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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
RESPOSTA FISIOLÓGICA E MOLECULAR DE DOIS
GENÓTIPOS DE MILHO À LIMITAÇÃO HÍDRICA
Rafaela Josemara Barbosa Queiroz
Engenheiro Agrônomo, MSc.
JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL
Outubro de 2010
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
RESPOSTA FISIOLÓGICA E MOLECULAR DE DOIS
GENÓTIPOS DE MILHO À LIMITAÇÃO HÍDRICA
Rafaela Josemara Barbosa Queiroz
Orientador: Prof. Dr. Jairo Osvaldo Cazetta
Coorientador: Prof. Dr. José Frederico Centurion
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de
Jaboticabal, como parte das exigências para
obtenção do grau de Doutor em Agronomia –
Área de concentração Produção Vegetal.
JABOTICABAL - SÃO PAULO - BRASIL
Outubro de 2010
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Queiroz, Rafaela Josemara Barbosa
Q3a Resposta fisiológica e molecular de dois genótipos de milho à limitação
hídrica. – Jaboticabal, 2010
xi, 154f.; 28 cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias, 2010
Orientador: Jairo Osvaldo Cazetta
Coorientador: José Frederico Centurion
Banca examinadora: Manuel Pedro Salema Fevereiro, Carlos Alberto Martinez
Y Huaman, Janete Aparecida Desidério, David Ariovaldo Banzatto
Bibliografia
1. Zea mays 2. Osmoprotetores. 3. Estresse hídrico I. Título. II. Jaboticabal –
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 633.61
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
RAFAELA JOSEMARA BARBOSA QUEIROZ - nascida em São Luis, Maranhão, em 19
de novembro de 1980, é Engenheiro Agrônomo, pela Universidade Federal Rural da
Amazônia – Belém, PA. Título esse concedido em 06 de novembro de 2003. Durante a
graduação, foi bolsista de Iniciação Científica do Programa Institucional de Bolsas de
Iniciação Científica (PIBIC) do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), participando ativamente em projetos de pesquisa da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa Amazônia Oriental). Obteve título de
Magister Scientiae
pelo programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal)
da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio
de Mesquita Filho”, Câmpus de Jaboticabal. Em Junho de 2006 foi aprovada para Curso
de Doutoramento na mesma área e instituição em que realizou o Mestrado. Em Março
de 2009, foi selecionada e contemplada com bolsa “sandwich” para desenvolver parte
da sua tese no exterior por meio do Programa de Doutoramento no País com Estágio no
Exterior Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal Superior (PDDE-CAPES).
A verdadeira beleza da ciência está em saber não
saber, em preferir ter mil dúvidas a uma certeza.
Em compreender que os “achados” podem ser
relativos, passíveis e mutáveis.
É ter prazer em desvencilhar-se deles, sem medos;
pois “saber não é uma supremacia sobre o quê os outros
não sabem, e sim um asilo dos achados de outros”.
E é isso que me instiga a uma incessante busca dos
porquês...
Penetrando-me cada vez mais aos meus
deslumbramentos e devaneios científicos...
Rafaela Josemara Barbosa Queiroz
Rafaela Josemara Barbosa QueirozRafaela Josemara Barbosa Queiroz
Rafaela Josemara Barbosa Queiroz
(Inverno Jaboticabalense de 2008)
"
Entender é sempre limitado. Mas não entender... pode não ter fronteiras..."
[ Cecília Meireles ]
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DEDICO
AGRADECIMENTOS
Ainda que uma tese seja um trabalho individual, há contribuições de natureza
diversa que não podem, nem devem deixar de ser ressaltadas. Por esse motivo, desejo
expressar os meus sinceros agradecimentos:
A Deus, meu Pai Celestial e Guia.
À minha família, minha Mãe Mara Inêz Mascarenhas Barbosa, meus Irmãos,
Saulo José Barbosa Queiroz e Paula Jéssica Chaves da Costa Barbosa, minha
cunhada Geovanna Oliveira Machado Queiroz e claro, aos meus filhotes Yorkshires,
Rubisco e Susy, e também meu Pitt Bull Bb bizon, meu primogênito. Vocês são as
Borboletas do meu Jardim! Passamos pelas crisálidas da vida, mas nós transformamos
nossas vidas num imenso, perene e colorido jardim!
Ao meu grande amor, meu marido, Marcelo Lira Pinheiro, pelo incentivo,
carinho, amizade e amor a mim confiados; principalmente, pela paciência em esperar o
término da Pós-Graduação, mostrando-me que seu amor é inabalável e persistente;
fazendo-me acreditar que para “estar junto” não-necessariamente se precisa estar
perto”. Você é a Ágape da minh’alma...
Ao Prof. Dr. Jairo Osvaldo Cazetta que me norteou desde os tempos de
Mestrado, cujo valor e contribuição em minha formação são incalculáveis. Mostrou-me
que para orientar, antes de tudo, é necessário ser amigo e ter muita paciência e,
principalmente, humildade. Para ele nunca foi um demérito dizer: - Vamos aprender
juntos! Pelo contrário, asilou-se de conhecimentos; e isso, para mim, é fazer ciência! O
que o faz grande, em todos os aspectos: Número, Gênero e Grau!
Ao Prof. Dr. José Frederico Centurion pelas orientações prévias à montagem
do ensaio experimental e Coorientação nas pesquisas da tese.
Ao Prof. Dr. Manoel Pedro Salema Fevereiro que sempre se mostrou solícito
ao pedido do doutoramento “sandwich”, sobretudo a sua receptividade em realizar
parceria com Instituições acadêmico-científicas brasileiras, bem como o quadro de
Investigadores Científicos do LBCV.
Ao Prof. Dra. Mara Cristina Pessoa da Cruz, pelo auxílio e interpretação das
análises de solo, bem como implantação do manejo nutricional do experimento.
Aos Pesquisadores, Dr. Eniel David Cruz e Dr. Moacyr B. Dias-Filho da
Embrapa Amazônia Oriental, meus queridos e eternos orientadores, mestres e amigos, a
quem sempre disponho para conselhos profissionais e pessoais, responsáveis pelos
meus “despertar” e “aguçar” à pesquisa científico-acadêmica.
Aos “irmãozinhos” de Pós-Graduação da Unesp/FCAV, Marcos Donizete
Revoredo e Helen Cristina de Arruda Rodrigues, e ao antigo orientado e
“escragiário” Guilherme Batista do Nascimento (Power), às estudantes de
graduação, Jacqueline Nayara Ferraça Leite (Abafa), Cilene Cristina Mathias
Mazzarelli (Dou-méstica), Nayara Patrícia Morotti (Philco), Mariana
Gianneschi Demetrio (Mariza, Mãe), Amanda de Faria Santos (Dou-rada) e
Jaqueline Cristina Fernandes (Sinistra), pela solicitude durante a condução do
ensaio experimental e análises, convívio e amizade.
Aos colegas do Laboratório de Análises Química e Bioquímica de Plantas
(Unesp/FCAV), sempre dispostos a deixar a realização das tarefas mais prazerosa e
menos maçante.
Aos amigos decênios Maria das Graças Sant’Anna Ferreira dos Santos,
Poliana Bento Bejo Altafim, Juliana Regina Rossi, Milena do Nascimento e
suas respectivas famílias e a Família Valadão. Que nunca deixaram esmorecer os
laços de amizade.
Às minhas queridas irmãs e (ex) companheiras da república “Farfaruei”, Vanessa
Cristiane Vollet; Natacha Deboni Cereser; Fernanda Malva Ramos Costa;
Juliana Moraes Boldini; Johanna Ramírez Díaz; Sônia Regina Alves Tagliari;
Greicy Mitzi Bezerra Moreno; Meire Aparecida Silvestrini Cordeiro; Verónica
Gonzalez Cadavid; Ludmilla Carregari e à agregada
mor
Samira Domingues
Carlin Cavallari pela amizade, incentivo, convivência alegre, paciência mútua,
descobertas, pelos sorrisos e situações inusitadas, porém, divertidas, compartilhadas;
pelo apoio nos momentos mais difíceis durante a conclusão do Mestrado e andamento
do Doutorado. Saibam que mesmo em um lugar muito, muito longe, sempre me
lembrarei dos anos, meses, dias, horas, segundos partilhados com vocês!
À Família Vollet, minha segunda família, que amenizaram a saudade de minha
casa, deixando-me fazer parte das suas vidas! Temos um laço afetivo que nem o tempo
e o espaço o desatarão.
A todos meus amigos e colegas do curso de Pós-Graduação, pela troca de
experiências, ensinamentos e bons momentos partilhados.
Aos meus primeiros alunos de graduação, Turma Bio08 da Unesp/FCAV, que
foram pacientes em assistir aulas de uma eterna aprendiza! Porém, que responderam,
grandiosamente, às exigências da disciplina de Química I; saibam que vocês
tornaram-me uma pessoa melhor e que houve um aprendizado mútuo! Espero ter
despertado em vocês o gosto em obter mais e mais conhecimento!
Aos funcionários da Unesp/FCAV, pelo apoio infra-estrutural .
À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho” (Unesp/FCAV), ao Programa de Pós-Graduação em
Agronomia/Produção Vegetal (PG/PV), bem como seu corpo docente, pela oportunidade
e contribuição em minha formação profissional e aos Departamentos de Tecnologia e
Biologia Aplicada à Agropecuária pelo apoio e uso infra-estrutural para realização desta
pesquisa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Superior (CAPES), pela concessão da bolsa
de estudos de doutoramento no Brasil e pela bolsa “sandwich” para estágio no Exterior.
“E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a
ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, se
não tivesse amor, nada seria... agora conheço em parte, mas então conhecerei como
também sou conhecido... Agora, pois, permanecem a fé, a esperança e o amor, estes
três, mas o maior destes é o amor. (1 Cor-13, 2;12-13)
ix
SUMÁRIO
Página
RESUMO.......................................................................................................................... x
SUMMARY ...................................................................................................................... xi
CAPÍTULO 1: Considerações Gerais .......................................................................... 04
CAPÍTULO 2: Reação osmoprotetora na germinação de sementes de milho sob
crescente potencial hídrico......................................................................................18
2.1. Introdução......................................................................................................20
2.2. Material e Métodos...........................................................................................21
2.3. Resultados e Discussão.....................................................................................24
2.4. Conclusões......................................................................................................35
2.5. Referências Bibliográficas..................................................................................35
CAPÍTULO 3: Tolerância de dois híbridos de milho à seca .......................................... 39
3.1. Introdução......................................................................................................41
3.2. Material e Métodos...........................................................................................43
3.3. Resultados e Discussão.....................................................................................48
3.4. Conclusões......................................................................................................63
3.5. Referências Bibliográficas..................................................................................64
CAPÍTULO 4: Quantificação da expressão gênica relativa do milho em resposta à
disponibilidade hídrica no solo por meio de qRT-PCR.................................................70
4.1. Introdução......................................................................................................72
4.2. Material e Métodos...........................................................................................76
4.3. Resultados e Discussão.....................................................................................89
4.4. Conclusões.....................................................................................................113
4.5. Referências Bibliográficas................................................................................113
Considerações finais..............................................................................................118
APÊNDICE............................................................................................................119
x
RESPOSTA FISIOLÓGICA E MOLECULAR DE DOIS GENÓTIPOS DE MILHO À
LIMITAÇÃO HÍDRICA
RESUMO – Nesta pesquisa foi avaliado o metabolismo de dois genótipos de
milho (
Zea mays
L.) ao estresse hídrico e a correlação entre o teor de compostos
responsáveis pela a aclimatação à limitação hídrica desses genótipos na germinação e
no estádio vegetativo. Foram instalados dois experimentos. Inicialmente, um ensaio de
germinação foi montado com o objetivo de verificar a tolerância de dois genótipos de
milho, DKB 390 e DAS 2B710 ao déficit hídrico e de quantificar a prolina e a trealose nos
tecidos endospermático e embrionário com intuito de descrever as suas funções
fisiológicas na germinação. O segundo avaliou o ajustamento osmótico através das
respostas bioquímicas e fisiológicas e moleculares de dois híbridos de milho sob duas
disponibilidades hídricas no solo, em um latossolo vermelho. A partir desses resultados,
verificou-se a tolerância destes híbridos a seca nesse estádio e o reflexo da expressão
relativa de genes relacionados à síntese de solutos compatíveis em reposta à limitação
hídrica no solo.
Palavras-Chave:
Zea mays
, solutos compatíveis, expressão gênica relativa, mRNA,
tolerância, seca.
xi
PHYSIOLOGICAL AND MOLECULAR RESPONSE OF TWO MAIZE GENOTYPES
TO WATER RESTRICTION
SUMMARY – The metabolism of maize genotypes (
Zea mays
L.) to soil water
avaibility and the correlation between the content of compounds responsible for this
acclimation to water limitation of these genotypes at the germination and the silking
stage. Two experiments were carried out. First, the germination test was evaluated the
tolerance of two genotypes of maize, DKB 390 and DAS 2B710 to water available and
also to quantify the proline and trehalose in the endosperm and embryonary axis tissues
with the aim of describe their physiological functions in germination. The second assay it
was examined the osmotic adjustment through biochemical and physiological responses
of two hybrids growing in two soil water availability. The results of that experiment,
checking the degree of tolerance of these hybrids and the reflection of the gene
expression related to synthesis of these compatible solutes in response to soil water
availability.
Keywords:
Zea mays
, compatible soluble, relative gene expression, mRNA, tolerance,
drought
1
CAPÍTULO 1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
1.1. Introdução
O milho (
Zea mays
L.), uma das gramíneas de maior importância econômica do
mundo, é cultivado em países de clima tropical, subtropical e de clima temperado com
verões quentes.
O estresse pela baixa disponibilidade hídrica (seca) é um dos principais
problemas da agricultura e a habilidade das plantas para resistir a tal estresse é de
suma importância para o desenvolvimento do agronegócio de qualquer país. Estudos de
tolerância à seca envolvendo o milho podem trazer melhorias no crescimento e no
rendimento da cultura em regiões com limitação hídrica, já que o milho é conhecido
pela sua alta sensibilidade a este estresse.
Grandes avanços em estudos sobre melhoramento do milho para a seca têm
trazido resultados satisfatórios, gerando genótipos tolerantes. Contudo, pouco é
conhecido sobre os mecanismos fisiológicos para a tolerância à seca. Nesse sentido, a
caracterização dos materiais genéticos, assim como a elucidação dos possíveis
mecanismos responsáveis pelo comportamento diferencial de genótipos sob condição de
estresse, pode facilitar o processo de geração de novos materiais genéticos, além de
contribuir para o desenvolvimento de técnicas de seleção que podem reduzir o tempo e
o trabalho para avaliação de fontes genéticas de tolerância ao estresse hídrico.
Diante do exposto, é importante que se estude o acúmulo de solutos compatíveis
e a expressão gênica de enzimas-chaves que regulam a biossíntese desses compostos e
se estes influenciam na tolerância de plantas de milho submetidas a condições
subótimas de água disponível no solo.
2
1.2. Revisão de Literatura:
1.2.1. O cultivo do milho propenso à limitação hídrica no solo
Previsões meteorológicas, através de projeções de modelos de simulação
climática, indicam um aumento do aquecimento global nas próximas décadas, sendo
esperada até o final do século XXI, uma variação de 1,4 a 5,8 ºC na temperatura. Em
decorrência disso, fenômenos como as secas são eminentes. Estima-se que este
aquecimento reduzirá em 20% a disponibilidade de água, não apenas nas zonas
propensas à seca, mas também nas regiões tropicais e subtropicais. Posto isso, deduz-
se que uma grave crise hídrica é esperada, pois a falta de água dificultará o aumento da
área agrícola irrigada e, consequentemente, a produção de alimentos, não havendo
água suficiente para a agricultura, que é responsável por 70% do consumo mundial
(Revisado por VIDAL et al., 2005).
De acordo com o cenário traçado pelos especialistas, as grandes culturas terão
suas áreas de cultivo reduzidas praticamente pela metade quando a temperatura média
da Terra estiver 5,8 ºC acima da atual, situação prevista para ocorrer num prazo de 50
a 100 anos (TILMAN et al., 2001).
O milho é cultivado em regiões cuja precipitação varia de 300 a 5.000 mm
anuais, sendo que a quantidade de água consumida por uma planta, durante o seu
ciclo, está em torno de 600 mm, apresentando relativa tolerância à limitação hídrica
durante a fase vegetativa. Porém, apresenta extrema sensibilidade na fase reprodutiva.
Dois dias de estresse hídrico no florescimento diminuem o rendimento em mais de 20%,
e quatro a oito dias no estádio de enchimento de grãos diminuem em mais de 50%. O
aumento na deposição de matéria seca nos grãos está intimamente relacionado à
fotossíntese e, uma vez que o estresse afeta este processo, reduz a produção de
3
carboidratos, implicando em menor acúmulo de matéria seca nos grãos (MAGALHÃES et
al., 2002).
Na maioria das áreas cultivadas com milho no mundo, a ocorrência de seca ou
períodos de estresse hídrico são fatores abióticos causadores de substanciais reduções
na produtividade. No Brasil, as áreas cultivadas com milho são predominantemente
desenvolvidas sem irrigação e mesmo em anos regulares de precipitação pluvial
observam-se, normalmente, perdas na produção em virtude de períodos de estiagem
denominados “veranicos”. As oscilações nas safras de milho, das principais regiões
produtoras do Brasil, estão associadas à disponibilidade de água, sobretudo no período
crítico da cultura. Por isso é fundamental avaliar os efeitos da disponibilidade hídrica
durante todo ciclo da cultura. Os efeitos dos fatores climáticos no crescimento e
desenvolvimento, assim como, a partição de assimilados entre os órgãos são
importantes nas taxas de crescimento da cultura (MAGALHÃES et al., 2009).
O solo e a atmosfera são os constituintes físicos do ambiente no qual a maioria
das espécies vegetais de interesse agronômico cresce e se desenvolve. São eles que
fornecem, de forma natural, as substâncias necessárias ao crescimento e ao
desenvolvimento das plantas, regulando a magnitude desses processos com o concurso
da energia disponível no meio (ANGELOCCI, 2002). A restrição causada pela baixa
disponibilidade de água do solo ou pela alta demanda evaporativa acionam certos
mecanismos bioquímico-fisiológicos que permitem aos vegetais tolerar essas limitações
climáticas. Dentre os mecanismos que contribuem para a tolerância à seca, os que têm
sido discutidos pela comunidade científica é o ajustamento osmótico. Esse, por sua vez,
inclui adaptações fisiológicas e bioquímicas de mecanismos que mantém o turgor celular
em condições de baixo potencial hídrico celular, pelo acúmulo e translocação de solutos
compatíveis nas células (VERSLUES et al., 2006).
4
1.2.2. Resposta de plantas ao déficit hídrico: aspectos bioquímico-fisiológicos
e moleculares
O estresse é geralmente definido como um fator externo que exerce uma
influência desvantajosa sobre a planta. Esse conceito está intimamente associado com
tolerância ao estresse, que é a capacidade da planta para enfrentar as condições
desfavoráveis. Já a tolerância à seca é a aptidão da planta para enfrentar um ambiente
desfavorável. Se a tolerância aumenta como consequência da exposição anterior ao
estresse, diz-se que a planta está aclimatada (TAIZ & ZEIGER, 2010).
Em ambas as condições, naturais e agrícolas, fatores ambientais, como
temperatura do ar, podem tornar-se estressantes em apenas alguns minutos. Conteúdo
de água no solo pode levar dias ou semanas, enquanto que outros fatores como a
deficiência mineral do solo, podem levar meses para se tornar estressantes. Respostas
celulares ao estresse podem incluir mudanças no ciclo e divisão celular, as membranas
celulares, a arquitetura da parede celular e metabolismo, por exemplo, a acumulação de
substâncias osmoticamente ativas (BRAY et al., 2001).
5
Figura 1. Resposta de plantas ao estresse hídrico (adaptado de BRAY et al., 2001).
O déficit hídrico em plantas inicia um complexo de respostas (Figuras 2 e 3),
começando com a percepção do estresse, o qual desencadeia uma cascata de eventos
moleculares que é finalizada em vários níveis de respostas fisiológicas, metabólicas e de
desenvolvimento. Em termos moleculares, o sinal de estresse, uma vez produzido pela
célula vegetal, deve ativar uma rota de transdução que envia esta mensagem aos
fatores de transcrição, que regulam a expressão dos genes encarregados da resposta ao
estresse. A perda do volume e da turgescência celular ou a concentração de solutos
altera a conformação de proteínas da parede celular e da membrana plasmática da
célula vegetal, ativando rotas de transdução de sinais que dão lugar à expressão de
determinados genes, transformando assim o fenômeno físico do déficit hídrico em uma
resposta bioquímica (BRAY et al., 2001).
Mudanças
Mudanças Mudanças
Mudanças
no genótipo
no genótipono genótipo
no genótipo
Susceptibilidade
SusceptibilidadeSusceptibilidade
Susceptibilidade
ACLIMATAÇÃO
ACLIMATAÇÃOACLIMATAÇÃO
ACLIMATAÇÃO
Sobrevivência
SobrevivênciaSobrevivência
Sobrevivência
Crescimento
CrescimentoCrescimento
Crescimento
ADAPTAÇÃO
ADAPTAÇÃOADAPTAÇÃO
ADAPTAÇÃO
Variedades
VariedadesVariedades
Variedades
Mutantes
MutantesMutantes
Mutantes
MORTE
MORTEMORTE
MORTE
ESTRESSE HÍDRICO
ESTRESSE HÍDRICO
ESTRESSE HÍDRICO
ESTRESSE HÍDRICO
Severidade
SeveridadeSeveridade
Severidade
Número de
Número de Número de
Número de
exposições
exposiçõesexposições
exposições
Combinação
CombinaçãoCombinação
Combinação
de estresses
de estressesde estresses
de estresses
Características
Características Características
Características
da planta
da plantada planta
da planta
Órgão
Órgão Órgão
Órgão
ou
ou ou
ou
tecido
tecido tecido
tecido
afetado
afetadoafetado
afetado
Estádio
Estádio Estádio
Estádio
de
de de
de
desenvolvimento
desenvolvimentodesenvolvimento
desenvolvimento
Genótipo
GenótipoGenótipo
Genótipo
Resultados
ResultadosResultados
ResultadosRespostas
RespostasRespostas
Respostas
Escape
EscapeEscape
Escape
Resistência
Resistência
Resistência
Resistência
Tolerância
TolerânciaTolerância
Tolerância
Duração
DuraçãoDuração
Duração
Características
CaracterísticasCaracterísticas
Características
do estresse
do estressedo estresse
do estresse
6
Figura 2. Modelo esquemático de um complexo de respostas à limitação hídrica
(adaptado de BRAY et al., 2001).
Essas substâncias osmoticamente ativas são moléculas ou íons atóxicos que não
interferem no metabolismo e se acumulam predominantemente no citoplasma, onde
têm função de manter a turgescência celular, além de estabilizar proteínas e estruturas
celulares nas condições subótimas dos fatores ambientais. O potencial osmótico da
solução celular, ou simplástica pode aumentar por perda de água ou por aumento da
síntese desses solutos (ANGELOCCI, 2002).
Há algum tempo, adota-se a hipótese de que o ajuste osmótico (osmoproteção) é
uma característica importante de aclimatação que confere vantagens às plantas
tolerantes ao estresse hídrico, porque é um modo de se manter o conteúdo de água da
célula em níveis adequados à atividade fisiológica (TAIZ & ZEIGER, 2010). No entanto,
existe outra vertente, que faz ressalvas ao ajuste osmótico como um mecanismo de
Alterações no
Alterações no Alterações no
Alterações no
metabolismo celular
metabolismo celularmetabolismo celular
metabolismo celular
Percepção
Percepção Percepção
Percepção
estresse
estresseestresse
estresse
Transdução
Transdução Transdução
Transdução
dos sinais
dos sinaisdos sinais
dos sinais
Modificações bioquímico
Modificações bioquímicoModificações bioquímico
Modificações bioquímico-
--
-
fisiológicas
fisiológicasfisiológicas
fisiológicas
, es
Problema:
a parte que “percebe”
(raízes) não é a
mesma que “gasta”
água
(folhas)
Solução:
um sinal deve ser
derivado das raízes
para os ramos e folhas
7
manutenção da turgescência e do crescimento do tecido sob deficiência hídrica ou
estresse, pois o processo seria limitado pela própria fotossíntese, que é a fonte de
solutos orgânicos, que em condições de estresse hídrico é reduzida (SERRAJ &
SINCLAIR, 2002).
Figura 3. A complexidade da resposta das plantas ao estress abiótico (adaptado de Prata, 2008
apud
VINOCUR & ALTMAN, 2005).
