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FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS
TÍTULO: ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE CELULAR IN SITU E
IN VITRO DE PACIENTES COM LESÃO ATIVA OU CICATRIZ
DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA.
FERNANDA NAZARÉ MORGADO
Programa de pós-graduação stricto sensu em Pesquisa Clínica em Doenças
Infecciosas
Orientação: Dra Fátima Conceição-Silva
Local: Laboratório de Imunoparasitologia – Departamento De Imunologia – IOC e
Ambulatório de Leishmaniose Tegumentar Americana – CRLeish – IPEC.
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO 2007
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2
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS
TÍTULO: ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE CELULAR IN SITU E
IN VITRO DE PACIENTES COM LESÃO ATIVA OU CICATRIZ
DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA.
Dissertação apresentada por Fernanda Nazaré
Morgado para conclusão do Curso de
Mestrado em Pesquisa Clínica em Doenças
Infecciosas - IPEC.
Orientação: Dra Fátima Conceição-Silva
Local: Laboratório de Imunoparasitologia – Departamento De Imunologia – IOC e
Ambulatório de Leishmaniose Tegumentar Americana – CRLeish – IPEC.
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO 2007
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3
Dedico este trabalho ao Raphael, pela sua
integridade, companhia incessante e por me fazer
enxergar que podemos sempre crescer.
4
“Tens que acreditar que os ventos soprarão,
Crer na grama por baixo da neve.
Ah, é por esta razão que o pássaro pode cantar:
Em seu dia mais escuro, acredita na primavera.”
(Autor desconhecido)
5
Morgado, Fernanda
Análise da Resposta Imune Celular in situ e in vitro de Pacientes co
m
Lesão Ativa ou Cicatriz de Leishmaniose Tegumentar Americana:
/
Fernanda Nazaré Morgado. - - Rio de Janeiro: IPEC-FIOCRUZ, 2007.
XII, 73 f. : il.. ; 31 cm.
Orientador: Dra Fátima Conceição-Silva
Dissertação (mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto de
Pesquisa Clínica Evandro Chagas, Mestrado em Pesquisa Clínica em Doenças
Infecciosas, 2007.
Referências bibliográficas: f. 88-98
1. Imunoparasitologia. 2. Imunopatogenia. 3.Imunologia celular. 4.
Leishmaniose Tegumentar Americana. 5. Cicatriz – Tese. I. Conceição-
Silva, Fátima. II. Fundação Oswaldo Cruz, Instituto de Pesquisa Clínic
a
Evandro Chagas, Mestrado em Pesquisa Clínica em Doenças Infecciosas.
III. Título.
6
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Fátima Conceição-Silva, por todos esses anos de convívio e de
amizade, pelo apoio e por tudo que me ensinou.
À Priscila Raibolt pela força nas tardes exaustivas de trabalho e pela amizade.
A todos os meus amigos do Laboratório de Imunoparasitologia que muito me ajudaram
e me encorajaram nos momentos mais difíceis.
Ao Dr Armando Schubach e toda a equipe do CRLeish por todo o apoio científico,
clínico e diagnóstico, como também pela amizade, companheirismo nos momentos
necessários. Em especial ao Dr Armando agradeço também todo apoio e colaboração à
minha permanência nesta Instituição desde os tempos da Iniciação Científica.
A todos os funcionários do IPEC-FIOCRUZ, em especial ao Serviço de Enfermagem e
ao Serviço de Coleta, pelo auxílio na obtenção do material biológico usado neste estudo.
Aos vários Serviços que realizaram o diagnóstico laboratorial dos casos: meus
agradecimentos.
À Marli e à Rosana pela calma de organizar o fluxo de pacientes do Ambulatório de
Leishmaniose.
À Dra Ginelza dos Santos, cujo trabalho foi fundamental para a realização deste estudo,
pois sem a sua insistência e simpatia nada teria acontecido.
Ao Dr Leonardo Quintella e toda equipe do Serviço de Anatomia Patológica do IPEC
pelos exames histopatológicos.
Aos Srs. Genilton José Vieira e Rodrigo Mexas do Laboratório de Tratamento de
Imagens- IOC, pelo auxílio na aquisição e formatação das figuras.
À Dra. Joseli Lannes Vieira pela cessão do aparelho e programa Soft Imaging System e
à Srta. Valeska Vieira pelo auxílio na aquisição e análise das imagens.
Ao Departamento de Ultraestrutura e Biologia Celular pela utilização do criostato para a
realização dos cortes dos tecidos estudados.
À Dra Claudia Maria Valete Rosalino pela revisão criteriosa desta dissertação.
Aos Drs Sergio Gomes Coutinho, Claudia Valete Rosalino, Paula Mello De Luca e
Armando Schubach por aceitarem participar da banca de defesa desta dissertação.
Desde já agradeço as críticas e sugestões.
7
À Coordenação da Pós-graduação, na figura de seus secretários, meus agradecimentos
pela colaboração e auxílio.
A todos os professores do Curso de Mestrado em Pesquisa Clínica em Doenças
Infecciosas-IPEC-FIOCRUZ pela dedicação e paciência.
Aos pacientes que padecem de Leishmaniose Tegumentar Americana, pois são o motivo
para a realização do estudo e sem os quais ele seria impossível.
Ao IOC- e IPEC-FIOCRUZ, ao CNPq, a FNS-MS e à Faperj pelo auxílio financeiro.
À Raphaela, meu estímulo, luz da minha vida, que enfeita meus dias com sua beleza,
travessuras e alegria.
À minha mãezinha pelo amor, compreensão (mesmo quando parece impossível) e pelo
amor que dedica à minha florzinha.
Ao meu avô Mario que esteve sempre presente em todos os momentos de minha vida.
A Deus, pela saúde e força para superar os obstáculos mais difíceis.
8
RESUMO
A pele é a maior interface entre o corpo e o ambiente e promove a primeira linha
de defesa contra a invasão de patógenos ou trauma. A cicatrização de lesões de pele
envolve um processo complexo e depende do controle do processo inflamatório. Uma
das doenças de acometimento cutâneo amplamente distribuída em nosso país é a
Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Nosso estudo de 19 lesões de LTA em
atividade mostrou que o infiltrado inflamatório é principalmente constituído por células
T e macrófagos, e que a dinâmica de infiltração muda durante a evolução da doença,
havendo um aumento da concentração de células CD4+ e CD68+, e redução da carga
parasitária. A associação entre a alta expressão de NOS2 (óxido nítrico sintase tipo 2) e
a baixa quantidade de parasitos sugere a importância desta enzima na eliminação das
formas amastigotas no sítio da lesão. Tendo em vista a possibilidade de persistência
parasitária nas cicatrizes de LTA e a importância da resposta imune local para o
controle da carga parasitária, conseqüentemente no controle do aparecimento de lesões
tardias nos propusemos a avaliar a composição celular e os marcadores de atividade
inflamatória presentes nos tecidos cicatriciais utilizando a técnica de imunohistoquímica
e comparando com os dados observados em lesões em atividade. Foram estudados 18
pacientes divididos em 2 grupos: 1- cicatrizes recentes (1 ano de cura clínica, n = 9); 2-
cicatrizes tardias (3 anos de cura clínica, n = 9). Foi observado que o infiltrado
inflamatório anteriormente difuso e intenso nas lesões ativas, torna-se restrito a grupos
de células bem delimitados em meio ao tecido fibrótico cicatricial e/ou associado aos
anexos cutâneos e em torno de vasos sanguíneos. As cicatrizes com 1 ano de cura
clínica, quando das análises pareadas com as lesões em atividade, apresentaram redução
significativa do percentual de neutrófilos e dos seguintes marcadores de atividade:
NOS2, E-selectina, Ki67, BCl-2 e Fas. Esta redução mostrou-se acentuada nas cicatrizes
mais antigas (3 anos), acompanhada da redução de células T CD3
+
, CD4
+
, CD8
+
e
células de Langerhans. Em conjunto os resultados sugerem que: 1- a dinâmica do
processo inflamatório nas formas cutâneas da LTA mantém um padrão de distribuição
celular ao longo do período de atividade que se modifica lentamente mesmo após a
aparente cicatrização das lesões; 2- a redução acentuada dos marcadores de atividade e
concentração de populações celulares observadas nas cicatrizes com 3 anos de cura
9
clínica sugerem que após este tempo o equilíbrio da relação parasito-hospedeiro in situ
começa a ser estabelecido.
10
ABSTRACT
The skin is the major interface between our body and the external environment
and it is responsible for the first defense against pathogens and trauma. Skin
Inflammation plays an important role during the healing of cutaneous lesions of
different diseases as American cutaneous leishmaniasis (ATL). In this context, we
studied 19 cutaneous ATL lesions during the active disease. Our results showed an
inflammatory reaction produced mainly by T lymphocytes and macrophages. The
distribution of these cells could modify according to disease outcome, mainly by
increasing the concentration of CD4+ and CD68+ cells as the parasite load decrease..
In addition, a negative correlation between NOS2 (nitric oxide synthase type 2) and
parasite detection was observed, suggesting a direct role of NOS2 in the parasite
control. Previous results have showed a presence of residual inflammatory reaction
associated with parasite antigens in the scars of ATL lesion. Based on this observation
we decide to evaluate the composition of cells and markers of inflammation in scars
from the same patients after 1 or 3 years of lesion’s healing. We could detect small
areas of cells clusters spread allover the fribrotic tissue as well as close to vessels and
cutaneous glands. The analysis of the scar tissue showed an important reduction of
NOS2, E- selectin, Ki67, Bcl-2 and Fas expression when compared with the lesions. In
addition, scars with 3 years duration also presented a reduction of CD3+, CD4+ and
CD8+ T cells as well as Langherhas cells. Taken togheter, the results suggests that: 1-
the inflammatory reaction shows a pattern of cellularity during the active phase of the
ATL lesion which change slowly even after the clinical healing of the lesions; 2- the
analysis of three years old scars showed an important reduction of inflammatory
reaction demonstrated by the decrease of either cells and expression of activity markers
suggesting that after this period the equilibrium between host and parasite is taking
place.
11
LISTA DE ABREVIATURAS
AEC – Aminoethyl carbazole
AP-1 – Ativação da proteína - 1
APC – Célula apresentadora de antígeno
BALB/C – Linhagem de camundongos susceptíveis a maioria das espécies de
Leishmania que desenvolvem infecção no modelo murino.
BCR – Receptor de célula B
BHI – Brain Heart Infusion
CD – Grupo de diferenciação
CEP-IPEC – Comitê de ética em pesquisa do IPEC
CIC – Cicatriz
CLA – Antígeno associado a linfócito cutâneo
ConA – Concanavalina A
cpm – Contagem por minuto
CTL – Linfócito T citotóxico
DFF40/CAD – Fator de fragmentação do DNA 40 / desoxinuclease ativada por caspase
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DTH – Hipersensibilidade tardia
ELISA – Ensaio imunoenzimático
HE – Hematoxilina-eosina
ICAM-1 – Molécula-1 de adesão intercelular
IDRM – Intradermorreação de Montenegro
IFI – Imunofluorescência indireta
IFN-γ – Interferon-γ
IL – interleucina
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
Lb-Ag – Antígeno de Leishmania sp
LCC – Leishmaniose cutânea crônica
LCD – Leishmaniose cutânea difusa
LCL – Leishmaniose cutânea localizada
LFA-1 – Antígeno-1 associado a função integrina do leucócito
12
LM – Leishmaniose mucosa
L-NIL – L-N
6
-iminoethyl-lysine
LPS – Lipopolissacarídeo
LTA – Leishmaniose Tegumentar Americana
MHC – Complexo de histocompatibilidade principal
MIP – Proteína inflamatória de macrófagos
MO – macrófago
ND – Não determinado
NEU – neutrófilo
NFkB – Fator nuclear kB
NK – Célula matadora natural
NNN – Meio Novy, MacNeal, Nicolle
NO – Óxido nítrico
NOS2 – Óxido nítrico sintase do tipo 2
PBMC – Células mononucleares de sangue periférico
PBS – Phosphate buffered solution
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PPD – Derivado protéico purificado
RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro
RNI – Intermediários reativos de nitrogênio
ROI – Intermediários reativos de oxigênio
RPL – Resposta proliferativa primária de linfócitos
SALT – Tecido linfóide associado à pele
SEM – erro mínimo
SFB – Soro fetal bovino
SI – Índice de estimulação
SIS – Sistema imune da pele
STAT - Transdutor de sinais e ativador de transcrição
TCR – Receptor de célula T
TGF-β – Fator de crescimento tumoral-β
Th – Célula T auxiliar
TNF-α – Fator de necrose tumoral-α
13
Tx-Ag – Antígeno de Toxoplasma gondii
UPD – Unidade perivascular dérmica
VCAM-1 – Molécula-1 de adesão das células vasculares
VLA-4 – Antígeno-4 de ativação tardia
14
SUMÁRIO
p.
INTRODUÇÃO ............................................................................................
20
A DOENÇA E SEU AGENTE........................................................................ 20
A RESPOSTA IMUNE DA PELE.................................................................. 23
A RESPOSTA IMUNE IN SITU NA LTA..................................................... 25
O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO............................................................ 27
EQUILÍBRIO PARASITO-HOSPEDEIRO................................................... 28
MARCADORES DE SUPERFÍCIE CELULAR E FUNCIONAIS NO
ESTUDO DA IMUNOPATOLOGIA DAS LEISHMANIOSES..................
29
JUSTIFICATIVA ........................................................................................
39
OBJETIVOS ..................................................................................................
41
Objetivo geral....................................................................................................... 41
Objetivos específicos............................................................................................ 41
CASUÍSTICA ................................................................................................
42
CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ..................................................................
43
METODOLOGIA ........................................................................................
44
1. Coleta de material biológico....................................................................... 44
2. Preparação dos fragmentos teciduais ........................................................ 44
3. Histopatologia............................................................................................. 45
4. Imunohistoquímica ..................................................................................... 45
5. Produção de antígenos de Leishmania braziliensis (Lb-Ag) e
Toxoplasma gondii (Tx-Ag).............................................................................
48
6. Resposta proliferaiva primária (RPL)......................................................... 48
7.Citometria de fluxo....................................................................................... 49
8. Análise estatística........................................................................................ 49
RESULTADOS..............................................................................................
50
Caracterização do grupo..................................................................................... 50
Histopatologia...................................................................................................... 51
IMUNOHISTOQUÌMICA – LESÔES ATIVAS..................................................... 54
1. Perfil quantitativo e qualitativo de macrófagos, linfócitos e neutrófilos
(figura 2).........................................................................................................
54
2. Distribuição e perfil quantitativo de células de Langerhans e células
dendríticas foliculares (tabela 4 e figura 2)....................................................
56
3. Marcadores de inflamação (figura 3)........................................................ 59
4. Detecção de parasitos................................................................................. 63
IMUNOHISTOQUÌMICA – CICATRIZES........................................................... 65
1. Perfil quantitativo e qualitativo de macrófagos, linfócitos e neutrófilos
(figura 6).........................................................................................................
65
2. Distribuição e perfil quantitativo de células de Langerhans (figura 6)...... 70
3. Marcadores de inflamação (figura 8)......................................................... 70
4. Detecção de parasitos................................................................................. 74
Evidenciação de diferenças significativas na análise comparativa lesões em
atividade versus cicatrizes – (figuras 10, 11, 12 e 13).........................................
74
Análise comparativa cicatrizes versus peles sadias contralaterais – (tabela 7 e
figura 14)..............................................................................................................
79
Resposta proliferativa primária........................................................................... 82
15
Caracterização fenotípica das células respondedoras in vitro ao Lb-Ag........... 83
DISCUSSÃO...................................................................................................
84
CONCLUSÃO................................................................................................
92
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................
94
16
LISTA DE TABELAS
p.
Tabela 1. Marcadores estudados................................................................................. 47
Tabela 2. Histopatologia das lesões de LTA de acordo com as características
principais evidenciadas nos cortes corados por HE....................................................
53
Tabela 3. Análise quantitativa e qualitativa do infiltrado inflamatório presente nas
lesões ativas, cicatrizes e peles sadias contralaterais..................................................
53
Tabela 4. Contagem percentual e por mm
2
dos marcadores estudados nos sítios
das lesões cutâneas de LTA em relação ao tempo de evolução.................................
58
Tabela 5. Intensidade de NOS2 + e E-selectina de acordo com o tempo de
evolução das lesões cutâneas de LTA........................................................................
61
Tabela 6. Contagem percentual e por mm
2
dos marcadores estudados nos sítios
das lesões cutâneas de LTA e nas cicatrizes com 1 e 3 anos de cura clínica.............
69
Tabela 7. Contagem percentual e por mm
2
dos marcadores estudados nos sítios
das cicatrizes com 1 e 3 anos de cura clínica, e respectivas peles sadias...................
81
17
LISTA DE FIGURAS
p.
Figura 1. Ligação do receptor Fas (CD95) presente na célula alvo e FasL
expresso pelo CTL resulta na morte induzida por apoptose.....................................
37
Figura 2. Lesão ativa: (a) células T CD3
+
, (b) células T CD4
+
, (c) células T
CD8
+
, (d) células B, (e) neutrófilos, (f) células de Langerhans. Aumento 200x.....
55
Figura 3. Lesão ativa: (a) células CLA
+
, (b) E-selectina, (c) células Ki67
+
, (d)
células BCl-2
+
, (e) células Fas
+
, (f) células FasL
+
. Aumento 200x..........................
60
Figura 4. Detecção em lesão ativa de endotélio expressando E-selectina.
Aumento 400x..........................................................................................................
62
Figura 5. Detecção de macrófagos (A - B); expressão de NOS2 (C - D); parasitas
(E - F), preparado como descrito em materiais e métodos. < 2 meses (A, C e E);
> 4 meses (B, D e F). (aumento 200x (A – D / barra de aumento = 50 µm) e 400x
(E – F / barra de aumento = 25 µm).........................................................................
64
Figura 6. Cicatriz: (a) células T CD3
+
, (b) células T CD4
+
, (c) células T CD8
+
,
(d) macrófagos, (e) células de Langerhans, (f) células dendríticas foliculares.
Aumento 400x......................................................................................................
67
Figura 7. Detecção através de imunohistoquímica de células CD4+ (A - B);
expressão de CLA (C - D); preparado como descrito em materiais e métodos.
Cicatriz 1 ano de cura clínica (A, C); Cicatriz 3 anos (B, D) (aumento 400x).........
68
Figura 8. Cicatriz: (a e b) células CLA
+
, (c) neutrófilos, (d) células BCl-2
+
, (e)
células Fas
+
, (f) células FasL
+
. Aumento 400x.........................................................
72
Figura 9. Detecção através de imunohistoquímica, em cicatriz, de endotélio
expressando E-selectina (A); expressão de CLA (B); preparado como descrito
em materiais e métodos. Aumento 200x..................................................................
73
Figura 10. Detecção através de imunohistoquímica de células CD3
+
(A - B);
CD4
+
(C - D); CD8
+
(E - F); CD1a
+
(G – H), preparado como descrito em
materiais e métodos. Lesão ativa (A, C, E e G); cicatriz (B, D, F e H). Aumento
200x............
75
Figura 11. Análise comparativa da distribuição fenotípica em (a) lesão ativa
versus cicatriz 1 ano de cura clínica e (b) lesão ativa versus cicatriz 3 anos de
18
cura clínica. * p<0,05. MO – macrófagos, NEU – neutrófilos, cic1 – cicatriz 1
ano, cic3 – cicatriz 3 anos.........................................................................................
