( PDF ) Obtenção de sistemas microemulsionados e estudo de simulação por dinâmica molecular de sistemas micelares objetivando a veiculação de produtos naturais bioativos

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Obtenção de sistemas microemulsionados e estudo de simulação

por dinâmica molecular de sistemas micelares objetivando a

veiculação de produtos naturais bioativos

Fabiano do Espírito Santo Gomes

_______________________________________

Tese de Doutorado

Natal/RN, março de 2010

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

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Fabiano do Espírito Santo Gomes

OBTENÇÃO DE SISTEMAS MICROEMULSIONADOS E ESTUDO DE

SIMULAÇÃO POR DINÂMICA MOLECULAR DE SISTEMAS MICELARES

OBJETIVANDO A VEICULAÇÃO DE PRODUTOS NATURAIS BIOATIVOS

Defesa de Tese de Doutorado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para a

obtenção do título de doutor em química.

Orientadora: Dra. Tereza Neuma de Castro Dantas

Co-orientadora: Dra. Maria Aparecida Medeiros Maciel

NATAL, RN

2010

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Divisão de Serviços Técnicos

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial de Química

Gomes, Fabiano do Espírito Santo.

Obtenção de sistemas microemulsionados e estudo de simulação por dinâmica molecular

de sistemas micelares objetivando a veiculação de produtos naturais bioativados. Natal, RN,

2010.

172 f.

Orientadora: Tereza Neuma de Castro Dantas.

Co-orientadora: Maria Aparecida Medeiros Maciel.

Tese (Doutorando em Química) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química.

1. Emulsão – Tese. 2. Microemulsão – Tese. 3. Sistemas de liberação de fármacos –

Tese. 4. Trans-desidrocrotonina – Tese. 5. Extratos vegetais – Tese. I. Dantas, Tereza Neuma

de Castro. III. Maciel, Maria Aparecida Medeiros. III. Universidade Federal do Rio Grande

do Norte. III. Título

RN/UFRN/BSE- Química CDU 615.451.2

DEDICATÓRIA

Ao meu pai, José Almir Gomes (in memoriam).

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar a Deus, autor e fonte de toda vida.

À minha família, em especial à minha mãe e ao meu pai (in memoriam) por toda

educação, instrução e suporte recebidos.

À minha amável esposa, Rosana, pelo carinho, amor, compreensão e apoio dispensados

a mim durante todo o tempo do meu doutorado, em especial durante o tempo em que estive no

Rio de Janeiro.

À minha orientadora e amiga Profa. Maria Aparecida Medeiros Maciel (Cida) pelas

sugestões, conselhos, incentivos e broncas que me ajudaram a me tornar um pesquisador

melhor. Obrigado por todos os ensinamentos, que não me fizeram crescer apenas na ciência,

mas também como pessoa.

À Profa. Tereza Neuma de Castro Dantas pela orientação e suporte que permitiram a

realização deste trabalho no Laboratório de Tecnologia de Tensoativos. Obrigado pelos

momentos de aprendizado tanto no laboratório como nas viagens em congressos.

Ao Prof. Ricardo Bicca de Alencastro e todos os integrantes do LABMMOL/IQ-UFRJ

(Profa. Magaly, Bruno, André, Tiago, Lucas, Ana Sodero, Felipe Fleming, Jocley, Estael,

Monique) pelo acolhimento, suporte e orientação dispensados a mim durante minha estadia no

Rio de Janeiro para a realização de estudos computacionais.

Aos professores do IQ-UFRJ Rosane San Gil, Carlos Kaiser e Angelo da Cunha Pinto

pelo suporte dados a mim durante a minha estadia na UFRJ.

À Profa. Nereide Magalhães e todos os seus alunos do LIKA (UFPE-PE), em especial

Waldenice e Marcília, pela colaboração em outros trabalhos científicos.

À Profa. Áurea Echevarria, da UFRRJ, juntamente com suas alunas Kenia e Amanda,

pela realização dos testes antioxidantes e colaboração em trabalhos científicos.

À colega Maria Beatriz (Bia), juntamente com seus orientadores Prof. Djalma Ribeiro e

Profa. Sílvia Regina, pela realização dos ensaios bacteriostáticos.

Aos professores Caio Firme e José Luiz, que estiveram sempre disponíveis para

discussões. Obrigado pelas sugestões e críticas que ajudaram a elevar a qualidade deste

trabalho.

Aos meus amigos e colegas de laboratório (LTT): Gineide, Ellen, Cássia, Gil, Ciro,

Breno, Cátia, Keila, Alyne, Janaína, Alcides, Kaline, Cláudia, Verônica, Samanta, Izabelly, e

todos os outros. Obrigado pelo companheirismo e amizade de todos vocês.

Ao CNPq pelo suporte financeiro concedido.

RESUMO

Dos novos fármacos lançados no mercado a partir de 1980, cerca de 30% apresentam

origem natural ou semissintética. Entre 40 e 70% destes novos protótipos de fármacos

(naturais ou sintéticos) apresentam baixa solubilidade aquosa, o que pode inviabilizar a sua

utilização comercial. Uma das alternativas encontrada pela indústria farmacêutica foi a

veiculação dessas substâncias a partir de veículos ou sistemas de liberação de fármacos, tais

como: micelas, microemulsões, lipossomos, nanopartículas e ciclodextrinas. Neste trabalho,

sistemas microemulsionados biologicamente compatíveis foram obtidos utilizando a mistura

Tween 80 e Span 20, na proporção 3:1, como tensoativo, miristato de isopropila ou ácido

oléico como fase oleosa, água bidestilada, e em alguns sistemas, etanol como cotensoativo.

Também foram obtidos sistemas auto-microemulsificantes (SMEDDS) utilizando

propilenoglicol ou sorbitol como cotensoativo. As microemulsões obtidas foram

caracterizadas quanto ao comportamento reológico, tamanho das gotículas e condutividade

elétrica. O produto natural bioativo trans-desidrocrotonina (DCTN), bem como extratos e

frações das espécies vegetais Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), Anacardium

occidentale L. (Anacardiaceae) e Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. (Euphorbiaceae),

foram solubilizados satisfatoriamente nos sistemas microemulsionados obtidos, enquanto que

outros produtos também isolados da espécie Croton cajucara, trans-crotonina e ácido

acetilaleuritólico, não apresentaram resultados satisfatórios em termos de solubilidade. A

avaliação da propriedade antioxidante, pelo método do DPPH, dos extratos vegetais

incorporados nos sistemas microemulsionados obtidos evidenciou a capacidade antioxidante

dos extratos de Phyllanthus amarus e Anacardium occidentale, bem como a atuação dos

sistemas microemulsionados, que para o caso do extrato etanólico de Phyllanthus amarus

dobrou a sua atividade antioxidante quando solubilizado em microemulsões. O extrato

hidroalcoólico de Croton cajucara incorporado em um sistema auto-microemulsificante

mostrou atividade bacteriostática frente a colônias de bactérias Bacillus cereus e Escherichia

coli. Adicionalmente, foi realizado um estudo de simulação computacional por Dinâmica

Molecular de sistemas micelares para uso farmacológico contendo tensoativos derivados de

açúcares, N-dodecilamino-1-deoxilactitol e N-dodecil-D-lactosilamina, que indicou que o

processo de micelização do primeiro sistema é mais favorável que o segundo.

Palavras-chave: Microemulsão. Sistemas de liberação de fármacos. Trans-desidrocrotonina.

Extratos vegetais. Atividade antioxidante. Dinâmica Molecular.

ABSTRACT

Among the new drugs launched into the market since 1980, up to 30% of them belong

to the class of natural products or they have semisynthetic origin. Between 40-70% of the new

chemical entities (or lead compounds) possess poor water solubility, which may impair their

commercial use. An alternative for administration of poorly water-soluble drugs is their

vehiculation into drug delivery systems like micelles, microemulsions, nanoparticles,

liposomes, and cyclodextrin systems. In this work, microemulsion-based drug delivery

systems were obtained using pharmaceutically acceptable components: a mixture Tween 80

and Span 20 in ratio 3:1 as surfactant, isopropyl mirystate or oleic acid as oil, bidistilled

water, and ethanol, in some formulations, as cosurfactants. Self-Microemulsifying Drug

Delivery Systems (SMEDDS) were also obtained using propylene glycol or sorbitol as

cosurfactant. All formulations were characterized for rheological behavior, droplet size and

electrical conductivity. The bioactive natural product trans-dehydrocrotonin, as well some

extracts and fractions from Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), Anacardium occidentale

L. (Anacardiaceae) e Phyllanthus amarus Schum. & Thonn. (Euphorbiaceae) specimens, were

satisfactorily solubilized into microemulsions formulations. Meanwhile, two other natural

products from Croton cajucara, trans-crotonin and acetyl aleuritolic acid, showed poor

solubility in these formulations. The evaluation of the antioxidant capacity, by DPPH method,

of plant extracts loaded into microemulsions evidenced the antioxidant activity of Phyllanthus

amarus and Anacardium occidentale extracts. For Phyllanthus amarus extract, the use of

microemulsions duplicated its antioxidant efficiency. A hydroalcoholic extract from Croton

cajucara incorporated into a SMEDDS formulation showed bacteriostatic activity against

colonies of Bacillus cereus and Escherichia coli bacteria. Additionally, Molecular Dynamics

simulations were performed using micellar systems, for drug delivery systems, containing

sugar-based surfactants, N-dodecylamino-1-deoxylactitol and N-dodecyl-D-lactosylamine.

The computational simulations indicated that micellization process for N-dodecylamino-1-

deoxylactitol is more favorable than N-dodecyl-D-lactosylamine system.

Keywords: Microemulsions. Drug delivery systems. Trans-dehydrocrotonin. Plant extracts.

antioxidant capacity. Molecular Dynamics.

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 – Representação esquemática de uma molécula anfifílica ...................................... 22

Figura 2.2 – Exemplos de tensoativos iônico, não-iônico e zwiteriônico ................................ 23

Figura 2.3 – Representação esquemática da classificação estrutural de tensoativos ................ 25

Figura 2.4 – Atuação de moléculas anfifílicas na supefície água-ar e no interior de uma

solução aquosa ..................................................................................................... 26

Figura 2.5 – Representação esquemática de agregados formados por tensoativos em

solução aquosa ..................................................................................................... 27

Figura 2.6 – Representação gráfica para a determinação da CMC a partir de diferentes

parâmetros físico-químicos ................................................................................. 28



Figura 2.7 – Representação esquemática dos agregados em função do parâmetro de

empacotamento .................................................................................................... 32

Figura 2.8 – Representação esquemática das três microestruturas mais comumente

encontradas em sistemas microemulsionados: (a) microemulsão água em

óleo; (b) microemulsão óleo em água; (c) microemulsão bicontínua ................. 34

Figura 2.9 – (a) Representação esquemática de um diagrama de fases pseudo-ternário. (b)

Diagrama de fases pseudo-ternário hipotético onde estão representadas as

regiões de microemulsão (1φ), de emulsão ou duas fases (2φ) e cristais

líquidos (CL) ....................................................................................................... 36



Figura 2.10 – Estrutura química da DCTN, CTN e AAA ........................................................ 50

Figura 2.11 – Exemplo de uma caixa MD, a sua transição e condições de fronteira a duas

dimensões ............................................................................................................ 57



Figura 3.1 – Estrutura das moléculas de tensoativo (a) N-dodecilamino-1-deoxilactitol

N-lactitol) e (b) N-dodecil-D-lactosilamina (C

N-lactosil) ......................... 76

Figura 5.1 – Capacidade máxima de formação de misturas isotrópicas em função

quantidade de água, variando-se a proporção entre os tensoativos Tween e

Span 20. ............................................................................................................... 88

Figura 5.2 – Diagramas de fases de misturas contendo Tween:Span 20 (3:1), IPM e água.

(a) Tween 80; (b) Tween 40; (c) Tween 20 ........................................................ 89

Figura 5.3 – Diagramas de fases de misturas contendo Tween 80:Span 20 (3:1) e etanol

nas razões (a) C/T igual a 0,5 e (b) C/T igual a 1,0 ............................................ 91

Figura 5.4 – Diagramas de fases de misturas contendo (a) IPM, (b) Miglyol e (c) ácido

oléico como fase oleosa ....................................................................................... 93

Figura 5.5 – Diagramas de fases a partir dos quais foram obtidos os sistemas auto-

microemulsificantes (a) ME-G e (b) ME-H. A região entre as duas linhas

pontilhadas indica a região propícia para formulação de sistemas auto-

microemulsificantes. ........................................................................................... 96

Figura 5.6 – Perfil de viscosidade dos sistemas auto-microemulsificantes no decorrer de

uma diluição com água ...................................................................................... 109

Figura 5.7 – Gráficos de condutividade elétrica em função da composição de água nos

sistemas auto-microemulsificantes ME-G (a) e ME-H (b). .............................. 113

Figura 5.8 – Gráfico da primeira derivada dk/dΦ

em função da composição de água ......... 113

Figura 5.9 – Percentual de sobrevivência de colônias da (a) bactéria gram-positiva B.

cereus e (b) bactéria gram-negativa E. coli em meio de cultura LB contendo

diferentes concentrações do extrato CC-EHA após 24 h de incubação. Cont+

= controle positivo (ampicilina : cloranfenicol, 4:1). Cont- = controle

negativo ............................................................................................................. 119



Figura 5.10 – Representação esquemática dos monômeros (a) C

N-lactosil e (b) C

N-

lactitol. São mostrados os átomos de oxigênio (vermelho), carbono (ciano),

nitrogênio (azul) e hidrogênio (branco) das moléculas de tensoativo ............... 122

Figura 5.11 – Snapshots dos agregados micelares (a) C

N-lactitol e (b) C

N-lactosil no

decorrer de 10 ns de simulação MD. São mostrados os átomos de oxigênio

(vermelho), carbono (ciano), nitrogênio (azul) e hidrogênio (branco) das

moléculas de tensoativo, enquanto que as moléculas de água foram omitidas

por motivos de clareza ....................................................................................... 124

Figura 5.12 – Raio de giro, R

, de micelas formadas por C

N-lactitol (preto) e C

N-

lactosil (cinza) no decorrer de 9,5 ns de simulação MD ................................... 125



Figura 5.13 – Área Superficial Acessível ao Solvente (SASA) de micelas contendo

moléculas de C

N-lactitol (negrito) e C

N-lactosil no decorrer de 9,5 ns de

simulação MD. São mostradas as áreas superficiais expostas das cadeias

alquílicas (inferior), e dos grupos glucosil/glucitol (meio) e galactosil

(superior) ........................................................................................................... 126

Figura 5.14 – Snapshot da simulação MD evidenciando uma das interações intra-

moleculares mais frquentes observadas no sistema micelar C

N-lactitol. O

número médio das ligações de hidrogênio intra-molecular O3(glc)–

H⋅⋅⋅O4(glc) and O3(glc)–H⋅⋅⋅O5(gal) é 0,14 e 0,12, respectivamente. Esta

conformação adotada pelas moléculas de C

N-lactitol previne o átomo

O3(glc) do contato com a água. ........................................................................ 131

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 – Estrutura química de alguns dos principais tensoativos farmaceuticamente

aceitáveis ............................................................................................................. 42

Tabela 2.2 – Estrutura química de alguns dos principais óleos farmaceuticamente

aceitáveis ............................................................................................................. 46

Tabela 3.1 – Fármacos microemulsionados para administração oral ....................................... 64

Tabela 3.2 – Fármacos microemulsionados para administração parenteral ............................. 66

Tabela 3.3 – Fármacos microemulsionados para administração transdérmica ........................ 68

Tabela 3.4 – Fármacos microemulsionados para outras vias de administração ....................... 71

Tabela 4.1 – Produtos utilizados na formulação das microemulsões ....................................... 78

Tabela 5.1 – Composição das Microemulsões (ME) (% em massa) ........................................ 94

Tabela 5.2 – Solubilidade da DCTN nos diversos veículos testados ....................................... 98

Tabela 5.3 – Dados de solubilidade da DCTN no sistema ME-G após sucessivas diluições

em água ............................................................................................................. 101

Tabela 5.4 – Solubilidade da CTN nos diversos veículos testados ........................................ 102

Tabela 5.5 – Solubilidade dos extratos vegetais nos sistemas microemulsionados testados . 103

Tabela 5.6 – Dados de viscosidade e índice de refração dos sistemas microemulsionados ... 106

Tabela 5.7 – Dados de viscosidade e índice de refração dos sistemas auto-

microemulsificantes .......................................................................................... 108

Tabela 5.8 – Dados de diâmetro das gotículas e índice de polidispersão dos sistemas

microemulsionados ............................................................................................ 110



Tabela 5.9 – Dados de diâmetro das gotículas e índice de polidispersão dos sistemas auto-

microemulsificantes .......................................................................................... 112



Tabela 5.10 – Valores de CE

obtidos para os extratos CC-EH, CC-EC e CC-EM

solubilizados em sistemas microemulsionados ................................................. 116

Tabela 5.11 – Valores de CE

obtidos para os extratos e frações de Anacardium

occidentale ........................................................................................................ 118



Tabela 5.12 – Valores de CE

obtidos para o extrato metanólico de Phyllanthus amarus ... 118

Tabela 5.13 – Cargas parciais atômicas das moléculas de C

N-lactitol e C

N-lactosil

usadas nas simulações MD ................................................................................ 123

Tabela 5.14 – Número médio de ligações de hidrogênio inter-monômero e monômero-

solvente no decorrer dos últimos 5 ns de simulação MD .................................. 128

Tabela 5.15 – Número médio de ligações de hidrogênio das principais interações intra-

monômeros por moléculas no decorrer dos últimos 5 ns de simulação

........... 130

LISTA DE SÍMBOLOS

CMC – Concentração micelar crítica

ΔG – Variação da energia livre de Gibbs

ΔH – Variação de entalpia

T – Temperatura

ΔS – Variação de entropia

P – Parâmetro e empacotamento

V – Volume da cadeia hidrocarbônica

rev

– Calor reversível

– Área ocupada pela cabeça polar na interface polar-apolar

l – Comprimento crítico da cadeia apolar

– Área da seção transversal da parte hidrocarbônica

A/O – Microemulsão do tipo água em óleo

O/A – Microemulsão do tipo óleo em água

ΔG

– Energia livre de micelização

- Tensão superficial

ΔA – Variação da área interfacial

CL – Cristais líquidos

BHL – Balanço hidrófilo-lipófilo

IPM – Miristato de isopropila

IPP – Palmitato de isopropila

DLS – Espalhamento de luz dinâmico

SANS – Espalhamento de nêutrons a baixo ângulo

SAXS – Espalhamento de raios-X a baixo ângulo

TEM – Microscopia eletrônica de transmissão

UV-Vis – Ultravioleta-visível

CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência

DCTN – trans-desidrocrotonina

CTN – trans-crotonina

AAA – Ácido acetil aleuritólico

MD – Simulação por dinâmica molecular

MC – Simulação por Monte Carlo

– Constante de Boltzmann

E – Energia potencial

NpT – Ensemble com pressão, temperatura e número de partículas constantes

NVT – Ensemble com volume, temperatura e número de partículas constantes

NVE – Ensemble microcanônico (energia, volume e número de partículas constantes)

SMEDDS – Sistemas auto-microemulsificantes

CC-EH – Extrato hexânico de Croton cajucara

CC-EC – Extrato clorofórmico de Croton cajucara

CC-EM – Extrato metanólico de Croton cajucara

TLC – Cromatografia em camada delgada

AO-EM – Extrato metanólico de Anacardium occidentale

AO-FO – Fração rica em óleo fixo de Anacardium occidentale

AO-FT – Fração rica em taninos de Anacardium occidentale

PA-EE – Extrato etanólico de Phyllanthus amarus

k – condutividade elétrica

DPPH – 2,2-difenil-picril-hidrazila

– concentração efetiva na captura de 50% do radical livre DPPH

%AA – Percentual da atividade antioxidante

LB – Meio de cultura Luria Broth

PME – Particle Mesh Ewald

SASA – Área superficial acessível ao solvente

T80 – Tween 80

T40 – Tween 40

T20 – Tween 20

S20 – Span 20

C/T – Razão cotensoativo/Tensoativos

EtOH – Etanol

AO – Ácido oléico

ME – Microemulsão

PG – Propilenoglicol

RMN – Ressonância magnética nuclear

CC-FA – Fração rica em alcalóides de Croton cajucara

CC-EHA – Extrato hidro-alcoólico de Croton cajucara

– Composição da fase aquosa

– limiar de percolação

N-lactitol – N-dodecilamino-1-deoxilactitol

N-lactosil – N-dodecil-D-lactosilamina

– Raio de giro

Glc – Grupo glucitol/glicosil

Gal – Grupo galactosil

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 19

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ....................................................................................... 22

2.1 TENSOATIVOS ................................................................................................................. 22

2.1.1 Classificação quanto à natureza da cabeça polar ....................................................... 23

2.1.2 Classificação quanto à estrutura química ................................................................... 24

2.1.3 Atividade dos tensoativos em solução .......................................................................... 25

2.3.1.1 Termodinâmica de micelização em solução aquosa ..................................................... 29

2.2 MICROEMULSÕES .......................................................................................................... 33

2.2.1 Formação de microemulsões ........................................................................................ 34

2.2.2 Diagramas de fases ........................................................................................................ 36

2.2.3 Aplicação das microemulsões ....................................................................................... 38

2.2.4 Microemulsões como sistemas de liberação de fármacos........................................... 38

2.2.4.1 Componentes de microemulsões .................................................................................. 40

2.2.4.1.1 Tensoativos em microemulsões biológicas ............................................................. 41

2.2.4.1.2 Cotensoativos em microemulsões biológicas ......................................................... 43

2.2.4.1.3 Fase oleosa em microemulsões biológicas .............................................................. 45

2.2.4.1.4 Fase aquosa em microemulsões biológicas ............................................................ 46

2.2.3 Caracterização físico-química ...................................................................................... 47

2.3 PRODUTOS NATURAIS E PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS ......................... 48

2.3.1 Croton cajucara Benth ................................................................................................... 48

2.3.1.1 trans-Desidrocrotonina ................................................................................................. 49

2.3.1.2 Extratos da sacaca ......................................................................................................... 50

2.3.2 Phyllantus amarus Schum. & Thonn ........................................................................... 51

2.3.3 Anacardium occidentale L. ............................................................................................ 51

2.4 SIMULAÇÕES POR DINÂMICA MOLECULAR .......................................................... 52

2.4.1 Interações moleculares .................................................................................................. 54

2.4.2 Campos de força e parametrização .............................................................................. 55

2.4.3 Etapas da simulação MD .............................................................................................. 56

2.4.3.1 Ensembles ..................................................................................................................... 58

3 ESTADO DA ARTE .......................................................................................................... 61

3.1 MICROEMULSÕES COMO VEÍCULOS DE FÁRMACOS ........................................... 61

3.1.1 Administração oral de microemulsões ......................................................................... 62

3.1.2 Administração parenteral de microemulsões ............................................................. 65

3.1.3 Administração transdérmica de microemulsões ......................................................... 67

3.1.4 Administração ocular de microemulsões ..................................................................... 70

3.2 PRODUTOS NATURAIS COMO FONTE DE FÁRMACOS .......................................... 72

3.2.1 Sistemas de liberação de fármacos e os produtos naturais ........................................ 73

3.3 MICELAS FORMADAS POR ALQUIL-GLICOSÍDEOS E SIMULAÇÃO POR

DINÂMICA MOLECULAR .................................................................................................... 75

4 METODOLOGIA EXPERIMENTAL ............................................................................ 78

4.1 ESCOLHA DOS COMPONENTES DA MICROEMULSÃO .......................................... 78

4.2 PRODUTOS NATURAIS MICROEMULSIONADOS .................................................... 79

4.2.1 Extratos vegetais ............................................................................................................ 79

4.3 OBTENÇÃO DOS DIAGRAMAS DE FASES ................................................................. 80

4.4 TESTES DE SOLUBILIDADE ......................................................................................... 80

4.5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MICROEMULSÕES ........................... 81

4.5.1 Índice de refração .......................................................................................................... 81

4.5.2 Reologia .......................................................................................................................... 82

4.5.3 Distribuição de tamanho das gotículas ........................................................................ 82

4.5.4 Condutividade elétrica .................................................................................................. 82

4.6 ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTIOXIDANTE E BACTERIOSTÁTICA ............ 83

4.6.1 Propriedade antioxidante.............................................................................................. 83

4.6.2 Atividade bacteriostática .............................................................................................. 84

4.7 SIMULAÇÃO POR DINÂMICA MOLECULAR DE MICELAS ................................... 84

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 87

5.1 ESCOLHA DOS COMPONENTES DA MICROEMULSÃO .......................................... 87

5.1.1 Escolha do tensoativo .................................................................................................... 87

5.1.2 Escolha do cotensoativo ................................................................................................ 90

5.1.3 Escolha da fase oleosa ................................................................................................... 92

5.2 OBTENÇÃO DOS SISTEMAS MICROEMULSIONADOS ........................................... 94

5.2.1 Obtenção dos sistemas auto-microemulsificantes ....................................................... 95

5.3 TESTES DE SOLUBILIDADE ......................................................................................... 97

5.3.1 Solubilização da trans-desidrocrotonina ..................................................................... 97

5.3.1.1 Solubilização nos sistemas auto-microemulsificantes ................................................ 100

5.3.2 Solubilização de outros produtos bioativos de Croton cajucara .............................. 102

5.3.3 Solubilização de extratos vegetais .............................................................................. 103

5.3.4 Considerações gerais sobre os testes de solubilidade ............................................... 104

5.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA ..................................................................... 105

5.4.1 Reologia ........................................................................................................................ 105

5.4.1.1 Reologia dos sistemas auto-microemulsificantes ....................................................... 107

5.4.2 Distribuição de tamanho das gotículas ...................................................................... 110

5.4.3 Condutividade elétrica ................................................................................................ 112

5.4.4 Considerações gerais sobre a caracterização físico-química ................................... 114

5.5 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES ANTIOXIDANTE E BACTERIOSTÁTICA .. 115

5.5.1 Propriedade antioxidante............................................................................................ 115

5.5.1.1 Extratos de Croton cajucara solubilizados em microemulsões ................................. 116

5.5.1.2 Extratos de Anacardium occidentale solubilizados em microemulsões ..................... 117

5.5.1.3 Extratos de Phyllanthus amarus solubilizados em microemulsões ............................ 118

5.5.2 Atividade bacteriostática ............................................................................................ 119

5.5.3 Considerações gerais sobre os ensaios antioxidantes e bacteriostáticos ................. 120

5.6 SIMULAÇÃO MD DE MICELAS DE C

N-LACTITOL E C

N-LACTOSIL ............ 121

5.6.1 Estabilidade e tamanho dos sistemas micelares ........................................................ 124

5.6.2 Área Superficial Acessível ao Solvente (SASA) ........................................................ 125

5.6.3 Interações inter-monômeros ....................................................................................... 127

5.6.4 Interações intra-monômeros ....................................................................................... 129

5.6.5 Perfil de hidratação ..................................................................................................... 130

5.6.6 Considerações gerais sobre as simulações MD ......................................................... 132

6 CONCLUSÕES GERAIS................................................................................................ 134

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 137

ANEXO A – Curva de Calibração da DCTN para testes de solubilidade por

espectroscopia no UV-Vísível .............................................................................................. 161

ANEXO B – Gráficos de comportamento reológico tensão (τ) x taxa de cisalhamento

(γ) ........................................................................................................................................... 162

Introdução

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 19

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

1 INTRODUÇÃO

Anualmente, milhares de novos protótipos de fármacos (lead compounds) ou novas

substâncias bioativas, isto é, moléculas que apresentam potencial biológico ou que são

candidatos a fármacos, são descobertas através de técnicas de química combinatória e High

Throughput Screening (HTS) (LIPINSKI et al., 1997; KOEHN e CARTER, 2005). No

entanto, 40 a 70% desses novos protótipos de fármacos apresentam baixa solubilidade aquosa,

inviabilizando, em alguns casos, o avanço nos estudos científicos que poderiam resultar na

comercialização do fármaco (GODDEERIS et al., 2006; KOGAN e GARTI, 2006).

A grande variedade de plantas e de substâncias presentes em cada espécie vegetal faz

com que o reino vegetal seja uma das principais fontes de novos protótipos de fármacos, em

especial antibióticos e agentes antitumorais. De fato, quase 30% dos novos fármacos lançados

no mercado a partir da década de 1980 até os dias de hoje são classificados como produtos

naturais ou semissintéticos (NEWMAN e CRAGG, 2007). Este percentual poderia ser ainda

maior se não fosse a baixa solubilidade aquosa comum nos compostos de origem natural.

Uma das espécies que detém destaque progressivo por suas propriedades biológicas é o

Croton cajucara Benth. (Euphorbiaceae), vulgarmente conhecido como “sacaca”, uma

espécie nativa da região amazônica do Brasil. Deste Croton pode ser isolado o diterpeno

bioativo trans-desidrocrotonina, que está correlacionado com as principais propriedades

farmacológicas desta planta (MACIEL et al., 2000). No entanto, têm sido reportados casos de

hepatotoxicidade após o uso crônico e indevido do chá das folhas da sacaca (MACIEL et al.,

2002).

A fim de superar a limitação da baixa solubilidade, bem como outras limitações comuns

aos protótipos de fármacos, foi desenvolvida uma série de sistemas de liberação de fármacos,

tais como nanopartículas, lipossomos, emulsões, microemulsões, soluções micelares,

dendrímeros e complexos de ciclodextrina. Dentre os muitos benefícios do uso destes

veículos, destacam-se: o aumento da eficácia terapêutica de um fármaco através do aumento

da sua solubilidade aquosa, proteção contra degradação enzimática, aumento do intervalo

entre as doses, e/ou diminuição de efeitos adversos pela administração de menor dose ou pela

liberação do fármaco em sítio específico. Dentre estes sistemas, as micelas e as

microemulsões têm se destacado pelo baixo custo e pela facilidade na preparação das

formulações, bem como pela estabilidade das formulações.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 20

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

A utilização de microemulsões como sistemas de liberação de fármacos requer um

cuidado especial na escolha de componentes que devem ser farmacologicamente aceitáveis.

Tensoativos não-iônicos e zwiteriônicos são preferidos, enquanto que o uso de cotensoativos

deve ser evitado ou minimizado por razões toxicológicas. A caracterização físico-química dos

sistemas de liberação de fármacos é de fundamental importância para orientar o seu uso nas

diversas vias de administração (injetável, oral, transdérmica, etc.). Em geral, experimentos de

reologia, tamanho de partículas, condutividade elétrica e de solubilidade são frequentemente

utilizados para a caracterização de sistemas microemulsionados.

Os métodos computacionais modernos também têm sido um importante instrumento

utilizado tanto para o descobrimento de novos fármacos quanto para a otimização da

formulação ou do fármaco. Sistemas micelares podem ser caracterizados por métodos de

simulação por Dinâmica Molecular, cujos resultados geralmente apresentam consonância com

dados obtidos experimentalmente.

O presente trabalho teve como objetivo a obtenção e a caracterização de sistemas

microemulsionados aplicados à solubilização de produtos naturais bioativos isolados de

Croton cajucara, bem como de extratos obtidos das espécies vegetais Croton cajucara Benth.

(Euphorbiaceae), Anacardium occidentale L. (Anacardiaceae) e Phyllanthus amarus Schum.

