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“Análise de especiação de estanho em plasma de trabalhadores expostos”
por
Débora Resende de Souza Lima
Dissertação apresentada com vistas à obtenção do título de Mestre em
Ciências na área de Saúde Pública.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria de Fátima Ramos Moreira
Rio de Janeiro, julho de 2010.
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II
Esta dissertação, intitulada
“Análise de especiação de estanho em plasma de trabalhadores expostos”
apresentada por
Débora Resende de Souza Lima
foi avaliada pela Banca Examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof.ª Drª Silvia Maria Sella
Prof. Dr. Filipe Soares Quirino da Silva
Prof.ª Dr.ª Maria de Fátima Ramos Moreira
Dissertação defendida e aprovada em 09 de julho de 2010.
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III
Crescer significa mudar e
mudar envolve riscos, uma
passagem do conhecido
para o desconhecido.
IV
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer à Deus, por colocar pessoas iluminadas no
meu caminho, são iluminadas tanto de sabedoria quanto de boa vontade ao me ajudar no
desenvolvimento da minha dissertação.
Ao setor de Imunobiológicos, do laboratório de Biológicos e Artigos e Insumos
de Saúde, do Departamento de Química, INCQS. Não tenho palavras para agradecer à
Sinéa Mendes, uma pessoa admirável pela sua paciência, desempenho ao explicar,
determinação para conseguir fazer mil coisas ao mesmo tempo e ainda ter que
desenvolver sua dissertação. Tornou-se uma amiga em pouco tempo e meu
conhecimento de cromatografia devo a ela, e boa parte da minha dissertação também.
Ao Filipe Quirino, que tem uma memória invejável e uma sabedoria divina, também
agradeço pela sua paciência e disposição de tempo, pois sei que é curto, perante aos
seus inúmeros deveres, também se fez presente em mais da metade do meu trabalho. À
Claudia Mª da Conceição e Diego Cavatti pela ajuda no laboratório e pelas risadas de
descontração necessárias em um momento de tensão.
À Anna Maria Barreto Silva Fust e à Renata de Freitas Dalavia Vale, do setor de
Artigos e Insumos de Saúde, do DQ, do INCQS, por me proporcionar o uso do seu
HPLC, sem qualquer restrição e ter sido sempre solícita quando necessário.
Ao Leandro Carvalho, do laboratório de indicadores biológicos, do CESTEH,
por iniciar meu aprendizado em uma nova técnica, cromatografia líquida, mesmo tendo
seu laboratório para administrar, tirou um tempo para me auxiliar. Além das caronas
sem cobranças, por ouvir meus desabafos e minhas “crises nervosas”, e ainda por nossas
conversas de amizade e descontração.
O mesmo posso dizer de Renato Marçullo, do laboratório de metais, do
CESTEH, foi um grande amigo, me chamava atenção com sutileza, me mostrando a
responsabilidade de um mestrado. Sua sabedoria na parte instrumental e em cálculos,
além da sua flexibilidade em assuntos diversos, fez dele um grande amigo, um
companheiro para todas as horas.
Do laboratório de metais, do CESTEH, não posso esquecer de ninguém, cada um
teve papel importante na minha dissertação. Regina Aderne me ajudava em qualquer
coisa sem reclamar, sempre de bom coração; com Sayonara Azevedo pude dividir
viagens de campo e congressos, que se tornaram divertidas, além de sua alegria
contagiante; à Fernanda Baptista foi minha amiga de desabafos e histórias, não posso
V
esquecer da sua ajuda com qualquer coisa relacionada à química; Thalita Dallapícula é
uma figura admirável pela sua doçura, também foi uma amiga nesse momento.
Aos meus amigos de mestrado Daniel Souza, Daniele Rocha, Beatriz Brum e
Deise Coelho, foram pessoas maravilhosas que conheci, de ótimo convívio tanto para
estudos como para uma mesa de bar. Vão deixar saudades e lembranças.
Ao laboratório da D
ra
Silvia Sella, do departamento de Química Analítica da
UFF, Monique Souza e Luana Bacellar se mostraram muito solicitas, foi de grande
ajuda nos meus resultados para ICP-MS. Além da própria D
ra
Silvia que se apresentou
muito prestativa ao emprestar seu laboratório e suas alunas.
Agradeço também à Rejane Correa Marques e José Garrofe Dórea, da
Universidade Federal de Rondônia, pelo apoio financeiro e a ajuda sua equipe.
Não posso esquecer-me da minha orientadora Maria de Fátima Ramos Moreira,
pois me proporcionou ao oferecer esse tema, uma oportunidade para o meu
desenvolvimento em conhecimentos metodológicos, instrumentais e analíticos. Estou
muito grata aos benefícios profissionais que esse estudo me gerou, além de ter tornado
oportuno em novas amizades, me fez alcançar relações profissionais.
Aos meus pais, Neuzely e Luís Cláudio de Souza Lima, e ao meu namorado Igor
Aragon, sempre me deram apoio e força durante o desenvolvimento da minha
dissertação. Foram pessoas a quem eu recorria perante ao desespero, e onde eu
encontrava a paz. À minha avó Cerly Chaves Resende, onde sempre pude me inspirar
no ato de estudar, é a pessoa em que dedico toda minha sabedoria, foi sempre uma
grande base nos estudos, desde a pré-escola. Obrigada vó por estar comigo mesmo de
longe.
VI
Resumo
O estanho (Sn) é um elemento natural na crosta terrestre obtido a partir do minério
cassiterita. Devido à sua utilização em processos industriais, é encontrado distribuído
pelo ambiente, e sendo um potencial contaminante. Na natureza, aparece nas formas
inorgânicas e orgânicas, e quanto menor a cadeia orgânica associada ao metal, maior
toxicidade do composto. Compostos organoestânicos de cadeia curta, como trimetil e
trietil Sn, são bem absorvidos no trato gastrointestinal. Compostos organoestânicos
podem penetrar nas membranas celulares, causando danos celulares e nas mitocôndrias,
e ainda interromper a fosforilação oxidativa. Desta forma, podem ser imuno e
genotóxicos. O interesse na especiação dos compostos de Sn é devido à toxicidade ser
dependente da espécie. O plasma sangüíneo contém a fração biodisponível do analito e
pode intermediar a predição de algumas formas de toxicidade crônica. No entanto, há
poucos trabalhos sobre como o Sn se encontra no plasma. Portanto, a caracterização dos
constituintes que se ligam e / ou transportam esse elemento ajustam na compreensão de
seu metabolismo, elucidação dos mecanismos de toxicidade, uma melhor compreensão
da distribuição de Sn na célula e sua deposição nos tecidos. Neste estudo, foi
desenvolvido um método analítico para separação das espécies de Sn no plasma
sanguíneo de trabalhadores que beneficiam o minério de cassiterita, através de
cromatografia líquida por filtração em gel, enquanto a concentração do Sn nas frações
coletadas foi determinada por espectrometria de absorção atômica por forno de grafite.
O uso de Sepharose CL-4B, uma coluna com altura de 1 m, fase móvel de 50
milimolares (mM) Tris-HCl + 30 mM NaHCO
3
, pH 7,4, fluxo de 0,7 militros por
minuto (ml min
-1
), volumes de plasma injetado e frações coletadas iguais a 2 ml cada,
apresentou melhor separação das proteínas, com o aparecimento de três picos. Para a
determinação do Sn, temperaturas de pirólise e de atomização iguais a 1400 e 2100°C,
respectivamente, e massa do modificador de 10 µg Pd + 5 µg Mg(NO
3
)
2
foram
utilizadas. O Sn se apresentou apenas na inclusão total, representando possivelmente a
albumina e as imunoglobulinas, que são as proteínas mais abundantes do plasma.
Contudo não se sabe se o metal se apresenta ligado às proteínas ou livre, para isso seria
necessária a determinação por espectrômetro de massas das frações selecionadas.
VII
Abstract
Tin is a natural element in the earth's crust and is obtained from cassiterite ores. Owing
to their wide use in industrial processes, tin is relatively distributed in the environment.
In nature, it occurs in both inorganic and organic forms and shorter organic chain
associated to the metal, higher the toxicity of the compound. Short-chain organotin
compounds such as trimethyl and triethyl tin are well absorbed in the gastrointestinal
tract. Organotin compounds can penetrate cell membranes causing damage to cell and
mitochondria, as well as interrupt oxidative phosphorylation. Thus organic compounds
can be immunotoxic and genotoxic. The interest on speciation of the organotin
compounds is due to species-dependent toxicity. The blood plasma contains the
bioavailable fraction of the analyte and can mediate the prediction of some forms of
chronic toxicity. However, very few species of tin existing in the plasma are known.
Therefore, the characterization of the constituents that bind to and / or transporting the
element of interest is critical to full understanding of metabolism, elucidation of the
mechanisms of toxicity, a better understanding of the distribution of tin in the cell and
its deposition in tissues. In this study, we developed an analytical method for the
separation of tin species in blood plasma using gel filtration liquid chromatography
while tin concentration in the collected fractions was determined by graphite furnace
atomic absorption spectrometry. The use of Sepharose CL-4B, height of 1 m, mobile
phase of 50mM Tris-HCl + 30mM NaHCO
3
,
pH 7,4, flow 0,7 ml min
-1
, fractions
collected volume of 2 ml, plasma injected volume of 2 ml, showed the best protein
separation with three peaks. For the determination of tin, pyrolisis and atomization
temperatures of 1400 and 2100°C, respectively, and a modifier mass of 10 µg Pd + 5 µg
Mg(NO
3
)
2
were used. The Sn is presented only in total inclusion, possibly representing
albumin and immunoglobulins, which are the most abundant proteins from plasma.
However it is not known if the metal appears bound to protein or free, for it would
require a determination by mass spectrometry of selected fractions.
VIII
Sumário
1- Introdução
1
2- Objetivos
4
2.1- Objetivo geral
4
2.2- Objetivos Específicos
4
3- Justificativa
5
4- Estanho
6
4.1- Propriedades físico-químicas
6
4.2- Ocorrência, produção e uso
7
4.3- Toxicocinética
9
4.3.1- Absorção
9
4.3.2- Distribuição
11
4.3.3- Metabolismo
12
4.3.4- Eliminação
13
4.4- Toxicodinâmica
14
4.4.1- Formação dos compostos de estanho em meio biológico
14
4.4.2- Efeitos causados pelos compostos de estanho
16
5- Plasma e sua importância para o monitoramento biológico
19
6- Exposição Ocupacional e Ambiental
20
7- Garimpo como um problema de saúde pública
22
8- Especiação e análise de especiação
25
9- Metodologias envolvidas na análise de especiação de fluidos biológicos
28
10- Experimental
36
11- Resultados e Discussão
42
IX
11.1- Determinação do Estanho no Plasma Total
42
11.1.1- Programa de temperatura
42
11.1.2- Curvas de Pirólise e de Atomização
43
11.1.3- Diluição
44
11.1.4- Massa do Modificador
46
11.1.5- Linearidade
47
11.1.6 - Massa Característica e Razão de Sensibilidade
48
11.1.7- Limite de Detecção e Quantificação
48
11.1.8- Exatidão
49
11.1.9- Análise de Plasmas de Trabalhadores Expostos
50
11.2. Separação e Identificação das Frações Plasmáticas
51
11.2.1- Estudo da fase móvel e do método cromatográfico
51
11.3 – Frações Plasmáticas
56
11.3.1- Programa de temperatura
56
11.3.2- Curvas de pirólise e atomização
57
11.3.3- Diluição
58
11.3.4- Massa do modificador
58
11.3.5- Linearidade
59
11.3.6- Massa Característica e Razão de Sensibilidades
60
11.3.7- Limite de detecção e quantificação
61
11.4- Determinação do Sn nas frações plasmáticas
61
11.5- Eletroforese
67
12- Conclusão
72
13- Bibliografias
75
14- Anexo
82
X
Índice de Tabelas
Tabela 1: Programa de temperatura utilizado na determinação de estanho no
plasma.
43
Tabela 2: Avaliação das massas características, nas curvas aquosa e no plasma,
utilizando-se diferentes massas de modificador.
46
Tabela 3: Razão de sensibilidade para as curvas aquosa e no plasma com adição
de analito.
48
Tabela 4: Concentração de estanho encontrada no plasma de trabalhadores
expostos ocupacionalmente.
50
Tabela 5: Programa de temperatura utilizado na determinação de estanho nas
frações.
56
Tabela 6: Avaliação das massas características, nas curvas aquosa e no tampão,
utilizando-se diferentes massas de modificador.
58
Tabela 7: Massa característica e razão de sensibilidades para as curvas aquosa e
no tampão.
60
XI
Índice de Figuras
Figura 1: Curvas de pirólise e de atomização para solução aquosa e plasma
enriquecido com 1000 pg Sn.
44
Figura 2: Influência da razão de diluição do plasma em Triton X-100 0,1% (v/v),
em HNO
3
0,2% e em água MilliQ.
45
Figura 3: Curvas de linearidade, na faixa de 10 a 300 g L
47
Figura 4: Curva de calibração usando Blue Dextran 1% e Azida 0,05%.
54
Figura 5: Cromatograma do plasma, em um λ = 220 nm.
54
Figura 6: Cromatograma do plasma de indivíduo não exposto, sem adição, em um
λ = 280 nm.
55
Figura 7: Cromatograma do plasma de indivíduo não exposto, com adição de 0,25
g Sn mL
-1
.
55
Figura 8: Curvas de pirólise e atomização, no tampão 50mM Tris-HCl + 30mM
NaHCO
3
.
57
Figura 9: Curvas de linearidade na curva aquosa e no tampão, na faixa de 2,5 a
100 g L
-1
.
59
Figura 10: Cromatograma das frações plasmáticas de indivíduo não exposto;
61
Figura 11: Cromatograma das frações plasmáticas de indivíduo não exposto
enriquecido com 250 ng de Sn.
61
Figura 12: Cromatograma de trabalhador exposto, amostra 01.
63
Figura 13: Cromatograma de trabalhador exposto, amostra 02.
63
Figura 14: Cromatograma de trabalhador exposto, amostra 03.
64
Figura 15: Cromatograma de trabalhador exposto, amostra 04. 64
Figura 16: Cromatograma de trabalhador exposto, amostra 05.
65
XII
Figura 17: Cromatograma de trabalhador exposto, amostra 06. 65
Figura 18 A: Gel com agente redutor β-mercaptol, representam as frações 84 a 88,
da amostra 1.
67
Figura 18 B: Gel com agente redutor β-mercaptol, representam as frações 89 a 93,
da amostra 1.
67
Figura 19 A: Gel sem agente redutor β-mercaptol, representam as frações 89 a 93,
da amostra 1.
68
Figura 19 B: Gel sem agente redutor β-mercaptol, representam as frações 89 a 93,
da amostra 1.
69
XIII
Lista de Abreviaturas
AAS – Atomic Absorption Spectrometry
APS – Persulfato de Amônio
BSA – Albumina de Soro Bovino
CEM – Cromatografia de Exclusão Molecular
CL – Cromatografia Líquida
CLBP – Cromatografia Líquida de Baixa Pressão
CG – Cromatografia Gasosa
CV-AAS – Cold Vapour Atomic Absorption Spectrometry
DBT – Dibutilestanho
EDTA – Ácido Etilenodiamino tetra-Acético
EG – Eletroforese em Gel
ETAAS – Electrothermal Atomic Absorption Spectrometry
FAAS – Flame Atomic Absorption Spectrometry
GC-OES – Gas Chromatography Optical Emission Spectrometry
GF AAS – Graphite Furnace
Atomic Absorption Spectrometry
HG AAS – Hydride Generation Atomic Absorption Spectrometry
HPLC- High Performance Liquid Chromatography
iSn – Estanho inorgânico
IBMP – Índice Biológico Máximo Permitido
ICP MS – Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry
IgG – Imunoglobulina G
IUPAC – International Union for Pure and Applied Chemistry
kDa – Quilodalton
L – Litro
LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
LPLC- Low Pressure Liquid Chromatography
Spectrometry
MBT – Monobutilestanho
mL - mililitro
MM – Massa Molecular
mM – milimol
m
0
–
Massa Característica
XIV
m
0
Aq/m
0
M – Razão de Sensibilidade
L – microlitro
ng – nanograma
NIOSH – National Institute for Occupational Safety and Health
nm – nanômetro
NR – Norma Regulamentadora
OSHA – Occupaional Safety and Health Administration
OVA – Ovalbumina
oSn – Estanho Orgânico
PABA – Ácido para-Aminobenzóico
PAGE – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
ppm – Parte Por Milhão
PVC – Cloreto de Polivinila
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
RPM – Rotação por Minuto
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
SDS-PAGE – Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SNC – Sistema Nervoso Central
STPF – Stabilized Temperature Platform Furnace
T
A
– Temperatura de Atomização
T
P
– Temperatura de Pirólise
TAT – trialquilestanho
TBT – Tributilestanho
TET – Trietilestanho
TEMED – N, N, N’, N’ Tetrametil Etilenodiamina
TGI – Trato Gastrointestinal
TLV-TWA – Threshold Limit Value - Time-Weighted Average
TMT – Trimetilestanho
Tris – Tris (Hidroximetil) Aminometano
UV – Ultravioleta
VR – Valor de Referência
Vol. – Volume
λ – Comprimento de Onda
[Sn] – Concentração de estanho
1
1- Introdução
O interesse sobre acumulação e toxicidade de metais tem crescido nos últimos
anos como conseqüência das exposições ocupacionais e ambientais, ou dos distúrbios
causados por esses elementos. A detecção molecular ou estrutural de diversos elementos
considerados tóxicos tem aumentado nas últimas décadas, sendo alvo de investigações
nas pesquisas ambientais e de saúde humana
1
.
Em sua maioria, os elementos traço ocorrem naturalmente no solo, em baixas
concentrações e em formas não prontamente disponíveis para plantas e organismos
vivos. Em função de suas características específicas, os metais podem apresentar risco
efetivo ou potencial à saúde humana, ou gerar impactos aos meios físico, biótico e
sócio-econômico. Estes elementos podem causar danos eco-biológicos irreversíveis
2,3
.
O estanho (Sn) é um metal de ocorrência natural, obtido de minérios como a
cassiterita (SnO
2
) ou polimetálicos. Industrialmente importante, os compostos de Sn
podem ser categorizados como inorgânico, quando combinado com cloro, enxofre e
oxigênio, na forma de Sn
+2
ou Sn
+4
, e orgânico, quando faz uma ligação covalente com
o carbono, com substituições mono, di, tri e tetra na ligação deste elemento com o
carbono
4, 5
.
O Sn metálico assim como os compostos inorgânicos e orgânicos de Sn pode ser
encontrado no ar, água e solo, próximo aos locais em que estão presentes nas rochas,
minas e indústrias, e de uso. Em geral, os compostos orgânicos de Sn são provenientes
de fontes antropogênicas e não ocorrem naturalmente no ambiente
6
.
O Sn metálico é usado no revestimento protetor de latas para alimentos, bebidas e
aerossóis. Está presente em ligas tais como latão, bronze e peltre, e alguns materiais de
solda. Os compostos inorgânicos deste metal (iSn) são usados na indústria de vidro e
corantes, também presentes em pastas de dente, perfumes, sabões, aditivos de alimentos
e tinturas. Por outro lado, os compostos orgânicos (oSn) são de origem sintética, e suas
principais aplicações estão relacionadas às suas propriedades biocidas, no combate às
bactérias, fungos, insetos, moluscos e pequenos animais. E ainda é utilizado na
prevenção do crescimento de colônias de moluscos em cascos de navios, além de seu
uso comercial como estabilizador do cloreto de polivinila (PVC)
5, 7
.
O iSn apresenta baixa absorção qualquer que seja sua rota de entrada, além de
ter pequena retenção nos tecidos, tempo de meia vida curto e rápida eliminação. O iSn
absorvido se deposita nos ossos, apesar de apresentar também elevadas concentrações
2
em tecidos moles como os pulmões, rins e fígado. Já o oSn é mais rapidamente
absorvido, sendo que a absorção é maior para os compostos de cadeias curtas. Após a
absorção, apresentam a mesma distribuição dos compostos iSn nos tecidos moles
5, 6, 8
.
A exposição ao Sn e seus compostos pode produzir diversos efeitos neuro, hemato
e imunológicos. Os iSn produzem a pneumoconiose não fibrinogênica e efeitos
gastrointestinais, enquanto que os oSn inibem síntese do heme oxigenase e também
podem ser genotóxicos. Causam ainda irritação severa e queimação na pele, quando
absorvidos por esta via. Outros efeitos são danos renais e hepáticos
8,
9
.
