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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA
AMBIENTAL - MESTRADO
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM GESTÃO E TECNOLOGIA AMBIENTAL
Marilda Teixeira Macagnan
BIORREMEDIAÇÃO DE RESÍDUOS SÓLIDOS E PRODUÇÃO DE LIPASE DE
Penicillium sp. UTILIZANDO FERMENTAÇÃO EM FASE SÓLIDA
Santa Cruz do Sul, setembro de 2007
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Marilda Teixeira Macagnan
BIORREMEDIAÇÃO DE RESÍDUOS SÓLIDOS E PRODUÇÃO DE LIPASE DE
Penicillium sp. UTILIZANDO FERMENTAÇÃO EM FASE SÓLIDA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Tecnologia Ambiental –
Mestrado, Área de Concentração em Gestão e
Tecnologia Ambiental, Universidade de Santa Cruz
do Sul – UNISC, como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Tecnologia
Ambiental.
Orientador: Prof. Dr. Valeriano Antonio Corbellini
Co-orientadora: Profª. Dra. Rosana de Cássia de
Souza Schneider
Santa Cruz do Sul, setembro de 2007
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Marilda Teixeira Macagnan
BIORREMEDIAÇÃO DE RESÍDUOS SÓLIDOS E PRODUÇÃO DE LIPASE DE
Penicillium sp. UTILIZANDO FERMENTAÇÃO EM FASE SÓLIDA
Esta Dissertação foi submetida ao
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia
Ambiental – Mestrado, Área de Concentração
Gestão e Tecnologia Ambiental, Universidade de
Santa Cruz do Sul – UNISC, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Tecnologia Ambiental.
Dr. Valeriano Antonio Corbellini
Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC
Orientador
Dra Rosana de Cássia de Souza Schneider
Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC
Co-orientadora
Dra Andréia Valim
Universidade de Santa Cruz do Sul - UNISC
Dra Patrícia Valente da Silva
Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre ao meu lado e me fazer acreditar na capacidade de superar
meus próprios limites.
Ao Prof. Dr. Valeriano Antonio Corbellini, pela orientação, pelo apoio, pelas
oportunidades de construção de conhecimento que me disponibilizou durante todo o
desenvolvimento deste trabalho.
À Profª. Dra Rosana de Cássia de Souza Schneider, pela co-orientação, amizade,
competência e dedicação que tornou mais rica esta caminhada.
Ao meu esposo, Cláudio, e aos meus filhos, Diego e Fernanda, pelo apoio nos
momentos difíceis, pelo amor e compreensão, por acreditarem na minha capacidade e estarem
sempre ao meu lado.
Aos meus pais, Osvaldo e Marilene, aos meus irmãos, Maria Inêz, Mara, Marisandra e
Osvaldo, que torceram e rezaram por mim, o meu eterno carinho e gratidão.
À minha irmã Magda, por ter-me mostrado o caminho, me encorajado a seguir em
frente e me fazer perceber que nunca é tarde para realizarmos os nossos sonhos.
Aos meus primos, Anamaria e Ivaldir, que foram preciosos nesta etapa da minha
caminhada, pelo carinho e hospitalidade.
Aos bolsistas, Mariela e Thiago, pela disponibilidade, persistência e amizade, sem os
quais este caminho seria mais longo.
_____________________________________Dissertação de Mestrado Marilda Macagnan –UNISC - 2007
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Ao Prof. Dr.Jair Putzke, pela contribuição tão generosamente a esta prestada.
A todos que me auxiliaram, direta ou indiretamente, professores, colegas e
funcionários da UNISC.
.
Sonhar tudo o que quiser sonhar.
Essa é a beleza da mente.
Fazer o que quiser fazer.
Essa é a força da vontade humana.
Testar seus limites com confiança.
Essa é a coragem de alcançar a meta.
Bernard Edmonds
RESUMO
O grande potencial do Brasil para a produção agrícola faz com que o nosso país seja
gerador de resíduos agroindustriais. Neste contexto, o processo de fermentação em fase sólida
surge como uma tecnologia que aponta caminhos alternativos para esses resíduos, agregando
valores a essas matérias-primas, através da produção de substâncias de interesse industrial,
além de reduzir os possíveis problemas ambientais. O principal objetivo deste estudo foi
aplicar fermentação em fase sólida de resíduos de sebo bovino associado a grama para a
produção de lipase fúngica. Inicialmente foram isoladas 75 culturas microbianas oriundas de
amostras de grama de jardim (coletadas em Cruz Alta e Santa Cruz do Sul) após incubação
em mistura com sebo bovino. Destas culturas foram selecionados os fungos filamentosos, os
quais foram avaliados quanto à capacidade de produção de lipase. O isolamento e a seleção
foram realizados em meio de cultura diferencial contendo Tween 80 como substrato indutor
da produção de lipase. As colônias com potencial lipolítico foram detectadas pela presença de
halos de precipitação brancos na superfície do ágar. Oito cepas fúngicas foram avaliadas e a
determinação da atividade enzimática foi realizada pela titulação dos ácidos graxos liberados
após incubação com Tween 80 em agitador orbital. A cepa melhor produtora, identificada
como Penicillium sp., produziu 10,0 U/g de lipase em 6 dias e 14,8 U/g em 35 dias de
fermentação. A enzima bruta obtida foi testada em processo de transesterificação para a
produção de biodiesel.
Palavras-chave: Penicillium sp., lipase, grama, sebo bovino, biodiesel.
ABSTRACT
The great potential of Brazil for the agricultural production makes our country a
generator of agro industrial residues. In this context, the solid-state fermentation appears as a
technology that shows alternative ways for those residues, adding values to these raw
materials, through the production of substances of industrial interest, besides reducing the
possible environmental problems. The main objective of this study was to apply the bovine fat
residue associated to the grass for the fungal lipase production. Initially, 75 microbial cultures
were isolated from garden grass samples (from Cruz Alta and Santa Cruz do Sul, RS, Brazil)
after incubation of the mixture with bovine fat. From these cultures were selected the
filamentous fungi, whose lipase production abilities were evaluated. The isolation and the
selection were accomplished by using a differential culture medium containing Tween 80 as
inducer substrate of lipase production The colonies with lipolytic potential were detected by
the presence of white precipitation haloes on the agar. Eight fungi were evaluated and the
determination of the time-related enzyme activity was accomplished by the titration of the
free fatty acids after incubation with Tween 80 in shaker. The best lipase producer fungus was
identified as Penicillium sp and produced 10 U/g of lipase in 6 days and 14.8 U/g in 35 days
of solid state fermentation. The crude enzyme obtained was tested in transesterification
process for the biodiesel production.
Keywords: Penicillium sp.; lipase, grass; bovine fat, biodiesel
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Método de imobilização de enzimas. Fonte: Dalla-Vecchia et al., 2004. .............. 23
Figura 2 - Reação de metanólise de um triacilglicerol pouco insaturado............................... 30
Figura 3 - Diagrama da metodologia adotada para obtenção de lipase microbiana para a
produção de biodiesel. ......................................................................................... 36
Figura 4 - Aspectos macromorfológicos de colônias isoladas da amostra A12 frente (A) e
verso (B) em ágar lipase. ..................................................................................... 44
Figura 5 - Aspectos macromorfológicos de colônias isoladas da amostra A13 frente (A) e
verso (B) em ágar lipase. ..................................................................................... 44
Figura 6 - Atividade lipase em coluna de isolados das amostras A) A7 e B) A12 .............. 45
Figura 7 - Aspecto das colônias cultivadas em ágar Sabouraud após 7 dias a 30ºC............... 48
Figura 8 - Avaliação quantitativa do crescimento micelial radial das amostras fúngicas
cultivadas em ágar lipase peptona ........................................................................ 50
Figura 9 - Avaliação quantitativa do crescimento micelial radial das amostras fúngicas
cultivadas em ágar lipase grama........................................................................... 50
Figura 10 - Avaliação quantitativa do crescimento micelial radial da amostra fúngica
A12 S/S 5 ............................................................................................................ 52
Figura 11 - Ensaio comparativo de fermentação em fase sólida de isolados fúngicos com
potencial lipolítico em presença de grama e sebo bovino: à esquerda, frascos em
tempo zero; à direita, frascos após 21 dias de cultivo. .......................................... 55
Figura 12 - Avaliação quantitativa da atividade lipase de isolados fúngicos obtidos de
grama e cultivados por fermentação em fase sólida de grama com sebo
bovino. ................................................................................................................ 55
Figura 13 - Avaliação quantitativa da atividade lipase do isolado Penicillium sp. A12
C/S 4 .................................................................................................................. 58
Figura 14 - Cromatoplacas da reação de metanólise com a biomassa de Penicillium sp.
(A) – antes da reação e (B) – após 24 h de reação. ............................................... 59
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LISTA DE TABELAS
TABELA I - Sistemas biocatalíticos utilizados para produção de biodiesel..................... 34
TABELA II - Altura da coluna de precipitação de sabão de cálcio de isolados com
atividade lipase.................................................................................................... 46
TABELA III - Média e desvio padrão do crescimento micelial radial (cm) relacionado com
o tempo de incubação em ágar lipase grama (superior) e ágar lipase peptona
(inferior).............................................................................................................. 52
TABELA IV - Média e desvio padrão do crescimento micelial radial (cm) relacionado com
o tempo para amostra A12 S/S 5, em ágar lipase grama e ágar lipase peptona...... 53
TABELA V - Teor de proteínas totais antes e depois da imobilização da lipase do isolado
Penicillium sp. A12 C/S 4.................................................................................... 59
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LISTA DE ABREVIATURAS
ALG Ágar Lipase Grama
ALP Ágar Lipase Peptona
FFS Fermentação em Fase Sólida
FS Fermentação Submersa
PP Polipropileno
UFC Unidade Formadora de Colônia
CCD Cromatografia em Camada Delgada
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14
1 OBJETIVOS .................................................................................................................. 16
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA...................................................................................... 17
2.1 Lipases........................................................................................................................... 17
2.2 Métodos de obtenção de lipases...................................................................................... 18
2.2.1 Fermentação em fase sólida (FFS)................................................................................19
2.3 Métodos de seleção de microrganismos com potencial lipolítico .................................... 20
2.4 Imobilização de lipase para fins industriais..................................................................... 22
2.5 Microrganismos com potencial lipolítico de interesse industrial ..................................... 24
2.5.1 Penicillium sp...............................................................................................................26
2.6 Biodiesel........................................................................................................................ 27
2.7 Biotransformação enzimática ......................................................................................... 30
2.7.1 Alcoólise enzimática ....................................................................................................31
2.7.1.1 Extração e imobilização de lipases para aplicação na obtenção de biodiesel.............. 33
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................ 36
3.1 Amostragem................................................................................................................... 37
3.2 Seleção e Isolamento de culturas microbianas ................................................................ 37
3.3 Caracterização morfológica parcial de microrganismos com atividade lipolítica............. 37
3.4 Seleção das cepas fúngicas cultivadas em extrato de grama e peptona ............................ 38
3.5 Produção de lipase por fermentação em fase sólida ........................................................ 39
3.6 Dosagem de atividade lipase .......................................................................................... 39
3.7 Manutenção da cepa selecionada.................................................................................... 39
3.8 Produção de lipase de Penicillium sp. A12 C/S 4 por fermentação em fase sólida de grama
e sebo bovino ................................................................................................................. 40
3.9 Determinação do teor de gordura no meio de cultura...................................................... 40
3.10 Aplicação das enzimas (células) na produção de biodiesel............................................ 40
3.10.1 Imobilização...............................................................................................................41
3.10.2 Determinação de proteínas totais ................................................................................41
3.10.3 Metanólise enzimática do óleo de girassol..................................................................42
3.10.4 Cromatografia em Camada Delgada ...........................................................................42
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................ 43
4.1 Seleção de microrganismos com atividade lipolítica....................................................... 43
4.2 Análise macroscópica dos isolados com atividade lipase ................................................ 47
4.3 Seleção de cepas fúngicas que crescem em extrato de grama e peptona.......................... 49
4.4 Avaliação quantitativa da atividade lipase ...................................................................... 54
4.5 Avaliação quantitativa da atividade lipase da cepa de Penicillium sp. ............................. 57
4.6 Estudo da aplicação das lipases na produção de biodiesel............................................... 58
CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................ 61
TRABALHOS FUTUROS.................................................................................................... 63
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 64
INTRODUÇÃO
Com o crescimento populacional, desencadeou-se o desenvolvimento tecnológico e
industrial e, como conseqüência, intensificaram-se alguns problemas ambientais. A
consciência ambiental gera preocupações em relação aos recursos naturais, sendo importante,
neste início de milênio, alcançar um equilíbrio entre desenvolvimento e preservação do meio
ambiente. Atualmente existe um grande interesse pelos processos biotecnológicos industriais,
os quais apresentam uma expressiva relevância social e econômica devido à possibilidade de
utilização de produtos oriundos de fontes renováveis.