& Thonn. (Euphorbiaceae). Adicionalmente, objetivou-se o estudo computacional de

simulação por Dinâmica Molecular de sistemas micelares formados por tensoativos à base de

açúcares, objetivando a ampliação do trabalho realizado na dissertação de mestrado deste

autor (GOMES, 2004), bem como a disponibilização de novos veículos de fármacos.

Fundamentação Teórica

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 22

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Este capítulo está subdividido em quatro partes, em que são discutidos: aspectos

teóricos referentes aos tensoativos, às microemulsões, às propriedades farmacológicas das

espécies vegetais utilizadas neste trabalho, e à técnica de simulação por Dinâmica Molecular.

2.1 TENSOATIVOS

Tensoativos ou surfactantes são compostos que apresentam a propriedade de se adsorver

na superfície ou interfaces de um sistema, alterando de maneira significativa a energia livre

superficial ou interfacial. São moléculas anfifílicas constituídas de duas regiões bem

características: uma polar ou hidrofílica, formada por grupos eletricamente carregados ou

cadeias polioxietilênicas, e outra região apolar ou hidrofóbica, que é constituída geralmente

de cadeias hidrocarbônicas. A presença, na mesma molécula, de duas partes com polaridades

distintas caracteriza o termo anfifílico. Uma representação esquemática de um tensoativo

pode ser vista na Figura 2.1, em que comumente a região hidrofóbica é representada por uma

cauda apolar, e a região hidrofílica por uma cabeça polar (ROSSI et al., 2006).

cauda apolar

cabeça

polar

Figura 2.1 – Representação esquemática de uma molécula anfifílica

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 23

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

2.1.1 Classificação quanto à natureza da cabeça polar

Quanto à natureza do grupo hidrofílico, os tensoativos podem ser classificados em

iônicos (catiônicos ou aniônicos), não-iônicos ou anfóteros (zwiteriônicos) (ROSSI et al.,

2006) (Figura 2.2).

TENSOATIVO CATIÔNICO

brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB)

TENSOATIVO ANIÔNICO

dodecilsulfato de sódio (SDS)

OCO

OPO

N(CH

)

TENSOATIVO ZWITERIÔNICO

dipalmitofosdatidilcolina (lecitina)

2n+2

( OCH

)

TENSOATIVO NÃO-IÔNICO

polioxietileno

Figura 2.2 – Exemplos de tensoativos iônico, não-iônico e zwiteriônico

Especificamente, os tensoativos catiônicos produzem, em solução aquosa, íons

carregados positivamente em sua superfície ativa. São representados pela forma geral R

em que R representa uma ou mais cadeias hidrofóbicas, X pode ser átomos de N, P, S, As, Te,

Sb, Bi ou os halogênios, e Y um contra-íon. Apresentam grande poder de adsorção nas mais

variadas superfícies, porém sua toxicidade é geralmente mais elevada em comparação com as

demais classes. São utilizados comumente no tratamento de têxteis e em condicionadores para

cabelo. Os sais de amônio quaternário, como o brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), estão

entre os principais compostos desta classe de tensoativos.

Os tensoativos aniônicos contêm, na sua maioria, um grupo polar do tipo sulfato,

sulfonato, carboxilato ou fosfato, combinado com uma cadeia hidrofóbica, que, em solução

aquosa, se ionizam e se tornam negativamente carregados. Esta classe constitui no principal

tipo de tensoativo, correspondendo a cerca de 60% da produção mundial de surfactantes

(HOLMBERG et al., 2003). São largamente utilizados na indústria de limpeza, como

detergentes e sabões. Os sabões possuem na sua parte hidrofílica um sal de sódio ou de

potássio de ácido carboxílico, enquanto os detergentes têm como matéria-prima compostos

sulfonados derivados do petróleo, como o dodecil-sulfato de sódio (SDS). Tensoativos

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 24

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

aniônicos são geralmente incompatíveis com os catiônicos, e sensíveis à “água dura” (solução

aquosa contendo certos cátions divalentes, como Ca

e Mg

Os tensoativos que apresentam em sua estrutura molecular dois grupos polares que, em

meio aquoso, tendem a produzir íons de cargas opostas são chamados de tensoativos anfóteros

ou zwiteriônicos. São extremamente dependentes do pH da solução em que se encontram,

podendo se comportar tanto como um tensoativo catiônico quanto aniônico, ou ainda, como

um não-iônico. São compatíveis com todas as outras classes e geralmente apresentam

propriedades biológicas (HOLMBERG et al., 2003), sendo, portanto, biocompatíveis.

Os tensoativos não-iônicos são substâncias cujas moléculas não formam íons em

solução aquosa, ou seja, são incapazes de se ionizarem. Sua natureza hidrofílica é justificada

pela presença de grupos oxietilênicos situados ao longo de uma cadeia hidrofóbica. Dessa

forma, a hidrofilia (polaridade) destes compostos é determinada pelo número de átomos de

carbono na cadeia lipofílica (quanto menor esse número maior a hidrofilicidade), bem como

pela quantidade de subunidades polares presentes em sua estrutura (quanto maior a

quantidade maior a hidrofilicidade). Apresentam a vantagem de serem pouco suscetíveis ao

pH e à presença de íons na solução em que se encontram, e são normalmente compatíveis com

todos os outros tipos de tensoativos, sendo a segunda classe de tensoativo mais utilizada no

mundo (HOLMBERG et al., 2003).

2.1.2 Classificação quanto à estrutura química

Com relação à sua estrutura química, os tensoativos podem ser classificados em

monocatenários (apresentam uma única cadeia hidrocarbônica), bicatenários (duas caudas

apolares) e tricatenários (com três cadeias alquílicas) (Figura 2.3).

Existem ainda os tensoativos geminados (diméricos) (MENGER e LITTAU, 1991), que

apresentam sequencialmente: uma cadeia hidrocarbônica longa, um grupo iônico, uma cadeia

espaçadora, um segundo grupo iônico, e outra cadeia hidrocarbônica (Figura 2.3). Quando um

tensoativo geminado apresenta os seus dois grupos iônicos diferentes entre si, ele é chamado

de heterogeminado (ALAMI e HOLMBERG, 2003). Em função da forte distorção da

estrutura no meio aquoso, causada pela presença de duas cadeias laterais na molécula, os

tensoativos geminados e os heterogeminados são agentes mais eficazes na redução da tensão

interfacial. Adicionalmente, este tipo de tensoativo forma agregados em concentrações mais

baixas que os seus correspondentes monopolares.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 25

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

MONOCATENÁRIO

BICATENÁRIO

TRICATENÁRIO

GEMINADO MÚLTIPLAS CABEÇAS (TRICATIÔNICO)

BOLAFORME

Figura 2.3 – Representação esquemática da classificação estrutural de tensoativos

Outro tipo de classificação é dado aos tensoativos cujas moléculas apresentam dois

sítios positivos ou negativos separados por uma distância relativamente grande, tendo sido

denominados tensoativos ou eletrólitos bolaformes (BRODY e FUOSS, 1956). Existem ainda

tensoativos com múltiplas cabeças (mono, di ou tricatiônicos) cujos agregados formados em

meio aquoso, diminuem progressivamente de tamanho à medida que aumenta a quantidade de

grupos polares (BHATTACHARYA e HALDAR, 2002).

2.1.3 Atividade dos tensoativos em solução

O comportamento dos tensoativos em soluções deriva diretamente de sua estrutura

molecular (regiões com solubilidade distinta em água). A parte hidrofílica (ou solvofílica)

consiste geralmente em um grupo polar pequeno, que pode ser iônico ou sem carga. A parte

hidrofóbica ou apolar é constituída de uma cadeia longa, geralmente de natureza

hidrocarbônica, podendo apresentar em alguns casos composição fluoralquil ou aromática.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 26

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Um surfactante (que literalmente significa agente ativante em uma superfície) é

caracterizado pela tendência de se adsorver em superfícies e interfaces. O termo interface

denota a fronteira entre duas fases imiscíveis, enquanto o termo superfície é geralmente

aplicado quando uma dessas fases é um gás ou vapor. Existem basicamente cinco tipos

diferentes de interfaces nas quais moléculas de tensoativos podem ser adsorvidas: sólido-

vapor (superfície), sólido-líquido (interface), sólido-sólido (interface), líquido-vapor

(superfície) e líquido-líquido (interface). Esta propriedade de adsorção em interfaces está

relacionada com a redução da energia livre na interface. A energia livre interfacial por

unidade de área representa a quantidade de trabalho necessária para a expansão da interface e

é frequentemente denominada de tensão interfacial (HOLMBERG et al., 2003).

A adição de tensoativos a uma solução aquosa faz com que as moléculas anfifílicas se

adsorvam na superfície água-ar, de modo que a parte hidrofílica do tensoativo esteja voltada

para a água, enquanto a parte hidrofóbica se encontra direcionada para o ar (Figura 2.4). Deste

modo, a superfície água-ar é coberta por moléculas anfifílicas e a tensão interfacial da solução

é reduzida. Quando esta superfície se encontra saturada com moléculas anfifílicas, a adição de

mais tensoativo provoca a migração destas novas moléculas introduzidas (monômeros) para o

interior da solução. A parte polar de cada monômero é hidratada ao contato com a fase

aquosa, e a parte hidrofóbica se auto-associa formando agregados micelares de modo a

minimizar o seu contato com a água (Figura 2.5). A estrutura dos agregados formados por um

tensoativo em solução aquosa depende de vários parâmetros, tais como: estrutura molecular

dos compostos anfifílicos, hidratação dos grupos polares, interações intermoleculares,

temperatura e concentração micelar (ISRAELACHVILI, 1976).

Figura 2.4 – Atuação de moléculas anfifílicas na supefície água-ar e no interior de uma solução aquosa

Em geral, podem ser encontradas micelas em soluções com baixa concentração de

tensoativo. A concentração em que agregados micelares começam a se formar é denominada

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 27

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

de concentração micelar crítica (CMC), e representa uma importante propriedade dos

tensoativos (RUCKENSTEIN e NAGARAJAN, 1975; HOLMBERG et al., 2003). Uma

solução contendo tensoativo acima da sua CMC significa que micelas podem ser encontradas

no interior da solução e que as interfaces existentes estão saturadas por moléculas de

tensoativo. O valor da CMC é determinado pelo balanço entre as forças de repulsão entre as

partes polares e as forças de atração entre as partes hidrofóbicas. Este valor é reduzido quando

a repulsão entre as partes polares é diminuída (TALHOUT e ENGBERTS, 1997).

micela direta micela inversa

disco

cilindro

lamelas

vesícula

Figura 2.5 – Representação esquemática de agregados formados por tensoativos em solução aquosa

A concentração micelar crítica pode ser determinada experimentalmente a partir de

diferentes propriedades físico-químicas. O ponto de inflexão apresentado em todas as curvas

corresponde ao início da formação de agregados moleculares, os quais interferem nas

propriedades da solução (Figura 2.6).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 28

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Figura 2.6 – Representação gráfica para a determinação da CMC a partir de diferentes parâmetros físico-

químicos

Os agregados moleculares de tensoativos e suas moléculas isoladas (monômeros)

encontram-se em equilíbrio associação-dissociação, e a lei da ação das massas pode ser

aplicada. Do ponto de vista cinético, a associação dos monômeros em agregados moleculares

se dá a partir de dois processos: um lento (10

-3

s) correspondente à desagregação total do

agregado molecular, e outro rápido (10

-6

s) que traduz a duração da presença de um

monômero no interior do agregado. A micelização, portanto, é um fenômeno dinâmico, em

que os monômeros continuamente se interconvertem em micelas e vice-versa (BLANZAT,

2000).

Uma das principais propriedades das soluções de tensoativos é a capacidade de

aumentar a solubilidade de solutos lipofílicos em água. A solubilização é consequência da

presença de domínios hidrofóbicos nos agregados micelares que atuam como microambiente

propício para a localização de compostos lipofílicos. Quando o formato dos agregados

micelares permanece inalterado com a adição do soluto lipofílico, tem-se a formação de

micelas inchadas, onde as moléculas do soluto encontram-se na camada interfacial de

tensoativos, aumentando o tamanho dos agregados. Quando o soluto lipofílico solubilizado

forma uma fase ou domínio no interior da micela, os agregados são designados de

microemulsão (NAGARAJAN e RUCKENSTEIN, 1991).

Detergente

Condutividade

CMC

Pressão osmótica

Tensão interfacial

Concentração do tensoativo

Propriedades

físico-químicas

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 29

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

2.3.1.1 Termodinâmica de micelização em solução aquosa

A formação de micelas pode ser visto como um mecanismo alternativo ao processo de

adsorção de moléculas anfifílicas em uma interface, já que para ambos os processos o

principal fator é a remoção do contato entre grupos hidrofóbicos do tensoativo e a água,

reduzindo, dessa forma, a energia livre do sistema. O efeito hidrofóbico é responsável pelos

processos espontâneos de adsorção interfacial e de auto-associação das moléculas de

tensoativo, que estão associados à remoção da cauda hidrofóbica do contato com a água

(TANFORD, 1980).

O efeito hidrofóbico também pode ser compreendido a partir do efeito causado pela

presença de grupos hidrofóbicos nas interações água-água (IUPAC, 1997). Antes do processo

de micelização, as moléculas de água localizadas ao redor da parte hidrofóbica do tensoativo

(primeira camada de solvatação) adotam uma conformação rígida, de modo a permitir a

existência de uma mínima rede de ligações de hidrogênio (CHANDLER, 2005). Durante a

micelização, diminui o contato das partes hidrofóbicas com o meio aquoso, liberando as

moléculas de água de uma arquitetura intermolecular rígida, favorecendo o aumento de

entropia do sistema.

A energia livre associada à solvatação de uma molécula anfifílica em meio aquoso ou

no interior do agregado micelar pode ser aproximada considerando os componentes

individuais da energia livre nas partes hidrofílicas e hidrofóbicas do tensoativo. Antes que as

primeiras micelas sejam formadas após a saturação das interfaces, moléculas isoladas de

tensoativos (monômeros) se encontram dispersas no interior de um sistema aquoso. Após a

micelização, a parte hidrofílica do tensoativo permanece interagindo com o meio aquoso,

enquanto as partes hidrofóbicas adotam uma conformação no interior da micela direta que

evita o contato com a água. Desse modo, a energia livre da parte hidrofílica permanece

constante durante a micelização porque sempre estará em contato com a água, e a energia

livre de micelização pode ser aproximada ao valor da energia livre que corresponde à

transferência da parte hidrofóbica do tensoativo do meio aquoso para o interior do agregado

micelar. Termodinamicamente, a energia livre é definida pela expressão:

ΔG = ΔH – TΔS (1)

De acordo com a equação (1), a energia livre pode ser decomposta nos termos entálpico

(H) e entrópico (S). Durante a micelização, o termo entálpico está associado à minimização do

contato interfacial água-óleo (transferência das cadeias lipofílicas do tensoativo de um

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 30

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

solvente polar para o interior hidrofóbico do agregado) e à formação de novas ligações de

hidrogênio ou interações dipolo-dipolo entre as partes polares dos tensoativos e a água, bem

como de interações dipolo induzido-dipolo induzido entre as partes hidrofóbicas do

tensoativo. No caso de tensoativos iônicos, a repulsão das partes polares (associada com as

repulsões eletrostáticas ou estéricas entre os grupos polares hidratados) contribui

negativamente para a entalpia de micelização. À temperatura ambiente, a contribuição

entálpica para a micelização é pequena, e torna-se mais significante com o aumento da

temperatura (PAULA et al., 1995). O termo entrópico está associado à agregação das

moléculas anfifílicas (diminuição da entropia) e à quebra da rígida configuração entre as

moléculas de água ao redor dos monômeros (aumento da entropia) (BLANZAT, 2000;

MARQUES et al., 2003; BRASHER et al., 1995). Ou seja, a diminuição da entropia do

sistema micelar é devida à transferência de calor, durante o fenômeno da agregação dos

tensoativos, para a vizinhança, de acordo com a equação (2):

(2)

Uma maneira simples de relacionar a estrutura geométrica de um tensoativo com o tipo

de agregado preferencial a ser formado é o parâmetro de empacotamento P

(ISRAELACHVILI, 1976). Este parâmetro é uma quantidade adimensional definida pela

expressão P = V/a

l = a

, em que V é o volume da cadeia hidrocarbônica, a

é a área ótima

ocupada pela cabeça polar na interface polar-apolar, e l é o comprimento crítico da cadeia

(aproximadamente igual, porém menor do que o comprimento da cadeia hidrocarbônica

totalmente estendida). O parâmetro P também pode ser visto como a razão entre a área da

seção transversal da parte hidrocarbônica, a

, e a área interfacial da cabeça polar, a

O parâmetro de empacotamento, P, não contém qualquer grandeza molecular, e sim,

quantidades que relacionam a presença de um tensoativo sob a “forma” de certo tipo de

agregado definido. Se o tensoativo tem a “forma” de um cone, então ele tende a formar

micelas esféricas, para as quais os valores de P são próximos de 1/3. Se o formato for similar

a um cone truncado, serão formadas micelas cilíndricas, já que P ≈ 1/3–1/2. Para os

tensoativos com formato cilíndrico, o tipo de agregado mais estável são as bicamadas, em que

P ≈ 1. Em micelas com formato de disco, bem como em vesículas, os valores de P se

encontram em um intervalo entre 0,5–1. Por fim, se o tensoativo apresenta o formato de um

cone truncado e invertido, tenderá a formar estruturas inversas, para as quais P > 1 (Figura

2.7). Dessa forma, variando-se o comprimento da cadeia alquílica ou a sua fluidez (através da

variação de temperatura, por exemplo), o volume hidrocarbônico ou a área da cabeça polar,

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 31

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

pode-se, em princípio, prever qual tipo de agregado será formado sob condições pré-definidas.

Para tensoativos iônicos, por exemplo, a diminuição das interações repulsivas entre as cabeças

polares, induzida pela adição de um sal, irá reduzir o valor de a

, aumentar V/a

l, e causar

uma transição entre micelas esféricas para micelas cilíndricas (NINHAM et al., 1983).

Para a obtenção de vesículas, cujo pré-requisito é 1/2 < V/a

l < 1, utiliza-se geralmente,

tensoativos bicatenários, já que suas duas caudas hidrofóbicas, em conjunto, apresentam

grande volume hidrocarbônico, V. Entretanto, no caso de tensoativos cataniônicos (mistura

equimolar de tensoativos iônicos de cargas opostas), a atração eletrostática entre as cabeças

polares dos dois tensoativos iônicos gera, aparentemente, um tensoativo pseudo-zwiteriônico

bicatenário, resultando em uma menor área efetiva da cabeça polar, com ampliação da região

hidrofóbica, quando comparado com os tensoativos isolados (KALER et al., 1992). Nesse

caso, observa-se também, a formação de estruturas vesiculares ao invés de micelas esféricas

ou cilíndricas.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 32

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Caudas Cabeça V/a

l Forma Organização

dupla e

insaturada ou

ramificada

pequena

micela inversa

dupla e rígida pequena

—1

bicamada plana

dupla e fluida grande

—1/2

vesícula

simples pequena

micela cilíndrica

simples pequena

micela globular

simples grande

—1/3

micela direta

Figura 2.7 – Representação esquemática dos agregados em função do parâmetro de empacotamento

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 33

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

2.2 MICROEMULSÕES

Quando um óleo é disperso em uma fase aquosa sem nenhum outro tipo de aditivo, a

estabilidade das gotículas formadas é muito pequena, e elas tendem a se fundirem

(coalescerem) até a total separação de fases. A adição de tensoativo a esta mistura permite a

criação de um filme na interface óleo-água e a formação de dispersões coloidais denominadas

emulsões e microemulsões. Emulsões são sistemas instáveis que tendem à separação de fases,

e que apresentam pequena curvatura da camada interfacial e que, por isso, geram gotículas de

tamanho relativamente grande (1-10 µm). A produção de emulsões geralmente requer o uso

de quantidade moderada de tensoativo. Microemulsões, por sua vez, são sistemas

considerados termodinamicamente estáveis, já que não tendem à separação de fases.

Apresentam camada interfacial com grande curvatura e agregados com tamanho nanométrico

(~10 nm). As microemulsões são consideradas sistemas altamente dinâmicos e para sua

formação são necessárias grandes quantidades de tensoativo e, usualmente, a adição de um

cotensoativo (HOLMBERG et al., 2003).

O conceito de microemulsão foi introduzido na literatura nos anos de 1940 por HOAR e

SCHULMAN (1943) ao descreverem a produção de uma solução transparente ou translúcida

a partir da titulação de uma emulsão com hexanol. Entretanto, apenas no final dos anos de

1950, foi que SCHULMAN et al. (1959) estabeleceram o termo microemulsão, que ao longo

dos anos, tem sido definido e redefinido em função dos avanços tecnológicos. Atualmente,

considera-se que as microemulsões são dispersões coloidais termodinamicamente estáveis e

opticamente isotrópicas constituídas de um ou mais agentes tensoativos, uma fase polar, uma

fase oleosa (orgânica), e frequentemente, um cotensoativo, que pode ser um álcool ou amina

de cadeia média (MOULIK e PAUL, 1998; KLIER et al., 2000). Ao contrário das emulsões,

as microemulsões requerem menor quantidade de energia mecânica para sua preparação, já

que são formadas espontaneamente após pouco tempo de agitação.

Quando tensoativos são adicionados a uma mistura imiscível de água e óleo, as

moléculas do tensoativo tendem se localizar na interface óleo/água, que é

termodinamicamente mais favorável, reduzindo, dessa forma, a tensão nesta interface a

valores muito próximos de zero, e gerando microdomínios de água e óleo separados por

extensas interfaces internas constituídas de moléculas do tensoativo (VOLLMER, 1999).

Estes microdomínios ou microestruturas compreendem microgotículas da fase dispersa em

uma fase contínua, com tamanho variando entre 15 e 200 nm (ESPOSITO et al., 2003).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 34

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

As microemulsões são sistemas dinâmicos, onde processos de agregação e desagregação

operam simultaneamente, em que a interface flutua espontânea e continuamente em função da

razão e natureza de seus componentes e da temperatura, gerando diversos tipos de

microestruturas (Figura 2.5). Estes processos envolvem a troca contínua de matéria entre as

diferentes fases, resultando em um equilíbrio global, e compreendem o intercâmbio de: (i)

moléculas de água nos seus estados livre e associado, (ii) contra-íons entre as partes polares

do tensoativo e o meio aquoso, (iii) moléculas do cotensoativo entre o filme interfacial e a

fase contínua ou dispersa, e (iv) moléculas do tensoativo entre o filme interfacial e a fase

aquosa (MOULIK e PAUL, 1998).

As microemulsões apresentam microestruturas que podem ser constituídas de

microgotículas de óleo em água (microemulsões do tipo O/A) ou de água em óleo

(microemulsões do tipo A/O) (Figura 2.8). As primeiras são observadas quando a fração de

volume do óleo é baixa em comparação à água, e as últimas quando a fração de volume da

água é pequena. Quando as quantidades de água e óleo em um sistema microemulsionado

forem similares, podem ser observadas estruturas bicontínuas, em que a água e o óleo

coexistem como fase contínua na presença de uma interface estabilizada por moléculas do

tensoativo.

Água

Óleo

Água

Óleo

Água

Óleo

Microemulsão A/O

Microemulsão O/A Microemulsão bicontínua

Figura 2.8 – Representação esquemática das três microestruturas mais comumente encontradas em sistemas

microemulsionados: (a) microemulsão água em óleo; (b) microemulsão óleo em água; (c) microemulsão

bicontínua

2.2.1 Formação de microemulsões

A formação e a estabilidade das microemulsões são justificadas por variadas teorias,

algumas das quais estão baseadas em interações envolvendo o filme interfacial

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 35

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

(ISRAELACHVILI, 1976), e outras em aspectos termodinâmicos (KAHLWEIT et al., 1990;

PECK et al., 1991; SKAF e STELL, 1992). Para ambos os tipos de teorias, a formação das

microemulsões deriva essencialmente da redução da tensão na interface água/óleo, da

formação de um filme interfacial fluido composto de moléculas do tensoativo, e da penetração

e associação de moléculas da fase oleosa neste filme de tensoativos (SCHULMAN et al.,

1959). No entanto, geralmente se faz necessária a presença de um cotensoativo para que o

filme interfacial se torne mais flexível e alcance valores de tensão inferiores a 1 mN/m.

Devido à maior flexibilidade do filme interfacial por causa da inclusão de um cotensoativo,

pode ocorrer a expansão da região de ocorrência de microemulsões em sistemas contendo

tensoativo, água e fase oleosa. A formação de microemulsões sem a presença de cotensoativo

é possível quando o volume da parte hidrofóbica do tensoativo é pequeno, ou quando a cadeia

lipofílica apresenta grupos fluidizantes, como insaturações. Nestes casos, a presença do

cotensoativo não é necessária e a composição da microemulsão restringe-se aos outros três

componentes (LV et al., 2006; WARISNOICHAROEN et al., 2000).

Admitindo-se uma racionalização termodinâmica simplificada, considera-se que a

energia livre de formação da microemulsão depende de dois fatores: (i) da capacidade do

tensoativo em reduzir a tensão superficial na interface água/óleo, e (ii) da variação de entropia

do sistema, os quais estão sumariamente apresentados na equação abaixo:

STAG

⋅−Δ⋅=Δ

, (3)

em que ΔG

é a energia livre de formação, γ é a tensão superficial na interface

água/óleo, ΔA é variação da área interfacial durante o processo de microemulsificação, ΔS é a

variação de entropia do sistema, e T é a temperatura. Como o aumento da área interfacial, ΔA,

é imprescindível para a formação de gotículas de água em óleo, ou óleo em água, a

estabilidade das microemulsões advém do aumento de entropia devido à mistura de uma fase

em outra na forma de um grande número de pequenas gotículas. No entanto, espera-se que

contribuições favoráveis de entropia também derivem de outros processos dinâmicos como a

difusão de moléculas de tensoativo na camada interfacial e o contínuo intercâmbio das

moléculas de tensoativo nos domínios monômero-micela (LAWRENCE e REES, 2000).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 36

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

2.2.2 Diagramas de fases

A mistura entre água, óleo e tensoativo(s) é capaz de gerar uma extensa variedade de

estruturas e fases (Figura 2.8). Além das microemulsões, podem também existir emulsões,

fases cúbicas ou hexagonais cristalinas e estruturas lamelares em misturas contendo

tensoativo, água e fase oleosa, dependendo da quantidade e da natureza de cada componente

do sistema. A relação entre a formação de diversas fases e estruturas de uma mistura e sua

composição pode ser visualizada com o auxílio de um diagrama de fases, que são sistemas

ternários onde cada vértice do diagrama representa 100% de um determinado componente.

Ocasionalmente, as microemulsões podem conter componentes adicionais como

cotensoativos, aditivos e fármacos, os quais podem influenciar na formação das

microestruturas observadas. Nestes casos, quando quatro ou mais componentes são estudados,

diagramas de fases pseudo-ternários são usados, nos quais um dos vértices do diagrama estará

representando uma mistura binária de razão fixa como tensoativo/cotensoativo, água/fármaco

ou fase oleosa/fármaco (Figura 2.9a).

Figura 2.9 – (a) Representação esquemática de um diagrama de fases pseudo-ternário. (b) Diagrama de fases

pseudo-ternário hipotético onde estão representadas as regiões de microemulsão (1φ), de emulsão ou duas fases

(2φ) e cristais líquidos (CL)

A construção de diagramas de fases pode requerer um gasto dispendioso de tempo,

principalmente quando um dos objetivos é delinear com precisão os limites de cada fase.

Além disso, sonicação e aquecimento podem ser utilizados para se alcançar rapidamente o

2φ

1φ

B D

Tensoativo

Água Óleo

Tensoativo

(Tensoativo/Cotensoativo)

Água Óleo

a b

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 37

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equilíbrio, principalmente quando são usados tensoativos não-iônicos

(WARISNOICHAROEN et al., 2000). A metodologia mais prática para a construção de

diagramas de fases envolve a preparação de uma série de misturas binárias e a sua posterior

titulação com um terceiro componente, avaliando-se aspectos físicos da mistura após cada

adição do titulante (DJORDJEVIC et al., 2004).

Alguns cuidados, no entanto, devem ser tomados com relação ao controle da

temperatura e ao tempo de espera para que o sistema atinja o equilíbrio, a fim de que não

ocorram discrepâncias no diagrama de fases. Estes cuidados são aplicados, sobretudo, quando

são utilizados tensoativos não-iônicos, já que são muito susceptíveis à temperatura,

ocorrendo, portanto, a diminuição de sua solubilidade com o aumento da temperatura. Esta

classe de tensoativos apresenta ainda uma temperatura de inversão de fase, conhecida como

PIT (phase inversion temperature), que é a temperatura em que um tensoativo solúvel em

água torna-se solúvel em óleo, tornando-se, portanto, incapaz de formar microemulsões do

tipo O/A. Se a PIT for muito próxima da temperatura de utilização da microemulsão, ela pode

se tornar um fator limitante para a sua aplicação (WARISNOICHAROEN et al., 2000).

A análise de um diagrama de fases pode revelar variadas regiões em que podem ser

encontrados diversos tipos de agregados, e que podem assumir diferentes tamanhos,

dependendo da concentração e natureza dos componentes, da razão tensoativo/cotensoativo e

da temperatura do sistema (Figura 2.9b). Em misturas muito ricas em tensoativo (região A) há

a tendência da formação de cristais líquidos (ALANY et al., 2001) e estruturas lamelares, em

que o tensoativo e o cotensoativo organizam-se sob a forma de bicamadas na interface

água/óleo, separando ambas as fases. Esta região é caracterizada por misturas viscosas, e em

alguns casos pode ser observada a formação de géis (ALVAREZ-FIGUEROA e BLANCO-

MÉNDEZ, 2001).

Na região próxima ao vértice da água (região B), podem ser observadas microgotículas

de óleo dispersas no meio aquoso (microemulsões do tipo O/A), desde que a concentração de

tensoativos seja suficiente para formar filmes interfaciais fluidos. A diluição infinita com a

fase aquosa tende a formar micelas diretas. O outro extremo do diagrama, próximo ao vértice

da fase oleosa (região D), é caracterizado pela presença de microgotículas de água dispersas

na fase oleosa (microemulsões do tipo A/O), sendo o volume da fase interna pequeno. A

diluição infinita com a fase oleosa tende a formar micelas inversas, com a fase aquosa

dissolvida em seu interior. Entre essas duas regiões pode existir uma região intermediária

(região C), em que podem ser observadas fases bicontínuas, caracterizadas por extensas fases

de água e óleo separadas por um filme interfacial composto por tensoativo e cotensoativo. Já

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 38

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nas composições próximas ao eixo binário água-óleo (região E), a quantidade de tensoativo

torna-se insuficiente para facilitar a formação de microemulsões. Nesta região, fases múltiplas

podem existir, tais como: emulsões, emulsões em equilíbrio com a fase aquosa ou oleosa,

microemulsões em equilíbrio com a fase aquosa ou oleosa, e sistemas trifásicos.

