores foram (1ª classe 18km; 2ª classe 28,5km; 3ª classe
40km e 4ª classe 49km). Assim, é possível relacionar o coeficiente de correlação matricial,
cuja significância foi estabelecida pelo teste de Mantel, com o aumento das distâncias
geográficas, gerando assim um correlograma multivariado (Sokal et al., 1986).
39
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização da variabilidade genética dentro e entre bandos de queixada
Foi extraído o DNA de 208 indivíduos de Tayassu pecari, distribuídos em 14 bandos.
Em alguns casos, não foi possível alocar com segurança o indivíduo ao bando, ou um número
pequeno de indivíduos foi analisada para um bando (n < 5), de modo que as análises genéticas
foram realizadas para um total de 182 indivíduos, distribuídos em 8 bandos. De uma maneira
geral, os bandos de Queixada apresentaram uma considerável variabilidade genética para os
dez primers de RAPD utilizados (Apêndice 2). O número de locos, por primer, variou entre 3
e 27, totalizando 129 locos nos oito bandos (Tabela 2). As Figuras 3, 4 e 5 exemplificam o
padrão perfil de amplificação dos locos RAPD nos bandos de Tayassu pecari, utilizando-se os
primers OPC-06, OPC-08 e OPC -11 respectivamente.
Tabela 2. Relação dos primers, suas seqüências de bases e o número de locos (NL), obtidos
nos oito bandos de Tayassu pecari.
Primer sequencia 5' para 3' NL
A-01 C
A
G
G
C
C
C
T T
C
3
A-08 G
T
G
A
C
G
T A
G
G
7
A-18 A
G
G
T G
A
C
C
G
T
4
C-04 C
C
G
C
A
T
C
T A
C
21
C-06 G
A
A
C
G
G
A
C
T
C
14
C-08 T G
G
A
C
C
G
G
T
G
14
C-10 T G
T
C
T G
G
G
T
G
16
C-11 A
A
A
G
C
T
G
C
G
G
17
C-16 C
A
C
A
C
T
C
C
A
G
27
C-18 T G
A
G
T G
G
G
T
G
6
Total 129
40
Figura 3. Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o primer OPC-
06 com alguns indivíduos do bando de Tayassu pecari. As colunas M 100bp,
indicam o marcador de peso molecular (100 bp ladder, Pharmacia).
Figura 4 - Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
primer OPC-08 com alguns indivíduos do bando de Tayassu pecari. As
colunas M 100bp, indicam o marcador de peso molecular (100 bp
ladder, Pharmacia).
800 bp
1400 bp
500 bp
800 bp
1400 bp
500 bp
800 bp
1400 bp
500 bp
800 bp
1400 bp
500 bp
41
Figura 5 - Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o primer OPC-
11 com alguns indivíduos do bando de Tayassu pecari. As colunas M 100bp,
indicam o marcador de peso molecular (100 bp ladder, Pharmacia).
A proporção de locos polimórficos variou entre 37% e 78% nos bandos, com um valor
global de 88%. A diversidade genética ou heterozigose esperada apresentou um valor
mediano, variando de 0,12 a 0,22 entre os bandos, com um valor global de 0,223 (Tabela 3). A
diversidade de Nei (1978), quando se considera todos os locos nos 182 indivíduos variou entre
0 e 0,5 (Figura 6). Antunes et al. (2006) realizou um trabalho com pacas, utilizando
marcadores RAPD, e obteve valores de He de cerca de 0,11, sugerindo que estes bandos ainda
possui uma considerável variabilidade genética que deve ser conservada, valores estes
próximos ao presente estudo.
800 bp
1400 bp
500 bp
1400 bp
800 bp
500 bp
42
Tabela 3. Relação da Diversidade genética de Nei (He), número de locos polimórficos (NLP)
e porcentagem de locos polimórficos (%LP), por bando de Tayassu pecari.
População He (Nei) NLP %LP
1 0,2266 101 78,2946
2 0,1993 99 76,7442
3 0,2053 87 67,4419
4 0,2178 92 71,3178
5 0,2054 93 72,0930
6 0,2015 89 68,9922
7 0,1383 49 37,9845
8 0,1268 48 37,2093
Geral 0,2234 114 88,3721
Diversidade (He) por loco
Número de observações
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Figura 6. Distribuição dos valores de He dos 129 locos analisados nos bandos de Tayassu
pecari.