76
Figura 12. Análise comparativa de atividade inflamatória em lesão ativa versus
cicatriz. (a) Comparação dos marcadores de direcionamento para a pele (CLA),
proliferação celular (Ki67) e apoptose (Fas/FasL) com cicatrizes 1 ano e (b) 3
anos de cura clínica. (c) Expressão de NOS2 em lesão ativa versus cicatriz 1 ano
e (d) 3 anos. (e) Expressão de E-selectina em lesão ativa versus cicatriz 1 ano e
(f) 3 anos. * p < 0,05................................................................................................
77
Figura 13. Análise comparativa da intensidade de células de Langerhans em
derme em lesão ativa versus (a) cicatriz com 1 ano de cura e (b) com 3 anos de
cura clínica. *p = 0,046.............................................................................................
78
Figura 14. Detecção em pele sadia contralateral de células Fas
+
(A); FasL
+
(B);
CD1a
+
(C); E-selectina
(D), preparado como descrito em materiais e métodos.
Aumento 400x..........................................................................................................
80
Figura 15. Resposta proliferativa primária de PBMC estimuladas com Lb-Ag.. 82
19
LISTA DE ANEXOS
p.
1. Termo de consentimento livre e esclarecido – lesões ativas................................... 105
2. Termo de consentimento livre e esclarecido – cicatriz........................................... 108
3. Termo de compromisso e responsabilidade............................................................ 113
4. Carta de aprovação CEP-IPEC/FIOCRUZ............................................................. 114
20
INTRODUÇÃO
A DOENÇA E SEU AGENTE
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença parasitária
causada por protozoários do gênero Leishmania. A transmissão ocorre através da picada
do inseto vetor, pertencente ao gênero Lutzomya, cujas espécies envolvidas dependem
da localização geográfica.
Durante a hematofagia, as formas promastigotas presentes no tubo digestivo do
inseto vetor são inoculadas no hospedeiro vertebrado. Uma vez no tecido, estes
parasitos são internalizados por fagócitos, e dentro do vacúolo parasitóforo convertem-
se nas formas amastigotas. A multiplicação do parasito no interior de macrófagos,
associada à resposta imune estimulada pela presença do antígeno parasitário, produz
uma reação inflamatória com predominância celular (processo inflamatório crônico do
tipo granulomatoso). Com a continuidade do binômio replicação parasitária/processo
inflamatório vão surgir lesões teciduais que podem acometer o tegumento cutâneo e/ou
mucoso (Leishmaniose Tegumentar) ou órgãos viscerais (Leishmaniose Visceral).
Apesar de estar em expansão, a forma visceral ainda é restrita a áreas bem determinadas
do território brasileiro. Já a forma tegumentar (LTA) pode ser encontrada em todo o
país tanto em área rural quanto urbana.
A LTA pode ser dividida em três formas clínicas básicas: leishmaniose cutânea
localizada (LCL), leishmaniose mucosa (LM) e a leishmaniose cutânea difusa (LCD).
A forma cutânea localizada tem como principal característica uma lesão ulcerada
que se desenvolve no local de inoculação do parasito, pelo inseto vetor. O indivíduo
desenvolve úlcera de bordos elevados e fundo granuloso, geralmente única e
autolimitada. O teste de Montenegro é positivo e é possível evidenciar resposta imune
celular específica in vitro (Conceição-Silva et al., 1990).
A leishmaniose mucosa geralmente se caracteriza por destruição tecidual
progressiva associada à intensa resposta inflamatória (Amato et al., 2003). Esta lesão
surge semanas ou anos após o desaparecimento da lesão cutânea inicial, por provável
disseminação hematogênica a partir do foco primário. Trabalhos experimentais em
21
hamsters parecem corroborar esta hipótese (Kanan, 1975). Mais raramente, a lesão
mucosa pode surgir na vigência de úlcera cutânea em atividade.
O quadro clássico da leishmaniose cutânea difusa (LCD) é caracterizado por
infiltrações, pápulas e tubérculos envolvendo extensas áreas cutâneas (Brasil, 2000).
Tem caráter progressivo e não responde ao tratamento antimonial, com ciclos contínuos
de remissão (após o tratamento) e atividade. Os pacientes com LCD não apresentam
resposta imunológica do tipo tardio especificamente ao antígeno do parasito in vivo
(DTH, teste de hipersensibilidade tardia ou reação de Montenegro negativa) nem in
vitro (resposta proliferativa) (Castes et al., 1983; Castes et al., 1984).
A LTA com sua ampla distribuição constitui uma das afecções dermatológicas
que merece maior atenção, devido a magnitude da doença, assim como pelo risco de
ocorrência de deformidades que pode produzir no homem, como também pelo
envolvimento psicológico do doente, com reflexos no campo social e econômico, uma
vez que, na maioria dos casos, pode ser considerada uma doença ocupacional (Brasil,
2000). As principais espécies envolvidas são: Leishmania (Leishmania) amazonensis,
Leishmania (Viannia) guyanensis e Leishmania (Viannia) braziliensis.
A L. (V.) guyanensis é classicamente encontrada no extremo norte do país,
sendo responsável por casos de lesões cutâneas e mais raramente lesões mucosas. Já os
indivíduos infectados por L. (L.) amazonensis podem desenvolver, além da forma
cutânea clássica, o quadro de leishmaniose cutânea difusa (LCD). Nestes indivíduos a
doença se torna de difícil controle, refratária ao tratamento e as lesões tendem a se
disseminar pelo tegumento cutâneo de forma lenta, mas progressiva.
O Rio de Janeiro é tradicionalmente considerado área endêmica de LTA, e a
espécie circulante em nosso meio tem sido identificada como L. braziliensis (Schubach
et al., 1998b).
A maioria dos pacientes infectados com L. (V.) braziliensis apresenta a forma
cutânea típica (como descrito anteriormente), com localizações variadas, às vezes
acompanhada de linfadenopatia regional precoce. Podem ocorrer lesões múltiplas, e em
alguns pacientes a doença se apresenta como leishmaniose cutânea disseminada (Barral
et al., 1992; Barral et al., 1995; Bittencourt e Barral-Neto, 1995; Grimaldi et al., 1989).
Alguns pacientes infectados por L. (V.) braziliensis, (1 a 10%), desenvolvem
leishmaniose mucosa (LM), uma forma destrutiva que compromete nariz, faringe,
22
palato, lábio superior e laringe. Em 42% dos pacientes ocorre perfuração do septo nasal
(Marsden, 1986). A LM tem como característica uma resposta imunológica exacerbada,
mediada por células, e é interessante a observação de grande destruição tecidual
acompanhada de dificuldade de detecção de parasitos (Carvalho et al., 1985). Estes
pacientes apresentam resposta positiva ao teste de Montenegro e a resposta proliferativa
in vitro de células do sangue periférico, frente ao antígeno. A magnitude desta resposta
é geralmente maior que na forma localizada (Carvalho et al., 1985; Castes et al., 1983).
De um modo geral, não importando o parasito envolvido, a forma clássica da
infecção se caracteriza pelo aparecimento de lesões tegumentares com característica
predominantemente ulcerativa e com a formação de um infiltrado granulomatoso
crônico evidenciado na histopatologia.
A úlcera leishmaniótica típica tende à cronicidade e pode evoluir para expansão
ou regressão, mesmo sem tratamento. A cicatrização pode dar-se num prazo de seis
meses a vários anos, curando-se muitas vezes, dentro de 12 a 15 meses (Rey, 1991).
O diagnóstico da LTA compreende a associação entre dados clínicos,
laboratoriais e epidemiológicos. Os testes laboratoriais consistem na evidenciação do
parasito e em provas imunológicas.
Os espécimes clínicos coletados para o diagnóstico parasitológico podem ser
obtidos a partir de escarificação ou biópsia de lesão. Também pode ser feita a punção
aspirativa quando houver necessidade de investigação de comprometimento ganglionar
primário. No exame parasitológico direto, é realizada a pesquisa de formas amastigotas
em lâminas de impressão por aposição ou material proveniente de escarificação e
punção aspirativa, corados pela técnica de Giemsa ou Leishman. O exame
parasitológico indireto visa o isolamento do agente infeccioso em meios de cultivo
apropriados, como por exemplo NNN, Scheneider ou BHI. Outro método de
diagnóstico indireto é a inoculação em animais de laboratório, sendo o hamster o animal
de escolha (Brasil, 2000). A análise histopatológica dos fragmentos de biópsia também
é de fundamental importância no diagnóstico da LTA, pois pode identificar as formas
parasitárias e ao mesmo tempo contribuir para o diagnóstico diferencial. Alguns estudos
têm sido realizados com o objetivo de implementação de outras metodologias auxiliares
como a imunohistoquímica e o PCR para o diagnóstico da LTA, através da detecção de
parasitos nas lesões ativas (Kenner et al., 1999).
23
A detecção de resposta imune específica pode ser feita através da
intradermorreação de Montenegro (IDRM), imunofluorescência indireta (IFI) e/ou
ensaio imunoenzimático (ELISA), além de resposta proliferativa primária de linfócitos
(RPL). Esta última é pouco utilizada na prática.
Para o tratamento da LTA o Ministério da Saúde (Brasil, 2000) preconiza a
utilização do antimonial pentavalente (antimoniato-N-metil-glucamina) como droga de
primeira escolha. A anfotericina B é considerada droga de segunda escolha, empregada
quando não se obtém resposta ao tratamento com o antimonial ou na impossibilidade de
seu uso.
A discussão sobre a erradicação do parasito após a cura clínica foi motivo de
controvérsia durante muitos anos. Com o estudo sistemático de cicatrizes e com a
possibilidade de utilização de técnicas de grande sensibilidade, a evidenciação de
parasitos pode ser feita com a detecção de antígenos ou DNA parasitários em lesões de
leishmaniose tegumentar americana (LTA) em cicatrização (Schubach et al., 1998a;
Schubach et al., 1998b; Amato et al., 2003; Mendonça et al., 2004). Schubach et al.
(2001) demonstraram a existência de antígenos de Leishmania no tecido cicatricial e
sugeriram que este fato poderia estar relacionado a mecanismos de manutenção da
resposta imune levando a imunoproteção. Por outro lado, como foi possível o
isolamento de parasitos em culturas de amostras de cicatriz, também foi sugerido que a
persistência do agente infeccioso poderia estar relacionada ao desenvolvimento de
lesões secundárias (lesão mucosa ou reativações). Todos estes dados sugerem um
equilíbrio dinâmico entre o parasito e o sistema imune, principalmente aquele existente
no local. Assim, o estudo de resposta imune da pele e seus mecanismos modulatórios
pode ser uma boa ferramenta na compreensão dos mecanismos que mantém ou alteram
este equilíbrio.
A RESPOSTA IMUNE DA PELE
Nos últimos anos, o estudo de lesões tegumentares tem sido modificado pela
valorização da detecção de fatores envolvidos na resposta imune in situ ao parasito. Este
24
fato foi melhor compreendido a partir dos trabalhos que descreveram a resposta imune
na pele.
O tegumento cutâneo de simples barreira mecânica à agressão e/ou entrada de
agentes físicos, químicos e patogênicos, hoje é visto como sendo fundamental no
desenvolvimento e seleção da resposta imune a vários agentes causais (Ahmed et al.,
1994; Modlin et al., 1989; Conceição-Silva et al., 1990; Conceição-Silva et al., 1994;
Conceição-Silva et al., 1998; Khanolkar-Young et al., 1998; Orteu et al., 1998; Pirmez
et al., 1990; Pirmez et al., 1993; Lessin et al., 1999; Bertho et al., 2000). Hoje pode-se
falar inclusive em sistemas organizados como o sistema imunológico da pele (SIS –
skin immune system; SALT – skin associated lynphoid tissue – Bos e Kapsemberg,
1993, revisão) e dos folículos pilosos (Christoph et al, 2000).
Streenlein (1978, 1983, 1990) define o tecido linfóide associado à pele (SALT)
com os seguintes constituintes: queratinócitos, células de Langerhans, células T, células
endoteliais da pele e linfonodos de drenagem. O SALT seria parte do sistema imune da
pele (SIS) descrito como a resposta associada a células e fatores humorais presentes na
pele humana normal (monócitos, macrófagos residentes, mastócitos, granulócitos,
queratinócitos entre outros) (Bos e Kapsemberg, 1993).
O estudo funcional de várias células constituintes da pele tem demonstrado sua
potencial participação na resposta imune local. Os queratinócitos, por exemplo, além de
participar da homeostase do tecido são capazes de, após estimulação, expressar
antígenos em complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe II, podendo
atuar como células apresentadoras de antígenos, e nas mesmas condições são produtoras
e secretoras de citocinas (Lunger et al., 1990).
Além dos queratinócitos, outras células com função de células apresentadoras de
antígenos (APC) estão presentes na pele como as células de Langerhans que derivariam
uma população de células dendríticas, macrófagos etc. Outras células do sistema imune,
notadamente células T, estão presentes na pele, prontas a serem ativadas no caso de
agressão tecidual. Estes linfócitos expressam em sua maioria uma molécula de
superfície denominada CLA (“cutaneous lymphocyte antigen”) tipicamente presente em
células com “preferência” pela migração para o tegumento cutâneo. Foi calculado que
num dado momento, o número de células T presentes na pele de um adulto sadio
somaria algo em torno de 4 bilhões, sendo que 90% delas se situariam nas proximidades
25
dos vasos capilares formando as unidades perivasculares dérmicas (UPD-Bos e
Kapsemberg, 1993). Outras células como mastócitos, polimorfonucleares neutrófilos
entre outras também estão presentes. Estas células estariam envolvidas em várias fases
do processo inflamatório no tegumento cutâneo e os fenômenos de citotoxicidade teriam
importante papel tanto na eliminação do patógeno quanto na regulação do processo
inflamatório por si. Como exemplo, Oishn et al. (1996) mostraram que a apoptose
mediada pelas moléculas denominadas Fas (CD95 – receptor ligado aos processos de
apoptose) e FasL (CD95L – molécula ligante do receptor Fas) pode exercer papel
importante no "turnover" e diferenciação celular na pele normal, na regulação imune de
tumores de pele e na patogênese de várias doenças de pele como as dermatoses,
queratoses, lupus, verruca vulgaris entre outras. Guan et al. (2000) ao analisar a
cicatrização de feridas não infecciosas provocadas experimentalmente em pele de
camundongos, sugeriram que a apoptose através de Fas e Fas-L exerceria função
importante na redução da celularidade durante o processo de cicatrização. A mesma
sugestão foi dada por Orteu et al. (1998), utilizando a resposta inflamatória induzida por
teste intradérmico (PPD). O estudo destes fenômenos trouxe à luz vários pontos que
hoje não devem ser esquecidos quando se tenta discutir patologias como as
leishmanioses tegumentares, a paracoccidiodomicose secundária, a esporotricose e a
hanseníase, por exemplo (Botelho et al., 1998; Gesztesi et al., 1999; Khanoulkar-Young
et al., 1998; Kauffman, 1999; Kurokawa et al., 1998; Lucey et al., 1996; Murphy et al.,
1994; Stevens et al., 1994; Zeppone-Carlos et al., 1999).
A RESPOSTA IMUNE IN SITU NA LTA
Nos últimos anos as técnicas de estudo in situ como a hibridização e a
imunohistoquímica se tornaram ferramentas importantes para o entendimento da
imunopatologia de uma grande variedade de doenças infecciosas, incluindo a
leishmaniose, pois permitem a identificação in situ do agente infeccioso e do tipo de
células e citocinas envolvidas na resposta inflamatória (Amato et al., 2003). Pirmez et
al. (1993) sugeriram que o curso clínico da infecção por Leishmania braziliensis no
homem estaria associado com o padrão local específico de produção de citocinas, pois
26
observaram predominância relativa de RNAms de citocinas do tipo 1 como a IL-2,
IFN-γ e linfotoxinas em lesões cutâneas localizadas e em reações de hipersensibilidade
tardia provocadas pelo teste de Montenegro. Nas lesões provenientes de formas
crônicas e mucocutâneas destrutivas da leishmaniose havia a presença simultânea de
RNAms de citocinas do tipo 1 e 2, porém com marcante abundância de IL-4. Esterrre et
al. (1992) caracterizaram a resposta imune celular na leishmaniose cutânea localizada e
observaram que o infiltrado inflamatório era composto em sua maior parte por linfócitos
T, macrófagos e uma pequena porção de células B, natural killer e granulócitos. Além
disso, as células CD4
+
e CD8
+
apresentavam-se em quantidades iguais. Lima et al.
(1994) encontraram resultados semelhantes quanto à proporção de linfócitos T CD4
+
e
CD8
+
e células B, e quando relacionaram o tempo de lesão e o fenótipo celular notaram
que a porcentagem das células positivas se mantinha fixa para todos os tipos celulares
com exceção das células T γδ que reduziram com o tempo. A partir destes resultados,
estes pesquisadores concluíram que provavelmente estas células seriam importantes na
fase inicial da resposta imune na doença granulomatosa.
Em estudo posterior (Diaz et al., 2002) foi realizada a caracterização fenotípica
de leucócitos e de moléculas associadas à ativação nos sítios de lesões de pacientes com
diferentes formas clínicas (leishmaniose cutânea difusa - LCD, leishmaniose cutânea
localizada - LCL e leishmaniose cutânea crônica - LCC). Foi observado que os
números de células T CD4
+
e CD8
+
foram semelhantes nas lesões dos pacientes de LCL
e LCC, e significativamente diferentes nas lesões dos pacientes de LCD. Além disso, as
lesões de LCL apresentaram cerca da metade do número de células CD69
+
recentemente
ativadas quando comparado às lesões de LCC, porém a maioria era CLA
+
, enquanto
LCC apresentaram os números mais altos de células CD69
+
, estando somente um terço
expressando CLA. Segundo os autores, isso sugere que o granuloma de pacientes LCC
contém muitas células T ativadas que não são “marcadas/primadas” com o antígeno
cutâneo, contribuindo assim para uma resposta imune aberrante. Por outro lado, o
granuloma dos pacientes LCD apresentavam os menores números de células CLA
+
e
CD69
+
, o que poderia ser associado ao estado tolerogênico característico destes
pacientes.
Amato et al. (2003) ao estudarem a caracterização in situ da resposta
inflamatória na LM antes e após o tratamento, demonstraram a
27
redução/desaparecimento das lesões inflamatórias e o desaparecimento de formas
amastigotas que foram atribuídos principalmente ao tratamento. Apesar disto, o
infiltrado de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
ou antígenos de Leishmania sp persistiram nas
lesões tratadas. Apesar do conhecimento obtido nestes estudos, várias questões ainda
permanecem obscuras. Entre elas o papel da relação parasito-hospedeiro na relação
infecção - doença.
O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO
A cicatrização de lesões de pele envolve um processo complexo, que inclui a
indução de inflamação aguda pela injúria inicial (fase inflamatória), seguido de
proliferação celular mesenquimal e parenquimal, epitelização e síntese de colágeno
(fase proliferativa ou fibroblástica), e uma fase final onde é estabelecido o equilíbrio
entre lise e síntese de colágeno e a orientação das fibras (fase de remodelamento)
(Greenhalgh, 1998; Hunt et al., 2000; Henry e Garner, 2003).