Es
tress
e
Secundário
Estresse Osmótico
Estresse Oxidativo
Seca
Frio
Sal
Calor
Poluição
Química
Falha na homeostasia
osmótica e iônica;
Danos de proteínas
funcionais e de estrutura
e membranas.
Mecanismos de
resposta ao estresse
Sinais sensoriais,
percepção e
transdução
Chaperoninas funcionais
(Hsp, SP1, LEA)
Mo
vimento de moléculas
água e íons (aquaporinas,
transportadores de íons)
Desintoxicação
Osmoproteção
:
prolina, açúcares,
polióis, etc.
Controle da
transcrição
Osmosensores, enzimas de clivagem de
fosfolipídios e mensageiros secundários (e.g.
Ca
2+
, ROS), MAP cinases, sensores de Ca
2+
e
proteí
nas cinases dependentes de cálcio
.
Fatores de transcrição
Ativação
de Genes
Restabelecimento de homeostase celular,
proteção de proteínas funcionais e de estrutura
e membranas.
Tolerância ao estresse
8
Assim, uma função do ajuste osmótico poderia estar potencialmente ligada à
eliminação de radicais livres, mas gerando, como função adicional, a retenção de água
(revisado por ANGELOCCI, 2002). O estresse hídrico quebra o equilíbrio
oxidativo/redutivo (redox) em várias organelas celulares, como os cloroplastos e as
mitocôndrias. O declínio na funcionalidade dos cloroplastos, inevitavelmente, leva à
geração de espécies como radicais livres.
O estresse desempenha importante função na determinação de como o solo e o
clima limitam a distribuição de espécies vegetais. O estresse é medido em relação à
sobrevivência da planta, produtividade agrícola, crescimento (acúmulo de massa seca),
processo primário de assimilação (absorção de CO
2
e de minerais), que estão
relacionados ao crescimento e desenvolvimento vegetal (TAIZ & ZEIGER, 2010).
Dentre os mecanismos de tolerância ao estresse hídrico, variações das respostas
fisiológicas, bioquímicas, bem como estratégias de crescimento têm sido comparadas e
discutidas em relação a características de tolerância de plantas à deficiência hídrica no
solo (STRECK, 2004; BARTELS & SUNKAR, 2005). O grau de tolerância de uma espécie
ou cultivar pode ser determinado através da capacidade de acumular solutos
compatíveis, os quais, além de atuarem no ajustamento osmótico, protegem as
estruturas celulares contra os danos induzidos pela desidratação e oxidação (ANAMI et
al., 2009). Por essa razão o nome soluto compatível utilizado algumas vezes para
designar estes osmólitos não é o mais apropriado devido estes compostos não serem
apenas compatíveis, ou seja, não prejudiciais quando em elevada concentração, mas
também protetores.
Medidas da variação da concentração de solutos têm sido usadas como meio para
avaliar a capacidade de ajustamento osmótico das plantas. Supõe-se que o estresse
hídrico pode afetar vias metabólicas ou "bombas" de íons ou causar um
desbalanceamento entre fotossíntese e translocação de solutos. O grau de ajustamento
osmótico na escala diária e em médio prazo varia bastante entre as espécies e até
9
mesmo entre genótipos. Desenvolve-se, preferencialmente, em plantas que sofrem uma
secagem lenta, não persistindo mais que alguns dias.
As reações bioquímicas e fisiológicas em resposta ao estresse hídrico podem ser
monitoradas através de alterações do padrão de expressão atividade que codificam
determinadas enzimas, como a nitrato redutase, glutamina sintetase, sacarose sintase,
trealase-fosfato-sintase, trealase, entre outras. O aumento ou redução da expressão de
um gene em plantas submetidas a condições de déficit hídrico pode ser fator
determinante da capacidade de aclimatação dessas plantas, podendo ser identificada
como um marcador molecular de tolerância ao estresse (VINOCUR & ALTMAN, 2005).
Por exemplo, alterações no metabolismo a nível molecular provocam, entre
outras reações, redução no teor de proteínas, como conseqüência da redução na sua
síntese ou na decomposição acentuada, resultando uma liberação reforçada de
aminoácidos. Neste caso há um acréscimo da atividade da enzima glutamina sintetase,
responsável pelo metabolismo dos aminoácidos, como a prolina (FERREIRA et al.,
2002). Um exemplo de redução da atividade enzimática é o decréscimo da conversão da
sacarose para amido nas folhas devido à diminuição da atividade da invertase, enzima-
chave que converte sacarose para hexose (SILVA & ARRABAÇA, 2004). Entretanto, o
estudo da atividade de enzimas de catabolismo de solutos compatíveis também é
importante, como a trealase. Esta enzima responsável pela hidrólise da trealose tem
atividade mais acentuada em plantas que as enzimas de síntese, pois para que este
dissacarídeo funcione como osmoprotetor, deve estar em concentrações baixas nos
tecidos vegetais, pois existem evidências científicas de que quando presente em altas
concentrações influencia negativamente nas chaperoninas, que são responsáveis pela
homeostase das proteínas (WINGLER, 2002).
A habilidade de algumas espécies ou genótipos de ajustar osmoticamente suas
células em condições de estresse hídrico é uma resposta bioquímica-fisiológica que
indica a capacidade destes organismos em aumentar a tolerância a períodos curtos de
seca (NEPOMUCENO et al., 2001). Muitos trabalhos evidenciam que o acúmulo da
10
trealose e da prolina livre constitui-se em um critério para estudos de tolerância à seca,
sendo estes osmoprotetores utilizados como indicadores bioquímico-fisiológicos de
estresse hídrico (VINOCUR & ALTMAN, 2005; ANAMI et al., 2009; ROSA et al., 2009,
DÍAZ et al., 2010).
Em condições de estresse, o metabolismo de aminoácidos é amplamente
alterado, sendo a síntese de proteínas diminuída e a proteólise aumentada. Como uma
consequência disto, ocorre a indução da biossíntese de prolina promovida pelo
incremento de metabólicos como poliaminas, amônia, arginina, ornitina, glutamina,
glutamato (FERREIRA et al., 2002). Várias funções são propostas a este acúmulo:
ajustamento osmótico; reserva de carbono e nitrogênio utilizados no crescimento para
restabelecimento após estresse; desintoxicação do excesso de amônia; estabilizador de
proteínas e membranas e eliminadores de radicais livres. Adicionalmente, existem
evidências de que a biossíntese desse aminoácido poderia estar também associada à
regulação do pH citosólico ou mediação do incremento da razão NADP+/NADPH,
influenciando o fluxo de carbono devido à via oxidativa da pentose fosfato. Além disso,
pode atuar como fonte acessível de energia, onde uma única molécula oxidada é capaz
de produzir 30 ATP (KAVI KISHOR et al., 2005).
A prolina livre é classificada como um “α – iminoácido”, pois seu grupo amino
está ligado a dois átomos de carbono, conferindo características de neutralidade à
molécula. O acúmulo deste aminoácido pode ocorrer por duas vias paralelas nas
plantas, uma direta e outra via ornitina (KAVI KISHOR et al., 2005).
A principal diferença entre as duas vias está na acetilação dos intermediários em
uma delas. Pela via direta (dependente de glutamato), após a formação do glutamato
semi-aldeído, a molécula se transforma em uma estrutura cíclica (∆’-pirrolina-5-
carboxilato), precursor da prolina. A estrutura cíclica é formada pela reação intra-
molecular (não-enzimática) dos grupos amino e aldeído do glutamato-semi-aldeído. Na
via dos derivados acetilados (dependente de ornitina), a presença dos grupos acetil
ligado ao grupo 2-amino impede essa reação interna, e uma estrutura aberta, a ornitina,
11
é formada. A ornitina pode ainda levar à formação da estrutura cíclica da prolina, após
perda do grupo amino por transaminação. Embora as duas vias de biossíntese de
prolina livre sejam igualmente importantes em condições normais, existem evidências
que favorecem a via direta do glutamato (sem acetilação) em condições de estresse
hídrico (BARTELS & SUNKAR, 2005; FUNCK et al., 2008).
Figura 4. Rota metabólica do aminoácido prolina.
NO
NONO
NO
3
33
3
-
--
-
NO
NONO
NO
2
22
2
-
--
-
NH
NHNH
NH
3
33
3
RN
RNi
∆
∆∆
∆
’
Pirrolina 5
’
- Carboxilato sintetase
Redutase nitrato
Glutamina sintetase
∆
∆∆
∆
’
Pirrolina 5
’
- Carboxilato redutatase
Pro oxigenase
Ortina aminotransferase
12
Quando ocorre a assimilação de uma fonte de nitrogênio (amônio) pela planta,
esta exige uma alta demanda por esqueletos de carbono que poderia ocasionar em um
desvio de esqueletos de carbono para produção desse aminoácido (TAIZ & ZEIGER,
2010). Entretanto, estudos indicam que a prolina desempenha um importante papel
durante o desenvolvimento das plantas servindo como uma fonte rápida e acessível de
energia. Além disso, a oxidação de uma molécula de prolina fornece 30 ATPs para a
célula. Neste contexto, é importante saber como o acúmulo de prolina influencia outras
vias de energia relacionadas, bem como no metabolismo de carbono durante e após o
período de submissão a estresses abióticos (revisado por KAVI KISHOR et al., 2005).
O acúmulo de prolina livre em condições de estresse tem sido estudado por mais
de 45 anos. Dentre os osmólitos, a prolina é aquele que é mais pesquisado nas
respostas de vegetais superiores a estresses abióticos (KAVI KISHOR et al., 2005,
FUNCK et al., 2008).
Com relação aos compostos advindos do metabolismo do carbono, a trealose tem
despertado interesse pela comunidade científica. A trealose é um dos mais efetivos
osmoprotetores, em termos de concentração mínima requerida. É um dissacarídeo que,
por várias décadas, tem sido relatado em bactérias, fungos e leveduras como um dos
responsáveis pela capacidade desses organismos de tolerar altos níveis de desidratação.
Somente no final da década passada foi identificada em plantas superiores. A
dificuldade na identificação de trealose, provavelmente, foi devido à alta atividade da
enzima trehalase em plantas superiores. A trealose liga-se às membranas celulares e
diminui sua temperatura de fusão, mantendo-as, assim, na sua fase líquido-cristalina
(Revisado por NEPOMUCENO et al., 2001; PAUL et al., 2008).
A trealose é dissacarídeo não-redutor, solúvel, é composto de duas moléculas de
glicose (α-D-glicopiranosil-[1,1]-α-D-glicopiranosídeo). Esse carboidrato é isômero
químico de outros dois dissacarídeos amplamente encontrados em plantas, a sacarose
(α-D-glicose-[1,2]-β-D-frutose) e a maltose (α-D-glicose-[1,4]-α-D-glicose). Eles têm a
mesma fórmula química (C
12
H
22
O
11
), entretanto, diferentes estruturas. Além destes
13
isômeros, existem três outros isômeros do dissacarídeo trealose: α,α-trealose, α,β-
trealose e β,β-trealose. Destes, apenas o α,α-trealose é encontrado endogenamente em
plantas. Apesar da biossíntese deste composto ser similar à da sacarose,
evolutivamente, a origem da trealose é mais antiga, devido à sua presença em todos os
reinos (GODDIJN & DUN, 1999) (Figura 5).
A sacarose é dissacarídeo não-redutor que pode ser hidrolisado em glicose e
frutose pela ação da invertase, ou então separada em frutose e uridina difosfoglicose
(UDPG) pela frutose sintase, conservando energia sob esta forma. Sendo os
polissacarídeos da parede celular sintetizados a partir de UDPG, é de extrema
importância a regulação da quantidade dos produtos deste açúcar. Pela figura 5 é
possível visualizar o papel central que este açúcar representa para o metabolismo das
plantas e como se relaciona com a trealose.
Figura 5: Modelo esquemático das vias metabólicas da sacarose e trealose
Glicose
+ Frutose
FOTOSSÍNTESE
S6P
Sacarose
UDP-Glic
Glic-1-P
Glic-6-P
Amido
UDP-Glicose +
Glicose-6-P
Trealose 6 -P
Trealose
2 Glicose
T
realase
Pi
H
2
O
TPP
TPS
UDP
H
2
O
SuSy
SPS
UDP-Glic
ADP-Glic
UDP-Glicose
pirofosforilase
ADP-Glicose
pirofosforilase
Sacarose Sintase
Sacarose fosfato Sintase
Frutose-6-P
14
Quando submetidas à limitação hídrica, as plantas desenvolvem alguns
mecanismos de resposta a esse tipo de estresse, que se resumem em três principais
eventos: percepção dos sinais, respostas em nível molecular e respostas
morfofisiológicas.
15
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18
CAPÍTULO 2: REAÇÃO OSMOPROTETORA NA GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE
MILHO SOB CRESCENTE POTENCIAL HÍDRICO
RESUMO – O aminoácido prolina e o dissacarídeo trealose ocorrem naturalmente
nas plantas, mas acumulam-se nos tecidos em resposta à limitação hídrica. São
conhecidos pelos efeitos na proteção de enzimas e integridade de membranas, bem
como no ajustamento osmótico. O teor de prolina e de trealose nos tecidos
endospermático e embrionário foi estudado com o objetivo de descrever as suas
funções fisiológicas na germinação de dois híbridos de milho (DKB 390 e DAS 2B710)
em resposta a diferentes potenciais hídricos. As sementes germinaram em substrato de
papel contendo soluções de PEG 6000 (Polietilenoglicol) com diferentes potenciais
hídricos: 0,0; -0,3; -0,6; -0,9 ou -1,2 MPa. A diminuição do potencial hídrico reduz a
germinação e a massa seca da parte aérea e raiz das plântulas dos híbridos DKB 390 e
DAS 2B710. Em condição de limitação hídrica, o índice de germinação de sementes sob
tratamento foi semelhante entre os híbridos DKB 390 e DAS 2B710, contudo, o índice de
velocidade de germinação foi maior e o tempo médio de germinação foi menor no
híbrido DAS 2B710. A prolina pode ser utilizada como indicador metabólico de resposta
dos híbridos de milho (DKB 390 e DAS 2B710) à limitação hídrica durante a germinação
quando quantificada no eixo embrionário. No híbrido DAS 2B710 há o acúmulo de
prolina conforme a redução do potencial hídrico. A trealose está presente na
constituição do endosperma e eixo embrionário dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710, mas
não indica resposta metabólica à limitação hídrica na germinação.
Palavras-chave: Prolina, trealose,
Zea mays
, estresse hídrico, híbridos, genótipos.
19
Reaction osmoprotectant on germination of maize seeds under increasing
water potential
ABSTRACT – The amino acid proline and the disaccharide trehalose occur widely
in higher plants, and usually accumulate in the tissues as a response to drought
stresses. Those compounds are known to have positive effects on protecting enzyme
and membrane integrity along with adaptative roles in mediating osmotic adjustment in
plants. The variability in proline and trehalose content in endosperm and embryos
tissues was studied with the objective to describe their physiological role in two
genotypes (DKB 390 and DAS 2B710) germinating maize in response to different water
potentials. Seeds were germinated on filter paper soaked with polyethylene glycol (PEG-
6000) solution corresponding to the water potentials of 0.0; -0.3; -0.6; -0.9 or -1.2 MPa.
The decrease of water potential reduces the germination and dry weight of shoot and
root of seedlings of DKB 390 and DAS 2B710 genotypes. Under water stress, the
germination index of the seeds under treatment was similar among the hybrids,
however, the speed of germination was higher and average time of germination was
shorter in DAS 2B710. Proline can be used as an indicator of metabolic response of
maize hybrids (DKB 390 and 2B710 DAS) to water limitation during germination when
quantified in the embryos axis. The DAS 2B710 hybrid accumulates proline as the
reduction of water potential. Trehalose is present in the constitution of the endosperm
and embryo axis of DKB and DAS 2B710 390 but does not indicate the metabolic
response to water limitation on seed germination.
Key words: Proline, trehalose,
Zea mays
, water stress, hybrids, genotypes.
20
2.1. Introdução
A seca é um dos fatores ambientais mais limitantes na produção do milho. Por
isso, há uma demanda por sementes de híbridos mais tolerantes aos estresses abióticos.
Os esforços da pesquisa nesse campo têm se concentrado no estudo da fisiologia de
plantas sob a seca, para determinar parâmetros e métodos rápidos de seleção de
híbridos tolerantes (MAGALHÃES et al., 2002; ANAMI et al., 2009).
Há indícios de que haveria plasticidade no grau de tolerância à limitação hídrica
do milho, em função do estádio fenológico da cultura, isto é, dependendo da fase de
desenvolvimento, uma planta pode ser mais ou menos suscetível à deficiência hídrica
(MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008; ABO-EL-KHEIR & MEKKI, 2007; ANAMI et al.,
2009). Todavia, são escassos os relatos de tolerância à seca, durante o processo de
germinação, embasados em respostas bioquímico-fisiológicas (THAKUR & SHARMA,
2005).
Dessa forma, há um interesse em se comprovar a diferenciação de híbridos de
milho quanto à susceptibilidade e/ou tolerância à seca mais precocemente, utilizando
ensaios de germinação, além da avaliação bioquímico-fisiológica da semente, para uma
melhor compreensão da fisiologia da germinação em condição de deficiência hídrica.
Uma resposta à limitação hídrica é o acúmulo de solutos osmoticamente
compatíveis com o metabolismo celular. Preconiza-se que essa resposta pode conduzir a
um ajustamento osmótico e à manutenção de um estado hídrico favorável para o
metabolismo e, nesse caso, os solutos denominam-se osmorreguladores. Em
contrapartida, a síntese de certos solutos compatíveis pode ter uma função primordial
na proteção de proteínas, na estabilização de membranas celulares e no controle de
espécies reativas de oxigênio, cuja produção aumenta em condições de deficiência
hídrica. Os solutos para tal finalidade são designados de osmoprotetores (MUNNS,
2002). Essas moléculas também podem ser reservas de energia e, também de
nitrogênio, no caso da prolina, para o restabelecimento da planta após período de
21
limitação hídrica (MUNNS, 2002; ANAMI et al., 2009). A prolina e a trealose são alguns
dos principais solutos compatíveis estudados na avaliação e distinção da tolerância de
plantas à seca.
Situações de estresse hídrico no solo podem ser simuladas em condições de
laboratório, utilizando-se soluções aquosas com diferentes potenciais osmóticos, como
as soluções de manitol e/ou de polietilenoglicol (PEG). Potenciais osmóticos muito
negativos, geralmente, ocasionam atraso ou mesmo diminuição na porcentagem de
germinação. O PEG é um agente osmótico, quimicamente inerte, atóxico para as
sementes e constituído por macromoléculas que dificultam a absorção da água pelo
tegumento (VILLELA et al., 1991). No presente trabalho foi usado esse artifício para
estudar a variabilidade do teor de prolina e de trealose nos tecidos endospermático e
embrionário, com o objetivo de descrever as suas funções fisiológicas na germinação de
dois híbridos de milho (
Zea mays
L): DKB 390 e DAS 2B710; bem como verificar o grau
de tolerância relativa à limitação hídrica desses genótipos.
2.2. Material e Métodos
O experimento foi desenvolvido na Unesp – Universidade Estadual Paulista, FCAV
– Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal, SP.
Tratamentos (simulação do estresse hídrico): inicialmente, o grau de umidade foi
avaliado em 25 sementes com quatro repetições pelo método de estufa a 105 ± 3
o
C
durante 24 h (BRASIL, 2009). Foram utilizadas sementes com características biométricas
semelhantes, sendo estas previamente tratadas com solução de nistatina a 1%
(fungicida) para manutenção da sanidade das mesmas. A cada três dias, as sementes
foram transferidas para novas caixas gerbox, contendo papéis umedecidos com o
respectivo tratamento, para manutenção constante dos potenciais osmóticos. As
parcelas foram distribuídas ao acaso em câmara de germinação (tipo BOD), em
22
condições controladas, 30 °C ± 2 °C, 60 ± 2 % UR e fotoperíodo de 12 h, de acordo
com BRASIL (2009). As contagens da germinação foram realizadas, diariamente, até o
término do ensaio experimental (10 dias após a imposição dos tratamentos),
considerando-se como germinadas as sementes com protrusão da raiz primária (2 mm).
Índice de germinação de sementes sob tratamento (IGT): a partir das contagens
diárias dos números de sementes germinadas para cada tratamento, calculou-se o IGT:
número de sementes germinadas sob estresse / número de sementes germinadas da
testemunha) x 100 (ZEID & EL-SEMARY, 2001).
Índice de velocidade de germinação (IVG): com os dados diários do número de
sementes germinadas, foi calculado o IVG, empregando-se a fórmula proposta por
MAGUIRE (1962).
Tempo médio de germinação (TMG): a partir das contagens diárias dos números de
sementes germinadas para cada parcela experimental, pode-se estimar o TMG segundo
EDMOND & DRAPALA (1958).
Massa seca dos tecidos (g MS): após a liofilização, a parte aérea (PA), as raízes (R),
o endosperma (EN) e o eixo embrionário (EE) foram separados manualmente,
utilizando-se luvas e lupa para melhor separação desses tecidos. Após o manuseio,
foram acondicionados em sacos de papel e armazenados em desumidificador até
atingirem massa constante; subsequentemente foram pesados em balança de precisão
(±0,01 g).
Teor de prolina (Pro): após a liofilização, o eixo embrionário e endosperma foram
separados e macerados em nitrogênio líquido e armazenados, separadamente, até a
determinação da prolina. O acúmulo de prolina livre foi quantificado no endosperma
(EN) e eixo embrionário (EE), segundo BATES et al., 1973.
Teor de trealose (Tre): a enzima trealase conidial foi preparada e purificada por
método de NEVES et al. (1994), com modificações. Realizou-se cromatografia de
filtração em gel em CM-cellulose column (0,6 x 30 cm). A trealose foi determinada
segundo método enzimático, utilizando-se 0,1 g de tecido liofilizado do EN e EE.
23
Tratamento estatístico: o delineamento experimental foi o inteiramente casualizado
em arranjo fatorial 2 x 5 (híbridos x potenciais hídricos - HxP) com 4 repetições. Cada
parcela experimental foi constituída de duas caixas tipo gerbox, cada uma contendo 25
sementes depositadas sobre papel germitest esterilizado e, dependendo do tratamento,
umedecido com água destilada estéril (testemunha) correspondendo ao potencial 0,0
Mega Pascal (MPa) ou com diferentes concentrações de PEG 6000, obedecendo aos
potenciais osmóticos: -0,3; -0,6; -0,9; e -1,2 MPa (sementes sob estresse). Os
resultados foram submetidos à análise de variância (teste F) e as médias comparadas
pelo teste de Tukey (5%) e análises da regressão polinomial foram utilizadas para o
desdobramento dos graus de liberdade do fator quantitativo potencial osmótico e para o
estudo da interação híbrido x potenciais osmóticos (BORGHETTI & FERREIRA, 2004;
SANTANA & RANAL, 2004). Realizou-se análise de correlação linear de Pearson entre as
variáveis avaliadas.
Figura 1. Esquema metodológico do ensaio da germinação de sementes de milho sob
crescente potencial hídrico.
24
2.3 – Resultados e Discussão
A diminuição da disponibilidade hídrica para a germinação (DHG), simulada pelo
polietilenoglicol (PEG), ocasionou redução de até 52% no índice de germinação de
sementes (IGT) sob o menor potencial osmótico, aos 10 dias após a imposição dos
tratamentos (DAT), independentemente do híbrido (Figura 2).
Figura 2. Efeito da limitação hídrica na germinação de híbridos simples de milho,
simulado pela solução de Polietilenoglicol (PEG 6000), no 10º dia após a
semeadura. Índice de germinação de sementes sob tratamento (IGT) de
híbridos de milho (Interação HxP
ns
; p>0,05)
IGE = -38,889x
2
- 7,6667x + 99,4
R² = 0,99**
0
25
50
75
100
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
Índice de germinação de sementes
sob tratamento (%)
Potencial Hídrico (MPa)
IGE DKB 390 = -47,675x
2
- 14,413x + 98,395
R² = 0,98
**
IGE 2B 710 = -38,889x
2
- 7,6667x + 99,4
R² = 0,99
**
0
25
50
75
100
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
IGE DKB 390
IGE DAS 2B710
25
Para o índice de velocidade de germinação (IVG) e o tempo médio germinação
(TMG), observou-se que o IVG reduziu-se proporcionalmente à menor DHG, enquanto
para o TMG a relação é inversa, isto é, maior foi o tempo despendido à germinação das
sementes. Nas variáveis IVG e TMG, verificou-se a diferença entre os híbridos, cujo
maior IVG e menor TMG foram verificados no híbrido DAS 2B710 (Figuras 3A e 3B).