2.2.3 Aplicação das microemulsões

Devido às suas propriedades físico-químicas singulares, tais como capacidade de formar

espontaneamente microestruturas em misturas imiscíveis, estabilidade termodinâmica e fácil

preparação, as microemulsões têm sido aplicadas na recuperação de petróleo (DANTAS et al.,

2001), na remoção de hidrocarbonetos no solo e na água (OLIVEIRA et al., 2004), na síntese

de nanopartículas (LÓPEZ-QUINTELA, 2003), como meio reacional para síntese de diversos

materiais (ENGBERTS et al., 2006), na extração de metais pesados (DANTAS et al., 2005) e

de cor de efluentes industriais (DANTAS et al., 2004), na solubilização e proteção de

moléculas ativas como pigmentos e substâncias perigosas (GARTI et al., 2004), em

formulações de limpeza, cosméticos e alimentos (FLANAGAN e SINGH, 2006), e como

espermicidas (D’CRUZ et al., 2001). Além dessas aplicações, as microemulsões têm sido

recentemente utilizadas na veiculação de fármacos (LAWRENCE e REES, 2000; OLIVEIRA

et al., 2004; FORMARIZ et al., 2005), que juntamente com outros sistemas como os

lipossomos e as nanopartículas, contribuem para a biodisponibilização de fármacos.

2.2.4 Microemulsões como sistemas de liberação de fármacos

Quando um fármaco é administrado a um indivíduo, ele é absorvido e distribuído por

todo o seu corpo. No entanto, apenas uma pequena parte da dose administrada alcança o seu

sítio de ação farmacológico. A fração restante pode agir em outras partes do organismo e

provocar efeitos adversos. A utilização dos sistemas de liberação de fármacos visa diminuir a

incidência desses efeitos adversos e aumentar o índice terapêutico dos fármacos, através da

sua liberação controlada em sítios específicos e/ou a taxas constantes. Nesse aspecto, as

microemulsões apresentam propriedades e vantagens peculiares. A existência de

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 39

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

microdomínios de diferentes polaridades no interior de uma solução unifásica permite a

solubilização tanto de fármacos hidrossolúveis quanto lipossolúveis, ou até de ambos ao

mesmo tempo (LEE et al., 2003). Em geral, fármacos lipofílicos tendem a se localizar no

interior das microemulsões O/A ou na região hidrofóbica das moléculas do tensoativo que

formam a camada interfacial, onde em ambos os casos a liberação do fármaco será lenta. No

caso de microemulsões do tipo A/O, a incorporação de um fármaco lipofílico geralmente se

dá na fase contínua oleosa ou mesmo na camada interfacial, mas nesse caso espera-se uma

liberação mais rápida do fármaco. Por sua vez, os fármacos hidrofílicos tendem a se encontrar

predominantemente no interior das microemulsões do tipo A/O ou na fase aquosa dispersa de

microemulsões do tipo O/A. Neste caso, a sua liberação será mais rápida em sistemas do tipo

A/O.

As microemulsões também apresentam a vantagem de aumentar a biodisponibilidade de

certos fármacos, seja através da solubilização de fármacos pouco solúveis (KAWAKAMI et

al., 2002), ou pela proteção contra a hidrólise enzimática (LYONS et al., 2000),

possibilitando a redução da dose administrada, garantindo além de vantagens econômicas, a

diminuição de possíveis efeitos adversos. Nesse contexto, estudos estão sendo realizados para

que certas substâncias tóxicas, como a camptotecina (CORTESI et al., 1997) e o metotrexato

(ALVAREZ-FIGUEROA e BLANCO-MÉNDEZ, 2001), possam ser veiculados a partir de

microemulsões para o tratamento de tumores malignos.

Adicionalmente, as microemulsões podem atuar ainda como um sistema reservatório

para o fármaco, garantindo a sua liberação lenta e a prolongação do seu efeito farmacológico

(DALMORA et al., 2001). Como exemplo, foi comprovado que microemulsões ricas em

colesterol tendem a se concentrar em certos tumores sólidos, garantindo a liberação de

agentes antineoplásicos em seu sítio de ação farmacológico (AZEVEDO et al., 2005).

A liberação do fármaco a partir dos sistemas microemulsionados pode seguir dois

mecanismos básicos (BONACUCINA et al., 2009), a depender do tipo de microemulsão, da

via de administração e da natureza do fármaco. No primeiro mecanismo, a fase oleosa pode

atuar como um sistema reservatório, no caso de microemulsões do tipo O/A, ou como uma

barreira externa difusora em microemulsões do tipo A/O. Em ambos os casos, ocorre

liberação lenta e prolongada do fármaco (DALMORA et al., 2001). Pelo outro mecanismo,

através da via oral, o fármaco pode ser liberado do sistema microemulsionado a partir da

fagocitose das gotículas de óleo contendo um fármaco lipofílico, aumentando, assim, a

biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água (BONACUCINA et al., 2009).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 40

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A aplicação de sistemas microemulsionados como veículos para fármacos depende não

apenas da natureza do fármaco, mas também da via pela qual o fármaco em questão será

administrado. Diversas características das microemulsões podem limitar seu uso por

determinada via de administração, mas, por outro lado, podem contribuir para sua veiculação

por outra via. Assim, por exemplo, a via parenteral (intravenosa) requer o uso de

microemulsões do tipo O/A, a fim de se evitar o risco de embolia causada pela inversão e

aumento das gotículas (FORMARIZ et al., 2005; PARK et al., 1999), e microemulsões

viscosas do tipo A/O são preferidas para a administração transdérmica (SPICLIN et al.,

2003). Para a administração oral é recomendado o uso de sistemas microemulsionados

resistentes à diluição, como os sistemas auto-microemulsificantes (NARANG et al., 2007).

Dessa forma, é imprescindível o conhecimento prévio da natureza do fármaco a ser

microemulsionado, bem como das vias em que esse fármaco será administrado a fim de se

obter um sistema microemulsionado otimizado. Além desses dois fatores, existe um terceiro,

igualmente importante: os componentes utilizados nas microemulsões para uso biológico

devem ser farmaceuticamente aceitáveis.

2.2.4.1 Componentes de microemulsões

Apesar das muitas vantagens, as microemulsões apresentam desvantagens que podem

limitar o seu uso como sistemas de liberação de fármacos. A principal delas consiste no fato

de que a maioria dos componentes comumente utilizados para a formação de microemulsões

não são farmaceuticamente aceitáveis. Em alguns casos, para que microemulsões sejam

formadas são necessárias grandes quantidades de tensoativo, que nessas condições podem

gerar efeitos toxicológicos significativos, além de elevar o custo final da formulação. Desta

forma, a escolha dos componentes de uma microemulsão para uso farmacológico requer um

balanço entre três fatores: a escolha de compostos que sejam capazes de formar

microemulsões, que sejam atóxicos, e que preencham todos os requisitos para um bom

veículo.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 41

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2.2.4.1.1 Tensoativos em microemulsões biológicas

Os tensoativos desempenham um papel fundamental na formação do filme interfacial,

gerando domínios de fase aquosa e oleosa. Para que este filme seja estável e alcance valores

de tensão próximos de zero são necessárias grandes quantidades de tensoativo,

correspondendo, na maioria dos casos, a no mínimo 30% em massa da microemulsão.

Portanto, a aplicação de microemulsões como sistema de liberação de fármacos requer a

utilização de tensoativos atóxicos e biodegradáveis. Neste caso, tensoativos não-iônicos e

anfóteros são preferíveis frente aos iônicos, pois além de serem menos tóxicos, são também

menos susceptíveis ao pH e à presença de eletrólitos, além de apresentarem CMC mais baixa.

Os tensoativos anfóteros de ocorrência natural, como as lecitinas, são considerados

biologicamente atóxicos (FIUME, 2001) e por isso têm sido largamente empregados na

formulação de microemulsões para uso farmacêutico (PARK et al., 1999; PAOLINO et al.,

2002; MORENO et al., 2003; CHANGEZ et al., 2006). As lecitinas são predominantemente

hidrofóbicas devido à presença de duas caudas apolares, no entanto, apresentam também

hidrofilia moderada proveniente dos grupos polares zwiteriônicos presentes em sua estrutura

(Tabela 2.1). Como as lecitinas são bastante lipofílicas para formar espontaneamente o filme

interfacial, imprescindível para a formação da microemulsão, faz-se necessária, geralmente, a

adição de um cotensoativo para viabilizar a formação de microemulsões à base de lecitinas, o

que pode acarretar em um aumento da toxicidade da formulação (PARK et al., 1999). No

entanto, para evitar o uso do cotensoativo, uma opção viável seria a utilização de uma mistura

de lecitina com um tensoativo não-iônico (MORENO et al., 2003).

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Tabela 2.1 – Estrutura química de alguns dos principais tensoativos farmaceuticamente

aceitáveis

Tensoativos Estrutura química

Tween 80 (Polissorbato 80)

Monooleato de polioxietileno (20)

sorbitano

R = C

(OCH

)

(OCH

)

(OCH

)

O C R

HO(CH

x + y + z + w = 20

Tween 20 (Polissorbato 20)

Monolaurato de polioxietileno (20)

sorbitano

R = C

Span 80

Monooleato de sorbitano

R = C

OH OH

O C

Span 20

Monolaurato de sorbitano

R = C

Poloxâmeros

Polietileno-polipropileno glicol

HOCH

O CH CH

O CH

O H

Cremophor EL

Óleo de rícino polietoxilado

(CH

)

(OCH

)

(CH

)

x,y,z

1,2,3

R = Polietilenoglicol ricinoleato

x + y + z = 35

Cremophor RH 40

Óleo de rícino hidrogenado polietoxilado

(CH

)

(OCH

)

(CH

)

x,y,z

1,2,3

R = Polietilenoglicol 12-

oxiestearato

x + y + z = 40

Monoestearato de sacarose

Éster da sacarose

(CH

)

COO

Fosfatidilcolina

Lecitina

R = grupos alquil (C

-C

)

Os tensoativos não-iônicos, por sua vez, podem ser utilizados como alternativa aos

fosfolipídios (lecitinas), já que apresentam baixa toxicidade em concentrações moderadas.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 43

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Dentre eles, destacam-se os ésteres do sorbitol (Tweens e Spans), os compostos polietoxilados

(alquil-poliéteres, Brij, Poloxâmeros e Cremophor) e os glicerídeos (Labrasol) (Tabela 2.1).

Todos são amplamente empregados em microemulsões para uso tópico (CHEN et al., 2004;

SINTOV e SHAPIRO, 2004; HUA et al., 2004) e oral (KIM et al., 2001; ZHENG e FULU,

2006; KIM et al., 2005), mas praticamente apenas os polissorbatos possuem toxicidade

tolerável para uso parenteral (PARK e KIM, 1999) e ocular (ALANY et al., 2006). Mesmo

assim, os tensoativos não-iônicos são desaconselhados em formulações de uso crônico, visto

que além de apresentarem certa toxicidade, não são facilmente eliminados pelo organismo.

Atualmente, tensoativos mais biodegradáveis, como os ésteres de sacarose (Tabela 2.1), vêm

sendo estudados e utilizados em sistemas microemulsionados para uso farmacológico

(GARTI et al., 1999; BOLZINGER et al., 1998).

Uma propriedade importante e determinante para a formação das microestruturas de

microemulsões contendo tensoativos não-iônicos é o balanço hidrófilo-lipófilo (BHL), que

leva em consideração a contribuição relativa das partes hidrofílica e hidrofóbica da molécula

do tensoativo. Geralmente, tensoativos com baixo BHL (3-6) tendem a formar microemulsões

do tipo A/O, enquanto que tensoativos com altos valores de BHL (8-18) são preferíveis na

formação de microemulsões do tipo O/A. Tendo em vista esta propriedade dos tensoativos

não-iônicos, vários estudos estão sendo realizados utilizando misturas de tensoativos com

BHL distintos no intuito de eliminar o uso de cotensoativo (LI et al., 2005; KIM et al., 2005),

melhorar as propriedades físico-químicas da microemulsão (CONSTANTINIDIS e

SCALART, 1997), aumentar a região de microemulsão no diagrama de fase (KIM et al.,

2005) e formar microestruturas distintas daquelas que seriam formadas utilizando-se os

tensoativos individualmente (efeito sinérgico dos tensoativos) (PORRAS et al., 2004).

2.2.4.1.2 Cotensoativos em microemulsões biológicas

Os cotensoativos são geralmente constituídos de moléculas polares que possuem uma

pequena cauda hidrofóbica, como os alcoóis e as aminas de cadeia média, que apresentam

variadas funções, tais como: (i) diminuição da tensão interfacial água-óleo (permitindo a

formação de microemulsões); (ii) estabilização do filme de tensoativo formado (aumentando a

sua fluidez); (iii) bloqueio do surgimento de fases líquidas cristalinas (aumentando a região de

microemulsão); (iv) permitir maior penetração da parte hidrofóbica do tensoativo na fase

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 44

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oleosa (aumentando a entropia do sistema); e (v) diminuição das interações repulsivas das

cabeças polares, no caso de tensoativos iônicos. Adicionalmente, a presença de um

cotensoativo pode influenciar na solubilização do fármaco, principalmente em microemulsões

ricas em fase oleosa, já que a molécula do cotensoativo irá competir com o fármaco por locais

livres na região interfacial (GARTI et al., 2006). Por outro lado, o uso de cotensoativos pode

facilitar a solubilização de fármacos lipofílicos em microemulsões do tipo O/A, uma vez que

torna o meio mais hidrofóbico a partir da diminuição da constante dielétrica da água

(NARANG et al., 2007).

Na maioria dos casos, a presença do cotensoativo pode inviabilizar a utilização

biológica de uma microemulsão, tornando-a uma formulação farmaceuticamente inaceitável.

De fato, o emprego de alcoóis de cadeia média, como butanol e hexanol, pode resultar em um

aumento significativo da toxicidade da formulação. Além disso, a solubilidade aquosa desses

compostos em microemulsões do tipo O/A é frequentemente maior que a do tensoativo

principal. Consequentemente, quando a microemulsão é diluída, o cotensoativo tende a migrar

para a fase aquosa, diminuindo sua concentração na interface água-óleo, podendo

desestabilizar as gotículas de microemulsão.

Alternativas para a utilização de alcoóis de cadeia média são alvo de interesse científico,

e o emprego de pequenas moléculas polares se mostra uma opção viável. Etanol, por exemplo,

tem sido utilizado como cotensoativo tanto em microemulsões do tipo O/A (RUTH et al.,

1995) quanto A/O (ZHANG et al., 2005), por apresentar toxicidade mais tolerável que seus

homólogos de cadeia maior (ALANY et al., 2006). Alcoóis polihidroxilados, tais como

sorbitol (KTISTIS, 1990) e propilenoglicol (RADOMSKA e DOBRUCKI, 2000; CHEN et

al., 2004), têm sido também utilizados como aditivos para facilitar a formação de

microemulsões, bem como os poligliceróis comerciais Plurol Oleique® (DJORDJEVIC et al.,

2005) e Plurol Isostearique® (ESPOSITO et al., 2003).

No entanto, dependendo da sua porcentagem na formulação, o uso destes cotensoativos

em formulações farmacêuticas pode levar à ocorrência de efeitos adversos. Por outro lado, a

necessidade do uso destes cotensoativos pode ser justificada pelo custo-benefício, ou seja,

biodisponibilidade do fármaco ou gravidade da enfermidade com poucas opções de

tratamento. Um exemplo clássico de que as vantagens são superiores aos efeitos adversos

causados pelo uso de cotensoativos consiste na formulação comercial Norvir®, utilizada no

tratamento da AIDS, que é um sistema auto-microemulsificante contendo 42% em massa de

etanol (STRICKLEY, 2004).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 45

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2.2.4.1.3 Fase oleosa em microemulsões biológicas

A fase orgânica ou oleosa desempenha um papel importante tanto na formação da

microemulsão como na solubilização do fármaco. Nem sempre o mesmo tipo de óleo gera

condições favoráveis para ambos os casos. De fato, moléculas de óleo com grandes cadeias

hidrocarbônicas podem não gerar microemulsões, pois suas moléculas não conseguem

penetrar no filme de tensoativo e ajudar na sua fluidez e estabilização. Já as moléculas de óleo

com cadeias hidrocarbônicas mais curtas apresentam maior facilidade de penetração do filme

interfacial, porém, a capacidade de solubilização de fármacos, sobretudo os lipofílicos, pela

fase orgânica é diminuída. Assim, um balanço entre essas duas propriedades deve ser levado

em conta na escolha da fase oleosa a ser utilizada em microemulsões para uso farmacêutico.

A maioria dos óleos utilizados nas microemulsões para uso farmacêutico são volumosos

e semi-polares, ao contrário dos óleos hidrocarbônicos (alcanos) que são comumente

utilizados em outras aplicações. Dessa forma, os triglicerídeos de cadeia média e longa, como

o Miglyol (VALENTA e SCHULTZ, 2004; AGATONOVIC-KUSTRIN et al., 2003), e os

ésteres de ácido graxo, como o miristato de isopropila (PODLOGAR et al., 2005; MORENO

et al., 2003) e o palmitato de isopropila (DREHER et al., 1997) são farmaceuticamente

aceitáveis e bastante utilizados na obtenção de microemulsões (Tabela 2.2). Outro óleo

bastante utilizado é o ácido oléico, que possui a propriedade de aumentar a permeação

transdérmica (ESCRIBANO et al., 2003) e a absorção enteral (ZHENG e FULU, 2006) de

certos fármacos. Óleos vegetais, como óleo de soja (TEREK et al., 2006), azeite de oliva

(KAWAKAMI et al., 2002), entre outros (KIM et al., 2005), bem como a mistura de vários

óleos (KAWAKAMI et al., 2002; ACHARYA et al., 2001) também podem ser empregados.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 46

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Tabela 2.2 – Estrutura química de alguns dos principais óleos farmaceuticamente aceitáveis

Óleo Estrutura química

Miristato de isopropila (IPM)

Éster de ácido graxo

n = 11

O CH

(CH

)

Palmitato de isopropila (IPP)

Éster de ácido graxo

n = 13

Ácido oléico

Ácido cis-9-octadecenóico

(CH

)

Triacetina

Triacetato de 1,2,3-propanotriol

Miglyol 812

Triglicerídeos do ácido caprílico/cáprico

x = 6,8

(CH

)

(CH

)

(CH

)

2.2.4.1.4 Fase aquosa em microemulsões biológicas

A fase aquosa utilizada em microemulsões para uso farmacêutico deve estar livre de

contaminantes, sendo utilizado geralmente água bidestilada, deionizada ou ultra-pura, além de

soluções de NaCl a 0,9%. Esta fase pode conter aditivos, como tampões (CORREA et al.,

2005), agentes gelificantes (VALENTA e SCHULTZ, 2004), promotores de permeação

dérmica (LEE et al., 2003; NEUBERT et al., 2005) e diversos tipos de preservativos (PARK

e KIM, 1999; KANG et al., 2004; GAO et al., 2003), que podem influenciar tanto na região

de ocorrência de microemulsão quanto na solubilização do fármaco.

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2.2.3 Caracterização físico-química

Em contraste com a fácil preparação, a caracterização das microestruturas presentes em

um sistema microemulsionado nem sempre é um procedimento simples, apesar de esse ser um

conhecimento de vital importância para a sua exploração comercial. Diversas técnicas têm

sido largamente empregadas com o objetivo de caracterizar os sistemas microemulsionados.

A nível macroscópico, experimentos de reologia (BOLZINGER-THEVENIN et al., 1999;

MORENO et al., 2003; SPICLIN et al., 2003; VALENTA e SCHULTZ, 2004) e de

condutividade elétrica (PODLOGAR et al., 2004; PODLOGAR et al., 2005; LV et al., 2005;

ALANY et al., 2001) têm sido empregados a fim de se obter valiosas informações a respeito

das microestruturas presentes no interior dos sistemas microemulsionados.

Por sua vez, técnicas de espalhamento de luz (espalhamento de luz dinâmico – DLS,

espalhamento de nêutrons a baixo ângulo – SANS, e espalhamento de raios X a baixo ângulo

– SAXS) (MOULIK e PAUL, 1998; GODDEERIS et al., 2006; SHUKLA et al., 2003;

SHUKLA e NEUBERT, 2006; BOON e YIP, 1982; SHUKLA et al., 2002; FANUN et al.,

2001; TOMSIC et al., 2006; GARTI et al., 2006) e de microscopia (microscopia eletrônica de

transmissão no modo criofratura – crio-TEM ou FFTEM) (MOULIK e PAUL, 1998;

VINSON et al., 1991; BOLZINGER et al., 1998; ALANY et al., 2001; BOLZINGER-

THEVENIN et al., 1999) podem ser utilizadas com o intuito de extrair informações sobre o

tamanho das gotículas. Para as técnicas de espalhamento faz-se necessário a utilização de

sistemas diluídos a fim de se evitar resultados incorretos devido às interações inter-gotas

(PODLOGAR et al., 2004). A utilização da microscopia eletrônica é restrita ao modo de

criofratura. A visualização das microestruturas presentes no interior das microemulsões pela

técnica de microscopia eletrônica requer o resfriamento extremamente rápido da amostra a

fim de manter intacta a microestrutura e minimizar a ocorrência de artefatos (VINSON et al.,

1991).

Um dos principais atributos das microemulsões como veículos farmacêuticos é o seu

alto poder de solubilização. A quantificação de um fármaco no interior de uma microemulsão

pode ser feita a partir de técnicas cromatográficas, em especial a cromatografia líquida de alta

eficiência (CLAE) (RHEE et al., 2001; LV et al., 2005; CHEN et al., 2004), ou

espectroscópicas (espectroscopia no UV-Vis). Quando o fármaco microemulsionado absorve

luz na região do UV-Visível (760 > λ > 220 nm) geralmente são utilizadas técnicas

espectroscópicas para a quantificação do fármaco (MORENO et al., 2001; HASSE e

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 48

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

KEIPERT, 1997; CORREA et al., 2005), visto ser uma técnica mais simples e barata. Caso

contrário, a quantificação pode ser feita apenas por CLAE. As interações do fármaco com os

componentes da microemulsão e a sua localização exata no interior do sistema

microemulsionado podem ser obtidas a partir de experimentos de ressonância magnética

nuclear de

H (LV et al., 2005) e de ressonância magnética nuclear de gradiente do campo

pulsante (MOMOT e KUCHEL, 2003; JOHNSON JR., 1999; HUA et al., 2004; FANUN et

al., 2001; KREILGAARD et al., 2000; GARTI et al., 2006).

A liberação e a permeação de fármacos a partir de microemulsões de uso tópico podem

ser testadas in vitro, a partir de métodos de difusão de fluxo contínuo ou estático, combinado

com o uso de membranas artificiais (acetato de celulose) (DALMORA et al., 2001;

JURKOVIC et al., 2003) ou naturais (derme humana ou de porco) (CHEN et al., 2004;

SINTOV e BOTNER, 2006).

2.3 PRODUTOS NATURAIS E PROPRIEDADES FARMACOLÓGICAS

Plantas têm sido tradicionalmente utilizadas por populações em todos os continentes no

controle de diversas doenças e pragas, sendo reconhecidas mais de 13 mil espécies que são

mundialmente consumidas como fármacos ou fonte de fármacos (SIMÕES et al., 2004).

Cerca de 30% dos novos fármacos lançados no mercado nos últimos 30 anos foram obtidos a

partir de fontes vegetais ou tiveram origem semi-sintética, isto é, a partir de transformações

químicas de um produto natural (NEWMAN e CRAGG, 2007).

2.3.1 Croton cajucara Benth

O gênero Croton, de acordo com PAX e HOFFMANN (1931), pertence à família

Euphorbiaceae (subfamília Crotonoideae), sendo um dos gêneros mais numerosos desta

família (MACIEL et al., 2006). A Euphorbiaceae possui mais de 8000 espécies amplamente

distribuídas em regiões tropicais e temperadas de todo o mundo. No Brasil há mais de 300 das

cerca de 700 espécies do gênero Croton, a maioria delas com propriedades químicas e/ou

farmacológicas conhecidas. O gênero Croton tem representantes tanto medicinais, quanto

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 49

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

tóxicos; uma das espécies mais conhecidas no Norte do Brasil é o Croton cajucara Benth,

vulgarmente conhecido por sacaca (feitiço na língua Tupi) (MACIEL et al., 2000).

No estado do Pará, as folhas e cascas do caule deste Croton cajucara são utilizadas na

forma de chá ou pílula, no combate a diabetes, diarréia, malária, febre, problemas estomacais,

inflamação do fígado, rins, vesícula e no controle de índices elevados de colesterol. A sacaca

também é comercializada em farmácias de manipulação e, neste caso, o pó das cascas do

caule é vendido em cápsulas (quantidade aproximada de 250 mg). As folhas são

comercializadas em feiras livres da cidade de Belém-PA para distúrbios do fígado e auxílio na

digestão, principalmente após ingestão de alimentação rica em gorduras. O pó das folhas é

vendido com indicação hepatoprotetora, para tratamento de diabetes e para dietas de

emagrecimento (COSTA et al., 2007).

Estudos fitoquímicos foram realizados com grandes quantidades de folhas e cascas do

caule (partes utilizadas na medicina popular) de árvores variando entre 1½-6 anos de idade,

buscando o isolamento de substâncias majoritárias que pudessem vir a ter representatividade

em testes biológicos, e mostraram que as cascas do caule são ricas em diterpenos do tipo

clerodano, tendo sido isolados: trans-desidrocrotonina (DCTN), trans-crotonina (CTN), cis-

cajucarina B, trans-cajucarina B, cajucarina A, cajucarinolida, isocajucarinolida,

isosacacarina e o triterpeno ácido acetilaleuritólico (AAA) (MACIEL et al., 1998; MACIEL

et al., 2003).

2.3.1.1 trans-Desidrocrotonina

Dentre os terpenóides isolados, a DCTN (Figura 2.10) foi o componente majoritário

isolado, com um rendimento incomum de 1,4%, em se tratando de produto natural. Este 19-

nor-clerodano mostrou correlação com grande parte das propriedades farmacológicas de

Croton cajucara, tendo sido comprovada as seguintes atividades: hipoglicêmica,

hipolipidêmica, antigenotóxica, antiulcerogênica, antiinflamatória e antinociceptiva,

antitumoral, antiestrogênica

e cardiovascular (COSTA et al., 2007).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 50

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Ácido acetilaleuritólico (AAA)

trans-desidrocrotonina (DCTN) trans-crotonina (CTN)

Figura 2.10 – Estrutura química da DCTN, CTN e AAA

2.3.1.2 Extratos da sacaca

Extratos de várias polaridades obtidos das folhas de Croton cajucara apresentaram

atividade anti-hiperlipidêmica (FARIAS et al., 1996), antiinflamatória e antinociceptiva

(CAMPOS et al., 2002). No entanto, apesar do seu perfil farmacológico, esses extratos

apresentaram baixa solubilidade nos solventes biológicos convencionais, dificultando sua

biodisponibilização (GOMES et al., 2007).

Além dos clerodanos, observou-se a presença de flavonóides (3,7,4'-tri-O-metilcanferol

e 3,7-di-O-metilcanferol) e esteróides (β-sitosterol, estigmasterol, 3-O-glicopiranosil-β-

sitosterol) em extratos polares de Croton cajucara (MACIEL et al., 2009). Estes compostos,

em especial os flavonóides, foram correlacionados com a propriedade antioxidante deste

Croton (MACIEL et al., 2009).

Estudos realizados com o extrato hexânico comprovaram que o óleo fixo apolar obtido

das cascas do caule de Croton cajucara possui propriedades antinociceptiva e antiinflamatória

(BIGHETTI et al., 1999), bem como atividade antifúngica frente a diversos patógenos

(SOUZA et al., 2006). Esta atividade biológica pode estar correlacionada à presença de

sesquiterpenos (espatulenol, 24%; α-copaeno, 20%; cipreno, 21%; linalol, 0,6%) e diterpenos

do tipo clerodano (trans-crotonina, cis-cajucarina B e trans-cajucarina B) presentes neste óleo

essencial (SOUZA et al., 2006).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 51

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

2.3.2 Phyllantus amarus Schum. & Thonn

Phyllanthus amarus Schum. & Tonn (Euphorbiaceae) é um arbusto que cresce de 30 a

60 cm, pertencente à família Euphorbiaceae, e pode ser encontrado em áreas tropicais e

subtropicais da América, Ásia e África (WRIGHT et al., 2007). No Brasil, esta espécie

também é conhecida como “quebra-pedra”, sendo empregada na medicina popular para o

tratamento de diversos distúrbios, tais como: disfunções renais, infecções intestinais, diabetes

e hepatite B (WRIGHT et al., 2007; KUMARAN e KARUNAKARAN, 2007; CALIXTO et

al., 1998), além de possuir propriedades anticâncer e antiinflamatória, frente a doenças que

tem como etiologia a ação de radicais livres (KUMARAN e KARUNAKARAN, 2007).

O estresse oxidativo, induzido pelo oxigênio radicalar, é considerado como uma das

principais causas de diversas doenças degenerativas como câncer, arteriosclerose, úlcera

gástrica, dentre outros (KUMARAN e KARUNAKARAN, 2007). Diversos produtos naturais,

como os polifenóis, taninos e flavonóides presentes em plantas do gênero Phyllanthus

(HARISH e SHIVANANDAPPA, 2006; FANG et al., 2008), apresentam atividade

antioxidante por serem capazes de doar um átomo de hidrogênio ou um elétron ao radical

livre.

2.3.3 Anacardium occidentale L.

A espécie Anacardium occidentale L. (Anarcadiaceae), popularmente conhecida como

caju, é nativa das regiões norte e nordeste do Brasil. A Amazônia parece ter sido o berço de

diferentes espécies do gênero Anacardium que se irradiou para o resto do mundo. E o

cajueiro, seu representante mais conhecido, é uma árvore rústica, nativa da zona arenosa

litorânea de campos e dunas, que vai do nordeste do país até o baixo Amazonas (SILVA e

TASSARA, 1996). Os indígenas de língua tupi, habitantes autóctones do nordeste do Brasil,

já conheciam muito bem o caju e faziam dele um de seus mais completos e importantes

alimentos (SILVA e TASSARA, 1996).

Muitos são os usos etnofarmacológicos associados ao caju, dentre eles encontram-se:

adstringente, antidiabético, anti-diarréico, anti-hemorrágico, antiinflamatório, anti-reumático,

antitérmico, antiulcerogênico, diurético e vermífugo, onde são utilizados cascas do caule,

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 52

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

casca da castanha, ramos, pendículos, raiz, folhas, frutos, semente e óleo (GONÇALVES et

al., 2005). Metabólitos especiais (ácidos anacárdicos, cardanóis, cardóis e fenóis alquílicos)

extraídos do líquido da castanha de caju de Anacardium occidentale apresentaram atividade

antioxidante (TREVISAN et al., 2006). Diversos metabólitos presentes nas plantas têm

apresentado atividade antioxidante, sendo cada vez mais reconhecidos como importantes

agentes na captura de radicais livres (cuja formação ocorre espontaneamente em diferentes

etapas do metabolismo, em que processos oxidativos estão envolvidos) que estão diretamente

relacionados ao processo de envelhecimento e às doenças degenerativas, dentre elas o câncer.