Um dos principais processos biotecnológicos industriais que vêm sendo desenvolvidos
é a produção de biodiesel por transesterificação utilizando enzimas microbianas como
biocatalisadores desta reação. Isso é devido à grande variedade e disponibilidade de recursos
naturais que podem ser utilizados nos cultivos microbianos para a produção de enzimas, entre
as quais as lipases vêm conquistando uma faixa crescente no mercado, em conseqüência do
grande número de aplicações industriais.
Ainda dentro da visão de tecnologias limpas, várias classes de resíduos orgânicos que
são geradas industrialmente ou na atividade agrícola (grama, rama de mandioca, palha de
milho, forragem, etc.) apresentam potencial nutricional quando associados a gorduras, para
servirem como substrato à produção de lipases por fermentação em fase sólida ao invés de
simples compostagem do resíduo. Portanto, é importante uma visão comprometida com a
questão ambiental no setor produtivo, reciclando e reaproveitando resíduos de outras áreas da
atividade humana em prol de novos produtos de interesse econômico.
As lipases, obtidas de forma sustentável a partir de resíduos industriais e agrícolas,
podem ser utilizadas como biocatalisadores em reações de transesterificação, o que as torna
um atrativo para a produção de biodiesel, uma vez que o processo de produção de ésteres a
_____________________________________Dissertação de Mestrado Marilda Macagnan –UNISC - 2007
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partir de óleos vegetais, com lipases como biocatalisadoras da reação, alcançam altos valores
de conversão e tempos razoavelmente baixos, quando comparados a outros processos
biocatalíticos. Por biocatálise, ainda é possível separar com maior facilidade o glicerol e há
formação de menor quantidade de resíduos (Macedo e Macedo, 2004). A maior dificuldade na
utilização desse sistema ainda é o custo de produção de lipases (Zeng, 2006). Assim, para
implantação de um sistema de produção de biodiesel, faz-se necessária a auto-suficiência
tecnológica na produção de lipase, daí a importância de se realizar pesquisas sobre novos
processos de fermentações baratos, rentáveis e ambientalmente corretos.
Dessa forma, o uso de tecnologias que aproveitam resíduos vegetais, obtidos de
processos agrícolas, de jardinagem e de processos primários de produção, como cascas,
bagaço, folhas, pó vegetal, sementes e outros, consorciados a produtos de menor valor
agregado para a indústria, como as gorduras obtidas em processos de curtimento ou em
frigoríficos, despontam hoje como uma excelente alternativa para a produção de lipases de
interesse industrial.
Logo, diante dessas circunstâncias, esta pesquisa, alicerçada em uma filosofia de
tecnologias mais limpa, visa desenvolver a produção de lipases de interesse para a indústria de
produção de biodiesel associada à biorremediação de resíduo sólido empregando o método de
fermentação em fase sólida.
1 OBJETIVOS
O presente trabalho teve por objetivo geral aplicar a fermentação em fase sólida de
resíduos de sebo bovino associados à grama para a produção de lipase fúngica. Este objetivo
principal foi alcançado pelo desenvolvimento de várias etapas de trabalho, que compõem os
seguintes objetivos específicos:
- Selecionar microrganismos com atividade lipase para utilização como inóculos para a
fermentação em fase sólida de resíduos vegetais e de gordura animal.
- Otimizar o processo de produção de lipase fúngica por fermentação em fase sólida de grama
e sebo bovino.
- Avaliar o potencial de aplicação de lipases obtidas por fermentação em fase sólida de
resíduos vegetais e de gordura animal para a produção de biodiesel.
- Avaliar a aplicação da fermentação em fase sólida como método de biorremediação de
resíduos sólidos.
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2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Lipases
As lipases são enzimas classificadas como hidrolases (glicerol éster hidrolase EC
3.1.1.3) capazes de catalisar a hidrólise de acilgliceróis na interface óleo/água para produzir
ácidos graxos. Essas enzimas encontram-se amplamente distribuídas na natureza e podem ser
de origem animal (pancreática, hepática e gástrica), microbiana (bactérias e fungos) e vegetal,
tendo suas propriedades de acordo com sua procedência (Saxena et al., 2003). Suas aplicações
são inúmeras, sendo que normalmente as lipases provenientes de microrganismos são as mais
utilizadas industrialmente por serem geralmente mais estáveis que as extraídas de plantas e
animais e apresentarem procedimentos mais simples de isolamento, tornando sua produção
mais segura (Hasan et al., 2005).
Essas enzimas são produzidas intra e extracelularmente em diversos microrganismos
entre os quais estão os fungos, que apresentam maior interesse em virtude de sua maior
estabilidade a temperaturas mais elevadas ou variações de pH. Dentre eles, os fungos
filamentosos têm sido muito utilizados pela indústria nos processos de produção de lipases
(Maras et al., 1999). Conforme a literatura, algumas espécies fúngicas que vêm sendo mais
investigadas são: Aspergillus niger (Kamini et al., 1998; Mahadik et al., 2002), Rhizopus
arrhizus (Elibol e Ozer, 2000), Rhizopus oligosporus (Ul-Haq et al., 2002), Penicillium
restrictum (Freire et al., 1997a; Gombert et al., 1999), Penicillium citrinum (Miranda et al.,
1999) e Penicillium chrysogenum (Ferrer et al., 2000). Na maioria dos casos, as lipases
produzidas por esses microrganismos são extracelulares, permitindo sua extração, isolamento
e purificação com maior facilidade (Essamri et al., 1998).
Embora o uso de lipases microbianas esteja concentrado nas indústrias de detergentes,
surgem novas aplicações, tais como: nas indústrias de papel e celulose, farmacêuticas,
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alimentícias e químicas (Sharma et al., 2001; Hasan et al., 2005). Podem ser utilizadas ainda
na degradação de resíduos lipídicos (Masse et al., 2001; Hasan et al., 2005), poliuretano
(Takamoto et al., 2001) e como biocatalisadores em reações de transesterificação aplicadas na
produção de biodiesel (Kamini e Iefuji, 2001; Zeng et al., 2006; Li et al., 2007; Shah e Gupta,
2007).
2.2 Métodos de obtenção de lipases
Existem basicamente dois tipos de processos que são utilizados para a produção de
lipases: a fermentação em fase sólida (FFS) e a fermentação submersa (FS). A maioria das
enzimas utilizadas industrialmente é produzida por fermentação submersa, que tem como
característica principal a utilização de um meio fermentativo líquido com nutrientes solúveis
(Martins, 2001).
Nos últimos anos, tem aumentado o interesse de pesquisadores pela produção de
enzimas utilizando o processo de fermentação em estado sólido, devido à possibilidade de
utilizar substratos de baixo valor agregado, diminuindo assim o custo de produção (Robison e
Nigam, 2003).
No Brasil, muitas pesquisas estão sendo desenvolvidas a fim de agregar valor aos
produtos e subprodutos da agricultura, devido ao aumento da geração de resíduos
agroindustriais. A utilização desses resíduos, além de fornecer diferentes alternativas de
substratos para a fermentação, também ajuda na diminuição dos problemas de poluição
ambiental (Pandey et al., 1999).
Pandey (2003) também relata em seu trabalho que, embora não existam métodos
eficazes para comparar os níveis de produtividade obtidos entre a FS e a FFS, o crescimento
dos níveis da atividade enzimática em meio sólido pode estar relacionado com o fato de este
cultivo aproximar-se muito do ambiente natural de crescimento dos microrganismos.
As enzimas são tradicionalmente obtidas por FS, embora a questão da viabilidade
econômica desse processo em relação à FFS seja um problema, pois os meios de fermentação
geralmente apresentam um alto custo. A técnica de FS apresenta maior facilidade de cultivo
_____________________________________Dissertação de Mestrado Marilda Macagnan –UNISC - 2007
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comparada à FFS, pois assegura maior homogeneidade do meio, além de facilitar o controle
dos parâmetros (Couto e Sanromán, 2006).
2.2.1 Fermentação em fase sólida (FFS)
A fermentação em fase sólida pode ser definida como o processo que se refere à
cultura de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida (substrato ou
material inerte), onde o conteúdo de líquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela está
a um nível de atividade de água que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das
células e, por outro, não exceda à máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida.
(Del Bianchi et al., 2001).
A FFS tem sido utilizada em processos de biorremediação e biodegradação de
compostos perigosos e desintoxicação biológica de resíduos agroindustriais (Brand et al.,
2000). O desenvolvimento microbiano através da técnica de FFS tornou-se uma ferramenta
potencialmente interessante na obtenção de diversos produtos, entre eles, enzimas, inóculos,
ração para animais, produtos para indústrias de alimento, química e farmacêutica. A utilização
da FFS envolve biotransformação de produtos e resíduos agrícolas para enriquecimento
nutricional, produção de biomassa e formação de produtos com alto valor agregado (Pandey,
2003).
Vários fatores são importantes no processo de FFS; dentre eles, estão a seleção do
microrganismo, a escolha do substrato e a otimização de parâmetros (Pandey, 2003). Devido à
simplicidade e por ser economicamente mais atraente, a fermentação em fase sólida tem sido
muito utilizada para a produção de enzimas (Ul-Haq et al., 2002). Microrganismos, como
bactérias, fungos e leveduras, estão sendo utilizados na produção de lipases por esse processo
fermentativo.
Os fungos filamentosos são muito utilizados industrialmente no processo de FFS. Suas
condições de cultivo estão muito próximas das condições naturais, pois crescem naturalmente
em resíduos agroindustriais, frutas e grãos. Os fungos filamentosos apresentam outras
características estimulantes para a utilização na FFS, porque crescem em meios com baixa
atividade de água (a
w
), baixo pH e produzem esporos, facilitando a estocagem e a preparação
_____________________________________Dissertação de Mestrado Marilda Macagnan –UNISC - 2007
20
dos inóculos (Mitchell et al, 2000). Leveduras e bactérias crescem em meios com altos índices
de a
w
, na ordem de 0,99, tendo seu crescimento inibido em condições de a
w
0,90. Essa é uma
das razões por que estes microrganismos não são tão utilizados em processos de FFS.
Entretanto os fungos filamentosos, segundo Mitchel et al. (2000), possuem geralmente
excelentes condições de crescimento com valores de atividade do meio entre 0,96 e 0,98. Em
alguns casos, esses fungos crescem em condições de a
w
próximas a 0,90.
Diferentes substratos já foram testados na produção de lipases; dentre eles, podemos
citar os resíduos de gergelim (Kamini et al., 1998), farelo de amêndoa e farelo da casca de
trigo (Ul-Haq et al., 2002) e bagaço-de-cana de açúcar (Cordova et al., 1998). Esses resíduos
são usados como fonte de nutrientes para o crescimento dos microrganismos.
Estudos têm sido realizados com diferentes fontes de carbono e nitrogênio, com a
finalidade de enriquecer o meio de cultura, induzindo a síntese de lipase (Domínguez et al,
2003; Freire et al. 1997b; Gombert et al.1999). Em alguns trabalhos, a adição de suplementos
tem aumentado a capacidade produtiva dos microrganismos. No entanto, Kamini et al. (1998)
utilizando diferentes resíduos agroindustriais na produção de lipases por Aspergillus niger,
mostrou que, dependendo da composição do substrato utilizado na FFS, não é necessária a
adição de fontes de carbono e nitrogênio.
Dominguez et al. (2003) elucidam em seu trabalho que a utilização de materiais
contendo lipídios no meio de cultura freqüentemente aumenta os níveis de atividade lipase. O
pH e a temperatura de fermentação do meio também são fatores importantes no processo de
produção de lipase (Domínguez et al., 2003). Essas enzimas produzidas por microrganismos
em FFS mantêm-se estáveis numa faixa de pH entre 5,0 e 8,0 e apresentam uma atividade
ótima com temperatura entre 30 a 40ºC (Freire et al., 1997a; Kamini et al., 1998).
2.3 Métodos de seleção de microrganismos com potencial lipolítico
Os microrganismos, possuindo as características essenciais para que possam ser
usados em processos biotecnológicos, podem ser isolados, purificados e selecionados a partir
de fontes naturais, que podem ser o solo, a água, plantas e animais. Os fungos produtores de
lipases podem ser isolados de resíduos industriais gordurosos, de solos contaminados com
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óleo, de fábricas de processamento de óleos vegetais e laticínios (Sztajer e Maliszewska,
1988; Sharma et al., 2001).