Estudos desenvolvidos na área da química analítica nas duas últimas décadas
sustentam que a determinação total do elemento não fornece informações adequadas
sobre mobilidade, biodisponibilidade, metabolismo, mecanismos, interações e
deposição nos tecidos, assim como, o impacto dos elementos sobre os sistemas
ecológicos e organismos biológicos. Somente a especiação, ou seja, o conhecimento das
espécies químicas dos elementos pode levar ao entendimento das reações químicas e
bioquímicas que envolvem essas espécies e, assim, fornecer informações sobre
toxicidade ou essencialidade
10
.
A presença de Sn gera efeitos imediatos do ambiente físico-biológico, levando a
problemas na saúde humana que podem ser observados nas regiões de mineração,
gerando graves conseqüências para a qualidade de vida. É necessário controlar a
crescente exposição dos trabalhadores e da população vizinha à mineração aos resíduos
derivados da atividade humana
11
.
A extração de cassiterita feita a céu aberto, emprega um processo de lavra quase
que totalmente mecânico, porém seus trabalhadores nem sempre fazem uso de
equipamentos de proteção. O tráfego intenso de máquinas e equipamentos altera
sensivelmente as propriedades do solo a ser minerado. No entanto, essas alterações não
decorrem somente desse tráfego, mas de todas as operações que antecedem ou sucedem
a retirada do minério
12
.
As operações de extração de Sn ocorrem em processos molhados, porém o pó e
o SnO
2
podem ser emitidos durante as operações de fundição, ensacamento e limpeza
do local, expondo os trabalhadores à inalação de poeiras e fumos, e deposição sobre a
pele dos compostos de Sn, como também à sílica, chumbo e arsênio
5, 9
.
A extração do mineral tem um grande impacto no meio ambiente, na saúde dos
trabalhadores bem como da comunidade local. As condições de saúde da população
exposta a essa situação são de amplo interesse da saúde pública. O uso descontrolado
3
dos solos para a retirada de metais expõe diretamente os próprios mineradores, além de
proporcionar uma exposição prolongada do meio ambiente e acúmulo dos metais na
cadeia alimentar
13
.
O acesso limitado dos mineradores às informações e ao tratamento de saúde
resulta em sofrimento dos próprios trabalhadores. A falta de informação abrangente e
confiável sobre a situação atual revela a não disponibilidade de dados sólidos para
fundamentar intervenções para correção dos problemas. Contudo, é necessário executar
projetos, estudos e atividades específicas que possam contribuir de maneira efetiva para
o desenvolvimento econômico e social, além da melhoria da qualidade de vida
14
.
4
2- Objetivos
2.1- Objetivo geral
O objetivo desse trabalho é determinar a concentração total de Sn no plasma dos
trabalhadores expostos à cassiterita e desenvolver uma análise de especiação do metal,
visando assim, uma melhor compreensão da distribuição do Sn no organismo.
Contribui-se, desta forma, na avaliação dos riscos à saúde dos trabalhadores envolvidos
no processo de beneficiamento de cassiterita.
2.2- Objetivos Específicos
• Estabelecimento das condições analíticas para a determinação do Sn no plasma por
espectrometria de absorção atômica eletrotérmica;
• Estabelecimento de metodologia analítica para separação das proteínas do plasma,
através da cromatografia líquida de baixa pressão com uma coluna de exclusão de
tamanho;
• Estudos das condições analíticas para a determinação do Sn nas frações eluídas do
plasma por espectrometria de absorção atômica eletrotérmica;
• Determinação dos pesos moleculares das proteínas fracionadas pela cromatografia
líquida, através da eletroforese em gel;
• Aplicação das metodologias padronizadas nas amostras de plasma dos trabalhadores
da área de produção de beneficiamento do minério de cassiterita em Rondônia;
5
3- Justificativa
A exposição humana a agentes químicos provenientes da mineração desencadeia
além de efeitos toxicológicos, uma série de efeitos sociais, econômicos e psicossociais
que podem culminar em episódios de morbidade e mortalidade. Contudo, impedir o
processo de trabalho dos mineradores e garimpeiros de cassiterita é inviável, pois nessas
regiões, onde a infraestrutura e as condições econômicas são precárias, este é um dos
poucos meios de subsistência da população
11, 15
.
Os efeitos do Sn à saúde dos mineradores geram uma crescente preocupação
com o modo de trabalho e vias de exposição ao metal durante esse processo, seja oral,
respiratória ou dérmica. A compreensão do modo de exposição favorece o estudo deste
elemento no organismo. Porém, o controle do Sn no meio biológico é um grande
desafio, devido à escassez de estudos realizados com este metal
5
.
O plasma sangüíneo contém a fração biodisponível do analito e pode intermediar
a predição de algumas formas crônicas de toxicidade. Entretanto, muito poucas espécies
de Sn existentes no plasma são conhecidas. Portanto, a especiação, ou seja, a
caracterização dos constituintes que se ligam e/ou que transportam o elemento de
interesse é fundamental para total entendimento do metabolismo, elucidação dos
mecanismos de toxicidade, melhor compreensão da distribuição do Sn na célula e sua
deposição nos tecidos
1
.
6
4- Estanho
4.1- Propriedades físico-químicas
O Sn apresenta número atômico igual a 50 e massa atômica de 118,71. Está
situado na tabela periódica no grupo 14, juntamente com o carbono, silício e germânio e
chumbo. É um metal branco prateado, maleável, pouco dúctil, altamente cristalino, com
baixo ponto de fusão de 231,9°C e elevado ponto de ebulição, 2 603°C
5
.
Os compostos de Sn são apresentados em duas formas, a inorgânica, em dois
estados de oxidação +2 e +4, ambos razoavelmente estáveis, enquanto que a forma
orgânica contém ligações covalentes entre o Sn e o carbono (C), expressando uma
fórmula geral RSnX, onde R é representado por um grupo alquil ou aril e X é uma
espécie inorgânica. Exemplos desses compostos são tributilestanho, trietilestanho,
trimetilestanho e dibutilestanho, entre outros. Nos compostos organoestanho, o número
de carbonos e o comprimento da cadeia produzem efeitos sobre as propriedades físicas e
químicas do composto, em geral, a hidrossolubilidade dos compostos diminui à medida
que o tamanho da cadeia aumenta
5, 6, 16
.
Os derivados organometálicos de Sn (IV) são mais numerosos que os de Sn (II).
Isto é devido, principalmente, à sensibilidade de compostos de Sn (II) frente ao ar e
umidade. Esta maior sensibilidade está relacionada com a facilidade do Sn (II) em ser
oxidado a Sn (IV) pela ação do O
2
ou hidrolisado na presença de umidade
17
. Os
complexos de estanho orgânico (IV) e aminoácidos são, sobretudo, estáveis em contato
com o ar e pouco solúveis em solventes orgânicos comuns
18
. Porém, estudos em
animais de laboratório sugerem que esses estados de oxidação não são facilmente
convertidos in vivo
6
.
Devido à natureza anfotérica, o Sn reage com ácidos e bases fortes, porém é
resistente a soluções neutras como água
16
. Os compostos ligados aos peptídeos são
solúveis em metanol, etanol, clorofórmio e sulfóxido de dimetila. Porém, alguns
derivados do difenilestanho de dipeptídeos são moderadamente solúveis em solventes
orgânicos comuns
18
.
O ácido sulfúrico concentrado reage com o Sn e forma o sulfato de estanho II,
enquanto que o ácido diluído reage lentamente em temperatura ambiente. Reações com
ácido nítrico diluído produzem compostos nitrados de estanho solúveis; em ácido nítrico
7
concentrado, o Sn é oxidado e forma compostos de dióxidos de estanho hidratados
insolúveis
6
.
Apenas pequenas quantidades de alguns metais como o cobre, níquel, prata e
ouro podem ser dissolvidos em uma solução pura de Sn líquido, próximo ao seu ponto
de fusão. Porém, alguns compostos que têm uma fórmula química bem determinada e
são constituídos por dois ou mais elementos metálicos que ocupam posições
cristalográficas distintas e bem definidas, são livremente formados, sendo de grande
importância metalúrgica
9
.
4.2- Ocorrência, produção e uso
O Sn inorgânico é encontrado naturalmente na crosta terrestre em uma
concentração de 2 - 3 ppm (parte por milhão). Em geral, os compostos orgânicos deste
metal são provenientes de fontes antropogênicas (origem sintética)
5
.
O Sn é extraído principalmente da cassiterita (SnO
2
), geralmente associado a
granitos. Sua extração ocorre pela redução do minério com carvão em alto forno, sendo
depois refinado em forno revérbero, obetendo o Sn metálico, conforme as reações
abaixo
4
:
SnO
2
+ C = Sn
+ CO
2
SnO
2
+ 2CO
= Sn
+ 2CO
2
Outro modo de produção da fusão do minério de Sn é a mistura do minério com
sal, levada à cerca de 600°C e lavada com água. Então, um agente redutor é
acrescentado e a mistura é fundida à 1500°C. Após o refino do Sn, o metal é moldado
em barras
9
.
A produção mundial anual de Sn tem sido bastante estável, com uma média de
220000 toneladas ao longo de décadas. Apesar de, aproximadamente, 30 países
produzirem o Sn, poucos apresentam as maiores reservas mensuradas e registradas
como a China, Malásia, Indonésia, Brasil, Bolívia, Tailândia e Estados Unidos
5
. O
Brasil é o 4º maior produtor de Sn, com produção aproximada de 12 mil toneladas por
ano, significando 4% da produção mundial
19
.
O crescimento do consumo do Sn inorgânico pode ser associada, em grande
parte, à evolução da sociedade industrial ou, mais diretamente, pelo uso de embalagens
alimentícias e de veículos, as duas fontes mais importantes de consumo final do Sn ao
longo do século XX
19
.
8
Em suas aplicações metalúrgicas, o Sn encontra-se quase sempre combinado
com outros metais, quer como elemento de formação de liga ou revestimento
14
. As
formas comercialmente mais importantes incluem os compostos inorgânicos de cloreto
de estanho (II) e (IV), fluoreto de estanho (II), difluoroborato e pirofosfato de estanho
(II)
6
. O cloreto de Sn (II), SnCl
2
, é o mais importante comercialmente, usado como
agente redutor em sínteses orgânicas e inorgânicas e na fabricação de vidros e
pigmentos. Cloreto de Sn (IV), SnCl
4
, também é usado em síntese orgânica, como
intermediário na fabricação compostos organoestânicos e em plástico
4
. Os compostos
inorgânicos de Sn também têm seu uso em pigmentos como o azul cerúleo, nome
tradicional do estanato de cobalto (II), CoSnO
3
9
.
Fluoreto de Sn (II), SnF
2
, é utilizado na odontologia preventiva, com uma ação
protetora plenamente aceita. Um dos maiores problemas associados ao uso de SnF
2
em
formulações dentárias é a instabilidade de suas soluções aquosas, já que o íon Sn (II)
pode oxidar-se facilmente a Sn (IV)
5
. No entanto, só Sn (II) apresenta a atividade
antibacteriana
9
.
O óxido de estanho (IV) tem sido usado há milênios como opacificador em
cerâmicas e em esmaltes vítreos. Películas com até 100 nanômetros (nm) de espessura
tornam o vidro mais resistente a choques mecânicos e são usadas em copos e pratos de
vidro de uso freqüente. Entre 100 e 1000 nm de espessura, efeitos de interferência
luminosa nas películas produzem um aspecto iridescente, já que aí está a faixa visível
do espectro. Acima de 1000 nm, a película é transparente, mas pode conduzir a corrente
elétrica, sobretudo associada a óxido de índio. O vidro tratado dessa maneira tem
inúmeras aplicações, entre as quais as janelas anti-congelantes de aviões e as telas
eletroluminescentes, como em monitores de computadores
5
.
O revestimento de Sn pode ser aplicado em muitas superfícies metálicas por
eletrodeposição, ainda que, quando molhado, o Sn fundido adere facilmente a ligas,
como o aço, e a metais, como o ferro e cobre, fornecendo proteção à oxidação destes
9
.
Porém, as aplicações mais relevantes continuam a ser o mercado de embalagens com as
folhas de flandres e as soldas, estas últimas, destinadas às indústrias automobilísticas, de
telecomunicações e eletro-eletrônicos
19
.
Os compostos organometálicos de Sn são de uso bem mais recente em
comparação com os compostos inorgânicos, pois são de origem sintética. No entanto,
sua utilização tem tido um crescimento
5
. O desenvolvimento crescente da química
organoestânica pode ser atribuído principalmente à importância tecnológica dos
9
compostos organometálicos do Sn, os quais podem ser utilizados como agentes
biocidas, pesticidas, catalisadores em diversas reações e mais recentemente como
agentes antitumorais
17
. Além da importante aplicação comercial nos estabilizadores de
PVC
5
.
Em alguns casos, os compostos organoestânicos (IV) têm apresentado uma
atividade antiproliferativa aceitável in vivo, como um novo agente quimioterápico. No
entanto, como muitos agentes antitumorais típicos, a eficiência e a aplicação dos
derivados organoestânicos parecem ser limitadas pela fraca hidrossolubilidade.
Portanto, a síntese de compostos organoestânicos com maior hidrossolubilidade tem
recebido uma atenção especial
20
.
No início dos anos 60, o tributilestanho (TBT) foi introduzido na navegação
como película protetora, prevenindo o crescimento de colônias de moluscos em cascos
de navios. Existem dois tipos de películas, o primeiro tipo consiste num copolímero de
acrilato e metacrilato de tributilestanho, que sofre hidrólise pela água do mar, liberando
lentamente a espécie TBT, especialmente tóxica para animais marinhos. O segundo tipo
de película utilizado consiste numa espécie triorganoestânica ancorada a um
polissiloxano, formando uma estrutura tridimensional rígida, mais resistente do que a
anterior
16
.
4.3- Toxicocinética
A maioria das pesquisas desenvolvidas para o conhecimento da cinética do Sn
foi realizada em animais como roedores e primatas e, depois extrapoladas para
humanos. Entretanto, existem diferenças entre estudos conduzidos nas mesmas
espécies, o que demonstra uma característica importante da toxicocinética dos
compostos de Sn
5
.
4.3.1- Absorção
Estudos de toxicidade sugerem que compostos inorgânicos de Sn não são
facilmente absorvidos por via oral ou após exposição por inalação, e mostram apenas
um efeito limitado após exposição dérmica
5
.
A pobre absorção, a baixa retenção nos tecidos e rápida eliminação contribuem
para a baixa toxicidade do Sn inorgânico (iSn)
5
. A absorção ocorrida por via
gastrointestinal deste metal é inferior a 5% e é influenciada pelo seu estado de oxidação,
10
sendo os compostos de Sn (II) mais rapidamente absorvidos do que os de Sn (IV)
8
.
Durante a inalação de poeiras e fumos, algumas partículas podem ficar retidas no
pulmão, porém essa acumulação é baixa, devido a pouca absorção deste metal pelo
organismo. Por outro lado, uma pequena concentração de Sn pode penetrar pela pele
intacta
5
.
Um estudo realizado por Johnson e Greger sugere que a absorção
gastrointestinal do iSn em humanos depende da presença de outras substâncias no meio
e sua forma iônica. Indivíduos ingeriram 0,11 mg Sn/dia em uma dieta controlada,
aproximadamente 45% da dose foram absorvidas pelo organismo. Outro grupo de
indivíduos ingeriu alimentos com uma adição de 50 mg por dia de SnCl
2
, e apenas 3%
foram absorvidas. A absorção do Sn resultou ser diferente entre as duas dietas, uma vez
que o tipo de ligação do metal com o alimento não é o mesmo na suplementada. O Sn
naturalmente incorporado nos alimentos pode ser mais prontamente absorvido do que
aquele adicionado como cloreto estanhoso à comida
5, 6
.
Como citado acima, uma das grandes fontes de Sn inorgânico é através dos
alimentos armazenados em embalagens contendo este metal. Neste caso, o alimento está
exposto mesmo congelado, fresco ou engarrafado. Estudos revelam que, ao ser aberto, o
alimento pode apresentar de 40 a 150 g Sn g
-1
, porém, quando armazenado por alguns
dias, mesmo no refrigerador, a concentração do Sn sobe para 500 g Sn g
-1
. Contudo, a
ingestão estimada do metal para um indivíduo que consome 0,5 Kg/dia de alimentos
expostos seria de 1 a 200 mg Sn/dia
21
.
A absorção por inalação de um composto orgânico é possível, apesar de haver
poucos relatos. Os casos publicados são relativos à intoxicação aguda como, por
exemplo, durante a limpeza de um caldeirão em uma indústria, seis trabalhadores
inalaram uma mistura de vapor de cloridrato de dimetilestanho e trimetilestanho. Um
deles morreu 12 dias após a exposição, com uma concentração elevada de Sn na urina,
depressão respiratória e coma
5
.
Em geral, os compostos orgânicos são mais rapidamente absorvidos pelo
organismo do que os inorgânicos
8
. Os derivados alquila de cadeia curta têm uma alta
absorção no trato gastrointestinal (TGI), enquanto que os de cadeia longa são pouco
absorvidos
5
. Logo, após uma exposição às diferentes espécies de Sn orgânico, os
compostos mais tóxicos são aqueles de cadeia curta, como é o caso do trimetil e
trietilestanho
22
.
11
Em humanos, não há estudos quantitativos sobre a absorção dos compostos de
metilestanho, etilestanho e fenilestanho após a ingestão. Apenas a presença de
butilestanho no sangue de animais e em amostras de fígado humano foi relatada,
indicando a absorção desses compostos. Entretanto, um estudo em ratos mostra que,
após a administração oral de 23 mg Sn kg
-1
de mono, di e tributilestanho, foi observada
a excreção de 2, 20 e 35% desses compostos, respectivamente, na urina. Contudo,
podemos concluir que maior excreção ocorre com o aumento do número de radicais
butila no composto, mostrando que os compostos menores são mais absorvidos
5
.
Muitos compostos orgânicos são absorvidos pelo contato com a pele, porém,
pesquisas quantitativas com humanos dessa absorção não foram encontradas
5
. Um
relato de caso mostrou o envenenamento de 217 pessoas após o uso da solução de
diiodato de dietilestanho combinado com ácido linóico para tratamento de furúnculo,
resultando em 111 mortes. Trabalhadores que entram em contado com a película
protetora de cascos de navios e pesticidas, contendo TBT e dibutilestanho (DBT),
sofrem queimaduras, irritação, eritema e lesões pustulosas na pele
22
.
4.3.2- Distribuição
O corpo humano contém em média, menos de 17 mg de Sn, sendo que 6 mg se
encontram nos tecidos moles, entre os quais se destacam os pulmões, fígado e rins, e a
fração restante nos tecidos esqueléticos, principal sítio de deposição. Porém, o
mecanismo de absorção e retenção deste metal não é bem elucidado. A fração de Sn
ingerida e absorvida pelo trato grastointestinal é transportada para a corrente sanguínea
e 50% é imediatamente excretado, 35% é transferido para os ossos e 15% é distribuído
de forma não uniforme entre os tecidos moles
5
.
Nos Estados Unidos, um estudo com indivíduos mostrou que o teor médio deste
metal nas glândulas supra-renais, pulmão, fígado, rins, baço, músculos e cérebro foi de
5,1; 3,4; 1,8; 1,5; 0,8 e <0,4; <0,3 mg / kg peso úmido, respectivamente
6
. Porém, alguns
estudos relatam uma distribuição muito variável de Sn em tecidos humanos, com
diferenças significativas relacionadas à idade e localização geográfica
8
.
Em dois estudos com pessoas não expostas ocupacionalmente aos compostos de
Sn, as concentrações encontradas deste metal no sangue variaram de 2 a 9 g L
-1
. Outro
estudo com doze voluntários, com idade média de 77,8 anos, revela que a concentração
normal de Sn no plasma é de 1,38 ± 0,52 g L
-1
e, nas células vermelhas do sangue,
12
2,49 ± 0,80 g L
-1
. Esses dados sugerem uma razão de, aproximadamente, 1,9 entre
essas concentrações, ou seja, em torno de 65% do Sn podem ser encontrados ligados aos
eritrócitos, enquanto que 35% estão presentes no plasma
5, 6
.