Alguns dos fatores que controlam o processo inflamatório e a cicatrização já
foram descritos. Guan et al. (2000) analisaram camundongos com feridas provocadas
experimentalmente e não infectadas, e observaram que a apoptose via Fas e FasL
poderia ter uma importante participação na redução da celularidade no processo de
cicatrização. Grennhalgh (1998), em revisão, discutiu a importância da apoptose em
todas as fases do processo cicatricial, tanto para a redução de células inflamatórias
quanto para a redução de células fibroblásticas, e, conseqüentemente passagem de uma
fase para a outra. O TGF-β (fator de crescimento tumoral – β) parece ter função chave
na transição da fase inflamatória para fibroblástica, pois regula negativamente a
inflamação (células T e macrófagos) e induz fibrose (Grennhalgh, 1998). O TGF-β tem
papel relevante na cura de lesões em camundongos infectados por L. major. O bloqueio
do TGF-β in vivo levou ao controle da carga parasitária e rápida cicatrização,
acompanhados por aumento da produção de óxido nítrico (NO) (Li et al., 1999). Stenger
et al. (1996) demonstraram expressão de NOS2 (óxido nítrico sintase tipo 2) a longo
prazo no sítio da lesão de pele original e no linfonodo drenante em camundongos
infectados com L. major, e constataram que a atividade de NOS2 foi dependente de
28
células T CD4
+
, mas não CD8
+
. A inibição da NOS2 por L-NIL (L-N
6
-iminoethyl-
lysine) determinou um aumento da carga parasitária no tecido cutâneo e linfonodo
drenante, levando a reativação da doença. Concluíram, então, que a atividade de NOS2
seria crucial para o controle de parasitos persistentes nos hospedeiros
imunocompetentes após a resolução da infecção primária. Nas fases de
imunossupressão, a inibição da atividade de NOS2 seria um dos mecanismos
responsáveis pela reativação endógena de infecções latentes por microrganismos
sensíveis ao NO. No homem, este mesmo fenômeno pôde ser observado com a
descrição de parasitos viáveis nas cicatrizes de LTA (Schubach et al., 1998a; Schubach
et al., 1998b) e na reativação da doença em pacientes aidéticos (Kubar et al., 1998;
Czechowicz et al., 1999).
EQUILÍBRIO PARASITO-HOSPEDEIRO
Em humanos os mecanismos de suscetibilidade e resistência aos agentes
infecciosos são complexos devido ao balanço entre respostas patogênicas e protetoras,
ao “background” genético e história imunológica variável dos indivíduos infectados
(Gaze et al., 2006).
A infecção por Leishmania induz a liberação de citocinas que inibem a morte
mediada por NO, como TGF-β e IL-10. O fosfoglicano da Leishmania regula
negativamente a produção de IL-12, consequentemente inibe a expansão de TH1 e
liberação de NO estimulada por INF-γ. O TGF-β é o supressor mais potente da
expressão de NOS2 em macrófagos murinos e atua ao nível pós-transcripcional
desestabilizando o RNAm de NOS2, retardando a síntese da enzima e acelerando a sua
degradação (Bradonisio et al., 2001).
A habilidade do hospedeiro em controlar a infecção pode ser resultado de um
balanço entre o número de microrganismos persistentes e células efetoras específicas do
sistema imune. Há a possibilidade de que mesmo poucos patógenos sobreviventes
possam facilitar a manutenção da imunidade protetora. Tem sido postulado que células
T de memória necessitam de perpétua reestimulação causada tanto por reações cruzadas,
29
a partir de patógenos relacionados ou do ambiente, ou pela presença de antígenos do
inóculo primário (Moll et al., 1995).
Assim como em diversas outras infecções, hospedeiros clinicamente curados
podem ainda abrigar formas viáveis de Leishmania sp. Stenger et al. (1996), como
citado anteriormente, estudando a infecção por Leishmania major no modelo murino,
observaram que 60-70% dos parasitos que persistem nos linfonodos satélites estavam
localizados em áreas negativas tanto para NOS2 quanto para marcadores de macrófagos,
granulócitos, células dendríticas ou células endoteliais. Na época os autores sugeriram a
existência de um outro tipo de célula, que de forma intrínseca ou devido à supressão por
produtos bacterianos, seriam deficientes na produção de NO e poderiam servir como
alvo seguro para L. major. Alguns anos mais tarde o mesmo grupo (Bogdan et al.,
2000), analisando a produção de NO por fibroblastos em resposta a citocinas ou
produtos bacterianos in vitro, observaram que fibroblastos murinos tinham capacidade
reduzida de produção desta molécula e eliminação de parasitos de L. major, e podiam
abrigar tanto formas amastigotas quanto promastigotas. Apesar disto, os parasitos
residentes em fibroblastos ainda eram suscetíveis à ação de NO por macrófagos
vizinhos. Os autores sugeriram que fibroblastos podem formar um ambiente menos
hostil para L. major do que os macrófagos, permitindo assim a persistência de formas
parasitárias. Além disto, algumas das amastigotas persistentes estavam localizadas no
meio extracelular envolvidas por matriz ou em áreas necróticas deficientes de células
nucleadas. A sobrevivência e replicação do parasito, no entanto estariam sujeitas ao
controle por macrófagos vizinhos, que então, manteriam um equilíbrio estável entre
parasito e hospedeiro.
MARCADORES DE SUPERFÍCIE CELULAR E FUNCIONAIS NO ESTUDO DA
IMUNOPATOLOGIA DAS LEISHMANIOSES
A composição e a característica funcional do infiltrado inflamatório podem ser
estudadas sobre vários aspectos. A utilização de anticorpos policlonais ou monoclonais
que detectam marcadores de superfície ou no interior da célula é amplamente difundida
e pode indicar particularidades da dinâmica inflamatória. Neste sentido, a escolha dos
30
marcadores é fundamental para a compreensão deste processo. Neste tópico e na tabela
1 estão resumidos as principais características dos anticorpos monoclonais utilizados e
suas especificidades, e alguns resultados já descritos na leishmaniose.
Linfócitos e suas subpopulações
Os linfócitos T são as células centrais da resposta imune adaptativa. A molécula
CD3, está localizada na superfície da células T formando o complexo TCR (receptor de
células T), e juntamente com ζ fazem a transdução de sinais bioquímicos desencadeados
pelo reconhecimento de antígenos. Como resultado, estes eventos bioquímicos induzem
a ativação funcional das células T. CD4 e CD8 são glicoproteínas transmembranares de
células T que se ligam a regiões não polimórficas das moléculas do MHC. Transduzem
sinais que, junto com os sinais liberados via complexo TCR, iniciam a ativação das
células T. CD4 está presente nas células T auxiliares e regulatórias e reconhece
seletivamente moléculas do MHC-II associadas a antígenos. CD8 está presente nas
células T supressoras/citotóxicas e liga-se seletivamente às moléculas do MHC-I
(Abbas, 2003).
A molécula CD22 é um marcador para linfócitos B, pois é uma proteína
associada ao receptor de antígeno da célula B (BCR) e participa da regulação deste tipo
celular, via sinalização transmembranar, em resposta a antígenos estranhos (Abbas,
2003).
Células de Langerhans e células dendríticas foliculares
As células de Langerhans epidérmicas são componentes importantes da resposta
imune inata da pele, pois iniciam a resposta imune adaptativa local de células T (Lunger
et al., 2004). Elas migram para a derme, onde captam antígenos e se dirigem para o
linfonodo regional, onde apresentam antígenos para as células T específicas, iniciando
assim a resposta imune celular (Elhassan et al., 1994; Moll et al., 1995). Durante a
migração, as células de Langerhans se diferenciam em células dendríticas e tornam-se
capazes de sensibilizar linfócitos T naive. Ao longo deste processo de maturação, as
células de Langerhans aumentam a expressão de moléculas do MHC-II e de moléculas
31
coestimulatórias B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86), CD40 e CD83 (Katou et al., 2000 em
revisão).
As células de Langerhans expressam altos níveis da molécula CD1a, com
capacidade de apresentar antígenos lipídicos microbianos às células T (Hunger et al.,
2004). Elas são capazes de fagocitar L. major, porém isto não é importante para
eliminação de parasitas, mas sim para a aquisição de antígenos para apresentação à
célula T. São também potentes estimuladoras da proliferação de células T específicas
para L. major e produção de linfocinas, sendo para tal mais eficientes do que os
macrófagos (Moll et al., 1993 APUD Xavier et al., 2005).
As células dendríticas foliculares são aquelas providas de projeções
membranosas, presentes nos centros germinativos dos folículos linfóides, no baço e nos
tecidos linfóides associados às mucosas. Estas células captam antígenos que estão
ligados a anticorpos ou a produtos do complemento e exibem esses antígenos em sua
superfície para o reconhecimento pelos linfócitos B (Abbas, 2003).
CD68 (Macrófagos) e NOS2 (Óxido nítrico sintase do tipo 2)
CD68 é uma glicoproteína transmembranar altamente glicosilada,
principalmente localizada em lisossomos. Está presente em macrófagos e apresenta
função ainda desconhecida (Abbas, 2003).
A óxido nítrico sintase do tipo 2 (NOS2) ou óxido nítrico sintase induzida
(iNOS) é uma enzima celular que catalisa a síntese de óxido nítrico (NO) a partir do
aminoácido L-arginina (Michel e Feron, 1997; Bogdan, 2001). NO é um radical de vida
curta que transmite sinais celulares envolvidos em vasodilatação, neurotransmissão e
citotoxicidade. Efeitos protetores e tóxicos de NO são frequentemente observados em
paralelo. Trabalhos têm demonstrado que o radical NO ou derivados do mesmo não
atuam somente como molécula efetora antimicrobiana direta, mas também exercem um
efeito imunorregulatório protetor para o hospedeiro (Bogdan, 2001). Como mecanismos
imunossupressores, têm sido descrito apoptose de células T, a regulação negativa da
expressão de MHC de classe II, citocinas ou moléculas coestimulatórias (Bogdan,
2001). Ormerod et al. (1999), estudando o efeito do NO em pele íntegra, observaram
que concentrações baixas desta molécula produziam efeitos pró-inflamatórios
32
acompanhados de aumento do número de células CD3, CD4, CD8 e CD68. Também as
células de Langerhans mostraram perda de suas projeções e migração para a derme. Já
as doses altas produziam um efeito inibitório com redução destes tipos celulares,
provavelmente devido à toxicidade desta molécula.
Os macrófagos são as principais células produtoras de NOS2 (Facchetti et al.,
1999), porém outros tipos celulares podem produzi-lo, como por exemplo, os linfócitos
T, fibroblastos, células dendríticas e células NK (Bogdan, 2001; Qadoumi et al., 2002).
Stenger et al. (1996), estudando a infecção por Leishmania major no modelo murino,
demonstraram a expressão de NOS2 no sítio original da lesão de pele e no linfonodo
satélite de camundongos C57BL/6 após longo tempo de infecção. Ao utilizar um
inibidor da NOS2 (L-N
6
-iminoethyl-lysine (L-NIL)), observaram um aumento da carga
parasitária e reativação da doença, sugerindo que a falha em manter a atividade de
NOS2 pode ser o mecanismo responsável pela reativação de infecções latentes durante
fases de imunossupressão. Os autores concluíram que a atividade de NOS2 é fator
determinante para o controle de parasitas que ainda persistam no hospedeiro
imunocompetente após a resolução da infecção primária. Além disso, efeitos protetores
do hospedeiro dependentes da expressão de NOS2 durante as doenças infecciosas
incluem a inibição da fibrose tecidual e o término da resposta imune pela apoptose de
células TCD4
+
ativadas (Bogdan, 2001).
Já foram identificadas mais de 30 citocinas que modulam a expressão de NOS2
no modelo murino: INF-γ e TNF-α induzem a sua expressão, enquanto IL-4, IL-10, IL-
13 e TGF-β a inibem (Bradonisio et al., 2001). Em humanos, a atividade de NOS2
aumenta após influência de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α, IL-1) e produtos
microbianos (Lipopolissacarídeo – LPS) (Facchetti et al., 1999). Por outro lado,
citocinas antiinflamatórias diminuem a sua expressão (IL-10 e IL-4) e a produção de
NO, como conseqüência inibe a eliminação de parasitas intracelulares em macrófagos
humanos infectados com L. major e L. infantum (Bradoniso et al., 2001). O nível de
expressão é controlado por vários fatores de transcrição incluindo NFκB, AP-1, STAT-
1α e IRF-1 (Bogdan, 2001).
NO por si só exerce um efeito duplo na transcrição de NOS2. Baixas
concentrações de NO (o que ocorre no início da estimulação de macrófagos pelas
citocinas) ativa NFk-β que regula positivamente a expressão de NOS2. Altas
33
concentrações produzem um efeito contrário, que pode ajudar a prevenir a produção
exacerbada de NO (Bogdan, 2001).
Segundo Qadoumi et al. (2002) a expressão de NOS2 é indispensável para a
resolução de infecções por Leishmania major e Leishmania donovani em camundongos.
Ao analisar biópsias de lesões de pele de pacientes com LCL ou LCD causadas por L.
mexicana observaram que a expressão de NOS2 nas lesões com menor carga parasitária
era muito maior do que naquelas lesões com alta carga parasitária. Baseados nestes
resultados sugeriram que o curso benigno da LCL seria resultado da alta expressão de
NOS2.
NOS2 é também expressa em um amplo espectro de doenças inflamatórias em
humanos. Esta enzima tem sido detectada em macrófagos alveolares de pacientes com
tuberculose pulmonar, córtex cerebral de pacientes aidéticos com demência severa, em
células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de pacientes com hepatite C e
malária, na pele de pacientes com lepra tuberculóide ou leishmaniose cutânea localizada
(Bogdan, 2001).
Diaz et al. (2005) analisaram a produção local de NOS2 e sua relação com a
expressão de citocinas TH1/TH2 em lesões de pacientes com LTA. Estes autores
observaram que existe um padrão funcional in situ para cada forma da doença. Na LCL
foi observada alta expressão de NOS2 e maior número de células IL-12
+
e IFN-γ
+
associados à resposta imune do tipo TH1, o que direciona para a cura das lesões. Por
outro lado, pacientes com LCD apresentaram menor expressão de NOS2 associada à
resposta do tipo TH2, com níveis aumentados de células IL-4
+
e IL-10
+
, que mantém
um estado tolerogênico incapaz de controlar a infecção, levando a disseminação do
parasita pela pele. Não foram encontradas referências a estudo de NOS2 em lesão
mucosa de LTA em atividade.
Elastase neutrofílica (Neutrófilos e precursores de neutrófilos)
Os neutrófilos estão envolvidos na resistência à leishmaniose cutânea no modelo
murino de infecção por L. major. Evidências mostram que estas células predominam
nas fases iniciais de infecção e seus números decrescem com a progressão da infecção.
A evidenciação de neutrófilos em áreas de destruição de parasitos e a redução deste tipo
34
celular contendo parasitas intracelulares com o decorrer da doença sugerem uma
importante função parasiticida durante a fase aguda de infecção (Pompeu et al., 1991).
Em trabalho posterior, foi evidenciado um intenso infiltrado de
polimorfonucleares, predominantemente neutrófilos, na derme de camundongos
BALB/C e C57BL/6 nas primeiras horas após a infecção por L. major. Estes neutrófilos
apresentaram um ou mais parasitas no interior de seus vacúolos citoplasmáticos. Com a
evolução, o quadro histopatológico mudava completamente, e os polimorfonucleares
passavam a ser raros e havia predominância de monócitos e macrófagos. A observação
de significante número de parasitas com diversos graus de degeneração no interior dos
neutrófilos, sugeriu que este tipo celular atuava de forma ativa na destruição de
parasitas. A depleção de neutrófilos murinos levou ao desenvolvimento de lesões mais
severas e aumento da carga parasitária no linfonodo drenante. Corroborando assim, a
idéia de que neutrófilos apresentam importante função como células efetoras da
imunidade inata, por serem responsáveis pela fagocitose e morte de parasitas na reação
inflamatória aguda, e pela redução da disseminação de parasitas para o linfonodo
drenante (Lima et al., 1998).
Segundo Venuprasad et al. (2003), o controle da infecção por neutrófilos é
mediado por alterações na função de células T. A ativação da molécula CD28 em
neutrófilos, após a interação com a molécula B7 de macrófagos, resultou na liberação de
IFN-γ. Como efeito da presença desta citocina, houve a restrição do crescimento
parasitário e a modulação da secreção de citocinas por células TCD4
+
, levando a alta
liberação de IFN-γ e menor expressão de IL-4. Assim, os neutrófilos foram capazes de
direcionar a resposta de células T para tipo 1, com conseqüente aumento da atividade
leishmanicida e controle da carga parasitária. Ribeiro-Gomes et al. (2004) evidenciaram
que interações entre macrófagos e neutrófilos mortos influenciavam de forma
importante a resposta hospedeira à infecção, podendo ser pró-inflamatória ou anti-
inflamatória dependendo da cepa de camundongo utilizada. Cepas susceptíveis
(BALB/C) apresentaram produção de TGF-β por macrófagos e alta carga parasitária.
Camundongos resistentes (C57BL/6) apresentaram produção de TNF-α e destruição
parasitária. Tacchini-Cottier et al. (2000) observaram que a depleção de neutrófilos de
camundongos BALB/C prevenia o pico recente de RNAm para IL-4 e era capaz de
35
inibir o desenvolvimento de células Th2. Em paralelo, havia a resolução da lesão e este
efeito protetor mostrava-se dependende de IL-12.
Alguns dados ainda são controversos: Zandbergen et al. (2004) observaram que
neutrófilos humanos obtidos de sangue periférico fagocitavam, porém não eram capazes
de eliminar o parasito. Estas células infectadas secretavam altos níveis de quimiocina
MIP-1β, que atraia os macrófagos. Os macrófagos rapidamente fagocitavam os
polimorfonucleares apópticos e infectados, o que resultava na liberação de TGF-β
(citocina anti-inflamatória). Assim, os parasitos internalizados eram capazes de
sobreviver e multiplicar nos macrófagos, utilizando os neutrófilos como um meio para
entrar silenciosamente em sua célula hospedeira final.
CD62E (E-selectina) e CLA (Antígeno associado a linfócito cutâneo)
Quando o antígeno é encontrado em um tecido específico, como
por exemplo, a pele, a ativação de células T no linfonodo satélite resulta na produção de
células efetoras antígeno específicas que expressam receptores de localização para
aquele sítio. Desta forma a resposta imune é direcionada para o sítio inicial de infecção
ou estímulo (Kupper & Fuhlbrigge, 2004).
As células T comprometidas com a migração para a pele são identificadas pela
expressão de um carboidrato de superfície celular denominado antígeno linfocitário
cutâneo (CLA). O CLA é ligante para E-selectina, que consiste em uma molécula de
adesão de endotélio induzida sob condições de inflamação por IL-1 e TNF-α (Teraki et
al., 2004). As selectinas são responsáveis pela adesão e rolamento, processo que permite
a captação de leucócitos circulantes pelas células endoteliais, juntamente pela ação de
quimiocinas e outras moléculas de adesão como ICAM-1. A interação entre CLA/E-
selectina, VLA-4/VCAM-1 e LFA-1/ICAM-1 são necessárias para a migração
transendotelial das células T CLA
+
circulantes (Santamaría-Babí, 2004).
CLA é expresso por aproximadamente 30% das células T de memória
circulantes e está ausente nas células T virgens. As células T encontradas nas lesões
inflamatórias de pele são principalmente CD45RO
+
CLA
+
, sendo poucas as células
acumuladas na pele inflamada que não expressam CLA
+
(Kupper & Fuhlbrigge, 2004).
36
A expressão desta molécula tem sido descrita em doenças alérgicas ou auto
imunes (Jung et al., 2002; Kupper & Fuhlbrigge, 2004), porém pouco tem sido relatado
quanto à influência destas células em doenças infecciosas.