2.4 SIMULAÇÕES POR DINÂMICA MOLECULAR

Simulações computacionais são frequentemente utilizadas em diversos estudos com o

objetivo de compreender as propriedades de moléculas e agregados moleculares em termos

estruturais e interações microscópicas entre elas. Elas servem como um complemento aos

experimentos convencionais, permitindo compreender algo novo que dificilmente seria

descoberto utilizando os métodos convencionais atuais. São duas as principais de técnicas de

simulação computacional clássica: Dinâmica Molecular (MD) e Monte Carlo (MC).

Adicionalmente, existem várias técnicas híbridas que combinam características de ambas. As

técnicas de simulação computacional podem ainda atuar como ponte entre a dimensão e a

escala de tempo microscópicos e o mundo macroscópico dos experimentos laboratoriais.

Pode-se assim prever interações moleculares e obter predições “exatas” acerca das

propriedades de uma solução, por exemplo. Por fim, os métodos computacionais podem

também realizar simulações que seriam difíceis ou impraticáveis em laboratório, como os

experimentos que devem ser realizados a altíssima pressão e/ou temperatura.

A simulação por Dinâmica Molecular (MD, do inglês Molecular Dynamics) constitui

em uma das principais ferramentas computacionais para o estudo de sistemas atômico-

moleculares, para os quais os efeitos de temperatura não podem ser desconsiderados. Nesta

categoria estão incluídos os sistemas físicos, químicos e biológicos constituídos por um

grande conjunto de átomos ou moléculas (aproximadamente 10

partículas), cujas

propriedades são governadas por processos que envolvem energias da ordem de k

T, onde k

é a constante de Boltzmann e T é a temperatura em Kelvin.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 53

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Em termos simplificados, a Dinâmica Molecular é uma técnica computacional em que

se determinam os movimentos das partículas de qualquer sistema, do qual se conhecem o

potencial de interação entre estas partículas e as equações que regem seu movimento. A

Dinâmica Molecular permite, portanto, estudar a evolução temporal das configurações dos

constituintes do sistema e, a partir das sequências de posições geradas, determinar as

propriedades macroscópicas do sistema, conforme os princípios fundamentais da Mecânica

Estatística. Neste método, partículas interagentes, inicialmente dispostas em uma determinada

configuração, movimentam-se sob a influência de potenciais intermoleculares. Conhecendo

posições e velocidades de todas as partículas em um determinado instante t

, pode-se

computar as forças resultantes em cada partícula, devido às interações com as demais e então

determinar posições e velocidades em um instante superior t

+ δt, através das equações de

movimento Newtonianas. As novas posições são utilizadas para o cômputo de novas forças e

daí posições e velocidades em t

+ 2·δt. Este procedimento é realizado sucessivamente

gerando trajetórias moleculares para todo o sistema.

O número de partículas que compõem o sistema a ser simulado depende da natureza do

próprio sistema, das propriedades que se deseja estudar e da capacidade computacional

disponível, mas deve, sobretudo, ser representativo do sistema macroscópico real. Sistemas

contendo 10

–10

átomos podem ser estudados com os métodos e recursos computacionais

atuais (MORGON e COUTINHO, 2007). As propriedades de equilíbrio do sistema em estudo

são determinadas a partir de médias temporais sobre um intervalo de tempo suficientemente

grande na escala atômica (aproximadamente entre 10

-11

a 10

-8

segundo de tempo real). O

tempo total de simulação depende dos processos dinâmicos que se deseja investigar e da

convergência estatística das propriedades de interesse.

Uma característica marcante do método MD é o estabelecimento de forte sinergia com

estudos experimentais. Os resultados das investigações experimentais geralmente motivam e

guiam os estudos de MD. Os resultados obtidos por dinâmica, por sua vez, fornecem

explicações detalhadas a nível microscópico dos fenômenos observados experimentalmente.

Outra característica importante é a diversidade de sistemas tratáveis por esta metodologia.

Podem ser estudados por MD desde sistemas homogêneos como gases, fluidos supercríticos,

líquidos, soluções e misturas, a sistemas pouco (ou nada) homogêneos como interfaces, filmes

de Langmuir-Blodgett, biomembranas, polímeros orgânicos e inorgânicos, polissacarídeos,

lipídeos, proteínas, ácidos nucléicos e seus complexos, passando por sistemas como micelas,

zeólitas, argilas e nanomateriais (MORGON e COUTINHO, 2007).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 54

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

2.4.1 Interações moleculares

A técnica de simulação por Dinâmica Molecular consiste basicamente na resolução,

passo a passo, das equações de movimento, que para um sistema atômico simples pode ser

escrita como:

(4)

As forças F, atuando sobre os átomos, podem ser calculadas derivando a energia

potencial E(r

), onde r

= (r

, r

, ..., r

) representa o conjunto completo de 6N coordenadas

atômicas, em que N é o número de átomos do sistema.

O estado de um sistema clássico pode ser completamente descrito especificando as

posições e momento lineares de todas as partículas. O espaço sendo tridimensional, cada

partícula está associada a 6 coordenadas. Um sistema de N partículas é caracterizado por 6N

coordenadas. O espaço dimensional 6N, definido por estas coordenadas é chamado de espaço-

fase do sistema.

As simulações MD clássicas são, na maioria das vezes, aplicadas a sistemas onde se

consideram interações clássicas. Com o objetivo de viabilizar o cálculo, os métodos MD

negligenciam os efeitos quânticos, gerando um erro intrínseco associado a essa aproximação.

Para esta finalidade, o sistema em estudo deve estar em estados nos quais os efeitos quânticos

possam ser desprezados, ou seja, estados nos quais as energias e as massas consideradas são

muito maiores que as envolvidas em efeitos nos quais as energias são transferidas em

quantidades discretas e não contínuas. Os potenciais efetivos clássicos de interações

moleculares (campos de força) são normalmente derivados de cálculos quânticos e

posteriormente ajustados através de métodos empíricos bem controlados de maneira a

representarem adequadamente as interações entre os constituintes em uma dada faixa de

condições termodinâmicas.

Os potenciais utilizados nas simulações MD clássicas são aproximações ou

representações clássicas de potenciais quânticos. Isto é, nenhum efeito quântico é

considerado. Isto quer dizer que nas simulações MD clássicas, nenhuma ligação química é

rompida, não há interações entre orbitais e não há ressonância, por exemplo. Diversos tipos de

potenciais analíticos podem ser usados para representar as interações entre as partículas, que

devem ser escolhidos para cada tipo de interação, procurando a melhor representação da curva

de energia potencial verdadeira, de acordo com os recursos computacionais disponíveis e com

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 55

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

o tipo de fenômeno observado. Estes potenciais analíticos poderiam ser usados para propagar

a trajetória dos núcleos tanto quanticamente, de acordo com a equação de Schrödinger

dependente do tempo, como classicamente, pelas equações de Newton. O cálculo das

trajetórias usando a mecânica clássica é, evidentemente, muito mais rápido, pois a interação

entre as partículas é analisada apenas pela carga atômica, enquanto que nos métodos MD

quanto-mecânicos a interação entre as partículas é analisada eletronicamente. Para o estudo de

propriedades dinâmicas de biomoléculas e certos agregados moleculares, à temperatura

ambiente, utilizando o método MD clássico existe um erro intrínseco, mas que pode ser pouco

relevante dependendo da análise feita (MORGON e COUTINHO, 2007).

2.4.2 Campos de força e parametrização

No contexto da mecânica molecular, um campo de força consiste em um conjunto de

funcionais e parâmetros utilizados para descrever a energia potencial de um conjunto de

partículas e que são derivados de trabalhos experimentais e de cálculos quânticos. Um campo

de força pode fornecer parâmetros para cada átomo em um sistema (all-atom force field),

incluindo o hidrogênio, ou tratar átomos de carbono e hidrogênio, em grupos metil ou

metilênicos por exemplo, como um único centro de interação (united-atom force field ou

coarse-grained force field). Este último tipo de campo de força é frequentemente utilizado em

longas simulações envolvendo proteínas e outras macromoléculas, em que se pode aumentar a

eficiência computacional simplificando o sistema estudado com apenas poucas perdas de

informações.

Os funcionais de um campo de força englobam tanto os termos ligados, referentes aos

átomos que estão ligados por ligações covalentes, quanto os termos não-ligados que

descrevem as interações eletrostáticas e de van der Waals de longo alcance. A decomposição

específica destes termos depende do campo de força, mas uma forma geral da energia

potencial total (E

total

) calculada por um campo de força genérico pode ser descrito como:

total

= E

ligados

+ E

não-ligados

, (5)

onde a energia dos componentes ligados e não ligados podem ser dados pelas equações:

ligados

= E

ligação

+ E

angular

+ E

torsional

, e (6)

não-ligados

= E

eletrostática

+ E

Lennard-Jones

(7)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 56

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Os termos E

ligação

e E

angular

correspondem, respectivamente, aos estiramentos de uma

ligação química e às descrições das deformações angulares, e são geralmente modelados

como osciladores harmônicos, não permitindo a quebra da ligação. O termo E

torsional

corresponde às deformações dos ângulos diedro. O termo não ligado E

Lennard-Jones

refere-se às

interações intermoleculares de van der Waals computadas em termos do potencial de

Lennard-Jones, enquanto que o termo eletrostático E

eletrostática

obedece a lei de Coulomb.

Além dos funcionais, um campo de força deve definir um conjunto de parâmetros para

cada tipo de átomo. Como exemplo, um campo de força deve incluir parâmetros distintos para

átomos de oxigênio de um grupo carbonila e de um grupo hidroxila. Um conjunto de

parâmetros típico inclui valores para a massa atômica, raio de van der Waals e carga parcial

para cada átomo individualmente, e valores de equilíbrio para comprimento de ligação,

ângulos de ligação e diedros. Geralmente, os parâmetros não são transferíveis entre campos de

força devido à utilização de diferentes funcionais de interação, e devido à existência de

correlações entre os parâmetros em cada campo de força. Pelo fato de usarem moléculas e

protocolos diferentes em suas parametrizações, pode acontecer de dois campos de força

possuírem parâmetros diferentes e serem igualmente precisos na descrição de determinadas

propriedades de um mesmo sistema.

Atualmente, existem diversos tipos de campos de força, cada qual projetado para

diferentes finalidades. Dentre eles, os mais usados são o AMBER (CASE et al., 2006),

CHARMM (MACKERELL JR. et al., 1998), GROMACS (LINDAHL et al., 2001) e OPLS

(JORGENSEN et al., 1996).

2.4.3 Etapas da simulação MD

Para a simulação de partículas através do método de Dinâmica Molecular são

necessárias algumas técnicas específicas para cada etapa do processo de descrição das

posições e velocidade das partículas a cada instante. Geralmente, estas etapas incluem: (i) a

geração inicial das moléculas; (ii) o cálculo das forças exercidas sobre cada partícula, devido

às interações intermoleculares; (iii) a movimentação das partículas; (iv) a escolha de

ensembles e controles de simulação; e (v) a análise ou armazenamento das configurações

(trajetórias) (MORGON e COUTINHO, 2007).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 57

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Inicialmente é criada uma caixa de simulação, que pode adotar a configuração cúbica,

ortorrômbica, octaédrica ou outra geometria, onde se encerram as N moléculas do sistema. As

dimensões desta caixa são escolhidas de modo que a densidade numérica, N/V, corresponda

àquela do sistema real nas condições termodinâmicas estudadas. A posição inicial das

moléculas na caixa de simulação pode ser feita de forma aleatória ou em configurações

específicas. No entanto, para evitar que eventuais maus-contatos entre moléculas prejudiquem

os primeiros passos de uma simulação, a maioria dos programas de simulação MD requerem

uma reacomodação das moléculas na caixa de simulação, que é realizada através de uma etapa

de minimização da energia de interação entre as moléculas (MORGON e COUTINHO, 2007).

Apesar de atualmente dispormos de recursos computacionais para estudarmos sistemas

com até cerca de 10

partículas, o método MD pode usar condições de fronteira para que os

resultados obtidos possam ser extrapolados para um sistema real de partículas

(aproximadamente 10

partículas). Assim, impõem-se condições periódicas de contorno à

caixa MD, imaginando que ela está rodeadas por imagens dela própria, preenchendo todo o

espaço tridimensional. As partículas-imagem em cada caixa-imagem terão precisamente as

mesmas posições relativas e as mesmas velocidades do que as partículas na caixa MD, como

ilustrado na Figura 2.11.

Figura 2.11 – Exemplo de uma caixa MD, a sua transição e condições de fronteira a duas dimensões

Uma dada partícula, em princípio, deve interagir com todas as demais partículas do

sistema, bem como suas imagens e mesmo com as imagens dela própria, com exceção dela

mesma. Isto tornaria o cálculo extremamente oneroso. Na prática, a caixa de simulação é

gerada grande o bastante para que cada átomo só interaja com as imagens mais próximas.

Quando as interações entre as moléculas forem de curto alcance, isto é, quando puderem ser

desprezadas após uma distância pré-determinada (aproximadamente 3 diâmetros

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 58

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

moleculares), chamada de distância ou raio de corte ou truncamento, r

, os cálculos das forças

e energia são realizados de acordo com a aproximação da imagem mais próxima com

truncamento: dada uma partícula d, a caixa sofre uma translação de modo a ficar centrada em

d (Figura 2.11). Então a partícula d somente atua explicitamente com as partículas ou imagens

que se encontrem dentro do raio de corte, r

, centrado na partícula d. A distância r

deve ser

igual ou menor do que metade do lado da caixa MD. Após a distância r

, assume-se uma

distribuição uniforme de partículas e aplicam-se correções de longo alcance que podem ser

calculadas analiticamente.

A densidade do sistema é mantida, assumindo que se uma partícula sair da caixa MD

atravessando uma das paredes, uma das partículas-imagem entra pela parede oposta com a

mesma velocidade. Deste modo, o método de Dinâmica Molecular mantém o volume V e o

número de moléculas constantes. Por outro lado, uma vez que as posições e velocidades

iniciais estejam atribuídas, a energia total do sistema fica definida como o somatório das

energias cinética e potencial para cada partícula. Como o sistema evolui no tempo sem

interferências externas, então a energia total conserva-se ao longo da trajetória no espaço

físico. De acordo com a Mecânica Estatística, a média temporal de qualquer propriedade

sobre aquela trajetória deve ser equivalente à média de ensemble microcanônico. Ou seja, as

médias de ensemble microcanônico podem ser obtidas a partir de uma trajetória de Dinâmica

Molecular. Como a energia total, volume e número de moléculas se mantêm constantes,

propriedades como a temperatura e a pressão, por exemplo, flutuam ao longo da trajetória. O

sistema alcançará o equilíbrio quando as médias das propriedades flutuantes forem constantes

no tempo.

2.4.3.1 Ensembles

Durante a simulação, alguns parâmetros macroscópicos podem ser mantidos constantes

em conjuntos como NpT, NVT ou NVE, onde N é o número de partículas no sistema, p a

pressão, V o volume, T a temperatura e E a energia. Estes conjuntos de parâmetros

caracterizam ensembles (conjuntos) diferentes e definem uma equação de estado para o

sistema, de modo a permitir que diferentes funções termodinâmicas possam ser mais

convenientemente calculadas em um ou outro ensemble. Um ensemble é um grande conjunto

de réplicas de um sistema de interesse que diferem entre si nas atribuições das coordenadas e

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 59

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

do momento das partículas. Assim, cada réplica ocupa uma região do espaço de fases. Se o

sistema for ergódico (isto é, depois de um tempo suficientemente grande cada réplica do

sistema tiver passado por todas as regiões do espaço de fases, onde a densidade de

probabilidade não é nula), a média temporal, da qual as funções termodinâmicas são

definidas, pode ser mais convenientemente, segundo Gibbs, substituídas por médias de

ensemble (MORGON e COUTINHO, 2007).

Equações de movimento diferentes geram sucessões de estados de acordo com o

ensemble empregado. As equações de movimento de Newton, especificamente, geram estados

com energias constantes e, se o sistema em estudo estiver livre de qualquer campo externo,

podem ser aplicadas as equações de Newton de maneira muito simples, para a obtenção das

trajetórias determinadas por estados do ensemble microcanônico (NVE). Na prática, uma dada

propriedade termodinâmica será obtida computando-se médias sobre todas as configurações

do sistema definidas pelas trajetórias de MD.

Estado da Arte

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 61

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

3 ESTADO DA ARTE

Neste capítulo é apresentado um breve resumo dos estudos encontrados na literatura a

respeito de sistemas microemulsionados aplicados à veiculação de fármacos (seção 3.1), das

propriedades biológicas dos produtos e extratos vegetais utilizados neste trabalho (seção 3.2)

e de estudos de simulação por Dinâmica Molecular realizadas com micelas formadas por

tensoativos à base de açúcares (seção 3.3).

3.1 MICROEMULSÕES COMO VEÍCULOS DE FÁRMACOS

Na farmacologia, as microemulsões têm sido bastante utilizadas na preparação de

nanopartículas poliméricas (LÓPEZ-QUINTELA, 2003), bem como em sistemas de liberação

de fármacos nas mais diversas vias de administração. Um exemplo significativo é a

formulação comercial de uso oral Sandimmune Neoral®, em que o fármaco ciclosporina A,

um undecapeptídeo cíclico imunossupressante, utilizado no combate à rejeição de órgãos de

pacientes transplantados, foi incorporado em uma microemulsão pré-concentrada contendo

Labrafil, azeite de oliva, etanol e outros excipientes (STRICKLEY, 2004).

Em um contexto geral, fármacos de diversas classes têm sido incorporados em sistemas

microemulsionados para as diversas vias de administração, objetivando variadas aplicações

farmacológicas, tais como: aumentar a biodisponibilidade do fármaco, reduzir sua toxicidade

e/ou manter sua concentração plasmática constante. A aplicação pela via oral de

microemulsões, por exemplo, é bastante comum para agentes antitumorais (KANG et al.,

2004; YANG et al., 2004) devido à grande capacidade de solubilização desses sistemas. Para

os antibióticos, a incorporação em microemulsões para uso parenteral é preferencial (HU et

al., 2001; MORENO et al., 2001; BRIME et al., 2004), no sentido de se manter a sua

concentração plasmática constante e diminuir seus efeitos adversos. Por fim, microemulsões

de uso transdérmico têm sido amplamente utilizadas para a veiculação de agentes

antiinflamatórios (ESCRIBANO et al., 2003; DALMORA et al., 2001; MEI et al., 2003) e

anestésicos (KREILGAARD et al., 2001; AREVALO et al., 2004). No primeiro caso, as

microemulsões de uso tópico podem evitar o surgimento de efeitos adversos gastrintestinais, e

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 62

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

no segundo, podem aumentar a absorção dos agentes anestésicos, produzindo um efeito mais

imediato.

3.1.1 Administração oral de microemulsões

A via oral é a rota preferencial para a veiculação da maioria dos agentes terapêuticos, já

que evita a dor e o risco de infecção associados à via parenteral, além de apresentar maior

aceitação por parte do paciente. No entanto, a veiculação oral de fármacos lipofílicos é

prejudicada devido à baixa solubilidade em água desses agentes, o que acarreta em uma

biodisponibilidade oral bastante reduzida. A via oral também representa um grande obstáculo

para os fármacos peptídicos devido a certas barreiras enzimáticas e físicas do trato

gastrintestinal (SARCIAUX et al., 1995).

A biodisponibilidade está relacionada com a quantidade de fármaco que alcança a

circulação sistêmica em comparação com a dose administrada, sendo clinicamente importante

porque os efeitos farmacológicos e toxicológicos de um fármaco são proporcionais tanto à

dose quanto à própria biodisponibilidade. Quando a biodisponibilidade é muito baixa, como

no caso da maioria dos peptídeos, a sua variação se torna mais abrangente, ocasionando

dificuldades no controle da concentração do fármaco e dos efeitos produzidos por ele. Além

disso, se a biodisponibilidade oral de um fármaco é de cerca de 10%, significa que 90% da

dose administrada é perdida. Para fármacos de elevado custo, esta situação pode ser

inaceitável.

A Organização Mundial de Saúde (OMS) divide os fármacos de uso oral em quatro

classes: cerca de 34% dos fármacos comerciais pertencem à classe I (alta solubilidade aquosa;

alta permeabilidade pelo trato gastrintestinal), 17% à classe II (baixa solubilidade; alta

permeabilidade), 39% à classe III (alta solubilidade; baixa permeabilidade), e 10% à classe IV

(baixa solubilidade; baixa permeabilidade) (LINDENBERG et al., 2004). Regra geral, os

sistemas microemulsionados são mais empregados na veiculação oral de fármacos lipofílicos

(classes II e IV). Isso porque fármacos lipofílicos necessitam atravessar o meio aquoso antes

de alcançar os tecidos-alvos, e esta etapa geralmente é a responsável pela sua baixa

biodisponibilidade devido à sua pouca solubilidade em água. Dessa forma, sistemas

microemulsionados permitem que tais fármacos estejam distribuídos no interior das três fases

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 63

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

(fase dispersa, fase contínua ou dispersante, e camada interfacial de tensoativo), minimizando

a sua precipitação e garantindo, assim, o aumento da sua biodisponibilidade.

Vários métodos foram desenvolvidos na tentativa de otimizar a biodisponibilização oral

de determinados fármacos, dentre eles o uso de sistemas de liberação controlada de fármacos.

Nesse contexto, as microemulsões se apresentam como bons veículos de liberação oral, pois

apresentam ampla capacidade de solubilização de fármacos pouco solúveis em água (YANG

et al., 2004) ou ainda, evitando a sua degradação enzimática (LYONS et al., 2000).

Entretanto, uma microemulsão pode ser diluída em contato com um meio fisiológico,

podendo resultar na formação de outras microestruturas a partir da quebra da microemulsão.

De fato, a diluição de uma microemulsão acarreta em um aumento do volume de água na sua

composição, e microemulsões do tipo A/O podem ser invertidas, transformando-se em

microemulsões múltiplas ou do tipo O/A. Além disso, a diluição de uma microemulsão pode

provocar ainda sua desestabilização devido à migração de moléculas do cotensoativo do filme

interfacial para a fase aquosa externa.

Com o intuito de minimizar estas desvantagens foram desenvolvidos sistemas de

liberação de fármacos auto-microemulsificantes (Self-microemulsifying drug delivery systems

– SMEDDS). Esses sistemas são constituídos de uma mistura isotrópica de tensoativos(s),

cotensoativo, óleo e o fármaco, que pode ser dispersa no trato gastrintestinal gerando, após

leve agitação, microemulsões do tipo O/A com tamanho inferior a 100 nm (POUTON, 1997).

Geralmente, a própria mobilidade digestiva do estômago e do intestino já gera uma agitação

suficiente para auto-microemulsificação in vivo. Os SMEDDS são compostos principalmente

por óleos e/ou tensoativos de natureza lipídica (GERSHANIK e BENITA, 2000; HU et al.,

2001), já que as microemulsões com componentes lipídicos apresentam a capacidade de

aumentar a liberação do fármaco (KIM et al., 2000) e de minimizarem possíveis variações na

sua absorção (SUBRAMANIAN et al., 2004), uma vez que este tipo de tensoativo é

facilmente hidrolisado no intestino delgado por enzimas do pâncreas (ARAYA et al., 2006).

A utilização dos sistemas auto-microemulsificantes tem recebido bastante atenção (Tabela

3.1) após o sucesso comercial de formulações contendo a ciclosporina A (comercializada com

o nome de Sandimmune Neoral®), e dois inibidores da protease do HIV, o saquinavir

(Fortovase®) e o ritonavir (Norvir®) (STRICKLEY, 2004).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 64

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tabela 3.1 – Fármacos microemulsionados para administração oral

Fármaco Estudos Referência

Flurbiprofeno Caracterização físico-química (LI et al., 2005)

Ibuprofeno Farmacocinético (ARAYA et al., 2006)

Celecoxibe

Farmacocinético

(SUBRAMANIAN et al.,

2004)

Caracterização físico-química (GARTI et al., 2006)

Paclitaxel

Citotóxico (MCF7)

Antitumoral in vivo (SKOV-3)

(KANG et al., 2004)

Farmacocinético (YANG et al., 2004)

Citotóxico (HTB37) (GURSOY et al., 2003)

Caracterização físico-química (LEE et al., 2008)

Farmacocinético (GAO et al., 2003)

Halofantrina

Farmacocinético (KHOO et al., 1998)

Farmacocinético (HOLM et al., 2003)

Nitrendipina Farmacocinético (KAWAKAMI et al., 2002)

Bifenil dimetil

dicarboxilato (BDD)

Farmacocinético (KIM et al., 2001)

Danazol Farmacocinético (PORTER et al., 2004)

Idebenona Caracterização físico-química (KIM et al., 2000)

Simvastatina Farmacocinético (KANG et al., 2004)

Silimarina

Farmacocinético (WU et al., 2006)

Farmacocinético (WOO et al., 2007)

Seocalcitol

Farmacocinético (GROVE et al., 2006)

Farmacocinético (GROVE et al., 2007)

Leuprolida

Supressão gonadotrópica in vivo

Farmacocinético

(ZHENG e FULU, 2006)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 65

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Xibornol Toxicológico (CIRRI et al., 2007)

Fenofibrato Antilipidêmico in vivo (PATEL e VAVIA, 2007)

Itraconazol Farmacocinético (WOO et al., 2008)

Vinpocetina Farmacocinético (CHEN et al., 2008)

Docetaxel Farmacocinético (YIN et al., 2009)

Arteméter Antimalárico in vivo

(MANDAWGADE et al.,

2008)

Oridonina

Farmacocinético (ZHANG et al., 2008)

Caracterização físico-química (LIU et al., 2009)

9-nitro-camptotecina

Farmacocinético

Citotóxico

Antitumoral in vivo (SKOV-3)

(LU et al., 2008)

Exemestano Caracterização físico-química (SINGH et al., 2008)

Curcumina Farmacocinético (CUI et al., 2009)

Nimodipina Farmacocinético (YI et al., 2008)

Tacrolimo Caracterização físico-química (BORHADE et al., 2008)

Prostaglandina E1 Disfunção erétil in vivo (LEE et al., 2008)

N-acetilglicosaminil-N-

acetilmuaramil dipeptídeo

Farmacocinético (LYONS et al., 2000)

Derivados da heparina Farmacocinético (KIM et al., 2005)

3.1.2 Administração parenteral de microemulsões

A via parenteral é bastante utilizada quando se deseja um efeito farmacológico

imediato, já que o fármaco é administrado diretamente na corrente sanguínea, estando ele

completamente biodisponível. No entanto, a administração parenteral de fármacos lipofílicos,

especialmente pela via intravenosa, é um grave problema para a indústria farmacêutica, visto

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 66

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

que soluções oleosas e agregados relativamente grandes podem causar embolia (VON

CORSWANT et al., 1998; PARK et al., 1999).

As microemulsões do tipo O/A são capazes de solubilizar fármacos pouco solúveis no

interior hidrofóbico de microestruturas cujo meio dispersante é a água, e dessa forma, têm

sido estudadas como sistemas capazes de administrar parenteralmente fármacos lipofílicos

(Tabela 3.2), principalmente aqueles que apresentam baixa biodisponibilidade oral (VON

CORSWANT et al., 1998; PARK e KIM, 1999; HWANG et al., 2004). Mais do que em

qualquer outra aplicação, o uso de microemulsões para a liberação parenteral de fármacos

requer alguns cuidados com relação à toxicidade dos componentes (MORENO et al., 2003;

VON CORSWANT et al., 1998), ao controle do tamanho das gotículas (a fim de se evitar a

percolação) (PARK et al., 1999) e à esterilização da formulação. Com relação a este último,

apesar das microemulsões não poderem ser autoclavadas, elas podem ser facilmente

esterilizadas por filtração (JUNPING et al., 2003).

Tabela 3.2 – Fármacos microemulsionados para administração parenteral

Fármaco Estudos Referência

Gentamicina Farmacocinético (HU et al., 2001)

Anfotericina B

Caracterização físico-química

Toxicológico

(MORENO et al., 2001)

Antifúngico in vivo (BRIME et al., 2004)

Farmacocinético (BRIME et al., 2003)

Caracterização físico-química

Toxicológico

(BRIME et al., 2002)

Flurbiprofeno

Farmacocinético (PARK e KIM, 1999)

Farmacocinético (PARK et al., 1999)

Paclitaxel

Farmacocinético

Citotóxico (H292)

Antitumoral in vivo (B16)

Toxicológico

(RODRIGUES et al., 2005)

Farmacocinético

Hipersensibilidade

(HE et al., 2003)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 67

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Vincristina

Farmacocinético

Antitumoral in vivo (M5076)

Toxicológico

(JUNPING et al., 2003)

Etoposida Farmacocinético (AZEVEDO et al., 2005)

Ácido retinóico

Farmacocinético

Citotóxico (HL60 e MCF7)

(HWANG et al., 2004)

Norcantaridina Farmacocinético (ZHANG et al., 2005)

Felodipina

Caracterização físico-química

Toxicológico

(VON CORSWANT et al.,

1998)

3.1.3 Administração transdérmica de microemulsões

A via transdérmica oferece várias vantagens quando comparada com outras vias de

administração mais tradicionais. A administração transdérmica de um fármaco permite, por

exemplo, que ele alcance a circulação sistêmica sem sofrer o efeito de primeira passagem no

fígado, o que é muito útil para fármacos que apresentam intenso metabolismo hepático. Além

disso, a via transdérmica permite uma liberação mais gradual e controlada do fármaco,

evitando o surgimento de picos plasmáticos que podem estar associados a efeitos adversos.

Outras vantagens incluem a fácil administração de uma formulação transdérmica e a

possibilidade da imediata suspensão do tratamento, quando necessário (KREILGAARD,

2002; HEUSCHKEL et al., 2008).

No entanto, apesar das vantagens da administração transdérmica, poucos fármacos estão

disponíveis comercialmente como formulações tópicas. A principal limitação se encontra na

própria pele, e mais especificadamente na stratum corneum, que é considerada como um dos

mais impermeáveis epitélios do corpo humano para substâncias exógenas. Dessa forma, o

principal desafio das formulações tópicas atualmente é permitir um aumento substancial da

permeação dérmica do fármaco sem induzir alterações irreversíveis na permeabilidade da pele

(KREILGAARD, 2002).

As microemulsões têm sido bastante estudadas como formulações tópicas tanto para

moléculas hidrofílicas quanto lipofílicas, das mais variadas classes de fármacos (Tabela 3.3).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 68

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

De fato, determinadas características das microemulsões contribuem para uma eficiente

administração transdérmica. A primeira delas é a grande quantidade de fármaco que pode ser

incorporada na formulação devido à sua alta capacidade de solubilização, aumentando assim,

o gradiente de concentração frente à pele (HUA et al., 2004). Outro aspecto é o controle do

coeficiente de partição do fármaco no interior da microemulsão e entre a microemulsão e a

pele, que pode ser regulado mudando-se a composição e/ou os constituintes da microemulsão

(CHANGEZ et al., 2006). Por fim, os tensoativos, em especial as lecitinas, e certos óleos,

principalmente os ácidos graxos, como o ácido oléico, e seus ésteres como o miristato de

isopropila, utilizados como componentes de microemulsões, podem reduzir a barreira

funcional da stratum corneum e atuar como promotores de permeação dérmica (CHANGEZ

et al., 2006; ESCRIBANO et al., 2003), através da modificação do nível de hidratação da

stratum corneum (HUA et al., 2004), ou da perturbação da bicamada lipídica da pele

(SINTOV e BOTNER, 2006).