Os pulmões são os únicos órgãos que apresentam acumulo desse metal de
acordo com a idade, isso devido à inalação em ar poluído com Sn, uma vez que este
metal não se acumula em outros órgãos com o avançar da idade. O iSn não cruza
facilmente a barreira hemato-encefálica, porém os dados existentes sugerem a
possibilidade de uma pequena transferência através da placenta
5, 6, 8
.
Os trialquilestanhos (TAT) são transportados pelo organismo através da
circulação enterohepática. Estudos em animais e peixes marinhos mostram que o TBT
acumula-se nos músculos, enquanto o dimetilestanho apresenta maior concentração no
fígado e nos rins. Isso ocorre devido à ligação do metal com proteínas tais como a
metalotioneína ou com peptídeos como a glutationa, presentes no fígado e nos rins, que
desempenham um papel importante na desalquilação dos radicais. Esses estudos em
animais são importantes, uma vez que tais proteínas também estão presentes em
humanos
22
.
Uma contaminação por compostos orgânicos de Sn, como butilestanho e
fenilestanho, foi observada por um estudo realizado com golfinhos na costa da
Tailândia. Concentrações desses compostos variando de 16 a 1152 g kg
-1
e ≤1 a 62 g
kg
-1
, respectivamente, foram encontradas nos órgãos e tecidos. Um elevado teor de TBT
foi encontrado no fígado, enquanto que o trifenilestanho não foi detectado devido à
baixa concentração. Dentre os compostos butilados, o monobutilestanho (MBT) foi a
espécie dominante nos tecidos e órgãos, com exceção do fígado, em que predominou o
DBT. O MBT e DBT produzidos no fígado são distribuídos por vários órgãos e tecidos
através da corrente sanguínea
23
.
4.3.3- Metabolismo
Existem poucos estudos realizados em humanos sobre o metabolismo dos
compostos de Sn inorgânico ou orgânico, após a exposição por inalação, ingestão e
dérmica
5
. Quando diferentes estudos são comparados, podem ser observadas variações
nas espécies do metal encontradas em um mesmo órgão, isso sugere a ocorrência de
alguns erros durante as análises, como uma separação mal sucedida, perdendo a espécie
original, ou ainda, a dependência dos compostos de Sn que expuseram os humanos.
13
A diferença em relação à afinidade do Sn (II) e Sn (IV) pelos rins e fígado é
indicada pela estabilidade da valência do Sn. Os resultados sugerem que estes dois
estados de oxidação não são facilmente mutáveis in vivo, como ocorre frente ao ar e
umidade. Pode-se concluir que os cátions deste metal não são rapidamente oxidados ou
reduzidos durante a sua absorção e distribuição sistêmica em mamíferos
6
.
Já para os compostos orgânicos, uma pesquisa realizada in vitro observou que os
microssomos hepáticos realizam a desalquilação do TBT para a forma metabólica de di
e monbutilestanho. Entretanto, a debutilação do DBT para o MBT pela monoxigenase
microssomal é consideravelmente mais baixa do que aquela do TBT para o DBT. O
metabolismo do TBT ocorre rapidamente, e seus metabólitos são detectados no sangue
3 horas após ser ingeridos
5, 22
.
O estudo com golfinhos pode explicar, in vivo, a metabolização dos compostos
butilados de Sn. O fígado foi o órgão alvo do TBT, assim como do DBT, devido à
rápida metabolização do primeiro para o segundo, quando comparada a do DBT para
MBT, pela enzima citocromo P450 presente neste órgão. Existem duas hipóteses para
explicar a predominância do DBT no fígado em relação aos outros compostos butilados.
A primeira possibilidade é a fácil excreção do MBT devido a sua alta polaridade frente
aos compostos di e tributilados, enquanto que a debutilação restrita de DBT para MBT
em comparação a do TBT para DBT pela monooxigenase microssomal é a uma
alternativa. A alta concentração de MBT em outros órgãos e tecidos pode ser dar pela
rápida metabolização do DBT para MBT nesses locais
23
.
Análises in vivo de complexos peptídicos com trietil (TET) e tripropilestanho
também apresentam uma progressiva desalquilação para dietil e dipropilestanho,
respectivamente. Isso pode indicar que os peptídeos complexados ao Sn são capazes de
desalquilar compostos trisubstituíveis. Essa desalquilação ocorre quando o Sn se liga ao
enxofre, presente nos grupamentos tióis dos peptídeos, fazendo com que haja perda de
um radical alquila
24
.
4.3.4- Eliminação
O iSn absorvido é excretado principalmente pela urina, porém apresenta baixa
excreção pela bile (< 15%). A excreção diária do iSn pela fezes representa
principalmente o metal não absorvido pelo sistema gastrintestinal
7
.
O organismo elimina o Sn inorgânico absorvido rapidamente, em dias ou
semanas. Parte deste Sn, entretanto, pode ficar retido nos ossos por 2 ou 3 meses.
14
Estudos realizados para calcular o tempo de meia vida deste metal no organismo
observaram que 20% de Sn absorvido foram excretados com um tempo de meia-vida de
4 dias, outros 20% em 25 dias, e os 60% restantes, em 400 dias
6
.
Para os compostos orgânicos, existem poucos estudos sobre a excreção
realizados em humanos e em animais após exposição por inalação, ingestão e dérmica
1
.
A excreção dos compostos orgânicos de Sn depende da sua estrutura química,
solubilidade e modo de administração
22
.
A rota de excreção do TBT absorvido ocorre principalmente pela urina e bile.
Porém, aproximadamente de 90 a 96% do TBT ingerido são excretados pelas fezes
22
.
Estudos em camundongos mostraram que a quantidade de Sn excretado na urina, após
uma dose oral de diferentes espécies de butilestanho, tri-, di- e mono-, aumenta de
acordo com o número de grupos butílicos. A excreção urinária de Sn, após cinco dias da
administração oral, foi de 5% para TBT, 3% para DBT e 0,3% MBT
5
.
4.4- Toxicodinâmica
4.4.1- Formação dos compostos de estanho em meio biológico
A maioria dos compostos orgânicos de Sn é considerada bastante tóxica, mesmo
em baixas concentrações. No entanto, a toxicidade é dependente da estrutura desses
compostos, em que a atividade biológica é determinada pelo número e natureza dos
grupamentos orgânicos ligados ao átomo central de Sn. No entanto, nesses compostos,
parece que a natureza dos grupos aniônicos, geralmente representados por Cl
-
, F
-
, O
2
-
,
OH
-
, COO
-
ou S
-
, tem apenas importância secundária na atividade biológica
25
.
A solução para os problemas toxicológicos causados por essas espécies no
organismo necessita de um profundo conhecimento dos mecanismos de ação, processos
que envolvem importantes ligantes biológicos como aminoácidos e proteínas. Porém, o
conhecimento específico ou seletivo das ligações ocorridas entre metal-proteína, os
sítios doadores nas estruturas biológicas e até mesmo das moléculas funcionais são
escassos
18
.
O mecanismo sugerido para a interação proteína-estanho é a formação da ligação
covalente entre o átomo de Sn (IV) e os grupamentos tióis presentes nas proteínas
24
. A
ligação das moléculas de TET em mitocôndrias de fígado de rato é atribuída a dois
sítios, à histidina, de alta afinidade, e ao grupo tiol, de baixa afinidade. Os grupamentos
15
mais importantes de proteínas a que os compostos trialquilestanho ou dimetilestanho
(IV) se ligam são hemoglobinas e sistema ATP-ase
18
.
A ligação covalente Sn-C pode ser clivada por uma série de fatores ambientais,
incluindo ataques químicos, nucleofílico ou eletrofílico, radiação de ultravioleta (UV),
alteração do pH e desalquilação por organismos procariontes e eucariontes, podendo
gerar novas espécies. Nos mamíferos, em órgãos como o cérebro, fígado e rins, os
compostos orgânicos são sistematicamente degradados a compostos inorgânicos de Sn,
a desalquilação ocorre inversamente proporcional ao comprimento e a estabilidade da
molécula alquila. Isto mostra que a degradação in vivo pode fornecer uma explicação
sobre o atraso na resposta tóxica dos compostos orgânicos
24
.
Os compostos orgânicos de Sn podem interagir com a atividade da membrana
devido a sua lipossolubilidade, tornando a membrana celular, um sítio inicial de sua
ação. Alguns estudos mostram que a mitocôndria tem sido alvo dos triorganoestanhos,
interferindo na produção de energia mitocondrial, inclusive na interrupção da
fosforilação oxidativa, mudanças na permeabilidade exterior da membrana mitocondrial
e supressão da atividade enzimática. Além disso, os compostos triorganoestanhos
aumentam o fluxo de saída de cálcio da célula, contribuindo para o aumento da
toxicidade
7
.
Billingsley e seus colaboradores identificaram uma proteína na membrana
mitocondrial chamada “stannin” que, segundo o artigo, vem de stannum (Sn em latim) e
sensibiliza as células neuronais por intoxicação do TMT. Essa proteína está fortemente
representada na região do hipocampo e apresenta dois sítios com cisteína, que, por ser
constituída de um grupamento tiol na sua cadeia lateral, pode contribuir para a ligação
do TMT
24
.
Outro aminoácido abundante em proteínas do plasma é a glicina, onde são vistos
complexos de aminoácidos e íons de Sn (II). Os íons desse metal podem bloquear o
grupo terminal da glicina inibindo a transformação da ação enzimática. As proteínas
podem se vincular aos íons de Sn (II) através de distintos sítios de ligação, constituídos
por diferentes grupos funcionais
26
.
Tais estudos, porém, sobre a ligação de compostos orgânicos de Sn e
macromoléculas biológicas são ainda muito raros na literatura e poucos para uma
descrição quantitativa. As pesquisas sobre esses compostos, e importantes ligantes
biológicos, têm conquistado importância devido ao seu potencial de aplicação
16
farmacêutica, como a atividade anticâncer fornecida pelos derivados de
dialquilestanho
18
.
4.4.2- Efeitos causados pelos compostos de estanho
Muitas das informações sobre os efeitos dos compostos de Sn na saúde humana
vêm de estudos em indivíduos expostos no trabalho, voluntários expostos a quantidades
controladas, e exposições acidental ou intencional. Alem disso, numerosos estudos
sobre efeitos têm sido realizados com uma variedade de animais, principalmente
roedores. Apesar dos estudos com animais apresentarem uma ampla variedade de
consequências, não é conhecido se a exposição de humanos a esses compostos
encontrados no meio ambiente causará efeitos similares
5
.
A maioria dos estudos encontrados para os compostos inorgânicos utilizou
animais de laboratório, uma vez que raras são as pesquisas realizadas em humanos com
tempo médio de exposição. Assim, um dos efeitos de maior destaque após a
administração de cloreto de Sn (II) foi o retardo no crescimento, avaliado através do
decréscimo significativo do peso do fêmur e seu conteúdo de cálcio. Foram observadas
também irritações do TGI, diminuição da eficiência alimentar, anemia leve e pequenas
alterações nos tecidos hepáticos
6
.
Os efeitos metabólicos associados com a ingestão diária de 1 a 200 mg Sn,
devido à exposição aos alimentos contidos em embalagens que apresentam este metal,
têm recebido pouca atenção. Em estudos com animais de laboratório, a ingestão de 500
– 5000 g Sn g
-1
, em uma dieta tem sido associada com a acumulação deste metal em
tecidos como ossos, fígados e rins; com distúrbios no metabolismo dos minerais
essenciais tais como ferro, cobre, zinco, cálcio e selênio, além da redução no
crescimento desses animais
21
. Portanto, se a farmacocinética desses metais essenciais é
alterada, é difícil de compreender se um determinado efeito é causado pela exposição ao
Sn ou é devido às flutuações dos níveis dos outros metais nos tecidos
5
.
Suplemento diário de ferro é fator de proteção contra a anemia induzida pelo Sn,
enquanto que uma diminuição do ferro na dieta exacerba o efeito. Contudo, o retardo no
crescimento causado pelo metal não foi atenuado pelo enriquecimento da dieta com
ferro ou cobre
6
.
17
Ratos de laboratório, quando alimentados com 206 g Sn g
-1
por três semanas,
apresentaram teores significativamente menores de cobre e zinco em seus rins e de
zinco em suas tíbias, porém, maiores níveis de ferro em seus fígados, quando
comparados a animais alimentados com 1 g Sn g
-1
na dieta. Quando os animais foram
expostos oralmente ao Sn, houve uma elevação no teor de cálcio contido na bile,
enquanto que os níveis deste metal essencial no soro e fêmur diminuíram. Entretanto,
humanos aparentemente absorvem menos zinco e selênio, quando 50 mg de iSn são
adicionados às suas dietas
21
.
Não existem estudos que avaliem se as concentrações de compostos de Sn
alteram a imunocompetência humana. Contudo, a exposição aguda em ratos expostos a
altas concentrações de TBT e outros compostos orgânicos deste metal, > 2 mg/kg/dia,
tem causado alterações imunes. O efeito é caracterizado por redução de peso e tamanho
do timus e depleção linfócica
5
.
Assim, sais de TBT e trifenil (TPhT) podem ser considerados imunotóxicos,
enquanto o TET e trimetilestanho (TMT) exibem uma atividade neurotóxica. Esses
últimos compostos apresentam um comportamento diferenciado, induzindo danos
seletivos em regiões distintas do sistema nervoso central (SNC). O TMT induz
toxicidade localizada dentro do hipocampo e no neocórtex, enquanto TET afeta regiões
da medula espinhal
24
.
Nos compostos alquilados, os homólogos menores, metil e etil, são mais tóxicos
quando administrados oralmente, e a toxicidade vai diminuindo de acordo com o
aumento do tamanho da cadeia como o octil, que não apresenta ação tóxica
25
. Entre os
compostos metilados, o TMT é o mais tóxico, tendo sido demonstrado efeito
neurotóxico em humanos nos casos de exposição acidental, resultando no aparecimento
de mudanças comportamentais como agressividade, além de fraqueza, depressão,
desorientação, perda de memória severa, doenças repentinas e, em alguns casos, a
morte. Se a metilação do dimetil para o trimetilestanho ocorre de forma significativa no
homem, o efeito neurotóxico severo do dimetilestanho em pacientes pode ser
explicado
27, 24
.
Compostos trialquilestanho, como o TET, podem causar encefalopatia e edema
cerebral. Uma pesquisa com trabalhadores expostos ao TMT e TET apontou para o
desenvolvimento de distúrbios físico-motores, tremores, convulsões e alucinações
22
.
Os compostos de Sn orgânico podem causar irritação severa e queimação na
pele, dependendo do grau de exposição. Esses compostos são conhecidos por serem
18
irritantes da pele e olhos. A toxicidade sistêmica, também produzida após inalação ou
ingestão, pode levar a anemia, danos renais e hepatocelulares, além de nefropatia e
desordem no SNC. A produção de catecolaminas pode ser estimulada, levando a
hiperglicemia, mudanças na pressão sanguínea e danos ao sistema imune
5, 7
.
Pessoas cronicamente expostas ao Sn inorgânico, como SnO
2
em poeiras e
fumos, podem desenvolver uma forma benigna de pneumoconiose, conhecida como
estanhose, que envolve principalmente a parte inferior do sistema respiratório
5
.
Presume-se que sejam capazes de reagir com membranas celulares, levando a
alterações tais como aceleração dos processos de troca iônica e oxidação de lipídeos,
inibição da fosforilação oxidativa e fotoquímica, além de inibir a síntese do heme
oxigenase e causar efeito genotóxico
22, 25
.
Os compostos de Sn contendo grupamentos alquila e aromático são potentes
neurotoxinas. Por exemplo, a exposição ao trifenilestanho pode causar espasmos
musculares das mãos, contração nervosa facial e até choro involuntário. Além disso,
anormalidades no SNC, neuropatia periférica, hepatite e leucopenia têm sido
monitoradas entre 6 e 9 dias após a exposição a este composto
22
.
Os compostos trialquilestanhos ligados com a membrana das mitocôndrias
induzem à rápida alcalinização na matriz energética dessas organelas, induzindo a
interrupção da fosforilação oxidativa e o desacoplamento da transdução de energia
mitocondrial. O ponto crucial desse mecanismo é a entrada dos compostos TAT na
mitocôndria como cátions lipofílicos (alquil)
3
Sn
+
. Isto confirma a hipótese que os
compostos de TAT não são somente trocadores iônicos, Cl
-
/ OH
-
, da membrana
biológica como também carreadores de prótons na membrana, sugerindo que o alvo
preferencial desses compostos são as células nervosas
28, 29
.
Um estudo, com cultura de células, mostrou que linfócitos humanos, expostos ao
dimetil, trimetil, butil e fenilestanho, são induzidos a aneuploidia. A genotoxicidade do
tri-n-butilestanho e trifenilestanho em células de mamíferos também foram relatadas. O
dietilestanho é conhecido por interagir com as membranas celulares de eritrócitos
humanos
30
.
19
5- Plasma e sua importância para o monitoramento biológico
O sangue é constituído pelo plasma e por células sanguíneas. O plasma é um
líquido amarelado formado por 90% de água, onde estão dissolvidos os componentes
mais abundantes, as proteínas (6%). Apresenta também carboidratos, lipídeos,
hormônios, íons como sódio, cloreto, fosfato, potássio, magnésio, cálcio, que são os
menores constituintes do plasma e ainda produtos da atividade celular. Os constituintes
do plasma têm a função de se ligar e transportar os elementos para os órgãos alvos,
como os ossos
31
. As principais proteínas presentes são a albumina, com 57 – 71% e a
imunoglobulina, com 8 – 26%
32
.
A fração plasmática do sangue é um dos principais informativos do ponto de
vista clínico. O plasma é considerado uma valiosa janela para a avaliação do estado
normal e fisiopatológico
33
.
Na separação do plasma, o sangue é coletado em um tubo à vácuo, contendo
heparina, substância anticoagulante. Posteriormente, é centrifugado, as células se
depositam e o sobrenadante corresponde ao plasma. Para se obter soro, a coleta é
realizada em tubo sem anticoagulante. Em seguida, deixa-se coagular o sangue (no frio,
para não haver degradação dos elementos a analisar), ficando o soro sobre o coágulo.
Portanto, o soro é o plasma sem os fatores de coagulação, como a fibrina
31
.
20
6- Exposição Ocupacional e Ambiental
O aumento do uso dos compostos de Sn (IV) na indústria, agricultura e
aplicações biológicas durante os últimos 50 anos leva ao acúmulo deste metal no meio
ambiente e em sistemas biológicos. Desta forma, sua interação com organismos vivos
aumentará nos próximos anos gerando um aumento nos problemas toxicológicos
relacionados ao metal
18
.
Elevados teores de metais podem ser encontrados na cadeia trófica e no homem,
nas regiões de garimpo, devido à dispersão desses elementos nos solos, cursos d'água e
alimentos produzidos nestas áreas, podendo colocar em risco toda população localizada
no entorno de locais com atividades relacionadas a minérios
34
.
No caso dos trabalhadores que realizam o beneficiamento do minério, a
exposição ao Sn ocorre através da inalação de poeiras e fumos ou por deposição dos
compostos de Sn sobre a pele. Para estes trabalhadores e para a população que vive nos
arredores das indústrias, onde a concentração de Sn é elevada, a contaminação poder
ocorrer através da inalação da poeira do minério ou fumos metálicos, contato com os
minerais ou ingestão de água e alimentos contaminados pelo metal
5
. E ainda, a
produção de Sn pode expor o trabalhador à sílica, chumbo e arsênico, durante a
mineração do sulfeto de estanho, gerando pneumoconioses. Do mesmo modo, a
preparação e utilização de Sn nas ligas e soldas representam uma exposição a estes
metais
9
.
Sais de trimetilestanho ainda são encontrados na urina de indivíduos não
expostos mesmo de áreas não contaminadas. Este composto não tem sido utilizado
comercialmente nos últimos anos devido a sua alta toxicidade, o que reforça a
preocupação com a contaminação ambiental
24
.
Um estudo de coorte investigou o risco de exposição à sílica em trabalhadores de
minas de Sn na China, o maior produtor do metal, e observou a relação do
desenvolvimento da silicose com a exposição à poeira acumulada. Foi observado que
33,7% dos trabalhadores apresentavam silicose. Desses, 67,4%, desenvolveram a
doença após exposição ocupacional média de 3,7 anos
35
.
Uma exposição crônica pode levar a estanhose, que ocorre devido à respiração
de poeiras e fumos com Sn. Partículas do metal que se depositam nas vias aéreas
inferiores são fagocitadas por macrófagos alveolares. Esses, carregados com material
cristalino, agregam-se ao redor de bronquíolos, vasos, septos interlobulares e paredes
21
alveolares, sem fibrose significativa. A estanhose não apresenta sintomas e a função
pulmonar continua normal. O quadro radiológico é muito importante para o diagnóstico,
associado à pobreza de sintomas
36
.