FasL (CD95L) e Fas (CD95)
Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) promovem defesas potenciais contra a
infecção por vírus e patógenos intracelulares. Os CTLs podem eliminar a célula alvo
através da exocitose de grânulos (por ação de perforina e granzimas) ou através da via
Fas. A ligação entre o receptor Fas da célula-alvo e o FasL no CTL desencadeia reações
em cascata levando a ativação de caspases. Inicialmente ocorre a ativação da caspase-8,
que por sua vez é capaz de ativar diretamente outros membros da família de caspases,
como a caspase-3. Ou pode levar a clivagem de proteínas pro-apoptóticas da família
BCl-2 e a translocação do BID e BAX (moléculas envolvidas no processo de apoptose)
para a mitocôndria. Uma vez inseridas na membrana mitocondrial, BID e BAX induzem
a liberação do citocromo c, o que resulta na ativação da caspase-9. Assim a caspase-9 é
capaz de ativar a caspase-3. O resultado é a ativação de DFF40/CAD (fator de
fragmentação do DNA 40 / desoxinuclease ativada por caspase) que cliva o DNA
levando a morte celular (Barry e Bleackley, 2002). Este processo está esquematizado na
figura 1, adaptada de Barry e Bleackley, 2002.
Alguns trabalhos têm mostrado a influência da via Fas no desenvolvimento e
resolução de lesões estéreis (Guan et al., 2000) ou causadas por agentes infecciosos
(Oddo et al., 1998; Zenewicz et al., 2004; Mustafa et al., 2001; Mustafa et al., 2005).
Guan et al. (2000) observaram a importância da redução da celularidade, via Fas-FasL,
durante a cicatrização de lesões de pele em camundongos.
Conceição-Silva et al. (1998) evidenciaram que camundongos infectados por L.
major, deficientes de sistema Fas, não apresentavam a cicatrização de suas lesões.
Também observaram que a administração de FasL recombinante, aos camundongos
deficientes deste indutor, resultava na resolução das lesões cutâneas demonstrando a
importância desta via na eliminação de parasitas. Ainda observaram que os macrófagos
infectados in vitro aumentavam a expressão de Fas em resposta ao IFN-γ, tornando-se
suscetíveis a apoptose induzida por células TCD4
+
.
37
Figura 1. Ligação do receptor Fas (CD95) presente na célula alvo e FasL expresso pelo CTL result
a
na morte induzida por apoptose. A estimulação do receptor Fas resulta no recrutamento e artivação
da caspase iniciadora (caspase-8) através da interação com a molécula adaptora FADD (proteín
a
domínio de morte associada ao Fas). A caspase-8 pode ativar diretamente outros membros d
a
família das caspases, como por exemplo a caspase-3. Por outro lado, a ativação da caspase-8 result
a
na clivagem da molécula pró-apoptótica BID (membro da família BCl-2) e translocação do BID e
BAX para a mitocôndria. Uma vez inseridos na mitocôndria, BID e BAX induzem a liberação do
citocromo c mitocondrial, o que resulta na ativação da caspase-9. Daí a caspase-9 é capaz de ativa
r
a caspase-3.
Linfócito citotóxico
Célula- alvo
38
Ki67 (Proliferação celular) e BCl-2 (Inibição da apoptose)
Ki67 consiste em uma proteína nuclear expressa em células em proliferação e
ausente em células em repouso (G
0
) (Sawhney e Hall, 1992). Muito tem sido descrito
quanto à utilização deste marcador como prognóstico (Pich et al., 2004; Diest et al.,
2006) ou diagnóstico diferencial para afecções cancerosas (Kaplan et al., 2005). Porém
são raros os trabalhos com foco em doenças infecciosas, e nenhum sobre leishmaniose.
Os membros da família BCl-2 formam um grupo de fatores regulatórios da
apoptose. Eles podem ser pró-apoptóticos (BID, BAX) ou anti-apoptóticos (BCl-2, BCl-
w). Estas proteínas anti-apoptóticas podem ligar-se à conformação ativa do BAX para
prevenir a sua inserção na membrana mitocondrial externa, mantendo assim a
permeabilidade normal e prevenindo a liberação de fatores pró-apoptóticos
mitocondriais como o citocromo c. Desta forma, as proteínas da família BCl-2 podem,
indiretamente, regular a atividade de caspases (Fan et al., 2005).
Orteu et al. (1998) estudaram a reação de hipersensibilidade tardia provocada
por PPD e acompanharam a expressão destes dois marcadores, entre outros.
Observaram que nesta reação, a geração de resposta envolve não apenas o recrutamento,
mas também a proliferação de células T, enquanto a resolução ocorre em parte pela
indução de apoptose das células T infiltrantes. Eles sugeriram que as fases proliferativas
e de resolução da resposta parecem ser controladas por diferentes níveis do mesmo
grupo de citocinas (IL-15, IL-2, TNF-α), cuja presença promoveria a proliferação, e a
ausência destes mediadores levaria a apoptose. A não regulação da apoptose de células
T poderia contribuir para a cronicidade da inflamação de doenças cutâneas.
Estes resultados demonstram a potencialidade do estudo de marcadores de
atividade inflamatória in situ que podem ser de grande valia na compreensão da
dinâmica da relação parasito-hospedeiro no processo imunopatológico da LTA.
39
JUSTIFICATIVAS
Apesar dos dados já obtidos, ainda não foi possível caracterizar de forma
sistemática a correlação/associação da presença e concentração de determinados tipos
celulares e seus produtos com a apresentação clínica, tempo de lesão e, principalmente,
com a resposta à terapêutica. Além disto, o estudo longitudinal (lesão X cicatriz) num
mesmo paciente pode indicar quadros imunopatológicos que a médio prazo poderiam
servir como indicativos de atividade residual nas lesões. Assim, estudar num mesmo
paciente a lesão ativa e a cicatriz e correlacionar os achados com o tipo e tempo de
evolução das lesões, o tempo de cicatrização e a resposta à terapêutica, poderia trazer
subsídeos que permitissem entender os mecanismos de reativação e/ou resistência ao
tratamento observado nesta patologia. Em adição, verificar e comparar o tipo e a
intensidade da resposta imune celular tanto no compartimento periférico quanto no sítio
das lesões em vários tempos no mesmo paciente e em grupos com características
clínicas comuns, poderia auxiliar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas,
assim como uma nova dinâmica de acompanhamento dos casos de LTA.
O estudo sistemático e comparativo da resposta imune celular tanto in vitro, a
partir de células de sangue periférico, quanto in situ poderia contribuir para o melhor
conhecimento do desenvolvimento desta e de outras lesões tegumentares, levando à
formulação de novas estratégias terapêuticas, profiláticas e prognósticas no campo da
dermatologia infecciosa.
Dentro deste conceito, podemos incluir a LTA cuja variedade de apresentações
clínicas e tipos de evolução parecem ser a resultante da associação do tipo de parasito
envolvido e da reposta imune do indivíduo infectado. Em particular, alguns pontos
relacionados ao aparecimento de lesões secundárias mucosas, a recidiva precoce em
lesões cutâneas e a resistência ao tratamento específico permanecem não esclarecidos.
Por exemplo, não é sabido se a disseminação parasitária é precoce ou tardia, se a
persistência parasitária é fenômeno generalizado ou não; se a persistência parasitária é
capaz de manter certo grau de imunidade e se esta imunidade é benéfica ou deletéria etc.
Assim, aprofundar o conhecimento sobre o processo inflamatório envolvido na
evolução de LTA pode propiciar a organização de um painel com características
imunopatológicas preditivas ou não de determinadas formas de evolução. Estas
40
características poderiam então propiciar novas abordagens para a modulação da resposta
imune do paciente em direção à cura das lesões e a prevenção de complicações precoces
ou tardias.
41
OBJETIVOS
Objetivo geral
Entender alguns aspectos da dinâmica do processo inflamatório e de cicatrização
na Leishmaniose Tegumentar Americana.
Objetivos específicos
Os objetivos específicos do estudo são:
1. Evidenciar modificações do processo inflamatório de acordo com o tempo
de evolução e outros parâmetros clínicos;
2. Comparar características celulares e de arquitetura da lesão ativa e cicatriz
em um mesmo paciente, correlacionando os achados com tipo de evolução,
resposta à terapêutica e tempo de cicatrização;
3. Avaliar a resposta imunológica sistêmica após tempos determinados de
cicatrização, utilizando o ensaio de linfoproliferação, e realizar a
caracterização fenotípica das células respondedoras pela análise em
citômetro de fluxo.
42
CASUÍSTICA
Pacientes com diagnóstico de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
confirmado pela evidenciação do parasito foram estudados em dois momentos (lesão
ativa e cicatriz). As lesões ativas foram estudadas em conjunto e depois agrupadas de
acordo com o tempo de evolução (recentes ou tardias). Quanto às cicatrizes, os
pacientes foram organizados de acordo com o tempo de cicatrização (menor que 1 ano e
maior que 3 anos). Além destas biópsias, foram coletadas amostras de pele sadia
contralateral às ciatrizes em todos os pacientes que concordaram com o procedimento.
A casuística foi composta de pacientes estudados em dois tempos: 1- com lesão ativa e
2- curados, que aceitaram participar do projeto após a leitura, compreensão e assinatura
do “termo de consentimento livre e esclarecido” (anexos 1 e 2) (protocolos n° 014/2002
e 0016.0.009-02, no presente formato este estudo foi revalidado pelo CEP-IPEC com o
número 0047.0.011.009-06). Foram formados 4 grupos, com 6 a 13 pacientes cada, a
saber:
1. lesão cutânea ativa recente (evolução < 2 meses, n = 13),
2. lesão cutânea ativa tardia (evolução > 4 meses, n = 6),
3. cicatriz recente + pele sadia contra-lateral (± 1 ano de cura clínica, n = 9),
4. cicatriz tardia + pele sadia contra-lateral (maior que 3 anos, n = 9).
Foi adotado como critério de exclusão do presente estudo, os extremos de idade
(pacientes com menos de 15 anos e com mais de 70 anos), a concomitância de
patologias/tratamentos imunossupressores, tamanho das lesões ativas (nas muito
pequenas houve prioridade para os fragmentos destinados ao diagnóstico),
alteração/ausência de níveis de compreensão necessários à assinatura do termo de
consentimento. No caso particular de cicatrizes foram excluídas aquelas com
localização em face e em áreas de difícil manuseio como mãos e pés.
43
CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A aprovação do projeto está inserida no protocolo 014/2002 coordenado pela
Dra Fátima da Conceição-Silva. Não houve mudança de método ou questionamento
que pudesse caracterizar uso de amostra para outros fins que o aprovado no projeto
014/2002. Os pacientes curados foram contatados e após esclarecimento e aceitação
(protocolo número 0016.0.009-02 coordenado pelo Dr Armando Schubach) assinaram o
termo de consentimento, sendo realizada então biópsia da área de cicatriz e de pele
sadia contralateral. De acordo com a sugestão da Coordenação de Ensino o projeto foi
submetido ao CEP-IPEC, tendo sido aprovado sob número de protocolo
0047.0.011.009-06.
44
METODOLOGIA
1. Coleta de material biológico
As biópsias de lesão ativa foram coletadas no momento do diagnóstico de
pacientes atendidos no ambulatório de Leishmaniose Tegumentar Americana
coordenado pelo Dr Armando Schubach, localizado no IPEC / FIOCRUZ e
armazenadas em nitrogênio líquido no Laboratório de Imunoparasitologia, IOC -
FIOCRUZ. As biópsias de cicatriz e pele sadia contralateral foram realizadas após a
assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (protocolo 0016.0.009-02).
Dependendo do local e da extensão da lesão/cicatriz, fragmentos de diferentes tamanhos
foram obtidos (punch descartável de 3 a 6 mm).
Além da biópsia, foram coletados 10 ml de sangue periférico heparinizado para a
realização de ensaio de Resposta Proliferativa Linfocitária (RPL), perfil de citocinas por
ELISA e caracterização fenotípica a partir da marcação com anticorpos monoclonais
para análise em citômetro de fluxo.
2. Preparação dos fragmentos teciduais
Biópsias com tamanho variável (punch 3 a 6mm) foram obtidas pelo médico
responsável após assepsia, antissepsia e anestesia local com lidocaína 2%. Parte deste
material foi destinado aos testes diagnósticos (culturas e histopatologia) e um fragmento
foi utilizado para o estudo.
O tecido para estudo foi mergulhado em resina OCT (Tissue-Tek, Sakura),
congelado à –70°C e posteriormente armazenado à –196°C. Para análise do material
foram realizados cortes com 3 µm de espessura utilizando-se para tal aparelho de
criostato (Leica, Germany). Os cortes foram apostos em lâminas de microscopia
(silanized slides, DakoCytomation, Carpinteria, Clostrup, Denmark) e fixados em
acetona PA (Merck, Darmstadt, Germany). As lâminas fixadas podiam ser utilizadas
imediatamente, ou então armazenadas à –70ºC.
O procedimento foi o mesmo para fragmentos de lesões ativas, cicatrizes ou pele
sadia.
45
3. Histopatologia
Fragmentos fixados em formalina foram corados por HE e examinados por
microscopia óptica (Zeiss, Alemanha). Além da descrição topográfica, foram
consideradas as alterações em epiderme (hiperplasia escamosa pseudoepiteliomatosa,
acantose, hiperqueratose) e derme (fibrose, neoformação vascular). A intensidade de
infiltrado inflamatório foi analisada em uma escala variando de discreto, moderado, a
intenso. Os resultados foram obtidos com o auxílio do médico patologista Leonardo
Quintella (IPEC-FIOCRUZ).
4. Imunohistoquímica
Cortes com 3µm de espessura dos fragmentos congelados foram apostos em
lâminas de microscopia (Silanized Slides, DakoCytomation), fixados em acetona PA
(Merck KgaA, Darmstadt, Germany) e hidratados em PBS pH 7.4. Foi feito o bloqueio
de reações inespecíficas com soro de cabra normal (Zymed Laboratories Inc., San
Francisco, U.S.A.), e em seguida, incubação com os anticorpos primários anti-CD3,
anti- CD4, anti-CD8, anti-CD22 (linfócitos B), anti-CD1a (células de Langerhans), anti-
DC (células dentríticas foliculares), anti-CD62E (E-selectina), anti-BCl2, anti-KI67
(marcador de proliferação celular), anti-elastase neutrofílica, anti-CD68 (macrófago)
(DakoCytomation); anti-NOS2 (óxido nítrico sintase do tipo 2) (BD Transduction
Laboratories, Lexington, KY), anti-CLA (cutaneous lymphocyte antigen), anti-Fas, anti-
FasL (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, U.S.A.). Para a detecção de parasitos
foi utilizado soro policlonal de coelho anti-Leishmania braziliensis, gentilmente cedido
pela Dra Maria de Fátima Madeira (IPEC-FIOCRUZ). As estapas subseqüentes
consistiram na incubação com anticorpo secundário biotinilado (Zymed Laboratories
Inc., San Francisco, U.S.A) e complexo streptavidina-biotina peroxidase (Kit ABC
DakoCytomation). O sistema substrato-cromógeno usado foi aminoethyl carbazole (Kit
AEC) e a contracoloração foi feita com Hematoxilina de Mayer (Dako). A leitura das
lâminas em microscópio óptico (Zeiss, Germany) se deu pela contagem percentual das
células marcadas, utilizando-se como padrão a contagem de 500 células.
Alternativamente, utilizou-se a contagem de células/mm
2
de tecido. A intensidade das
46
marcações de NOS2 e E-selectina foi determinada da seguinte forma: discreto (1 sítio
positivo por campo 200x), moderado (2 a 3 sítios positivos por campo), intenso (3 a 4
sítios positivos por campo) e muito intenso (5 ou mais sítios positivos por campo).
47
Tabela 1. Marcadores estudados.
Anticorpo Descrição Marca Diluições
Anti-CD3 Clone UCHT1. Reconhecimento de células T. Dako 1:100
Anti-CD4 Clone MT310. Reconhecimento de linfócitos T
auxiliares e indutores.
Dako 1:100
Anti-CD8 Clone DK25. Reconhecimento de linfócitos T
supressores e citotóxicos.
Dako 1:100
Anti-CD22 Clone 4KB128. Reconhecimento de linfócitos B. Dako 1:100
Anti-CD1a Clone NA1/34. Reconhecimento de células de
Langerhans e timócitos corticais.
Dako 1:100
Anti-FDC Clone CNA.42. Reconhecimento de células
dendríticas foliculares, timócitos corticais e
raramente mastócitos.
Dako 1:100
Anti-CD68 Clone KP1. Reconhecimento de macrófagos
teciduais, precursores mielóides e granulócitos de
sangue periférico.
Dako 1:300
Anti-elastase
neutrofílica
Clone NP57. Reconhecimento de neutrófilos
teciduais.
Dako 1:200
Anti-NOS2 Clone 6. Reconhecimento da enzima óxido nítrico
sintase induzida.
BD
Transduction
1:100
Anti-E-selectina Clone 1.2B6. Reconhecimento de E-selectina
expressa em célula endotelial ativada.
Dako 1:100
Anti-CLA Clone HECA-452. Reconhecimento do antígeno
associado a linfócito cutâneo.
BD
Pharmingen
1:100
Anti-Ki67 Clone Ki-S5. Reconhecimento da proteína nuclear
Ki-67 presente em células em proliferação.
Dako 1:100
Anti-BCL2 Clone 124. Reconhecimento da oncoproteína BCL2
que apresenta função central na inibição da
apoptose.
Dako 1:50
Anti-Fas Clone DX2. Reconhecimento da molécula de
superfície celular CD95, expressa em uma grande
variedade de células normais e neoplásicas. Está
envolvida nos eventos iniciais da apoptose.
BD
Pharmingen
1:50
Anti-FasL Clone G247-4. Reconhecimento do ligante para Fas,
expresso em células T ativadas, células NK e sítios
imunologicamente privilegiados.
BD
Pharmingen
1:50
48
5. Produção de antígenos de Leishmania (Lb-Ag) e Toxoplasma gondii (Tx-Ag)
Formas promastigotas de Leishmania braziliensis (MHOM/BR/1999/RVSB)
foram cultivadas em meio Schneider's Drosophila Medium (Gibco, Grand Island, N.Y.,
U.S.A.) suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e L-glutamina (Sigma,
U.S.A.). Após expansão, a massa parasitária foi submetida a lavagens seriadas com PBS
e ajustada para 10
8
parasitos/mL. Em seguida, foi feita a quebra por 10 ciclos de
congelamento (-196ºC) / descongelamento (37ºC), e sonicação em alta freqüência
(sonicador Lab-line Ultratip, Lab-Line instruments, Melrose Park, Illinois, U.S.A.). Os
antígenos preparados foram aliqüotados e mantidos congelados (-20°C) até o momento
do uso.
Parasitos da espécie Toxoplasma gondii (Tx-Ag) foram mantidos em passagens
seriadas em cavidade peritoneal de camundongos Swiss-webster (clearance n°
P0227/04). O líquido ascítico foi coletado no 4° dia de infecção. A massa parasitária foi
preparada como descrito para o Lb-Ag.
6. Resposta proliferativa primária (RPL)
A amostra de sangue periférico foi submetida ao gradiente de Ficoll-paque
(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) (Mendonça et al., 1986). Após isolamento e
lavagens seriadas, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram
cultivadas em placas de microtitulação de 96 poços de fundo chato (TPP,
Switzwerland), na concentração 4 x 10
5
células por poço. As culturas foram feitas em
triplicata na presença de Lb-Ag na concentração equivalente a 10
6
parasitos/poço. Os
cultivos na presença de concanavalina A (ConA - 4µg/ml - Sigma) e Tx-Ag 10
6
parasitos/poço (cepa RH) foram utilizados como controle do experimento. As placas
foram incubadas em estufa 37ºC, atmosfera úmida e 5% de CO
2
durante 5 dias. Nas
últimas 8-20 horas do período de incubação foi adicionado 0,5µCi de Timidina triciada
(Amershan LifeScience, UK) por poço da placa. A detecção da incorporação de
Timidina triciada foi feita em aparelho contador de emissão radioativa tipo Beta
(Packard, Canberra Company), e o índice de estimulação (SI) foi calculado dividindo-se
49
a média das contagens por minuto (cpm) dos poços em teste, pela média dos poços
negativos (cultivados na ausência de antígenos). Foram considerados positivos SI ≥ 2,5.