Apesar do IGT de ambos híbridos assemelharem-se, averiguou-se que o IVG do híbrido
DAS 2B710, no maior e menor potencial osmótico (0,0 MPa e -1,2 MPa), foi de 10,9 e
2,8 sementes germinadas por dia, respectivamente, contrapondo os 9,1 e 1,6 sementes
germinadas por dia do híbrido DKB 390, para os mesmos potenciais.
Para o TMG do híbrido DAS 2B710 foram despendidos 2,4 e 6,5 dias para que
100% e 58% das sementes germinassem sob os potenciais 0,0 MPa e -1,2 MPa,
respectivamente; já para o híbrido DKB 390 foram utilizados 2,8 e 7,3 dias para que
100% e 45% das sementes germinassem, respectivamente.
Constatou-se que as variáveis que melhor descreveram o processo de
germinação em condições adversas foram o IVG e o TMG, principalmente na distinção
da resposta dos híbridos à limitação hídrica. Outra observação pertinente seria que,
possivelmente, a diminuição do IVG e o aumento do TMG em crescente limitação hídrica
poderiam ter sido ocasionados pela quiescência, para assegurar uma boa germinação e
o estabelecimento das plântulas em condições normais (FINCH-SAVAGE & LEUBNER-
METZGER, 2006).
Verificou-se que além do PEG diminuir a disponibilidade hídrica para a
germinação, comprometeu o estabelecimento das plântulas. A massa seca (g MS) em
diferentes tecidos das plântulas não foi reduzida proporcionalmente à disponibilidade
hídrica, por exemplo, nos tecidos endospermático (EN) e embrionário (EE). Tal fato foi
também observado por ZEID & EL-SEMARY (2001) e GILL et al. (2002), onde a
biomassa de tecidos como EN e EE não se reduziu, porém, a parte aérea e o sistema
radicular tiveram drásticas diminuições conforme a supressão da água, concordando
com os resultados apresentados na Tabela 1.
26
Figura 3. Efeito da limitação hídrica na germinação de híbridos simples de milho, simulado pela
solução de Polietilenoglicol (PEG 6000), no 10º dia após a semeadura. Interação HxP*
(p<0,05) para as variáveis Tempo médio (TMG) e Índice de velocidade germinação (IVG).
A) TMG e IVG do híbrido DKB 390 B) TMG e IVG do híbrido DAS 2B710. **Regressão
linear significativa (p<0,01).
IVG= -6,899x + 10,43
R² = 0,98**
TMG = -3,3767x + 2,1875
R² = 0,97**
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
Tempo médio de germinação
(dias)
Índice de velocidade de germinação
(sementes germinadas / dia)
Potencial Hídrico (MPa)
DAS 2B710
IVG = 5,6967x + 8,4745
R² = 0,96**
TMG = 3,388x + 2,819
R² = 1,00**
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
Tempo médio de germinação
(dias)
Índice de velocidade de germinação
(sementes germinadas / dia)
Potencial Hídrico (MPa)
DKB 390
A
B
TMG
IVG
IVG
TMG
27
Tabela 1. Modificações na massa seca (g/plântulas MS) de dois híbridos de milho em
diferentes potenciais hídricos (MPa) e tecidos*: parte aérea, endosperma,
eixo embrionário e raiz no 10º dia após imposição dos tratamentos.
Potencial
hídrico
(MPa)
Tecidos (g MS)
1
Parte Aérea
Endosperma
Eixo Embrionário
Raiz
DKB 390
DAS
2B710
DKB 390
DAS
2B710
DKB 390
DAS
2B710
DKB 390
DAS
2B710
0,0
1,64 ± 0,11 1,52 ± 0,13 5,03 ± 0,55 5,25 ± 0,23 1,87 ± 0,24 1,67 ± 0,18 2,08 ± 0,15 1,67 ± 0,69
-0,3
1,10 ± 0,19 1,65 ± 0,16 7,94 2,14 6,06 ± 2,07 1,91 ± 0,12 1,75 ± 0,19 1,69 ± 0,43 1,88 ± 0,33
-0,6
0,99 ± 0,03 1,53 ± 0,54 5,29 ± 0,58 5,13 ± 0,64 1,66 ± 0,03 1,62 ± 0,10 2,09 ± 0,26 2,72 ± 0,99
-0,9
0,90 ± 0,16 1,72 ± 0,00 6,90 ± 0,16 5,31 ± 0,37 1,58 ± 0,19 2,04 ± 0,09 1,22 ± 0,15 0,98 ± 0,06
-1,2
0,29 ± 0,01 0,57 ± 0,01 6,97 ± 0,90 7,40 ± 0,85 1,52 ± 0,07 2,38 ± 0,21 0,06 ± 0,00 0,73 ± 0,17
*Interação significativa entre híbridos x potenciais hídricos (p<0,05).
1
Valores da média e desvio padrão.
Essa resposta é esperada, pois a parte aérea e a raiz dependem da semente
(órgão fonte de reserva de energia de carbono e nutrientes minerais), podendo até
serem denominados de órgãos “comensais”, uma vez que há uma interdependência
com a semente, principalmente da interação entre endosperma e eixo embrionário, para
a formação desses órgãos (parte aérea e raiz), até que haja a autonomia dos mesmos
(MARCOS FILHO, 2005).
O teor de prolina no híbrido DKB 390, para os tecidos endospermático (EN) e
embrionário (EE), nessa ordem, foi de 0,2 e 2,6 µmol
g
-1
MS em 0,0 MPa. Contudo, em
situação de limitação hídrica (-0,3 a -1,2 MPa) acresceu-se, em média, em 2,8 e 2,7
vezes (Tabela 2). Em contrapartida, o teor do aminoácido nos tecidos EN e EE do
híbrido DAS 2B710 (0,2 e 0,5 µmol
g
-1
MS) aumentou em duas e oito vezes,
respectivamente. O acúmulo de prolina foi gradativo conforme houve a limitação hídrica
para o genótipo 2B 270, em ambos tecidos. Entretanto, para o DKB 390 apenas no EN
houve similaridade na tendência linear. No EE, o teor do aminoácido foi oscilante, tendo
um acúmulo máximo de 9,23 µmol
g
-1
MS em -0,32 MPa e mínimo de 3,66 µmol
g
-1
MS
em -0,93 MPa (Figura 4).
28
O acúmulo de prolina no EN e no EE das sementes em função dos diferentes
potenciais hídricos pode evidenciar a capacidade de osmoproteção dessas plantas
durante o processo de germinação em condição adversa. Outro fato, é que o EN é um
tecido altamente dependente do EE à mobilização de compostos. De acordo com
MOHAMMADKHANI & HEIDARI (2008), o acúmulo desse aminoácido é relativamente
dependente dos níveis de carboidratos nos tecidos e mencionam ainda que a sacarose
tenha um efeito positivo no acúmulo de prolina.
Sabe-se que o eixo embrionário possui maiores concentrações de açúcares não-
redutores e redutores, e que o endosperma tem seu metabolismo reduzido, pois a sua
função principal é a de reserva e fonte energética, ou seja, há a predominância em sua
constituição de macromoléculas como o amido (LOPES & LARKINS, 1993; BORGHETTI &
FERREIRA, 2004).
Tabela 2. Teor de solutos compatíveis (µmol/g MS) de dois híbridos de milho em diferentes
potenciais hídricos (MPa) e tecidos, endosperma e eixo embrionário no 10º dia após
imposição dos tratamentos.
Potencial
hídrico
MPa
Solutos compatíveis (µmol/g MS)
1
Prolina* Trealose
DKB 390 DAS 2B710 DKB 390 DAS 2B710
Endosperma
Eixo
embrionário
Endosperma
Eixo
embrionário
Endosperma
Eixo
embrionário
Endosperma
Eixo
embrionário
0,0
0,20 ± 0,00 2,61± 0,49 0,20± 0,00 0,54 ± 0,04 3,37 ± 0,60 8,02 ± 1,36 5,63 ± 1,67 7,75 ± 0,63
-0,3
0,31 ± 0,01
10,83 ± 0,59
0,20 ± 0,00 3,35 ± 0,42 2,36 ± 1,03 6,44 ± 1,29 2,75 ± 1,17 6,27 ± 1,50
-0,6
0,44± 0,10 4,38 ± 0,52 0,27 ± 0,04 3,52 ± 0,59 3,96 ± 1,03 6,17 ± 2,74 6,58 ± 1,13 6,93 ± 1,77
-0,9
0,56 ± 0,06 5,30 ± 0,62 0,40± 0,07 5,82 ± 0,82 3,00 ± 1,36 7,39 ± 1,11 3,23 ± 1,05 3,23 ± 1,05
-1,2
0,60 ± 0,08 7,62 ± 0,42 0,76 ± 0,04 6,61 ± 0,35 2,80 ± 0,44 4,18 ± 1,41 2,61 ± 0,44 2,61 ± 0,44
*Interação significativa entre híbridos x potenciais hídricos (p<0,05).
1
Valores da média e desvio padrão.
Adicionalmente, esse aminoácido pode ser considerado um indicador metabólico
de tolerância à seca para esses híbridos, principalmente se quantificado no EE das
sementes, onde o teor é até oito vezes superior ao do EN, mostrando-se acumulativo a
partir do potencial -0,3 MPa com leve declínio no potencial -1,2 MPa (Figura 5).
29
Figura 4. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) no
conteúdo de prolina (µmol g
-1
MS) em sementes germinadas de milho aos
dez dias após a imposição dos tratamentos. Interação significativa HxP**(p <
0,01). Tecidos: endospermático (EN) e embrionário (EE). Regressões
significativas: **p < 0,01.
Com isso, observa-se que a síntese de prolina (Pro), possivelmente, tenha um
limite ótimo, o qual é dependente da condição de restrição hídrica em que a semente
germina. O decréscimo do aminoácido pôde ter ocorrido em detrimento da semente
requerer energia para manutenção do seu metabolismo, podendo estar associado à
degradação de moléculas de Pro, resultantes da regulação recíproca das vias de síntese
e de degradação o que a torna fonte energética. A versatilidade do aminoácido foi
verificada por KAVI KISHOR et al. (2005) que relatam que a oxidação de 1 mol de
prolina pode gerar 30 mol de ATP (Adenosina trifosfato).
DKB 390 (EN) = -0,3488x + 0,2133
R² = 0,80**
2B 710 (EN) = -0,4386x + 0,1043
R² = 0,75**
2B 710 (EE) = -4,8715x + 1,0458
R² = 0,87**
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
Conteúdo de Prolina (µmol g
-1
MS)
Potencial Hídrico (MPa)
DKB 390 (EN)
DKB 390(EA)
2B 710 (EN)
2B 710 (EA)
30
Figura 5. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) sobre a
distribuição média da prolina nos tecidos endospermático e embrionário de
sementes germinadas de milho, aos dez dias após a imposição dos tratamentos.
Com relação ao conteúdo de trealose (Tre) nas sementes no 10º DAT, houve
oscilação nos teores nos tecidos endospermático (EN) e embrionário (EE), independente
do híbrido estudado (HxP
ns
, p > 0,05). Contudo, o teor de trealose no EE foi o dobro em
relação ao EN (Figura 6). A distinção quanto à concentração de metabólitos nesses
tecidos é esperada, como mencionado anteriormente. Apesar disso, notou-se a mesma
tendência em ambos tecidos conforme o estresse hídrico, em que nos potenciais -0,29
MPa e -0,78 MPa apresentaram acúmulo máximo de 6,62 µmol
g
-1
MS e mínimo de 5,90
µmol
g
-1
MS para EE, enquanto para o EN, 4,34 µmol
g
-1
MS foi o máximo acumulado (-
0,81 MPa), e mínimo 3,48 µmol
g
-1
MS (-0,29 MPa ).
Observou-se que há um
feedback
negativo entre EE e EN, corroborando com a
literatura DOWNIE et al. (2003). O potencial em que houve maior acúmulo de Tre no
eixo embrionário (-0,29 MPa), foi o de menor acúmulo no EN (-0,29 MPa ) e vice-versa
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0-0,3-0,6-0,9-1,2
Porcentagem média de prolina
acumulada
Potencial hídrico
(MPa)
Eixo embrionário
Endosperma
31
(Figura 6). Com isso, o aumento e declínio de Tre (Figura 7) indica que há uma
regulação metabólica entre os dois tecidos. O aumento, possivelmente, atrelou-se à
redução de polímeros, em grande parte compartimentalizados, metabolizados a partir
da demanda dessas moléculas na preservação da membrana plasmática, que estaria
desestabilizada pela seca (PAUL et al., 2008).
Figura 6. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) no conteúdo de
trealose (µmol g
-1
MS) em sementes germinadas de milho aos dez dias após a
imposição dos tratamentos.
Já a redução no teor de trealose (Tre) em ambos os tecidos poderia estar conexa
ao dispêndio de energia para sintetizar cada mol desse açúcar, que é limitado nas
plantas em condições adversas. Adicionalmente, há relatos do efeito deletério de
elevadas concentrações da Tre nas células do tecido vegetal, pois podem influenciar
negativamente as chaperoninas, responsáveis pela homeostase das proteínas
(WINGLER, 2002).
y = 8,7449x3 + 14,434x2 + 6,1588x + 4,268
R² = 0,24*
y = 6,2721x3 + 10,104x2 + 6,5359x + 7,8219
R² = 0,65*
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
-1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0,0
T
r
e
a
l
o
s
e
(
µ
m
o
l
g
-
1
M
S
)
Potencial Hídrico (MPa)
Endosperma
Eixo embrionário
32
Tal hipótese permite explicar as oscilações do teor nos distintos tecidos no
presente trabalho. Assim, para que haja a manutenção do nível ótimo deste açúcar nos
tecidos estudados, há um balanço entre a síntese e a degradação. De tal modo,
percebe-se que nem sempre existe a relação direta entre a síntese de Tre com o
aumento da limitação hídrica. Possivelmente, o soluto pode ter conduzido à manutenção
de um estado hídrico favorável para o metabolismo, atendendo a função de
osmorregulador. Do mesmo modo, como o acúmulo de Pro é relativamente dependente
dos níveis de sacarose (MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008), analogicamente, a
trealose poderia ter função comum, uma vez que possui função semelhante ao seu
isômero (WINGLER, 2002).
Figura 7. Efeito da limitação hídrica (simulada pela solução de polietilenoglicol) sobre a
distribuição média da trealose nos tecidos endospermático e embrionário de
sementes germinadas de milho, aos dez dias após a imposição dos tratamentos.
0%
25%
50%
75%
100%
0,0-0,3-0,6-0,9-1,2
Porcentagem média acumulada
de trealose
Potencial Hídrico (MPa)
Eixo Embrionário
Endosperma
33
Os estudos sobre a interação dos mecanismos dessas respostas, tanto do ponto
de vista fisiológico quanto bioquímico, podem ser observados na análise de correlações
de Pearson (Tabela 3).
Verificou-se a dependência entre algumas variáveis avaliadas em resposta à
germinação dos híbridos em limitação hídrica. Constatou-se que as variáveis que
quantificam a germinação têm correlação entre si, bem como com algumas variáveis
metabólicas. As sementes que germinaram mais rapidamente (alto IVG e baixo TMG) e
em maior percentual, apresentaram biomassa seca na parte aérea e radicular
proporcionais, bem como o teor de trealose (Tre) no eixo embrionário (Tre EE). O
inverso ocorreu para o teor de prolina (Pro), tanto no endosperma (Pro EN) quanto no
eixo embrionário (Pro EE). Com isso, demonstrou-se que esse dissacarídeo seria mais
constitutivo, uma vez que apresentou tendência similar às variáveis de crescimento.
Tabela 3. Estimativas dos coeficientes de correlação de Pearson (r) entre variáveis estudadas: Índice de
velocidade de germinação (IVG), Tempo médio de germinação (TMG), Índice de germinação
sob tratamento (IGT), Teor de prolina no endosperma (Pro EN), Teor de prolina no eixo
embrionário (Pro EE), Teor de trealose no endosperma (Tre EN), Teor de trealose no eixo
embrionário (Tre EE), Massa seca da parte aérea (MSPA), endosperma (MSEN), eixo
embrionário (MSEE) e Raiz (MSR) no 10º dia após semeadura.
IVG TMG IGT Pro EN
Pro EE
Tre EM
Tre EE
MSPA
MSEN
MSEE MSR
IVG -0,98**
0,88** -0,89**
-0,68* 0,47
ns
0,65* 0,75* -0,55
ns
-0,19
ns
0,68*
TMG -0,98* -0,96**
0,92** 0,64* -0,46
ns
-0,67* -0,83**
0,57
ns
0,17
ns
-0,79**
IGT 0,88** -0,96**
-0,89**
-0,47
ns
0,36
ns
0,63
ns
0,83** -0,49
ns
-0,14
ns
0,85**
Pro EN
-0,89**
0,92** -0,89**
0,49
ns
-0,41
ns
-0,43
ns
-0,85* 0,57
ns
0,32
ns
-0,73*
Pro EE
-0,68* 0,64* -0,47
ns
0,49
ns
-0,64* -0,56
ns
-0,56
ns
0,82** 0,27
ns
-0,47
ns
Tre EN
0,47
ns
-0,46
ns
0,36
ns
-0,41
ns
-0,64* 0,35
ns
0,38
ns
-0,65* -0,42
ns
0,57
ns
Tre EE
0,65* -0,67* 0,63
ns
-0,43
ns
-0,56
ns
0,35
ns
0,63
ns
-0,44
ns
0,18
ns
0,48
ns
MSPA 0,75* -0,83**
0,83** -0,85**
-0,56
ns
0,38
ns
0,63
ns
-0,69* 0,01
ns
0,68*
MSEN -0,55
ns
0,57
ns
-0,49
ns
0,57
ns
0,82** -0,65* -0,44
ns
-0,69* 0,27
ns
-0,55
ns
MSEE -0,19
ns
0,17
ns
-0,14
ns
0,32
ns
0,27
ns
-0,42
ns
0,18
ns
0,01
ns
0,27
ns
-0,21
ns
MSR 0,68* -0,79**
0,85** -0,73* -0,47
ns
0,57
ns
0,48
ns
0,68* -0,55
ns
-0,21
ns
Correlação significativa *p < 0,05 e **p< 0,01;
ns
não-significativa; N=10
34
O mesmo não ocorreu para Pro EN e Pro EE, havendo uma relação inversa, pois
as sementes que estiveram em condições hídricas ótimas para a germinação, não
necessitariam acumular o aminoácido. Dessa forma, esse soluto compatível atuaria,
efetivamente, na osmoproteção desses tecidos para assegurar o adequado
estabelecimento das plântulas em condições subótimas. Outra hipótese seria de que
além da prolina agir como uma molécula atóxica de proteção em condições de estresse,
também atuaria na dormência secundária da semente. De acordo com THAKUR &
SHARMA (2005), possivelmente, esse aminoácido faça parte do sistema que mantém o
desenvolvimento do eixo embrionário em repouso, o que corrobora com os resultados
de o teor acumulado de prolina ser maior nesse tecido (Figura 5), além da relação
inversa com IVG e direta com TMG (Tabela 3).
A relação negativa do teor de Pro EN com MSPA e MSR pode estar relacionada à
localização, atuando como fonte energética, uma vez que, com o aumento MSPA e MSR
há uma demanda energética para o estabelecimento da plântula, com isso o
metabolismo de moléculas de prolina é necessário. A relação inversa do MSEN com teor
de Tre EN poderia estar aliada ao metabolismo dos carboidratos (DOWNIE et al., 2003).
Acréscimos no potencial osmótico celular ocorrem pelos aumentos na concentração de
solutos compatíveis presentes na célula túrgida. Todavia, no caso da trealose, a
osmorregulação ocorreria devido à degradação do açúcar para atender a manutenção
do metabolismo, como fonte energética, atendendo a demanda celular na síntese de
moléculas como a prolina (relação inversa Tre En e Pro EE).
Dessa forma, o estudo da resposta na germinação de milho sob condições
adversas é complexo e muitos aspectos necessitam ser mais estudados, elucidados e
discutidos.
35
2.4. Conclusões
A diminuição do potencial hídrico reduz a germinação e a massa seca da parte
aérea e raiz das plântulas dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710;
Em condição de limitação hídrica, o índice de germinação de sementes sob
tratamento foi semelhante entre os híbridos DKB 390 e DAS 2B710, contudo, o índice de
velocidade de germinação foi maior e o tempo médio de germinação foi menor no
híbrido DAS 2B710;
A prolina pode ser utilizada como indicador metabólico de resposta dos híbridos
de milho (DKB 390 e DAS 2B710) à limitação hídrica durante a germinação quando
quantificada no eixo embrionário;
No híbrido DAS 2B710 há o acúmulo de prolina no eixo embrionário conforme a
redução do potencial hídrico;
A trealose está presente na constituição do endosperma e eixo embrionário dos
híbridos DKB 390 e DAS 2B710, mas não indica resposta metabólica à limitação hídrica
na germinação.
2.5. Referências Bibliográficas
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39
CAPÍTULO 3: TOLERÂNCIA DE DOIS HÍBRIDOS DE MILHO À LIMITAÇÃO
HÍDRICA
RESUMO: As plantas podem desencadear respostas à limitação hídrica como
alterações no metabolismo, crescimento e desenvolvimento. Os teores de sacarose,
trealose, açúcares redutores, amido, aminoácidos livres e prolina em folhas de milho
(
Zea mays
L.), nos híbridos DKB 390 e DAS 2B710, foram determinados em respostas
ao déficit hídrico no estádio vegetativo. O experimento foi conduzido em casa de
vegetação. As plantas foram cultivadas em vasos (54 dm
3
) contendo Latossolo vermelho
distrófico (LVd). Houve a redução na fotossíntese, na condutância estomática e no
crescimento dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710. O estresse hídrico induziu acúmulo de
sacarose e prolina, que podem ser indicadores metabólicos de resposta à limitação
hídrica dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710. O híbrido DKB 390 mantém os teores de
açúcares redutores e de amido, reduz o teor de trealose e aumenta o teor de
aminoácidos livres quando exposto a uma condição hídrica adversa. Já o híbrido DAS
2B710 reduz os teores açúcares redutores e de amido na menor disponibilidade hídrica
no solo e mantém os de trealose e aminoácidos livres nessas condições. Os híbridos
DKB 390 e DAS 2B710 apresentam tolerância semelhante à limitação hídrica no estádio
vegetativo.
Palavras-chave:
Zea mays
, fotossíntese, metabolismo, solutos compatíveis, estresse
hídrico.
40
Tolerance of two maize hybrids to water stress
ABSTRACT: Plants can trigger responses to water limitation as changes in
metabolism, growth and development. The levels of sucrose, trehalose, reducing sugars,
starch, total free amino acids and proline in leaves maize (
Zea mays
L.), DKB 390 and
DAS 2B710 varieties, were determined in response to a water deficit at the silking stage.
The experiment carried out in greenhouse. Plants were cultivated in pots (54 dm
3
)
containing Oxisoil. There was a reduction in photosynthesis, stomatal conductance and
growth of DKB 390 and DAS 2B710 hybrids. The water stress induced accumulation of
sucrose and proline, which can be indicators of metabolic response to water limitation of
DKB and 390 DAS 2B710. The DKB 390 hybrid maintains the reducing sugars and starch
content, reduces the level of trehalose and increased the free amino acids content when
exposed to adverse water conditions. Since the DAS 2B710 hybrid reduces the levels of
reducing sugars and starch in less soil water availability and maintain the trehalose and
free amino acids in these conditions. The DKB 390 and DAS 2B710 hybrids show similar
tolerance to water limitation in the vegetative stage.
Key words:
Zea mays
, photosynthesis, metabolism, soluble compatible, water stress
41
3.1. Introdução
Durante o ciclo de vida das plantas nem sempre as condições ambientais são
ótimos ao seu crescimento e desenvolvimento. Um importante fator ambiental que
frequentemente limita o crescimento é a redução na disponibilidade hídrica do solo. O
estresse hídrico ocorre geralmente na natureza e em ecossistemas de produção, de
maneira gradual e, por isso, as plantas tolerantes desenvolveram mecanismos para se
adaptarem às limitações hídricas do solo (MAGALHÃES et al., 2002; DURÃES et al.,
2004).
A tolerância de plantas a ambientes adversos ou a condições de fatores
ambientais subótimos envolve a adaptação a estresses múltiplos, com interações diretas
e indiretas. Assim, torna-se de grande importância a caracterização de genótipos
contrastantes, bem como os estudos sobre a interação e a sobreposição de
mecanismos, tanto do ponto de vista fisiológico quanto bioquímico (DURÃES et al.,
2004; ANAMI et al., 2009).