A procura por enzimas que sejam capazes de catalisar novas reações tem aumentado
rapidamente, sendo que o meio mais eficiente para encontrar novas enzimas é o isolamento e
a seleção de microrganismos, como conseqüência das suas características de diversidade e
versatilidade (Ogawa e Shimizu, 1999).
A seleção primária para detectar a atividade lipolítica é importante no processo de
seleção de microrganismos específicos. Segundo Steele e Stowers (1991), a seleção primária é
predominantemente um procedimento qualitativo no qual uma grande população de
organismos é selecionada, direta ou indiretamente, para um tipo específico de atividade.
Segundo os mesmos autores, a maioria dos métodos é categorizada, como diretos, quando
permitem a identificação específica do produto alvo, e como indiretos, quando ocorre a
indicação da presença de determinada substância pela detecção de alguma atividade
específica, tal como a detecção de uma atividade enzimática via reação colorimétrica ou
fluorimétrica.
A seleção primária geralmente é realizada pelo cultivo do microrganismo em meio de
cultura solidificado com ágar bacteriológico, em placas de Petri, onde o microrganismo que
possui a capacidade de produzir o metabólito ou substância de interesse é detectado. Os
métodos de observação direta em placas se baseiam na formação de zonas claras ou opacas
em torno das colônias lipolíticas ou na formação de produtos de precipitação na superfície do
ágar (Shelley et al., 1987).
Na observação direta da atividade lipolítica, os substratos solúveis em água são úteis,
quando a hidrólise resulta na liberação de produtos fluorogênicos ou cromogênicos ou na
liberação de ácidos graxos insolúveis em água, ocorrendo sua precipitação no meio, formando
um halo opaco. Portanto, a ação da lipase em um meio solidificado com ágar contendo
substratos insolúveis resulta na formação de uma região clara correspondente à produção de
lipase em torno da colônia (Shelley et al., 1987).
Ionita et al. (1997) testaram a capacidade lipolítica de cepas de fungos de uma coleção
de culturas, empregando ágar nutriente suplementado com cloreto de cálcio e Tween 80.
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Destas, foram selecionadas, como melhores produtoras, as cepas de Aspergillus oryzae e
Candida lipolytica, pela determinação dos halos de opacidade, devido à formação de sabões
de cálcio, desenvolvidos em torno das colônias lipolíticas.
Após a seleção primária, é usual submeter as cepas ao cultivo em substratos líquidos
(submersos) para a avaliação da produção da enzima, podendo, assim, selecionar as melhores
cepas, descartando-se as demais. Os métodos para medição da atividade lipolítica em cultivos
tais como o titrimétrico (Watanabe et al., 1977) e o colorimétrico (Stuer et al, 1986) são
consumidores de tempo e não podem ser usados em etapa inicial de seleção, principalmente
quando é avaliado um grande número de cepas.
2.4 Imobilização de lipase para fins industriais
A utilização de lipases tem sido muito investigada com relação às suas propriedades
bioquímicas e fisiológicas e suas aplicações industriais (Gandhi, 1997). O principal interesse
em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não
seja afetada durante o processo. Para que isso ocorra, é importante protegê-la da interação
com o solvente, pois o mesmo poderia ocasionar sua inativação (Dalla-Vecchia et al., 2004).
A crescente utilização de lipases em síntese impulsionou estudos de imobilização dessas
enzimas por diversas técnicas e em diferentes suportes, pois a imobilização, além
proporcionar a recuperação e reutilização das enzimas, facilita a separação dos produtos e
aumenta a estabilidade em solventes orgânicos (Pinheiro et al., 2005).
A imobilização pode ocorrer através da adsorção ou ligação da enzima em um material
insolúvel, pelo uso de um reagente multifuncional através de ligações cruzadas, confinamento
em matrizes formadas por géis poliméricos ou encapsulação através de uma membrana
polimérica (Dalla-Vecchia et al., 2004). O processo de imobilização por adsorção é mais
simples e envolve interações enzima-suporte mais fracas e menos específicas, obtendo-se
preparações enzimáticas com atividades catalíticas elevadas e rendimentos de imobilização
também elevados. A principal desvantagem da imobilização por adsorção se deve a possíveis
perdas de enzimas, que poderão ocorrer durante a utilização da preparação enzimática no
meio reacional (Vitolo, 2001).
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23
Em relação aos métodos em que a enzima fica retida no interior do suporte, a
imobilização pode ocorrer pela formação de uma estrutura porosa na presença da enzima, a
qual fica aprisionada na matriz tridimensional, ou pela introdução da enzima em uma
membrana porosa previamente formada. Nos dois casos, a enzima fica absorvida por um gel
poroso que permite a difusão dos substratos, mas retém a enzima no interior da matriz (Dall-
Vecchia et al., 2004). Nesse contexto, o uso do polipropileno poroso pode ser vantajoso para a
imobilização e purificação de lipases, pois a enzima é adsorvida no interior dos poros
tornando-a mais estável, facilitando sua recuperação e reutilização.
A adsorção de uma enzima em um suporte geralmente ocorre na superfície, portanto a
eficiência deste processo depende de vários parâmetros, tais como tamanho da proteína a ser
adsorvida, área superficial do adsorvente e, principalmente, da porosidade e tamanho dos
poros (Villeneuve et al., 2000). O uso de suportes porosos torna-se, pois, vantajoso, devido à
enzima ser adsorvida no interior dos poros. A Figura 1 representa esquematicamente a
classificação dos métodos utilizados para imobilização de enzimas.
Figura 1 - Método de imobilização de enzimas. Fonte: Dalla-Vecchia et al., 2004.
Vários fatores influenciam no processo de imobilização de enzimas, destes, é
importante ressaltar o pH do meio, o qual modifica as interações entre grupos de carga
elétrica ou dipolo, da enzima e do suporte, influenciando na afinidade entre os mesmos; a
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24
temperatura, pois, quanto mais elevada, maior a agitação das moléculas e maior a tendência
das mesmas a se desnaturarem; pequenas concentrações de enzimas na solução podem causar
maior intensidade das forças de interação enzima-suporte e o excesso pode causar uma
adsorção em multicamada; a presença de aditivos, que são substâncias utilizadas para
melhorar a eficiência da imobilização, podem atuar mudando a conformação da enzima
imobilizada (Pinheiro et al., 2005).
Os suportes sólidos utilizados para imobilização podem ser constituídos por vários
tipos de materiais; dentre eles podem-se citar: sílica (Noureddini et al., 2005), celite (Shah e
Gupta, 2007), polipropileno (Gitlesen et al., 1997), poliacrilamida (Knight et al., 2000) e
outros polímeros (Dalla-Vecchia et al., 2004). A escolha do método de imobilização e do tipo
de suporte dependerá essencialmente de dois fatores: as propriedades da enzima e as
condições de uso da enzima imobilizada. Devido à variabilidade desses fatores, não se pode
afirmar que exista um método geral de imobilização nem um suporte que possa ser
considerado de aplicação universal (Vitolo, 2001).
2.5 Microrganismos com potencial lipolítico de interesse industrial
Enzimas microbianas são freqüentemente mais úteis que as enzimas derivadas de
plantas ou animais, devido à grande variedade de atividades catalíticas disponíveis, aos altos
rendimentos possíveis, à facilidade de manipulação genética e ao crescimento rápido dos
microrganismos (Hasan et al., 2005). Os processos industriais que empregam enzimas são, em
geral, relativamente simples, fáceis de controlar, eficientes energeticamente e de
investimentos de baixo custo (Dziezak, 1991; Pizarro e Park, 2003).
Enzimas provenientes de microrganismos apresentam grande emprego em indústrias
de alimentação, como derivados do leite, e também, em indústrias de produtos farmacêuticos,
detergentes, agroquímicos, oleoquímicos, têxteis, cosméticos, entre outras. As indústrias têm
utilizado enzimas lipolíticas em uma variedade de reações, devido ao potencial de biocatálise
de lipases microbianas, tanto em meio aquoso, quanto não aquoso.
Os microrganismos mais utilizados em processos industriais são as bactérias e os
fungos; estes podem ser isolados de nichos ecológicos naturais ou podem ser adquiridos de
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25
coleções de cultura. Dentre as bactérias produtoras de lipases, estão disponíveis
comercialmente as enzimas de Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens e Burkholderia
cepacia (anteriormente Pseudomonas) para a aplicação em síntese quiral, e as lipases de
Burkholderia sp. e Arthrobacter sp. utilizadas para a determinação diagnóstica de
triacilglicerídeos (Jaeger et al., 1999).
Fungos de diversos gêneros têm sido demonstrados como bons produtores de lipases;
entre eles podem-se citar: Aspergillus oryzae, Aaspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus
niveus, Rhizopus oryzae, Penicillium camembertii, Penicillium roqueforti, e da levedura
Candida rugosa, que estão sendo comercializados para o processamento de óleos, gorduras,
queijos, etc (Jaeger et al., 1999).
Encontram-se listados a seguir alguns microrganismos lipolíticos de interesse
industrial e suas aplicações:
- As lipases de Candida spp. apresentam aplicação potencial para a síntese de ésteres
de cadeia curta, que podem ser usados como compostos flavorizantes ou aromatizantes ou
como combustíveis na forma de biodiesel, neste caso, como ésteres metílicos ou etílicos de
ácidos graxos (Fukuda et al., 2001; Tan et al., 2003; Larios et al., 2004);
- Mucor miehei, imobilizado em solventes orgânicos, catalisa as reações enzimáticas
de interesterificação para a produção de óleos vegetais, como: óleo de amendoim, azeite de
oliva e óleo de soja, que contêm ácidos gordurosos polinsaturados como ômega-3 (Li e Ward,
1993);
- Lipase de Rhizopus nodosus é usada no desengraxamento de camurça e couro
(Muthukumaran e Dhar, 1982);
- P. putida, Acinetobacter spp, Rhodococcus spp, Mycobacterium sp. são usados em
processos de biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo (Margesin et al., 2003);
- Lipases de B. cepacia foram imobilizadas e usadas para a transesterificação de óleo
de soja com metanol e etanol (Noureddini et al., 2005);
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26
- Lipases de Thermomyces lanuginosa e Candida antarctica são utilizadas como
biocatalisadores em processos de transesterificação usando óleos residuais de restaurantes
(Hsu et al., 2002);
- Lipases de bactérias de gênero Pseudomonas são utilizadas na produção de
monoacilgiceróis, usados como emulsificantes em diversos alimentos, cosméticos e produtos
farmacêuticos (Yamamoto e Fujiwara, 1998).
2.5.1 Penicillium sp.
Diversos gêneros de fungos filamentosos produtores de lipases têm sido estudados,
entre eles, Rhizopus (Kaieda et al., 1999; Elibol e Ozer, 2000), Aspergillus (Macris et al.,
1996; Ellaiah, 2004), Mucor (Aktar et al., 1980; Abbas et al., 2002) e Penicillium (Jesus et al.,
1999; Lima et al., 2004; Bian et al., 2005).
O gênero Penicillium é encontrado em todo o planeta e a maioria das espécies são
saprófitas, vivem no solo, em cereais, vegetais podres, etc. Alguns membros deste grupo,
como P. roquefortii e P. camembertii, têm sido utilizados na indústria alimentícia na
fabricação de queijos que levam seus nomes e são considerados de grande importância
econômica, pois dão aos queijos a aparência, o sabor, o odor e a textura (Eitenmiller et al.,
1970).
Estudos realizados por Petrovic et al. (1990), empregando uma cepa de P. roquefortii,
isolada de uma amostra comercial do queijo Roquefortii, demonstraram o efeito da adição de
carboidratos glicose, frutose e sacarose e dos lipídios manteiga e óleo de oliva em cultivos
submersos. A quantidade máxima de lipase foi detectada no meio com glicose após seis dias
de incubação.
P. camembertii também foi estudado por Tan et al. (2004) quanto às melhores
condições de cultivo para produção de lipase. O melhor meio de cultura testado foi farelo de
soja desengordurado (4,0 %); óleo de jojoba (0,5 %); NH
4
HPO
4
(0,1 %); Tween 60 (0,1 %). O
pH inicial foi de 6,3 e a melhor temperatura foi de 28 ºC em um tempo de fermentação de 96
horas.