A absorção dérmica e inalatória são importantes rotas de exposição ocupacional
para certos compostos organoestânicos, como o lactato de trifenilestanho, usados em
fungicidas e inseticidas, e podem ocorrer durante a manipulação e aplicação dos
produtos
5
.
Julião e colaboradores realizaram um estudo com trabalhadores de uma mina de
nióbio na Floresta Amazônica, onde são obtidos concentrados de nióbio e tântalo,
cassiterita e zirconita, através de separação eletromagnética e por hidrogravimetria. A
concentração de Sn foi determinada na urina de três grupos de trabalhadores. No
primeiro, a urina foi coletada antes da jornada de trabalho, enquanto que o segundo
grupo fez a coleta no final do dia trabalhado. Pessoas não expostas ocupacionalmente
constituíram o grupo controle. Os teores médios de Sn encontrados nas urinas coletadas
antes e após a jornada de trabalho foram de 0,13 ± 0,2
e 0,5 ± 0,9 g L
-1
,
respectivamente. Por outro lado, o grupo não exposto apresentou concentração média de
apenas 0,1 ± 0,1 g L
-1
. Os resultados apresentados mostram que a concentração média
de Sn na urina do grupo exposto é estatisticamente maior do que a encontrada no grupo
controle, indicando uma exposição ocupacional
37
.
A Occupaional Safety and Health Administration (OSHA), dos Estados Unidos,
e o National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) estabeleceram um
limite de 0,1 mg m
-3
(Threshold Limit Value - Time-Weighted Average, TLV-TWA)
para compostos orgânicos de Sn no ar do ambiente de trabalho. Porém, este nível de
exposição deve ser de, no máximo, trinta minutos em um dia com 8 h de trabalho.
Fixaram ainda, para os compostos inorgânico de Sn, um valor de 2 mg m
-3
, exceto para
SnO
2
. Segundo o NIOSH, o tempo médio ponderado para a exposição ao metal
inorgânico é de dez horas
22
.
Em um estudo sobre exposição ocupacional, as análises das amostras de poeiras
coletadas durante a fundição de Sn indicaram a presença de Sn metálico superior a 33%
em partículas com diâmetro menor do que 5 m, porém não mostraram indícios de
sílica. As concentrações encontradas em alguns ambientes de trabalho foram 2,22 mg m
-
3
no galpão, 1,10 mg m
-3
nos filtros de ar, 1,55 mg m
-3
na fundição e 0,82 mg m
-3
na
refinação. Entretanto, os métodos de análises não foram descritos neste trabalho
9
.
22
7- Garimpo como um problema de saúde pública
As mudanças nos ecossistemas podem ocorrer em escala de magnitude tal que
produzam um efeito catastrófico sobre os processos econômicos, sociais e políticos, dos
quais a estabilidade social, o bem-estar humano e a boa saúde são dependentes
5
.
A degradação em curso decorrente da interferência humana nos sistemas
hídricos amazônicos, como é o caso da mineração de cassiterita, deixa a área desmatada,
e preenchida com rejeitos do metal. Assim, é uma barreira significativa para o alcance
de bons indicadores de qualidade de vida
38
. A principal perda observada no solo é de
sua fertilidade, onde a matéria orgânica, a fauna e os nutrientes se concentram, sendo
desfavorável para o crescimento da vegetação. A recuperação de áreas degradadas por
homens visa acelerar o processo sucessório e, se possível, melhorar tais áreas em
conformidade com a sua utilização futura
39
.
É necessário controlar a crescente exposição dos trabalhadores e das
comunidades ao redor da mineração, às substâncias tóxicas produzidas, com as quais os
mineradores têm contato diário. A falta de medidas para a minimização de resíduos
perigosos e a inexperiência em seu manejo, assim como, o destino inadequado,
permitiram a exposição de muitas populações a estas substâncias. As conseqüências
sobre a saúde destas populações são devidas à falta de profissionais especializados tais
como epidemiologistas e toxicologistas ambientais e clínicos
11
.
O modo de trabalho dos garimpeiros pode justificar sua contaminação pelo
metal, visto que o minério é produzido através de uma longa cadeia de processos, que
acarretam em poluição e geração de resíduos, para os quais não foi observada nenhuma
forma de controle ou armazenamento.
Apesar da situação de informalidade, os garimpeiros utilizam pesados
equipamentos nas suas atividades; os garimpos se tornaram complexos sistemas
informais de lavra mecanizada, utilizando equipamentos como dragas, tratores e até
completas estações de tratamento de minérios.
Os garimpeiros que fazem o trabalho manualmente são chamados de requeiro ou
reco. Trabalham com as sobras da escavadeira, nos veios dos barrancos e no lodo
descartado dos separadores, para depois realizar o beneficiamento do minério, que tem
como objetivo separar a cassiterita da matriz que a envolve. Desta forma, é reduzido a
metal cru em altas temperaturas num fundidor, sendo posteriormente purificado numa
refinaria por intermédio de refundição
40, 41
.
23
É necessário observar a qualidade de vida dos mineradores da Bacia
Hidrográfica do Rio Jamari, com vistas a entender e minimizar a vulnerabilidade desses
trabalhadores aos problemas relacionados à mineração de cassiterita. As condições de
vida e trabalho dos garimpeiros permanecem bastante adversas, caracterizadas pela falta
de infraestrutura, principalmente de saúde e educação. A saúde dos mineradores é pouco
explorada, os centros de pesquisas ficam distantes e com pouco acesso, dificultando a
promoção à saúde deste setor trabalhista
15
.
A saúde pública no Brasil dispõe das Normas Regulamentadoras, NRs, que têm
como objetivo regulamentar e fornecer orientações sobre os procedimentos obrigatórios
relacionados à medicina e segurança no trabalho no Brasil. A NR-22, que dispõe da
Segurança e Saúde Ocupacional na Mineração, tem por objetivo disciplinar os preceitos
a serem observados na organização e no ambiente de trabalho, de forma a tornar
compatível o planejamento e o desenvolvimento da atividade mineradora com a busca
permanente da segurança e saúde dos trabalhadores. Esta norma se aplica tanto a
minerações subterrâneas, como as de céu aberto, garimpos e beneficiamentos
minerais
42
.
A NR-22 apresenta critérios a serem impostos às empresas, tais como
interromper todo e qualquer tipo de atividade que exponha os trabalhadores a condições
de risco grave e iminente para sua saúde e segurança; fornecer às empresas contratadas
as informações sobre os riscos potenciais nas áreas em que desenvolverão suas
atividades, além de coordenar a implementação das medidas relativas à segurança e
saúde dos trabalhadores; elaborar e implementar o Programa de Controle Médico e
Saúde Ocupacional e o Programa de Gerenciamento de Riscos, incluindo riscos físicos,
químicos e biológicos, além dos limites de exposição ocupacional, equipamentos de
proteção individual, entre outros tipos de riscos incluídos nas NRs
42
.
Observando-se a NR 22, nota-se que diversas melhorias podem ser feitas nos
garimpos da região. Entretanto, a realidade de muitas empresas é outra, podendo ser
encontrados alguns problemas, como o uso de maneira inadequada dos equipamentos de
proteção individual e a falta de tratamento dos rejeitos gerados pela mineração, os quais
são critérios essenciais no Programa de Gerenciamento de Riscos.
Além das normas regulamentadoras que auxiliam na segurança do trabalho,
existe a Comissão Interna de Prevenção de Acidentes, CIPA, que tem por objetivo a
prevenção de acidentes e doenças decorrentes do trabalho, de modo a tornar compatível
24
permanentemente o trabalho com a preservação da vida e a promoção da saúde do
trabalhador
100
. O conhecimento dos níveis de ocorrência de acidentes de trabalho é fator
indispensável para a adoção de uma política trabalhista e empresarial que preserve o
bem-estar do trabalhador e evite custos e prejuízos aos empresários. Porém, esses
mecanismos técnicos, legais, sociais e jurídicos ainda não foram suficientes para reduzir
de forma significativa os níveis de acidentes de trabalho e de doenças profissionais no
Brasil. Os acidentes mais freqüentes ocorrem na construção civil, na indústria
metalúrgica, na fabricação de móveis, no garimpo e nas atividades agrícolas
43
.
Ainda existem leis que antecedem a atividade garimpeira, como a Lei nº 11.685,
que instituiu o Estatuto do Garimpeiro, destinado a disciplinar os direitos e deveres
assegurados aos garimpeiros. E a Lei nº 3.295, que autoriza o Governo Federal a criar
uma instituição denominada Fundação de Assistência aos Garimpeiros, cujo objetivo é a
prestação de serviços sociais nas regiões garimpeiras, visando a melhoria das condições
de vida das suas populações, notadamente no que diz respeito à saúde, educação e
assistência sanitária, à habitação, alimentação e vestuário; ao incentivo à atividade
extrativa-produtora e a quaisquer empreendimentos que visem ao amparo, assistência e
valorização do garimpeiro; e à vinculação do garimpeiro ao regime de Previdência
social
44
.
25
8- Especiação e análise de especiação
A “International Union for Pure and Applied Chemistry” (IUPAC) estabeleceu
recomendações sobre o uso da terminologia comum em química, para facilitar a
comunicação entre cientistas de diferentes campos e evitar interpretação errônea devido
à terminologia ambígua. Assim, a IUPAC definiu a especiação como sendo a
ocorrência de um elemento em diferentes formas em um sistema, como por exemplo,
quais as formas orgânicas e inorgânicas presentes e a ligação destes com outras
substâncias no organismo, como proteínas. E foi recomendado o uso do termo análise
de especiação quando se referir à atividade analítica de identificar e determinar as
diferentes espécies químicas em uma amostra e a determinação dos constituintes que se
ligam ou que transportam o analito de interesse
45
.
A especiação é aplicada no campo ecológico, especialmente em solos, água e
materiais particulados, além de haver um grande interesse na medicina e biologia sobre
a acumulação e toxicidade de metais no organismo, principalmente para trabalhadores
expostos ocupacionalmente
10
.
O conhecimento do conteúdo total do elemento no organismo é importante no
monitoramento ocupacional. Todavia, é insuficiente para a compreensão do
metabolismo, dos mecanismos de toxicidade, avaliação de risco de consumo,
entendimento do modo de entrada e distribuição do elemento na célula, interações dos
diferentes metais com biomoléculas e a deposição nos tecidos, além de ajudar a
desenvolver estratégias de descontaminação e de detoxificação. Devido a essas
informações, a utilização da detecção das formas molecular e estrutural tem ganhado
popularidade ao longo das últimas décadas
1, 46, 47
.
A análise dos metais ligados aos compostos orgânicos tem se tornado cada vez
mais importante nas ultimas décadas, pois as formas orgânicas de alguns metais podem
ser muito mais tóxicas do que sua forma inorgânica
48
.
A partição dos compostos organoestanho entre os compartimentos, bem como a
sua toxicidade, bioatividade e biodisponibilidade, depende criticamente das
propriedades físico-química em que as espécies estão realmente presentes. Esta é a
razão pelo qual o conhecimento das concentrações relativas de todas as espécies
químicas, presentes em um determinado meio, é muito mais relevante para avaliação da
exposição do que as determinações do Sn total
1, 49
.
26
As espécies podem ser divididas em exógenas, tais como contaminantes
ambientais e produtos de sua degradação, e endógenas como metabólitos naturais ou
metais complexados com bioligantes. Do ponto de vista químico, as espécies podem ser
categorizadas pelo seu estado redox, espécies organometálicas, quando ligadas ao átomo
de carbono, e complexadas, quando ligadas a polipeptídeos, proteínas, fragmentos de
DNA ou outros compostos macromoleculares
50
.
Devido às atividades microbiológicas e as condições de redução freqüentemente
presentes em matrizes ambientais, esses metais podem ser metilados. Em caso de
permetilação, os metais tornam-se voláteis e entram na atmosfera. As mudanças na
metilação alteram a mobilidade dos elementos
48
.
A análise das espécies deveria permitir a determinação das diferentes espécies
do elemento em uma amostra, porém este objetivo não é facilmente alcançado. Durante
a análise, diversas tarefas podem induzir a resultados errados no final do todo processo,
tais como a coleta, armazenamento e preparação das amostras, separação das espécies e
detecção do analito, que assim contribuem para que as espécies encontradas não sejam
realmente aquelas de interesse
10, 1
.
Alguns motivos podem ser citados como causa da instabilidade das espécies,
como reações químicas entre as próprias espécies, interação com o material de
armazenamento, atividade microbiana, temperatura, pH, ação da luz e outros fatores,
como a complexidade da matriz, especificidade insuficiente da separação dos
biocompostos, contaminações fortuitas com o elemento de interesse e a quebra da
ligação original metal-proteína
1, 51
.
A necessidade de abordagens sofisticadas envolvendo várias etapas analíticas
também faz com que aumentem os erros dos resultados. Porém, existe uma forte
tendência para reduzir o número de passos, graças à combinação de alguns deles. A
preparação das amostras é de longe, a mais importante na fonte de erros nos métodos
analíticos modernos
22, 49
.
A etapa de coleta da amostra é a mais crítica da análise de especiação, visto que
pode ocorrer interferência no equilíbrio das espécies, causando erros irreversíveis. O
processo de amostragem deve preservar a informação original sobre as espécies nativas
e o equilíbrio entre elas. Entretanto, nem sempre isso acontece. Por exemplo, a
contaminação do sangue pelo analito de interesse pode ocorrer através do material de
coleta, assim como a perda da espécie original devido à pressão do tubo. Outros
27
problemas ainda podem vir a ocorrer, quando as espécies são adsorvidas nas paredes
dos frascos coletores, e ainda há oxidação causada pelo oxigênio
10
.
Apenas a preparação de amostra é responsável por 60% do tempo gasto na
execução de análise e até 50% do eventual erro de medição. Esses percentuais podem
ser considerados ainda mais elevados na análise de especiação, onde as matrizes são
complexas, apresentando uma baixa concentração das espécies e uma distribuição
heterogênea
52
.
Durante o armazenamento das amostras, cuidados devem ser tomados para evitar
as contaminações fortuitas, que podem surgir devido à descontaminação inadequada dos
frascos utilizados, ou ainda, às propriedades de troca-iônica do material de que são
fabricadas as paredes dos recipientes. Uma amostra estocada por um longo período terá
mais chances de ser contaminada pelas paredes do frasco. Além dessas precauções,
deve-se observar a temperatura conveniente para cada armazenamento, pois espécies
voláteis podem ser perdidas
10
.
A perturbação do equilíbrio físico-químico existente faz com que, no final, as
espécies determinadas pelas medições podem não representar completamente aquelas
originalmente existentes nas amostras. Outros desafios são as concentrações
excessivamente baixas que, após o fracionamento das diferentes formas do metal,
necessitarão de detectores extremamente sensíveis e seletivos
1
.
O controle de qualidade é fundamental nas análises de especiação, uma vez que
mostra a existência de erros, contribuindo assim para a sua identificação e remoção. É
importante ter em mente, que as principais fontes de erros, normalmente ocorrem
durante a amostragem, armazenamento, tratamento e a manipulação da amostra, tarefas
difíceis na análise de especiação, que requer muita cautela
51
.
28
9- Metodologias envolvidas na análise de especiação de fluidos biológicos
Os exemplos de toxicidade mostrados no decorrer do trabalho mostram a
necessidade crescente de conhecimentos sobre a análise de especiação e o
desenvolvimento de metodologias analíticas. Um grande número de técnicas e métodos
analíticos tem sido usado para determinar compostos inorgânico e orgânico de Sn
22
. A
preocupação sobre o potencial de toxicidade do TBT e seus produtos de degradação,
DBT e MBT, gera o aumento do interesse no desenvolvimento de métodos analíticos
mais sensíveis e precisos para a sua determinação
53
.
As frações sanguíneas, eritrócitos e plasma, contêm uma grande variedade de
substâncias que variam de massa molecular elevada à pequenos íons metálicos. Daí, há
necessidade de eficiência nos métodos de separação. Por exemplo, nos eritrócitos, que
representam 94% do montante total de proteínas no sangue, com essa alta concentração
protéica é difícil a identificação de alguns compostos. A separação das proteínas de
acordo com o tamanho é útil, pois é aproximadamente diretamente proporcional à massa
das partículas
54
.
O processo analítico compreende uma série de etapas sucessivas, começando
com a concepção de uma estratégia adequada para um dado analito em uma
determinada matriz, e terminando com a interpretação dos dados obtidos através do
instrumento escolhido. Um método ideal permite realizar amostragem, preparação das
amostras, separação e quantificação, incluindo tratamento de dados estatísticos em um
único processo, e sem intervenção de um operador
52
.
A moderna análise de especiação geralmente conta com a extração, separação e
detecção, onde técnicas como a cromatografia líquida de alta e baixa pressão (High
Pressure Liquid Chromatography – HPLC, Low Pressure Liquid Chromatography -
LPLC), cromatografia gasosa (CG) e eletroforese realizam a separação das espécies, e
espectrometrias como ICP MS
(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry) e AAS
(Atomic Absorption Spectrometry) detectam e quantificam o analito em questão.
Ainda existem os métodos diretos, que incluem ressonância magnética nuclear
(RMN) e voltametria. Porém, a faixa de concentração detectável pelo RMN é
demasiada elevada para as amostras reais, de relevância ecológica e biológica. E com a
voltametria, a quantificação é impossível em amostras com alta carga orgânica
10
.
29
A escolha da técnica depende do objetivo da pesquisa, da acuracidade e
sensibilidade, principalmente quando a concentração da espécie do analito é muito
pequena ou apresenta um baixo limite de detecção
1
.
A cromatografia gasosa apresenta um elevado poder de resolução quando
comparado a uma cromatografia líquida, e é relativamente fácil seu acoplamento a
detectores sensíveis e seletivos. Por exemplo, um cromatógrafo gasoso hifenado a um
espectrômetro de emissão ótica (GC - OES) foi recentemente proposto para a análise de
especiação dos compostos orgânicos de Sn, em amostras ambientais, mostrando boa
seletividade e sensibilidade. Porém, já para a técnica de absorção atômica, em teoria,
qualquer tipo de atomizador pode ser acoplado a um cromatógrafo a gás, contudo, na
prática, várias condições precisam ser atendidas, a fim de obter boa sensibilidade e
seletividade para problemas específicos de análise
49
.
Entretanto, para realizar a separação por CG, as espécies organometálicas devem
ser suficientemente voláteis, caso isso não seja possível, ocorre um processo de
derivatização da amostra, deixando o analito mais volátil. Esse processo pode causar a
decomposição da espécie, perdendo assim a espécie original
55
. Outra desvantagem dessa
técnica em relação à análise da ligação metal-proteína é o perigo de ocorrer o bloqueio,
por água ou outros compostos da matriz, do microcapilar utilizado por essa técnica
48
.
Uma das vantagens da cromatografia líquida (CL) é a extensa flexibilidade dos
mecanismos de separação com o uso de diferentes fases móveis e estacionárias,
podendo assim prevenir alguns erros ou solucioná-los
56
. Diferentes técnicas de CL são
utilizadas para a análise de especiação tais como troca-iônica, fase-reversa e exclusão de
tamanho. A seguir, as vantagens e desvantagens de cada uma frente a esse objetivo.
A cromatografia de troca-iônica apresenta uma eficiente separação e ampla
aplicabilidade, fornecendo soluções para muitos problemas ocorridos em análises de
especiação. O tamanho dos poros da resina da fase estacionária é um parâmetro
importante para o sucesso da resolução. Seu mecanismo de separação ocorre de acordo
com a carga positiva ou negativa apresentada pela molécula. Contudo, muitas vezes os
íons metálicos ligados vagamente são perdidos ou substituídos por outros metais
provenientes do tampão utilizado para a corrida
10
.
Como foi o caso da pesquisa desenvolvida por Alfredo Sanz-Medel e sua equipe,
ao realizar a especiação química do alumínio no soro humano. A resolução apresentada
pela coluna de exclusão de tamanho levou os pesquisadores a procurar técnicas
cromatográficas alternativas, que oferecessem melhor resolução na separação das
30
proteínas do soro. Entretanto, ao utilizarem a cromatografia de troca-iônica, foi
observado o risco de deslocamento do alumínio da proteína, pois os íons metálicos das
fases, móvel ou estacionária, utilizadas podiam competir com o metal de interesse pelo
seu sítio protéico natural
33
.