A estrutura das microemulsões também desempenha um papel fundamental na

veiculação transdérmica de substâncias bioativas. Para fármacos hidrossolúveis, por exemplo,

as microemulsões do tipo O/A são preferíveis devido à maior capacidade de solubilização de

compostos hidrofílicos e do efeito de hidratação da pele (LEE et al., 2003). Geralmente, o

inverso é observado para fármacos lipofílicos, onde as microemulsões do tipo A/O e

bicontínuas são bastante utilizadas. Por outro lado, hidrogéis e organogéis de microemulsão

vêm sendo amplamente estudados como veículos para a liberação transdérmica de fármacos

(ALVAREZ-FIGUEROA e BLANCO-MÉNDEZ, 2001; DREHER et al., 1997;

ABOOFAZELI et al., 2002).

Tabela 3.3 – Fármacos microemulsionados para administração transdérmica

Fármaco Estudos Referência

Diclofenaco

Permeação in vitro

Antiinflamatório in vivo

Irritabilidade

(ESCRIBANO et al., 2003)

Permeação in vitro

Farmacocinético

(SINTOV e BOTNER, 2006)

Permeação in vitro (KANTARCI et al., 2005)

Permeação in vitro (KWEON et al., 2004)

Diclofenaco e indometacina Permeação in vitro (DREHER et al., 1997)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 69

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Aceclofenaco

Permeação in vitro

Antiinflamatório in vivo

(YANG et al., 2002)

Permeação in vitro (LEE et al., 2005)

Cetoprofeno

Permeação in vitro

Irritabilidade

(PAOLINO et al., 2002)

Permeação in vitro (RHEE et al., 2001)

Ibuprofeno Permeação in vitro (CHEN et al., 2006)

Piroxicam

Permeação in vitro (PARK et al., 2005)

Antiinflamatório in vivo (DALMORA et al., 2001)

Triptolida

Permeação in vitro

Irritabilidade

(CHEN et al., 2004)

Permeação in vitro

Antiinflamatório in vivo

(MEI et al., 2003)

Rofecoxibe

Permeação in vitro

Antiinflamatório in vivo

(DESAI, 2004)

Ácido niflúmico Antiinflamatório in vivo (BOLZINGER et al., 1998)

Ácido ascórbico e derivados

Antioxidante in vitro (JURKOVIC et al., 2003)

Antioxidante in vitro (JURKOVIC et al., 2004)

Metotrexato

Permeação in vitro (TROTTA et al., 1996)

Permeação in vitro

(ALVAREZ-FIGUEROA e

BLANCO-MÉNDEZ, 2001)

Vinpocetina

Permeação in vitro

Irritabilidade

(HUA et al., 2004)

5-fluorouracila

Permeação in vitro

Irritabilidade

(GUPTA et al., 2005)

Difenidramina Permeação in vitro (SCHMALFUB et al., 1997)

Estradiol Permeação in vitro (PELTOLA et al., 2003)

Lidocaína e prilocaína

Permeação in vitro (KREILGAARD et al., 2000)

Farmacocinético (KREILGAARD, 2001)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 70

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Lidocaína

Farmacocinético

Permeação in vitro

(SINTOV e SHAPIRO, 2004)

Farmacocinético

Anestésico in vivo

(KREILGAARD et al., 2001)

Permeação in vitro

(SINTOV e BRANDYS-SITTON,

2006)

Ametocaína

Analgésico in vivo (AREVALO et al., 2004)

Analgésico in vivo

Permeação in vitro

(ESCRIBANO et al., 2005)

Tetracaína

Farmacocinético

Analgésico in vivo

Irritabilidade

(CHANGEZ et al., 2006)

Permeação in vitro (CHANGEZ et al., 2006)

Metoxsaleno Permeação in vitro (BAROLI et al., 2000)

Indometacina Permeação in vitro (EL MAGHRABY, 2010)

Nicardipina Permeação in vitro (ABOOFAZELI et al., 2002)

Nifedipina

Permeação in vitro (BOLTRI et al., 1994)

Permeação in vitro (THACHARODI e RAO, 1994)

3.1.4 Administração ocular de microemulsões

A administração de fármacos pela via ocular é bastante utilizada quando se deseja um

efeito farmacológico tópico, isto é, restrito ao local de aplicação da dose, evitando assim, que

o fármaco seja distribuído pela circulação sistêmica. No entanto, a aplicação oftálmica

apresenta algumas desvantagens, principalmente com relação à baixa biodisponibilidade (1-

10%) dos fármacos, que se deve à sua absorção dificultada pela córnea, ocasionada pela

drenagem lacrimal (VANDAMME, 2002).

As microemulsões têm sido alvo de constante estudo, objetivando otimizar o potencial

oftalmológico de diversas substâncias bioativas (Tabela 3.4). Geralmente, as microemulsões

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 71

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

de uso ocular são do tipo O/A, pois tal tipo de microestrutura presente permite a dissolução de

fármacos lipofílicos na camada interfacial ou na fase oleosa interna, promovendo a liberação

controlada do fármaco incorporado (HASSE e KEIPERT, 1997) e o aumento de sua

estabilidade físico-química (LV et al., 2005). Adicionalmente, as microemulsões não

provocam prejuízos temporários à visão do paciente, tendo em vista que são sistemas

opticamente isotrópicos (HASSE e KEIPERT, 1997). Microemulsões do tipo A/O voltadas

para aplicação ocular também têm sido estudadas devido às possíveis diluições e transições de

fase que podem ocorrer no olho após a sua aplicação (ALANY et al., 2006).

A toxicidade das microemulsões de uso oftálmico deve ser levada em consideração a

fim de se evitar possíveis danos à córnea e à retina. O uso de tensoativos e cotensoativos com

toxicidade mínima é altamente recomendado. Dentre os tensoativos mais utilizados estão os

polissorbatos, poloxâmeros e lecitinas (VANDAMME, 2002), e dentre os alcoóis utilizados

como cotensoativo, aquele que apresenta menor toxicidade é o etanol (ALANY et al., 2006),

apesar de o propilenoglicol ser bastante utilizado (HASSE e KEIPERT, 1997; RICHTER e

KEIPERT, 2004). Em 2006, LV et al. (2006) reportaram a obtenção de microemulsões livres

de cotensoativo contendo uma mistura dos tensoativos Tween 20 e Span 20 para a aplicação

ocular do cloranfenicol.

Tabela 3.4 – Fármacos microemulsionados para outras vias de administração

Fármaco Estudos Referência

Intranasal

Diazepam Farmacocinético (LI et al., 2002)

Clonazepam Farmacocinético (VYAS et al., 2006)

Zolmitriptano Farmacocinético (VYAS et al., 2005)

Nimodipina

Farmacocinético

Toxicológico

(ZHANG et al., 2004)

Sumatriptano

Caracterização físico-química

Farmacocinético

(VYAS et al., 2006)

Intranasal e ocular

Androstenediona Permeação in vitro (RICHTER e KEIPERT, 2004)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 72

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Ocular

Cloranfenicol

Caracterização físico-química (LV et al., 2005)

Caracterização físico-química (LV et al., 2006)

Prilocarpina

Miótica in vivo

Biocompatibilidade

(HASSE e KEIPERT, 1997)

Subcutâneo

Quercetina

Antileishmaniose in vivo

Toxicológico

(GUPTA et al., 2005)

Intravaginal

Vanadoceno Toxicológico (D’CRUZ e UCKUN, 2001)

3.2 PRODUTOS NATURAIS COMO FONTE DE FÁRMACOS

Durante um longo período, as plantas medicinais constituíram a base da medicina

terapêutica e, somente em meados do século passado é que as substâncias puras isoladas ou

sintetizadas, foram incorporadas ao arsenal terapêutico, tendo sido denominadas de fármacos.

Os vegetais constituem uma grande e diversificada fonte de fármacos, pertencentes à classe de

metabólitos especiais ou secundários que apresentam uma variedade enorme de atividades

biológicas, muitas das quais podendo ser essenciais para a sobrevivência e o bem estar de

humanos e animais (SOEJARTO e FARNSWORTH, 1989).

O uso de plantas medicinais com fins de prevenção, tratamento e cura de doenças,

ultrapassou todas as barreiras dos processos evolutivos e sobrevive até os dias atuais, sendo

amplamente utilizada por grande parte da população mundial como fonte de recurso

terapêutico eficaz. No século XX o progresso científico possibilitou o estudo sistemático de

um grande número de plantas, com consequente identificação de compostos bioativos. No

final da década de 1980 estimou-se que 74% destes compostos teriam sido obtidos através de

pesquisas que visavam comprovar a autenticidade das informações populares ou etnomédicas

de vegetais medicinais (SOEJARTO e FARNSWORTH, 1989).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 73

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

No período entre 1983 e 1994, dos 520 novos fármacos aprovados pela Food and Drug

Administration (FDA), 203 (39%) foram desenvolvidos a partir de produtos naturais

(CRAGG et al., 1997). Dados reportados em 1985 mostram que a medicina alopática já

utilizava aproximadamente 119 fármacos provenientes de 90 espécies de plantas superiores

(FARNSWORTH e SOEJARTO, 1985). Dentre elas, 74% foram descobertas em pesquisas

fitoquímicas que contemplaram a escolha da planta pelo seu uso na medicinal tradicional

(FARNSWORTH e SOEJARTO, 1985).

Na década passada, estimou-se que entre os vinte principais fármacos mais vendidos

nos Estados Unidos, apenas sete não eram derivados de produtos naturais. Em contrapartida,

faziam parte do contexto histórico de drogas medicinais naturais, em decorrência de terem

aspectos estruturais (semelhança em subunidades moleculares) e farmacológicos semelhantes

a determinados produtos naturais. Atualmente, um terço dos medicamentos mais vendidos e

prescritos no mundo, tem origem a partir de produtos naturais, o que equivale dizer que 40%

dos medicamentos disponíveis na terapêutica atual foram desenvolvidos a partir de produtos

naturais, onde 25% são de origem vegetal, 13% de microorganismos e 3% de animais

(CALIXTO, 2003). O percentual se eleva para 70% quando se trata de drogas

anticarcinogénicas e antibióticas (CALIXTO, 2003). Newman e colaboradores reforçam estes

dados ao divulgarem em 2000, que 25% das receitas médicas de países industrializados

derivam direta ou indiretamente de plantas. E estima ainda, que este percentual sobe para 50%

quando se considera a comercialização de medicamentos em mercados populares (NEWMAN

et al., 2000).

3.2.1 Sistemas de liberação de fármacos e os produtos naturais

A principal classe de metabólitos especiais é, sem dúvida alguma, a dos alcalóides,

como os extraídos dos gêneros Vinca, Taxus e Camptotheca, que apresentam intensa atividade

antitumoral. Os alcalóides extraídos da Vinca rosea, como a vincristina e a vimblastina, são

amplamente solúveis em água e representam o segundo fármaco antineoplásico mais utilizado

no mundo (CORTESI e NASTRUZZI, 1999). Apesar disso, a alta incidência de efeitos

adversos neurológicos causados pela administração de alcalóides da Vinca impedem a

expansão de seu uso. Nesse sentido, diversos sistemas carreadores, em especial lipossomos e

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 74

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

microemulsões, foram obtidos e estudados para a veiculação desta importante classe de

alcalóides (JUNPING et al., 2003; HUA et al., 2004; CHEN et al., 2008).

O paclitaxel é um alcalóide extraído da espécie Taxus brevifolia, uma árvore nativa do

Pacífico, sendo um dos mais efetivos agentes quimioterápicos utilizados no tratamento do

câncer de ovário e mama. Ele é comercializado sob o nome de Taxol®, tendo como

excipiente uma mistura 1:1 de Cremophor EL, um tensoativo derivado do óleo de rícino, e

etanol, os quais são responsáveis pela alta incidência de efeitos adversos em pacientes

tratados com Taxol®. Além disso, o paclitaxel apresenta baixíssima solubilidade aquosa, o

que diminui consideravelmente a sua biodisponibilidade. Uma solução para estes problemas,

tem sido o desenvolvimento e a otimização de sistemas de liberação para a veiculação do

paclitaxel, como as microemulsões (RODRIGUES et al., 2005; HE et al., 2003), em especial

os sistemas auto-microemulsificantes (KANG et al., 2004; YANG et al., 2004; GURSOY et

al., 2003; GAO et al., 2003; LEE et al., 2008). Outros compostos derivados do paclitaxel,

como o docetaxel, também vêm sendo estudados em sistemas microemulsionados com o

objetivo de aumentar sua biodisponibilidade oral (YIN et al., 2009).

A camptotecina e seus análogos semissintéticos apresentam intensa atividade

antitumoral frente a diversos modelos de tumores. No entanto, devido à sua baixa

biodisponibilidade e aos seus intensos efeitos adversos, seu uso clínico prolongado tem sido

evitado (CORTESI et al., 1997; CORTESI e NASTRUZZI, 1999). O uso clínico deste

importante alcalóide pode estar associado à utilização de sistemas de liberação controlada de

fármacos, como lipossomos, microemulsões e sistemas micelares, que permitem diminuir a

dose administrada e, consequentemente, diminuir os efeitos adversos, aumentando a sua

biodisponibilidade (CORTESI et al., 1997; CORTESI e NASTRUZZI, 1999; LU et al.,

2008).

Além dos alcalóides antineoplásicos, diversos outros fármacos de origem vegetal (WOO

et al., 2007; ZHANG et al., 2008; MANDAWGADE et al., 2008; LIU et al., 2009; CUI et al.,

2009) têm sido introduzidos em sistemas microemulsionados. O principal motivo tem sido a

baixa solubilidade destes produtos naturais, visando o aumento da sua biodisponibilidade.

Óleos vegetais também têm sido utilizados em sistemas microemulsionados como fase

oleosa (BIRUSS et al., 2007; MANDAWGADE et al

., 2008; STRICKLEY, 2004). Apesar de

geralmente apresentarem uma extensa cauda apolar, o que dificulta o processo de

micelização, a utilização de cotensoativos diminui a constante dielétrica da água e permite

maior penetração das caudas apolares na fase aquosa.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 75

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

3.3 MICELAS FORMADAS POR ALQUIL-GLICOSÍDEOS E SIMULAÇÃO POR

DINÂMICA MOLECULAR

Tensoativos não-iônicos à base de açúcares, como os glicolipídeos e os alquil-

poliglicosídeos, têm atraído a atenção devido à sua capacidade de biodegradação, baixa

toxicologia (VON RYBINSKI e HILL, 1998), e pequena ou nenhuma dependência com a

temperatura (AOUDIA e ZANA, 1998). A cabeça polar destes tensoativos pode consistir de

um ou mais grupos sacarídeos, enquanto que a parte hidrofóbica pode consistir de uma, duas

ou até mais cadeias alquílicas. A ligação química mais frequente entre as partes hidrofílica e

hidrofóbica nesta classe de tensoativo são éter, éster, amina e amida. Tensoativos à base de

açúcares exibem variado comportamento termotrópico e liotrópico, e podem apresentar fases

cúbicas, hexagonais, lamelares, cristais líquidos e micelares em solução aquosa

(DRUMMOND e WELLS, 1998; WALTON et al., 2006; COPPOLA et al., 2002; AUVRAY

et al., 1995). São ainda largamente empregados na extração e cristalização de membranas

protéicas (ODAHARA, 2004), na emulsificação de substratos para reações enzimáticas

(LAZO e QUINN, 1980) e como veículos para fármacos (SÖDERLIND et al., 2003).

No entanto, a ocorrência natural de tensoativos à base de açúcares é geralmente

pequena, além de serem de difícil isolamento (HOLMBERG, 2001). No final do século XX,

uma nova família de tensoativos à base de açúcares proveniente de dissacarídeos

desprotegidos foi introduzida na literatura (LATGE et al., 1991; GARELLI-CALVET et al.,

1992). Eles consistem de uma cadeia alquílica ligada, por uma ligação amina, a um grupo

açúcar, o qual pode estar na configuração aberta (alditol) ou de anel (aldose) (Figura 3.1), e

sua síntese envolve apenas duas etapas de baixo custo (LATGE et al., 1991;

BHATTACHARYA e ACHARYA, 2000; GOMES, 2004). N-dodecilamino-1-deoxilactitol e

N-dodecil-D-lactosilamina apresentam uma grande variedade de agregados e microestruturas

em soluções aquosas e seu processo de micelização tem sido estudado por técnicas de

espalhamento como SANS e SAXS (DUPUY et al.,1996; DUPUY et al., 1998). Com base

nessas propriedades, têm-se estudado a possibilidade de utilizar tais tensoativos como agentes

de solubilização de moléculas e fármacos hidrofóbicos, seja através de sistemas micelares ou

de vesículas cataniônicas (BLANZAT, 2000; GOMES, 2004).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 76

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

galactosyl residue

glucosyl residue alkyl chain

glucitol residue

galactosyl residue

alkyl chain

(a)

(b)

Figura 3.1 – Estrutura das moléculas de tensoativo (a) N-dodecilamino-1-deoxilactitol (C

N-lactitol) e (b) N-

dodecil-D-lactosilamina (C

N-lactosil)

Simulações de Dinâmica Molecular (MD) têm demonstrado ser uma importante

ferramenta para a investigação de propriedades micelares, e estudos recentes forneceram

importantes informações a respeito do formato (KONIDALA et al., 2006; BRUCE et al.,

2002; TIELEMAN et al., 2000; BOGUSZ et al., 2000; CHONG et al., 2006), perfil de

hidratação (FAEDER e LADANYI, 2005; FAEDER e LADANYI, 2001; BRUCE et al.,

2002), interações específicas (RAKITIN e PACK, 2004; FAEDER et al., 2003) e

propriedades dinâmicas das micelas (FAEDER e LADANYI, 2005; BOGUSZ et al., 2001;

MARRINK et al., 2000) em soluções aquosas. A principal força atuante no processo de

micelização é o efeito hidrofóbico (TANFORD, 1980), porém, em tensoativos à base de

açúcares a extensa rede de ligações de hidrogênio observada na cabeça polar pode também

exercer certa influência na micelização. Alguns estudos computacionais têm se destinado a

estudar propriedades estruturais de compostos alquil-glicosídeos no processo de micelização

em termos do tipo de ligação (alfa ou beta) entre a cadeia alquílica e o grupo açúcar

(BOGUSZ et al., 2000) e das posições axial ou equatorial dos grupos hidroxila

(estereoquímica do grupo sacarídeo) (CHONG et al., 2006).

Metodologia Experimental

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 78

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

4 METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Neste capítulo são apresentados os materiais e métodos utilizados durante a execução

deste trabalho.

4.1 ESCOLHA DOS COMPONENTES DA MICROEMULSÃO

Todos os produtos utilizados na formulação das microemulsões são farmaceuticamente

aceitáveis e foram utilizados sem prévia purificação (Tabela 4.1), à exceção do ácido oléico,

que foi purificado em coluna cromatográfica contendo sílica (230-80 Mesh) e carvão ativado,

e sua pureza foi confirmada pelo índice de refração.

Tabela 4.1 – Produtos utilizados na formulação das microemulsões

Produto Fabricante Pureza

Tensoativos

Tween 80 Acros Organics −

Tween 40 Acros Organics −

Tween 20 Acros Organics −

Span 20 Sigma-Aldrich −

Cotensoativos

Etanol P.A. Cromato Química 99,5%

Propilenoglicol P.A. Vetec 99,5%

Sorbitol Sigma > 98%

Óleos

Miristato de isopropila Acros Organics 96%

Ácido oléico Synth Purificado em coluna cromatográfica

Miglyol Condea Chemie −

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 79

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

4.2 PRODUTOS NATURAIS MICROEMULSIONADOS

Os clerodanos trans-desidrocrotonina (DCTN) e trans-crotonina (CTN), bem como o

triterpeno ácido acetil aleuritólico (AAA) (Figura 2.10, página 42) foram obtidos a partir de

estudos realizados previamente segundo metodologia descrita por MACIEL et al. (2000) e

disponibilizados para uso neste trabalho.

Dentre os produtos bioativos isolados do Croton cajucara Benth, apenas o clerodano

trans-desidrocrotonina foi purificado em coluna cromatográfica contendo sílica gel (230-80

Mesh). Após concentração das frações obtidas e de experimentos de cromatografia de camada

delgada (TLC), as frações que tiveram a sua pureza assegurada foram reunidas e

disponibilizadas para uso.

4.2.1 Extratos vegetais

Os extratos hexânico (CC-EH), clorofórmico (CC-EC) e metanólico (CC-EM)

provenientes das folhas de Croton cajucara, bem como os terpenóides isolados, foram obtidos

de acordo com a metodologia previamente descrita (MACIEL et al., 2000). A planta foi

adquirida no mercado Ver-o-peso (Belém-PA) e sua autenticidade comprovada por

experimentos fitoquímicos que foram monitorados por comparações em cromatografia em

camada delgada (TLC) com padrões autênticos de DCTN, CTN e AAA.

As cascas do caule de Anacardium occidentale L. foram coletadas em Natal (RN) e a

identificação botânica da espécie foi realizada pela botânica Maria Iracema Bezerra Loiola.

Uma exsicata elaborada foi depositada no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. O material vegetal (1,3 kg) foi fragmentado em pequenos pedaços e submetido à

extração via percolação com metanol. O extrato metanólico obtido (AO-EM) (62,3 g) foi

submetido a um procedimento cromatográfico em gel de sílica, e forneceu uma fração apolar

(eluída em hexano) correspondente ao óleo fixo (AO-FO), uma fração de polaridade mediana

(eluída em clorofórmio), uma fração polar (eluída em metanol) e uma fração muito polar

(eluída em metanol:água, 8:2) rica em taninos (AO-FT) (GOMES et al., 2006).

Phyllanthus amarus Schumm. & Thonn foi coletado em Natal (RN) e a identificação

botânica da espécie foi realizada pela botânica Maria Iracema Bezerra Loiola. Uma exsicata

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 80

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

foi elaborada (nº 1645) e depositada no herbário da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. O material vegetal seco (124,5 g da planta inteira) foi submetido à extração via

percolação com metanol. O filtrado obtido foi reduzido em um rotaevaporador, gerando 16,9

g do extrato alcoólico de Phyllanthus amarus (PA-EE) (MACIEL et al., 2007).

4.3 OBTENÇÃO DOS DIAGRAMAS DE FASES

Os diagramas de fases pseudo-ternários foram elaborados a partir da diluição com a fase

aquosa de pré-misturas de tensoativo/cotensoativo e fase oleosa a várias composições,

verificando sempre após cada adição do titulante, e posterior agitação em vortex, qualquer

mudança no aspecto físico da mistura. Quando necessário, foi feita também a diluição de pré-

misturas de tensoativo/cotensoativo e água com a fase oleosa. Em todos os diagramas foram

obtidas apenas as regiões de ocorrência das microemulsões, ignorando-se as fases existentes

nas demais regiões.

4.4 TESTES DE SOLUBILIDADE

A quantificação do fármaco foi determinada por espectroscopia no UV-Vis a partir de

sucessivas diluições em metanol. Inicialmente, foi obtida uma curva de calibração tomando-se

uma massa conhecida do fármaco, o qual foi dissolvido em 1,0 mL de metanol. Em seguida,

determinou-se a absorbância das amostras contendo o fármaco após diversas diluições em

metanol.

Para a determinação da solubilidade da DCTN e CTN nos sistemas microemulsionados,

ou em um de seus componentes isolados, procedeu-se da seguinte maneira: em um tubo de

ensaio foi colocado 1,0 mL do veículo (microemulsão ou um de seus componentes) e em

seguida adicionou-se o fármaco até que se verificasse a saturação do sistema (formação de

precipitado em suspensão) após um mínimo de 10 minutos de agitação (vortex). Em seguida,

a mistura foi agitada em um banho termostático, por 24 h, à temperatura ambiente (27 ± 1 ºC).

Por fim, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 2800 rpm e pequenas alíquotas do

sobrenadante foram analisadas por espectroscopia no UV-Vis, cujas medidas de absorbância

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 81

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

foram realizadas em triplicata a fim de se calcular a concentração do fármaco nos sistemas

microemulsionados a partir da curva de calibração.

Para os sistemas auto-microemulsificantes foi realizado um teste de retenção do

fármaco na microemulsão à medida que esta é diluída em água. Uma quantidade pré-

determinada do produto natural foi solubilizada no sistema auto-microemulsificante, o qual,

em seguida, foi diluído em três vezes (D1) e depois em trinta vezes (D2) à concentração

inicial. A quantidade do produto natural dissolvida na microemulsão original (D0) e diluída

(D1 e D2) foi determinada por espectroscopia no UV-Vis a partir de sucessivas diluições em

metanol, de forma similar ao procedimento realizado para os sistemas microemulsionados

convencionais. Todas as análises de UV-Vis, para cada diluição, foram realizadas em

triplicata.

Para a determinação da solubilidade dos extratos nos sistemas microemulsionados, a

curva de calibração foi obtida solubilizando-se 1,0 g do extrato em 1,0 mL do próprio sistema

microemulsionado testado e, posteriormente, realizada a leitura da absorbância, no

comprimento de onda máximo de cada extrato, de soluções diluídas a partir desta solução

inicial. O restante da metodologia seguiu o protocolo descrito acima para os ensaios de

solubilidade dos produtos naturais de Croton cajucara (DCTN e CTN).

4.5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS MICROEMULSÕES

Os sistemas microemulsionados obtidos foram caracterizados quanto ao índice de

refração, comportamento reológico, tamanho das gotículas e condutividade elétrica.

4.5.1 Índice de refração

O índice de refração foi obtido em um refratômetro Abbé Leica Auto, da Tecnal

(Piracicaba, São Paulo) a temperatura ambiente (25 ºC).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 82

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

4.5.2 Reologia

Os dados de viscosidade foram obtidos em um reômetro Haake Mars, utilizando o

software RheoWin 3 Job Manager. Foram empregados em todas as análises o rotor Z41. Foi

utilizado o modo de variação de tensão a uma taxa de cisalhamento constante dentro do

período de rotação que variou de 1 a 150 s

-1

. A temperatura em todas as análises foi de 25 ±

0,5 ºC. O comportamento reológico de cada sistema microemulsionado foi avaliado a partir

do gráfico gerado pelos valores da tensão versus taxa de cisalhamento, obtidos no decorrer de

120 segundos de experimento. Os sistemas que apresentaram comportamento linear (valor de

≥ 0,9999) no gráfico gerado foram considerados fluidos Newtonianos e sua viscosidade foi

determinada pelo software RheoWin 3 Job Manager como o coeficiente angular da curva. Os

sistemas considerados não-Newtonianos tiveram sua viscosidade determinada a partir do

coeficiente angular da linha de tendência do gráfico tensão versus taxa de cisalhamento,

gerado a partir de no mínimo 100 pontos.

4.5.3 Distribuição de tamanho das gotículas

O tamanho das gotículas de microemulsão foi determinado em um instrumento zetasizer

da Brookhaven Instruments. Todas as medidas foram realizadas em triplicata a temperatura

constante de 25,0 ºC e com um feixe de luz de comprimento de onda de 659,0 nm, com um

ângulo de incidência de 90,0º. Todas as amostras utilizadas foram recém-preparadas e

agitadas durante 10 minutos antes da análise.

4.5.4 Condutividade elétrica

As determinações de condutividade elétrica, k, foram realizadas em um condutivímetro

Digimed DM-31 equipado com um eletrodo cuja constante da célula era 0,77 cm

-1

. Todas as

medidas de condutividade foram realizadas em triplicata a temperatura controlada de 25 ± 0,5

ºC.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 83

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

4.6 ESTUDO DAS PROPRIEDADES ANTIOXIDANTE E BACTERIOSTÁTICA

Os ensaios farmacológicos dos extratos solubilizados em sistemas microemulsionados

consistiram da avaliação da propriedade antioxidante e do efeito bacteriostático, realizados

em parceria com laboratórios do departamento de Química da UFRRJ e do departamento de

Biologia e Genética da UFRN.

4.6.1 Propriedade antioxidante

A ação antioxidante dos extratos vegetais solubilizados em sistemas microemulsionados

foi avaliada utilizando-se como fonte de radical livre o 2,2-difenil-picril-hidrazila (DPPH)

(MENSOR et al., 2001). As soluções-estoque foram preparadas em metanol na concentração

de 1 mg/mL. O ensaio foi realizado em microplacas de 96 poços no volume total de 100 μL.

Foram feitas diluições dos extratos e frações testados, às quais foi ajuntada uma solução de

0,3 mM de DPPH em metanol. Após o tempo de 30 minutos de repouso no escuro, foi feita a

leitura das microplacas em leitora Elisa a 490 nm. Foram realizados três ensaios

independentes, todos em triplicata. O percentual antioxidante foi calculado a partir da

seguinte equação:

%AA = 100 – (A

amostra

– A

branco

) × 100 / A

controle

(8)

Onde: A

amostra

= absorbância da amostra correspondente ao extrato com DPPH; A

branco

absorbância do branco correspondente ao extrato sem DPPH; A

controle

= absorbância da

solução pura de DPPH a 0,3 mM.

A atividade antioxidante foi expressa em valores de CE

± dp (concentração efetiva na

captura de 50% do radical livre DPPH e desvio-padrão, respectivamente), obtidos a partir do

gráfico que relaciona o percentual de atividade antioxidante (%AA) com a concentração de

cada extrato testado.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 84

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

4.6.2 Atividade bacteriostática

Foi realizado o inóculo de uma colônia para cada espécie bacteriana testada em 5 mL de

meio de cultura LB (Luria Broth), incubados por 16-18 h, a 37 ºC, sob agitação de 180 rpm.

Após esse período, 5 μL do cultivo descrito foi adicionado a diferentes concentrações da

amostra a ser testada e ao meio de cultura, perfazendo um volume final de 100 μL. As

amostras foram então incubadas por 24 h, a 37 ºC, sem agitação. Após o período de

incubação, o crescimento microbiano foi observado e determinado como a medida de

absorbância obtida através de espectrometria no UV-Vis em comprimento de onda de 600 nm.

Como controle positivo foi utilizada uma combinação dos antibióticos ampicilina (2 μg/mL) e

cloranfenicol (12,5 μg/mL).

4.7 SIMULAÇÃO POR DINÂMICA MOLECULAR DE MICELAS

Moléculas de N-dodecilamino-1-deoxilactitol (C

N-lactitol) e N-dodecil-D-

lactosilamina (C

N-lactosil) foram modeladas utilizando o campo de força GLYCAM_04

(WOODS GROUP, 2007). Os parâmetros ausentes foram obtidos a partir do módulo

antechamber (WANG et al., 2006) da suíte de programas AMBER 9.0 (CASE et al., 2006).

As cargas parciais atômicas foram obtidas utilizando o algorítmo RESP, derivando as cargas

de potenciais eletrostáticos calculados no nível HF/6-31G* a partir do programa GAMESS.

Duas micelas esféricas contendo 88 monômeros de C

N-lactitol e C

N-lactosil foram

construídas empregando-se um software criado pelo grupo. Cada micela foi solvatada com

aproximadamente 17.000 moléculas de água do tipo TIP3P em uma célula periódica de

formato octaédrico com dimensões iniciais a = b = c = 119,0 Å, gerando uma concentração de

0,25 M ou 87,2% (m/m) de água. Esta configuração inicial está consideravelmente acima da

CMC (6 x 10

-4

mol/L) para o C

N-lactitol e está de acordo com estudos experimentais que

revelaram um número de agregação de 88 a 297 K (24 ºC) (DUPUY et al., 1996; DUPUY et

al., 1998).