43
A análise de variância molecular (AMOVA) quando realizada considerando todos os
locos mostrou que, de fato, existe uma forte estruturação da variabilidade genética nos bandos,
com um
ST
Φ
igual a 0,1104, significativo ao nível de 1% através de 10000 permutações
aleatórias, como encontrado em alguns estudos (Antunes et al., 2006; Godoy et al.,2005;
Telles et al., 2003; Telles, 2005). No estudo com três bandos de queixadas, realizado em 2003
por Telles e colaboradores, a análise de variância molecular (AMOVA) considerando todos os
locos mostrou que existe uma tendência de estruturação da variabilidade genética nos bandos,
com um Φ
ST
igual a 0,081 (P=0,07). Neste trabalho, cerca de 11% da variabilidade genética
foi observada “entre” os bandos, um valor consideravelmente elevado considerando que trata-
se de uma única população local distribuída em escala regional (paisagem) (Tabela 4).
Antunes et al. (2006) realizou um estudo utilizando 60 locos do marcador RAPD em
três criatórios de paca (Agouti paca) localizado no Estado de Minas Gerais, obtendo como
resultado uma variabilidade genética inter e intrapopulacinal igual a 12,55% e 87,45%,
respectivamente, valores estes que estão muito próximos aos obtidos neste trabalho com
Queixada.
Tabela 4. Quadro de Análise de Variância Molecular para os 8 bandos de Tayassu pecari,
com base em 129 locos RAPD.
Fonte de Variação Grau de
Liberdade
Soma de
Quadrado
Componente de
Variância
Porcentagem de
Variação
População 7 329,213 1,61686 11,94
Indivíduo 174 2075,671 11,92915 88,06
Total 181 5857,7196 13,54600
44
O valor do Φ
ST
, para os pares de população, variou entre 0,04 e 0,29, o que ilustra a
heterogeneidade da variabilidade genética nessa escala espacial. O agrupamento dessas
distâncias reflete essa heterogeneidade, mas é de difícil interpretação sem que mais
informações ecológicas dos diferentes bandos estejam disponíveis (Tabela 5). Considerando a
escala geográfica em estudo (maior distância igual a 48km – Tabela 6), bandos que estão
próximos geograficamente apresentam uma considerável divergência genética, como é o caso
dos seguintes pares de bandos: 2 e 8 com Φ
ST
igual a 0,211; 4 e 8 com Φ
ST
igual a 0,137.
Tabela 5. Valores de Φ
ST
par a par entre oito bandos de Tayassu pecari, com base em locos
RAPD.
1 2 3 4 5 6 7 8
1 0,000
2 0,111 0,000
3 0,099 0,177 0,000
4 0,050 0,040 0,110 0,000
5 0,049 0,153 0,079 0,090 0,000
6 0,093 0,202 0,122 0,108 0,096 0,000
7 0,171 0,293 0,173 0,195 0,137 0,121 0,000
8 0,105 0,211 0,092 0,137 0,079 0,084 0,184 0,000
Tabela 6. Distância geográfica (km) entre oito bandos de Queixada (Tayassu pecari).
1 2 3 4 5 6 7 8
1 -
2 39 -
3 16 49 -
4 30 9 42 -
5 5 43 18 34 -
6 29 20 44 13 31 -
7 14 28 21 21 19 25 -
8 34 5 44 5 37 17 22 -
45
Com base no cálculo indireto do fluxo gênico a partir do valor de Φ
ST,
proposto por
Slatikin (1995), pode-se perceber que o número médio de indivíduos migrantes, por geração,
entre os bandos de queixada é igual a dois, valor que é suficiente para suprimir a maior parte
dos efeitos da deriva genética sob a diferenciação entre os bandos.
5.2. Divergência genética e padrão espacial da variabilidade genética em bandos de
Queixada
A partir da análise de estruturação da variabilidade genética entre e dentro dos bandos
descritas anteriormente pode-se observar que existe diferenciação significativa entre esses
bandos. Outra informação importante é a verificação de como a variabilidade genética
encontrada está estruturada no espaço, o que foi avaliado a partir de análises multivariadas.
As distâncias genéticas (Φ
ST
) entre os bandos variaram entre 0,04 e 0,29 (Tabela 5). A
correlação cofenética do agrupamento por UPGMA dessa matriz de distâncias foi
relativamente baixa (0,71), de modo que as ligações do dendrograma não refletem
corretamente os padrões multivariados de distância genética (Figura 7). Essa correlação
cofenética baixa é esperada para sistema que não apresentam uma estruturação hierárquica
muito clara (Rodrigues & Diniz-Filho, 1998). Nesses casos as análises de ordenação podem
ser úteis no sentido de detectar padrões espaciais.