A principal vantagem da cromatografia de fase-reversa é o amplo espectro dos
possíveis analitos. A separação eficaz produzida por esta técnica fornece alta resolução.
Esse método ainda apresenta resultados rápidos e fáceis de serem alcançados, assim
como ótima reprodutibilidade. Contudo, na prática, os problemas são similares aos da
técnica anterior, a fase estacionária mostra propriedades de troca-iônica e de adsorção,
especialmente em analitos de caráter básico, quando o pH > 4
10
.
Outra desvantagem da fase reversa é seu efeito desnaturante. O uso do HPLC
com uma coluna de fase-reversa pode aumentar o risco de degradação dos compostos de
butilestanho
53, 54
. Solventes orgânicos e ácidos podem facilmente mudar as espécies do
complexo metal-proteína. A estrutura das proteínas pode ser desnaturada, liberando o
elemento complexado, fazendo com que os metais liberados formem complexos com
outros novos ligantes, resultando em reações de transferência de espécies. Portanto,
espécies com ligações covalentes são as mais apropriadas para esta técnica
10
.
Contudo, este método tem sido usado sucessivamente na determinação de di e
tributilestanho em sedimentos e mexilhões
53
. A pesquisa desenvolvida por Hueih-Jen
Yang e seus colaboradores determinou compostos de Sn inorgânico, trimetil, trietil,
tripropil, tributil e trifenilestanho em amostras de sedimentos e água, utilizando um ICP
MS, com nebulização ultra-sônica, acoplado a um cromatógrafo líquido de fase
reversa
57
.
A cromatografia de exclusão molecular (CEM) é o método cromatográfico mais
simples, previsível e requerido entre as outras modalidades cromatográficas, oferecendo
uma série de vantagens em relação aos outros métodos: (1) amostras de peso
desconhecido são caracterizadas por uma curva de calibração; (2) é um método de
separação suave e normalmente não resulta na perda da espécie ou em alterações
durante a corrida cromatográfica; (3) apresenta menor esforço no desenvolvimento de
métodos analíticos; (4) possui insensibilidade a solventes e temperatura
58, 59, 60
.
Esse método também é conhecido como filtração em gel, permeação em gel, ou
cromatografia em peneira molecular de difusão restrita. Isso é devido a sua
característica de determinar a massa molecular e a forma das macromoléculas a serem
eluídas pela coluna
45
. Este método separa as substâncias de acordo com seu tamanho
31
efetivo. Como o tamanho efetivo de uma molécula em solução e seu peso molecular são
parâmetros proporcionais nessas condições, essa modalidade cromatográfica fica
habilitada tanto para a determinação do peso molecular quanto para a distribuição dos
mesmos
58
.
A eficiência desse método cromatográfico de separação protéica é influenciada
pelos parâmentros de pH, temperatura, concentração salina e o fluxo. Todos esses
fatores devem ser otimizados para permanência da espécie nativa
54
. Contudo, devido a
diversidade da preparação dos tampões, pode-se otimizar todas essas variáveis de
acordo com o objetivo a ser alcançado.
Existem dois tipos de fase estacionária, sílica e polímeros, a sílica gel é a mais
utilizada, devido à sua alta eficiência, em razão do menor tamanho das partículas, e pela
sua robustez. A coluna empacotada com sílica gel só permite a entrada de moléculas
pequenas fazendo com que haja uma distribuição homogênea entre o líquido e o gel.
Para moléculas maiores, este acesso é muito mais complicado, induzindo-as a emergir
da coluna mais cedo do que as pequenas moléculas. O caráter da fase estacionária
controla o movimento das proteínas, variando suas velocidades e assim promovendo a
separação
54, 56, 59, 61
.
Uma vez que o tempo de retenção não é baseado em interações químicas, a fase
móvel não desempenha um papel crítico. Porém, é necessário observar alguns fatores
que podem intervir nessa variável, uma vez que a coluna de CEM exibe efeitos
eletrostático e hidrofóbico, em força iônica baixa ou alta, respectivamente. Em ambos
os casos, os componentes da amostra são retidos por interação na superfície da coluna
54,
62
.
O pH exerce um efeito significativo na formação do pico e no tempo de eluição
da amostra, isso se deve ao efeito no equilíbrio das cargas das moléculas, além da
modificação ocorrida no gel da coluna cromatográfica, que deve ser observado no seu
manual antes de injetar qualquer eluente
62
.
Esta técnica tem crescido na aplicação em material biológico. Esse tipo de
separação é ideal para compostos de alto peso molecular como proteínas, polímeros e
peptídeos, além de separar monômeros, dímeros e trímeros agregados, e
imunoglobulinas e anticorpos
61, 62
. Em matrizes complexas como os fluidos biológicos,
alguns elementos traço ocorrem como íons livres e outros como complexos de baixo
peso molecular ou macromolecular, reversíveis ou irreversíveis
1
.
32
Um exemplo do uso da CEM para fluidos biológicos foi a pesquisa realizada por
Bernhard Michalke e sua equipe, na qual analisaram as espécies de manganês (Mn)
presentes no soro humano e no fluido cérebro-espinhal. O grupo utilizou dois tipos de
coluna, de acordo com seus objetivos. No caso do soro, foi utilizada uma coluna com
capacidade de peneiração de 7 – 200 kDa, enquanto que a coluna empregada para o
fluido cérebro-espinhal apresentava malha de menor tamanho, de 100 – 2000 Da. A
concentração de Mn nas frações separadas foram determinadas por ICP MS. A pesquisa
concluiu que a albumina e a transferrina são as proteínas carreadoras predominantes de
Mn no soro, ao passo que o complexo de citrato-Mn foi o mais encontrado no fluido
entre as frações de menor peso molecular
63
.
Entretanto, existem algumas desvantagens nessa técnica, pois para obter uma
separação adequada, os picos devem ser estreitos, para que proporcione pesos
moleculares distintos. Contudo, a coluna de gel filtração apresenta um limite na
capacidade de separação, principalmente quando se trata de uma amostra complexa,
como o caso de uma matriz biológica, ocasionando nas frações eluídas, a presença de
diferentes moléculas com peso molecular similar
60
.
Outra desvantagem é a adsorção das moléculas na fase estacionária, devido a
interações hidrofóbicas ou efeitos eletrostáticos e, até mesmo, ao comprimento da
coluna. A liberação do metal para sua forma original pode ocorrer, especialmente, se o
tampão contém uma baixa concentração salina. Entretanto, concentrações elevadas de
sal podem desnaturar o complexo organometálico. Este efeito pode causar várias
alterações, entre elas, a destruição ou transformação da espécie
60
.
A cromatografia de alto desempenho, ou alta pressão como também é conhecida,
é vantajosa devido a sua velocidade e melhor resolução, quando comparada àquela de
baixa pressão. Porém, tão importante quanto a resolução, é a preservação das espécies
originais, pois algumas fases estacionárias e tampões podem desnaturar a espécie
primitiva, assim como a alta pressão exercida pelo equipamento
10
.
Outra técnica utilizada na separação das proteínas é a eletroforese em gel (EG).
É uma ferramenta amplamente utilizada no meio científico, sendo uma técnica baseada
na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e carga. A
migração de partículas carregadas em um determinado meio acontece sob a influência
de uma diferença de potencial elétrico. As moléculas podem ser separadas através das
suas características de mobilidade frente a campos elétricos, constituindo o fundamento
da eletroforese
64, 65
.
33
Nos dias atuais, a eletroforese de proteínas e polipeptídeos ainda é muito
realizada em meios gelatinosos tais como gel de poliacrilamida (PAGE) e de agarose.
Uma das grandes vantagens do PAGE, quando comparado à agarose, é praticamente não
apresentar problemas de adsorção, devido à diminuta quantidade de grupos carregados
em sua estrutura química. E ainda, nos sistemas a base de poliacrilamida, a porosidade
do gel pode ser ajustada ao diâmetro das partículas protéicas, através de uma
concentração fixa do monômero (acrilamida) e do agente de ligação cruzada
(bisacrilamida)
65
.
O avanço mais promissor na metodologia eletroforética está relacionado à
implantação definitiva da eletroforese capilar na purificação e análise de proteínas,
devido à alta resolução, eficiência, velocidade e uso de pequena quantidade de amostras.
Porém, infelizmente, este sistema é bem mais caro do que aquele desenvolvido em
PAGE
65
.
A eletroforese de proteínas permanece como uma forma fácil e comum de
investigação, possibilitando a detecção de alterações que não poderiam ser vistas através
das técnicas tradicionais. Pode-se também determinar o peso molecular das proteínas, a
partir de um padrão protéico com diferentes pesos moleculares. É um dos métodos mais
utilizados para esse fim, devido sua simplicidade e boa resposta alcançada
64
.
As técnicas como o ICP MS e AAS são métodos capacitados para a
determinação exata de elementos em baixas concentrações, logo após uma separação
cromatográfica
43
. Atualmente, a AAS está sofrendo forte concorrência do ICP MS, que
vem ganhando popularidade devido à sua capacidade multi-elementar, oferecendo a
possibilidade de analisar todos os elementos de interesse simultaneamente, além dos
baixos limites de detecção, em nanograma por litro (ng L
-1
), e a possibilidade de
diluição isotópica “on line”. Entretanto, seu uso tem sido dificultado pelos custos
elevados de instrumentação e de manutenção
48
.
A espectrometria de absorção atômica apresenta diferentes atomizadores tais
como forno de grafite (GFAAS), chama (FAAS), vapor frio (CVAAS) e geração de
hidretos (HGAAS)
1
. O método de AAS com chama foi amplamente usado no passado
para a determinação de Sn inorgânico em alimentos e material biológico. Contudo,
novos atomizadores para a AAS foram sendo desenvolvidos, entre eles, o GF AAS
22, 49
.
A espectrometria de absorção atômica com atomização eletrotérmica (ETAAS)
tem sido bastante usada para análise de diferentes tipos de amostras, devido a sua
sensibilidade e exatidão. Entretanto, para matrizes com alto teor salino, como a água do
34
mar, ou concentrações do metal abaixo do limite de detecção, que necessitem de pré-
concentração, esses fatores podem tornar esta técnica mais difícil de ser utilizada em
análises de rotina
55
. Logo, deve-se observar a composição do tampão, pois, ao usar uma
fase móvel com elevada concentração salina, pode-se aumentar a altura do fundo
66
.
A combinação da HPLC, sendo um método de separação, com a GFAAS,
método de quantificação, aumenta a seletividade e sensitividade do processo de análise,
sendo que sozinhas não são adequadas para a determinação “in situ” das espécies
metálicas. Em teoria, qualquer tipo de atomizador pode ser acoplado a um
cromatógrafo, todavia, na prática, várias condições precisam ser cumpridas, a fim de
obter boa sensibilidade e seletividade analítica para problemas específicos
49, 51, 53
.
As técnicas hifenadas ocorrem quando há uma combinação da separação com a
análise quantitativa, permitindo a determinação simultânea das espécies. Na análise de
especiação, as técnicas de acoplamento direto levam a resultados reprodutivos com
menor risco de contaminação ou perdas do analito em um curto período de tempo.
Geralmente, cromatografia e espectrometria podem ser acopladas “on line”. No entanto,
a preferência por uma técnica de atomização discreta e altamente sensível, como a ET
AAS, e a disponibilidade no laboratório, foram as razões para a escolha desta técnica de
acoplamento “off line”
1
.
Como a análise de especiação de metais traço é relativamente recente e
extremamente complexa, o número de revisões sobre o assunto tem sido crescente.
Alguns pesquisadores utilizam a interface entre HPLC e ICP MS para separar e
quantificar as espécies metálicas existentes em amostras biológicas
67
. Vários estudos
apresentam a determinação das espécies de arsênio em soro, água ou urina, utilizando
técnicas hifenadas de HPLC – HGAAS
68, 69, 70
. Este mesmo acoplamento também
permitiu a análise de especiação de selênio em material biológico
70, 71
. Uma técnica
híbrida entre HPLC e CVAAS foi desenvolvida para a determinação das espécies de
mercúrio e metilmercúrio em uma amostra de água fortificada
72
. Espécies de germânio
inorgânico são determinadas por SEC - HG/GFAAS
73
.
Contudo, algumas desvantagens também são vistas nas técnicas hifenadas. O
controle da qualidade da análise fica comprometido, uma vez que pode ser realizado
com mais facilidade no modo off-line, assim como a otimização da separação e da
detecção, sem interferências e melhor limite de detecção. Todos esses fatores são mais
fáceis de serem manipulados quando não há hifenação das técnicas
60
.
35
A especiação exige um tratamento substancialmente diferente e tem que ser
seletivamente desempenhada para aquela espécie metálica naquela amostra, já que
nenhum método proporciona uma identificação universal e inequívoca de todos os
metais
1
.
36
10- Experimental
Descrição da área de estudo
A área selecionada foi uma indústria de beneficiamento da cassiterita na cidade de
Ariquemes, Rondônia. O setor de interesse foi a produção, onde ocorre o processo de
beneficiamento da cassiterita, que compreende as seguintes etapas: britagem - para a
redução da granulometria; moagem - para a liberação da maior parte dos minerais de
minério disseminados no pegmatito; e mesas vibratórias - concentração mecânica
(método gravimétrico) dos minerais pesados. O produto concentrado não magnético
obtido é composto por cassiterita, microlita, quartzo e feldspato, que então é submetido
a um separador eletrostático para a retirada da cassiterita. Os rejeitos são estocados e a
cassiterita recebe um tratamento metalúrgico na própria indústria, cujo produto final
para a venda é o Sn.
População alvo
O estudo foi realizado com dois grupos populacionais, um constituído por seis
trabalhadores da área de produção, em uma indústria de beneficiamento de minérios,
(área de estudo) e outro grupo, composto por cinco adultos expostos ambientalmente,
apresentando qualidades de vida semelhantes às dos trabalhadores expostos
ocupacionalmente. Ambos concordaram em participar através da assinatura do Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 1).
Critérios de Seleção
• Inclusão:
1. Concordância em participar do estudo por meio da assinatura do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE);
2. Trabalhadores do setor de produção da indústria de beneficiamento da cassiterita.
• Exclusão:
1. Trabalhadores em que não concordaram em participar do estudo;
2. Pacientes que estivessem em situações em que normalmente ocorre uma maior
mobilização como nos estados fisiológicos e patológicos, que promovem a
37
reabsorção óssea tais como distúrbios no equilíbrio ácido-base, infecções,
intervenções cirúrgicas, osteoporose, tirotoxicose, e terapias com certas drogas.
3. Indivíduos que não trabalhassem no setor de produção da indústria.
Coleta e Armazenamento das Amostras
O risco de contaminação das amostras e perdas das espécies originais durante
amostragem, transporte, armazenamento, separação e determinação foram minimizados
seguindo as recomendações já descritas em diversos trabalhos
1, 9, 26, 31, 39
.
Amostras de sangue venoso foram coletadas em tubos a vácuo, 7ml, específicos
para a determinação de metais traço, contendo heparina como anticoagulante e
etiquetados com nome e data. Após a coleta, as amostras foram acondicionadas em
sacos plásticos em posição vertical e transportadas em gelo para o Laboratório de
Toxicologia do Centro de Estudos da Saúde do Trabalhador e Ecologia Humana
(CESTEH), onde foram centrifugadas à 3500 rotação por minuto (rpm) por 15 min. para
a obtenção do plasma, quando então o sobrenadante era retirado e congelado a –20°C
até a análise.
Uma parte deste plasma era destinada para a determinação da concentração total
de Sn nesta matriz, enquanto a outra era utilizada na análise de especiação do metal.
Descontaminação do Material
A descontaminação cuidadosa de todo o material é fundamental para a análise de
traços e, principalmente, para a especiação. Toda a vidraria e utensílios plásticos
utilizados ficam de molho em uma solução de Extran (Merck) a 5% (v/v), por um
período mínimo de 24 horas. Após este tempo, são enxaguados copiosamente em água
corrente e, em seguida, imersos em uma solução de ácido nítrico a 10% (v/v) para a
descontaminação por, pelo menos, 48 horas. Depois de lavado inúmeras vezes com água
deionizada, o material é seco em estufa a 40
o
C, devidamente protegido de contato com
superfícies metálicas e de poeira até seu uso. Todos os reagentes utilizdos são de caráter
analítico.
Instrumental
O equipamento utilizado na determinação de Sn no plasma e nas frações foi um
espectrômetro de absorção atômica AAnalyst 800 equipado com atomizador
eletrotérmico transversal, corretor de fundo Zeeman longitudinal e amostrador
38
automático AS-800, todos Perkin-Elmer. Tubos “end cap” recobertos com grafite
pirolítico (Perkin Elmer) foram usados nesses experimentos. O comprimento de onda da
lâmpada de catodo oco (Perkin-Elmer) de Sn foi de 286,3 nm, enquanto que a corrente e
largura de fenda usadas foram de 55 mA e de 0,7 nm, respectivamente. Todas as leituras
foram realizadas em área de pico (absorvância integrada) e o uso de rampa zero e
interrupção do fluxo de argônio na etapa de atomização, completam a obediência às
condições “Stabilized Temperature Platform Furnace” (STPF).
As condições STPF foram adotadas no forno de grafite para reduzir, ou até mesmo
eliminar, as interferências. Entre elas, está a utilização de um modificador químico,
necessário em matrizes mais complexas, como é o caso de fluidos biológicos.
Uma coluna XK 16/100 (16 mm di X 100 cm, Amersham Pharmacia Biotech)
empacotada com o gel Sepharose CL 4B, faixa de fracionamento: 60 - 200000 kDa, foi
conectada a um sistema cromatográfico de baixa pressão Pharmacia Biotech AB (GE),
modelo GradiFrac
TM
System, coletor de fração GradiFRac, para separação das proteínas
do plasma. O detector utilizado foi o UV-Visible Spectrophotometer, modelo UV-1601,
produzido pela Shimadzu Corporation Analytical Instruments Division, em um
comprimento de onda de 280nm. Algumas frações coletadas no GradiFRac foram
concentradas no Savant SPD 131DDA SpeedVac Concentrator, para posterior uso na
eletroforese.
A eletroforese foi realizada por meio de um sistema Mini-Protean, da Bio-Rad,
ligado à fonte EPS 3501 XL (Amersham Pharmacia Biotech). Os géis obtidos foram
digitalizados no densitômetro, GS-800, Bio-Rad, com o auxílio do programa Quantity
One (Bio-Rad).
Reagentes e Soluções
Todos os reagentes utilizados foram, pelo menos, de grau analítico. A solução
padrão intermediária contendo 1000 g L
-1
de Sn foi preparada a partir da solução
estoque de 1000 g mL
-1
em solução 20% HCl (Perkin Elmer - part n° 9300161). As
soluções analíticas de calibração foram preparadas diariamente em ácido nítrico 0,2%
(v/v), tendo sido a água de diluição previamente purificada pelo sistema Milli-Q
(Millipore).
Na preparação do modificador químico, foi utilizada uma solução de nitrato de
paládio 10 g L
-1
e de nitrato de magnésio 10 g L
-1
diluídos em ácido nítrico 0,2% (v/v).
39
Uma mistura com volumes apropriados dessas soluções foi preparada de modo que uma
alíquota de 10 microlitros (L) do modificador contivesse 10 g de paládio elementar e
5 g de nitrato de magnésio.
Uma solução de 50mM Tris – HCl e 30mM NaHCO
3
foi utilizada como fase móvel,
com seu pH ajustado em 7,4. Contudo, inicialmente foram testados soluções de tampão
50mM Tris – HCl + 0,15mM NaCl; 0,02M NaH
2
PO
4
+ 0,30M NaCl; 50mM Tris – HCl
+ 30mM NaCl. Todos os reagentes até aqui mencionados são da marca Merck.
Para calibração da coluna na cromatografia de baixa pressão foi utilizada a Azida
0,05% (m/v), para a determinação do volume de inclusão total, e o Blue Dextran 1%
(m/v) para a determinação do volume de exclusão total.
Na eletroforese, para o preparo dos géis, as concentrações da acrilamida (Aldrich)
utilizada nos géis fracionador de 15 e 12% e concentrador de 5%. O gel fracionador
continha Tris-HCl 370 mmol L
-1
(pH=8,8), dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,1% (m/v),
persulfato de amônio (APS) 0,05% (m/v) e tetrametiletilenodiamina (TEMED)
0,00033% (v/v). Uma solução com Tris-HCl 125 mmol L
-1
(pH=6,8), SDS 0,1% (m/v),
APS 0,13% (m/v) e TEMED 0,001% (v/v) fez parte da preparação do gel concentrador.