As simulações de Dinâmica Molecular (MD) foram realizadas usando a suíte de

programas AMBER 9.0 (CASE et al., 2006). O raio de corte foi fixado em 9,0 Å e todas as

interações eletrostáticas de longo alcance foram tratadas pelo método Particle Mesh Ewald

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 85

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

(PME). Como sugerido por KIRSCHNER e WOODS (2001), as interações de van der Waals

do tipo 1-4 (scnb) e as interações eletrostáticas do tipo 1-4 (scee) foram fixadas em 1. A

geometria molecular foi preservada utilizando o algoritmo SHAKE (RYCKAERT et al.,

1997) e as equações de movimento foram integradas com um intervalo de tempo de 2 fs.

Inicialmente, os sistemas solvatados tiveram a sua energia minimizada utilizando 500

passos do método Steepest Descent (SD), seguido de 2.000 passos do método de gradiente

conjugado, mantendo a micela fixa. Uma outra etapa de minimização foi realizada, desta vez

deixando a micela livre, a fim de eliminar maus contatos antes da etapa de termalização. Em

seguida, os sistemas foram aquecidos de 0 a 298 K a volume constante em um intervalo de

100 ps usando a técnica de Langevin com uma frequência de colisão de 25,0 ps

-1

. Finalmente,

uma simulação MD no ensemble NpT foi realizada para cada sistema em um intervalo de 10

ns, a 1 atm e 298 K, com coordenadas arquivadas a cada 0,5 ps. Os primeiros 500 ps da

simulação foram considerados como etapa de equilíbrio e o restante como a etapa de

produção.

O cálculo do raio de giro e a análise das ligações de hidrogênio foram realizados a partir

do módulo ptraj da suíte de programas AMBER. Para avaliar as interações monômero-

solvente e inter- e intra-monômeros, a ligação de hidrogênio foi definida baseada em dois

critérios geométricos: (i) distância oxigênio-oxigênio máxima de 3,0 Å, e (ii) ângulo da

ligação O–H⋅⋅⋅O superior a 120º. Foram ainda considerados os átomos de nitrogênio e

oxigênio como aceptores de hidrogênio, e quando apropriado, o correspondente átomo de

hidrogênio como doador. A área superficial acessível ao solvente (SASA) dos agregados foi

calculada usando o programa NACCESS (HUBBARD e THORNTON, 1993). Para os

cálculos de SASA foram definidos raios atômicos de 1,8; 1,6; 1,4 e 0,0 Å para os átomos de

C, N, O e H, respectivamente, além de um raio de prova de 1,4 Å com espessura de 0,05 Å.

Resultados e Discussão

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 87

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ESCOLHA DOS COMPONENTES DA MICROEMULSÃO

Inicialmente, a escolha dos componentes (tensoativo, cotensoativo e fase oleosa) das

microemulsões seguiu o critério de toxicidade, em virtude da aplicação biológica dos sistemas

microemulsionados obtidos. Na sequência, procurou-se utilizar componentes que permitissem

a obtenção de extensas regiões de microemulsão em um diagrama de fases.

5.1.1 Escolha do tensoativo

Para a obtenção dos sistemas microemulsionados foram selecionados tensoativos não-

iônicos, já que são inertes a variações de pH e apresentam baixa toxicidade (STRICKLEY,

2004). Nesse contexto, foram testados os tensoativos Tween 80, 40 e 20, e o Span 20, que são

líquidos à temperatura ambiente, bem como misturas Tween/Span em várias proporções.

O Span 20 é um éster do sorbitol bastante lipofílico (Tabela 2.1, página 42),

apresentando, portanto, um baixo BHL. Misturas contendo apenas o Span 20 como tensoativo

tenderam a formar emulsões nas composições ricas em óleo, e géis ou cristais líquidos nas

composições ricas no tensoativo. A utilização de Tweens (80, 40 e 20) como tensoativo

estendeu um pouco a região de microemulsão, porém verificou-se ainda a existência de uma

ampla região de cristais líquidos nas composições ricas em tensoativo e também em certas

regiões próximas ao vértice da água.

Os tensoativos não-iônicos tendem a formar com maior facilidade microestruturas

gelificadas em composições com alta concentração do tensoativo. A interação do tensoativo

com moléculas de água permite a formação de um arranjo estrutural rígido, como as fases

cúbicas, lamelares ou hexagonais de alta viscosidade. Tais microestruturas tendem a limitar o

potencial de aplicação das microemulsões como veículo de fármacos, devido ao seu

comportamento reológico. Uma forma simples e útil de verificar a tendência da formação de

géis por parte desse tipo de tensoativo pode ser feita através do estudo de uma mistura binária

tensoativo-água. Desta forma, foi realizado o estudo liotrópico de sistemas contendo os

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 88

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

tensoativos hidrofílicos Tween 20, 40 e 80 em mistura com o Span 20, em três diferentes

proporções, com o objetivo de se eleger a melhor proporção dos tensoativos empregados em

cada sistema, ou seja, aquele que apresenta a menor tendência à formação de gel. (Figura 5.1).

Para as misturas Tween 80/Span 20 (T80:S20) e Tween 20/Span 20 (T20:S20) a proporção

que apresentou a maior resistência à gelificação foi 3:1 (Tween : Span), enquanto que para o

sistema Tween 40/Span 20 (T40:S20) a razão escolhida foi 2:1.

Figura 5.1 – Capacidade máxima de formação de misturas isotrópicas em função quantidade de água, variando-

se a proporção entre os tensoativos Tween e Span 20.

A partir da definição das proporções de cada sistema de tensoativo foi obtido um

diagrama de fases ternário, utilizando o miristato de isopropila (IPM) como fase oleosa

(Figura 5.2). O resultado demonstrou que a utilização de um tensoativo bastante hidrofílico

como o Tween 20 inibiu a formação de microemulsão em regiões ricas em óleo, e estendeu

um pouco a região de microemulsão em direção ao vértice da água. Os sistemas T80:S20

(3:1) e T40:S20 (2:1) apresentaram diagramas parecidos. Entretanto, a utilização do Tween 80

permitiu a formação de microemulsões A/O com pelo menos 5% em massa de água. Por isso,

o sistema T80:S20 (3:1) foi utilizado na preparação de todos os sistemas microemulsionados

deste trabalho.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 89

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Figura 5.2 – Diagramas de fases de misturas contendo Tween:Span 20 (3:1), IPM e água. (a) Tween 80; (b)

Tween 40; (c) Tween 20

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 90

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

A utilização de misturas de tensoativos de BHL distintos é um recurso bastante

utilizado, pois o efeito sinérgico entre eles pode ampliar a região de microemulsão, bem como

garantir ou melhorar certas propriedades físico-químicas da formulação (LI et al., 2005; KIM

et al., 2005). Observou-se, neste caso, a diminuição da região de cristais líquidos nas

composições próximas ao eixo tensoativo-água, devido principalmente ao abaixamento do

balanço hidrófilo-lipófilo (BHL) da mistura de tensoativos utilizada, que contribuiu para uma

melhor interação com a água. De fato, o Span 20, que é um tensoativo bastante lipofílico,

pode atuar como fase oleosa estabilizando a região lipofílica do Tween 80.

5.1.2 Escolha do cotensoativo

Os cotensoativos têm como principal função aumentar a fluidez do filme de tensoativo

formado, estabilizando os microdomínios formados de óleo em água ou de água em óleo.

Nesse contexto, são usados geralmente alcoóis de cadeia média como o butanol e o hexanol.

No entanto, estes alcoóis são bastante tóxicos, mostrando-se inapropriados para uso

farmacológico. Uma alternativa é o uso do etanol como cotensoativo. Apesar do etanol não

apresentar a mesma capacidade de penetração no filme interfacial que seus homólogos de

cadeia maior, este álcool apresenta toxicidade bastante inferior em comparação com os

alcoóis superiores, e por isso é largamente utilizado em microemulsões para uso

farmacológico (RUTH et al., 1995; ZHANG et al., 2005; ALANY et al., 2006).

Neste trabalho, o etanol foi testado como cotensoativo em duas concentrações: na razão

Cotensoativo/Tensoativo (C/T) igual a 0,5 e 1,0 (Figura 5.3). Na mistura com menores

quantidades de etanol (C/T igual a 0,5) observou-se um pequeno estreitamento da região de

microemulsão próxima ao vértice da água em comparação com a mistura com C/T igual a 1.

Nas composições ricas em fase oleosa, os dois sistemas apresentaram comportamento similar.

Apesar de ser preferível a utilização de quantidades mínimas de etanol em virtude de sua

toxicidade, o sistema com razão C/T igual a 1 foi escolhido, levando-se em conta a

possibilidade de migração do álcool para o meio externo, que pode levar à desestabilização e

consequente quebra da microemulsão.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 91

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Figura 5.3 – Diagramas de fases de misturas contendo Tween 80:Span 20 (3:1) e etanol nas razões (a) C/T igual

a 0,5 e (b) C/T igual a 1,0

Além de permitir a estabilização da fase dispersa, o cotensoativo possui a capacidade de

tornar a fase aquosa menos hidrofílica a partir da diminuição da constante dielétrica da água.

Como resultado, haverá maior penetração da parte hidrofóbica do tensoativo na fase aquosa e,

consequentemente, maior estabilização das gotículas (O/A ou A/O) formadas na

microemulsão, como pode ser observado comparando-se os diagramas de fase da Figura 5.3

com o da Figura 5.2a (região de microemulsão mais extensa em sistemas com cotensoativo).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 92

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.1.3 Escolha da fase oleosa

Em microemulsões de uso biológico é preferível a utilização de óleos com cadeia

hidrocarbônica relativamente curta à média. Isso porque tais sistemas frequentemente

apresentam cotensoativos com cadeias bastante curtas, como o etanol, o que dificulta a sua

penetração no filme interfacial e a sua consequente estabilização. Assim, óleos com cadeias

mais curtas tendem a penetrar mais no filme interfacial auxiliando também na sua

estabilização.

Dentre os óleos testados, o miristato de isopropila (IPM) se sobressaiu frente aos demais

por apresentar a maior região de microemulsão (Figura 5.4). O Miglyol, apesar de possuir

uma cadeia hidrocarbônica menor que o IPM, apresenta em sua estrutura três cadeias

hidrocarbônicas (Tabela 2.2, página 46), resultando em uma alta lipofilicidade e rigidez da

molécula, o que justifica a estreita região de microemulsão observada quando é utilizado este

óleo como fase oleosa. Por isso, o Miglyol não foi empregado em nenhum sistema

microemulsionado deste trabalho. O ácido oléico (AO), por sua vez, apresenta a maior cadeia

hidrocarbônica, porém a insaturação presente em sua estrutura lhe confere maior fluidez por

comparação com os demais óleos testados. Adicionalmente, o ácido oléico é bastante

utilizado em formulações tópicas por ser um bom promotor de permeação dérmica

(ESCRIBANO et al., 2003). Porém, o alto caráter lipofílico do ácido oléico restringiu a

formação de microemulsões do tipo O/A (região de microemulsão próxima ao vértice da

água), apesar de ter facilitado a ocorrência de microemulsões do tipo A/O (região de

microemulsão próxima ao vértice do óleo).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 93

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Figura 5.4 – Diagramas de fases de misturas contendo (a) IPM, (b) Miglyol e (c) ácido oléico como fase oleosa

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 94

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.2 OBTENÇÃO DOS SISTEMAS MICROEMULSIONADOS

A partir da análise dos diagramas de fase obtidos foram escolhidas várias composições

na região de microemulsão de cada diagrama (Tabela 5.1), contemplando as microestruturas

bicontínuas, do tipo óleo em água (O/A) e do tipo água em óleo (A/O) (Figura 2.8, página

34). Entretanto, devido ao alto caráter lipofílico do ácido oléico, os sistemas contendo este

óleo se restringiram às microemulsões bicontínuas e do tipo A/O.

O sistema ME-A do tipo O/A (microemulsão rica em fase aquosa) tem,

preferencialmente, indicação para a solubilização e veiculação de substâncias polares de

caráter hidrofílico. Em um contexto geral, este tipo de sistema (O/A) é utilizado para

administração parenteral (PARK e KIM, 1999) e transdérmica (CHANGEZ et al., 2006) de

fármacos.

Por sua vez, os sistemas ME-C e ME-F são microemulsões ricas em fase oleosa (tipo

A/O), que são empregadas na veiculação de fármacos lipofílicos ou apolares, principalmente a

partir da via transdérmica (BAROLI et al., 2000), já que podem atuar como adjuvantes na

permeação dérmica do fármaco.

Os sistemas ME-B e a ME-E são microemulsões do tipo bicontínua e se caracterizam

por uma alta viscosidade e quantidades equivalentes de fase aquosa e oleosa. Diante dessas

características, são largamente empregados na administração transdérmica (ESCRIBANO et

al., 2003) e intranasal (LI et al., 2002) de fármacos das mais variadas classes e polaridades.

Tabela 5.1 – Composição das Microemulsões (ME) (% em massa)

ME-A ME-B ME-C ME-D ME-E ME-F

Tween 80 13,12% 22,5% 18,75% 22,5% 22,5% 15,0%

Span 20 4,38% 7,5% 6,25% 7,5% 7,5% 5,0%

Etanol 17,5% 30,0% 25,0% ― 30,0% 20,0%

IPM 5,0% 20,0% 45,0% 65,0% ― ―

Ácido oléico ― ― ― ― 20,0% 55,0%

Água 60,0% 20,0% 5,0% 5,0% 20,0% 5,0%

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 95

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Com o intuito de se evitar a utilização do etanol foi obtido um diagrama de fases cujo

sistema não apresentava cotensoativo (Figura 5.2a). O sistema foi composto da mistura

Tween 80:Span 20 (3:1), IPM e água, tendo apresentado uma considerável região de

microemulsão. Assim como os sistemas ME-C e ME-F, o sistema ME-D, obtido sem uso de

etanol, é uma microemulsão do tipo A/O, rica em fase oleosa. Este sistema se difere das

microemulsões com etanol por apresentar maior viscosidade, devido à menor fluidez da

camada interfacial ocasionada pela ausência do cotensoativo. Comparativamente, o sistema

ME-D representa a melhor proposta de veiculação de fármacos, em função de não conter

etanol.

5.2.1 Obtenção dos sistemas auto-microemulsificantes

Os sistemas auto-microemulsificantes são constituídos de uma mistura isotrópica de

tensoativos, cotensoativos, óleo e fármaco, sendo bastante utilizados na administração oral de

fármacos com baixa biodisponibilidade oral. Uma propriedade importante destes sistemas é

que o aspecto isotrópico da microemulsão permanece inalterado mesmo após sucessivas

diluições com água. Isso é muito importante, pois no sistema digestivo as microemulsões são

diluídas ou “absorvem” a água do trato gastrintestinal, podendo ocorrer a quebra da

microemulsão.

Dentre os vários sistemas testados, dois deles apresentaram regiões propícias para a

formulação de sistemas auto-microemulsificantes (Figura 5.5). Essas regiões podem ser

identificadas pela área compreendida entre as linhas pontilhadas que percorrem o diagrama de

fases, partindo do eixo binário tensoativo/cotensoativo-óleo até o vértice da água. Ambos os

sistemas foram diluídos em até trinta vezes e não se verificou a quebra da microemulsão.

Entretanto, os sistemas apresentaram mudança de coloração do amarelo (devido à alta

concentração do Tween 80 e Span 20 no sistema inicial) para um tom levemente azul,

característico de partículas coloidais de tamanho nanométrico, o que pode sugerir a

coalescência das gotículas de microemulsão quando esta é diluída.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 96

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Figura 5.5 – Diagramas de fases a partir dos quais foram obtidos os sistemas auto-microemulsificantes (a) ME-G

e (b) ME-H. A região entre as duas linhas pontilhadas indica a região propícia para formulação de sistemas auto-

microemulsificantes.

O sistema ME-G é composto de 46,66% em massa da mistura Tween 80:Span 20 (3:1),

que foi o tensoativo utilizado, 23,33% de propilenoglicol (PG) como cotensoativo, e 30,0% de

IPM, utilizado como fase oleosa. Para este sistema de uso oral, o etanol foi substituído pelo

propilenoglicol, que é um álcool mais tolerável que o primeiro. Por sua vez, o sistema auto-

microemulsificante ME-H contém em sua composição 52,29% da mistura Tween 80:Span 20

(3:1), 13,06% de etanol (EtOH), 2,65% de sorbitol (Sorb), 25,0% de IPM e 7,0% de água

bidestilada, que foi utilizada para solubilizar o sorbitol. Neste sistema, o sorbitol foi utilizado

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 97

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

com o objetivo de diminuir a quantidade de etanol utilizada e garantir a estabilidade da

microemulsão após sucessivas diluições com água, já que apesar de ser um açúcar, o sorbitol

é freqüentemente utilizado como adjuvante na formação de microemulsões do tipo O/A

(KTISTIS, 1990; PARK e KIM, 1999). O mecanismo de atuação do sorbitol na microemulsão

ainda não está completamente elucidado, porém experimentos de espalhamento de luz

comprovaram que microemulsões contendo sorbitol tendem a apresentar gotículas com

tamanho duas vezes maior que os sistemas sem sorbitol (PARK e KIM, 1999).

5.3 TESTES DE SOLUBILIDADE

Um dos grandes desafios da indústria farmacêutica atualmente é a veiculação de

compostos bioativos pouco solúveis em água. Dados recentes mostraram que

aproximadamente 35-40% de todos os novos compostos químicos, isolados ou sintetizados,

apresentam baixa solubilidade aquosa (GODDEERIS et al., 2006; KOGAN e GART, 2006).

Nesse sentido, as microemulsões tornam-se valiosos instrumentos na veiculação desses

compostos, pois são capazes de solubilizá-los nos microdomínios da fase dispersa e, em

especial, na camada interfacial, aumentando, assim, a sua biodisponibilidade (NARANG et

al., 2007).

Neste trabalho, a solubilidade dos produtos naturais DCTN, CTN e AAA, bem como

dos extratos vegetais, foi avaliada a partir do cálculo da sua concentração em uma

microemulsão (ou uma solução de um dos seus componentes) saturada com precipitado

visível. Dessa forma, pôde-se garantir que ao se retirar uma alíquota do sobrenadante, após

centrifugação, e calcular a concentração do produto nesta alíquota, obteve-se a sua

solubilidade nesta solução após fazer todos os cálculos referentes às diluições realizadas.

5.3.1 Solubilização da trans-desidrocrotonina

A quantificação do produto natural bioativo trans-desidrocrotonina (DCTN) foi

realizada por espectroscopia no UV-Visível, em todos os sistemas microemulsionados

convencionais (ME-A ao ME-F), bem como em certos componentes isoladamente, tais como

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 98

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tween 80, IPM, água bidestilada, ácido oléico, Miglyol e propilenoglicol (Tabela 5.2). O

comprimento de onda máximo (λ

máx

) encontrado para a DCTN foi 238 nm, em metanol a

temperatura ambiente. O λ

máx

encontrado para os sistemas microemulsionados usados neste

trabalho variou de 215 a 230 nm, de modo que não houve sobreposição significativa com o

comprimento de onda da amostra a ser analisada. Em todas as análises, foi realizada a leitura

da absorbância da microemulsão sem a amostra (branco) no comprimento de onda de 238 nm

e descontada do sistema contendo a amostra, correlacionando a absorbância obtida com a

curva de calibração previamente construída (Anexo A).

Tabela 5.2 – Solubilidade da DCTN nos diversos veículos testados

Veículo Solubilidade DCTN (mg/mL)*

ME-A (O/A) 1,306 ± 0,048

ME-B (bicontínua) 12,024 ± 0,538

ME-C (A/O) 25,045 ± 0,141

ME-D (A/O)** 10,262 ± 0,423

ME-E (bicontínua) 10,967 ± 0,492

ME-F (A/O) 27,193 ± 0,368

IPM 4,176 ± 0,035

Miglyol 11,754 ± 0,588

Ácido oléico 5,427 ± 0,236

Propilenoglicol 4,774 ± 0,076

Tween 80 4,266 ± 0,304

Água 5,03 × 10

-2

± 0,0048

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos (Solubilidade = média ± desvio-padrão)

** Isento de cotensoativo

A polaridade mediana da DCTN permitiu obter melhores resultados com os sistemas

ME-C e ME-F, que são microemulsões do tipo A/O. Neste caso, a grande quantidade da fase

oleosa contribuiu para a dissolução da molécula, que pode se encontrar dissolvida no meio

dispersante (fase oleosa), bem como na camada interfacial de tensoativo. A ausência do

cotensoativo (etanol) ocasionou significativa redução da solubilidade da DCTN no sistema

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 99

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

ME-D. A justificativa pode ser dada pela diminuição da fluidez da camada de tensoativo, em

função da ausência do etanol (que solubiliza bem a DCTN), que tem como consequência a

diminuição da capacidade de solubilização da camada interfacial.

A grande quantidade de água (60% em massa) na ME-A fez com que a DCTN

apresentasse a menor solubilidade nesse sistema quando comparada com os demais sistemas

microemulsionados testados, sendo mais baixa inclusive que a sua solubilidade nos

componentes isolados da microemulsão. De fato, microemulsões do tipo O/A não são

apropriadas para solubilizar moléculas com baixa polaridade. Entretanto, uma forma de se

elevar a solubilidade da DCTN em microemulsões do tipo O/A seria aumentar a proporção de

tensoativo/cotensoativo, permitindo assim a obtenção de gotículas com menores tamanhos e

uma associação mais facilitada entre a camada interfacial e a molécula da DCTN. Para os

sistemas bicontínuos (ME-B e ME-E) a DCTN apresentou solubilidade intermediária entre os

sistemas do tipo A/O e O/A, porém equivalente à ME-D.

Quanto à solubilidade da DCTN nos componentes individuais, verificou-se maior

solubilidade nos óleos e no Tween 80 que na água, como já era esperado, devido à polaridade

mediana da molécula. Mesmo assim, sua solubilidade em todos os óleos foi inferior àquela

verificada nas microemulsões do tipo A/O, o que comprova o grande poder de solubilização

dos sistemas microemulsionados. Um resultado interessante foi a alta solubilidade da DCTN

no Miglyol, superando em mais de duas vezes a dos outros óleos testados e se equivalendo às

microemulsões bicontínuas e à ME-D. O grande volume molecular do Miglyol pode ser o

responsável pelo alto poder solubilizante deste óleo semi-polar (NARANG et al., 2007).

Entretanto, a DCTN não foi encapsulada em nenhum sistema microemulsionado contendo

Miglyol, pois todas as misturas testadas com este óleo geraram pequenas regiões de

microemulsão.

Quanto à estabilidade dos sistemas microemulsionados, não se observou a quebra das

microemulsões com o tempo. Também não se observou a precipitação da DCTN solubilizada

nos sistemas ME-C e ME-D, nos quais a DCTN microemulsionada foi disponibilizada para

testes farmacológicos, em um intervalo mínimo de três meses.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 100

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.3.1.1 Solubilização nos sistemas auto-microemulsificantes

O produto natural bioativo trans-desidrocrotonina foi solubilizado satisfatoriamente no

sistema auto-microemulsificante ME-G (solubilidade = 10,830 ± 0,221 mg/mL), que possui

em sua composição o propilenoglicol como cotensoativo ao invés do etanol. O

propilenoglicol (propan-1,2-diol) é um cotensoativo menos tóxico que o etanol, e por isso é

largamente empregado em formulações farmacêuticas, chegando a atingir 55% em massa em

formulações comerciais de uso oral, como na formulação Agenarase®, que contém o

amprenavir como princípio ativo (STRICKLEY, 2004).

O alto poder solubilizante de um sistema microemulsionado deriva principalmente da

solubilização na camada interfacial de tensoativo. Nesse contexto, a solubilização de um

fármaco na camada interfacial afeta a microemulsão em nível microestrutural (por exemplo, o

tamanho das gotículas), mas também é intensamente afetada pelas mudanças estruturais que

porventura ocorrerem na microemulsão. Quando um sistema auto-microemulsificante é

diluído com água, como observado no trato gastrintestinal, ocorre a inversão da curvatura da

camada interfacial: as gotículas do tipo A/O se transformam em gotículas do tipo O/A.

Durante este fenômeno, pode ocorrer a precipitação do fármaco solubilizado no sistema auto-

microemulsificante, principalmente quando o sistema está próximo da capacidade máxima de

solubilização do fármaco em questão. Isso porque, além da camada interfacial, a fase oleosa

também desempenha um importante papel no poder solubilizante das microemulsões, uma

vez que as moléculas do óleo penetram na camada interfacial de tensoativos, aumentando a

hidrofobicidade desta e, assim, favorecendo a solubilização de fármacos lipofílicos.

Dessa forma, a precipitação de um fármaco a partir de um sistema auto-

microemulsificante se deve a uma súbita diminuição da capacidade de solubilização da

microemulsão, que pode ocorrer durante a diluição em água. Neste caso, a água interfere na

curvatura da camada interfacial, principalmente em sistemas contendo cotensoativos, que

podem migrar para a fase aquosa dispersante com a diluição. Assim, o processo de

precipitação pode ser afetado pelas condições do trato gastrintestinal e pela atuação lipídica

(NARANG et al., 2007; PORTER et al., 2004; GODDEERIS et al., 2007; FATOUROS et al.,

2008).

A fim de se avaliar a possibilidade de precipitação da DCTN a partir do sistema auto-

microemulsificante ME-G no que diz respeito à diluição com água, foram realizados dois

experimentos de solubilidade. Em um deles partiu-se do sistema ME-G saturado com a DCTN

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 101

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

(na capacidade máxima de solubilização da DCTN, ou seja, na concentração de 10,8 mg/mL),

e no outro partiu-se de uma concentração 3,0 mg/mL de DCTN incorporada no sistema ME-

G. Ambos os sistemas foram diluídos duas vezes: três vezes a concentração original D0 (D1)

e trinta vezes a concentração original (D2), e tiveram sua solubilidade testada nos sistemas

diluídos D1 e D2 (Tabela 5.3).

Tabela 5.3 – Dados de solubilidade da DCTN no sistema ME-G após sucessivas diluições em água

Sistema

(Diluição)

Concentração

teórica (mg/mL)

Concentração

obtida (mg/mL)

Concentração obtida/

concentração teórica

ME-G D0

(original)

3,0 3,0 100,0%

10,8 10,8 100,0%

ME-G D1

(3 vezes)

1,0 1,0 100,0%

3,6 2,9 80,5%

ME-G D2

(30 vezes)

0,10 0,08 80,0%

0,36 0,24 66,7%

Para o sistema não-saturado na concentração inicial de 3,0 mg/mL, cerca de 80% da

DCTN permaneceu retida no sistema auto-microemulsificante após à diluição D2,

correspondente à trinta vezes a concentração original. Este resultado já era esperado e reforça

o uso do sistema ME-G na veiculação oral da DCTN, uma vez que não se observou

precipitação considerável do produto natural na concentração testada. O propilenoglicol,

presente na composição do sistema ME-G, é menos propenso à migração para a fase aquosa

que o etanol, que é comumente utilizado como cotensoativo em sistemas auto-

microemulsificantes, e pode ser o responsável pela baixa precipitação da DCTN, uma vez que

a camada interfacial permaneceu praticamente intacta, no que diz respeito à sua

hidrofobicidade.

No entanto, quando este experimento foi repetido na capacidade máxima de

solubilização do sistema ME-G, observou-se a redução de cerca de 35% na solubilidade da

DCTN no sistema diluído D2 (Tabela 5.3). Este fato pode ser atribuído à inversão da

curvatura da camada interfacial, associado a mudanças microestruturais do local de

solubilização da DCTN (NARANG et al., 2007).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 102

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.3.2 Solubilização de outros produtos bioativos de Croton cajucara

A trans-crotonina (CTN), outro clerodano isolado de Croton cajucara, teve sua

solubilidade testada nos sistemas microemulsionados contendo IPM como fase oleosa e etanol

como cotensoativo (sistemas ME-A a ME-C), bem como nos componentes Tween 80, IPM e

água bidestilada (Tabela 5.4). A CTN apresentou solubilidade bastante inferior àquela

observada para a DCTN. Porém, de maneira similar à DCTN, a solubilidade da CTN foi

maior nos sistemas ricos em fase oleosa (ME-B e ME-C), devido à polaridade mediana desta

molécula. Além disso, sua solubilidade nos sistemas microemulsionados foram superiores em

comparação com seus componentes isolados, o que comprova a eficácia das microemulsões

na solubilização deste importante produto natural.

Tabela 5.4 – Solubilidade da CTN nos diversos veículos testados

Veículo Solubilidade CTN (mg/mL)*

ME-A 2,038 ± 0,115

ME-B 3,941 ± 0,080

ME-C 3,585 ± 0,065

IPM 2,613 ± 0,183

Tween 80 2,781 ± 0,396

Água 5,3 × 10

-2

± 0,048

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos (Solubilidade = média ± desvio-padrão)

Quanto ao triterpeno ácido acetilaleuritólico (AAA), sua solubilidade foi testada em

diversos sistemas microemulsionados, porém em nenhum deles a solubilidade foi superior a 1

mg/mL. O AAA apresenta propriedades biológicas significativas (MACIEL et al., 2000),

porém sua baixa solubilidade em praticamente todos os excipientes biológicos limita sua

biodisponibilidade e, consequentemente, uma resposta farmacológica satisfatória. Estudos de

RMN no estado sólido, DSC e de modelagem molecular confirmaram que a molécula de

AAA apresenta-se sob a forma dimérica, com ligações de hidrogênio inter-moleculares,

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 103

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

diminuindo, assim, a ocorrência de formação de ligações de hidrogênio com a água, e

consequentemente a sua solubilidade (SAN GIL et al., 2008).

5.3.3 Solubilização de extratos vegetais

Extratos e frações obtidas de três diferentes espécies – Croton cajucara, Anacardium

occidentale e Phyllanthus amarus – foram solubilizados nos sistemas microemulsionados

ME-D e/ou ME-G para fins de realização de experimentos farmacológicos (Tabela 5.5). A

escolha destes dois sistemas microemulsionados é devida à ausência de etanol, que pode ser

um fator decisivo para a obtenção de bons resultados farmacológicos.

Tabela 5.5 – Solubilidade dos extratos vegetais nos sistemas microemulsionados testados

Extrato

Solubilidade extratos (mg/mL)*

ME-D ME-G

CC-EHA ― 8,04 ± 0,56

CC-FA 8,35 ± 1,05 2,94 ± 1,05

AO-EM 8,12 ± 2,47 ―

AO-FT 5,59 ± 1,35 ―

PA-EE 50,97 ± 0,64 44,25 ± 1,12

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos (Solubilidade = média ± desvio-padrão)

O extrato hidroalcoólico das cascas do caule de Croton cajucara (CC-EHA), bem como

uma fração deste extrato rica em alcalóides (CC-FA) foram solubilizados no sistema ME-G.

O extrato CC-EHA apresentou solubilidade satisfatória neste sistema, enquanto que a fração

rica em alcalóides (CC-FA) apresentou maior solubilidade no sistema ME-D.