A capacidade de acúmulo de solutos compatíveis é uma resposta comum em
organismos sob condições adversas, e vem sendo muito investigada nas plantas nos
últimos anos (ZEID & EL-SEMARY, 2001; ABO-EL-KHEIR & MEKKI, 2007;
MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008; DÍAZ et al., 2010). Os vegetais superiores em
condições de estresse hídrico acumulam açúcares, prolina livre, ácidos orgânicos, íons,
entre outros solutos (BARTELS & SUNKAR, 2005; ANAMI et al., 2009). Estes solutos
compatíveis são moléculas ou íons atóxicos que não interferem no metabolismo e se
acumulam predominamente no citoplasma, onde têm função de manter a turgescência
celular, além de estabilizar proteínas e estruturas celulares nas condições subótimas dos
fatores ambientais (BRAY et al., 2001; BARTELS & SUNKAR, 2005).
O crescimento vegetal é reflexo do balanço de carbono na planta, que depende
dos processos de fotossíntese e de respiração nos vegetais, os quais, por sua vez,
dependem de uma complexa série de fatores ambientais, como disponibilidade de água,
de nutrientes e de energia (ANGELOCCI, 2002). A redução da capacidade fotossintética
é uma importante resposta ao estresse hídrico. Para conservar água, nutrientes e
42
carboidratos necessários para a sobrevivência, as plantas apresentam modificações
morfofisiológicas, como a redução da expansão foliar e o fechamento dos estômatos.
Como o estômato controla a difusão de CO
2
e de vapor de água, suas respostas à
deficiência hídrica são fundamentais no controle da eficiência de assimilação de CO
2
e
da economia de água (TAIZ & ZEIGER, 2010).
A cultura do milho (
Zea mays
L.) encontra-se amplamente disseminada no Brasil
e no mundo. Dessa forma, o cultivo desta espécie é realizado em determinadas regiões
cujo ciclo de desenvolvimento coincide com os períodos em que ocorre a limitação
hídrica, afetando o desenvolvimento das plantas, e, portanto, a produção da biomassa
vegetal. Estima-se que na região tropical, 95% do cultivo são realizados em áreas
propensas à deficiência hídrica, ocasionando um declínio de 10% a 50% da produção,
dependendo do estádio fenológico em que a cultura se encontra (MAGALHÃES et al.,
2002; MOHAMMADKHANI & HEIDARI, 2008).
O estresse pela baixa disponibilidade hídrica é um dos principais problemas da
agricultura e a habilidade das plantas para tolerar a tal estresse é de suma importância
para o desenvolvimento do agronegócio de qualquer país. Estudos de tolerância à
limitação hídrica envolvendo o milho podem trazer melhorias no crescimento e no
rendimento da cultura em regiões com limitação hídrica, pois o milho é conhecido pela
sua alta sensibilidade a este estresse (revisado por MAGALHÃES et al., 2009). Por isso,
o objetivo deste trabalho foi avaliar o acúmulo de solutos orgânicos e suas respectivas
contribuições para o ajustamento osmótico em folhas de diferentes híbridos de milho,
em distintas disponibilidades hídricas no solo.
43
3.2. Material e Métodos
3.2.1. Instalação e condução do experimento
O experimento foi desenvolvido na Unesp – Universidade Estadual Paulista, FCAV
– Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal, SP.
Com o intuito de se observar as respostas bioquímico-fisiológicas à limitação
hídrica foi desenvolvido um experimento em casa de vegetação com os híbridos DKB
390 e DAS 2B710 que possuem as características apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1. Características dos híbridos de milho
Empresa Híbrido Base genética* ciclo grão
Dekalb DKB 390
®
HS Precoce semidentado
Dow AgroSciences
DAS 2B710
®
HS Precoce semiduro
*Base Genética: HS-Híbrido simples.
Após a germinação e desbaste, foram mantidas três plantas por vaso com
capacidade para 54 dm
3
, as quais foram cultivadas em Latossolo Vermelho distrófico
(LVd), típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (ANDRIOLI &
CENTURION, 1999) sem restrição hídrica até o estádio V
3
, quando as plantas foram
submetidas a duas distintas tensões hídricas (-0,01 e -0,06 MPa). Sendo assim, os
quatro tratamentos implantados foram os seguintes:
Tratamento 1 = Híbrido DKB 390 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,01 MPa
(Controle);
Tratamento 2 = Híbrido DKB 390 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,06 MPa
(déficit hídrico);
Tratamento 3 = Híbrido DAS 2B710 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,01 MPa
(controle);
44
Tratamento 4 = Híbrido DAS 2B710 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,06 MPa
(déficit hídrico).
Para o controle do conteúdo de água no solo foram instalados dois tensiômetros
em cada unidade experimental, sendo um na profundidade de 10 cm e o outro na de 30
cm. Através de tensímetro digital, foi mensurada a umidade (tensão hídrica) do solo
com o monitoramento diário das leituras das tensões do solo, mantendo a umidade
concernente a cada tratamento (Figura 1). A estimativa da umidade do solo de cada
vaso foi realizada a partir da média das leituras dos tensiômetros instalados nos vasos.
A reposição de água foi realizada com uso de regas superficiais e de um tubo de PVC
com perfurações ao longo de toda a extensão do vaso, instalado no centro geométrico,
para garantir uma rápida e uniforme distribuição da umidade no solo do vaso.
Figura 1. O controle do conteúdo de água no solo foi realizado através de tensiometria.
Após a germinação foram mantidas três plantas por vaso, as quais foram
mantidas sem limitação hídrica até estágio vegetativo V
3
. A partir deste estádio, houve a
diminuição da tensão do solo conforme estabelecido nos tratamentos, mantidos até o
estádio V
10
(Figura 2).
As adubações de base e de cobertura foram realizadas de acordo com as
recomendações para a cultura do milho (RAIJ et al., 1997; FORNASIERI FILHO, 1992;
45
Vide apêndice A.3). A temperatura e a umidade relativa do ar foram monitoradas na
casa de vegetação, com auxílio de um termohigrômetro até o término do experimento.
Figura 2. Mantiveram-se três plantas/vaso. Visão geral do experimento
4.3.2. Avaliações bioquímico-fisiológicas
Durante o período de limitação hídrica, o comprimento de uma folha jovem em
expansão (com a lígula ainda não evidente) foi medido diariamente, no mesmo horário,
em todas as unidades para cálculo da taxa de elongação foliar. O alongamento diário foi
adquirido da diferença entre a medida do dia corrente com a do dia anterior. A
elongação foliar está relacionada à expansão da célula que é dependente do turgor
celular, o qual é extremamente sensível à limitação hídrica. Com auxílio de uma trena
mediu-se a altura das plantas (do solo até a inserção da folha +1) e a altura de inserção
46
de espiga (do solo até a inserção da espiga principal). O diâmetro foi avaliado com
auxílio de paquímetro no terceiro internó a contar do solo.
Na primeira folha jovem e completamente expandida foi medida a fotossíntese
líquida e condutância estomática, com auxílio de um medidor portátil de fotossíntese
(LI-6400, Li-Cor, Inc. EUA), equipado com uma fonte artificial de luz, ajustada para
3000 micro mol/m
2
/s, entre 9 e 12 h, horário local (Figura 3).
No estádio V
6
, foi coletada a folha +1 (caracterizada como primeira folha com
aurícula visível) no início da manhã e imediatamente armazenadas em nitrogênio líquido
e posteriormente transferidas para ultra-freezer ajustado a –80 ºC até serem realizadas
as quantificações dos metabólitos (Figura 4).
Figura 3. Mensuração da fotossíntese líquida e condutância estomática, com auxílio de medidor
portátil de fotossíntese (LI-6400, Li-Cor, Inc. EUA).
47
Figura 4. Amostras de folhas liofilizadas maceradas em nitrogênio líquido para análises
bioquímicas.
Para a extração dos metabólitos sacarose, açúcares redutores, amido e
aminoácidos livres, utilizaram-se 25 mg de cada amostra. Em seguida a amostra foi
agitada em um tubo de centrífuga contendo 1 mL de etanol 80% e em seguida colocou-
se em banho-maria a 60 ºC, por 30 minutos. Após centrifugação durante 20 minutos a
1.200 x g o sobrenadante foi retirado, adicionado mais 1 mL de etanol 80% repetindo-
se o processo por mais duas vezes, juntou-se os sobrenadantes e o volume completado
para 8 mL com água deionizada (FALEIROS et al., 1996).
Neste extrato foram determinados os teores de açúcares redutores através da
reação com DNSA (ácido 3,5-dinitrosalicílico), com posterior determinação
espectrofotométrica a 520 nm, seguindo as indicações de FALEIROS et al. (1996). Os
teores de sacarose foram determinados através da reação quantitativa com resorcinol,
com posterior leitura espectrofotométrica a 520 nm (FIEW & WILLENBRINK, 1987). Os
teores de aminoácidos livres foram determinados pela reação quantitativa com
ninhidrina, com posterior determinação espectrofotométrica a 570 nm (MOORE, 1968).
A prolina livre foi extraída e mensurada de acordo com método descrito por
BATES et al.(1973).
48
A trealose foi determinada por reação enzimática através da ação hidrolítica da
trealase em meio tamponado, sendo posteriomente, quantificado o produto glicolítico,
através da enzima glicoseoxidase e, posterior leitura espectrofotométrica a 505 nm
(NEVES et al., 1994).
Para as avaliações biométricas, a parte área foi separada nas partes: lâminas
foliares, colmo+bainha, flores e espiga, sendo acondicionadas em saco de papel e
colocadas para secar em estufa de circulação forçada de ar a 80 ºC até atingir peso
constante. Posteriormente foram pesadas em balança digital com precisão de ± 0,01 g.
3.2.3. Delineamento experimental e tratamento estatístico
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em um arranjo
fatorial 2x2 (dois híbridos x duas disponibilidades hídricas no solo) com cinco repetições,
a fim de se ter um melhor controle das variáveis ambientais dentro da casa de
vegetação.
Realizou-se a análise de variância pelo teste F, utilizando-se do teste de Tukey
para a comparação entre médias dos fatores qualitativos, híbridos (H) e disponibilidade
hídrica no solo (DHS), segundo BANZATTO & KRONKA (2006).
3.3. Resultados e Discussão
Para a grande maioria das respostas bioquímico-fisiológicas, a interação híbrido x
disponibilidade hídrica no solo (HxDHS) foi não-significativa (p>0,05), ou seja, os efeitos
da disponibilidade hídrica sobre a fotossíntese (A), a condutância estomática (gs), a
elongação foliar (EFM), a altura da planta (Alt), a altura de inserção de espiga (Alt.I.E),
o diâmetro do colmo (Diam.), a sacarose (sac.), a trealose (Tre) e a prolina (Pro)
independem do tipo de híbrido. Para as variáveis açúcares redutores (Aç.Red.), amido e
aminoácidos livres (AA) a interação foi significativa (p<0,05) (Tabela 1).
49
As plantas sob estresse hídrico apresentaram reduções significativas (≈ 98%) na
fotossíntese líquida (Figura 5). O híbrido DKB 390 apresentou valores 26,05 e 1,47
µmoles de CO
2
/m
2
/s nas DHS -0,01 e -0,06 MPa, respectivamente. Enquanto que para o
híbrido DAS 2B710 foram 29,43 e 1,47 µmoles de CO
2
/m
2
/s, nas mesmas condições. A
condutância estomática (Figura 6) também foi afetada no potencial mais negativo (-0,06
MPa), de forma similar nos híbridos de milho: de 0,37 para
0, 019 mmol de H
2
O/m
2
/s, para o híbrido DKB 390, e de 0,30 para 0,020 mmol de
H
2
O/m
2
/s no DAS 2B710.
50
Tabela 5. Análise de variância por meio do Teste F das respostas bioquímico-fisiológicas (
p value
) de híbridos de milho
submetidos a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
**significativo (
p
<0,01); *significativo (
p
<0,05);
ns
não-significativo (
p
>0,05).
Causa da variação
G.L.
p value
dos parâmetros bioquímico-fisiológicos
A Gs EFM Alt. Alt.I.E Diam. MST Sac. Tre. Ac.Red
Amido AA Pro
Híbridos (H)
1
0,46
ns
0,12
ns
0,78
ns
0,33
ns
0,57
ns
0,74
ns
0,77
ns
0,01** 0,01** 0,01**
0,10
ns
0,01**
0,30
ns
Disponibilidade hídrica
no solo (DHS)
1
0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01* 0,01** 0,01**
Interação HxDHS 1
0,46
ns
0,15
ns
0,67
ns
0,79
ns
0,46
ns
0,80
ns
0,73
ns
0,06
ns
0,06
ns
0,01**
0,02
*
0,01**
0,97
ns
(Tratamentos)
3
Resíduo
16
Total
19
C.V - 19,42 15,64 11,11 16,14 18,23
14,06
19,32 8,25 10,75 10,07 9,48 9,06 7,26
51
Figura 5. Fotossíntese líquida de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no
solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do híbrido
(p<0,01).
Figura 6. Condutância estomática de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas
no solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do
híbrido (p<0,01).
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Fotossíntese Líquida (
µ
Mol/m
2
/s)
**
**
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Condutância estomática (mmol/m
2
/s)
**
**
52
Esses resultados indicam que as plantas de milho sob deficiência hídrica possuem
um decréscimo da fotossíntese, devido à diminuição da condutância estomática,
ocasionando o fechamento dos estômatos e a redução da transpiração (GRZESIAK et
al., 2007; GHANNOUM, 2009). Decréscimos na fotossíntese e na condutância foram
também observados por XU et al. (2009) em uma variedade de milho chinesa sob
deficiência hídrica. Estudos de HUND et al. (2009) indicaram diferenças na tolerância de
híbridos de milho ao estresse hídrico por meio da avaliação das taxas fotossintéticas e
condutância estomática, contrariamente, neste estudo os híbridos apresentaram
respostas semelhantes em ambas DHS, corroborando com MAGALHÃES et al. (2009)
que caracterizaram linhagens de milho contrastantes à seca no estádio de florescimento
através de parâmetros de trocas gasosas, e não verificaram diferenças significativas
entre as linhagens sob estresse hídrico.
O decréscimo na elongação foliar média foi semelhante para os dois híbridos
(Figura 7). Contudo, houve diminuição significativa do crescimento do híbrido DKB 390
sob limitação hídrica. Como o alongamento foliar depende da expansão celular, em
déficit hídrico, há uma inibição da expansão celular. Há evidências que fatores como
síntese da parede celular e de membranas, divisão celular e síntese protéica coordenam
essa resposta (TAIZ & ZEIGER, 2010), corroborando com os resultados de SANTOS &
CARLESSO (1998) que verificaram menor redução na expansão de folhas de milho em
plantas cultivadas em solo de textura arenosa, submetidas a déficit hídrico.
Os efeitos deletérios do estresse hídrico sobre o crescimento das plantas dos dois
híbridos de milho foram detectados em todos os parâmetros analisados (Tabela 1). As
características biométricas: altura, altura de inserção de espiga, diâmetro do colmo e
massa seca total apresentaram diferenças quando as plantas foram submetidas à
disponibilidade hídricas distintas. Conforme houve a supressão hídrica, a altura, a altura
de inserção de espiga, o diâmetro do colmo e a massa seca total apresentaram
reduções drásticas, aferindo redução no crescimento vegetal (Figuras 8, 9, 10 e 11).
53
Figura 7. Elongação foliar de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas
no solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo
independente do híbrido (p<0,01).
O crescimento celular que tem dois componentes, divisão e alongamento celular,
é um dos processos da planta mais sensível à deficiência hídrica, e é, normalmente,
reduzido mesmo antes da fotossíntese ou condutância estomática (DURÃES et al., 2004;
TAIZ & ZEIGER, 2010). Com a diminuição da disponibilidade hídrica do solo, ocorreu
uma redução do alongamento celular (Figura 8), e consequentemente, no consumo de
carbono e energia, observados com a redução da fotossíntese líquida (Figura 5) e
condutância estomática (Figura 6).
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Elongação foliar média (cm)
**
**
54
Figura 8. Altura da planta de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
**Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do híbrido
(p<0,01).
Figura 9. Altura de inserção de espiga de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades
hídricas no solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo
independente do híbrido (p<0,01).
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0
50
100
150
200
250
300
Altura (cm)
**
**
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Altura de Inserção da espiga (cm)
**
**
55
Figura 10. Diâmetro do colmo de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no
solo. Não houve diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente
do híbrido (p>0,05).
Figura 11. Massa seca total de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no
solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do híbrido
(p<0,01).
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Diâmetro (cm)
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
50
100
150
200
250
300
350
400
Massa seca total da planta (g)
** **
56
Para muitas gramíneas a combinação dos mecanismos de tolerância à seca
(acúmulo e translocação de assimilados, redução da área foliar, ajustamento osmótico,
entre outros) é determinante no potencial de sobrevivência da espécie durante a seca,
BARTELS & SUNKAR (2005) (Figura 12).
Figura 12. Sintoma visual do estresse hídrico: Enrolamento das folhas no tratamento com menor
capacidade de água disponível no solo (-0,06 MPa).
Com relação aos teores de sacarose, os híbridos apresentaram um acréscimo
nos teores na condição menor DHS (-0,06 MPa). O híbrido DKB 390 aumentou em 2,5
vezes o teor de açúcar (47,58 a 108,89 µmol g MS
-1
) em suas folhas. Em contrapartida,
apesar de apresentar valores maiores no teor de sacarose nas duas DHS (93,45 a
167,02 µmol g MS
-1
), o híbrido DAS 2B710 acrescentou 1,8 vezes a mais o açúcar em
suas folhas (Figura 13).
De acordo com esses resultados, presumiu-se que a sacarose exerceu alguma
função em plantas de milho sob condição de limitação hídrica, pois apesar das plantas
terem reduzido a sua taxa de fotossíntese drasticamente (Figura 6), percebeu-se que
não houve competição entre a síntese de sacarose e fotossíntese, contrariando as
postulações de SERRAJ & SINCLAIR (2002) os quais afirmam que um mecanismo de
manutenção da turgescência e do crescimento do tecido sob deficiência hídrica ou
57
estresse (ajustamento osmótico), seria limitado pe
l
a própria fotossíntese, fonte do
fotossintato sacarose. Porém, há indícios que o incremento nos teores de sacarose
advém da hidrólise de polissacarídeos, como o amido, em grande parte
compartimentalizados, pois haveria a demanda do açúcar para atuar na preservação da
membrana plasmática, que estaria desestabilizada pela seca (ROSA et al., 2009).
Figura 13. Teor de sacarose de híbridos de milho em reposta a diferentes disponibilidades hídricas no
solo.**Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do
híbrido (p<0,01).
Contrariamente ao seu isômero (sacarose), os teores do dissacarídeo trealose
foram reduzidos significativamente no híbrido DKB 390 (≈40%) de 1,81 para 1,04 µmol
g MS
-1
, enquanto que no híbrido DAS 2B710 houve um decréscimo irrisório (≈15%) de
0,75 a 0,60 µmol g MS
-1
(Figura 14). Os resultados desta pesquisa vão de encontro às
realizadas em outras gramíneas, onde as maiores quantidades foram também
detectadas em plantas mais tolerantes à seca (GARG et al., 2002a; GARG et al., 2002b;
El-BASHITI et al., 2005). As quantidades encontradas em cultivares geneticamente
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
Sacarose (µMol g MS
-1
)
**
**
58
modificadas para tolerar a seca, arroz, cana-de-açúcar e de trigo, foram de 0,17, 0,15 e
0,63 mg g
-1
de massa fresca, respectivamente.
Figura 14. Teor de trealose de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no
solo. **Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do híbrido
(p<0,01).
De acordo com ITURRIAGA et al. (2009), exceto nas plantas de ressurreição, os
níveis de trealose obtidos nas plantas superiores não possuem correlação com a
tolerância a estresse. Esta falta de correlação pode se dar devido a ela não ser o
composto ativo e sim a trealose-6- fosfato (T6P). A trealose-6-fosfato (T6P), um
intermediário da via da trealose formada pela ação da enzima TPS, é, segundo
SCHLUEPMANN et al. (2003, 2004), indispensável para a utilização de carboidrato
disponível durante o crescimento e desenvolvimento da planta e está intimamente
relacionada com a percepção de estresses nutricionais, bióticos e abióticos. Dessa
forma, pode-se explicar em parte o não-acúmulo de trealose nas folhas de milho em
condição de estresse hídrico do presente estudo, contudo, teoricamente, deveria haver
uma manutenção do conteúdo do açúcar e não um decréscimo, já que o mesmo tem
função osmoprotetora em condição adversa.
Adicionalmente, alguns autores apontam que o acúmulo de trealose em plantas
superiores vasculares, em condições adversas, é um fenômeno raro, sugerindo que na
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
Trealose (µMol g MS
-1
)
**
59
maioria das espécies, a sacarose seria mais atuante na preservação membranas,
proteínas, do que a trealose (WINGLER, 2002).
De fato, em vegetais superiores, as concentrações de sacarose são bem mais
superiores que as de trealose, como também foram observadas no presente estudo.
Isso se deve à ação celular deste último ser realizada em baixas concentrações para
prevenção de efeitos danosos do seu acúmulo na regulação do metabolismo do
carbono (WINGLER, 2002). Entretanto, muitos estudos demonstram que outros
dissacarídeos como a sacarose induzem, somente em parte, a estabilização celular
quando comparada com a trealose; e que a ação deste carboidrato na estabilização de
membranas em condição de seca, chega a ser três vezes mais eficiente que a
sacarose, devido à alta afinidade da molécula às ligações do tipo ponte de hidrogênio
(PATIST & ZOERB, 2005; ITURRIAGA et al., 2009).
A quantidade de açúcares redutores varia entre híbridos conforme a
disponibilidade de água no solo. O teor de açúcares redutores foi diferente nos híbridos
apenas no maior potencial hídrico (-0,01 MPa). Para o híbrido DKB 390 não houve
diferenças significativas no teor do açúcar nas plantas cultivadas em distintas DHS. O
mesmo não ocorreu para o híbrido DAS 2B710 que apresentou diferença no potencial
mais negativo (Figura 15). Para o teor de amido nas folhas, houve distinção de acordo
com a disponibilidade de água no solo (Figura 16). Para o híbrido DKB 390 não houve
diferenças significativas no teor do polissacarídeo nas plantas cultivadas em distintas
DHS. Já o híbrido DAS 2B710 reduziu o teor de amido na menor disponibilidade hídrica
(-0,06 MPa).
Para alguns autores, o acúmulo de açúcares não-redutores nas plantas pode
ocorrer devido à degradação de polissacarídeos, como amido, resultando a produção de
sacarose, altamente solúvel, que atua na preservação da integridade celular em
condições adversas (BARTELS & SUNKAR, 2005; ITURRIAGA et al., 2009), corroborando
com os resultados presentes nesta pesquisa.
60
Figura 15
.
Teor de açúcares redutores de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
Para cada híbrido, médias seguidas de mesma letra maiúscula não diferiram entre si os teores de açúcares
redutores em condições controle e déficit hídrico (p>0,05). Para cada disponibilidade hídrica, médias
seguidas de mesma letra minúscula não diferiram entre si os teores de açúcares redutores dos híbridos
DKB 290 e DAS 2B710 (p>0,05).
Figura 16. Teor de amido de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no solo. Para cada
híbrido, médias seguidas de mesma letra maiúscula não diferiram entre si os teores de amido em
condições controle e déficit hídrico (p>0,05). Para cada disponibilidade hídrica, médias seguidas de mesma
letra minúscula não diferiram entre si teores de amido dos híbridos DKB 290 e DAS 2B710 (p>0,05).
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo**
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo
(MPa)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Açúcares redutores (µMol g MS
-1
)
Ab
Aa
Aa
Ba
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo*
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0
25
50
75
100
125
150
Amido (mg g MS
-1
)
Aa
Aa
Ba
Aa
61
Na figura 17, verificou-se o distinto comportamento no teor de aminoácidos livres
dos híbridos quando submetidos a diferenças na disponibilidade hídrica no solo. Em
condições ótimas de água no solo, não apresentaram diferenças entre si, contudo, a
partir da redução da umidade no solo (-0,06 MPa) houve uma discrepância entre eles. O
híbrido DKB 390 tem o teor aumentado de acordo com a redução do potencial. Já para
o híbrido DAS 2B710 não houve alterações na produção desse soluto, sendo estável em
todas as situações de DHS. Geralmente, parte dos estudos realizados em plantas sob
condições de deficiência hídrica evidenciou que o acúmulo de aminoácidos livres
aumenta gradativamente, conforme o tempo de imposição ao estresse (FUMIS &
PEDRAS, 2002; YAMADA et al., 2005), embora, também seja verificada em outros
trabalhos, tendências de estabilização e/ou decréscimo desses compostos (FUMIS &
PEDRAS, 2002; CARVALHO et al., 2003). A constância das quantidades encontradas do
híbrido DAS 2B710 poderia estar atribuída à aclimatação do híbrido ao estresse,
caracterizando certa tolerância (FUMIS & PEDRAS, 2002)
O teor de prolina aumentou em quase 50% quando as plantas de milho
estiveram sob estresse hídrico (Figura 19). Esse desempenho foi semelhante em ambos
os híbridos. Para o híbrido DKB 390 na DHS -0,01 MPa o teor foliar de prolina foi de
3,21 µmol g MS
-1
, acrescido a 5,68 µmol g MS
-1
na condição limitante de água no solo
(-0,06 MPa). No híbrido DAS 2B710 esses valores foram 3,69 e 6,12 µmol g MS
-1
,
respectivamente. Estes resultados corroboram com distintos estudos de FERREIRA et al.