O mesmo pode ser dito do escalonamento multidimensional não-métrico (NMDS),
cujo estresse em duas dimensões foi igual a 0,164 (Figura 8). Este valor de estresse, segundo
Kruskall (1964), pode ser considerado moderado para representar as distâncias genéticas nesse
46
espaço bi-dimensional. Pode-se observar, pelo NMDS, que existem bandos que estão em lados
opostos tanto no espaço geográfico quanto genético (populações 2 e 5; 3 e 6; 3 e 4). Por outro
lado, existem bandos próximos no espaço geográfico que são distantes no espaço genético
(bandos 1 e 7; 2 e 8; 4 e 8). Alguns grupos de bandos que são próximos no espaço geográfico
são também similares do espaço genético (tais como a 1 e 5; 2 e 4; 4 e 6). Ou seja, não existe
um único padrão espacial que possibilite a interpretação global da estruturação da
variabilidade genética, sugerindo que investigações mais detalhadas e que levem em conta
outras variáveis que possivelmente estejam interferindo na microevolução destes bandos
devem ser realizadas. Até o presente, foram encontrados apenas quatro estudos abordando
aspectos da área de vida do queixada, utilizando como método o monitoramento por radio-
telemetria (Fragoso, 1998; Carrillo, et al., 2002; Keuroghlian, 2003; Jácomo, 2004), e nenhum
deles relaciona estes padrões com a variabilidade genética presente nos bandos.
Na escala geográfica analisada, tanto as técnicas de análises multivariadas exploratórias
como o UPGMA e o escalonamento multidimensional não-métrico não foram muito eficientes
no sentido de reconstruir estes padrões. Ainda no sentido de investigar o padrão espacial, o
teste de Mantel apresentou uma correlação matricial entre distância genética (Φ
ST
) e
geográfica igual a -0,0154 (P = 0,4979 com 5000 permutações) (Figura 9). Esses resultados
mostram que, de fato, a distância geográfica global não é capaz de explicar o padrão espacial
da variabilidade genética entre os bandos T. pecari, mas sugere que a tendência de haver uma
correlação negativa poderia ser um indicativo de que bandos mais distantes geograficamente
deveriam ser mais similares geneticamente.
47
Figura 7. Padrão de divergência genética entre os 8 bandos de Tayassu pecari, definido pelo
agrupamento por UPGMA, com base nas distâncias genéticas (Φ
ST
). Correlação
cofenética igual a 0,714.
Eixo I
-0.93 -0.32 0.30 0.91 1.53
Eixo II
-0.78
-0.44
-0.09
0.25
0.60
1
2
3
4
5
6
7
8
Figura 8. Análise bi-dimensional mostrando a posição relativa dos 8 bandos de Queixada no
espaço genético (Φ
ST
) reduzido por uma análise de escalonamento
multidimensional não métrico (NMDS). Valor de estresse = 0,16447.
48
O correlograma multivariado, que permite relacionar o coeficiente de correlação matricial
com o aumento das distâncias geográficas (Figura 10), confirmou parcialmente o resultado
obtido no teste de Mantel e mostrou que existe um padrão clinal de variação genética quando
se considera as duas primeiras classes de distâncias (até 28km). Ou seja, bandos que se situam
até cerca 28km de distância tendem a ser mais similares geneticamente e bandos acima de
29km que passam a apresentar correlação negativa, sendo portanto mais diferentes
geneticamente do que o esperado pelo acaso. Quando se analisa a terceira classe de distância,
entretanto, a correlação volta a ser positiva e significativa, e finalmente deixa de ser
significativa na quarta classe de distância.
A maior parte dos estudos em genética de populações naturais, especialmente em escalas
geográficas mais amplas (i.e., regional ou continental) mostra um padrão diferente do
observado neste trabalho. Nesses casos, se observa em geral que as populações, ou indivíduos,
mais próximos no espaço geográfico tendem a ser mais similar geneticamente (autocorrelação
positiva –Rodrigues & Diniz-Filho, 1998; Manly 1985), como no caso do estudo de Ruiz-
Garcia & Jordana (1997), Schweiger et al.(2003) e Telles (2005). Essa autocorrelação
decresce com a distância de forma linear ou exponencial, indicando gradientes (clines) ou
tende a se estabilizar a partir de uma certa distância, o que caracterizaria um modelo de
“isolamento-por-distância”. Nesse modelo, o ponto de estabilização seria um parâmetro
associado à distância média de dispersão por geração (Rodrigues & Diniz-Filho 1998).