O sistema microemulsionado ME-D solubilizou satisfatoriamente o extrato metanólico

de Anacardium occidentale (AO-EM) e a fração polar rica em taninos (AO-FT) obtida deste

extrato. A menor solubilidade para AO-FT pode ser atribuída à elevada polaridade desta

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 104

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

fração, uma vez que o sistema microemulsionado utilizado (ME-D) é rico em fase oleosa e

indicado para a solubilização de compostos lipofílicos.

O extrato etanólico de Phyllanthus amarus (PA-EE) foi o que apresentou o melhor

resultado nos testes de solubilidade. Este extrato é rico em lignanas (KASSUYA et al., 2006;

KASSUYA et al., 2003; MACIEL et al., 2007), que são compostos com polaridade

moderada, que podem ser facilmente solubilizados em sistemas microemulsionados ricos em

fase oleosa.

5.3.4 Considerações gerais sobre os testes de solubilidade

Os sistemas microemulsionados testados solubilizaram satisfatoriamente o produto

natural bioativo trans-desidrocrotonina (DCTN), em especial os sistemas ricos em fase oleosa

devido à polaridade mediana deste diterpeno. Adicionalmente, todos os sistemas

microemulsionados, à exceção do sistema ME-A, rico em fase aquosa, foram mais eficazes na

solubilização da DCTN do que seus componentes isoladamente, atestando o alto poder de

solubilização das microemulsões obtidas.

No entanto, não se observou a mesma capacidade de solubilização destes sistemas com

a CTN, apesar de a única mudança estrutural entre a DCTN ser a hidrogenação da ligação

dupla nos carbonos 3 e 4. Quanto ao triterpeno AAA, a sua solubilização nos sistemas

microemulsionados obtidos não produziu resultados satisfatórios. Portanto, uma das

alternativas remanescentes para a veiculação deste triterpeno é o seu encapsulamento em

nano- e micro-esferas, em que o AAA pode vir a ser encapsulado sob a forma sólida (SAN

GIL et al., 2008).

Os ensaios de diluição com o sistema auto-microemulsificante ME-G contendo a DCTN

demonstraram que não ocorreu precipitação significativa do material solubilizado, quando se

utiliza concentrações abaixo do ponto de saturação ou solubilidade máxima da microemulsão.

Este resultado pode ser visto como uma garantia da não-ocorrência de precipitação do

material microemulsionado em uma possível aplicação oral do sistema ME-G contendo a

DCTN.

Os sistemas microemulsionados obtidos neste trabalho também foram úteis na

solubilização de extratos de três diferentes espécies vegetais. À exceção do extrato etanólico

de Phyllanthus amarus (PA-EE), os demais extratos tiveram solubilidade inferior àquela

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 105

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

encontrada para o produto isolado DCTN. A existência de uma gama de produtos naturais de

diferentes polaridades pode ter sido o responsável por essa baixa solubilidade dos extratos

comparada com a DCTN. Mesmo assim, estes extratos foram mais solúveis nos sistemas

microemulsionados testados do que nos excipientes comumente utilizados, e dessa forma,

permitiu que ensaios farmacológicos fossem realizados com tais extratos.

5.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA

Os sistemas microemulsionados obtidos foram caracterizados quanto ao índice de

refração, comportamento reológico, distribuição de tamanho das gotículas e condutividade

elétrica. Os dados obtidos de índice de refração foram utilizados nas análises de tamanho das

gotículas.

5.4.1 Reologia

A análise dos resultados de viscosidade e de índice de refração obtidos para os seis

sistemas microemulsionados convencionais (ME-A a ME-F) indicou algumas características

interessantes que podem inviabilizar ou respaldar a sua aplicação em uma determinada via de

administração (Tabela 5.6). Adicionalmente, o comportamento reológico de microemulsões

pode ser um indicativo do arranjo estrutural das gotículas no interior do sistema.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 106

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tabela 5.6 – Dados de viscosidade e índice de refração dos sistemas microemulsionados

Sistema Viscosidade (cp)* Índice de refração

ME-A 11,25 ± 0,08 1,3723

ME-B 26,74 ± 0,08 1,4068

ME-C 15,81 ± 0,09 1,4178

ME-D 78,73 ± 0,08 1,4404

ME-E 28,85 ± 0,07 1,4122

ME-F 23,52 ± 0,07 1,4443

* Os valores correspondem à media de 100 pontos com período de rotação 1-150 s

-1

O sistema ME-A apresentou a menor viscosidade devido à maior quantidade de água

presente (60% em massa) neste sistema. Ainda assim, sua viscosidade foi dez vezes superior

ao valor da viscosidade da água pura a 25 ºC. Este resultado pode ser atribuído à estrutura

rígida, bem como ao baixo BHL (lipofilicidade) da mistura de tensoativo no sistema ME-A.

Isto pode ser comprovado quando comparamos este sistema com o sistema rico em óleo, ME-

C. Em comparação com ME-A, o sistema ME-C apresentou viscosidade pouco superior,

apesar de apresentar grande quantidade de IPM, que apresenta viscosidade bem superior à

água, demostrando que a mistura de tensoativo Tween 80 : Span 20 (3:1) apresenta maior

afinidade com o óleo (IPM). Em termos de aplicação farmacológica, pode-se inferir que o

sistema ME-A não seria útil para aplicação parenteral. Para esta aplicação, faz-se necessário o

uso de sistemas ricos em água, porém com baixa viscosidade. No entanto, o sistema ME-A

pode ser aplicado em outras vias como a intranasal e intra-ocular, por exemplo.

Os sistemas ricos em fase oleosa, ME-C (45% de IPM) e ME-F (55% de ácido oléico),

apresentaram alta viscosidade. No entanto, o sistema ME-F apresentou viscosidade superior

devido principalmente à presença do ácido oléico, que é uma molécula hidrofóbica de cadeia

longa e, portanto, com menor poder de penetração na camada interfacial de tensoativo que o

IPM. A alta viscosidade desses sistemas, aliada ao caráter lipofílico da microemulsão do tipo

A/O torna estes sistemas valiosos para aplicação transdérmica de fármacos.

Para o sistema ME-D, a ausência do cotensoativo etanol ocasionou aumento

significativo da sua viscosidade. De fato, uma das funções do cotensoativo é aumentar a

fluidez da camada interfacial de tensoativo. Sua ausência, portanto, acarreta em uma maior

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 107

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

rigidez dos domínios água-óleo formados, modificando a viscosidade do sistema, e a região

de microemulsão (que diminui), como pode ser observado no diagrama de fases (Figura 5.2a,

página 89).

Os sistemas ME-B e ME-E, que possuem quantidades equivalentes de água e óleo em

sua composição, apresentaram a maior viscosidade dentre os sistemas que possuíam

cotensoativo. Este resultado pode ser indicativo, mas não necessariamente conclusivo, da

presença de estruturas bicontínuas no interior do sistema. Estruturas bicontínuas são

caracterizadas por extensos domínios de óleo e água inter-conectados tridimensionalmente, e

por isso, apresentam geralmente alta viscosidade (BOLZINGER-THEVENIN et al., 1999).

Todos os sistemas microemulsionados convencionais apresentaram comportamento

Newtoniano, ou seja, a taxa de cisalhamento foi proporcional à tensão aplicada,

proporcionando, assim, uma viscosidade constante com o tempo dentro da faixa de tensão

aplicada (Anexo B).

5.4.1.1 Reologia dos sistemas auto-microemulsificantes

Os sistemas auto-microemulsificantes também foram avaliados quanto ao seu

comportamento reológico. Inicialmente, foram obtidas a viscosidade de ambos os sistemas

(ME-G e ME-H) na sua forma original (D0), bem como nas diluições em um fator de 3 e em

fator de 30 (D1 e D2, respectivamente) (Tabela 5.7). Como era de se esperar, os sistemas

originais D0 apresentaram elevada viscosidade, devido à ausência (ou pequena quantidade) de

água em sua composição inicial. No entanto, a viscosidade do sistema ME-G foi praticamente

o dobro da observada para o sistema ME-H. Dois fatores contribuíram para este resultado: (i)

o uso do etanol como cotensoativo no sistema ME-H, que conferiu maior fluidez à camada

interfacial de tensoativo, e (ii) a presença do propilenoglicol como cotensoativo no sistema

ME-G. O propilenoglicol, de fato, possui viscosidade acentuada quando comparado aos

alcoóis simples, apresentando um aspecto oleoso. Apesar da alta viscosidade dos sistemas

originais D0, ambos (ME-G e ME-H) apresentaram comportamento Newtoniano (Anexo B).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 108

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tabela 5.7 – Dados de viscosidade e índice de refração dos sistemas auto-microemulsificantes

Sistema Viscosidade (cp)* Índice de refração

ME-G (D0) 145,72 ± 0,26 1,4471

ME-G (D1) 3,61 ± 0,09 1,3610

ME-G (D2) 1,18 ± 0,07 1,3349

ME-H (D0) 74,6 ± 0,23 1,4390

ME-H (D1) 3,67 ± 0,09 1,3586

ME-H (D2) 1,16 ± 0,06 1,3346

* Os valores correspondem à media de 100 pontos com período de rotação 1-150 s

-1

Quanto aos sistemas diluídos, pode-se observar que houve um decréscimo bastante

significativo da viscosidade a partir da primeira diluição D1 (fator 3), que apresenta

aproximadamente 75% em massa de água. Isto significa que os sistemas auto-

microemulsificantes obtidos são bastante toleráveis à presença de água, ou seja, à diluição em

água, principalmente quando se compara sua viscosidade com a do sistema microemulsionado

convencional rico em água, ME-A (aproximadamente 11,25 cp). Esta capacidade de

assimilação de moléculas de água no interior da microemulsão é uma característica

fundamental dos sistemas auto-microemulsificantes. Na segunda diluição, D2, (com fator de

diluição 30) a viscosidade do sistema ficou bastante próxima à viscosidade da água pura na

temperatura analisada. Todos os sistemas diluídos, D1 e D2, tanto para o sistema ME-G

quanto para ME-H, apresentaram comportamento Newtoniano (Anexo B).

Outro estudo foi realizado a fim de se determinar os tipos de microestruturas presentes

no decorrer da diluição dos sistemas auto-microemulsificantes. No início da diluição, devido à

pequena quantidade de água presente, as microestruturas observadas no sistema são do tipo

A/O. Continuando a diluição, a quantidade de água aumenta até se observar a inversão das

gotículas no interior da microemulsão para o tipo O/A. Entre essa inversão, ocorre a formação

de estruturas bicontínuas ou cristais líquidos, que são caracterizadas por uma alta viscosidade

(BOLZINGER-THEVENIN et al., 1999). Assim, o perfil de viscosidade reflete as interações

estruturais ocorridas no decorrer da diluição e não necessariamente os pontos nos quais as

transições ocorrem. Para o sistema ME-G o pico máximo de viscosidade foi alcançado com a

adição de 30% em massa de água, enquanto que para o sistema ME-H ele foi alcançado com

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 109

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

40% de água. (Figura 5.6). Neste pico, podemos garantir a existência de estruturas bicontínuas

e/ou cristais líquidos (gel, estruturas cúbicas, cilíndricas, lamelares). Após o pico, a adição de

mais água provoca o colapso das estruturas em forma de gel e a viscosidade diminui

significativamente, sugerindo a formação de microestruturas do tipo O/A.

Como esperado, o sistema ME-G apresentou viscosidade superior ao sistema ME-H nas

primeiras diluições. Entretanto, nas últimas diluições realizadas, um decréscimo acentuado da

viscosidade do sistema ME-G foi observado. Isto significa que a inversão das gotículas do

tipo A/O para O/A ocorre mais rapidamente no sistema ME-G, ou que a existência de

estruturas bicontínuas é mais frequentemente observada no sistema ME-H. Além disso, o

estudo reológico dessas diluições demonstrou que ambos os sistemas deixaram de ter um

comportamento Newtoniano (Anexo B) em uma diluição intermediária (para ME-G: 20-40%

de água; ME-H: 30-40%) para retornarem apenas nas últimas diluições (a partir de 50% para

ME-G e ME-H) (Figura 5.6). Este comportamento não-Newtoniano é característico de

estruturas lamelares e cristais líquidos (CHAN et al., 2007; D’ANTONA et al., 2000).

Figura 5.6 – Perfil de viscosidade dos sistemas auto-microemulsificantes no decorrer de uma diluição com água

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 110

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.4.2 Distribuição de tamanho das gotículas

O tamanho médio das gotículas nos sistemas microemulsionados convencionais (ME-A

a ME-F) são mostrados na Tabela 5.8. À exceção do sistema ME-F, todas as outras

microemulsões apresentaram diâmetro médio das gotículas inferior a 30 nm, dentro da faixa

nanométrica. Adicionalmente, apresentaram também baixo índice de polidispersão, o que

representa uma distribuição de tamanho mais uniforme. O resultado aparentemente

discrepante para o sistema ME-F foi repetido em dois equipamentos diferentes, que

apresentaram valores semelhantes. Este resultado pode ser demonstrativo de um sistema

meta-estável, uma microemulsão que se encontra no limiar de se tornar uma emulsão. De fato,

a adição de uma pequena quantidade de água (e.g. o volume de meia gota) ocasiona a quebra

da microemulsão, transformando-a em um sistema emulsionado de aspecto turvo.

Tabela 5.8 – Dados de diâmetro das gotículas e índice de polidispersão dos sistemas microemulsionados

Sistema Diâmetro (nm)* Índice de Polidispersão

ME-A 29,2 ± 0,5 0,290 ± 0,005

ME-B 21,1 ± 0,1 0,253 ± 0,004

ME-C 22,6 ± 1,1 0,264 ± 0,014

ME-D 19,4 ± 0,3 0,212 ± 0,009

ME-E 11,7 ± 0,1 0,308 ± 0,002

ME-F 4604,2 ± 220,1 0,489 ± 0,012

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos (média ± desvio-padrão)

O resultado mais elevado para o sistema ME-A, rico em fase aquosa, já era esperado,

tendo em vista que foi utilizada uma mistura de tensoativos com baixo BHL. O alto caráter

lipofílico dos tensoativos utilizados faz com que eles se auto-associem, em meio aquoso, com

uma curvatura relativamente pequena, a fim de evitar ao máximo o contato de suas regiões

hidrofóbicas com as moléculas de água, o que reflete em um maior diâmetro das gotículas de

microemulsão do tipo O/A.

Os sistemas bicontínuos, ME-B e ME-E, apresentaram baixos valores para o diâmetro

de suas partículas. Considerando que os sistemas bicontínuos são constituídos de extensas

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 111

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

regiões de óleo e água, tal resultado parece ser discrepante. Entretanto, a análise do tamanho

de partículas utilizando técnicas de espalhamento de luz fornece resultados considerando

sempre o formato esférico das partículas (ACHARYA et al., 2001), limitando, assim, a

utilização desta técnica para a obtenção do tamanho das gotículas em sistemas bicontínuos.

Outro fator que aponta para a existência de sistemas bicontínuos é o alto índice de

polidispersão. Apesar, de ter apresentado o menor tamanho de suas gotículas, o sistema ME-E

também apresentou o maior índice de polidispersão (excetuando o sistema ME-F).

Também foi obtido o tamanho médio das gotículas do sistema ME-D contendo a

DCTN. O tamanho médio observado foi de 20,5 ± 0,1 nm, com índice de polidispersão igual a

0,225. O aumento do tamanho das gotículas de microemulsão no sistema ME-D com a

incorporação da DCTN evidencia a localização da molécula de DCTN na camada interfacial

de tensoativos. A presença de moléculas de DCTN entre moléculas do tensoativo provoca a

diminuição da curvatura da micela, e consequentemente, o aumento do tamanho das gotículas.

Por outro lado, a incorporação da DCTN no sistema ME-C provocou a diminuição do

tamanho das gotículas (18,1 ± 0,3 nm; índice de polidispersão = 0,233). Sabe-se que a adição

de cotensoativos ocasiona a expansão da camada interfacial, e consequentemente, o aumento

do tamanho das gotículas de microemulsão (PATEL e VAVIA, 2007), o que explica, por

exemplo, o menor tamanho das gotículas de microemulsão do tipo A/O no sistema ME-D,

isento de etanol, comparado com o sistema ME-C, ambos sem o fármaco incorporado. A

incorporação da DCTN nos sistemas microemulsionados compete com o etanol pela

localização na camada interfacial. A DCTN incorporada expulsa moléculas de etanol da

camada interfacial. Como a DCTN é uma molécula de tamanho médio, a expulsão de

moléculas do cotensoativo no filme interfacial tem um efeito mais pronunciado (diminuição

do tamanho) que o aumento de tamanho ocasionado pela incorporação das moléculas de

DCTN.

O tamanho médio das gotículas nos sistemas auto-microemulsificantes (ME-G e ME-H)

também foi avaliado em função da diluição em água. Nesse contexto, foi analisado o tamanho

médio das gotículas nos sistemas originais (D0) e em dois sistemas diluídos (D1 e D2). Para o

sistema ME-G não foi observado qualquer influência da adição de água no tamanho das

gotículas (aproximadamente 60 nm) (Tabela 5.9). No entanto, para o sistema ME-H observou-

se um comportamento anômalo para o tamanho médio das gotículas, o que pode ocasionar

problemas de liberação e/ou precipitação do fármaco antes de alcançar o estômago, causados

principalmente pela migração do etanol da camada interfacial para a fase aquosa dispersante,

justificando as mudanças microestruturais observadas (NARANG et al., 2007).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 112

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tabela 5.9 – Dados de diâmetro das gotículas e índice de polidispersão dos sistemas auto-microemulsificantes

Sistema Diâmetro (nm)* Índice de Polidispersão

ME G (D0) 32,5 ± 0,5 0,361 ± 0,008

ME G (D1) 61,7 ± 0,5 0,274 ± 0,002

ME G (D2) 59,6 ± 0,6 0,120 ± 0,012

ME H (D0) 41,7 ± 4,4 0,371 ± 0,006

ME H (D1) 85,1 ± 1,3 0,328 ± 0,003

ME H (D2) 23,1 ± 0,2 0,076 ± 0,008

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos (média ± desvio-padrão)

5.4.3 Condutividade elétrica

Medidas de condutividade elétrica podem ser empregadas para monitorar mudanças

estruturais nas microemulsões no decorrer de uma diluição. Um gráfico de condutividade

versus fração de água apresenta tipicamente um formato de sino, onde é possível distinguir

três importantes regiões (PODLOGAR et al., 2004; PODLOGAR et al., 2005) (Figura 5.7).

Inicialmente, observa-se pequeno acréscimo da condutividade com a adição de água (Φ

12% para o sistema ME-G; e Φ

< 20% para o ME-H). Neste intervalo são encontradas

gotículas do tipo A/O, que estão isoladas uma das outras. Quando a fração de água (Φ

)

alcança e excede um valor crítico conhecido como limiar de percolação (Φ

), as gotículas

começam a interagir umas com as outras, formando gotículas maiores além de canais com

muitos caminhos de condutividade, provocando um aumento significativo da condutividade

(k). O limiar de percolação (Φ

) pode ser estimado com maior precisão a partir do gráfico

(dk/dΦ

) em função da fração de água (Φ

) (PODLOGAR et al., 2004; PODLOGAR et al.,

2005) (Figura 5.8). O pico máximo desse gráfico corresponde ao Φ

e pode ser encontrado

entre 20-30% de água para o sistema ME-G, e entre 30-40% para o sistema ME-H. Assim, a

transição de gotículas do tipo A/O para a fase bicontínua ocorre nesse intervalo. A região da

fase bicontínua é relativamente ampla, compreendendo o intervalo 20-30 < Φ

< 55% para

ambos os sistemas, onde a curva perde a sua linearidade. Com a adição de mais água, a

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 113

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

condutividade decai um pouco, sugerindo a ocorrência do processo de transformação da fase

bicontínua em gotículas do tipo O/A, onde a fase aquosa torna-se a fase contínua.

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

100

ME-G

k (μ S/cm)

% água

0 1020304050607080

100

ME-H

k (μ S/cm)

% água

Figura 5.7 – Gráficos de condutividade elétrica em função da composição de água nos sistemas auto-

microemulsificantes ME-G (a) e ME-H (b).

A análise das mudanças estruturais nos sistemas auto-microemulsificantes feita a partir

dos dados de condutividade corroboraram com os resultados de viscosidade. A região de fase

bicontínua ou cristais líquidos inicia-se entre 20-30% e se estende por volta de 50-60% de

água, e é caracterizada por um aumento significativo da condutividade (Figura 5.7) e da

viscosidade (Figura 5.6). Antes e após essa região temos, respectivamente, microestruturas do

tipo A/O e O/A.

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

-6

-4

-2

dk/d φ

% água

ME-H

ME-G

Figura 5.8 – Gráfico da primeira derivada dk/dΦ

em função da composição de água

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 114

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.4.4 Considerações gerais sobre a caracterização físico-química

Os ensaios de caracterização físico-química permitiram confirmar o tamanho

nanométrico das microemulsões obtidas e, principalmente, estimar o tipo de microestrutura

presente em cada sistema microemulsionado convencional (ME-A a ME-F). Desta forma, os

resultados de distribuição de tamanho sugerem que o sistema ME-F, apesar de ser unifásico e

límpido, pode não se constituir em uma microemulsão. Além disso, os dados de viscosidade

obtidos também permitiram viabilizar ou restringir cada sistema microemulsionado para

aplicação em determinada via de administração (parenteral, oral, transdérmica, etc.).

Quanto aos sistemas auto-microemulsificantes, observou-se concordância dos

resultados de viscosidade e condutividade com relação às transições de microestruturas

observadas no decorrer da diluição em água. A inversão das gotículas A/O para O/A ocorre

mais cedo para o sistema ME-G. O sistema ME-H apresentou extensa região de cristais

líquidos e/ou fase bicontínua, mesmo em altas composições de fase aquosa.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 115

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.5 AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES ANTIOXIDANTE E BACTERIOSTÁTICA

Produtos naturais bioativos e extratos obtidos de diversas espécies vegetais apresentam

valiosas propriedades biológicas. Extratos e frações, apesar de conterem uma variedade de

substâncias, podem apresentar um ou mais princípios ativos responsável(is) por determinada

propriedade farmacológica da planta. Dessa forma, podem-se reduzir custos e trabalho com o

isolamento de um produto natural bioativo, utilizando-se extratos e frações, contendo este

produto em quantidade apreciável, sem perda significativa de suas propriedades biológicas.

No entanto, a utilização de extratos vegetais pode recair no mesmo problema

frequentemente observado para produtos naturais isolados: a baixa solubilidade nos

excipientes convencionais. Nesse contexto, os sistemas microemulsionados podem se tornar

valiosos instrumentos para a biodisponibilização desses extratos, bem como para diminuição

da sua dose-resposta.

Neste trabalho foi avaliada a propriedade antioxidante de extratos de diferentes espécies

vegetais, bem como a atividade bacteriostática de um extrato de Croton cajucara. Em todos

os ensaios farmacológicos, os extratos foram solubilizados em microemulsões, a fim de se

avaliar a eficácia desses sistemas como veículos farmacológicos.

5.5.1 Propriedade antioxidante

A propriedade antioxidante de extratos ou frações das espécies vegetais Croton

cajucara, Anacardium occidentale e Phyllanthus amarus foi avaliada frente ao radical DPPH.

Sistemas microemulsionados foram utilizados para aumentar a solubilidade dos materiais

testados com perspectiva de aumento da sua ação antioxidante. Em alguns casos, foi avaliada

a ação antioxidante de extratos na sua forma bruta e solubilizados em sistemas

microemulsionados, a fim de atestar a importância desses sistemas na veiculação de fármacos

e extratos vegetais.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 116

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.5.1.1 Extratos de Croton cajucara solubilizados em microemulsões

Os sistemas microemulsionados obtidos neste trabalho mostraram-se eficazes no

processo de solubilização dos extratos de diversas polaridades obtidos das folhas da espécie

Croton cajucara. O sistema ME-A (rico em fase aquosa) foi o que melhor solubilizou o

extrato metanólico (CC-EM), devido, principalmente, à alta polaridade deste extrato. Ambos

os sistemas ME-C e ME-D solubilizaram bem o extrato hexânico (CC-EH). Para o extrato

clorofórmico (CC-EC), o sistema contendo o cotensoativo (ME-C) foi o mais eficaz (GOMES

et al., 2007).

Os resultados antioxidativos obtidos com os extratos testados (CC-EH, CC-EC e CC-

EM) mostraram que as folhas de Croton cajucara apresentam propriedade antioxidante. A

atividade antioxidante foi expressa em valores de CE

± desvio-padrão (Tabela 5.10), obtidos

através do gráfico que relaciona o percentual de atividade antioxidante (%AA) com a

concentração de cada extrato testado.

Tabela 5.10 – Valores de CE

obtidos para os extratos CC-EH, CC-EC e CC-EM solubilizados em sistemas

microemulsionados

Extrato CE

(mg/mL)*

CC-EH em ME-C 413,00 ± 11,07

CC-EH em ME-D 446,07 ± 52,22

CC-EC em ME-C 279,96 ± 38,26

CC-EC em ME-D 362,63 ± 15,27

CC-EM em ME-A 348,05 ± 3,70

CC-EM em ME-D 321,83 ± 22,10

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos

Os extratos de maior polaridade (CC-EC e CC-EM) apresentaram os melhores

resultados antioxidantes, que pode ser justificado pela maior concentração dos flavonóides

3,7,4'-tri-O-metilcanferol e 3,7-di-O-metilcanferol, que são compostos polares presentes

nesses extratos (MACIEL et al., 2009).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 117

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Adicionalmente, pôde-se verificar, que em relação aos sistemas microemulsionados

testados, não se observou interferência significativa na atividade avaliada, à exceção do

extrato clorofórmico, CC-EC, que apresentou maior atividade antioxidante quando

solubilizado no sistema ME-C, que pode ser justificado pela baixa solubilidade deste extrato

no sistema ME-D.

5.5.1.2 Extratos de Anacardium occidentale solubilizados em microemulsões

Foram avaliados o extrato metanólico bruto (AO-EM) obtido das cascas de Anacardium

occidentale, bem como uma fração apolar correspondente ao óleo fixo (AO-FO) deste extrato

e outra fração muito polar, rica em taninos (AO-FT) (GOMES et al., 2006). Devido à sua

baixa solubilidade em excipientes comumente utilizados, a fração AO-FT foi solubilizada em

sistemas microemulsionados. Deste modo, pôde-se avaliar também a influência das

microemulsões na atividade antioxidante e, igualmente, atestar a sua importância como

veículos de fármacos.

Os resultados da avaliação da ação antioxidante mostraram-se bastante positivos,

particularmente para o extrato metanólico bruto (AO-EM) e para a fração rica em taninos

(AO-FT) (Tabela 5.11) (GOMES et al., 2006). No entanto, a fração correspondente ao óleo

fixo (AO-FO) não apresentou atividade até a dose de 710 μg/mL. De acordo com o esperado,

estes resultados indicam que a atividade antioxidante de AO-EM decorre provavelmente da

fração AO-FT rica em taninos (CHANWITHEESUK et al., 2005). Em relação aos sistemas

microemulsionados testados, ME-A e ME-D, não se observou interferência significativa na

atividade avaliada.

Apesar do caráter polar da fração AO-FT, ambas as formulações testadas (ME-A e ME-

D) solubilizaram parcialmente esta fração. Apesar disso, foram significativamente eficazes na

avaliação da ação antioxidante de Anacardium occidentale, já que possibilitaram a

biodisponibilização dos taninos. Uma vez que a ação antioxidante de AO-FT foi comparável

ao do extrato bruto (AO-EM), o poder antioxidante de Anacardium occidentale foi atribuído à

presença de taninos, contidos nesta fração. Outros sistemas microemulsionados não foram

avaliados, pois não foram mais eficazes na solubilização de AO-FT (GOMES et al., 2006).

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 118

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tabela 5.11 – Valores de CE

obtidos para os extratos e frações de Anacardium occidentale

Extrato CE

(μg/mL)*

AO-EM bruto 42,47 ± 0,14

AO-FT em ME-A 39,27 ± 1,07

AO-FT em ME-D 42,20 ± 5,20

AO-FO N/A

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos

5.5.1.3 Extratos de Phyllanthus amarus solubilizados em microemulsões

O extrato metanólico de Phyllanthus amarus (PA-EM) e suas formulações

microemulsionadas tiveram sua ação antioxidante avaliada frente ao radical DPPH (Tabela

5.12). Observou-se aumento efetivo da propriedade antioxidante quando o extrato PA-EM foi

microemulsionado. De fato, a utilização de um sistema microemulsionado aumentou a

capacidade do material solubilizado, prevenindo a sua precipitação durante o experimento e,

como consequencia, praticamente dobrando a sua ação antioxidante.

Tabela 5.12 – Valores de CE

obtidos para o extrato metanólico de Phyllanthus amarus

Extrato CE

(μg/mL)*

PA-EM bruto 46,67 ± 1,12

PA-EM em ME-A 18,33 ± 0,75

PA-EM em ME-D 22,96 ± 1,29

* Os valores correspondem à media de 3 experimentos

O sistema ME-A, do tipo O/A, foi mais eficaz que o sistema ME-D (A/O), rico em fase

oleosa, devido ao caráter polar do extrato avaliado. Microemulsões do tipo O/A são mais

eficazes na veiculação de compostos polares, como as lignanas e compostos fenólicos

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 119

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

presentes na espécie Phyllanthus amarus, que são provavelmente responsáveis pela sua ação

antioxidante (MACIEL et al., 2007).

5.5.2 Atividade bacteriostática

O extrato hidroalcoólico obtido das cascas do caule de Croton cajucara (CC-EHA),

solubilizado no sistema auto-microemulsificante ME-G, teve sua ação bacteriostática avaliada

frente a bactérias gram-negativa Escherichia coli e gram-positivas Bacillus cereus. Ambas as

linhagens utilizadas apresentaram-se sensíveis ao extrato CC-EHA em ME-G, tendo sido

observado efeito dose-dependente nas concentrações testadas (0,1; 0,5 e 1,0 mg/mL) (Figura

5.9).

Figura 5.9 – Percentual de sobrevivência de colônias da (a) bactéria gram-positiva B. cereus e (b) bactéria gram-

negativa E. coli em meio de cultura LB contendo diferentes concentrações do extrato CC-EHA após 24 h de

incubação. Cont+ = controle positivo (ampicilina : cloranfenicol, 4:1). Cont- = controle negativo

Comparativamente, o efeito inibitório mais significativo foi observado frente à bactéria

gram-positiva B. cereus (Figura 5.9a), e pode estar correlacionada com diferenças na estrutura

molecular, especialmente na membrana celular, entre os indivíduos destes dois grupos de

gram. Este efeito bactericida pode estar correlacionado com a presença de clerodanos (trans-

desidrocrotonina, dentre outros) (MACIEL et al., 2000), bem como com os constituintes

apolares presentes no óleo fixo do extrato CC-EHA (SOUZA et al., 2006).