(2002), MOHAMMADKHANI & HEIDARI (2008) e EFEOGLU et al. (2009) que também
observaram, em genótipos de milho, aumento significativo no teor do aminoácido,
utilizando a prolina como marcador bioquímico na avaliação de genótipos de milho com
diferentes graus de tolerância à seca. Nas plantas avaliadas por MOHAMMADKHANI &
HEIDARI (2008), o incremento do aminoácido foi de 3,13 vezes na variedade mais
tolerante em relação à sensível (1,56 vezes). No entanto, quando as plantas foram
reidratadas, observaram decréscimo no conteúdo do soluto, ou retorno aos níveis
normais, possivelmente, a prolina deixa o papel de soluto compatível e age como
protetora atuando como eliminadora de radicais livres ou como fonte de energia
(FERREIRA et al., 2002; EFEOGLU et al., 2009).
62
Figura 17.
Teor de aminoácidos livres totais de híbridos de milho em reposta a diferentes disponibilidades hídricas no
solo. Para cada híbrido, médias seguidas de mesma letra maiúscula não diferiram entre si os teores de
aminoácidos livres em condições controle e déficit hídrico (p>0,05). Para cada disponibilidade hídrica,
médias seguidas de mesma letra minúscula não diferiram entre si teores de amido dos híbridos DKB 290 e
DAS 2B710 (p>0,05).
Figura 18.
Teor de prolina de híbridos de milho em resposta a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
**Diferença estatística entre as disponibilidades hídricas no solo independente do híbrido (p<0,01).
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo**
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Aminoácidos Livre (µMol g MS
-1
)
Ba
Aa
Ab
Aa
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Prolina (µMol g MS
-1
)
**
**
63
Na figura 19 podem ser observadas as diferenças fenotípicas no crescimento das
plantas submetidas aos diferentes tratamentos e os sintomas de deficiência hídrica
devido aos tratamentos com estresse.
Figura 19. Híbridos de milho submetidos a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
3.4. Conclusões
A diminuição da disponibilidade hídrica no solo promove a redução da atividade
fotossintética e da condutância estomática nos híbridos DKB 390 e DAS 2B710;
O crescimento dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710 é reduzido na menor
disponibilidade hídrica no solo;
Os híbridos DKB 390 e DAS 2B710 apresentam maiores teores de sacarose e
prolina em resposta à limitação hídrica;
O híbrido DKB 390 mantém os teores de açúcares redutores e de amido, reduz o
teor de trealose e aumenta o teor de aminoácidos livres quando exposto a uma
condição hídrica adversa. Já o híbrido DAS 2B710 reduz os teores açúcares redutores e
DKB 390
2B 710
controle
Déficit Hídrico
controle
Déficit Hídrico
64
de amido na menor disponibilidade hídrica no solo e mantém os de trealose e
aminoácidos livres nessas condições;
Os híbridos DKB 390 e DAS 2B710 apresentam grau de tolerância semelhante à
limitação hídrica no estádio vegetativo.
3.5. Referências Bibliográficas
ABO-EL-KHEIR, M. S. A.; MEKKI, B. B. Response of maize single cross-10 to water
deficits during silking and filling stages. World Applied Sciences Journal, Babol, v. 3,
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70
CAPÍTULO 4: QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA RELATIVA DO MILHO
EM RESPOSTA À DISPONIBILIDADE HÍDRICA NO SOLO POR MEIO DE qRT-
PCR
RESUMO: De uma forma geral, as plantas submetidas à limitação hídrica desenvolvem
mecanismos bioquímicos e moleculares para diminuir os efeitos nocivos do déficit
hídrico, acumulado vários solutos compatíveis: prolina, trealose, sacarose, entre outros.
Para se obter resultados precisos e confiáveis na avaliação da expressão dos genes das
vias metabólicas que regulam a biossíntese desses compostos, faz-se necessária a
normalização dos dados de qPCR em tempo real contra um gene de controle, que exibe
expressão uniforme nas diferentes condições de disponibilidade hídrica. Com o intuito
de identificar os melhores genes referência para análise de expressão diferencial de
genes de milho em resposta à limitação hídrica por meio de RT-PCR em tempo real
(qRT-PCR), o presente estudo propôs-se. Avaliou-se a expressão gênica de seis genes
de referência: ACT2; eEF-1α; eIF-4α; GAPDH; UBC e ClatAd em tecidos foliares de milho
sob diferentes disponibilidades hídricas, bem como de enzimas-chave da biossíntese da
prolina, sacarose e trealose. A expressão de ACT2 e eIF-4α foi a mais estável em todas
as amostras de tecido analisadas.
Palavras-chave: Normalização, real-time PCR, solutos compatíveis, estresse hídrico,
mRNA
71
Quantification of relative gene expression of maize in response to soil water
availability by quantitative real-time PCR
Abstract: In general, plants subjected to water restriction develop biochemical and
molecular mechanisms to reduce the harmful effects of water deficit, accumulated
several compatible solutes: proline, sucrose, trehalose and among others. For accurate
and reliable gene expression results in evaluating gene expression of metabolic
pathways that regulate the biosynthesis of these compounds, normalization of real-time
PCR data is required against a control gene, which exhibits uniform expression in maize
for several in different conditions of water availability. Aiming to identify the best
reference genes for analysis of differential gene expression of maize in response to
water limitation by using RT-PCR in real time (qRT-PCR), the present study is intended.
Assessed the gene expression of six frequently used reference genes: ACT2, eEF-1α,
eIF-4α, GAPDH, UBC, and ClatAd, in leaf tissues of maize under different water
availability, as well as key enzymes in the biosynthesis of proline, sucrose and trehalose.
The expression of ACT2 and eIF-4α was most stable across all the tissue samples
examined.
Key Words: Normalization, real-time PCR, compatible soluble, water stress, mRNA
72
4.1. Introdução
Como as plantas são sésseis ao local em que crescem, têm capacidade limitada
para evitar condições desfavoráveis ao seu meio como: condições extremas de
temperatura, luz, escassez de água, nutrientes minerais insuficientes ou excessivos ou
adversidades bióticas (herbívoros, patógenos, plantas daninhas, etc.). As plantas têm
desenvolvido estratégias fisiológicas, bioquímicas e moleculares para se defender contra
os estresses abióticos e bióticos como, muitas vezes combinados com alterações no
crescimento e padrões de desenvolvimento (BRAY et al., 2001; GASPAR et al., 2002).
O estresse é geralmente definido como um fator externo que exerce uma
influência desvantajosa sobre a planta. Esse conceito está intimamente associado com
tolerância ao estresse, que é a capacidade da planta para enfrentar as condições
desfavoráveis (TAIZ & ZEIGER, 2010).
Em ambas as condições, naturais e agrícolas, fatores ambientais, como
temperatura do ar, podem tornar-se estressantes em apenas alguns minutos. Conteúdo
de água no solo pode levar dias ou semanas, enquanto que outros fatores como a
deficiência mineral do solo, podem levar meses para se tornar estressante. Respostas
celulares ao estresse podem incluir mudanças no ciclo e divisão celular, as membranas
celulares, a arquitetura da parede celular e metabolismo, por exemplo, a acumulação de
substâncias osmoticamente ativas (BRAY et al., 2001).
Em condições de estresse hídrico as plantas têm necessidade de manter potencial
hídrico interno abaixo do solo e manter o turgor para captação de água a fim de manter
seu crescimento. Isso requer um aumento da pressão osmótica, quer seja por absorção
de solutos do solo ou pela síntese de metabólitos (solutos compatíveis). Para ajustar o
equilíbrio iônico dos vacúolos, o citoplasma acumula compostos de baixa massa
molecular, chamados de soluto compatível, porque não interferem nas reações
bioquímicas, contudo, pode atuar como moléculas que atuam similarmente à água em
reações bioquímicas. Os compostos dividem-se em vários grupos: aminoácidos (prolina),
compostos quaternários (glicina betaína) e seus derivados (β-alanina betaína, prolina-
betaína, etc.), polióis e açúcares (manitol, D-ononitil, trealose, sacarose e frutanos).
73
O estudo da expressão dos genes responsáveis pela síntese e catabolismo desses
compostos é de extrema importância, e abordagens genômicas podem contribuir
consideravelmente para compreender o metabolismo das plantas sob a limitação hídrica
(ANAMI et al., 2009), bem como para a manipulação genética do metabolismo desses
osmoprotetores em relação à tolerância ao estresse abiótico em plantas melhoradas. Em
nível celular, os genes que são induzidos com a seca podem ser classificados em dois
tipos: genes que protegem diretamente contra o estresse ou genes que regulam a
expressão da tradução de sinais em resposta ao estresse (DJILIANOV et al., 2005).
Tecnologias de análise de expressão gênica diferencial são muito importantes em
estudos de comparação de processos biológicos. Uma tecnologia bastante aplicada é a
reação de PCR quatificativo em tempo real (qRT-PCR), técnica que permite uma análise
precisa da expressão de genes em diferentes tecidos. A quantificação da expressão dos
genes por qRT-PCR (do inglês,
real-time quantitative RT-PCR
) é muito sensível e
reprodutível. Atualmente, é o método que apresenta maior sensibilidade e especificidade
na análise de transcritos.
O princípio da técnica é o mesmo que um PCR tradicional, ou seja, tem como
base o processo de transcrição reversa (RT) seguida da reação em cadeia da DNA-
polimerase (PCR), a diferença consiste na inclusão de moléculas fluorescentes
covalentemente ligadas ou não a nucleotídeos, as quais podem ser quantificadas
durante a cinética da reação (em “tempo real”). Os produtos formados são monitorados
a cada ciclo de reação, o que permite uma detecção rápida e específica dos produtos de
amplificação (GACHON et al., 2004).
O sucesso na aplicação da técnica de RT-PCR quantitativa está na normalização
adequada dos dados mensurados. Logo, atenção especial deve ser dada a aspectos
como: utilização da mesma quantidade inicial de amostra, padronização da síntese de
cDNA, escolha do gene de referência e do modelo matemático para a análise dos dados
(UDVARDI et al., 2008).
Para a normalização, são necessários genes que apresentem transcritos que
mostrem uma expressão uniforme na maioria das células do organismo ou entre as
espécies que estão sendo analisadas, assim como durante várias fases do
74
desenvolvimento e sob distintas condições ambientais. Esses genes constitutivos são
designados de genes de referência, ou normalizadores ou também conhecidos como
housekeeping genes
, ou seja, genes responsáveis por funções essenciais para a
manutenção da estrutura ou do funcionamento celular (metabolismo primário). Um
gene de referência ideal deve ter expressão constante nos diversos estádios de
desenvolvimento, em diferentes tecidos e em condições fisiológicas distintas.
No entanto, vários estudos utilizam genes de referência sem prévia validação da
estabilidade de sua expressão, o que pode levar a interpretações errôneas dos
resultados obtidos. Há relatos que alguns genes utilizados na era pré-genômica não
apresentam expressão estável entre tecidos e genótipos, e por esse motivo, não são
adequados como controles a métodos mais sensíveis como qRT-PCR (CZECHOWSKI et
al., 2005). A pesquisa realizada em
Arabidopsis
, por CZECHOWSKI et al. (2005),
demonstrou que dos genes de referências tradicionais para estudo de qRT-PCR, ACT2,
TUB6, EF-1α, UBQ10 e GAPDH, apresentaram diferenças de expressão em alguma
situação estudada. O resultado da análise de todo o conjunto de genes (23.500 genes)
levou à indicação de 100 genes com expressão relativamente estável subdivididos em
categorias de interesse. Desses, dezoito genes apresentaram-se estáveis em todas as
condições e foram validados para normalização de qRT-PCR em
Arabidopsis
.
Entre as gramíneas de
importância econômica
,
ISKANDAR et al. (2004) ao avaliar
a expressão de α-TUB, β-TUB, GAPDH e 25S rRNA em diversos tecidos e genótipos de
cana-de-açúcar (metabolismo C
4
) constataram que os genes mais estáveis foram para
GAPDH e rRNA 25S. Em arroz (metabolismo C
3
), JAIN et al. (2006) estudaram dez
genes (ACT11, UBC, eEF-1α, GAPDH, β-TUB, eIF-4α, UBQ10, UBQ5; 18S rRNA e 25S
rRNA) em diferentes tecidos e órgãos em estádios de desenvolvimento, bem como em
plântulas submetidas a condições adversas (estresse salino e seca) e diferentes
hormônios. Dos genes estudados, os mais estáveis foram UBQ5 e eEF-1α.
Posto o acima, para utilização de qRT-PCR e cálculo da expressão relativa de um
determinado gene em diferentes tecidos, faz-se necessária a identificação de genes
referência, ou seja, genes que apresentem um padrão de expressão estável em
diferentes tecidos que possam ser utilizados para normalização dos dados. A utilização
75
de genes referência sem prévia verificação da sua estabilidade pode levar a má
interpretação dos dados de expressão relativa e, com isso, gerar resultados que não
representam as condições
in vivo
(UDVARDI et al., 2008).
Para o milho (
Zea mays
L.), ainda não foram descritos genes de referência para
qRT-PCR. Com o intuito de identificar os melhores genes de referência para análise de
expressão diferencial durante o estudo da resposta do milho à limitação hídrica, serão
desenhados iniciadores para dez EST’s, oriundos de uma biblioteca de cDNA de milho,
que possuam similaridade com sequências de outras espécies que já foram utilizadas
como genes de referência (CZECHOWSKI et al., 2005; JAIN et al., 2006) e esses
iniciadores serão testados em reações de qRT-PCR utilizando como material vegetal os
diferentes híbridos de milho submetidos a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
A medida da expressão do gene é baseada em duas estratégias qRT-PCR:
medido em termos absolutos e/ou dedução, em termos relativos. A quantificação
absoluta relaciona o sinal fluorescente PCR com o número das cópias em uma curva de
calibração. A curva é altamente específica, sensível e reprodutível, mas a
reprodutibilidade depende fortemente das condições e eficiência da amplificação. Nesse
sentido, a quantificação relativa é muito mais fácil de fazer por não necessitar de curva
de calibração. É com base na expressão de um gene de interesse contra um ou mais
genes de referência ou controle, que não têm necessariamente de conhecer as
concentrações das amostras e, portanto, não tem unidades qualquer relevância. Esta
última forma de quantificar é adequada para a maioria dos estudos que pretendem
investigar as relações entre as alterações fisiológicas das plantas e as respostas de
expressão gênica.
A monocotiledônea de metabolismo C
4
Zea mays
é a terceira mais importante
cultura alimentar mundial depois do trigo e do arroz em termos de produção e a
segunda cultura mais modificada geneticamente (OGM), depois da soja. Sua procura
deverá aumentar em 45% até 2020 (ANAMI et al., 2009).
Assim, como hipótese científica cogitou-se que a tolerância de plantas de milho
sob estresse hídrico é afetada pela expressão gênica significativa de determinadas
enzimas envolvidas no metabolismo de solutos orgânicos. Dessa forma os objetivos
76
desta pesquisa foram: encontrar um ou um conjunto de genes que possam ser usados
como referência para estudos de qRT-PCR em híbridos de milho em resposta à limitação
hídrica; determinar se os genes envolvidos na produção de metabólitos celulares estão
relacionados com as respostas fisiológicas dos híbridos de milho a deficiência hídrica.
4.2. Material e Métodos
4.2.1. Material vegetal e condições de crescimento
O experimento foi desenvolvido na Unesp – Universidade Estadual Paulista, FCAV
– Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal, SP. Foram utilizados dois
híbridos simples de milho, DKB 390 e DAS 2B710, cultivados em Latossolo Vermelho
distrófico (LVd) em condições de casa de vegetação. A temperatura e a umidade
relativa do ar foram monitoradas, com auxílio de um termohigrômetro até o término do
experimento. Após a germinação e desbaste, foram mantidas três plantas por vaso com
capacidade para 54 dm
3
, as quais foram cultivadas sem restrição hídrica até o estádio
V
3
, quando foram submetidas a duas tensões hídricas (-0,01 e -0,06 MPa). Sendo assim,
os quatro tratamentos implantados foram:
Tratamento 1 = Híbrido DKB 390 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,01 MPa (controle);
Tratamento 2 = Híbrido DKB 390 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,06 MPa (déficit hídrico);
Tratamento 3 = Híbrido DAS 2B710 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,01 MPa (controle);
Tratamento 4 = Híbrido DAS 2B710 cultivado em solo com tensão hídrica de -0,06 MPa (déficit
hídrico).
77
Figura 1. Controle e manutenção da disponibilidade hídrica no solo dos vasos.
O controle do conteúdo de água no solo foi realizado através de tensiometria, a
partir do monitoramento diário das leituras das tensões do solo para controle da
umidade do solo no nível concernente a cada tratamento. Para isso, foram instalados
dois tensiômetros em cada vaso, um na profundidade de 10 cm e o outro na de 30 cm.
Através de tensímetro digital, foi monitorada, diariamente, a umidade (tensão hídrica)
do solo. A estimativa da umidade do solo de cada vaso foi realizada a partir da média
das leituras dos tensiômetros instalados nos vasos. A reposição de água foi realizada
através de um tubo de PVC com perfurações ao longo de toda a sua extensão, instalado
no centro geométrico do vaso, para garantir uma distribuição uniforme da umidade em
todos os estratos do solo.
No estádio V
6
, as folhas +1 foram coletadas e estocadas em nitrogênio líquido
até serem armazenadas em ultra-freezer (-80 ºC) para posterior análise.
Ensaio conduzido em casa de vegetação
em DIC em arranjo fatorial 2x2
Vasos (54 dm
3
):
2 tensiômetros
(10 cm e 30 cm) e
canal central para
irrigação
Unidade
experimental:
1 vaso com 3
plantas
Cultivado em Latossolo nas tensões-0,01 e -0,06 MPa
Manutençãoda disponibilidade hídrica no solo
(Tensiometria)
Híbrido DKB 390 e Híbrido DAS 2B270
78
As análises dos transcritos foram realizadas no Instituto de Tecnologia Química e
Biológica, Laboratório de Biotecnologia celular vegetal, Universidade Nova de Lisboa,
Oeiras-Portugal.
4.2.2. Extração, controle de qualidade do RNA e síntese de cDNA
O método de extração por Trizol, conforme recomendações dos fabricantes
(Gibco
TM
), foi utilizado para extração de RNA total das amostras dos tratamentos. O
RNA foi então tratado com DNAse (TURBO DNA-
free
™). A integridade do RNA foi
verificada por eletroforese em gel de agarose 2% e a quantidade no espectrofotômetro
NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies
TM
). Somente as amostras de RNA com
razão A260/ A280 entre 1,9 e 2,1 foram utilizadas para síntese da fita simples de cDNA.
Os cDNAs fita simples foram sintetizados por transcrição reversa de 2 µg de RNA, no
mínimo, em volume final de 20 µL utilizando a enzima Improm II reverse (Promega
TM
),
de modo a atingir concentrações de RNA que permitissem efetuar a síntese de cDNA de
cadeia simples.
As condições de PCR foram otimizadas no termociclador Biometra T-Gradient,
com 20 ng/µL de DNA genômico de milho a um gradiente de temperaturas de
annealing. A reação efetuou-se em um volume total de 20 µL com 0,2 mM de dNTPs,
200 nM de cada primer, 2,5 mM de MgCl
2
, 1 U de Taq DNA polimerase (Promega, EUA)
e tampão de Taq 1×. Em cada tubo de reação foram colocados 2 µL de DNA (10ng/µL).
A desnaturação do DNA deu-se a 94 ºC durante 3 minutos, seguida por 40 ciclos
com três passos: um passo a 95 ºC durante 30 segundos, o segundo para ligação dos
primers à cadeia molde de DNA com uma temperatura de annealing (58 ºC) entre 55,9 -
64,1 ºC por 30 segundos e por fim o passo de extensão a 72 ºC durante 30 segundos.
Um passo de extensão final de 3 minutos a 72 ºC finalizou o ciclo.
Os tecidos foram macerados em nitrogênio líquido com um almofariz e pilão,
previamente tratados com RNaseZap (Sigma- Aldrich, EUA). O RNa total foi extraído por
meio do método de extração por Trizol (Gibco
TM
). O RNA foi então tratado com DNAse
(Amersham
TM
) e purificado em coluna RNeasy Mini Column (Qiagen). Para cada amostra
79
foram feitas duas extrações independentes. A integridade do RNA foi verificada por
eletroforese em gel de agarose 2% e a quantidade no espectrofotômetro NanoDrop ND-
1000 (NanoDrop Technologies
TM
). Somente as amostras de RNA com razão A260/ A280
entre 1,9 e 2,1 foram utilizadas para síntese da cadeia simples de cDNA. Os cDNAs fita
simples foram sintetizados por transcrição reversa de 2 µg de RNA, no mínimo, em
volume final de 20 µL utilizando a enzima Superscript II (Invitrogen
TM
).
4.2.3. Análise
in silico
Inicialmente, as buscas das mRNA de interesse se deram na base de dados do
GenBank sequence database
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). A análise
in silico
foi
realizada comparando diversos bancos de dados de diferentes organismos utilizando o
algoritmo BLASTn. As sequências homólogas identificadas em milho base de dados do
NCBI - National Center for Biotechnology Information -
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantESTBLAST.shtml) foram
comparadas com as identificadas na base de DFCI
gene índex
- ZmGI
(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=maize). Foi escolhida a
sequência que obteve o melhor
E-value
(menor que
e
-10
) na homologia.
4.2.4. Desenho de iniciadores para genes controle e genes de interesse
Os
primers
foram desenhados utilizando o programa o programa PRIMER 3,
desenvolvido pelo Whitehead Institute e Howard Hughes Medical Institute, EUA. Os
parâmetros considerados foram: tamanho dos oligonucleotídeos (18 – 23 nucleotídeos),
conteúdo de G/C em torno de 50 %, temperatura de anelamento (60 ºC), e tamanho do
amplicon (83 - 211 bp). Foi utilizado o programa de comparação de sequências BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool), www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, para determinar a
combinação de oligonucleotídeos mais específica. Os oligonucleotídeos sintetizados
foram inicialmente testados na temperatura de anelamento desejada (60 ºC) pelo
método da PCR convencional. A especificidade do produto de amplificação foi verificada
80
em gel de agarose 2 % corado com sybr safe (0,5 µg/µL). Os melhores pares para cada
gene, foram testados inicialmente em cDNA, via qRT-PCR; e a especificidade da
amplificação foi verificada pela análise de curvas de dissociação por meio do programa
Bio-Rad IQ™5 (Optical System Software).
Para identificação dos genes referência em milho foram desenhados iniciadores
para seis genes ortólogos àqueles já descritos na literatura como referência para outras
espécies de plantas (CZECHOWSKI et al., 2005; JAIN et al., 2006). A escolha dos genes
escolhidos deveu-se por estes apresentarem menor variação na expressão (maior
estabilidade –
M
) em estudos prévios para outras plantas (Tabela 1).
Tabela 1. Genes de referência para uso em qRT-PCR
Nome do Gene
Descrição do gene
Acesso (DFCI bank)
ACT2
structural constituent of cytoskeleton
2
TC494297
UBC
ubiquitin conjugating enzyme
TC459905
eEF
-
1α
elongation factor 1
-
alpha
TC561686
GAPHD
cytosolic glyceroldehyde
-
3
-
phosphate
dehydrogenase
TC496821
eIF
-
4α
translation initiation factor 4
-
alpha
TC471738
ClatAd
clathrin adaptor complexes
TC469062
O estudo da expressão de genes de enzimas-chave do metabolismo de plantas
sob limitação hídrica está descrito na Tabela 2. Os genes estudados fazem parte do
metabolismo primário das plantas. Dessa forma compõem os compostos: amido e
sacarose, trealose, aminoácido e prolina.