Poços adicionais com ou sem antígeno foram usados para obtenção de células e
sobrenadantes para estudo.
7. Citometria de fluxo
As células presentes nos poços adicionais das culturas, na presença do Lb-Ag,
foram coletadas no 5° dia de cultivo e submetidas à centrifugação a 2000 RPM durante
5 minutos. O sobrenadante foi separado para estocagem. As células do sedimento foram
então lavadas com PBS-azida (PBS + 2% soro fetal bovino e 0,01g de azida sódica -
Sigma) por duas vezes nas mesmas condições de centrifugação descritas anteriormente.
As células foram incubadas na presença de anticorpos anti-CD4 – FITC, anti-CD8 – PE
e anti-CD3 – PE – CY5 (Immunotech, France) durante 30 minutos a 4°C. Após o
período de incubação, foram lavadas novamente em PBS-azida e ressuspensas em PBS-
formol 1%. As análises foram realizadas em aparelho FACS (Coulter BD) pelo
pesquisador responsável, Dr Álvaro Bertho.
8. Análise estatística
Os dados clínicos foram obtidos do prontuário de atendimento e discutidos com
o médico responsável, mantendo-se a cláusula de sigilo (anexo 3).
Foi utilizado o programa SPSS para Windows versão 11 (SPSS Inc.). Foram
realizados os testes não-paramétricos de Mean-Whitney e Willcoxon, para amostras não
relacionadas e relacionadas, respectivamente. Também foi feita a análise de correlação
por Postos de Spearman. Os dados são apresentados em distribuição como média ±
SEM. Os resultados não numéricos foram analisados em tabelas de contingência 2 x 2
através do teste exato de Fischer do programa INSTAT (Graphpad Software V2-04
Graphpad Instat TM).
50
RESULTADOS
Caracterização do grupo
Foram estudados 19 pacientes apresentando lesão cutânea de leishmaniose
tegumentar americana, 6 do sexo feminino (31,6%) e 13 do sexo masculino (68,4%),
com idade entre 18 e 69 anos (média 41,95 ± 3,39). Os pacientes apresentavam de 1 a 6
lesões (média 1,63 ± 0,29) localizadas com maior freqüência em membros (superiores
12 lesões – 38,7%; e inferiores 8 lesões – 25,8%), mas também presentes em tronco (8
lesões – 25,8%) e face (3 lesões – 9,7%). A IDRM foi positiva em 94,12% dos casos
com área de induração de 1,5 a 31mm. Em todos os 19 casos o diagnóstico foi
confirmado por visualização do parasito (cultura, imprint e/ou histopatologia). Quanto à
evolução da doença, 6 pacientes apresentavam mais que quatro meses de evolução, e os
13 restantes apresentavam menos que dois meses.
Dezoito dos 19 pacientes com lesão ativa foram também avaliados após a
cicatrização e divididos em dois grupos de acordo com o tempo de cura das lesões: 1-
cicatrizes recentes (1 ano de cura clínica; n = 9); 2- cicatrizes tardias (3 anos de cura
clínica; n = 9). De cada um deles, foi também obtida amostra de pele sadia contralateral
à localização da cicatriz (n = 18). Apenas 5 eram do sexo feminino (27,7%) e 13 do
sexo masculino (72,3%). Uma paciente do sexo feminino, examinada na época de lesão
ativa, não participou desta fase do estudo. As cicatrizes biopsiadas estavam localizadas
em membros (superiores 44,44% e inferiores 38,89%) e tronco (16,67%).
A IDRM após a cura clínica foi realizada em 15 pacientes. Apenas 2
apresentaram IDRM < 5 mm (1 de cada grupo de estudo) sendo que, um destes
pacientes não tinha registro de realização de IDRM quando em lesão em atividade e o
segundo apresentava na época (2 meses de evolução) IDRM positiva de 7 mm. O
restante apresentou diâmetro de induração variando de 8 a 40 mm (média 21,17 ± 2,9).
Não houve diferença de intensidade de IDRM se comparado àquela obtida quando em
lesão em atividade (p = 0,666), e nem entre 1 ano e 3 anos de cura clínica (p = 0,948).
Em nenhum dos casos de cicatriz estudados foi possível o isolamento de parasitos,
assim como não houve a visualização de formas amastigotas através da histopatologia.
51
Histopatologia
O estudo histológico das lesões em atividade foi realizado em todos os pacientes
(tabela 2). O exame microscópico das lesões evidenciou presença de infiltrado
inflamatório com predominância de células mononucleares. O infiltrado inflamatório
mostrou-se intenso em 14 casos e discreto a moderado em 5 casos, não havendo
correlação com tempo de evolução (p = 1,0). Em geral havia a formação de esboços de
granulomas (15 casos), mas em 4 casos o infiltrado apresentava-se difuso e multifocal.
Era freqüente a presença de reações na epiderme como, acantose (6 biopsias),
hiperqueratose (5 biopsias) e hiperplasia escamosa pseudoepiteliomatosa (8 biopsias).
Acantose e hiperqueratose eram alterações na maioria das vezes associadas podendo ser
observadas em lesões com intensidade de infiltrado variáveis. Por outro lado, a
hiperplasia escamosa pseudoepiteliomatosa só podia ser observada nas lesões com
infiltrado intenso. Cinco dos 19 pacientes apresentavam ainda depósito fibrinóide (4
casos) e neoformação vascular (3 casos) na derme, também associadas às lesões com
infiltrado intenso. Não houve correlação destas alterações com tempo de evolução (p =
1,0; p = 0,27 e p = 1,0; respectivamente).
O estudo histológico das cicatrizes foi realizado em todos os pacientes. Em geral
as cicatrizes mostraram ninhos de células em meio à intensa fibrose dérmica ou em
torno de vasos sanguíneos e anexos cutâneos (glândulas, ductos glandulares e folículos
pilosos). Estes grupos de células estavam mais concentrados em derme papilar e em
média eram constituídos de 49,02 ± 4,90 e 38,87 ± 3,49 células nas cicatrizes com 1 ano
e 3 anos de cura clínica, respectivamente. Em 3 casos foi possível observar infiltrado
inflamatório discreto a moderado (tabela 3). Destes, 2 pacientes pertenciam ao grupo
com 1 ano de cura clínica, e o terceiro apresentava 3 anos de cura. Não foi verificada
diferença de intensidade de infiltrado do tipo inflamatório entre cicatrizes com 1 e 3
anos de cura clínica (p = 0,346) e entre cicatrizes e suas respectivas peles sadias
contralaterais, que não apresentaram diferenças apreciáveis no estudo histopatológico (p
= 0,225; p = 0,715). Porém, observamos uma redução marcante de intensidade nas
lesões cicatrizadas de 1 e 3 anos respectivamente, quando comparado ao infiltrado
inflamatório presente nas lesões ativas (p = 0,021; p = 0,028) (tabela 3). O infiltrado
52
antes difuso e ocupando grande parte da derme, em cicatrizes foi reduzido a ninhos de
células bem delimitados.
53
Tabela 2. Histopatologia das lesões de LTA de acordo com as características principais
evidenciadas nos cortes corados por HE.
Lesão ativa
Infiltrado Inflamatório
Discreto Moderado Intenso
N° de pacientes 2 3 14
Organização do infiltrado inflamatório
Difuso Esboço de granuloma
N° de pacientes 4 15
Reações em epiderme
Acantose Hiperqueratose Hiperplasia escamosa
pseudoepiteliomatosa
N° de pacientes 6 5 8
Alterações em derme
Depósito fibrinóide Neoformação vascular
N° de pacientes 4 3
Tabela 3. Análise quantitativa e qualitativa do infiltrado inflamatório presente nas lesões
ativas, cicatrizes e peles sadias contralaterais.
Intensidade de infiltrado inflamatório
Média ± SEM S/ alterações Discreto Moderado Intenso
Lesão ativa
1394,89 ± 206,68 0 2 3 14
Cicatriz 1 ano
254,52 ± 55,92 7 1 1 0
Cicatriz 3 anos
204,96 ± 81,08 8 1 0 0
Peles sadias
152,44 ± 24,36 19 0 0 0
54
IMUNOHISTOQUÍMICA – LESÕES ATIVAS
Os resultados estão apresentados na tabela 4 e 5.
1. Perfil quantitativo e qualitativo de macrófagos, linfócitos e neutrófilos (figura 2)
Os macrófagos CD68
+
eram muito freqüentes (45,77% ± 1,44), e apresentavam
uma distribuição homogênea por todo o infiltrado presente na derme. Era comum a
observação de células positivamente marcadas na epiderme. Foi verificada correlação
entre tempo de evolução e percentual de macrófagos (r = 0,638; p = 0,004 ; < 2meses =
43,57% ± 1,55 ; > 4meses = 51,5% ± 1,23). Não houve diferença no padrão de
distribuição entre os dois grupos.
Os linfócitos T CD3
+
(54,85% ± 2,62) e suas subpopulações podiam ser
encontrados na epiderme, principalmente nas camadas basais. Além da epiderme os
linfócitos T eram detectados por toda a derme de forma difusa ou formando focos, além
de serem vistos no interior de vasos e/ou justapostos ao endotélio. Não foi observada
correlação com tempo de evolução, número de lesões ou teste de Montenegro (valores
indicados no tópico caracterização do grupo). As células CD4
+
constituíam em média
40,65% ± 3,08 do infiltrado e apresentavam distribuição homogênea por toda a derme
além de estarem presentes na epiderme subjacente. Foi verificado o aumento da
concentração de células TCD4
+
de acordo com o tempo de evolução das lesões (<
2meses = 36,32% ± 3,42 ; >4meses = 49,32% ± 4,75; p = 0,039). Houve correlação
positiva entre tempo de evolução e percentual de CD4
+
(r = 0,643; p = 0,004). Não foi
observada correlação com os demais parâmetros.
As células CD8
+
constituíam em média 34,5% ± 2,04 e apresentavam
distribuição heterogênea, com áreas de marcação mais freqüente do que outras, em meio
ao infiltrado inflamatório presente em derme. Apesar de não significativa, foi observada
uma tendência à redução da concentração de células TCD8
+
de acordo com o tempo de
evolução (< 2 meses = 36,5 ± 2,5 ; > 4 meses = 30,2 ± 3,3 p = 0,188) (tabela 4). Não
houve correlação com tempo de evolução e nem com os demais parâmetros.
A razão CD4/CD8 variou de 0,5 a 1,62 (média 0,97 ± 0,08) nas lesões com
menos de 2 meses de evolução. Nas lesões com mais de 4 meses de evolução, esta razão
variou de 1,34 a 2,20 (média 1,68 ± 0,13). A diferença entre estas razões foi significante
(p = 0,012) (tabela 4).
55
Figura 2. Lesão ativa: (a) células T CD3
+
, (b) células T CD4
+
, (c) células T CD8
+
, (d)
células B, (e) neutrófilos, (f) células de Langerhans. As células consideradas positivas
apresentam coloração castanha-avermelhada de intensidade e distribuição variáveis,
na dependência do marcador utilizado. O tecido foi contracorado com hematoxilina de
Meyer que produz coloração azul-acastanhada. As setas exemplificam algumas das
células positivas. Aumento 200x.
A
B
C
D
E
F
56
Nas lesões tardias observamos uma concentração dos focos inflamatórios em
meio a extensas áreas de fibrose. Como havia a possibilidade do aumento da proporção
CD4/CD8 ser devido a este tipo de distribuição, analisamos no mesmo tecido a
proporção CD4/CD8 em dois focos distintos: um com maior quantidade de células
inflamatórias e outro com menor quantidade. Tanto em lesões recentes quanto tardias, a
razão CD4/CD8 observada em áreas focais ou difusas de infiltrado inflamatório foram
semelhantes (lesões tardias: média CD4/CD8 = foco 1,69 ± 0,27, infiltrado 1,68 ± 0,13;
e lesões recentes: média CD4/CD8 = foco 0,78 ± 0,02, infiltrado 0,97 ± 0,08).
A quantidade de células B CD22
+
variou de 0 a 46% (média 13,8% ± 4,8). Estas
células apresentaram um padrão de distribuição heterogêneo formando grupos pequenos
de células em meio ao infiltrado inflamatório. Não foi observada correlação com os
parâmetros estudados, inclusive tempo de evolução.
Os neutrófilos apresentaram um padrão de distribuição heterogêneo variando de
1,3 a 37,7% (média 15,3% ± 3,5). Nos cortes com marcação mais freqüente, estas
células mostraram-se presentes em áreas de intensa necrose em meio a depósito
fibrinóide. Nos demais, os neutrófilos apresentavam-se isolados em meio ao infiltrado,
algumas vezes apenas no interior de vaso. Foi observada também uma diferença na
morfologia das células: nos cortes com menos neutrófilos, estes se encontravam bem
compactados enquanto que naqueles com maior quantidade, este tipo celular mostrava-
se com maior tamanho e conteúdo citoplasmático. Apesar de não haver diferença
significativa, foi observado uma redução nos valores de neutrófilos de acordo com o
tempo de evolução (< 2meses = 18,5% ± 4,5 ; >4meses = 7,9% ± 3,8; p = 0,123). Não
foi observada correlação com os demais parâmetros estudados.
2. Distribuição e perfil quantitativo de células de Langerhans e células dendríticas
foliculares (tabela 4 e figura 2).
Células de Langerhans CD1a
+
foram observadas na epiderme (média 40,3 ± 10,5 /
mm
2
) formando, com suas projeções, uma rede. A derme também apresentava células
positivas (6,1/mm2 ± 1,12), limitada à derme papilar. Em algumas lesões, foi possível
visualizar células positivas enfileiradas na epiderme e derme, assim como entre as
células endoteliais e no interior de vasos. Já as células dendríticas foliculares estavam
57
ausentes em epiderme, e presentes por toda a derme (3,6% ± 0,99; 11,88/mm2 ± 2,92),
como células isoladas em meio ao infiltrado inflamatório, inclusive em derme reticular.
Era possível visualizá-las, assim como as células CD1a
+
, no interior de vasos. Estas
células apresentavam-se mais arredondadas quando comparadas às células CD1a
+
. Não
houve correlação com os parâmetros estudados.
58
Tabela 4. Contagem percentual e por mm
2
dos marcadores estudados nos sítios das
lesões cutâneas de LTA em relação ao tempo de evolução
Marcadores celulares < 2 meses (%) (cels/mm2) > 4 meses (%) (cels/mm2)
MO * 43,56 ± 1,55 51,5 ± 1,2
(769,38 ± 193,54) (828,25 ± 171,75)
CD3 53,63 ± 3,19 57,08 ± 4,84
(610,3 ± 125,67) (750,87 ± 209,03)
CD4 ** 36,32 ± 3,43 49,32 ± 4,75
(522,6 ± 124,68) (796,75 ± 259,70)
CD8 36,48 ± 2,45 30,18 ± 3,26
(528,21 ± 105,47) (419,91 ± 107,00)
CD4/CD8 *** 0,97 ± 0,08 1,68 ± 0,13
CD22 11,24 ± 7,14 16,92 ± 6,93
(26,1 ± 15,53) (139,77 ± 88,98)
Neutrófilos 18,52 ± 4,48
(164,96 ± 46,39)
7,93 ± 3,78
(55,65 ± 18,83)
DC 4,11 ± 1,4 2,3 ± 0,65
(13,00 ± 4,04) (9,87 ± 4,12)
CD1a ND ND
(5,7 ± 1,29) (6,9 ± 2,4)
CLA 32,45 ± 3,6 27,93 ± 3,49
289,77 ± 61,60 198,08 ± 86,94
KI67 12,66 ± 1,6 8,87 ± 1,73
(90,11 ± 14,06) (110,60 ± 35,84)
BCl2 38,18 ± 2,94
(658,54 ± 211,00)
39,37 ± 10,14
(565,33 ± 255,74)
Fas 49,97 ± 5,4
(726,05 ± 170,69)
59,45 ± 9,01
(759,38 ± 240,63)
FasL 22,5 ± 2,84
(134,09 ± 49,38)
23,88 ± 2,49
(325,67 ± 140,1)
• *p = 0,004 **p = 0,039 ***p = 0,002
59
3. Marcadores de inflamação – (figura 3)
O percentual de células CLA
+
variou de 9,4 a 55,1% (média: 31,02% ± 2,69),
apresentando uma distribuição heterogênea pelo infiltrado inflamatório presente em
derme (tabela 4). No entanto, pôde-se freqüentemente observar células CLA
+
próximas
ou na luz de vasos. Houve correlação positiva entre a expressão de CLA e células T
CD3
+
(r = 0,638; p = 0,026), células T CD4
+
(r = 0,641; p = 0,014) e células T CD8
+
(r
= 0,710; p = 0,003).
Foram encontrados 5,1 a 24% (média 11,5% ± 1,26) de células Ki67
+
,
distribuídas de forma homogênea na derme por todo infiltrado inflamatório. A
membrana basal apresentava positividade em todas as lesões, sendo que em algumas,
esta marcação se estendia até camadas superiores da epiderme. Houve tendência de
correlação entre a expressão de Ki67 e a concentração de CD4 (r = 0,537; p = 0,058).
Não houve correlação com o tempo de evolução ou outros parâmetros.
Foi possível detectar a presença de NOS2 em todas as lesões com intensidade e
distribuição variável (tabela 5), desde pequenos grupos de células (discreto) até
distribuição difusa abrangendo todo ou grande parte do tecido (muito intenso). Houve
correlação positiva entre intensidade de NOS2 e quantidade de células T CD3
+
(or=
20,000; p = 0,03). Não houve correlação com tempo de evolução (tabela 5) ou outros
parâmetros.
Células endoteliais expressando E-selectina (CD62-E) foram observadas em
todas as lesões estudadas. A distribuição dos vasos sangüíneos positivos e a intensidade
de marcação variaram como demonstrado na tabela 5. Na figura 4 observa-se a
distribuição heterogênea de vasos ativados: foi possível observar em um mesmo campo
vasos ativados e não ativados em proximidade. Não houve correlação com intensidade
de infiltrado, tempo de evolução ou intensidade dos tipos celulares estudados (tabela 3).
As células BCl-2
+
apresentaram distribuição heterogênea, variando de 6,7 a
68,4% (média 38,6 ± 3,6%). Houve correlação positiva entre as expressões de BCl-2 e
KI67 (r = 0,900; p = 0,037), células T CD3
+
(r = 0,532; p = 0,028), células T CD4
+
(r =
0,546; p = 0,019) e células T CD8 (r = 0,898; p = 0,001). Não foram observadas
diferenças significativas de acordo com o tempo de evolução e nem correlação com os
outros parâmetros.
60
Figura 3. Lesão ativa: (a) células CLA
+
, (b) E-selectina, (c) células Ki67
+
, (d) células
BCl-2
+
, (e) células Fas
+
, (f) células FasL
+
. As colorações são as mesmas descritas para
a figura 1. As setas exemplificam as células positivas. Aumento 200x.
A
B
C
D
E
F
61
Tabela 5. intensidade de NOS2 + e E-selectina de acordo com o tempo de evolução
das lesões cutâneas de LTA
Tempo de evolução Quantidade de pacientes para cada intensidade
x/4
Discreto
(+/4)
Moderado
(++/4)
Intenso
(+++/4)
Muito intenso
(++++/4)
NOS2 < 2 meses 1 4 3 5
> 4 meses 1 0 5 1
E- selectina < 2 meses 3 3 1 6
> 4 meses 1 1 2 2
62
Figura 4. Detecção em lesão ativa de endotélio expressando E-
selectina. As colorações são as mesmas descritas para a figura 1. As
setas exemplificam as células positivas. Aumento 400x.