Apesar de o padrão espacial observado para os dados genéticos dos Queixadas no PNE
não ser o mais freqüentemente observado, ele de fato seria esperado para escalas locais,
considerando determinados modelos demográficos dos bandos, embora seja interessante
destacar que nem sempre esses padrões seriam passíveis de investigação somente a partir de
marcadores moleculares. Além disso, é preciso acrescentar que o correlograma foi baseado em
49
um número relativamente pequeno de unidades amostrais (bandos), o que torna difícil a
avaliação de padrões complexos de variação espacial (Telles & Diniz-Filho, 2000). O padrão
observado, nesse sentido, poderia ser a princípio interpretado como esperado sob um modelo
estocástico (tal como o “isolamento-por-distância”), e nesse caso o correlograma dos dados de
RAPD sugeriria uma distância de dispersão de cerca de 28 km. Entretanto, a autocorrelação
positiva na 3ª classe de distância (de 29 a 40 km) não seria esperada sob esse modelo mais
simples, relevando que processos demográficos e ecológicos mais complexos devem estar
envolvidos na estruturação genética desses indivíduos nos bandos.
Distância geográfica (Km)
Distância genética (PhyST)
0,02
0,08
0,14
0,20
0,26
0,32
0 10 20 30 40 50
r = -0,01547
P = 0,4979
Figura 9. Relação entre as distâncias genéticas obtidas na AMOVA e as distâncias
geográficas (r = -0,0154; P = 0,4979 com 5000 permutações do teste de Mantel),
para os 8 bandos de Queixada.
50
Classes de Distâncias
Correlação matricial (r)
-0,7
-0,5
-0,3
-0,1
0,1
0,3
0,5
Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4
P = 0,0872
P = 0,0134
P = 0,0228
P = 0.3783
Figura 10. Correlograma de Mantel construído com base nas distâncias genéticas (Φ
ST
) entre
8 bandos de Tayassu pecari, ao longo de quatro classes de distâncias geográficas. A
linha tracejada mostra a correlação esperada sob a hipótese nula de ausência de
padrão espacial. Os números indicam a probabilidade de erro tipo I obtida usando
5000 permutações pelo teste de Mantel.
Um padrão de autocorrelação positiva em grandes distâncias, tal como observado nos
Queixada na região do Parque Nacional das Emas, seria compatível com um modelo no qual
há dispersão dos machos para distâncias relativamente longas, de modo que estes passam a
contribuir significativamente para a composição genética do bando que os recebe (Jácomo,
2004). Além disso, ou em função de reconhecimento individual (de parentesco), evitando
endogamia, ou em função do efeito da própria distância espacial (gap) criado no momento da
dispersão, os bandos geneticamente próximos (ligados “via” macho) não se sobrepõem no
espaço, e a coexistência só existe entre bandos de origens distintas. Embora investigações
mais detalhadas devam ser realizadas a fim de confirmar o modelo, ele é uma explicação
plausível para a autocorrelação negativa observada e está de acordo com os dados de história
de vida e demografia da espécie.
51
6. CONCLUSÕES
• Os 129 locos RAPD analisados mostraram que existe uma estruturação da
variabilidade genética entre os 8 bandos de queixada (Tayassu pecari) do Parque
Nacional das Emas, apresentando um valor do componente interpopulacional da
variabilidade genética (Φ
ST
) igual a 0,11. Assim, a presente análise permite
caracterizar os bandos de Queixada na região do PNE como unidades genético-
ecológicas distintas, estruturando-se por processos demográficos e microevolutivos ao
longo do tempo e do espaço;
• Apesar de haver diferenças entre os bandos para o total de locos, não há um padrão
espacial simples na variabilidade genética, de acordo com as análises multivariadas
(UPGMA e NMDS) e com o teste de Mantel correlacionando os valores de Φ
ST
às
distâncias geográficas (r = -0,0154; P = 0,4979 - 5000 permutações);
• O correlograma multivariado mostrou uma correlação positiva e significativa na
terceira classe de distância geográfica (até 40 km), o que seria compatível com um
modelo no qual há dispersão dos machos para distâncias relativamente longas, de
modo que estes passam a contribuir significativamente para a composição genética do
bando que os recebe.
52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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66
APÊNDICE I
GFX
TM
– KIT DE PURIFICAÇÃO DE DNA A PARTIR DE SANGUE
PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA A PARTIR DE SANGUE
1- Coleta do material
O sangue deve ser coletado em vacuteiner contendo EDTA, em seguida estocado em geladeira
a 4ºC para evitar a coagulação do sangue e a degradação do DNA. Para melhores resultados o
sangue deve permanecer na geladeira por no máximo 2 dias. O sangue congelado apresentará
menor rendimento do que o sangue fresco.