81
Tabela 2. Genes de interesse para uso em qRT-PCR
Referência da
sequência
Gene E.C Descrição do gene
Metabolismo de carboidratos: sacarose e trealose
TC531667 SPS 2.4.1.14 Sucrose Phosphate Synthase
NM_001111724.1 SUSY 2.4.1.13 Sucrose Synthase
NM_001111568.1 ADP-Glu 2.7.7.27 ADP-glucose
pyrophosphorylase
TC466102 UDP-Glu 2.7.7.9 UDP-glucose
pyrophosphorylase
NM_001130121.2 T6PS 2.4.1.15 trehalose-6-phosphate
synthase
NM_001158750.1 TPP 3.1.3.12 trehalose-phosphate
phosphatase
TC474957 THE 3.1.3.28 Trehalase
Metabolismo de compostos nitrogenados
NM_001112068.1 GtSy 2.6.1.13 glutamine synthetase
M27821.1 NtR 1.5.1.1 nitrate reductase
TC466517 OAT 1.2.1.41 delta ornithine
aminotransferase
CO460824 P5CR 1.5.9.98 pyrroline 5-carboxylate
reductase
TC471964 P5CS 1.2.1.8 delta 1-pyrroline-5-
carboxylate synthetase
NM_001154188.1 PROX 1.14.15.7 proline oxidase
4.2.5.
Real Time Polymerase Chain Reaction
(qRT-PCR)
A análise quantitativa da expressão foi realizada por qRT-PCR, usando o sistema
de detecção Optical System Software (Bio-Rad IQ™5). Realizou-se, inicialmente, uma
padronização do método que incluiu: a escolha do normalizador adequado; a
determinação da eficiência de amplificação dos oligonucleotídeos; a determinação da
quantidade de cDNA molde; os ajustes na concentração final dos oligonucleotídeos e a
avaliação das condições de termociclagem.
82
Foi utilizado o SYBR® Green PCR Master Mix para as reações de qRT-PCR, que é
um agente fluorescente que se intercala nas cadeias duplas de DNA, e emite grande
quantidade de fluorescência. Desta forma, a detecção do aumento de produtos de PCR
gerados ao longo de cada ciclo, foi feito proporcionalmente ao aumento da fluorescência
emitida pelo SYBR® Green. O equipamento detectou, a cada ciclo, uma elevação de
sinal fluorescente e construiu uma curva de amplificação em tempo real (intensidade de
fluorescência x ciclos). Foram testados seis normalizadores. O gene de referência
normalizou a amplificação do gene alvo, obtendo um valor real de expressão do alvo em
relação ao total de RNA utilizado na reação. As reações foram feitas em triplicatas, a fim
de garantir a consistência dos dados coletados. Além disso, o perfil dos produtos
amplificados foi analisado por eletroforese em gel de agarose 2%.
4.2.5.1. Curvas de eficiência
Foram construídas curvas de amplificação com quantidades conhecidas de cDNA,
para determinar a eficiência de amplificação dos oligonucleotídeos e o nível de
expressão tecidual de cada variante. Diluições foram realizadas de 50 ng/µL, 25 ng/µL,
12,5 ng/µL e 6,25 ng/µL, a partir do cDNA estoque (100 ng/µL). Verificou-se a relação
entre a quantidade inicial de amostra e o número de ciclos obtidos em uma determinada
fluorescência (Ct). O esperado era que, a cada ciclo, dobrasse a quantidade de produto
formado. Determinando-se um nível de fluorescência e o número de ciclos necessários
para amplificar quantidades diferentes de cDNA inicial, foi possível fazer a correlação
desses dois fatores. O valor de R
2
gerou o fator de correlação entre os pontos de
diluição e o Ct obtido. A inclinação da reta (
slope
) determinou a eficiência de
amplificação da reação. Uma reação onde ocorreu a duplicação dos produtos de PCR a
cada ciclo (100 % de eficiência), obteve uma inclinação de -3,32 e coeficiente de
correlação igual a -1, quando todos os pontos da curva estiverem coincidentes ao Ct
esperado. Por meio dessas análises, foi possível determinar a melhor quantidade de
amostra para cada par de oligonucleotídeos desenhado.
83
4.2.5.2. Curvas de amplificação
Todas as reações de qRT-PCR foram realizadas em placas ópticas de 96
amostras. Foi utilizado para reação: 2 µL de cDNA; 0,5 µL de cada oligonucleotídeo (200
nM) sense e anti-sense específico para cada variante; 10 µL de 2x SYBR Green PCR
Master Mix e 7 µL de água (Nuclease-Free Water, Promega
®
), no volume total de 20 µL.
O programa de amplificação utilizado foi 95 ºC por 3 minutos para ativação da
AmpliTaq DNA Polymerase; 50 ciclos de 95 ºC por 15 segundos (desnaturação), 60 ºC
por 10 segundos (anelamento do primer) e 72 ºC por 10 segundos (extensão). Ao final
de cada ciclo foi realizada a coleta do sinal de fluorescência. O software quantificou a
intensidade da fluorescência dada pelo SYBR. Utilizou-se um controle negativo de
amplificação, que consistiu de uma reação sem o cDNA, a partir de uma mesma mistura
de reagentes das amostras experimentais e na mesma placa óptica, possibilitando a
exclusão de contaminação.
4.2.5.3. Curvas de dissociação
A curva de dissociação foi realizada após a reação de qRT-PCR, para determinar a
especificidade dos produtos de PCR formados. Reações que apresentaram mais do que
um pico de dissociação era indicador que podia existir interferência de intercalação de
primers
entre eles ou com eles mesmos; ou ainda um produto inespecífico a ser
amplificado na reação. Os gráficos da cuva de dissociação foram obtidos pelo programa
Optical System Software (Bio-Rad IQ™5).
4.2.6. Análise da estabilidade da expressão gênica
Os dados gerados a partir do software Optical System Software (Bio-Rad IQ™5),
utilizado para leitura de fluorescência, foram colocados em planilha MS Excel (Microsoft,
Redmond, WA), e analisados nos aplicativos visual basic do MS Excel qBase versão 1.3.4
84
(http://medgen.ugent.be/qbase/), e GeNORM versão 3.4, (http://medgen.ugent.be/
~jvdesomp/genorm/).
Para identificação dos genes mais estáveis dentro dos tratamentos, foi utilizado o
programa GeNORM, que calcula um valor de estabilidade M. O cálculo de M é baseado
na média da variação (
pairwise variation
) entre um gene particular e todos os outros
genes analisados. Por exclusão dos genes menos estáveis, maior valor M, são
identificados os genes mais estáveis. Como resultado, foi gerado um fator de
normalização (NF) e a partir desse valor NF, houve a identificação de genes referência.
Determinou-se o número ideal de genes referência a ser utilizado para uma
normalização acurada dos níveis de expressão dos genes a serem estudados. Esse
número ideal foi dado pela inclusão de genes controles (n+1) no cálculo de NF até que
não houvesse contribuição significativa desses genes.
4.2.7. Quantificação da expressão gênica dos genes que regulam as vias
metabólicas dos solutos compatíveis
As amostras de cDNA dos quatro tratamentos foram amplificadas por PCR com
recurso ao Bio-Rad iCycler iQ™. Os
primers
usados para amplificação encontram-se na
tabela 3 e 4. As condições de PCR foram as mesmas descritas no item
4.2.5.2
.
As amplificações foram efetuadas em três placas: para cada amostra de cDNA
fizeram-se 3 réplicas técnicas e por cada tratamento testaram-se três réplicas
biológicas.
Repetiu-se a amplificação para os 15 genes alvo, e para os dois genes de
referência, com
pools
de cDNA das amostras de cada tratamento.
85
Tabela 3. Descrição dos EST’s escolhidos: sequências dos primers, temperatura de
Melting e tamanho do produto de amplificação, utilizados para amplificar os
genes em estudo para real-time RT – PCR.
Referência da
sequência
Gene
Nome
enzima
Primer Sense Primer Antisense: TM Prod
NM_001155179.1
ACT
Constituinte
estrutural do
citoesqueleto
2
CCAACTGCCGAAG
CCATC
TGCCATTGTCACAT
ACGATAGG
55,7 96
EU953172.1
eEF-1α
Fator 1-alfa
de elongação
eucariótica
TGCTCTCCTTGCGT
TCAC
CTTCCTTCACAATC
TCTTCATAAC
55,6 113
NM_001111404.1
eIF-4α
Fator 4-alfa
de iniciação
(tradução)
eucariótica
CTCTCCGTCGCTTC
AGTC
AAGAACTCCTCAGT
CTCACC
53,1 116
NM_001112481.1
GAPDH
gliceraldeído-
3-fosfato
desidrogenas
e citosólico
CCTTCATCAGCACC
GACTAC
CAGCAACCTCCTTC
TCACC
55,1 130
NM_001111418.1
UBC
Enzima
conjugada de
Ubiquitina
CCTAATATCAACAG
CAATGGAAG
GGAGCAGATGGAG
AGCAG
53,2 99
TC483326
Clatad
Complexo
adaptado para
Clatirina
TCCACCGCTCCCG
AGTCCAA
GGGCAGCCTTGTA
TGCCACCA
59,5 133
Como já foi referido, para quantificação da expressão relativa dos genes alvo, foi
necessário todo um tratamento de normalização dos valores de C
T
. Assim, todos os
valores de C
T
foram corrigidos tendo em conta os valores de eficiências de cada gene no
programa GenEx com recurso à expressão 1,
(
)
( )
2log
E1log
CC
E
T
%100E
T
+
=
=
(1)
Sendo: E = a Eficiência de cada gene.
Em seguida, a todos os valores de C
T
de cada réplica técnica aplicou-se a
expressão 2,
∑
=
=
n
1i
i
T
repetições_norm
T
C
n
1
C
(2)
86
Dessa forma, efetuou-se a média aritmética dos valores de C
T
para cada réplica
biológica. Para se poder normalizar os genes alvo, calculou-se o valor de C
T
normalizado, usando a expressão 3.
∑
=
−=
n
1i
ferênciaReGene
T
alvo,Gene
T
norm,alvo_Gene
T
C
n
1
CC
(3)
Por fim, as quantidades de expressão relativas foram determinadas através da
expressão 4,
CTCT
relativo
calibração
2Q
−
=
(4)
Como os valores de quantidades relativas não seguem normalmente uma
distribuição normal, foi necessário transformá-los numa escala logarítmica. Desse modo,
os valores apresentaram uma distribuição normal, podendo assim efetuar-se a análise
estatística. As expressões diferenciais (
fold differences)
foram obtidas com recurso ao
logaritmo de base 2 (expressão 5). Vide dedução da expressão no apêndice.
(
)
relativo2
QlogFD
=
(5)
87
Tabela 4. Descrição dos EST escolhidos, sequências dos primers, temperatura de
Melting e tamanho do produto de amplificação utilizados para amplificar os
genes das vias metabólicas de solutos compatíveis para estudo em real-time
RT – PCR.
Referência da
sequência
Gene Nome enzima
Primer Sense
5’-3’
Primer
Antisense:
3’-5’
TM Prod
TC531667 SPS
Sacarose Fosfato
Sintase
CCTGGAGTGT
ACAGGGTGG
ACCT
TCCATCATTG
GAACCGGCGC
A
60,87 108
NM_001111724.1 SUSY Sacarose Sintase
CACCGGCAC
AAGGGGCAT
GT
GGTGTGTCAG
CAGGGAGCTT
TGAC
59,9 116
TC466102
UDP-
Glu
UDP-glicose
pirofosforilase
CCCCGCTCAA
GGTTTCTCCC
AG
TCGCTCTGGA
TGGGTTGCGG
59,43 109
NM_001111568.1
ADP-
Glu
ADP-glicose
pirofosforilase
TGCAGTGCCA
TTGGGTGCCA
AGGTGACGGT
TGAGGGAAGC
AGA
59,47 123
NM_001130121.2 T6PS
Trealose-6-
Fosfato sintase
ACTTGACCGG
AGGCCGAAC
G
TGCTGCTCGT
GCTGCTGTGA
59,28 137
NM_001158750.1 TPP
Trealose-
fosfato
fosfatase
GGTCCGTCCT
GTTATTGATT
GG
ATCTTCATCTG
TTCTGTCATCT
CC
56,5 124
TC474957 THE
Trealase
GCCATTGCTG
TGGCCGAGG
A
ACCCCAGCAT
GTGGCTTGGC
59,9 272
M27821.1 NtR Nitrato redutase
GCTCGTTTTG
GATTGGGTGC
CG
CCACTTGCCC
ACTTCCTCGC
A
59,31 121
NM_001112068.1 GtSy
Glutamina
sintetase
GCGCTGTGG
CAGTTGCATC
AC
CAAACCCCTC
CCGCGCACTT
59,9 149
TC471964 P5CS
delta 1-pirrolina-
5-carboxilato
sintetase
AACATTGTGA
CAGGATTAGG
GTAACAGGCT
TAACCATAGG
50,1 140
TC466517 OAT
delta ornitina
aminotransferse
GCTACAGCCC
GAGAGATGG
CAGT
CTTGTGCTGC
CTCAACATCG
GCA
60,36 166
CO460824 P5CR
pirrolina 5-
carboxilato
reductase
CTCTCCGCCT
CCTCCTTC
AGCAGGTTCA
CTTCACTCAC
54,8 96
NM_001154188.1 PROX Prolina oxidase
GGAATTTGTC
GTATGTCGGG
ATG
ATGAGGCGGT
GGAAGTGG
57,5 124
88
4.2.9. Tratamento estatístico
O delineamento experimental foi em delineamento inteiramente casualizado no
esquema fatorial 2x2 com cinco repetições. A análise estatística dos dados realizou-se
através do programa Statistica, em seguida foram submetidos à análise de variância e
as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de
probabilidade.
Figura 2. Etapas realizadas para validar os genes de referência e quantificação da
expressão gênica relativa dos genes alvo.
89
4.3. Resultados e Discussão
4.3.1. Determinação dos genes de referência
Após a quantificação do RNA total por meio de avaliação por espectrofotometria
(
vide
apêndice A4.3), cada uma das amostras foram submetidos à eletroforese em gel
de agarose 2% (condições desnaturantes) para verificação da integridade do RNA total
através da visualização das bandas 28S e 18S de RNA ribossomal (Figura 3).
A análise da qualidade e quantidade do RNA extraído também foi realizada por
leitura em espectrofotômetro nos comprimentos de onda 260 nm e 280 nm. Os
resultados evidenciaram os níveis baixos de contaminações por polissacarídeos,
compostos fenólicos e proteínas determinados pelas razões das absorbâncias 260/280
superiores a 1,8 (vide apêndice). A quantificação e análise da qualidade do RNA total
extraído são necessárias, uma vez que a eficiência do processo de hibridação é
influenciada por diversos parâmetros experimentais, em especial, pela qualidade e
quantidade de RNA utilizado na síntese de cDNA (FELIX et al., 2002).
Figura 3. Integridade do RNA do tecido foliar de milho.
28 S
18 S
28 S
18 S
90
Com base na curva de dissociação (Vide apêndice) e análise em gel de agarose
foi verificada a amplificação de um produto único para os seis genes (Figura 4).
Figura 4. Gel de agarose 2% dos produtos de amplificação da reação de qRT-PCR. Presença de única
banda para o teste da eficiência dos primers com pool de cDNA das réplicas biológicas de
milho e ausência de banda no controle sem cDNA. M= marcador molecular 100 pb.
A partir dos resultados das análises de qRT-PCR, dos seis genes utilizados na
análise, dois apresentaram um valor M desejado. Foram eles: eIF-4α e ACT2 , com valor
de estabilidade de 1,168 e 1,308, respectivamente, caracterizando-os como candidatos
potenciais a genes de referência para análise da expressão gênica relativa para a
presente pesquisa. Os genes eIF-4α e ACT2 demonstraram pouca variabilidade de
expressão no tecido foliar de milho em diferentes condições de disponibilidade hídrica
no solo (Figura 5), por essa razão foram os escolhidos.
Foram avaliados seis genes tradicionalmente utilizados como genes
normalizadores, preconizados pela literatura (ISKADAR et al., 2005; CZECHOWSKI et al.,
2005; JAIN et al., 2006; SILVEIRA et al., 2009) como genes padrões de expressão
estável, verificou-se que há divergência dos resultados descritos para gramíneas de
interesse econômico cultivadas em condições adversas com a deste estudo;
corroborando a importância desse tipo de análise para cada caso particular de uma
pesquisa.
ACT2
Control
Control
Control
eE
F
-
1α
eIF
-
4α
GAPDH
UBC
Clatad
Control
Control
Control
M
M
M
M
91
Figura 5. Estabilidade da expressão de genes de referência, baseado no valor M, calculado pelo GeNORM.
Menor valor de M indica maior estabilidade nos tecidos foliares das plantas de milho sob os
tratamentos.
Estudos realizados em cana-de-açúcar, que também apresenta metabolismo C
4
como milho, obtiveram como melhor gene constitutivo o GAPDH em diversos tecidos e
genótipos, contrário ao observado neste estudo, que o classifica como menos estável
(M=1,6) que os genes selecionados. JAIN et al. (2006) obtiveram resultados
semelhantes e discordantes a esta pesquisa, ao avaliar a estabilidade de 10 genes
potencialmente estáveis. Estes autores contestaram a constitutividade do gene GAPDH
para arroz, gramínea de metabolismo C
3
. Os genes GAPDH, eIF-4α, ACT2 foram
classificados como menos estáveis enquanto que os genes eEF-1α, UBC, 18S rRNA e
25S rRNA mais estáveis. Resultados contrastantes foram observados por SILVEIRA et al.
(2009) na gramínea forrageira
Brachiaria brizantha
(C
4
). Esses autores demonstraram
que os genes eEF-4α, GAPDH, eIF-1 α, UBC apresentaram, em ordem crescente, maior
estabilidade.
Já CZECHOWSKI et al. (2005) observaram em
Arabidopsis
menor estabilidade
para GAPDH e maior estabilidade para Clatad, contrastando com o resultado observado
nas plantas de milho, onde dos genes avaliados, esse gene apresentou menor
1,4
1,6
1,8
1,9
1,9
2,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
eIF-4α ACT2 GAPDH eEF-1α UBC Clatad
Estabilidade na expressão gênica relativa
(
M value)
Mais estáveis Menos estáveis
(M<1,5)
92
estabilidade (M=2,5). Em relação ao número ideal de genes referência para análise,
determinado a partir da variação entre os pares (Figura 6), houve um aumento da
instabilidade quando incluído o gene Clatad.
Figura 6. Estabilidade de expressão de candidatos a genes de referência, baseado no valor M,
calculado pelo GeNORM. Menor valor de M indica maior estabilidade nos tecidos
foliares das plantas de milho sob os tratamentos
Embora ao se realizar a validação de genes de referência, observaram-se tais
concordâncias e discrepâncias com a literatura, tal fato pode estar relacionado à análise
in silico
realizada em um gene ortólogo em milho que possa não corresponder ao exato
parálogo de cana-de-açúcar, braquiária e/ou arroz. Por exemplo, um alinhamento
realizado entre as sequências derivadas dessas espécies pode revelar uma identidade de
90%, contudo, esse grau de similaridade não garante tratar-se de um mesmo ortólogo
(CZECHOWSKI et al., 2005; JAIN et al. 2006).
Em conjunto, estes resultados sugerem que os genes denominados normalmente
como de referência são regulados de forma diferente em diferentes espécies de plantas
e podem apresentar padrões de expressão diferencial. Portanto, um gene de referência
com expressão estável em um organismo pode não ser adequado para a normalização
da expressão gênica em outro, em um determinado conjunto de condições e precisa ser
1,2
1,4
1,6
1,7
1,7
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
eIF -4α ACT2 GAPDH eEF-1α UBC
Estabilidade da expressão gêncica relativa
(M value)
Mais estável Menos estável
M<1,5
93
validado antes da sua utilização. Além da expressão estável, o nível da expressão do
gene de referência em relação aos genes a serem analisados (genes alvo) também é
importante, isto é, genes com expressão altamente estáveis não podem servir como um
bom controle interno para a quantificação de genes com baixo nível de expressão (JAIN
et al., 2006).
4.3.2. Expressão gênica dos genes que regulam as vias metabólicas dos
solutos compatíveis
Na Tabela 5, observa-se o perfil da expressão relativa de genes das enzimas-
chave do metabolismo de distintos híbridos de milho sob limitação hídrica. Verificou-se
que para a expressão relativa dos genes,
ADP-Glic, P5CS
e
PROX
são diferentes entre os
híbridos de milho quando submetidos a diferentes disponibilidades hídricas. Para outros
genes, a expressão relativa foi contrastante independente do híbrido avaliado nas
situações de disponibilidade hídrica no solo (H x DHS
ns
, p>0,05). A expressão relativa
dos genes
Susy, TPP, THE, GtSy e OAT
não apresentaram diferenças significativas
quando os híbridos foram submetidos ao estresse hídrico. Os genes
T6PS, GTSY e OAT
apresentaram diferenças entre os híbridos, independente à condição de status hídrico
cultivado; essa diferença refere-se às características genotípicas dessas plantas.
Como houve a avaliação de 13 genes de enzimas-chave relacionadas ao
metabolismo de plantas sob estresse hídrico espera-se que muitos genes fossem
induzidos pela limitação hídrica, promovendo o aumento da tolerância celular à limitação
hídrica, o aumento das funções de proteção do citoplasma, organelas e membranas
celulares, alterações do potencial celular osmótico, o aumento na absorção de água (ex.
aquaporinas), o aumento no controle e no acúmulo de íons e maior regulação da
expressão de outros genes (BRAY et al., 2001).
94
4.3.2.1. Metabolismo dos carboidratos sacarose e trealose
O metabolismo de açúcares específicos foi afetado pela limitação hídrica (Tabela
5). Para o dissacarídeo sacarose, o gene
sacarose-6-fosfato-sintase
(
S6PS)
, reduziu sua
expressão quando as plantas estavam em condição adversa (Figura 7), já a expressão
do gene
Sacarose sintase
(
Susy)
permaneceu inalterada (Figura 8). Como o primeiro
refere-se à síntese, S6PS, e o segundo, à degradação, SuSy; observou-se que houve
sinergismo na regulação metabólica desse osmólito como postulado em literatura
(ROSA et al., 2009).
95
Tabela 5. Análise de variância por meio do Teste F da expressão gênica dos genes que regulam as vias metabólicas dos
solutos compatíveis (
p value
) em híbridos de milho submetidos a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
Causa da variação G.L.
p value
dos genes alvo do metabolismo de solutos compatíveis
S6PS SuSy
UDP-
Glic.
ADP-
Glic.
T6PS TPP THE NTR GTSY OAT P5CR
P5CS PROX
Híbridos (H) 1
0,02* 0,61
ns
0,01** 0,07
ns
0,01**
0,96
ns
0,33
ns
0,01**
0,01
**
0,01
**
0,06
ns
0,01
**
0,94
ns
Disponibilidade
hídrica no solo (DHS)
1
0,01** 0,14
ns
0,01** 0,05
*
0,98
ns
0,71
ns
0,08
ns
0,01**
0,74
ns
0,39
ns
0,01
**
0,01
**
0,15
ns
Interação HxDHS 1
0,18
ns
0,13
ns
0,17
ns
0,02* 0,01**
0,94
ns
0,33
ns
0,94
ns
0,93
ns
0,24
ns
0,15
ns
0,01
**
0,01
**
(Tratamentos) 3
- - - - - - - - - - - - -
Resíduo 16
- - - - - - - - - - - - -
Total 19
- - - - - - - - - - - - -
C.V - 7,61 7,31
1,82 5,47
2,92 4,28 13,54 8,54 9,59 4,28 10,28 6,96 7,08
96
Figura 7. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene
S6PS
. O fator DHS apresenta efeito distinto sobre a expressão desse gene
(p<0,01).
Segundo TAIZ & ZEIGER (2010), quando há redução nas taxas fotossintéticas
das plantas em condições adversas, há a redução na concentração de hexoses fosfato
no citosol, e, por conseguinte, da sacarose. Tal fato pode ser confirmado quando se
analisa a expressões de genes-alvo das vias metabólicas. A redução da expressão do
gene S6PS, precursor da sacarose-6-fosfato, importante molécula sinalizadora de
tolerância ao estresse hídrico, foi também verificada por SILVA & ARRABAÇA (2004) e
ROSA et al. (2009). Analogicamente, não havendo substrato para a degradação da
molécula de sacarose, o padrão de expressão do gene Susy permaneceu inalterado,
corroborando com os resultados da presente pesquisa.
Efeito da interação Hibrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denoatm 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
S6PS
(genes de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
**
**
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
97
Figura 8. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene
SuSy
. O fator DHS apresenta efeito semelhante sobre a expressão desse gene
(p>0,05).
A mudança do metabolismo da sacarose pode ocorrer devido à síntese e/ou à
degradação do amido ser mais influenciada em condições adversas do que a síntese de
sacarose (SILVA & ARRABAÇA, 2004). No presente estudo, ao se analisar a expressão
do gene
ADP-gliclose pirofosfolirase (ADP-Glic.)