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27
A produção de lipase pelo fungo P. restrictum, utilizando como meio a torta de
babaçu, foi estudada por Palma et al. (2000). O meio de cultura foi enriquecido com óleo de
oliva, peptona e Tween 80. Obteve-se a melhor atividade lipase, 27,8 U g
-1
, em 25 horas de
fermentação, quando se utilizou peptona como suplemento. A mesma espécie de fungo foi
estudada por Freire et al. (1997b), utilizando glicose, óleo de oliva e lactose, como fonte de
carbono para a produção de lipase. Os resultados mostraram que a atividade enzimática foi
seis vezes maior para o óleo de oliva do que a glicose, sendo que, para a lactose, ocorreu
baixa produção da enzima. Peptonas de carne, soja e caseína a 2 % foram testadas como fonte
de nitrogênio e os melhores níveis de atividade enzimática (13 U mL
-1
) ocorreram com a
peptona de carne.
Vargas (2004) estudou a produção de lipases por P. simplicissimum em fermentação
em fase sólida utilizando torta de soja como substrato. Neste estudo, não foram adicionadas
fontes suplementares de carbono e nitrogênio para otimizar a produção de lipases, pois a torta
de soja é rica em nutrientes. A maior produção da enzima foi de 30 U g
-1
em 80 horas de
fermentação a 27 ºC e 55 % de umidade do meio.
Como demonstrado acima, vários meios de cultura foram utilizados para estudar a
produção de lipase por espécies de Penicillium. As espécies estudadas, apesar de pertencerem
ao mesmo gênero, demonstraram diferenças quanto ao melhor meio para a produção de
lipases. Por isso, pode-se dizer que cada fungo é único no seu desenvolvimento e os estudos
para a produção de um metabólito requerem um conhecimento detalhado das características
do seu crescimento e da sua fisiologia.
2.6 Biodiesel
A principal fonte de energia mundial provém do petróleo, do carvão e do gás natural.
Considerando que essas fontes são limitadas e as previsões de que esses recursos se esgotem,
somados às crescentes preocupações com o meio ambiente, torna-se de suma importância a
busca por fontes de energia renovável. Nesse contexto, o biodiesel torna-se uma alternativa
sustentável, capaz de substituir o diesel de petróleo, pois pode ser obtido a partir de fontes
renováveis, como óleos vegetais, gorduras animais e ácidos graxos (Ghassan et al., 2003).
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28
O Brasil é um país com grande extensão territorial e clima favorável ao cultivo de
diversas oleaginosas. Devido a essa grande variedade de oleaginosas, existem diversas
matérias-primas capazes de produzir biodiesel. Por se tratar de fonte de energia renovável, os
óleos vegetais têm sido amplamente investigados como concorrentes a programas de energia
renovável, pois proporcionam uma geração descentralizada de energia em apoio à agricultura
familiar, oferecendo melhores condições de vida em regiões carentes, valorizando
potencialidades regionais e criando alternativas a problemas econômicos e sócio-ambientais
(Urioste, 2004).
Outra forma de obtenção de biodiesel é através dos óleos e gorduras de animais, já que
essas substâncias possuem estruturas químicas semelhantes às dos óleos vegetais, sendo, na
maioria, moléculas de triacilgliceróis saturados. Do ponto de vista ambiental, é importante a
utilização de produtos residuais, pois são surpreendentes os volumes ofertados de sebo de
animais, especialmente de bovinos, nos países produtores de carnes e couros, como é o caso
do Brasil. Outro fator importante é a utilização do óleo residual usado na fritura de alimentos
que, assim como os óleos e as gorduras animais, pode ser convertido em produtos de elevado
valor agregado, tais como combustíveis (biodiesel), lubrificantes, solventes, adesivos, entre
outros produtos (Metzger, 2001).
Um dos fatores que levam ao aquecimento global é a intensa liberação de CO
2
pela
combustão de carbono, tal como o diesel de petróleo. Sabe-se também que a poluição do ar
nas grandes cidades é, provavelmente, o mais visível impacto da queima dos derivados de
petróleo. Substituindo o diesel pelo biodiesel, resultaria uma redução significativa no padrão
de emissões de materiais particulados, óxidos de enxofre e gases que contribuem para o efeito
estufa e chuvas ácidas (Mittelbach et al., 1985), além de proporcionar uma maior expectativa
de vida à população e, como conseqüência, uma redução nos custos com saúde pública.
O biodiesel permite que se estabeleça um ciclo fechado de carbono no qual o CO
2
é
capturado quando a planta cresce e emitido quando o biodiesel é queimado na combustão do
motor. Portanto existe um equilíbrio entre a emissão de CO
2
na queima do diesel e sua fixação
na fotossíntese das oleaginosas cultivadas, fazendo-se, assim, o aproveitamento máximo dos
recursos energéticos juntamente com a renovação da natureza (Peterson e Hustrulid, 1998).
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29
A redução no acúmulo de CO
2
na atmosfera é alcançada diminuindo a quantidade de
petróleo usada para a produção de combustível diesel. Para cada quilograma de diesel não
usado, há um equivalente de 3,11 kg de CO
2
, mais um adicional de redução de 15 a 20 % de
energia no processo que não é liberada à atmosfera (Peterson e Hustrulid, 1998). Em seu
trabalho, Peterson e Hustrulid calcularam que, com o uso do biodiesel, a redução máxima de
CO
2
seria de 113 a 136 bilhões de quilogramas por ano.
Iniciativas à produção do biodiesel, vêm ganhando cada vez mais atenção pelo fato de
seus combustíveis apresentarem muitas características atrativas que trazem benefício ao meio
ambiente. Além de ser um combustível não tóxico, seguro para se trabalhar, e ainda,
biodegradável, os produtos de combustão reduziriam os níveis de substâncias particuladas,
sendo que o biodiesel produz 8,7 % menos de CO
2
por kg comparado ao diesel (Peterson e
Hustrulid, 1998).
O biodiesel pode, então, ser definido quimicamente como éster monoalquílico de
ácidos graxos derivados de lipídios de ocorrência natural e pode ser produzido, através da
reação de transesterificação química ou enzimática, nas quais ocorre a transformação de
triacilgliceróis em moléculas menores de ésteres de ácidos graxos, como mostra a Figura 2
(Schuchardt et al, 1998; Zagonel e Ramos, 2001).
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30
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
+
HO
OH
HO
+
CH
3
OH
Catalisador/ biocatalisador
ésteres metílicos
glicerol
triacilglicerol
metanol
3
Figura 2 - Reação de metanólise de um triacilglicerol pouco insaturado.
2.7 Biotransformação enzimática
Através da tecnologia enzimática, podem-se obter produtos de alta qualidade de
maneira limpa, atendendo às necessidades tecnológicas, de mercado e de preservação
ambiental.
Catalisadores são compostos capazes de aumentar a velocidade da reação, participando
efetivamente do processo sem alterar a proporção entre reagentes e produtos, sofrendo
alterações de sua estrutura química, mas retornando a sua forma original no final da reação
(Borzani et al., 2001).
_____________________________________Dissertação de Mestrado Marilda Macagnan –UNISC - 2007
31
O termo biotransformação pode ser aplicado às modificações específicas ou
interconversões de estrutura química realizadas por catalisadores bioquímicos, empregando
enzimas contidas em células ou isoladas. A escolha do biocatalisador ocorre entre organismos
vivos, de origem animal, vegetal ou microbiana (Pereira, 1995).
Catalisadores biológicos são proteínas denominadas enzimas que possuem um alto
poder catalítico. A velocidade das reações catalisadas por enzimas é de 10
6
a 10
12
vezes maior
do que a das não catalisadas; geralmente, são muito mais rápidas que aquelas catalisadas por
catalisadores inorgânicos; têm alto grau de especificidade por seus substratos; aceleram
reações químicas específicas e, em alguns casos, podem funcionar tanto em soluções aquosas
quanto em solventes orgânicos (Lehninger et al., 2001; Borzani et al., 2001).
Existem vários fatores que podem influenciar a ação das enzimas como
biocatalisadores; entre estes podem ser citados a temperatura, o pH, as interações químicas do
fluído, os agentes químicos e as irradiações. Altas temperaturas provocam a desnaturação das
enzimas, por alterar as ligações químicas que mantêm a estrutura tridimensional da enzima
(Borzani et al., 2001).
A aplicação das enzimas como biocatalisadores em processos industriais tem
aumentado gradativamente. Entre os processos de maior interesse, estão as reações de
hidrólise, síntese e transesterificação de lipídios, particularmente triacilgliceróis, por ação de
lipases (Hasan et al., 2005). As enzimas de origem vegetal ou microbiana são obtidas com
maior facilidade que as de origem animal, sendo que as de maior interesse comercial são as
enzimas microbianas devido ao curto período de desenvolvimento, à grande variedade de
processos metabólicos e à infinidade de microrganismos presentes na natureza passíveis de
serem testados, além de modificarem e degradarem moléculas orgânicas complexas (Conti et
al, 2001).
2.7.1 Alcoólise enzimática
A transesterificação é o processo mais utilizado, atualmente, para a produção de
biodiesel. Consiste numa reação química dos óleos vegetais ou gorduras animais com álcoois
de cadeia curta, como etanol ou metanol, na presença de um catalisador, da qual se obtêm os
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32
ésteres e o glicerol. A reação de transesterificação é acelerada pela catálise ácida, básica ou
enzimática. A utilização da lipase como biocatalisador na produção de biodiesel tem um
grande potencial comparado com os métodos químicos, porque não exige operações
complexas para recuperação do glicerol e eliminação do catalisador, além de evitar etapas de
purificação (Ban et al., 2000).
As vantagens ambientais do processo enzimático comparado ao químico são claras,
pois requerem menor gasto energético com temperatura elevadas, os produtos são mais
facilmente recuperados e a quantidade de glicerol, subproduto do processo, é menor. O custo
das lipases é consideravelmente maior que dos catalisadores químicos, entretanto o
procedimento de imobilização da lipase facilita uma posterior reutilização do biocatalisador,
podendo tornar o processo economicamente mais viável (Villeneuve et al., 2000).
O processo geral da reação de transesterificação é normalmente uma seqüência de três
etapas consecutivas e reversíveis, em que um éster é transformado em outro pela mudança na
porção alcóxi (radical alquila ligado ao átomo de oxigênio, RO-). Na primeira etapa, as
moléculas de triacilglicerol são convertidas em diacilglicerol, depois em monoacilglicerol e,
finalmente, na última etapa, o glicerol é obtido. Os álcoois que podem ser utilizados neste tipo
de reação são metanol, etanol, propanol, butanol, álcool amílico, entre outros. Entretanto,
devido às propriedades conferidas ao produto, o metanol e o etanol estão entre os principais
agentes de transesterificação e são os mais freqüentemente empregados no processo (Darnoko
e Cheryan, 2000; Marchetti et al., 2005).
No entanto, produzir biodiesel por etanólise, que usa o etanol, não é um processo tão
simples quanto realizar a transformação com o uso do metanol, denominado metanólise. Uma
dificuldade no processo de etanólise é a necessidade de se utilizar o etanol anidro, pois o uso
do etanol hidratado reduz o grau de conversão da reação, levando à ocorrência de reações
indesejáveis, como a saponificação (Ma e Hanna, 1999). Outro problema importante a ser
destacado é a maior dificuldade de separação dos produtos, ésteres etílicos e glicerol.
No caso da síntese dos ésteres metílicos, o glicerol pode ser facilmente separado por
decantação. O metanol também é muito utilizado na reação de transesterificação devido ao
seu baixo custo, maior reatividade, menor consumo de energia no processo e disponibilidade
como álcool absoluto, além de ser utilizado em pequeno excesso no processo. Como a reação
_____________________________________Dissertação de Mestrado Marilda Macagnan –UNISC - 2007
33
é reversível, o álcool é utilizado em excesso a fim de deslocar o equilíbrio para um máximo
rendimento de éster e também para permitir a posterior separação dos ésteres e glicerol (Neto
et al., 2000; Fukuda et al., 2001).
O uso do etanol, mesmo com suas desvantagens técnicas e econômicas, é muito
atrativo, pois é menos tóxico e assim mais seguro de se trabalhar que o metanol, além de ser
proveniente de biomassa, tornando o processo totalmente independente do petróleo. No
entanto, estudos publicados mostram que o metanol tem sido o mais empregado devido ao seu
baixo custo e grande disponibilidade em países da Europa, Japão e Estados Unidos da
América (EUA). No Brasil, o etanol tende a ser utilizado, visto que existe grande
disponibilidade desse produto com excelente qualidade para a aplicação na obtenção de
biocombustíveis ( Macedo e Macedo, 2004).
2.7.1.1 Extração e imobilização de lipases para aplicação na obtenção de biodiesel
A produção e imobilização de lipases já estão sendo direcionadas para a sua utilização
em etanólise ou metanólise. Muitos estudos foram realizados a respeito de alcoólises
enzimáticas de triacilgliceróis para a produção de biodiesel, utilizando vários tipos de óleos e
gorduras. Alguns desses resultados encontram-se na Tabela I. De um modo geral, percebe-se
que a transesterificação dos triacilgliceróis utilizando células imobilizadas é mais eficiente do
que o uso de enzimas não imobilizadas, apresentando um bom rendimento em menor tempo
de reação tanto em sistemas com ou sem solventes orgânicos.