63
Foram observadas células expressando o ligante para Fas (FasL
+
) com
distribuição heterogênea (figura 3-F), em meio ao infiltrado inflamatório, e
principalmente formando pequenos agrupamentos variando de 15 a 36,3% (média
24,05% ± 2,4) das células da lesão. Já a molécula Fas apresentava distribuição
homogênea pelo infiltrado, variando o percentual de células positivas de 11,8 a 78,4%
(média 52,5% ± 4,6). Houve correlação entre a expressão de Fas e células T CD4
+
(r=
0,932 p= 0,0001), células T CD8
+
(r= 0,747 p= 0,013) e células Ki67
+
(r= 0,792 p=
0,006). Não foi observada correlação com nenhum dos outros parâmetros estudados.
Apesar de não ter sido encontrada diferença significante, foi observado um aumento do
número de células expressando o ligante para Fas de acordo com o tempo de evolução
(< 2 meses = 134,09 ± 49,4; > 4 meses = 325,67 ± 140,1; p = 0,386).
4. Detecção de parasitos
Foi possível detectar parasitos em 10 dos 19 pacientes estudados. Nos 9
pacientes em que o parasito não foi visualizado pela imunohistoquímica, a infecção foi
confirmada por isolamento em cultivo. Os parasitos podiam ser encontrados no meio
extracelular ou no citoplasma de células infectadas presentes no infiltrado inflamatório
em derme, e menos freqüente em células na epiderme. Havia uma distribuição
heterogênea com áreas de concentração de parasitos. A quantidade de parasitos variou
de 0 a 70,6 /mm
2
(média 8.43 ± 5.59). Houve correlação negativa com tempo de
evolução (r = - 0,709, p = 0,007) e associação entre a alta expressão de NOS2 e a baixa
quantidade de parasitos detectados (or = 0,042; p = 0,05), como ilustrado pela figura 5
onde é feita a comparação visual da quantidade de macrófagos, expressão de NOS2 e
quantidade de parasitas em lesões com diferentes tempos de evolução.
64
Figura 5. Detecção de macrófagos (A - B); expressão de NOS2 (C - D); parasitas (E -
F), preparado como descrito em materiais e métodos. < 2 meses (A, C e E); > 4 meses
(B, D e F). As colorações são as mesmas descritas para a figura 1. As setas
exemplificam as células positivas. Aumento 200x (A – D / barra de aumento = 50 µm) e
400x (E – F / barra de aumento = 25 µm).
A
B
C D
E
F
65
IMUNOHISTOQUÍMICA - CICATRIZES
Os resultados estão apresentados na tabela 6, em contagem percentual sobre o
número de células (nos ninhos de concentração celular em meio a áreas de fibrose) ou
em mm
2
de área de tecido total. Os dados comparativos de lesões ativas e cicatrizes
apresentando diferença significante serão demonstrados adiante e nas figuras 10 a 13.
1. Macrófagos, linfócitos e neutrófilos (figura 6)
Os macrófagos CD68
+
podiam ser observados nos grupos de células
apresentando em média 34,80 ± 4,32% nas cicatrizes com 1 ano de cura clínica, e 42,98
± 3,24% naquelas com 3 anos. Não foi observada diferença significativa entre os dois
grupos (p = 0,185). Quando comparado às lesões em atividade, houve uma redução de
5,9 vezes na intensidade de macrófagos por área de tecido nas cicatrizes com 1 ano de
cura clínica e 8,7 vezes naquelas com 3 anos de cura. Apesar da tendência a menor
intensidade, as diferenças não foram estatisticamente significantes (p = 0,180 e p =
0,655; respectivamente).
Os linfócitos TCD3
+
e suas subpopulações, assim como os macrófagos eram os
principais tipos celulares encontrados nos ninhos de células. Raramente essas
populações podiam ser encontradas em epiderme, diferente das lesões ativas onde esta
invasão era achado freqüente. As cicatrizes com 1 ano de cura clínica apresentaram
percentual de CD3
+
variando de 37 a 58,7% (média 45,12% ± 2,6), enquanto aquelas
com 3 anos de cura clínica variaram de 30 a 56,1% (média 44,01% ± 4,14). Não foi
observada diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,874). Quando comparado
às lesões em atividade, houve uma redução de 8 vezes na intensidade de células CD3
+
por área de tecido nas cicatrizes com 1 ano de cura clínica e 6,9 vezes naquelas com 3
anos de cura, porém as diferenças não foram estatisticamente significantes (p = 0,144 e
p = 0,180; respectivamente).
As células TCD4
+
constituíam em média 33,19% ± 3,38 nas cicatrizes com 1
ano de cura clínica. Já as cicatrizes com 3 anos de cura clínica apresentaram CD4
+
em
média 31,83% ± 2,74. Não houve diferença significativa entre os dois grupos (p =
0,791) (figura 7). Quando comparado às lesões em atividade, evidenciou-se uma
66
redução de 18,4 vezes na intensidade de células CD4
+
por área de tecido nas cicatrizes
com 1 ano de cura clínica e 13,7 vezes naquelas com 3 anos de cura. Apesar da
tendência a menor intensidade, as diferenças não foram estatisticamente significantes (p
= 0,144 e p = 0,180; respectivamente).
As células TCD8
+
constituíam em média 24,09% ± 4,07 nas cicatrizes com 1 ano
de cura clínica, e as cicatrizes com 3 anos de cura clínica apresentaram CD8
+
em média
22,74% ± 3,68. Não foi observada diferença significativa entre os dois grupos (p =
0,965). Quando comparado às lesões em atividade, evidenciou-se uma redução de 10,36
vezes na intensidade de células CD8
+
por área de tecido nas cicatrizes com 1 ano de
cura clínica e 24,0 vezes naquelas com 3 anos de cura, porém as diferenças não foram
estatisticamente significantes (p = 0,080 e p = 0,180; respectivamente).
A quantidade de células B CD22
+
variou de 0 a 14,4% (média 4,4% ± 3,42) nas
cicatrizes com 1 ano de cura clínica, e 0 a 10,40% (média 3,07% ± 1,61) naquelas com
3 anos de cura clínica. Não foi observada diferença significativa entre os dois grupos (p
= 0,683).
Os neutrófilos apresentaram baixa freqüência, variando de 0 a 5,9% (média
1,83% ± 0,88) nas cicatrizes com 1 ano de cura clínica e de 0 a 12 % (média 2,83% ±
1,9) naquelas com 3 anos de cura. Não foi observada diferença significativa entre os
dois grupos (p = 0,868). Quando comparado às lesões em atividade, evidenciou-se uma
redução de 76,0 vezes na intensidade de neutrófilos por área de tecido nas cicatrizes
com 1 ano de cura clínica e 105,6 vezes naquelas com 3 anos de cura. Apesar de haver
diferentes concentrações médias, devido à variação intrínseca dentro do grupo, a análise
estatística demonstrou semelhança de distribuição entre os grupos (p = 0,109 e p =
0,180; respectivamente).
67
Figura 6. Cicatriz: (a) células T CD3
+
, (b) células T CD4
+
, (c) células T CD8
+
, (d)
macrófagos, (e) células de Langerhans, (f) células dendríticas foliculares. As colorações
são as mesmas descritas para a figura 1. As setas exemplificam as células positivas.
Aumento 400x.
B
D
F
C
A
E
68
Figura 7. Detecção através de imunohistoquímica de células CD4+ (A - B); expressão
de CLA (C - D); preparado como descrito em materiais e métodos. Cicatriz 1 ano de
cura clínica (A, C); Cicatriz 3 anos (B, D). As colorações são as mesmas descritas para
a figura 1. As setas exemplificam as células positivas. Aumento 400x.
A
B
C
D
69
Tabela 6. Contagem percentual e por mm
2
dos marcadores estudados nos sítios das
lesões cutâneas de LTA e nas cicatrizes com 1 e 3 anos de cura clínica.
ND – não determinado
Vide dados comparativos nas figuras 10 a 13.
Marcador Lesão Ativa Cicatriz 1 ano Cicatriz 3 anos
CD3 54,85 ± 2,62
636,40 ± 113,39
45,12 ± 2,6
79,38 ± 20,12
44,01 ± 4,14
91,77 ± 25,31
CD4 40,65 ± 3,08
582,64 ± 123,06
33,19 ± 3,38
31,66 ± 8,6
31,83 ± 2,74
42,55 ± 11,95
CD8 34,5 ± 2,04
460,66 ± 76,23
24,09 ± 4,07
44,46 ± 11,09
22,74 ± 3,68
19,17 ± 1,94
CD22 13,8 ± 4,8
74,81 ± 41,56
4,4 ± 3,42
ND
3,07 ± 1,61
ND
CD1a ND
6,1 ± 1,12
ND
1,15 ± 0,64
ND
1,20 ± 0,32
DC 3,6 ± 0,99
11,88 ± 2,92
7,41 ± 2,53
23,96 ± 13,5
6,48 ± 2,36
10,37 ± 3,12
CLA 31,02 ± 2,69
273,79 ± 53,34
24,06 ± 3,7
36,53 ± 8,55
27,16 ± 3,43
72,93 ± 24,53
BCl2 38,6 ± 3,6
617,11 ± 153,41
15,85 ± 4,48
16,80 ± 8,63
26,92 ± 4,2
47,7 ± 37
Ki67 11,5 ± 1,26
97,08 ± 15,7
3,52 ± 1,72
1,55 ± 0,79
2,63 ± 1,13
0,6 ± 0,4
FasL 24,05 ± 2,4
160,75 ± 46,78
18,17 ± 6,7
ND
14,83 ± 5,49
ND
Fas 52,5% ± 4,6
739,38 ± 132,14
40,06 ± 2,31
92,48 ± 17,6
48,22 ± 5,1
103,10 ± 11,60
MO 45,77 ± 1,44
(769,92 ± 141,34)
34,80 ± 4,32
(107,40 ± 25,45)
42,98 ± 3,24
(73,00 ± 16,55)
NEU
15,3 ± 3,5
114,07 ± 35,29
1,83 ± 0,88
1,50 ± 0,75
2,83 ± 1,90
1,08 ± 0,64
70
2. Distribuição e perfil quantitativo de células de Langerhans (figura 6)
As células CD1a
+
podiam ser encontradas em grande quantidade em epiderme
em todos os casos estudados, e em menor quantidade em derme papilar. A proximidade
a vasos sanguíneos também pôde ser constatada. Na derme, a intensidade de células
CD1a
+
variou de 0 a 5,5 /mm
2
(média 1,15 ± 0,64) e de 0 a 2,7 /mm
2
(média 1,2 ± 0,32)
nas cicatrizes com 1 e 3 anos de cura clínica, respectivamente. Não foi observada
diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,258). Quando comparado às lesões
em atividade, evidenciou-se uma redução de 5,2 vezes na intensidade de CD1a
+
por área
de tecido nas cicatrizes com 1 ano de cura clínica e 5,0 vezes naquelas com 3 anos de
cura. Não foi observada diferença significativa para as cicatrizes com 1 ano de cura
clínica (p = 0,069), porém foi observado para aquelas com 3 anos (p = 0,046).
3. Marcadores de inflamação (figura 8)
As células CLA
+
variaram de 7 a 36,30% (média 24,06% ± 3,7) nas cicatrizes
com 1 ano de cura clínica, e 8,3 a 38,90% (média 27,16% ± 3,4) naquelas com 3 anos.
Não foi observada diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,636). Foi possível
observar a co-localização entre a presença de endotélio ativado e células expressando
CLA (figura 8). Quando comparado às lesões em atividade, evidenciou-se uma redução
de 7,5 vezes na intensidade de CLA
+
por área de tecido nas cicatrizes com 1 ano de cura
clínica e 3,8 vezes naquelas com 3 anos de cura, Foi observada diferença significativa
para as cicatrizes com 1 ano de cura clínica (p = 0,028), porém não foi observado para
aquelas com 3 anos (p = 0,180).
A expressão de Ki67 variou de 0 a 14,9% (média 3,52% ± 1,72) nas cicatrizes
com 1 ano de cura clínica, estando ausentes em 5 casos. Nas cicatrizes com 3 anos de
cura clínica foram encontradas de 0 a 10,5% (média 2,63% ± 1,13), estando ausentes em
4 casos. Não foi observada diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,887).
Quando comparado às lesões em atividade, evidenciou-se uma redução de 62,6 vezes na
intensidade de Ki67 por área de tecido nas cicatrizes com 1 ano de cura clínica e 161,8
vezes naquelas com 3 anos de cura, porém não foi observada diferença significativa (p =
0,053 e p = 0,068; respectivamente).
71
A expressão de NOS2 foi de baixa intensidade em todos os casos (discreto a
moderado), estando ausente em 4 deles. Destes, 3 eram provenientes de pacientes com 3
anos de cura clínica. Foi observada redução significativa da intensidade de expressão de
NOS2 nas cicatrizes com 3 anos de cura clínica quando comparado ao grupo com 1 ano
(p = 0,03).
Foi observada baixa expressão de E-selectina, variando de discreto a moderado.
Os vasos ativados podiam ser encontrados no centro dos grupos de células presentes em
derme em meio à intensa fibrose (figura 9). Não houve diferença significativa entre os
dois grupos (p = 0,546).
A expressão de BCl-2 variou de 0 a 35,8% (média 15,85% ± 4,48) nas cicatrizes
com 1 ano de cura clínica. Já nas cicatrizes com 3 anos houve variação de 12,6 a 45%
(média 26,92% ± 4,2). Não foi observada diferença significativa entre os dois grupos (p
= 0,124). Quando comparado às lesões em atividade, evidenciou-se uma redução de
36,7 vezes na intensidade de BCl-2 por área de tecido nas cicatrizes com 1 ano de cura
clínica e 12,9 vezes naquelas com 3 anos de cura, porém não foi observada diferença
significativa (p = 0,655 e p = 0,880; respectivamente).
A expressão do ligante para Fas variou de 0 a 50,9% (média 18,17% ± 6,7) e 0 a
48,1% (média 14,83% ± 5,49) nas cicatrizes com 1 ano e 3 anos de cura clínica,
respectivamente. Já a expressão do receptor Fas variou de 30,1 a 49,1% (média 40,06%
± 2,31) nas cicatrizes com 1 ano de cura clínica. Nas cicatrizes com 3 anos, Fas
+
variou
de 24,3 a 69,7% (média 48,22% ± 5,1). Não foi observada diferença significativa entre
os dois grupos tanto para FasL (p = 0,481) quanto para Fas (p = 0,171). Quando
comparado às lesões em atividade, evidenciou-se uma redução de 8 vezes na
intensidade de Fas por área de tecido nas cicatrizes com 1 ano de cura clínica e 7,2
vezes naquelas com 3 anos de cura, porém não foi observada diferença significativa (p =
0,655 e p = 0,180).
72
Figura 8. Cicatriz: (a e b) células CLA
+
, (c) neutrófilos, (d) células BCl-2
+
, (e) células
Fas
+
, (f) células FasL
+
. As colorações são as mesmas descritas para a figura 1. As setas
exemplificam as células positivas. Aumento 400x.
B
D
A
C
E F
73
Figura 9. Detecção através de imunohistoquímica, em cicatriz, de
endotélio expressando E-selectina (A); expressão de CLA (B);
preparado como descrito em materiais e métodos. As colorações
são as mesmas descritas para a figura 1. As setas exemplificam as
células positivas. Aumento 200x.
A
B
74
4. Detecção de parasitos
Não foram detectados parasitos íntegros nas cicatrizes e suas respectivas peles
sadias contralaterais. Algumas imagens, em cicatrizes, sugeriam a presença de restos
parasitários e granulações em citoplasma.
Evidenciação de diferenças significativas na análise comparativa lesões em atividade
versus cicatrizes – (figuras 10, 11, 12 e 13).
Ao comparar os dados obtidos em lesões em atividade com aqueles obtidos nas
cicatrizadas, foi observada redução significativa do percentual de neutrófilos (p = 0,043)
(figura 11), e dos seguintes marcadores de atividade: NOS2 (p = 0,023), E-selectina (p =
0,024), Ki67 (p = 0,028), BCl-2 (p = 0,036) e Fas (p = 0,028) nas cicatrizes com 1 ano
de cura clínica. Esta redução foi mais pronunciada nas cicatrizes com 3 anos de cura
clínica para NOS2 (p = 0,006), e-selectina (p = 0,026), Ki67 (p = 0,011) e BCl2 (p =
0,021) (figura 12).
Além disso, nas cicatrizes mais antigas ainda pôde ser observada redução do
percentual de linfócitos TCD3 (p = 0,043), CD4 (p = 0,015), CD8 (p = 0,011) (figura
11) e células de Langerhans (CD1a
+
) (p = 0,046) (figura 12).
Apesar de não ter sido observada diferença significativa, evidenciou-se a
redução de intensidade por área de tecido para todos os marcadores, com exceção das
células dendríticas foliculares (Tabela 6 e figura 10), como descrito no tópico de análise
imunohistoquímica das cicatrizes.
75
Figura 10. Detecção através de imunohistoquímica de células CD3
+
(A - B); CD4
+
(C -
D); CD8
+
(E - F); CD1a
+
(G – H), preparado como descrito em materiais e métodos.
Lesão ativa (A, C, E e G); cicatriz (B, D, F e H). As colorações são as mesmas descritas
para a figura 1. As setas exemplificam as células positivas. Aumento 200x.
A B
C
D
E
F
G H
76
Figura 11. Análise comparativa da distribuição fenotípica em (a) lesão ativa versus
cicatriz 1 ano de cura clínica e (b) lesão ativa versus cicatriz 3 anos de cura clínica.
* p<0,05. MO – macrófagos, NEU – neutrófilos, cic1 – cicatriz 1 ano, cic3 – cicatriz 3
anos.
77
0
10
20
30
40
50
60
70
CLA Ki67 BCl-2 FasL Fas
Marcadores de inflamação
Percentual de células positivas
Lesão
Cic 1
0
10
20
30
40
50
60
70
CLA Ki67 BCl-2 FasL Fas
Marcadores de inflamação
Percentual de células positivas
Lesão
Cic 3
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Lesão Cic 1
Tempo
Intensidade de expressão
de NOS2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Lesão Cic 3
Tempo
Intensidade de expressão
de NOS2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Lesão Cic 1
Tempo
Intensidade de expressão
e-selectina
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Lesão Cic 3
Tempo
Intensidade de expressão
e-selectina
Figura 12. Análise comparativa de atividade inflamatória em lesão ativa versus cicatriz.
(a) Comparação dos marcadores de direcionamento para a pele (CLA), proliferação
celular (Ki67) e apoptose (Fas/FasL) com cicatrizes 1 ano e (b) 3 anos de cura clínica.
(c) Expressão de NOS2 em lesão ativa versus cicatriz 1 ano e (d) 3 anos. (e) Expressão
de E-selectina em lesão ativa versus cicatriz 1 ano e (f) 3 anos. Cada linha representa 1
paciente. * p < 0,05.
*
*
*
*
*
p
= 0
,
023
p
= 0
,
024
p
= 0
,
006
p
= 0
,
026
(a)
(b)
(c)
(e)
(d)
(f)
78
Figura 13. Análise comparativa da intensidade de células de Langerhans em derme em
lesão ativa versus (a) cicatriz com 1 ano de cura e (b) com 3 anos de cura clínica. *p =
0,046.
79
Análise comparativa cicatrizes versus peles sadias contralaterais – (tabela 7 e figura
14)
A análise comparativa entre cicatrizes e suas respectivas peles contralaterais
mostrou, em geral, uma menor intensidade dos tipos celulares e marcadores
inflamatórios nas peles sadias, porém esta diferença não foi significativa (p > 0,05).