, gene envolvido na síntese do amido
(ADP-glicose: doadora de glicosil para alongamento da cadeia do polissacarídeo),
observou-se que foi distinta entre os híbridos. No híbrido DKB 390 não houve alterações
significativas na expressão desse gene independente da disponibilidade hídrica no solo
em que foi cultivado, contudo, quando o híbrido DAS 2B710 foi submetido a menor
DHS, houve redução da expressão gênica do mesmo gene (Figura 9).
Tanto a manutenção quanto a redução da expressão podem também estar
relacionadas à redução da expressão do gene
S6PS
, pois há evidências que é uma
molécula sinalizadora do
pool
das hexoses (ROSA et al., 2009), pois um baixo
status
de
açúcar aumenta a mobilização de reservas e a exportação, enquanto que açúcares em
abundância promove a estocagem de carboidratos (TAIZ & ZEIGER, 2010). Dessa
Efeito da interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
SuSy
(genes de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
-0,01 MPa -0,06 MPa
98
forma, a repressão do gene
ADP-glic.
seria uma forma de acionar invertases para
hidrólise do amido para suprir o carbono necessário para a manutenção da produção de
sacarose, uma vez que houve reduções nas taxas de assimilação do CO
2
(vide capítulo
3).
Figura 9. A interação HxDHS foi significativa (p<0,01). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo dependente sobre a expressão gênica
relativa do gene ADP-Glic. Para cada híbrido, médias seguidas de mesma letra maiúscula não
diferiram entre si na expressão relativa do gene nas condições controle e seca (p>0,05). Para
cada disponibilidade hídrica, médias seguidas de mesma letra minúscula não diferiram entre si
na expressão relativa gênica dos híbridos DKB 290 e DAS 2B710 (p>0,05).
Com relação ao gene
UDP-glicose pirofosforilase (UDP-Glic.)
, observou-se que
houve um aumento da expressão do gene na condição mais limitante (Figura 10). O
produto metabólico desse gene é uma molécula central, para biossíntese da sacarose e
da trealose, derivando destas, várias outras funções celulares: obtenção de energia e
produção de estruturas de carbonos para polissacarídeos de celulose e da parede
celular, amido, lipídeos, proteínas, sacarose e trealose (PAUL et al., 2008).
Efeito da Interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo*
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
ADP-Glicose
(Genes de referência eIF-1a e ACT2)
Aa
Aa
Aa
Bb
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
99
Figura 10. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbrido (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene UDP-glic. O fator DHS apresenta efeito distinto sobre a expressão desse
gene (p<0,05).
As vias de sinalização da sacarose e UDP-glicose se cruzam antagonicamente,
pelo menos para os genes
S6PS, SuSy
e
UDP-glic
., corroborando com a literatura
(CIERESZKO et al., 2001). Entretanto, há relatos que as vias podem agir
sinergicamente, em condições de deficiência mineral e baixa temperatura (LESZEK et
al., 2004). Segundo esses autores, a presença de distintas vias de sinalização para os
genes
UDP-glic
e
S6PS-T6PS
pode representar um mecanismo onde
UDP-glic.
é
assegurada a ser produzida, mesmo se uma das vias está inativa ou bloqueada (LESZEK
et al., 2004; PAUL et al., 2008).
Já para a via da trealose, houve distinção na expressão do gene
trealose-6-
fosfato-sintase
(
T6PS
) entre os genótipos. Tendencialmente, para o genótipo DKB 390
houve o aumento da expressão do gene, enquanto para o DAS 2B710 houve a redução
(Figura 11), apesar de não ser significativa. Contudo, no potencial -0,06 MPa, há
diferença significativa da expressão do gene
T6PS
entre os híbridos, na qual o DKB 390
Efeito da interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
UDP-Glicose
(Genes de referência
eIF-1a
e
ACT2
)
**
**
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
100
apresenta três vezes a mais de transcrição do gene comparado ao DAS 2B710. Os
genes
trealose-6-fosfato-fosfatase (TPP)
e
trealase (THE)
não alteraram sua expressão,
independente do híbrido e da umidade no solo (Figuras 12 e 13). Os padrões de
expressão das enzimas-chave do metabolismo da trealose obtidos nas plantas
superiores, às vezes, não possuem correlação com a tolerância ao estresse (EASTMOND
et al., 2003; PAUL, 2008), uma vez que o composto ativo não seria a trealose e sim a
trealose-6-fosfato (T6P) nessas condições (EASTMOND et al., 2003).
Figura 11. A interação HxDHS foi significativa (p<0,01). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo dependente sobre a expressão gênica
relativa do gene
T6PS
. Para cada híbrido, médias seguidas de mesma letra maiúscula não
diferiram entre si na expressão relativa do gene nas condições controle e seca (p>0,05).
Para cada disponibilidade hídrica, médias seguidas de mesma letra minúscula não diferiram
entre si na expressão gênica relativa dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710 (p>0,05).
Efeito da interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo**
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
T6PS
(genes de referência
e-IF4a
e
ACT2
)
Aa
Aa
Aa
Ab
-0,01 MPa -0,06 MPa
101
Figura 12. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene
TPP
. O fator DHS apresenta efeito semelhante sobre a expressão desse gene
(p>0,05).
Figura 13. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene THE. O fator DHS apresenta efeito semelhante sobre a expressão desse
gene (p>0,05).
Efeito da interação Híbrido
X
Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
-0,01 MPa -0,06 MPa
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expresão relativa do gene
THE
(genes de referência
eIF-4a e ACT2
)
Efeito da Interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
TPP
(gene de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
102
Nos genes
T6PS, TPP
e
THE
não se detectaram variações significativas em seus
padrões de expressão, pois a síntese de trealose nas plantas pode ser limitada, pois em
excesso, pode causar efeitos deletérios no metabolismo (WIGLER, 2002). O metabólito
T6P, um intermediário da via da trealose, é formado pela ação da enzima T6PS,
indispensável para a utilização de carboidrato disponível durante o crescimento e
desenvolvimento da planta e está intimamente relacionada com a percepção de
estresses nutricionais, bióticos e abióticos (PAUL, et al. 2008). Há forte evidência de que
a trealose-6-fosfato (
T6PS
) atuaria como uma molécula sinalizadora no metabolismo de
carboidrato (PAUL, 2008).
Observou-se também que um gene, cujo produto está envolvido em outras vias
metabólicas e funções celulares, são também positivamente regulados por açúcares
solúveis, por exemplo, o gene que codifica a proteína de síntese da UDP-glicose pode
ser regulado pelos genes que codificam as proteínas dos precursores S6PS e T6PS.
Em contrapartida, muitos genes são regulados negativamente por açúcares que
possivelmente reprimiram a expressão do gene ADP-glicose. Entretanto, nada se sabe
sobre a possibilidade de um mecanismo comum responsável pela regulação dos
metabólitos sacarose e trealose. Os sinais que desencadeiam estes processos, como a
regulação do metabolismo de carbono pela fotossíntese interage com outros processos
durante condições de estresse ainda necessitam ser mais elucidados.
Com isso, as alterações na expressão dos genes que codificam as proteínas de
enzimas-chave desses açúcares não seguem um modelo estático e variam com o
genótipo e tipo de estresse, conforme os resultados descritos no perfil de expressão
gênica relativa no presente estudo (Figura 14). Além disso, também foram notificados
que nem todos os açúcares solúveis desempenham papéis similares em eventos
associados ao metabolismo de plantas estressadas. A sacarose e a trealose podem atuar
como substratos para a respiração celular, ou como osmólitos para manter a
homeostase celular, enquanto a frutose não está relacionada com osmoproteção e
parece estar relacionada com a síntese de metabólitos secundários (ROSA et al., 2009).
Ademais, a atividade de uma enzima poderia não corresponder linearmente a um
103
aumento da expressão do seu gene codificante, uma vez que podem ocorrer diversos
fatores que atuariam na atividade de uma enzima, a exemplo: a ausência de cofatores
ou presença de inibidores enzimáticos.
Figura 14. Perfil da expressão relativa de genes das enzimas-chave do metabolismo da
sacarose e trealose em distintos híbridos de milho (DKB 390 e DAS 2B710)
sob déficit hídrico (-0,06 MPa).
Glicose
+ Frutose
FOTOSSÍNTESE
S6P
Sacarose
UDP-Glic
Glic-1-P
Glic-6-P
Amido
UDP-Glicose +
Glicose-6-P
Trealose 6 -P
Trealose
2 Glicose
T
realase
Pi
H
2
O
TPP
TPS
UDP
H
2
O
SuSy
SPS
UDP-Glic
ADP-Glic
UDP-Glicose
pirofosforilase
ADP-Glicose
pirofosforilase
Sacarose Sintase
Sacarose fosfato Sintase
Frutose-6-P
Legenda:
Híbrido DKB 390
Híbrido DAS 2B710
104
4.3.2.2. Metabolismo dos compostos nitrogenados
Como parte do metabolismo global das plantas, o metabolismo do nitrogênio é
afetado pelo déficit hídrico
.
A conversão do nitrato a amônio, mediada pela nitrato
redutase (NtR), a qual reduz nitrato a nitrito, e pela nitrito redutase, que converte nitrito
a amônio, que por sua vez é assimilado nos aminoácidos glutamina e glutamato por
meio da glutamina sintetase (GtSy) e glutamato sintase (GOGAT). Esses aminoácidos
servem para translocar nitrogênio orgânico de fontes para drenos, bem como para a
incorporação a outros aminoácidos por meio de reações de transaminações; é
influenciado negativamente por fatores abióticos (TAIZ & ZEIGER, 2010). Como as
plantas sintetizam seus componentes orgânicos a partir de nutrientes inorgânicos,
evidenciou-se a necessidade de se quantificar a expressão gênica de enzimas que
codificam a assimilação do nitrato (nitrato redutase) e do amônio (glutamina sintetase).
A expressão do gene que codifica a enzima nitrato redutase foi reduzida em
ambos os híbridos sob estresse hídrico (Figura 15). Possivelmente, com o decréscimo do
potencial hídrico no solo para -0,06 MPa, a absorção de NO
3
-
foi reduzida, ocasionando
modificações em níveis de transcrição e tradução do gene
nitrato redutase
(
NtR
). Em
diferentes genótipos de milho a atividade da enzima apresentou redução sob condições
de estresse hídrico (FERREIRA et al., 2002), evidenciando que fatores adversos como a
seca regulam a atividade da enzima. A nível transcricional, FOYER et al. (1998)
evidenciaram que no milho, através da northern-blot analysis, os níveis de transcrição
da
NtR
é diminuído (em cerca de 80% nas folhas de milho) em condições de seca.
Dessa forma, os resultados desta pesquisa aliados à literatura, sugerem que houve
presumivelmente uma diminuição na síntese de proteínas, devido à inibição de
processos envolvendo a transcrição e formação da proteína ativa nitrato redutase. Os
decréscimos observados na expressão do gene
NtR
em ambos híbridos de milho podem
ter sido causados por uma diminuição nos níveis de nitrato na folha.
105
Figura 15. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbrido (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene
NtR
. O fator DHS apresenta efeito distinto sobre a expressão desse gene
(p<0,05).
O gene
glutamina sintetase
(
GtSy)
manteve padrão de expressão inalterado em
ambos os híbridos na condição adversa (Figura 16). Mesmo com a redução da
disponibilidade hídrica no solo para -0,06 MPa, a conversão do NH
4
+
em glutamina foi
mantida, ainda que todo o processo consuma o equivalente a 12 ATPs para cada nitrato
assimilado (revisado por TAIZ & ZEIGER, 2010). Com isso, pode-se presumir que o
amônio não foi mantido por meio da rota comum, quando o substrato NH
4
+
advém da
redutase do NO
3
-
, mas possivelmente por meio da proteólise, que é um processo
desencadeado quando a plantas encontra-se em condição limitante, sugestionada, neste
trabalho, pelo decréscimo da expressão do gene que codifica a enzima nitrato redutase.
Efeito da interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
NtR
(gene de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
**
**
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
106
Figura 16. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene
GtSy
. O fator DHS apresenta efeito semelhante sobre a expressão desse gene
(p>0,05).
De acordo com FERREIRA et al. (2002) e MEDICI et al. (2003), ao avaliarem a
atividade da enzima glutamina sintetase em diferentes genótipos de milho sob seca,
observaram que não houve diferenças significativas na atividade da proteína,
independente do genótipo ou condição de disponibilidade hídrica estudada. Como a
assimilação do nitrogênio é reduzida sob tais condições, pode-se supor que tal
composto se origina da rotatividade de proteínas. É neste contexto que as enzimas
envolvidas na incorporação do amônio a compostos orgânicos, os quais podem agir
como precursores para diferentes metabólitos, podem ter importante papel na
sobrevivência de plantas durante estresse (FERREIRA et al., 2002).
Em recente pesquisa, DÍAZ et al. (2010), comprovaram a importância da
glutamina sintetase no metabolismo da prolina. Em mutantes de
Lotus japonicus
(GS2
mutante, Ljgln2-2) que subexpressam o gene
GtSy
, foi avaliada a resposta transcricional
à seca através de qRT-PCR de linhagens mutantes e selvagem dessa espécie. Esses
autores observaram que o Ljgln2-2 mutante apresentou sensibilidade ao estresse
Efeito da interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
GtSy
(genes de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
107
hídrico, comparada à linhagem selvagem, obtendo diferenças significativas no padrão de
expressão dos genes envolvidos no metabolismo de prolina, bem como redução no
acúmulo de prolina, tornando os mutantes mais sensíveis aos danos causados pela seca.
Ao se avaliar o padrão de expressão dos genes envolvidos no metabolismo da
prolina em genótipos de milho sob condição de estresse, observou-se têm padrão de
expressão distintos (Figuras 17, 18 e 19).
Como o precursor ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato pode ser sintetizado diretamente
e/ou indiretamente, observou-se que na via direta, a expressão do gene
P5CS
(
∆’
pirrolina-5’ carboxilato sintetase
) é distinta entre os híbridos de milho. O híbrido DKB
390 apresentou expressão inalterada, independente da DHS. Já o DAS 2B710 duplicou,
significativamente, a sua expressão na condição de limitação hídrica: -0,06 MPa
comparado à planta controle (-0,01 MPa). Na condição limitante de umidade no solo, os
níveis de transcrição da
P5CS
são quatro vezes maiores no híbrido DAS 2B710 que no
DKB 390 (Figura 17). Já na via indireta, para ambos os híbridos, o gene
OAT
(
ornitina
aminotransferase
) não apresentou alterações no padrão de expressão em nenhuma
condição de DHS. No passo comum as duas vias, o qual a ∆
1
-pirrolina-5-carboxilato é
reduzida a prolina através da enzima ∆’ pirrolina-5’ carboxilato redutase (P5CR), a
expressão do gene que codifica essa enzima (
P5CR
) foi maior na condição limitante de
água no solo para os híbridos de milho (Figura 19). De acordo com a literatura, embora
as duas vias de síntese sejam igualmente importantes em condições normais, as
evidências favorecem a via direta do glutamato em condições de estresse hídrico.
Ao sofrer deleção do gene
OAT
, plantas mutantes de
Arabidopsis
em condições
de estresse hídrico acumularam prolina normalmente quando comparado com a
linhagem selvagem, acumulou intermediários do ciclo da uréia, prejudicando o
catabolismo dos aminoácidos ornitina e arginina para fins de fonte de nitrogênio (FUNCK
et al. 2008). Esses autores afirmam ainda que a biossíntese de prolina em
Arabidopsis
seja praticamente ou exclusivamente realizada por meio da via glutamato (via direta) e
que não depende do glutamato advindo do catabolismo da ornitina ou arginina.
108
Figura 18. A interação HxDHS foi significativa (p<0,01). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo dependente sobre a expressão gênica
relativa do gene
P5CS
. Para cada híbrido, médias seguidas de mesma letra maiúscula não
diferiram entre si na expressão relativa do gene nas condições controle e seca (p>0,05).
Para cada disponibilidade hídrica, médias seguidas de mesma letra minúscula não diferiram
entre si na expressão gênica relativa dos híbridos DKB 390 e DAS 2B710 (p>0,05).
Figura 19. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene
OAT
. O fator DHS apresenta efeito semelhante sobre a expressão desse
gene (p>0,05).
Efeito da Interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo**
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
P5CS
(genes de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
Aa
Ab
Ab
Ba
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
Efeito da interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
OAT
(genes de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
109
No caso deste trabalho, pode ser admitido que a prolina acumulada (vide capítulo
3) tenha sua origem no glutamato proveniente do N assimilado recentemente, ou seja,
pela expressão dos genes que codificam as proteína nitrato redutase e glutamina
sintetase, uma vez que as respostas à expressão dos genes dessas enzimas ao estresse
hídrico foram coesas à expressão dos genes
P5CS
e
P5CR
. Consequentemente, a
disponibilidade de glutamato necessária para síntese de prolina poderia ser explicada
pela hidrólise de proteínas ou por transaminação a partir de outros aminoácidos. A
hidrólise de proteínas, além de contribuir com o aminoácido precursor (glutamato),
pode também contribuir com a própria prolina, favorecendo o seu aumento como
aminoácido livre nos tratamentos sob estresse hídrico (MEDICI et al., 2003; DÍAZ et al.
2010).
Figura 19. A interação HxDHS foi não-significativa (p>0,05). Os efeitos dos fatores híbrido (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo independente sobre a expressão gênica
relativa do gene
P5CR
. O fator DHS apresenta efeito distinto sobre a expressão desse gene
(p<0,05).
Efeito da interaçao Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
P5CR
(genes de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
**
**
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
110
Ao se analisar a expressão do gene responsável pela degradação da prolina
(
PROX
), demonstrou-se que os níveis de transcrição do híbrido DKB 390 são estáveis.
Com relação ao DAS 2B710, houve redução significativa da expressão do gene
PROX
para 1/3 em condição de déficit hídrico quando comparado ao controle. Percebeu-se
que os genes
P5CS
e
PROX
são altamente conexos, ocorrendo ciclagem do produto da
rota metabólica. Calculando a razão
P5CS
/
PROX
da expressão desses genes, para cada
híbrido sob distintas disponibilidades hídrica no solo, obtiveram-se os valores: híbrido
DKB 390: 0,0 (controle) e 0,3 (déficit hídrico); híbrido DAS 2B710: 0,53 (controle) e 4,8
(déficit hídrico).
Figura 20. A interação HxDHS foi significativa (p<0,01). Os efeitos dos fatores híbridos (H) e
disponibilidade hídrica no solo (DHS) agem de modo dependente sobre a expressão gênica
relativa do gene
PROX
. Para cada híbrido, médias seguidas de mesma letra maiúscula não
diferiram entre si na expressão relativa do gene nas condições controle e déficit hídrico
(p>0,05). Para cada disponibilidade hídrica, médias seguidas de mesma letra minúscula não
diferiram entre si na expressão gênica relativa dos híbridos DKB 290 e DAS 2B710 (p>0,05).
Efeito da interação Híbrido x Disponibilidade hídrica no solo**
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Híbrido
DKB 390
Híbrido
2B 710
Controle (-0,01 MPa) Seca (-0,06 MPa)
Disponibilidade hídrica no solo (MPa)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Expressão relativa do gene
PrOX)
(genes de referência
eIF-4a
e
ACT2
)
Aa
Aa
Aa
Ba
-
0,01 MPa
-
0,06 MPa
111
Neste estudo, também se revelou o aspecto inovador do metabolismo Pro em
plantas mencionado por MILLER et al. (2009), o qual demonstra a existência de um ciclo
P5C-Pro. Corroborando a ciclagem do metabólito nos genótipos DKB 390 e DAS 2B710,
embasados nos resultados dos níveis de transcritos para os genes
P5CR
e
PROX
desta
pesquisa. Esse ciclo citosólico-mitocondrial seria responsável pelo acúmulo preferencial
de prolina, mantendo uma elevada razão celular de Pro para P5C e fluxo de elétrons
para a cadeia mitocondrial de transporte de elétrons.
Esses autores postulam que o ciclo P5C-Pro está intrínseco ao desenvolvimento e
ao metabolismo de plantas sob estresse, onde os genes
PRODH
e
P5CDH
são altamente
expressos em órgãos florais e zonas meristemáticas, bem como em partes vegetativas
(heterotróficas) em regiões com depleção de luz e/ou de açúcar (MILLER et al., 2009).
Evidenciam ainda que esse catabolismo é mais proeminente durante a recuperação de
estresses abióticos.
A superexpressão do gene
PROX
em mutantes de alfafa, tabaco e
Arabidopsis
aumentaram a capacidade oxidante da Pro, mas não reduziram o teor de Pro, em
comparação com as plantas selvagens, em condições normais, ou salinidade, ou
condições de déficit hídrico. Além disso, nenhum aumento nos níveis de P5C ou
hipersensibilidade à seca ou salinidade foram registrados. A manutenção dos níveis
comparáveis Pro e P5C em linhagens selvagens e mutantes
PRODH-OE
indica que a
compensação do excesso de produção de P5C é alcançada pela redução imediata a Pro
e, assim, o equilíbrio entre os dois compostos é mantido como nas linhagens selvagens
(MILLER et al., 2009). Teoricamente, tais apontamentos explicariam a diferença na
razão
P5CS/PROX
da expressão dos genes de híbridos: aquele híbrido mais tolerante
apresentaria uma razão
P5CS/PROX
menor, enquanto o de menor tolerância, uma razão
maior.
Posto isso, o gene PROX pode ser considerado como um importante regulador
das plantas, envolvido no controle da atividade do ciclo P5C-Pro, além de contribuir
para o controle redox mitocondrial e à prevenção da superprodução de ROS.
112
i
Figura 21. Perfil da expressão relativa de genes das enzimas-chave do metabolismo da prolina em
distintos híbridos de milho (DKB 390 e DAS 2B710) sob déficit hídrico (-0,06 MPa).
As postulações anteriores podem explicar as diferenças em níveis de transcrição e
tradução dos genes que regulam a biossíntese e a degradação da prolina:
P5CS, OAT,
P5CR
e
PROX
. Em tese, em condições de estresse hídrico, há a predominância do uso
da via direta pelos híbridos de milho, evidenciada pela expressão dos genes codificantes
das enzimas P5CS e P5CR, mantendo o equilíbrio da razão P5C/Pro através da
NO
NONO
NO
3
33
3
-
--
-
NO
NONO
NO
2
22
2
-
--
-
NH
NHNH
NH
3
33
3
RN
RNi
∆
∆∆
∆
’
Pirrolina 5
’
- Carboxilato sintetase
Redutase nitrato
Glutamina sintetase
∆
∆∆
∆
’
Pirrolina 5
’
- Carboxilato redutatase
Pro oxigenase
Ortina aminotransferase
Legenda:
Híbrido DKB 390
Híbrido DAS 2B710
113
expressão do gene
PROX
. Sendo esse gene importante para homeostase celular ao
prevenir do estresse oxidativo.
Ademais, alguns genes evidenciaram diferenças fenotípicas entre os híbridos,
podendo ser utilizados no
screening
de genótipos na avaliação do grau de tolerância ao
déficit hídrico.
4.4. Conclusões
Os genes
ACT2
e
eIF-4α
foram utilizados como normalizadores para a análise de
expressão relativa de milho sob diferentes disponibilidades hídricas no solo. Os dois
genes apresentam menor variação na sua expressão entre os tratamentos testados.
Os genes identificados como responsivos à limitação hídrica foram:
S6PS, UDP-
Glic
e
ADP-Glic
para metabolismo de carboidratos, e
NtR, P5CS, P5CR e PROX para o
metabolismo dos aminoácidos.
Esses genes
podem, ainda, ser potenciais marcadores
moleculares para uso em programa de melhoramento genético de milho fundamentado
em seleção assistida.
No conjunto das respostas transcricionais ao déficit hídrico, analisado através da
técnica de qRT-PCR, evidenciou-se que o híbrido DKB 390 é mais tolerante às mudanças
na disponibilidade hídrica no solo do que o híbrido DAS 2B710, classificando-os como
tolerante e sensível ao déficit hídrico, respectivamente.
4.5. Referências Bibliográficas
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116
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1
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118
CONSIDERAÇÕES FINAIS
As mudanças nos teores de prolina e sacarose, bem como na expressão de genes
que codificam enzimas-chave envolvidas no metabolismo desses compostos em plantas
de milho submetidas à deficiência de água, constituem fortes indicadores do papel
desses compostos na resposta à limitação hídrica e na aclimatação dessas plantas ao
estresse.
IMPACTO E PERSPECTIVAS FUTURAS DA PESQUISA
Apesar das pesquisas, que produzem uma infinidade de informações, dos
diversos fenômenos chaves na tolerância ao estresse, ainda não está totalmente
elucidada, pois apenas alguns componentes de diversas vias foram relacionados nos
estudos. A prioridade, certamente, será a identificação de moléculas conectoras das
diversas vias e dos componentes chaves de cada via de resposta à limitação hídrica.