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34
TABELA I - Sistemas biocatalíticos utilizados para produção de biodiesel.
Biocatalisadores Agente microbiano Solvente Óleo Álcool Rendimento (%) Tempo (h)
Fonte
Lipase bruta Cryptococcus spp n-hexano arroz Metanol 86 120
Kamini e Iefuji, 2001
Bacillus sp Hexano ácido oléico Metanol 51 16
Dosanjh e Kaur, 2002
Burkholderia cepacia Água soja Metanol 40 1
Noureddini et al, 2005
Lipase livre
Burkholderia cepacia Água soja Etanol 35 1
Noureddini et al, 2005
Burkholderia cepacia
/ celite
Livre pinhão-manso
Etanol 98 8
Shah e Gupta, 2007
Bacillus sp / sefarose
4B ativada
Hexano ácido oléico Metanol 60 16
Dosanjh e Kaur, 2002
Burkholderia cepacia /
matriz de filosilicato
sol-gel
Livre gordura Metanol 98 48
Hsu et al, 2002
Candida antarctica /
matriz de filosilicato
sol-gel
Livre gordura Metanol 60 48
Hsu et al, 2002
Burkholderia cepacia
/silica
Água soja Metanol 67 1
Noureddini et al, 2005
Lipase imobilizada
Burkholderia cepacia
/silica
Água soja Etanol 65 1
Noureddini et al, 2005
Rhizopus oryzae Hexano soja Metanol 86 72
Zeng et al., 2006
Rhizopus oryzae Livre soja Metanol 72 72
Li et al., 2007
Sistema celular
íntegro
Rhizopus oryzae terc-butanol soja Metanol 90 24
Li et al., 2007
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35
Observou-se que a lipase imobilizada de B. cepacia utilizando óleo de Jatropha
(pinhão manso) mostrou-se mais efetiva na etanólise, apresentando uma taxa de conversão de
98 % em 8 horas de reação.
Noureddini et al. (2005) investigou a enzima livre e a enzima imobilizada de B.
cepacia em processos de transesterificação de óleo de soja com metanol e etanol. A lipase
imobilizada, além de apresentar melhores resultados, foi constantemente mais ativa do que a
livre e também mais estável, apresentando maiores condições de reutilização no processo e
perdendo pouca atividade quando submetida a usos repetitivos.
Estudos mostraram que a utilização de células inteiras de R. oryzae como
biocatalisador tornou-se eficiente na metanólise de óleo de soja. Zeng, em 2006, demonstrou,
em seus ensaios, que, realizando o pré-tratamento da célula, aumenta consideravelmente a
taxa inicial de reação. Com isso, pode-se concluir que os óleos, além de agirem como
indutores para a produção de lipase, também são ótimas fontes de carbono para o cultivo da
célula, por apresentarem uma atividade catalítica mais alta, catalisando a transesterificação do
mesmo óleo para a produção do biodiesel.
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36
3 MATERIAL E MÉTODOS
Nesta seção, estão descritos os materiais e métodos utilizados para o desenvolvimento
do estudo da produção de lipase por fermentação em fase sólida de resíduos de sebo bovino
associado a grama e aplicação na produção de biodiesel.
Na Figura 3, encontra-se o diagrama da metodologia que foi adotada para a seleção de
microrganismo com atividade lipase e para produção de lipase com o microrganismo
selecionado.
Figura 3 - Diagrama da metodologia adotada para obtenção de lipase microbiana para a
produção de biodiesel.
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37
3.1 Amostragem
Foram utilizadas 16 amostras de grama, sendo 15 coletadas na cidade de Cruz Alta e
uma na cidade de Santa Cruz do Sul, oriundas de terrenos baldios, cinturão verde e jardins
residenciais. O material foi acondicionado em sacos de polietileno e, em seguida foi realizada
a transferência de 5 g de cada amostra para 2 frascos snap cap estéreis; em um deles, foi
acrescido 1 g de sebo bovino proveniente de açougue da cidade de Cruz Alta; as amostras
foram armazenadas a temperatura ambiente ( 25-30 ºC) até o processamento.
3.2 Seleção e Isolamento de culturas microbianas
Fragmentos de grama de cada amostra impregnados com sebo ou sem impregnação
foram transferidos para placas de Petri contendo 10 mL ágar lipase com a seguinte
composição (g L
-1
): Tween 80 10; peptona bacteriológica 10; cloreto de cálcio anidro 0,5;
cloreto de sódio 5; ágar bacteriológico 20, água destilada 1L. As placas foram incubadas a
30ºC por 7 dias e as colônias microbianas apresentando halo de precipitação branco
(formação de sabão de cálcio) foram selecionadas e reinoculadas em tubos de ensaio de
100x10 mm contendo 2 mL de ágar lipase não inclinado e incubadas por 7 dias para
determinação da formação de coluna de precipitação de sabão de cálcio e isolamento. As
culturas isoladas foram catalogadas com o código AX C/S Y ou AX S/S Y, assim
caracterizado,
A = amostra
X = Nº de amostra de grama coletada (de 1 a 16)
C/S ou S/S = iniciais de “Com Sebo e Sem Sebo”
Y = Nº da colônia isolada em uma determinada placa
3.3 Caracterização morfológica parcial de microrganismos com atividade lipolítica
Os isolados com atividade lipase positivos foram submetidos à análise macroscópica
para diferenciação entre culturas miceliais (fungos filamentosos) e viscosas (bactérias ou
leveduras). Para as culturas viscosas, foram realizados posteriormente ensaios de coloração de
Gram a fim de verificar as características morfológicas das células.
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38
O critério inicial para diferenciação entre leveduras e bactérias foi a visualização por
exame direto de células com definição até o tamanho de 600x (15 da ocular x 40 da objetiva).
Células que não puderam ser visualizadas até esta amplificação em microscopia de campo
claro foram classificadas como de bactérias. Candida albicans ATCC 10231 e
Saccharomyces cerevisae (fermento de pão comercial) foram utilizadas como padrões de
leveduras e Escherichia coli, Serratia marcescens como padrões de células bacterianas.
As culturas classificadas como leveduras foram inoculadas em ágar com a seguinte
composição (g L
-1
): glicose 40; peptona bacteriológica 10; ágar 20; água 1L. As culturas
classificadas como bactérias foram inoculadas em caldo nutriente com a seguinte composição
(g L
-1
): peptona 10; extrato de levedura 10; água 1L. Após 24 horas de incubação a 30 ºC foi
feita a avaliação da morfologia celular através da técnica de coloração de Gram.
Os fungos filamentosos selecionados foram submetidos à análise macroscópica e
microscópica. A análise macroscópica foi realizada por inoculação dos isolados em placas de
Petri com ágar Sabouraud e, após 7 dias de incubação a 30 ºC, observaram-se alguns aspectos
morfológicos das colônias. A análise microscópica foi realizada pela técnica de microcultivo
em lâmina usando como meio de crescimento o ágar Sabouraud. Após uma semana de
incubação, as lâminas com cada isolado foram analisadas em microscópio de campo claro
para caracterização de corpos de frutificação. Entre estes isolados, um apresentou aspecto
misto, micélio e levedura, sendo denominado como yeast-like.
3.4 Seleção das cepas fúngicas cultivadas em extrato de grama e peptona
As culturas fúngicas isoladas foram inoculadas em triplicata no centro de placas de
Petri (diâmetro de 7 cm) contendo 10 mL de ágar lipase ou ágar lipase grama (substituindo a
água destilada por 1 L de extrato de grama). O extrato de grama foi preparado na proporção
de 1 L de água destilada para 100 g de grama, triturado em mixer manual (Arno), aquecido no
microondas até a fervura e, logo após, filtrado. Após 24 horas de incubação, analisou-se o
crescimento dos isolados nos diferentes meios com medição de 12 em 12 horas dos diâmetros
perpendiculares de cada colônia.
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3.5 Produção de lipase por fermentação em fase sólida
Cada um dos oito isolados fúngicos foi inoculado em um erlenmeyer de 250 mL
contendo 100 mL de extrato de grama e incubado por cultivo estático a 30 ºC por 7 dias. Em
seguida, 1 mL de suspensão celular foi inoculada em 15 frascos de 50 mL contendo 5 g de
grama e 1 g de sebo bovino previamente esterilizados (120 ºC/20 min). O material foi
incubado à temperatura ambiente por 25-30 ºC, sendo coletadas triplicatas em 0, 1, 2, 3 e 4
semanas de cultivo, sendo armazenadas a -20 ºC até o processamento.
3.6 Dosagem de atividade lipase
A determinação da atividade enzimática foi realizada pela titrimetria dos ácidos graxos
liberados pela hidrólise do Tween 80. A determinação dos ácidos graxos livres foi realizada
em copos de becker com 1 g de amostra em 19 mL de solução 5 % de Tween 80 em tampão
fosfato 0,1 mol L
-1
pH 7,0. Para tanto, os copos de Becker foram selados com filme plástico e
incubados a 37 ºC por 30 minutos sob agitação constante de 40 rpm. Os ácidos graxos
liberados durante a reação foram então titulados até pH 9,5 com solução de NaOH 0,05 mol
L
-1
. Os controles negativos (brancos) foram obtidos incubando separadamente 1 mL de
amostra e 19 mL de substrato, sendo misturados imediatamente antes de iniciar a titrimetria.
A unidade de lipase foi definida como a quantidade de enzima que libera 1 µmol de
ácido graxo por minuto à temperatura de 37 ºC (Definição de Unidade Internacional de
lipase).
3.7 Manutenção da cepa selecionada
O fungo Penicillium sp. A12 C/S 4 foi mantido em tubos de ensaio contendo meio
com a seguinte composição (g L
-1
): sebo 2; ágar 25; extrato de grama 1 L. Após incubação
por 7 dias a 30 ºC, a cultura foi armazenada a 4 ºC.
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40
3.8 Produção de lipase de Penicillium sp. A12 C/S 4 por fermentação em fase sólida
de grama e sebo bovino
Os esporos de Penicillium sp. de 7 dias de cultivo a 30 ºC foram suspensos em água
destilada e padronizados pela técnica pour plate na faixa de 3 x 10
12
UFC/mL. Alíquotas de 2
mL dessa suspensão foram aplicadas em 42 frascos snap cap contendo 5 g de grama e 2 g de
sebo e incubadas a 30 ºC, recolhendo-se triplicatas de dois em dois dias por 14 dias e de 7 em
7 dias por mais 6 semanas. Após as coletas, os frascos foram armazenados a -20 ºC até a
determinação de atividade lipase.
3.9 Determinação do teor de gordura no meio de cultura
Para determinação do teor total de gorduras no meio de cultura foi utilizado um
sistema de extração Soxhlet. Aproximadamente 5 gramas da amostra foi adicionado no
cartucho e o solvente utilizado foi hexano. A extração foi conduzida por 6 horas. Após a
extração o solvente foi rotaevaporado e o resíduo de gordura extraída foi seca em estufa até
massa constante. O experimento foi realizado em duplicata. O resultado foi expresso em
porcentagem de massa de gordura residual sobre a massa total de amostra analisada.
3.10 Aplicação das enzimas (células) na produção de biodiesel
Foram preparados 46 frascos snap cap, nas mesmas condições anteriores (5g de
grama, 2g de sebo e alíquotas de 2 mL da suspensão de inóculo). De acordo com o resultado
da curva de atividade lipase, os pontos altos de produção da enzima ocorreram durante 7 e 35
dias de incubação. Estas amostras foram incubadas a 30 ºC e, após 7 dias retirou-se a metade
dos frascos e a outra metade aos 35 dias.
O material retirado foi suspenso em 25 mL de solução tampão fosfato 0,1 mol L
-1
pH
7,0. Agitou-se com um bastão de vidro para uma prévia homogeneização e foram
acondicionados em agitador mecânico a 35 ºC por 1 hora sob agitação constante de 50 rpm.
Após, filtrou-se a suspensão em funil analítico com gaze e algodão, reservando-se 30 mL do
filtrado para realizar as análises.
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3.10.1 Imobilização
Em 10 copos de Becker de 100 mL, adicionou-se, em cada um, 30 mL do caldo
filtrado juntamente com 300 mg de polipropileno poroso (PP) e 900 µL de etanol 95 %. Após,
filtrou-se com algodão. O PP foi liofilizado em equipamento FREEZE DRY SYSTEM –
LABCONCO, no modo automático com temperatura de -50 ºC, pressão 140 x 10
-3
mbar por
2 horas e 30 minutos o líquido resultante foi encaminhado para análise pelo Método de Lowry
para determinação de proteínas totais.