Água deionizada foi utilizada na preparação dos géis.
No preparo da amostra para SDS-PAGE (do inglês, sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis), foi utilizado um tampão de aplicação de amostra
contendo Tris-HCl 10 mmol L
-1
(pH=6,8), β-mercaptoetanol 5% (v/v), SDS 0,1%
(m/v), glicerol 20% (v/v) e azul de bromofenol 0,00005% (m/v). Além deste, outro
tampão contendo os mesmo reagentes, exceto o agente redutor β-mercaptoetanol,
também foi aplicado, conforme a necessidade.
O Tris-HCl, glicerol, β-mercaptoetanol, APS, TEMED foram de procedência
Merck, enquanto que o SDS, azul de bromo fenol, ácido acético, metanol e Comassie
Blue R-250 foram fabricados pela Sigma. Para a revelação por nitrato de prata
(AgNO
3
), foram necessários etanol 95% (v/v), ácido acético, acetato de sódio,
glutaraldeído 25% (v/v), Na
2
S
2
O
3
.5H
2
O, formaldeído 35% (v/v), carbonato de sódio,
AgNO
3
, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e timerosol. Água deionizada foi
utilizada no preparo das soluções.
Dois conjuntos de proteínas serviram para a calibração na eletroforese, um de baixo
massa molecular (MM) (Amersham PharmaciaBiotech), em que fosforilase B (MM =
92 kDa), albumina (BSA) (MM = 66 kDa), ovalbumina (OVA) (MM = 45 kDa),
40
anidrase carbônica (MM = 30 kDa), inibidor tripsina (MM = 21 kDa), α lactalbumina
(MM = 14,4 kDa) e aprotinina (MM = 6,5 kDa) fazem parte deste grupo. E o outro
conjunto de proteínas, com uma variedade de massa molecular, (Broad Range, BioRad)
inclui miosina (MM = 200 kDa), ß-galactose (MM = 116,3 kDa), BSA (MM = 66 kDa),
OVA (MM = 45 kDa), anidrase carbônica (MM = 30 kDa), inibidor tripsina (MM = 21
kDa), lisozima (MM = 14,4 kDa) e aprotinina (MM = 6,5 kDa).
Preparação das Amostras
Para a injeção na coluna cromatográfca de baixa pressão, foram preparadas duas
alíquotas de um mesmo plasma, pertencente a indivíduo não exposto, sendo que uma
delas foi enriquecida com 250 ng mL
-1
de SnCl
2
. O plasma foi diluído 1+1 em 50 mM
Tris-HCl + 30mM NaHCO
3
, resultando em uma massa de 250 ng de Sn e uma
concentração final de 125 ng mL
-1
. Após filtração (filtro de celulose regenerada, 0,45
µm de poro), essa solução de plasma diluído duas vezes era injetada em um loop de
2mL para a separação das proteínas por exclusão de tamanho através da cromatografia
de baixa pressão. O tampão passou por filtração à vácuo (filtro de acetato de celulose,
poro de 0,2 µm e 47 mm de diâmetro) e degaseificação com hélio por 15 min antes do
uso.
Volume de 1000 L de cada fração coletada foi utilizado sem diluição para a
determinação do Sn por ET AAS. Diariamente, uma curva de calibração era preparada
nas concentrações de 2,5; 5,0; 10,0; 25,0 g Sn L
-1
a partir do padrão de 1 g mL no
próprio tampão (sem ser passado na coluna).
A concentração total de Sn no plasma de cada trabalhador foi determinada por ET
AAS. A diluição do plasma foi de 1+4 em Triton X-100 0,1% (v/v). Com o plasma de
um indivíduo não exposto preparou-se uma curva de calibração, seguindo as mesmas
concentrações anteriores. A exatidão dos resultados foi verificada através da análise dos
materiais de referência Contox Trace Metal Serum Control (Kaulson Laboratories,
USA), Level I, lot. TM 144 1097: 3,0 ± 2,0 µg L
-1
. A diluição do soro seguiu a mesma
das amostras.
Para o plasma da amostra 1, somente as frações que apresentaram Sn após leitura
por ET AAS foram selecionadas para eletroforese. Aos 10 µL da fração concentrada no
SpeedVac foram adicionados 10 µL do tampão de aplicação (contendo e não contendo
41
β-mercaptoetanol) e levados à ebulição por 5 min. Os valores de tensão e trabalho
oscilavam de acordo com a necessidade do equipamento, já a corrente era fixa em
25mA, para uma placa de gel, e 50mA para duas placas. As corridas levavam em média
1h.
A solução reveladora Comassie Blue R250 era usada com elevados teores de
proteínas, uma vez que seu limite de detecção é de 0,1-10 mg / banda, enquanto que a
revelação por AgNO
3
apresenta uma sensibilidade ideal para baixas concentrações, com
um limite de detecção da ordem de 1-10 ng proteína / banda.
Na revelação por AgNO
3
, o gel ficou 1 hora em solução contendo 50% de metanol
(v/v) e 10% de ácido acético (v/v) para fixação. A seguir, procedeu-se à incubação por 2
horas em solução descorante (ácido acético a 7% e metanol a 5% (v/v)). Após esta
etapa, o gel foi lavado abundantemente em água deionizada por 1 hora (a cada 20
minutos a água era trocada) e, em seguida, incubado com solução de por AgNO
3
a 0,1%
(m/v) por 30 minutos. Para a revelação, o gel foi lavado rapidamente em água
deionizada e colocado em solução contendo formaldeído a 0,0185% (v/v) e carbonato
de sódio a 3% (m/v) até o aparecimento das proteínas. A reação foi inativada pela
adição de 115mM de citrato de sódio.
Já para a coloração com Comassie Blue, foram necessárias apenas três etapas, uma
de fixação (45% de metanol e 10% ácido acético (v/v)), deixando agir por 5 minutos sob
agitação. Em seguida, adicionou-se a solução corante (0,1% de Comassie Blue G-250,
25% de Metanol, 5% de Ácido Acético (v/v)), sob agitação por 30 minutos. Depois,
adicionou-se a solução descorante, que foi a mesma utilizada na fixação, para lavagem
do gel até o desaparecimento de toda a coloração azulada e revelação das bandas.
42
11- Resultados e Discussão
A fim de compreender os mecanismos e processos pelo qual os elementos traços
são absorvidos, transportados e incorporados nas proteínas, é importante monitorar
esses elementos, devido às suas diversas interações. O desenvolvimento de um método
analítico para a separação de proteínas e a determinação dos metais nas frações geradas
necessita de vários pré-requisitos a serem cumpridos, como a contaminação que deve
ser evitada, o sistema de separação deve ser otimizado, interferências durante a detecção
espectroscópica tem de ser eliminada e a sensibilidade para os metais de interesse deve
ser otimizada na matriz
51
.
11.1- Determinação do Estanho no Plasma Total
O objetivo deste capítulo foi o desenvolvimento de uma metodologia para a
determinação direta de Sn no plasma humano por ET AAS, com um pré-tratamento
mínimo da amostra, sempre visando a redução de possíveis contaminações.
Os valores de absorvância integrada (área de pico), contidos nas tabelas e figuras
deste trabalho, representam a média de duas leituras, já descontadas do branco, salvo no
caso de disparidade entre as mesmas, quando era realizada, pelo menos, mais uma
medição.
11.1.1- Programa de temperatura
A análise consiste na medida do elemento de interesse em um volume conhecido
de amostra dentro do forno. Essa alíquota é submetida a um programa de temperatura, e
a absorvância é medida durante a etapa de atomização
67
. Fazem parte de um programa
de temperatura a secagem, utilizada para a remoção do solvente, pirólise, necessária
para a destruição da matriz, atomização, quando o analito passa para o estado
fundamental, limpeza e resfriamento do forno
74
.
Amostra e modificador são dispensados sucessivamente, antes da inicialização do
programa de temperatura. Contudo, foi observada a presença da formação de resíduos
carbônicos no interior do tubo, mesmo secando toda a amostra de acordo com o
programa de temperatura. Com isso, era necessária a limpeza constante do forno. Na
43
tabela 1, o programa de temperatura utilizado com êxito para a determinação de Sn em
plasma.
Tabela 1: Programa de temperatura utilizado na determinação de Sn no plasma.
* Introdução Modificador 10 L + amostra 20 L ** Leitura
11.1.2- Curvas de Pirólise e de Atomização
As curvas de pirólise e de atomização têm, por objetivo estabelecer as
temperaturas ótimas de pirólise, onde ocorre decomposição da matriz sem perda do
analito, e também sua temperatura ótima de atomização, onde o melhor compromisso
entre sensibilidade, tempo de vida do forno e tempo de atomização deve ser buscado.
Na figura 1, encontram-se as curvas de pirólise e atomização para 1000 pg de Sn
em solução aquosa (curva efetuada com Triton X 100 0,1% (v/v)) e o plasma de um
indivíduo não exposto enriquecido com 1000 pg de Sn e diluído 1+4 em Triton X-100
0,1% (v/v). Neste estudo, a temperatura de atomização foi fixada em 2200°C, enquanto
a de pirólise era variada de 700 a 1700°C, com intervalos de 100°C, exceto nos valores
de 700°C a 1100°C que variou com intervalos de 200°C. A temperatura ótima de
pirólise encontrada foi de 1400°C, tanto na solução aquosa quanto na matriz. A seguir,
procedeu-se uma variação da temperatura de atomização entre 1900 e 2300°C, com
gradiente de temperatura de 100°C, com 1400°C fixada aleatoriamente como
temperatura de pirólise. Neste caso, a temperatura ótima de atomização ficou em
2200°C. A esta temperatura, o pulso de absorção do Sn resolveu-se num tempo de 5
segundos.
Etapa
Temperatura
(°C)
Rampa
(s)
“Hold”
(s)
Fluxo Argônio
(mL min
-1
)
1*
110 1 10 250
2 130 20 20 250
3 400 30 10 250
4 1400 10 10 250
5** 2200 0 5 0
6
2450 5 3 250
44
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0 500 1000 1500 2000 2500
Temperatura (°C)
Absorvância
Figura 1: Curvas de pirólise (quadrado) e de atomização (círculo) para 1000 pg Sn em solução aquosa
(símbolo azul) e plasma enriquecido com 1000 pg Sn (símbolo rosa).
11.1.3- Diluição
A figura 2 apresenta o comportamento do sinal corrigido para o plasma
enriquecido com 1 ng de Sn. A partir desse plasma adicionado, foram estudados
diferentes diluentes e proporções de diluição, além de observar a atenuação de fundo em
altura de pico. Vale ressaltar que este padrão de Sn foi preparado com Triton X-100
0,1% (v/v), uma vez que o plasma se tornava turvo após a adição do padrão preparado
em ácido.
O ácido nítrico age também como modificador químico. No entanto, quando em
contato com plasma, desnatura as proteínas, fazendo com que precipitem. O seu uso
como solvente para o plasma tornou turva a solução, além ser difícil a dispensa do
material pela ponteira, desperdiçando assim a amostra e, conseqüentemente, perdendo o
analito. Já para a diluição em água, foi observado que a sensibilidade alcançada era a
menor entre os três diluentes testados.
Normalmente, o Triton é usado como diluente do sangue e seus derivados, por
diminuir a tensão superficial e facilitar assim a pipetagem. Assim, a diluição do plasma
em Triton X-100 0,1% (v/v) se mostrou a melhor alternativa entre as pesquisadas. O
45
sinal de Sn foi o maior, enquanto que o da atenuação de fundo se manteve
adequadamente dentro da capacidade de correção do efeito Zeeman.
As proporções de diluição do plasma testadas foram 1+1, 1+2, 1+3, 1+4, 1+5,
1+6, 1+7, 1+8, 1+9. A figura 2 mostra o comportamento do sinal normalizado de uma
amostra de plasma enriquecido com 1 ng de Sn.
Figura 2: Influência do fator de diluição. Em azul, plasma diluído em Triton X-100 0,1% (v/v);
Em de
vermelho, HNO
3
0,2% (v/v) e em verde, água. T
P
= 1400°C e T
A
= 2200°C, Vol amostra = 20µL;
modificador: 10 µg Pd + 5 µg Mg(NO
3
)
2
em 10µL;
A leitura do plasma sem diluição não foi tentada devido às enormes dificuldades
de pipetagem, uma vez que esta matriz é muito densa e facilmente causa a obstrução do
capilar do amostrador. A diluição 1+1 apresenta o menor sinal corrigido devido à
complexidade da matriz que, nesta pequena diluição, dificulta a liberação do analito.
O pequeno acréscimo no sinal do analito nas diluições 1+2 e 1+3 sugere a
existência de considerável efeito de matriz, além da maior produção de resíduos
carbônicos encontrada no interior do tudo nessas baixas diluições.
A diluição 1+4 foi a escolhida, pois, a partir desta proporção, a sensibilidade se
manteve constante, sem diferenças estatisticamente significativas, de acordo com o teste
t
de Student (95% de confiança). O uso de diluições maiores pode aumentar a
propagação do erro e piorar o limite de detecção.
46
11.1.4- Massa do Modificador
Massas diferentes de nitrato de paládio juntamente com nitrato de magnésio em
10
µ
L de solução foram usadas para estudar o efeito da concentração do modificador
químico sobre a sensibilidade. A massa de modificador mais adequada foi avaliada
através das massas características alcançadas pelas curvas analíticas, geradas com o uso
de diferentes massas de modificador.
Neste estudo, três massas (em µg) para a mistura de Pd + Mg foram
investigadas, 30 + 20, 15 + 10 e 10 + 5. Os volumes injetados no tubo de grafite foram
sempre os mesmos, 20 µL da amostra e uma alíquota de 10 µL de modificador contendo
a massa estudada. Foram utilizadas apenas três soluções para a calibração nas
concentrações iguais a 10, 25 e 50 µg L
-1
, uma vez que se desejava tão somente um
estudo comparativo de sensibilidades. Este estudo foi realizado em meio aquoso e na
presença da matriz, neste caso diluída 1+4 com Triton X-100 0,1% (v/v). A tabela 2
mostra os valores encontrados da massa característica de cada massa de modificador
estudada, nas curvas aquosa e no plasma.
Tabela 2: Avaliação das massas características, nas curvas aquosa e no plasma, utilizando-se diferentes
massas de modificador.
Massa do Modificador
Pd/Mg (µg)
Massa Característica
HNO
3
0,2% (pg)
Massa Característica do
plasma (pg)
10 + 5 50,9 52,4
15 + 10 51,5 50,3
30 + 20 49,7 49,7
Volume de injeção da amostra = 20µL; modificador: Pd e Mg(NO
3
)
2
= 10µL; T
P
= 1400ºC; T
A
= 2200ºC. Diluição: 1+4; diluente,
triton 0,1 % (v/v).
O desvio padrão da massa característica (m
0
) para a curva aquosa foi de 3%
entre as três massas analisadas e o desvio padrão da m
0
para a curva na matriz foi de
5%, não apresentando em ambos, uma diferença estatisticamente significativa, de
acordo com o teste
t
de Student (95% de confiança). Com isso, segundo os dados
obtidos, não seria necessário usar uma massa de modificador três vezes maior para obter
uma sensibilidade semelhante. Conclui-se que, a massa 10 + 5 g de paládio e
47
magnésio, respectivamente, seria a melhor escolha, já que se trata de uma solução de
alto custo.
11.1.5- Linearidade
Linearidade é a capacidade de um método analítico em produzir resultados
diretamente proporcionais à concentração do analito em amostras, em uma dada faixa
de concentração
71
.
As curvas analíticas, aquosa e no plasma, foram analisadas em três dias
consecutivos. Todas as condições já estabelecidas anteriormente foram mantidas, como
mostra a figura 3.
Figura 3: Curvas de adição de analito em amostra de plasma, na faixa de 10 a 300 g.L
-1
; Curva aquosa
( ), Plasma ( ). Vol. de injeção = 20µL; modificador: 10 g Pd + 5 g Mg(NO3)2 em 10µL; T
P
=
1400ºC; T
A
= 2200ºC. Amostras diluídas 1+4 com diluente, Triton X-100 0,1 % (v/v).
A curva aquosa se mostrou linear até o ponto de 300 g L
-1
, enquanto que a curva
no plasma permaneceu linear até a concentração de 200 g L
-1
. Isso, devido uma
diferença de 19% entre os pontos de 200 e 300 g.L
-1
. Comparando com o desvio de
linearidade entre 100 e 200 g L
-1
de apenas 1%, a curvatura para as concentrações
inferiores, não foi estatisticamente significativa, de acordo com o teste
t
de Student
(95% de confiança). Da mesma forma, a curva aquosa apresentou um desvio padrão de
3% na faixa de concentração entre 200 e 300 g L
-1
.
48
11.1.6 - Massa Característica e Razão de Sensibilidade
A sensibilidade foi avaliada pela massa característica (m
0
)
relativa às curvas de
adição de analito (iSn) em cinco diferentes amostras de plasma, como mostra a tabela 3,
assim como, seus respectivos coeficientes de correlação. A interferência de matriz foi
avaliada pela razão de sensibilidades (m
0
aq / m
0
m), em que m
0
aq é a massa
característica obtida pela curva aquosa, enquanto m
0
m foi alcançada com a matriz. O
efeito da matriz não existe se essa razão se aproxima da unidade. A melhor
sensibilidade é obtida com uma menor m
0
.
Tabela 3: Razão de sensibilidade para as curvas aquosa e no plasma com adição de analito.
Amostras de Plasma
Razão de
Sensibilidades
(m
0
aq/m
0
m)
Massa
Característica
(pg)
Coeficiente de
correlação
(r
2
)
HNO
3
0,2 % (v/v) - 57,89 0,9999
Plasma 1 0,97 59,46 0,9998
Plasma 2 1,03 56,41 0,9999
Plasma 3 1,04 55,70 0,9999
Plasma 4 0,91 63,77 0,9997
Plasma 5 0,93 62,41 0,9999
Vol. de injeção da amostra = 20µL; modificador: 10 µg Pd + 5 µg Mg(NO
3
)
2
em 10µL; T
P
=1400ºC; T
A
=2200ºC. Diluição: 1+4;
diluente, Triton X-100 0,1 % (v/v).
Apesar de o plasma ser considerado uma matriz complexa, foi observada uma
notável semelhança entre as sensibilidades das curvas na matriz e no meio aquoso, uma
vez que as razões se aproximaram de 1,0, de acordo com o teste
t
de Student (95% de
confiança). Assim, não há interferência dos concomitantes e a calibração externa com
soluções aquosas é possível.
11.1.7- Limite de Detecção e Quantificação
Segundo o INMETRO
75
, o limite de detecção do método é “a concentração
mínima de uma substância medida e declarada com 95% ou 99% de confiança de que a
concentração do analito é maior do que zero”. Na prática, é a menor concentração que
49
pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada. Pode ser calculado de acordo
com a expressão:
LOD=3.s.b
-1
Onde
s
é o desvio padrão estimado para 10 medidas do branco, ou amostra isenta
do analito e b é inclinação da curva de calibração.
O limite de detecção (LD) para a determinação de Sn em plasma foi obtido a
partir da leitura de dez soluções de uma mesma amostra sem sinal detectável do metal,
diluídas cinco vezes, conforme já descrito anteriormente. O valor encontrado foi de 1,44
± 0,17 g Sn L
-1
na amostra original (já considerando o fator de diluição), mostrando
que o método proposto pode ser confortavelmente usado para análise de amostras de
populações expostas a este analito.
O limite de quantificação (LQ) é definido pelo INMETRO
75
como “a menor
concentração do analito que pode ser determinada com precisão e veracidade”. Na
prática, corresponde à concentração mínima possível de ser quantificada pelo método. É
calculado através da expressão:
LOQ=10.s.b
-1
Assim, o limite de quantificação obtido como resultado de 10 determinações de
uma amostra com baixa concentração do analito foi de 4,79 ± 0,65 µg Sn L
-1
a amostra
original. As mesmas considerações feitas para o LOD são aqui também válidas.
11.1.8- Exatidão
A exatidão do método foi verificada pela análise da amostra de referência
Contox Trace Metal Serum Control (Kaulson Laboratories, USA), Level I, lot. TM 144
1097, cuja concentração é 3,0
±
2,0
µ
g.L
-1
.