Portanto, os trabalhos de pesquisa voltados à identificação de espécies vegetais
tolerantes à seca, determinação dos mecanismos de tolerância, a conservação e a
transformação dos recursos genéticos das plantas mais tolerantes à seca, são fatores
importantes para o equilíbrio ambiental, uma vez que cerca de 80% da água consumida
no mundo é destinada à agricultura.
119
APÊNDICES
120
APÊNDICE CAPÍTULO 3 (A3)
A3.1. Instalação e Condução do experimento piloto
Inicialmente, foi determinada a curva de retenção hídrica para os solos propostos,
com o intuito de se obter a umidade correspondente às diferentes tensões. Para isso,
foram coletadas amostras do solo dos vasos com auxílio de anel volumétrico de 4,8 cm
de diâmetro e 3,0 cm de altura (Figuras 1 e 2), para determinação da densidade e da
capacidade de retenção de água por secamento, nas tensões de 0,001; 0,006; 0,01;
0,03; 0,06; 0,1 e 0,3 MPa (Tabela 4 e Figura 5), com o auxílio de uma câmara de
pressão de Richards com placa porosa. As curvas de retenção foram ajustadas com base
no modelo matemático proposto por van GENUCHTEN (1980) e, a partir dessas, foi
estimada a retenção de água a 1,5 MPa, com vistas a calcular a capacidade de
disponibilidade hídrica no solo (DHS).
Figura 1. Coleta das amostras do solo dos vasos com auxílio de anel volumétrico de 4,8
cm de diâmetro e 3,0 cm de altura para determinação da densidade e da
capacidade de retenção de água por secamento.
121
Figura 2. Amostras do solo indeformado em anel volumétrico de 4,8 cm de diâmetro e
3,0 de altura para determinação da densidade e da capacidade de retenção
de água por secamento.
Figura 3. Curvas de retenção ajustadas com base no modelo matemático proposto por van
GENUCHTEN (1980) e, a partir dessas, foi estimada a retenção de água a 1,5 MPa,
com vistas a calcular a disponibilidade hídrica no solo (DHS).
122
Para calibração da curva, planejamento da adubação e análises bioquímicas foi
montado um experimento piloto.
A partir das leituras no tensímetro, foi realizado o cálculo através dos dados da
curva de retenção para os solos propostos no trabalho e do volume do vaso (Figura 4).
Figura 4. Exemplo de cálculo para volume de um vaso.
Ex: Solo LVd com tensão hídrica de -0,03 MPa
Leitura diária da tensão do vaso (tensímetro digital): 860, 7 mBar Ξ –0,08607 MPa
Logo, o solo LVd com tensão hídrica de 0,03 MPa tem capacidade de água disponível de
0,1313 cm
3
/cm
3
.
Então, a quantidade de água reposta foi calculada por meio da diferença do valor
de cm
3
/cm
3
do tratamento e o valor de cm
3
/cm
3
correspondente a leitura da tensão
diária do vaso, multiplicado ao volume do vaso:
DHS = (0,1339 cm
3
/cm
3
- 0,1154 cm
3
/cm
3
)*35000 cm
3
DHS= 647,5 cm
3
(quantidade reposta de água no vaso para manutenção da umidade
concernente a tensão do tratamento.
123
Caracterização física e química dos solos
Amostras de dois tipos de solos: 1) Latossolo Vermelho distrófico, típico, textura
média, A moderado caulinítico, hipoférrico (LVd) e, 2) Latossolo Vermelho distrófico,
eutroférrico, típico, textura argilosa, A moderado, caulinítico-oxídico (LVef) (ANDRIOLI &
CENTURION, 1999) foram coletados na profundidade de 0 a 20 cm, sendo retiradas
alíquotas representativas, as quais foram homogeneizadas e submetidas à análise
química e granulométrica (RAIJ & QUAGGIO, 1983). A partir dos resultados das
análises, foi realizada a correção e a adubação (Figura 5), de acordo com as exigências
nutricionais da cultura do milho (RAIJ et al. 1997; FORNASIERI FILHO, 1992).
Vaso com solo LVd com tensão
hídrica de 0,03
MPa
Leitura diária do vaso com solo LVd
com tensão hídrica de 0,07 MPa
124
Tabela 1. Resultado de análise química dos solos para o experimento: Latossolo Vermelho distrófico,
típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (LVd) e, Latossolo Vermelho
distrófico, eutroférrico, típico, textura argilosa, A moderado, caulinítico-oxídico (LVe).
Macronutrientes
Camada
0-20 cm
pH*
CaCl
2
M.O. P(resina)
K Ca Mg H+Al SB CTC V
g dm
-
3
mg dm
-
3
--------------mmol
c
dm
-
3
----------- %
LVef 5,6 20 45 3,0 35 13 22 51,0 73,0 70
LVd 5,3 12 17 1,4 14 7 18 22,4 40,4 55
Análise realizada no Laboratório de Análise de Solo e Planta, do Departamento de Solos e Adubos, da Faculdade de Ciências Agrárias
e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal, Estado de São Paulo. E-mail: solos@fcav.unesp.br
Tabela 2 Resultado de análise química dos solos para o experimento: Latossolo Vermelho distrófico,
típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (LVd) e, Latossolo Vermelho
distrófico, eutroférrico, típico, textura argilosa, A moderado, caulinítico-oxídico (LVef).
Micronutrientes
Camada
0-20 cm
B Cu Fe Mn Zn
----------------------------------------mg dm
-
3
----------------------------------
LVef 0,12 3,3 12,0 45,5 1,0
LVd 0,15 0,6 11,0 14,7 0,5
Análise realizada no Laboratório de Análise de Solo e Planta, do Departamento de Solos e Adubos, da Faculdade de Ciências Agrárias
e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal, Estado de São Paulo. E-mail: solos@fcav.unesp.br
Tabela 3. Resultado de análise granulométrica dos solos para o experimento: Latossolo Vermelho
distrófico, típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (LVd) e, Latossolo
Vermelho distrófico, eutroférrico, típico, textura argilosa, A moderado, caulinítico-oxídico
(LVef).
Camada
0-20 cm
Argila Limo Areia fina Areia grossa Classe textural
------------------------g Kg
-
1
-------------------------
LVef 540 270 120 70 Argilosa
LVd 300 30 290 380 Média
* Análise realizada no Laboratório de Análise de Solo e Planta, do Departamento de Solos e Adubos, da Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal, Estado de São Paulo. E-mail: solos@fcav.unesp.br
125
A partir desses resultados, foi realizado o planejamento de adubação de acordo
com com as exigências nutricionais da cultura (RAIJ et al.,1997; FORNASIERI FILHO,
1992):
1. Calagem (MgCO
3
p.a): 0,48 t/h para o solo Lvd. Foi realizado o cálculo por vaso = 7g
MgCO
3
/vaso.
2. Nitrogênio (uréia p.a): 18,18 g/vaso (aplicação parcelada)
3. Potássio (Sulfato de potássio p.a): 17,5 g/vaso (aplicação parcelada).
4. Fósforo (Superfosfato triplo): 82 g/vaso (aplicação única-semeadura).
5. Boro (ácido bórico p.a): 0,1029 g/vaso (aplicação única-semeadura).
6. Zinco (sulfato de zinco p.a): 0,2625 g/vaso (aplicação única-semeadura)
7. Molibdênio (Molibdato de amônio tetrahidratado p.a): 0,0065 g/vaso (aplicação única-
semeadura).
8. Cobre (Sulfato de cobre pentahidratado p.a): 0,036 g/vaso (aplicação única-semeadura)
Quadro 1. Planejamento do manejo nutricional do Experimento
Macronutrientes (g/vaso/aplicação)
Cronograma N P K/S Ca/Mg
Semeadura 2,27 g 82 g 2,19 7 g
A partir de 45 dias (Quinzenal) 2,27 g - 2,19 -
Após 45 dias (Semanal) 2,27 g - 2,19 -
Após 45 dias (Semanal, 1,5 x a dose) 3,40 - 3,29 -
Micronutrientes (g/vaso/aplicação)
Cronograma B Zn Mo Cu
Semeadura 0,1029 0,2625 0,0065 0,036
126
Figura 5. Correção da acidez e a adubação, individualmente, dos vasos, de acordo com
as exigências nutricionais da cultura. A terra foi seca a sombra e peneirada
anteriormente.
Após a correção e adubação, os solos foram umedecidos e mantidos com umidade em
torno de 60% da capacidade de campo por um período de 30 dias a fim de promover as
reações de correção e a distribuição uniforme dos nutrientes. Após esse período, para
comprovar o efeito das correções, realizou-se nova análise do solo (Tabelas 4, 5 e 6).
127
Tabela 4. Resultado de análise química dos solos para o experimento: Latossolo Vermelho
distrófico, típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (LVd) e,
Latossolo Vermelho distrófico, eutroférrico, típico, textura argilosa, A moderado,
caulinítico-oxídico (LVef) após as correção e adubação mineral. Macronutrientes.
Camada
0-20
cm
pH*
CaCl
2
M.O.
P(resina)
K
Ca
Mg
H+Al
SB
CTC
V
g dm
-
3
mg dm
-3
--------------------
mmol
c
dm
-
3
------------
--------
%
LVef 5,7 21 300 4,1 63 22 28 89,1 117,1
76
LVd
5,6
11
260
3,6
46
28
25
77,6
102,6
76
Análise realizada no Laboratório de Análise de Solo e Planta, do Departamento de Solos e Adubos, da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal, Estado de São Paulo. E-mail: [email protected]
Tabela 5. Resultado de análise química dos solos para experimento: Latossolo Vermelho
distrófico, típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (LVd) e,
Latossolo Vermelho distrófico, eutroférrico, típico, textura argilosa, A moderado,
caulinítico-oxídico (LVef). após após as correção e adubação mineral.
Micronutrientes.
Camada
0-20
cm
B
Cu
Fe
Mn
Zn
------------------------------------mg dm
-3
----------------------------------
LVef
0,54
4,6
10,0
37,8
2,1
LVd
0,50
2,6
9,0
22,4
2,1
* Análise realizada no Laboratório de Análise de Solo e Planta, do Departamento de Solos e Adubos, da Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal, Estado de São Paulo. E-mail: solos@fcav.unesp.br
128
Tabela 6. Resultado de análise granulométrica dos solos para o experimento: Latossolo
Vermelho distrófico, típico, textura média, A moderado caulinítico, hipoférrico (LVd)
e, Latossolo Vermelho distrófico, eutroférrico, típico, textura argilosa, A moderado,
caulinítico-oxídico (LVef).
Ca
mada
0-20
cm
Argila Limo Areia fina
Areia
grossa
Classe textural
------------------------
g Kg
-
1
-------------------------
LVef
507
281
141
71
Argilosa
LVd
298
57
320
325
Média
* Análise realizada no Laboratório de Análise de Solo e Planta, do Departamento de Solos e Adubos, da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal, Estado de São Paulo. E-mail: [email protected]
129
RESULTADOS PRELIMINARES-EXPERIMENTO PILOTO
Tabela 7. Análise de variância por meio do Teste F das respostas bioquímico-fisiológicas (
p value
) de híbridos de milho
submetidos a diferentes disponibilidades hídricas no solo.
**significativo (
p
<0,01); *significativo (
p
<0,05);
ns
não-significativo (
p
>0,05).
Causa da
variação
G.L.
p value
dos parâmetros bioquímico-fisiológicos
Fotost
C. Est EFM Alt. A.I.E Diam. MST Sac. Tre.
Ac.Re
d
Amido
AA Pro
Híbridos (H)
1
0,81
ns
0,12
ns
0,17
ns
0,37
ns
0,17
ns
0,74
ns
0,29
ns
0,01** 0,44
ns
0,64
ns
0,09
ns
0,01** 0,18
ns
Disponibilidade hídrica
no solo (DHS)
2
0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,01** 0,49
ns
0,42
ns
0,02* 0,01** 0,01**
Solo (S)
1
0,07
ns
0,51
ns
0,43
ns
0,35
ns
0,33
ns
0,99
ns
0,43
ns
0,01** 0,01** 0,74
ns
0,73
ns
0,51
ns
0,23
ns
Interação HxDHS
2
0,38
ns
0,02* 0,22
ns
0,51
ns
0,88
ns
0,80
ns
0,77
ns
0,11
ns
0,01** 0,01** 0,84
ns
0,01** 0,32
ns
Interação HxS
1
0,04* 0,37
ns
0,47
ns
0,26
ns
0,81
ns
0,48
ns
0,75
ns
0,01** 0,01** 0,82
ns
0,64
ns
0,01** 0,47
ns
Interação DHSxS
2
0,37
ns
0,65
ns
0,88
ns
0,26
ns
0,66
ns
0.71
ns
0,79
ns
0,01** 0,01** 0,11
ns
0,93
ns
0,24
ns
0,59
ns
Interação HxDHSxS
2
0,01** 0,12
ns
0,11
ns
0,30
ns
0,67
ns
0,10
ns
0,64
ns
0,14
ns
0,01** 0,11
ns
0,17
ns
0,40
ns
0,29
ns
(Tratamentos) 11 - - - - - - - - - - - - -
Resíduo 36 - - - - - - - - - - - - -
Total
47
C.V -
18,22 19,03 16,85 18,6 21,83 14,06 19,23 13,71 10,33 18,07 18,07 17,06
24,
44
130
Figura 6. Fotossíntese líquida de híbridos de milho em reposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da Interação Hibrido x Tensão x Solo
ns
Barras Verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
DKB 390
2B 710
Disponibilidade hídrica do solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
-10
0
10
20
30
40
50
Fotossíntese Líquida (µmol m
-2
s
-1
)
Disponibilidade hídrica do solo
LVef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
**
131
Figura 7. Condutância estomática de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica
em diferentes tipos de solos.
Efeito da interação hibrido x DHS x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
DKB 390
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
0,0 MPa -0,3 MPa -0,6 MPa
0,00
0,25
0,50
0,75
Condutância Estomática (mol m
-2
s
-1
)
Disponibilidade hídrica no solo
LVef
0,0 MPa -0,3 MPa -0,6 MPa
132
Figura 8. Elongação foliar de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da interação Hibrido x DHS x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Enlongação foliar média (cm)
Disponibilidade hídrica no solo
Lvef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
133
Figura 9. Altura de inserção de espiga de híbridos de milho em resposta à limitação
hídrica em diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Altura de inserção da espiga (cm)
Disponibilidade hídrica no solo
Lvef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
134
Figura 10. Altura da planta de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
50
100
150
200
250
300
Altura (cm)
Disponibilidade hídrica no solo
Lvef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
135
Figura 11. Diâmetro do colmo de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3,0
Diâmetro do colmo (cm)
Disponibilidade hídrica no solo
LVef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
136
Figura 12. Massa seca total de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Massa seca total (g MS)
Disponibilidade hídrica no solo
LVef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
137
Figura 13. Teor de aminoácidos livres totais de híbridos de milho em resposta à
limitação hídrica em diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
15
30
45
60
75
90
105
120
Aminoácidos Livres (µMol g MS
-1
)
Disponibilidade hídrica no solo
LVef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
138
Figura 14. Teor de prolina de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Prolina (µMol g MS
-1
)
Disponibilidade hídrica no solo
Lvef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
139
Figura 15. Teor de sacarose de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Sacarose (µMol g MS
-1
)
Disponibilidade hídrica no solo
Lvef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
140
Figura 16. Teor de trealose de híbridos de milho em resposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da Interação Hibrido x DHS x solo*
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
DKB 390
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
Trealose (µMol g
-1
MS)
Disponibilidade hídrica no solo
LVef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
141
Figura 17. Teor de açúcares redutores de híbridos de milho em resposta à limitação
hídrica em diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Açúcares Redutores (µMol g MS
-1
)
Disponibilidade hídrica no solo
LVef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
142
Figura 18. Teor de amido de híbridos de milho em reposta à limitação hídrica em
diferentes tipos de solos.
Efeito da interação híbrido x disponibilidade hídrica no solo x solo
ns
Barras verticais denotam 0,95 de intervalo de confiança
Hibrido
DKB 390
Hibrido
2B 710
Disponibilidade hídrica no solo
LVd
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
0
25
50
75
100
125
150
Amido (µMol g MS
-1
)
Disponibilidade hídrica no solo
LVef
-0,01 MPa -0,03 MPa -0,06 MPa
143
Referências Bibliográficas
ANDRIOLI, I.; CENTURION, J. F. Levantamento detalhado dos solos da Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
CIÊNCIA DO SOLO, 27, 1999, Brasília. Anais... Brasília: Sociedade Brasileira de Ciência
do Solo, 1999. p. 32.
FORNASIERI FILHO, D. A cultura do milho. Jaboticabal: FUNEP, 1992. 273 p.
RAIJ, B. Van; CANTARELLA, H.; QUAGGIO, J. A.; FURLANI, A. M. C. Recomendações
de adubação e calagem para o estado de São Paulo. 2. ed. Campinas, Instituto
Agronômico & Fundação IAC (Boletim Técnico 100), 1997. p. 56-57.
van GENUCHTEN, M. T. A. A closed-form equation for predicting the hydraulic
conductivity of unsaturated soils. Soil Science Society of America Journal, Madison,
v. 44, p. 892-897, 1980.
144
A4. 1. DEMOSNTRAÇÃO DO CÁLCULO PARA EXPRESSÃO GÊNICA POR qRT-PCR
Como os valores de quantidades relativas não seguem normalmente uma
distribuição normal, foi necessária transformá-las numa escala logarítmica. Desse modo,
os valores apresentaram uma distribuição normal, podendo assim efetuar-se a análise
estatística. As expressões diferenciais (
fold differences)
foram obtidas com recurso ao
logaritmo de base 2 (expressão 5)
(
)
relativo2
QlogFD = (5)
Para esclarecer a origem da expressão 5 é oportuno apresentar a sua dedução. A
quantidade do gene alvo normalizada em relação ao valor médio dos genes de
referência e relativa à amostra de calibração (neste caso a amostra que apresentava o
menor valor de expressão) e é dada pela expressão 6:
T
calibração
C
CTCT
relativo
22Q
∆∆−
−
== (6)
Esta expressão deriva do fato da reação de amplificação por PCR possuir um caráter
exponencial, como se pode ver pela expressão 7.
(
)
n
x0n
E1XX +×=
(7)
Em que
X
n
é o número de moléculas de produto alvo no ciclo n
X
0
é o número inicial de moléculas de produto alvo
E
X
é a eficiência de amplificação do gene alvo
N é o número de ciclos
O valor de C
T
(
cycle treshold
) indica o número de ciclo em que a quantidade de produto
amplificado atinge o
treshold
definido, ou seja, o sinal de fundo. Então, a expressão 7
transforma-se na expressão 8.
(
)
X
C
x0T
KE1XX
X,T
=+×=
(8)
Em que,
145
X
T
é o número de moléculas de produto do gene alvo no ciclo T
C
T,X
é o ciclo de amplificação do gene alvo
K
X
é uma constante
A expressão para a referente à amplificação das moléculas do gene de referência é dada
pela expressão 9:
(
)
R
C
R0T
KE1RR
R,T
=+×=
(9)
Em que
R
T
é o número de moléculas de produto do gene de referencia no ciclo T
R
0
é o número inicial de moléculas de produto do gene referência
E
R
é a eficiência de amplificação do gene de referência
C
T,R
é o ciclo de amplificação do gene de referência
K
R
é uma constante
Dividindo X
T
por R
T
obtém-se a expressão 10
(
)
( )
Κ==
+×
+×
=
R
X
C
R0
C
x0
T
T
K
K
E1R
E1X
R
X
R,T
X,T
(10)
Assumindo que as eficiências do gene alvo e dos genes de referência são iguais,
expressão 11:
Ε==
RX
EE
(11)
Obtém-se a expressão 12 ou 13
( )
Κ=+×
−
R,TX,T
CC
0
0
E1
R
X
(12)
(
)
Κ=+×
−
R,TX,T
CC
N
E1X
(13)
Em que,
X
N
é X
0
/R
0
, a quantidade normalizada do gene alvo
Rearranjando a expressão 13 obtém-se a expressão 14
146
(
)
X,TR,T
CC
N
E1X
−
+×Κ=
(14)
O último passo é a divisão de X
N
de qualquer amostra q pelo X
N
da amostra de
calibração (cb), expressão 15:
(
)
( )
( ) ( )
q,Tcb,Tcb,TR,Tq,TR,T
cb,TR,T
q,TR,T
CCCCCC
CC
CC
cb,N
q,N
E1E1
E1K
E1K
X
X
−+−−
−
−
+=+=
+×
+×
=
(15)
Esta amostra de calibração serve exatamente para o cálculo da expressão para cada
gene relativa à amostra em que o gene apresenta o maior ou menor valor de expressão
normalizada (dentro dos valores do mesmo gene). Para este caso fez-se em relação ao
valor mínimo de expressão. Uma vez que o programa GenEx corrige os valores de
eficiência para 100%, tendo em conta os valores reais de eficiências (expressão 7), a
quantidade relativa de um fragmento de amplificação alvo, normalizada com os dois
genes de referência e relativa a uma quantidade da amostra de calibração, é dada pela
expressão 16:
onormalizad_CTgenealvoãoCTcalibraç
relativo
2Q
−
=
(16)
147
A4. 2. QUALIDADE DO RNA DAS AMOSTRAS
Tabela 1. Resultados das avaliações espectrofotométricas de RNA total preparadas para
análise de qRT-PCR.
Amostras
de RNA
Abs
260
Abs
280
260/280 260/230
Concentração
(ng/µL)
5 6,510 3,249 2,00 1,54 260,42
14 8,198 4,063 2,02 1,80 327,91
11 7,982 4,049 1,97 1,68 319,28
18 7,583 3,760 2,02 1,86 303,31
19 5,664 2,789 2,03 1,67 226,57
20 7,118 3,578 1,99 1,70 284.72
25 6,923 3,433 2,02 1,64 276,94
32 5,942 2,985 1,99 1,74 237,67
35 7,142 3,539 2,02 1,55 285,68
27 7,609 3,754 2,03 1,81 304,34
38 7,634 3,796 2,01 1,54 305,35
39 5,731 2,867 2,00
1,43
229,25
148
A4.3. ESPECIFICIDADE DOS GENES DE REFERÊNCIA: CURVAS DE DISSOCIAÇÃO
Figura 1. Especificidade de amplificação da reação de qRT-PCR, evidenciada pela curva
de dissociação gen ACT2. Presença de pico único para o pool de cDNA das
réplicas biológicas de Milho e ausência de pico no controle sem cDNA (No
template control).
149
Figura 2. Especificidade de amplificação da reação de qRT-PCR, evidenciada pela curva
de dissociação gen Eef-1α. Presença de pico único para o pool de cDNA das
réplicas biológicas de Milho e ausência de pico no controle sem cDNA (No
template control).
150
Figura 3. Especificidade de amplificação da reação de qRT-PCR, evidenciada pela curva
de dissociação gen eIF-4α. Presença de pico único para o pool de cDNA das
réplicas biológicas de Milho e ausência de pico no controle sem cDNA (No
template control).
151
Figura 4. Especificidade de amplificação da reação de qRT-PCR, evidenciada pela curva
de dissociação gen GADPH. Presença de pico único para o pool de cDNA das
réplicas biológicas de Milho e ausência de pico no controle sem cDNA (No
template control).
152
Figura 5. Especificidade de amplificação da reação de qRT-PCR, evidenciada pela curva
de dissociação gen UBC. Presença de pico único para o pool de cDNA das
réplicas biológicas de Milho e ausência de pico no controle sem cDNA (No
template control).
153
Figura 6. Especificidade de amplificação da reação de qRT-PCR, evidenciada pela curva
de dissociação gen ClatAd. Presença de pico único para o pool de cDNA das
réplicas biológicas de Milho e ausência de pico no controle sem cDNA (No
template control).
154
A4.4. EFICÊNCIA DOS GENES
Tabela 2. Valores Eficiência dos genes de referência.
GENE DE REFERÊNCIA
Gene
No Gene/primer
Eficiência %
Eficiência
ACT2
1.2
98,9
0,988
Eef
-
1
α
4.2
92,3
0,923
eIF
-
4α
5.1
105,1
1,051
GADPH
6.1
94,9
0,949
UBC
7.1
90,0
0,900
ClatAd
10.1
100,3
1,003
Tabela 3. Valores Eficiência dos genes-alvo do metabolismo de solutos
compatíveis.
GENE DE INTERESSE
Gene
No Gene/primer
Eficiência %
Eficiên
cia
ADP
-
Glu
11.2
100,3
1,003
UDP
-
Glu
12.2
92,9
0,920
S6PS
13.2
92,8
0,928
SUSY
14.2
89,2
0,892
T6PS
15.2
106,2
1,062
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