3.10.2 Determinação de proteínas totais
Para determinação de proteínas totais, foi utilizado o método espectrofotométrico
descrito por Lowry et al. (1951).
A partir de uma solução de 300 mg % de albumina bovina, foi confeccionada a curva
padrão com as concentrações de 50, 100, 150 e 300 mg %. Foram adicionadas quantidades
previamente calculadas da solução de albumina e 3,5 mL da solução C (descrita a seguir),
sendo as mesmas mantidas em repouso por 15 minutos. Após, foi adicionado 1mL do
reagente de Folin a cada balão, completando seu volume com água até 5 mL. Leu-se a
absorvância a 660 nm em triplicata.
Uma alíquota de 0,5 mL do caldo foi diluída até 10 mL com água. Foi retirada uma
alíquota de 0,5 mL desse balão e, ao mesmo, foram adicionados 3,5 mL da solução C.
Deixou-se em repouso por 15 min e, então, foi adicionado 1 mL do reagente de Folin. A
absorvância de cada amostra foi avaliada a 660 nm em triplicata, correlacionando os valores
de absorvância da curva para a determinação da quantidade de proteínas totais.
Solução A: em balão volumétrico de 250 mL, foi adicionado 1 g de NaOH, 5 g de
Na
2
CO
3
e completou-se com água deionizada
Solução B: em balão volumétrico de 100 mL, foi adicionado 1 g de citrato de sódio
( Na
3
C
6
H
5
O
7
), 0,5 g de sulfato de cobre penta-hidratado (CuSO
4
. 5H
2
O), completando-se com
água deionizada.
Solução C: em balão volumétrico de 50 mL, foram adicionados 49 mL da solução A e
1 mL da solução B. Essa solução C foi preparada ao realizar o experimento.
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42
3.10.3 Metanólise enzimática do óleo de girassol
Para a reação de metanólise do óleo de girassol, foram utilizados dois métodos: com a
lipase imobilizada e com biomassa bruta.
Primeiro foram utilizadas as seguintes condições: 0,5 g de óleo de girassol, 100 % de
biocatalisador imobilizado em relação à massa de óleo, 20 mL de hexano, proporção
óleo:metanol de 1:10, temperatura de 37ºC, e tempos de 24 a 72h. As reações foram
conduzidas em agitador mecânico (50 rpm) e analisadas por cromatografia em camada
delgada.
Com o segundo método, a reação foi conduzida utilizando 1 g de óleo, toda a
biomassa produzida, em conjunto com os substratos residuais, em pH controlado (5, 6 e 7),
50mL de hexano e 1:10 como proporção de óleo:metanol. A reação foi realizada em 37 °C em
agitador mecânico com 50 rpm.
3.10.4 Cromatografia em Camada Delgada
A análise qualitativa foi feita em cromatografia em camada delgada, com fase
estacionária sílica gel GF 256 (Merck). Na cromatoplaca, foram aplicados a amostra e o
padrão. O padrão consistia em óleo vegetal diluído em hexano. O desenvolvimento do
cromatograma foi realizado com a fase móvel hexano:acetato de etila (9:1 v/v) e a revelação
das substâncias separadas foi por adsorção de iodo. Para definição das variáveis de análise,
foram utilizadas separações de amostras de biodiesel produzidas por catálise básica.
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a apresentação da revisão bibliográfica e da descrição da metodologia aplicada
neste trabalho, estão apresentados e discutidos os resultados obtidos na condução dos
processos em fermentação em fase sólida. A associação do sebo bovino à grama criou as
condições de enriquecimento necessárias ao desenvolvimento de microrganismos com
potencial de lipase, tendo sido detectados bolores, aderidos à superfície do substrato em
poucos dias de fermentação.
4.1 Seleção de microrganismos com atividade lipolítica
Foram coletadas 16 amostras de grama e, para cada uma, foi preparado um recipiente
de vidro contendo resíduo orgânico vegetal e sebo, e outro, contendo apenas a grama, com a
finalidade de isolar microrganismos que desenvolvessem atividade lipase. Após 20 dias em
temperatura ambiente, fragmentos de grama de cada amostra foram inoculados em placas de
Petri contendo ágar lipase, permitindo que as colônias microbianas se formassem em diversos
pontos da placa, o que facilitou a identificação e numeração das mesmas.
Nas Figuras 4 e 5, encontram-se representados a frente e o verso de algumas amostras
inoculadas em ágar lipase.
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44
Figura 4 - Aspectos macromorfológicos de colônias isoladas da amostra A12
frente (A) e verso (B) em ágar lipase.
Figura 5 - Aspectos macromorfológicos de colônias isoladas da amostra A13
frente (A) e verso (B) em ágar lipase.
Foram observadas várias colônias e as amostras que apresentaram halos de
precipitação brancos foram isoladas. O ágar lipase é um meio diferencial, utilizado para a
identificação de ácidos graxos liberados pela hidrólise dos ésteres destes ácidos. Quando os
ácidos graxos são liberados no meio de cultura, reagem com o cálcio também presente,
formando sais de ácidos graxos que são visualizados sob a forma de halos de precipitação
brancos na superfície do ágar (Shelley et al., 1987).
Culturas de 75 amostras formaram halos indicando que os microrganismos secretaram
lipases para a degradação do Tween 80, éster de ácido graxo adicionado ao meio de cultura
A B
A B
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45
como indutor da atividade lipase. As culturas que induziram halo de precipitação foram
transferidas para tubos de ensaio contendo ágar lipase em tubo reto. Com esse ensaio, pode-se
confirmar a presença do precipitado branco e a pureza da cultura das 75 amostras isoladas,
conforme demonstrado na Figura 6.
A B
Figura 6 - Atividade lipase em coluna de isolados das amostras A) A7 e B) A12
Como foi relatado por Steele e Stowers (1991), a seleção primária é importante no
processo de triagem de microrganismos, onde estes são selecionados direta ou indiretamente.
Utilizou-se o método direto, pois, segundo os mesmos autores, este permite a identificação
específica do produto alvo. Os microrganismos foram cultivados em meio de cultura com ágar
lipase e, durante uma semana, observou-se a evolução da coluna de precipitação de sabão de
cálcio, sendo que a medida da altura da coluna formada abaixo da superfície do ágar foi
realizada após 7 dias de incubação. A Tabela II apresenta as medidas dos 75 isolados com
atividade lipase.
A B
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46
TABELA II - Altura da coluna de precipitação de sabão de cálcio de isolados com atividade
lipase.
Amostra
Classificação
Altura da
Coluna(cm)
Amostra
Classificação
Altura da
Coluna(cm)
Amostra
Classificação
Altura da
Coluna(cm)
A1 S/S 1(B) 1,26 A7 C/S 1(B) 1,48 A11 S/S 1(B) 0,41
A2 C/S 1 (F) 1,15 A7 C/S 2 (F) 1,01 A11 S/S 2(B) 0,77
A2 C/S 2(YL)
1,06 A7 C/S 3(B) 0,73 A12 C/S 1(L) 0,42
A2 C/S 3 (L) 0,49 A8 C/S 1(B) 0,43 A12 C/S 2 (F) 0,63
A2 C/S 4 (L) 0,63 A8 S/S 2 (L) 0,91 A12 C/S 3(B) 0,78
A2 S/S 5(B) 0,58 A8 S/S 3 (L) 0,90 A12 C/S 4 (F) 0,99
A3 S/S 1(B) 0,34 A9 S/S 1 (L) 0,32 A12 S/S 5 (F) 0,66
A3 S/S 2(B) 0,29 A9 S/S 2(B) 0,32 A12 S/S 6(B) 0,29
A3 C/S 3 (F) 0,57 A9 S/S 3(B) 0,17 A12 C/S 7(L) 1,29
A4 C/S 1 (F) 0,32 A9 S/S 4(B) 1,26 A13 S/S 1 (L) 0,51
A4 C/S 2(B) 0,16 A9 S/S 5(B) 1,60 A13 S/S 2(B) 0,23
A4 C/S 3 (L) 0,70 A9 S/S 6(B) 0,41 A13 S/S 3(B) 1,85
A4 S/S 4(B) 0,68 A9 S/S 7(B) 1,34 A13 C/S 4(L) 1,03
A4 C/S 5(B) 1,06 A9 C/S 8(B) 0,43 A13 S/S 7(B) 0,40
A5 S/S 1(B) 1,71 A9 C/S 9 (L) 1,19 A14 C/S 2(L) 0,39
A5 C/S 2(B) 0,23 A9 C/S 10(B) 0,27 A14 S/S 3 (L) 0,68
A5 S/S 3 (F) 0,28 A10 C/S 1 (L) 0,90 A14 S/S 4 (L) 0,88
A 5 S/S 4(B) 0,74 A10 C/S 2(B) 0,24 A14 S/S 5 (L) 1,33
A5 C/S 5(B) 0,90 A10 C/S 3(B) 0,25 A14 C/S 6(B) 0,65
A6 S/S 1 (L) 1,20 A10 S/S 4(B) 0,56 A15 C/S 1(B) 1,25
A6 S/S 2(B) 1,54 A10 S/S 5(B) 0,47 A16 C/S 1(B) 0,20
A6 S/S 3(B) 1,23 A10 S/S 6 (L) 1,07 A16 C/S 2(B) 0,31
A6 S/S 4(B) 0,88 A10 S/S 7(B) 1,80 A16 S/S 3(B) 0,20
A6 S/S 5(B) 0,57 A10 S/S 8(B) 0,37 A16 S/S 4(B) 0,38
A6 C/S 6(B) 0,40 A10 C/S 9(B) 0,44 A16 S/S 5(B) 0,29
(B) = Bactéria; (F) = fungo filamentoso; (L) = levedura; (YL) = yeast-like
Como pode ser observado, na Tabela II, todos os isolados confirmaram a produção do
precipitado branco, embora alguns tenham apresentado baixa produtividade de formação de
coluna de sabão de cálcio. Foi observado maior isolamento de bactérias (64 %), seguido por
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leveduras (24 %) e fungos filamentosos (12 %). Entre os isolados com menor potencial de
índice de precipitação, destacam-se A4 C/S 2 (0,16 cm), A16 C/S 1 e A16 S/S 3 (0,20 cm),
A5 C/S 2 e A13 S/S 2 (0,23 cm), A10 C/S 2 (0,24 cm) e A10 C/S 3 (0,25 cm), sendo que,
para outros, a produtividade foi melhor, assim como as amostras A5 S/S 1 (1,71 cm), A6 S/S
2 (1,54 cm), A7 C/S 1 (1,48 cm), A9 S/S 5 (1,60 cm), A10 S/S 7 (1,80 cm) e A13 S/S 3 (1,85
cm). Os isolados que apresentaram maior produção do precipitado branco foram as bactérias.
Entretanto, entre os microrganismos que apresentaram atividade lipase, foram selecionados
apenas os fungos filamentosos, porque as enzimas produzidas por eles são geralmente
extracelulares, facilitando sua extração do meio fermentativo e por se adaptarem melhor a
substratos de fermentação em fase sólida.
Este método permitiu uma melhor visualização da intensidade do precipitado de oleato
de cálcio, sendo um bom indicativo da produção de lipase. Entretanto sabe-se que a atividade
lipase não depende só da altura da coluna, mas também da concentração de sabão de cálcio.
Portanto, para determinar a atividade lipase é necessário realizar a dosagem do produto
formado (ácido graxo), o qual é liberado ao longo do tempo de incubação da reação
enzimática. Neste estudo, os ácidos graxos liberados foram quantificados pelo método
titrimétrico, que se fundamenta na titrimetria alcalina dos íons de hidrogênio liberados na
dissociação dos ácidos graxos, resultantes da ação das lipases sobre as moléculas do
triglicerídeo (Watanabe et al., 1977; Akhtar et al., 1980).
4.2 Análise macroscópica dos isolados com atividade lipase
Todas as amostras foram reinoculadas em placas com ágar Sabouraud, permitindo
identificar alguns aspectos morfológicos, tais como, cor, textura, brilho, tamanho, etc; em
algumas amostras, já foi possível visualizar a formação de micélios através da observação
direta dos tubos de ensaio. Com essa técnica, foi possível identificar culturas miceliais e
culturas viscosas classificadas como leveduras e bactérias, que foram posteriormente
identificadas através da coloração de Gram.