Realizaram-se quatro replicatas da amostra de referência em dias diferentes,
gerando uma concentração média de 4,4 ± 0,2
µ
g L
-1
, apresentando um resultado dentro
do desvio padrão da amostra certificada. Apesar do resultado se encontrar dentro da
faixa de referência, foi observado que, embora todos os cuidados tenham sido tomados,
houve algum tipo de contaminação, uma vez que todas concentrações obtidas se
encontravam acima da média.
50
11.1.9- Análise de Plasmas de Trabalhadores Expostos
Foram analisadas amostras de plasma de trabalhadores que operam no
beneficiamento do mineral de cassiterita, sendo expostos ocupacionalmente ao Sn.
Esses resultados, conforme já esperado, estavam acima da faixa encontrada para
populações não expostas ocupacionalmente. A legislação brasileira de Normas
Regulamentadoras de Segurança e Saúde no Trabalho (NR-7) não estabelece limites,
valor de referência (VR) e índice biológico máximo permitido (IBMP) para Sn. Assim,
os resultados encontrados na população ocupacionalmente exposta foram comparados
com os teores de Sn de uma população exposta ambientalmente, por se tratar indivíduos
da mesma região, mesmos hábitos e nível sócio-econômico. Na tabela 4, são
apresentadas as concentrações de Sn encontradas no plasma de ambas as populações.
Tabela 4: Concentração de Sn encontrada no plasma de trabalhadores expostos ocupacionalmente e
ambientalmente.
Amostra
Populações Expostas (µg L
-
1
)
Ocupacionalmente Ambientalmente
01 3,90
≤ 1,44
02 3,59
≤ 1,44
03 3,28
≤ 1,44
04 3,59
≤ 1,44
05 2,98
≤ 1,44
06 3,77
≤ 1,44
Resultados correspondem a uma única preparação, T
P
= 1400°C, T
A
= 2200°C, 20 µL plasma diluído 1+5 em Triton X-100 0,1%
(v/v) e 10 µL 10 g Pd + 5 g Mg(NO
3
)
2.
Apesar de esses resultados corresponderem a uma única preparação, já é possível
observar as diferenças existentes entre as concentrações de Sn no plasma das duas
populações. Pode-se observar que a média das concentrações da população exposta
ocupacionalmente é 4,3 vezes maior do que aquela encontrada para a população
ambientalmente exposta.
Os indivíduos expostos ambientalmente são moradores de uma vila localizada na
área de mineração da cassiterita, também na cidade de Ariquemes, RO. Portanto,
51
expostos a níveis mais baixos de Sn no ar do que aqueles encontrados em um ambiente
de trabalho (“indoor”). Assim, os trabalhadores do setor de produção, da indústria de
beneficiamento da cassiterita, apresentaram concentrações de Sn no plasma
significativamente mais elevadas do que aquelas encontradas em pessoas também
expostas, mostrando a existência de contaminação ocupacional.
11.2. Separação e Identificação das Frações Plasmáticas que contém Sn
A especiação é realizada utilizando diferentes procedimentos analíticos. Essas
técnicas consistiram de uma unidade de separação, como a cromatografia líquida, com
uma coluna de gel filtração, e para a determinação do metal, a espectrometria de
absorção atômica. Para a determinação da faixa fracionária das proteínas foi necessária
outra técnica de separação, a eletroforese em gel.
11.2.1- Estudo da fase móvel e do método cromatográfico
Métodos efetivos de separação são necessários, uma vez que as frações do plasma
contêm uma grande variedade de substâncias, que vão desde proteínas de elevada massa
molecular até pequenos íons metálicos. A separação das proteínas de acordo com o
tamanho é conveniente, visto que este é, aproximadamente, diretamente proporcional ao
raio molecular das partículas
51
.
A técnica da cromatografia de exclusão molecular permite a preservação da forma
nativa das proteínas nos sistemas de separação. Como já citado anteriormente, no caso
da análise de especiação é fundamental preservar a ligação original entre o metal e o
ligante. A combinação com outras técnicas permite uma separação mais efetiva, porém
deve-se ter sempre o cuidado para não usar procedimentos mais agressivos que possam
vir a quebrar a ligação original
50
.
A separação das proteínas plasmáticas pela cromatografia por exclusão de
tamanho foi otimizada, com vistas a uma maior eficiência, que é influenciada
principalmente pelo pH, força iônica da fase móvel e fluxo. Assim, um estudo dessas
variáveis foi desenvolvido.
Concomitantemente, foram desenvolvidos estudos em um cromatógrafo líquido de
alta pressão, HPLC, porém, os resultados não foram satisfatórios, isso porque, devido ao
pequeno volume de plasma injetado, cerca de 100 L, foi observado que a concentração
do Sn presente nas frações geradas poderia permanecer abaixo do limite de detecção.
Portanto, essa técnica foi inviabilizada.
52
Por conseqüência disso, para a separação do plasma usou-se um cromatógrafo
líquido de baixa pressão, com uma coluna de gel filtração, em escala preparativa. O uso
dessa escala preparativa foi importante para obtermos frações do plasma em escala
suficiente para as análises subseqüentes por AAS.
Uma coluna XK 16/100, de exclusão molecular, empacotada com o gel Sepharose
CL 4B, com uma faixa de fracionamento de 60 - 200000 kDa foi utilizada. Com o fluxo
fixado em 0,7 mL min
-1
; foram injetados 2 mL de plasma diluído 1+1 em tampão.
Entretanto, diferentes fases móveis foram testadas, a fim de encontrar o melhor perfil
cromatográfico: 50mM Tris – HCl + 0,15mM NaCl; 50mM Tris – HCl + 30mM NaCl;
0,02M NaH
2
PO
4
+ 0,30M NaCl; 50mM Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
. Todas as fases
móveis avaliadas apresentaram um nítido perfil cromatográfico, entretanto, a razão da
escolha do tampão 50mM Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
foi por não apresentar
interferências na relação sinal/ruído na determinação por AAS, como será visto mais
adiante. O volume coletado foi de 2 mL em tubos falcon.
De acordo com o manual do fabricante do gel, 0,7 mL min
-1
era o fluxo máximo
permitido para não haver deformação dos poros, uma vez que um fluxo menor
aumentaria o tempo de corrida e os picos seriam mais largos, tornando ambos
desfavoráveis. Como o loop usado era de 2 mL, esse foi o volume injetado, enquanto
que o plasma foi diluído duas vezes para evitar uma futura saturação dos poros da
coluna. Por se tratar de uma coluna com uma faixa de fracionamento de médio a alto
peso molecular, optou-se por coletar um volume de 2 mL, pois as frações certamente
apresentariam as mesmas proteínas com um volume menor.
Para a determinação dos volumes de exclusão e inclusão total da coluna foi
usado Blue Dextran 1% (m/v) e azida 0,05% (m/v), respectivamente. A figura 4 mostra
a exclusão e inclusão totais, representadas por uma solução de Blue Dextran e a azida,
onde o primeiro pico representa a exclusão e o segundo, a inclusão total,
respectivamente.
53
0
0,5
1
1,5
2
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Frações (2mL tubo
-1
)
Absorvância em 220 nm
Figura 4: Curva de calibração usando Blue Dextran 1% e Azida 0,05%. Primeiro pico, a partir da fração
30, representa o blue dextran e o segundo pico, a partir da fração 81, a azida. Condições do equipamento:
Cromatografia Líquida de Baixa Pressão, fluxo 0,7 mL min
-1
,
λ = 220 nm, vol. injetado 2 mL, vol.
coletado 2 mL, pH 7,4, tampão 50mM Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
.
Uma amostra de plasma de um indivíduo não exposto foi injetada de acordo com
as condições anteriores. Contudo, na figura 5, pode-se observar uma saturação do
detector do espectrofotômetro ao ser lido em um λ = 220 nm. Esse comprimento de
onda absorve ligações peptídicas e de alguns aminoácidos, como metionina, cisteína e
histidina, além de grupamentos sulfidrilas livres
76
.
54
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
1 11 21 31 41 51 61 71
Fração (2mL tubo
-1
)
Absorvância em 220 nm
Figura 5: Cromatograma do plasma, em um λ = 220 nm. Plasma de indivíduo não exposto. Condições do
equipamento: Cromatografia Líquida de Baixa Pressão, fluxo 0,7 mL min
-1
,
vol. injetado 2 mL, vol.
coletado 2 mL, pH 7,4, tampão 50mM Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
.
Deste modo, as frações foram absorvidas em um λ = 280 nm, pois neste
comprimento de onda apenas traduz as bandas relativas aos cromóforos das cadeias
laterais
76
. Essas são as ligações que mais se predominam nas proteínas presentes no
plasma. Assim, o perfil cromatográfico se apresentou de forma mais nítida. A maior
parte das proteínas presentes no plasma formou um único pico, ente as frações 50 a 80.
Um pico, menor, na inclusão e exclusão total também foi observado.
A figura 6 mostra uma amostra de plasma sem adição do metal. A figura 7
representa um plasma com adição de 0,25 g mL
-1
de SnCl
2
. O padrão de Sn foi
preparado com Triton X-100 0,1% (v/v). Para certificar, foram testados três diferentes
plasmas nas mesmas condições que apresentaram o perfil cromatográfico.
55
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Frações (2mL tubo
-1
)
Absorvância em 280 nm
Figura 6: Cromatograma do plasma sem adição de SnCl
2
, em um λ = 280 nm. Plasma de indivíduo não
exposto. Fluxo 0,7 ml min
-1
,
vol. injetado 2 mL (1mL plasma + 1mL tampão), vol. coletado 2 mL, pH 7,4,
tampão 50mM Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Frações (2mL tubo
-1
)
Absorvância em 280 nm
Figura 7: Cromatograma do plasma enriquecido com SnCl
2
, em um λ = 280 nm. Plasma de indivíduo não
exposto adicionado de 0,25 g mL
-1
de cloreto de estanho. Fluxo 0,7 mL min
-1
,
vol. injetado 2 mL (1 mL
plasma + 1 mL tampão), vol. coletado 2 mL, pH 7,4, tampão 50mM Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
.
Como se pode observar pelas figuras acima, o perfil cromatográfico é
semelhante para ambas as amostras injetadas. Todavia, a absorbância do plasma sem
adição do analito está entre 2,5 - 3,0, enquanto que o sinal do plasma enriquecido está
56
entre 2,0 - 2,5. Essa pequena diferença não é significativa para a definição da proteína
bem como para a determinação da concentração do metal em cada fração.
A cromatografia de gel filtração realiza uma separação mecânica das proteínas,
evitando sua desnaturação, porém apresenta picos largos região onde se encontram as
principais proteínas presentes no plasma, como a albumina, transferrina e o complexo
de imunoglobulinas. Com isso, normalmente esta técnica é usada para pré-análise, e
posteriormente, outros métodos com melhor resolução são realizados, permitindo assim,
uma identificação apropriada dessas proteínas
32
.
Após a separação do plasma, um novo estudo foi realizado para otimizar as
condições com o tampão, 50mM Tris - HCl + 30mM NaHCO
3
, em AAS, para
determinar as concentrações de Sn em cada fração coletada.
11.3 – Frações Plasmáticas
11.3.1- Programa de temperatura
Amostra e modificador são dispensados sucessivamente, antes da inicialização do
programa de temperatura. Após a etapa de secagem, foi observada a expansão da
amostra devido ao aquecimento rápido do forno, levando a perda do analito antes da
pirólise, uma vez que ocorre a dispersão da solução por todo o tubo ao estourar a bolha.
Para evitar o viés nos resultados, inserimos uma temperatura pré-pirólise. Na tabela 5
abaixo, o programa de temperatura utilizado com êxito para a determinação de Sn em
frações geradas pelo cromatógrafo.
Tabela 5: Programa de temperatura utilizado na determinação de Sn nas frações.
* Introdução Modificador 10 L + amostra 20 L ** Leitura
Etapa
Temperatura
(°C)
Rampa
(s)
“Hold”
(s)
Fluxo Argônio
(mL min
-1
)
1*
110 1 10 250
2 130 20 20 250
3 400 30 10 250
4 1400 10 10 250
5** 2100 0 5 0
6
2450 5 3 250
57
Uma revisão da literatura mostrou que o Tris-HCl é um dos tampões mais
utilizados pela maioria dos pesquisadores na cromatografia líquida para separação de
proteínas. No entanto, a presença de íons cloreto faz com que a atenuação de fundo no
forno de grafite seja muito elevada
77, 78
. Assim, a melhor opção para diminuir íons de
cloro no tubo de grafite foi substituir o NaCl, estudado anteriormente, por NaHCO
3
.
Com isso, a relação sinal/ruído não se mostrou ruim, pois sem diluição apresentou um
fundo igual a 0,114 ± 0,006. Além de encontrar dentro da capacidade de correção do
efeito Zeeman, as leituras do sinal corrigido para Sn.
11.3.2- Curvas de pirólise e atomização
O levantamento das curvas de pirólise e de atomização para o tampão enriquecido
com 500 pg de Sn (figura 8) apontou para uma temperatura ótima de pirólise igual
1400°C, enquanto que a temperatura ideal de atomização ficou em 2100°C. No teste
com todas as temperaturas, o pico fecha entre 3 e 4 segundos, exceto na temperatura de
atomização 1900°C e a de pirólise em 1400°C o pico fecha em 5 segundos.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0 500 1000 1500 2000 2500
Temperatura (°C)
Absorvância
Figura 8: Curvas de pirólise (quadrado) e de atomização (losango) para 500 pg Sn em solução aquosa
(símbolo azul) e tampão 50mM Tris-HCl + 30mM NaHCO
3
enriquecido com 500 pg Sn (símbolo rosa).
Apresentando uma temp. ótima de pirólise em 1400°C e temp. ótima de atomização em 2100°C.
58
11.3.3- Diluição
A diluição das amostras não se mostrou interessante, uma vez que algumas
concentrações se encontram próximas ao limite de detecção, visto que, as frações já se
encontram diluídas ao passarem pela coluna. Além de apresentar um sinal de fundo em
altura igual a 0,1141 ± 0,0063, sem interferência no sinal/ruído, como foi citado
anteriormente.
11.3.4- Massa do modificador
Massas diferentes de nitrato de paládio juntamente com nitrato de magnésio em
10
µ
L de solução foram avaliadas através das sensibilidades alcançadas pelas curvas
analíticas, geradas pelas diferentes massas de modificador investigadas.
Neste estudo, foram investigadas três massas (em µg) para Pd + Mg: 30 + 20, 15
+ 10 e 10 + 5, para estudar a influência da concentração de modificador sobre a massa
característica. Os volumes injetados no tubo de grafite foram sempre os mesmos, 20 µL
da amostra e uma alíquota de 10 µL de modificador contendo a massa estudada. Três
pontos de calibração com concentrações iguais a 2,5; 5 e 10 µg L
-1
foram utilizados,
uma vez que se desejava tão somente um estudo comparativo de sensibilidades. Este
estudo foi realizado em meio aquoso e na presença do tampão. A tabela 6 mostra uma
avaliação das massas características obtidas por diferentes massas de modificador nas
curvas aquosas e na matriz, respectivamente.
Tabela 6: Avaliação das massas características, nas curvas aquosa e no tampão, utilizando-se diferentes
massas de modificador.
Massa do Modificador
Pd/Mg (µg)
Massa Característica
Curva Aquosa
HNO
3
0,2% (pg)
Massa Característica do
Tampão (pg)
10 + 5 61,1 62,0
15 + 10 68,8 69,3
30 + 20 77,2 73,9
Volume de injeção da amostra = 20µL; modificador: Pd e Mg(NO
3
)
2
= 10µL; T
P
= 1400ºC; T
A
= 2100ºC. Sem diluição.
O estudo da massa característica no tampão não apresentou sensibilidades
semelhantes entre as diferentes massas de modificadores analisadas, como foi
59
determinado no estudo no plasma. O desvio padrão para a curva aquosa foi de 21% e
para a curva no tampão foi de 16%. Sabendo-se que a menor m
0
representa uma melhor
sensibilidade, a massa 10 + 5 g de paládio e magnésio, respectivamente, foi a melhor
opção. Além disso, pode-se afirmar que o modificador de Pd/Mg é apto a reduzir a
absorção de fundo.
11.3.5- Linearidade
Neste estudo, foram utilizadas seis soluções de calibração, nas concentrações
2,5; 5; 10; 25; 50; 100 g Sn L
-1
, tendo como objetivo verificar a linearidade através das
inclinações encontradas. A figura 9 apresenta a inclinação para a curva aquosa e no
tampão.
0
0,04
0,08
0,12
0,16
0 20 40 60 80 100
Concentração de Sn (ug/L)
Absorvância
Figura 9: Curvas de adição de analito em ambas as matrizes, na faixa de 2,5 a 100 g.L
-1
; Curva aquosa
( ) e curva no tampão 50mM Tris-HCl + 30mM NaHCO
3
( ). Vol. de injeção = 20µL; modificador: 10
g Pd + 5 g Mg(NO3)2 em 10µL; T
P
= 1400ºC; T
A
= 2100ºC. Amostras sem diluição.
A curva aquosa se mostrou linear até o ponto de 50 g L
-1
, enquanto que a curva
no tampão permaneceu linear até a concentração de 25 g L
-1
, para ambos, foi aplicado
o teste
t
Student e 95% de grau de confiança. Entretanto, houve uma diferença
significativa na linearidade e no grau de curvatura para concentrações mais elevadas de
Sn, para o tampão, cerca de 17% para as faixas de 25 a 50 g L
-1
e entre as faixas de 50
a 100 g.L
-1
o desvio de linearidade foi de 15%. Contudo, na curva aquosa a faixa de
concentração 25 a 50 g L
-1
apresentou um desvio padrão de 5% e para a faixa de 50 a
100 g L
-1
se mostrou com um desvio de 7%.
60
11.3.6- Massa Característica e Razão de Sensibilidades
A sensibilidade foi avaliada pela média, calculada entre dias, das massas
características (m
0
) relativas às curvas aquosa e no tampão, com adição de analito (iSn),
como mostra a tabela 7. O efeito da matriz foi avaliado pela razão de sensibilidades
(m
0
aq / m
0
m) entre as massas características obtidas pela curva aquosa e a curva na
matriz adicionada com padrão de Sn.
Tabela 7: Massa característica e razão de sensibilidades para as curvas aquosa e no tampão.
Matriz
Razão de Sensibilidades
(m
0
aq/m
0
m)
Massa Característica
(pg)
HNO
3
0,2% (v/v) - 64,0 ± 2,8
Tampão 0,99 64,6 ± 2,4
Vol. de injeção da amostra = 20µL; modificador: Pd e Mg(NO
3
)
2
= 10µL; T
P
= 1400ºC; T
A
= 2100ºC. Sem diluição.
Pode-se observar uma notável semelhança entre as sensibilidades das curvas na
matriz e no meio aquoso, uma vez que as razões se aproximaram de 1,00, de acordo
com o teste
t
de Student (95% de confiança). Sugerindo que não há interferência e a
calibração externa com soluções aquosas é adequada.
11.3.7- Limite de detecção e quantificação
O limite de detecção e quantificação, calculado para a determinação de Sn em
tampão, foi obtido a partir da leitura de dez frações de uma mesma fase móvel sem sinal
detectável do metal. O valor encontrado para LD foi de 0,38 g L
-1
e para LQ foi de
1,27 g L
-1
de Sn nas frações eluídas sem diluição, mostrando que o método proposto
pode ser usado para análise das frações de plasma de populações expostas a este analito.
11.4- Determinação do Sn nas frações plasmáticas
De acordo com a metodologia desenvolvida para a separação das proteínas e
determinação do Sn com o tampão 50mM Tris-HCl + 30mM NaHCO
3
, foram injetados
61
plasmas de um indivíduo não exposto sem adição do metal (Figura 10) e o mesmo
plasma enriquecido com 250 ng de Sn (Figura 11).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 ml tubo
-1
)
Concentração de Sn (µg L
-1
)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Absorvância em 280nm
Figura 10: Cromatograma das frações plasmáticas de indivíduo não exposto. Fluxo 0,7 mL min-
1
,
λ =
280 nm, vol. injetado 2 mL, plasma dil 2X no tampão 50mM Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
, pH 7,4, vol.
coletado 2 ml. ET AAS - 800: T
P
= 1400°C, T
A
= 2100°C, sem diluição.