As cicatrizes com 3 anos de cura clínica apresentavam localização das
populações celulares semelhante às peles sadias, tendo seus tipos celulares formando as
unidades perivasculares dérmicas, e concentrados nas proximidades aos anexos
cutâneos como folículos pilosos e ductos glandulares como demonstrado através da
figura 7 (B e D) em cicatriz e figura 13 em pele sadia . Ainda na figura 13 é possível
observar a presença de células CD1a
+
em epiderme e a expressão de E-selectina em
endotélio.
80
Figura 14. Detecção em pele sadia contralateral de células Fas
+
(A); FasL
+
(B);
CD1a
+
(C); E-selectina
(D), preparado como descrito em materiais e métodos. As
colorações são as mesmas descritas para a figura 1. As setas exemplificam as células
positivas. Aumento 400x.
A
B
C
D
81
Tabela 7. Contagem percentual e por mm
2
dos marcadores estudados nos sítios das
cicatrizes com 1 e 3 anos de cura clínica, e respectivas peles sadias.
ND – não determinado
A comparação entre os dados obtidos no estudo dos tecidos cicatriciais e das peles
sadias não demonstraram diferenças significativas na concentração de células (p >
0,05).
Marcador 1 ano 3 anos
Cicatriz Pele sadia Cicatriz Pele sadia
CD3 45,12 ± 2,6
79,38 ± 20,12
26,5 ± 6,02
17,25 ± 10,25
44,01 ± 4,14
91,77 ± 25,31
ND
ND
CD4 33,19 ± 3,38
31,66 ± 8,6
23,55 ± 3,37
26,04 ± 9,32
31,83 ± 2,74
42,55 ± 11,95
23,48 ± 3,83
24,88 ± 8,37
CD8 24,09 ± 4,07
44,46 ± 11,09
17,99 ± 3,92
24,50 ± 16,47
22,74 ± 3,68
19,17 ± 1,94
19,35 ± 3,49
39,38 ± 13,41
CD1a ND
1,15 ± 0,64
ND
1,4 ± 0,65
ND
1,20 ± 0,32
ND
4,50 ± 1,76
DC 7,41 ± 2,53
23,96 ± 13,5
5,1 ± 1,31
10,40 ± 3,54
6,48 ± 2,36
10,37 ± 3,12
14,13 ± 3,54
7,55 ± 0,92
CLA 24,06 ± 3,7
36,53 ± 8,55
35,28 ± 5,73
45,88 ± 20,87
27,16 ± 3,43
72,93 ± 24,53
33,53 ± 2,29
52,50 ± 12,18
BCl2 15,85 ± 4,48
16,80 ± 8,63
20,86 ± 6,20
9,25 ± 7,59
26,92 ± 4,2
47,7 ± 37
21,43 ± 3,98
13,00 ± 2,61
Ki67 3,52 ± 1,72
1,55 ± 0,79
1,88 ± 0,77
0,75 ± 0,48
2,63 ± 1,13
0,6 ± 0,4
1,72 ± 0,93
0,60 ± 0,24
FasL 18,17 ± 6,7
ND
10,33 ± 5,21
1,20 ± 1,20
14,83 ± 5,49
ND
7,72 ± 3,87
5,25 ± 3,54
Fas 40,06 ± 2,31
92,48 ± 17,6
51,10 ± 14,88
14,00 ± 7,00
48,22 ± 5,1
103,10 ± 11,6
57,78 ± 8,83
53,67 ± 15,34
MO 34,80 ± 4,32
107,40 ± 25,45
35,80 ± 8,09
33,57 ± 15,89
42,98 ± 3,24
73 ± 16,55
29,98 ± 4,87
34,68 ± 12,10
NEU
1,83 ± 0,88
1,50 ± 0,75
8,05 ± 8,05
2,25 ± 1,97
2,83 ± 1,90
1,08 ± 0,64
0
0
82
Resposta proliferativa primária
A LPR foi realizada nos diferentes tempos (lesão em atividade, cicatriz 1 ano e
cicatriz 3 anos de cura clínica). Apenas 1 paciente com lesão em atividade apresentou
resposta negativa (SI < 2,5), o restante variou de 2,5 a 33,4 (média 9,53 ± 3,98). O
paciente não respondedor precisou de mais séries de glucantime que o habitual e
também doses intralesionais. Além disso, suas lesões levaram 4 meses para cicatrizar,
tempo superior à média (1,4 ± 0,24 meses).
Todos os pacientes com 1 ano de cura clínica apresentaram respostas positivas
ao Lb-Ag variando de 3 a 22 (média 13,4 ± 3,94). Dos pacientes com 3 anos de cura
clínica apenas 1 apresentou resposta negativa (SI = 2) e o restante variou de 3,4 a 30
(média 12,57 ± 2,93). O paciente não respondedor apresentou cura espontânea e não foi
submetido ao tratamento com glucantime, e quando em lesão em atividade obteve um
SI = 4,4. Não foram encontradas diferenças significativas entre estes dois grupos (p =
0,413), assim como entre lesão em atividade e cicatrizes dos dois grupos (p = 0,299 e p
= 0,222) (figura 15). Não foi possível fazer análise pareada destes resultados devido ao
número de pacientes avaliados durante a atividade da doença.
Figura 15. Resposta proliferativa primária de PBMC estimuladas com Lb-Ag.
Cic= cicatriz
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Lesão 1 ano 3 anos
Tempo
Índice de Estimulação (SI)
Lesão
1 ano
3 anos
Lesão ativa Cic 1 ano Cic 3 anos
83
Caracterização fenotípica das células respondedoras in vitro ao Lb-Ag
Foi realizada a caracterização fenotípica das células que proliferaram quando
estimuladas in vitro ao Lb-Ag nos diferentes tempos (lesão ativa, cicatriz 1 ano e 3
anos). Durante a atividade da doença, o percentual de CD3
+
variou de 44,7 a 87,1%
(média 70,07 ± 5,2%), %CD4
+
variou de 36,5 a 77,4% (média 52,47 ± 5,6%) e %CD8
+
de 6,7 a 23,3% (média 15,87 ± 2,61%).
Os pacientes com 1 ano de cura clínica apresentaram percentual de CD3
+
variando de 17,4 a 91,8% (média 67,6 ± 8,1%), %CD4
+
variou de 15,3 a 50,6% (média
40,94 ± 3,9%) e %CD8
+
de 2,6 a 44,5% (média 27,7 ± 4,54%). Não houve diferença
significativa quando com parado às lesões ativas. Não foi possível fazer as análises
pareadas.
Já os pacientes com 3 anos de cura clínica apresentaram percentuais de CD3
+
variando de 54,6 a 87,9% (média 72,6 ± 3,8%), %CD4
+
variando de 38,2 a 62,2%
(média 49,6 ± 2,7%) e %CD8 de 18,8 a 40,7% (média 26,4 ± 2,09%). Não houve
diferença quando comparado às cicatrizes com 1 ano de cura clínica, porém houve um
aumento significativo do %CD8
+
(p = 0,005) quando comparado às lesões em atividade.
84
DISCUSSÃO
No presente estudo foi analisado o infiltrado inflamatório em lesões cutâneas
ulceradas de LTA apresentando diferentes tempos de evolução, a constituição celular de
cicatrizes com 1 e 3 anos após a cura clínica, e a resposta proliferativa primária destes
pacientes.
As lesões de LTA em atividade mostraram consideráveis infiltrados
inflamatórios, constituídos principalmente por células T e macrófagos. Os macrófagos
são as células hospedeiras das formas amastigotas de Leishmania. No entanto, uma vez
ativados são capazes de eliminar o parasito através de seus mecanismos microbicidas. A
eliminação de amastigotas por macrófagos murinos e humanos depende principalmente
de mecanismos oxidativos, como intermediários reativos de oxigênio (ROI) e
intermediários reativos de nitrogênio (RNI), em particular NO, cuja produção é
estimulada pela ativação da enzima NOS2 (Bradoniso et al., 2001). Neste trabalho
observamos a expressão de NOS2 tanto em lesões recentes quanto tardias, estando sua
intensidade diretamente correlacionada com a quantidade de células T CD3
+
. Esta
associação sugere a importância dos linfócitos na ativação de macrófagos e produção de
NO. Também foi possível detectar uma associação entre a alta expressão de NOS2 e
baixa quantidade de parasitos indicando a importância de NOS2 na eliminação das
formas amastigotas do sítio de lesão. A ausência de correlação entre NOS2 e
macrófagos sugere que muitas destas células poderiam não estar ativadas ao estado
parasiticida. Muitos macrófagos parasitados não são bem-sucedidos em destruir os
parasitos devido a mecanismos de escape como a degradação de moléculas MHC-II,
prejudicando assim a apresentação de antígenos e ativação de células T helper (Lang et
al., 1994; De Souza-Leão et al., 1995). Apesar disto, estes macrófagos são ainda
capazes de liberar citocinas e quimiocinas que atraem mais macrófagos para o sítio de
lesão. Como a diminuição da carga parasitária foi verificada em lesões tardias, estes
resultados podem sugerir que nas lesões mais antigas estes macrófagos possam ser
utilizados no processo de eliminação por apoptose das células inflamatórias
desnecessárias, como já anteriormente descrito (Fadok et al., 1998; Orteu et al., 1998).
Nestes casos, os macrófagos tendem a permanecer inativados auxiliando assim no
controle e redução do processo inflamatório, necessário ao início da cicatrização das
85
lesões (Fujiwara & Kobayashi, 2005). O achado de maior concentração de áreas de
fibrose, assim como a tendência de aumento de células expressando FasL nas lesões
antigas parece corroborar esta hipótese.
Já foi demonstrado a importância de células TCD4
+
FasL
+
no controle do
infiltrado inflamatório facilitando o estabelecimento do processo de cicatrização
(Conceição-Silva et al., 1998). Por outro lado, células TCD8
+
têm sido descritas como
importantes para o desenvolvimento da LTA tanto no modelo murino (Conceição-Silva
et al., 1994) quanto em pacientes (Da-Cruz et al., 1994; Brodiskyn et al., 1997). Devido
à predominância de intensidade e distribuição, os resultados do presente trabalho
sugerem que nas lesões recentes, a resposta imunológica local se faz através da ação
conjunta das subpopulações de células T CD4
+
e CD8
+
em igual intensidade, pois
mesmo havendo áreas de concentração diferentes, CD8
+
era ou mais abundante ou
equivalente à concentração de CD4
+
. Nas lesões tardias, a densidade do infiltrado
inflamatório não era homogênea, mas tanto nas áreas menos densas quanto nas de maior
concentração de células era verificado uma constante superioridade de células CD4
+
em
relação às CD8
+
, assim como o aumento da razão CD4/CD8, pois a concentração de
CD8
+
tendeu a diminuir. Machado e cols (2002) estudando a citotoxicidade in situ na
LTA, observaram uma notável presença de células TCD8
+
e células ativadas, e
sugeriram que este tipo celular estaria envolvido na eliminação do parasito e
desenvolvimento da úlcera. Assim, lesões cuja carga parasitária estivesse em declínio
poderiam prescindir do acúmulo exagerado de células TCD8
+
. Neste estudo, as células
TCD8
+
apresentaram a tendência a maiores quantidades nas lesões recentes, onde
também eram observados os maiores números de parasitos, portanto, o efeito citotóxico
destas células TCD8
+
parece perder importância nas lesões com maior tempo de
evolução, quando o número de parasitos começa a ser controlado.
Lima et al. (1994) encontraram percentual in situ equivalente de células CD4
+
e
CD8
+
e não observaram diferenças entre lesões tardias e recentes, porém estes autores
consideraram como limite 1,5 meses e no presente trabalho consideramos como lesões
tardias aquelas com mais de 4 meses de evolução. Isaza et al. (1996) estudando lesões
de LTA em pacientes infectados por L. panamensis, observaram relação CD4/CD8 de
0,80 ± 0,06, em pacientes com menos de 2 meses de evolução, resultado este
semelhante ao obtido no presente trabalho. Por outro lado, em relação à função de
86
células TCD8
+
, Da-Cruz et al. (1994) estudando células recuperadas do sangue
periférico compararam as proporções de células TCD4
+
e TCD8
+
- Leishmania
específicas antes e depois do tratamento, e observaram uma redução significativa da
razão CD4/CD8. Sugeriram, então, que o aumento dos níveis de células TCD8
+
e a
produção de IFN-γ poderiam ser importantes para a cura das lesões e também para
proteção imunológica. Esta aparente contradição com os resultados aqui apresentados
pode ser explicada pelos diferentes sítios de estudo (resposta imune celular periférica X
infiltrado inflamatório in situ). Além disto, como as lesões tardias foram estudadas
ainda na fase de atividade, antes do início do tratamento específico, não se pode
descartar que as lesões em franco processo de cicatrização apresentariam o aumento,
mesmo que transitório de células TCD8
+
. Corroborando esta hipótese, o estudo in vitro
(RPL) destes mostrou um aumento significativo de células CD8
+
respondedoras que não
se relacionava aos achados in situ.
Um fator indicativo de atividade das lesões foi o encontro consistente de
neutrófilos de permeio aos linfócitos nos sítios de lesão. A constatação da intensa
positividade de elastase neutrofílica em áreas de necrose em algumas lesões e o achado
de lesões apresentando infecções bacterianas secundárias (dados não demonstrados) não
permite a correlação direta com a atividade leishmanicida local. Trabalhos anteriores
têm demonstrado a importância de neutrófilos no início da infecção por Leishmania sp
demonstrando que camundongos depletados de polimorfonucleares neutrófilos
apresentavam maiores cargas parasitárias (Lima et al., 1998). Por outro lado, a literatura
tem pontuado a importância da associação de patógenos na apresentação clínica e
evolução de lesões tegumentares pela associação de infecções secundárias por bactérias
e fungos intensificando a injúria da pele (Taskapan et al., 2000). Desta forma, mesmo se
os neutrófilos estivessem presentes nas lesões devido a outros patógenos, sua atividade
poderia contribuir para a intensidade do processo inflamatório e manutenção das lesões
em atividade.
Nas lesões em atividade as células de Langerhans CD1a
+
foram observadas
distribuídas na epiderme formando, lado a lado e com suas projeções, uma rede de
células. É descrito na literatura que uma das funções deste tipo celular é capturar e
transportar os antígenos protéicos para os linfonodos (Moll et al., 1995). Algumas
destas células formavam grupos alinhados, sendo ainda observados em determinadas
87
áreas da derme grupos próximos a vasos CD62E positivos (dados não demonstrados).
Segundo Koch et al. (2006) pouca informação existe sobre os sinais que controlam a
migração das células de Langerhans do sangue para a epiderme. Assume-se que não há
uma origem única para as células de Langerhans e que as condições locais na epiderme
direcionam o seu desenvolvimento. Sob trauma ou inflamação da epiderme, os
queratinócitos produzem quimiocinas, como por exemplo MIP-3α (Dien-Nosjan et al.,
2000), atraindo precursores destas células para a região. As alterações histológicas
observadas na epiderme sugerem uma proliferação importante e uma intensa
participação de queratinócitos na atividade das lesões, o que poderia sugerir uma
participação de queratinócitos na produção de citocinas e quimiocinas que atuariam não
só sobre células de Langerhans, mas sobre o infiltrado inflamatório como um todo.
Apesar da sugestão visual de atividade de migração em direção aos vasos, nossos dados
não permitem esta afirmação e outras análises devem ser realizadas de modo a
caracterizar esta movimentação.
As células CLA
+
também eram encontradas com grande freqüência no interior
de vasos e aderidas ao endotélio nas lesões ativas. A importância desta molécula nos
processos de migração e localização celular na pele já foi demonstrado (Elhassan et al.,
1994). Os linfócitos T sensibilizados no linfonodo regional, através da ação das células
apresentadoras de antígenos, passam a expressar moléculas de superfície (CLA, LFA-1)
que os direcionam para o sítio de lesão. Essa migração é possibilitada pela expressão de
CD62E e ICAM-1 pelo endotélio das vênulas ativadas pelas citocinas inflamatórias.
Nas lesões estudadas as expressões de CD62E e CLA
+
apresentararam intensidade
variável e não apresentaram correlação com o tempo de evolução. Estes resultados
corroboram a indicação de lesões em atividade mesmo após tempos de evolução
superiores a 4 meses.
O percentual médio de positividade para Ki67 mostra que parte das células
estava em proliferação no sítio da lesão o que pode contribuir para o aumento local da
população de células. Foi encontrada uma correlação positiva de Ki67 com a quantidade
de células TCD4
+
(p = 0,058), o que sugere que estas seriam as células em proliferação,
e a possível explicação para o acúmulo destas células e aumento da razão CD4/CD8 de
acordo com o tempo de evolução. Em adição, a correlação positiva entre a expressão de
KI67
+
e BCl2
+
corroboram o ambiente de proliferação celular e proteção da apoptose.
88
As etapas de proliferação e resolução do processo inflamatório foram elegantemente
demonstradas por Orteu et al. (1998) principalmente baseados na expressão de BCl-2 e
FasL respectivamente. Juntos estes dados mais uma vez demonstram a atividade
inflamatória nas lesões e indica, junto com a correlação negativa para FasL, que o
processo inflamatório ainda se encontrava em fase proliferativa.
Foi detectada intensa expressão de Fas. Esta molécula, quando ativada pela via
FasL-Fas desencadeia uma cascata enzimática levando à morte celular por apoptose.
Neste estudo não foi possível observar uma diferença significativa nas quantidades de
células FasL
+
em relação ao tempo de evolução. Já foi demonstrado no modelo animal a
importância da via Fas-FasL no controle do processo inflamatório. Conceição-Silva et
al. (1998) estudando camundongos deficientes de Fas ou FasL demonstraram ser
necessária a presença destas moléculas para o controle do processo inflamatório e
cicatrização das lesões in vivo. É possível que lesões em franco processo de cicatrização
pudessem apresentar maior acúmulo de células FasL
+
. Corroborando esta hipótese, não
foi observada diferença no percentual de células em proliferação de acordo com o
tempo de evolução, que associado à positividade de CD62E sugerem que a atividade na
lesão continuava intensa mesmo nas lesões com maior tempo de evolução.
Neste estudo, foram ainda avaliadas as características histopatológicas e
respostas imunológicas celulares sistêmica e local de 18 pacientes com cicatrizes de
LTA, e as respectivas lesões em atividade.
Foi observada a manutenção da intensidade de resposta celular in vitro mesmo
após 3 anos de cura clínica. Da-Cruz et al. (2002) sugeriram que esta resposta poderia
ser relevante para imunoproteção contra reinfecção, e poderia ser utilizada como
parâmetro para determinação de prognóstico. Também verificamos uma predominância
de células CD8
+
entre aquelas recuperadas após estimulação in vitro com antígenos de
Leishmania sp nos pacientes com 3 anos de cura clínica quando comparadas às
respostas do mesmo grupo durante a fase de doença ativa.
Ao compararmos lesões e cicatrizes de cada paciente, observamos a redução
significativa de intensidade de infiltrado inflamatório nos tecidos cicatrizados.
Constatou-se a manutenção de um infiltrado inflamatório nas cicatrizes, porém
delimitado e reduzido a grupos de células. Não foi possível associar os achados
histopatológicos das cicatrizes com a idade de cura clínica, não havendo diferença de
89
intensidade de infiltrado entre cicatrizes recentes e tardias, mas uma tendência de
redução naquelas mais antigas. Mendonça et al. (2004) observaram dado semelhante,
além de características histopatológicas similares às cicatrizes no presente estudo.