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A2 C/S 1 - Frente
A2 C/S 1 - Verso
A12 C/S 4 - Frente
A12 C/S 4 - Verso
A12 S/S 5 - Frente
A12 S/S 5 - Verso
Figura 7 - Aspecto das colônias cultivadas em ágar Sabouraud após 7 dias a 30ºC.
Através desses ensaios, baseado em critérios de visualização, foi possível descartar
amostras macroscopicamente semelhantes e as culturas não miceliais (viscosas), reduzindo-se,
assim, o número de oito amostras miceliais para a etapa de avaliação quantitativa da produção
de lipase.
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Dessa forma, as oito amostras de fungos filamentosos A2 C/S 1, A3 C/S 3, A4 C/S 1,
A5 S/S 3, A7 C/S 2, A12 C/S 2, A12 C/S 4 e A12 S/S 5 foram reinoculadas (em triplicata) em
placas de Petri para a avaliação do crescimento em dois meios distintos.
4.3 Seleção de cepas fúngicas que crescem em extrato de grama e peptona
Vários microrganismos produzem lipases em escala industrial, entre eles, muitas
espécies de bactérias, fungos filamentosos e leveduras. Um fator determinante em um
processo fermentativo é a seleção do microrganismo produtor, sendo que a cepa ideal deve
apresentar, entre outras características, um bom rendimento de produção, ser de fácil cultivo e
manutenção (Schmidt, 2005).
O crescimento microbiano e a formação de produto ocorrem em resposta ao ambiente.
Por isso, a formulação do meio de cultura é um fator importante para a otimização de um
processo fermentativo, para que atenda, primeiramente, ao crescimento microbiano. Devido a
isso, os microrganismos em estudo foram testados em dois meios distintos, ágar lipase
peptona e ágar lipase extrato de grama (em substituição à peptona) com a finalidade de avaliar
o seu crescimento como uma medida direta da melhor adaptação aos nutrientes do extrato de
grama associados ao sebo bovino.
Os gráficos das Figuras 8 e 9 apresentam o crescimento das culturas fúngicas em ágar
lipase peptona e ágar lipase grama relacionado com o tempo de incubação.
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0 12 24 36 48
0
1
2
3
4
5
6
7
A2 C/S 1
A3 C/S 3
A4 C/S 1
A5 S/S 3
A7 C/S 2
A12 C/S 2
A12 C/S 4
Curva de crescimento micelial radial
Ágar Lipase Peptona
Diâmetro do halo de
crescimento (cm)
Tempo (horas)
Figura 8 - Avaliação quantitativa do crescimento micelial radial das amostras
fúngicas cultivadas em ágar lipase peptona
0 12 24 36 48
0
1
2
3
4
5
6
7
Curva de crescimento micelial radial
Ágar Lipase Grama
Diâmetro do halo de
crescimento (cm)
Tempo (horas)
A2 C/S 1
A3 C/S 3
A4 C/S 1
A5 S/S 3
A7 C/S 2
A12 C/S 2
A12 C/S 4
Figura 9 - Avaliação quantitativa do crescimento micelial radial das amostras
fúngicas cultivadas em ágar lipase grama
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De acordo com as Figuras 8 e 9, foi observado que todas as amostras apresentaram um
crescimento contínuo em 48 horas, sendo que a amostra A12 C/S 2 cresceu mais rápido
durante esse intervalo de tempo, enquanto as demais demonstraram um crescimento menor e
similar entre si. Observaram-se reações de precipitação e, inclusive em algumas amostras, o
halo de precipitação quase se igualava ao halo de crescimento, mas, nesse experimento,
avaliou-se apenas o crescimento do fungo.
Conforme os dados obtidos através da curva de crescimento micelial radial, houve
uma diferença no crescimento dos fungos entre os dois meios de cultura analisados. O valor
máximo de crescimento da amostra fúngica A12 C/S 2 foi de 6,58 cm em 48 horas, para
ambos os meios; já a amostra A12 C/S 4 apresentou um crescimento máximo de 2,96 cm em
ágar lipase peptona e 2,47 cm em ágar lipase grama.
As formulações dos dois meios de cultura testados diferenciam-se apenas quanto ao
extrato de grama (água destilada e grama triturada e filtrada) em substituição à peptona e
apresentaram respostas distintas em relação ao crescimento das cepas fúngicas nos meios
testados.
A produção de lipases por fungos filamentosos varia de acordo com a cepa, com o
meio de cultura e com as condições de cultivo (Sharma et al., 2001). Geralmente a seleção
inicia com a avaliação do crescimento das cepas em meio de cultura sólido, em placas de
Petri. A detecção de colônias fúngicas com potencial de lipase pode apresentar dificuldades,
como o crescimento excessivo de alguns fungos e a baixa atividade de lipase ou devido à
interferência de metabólitos produzidos pelos fungos com corantes presentes no meio (Jensen,
1983).
Destaca-se também que a amostra A12 S/S 5 teve um crescimento muito rápido;
devido a isso, a avaliação do diâmetro do halo de crescimento foi realizada de 3 em 3 horas,
como mostra a Figura 10. Apesar de essa amostra ter apresentado um crescimento rápido,
verificou-se que o halo de atividade lipase em torno da colônia era muito pequeno; devido a
isso, essa amostra não foi selecionada para a fermentação em fase sólida.
Os valores das médias de crescimento em ágar lipase grama e ágar lipase peptona
encontram-se listados nas Tabelas III e IV.
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Figura 10 - Avaliação quantitativa do crescimento micelial radial da amostra
fúngica A12 S/S 5
TABELA III - Média e desvio padrão do crescimento micelial radial (cm) relacionado com o
tempo de incubação em ágar lipase grama (superior) e ágar lipase peptona (inferior).
Tempo (h)
Amostras
12 24 36 48
A2 C/S 1 0,65 + 0,07
0,67 + 0,04
1,39 + 0,02
1,33 + 0,07
1,99 + 0,06
2,12 + 0,04
2,80 + 0,06
2,57 + 0,12
A3 C/S 3 0,64 + 0,15
0,73 + 0,08
1,02 + 0,12
1,17 + 0,15
1,86 + 0,02
1,70 + 0,24
2,62 + 0,26
2,44 + 0,32
A4 C/S 1 0,66 + 0,08
0,65 + 0,04
1,35 + 0,09
1,21 + 0,01
1,95 + 0,16
1,86 + 0,06
2,64 + 0,13
2,52 + 0,05
A7 C/S 2 0,76 + 0,07
0,69 + 0,03
1,23 + 0,14
1,61 + 0,08
2,05 + 0,02
2,05 + 0,07
2,72 + 0,11
2,51 + 0,22
A12 C/S 2 1,85 + 0,04
3,50 + 0,02
3,53 + 0,07
4,06 + 0,00
4,98 + 0,05
4,98 + 0,02
6,58 + 0,05
6,58 + 0,08
A12 C/S 4 0,58 + 0,18
0,72 + 0,09
0,99 + 0,20
1,31 + 0,07
1,60 + 0,24
1,94 + 0,04
2,47 + 0,26
2,96 + 0,09
A5 S/S 3 0,34 + 0,14
0,20 + 0,10
0,99 + 0,15
0,88 + 0,14
1,81 + 0,08
1,51 + 0,26
2,43 + 0,23
2,32 + 0,11
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Conforme os resultados mostrados na tabela III, a amostra A12 C/S 2 apresentou
maior crescimento (6,58 cm) em ambos os meios, comparado às demais que apresentaram um
crescimento bem inferior a este, porém similar entre si. É importante destacar que apenas a
amostra A12 C/S 4 apresentou um crescimento superior em 48 horas, no meio ágar lipase
peptona comparado ao ágar lipase grama.
Como já foi dito anteriormente, o crescimento e produção de lipases pelos fungos são
influenciados por fatores ambientais, sendo que as respostas a esses fatores também são
diferentes entre as cepas fúngicas. Na Tabela IV, observa-se um crescimento muito rápido da
amostra A12 S/S 5, tanto no meio ágar lipase grama, quanto no meio ágar lipase peptona.
Pode-se visualizar, também, que, no meio ágar lipase grama, ocorreu um crescimento mais
elevado nas primeiras horas e, com o passar do tempo, o crescimento do fungo se iguala nos
dois meios de cultura.
TABELA IV - Média e desvio padrão do crescimento micelial radial (cm) relacionado com o
tempo para amostra A12 S/S 5, em ágar lipase grama e ágar lipase peptona.
Tempo (h)
Ágar
3 6 9 12
Lipase Grama 1,78 + 0,20 2,22 + 0,06 3,53 + 0,16 4,86 + 0,38
Lipase Peptona 1,13 + 0,01 1,58 + 0,25 2,76 + 0,14 4,11 + 0,16
O resíduo vegetal, utilizado como fonte de carbono no meio de cultura ágar lipase
grama, foi considerado favorável ao desenvolvimento dos fungos, pois houve diferença
quanto ao crescimento micelial radial, comparado ao meio ágar lipase peptona.
Segundo Gombert et al. (1999), a utilização de resíduos sólidos vegetais, como tortas
de sementes e amêndoas obtidas de processos de prensagem associada ao óleo de oliva, (em
sua pesquisa, usou torta de babaçu), leva à obtenção de maior atividade lipase do que com a
mesma torta e peptona, salientando a possibilidade de uso da torta associada a um óleo para
produção de lipases.
Em função de a lipase realizar reação de hidrólise, é importante que no meio haja um
conteúdo em óleo ou gordura, para que o efeito na produção de lipase seja mais pronunciado.
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Conforme Venkata et al. (1993), alguns resíduos, como farelo de arroz, alcançam essa
condição e também podem servir de suporte para a imobilização da lipase.
No emprego de outros resíduos vegetais, como a grama utilizada neste trabalho,
observa-se que há a necessidade de um componente lipídico, no caso o sebo, que permite a
obtenção de resultados relevantes em substituição aos meios clássicos de produção de lipase
com outros componentes desta natureza (azeite de oliva, por exemplo).
Isso é importante, pois a produção de lipase em FS e FFS tem uma diferença quanto ao
custo de produção, relacionado a investimentos necessários e a custo do produto final.
Utilizando a fermentação em fase sólida, os investimentos necessários são menores e o custo
do produto final também é menor. Um trabalho realizado por Castilho et al. (2000), permitiu
constatar que é vantajoso o uso de FFS, e em seu estudo, o sistema comparado foi semelhante
ao realizado neste trabalho, porém o resíduo sólido utilizado foi a torta de babaçu associada
ao óleo de oliva. Este autor encontrou 78 % mais investimentos para a FS e 68 % maior o
custo da lipase produzida.
Destaca-se também que o efeito sinérgico de um substrato oleoso com um resíduo
sólido vegetal já foi confirmado na fermentação em fase sólida, valorizando o uso de resíduos
com a finalidade de geração de novos produtos (Cordova et al., 1998).
4.4 Avaliação quantitativa da atividade lipase
O experimento anterior serviu para avaliação do crescimento micelial radial nos
diferentes meios de cultura (ágar lipase grama e ágar lipase peptona), uma vez que, em
fermentação em fase sólida, esta avaliação é feita por determinação da produção glucosamina,
que tem relação direta com a produção de biomassa fúngica (Desgranges et al., 1991). Como
o objetivo principal deste trabalho é produzir lipase por fermentação em fase sólida, foi
realizada, então, uma curva de produção de lipase com os isolados acima para verificar as
semelhanças e diferenças quanto à capacidade de produzir esta enzima em presença do
substrato íntegro.
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Após a reinoculação em resíduo vegetal (grama) e sebo bovino das culturas
selecionadas A2 C/S 1, A3 C/S 3, A4 C/S 1, A5 S/S 3, A7 C/S 2, A12 C/S 2, A12 C/S 4 e
A12 S/S 5, realizou-se o monitoramento das mesmas em tempos variáveis. As amostras
reinoculadas estão apresentadas na Figura 11 e foram analisadas após 7, 14, 21 e 28 dias. As
amostras analisadas após 21 dias estão apresentadas na mesma Figura (B).
Figura 11 - Ensaio comparativo de fermentação em fase sólida de isolados fúngicos
com potencial lipolítico em presença de grama e sebo bovino: à esquerda,
frascos em tempo zero; à direita, frascos após 21 dias de cultivo.
O gráfico da Figura 12 mostra a atividade lipase de cada amostra relacionada com o
tempo de incubação.
0 7 14 21 28
0
1
2
3
4
5
Unidades de lipase (U/g)
Tempo (dias)
A2 C/S 1
A3 C/S 3
A4 C/S 1
A5 S/S 3
A7 C/S 2
A12 C/S 2
A12 C/S 4
A12 S/S 5
Figura 12 - Avaliação quantitativa da atividade lipase de isolados fúngicos obtidos
de grama e cultivados por fermentação em fase sólida de grama
com sebo bovino.