0
2
4
6
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 ml tubo
-1
)
Concentração de Sn (µg L
-1
)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Absorbância em 280nm
Figura 11: Cromatograma das frações plasmáticas de indivíduo não exposto enriquecido com 250 ng de
Sn. Recuperação de 90%, determinada pelo somatório do conteúdo de Sn nas frações coletadas após
leitura por ETAAS. Fluxo 0,7 mL min-
1
,
λ = 280 nm, vol. injetado 2 mL, plasma dil 2X no tampão 50mM
Tris – HCl + 30mM NaHCO
3
, pH 7,4, vol. coletado 2 ml. T
P
= 1400°C, T
A
= 2100°C, fração plasmática
sem diluição.
62
Após a leitura por ET AAS das frações do plasma adicionado, houve uma
recuperação de aproximadamente 90%, significando que pode haver adsorção do metal
na coluna ou um erro na pipetagem. Para o plasma sem adição, os picos apresentados
podem ser resultado de uma possível contaminação, enquanto que, o Sn presente no
plasma enriquecido, se mostrou presente nas frações de exclusão total, indicando as
proteínas de alto peso molecular e também se apresentou nas frações de inclusão total,
apontando as proteínas de baixo peso.
A localização do Sn nas frações eluídas se mostrou diferente no plasma
enriquecido com padrão de SnCl
2
e naqueles de trabalhadores expostos à SnO
2
. Três
fatores podem ter interferido nessa diferença tais como a massa adicionada ser 100
vezes maior do que a encontrada, o composto do metal adicionado ser diferente daquele
em que o trabalhador se expõe e o tipo de ligação do Sn adicionado ser diferente
daquele em meio biológico.
Quando se adiciona uma massa cem vezes maior do que aquela naturalmente
encontrada em pessoas ocupacionalmente expostas, a probabilidade dos sítios de ligação
das proteínas que estejam disponíveis, serem então ocupados devido ao excesso de
metal disposto no meio. Em razão da falta de um valor de referência, a massa
adicionada no plasma foi 100 vezes maior que uma amostra real. Em relação à diferença
entre a espécie adicionada (SnCl
2
) e a espécie encontrada ambientalmente (SnO
2
),
proporcionou ligações do metal em diferentes frações, isso devido à diferença na
toxicocinética de cada espécie, e vale lembrar que, se trata de análises
in vitro
e
in vivo
.
Durante o desenvolvimento da metodologia, o volume de injeção foi igual a 2
mL. Contudo, o volume de plasma disponível não alcançou 2 ml, chegando, no
máximo, até 1,5 mL. Porém, no decorrer das análises, foi observado que essa variação
no volume injetado não alterava o perfil cromatográfico. Dos seis plasmas coletados, os
três primeiros analisados foram injetados diluídos duas vezes no tampão, como
desenvolvido na metodologia, e as últimas três amostras foram injetadas sem diluição,
para assim conseguir melhor observar o Sn nas frações, já que se tratava de um plasma
com uma concentração menor de metal do que a matriz estudada.
As figuras 12, 13, 14, 15, 16 e 17 apresentam os plasmas dos trabalhadores
expostos à cassiterita, com Sn determinado por AAS, de acordo com a metodologia
desenvolvida para a separação das proteínas e determinação do metal.
63
0
1
2
3
4
5
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 mL tubo
-1
)
Concentração (µg L
-1
)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Absorvância em 280nm
Figura 12: Cromatograma de trabalhador exposto. Amostra 01: [Sn] = 3,90 g L
-1
. Vol. de plasma
injetado: 700 l; fluxo: 0,7 ml min-
1
;
λ = 280 nm, plasma dil 2X no tampão 50mM Tris – HCl + 30mM
NaHCO
3
; pH 7,4; vol. coletado: 2 ml. T
p
= 1400°C, T
A
= 2100°C, fração plasmática sem diluição.
0
1
2
3
4
5
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 mL tubo
-1
)
Concentração (µg L
-1
)
0
0,5
1
1,5
2
Absorvância em 280 nm
Figura 13: Cromatograma de trabalhador exposto. Amostra 02: [Sn] = 3,59g L
-1
. Vol. de plasma
injetado: 1000 l; fluxo: 0,7 ml min-
1
;
λ = 280 nm; plasma dil 2X no tampão 50mM Tris – HCl + 30mM
NaHCO
3
; pH: 7,4; vol. Coletado: 2 ml. T
P
= 1400°C, T
A
= 2100°C, fração plasmática sem diluição.
64
0
1
2
3
4
5
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 ml tubo
-1
)
Concentração (µg L
-1
)
0
0,5
1
1,5
2
Absorvância
Figura 14: Cromatograma de trabalhador exposto. Amostra 03: [Sn] = 3,28 g L
-1
. Vol. de plasma
injetado; 1500 l; fluxo: 0,7 ml min-
1
;
λ = 280 nm; plasma dil 2X no tampão 50mM Tris – HCl + 30mM
NaHCO
3
; pH: 7,4; vol. coletado: 2 ml. T
P
= 1400°C, T
A
= 2100°C, fração plasmática sem diluição.
0
1
2
3
4
5
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 mL tubo
-1
)
Concentração (µg L
-1
)
0
0,5
1
1,5
Absorvância em 280 nm
Figura 15: Cromatograma de trabalhador exposto. Amostra 04: [Sn] = 3,59 g L
-1
. Vol. de plasma
injetado: 500 l; fluxo: 0,7 ml min-
1
;
λ = 280 nm; plasma não diluído no tampão 50mM Tris – HCl +
30mM NaHCO
3
; pH: 7,4; vol. coletado 2 ml. T
P
= 1400°C, T
A
= 2100°C, fração plasmática sem diluição.
65
0
2
4
6
8
10
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 mL tubo
-1
)
Concentração (µg L
-1
)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Absorbância em 280nm
Figura 16: Cromatograma de trabalhador exposto. Amostra 05: [Sn] = 2,98 g L
-1
. Vol. de plasma
injetado 700 l; fluxo 0,7 ml min-
1
;
λ = 280 nm; plasma não diluído no tampão 50mM Tris – HCl +
30mM NaHCO
3
; pH; 7,4; vol. coletado: 2 ml. T
p
= 1400°C, T
A
= 2100°C, fração plasmática sem diluição.
0
2
4
6
8
10
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
Fração (2 mL tubo
-1
)
Concentração (µg L
-1
)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Absorbância em 280nm
Figura 17: Cromatograma de trabalhador exposto. Amostra 06: [Sn] = 3,77 g L
-1
. Vol. de plasma
injetado: 1000 l; fluxo: 0,7 ml min-
1
;
λ = 280 nm; plasma não diluído no tampão 50mM Tris – HCl +
30mM NaHCO
3
; pH: 7,4; vol. coletado: 2 ml. T
p
= 1400°C, T
A
= 2100°C, fração plasmática sem diluição.
Pode-se dizer que, dos seis plasmas analisados, três não apresentaram Sn nas
frações. Possivelmente, os picos expostos, se tratam de contaminação, já que alguns
66
desses picos se mostraram presentes no volume morto. A falta de detecção do metal,
talvez se deve à baixa concentração de Sn no plasma, ou à falta de sensibilidade do
equipamento. Já nas outras três amostras, o Sn se mostra presente na inclusão total,
referindo-se às frações 85 a 95, correspondendo às proteínas de menor massa molecular.
11.5- Eletroforese
A resolução de colunas de gel filtração preparativas é baixa, separando as
proteínas por faixas de peso molecular. Esse tipo de coluna, freqüentemente é usada
para primeira abordagem, assim, seria necessário submeter a uma cromatografia de alta
resolução, como a de troca-iônica e fase reversa, porém é possível o deslocamento do
metal da proteína
33
.
Para tentar esclarecer quais as proteínas presentes nas frações onde aparece o Sn,
foi usada a eletroforese do tipo SDS-PAGE, que permite uma avaliação mais precisa do
peso molecular das proteínas.
A incubação das amostras na presença de SDS normaliza a carga e a forma das
proteínas, de modo que o elemento de distinção entre estes passa a ser o peso molecular
(PM). O agente redutor
β
-mercaptoetanol, ao romper as fontes de dissulfeto presentes
em boa parte das proteínas, torna o acesso do SDS mais facilitado às partes internas das
proteínas. O uso desta técnica permite a determinação dos PM de polipeptídeos
62
.
Foram feitos dois tipos de análises, com e sem
β
-mercaptoetanol, para avaliar se as
frações com Sn tinham proteínas com mais de uma sub-unidade.
As densidades de géis estudadas foram 12 e 15%, com uma faixa de
fracionamento de proteínas variável. Foram discernidas as frações da amostra 1 que
apresentaram Sn, entre 84 a 93. Dois tipos de estudos foram realizados, as figuras 18A e
18B representam os géis com
β
-mercaptoetanol presente nas frações, gel com densidade
de 15% e um padrão de proteína de intervalos entre 6,5 – 66 kDa. As figuras 19A e 19B
representam os géis sem o agente redutor nas frações, gel com densidade 12% e um
padrão de proteínas de MM = 6,5 a 200 kDa, pré-corado da BioRad.
Primeiramente o gel foi corado com Comassie Blue, porém a revelação não foi
satisfatória. A concentração das frações no Speed Vac não resolveu o problema, desta
maneira, foi necessária a coloração por AgNO
3
. Devido a essa mudança de corante no
mesmo gel, o padrão de PM das proteínas das figuras 18A e 18B se mostrou muito
67
concentrado. Contudo, nos géis mostrados nas figuras 19A e 19B, o padrão de PM foi
preparado para a coloração por AgNO
3
.
Na figura 18A, no primeiro poço foi aplicado o padrão de PM, do 2
o
ao 6
o
poço
foram aplicadas são as frações entre 84 a 88, respectivamente. Na figura 18B o primeiro
poço também representa o padrão de proteínas e do 2
o
ao 6
o
poço as frações entre 89 a
93, respectivamente. Nos géis mostrados nas figuras 19A e 19B as frações foram
aplicadas na mesma ordem.
Figura 18A: Gel com agente redutor β-mercaptoetanol, corado com AgNO
3
, densidade 15% e padrão de
proteínas de baixo PM (6,5 – 66 kDa). 1
o
poço padrão, da 2º ao 6º poço representam as frações 84 a 88,
respectivamente, da amostra 1.
Figura 18B: Gel com agente redutor β-mercaptoetanol, corado com AgNO
3
, densidade 15% e padrão de
proteínas de baixo PM (6,5 – 66 kDa). 1º poço padrão, da 2º ao 6º poço representam as frações 89 a 93,
respectivamente, da amostra 1.
kDa
66
45
36
29
24
20
14
6,5
1
o
2
o
3
o
4
o
5
o
6
o
Albumina
Cadeia pesada IgG
kDa
66
45
36
29
24
20
14
6,5
1
o
2
o
3
o
4
o
5
o
6
o
Albumina
Cadeia pesada IgG
68
A análise desses géis demonstra que há um grande número de proteínas
diferentes nas frações iniciais (84-88), com bandas de 85, 77, 71, 66, 63, 57, 53, 51, 48,
46, 43, 39, 37, 35, 33, 33, 30, 16 e 15 kDa. A medida que as frações caminham para a
inclusão total, a variedade de bandas diminui. Possivelmente as bandas de menor PM
fazem parte de proteínas formadas por mais de uma subunidade.
A banda principal em todas as frações tem peso molecular de 66 kDa, que em
amostras de plasma humano corresponde a soro albumina. Essa é a principal proteína
plasmática, correspondendo a cerca de 60% da proteína total presente nesse fluido
79
.
Além da soro albumina, outra banda presente em todas as frações apresenta PM
de 57 kDa. Essa banda está relacionada a cadeia pesada das imunoglobulinas, segunda
maior fração das proteínas plasmáticas
79
.
Figura 19A: Gel sem agente redutor β-mercaptoetanol, corado com AgNO
3
, densidade 12% e padrão de
proteínas de MM = 6,5 – 200 kDa. 1ª banda padrão, da 2ª a 6ª banda representam as frações 84 a 88,
respectivamente, da amostra 1.
1
o
2
o
3
o
4
o
5
o
6
o
kDa
200
115
96
51
37
29
20
6,5
Albumina
Proteína de
alto PM
69
Figura 19B: Gel sem agente redutor β-mercaptoetanol, corado com AgNO
3
, densidade 12% e padrão de
proteínas de MM = 6,5 – 200 kDa. 1º poço padrão, da 2º ao 6º poço representam as frações 89 a 93,
respectivamente, da amostra 1.
A análise das mesmas frações em condições não redutoras, mostradas nas
figuras 19A e 19B, demonstrou uma redução significativa nas bandas de menor peso
molecular, e um aumento da fração de alto peso, apresentando bandas de 92, 112 e 193
kDa, isso devido a baixa resolução da coluna.
A banda de alto PM, possivelmente, representa frações de imunoglobulinas
79
.
Estas bandas se mostraram de forma agregada, isso porque não houve fragmentação da
proteína devido à ausência do agente redutor
β
-mercaptoetanol, impossibilitando sua
migração. A banda representando a albumina, mais uma vez se torna presente
nitidamente.
De acordo com a literatura, o Sn (IV) se encontra ligado a importantes ligantes
biológicos de baixo PM
18
. Possivelmente, o Sn está ligado também à metalotioneínas, já
que se trata de uma proteína que desempenha a detoxificação dos metais não
essenciais
80
. Entretanto, a separação de proteínas de baixo PM, pelo método
cromatográfico desenvolvido, não é possível, devido à baixa resolução. Seria necessária
uma coluna com uma faixa de fracionamento menor, para aumentar a resolução. Esse
tipo de coluna, no entanto, tem uma capacidade menor, levando a uma redução do
volume injetado, o que dificultaria a determinação do Sn por AAS.
kDa
200
115
96
51
37
29
20
6,5
1
o
2
o
3
o
4
o
5
o
6
o
Albumina
Proteína de
alto PM
70
Não é possível afirmar se o metal estava ou não ligado a essas proteínas, uma
vez que ele foi observado na inclusão total. Essa observação reforça a necessidade de
mais experimentos para confirmar a ligação do Sn à proteína.
71
12- Conclusão
A determinação de Sn em plasma humano foi um trabalho analítico complexo. O
desenvolvimento dessa metodologia foi uma tarefa difícil, devido aos níveis basais do
elemento nos plasmas dos trabalhadores expostos à cassiterita, < 3,5 g L
-1
. Além disso,
essa concentração ainda era diluída ao ser fracionada pela coluna cromatográfica.
Apesar de todas as dificuldades, a metodologia foi desenvolvida com êxito. O metal foi
determinando por ET AAS, tanto no plasma, como nas frações, e para o processo de
separação das proteínas foi utilizada cromatografia líquida de baixa pressão, com uma
coluna de gel filtração.
As temperaturas ótimas de pirólise (1400°C) e de atomização (2200°C) para as
amostras de plasma e padrão aquoso foram as mesmas. A curva analítica no plasma se
manteve linear até 200
µ
g L
-1
. As massas de modificadores estudadas apresentaram uma
sensibilidade semelhante, assim, a massa de 10
µ
g de Pd e 5
µ
g de Mg(NO
3
)
2
foi eleita,
por utilizar um menor volume da solução, em razão ao alto custo. A diluição do plasma
em Triton X-100 0,1% (v/v) se mostrou a melhor alternativa entre as pesquisadas, pois
além de ser usado como diluente do sangue e seus derivados, diminui a tensão
superficial e facilita assim a pipetagem. Já a diluição 4 + 1 do plasma se mostrou mais
eficiente, pois possibilitou uma diminuição do fundo, sem comprometer a razão de
sensibilidades e o limite de detecção. O limite de detecção encontrado foi de 1,4 ± 0,2
g Sn L
-1
e o limite de quantificação obtido foi de 4,8 ± 0,7 µg Sn L
-1
.Mesmo se
tratando de uma matriz complexa, as sensibilidades foram semelhantes entre as matrizes
aquosa e no plasma, assim, a calibração pode ser realizada através da curva aquosa. E o
método se mostrou exato.
A análise do plasma dos trabalhadores expostos ocupacionalmente mostrou
elevados teores de Sn total, = 3,5 µg Sn L
-1
. Infelizmente, não existe um valor de
referência para este metal. Porém, a comparação à população ambientalmente exposta
evidencia essa diferença, apresentando-se 4,3 vezes menor do que a encontrada na
população de trabalhadores. Além do setor de produção da indústria apresentar uma
concentração de Sn maior do que aquela existente no ambiente da vila, a via de
exposição, assim como, o tipo de composto também são importantes.
O uso da cromatografia de baixa pressão por gel filtração, em uma coluna de 1m
de altura, empacotada com Sepharose CL-4B, para a separação das proteínas do plasma,
72
permitiu uma excelente recuperação de Sn nas frações eluídas, além de ser uma técnica
que contribui para a preservação da forma nativa das proteínas. Contudo, existem
fatores que impedem que apenas esta técnica seja utilizada para a análise de especiação,
como a baixa resolução, que não permiti uma identificação apropriada. Por isso, esta
técnica é usada para análise preliminar, e posteriormente, outras com melhor resolução
são empregadas.
A fase móvel escolhida foi 50 mM Tris-HCl + 30 mM NaHCO
3
, pH 7,4 para
manter o pH fisiológico, o fluxo foi 0,7 mL min
-1
e o volume coletado foi 2 mL/fração.
O plasma para injeção sofreu diluição de 1 + 1 com o tampão, porém, devido à baixa
concentração de Sn encontrada no plasma dos trabalhadores, três amostras não sofreram
diluição, contudo, não alterou o perfil cromatográfico. Além disso, o volume de injeção
da amostra variou de 500 a 1500 L, também não havendo alteração do cromatograma.
A determinação do Sn nas frações levou a uma otimização das condições
analíticas, por ET AAS. A temperatura ótima de pirólise se mostrou como no plasma,
1400°C, entretanto, a temperatura ótima de atomização foi de 2100°C. As frações não
sofreram diluição, e o sinal de fundo se apresentou numa faixa de absorvância aceitável
para um corretor com efeito Zeeman. A curva no tampão permaneceu linear até a
concentração de 25 g L
-1
. A massa de 10
µ
g de Pd e 5
µ
g de Mg(NO
3
)
2
apresentou
uma sensibilidade melhor nas leituras das frações. Além disso, pode-se observar uma
notável semelhança entre as sensibilidades das curvas na matriz e no meio aquoso. O
valor encontrado para LD foi de 0,38 g L
-1
e para LQ foi de 1,27 g L
-1
de Sn nas
frações eluídas.
O Sn apareceu no final da corrida, próximo a faixa de inclusão total. A análise
dessas frações por SDS PAGE demonstrou a presença das principais proteínas
plasmáticas, albumina e imunoglobulinas, além de proteínas de menor peso molecular.
Como o Sn foi encontrado próximo a inclusão total, não é possível afirmar se ele
se encontra ligado ou livre, já que se trata de um composto de baixo peso molecular. A
identificação do complexo metal-proteína não é possível apenas com técnicas de
separação e determinação do metal. Essa ligação metal-proteína só pode ser confirmada
através de métodos analíticos que apresentam a identificação seletiva da massa de
proteína com o peso do metal.
Nenhum trabalho foi encontrado no desenvolvimento de uma metodologia
analítica para a especiação de Sn em plasma humano. Entretanto, os estudos
73
encontrados para esse tipo de análise, se tratavam do alumínio, manganês, arsênio,
mercúrio e chumbo, em matrizes biológicas semelhantes ao plasma.
Apesar das técnicas utilizadas realizarem a separação protéica e determinação do
metal, existem outras com melhor resolução e sensibilidade. Diante disso, sugerimos as
técnicas hifenadas, que permitem a separação e determinação, como a LC-ICP-MS, e na
identificação do complexo metal-proteína, o Matrix-Assisted Laser Desorption
Ionization - Time Of Flight Mass Spectrometry.
74
13- Referências Bibliográficas
1- Moreira FR, Moreira JC. A importância da análise de especiação do chumbo em
plasma para a avaliação dos riscos à saúde. Química Nova. Vol. 27(2), p. 251-260,
2004.
2- Shona McSheehy, Zoltan Mester. The speciation of natural tissues by
electrospray-mass spectrometry. I: Biosynthesized species, As and Se. Trends in
Analytical Chemistry, Vol. 22, No. 4, 2003
3- Oliveira RC. Avaliação do movimento de cádmio, chumbo e zinco em solo
tratado com resíduo calcário. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação
em Agronomia. Universidade Federal de Lavras. 2003.
4- Carlos A. L. Filgueiras. A nova química do estanho. Química Nova, v. 2, p. 21,
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Human Services. Public Health Service Agency for Toxic Substances and Disease
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