O extrato CC-EHA apresenta baixa solubilidade aquosa, limitando seu uso oral e

parenteral. Nos ensaios bactericidas foi utilizado o sistema auto-microemulsificante ME-G

para a solubilização deste extrato, permitindo assim a avaliação de sua atividade

Cont + Cont - 0,1mg/ml 0,5mg/ml 1,0mg/ml

100

Sobrevivência bacteriana (%)

B. cereus

Extrato Croton cajucara

Cont + Cont - 0,1mg/ml 0,5mg/ml 1,0mg/ml

100

Sobrevivência bacteriana (%)

E. coli

Extrato Croton cajucara

a b

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 120

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

bacteriostática. O uso deste tipo de microemulsão ao invés dos sistemas microemulsionados

convencionais (ME-A a ME-F) foi de extrema importância neste tipo de ensaio biológico,

visto que nele ocorrem diluições em meio essencialmente aquoso, o que provocaria a quebra

das microemulsões se não fosse utilizado um sistema auto-microemulsificante. O sistema

ME-H, também um sistema auto-microemulsificante, não foi utilizado por conter etanol em

sua composição, um solvente que apresenta propriedades citotóxicas que poderia interferir

nos resultados obtidos. No entanto, mesmo com o uso do sistema ME-G, isento de etanol,

observou-se efeito bactericida moderado da microemulsão testada.

5.5.3 Considerações gerais sobre os ensaios antioxidantes e bacteriostáticos

A atividade antioxidante está correlacionada com a presença de certas classes de

compostos que possuem a propriedade de neutralizar a ação do oxigênio radicalar. Plantas de

diversas espécies vegetais contêm substâncias antioxidantes e são empregadas no combate a

doenças cuja etiologia é o estresse oxidativo. Entretanto, certos compostos e extratos dessas

plantas apresentam baixa solubilidade nos excipientes mais utilizados, podendo ocasionar sua

precipitação e diminuição da atividade antioxidante. Neste sentido, as microemulsões podem

atuar na solubilização de agentes antioxidantes, prevenindo a sua precipitação e,

consequentemente, contribuindo eficazmente para a biodisponibilidade do fármaco e, em

alguns casos, ampliando sua ação biológica. Como exemplo, destacam-se os experimentos

envolvendo extratos de Croton cajucara, que tiveram sua atividade antioxidante diretamente

proporcional à sua solubilidade em sistemas microemulsionados.

As microemulsões obtidas neste trabalho foram, ainda, imprescindíveis para a

realização de ensaios que avaliaram a propriedade antioxidante de uma fração polar, insolúvel

em solventes biológicos, obtida de Anacardium occidentale (AO-FT). Dessa forma, pôde-se

atribuir à classe de compostos dos taninos a responsabilidade por grande parte da ação

antioxidante do extrato metanólico desta planta. Os resultados antioxidativos obtidos com as

microemulsões utilizadas, bem como com os extratos e frações solubilizados nestes sistemas

microemulsionados, demonstraram que as formulações não interferem nos resultados e foram

eficazes na solubilização dos materiais vegetais, reforçando, portanto, a utilização de

nanossistemas do tipo microemulsão como veículos de fármacos e extratos.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 121

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Do mesmo modo, a solubilização de CC-EHA em um sistema auto-microemulsificante

farmacologicamente aceitável possibilitou a avaliação do efeito bacteriostático deste extrato,

já que se trata de um extrato polar com baixa solubilidade nos solventes biológicos

comumente utilizados. No entanto, neste caso, houve interferência do sistema utilizado, tendo

sido evidenciado efeito bactericida moderado da microemulsão testada (ME-G) frente às

bactérias estudadas.

Os testes de avaliação das propriedades antioxidante e bacteriostática foram realizados

in vitro. Para o clerodano DCTN, sabe-se que a dosagem utilizada na avaliação in vivo de

diversas propriedades biológicas foi, na maioria dos casos, superior a 25 mg do produto

natural para cada kg do animal. Como exemplos: propriedade hipoglicêmica (25 e 50 mg/kg,

via oral), hipolipidêmica (50 mg/kg, via oral), antiulcerogênica (100 mg/kg, via oral),

antiinflamatória (50 e 200 mg/kg, via intraperitoneal), antinociceptiva (10, 20, 50 e 100

mg/kg, via oral), antiestrogênica (25 e 50 mg/kg, via oral), cardiovascular (10 e 15 mg/kg),

antitumoral contra o carcinoma de Ehrlich (120 mg/kg, via intraperitoneal) (COSTA et al.,

2007).

Comparativamente, pode-se dizer que os sistemas que apresentaram maior capacidade

de solubilização da DCTN foram aqueles do tipo A/O com a presença de etanol como

cotensoativo (cerca de 25 mg/mL). Neste contexto, para realização de ensaios in vivo

utilizando a DCTN incorporada nos sistemas microemulsionados avaliados, os experimentos

mais viáveis são as atividades antinociceptiva, hipoglicêmica e cardiovascular. Para os demais

experimentos, faz-se necessário a utilização de um volume maior de microemulsão para

atingir a concentração utilizada nos testes in vivo que foram previamente realizados com a

DCTN livre. Portanto, estudos toxicológicos das formulações obtidas neste trabalho,

correlacionando doseamento e composição das microemulsões, estão sendo realizados para

avaliar a possibilidade de veiculação segura deste protótipo de fármaco nestas formulações.

5.6 SIMULAÇÃO MD DE MICELAS DE C

N-LACTITOL E C

N-LACTOSIL

Sistemas micelares contendo tensoativos à base de açúcares, como C

N-lactitol e C

N-

lactosil, podem se constituir em uma excelente opção como veículos para fármacos. Estudos

computacionais podem ser empregados para a otimização desses sistemas a partir da

compreensão do processo de micelização.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 122

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

A concentração abaixo de 50%, soluções de C

N-lactitol apresentam uma fase

isotrópica micelar (I

) (AUVRAY et al., 1995). Em concentrações próximas de 0,1M, são

observados sistemas micelares contendo cerca de 88 monômeros (DUPUY et al., 1996;

DUPUY et al., 1998). Dados experimentais referentes ao C

N-lactosil não foram encontrados

na literatura. Adicionalmente, cerca de 5% das moléculas de C

N-lactitol encontram-se sob a

forma ionizada em soluções aquosas com pH 9-10 (DUPUY et al., 1996). Para as moléculas

de C

N-lactosil espera-se que esta porcentagem seja ainda menor, devido ao impedimento

estérico do grupo amino na configuração cíclica. Dessa forma, as simulações foram realizadas

com um alto grau de solvatação (cerca de 17.000 moléculas de água ou 0,25 M), com número

de agregação 88 para ambos os sistemas, e com todas as moléculas de tensoativo na forma

não-ionizada. As simulações MD foram realizadas em um intervalo de tempo de 10 ns no

ensemble NpT, porém os primeiros 500 ps foram tomados como etapa para equilíbrio. As

propriedades calculadas neste trabalho foram computadas utilizando o tempo total de

produção de 9,5 ns ou, em alguns casos, dos últimos 5 ns. As cargas parciais atômicas, para

cada um dos monômeros (Figura 5.10), foram calculadas a partir do nível HF/6-31G*, sendo

posteriormente utilizadas no algoritmo RESP (Tabela 5.13).

Figura 5.10 – Representação esquemática dos monômeros (a) C

N-lactosil e (b) C

N-lactitol. São mostrados os

átomos de oxigênio (vermelho), carbono (ciano), nitrogênio (azul) e hidrogênio (branco) das moléculas de

tensoativo

C10

C11

C12

C4 C5

cadeia alquílica

grupo glucitol

grupo glucosil

grupo galactosil

(a)

(b)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 123

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tabela 5.13 – Cargas parciais atômicas das moléculas de C

N-lactitol e C

N-lactosil usadas

nas simulações MD

Tipo de átomo

(ver Figura 3.1)

Cargas parciais

N-lactitol C

N-lactosyl

Cadeia alquílica

N -0.39 -0.52

C1-C10 0.00 to 0.02 0.01 to 0.03

C11 0.04 0.05

C12 -0.06 -0.07

H(N) 0.23 0.30

H(C1) 0.04 0.06

Outros hidrogênios -0.01 to 0.01 -0.01 to 0.01

Grupo glucosil (glucitol)

C1, C3 0.00 to 0.03 0.00 to 0.03

C2 0.09 -0.01

C4 -0.06 -0.03

C5 0.00 0.11

C6 0.06 0.06

O2, O3, O6 -0.63 to -0.53 -0.63 to -0.53

O4 -0.31 -0.30

O5 -0.57 -0.25

HO2, HO3, HO5

†

, HO6 0.38 to 0.43 0.38 to 0.40

Outros hidrogênios 0.01 to 0.15 0.11 to 0.18

Grupo galactosil

C1, C5 -0.02 -0.04 to -0.01

C2, C3, C4 0.02 to 0.04 0.01 to 0.04

C6 0.04 0.09

O2, O3, O4, O6 -0.63 to -0.60 -0.65 to -0.60

O5 -0.14 -0.05

HO2, HO3, HO4, HO6 0.37 to 0.46 0.36 to 0.48

Outros hidrogênios 0.10 to 0.18 0.09 to 0.15

†

Apenas para C

N-lactitol

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 124

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.6.1 Estabilidade e tamanho dos sistemas micelares

Apesar dos agregados micelares estarem em equilíbrio dinâmico em sistemas aquosos e

as trocas monômero-micela ocorrerem na escala de tempo de aproximadamente 10

-5

(FENDLER e FENDLER, 1975), em ambos os sistemas as micelas permaneceram estáveis e

eventos de escape de monômeros não foram observados no decorrer dos 10 ns de simulação.

Entretanto, foi observado eventos de escape de monômeros da célula periódica, conforme

esperado (KONIDALA et al., 2006; CHONG et al., 2006). Além disso, protusões na

superfície micelar foram claramente observadas a partir dos snapshots obtidos ao longo da

simulação (Figura 5.11). No decorrer da simulação, ambas as micelas perderam seu formato

esférico inicial para adotar uma conformação onde regiões específicas da cauda hidrofóbica e

da cabeça polar da superfície da micela estavam altamente expostas ao solvente.

Figura 5.11 – Snapshots dos agregados micelares (a) C

N-lactitol e (b) C

N-lactosil no decorrer de 10 ns de

simulação MD. São mostrados os átomos de oxigênio (vermelho), carbono (ciano), nitrogênio (azul) e

hidrogênio (branco) das moléculas de tensoativo, enquanto que as moléculas de água foram omitidas por

motivos de clareza

O raio de giro (R

) foi calculado sobre o tempo de simulação de 9,5 ns. O gráfico de R

em função do tempo para C

N-lactitol mostrou uma curva ligeiramente ascendente, cujo

valor médio de R

encontrado para este sistema foi 22,06 Å (Figura 5.12). Este valor está de

acordo com o valor experimental de 23,23 Å calculado a partir de técnicas de SANS e SAXS

obtidos de um sistema micelar no formato elipsóide oblato contendo 88 moléculas de C

N-

lactitol a 24 ºC (DUPUY et al., 1996; DUPUY et al., 1998). O valor médio de R

encontrado

para C

N-lactosil foi 21,43 Å, e permaneceu constante durante o tempo de simulação,

indicando estabilização deste sistema micelar. O valor superior de R

encontrado para o

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 125

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

sistema contendo C

N-lactitol em comparação com o C

N-lactosil pode estar relacionado à

grande flexibilidade do resíduo acíclico (glucitol) presente no composto alditol. Assim, os

graus de liberdade rotacionais do resíduo glucitol permitem a observação de múltiplas

conformações da cabeça polar no interior da camada hidrofílica.

Figura 5.12 – Raio de giro, R

, de micelas formadas por C

N-lactitol (preto) e C

N-lactosil (cinza) no decorrer

de 9,5 ns de simulação MD

5.6.2 Área Superficial Acessível ao Solvente (SASA)

A avaliação das regiões hidrofóbicas e hidrofílicas do sistema micelar expostas ao

solvente foram computadas sobre os últimos 9,5 ns de trajetória (Figura 5.13), usando o

método desenvolvido por LEE e RICHARDS (1971). A contribuição da cadeia alquílica de

ambos os sistemas ao valor total de SASA foi similar e apresentou-se constante durante a

simulação, com valores médios de 3.655 Å

e 3.537 Å

para C

N-lactitol e C

N-lactosil,

respectivamente. Comparada com o valor total de SASA (21.567 Å

para C

N-lactitol, e

22.108 Å

para C

N-lactosil), a contribuição da parte hidrofóbica é pequena (menos que

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 126

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

17%), indicando que as cadeias alquílicas estão apontadas para o centro da micela, evitando

ao máximo o contato com o solvente. A contribuição da cabeça polar ao valor total de SASA

foi dividida entre os dois grupos açúcar. Apesar de ambos os tensoativos conterem o mesmo

grupo externo galactosil, a contribuição deste grupo para o SASA foi notadamente diferente

(10.780 Å

para o grupo galactosil em C

N-lactitol, e 13.076 Å

em C

N-lactosil).

Entretanto, esta diferença foi compensada pelo grupo sacarídeo ligado à cadeia alquílica,

glucitol para C

N-lactitol (7.132 Å

) e β-glucosil para C

N-lactosil (5.495 Å

Figura 5.13 – Área Superficial Acessível ao Solvente (SASA) de micelas contendo moléculas de C

N-lactitol

(negrito) e C

N-lactosil no decorrer de 9,5 ns de simulação MD. São mostradas as áreas superficiais expostas

das cadeias alquílicas (inferior), e dos grupos glucosil/glucitol (meio) e galactosil (superior)

No processo de micelização, é esperado que a área superficial acessível da cauda

hidrofóbica diminua consideravelmente devido à agregação das moléculas de tensoativos

exposta à água (TANFORD, 1980). Em contrapartida, apenas mudanças sutis são

frequentemente observadas na área superficial acessível das cabeças polares (LAH et al.,

2006). Desvios no valor de SASA para a cauda hidrofóbica podem sugerir mudanças no

formato das micelas (KONIDALA et al., 2006), enquanto que desvios dos valores de SASA

dos grupos hidrofílicos podem ser atribuídos às interações intermoleculares entre as cabeças-

polares. Em nossas simulações MD a contribuição de cada grupo para o valor total de SASA

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 127

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

permaneceu constante para C

N-lactitol. Já para C

N-lactosil foi observada diminuição

gradual das contribuições provenientes dos grupos hidrofílicos galactosil e glucosil (Figura

5.13). Este decréscimo pode influenciar negativamente a hidratação da micela formada de

N-lactosil, uma vez que a grande quantidade de ligações de hidrogênio intermoleculares

pode reduzir a ocorrência de interações monômero-solvente.

5.6.3 Interações inter-monômeros

A rede de ligações de hidrogênio desempenha um papel fundamental na estabilidade,

conformação e solubilidade de compostos à base de açúcares, devido, principalmente, à

presença de vários grupos hidroxila em sua estrutura. De maneira geral, a situação mais

comum é cada grupo hidroxila estando associado com duas ligações de hidrogênio, uma como

doador e outra como aceptor de ligação de hidrogênio. Adicionalmente, o grupo amino

presente nas moléculas de C

N-lactitol e C

N-lactosil pode também atuar tanto como

aceptor quanto doador de ligação de hidrogênio, apesar de que é esperado que uma pequena

fração esteja na forma protonada em solução aquosa (DUPUY et al., 1996). Interações

intermoleculares, como as ligações de hidrogênio, afetam algumas propriedades físicas das

moléculas e, neste caso específico, algumas propriedades estruturais dos agregados micelares

(SVENSON, 2004). Assim, a grande quantidade de ligações de hidrogênio intermoleculares

observada nas micelas formadas pelos tensoativos à base de açúcares pode influenciar alguns

aspectos estruturais como tamanho, formato e estabilidade das micelas.

Neste trabalho, foi avaliado, em nível molecular, as interações inter-monômeros entre os

grupos açúcar sobre os últimos 5 ns de simulação. O número total de ligações de hidrogênio

intermoleculares por monômero encontrado para C

N-lactitol foi 1,05 e para C

N-lactosil

0,86 (Tabela 5.14). Considerando que a contribuição energética de cada ligação de hidrogênio

é cerca de 5 kcal/mol, a diferença de 0,19 ligações de hidrogênio entre os dois sistemas

micelares indicam que a formação de micelas contendo C

N-lactitol é entalpicamente mais

favorável que C

N-lactosil por aproximadamente 0,95 kcal/mol de tensoativo (considerando

apenas a componente de ligações de hidrogênio). PESTMAN et al. (1999) encontraram uma

diferença entálpica similar para tensoativos com grupos amida, N-acetil-N-dodecil-

lactosilamina e N-acetil-N-dodecil-1-deoxilactitol, no valor de 1,3 kcal/mol em favor do

composto lactitol. Este resultado calorimétrico reflete as interações micela-micela,

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 128

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

monômero-micela e monômero-monômero, enquanto que a simulação MD apresentada neste

trabalho avaliou somente a contribuição das interações monômero-monômero, oriundas das

ligações de hidrogênio, para a entalpia de micelização.

Tabela 5.14 – Número médio de ligações de hidrogênio inter-monômero e monômero-solvente no decorrer dos

últimos 5 ns de simulação MD

Átomo

†

N-lactitol C

N-lactosil

Inter-monômero

Monômero-

solvente

Inter-monômero

Monômero-

solvente

doador aceptor doador aceptor doador aceptor doador aceptor

N 0.02 0.00 0.04 0.03 0.07 0.03 0.06 0.12

O2 (glc) 0.19 0.15 0.40 0.50 0.13 0.12 0.33 0.36

O3 (glc) 0.13 0.13 0.16 0.22 0.10 0.07 0.38 0.48

O4 (glc) 0.04 0.12 0.05 0.17

O5 (glc) 0.08 0.06 0.30 0.41 0.07 0.12

O6 (glc) 0.15 0.16 0.40 0.62 0.12 0.12 0.26 0.64

O2 (gal) 0.10 0.13 0.42 0.51 0.15 0.10 0.49 0.49

O3 (gal) 0.13 0.10 0.55 0.64 0.09 0.06 0.52 0.61

O4 (gal) 0.17 0.15 0.47 0.51 0.07 0.09 0.58 0.58

O5 (gal) 0.01 0.03 0.01 0.04

O6 (gal) 0.11 0.12 0.33 0.63 0.13 0.14 0.32 0.63

Total 1.07 1.05 3.07 4.22 0.86 0.86 2.93 4.23

†

glc = grupo glucosil/glucitol; gal = grupo galactosil

A análise das contribuições individuais dos doadores e aceptores de ligações de

hidrogênio inter-monômeros revelaram pequenas variações entre os dois sistemas. A maior

diferença encontrada foi para o átomo O4–H do grupo galactosil, em que se observou a

doação de 0,10 ligações de hidrogênio a mais no sistema contendo C

N-lactitol, e para os

átomos O3 do grupo glucosil/glucitol e O4 do grupo galactosil, que aceitam, cada um, 0,06

ligações de hidrogênio a mais também no sistema contendo C

N-lactitol. Apesar do grupo

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 129

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

externo galactosil ser o mesmo em ambas as moléculas de tensoativo, a única hidroxila axial,

presente no carbono C4, está mais exposta para a formação de interações inter- e intra-

moleculares. De fato, os átomos de oxigênio da cadeia flexível de glucitol, presente em C

N-

lactitol, são capazes de interagir mais facilmente e fortemente com a hidroxila axial (O4) do

grupo galactosil.

5.6.4 Interações intra-monômeros

As micelas de C

N-lactitol fazem um total de 1,37 ligações de hidrogênio intra-

molecular por monômero contra apenas 0,48 para o sistema contendo C

N-lactosil (Tabela

5.15). Geralmente, ligações de hidrogênio intramoleculares são mais observadas em

dissacarídeos cíclicos que em monossacarídeos, devido à possibilidade de interações entre os

átomos de oxigênio proveniente dos dois grupos diferentes de açúcar presentes na mesma

molécula. Neste caso, os ângulos torcionais ou diedros envolvendo a ligação glicosídica são

de crucial importância para o estabelecimento de interações intra-moleculares de

dissacarídeos. Dessa forma, as interações intra-monômeros mais frequentemente observadas

envolveram átomos dos dois grupos açúcares, à exceção da interação O6–H⋅⋅⋅O4 que ocorre

no grupo glucosil (glucitol) em ambos os sistemas micelares. No entanto, o fato de C

N-

lactitol possuir uma cadeia acíclica flexível lhe permitiu adotar conformações que facilitam a

ocorrência de interações intramoleculares, e isto pode explicar a grande diferença encontrada

entre estes dois sistemas micelares à base de açúcares. De fato, o sistema contendo C

N-

lactitol apresenta interações intra-monômeros mais frequentes entre os átomos de oxigênio

pertencentes ao grupo glucitol, em especial os átomos O2, O4 e O5 (Tabela 5.15).

Adicionalmente, na molécula de C

N-lactitol, o átomo O5 pertence a um grupo hidroxila ao

invés do grupo éter como em C

N-lactosil, e dessa forma, pode tanto doar como aceitar

ligações de hidrogênio.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 130

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tabela 5.15 – Número médio de ligações de hidrogênio das principais interações intra-

monômeros por moléculas no decorrer dos últimos 5 ns de simulação

Interação

N-lactitol C

N-lactosil

N–H⋅⋅⋅O3

0.07 0.00

O2–H⋅⋅⋅O4

0.09 0.00

O2–H⋅⋅⋅O5

0.09 0.00

O3–H⋅⋅⋅O4

0.14 0.00

O3–H⋅⋅⋅O5(gal)

0.12 0.10

O5–H⋅⋅⋅O2

0.11 N.A.

O5–H⋅⋅⋅O2(gal)

0.20 N.A.

O6–H⋅⋅⋅O4

0.06 0.07

O6–H⋅⋅⋅O2(gal)

0.03 0.07

O2–H(gal)⋅⋅⋅O5

0.07 0.00

O2–H(gal)⋅⋅⋅O6

0.02 0.05

Total

1.37 0.48

São mostradas apenas as interações com 0.05+ ligações de hidrogênio

Átomos do grupo galactosil estão indicados por “gal”. Caso contrário, os

átomos pertencem ao grupo glucosil/glucitol

Considerando todas as ligações de hidrogênio intra-moleculares

5.6.5 Perfil de hidratação

Os sistemas micelares C

N-lactitol e C

N-lactosil mostraram capacidade de hidratação

similar, com o primeiro sistema perfazendo uma média total de 3,07 e 4,22 ligações de

hidrogênio como doador e aceptor, respectivamente, enquanto que o último faz 2,93 e 4,23

ligações de hidrogênio com a água por monômero (Tabela 5.14). As principais diferenças

foram encontradas mais uma vez no grupo glucosil/glucitol. O grupo glucitol em C

N-lactitol

doa 0,29 ligações de hidrogênio a mais que o grupo glucosil em C

N-lactosil, mas aceita 0,10

ligações a menos, devido à substituição do grupo éter por um grupo hidroxila em O5, que é

capaz agora de doar ligações de hidrogênio para a água. O grupo amino também parece sofrer

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 131

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

influência da configuração do sacarídeo. A simulação MD mostrou que o grupo amino é

capaz de fazer 0,11 ligações de hidrogênio a mais com a água na configuração cíclica, porém,

é importante ter em mente que as cargas parciais atômicas para o nitrogênio foram diferentes

para C

N-lactitol (-0,39) e para C

N-lactosil (-0,52) (Tabela 5.13, página 122). A capacidade

de hidratação do grupo galactosil foi similar para ambos os sistemas micelares.

Apesar da semelhança da capacidade de hidratação, existiram diferenças particulares na

contribuição atômica para as interações monômero-solvente. O átomo O3 do grupo glucosil

faz 0,48 ligações de hidrogênio a mais com a água em C

N-lactosil, enquanto que os átomos

O2 e O5 do mesmo grupo fazem 0,21 e 0,59 ligações de hidrogênio a mais em C

N-lactitol,

respectivamente. Este surpreendente resultado para o átomo O3 pode ser explicado em termos

da conformação preferencial adotada pelas moléculas de C

N-lactitol no interior da micela.

Foi observado que o átomo O3 do grupo glucitol em C

N-lactitol interage bem com os

átomos O4 e O5 dos grupos glucitol e galactosil, respectivamente (Tabela 5.15). Isto sugere

uma conformação preferencial para esta molécula no interior da micela, em que o átomo O3

está localizado em uma região menos exposta ao solvente, como mostrado na Figura 5.14.

Figura 5.14 – Snapshot da simulação MD evidenciando uma das interações intra-moleculares mais frquentes

observadas no sistema micelar C

N-lactitol. O número médio das ligações de hidrogênio intra-molecular

O3(glc)–H⋅⋅⋅O4(glc) and O3(glc)–H⋅⋅⋅O5(gal) é 0,14 e 0,12, respectivamente. Esta conformação adotada pelas

moléculas de C

N-lactitol previne o átomo O3(glc) do contato com a água.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 132

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

5.6.6 Considerações gerais sobre as simulações MD

As simulações MD caracterizaram as propriedades estruturais e a rede de ligações de

hidrogênio de sistemas micelares contendo 88 monômeros de C

N-lactitol e C

N-lactosil em

solução aquosa. Ambos os sistemas exibiram tamanho e estabilidade similares, embora o

sistema C

N-lactitol tenha apresentado ao final da simulação fortes deformações ou

protrusões que levaram a grandes diferenças com relação ao formato esférico inicial. A baixa

contribuição das cadeias alquílicas de ambos os sistemas ao valor total de SASA indicaram

uma elongação das micelas (KONIDALA et al., 2006), enquanto que as diferentes

contribuições ao SASA total proveniente dos dois grupos açúcar presentes na molécula de

ambos os tensoativos indicaram um padrão diferente de ligações de hidrogênio.

O sistema micelar C

N-lactitol faz mais ligações de hidrogênio intra- e intermolecular

que o sistema C

N-lactosil. O fato do oxigênio O5 do grupo glucitol em C

N-lactitol

pertencer ao grupo hidroxila, ao invés da função éter, contribuiu significativamente para esta

diferença. Adicionalmente, a grande flexibilidade do grupo glucitol aumentou a ocorrência de

ligações de hidrogênio intramoleculares no sistema micelar C

N-lactitol. Apesar das

diferenças estruturais entre ambos os tensoativos estudados, a capacidade de hidratação de

suas micelas foi similar. A grande quantidade de ligações de hidrogênio observada no sistema

micelar C

N-lactitol sugere que seu processo de micelização é mais favorável que no sistema

N-lactosil, o que corrobora com estudos recentes que demonstram que um grupo alditol é

mais favorável para a formação de micelas que um grupo aldose (PESTMAN et al., 1999).

Dessa forma, as simulações MD apontam para o uso de micelas de C

N-lactitol, em

detrimento de C

N-lactosil, como veículos carreadores de fármacos.

O raio de giro, R

, do sistema micelar C

N-lactitol não permaneceu estável no decorrer

dos 10 ns de simulação MD, o que pode ser indicativo de uma micela não-estável. Dessa

forma, esse sistema foi submetido a mais 10 ns de simulação MD nas mesmas condições que

a anterior, perfazendo um total de 20 ns, e verificou-se que o R

para este sistema continuou a

crescer levemente no decorrer da simulação. Este resultado pode ser devido à própria natureza

das moléculas anfifílicas, em que sua parte hidrofóbica estará em contínuo movimento no

interior da micela, e em especial, pelo grande número de conformações que podem ser

adotadas pelas moléculas de C

N-lactitol, que podem ocasionar contínuas diferenças

estruturais no agregado, como observado na Figura 5.11a.

Conclusões Gerais

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 134

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

6 CONCLUSÕES GERAIS

Conseguiu-se obter sistemas microemulsionados utilizando compostos (tensoativo,

cotensoativo e óleo) farmaceuticamente aceitáveis, contribuindo assim para a sua aplicação

em meio biológico. Obteve-se ainda um sistema microemulsionado isento de cotensoativo

(sistema ME-D), que devido à ausência de etanol em sua composição, pode apresentar

redução na toxicologia das microemulsões. Adicionalmente, sistemas auto-

microemulsificantes, voltados para a administração oral de fármacos, foram obtidos, sendo

um deles utilizando propilenoglicol ao invés de etanol como cotensoativo em sua composição

(sistema ME-G), e outro utilizando sorbitol a fim de diminuir a quantidade de etanol utilizada

(sistema ME-H).

Os sistemas micromeulsionados obtidos foram capazes de solubilizar satisfatoriamente

o diterpeno bioativo trans-desidrocrotonina (DCTN), parcialmente a trans-crotonina (CTN), e

incapaz de solubilizar o triterpeno ácido acetilaleuritólico (AAA), todos isolados das cascas

do caule da espécie vegetal Croton cajucara. O sistema auto-microemulsificante ME-G,

isento de etanol, também solubilizou satisfatoriamente a DCTN e não se observou

precipitação significativa do produto natural com a diluição em água do sistema ME-G.

Adicionalmente, os sistemas microemulsionados obtidos solubilizaram satisfatoriamente

extratos e frações obtidos de três espécies vegetais: Croton cajucara, Anacardium occidentale

e Phyllanthus amarus.

Os experimentos de caracterização físico-química permitiram confirmar a existência de

microemulsões em cada sistema obtido, além de direcionar a aplicação de cada um desses

sistemas quanto às vias de administração preferenciais. Nesse sentido, confirmou-se que o

sistema ME-F não se tratava de uma microemulsão estável. Os estudos de reologia e de

condutividade elétrica dos sistemas auto-microemulsificantes permitiram ainda prever as

transições de microestruturas que ocorrem nesses sistemas com a diluição em água.

Os sistemas microemulsionados obtidos permitiram a realização de ensaios biológicos

de extratos com baixa solubilidade nos excipientes comumente utilizados. Os ensaios

antioxidantes evidenciaram ainda que a propriedade antioxidante dos extratos testados é

diretamente proporcional à sua solubilidade nos sistemas microemulsionados testados.

Adicionalmente, as microemulsões utilizadas não provocaram interferência significativa nos

resultados antioxidativos obtidos, e apenas um efeito bactericida moderado frente às colônias

de bactérias estudadas, o que pode ser considerado uma vantagem adicional desses sistemas.

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 135

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Os estudos de simulação de Dinâmica Molecular (MD) permitiram caracterizar as

propriedades estruturais de agregados micelares contendo moléculas de N-dodecilamino-1-

deoxilactitol (C

N-lactitol) e N-dodecil-D-lactosilamina (C

N-lactosil). Os resultados

computacionais obtidos corroboraram os dados experimentais de SANS e SAXS obtidos para

o C

N-lactitol (DUPUY et al., 1996; DUPUY et al., 1998). Adicionalmente, as simulações

MD apontaram para um processo de micelização mais favorável para sistemas alditóis, como

o C

N-lactitol, e podem servir como parâmetro na obtenção de sistemas micelares de

tensoativos à base de açúcares.

Os resultados obtidos neste trabalho permitiram avaliar que os sistemas

microemulsionados obtidos, em especial os sistemas que não contêm etanol em sua

composição, podem se constituir em alternativas viáveis para a veiculação de fármacos e

extratos pouco solúveis nos excipientes comumente utilizados, com ganhos significativos na

sua biodisponibilidade.

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Anexos

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 161

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

ANEXO A – Curva de Calibração da DCTN para testes de solubilidade por

espectroscopia no UV-Vísível

0 1020304050

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Absorbância

Concentração (x10

-3

mg/mL)

y = 0,05426 x + 0,06708

= 0,9969

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 162

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

ANEXO B – Gráficos de comportamento reológico tensão (τ) x taxa de cisalhamento (γ)

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 163

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 164

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 165

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 166

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 167

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 168

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 169

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 170

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 171

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

Tese de Doutorado, PPGQ-UFRN 172

Fabiano do Espírito Santo Gomes 2010

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