B A
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De acordo com a Figura 12, pode-se observar que a maioria das amostras teve uma
elevação da atividade lipase em 7 dias de fermentação, ocorrendo, a partir daí, uma queda na
atividade até os 14 dias. A amostra A12 C/S 4 apresentou uma atividade lipase superior, pois,
a partir do 7º dia, foi a única que não reduziu sua atividade. Por esse motivo, definiu-se que
esta amostra seria utilizada como a amostra com maior potencial para a fermentação em fase
sólida.
Durante o crescimento do fungo para a produção de lipases, dependendo das
condições de cultivo, podem se formar proteases extracelulares ou intracelulares, no caso de
rompimento da hifa. A presença dessas enzimas pode dificultar o processo de recuperação da
lipase, interferindo na sua estabilidade (Gordillo et al., 1995).
Em estudos realizados para a produção de lipase em FFS, sempre ocorre um máximo
na atividade lipase (Gombert et al., 1999; Palma et al., 2000) e surgem como resposta ao
máximo predomínio de fatores indutivos positivos para a produção de lipase, a partir do qual
começam a ser sobrepujados por fatores negativos, tais como início da produção de proteases
que digerem a enzima, bem como diminuição de substrato indutor ou excesso de ácido graxo
livre (retroalimentação negativa), além de alteração do pH do meio. Em alguns casos, a
variação de fatores nutricionais leva a uma seqüência de liberação de isoenzimas com
potencial lipolítico com diferentes máximos de produção relacionados a enzimas com
diferentes propriedades, em função da variação da composição do substrato à medida que a
fermentação progride (Naessens e Vandamme, 2002).
A partir do ensaio de microcultivo, utilizado para análise de fungos, foi possível
identificar este microrganismo como uma cepa de Penicillium sp. A identificação foi realizada
por microscopia pelo Dr. Jair Putzke, professor da Universidade de Santa Cruz do Sul.
Através dos ensaios da avaliação quantitativa da atividade lipase das oito amostras
estudadas, observou-se que três delas (A4 C/S 1, A5 S/S 3 e A12 S/S 5) não apresentaram
elevação na atividade lipase com o tempo de incubação, sendo que a amostra A5 S/S 3
praticamente, nos 7 primeiros dias, conservou a atividade, e as amostras A4 C/S 1 e A12 S/S
5 diminuíram sua atividade.
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Os resultados mostram que as 5 amostras (A2 C/S 1, A3 C/S 3, A7 C/S 2, A12 C/S 2 e
A12 C/S 4), que apresentaram elevação da atividade lipase nos 7 primeiros dias de
fermentação, tinham associado ao seu substrato, por ocasião do isolamento, o sebo bovino, de
forma que este pode ter influenciado na produção de lipase pelos fungos testados. Entretanto,
num estudo realizado por Vargas (2004), que avaliou a produção de lipase por Penicillium
simplicissimum utilizando torta de soja como substrato, constatou que o acréscimo de vários
óleos ao substrato provocou uma queda da produção de lipases, dando indícios de que ocorreu
uma inibição da atividade da enzima devido ao excesso de substrato.
Vale ressaltar que Mahadik et al. (2002), em seu trabalho, obteve uma das mais altas
produções de lipase por fungo em FFS, verificando que a biossíntese da enzima somente
ocorreu na presença de um substrato lipídico e foi completamente reprimida através da
glicose. Os rendimentos mais altos de lipase (630 U/g) foram obtidos por FFS quando se
utilizou o farelo de trigo como substrato sólido em combinação com azeite de oliva como
substrato lipídico.
As fontes de carbono lipídicas têm mostrado serem essenciais para a obtenção de
lipase com alto rendimento, sendo que muitas delas geralmente são produzidas na presença de
uma substância indutora, que pode ser um triacilglicerol, um ácido graxo ou outro lipídio
(Shimada et al., 1992; Domínguez et al., 2003). Isso justifica a importância de se associar o
sebo bovino à grama e não simplesmente utilizar a grama como substrato exclusivo para a
obtenção de lipase pelo isolado em questão.
4.5 Avaliação quantitativa da atividade lipase da cepa de Penicillium sp.
A Figura 13 apresenta as curvas de atividade lipase da primeira e segunda replicata da
amostra selecionada em relação ao tempo de incubação.
A amostra A12 C/S 4 apresentou um aumento da atividade lipase com um posterior
declínio da mesma. Logo após, há uma recuperação da produção de lipase obtendo um pico de
produção da enzima em torno do 7º dia para as duas replicatas, seguido novamente de uma
queda na produção de lipase. De acordo com o gráfico obtido, observou-se que o isolado A12
C/S 4, a partir do 15º dia de fermentação, recuperou gradativamente a produção de lipase,
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indicando uma lenta assimilação da fonte de carbono utilizada como indutora da atividade
lipase (Tween 80).
0 10 20 30 40 50 60
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Unidades de lipase (U/g)
Tempo (dias)
Replicara I
Replicata II
Figura 13 - Avaliação quantitativa da atividade lipase do isolado Penicillium sp.
A12 C/S 4
Os meios também foram analisados quanto ao teor de gordura inicial e final. A
avaliação do percentual de gordura para a amostra com 7 dias de incubação foi de 19 % e para
o branco (sem inoculação e incubação) do meio grama e sebo foi de 40 % . Os resultados
mostram que o fungo utilizou o sebo como fonte de carbono para a produção de lipase.
O fato de ter sido reduzido o teor de gordura em cerca de 50 % em relação ao teor
inicial indica que houve consumo desta fonte de carbono para a indução de produção de
lipase. Este comportamento é verificado em processo de fermentação em fase sólida para
produção de lípases com outras fontes de material lipídico. (ver artigos)
4.6 Estudo da aplicação das lipases na produção de biodiesel
Conforme a avaliação quantitativa da atividade lipase do isolado Penicillium sp. A12
C/S 4, foram observados dois pontos de produção elevada. O fungo isolado foi cultivado em
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FFS de grama e sebo bovino nos tempos selecionados; a atividade lipase foi novamente
avaliada e procedeu-se à etapa de imobilização.
Com as amostras correspondentes a 7 e 35 dias de incubação, antes e depois de
imobilizada, foi confirmada uma atividade lipase, no filtrado, semelhante para esses tempos.
Com o monitoramento dessa atividade no filtrado, após a imobilização, observou-se que a
quantidade de lipase imobilizada foi mínima (< 12 % para amostra de 35 dias de incubação).
Devido à baixa taxa de imobilização, nos experimentos de produção de biodiesel não
foram observadas evidências de formação de ésteres metílicos (biodiesel). Da mesma forma,
para atividade lipase, também não foi observada redução do teor de proteínas no filtrado após
a imobilização, como mostra a Tabela V.
TABELA V - Teor de proteínas totais antes e depois da imobilização da lipase do isolado
Penicillium sp. A12 C/S 4.
Amostras Concentração mg/ 100 mL
7 dias antes da imobilização 4747
7 dias depois da imobilização 5820
35 dias antes da imobilização 4947
35 dias depois da imobilização 5438
Nas reações realizadas com a biomassa total, incluindo o resíduo de grama e sebo
retirada de um frasco snap cap (conforme descrito no item 3.9), observou-se que a reação de
metanólise biocatalisada pela lipase presente nesta biomassa é possível. Este resultado é
observado nas cromatoplacas apresentadas na Figura 14.
Figura 14 - Cromatoplacas da reação de metanólise com a biomassa de Penicillium
sp. (A) – antes da reação e (B) – após 24 h de reação.
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Nesta Figura 14, observa-se a presença de uma substância separada em Rf superior a
dos triacilgliceróis referente à presença de ésteres metílicos no meio reacional. Estes ésteres
podem ter sido formados na metanólise do sebo remanescente, correpondente à fração de 19%
de resíduo não utilizado como fonte de carbono pelo fungo ou do óleo de girassol adicionado.
Ressalta-se que, independente da origem dos ésteres formados, identificou-se que a lipase
hidrolisou triacilgliceróis. Como este é um estudo preliminar do uso da lipase isolada de
Penicillium sp. para metanólise de óleos vegetais, será necessário a continuidade deste
trabalho para avaliar de fato o seu uso na produção de biodiesel com uma alta conversão.
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir de várias amostras de grama associadas ao sebo bovino, foi possível
selecionar e isolar diversos microrganismos com potencial lipolítico, sendo observado o
predomínio de bactérias sobre fungos filamentosos e leveduras. Entretanto, foi dada a
preferência aos fungos filamentosos cuja atividade lipolítica fosse satisfatória. Dessa forma,
as bactérias e leveduras foram mantidas sob refrigeração para uma posterior utilização.
A substituição de peptona por extrato de grama em meio complexo para a produção de
lipase leva a um pequeno aumento do crescimento micelial radial para a maioria das cepas
fúngicas isoladas de cultivo de grama com sebo bovino, indicando que os componentes
presentes nesse extrato apresentam potencial nutricional para indução de crescimento e para
aplicação em fermentação em fase sólida, com barateamento do custo do processo.
A cepa de Penicillium sp. A12 C/S 4 foi selecionada a partir da comparação de sua
produção de lipases com as outras amostras fúngicas, sendo esta capaz de produzir uma maior
quantidade de enzima em um mesmo tempo de incubação.
Foi possível otimizar o processo de fermentação em fase sólida de cepa fúngica de
Penicillium sp sobre grama e sebo bovino em função do tempo, concluindo-se que ocorrem
picos de produção de lipase com a evolução da fermentação.
A produção de lipase pelo Penicillium sp. foi estudada isoladamente e, em estudos
qualitativos, foi confirmado que o fungo, no meio de cultura, produziu lipase que, pela sua
atividade, tem potencial para biocatalisar reações de produção de biodiesel. Nos experimentos
realizados com a lipase imobilizada, não houve formação de éster metílico, devido à baixa
taxa de imobilização. Entretanto, nas reações realizadas com a biomassa total, foi verificada a
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presença de ésteres metílicos no meio reacional. Essas reações devem ser exploradas com o
objetivo de utilizar a biomassa total evitando etapas de purificação. Neste sentido, os
resultados ainda são excipientes e exigem uma produção de biomassa em maior escala e testes
com controle de variáveis como temperatura, quantidade de biomassa, proporção óleo-álcool
e pH.
O processo de fermentação em fase sólida mostrou ser muito eficaz para a produção de
lipases. Os resultados obtidos indicaram não haver necessidade de utilização de fontes
suplementares de carbono e nitrogênio, sendo que o resíduo orgânico vegetal (grama),
associado ao sebo bovino, demonstrou ter um bom potencial nutricional, permitindo o
desenvolvimento do microrganismo tanto em termos de crescimento quanto em produção de
lipase.
Os resíduos agroindustriais podem apresentar tanto problemas de disposição final,
quanto de potencial poluente, além de representarem, muitas vezes, perdas de biomassa e de
nutrientes de alto valor. A utilização desses resíduos vegetais no processo de fermentação em
fase sólida é uma alternativa para o aproveitamento e valorização de resíduos sólidos, pois,
em virtude do crescimento microbiano, ocorre a síntese de diversos compostos, como enzimas
e outras substâncias de interesse de diferentes segmentos industriais. Esse processo também é
uma alternativa viável para reduzir os problemas ambientais causados por resíduos (gerados
por curtumes, entre eles, o sebo bovino) e subprodutos inerentes a qualquer setor produtivo.
Destaca-se, por último, que a produção de substâncias com potencialidade para uso
como biocatalisador em reações de produção de biocombustíveis, utilizando como substrato
resíduos industriais e agrícolas, tem um alto comprometimento com a questão ambiental e age
diretamente na busca de tecnologia limpa de produção, gerando resíduos inócuos que podem
ser incorporados ao meio ambiente sem impacto, comparando-se aos procedimentos clássicos
de utilização de catalisadores químicos. Além disso, aumenta o valor agregado aos resíduos
sólidos de partida.
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TRABALHOS FUTUROS
- Otimizar parâmetros físico-químicos e biológicos que influenciem na produção
máxima de lipase pelo fungo Penicillium sp.;
- Analisar a influência da concentração do sebo bovino sobre a produção de lipase
extracelular por Penicillium sp.;
- Avaliar a produção de outras enzimas microbianas como celulases, proteases e
amilases;
- Realizar a imobilização das células inteiras em outros polímeros;
- Realizar estudos utilizando a grama e sebo bovino como substrato para a produção de
lipase usando outros microrganismos.
- Modificar as condições de produção de biodiesel utilizando a biomassa total.
- Aplicar a lipase do isolado Penicillium sp. A12 C/S 4 para outros processos de
produção na área da oleoquímica.
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