2- Preparo do material a ser utilizado na extração para cada amostra:
1 tubo eppendorf de 2,0ml
1 tubo coletor
1 coluna com matriz de fibra
1 eppendorf de 1,5ml
obs.: ligar o banho-maria e colocar os tampões de extração e eluição para aquecer
3- Método Scalable – para extração de DNA a partir de pequenas amostras de
sangue
Este procedimento pode processar mais de 300
l
µ
de sangue, com um rendimento de 4,5 a
7,5
g
µ
de DNA, proveniente de 300
l
µ
de sangue total (o qual contém aproximadamente 3 x
10
6
de células nucleadas)
Procedimento:
1.1. Lise das células
- adicionar 3X do volume da amostra do tampão RBC Lysis Solution e misturar por inversão
- por exemplo: para a extração em eppendorf de 2,0ml
- 1500
l
µ
do tampão RBC Lysis Solution
- 500
l
µ
de sangue
- incubar a mistura de lise por 5 minutos em temperatura ambiente, em seguida centrifugar a
14000rpm em microcentrífuga por 35 segundos
67
- remover o sobrenadante, o resíduo (aproximadamente 20-50
l
µ
) é utilizado para resuspender
as células antes da extração.
1.2. Extração:
- resuspenda as células brancas do sangue, no mesmo tubo de lise, com o auxílio de um vortex
- adicionar 500
l
µ
de tampão de extração (Extraction Solution), para suspender as células
brancas do sangue, e misturar com o auxílio de um vortex
- incubar a mistura de extração por 5 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação,
colocar as colunas em tubos coletores para o número de amostras analisadas
- obs.: pré-aquecer o tampão até 70ºC
1.3. Recuperação do DNA
- transferir toda a mistura da extração para uma coluna (GFX Column), em seguida centrifugar
a 8000rpm por 1’10”
- descartar o líquido do tubo coletor e em seguida, colocar a coluna novamente no mesmo tubo
coletor
1.4. Lavagem
- adicionar novamente mais 500
l
µ
de solução de extração (Extraction Solution) a coluna
dentro do tubo coletor e em seguida, centrifugar a 8000rpm por 1’10”
- descartar o líquido do tubo coletor e em seguida, colocar a coluna no mesmo tubo coletor
- adicionar 500
l
µ
de solução de lavagem (Wash Solution) a uma coluna dentro dos tubos e em
seguida, centrifugar a 14000rpm por 3’15”
- descartar o tubo coletor e transferir a coluna para um tubo eppendorf de 1,5ml.
1.5. Eluição
- adicionar 100
l
µ
de tampão de eluição (TE) pré aquecido a coluna dentro do eppendorf
- incubar a amostra a temperatura ambiente por 1 minuto
- centrifugar a 8000rpm por 1’10” para recuperar o DNA purificado
68
- obs.1: antes de começar, pré-aqueça o tampão (TE) até atingir 70ºC. Esta temperatura
maximiza a recuperação de DNA da coluna;
- obs.2: volume de eluição menor que 100
l
µ
pode ser usado para concentrar a amostra, mas
ele diminui o rendimento. Por exemplo, utilizando 50
l
µ
ao invés de 100
l
µ
, o DNA passará
para uma concentração 2X, com uma perda na recuperação de aproximadamente 20%
69
APÊNDICE II
# Project file example created by Arlequin:
# -----------------------------------------
# -Everything written after the symbol are just comments.
[Profile]
Title="Analise de RAPD Queixada"
NbSamples= 8 #Number of sample in the Project.
DataType= RFLP
GenotypicData= 0
LocusSeparator= NONE
GameticPhase= 0
RecessiveData= 0
RecessiveAllele= null
MissingData= '?'
# Some advenced settings the experienced user can unkomment
Frequency= ABS # - {ABS, REL}
CompDistMatrix= 1 # - {0, 1}
FrequencyThreshold= 1.0e-5 # - (Any real number between 1.0e-7 and 1.e-2)
EpsilonValue= 1.0e-7 # - (Any real number between 1.0e-12 and 1.0e-7)
[Data]
[[Samples]]
SampleName="pop 1"
SampleSize= 28
SampleData= {
#Sample of haplotypic data:
h001 1
11110111111010110111011101001110110110100100001001111111???1?1???0101111101111101100010010010?1???001001100101111110
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111111111001101
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11111111110111
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}
[[Structure]]
StructureName = "geral"
NbGroups = 1 #Number of groups + {1,2,3...}
IndividualLevel = 0 # - {0, 1}
#Define hereafter the structure of the first group
Group ={
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"pop 2"
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"pop 4"
"pop 5"
"pop 6"
"pop 7"
"pop 8"
}
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