As cicatrizes de 1 ano apresentavam intensa substituição da reação inflamatória
por tecido cicatricial. No entanto, em alguns locais ainda era possível a verificação de
aglomerados de células. A concentração das populações de células presentes nestes
locais se manteve semelhante às observadas em lesões em atividade, apesar da redução
marcante de intensidade de infiltrado inflamatório por área de tecido. Amato et al.
(2003a) estudando lesões mucosas, cicatrizadas após 6 meses do término do tratamento,
observaram a manutenção da intensidade de linfócitos TCD4
+
e TCD8
+
assim como
antígenos parasitários. Sugeriram, então, que a persistência de antígenos parasitários
poderia estar relacionada à manutenção de resposta inflamatória local e ativação
continuada destas células.
No presente estudo, somente aos 3 anos de cura clínica, os linfócitos T e suas
subpopulações tiveram suas concentrações reduzidas significativamente. A exceção foi
a intensidade de macrófagos, que se manteve em patamar semelhante às lesões em
atividade, apesar da distribuição mais restrita, já que as áreas de fibrose dominavam o
tecido.
Os linfócitos T CD8
+
têm papel relevante para o controle da carga parasitária na
leishmaniose (Belkaid et al., 2002). No presente estudo, a manutenção do percentual de
células CD8
+
em cicatrizes com 1 ano de cura clínica poderia ser conseqüência da
presença de antígenos parasitários ao longo do período de observação. Assim, estas
células seriam necessárias aos mecanismos de controle da infecção. Isto se tornaria
menos relevante aos 3 anos de cura clínica, quando o equilíbrio parasita-hospedeiro já
estaria estabelecido.
A redução da atividade inflamatória, caracterizada por diminuição da expressão
de NOS2, E-selectina, células Ki67
+
, BCl-2
+
e Fas
+
foi constatada nas cicatrizes
recentes. Nas cicatrizes tardias esta redução foi ainda mais intensa. Apesar disto, a
expressão de indutores de apoptose se manteve sugerindo que apesar da cura clínica da
lesão, o processo de cicatrização seria, microscopicamente, um fenômeno lento. A
possibilidade de reativação durante este período poderia ocorrer em decorrência da
exacerbação desta atividade inflamatória remanescente. Amato et al. (2003b) estudando
90
lesões de pacientes com leishmaniose mucosa antes e após o tratamento observaram a
redução significativa de TNF-α, porém evidenciaram a persistência desta citocina in
situ após a cura das lesões, o que poderia estar relacionado à manutenção de um
“background” imunopatológico favorável às reativações muito freqüentes nesta forma
da doença.
A intensidade de células de Langerhans em derme, após 1 ano de cura clínica, se
manteve em patamar semelhante às lesões em atividade. Gray (2002), em revisão,
discute que as células de memória têm vida relativamente curta e necessitam de
estimulação antigênica continuada. Os antígenos persistiriam ao longo de muitos meses
e, possivelmente, anos pelas células do sistema imune, como, por exemplo, sob a forma
de imunocomplexos na superfície de células dendríticas foliculares. A manutenção da
intensidade de células de Langerhans nas cicatrizes recentes poderia sugerir ainda a
necessidade de movimentação destas células mesmo após 1 ano de cura clínica. Aos 3
anos de cura clínica observou-se a redução significativa da intensidade de células de
Langerhans em derme, pois é provável que esta movimentação se torne menos
necessária pela ausência de antígenos.
As fases da cicatrização da Leishmaniose Tegumentar Americana parecem se
sobrepor. Greenhalgh (1998) discutiu que para a resolução da fase inflamatória, é
necessária a eliminação do estímulo antigênico inicial. Uma vez que o parasito possa
persistir nas lesões curadas (Ramirez & Guevara, 1997; Schubach et al., 1998a;
Schubach et al., 1998b; Bogdan & Rollinghoff, 1999; Gray et al., 2002; Schubach et al.,
2001; Spath et al., 2003; Mendonça et al., 2004) a presença do antígeno tornaria este
processo desordenado, e disso seria decorrente a observação no presente trabalho de
infiltrado inflamatório, mesmo discreto em meio à intensa fibrose cicatricial. Mendonça
et al. (2004) concluíram que a cura clínica nem sempre coincide com a cura histológica.
O achado de manutenção da atividade inflamatória nas lesões cicatrizadas e a sua
redução gradativa com o tempo de cicatrização corroboram esta conclusão.
Evidências sugerem que o parasito seja capaz de disseminar através da
circulação sanguínea, podendo ser detectado na circulação periférica mesmo após anos
de cura clínica. Lugo-Yarbuh et al. (2003) observaram parasitos e antígenos parasitários
na luz de vasos ou adsorvidos ao endotélio das lesões ativas de LTA. Vergel et al.
(2006) identificaram parasitos na pele normal e em monócitos de sangue periférico de
91
pacientes mesmo após o tratamento. Junto com a aquisição da infecção pelos insetos
vetores no bordo de lesão, estes dados suportam a possibilidade de transmissão
antroponótica na leishmaniose tegumentar americana. Além disso, a pele é considerada
parte do sistema imune e é constantemente exposta a agentes potencialmente capazes de
gerar resposta imune. A observação das UPDs e linfócitos intraepiteliais trazem
evidências da permanente vigilância destas células imunes na pele. Desta forma, não foi
possível observar diferenças significativas entre as cicatrizes e suas respectivas peles
sadias. Por outro lado, existe a possibilidade de a pele como um todo ser afetada pela
doença, e somente o estudo de pele sadia de pacientes não acometidos pela infecção e
de áreas não endêmicas poderia elucidar esta questão.
Para outras doenças (toxoplasmose, tuberculose, etc.) já foram determinados
alguns dos fatores que controlam o processo inflamatório e estabelecem o equilíbrio
parasito-hospedeiro (Murray, 1999; Luder et al., 2001; Luder e Gross, 2005). Nesses
casos, onde a persistência parasitária ocorre, a resposta imune torna-se fundamental para
o controle da replicação parasitária e no quadro de imunodeficiência, como na
coinfecção com HIV poderia haver a reativação da doença (Kubar et al., 1998;
Czechowicz et al., 1999). Já foi determinado que a evolução da leishmaniose cutânea
depende do balanço de resposta TH1/TH2, onde uma resposta do tipo 1 predominante
levaria à resistência e cura, enquanto uma resposta predominantemente do tipo 2 levaria
à suscetibilidade e doença progressiva (Uzonna e Bretscher, 2001; outros). A reativação
de pacientes com leishmaniose tegumentar americana tem sido relatada (Oliveira-Neto
et al., 1998; Calvopina et al., 2004) e o estudo imunológico destas lesões recidivantes
poderia contribuir para o entendimento das possíveis alterações que estariam ocorrendo
no sítio de lesão destes pacientes, assim como demonstrado no modelo murino de
infecção experimental (Stenger et al., 1996; Mendez et al., 2004).
92
CONCLUSÃO
Em conclusão, os dados aqui apresentados demonstram que:
1- nas lesões cutâneas de LTA o processo inflamatório é intenso e pode se estender por
vários meses com características de atividade semelhantes;
2- a expressão de NOS2 está diretamente relacionada à intensidade de células TCD3
+
e
não de macrófagos, e a associação entre a alta expressão desta enzima e a baixa
quantidade de parasitos sugere a importância da NOS2 na eliminação das formas
amastigotas no sítio de lesão;
3- neutrófilos podem participar do processo inflamatório mesmo em fases mais tardias
da infecção;
4- o aumento relativo de células CD4
+
associado ao início dos processos de fibrose pode
indicar uma participação destas no controle do processo inflamatório;
5- com o passar do tempo, o infiltrado inflamatório vai se tornando focal permitindo a
cicatrização, de início pontual;
6- a dinâmica do processo inflamatório nas formas cutâneas da LTA mantém um padrão
de distribuição celular ao longo do período de atividade que se modifica lentamente
mesmo após a aparente cicatrização das lesões;
7- a presença de locais de concentração de células envolvidas na resposta imune nas
cicatrizes de 3 anos mostrou uma redução acentuada de marcadores de atividade como
NOS2, Ki67 e BCl-2 sugerindo que após este tempo o equilíbrio da relação parasito-
hospedeiro in situ começa a ser estabelecido;
8- se o estabelecimento do equilíbrio parasito-hospedeiro ocorre de forma gradativa,
mesmo após a evidenciação de cura clínica da lesão ativa, existiria a possibilidade de
93
quebra deste equilíbrio nos momentos de imunossupressão, conseqüentemente levando
a reativação da doença. Estudos focados em lesões recidivantes ajudariam a elucidar
esta questão.
9 - a observação de aumento de blastos CD8
+
reativos ao Lb-Ag no sangue periférico,
em contraste com a redução deste tipo celular no foco de lesão após a cura clínica,
mostra a importância da “compartimentalização” da resposta imune e sugere que exista
uma dinâmica diferenciada nestes dois locais.
94
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108
ANEXOS
1. Termo de consentimento livre e esclarecido – lesões ativas
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
LEISHMANIOSE
Instituição:
Instituto Oswaldo Cruz e Instituto de Pesquisas Clinica Evandro Chagas /FIOCRUZ
Título do Projeto: “:” Influência da resposta imune in situ na evolução de doenças infecto-parasitárias
caracterizadas pela presença de reação granulomatosa crônica. Haverá correlação entre a evolução
das lesões de esporotricose, leishmaniose, tuberculose, hanseníase e paracoccidioidomicose e o
fenômeno inflamatório localizado” (protocolo 014/ 2001)
coordenador: Fátima da Conceição Silva MD, PhD
Nome do Voluntário:
Eu, .................................................................................................................., declaro que sou
voluntário no estudo sobre LEISHMANIOSE. Fui informado que este estudo é para obter
mais conhecimentos sobre a minha doença que se chama Leishmaniose. A minha
participação em nada alterará o atendimento e acompanhamento médico que se faz
necessário para diagnosticar e tratar a minha doença. Os resultados deste estudo não me
beneficiarão diretamente, mas poderão no futuro beneficiar outras pessoas que também
tenham a minha doença. Todos os resultados serão relatados à minha pessoa e
considerados confidenciais, podendo os mesmos serem divulgados na forma de
comunicação científica. Entretanto não será permitido a minha identificação.
Pelo responsável fui informado de que:
1- Este documento procura fornecer informações sobre a Leishmaniose e o que será
realizado, detalhando os procedimentos e exames, benefícios, inconvenientes e riscos
potenciais. Poderei recusar-me a participar da pesquisa ou, mesmo, dela me afastar
em qualquer tempo, sem que este fato me venha a causar qualquer constrangimento, e
que o acompanhamento clínico, o tratamento e o controle de cura em nada serão
109
modificados pela minha desistência. Os exames e procedimentos aplicados serão
gratuitos.
2- Os investigadores se obrigam a não revelar minha identidade em qualquer publicação
resultante deste estudo, assim como, poderão interromper minha participação, a
qualquer tempo, por razões técnico/ médicas quando, então, me serão fornecidos
aconselhamentos e orientação.
3- Antes de assinar este Termo, devo me informar plenamente sobre o mesmo, não
hesitando em fazer perguntas sobre qualquer aspecto que julgar conveniente
esclarecer. É importante estar ciente das seguintes informações:
A- O problema de saúde objeto da investigação:
A leishmaniose é uma doença da pele de gravidade variável de acordo com a reação do
organismo do doente. É causada por um micróbio denominado Leishmania. Ainda não
existe uma forma de prevenção, como vacinas para esta doença.
B- Objetivo da investigação:
O objetivo principal deste trabalho é estudar a resposta imunológica dos pacientes para
que possamos deste modo tentar evidenciar um tipo de reposta protetora (benéfica).O
conhecimento desta resposta poderá ser importante para se tentar prever a evolução da
doença e com isto tentar evitar ou minimizar as formas graves. Além disto, o melhor
conhecimento desta doença pode propiciar no futuro o desenvolvimento de novos
tratamentos e mesmo de uma vacina.
C- Exames, procedimentos e tratamento que serão utilizados:
Nesta investigação está previsto o estudo da resposta imunológica dos voluntários
provenientes de áreas endêmicas de leishmaniose. Os voluntários farão um teste na pele
(injeção de 0,1 ml), chamado teste de Montenegro, para auxiliar no diagnóstico da doença.
Será coletado sangue da veia (20 ml) antes e após o tratamento com antimonial. Este
sangue servirá para fazer alguns exames de esclarecimento diagnóstico e também para a
pesquisa. Além disso, será retirado um fragmento de biópsia de lesão que será dividido em
partes para o diagnóstico da doença, isolando o parasito, e para o estudo científico. Todos
estes procedimentos são usados na rotina de diagnóstico e servem para confirmar que
estou com Leishmaniose. Em alguns casos, e mediante meu consentimento formal para
este procedimento, poderá ser coletada uma segunda biopsia, guardando os cuidados
necessários e mediante aviso e esclarecimento prévio.
D- Benefícios:
O estudo da resposta imune em pacientes com leishmaniose tem apontado para um
importante papel de algumas células e fatores imunológicos na evolução da doença. No
110
entanto, mais estudos são necessários para que possamos tentar esclarecer o seu papel
na regulação da resposta imune levando à cura ou à proteção da Leishmaniose. Estes
conhecimentos poderão fornecer importantes contribuições para se prever a evolução
desta enfermidade nos indivíduos doentes e, para que possamos estabelecer uma futura
vacina para a leishmaniose.
E- Inconvenientes:
A reação positiva ao teste de Montenegro se acompanha de inflamação restrita à área de
aplicação do teste na pele. Este, no entanto, é o teste padrão para o diagnóstico da
leishmaniose tegumentar. A coleta de sangue pode produzir em alguns casos hematoma
(rouxidão) local que desaparece em 3 a 5 dias. A biopsia é feita sob anestesia no local da
lesão (ferida). A lesão é mantida sob tratamento local e curativo para manter a limpeza.
Serei informado de cada passo para faze-la pelo médico responsável.
F- Riscos potenciais conhecidos até os dias atuais:
Não há riscos potenciais visto que os procedimentos que serão utilizados durante este
trabalho são os rotineiramente usados para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar.
Declaro estar ciente do inteiro teor deste Termo de Consentimento, decidindo-me a participar da
investigação proposta, depois de ter formulado perguntas e de ter recebido respostas
satisfatórias a todas elas, e ciente de que poderei voltar a fazê-las a qualquer tempo assim
como abandonar o estudo caso queira. Declaro dar meu consentimento para participar
desta investigação recebendo uma cópia do Termo, estando ciente, ainda, de que uma
outra cópia permanecerá registrada nos arquivos do laboratório responsável pela pesquisa.
local e data:_________________________________________________________________
Nome do voluntário:_____________________________________________________________
Endereço _____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
assinatura:____________________________________________________________
Nome da testemunha:
_____________________________________________________________________
Assinatura: _____________________________________________________________________
Nome do investigador /
médico reponsável:____________________________________________________________
assinatura:____________________________________________________________
111
2. Termo de consentimento livre e esclarecido – cicatriz
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
1
INSTITUIÇÃO: INSTITUTO DE PESQUISA CLÍNICA EVANDRO CHAGAS (IPEC) – FIOCRUZ
COORDENADOR DA PESQUISA: ARMANDO DE OLIVEIRA SCHUBACH
ENDEREÇO: AV. BRASIL 4365 - MANGUINHOS - RIO DE JANEIRO - RJ - CEP 21045-
900
TELEFONES: (0XX21) 2598-4260 / 2598-4263 / 2598-4266 FAX (0XX21) 2590-
9988
NOME DO PROJETO DE PESQUISA: AVALIAÇÃO CLÍNICA, IMUNOLÓGICA,
HISTOPATOLÓGICA E PARASITOLÓGICA DE PACIENTES COM LEISHMANIOSE
TEGUMENTAR AMERICANA APRESENTANDO LESÕES ATIVAS E CICATRIZADAS
NOME DO VOLUNTÁRIO: ______________________________________________
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença causada por
parasitos chamados leishmanias e que acomete seres humanos e animais. A
doença é transmitida pelo "mosquito palha", que vive em regiões de mata,
plantações de banana, manga etc. localizadas próximas às moradias humanas,
onde costuma entrar para se alimentar de sangue de pessoas e animais
domésticos. A LTA se apresenta como feridas na pele de difícil cicatrização.
Algumas vezes, a LTA pode se tornar mais grave, envolvendo as mucosas de
revestimento interno do nariz e da garganta, mesmo vários anos após a
cicatrização da ferida na pele. Atualmente, não temos como saber qual
paciente adoecerá de novo e qual permanecerá curado definitivamente.
Outras doenças como infecções por bactérias, micoses, tuberculose, sífilis,
tumores etc. podem se manifestar de forma parecida com a leishmaniose e,
depois de curadas, pode não ser possível diferenciar as cicatrizes através dos
exames utilizados de rotina atualmente.
1
1
a
via: Prontuário Médico 2
a
via: Paciente
112
No momento, várias perguntas precisam ser respondidas como: quais
pacientes irão permanecer curados após o tratamento e quais irão reabrir suas
cicatrizes ou desenvolver doença dentro do nariz ou na garganta? outras
doenças têm sido confundidas e tratadas como LTA? qual o papel dos seres
humanos doentes ou aparentemente curados na transmissão da doença?
Pelo presente documento, você está sendo convidado(a) a participar de uma
investigação clínica a ser realizada no IPEC, com o objetivo de avaliar o estado
clínico e os exames de laboratório de indivíduos com LTA, em diferentes
períodos de evolução, assim como o aspecto microscópico e a presença de
leishmanias no sangue e nas lesões de pele ativas ou cicatrizadas
comparando-as com amostras de pele sadia e com outras doenças.
Este documento procura esclarecê-lo sobre o problema de saúde em estudo
e sobre a pesquisa que será realizada, prestando informações, detalhando os
procedimentos e exames, benefícios, inconvenientes e riscos potenciais.
A sua participação neste estudo é voluntária. Você poderá recusar-se a
participar de uma ou todas as etapas da pesquisa ou, mesmo, se retirar dela a
qualquer momento, sem que este fato lhe venha causar qualquer
constrangimento ou penalidade por parte do IPEC. O seu atendimento médico
não será prejudicado caso você decida não participar ou caso decida sair do
estudo já iniciado. Os seus médicos poderão também interromper a sua
participação a qualquer momento, se julgarem conveniente para a sua saúde.
A sua participação com relação ao Projeto consiste em autorizar a realização
de uma série de exames para avaliar a evolução da sua doença e que este
material seja utilizado neste estudo. Também será necessária a sua
autorização para a utilização de documentação fotográfica ou filmagem de suas
lesões para estudo e para que parte das amostras coletadas seja estocada a
fim de servir para outros estudos que tenham como finalidade a melhor
compreensão da doença, o desenvolvimento e avaliação de novos métodos
diagnósticos; avaliação da resposta ao tratamento etc., desde que tal estudo
seja previamente analisado e autorizado por um Comitê de Ética em Pesquisa.
113
Os exames e procedimentos aplicados lhe serão gratuitos. Você receberá
todos os cuidados médicos adequados para a sua doença.
Participando deste estudo você terá algumas responsabilidades: seguir as
instruções do seu médico; comparecer à unidade de saúde nas datas
marcadas; relatar a seu médico todas as reações que você vier apresentar
referentes ao estudo, tanto positivas quanto negativas.
Caso você necessite de atendimento médico, durante o período em que
estiver participando do estudo, procure o Instituto de Pesquisa Clínica Evandro
Chagas, mesmo fora do seu agendamento. Em caso de necessidade ligue
para o Dr. Armando de Oliveira Schubach ou Dra. Mariza Salgueiro nos
telefones acima. Caso você apresente qualquer problema clínico relacionado
ao estudo e que necessite de internação, a equipe médica providenciará seu
leito no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas. Sua identidade será
mantida como informação confidencial. Os resultados do estudo poderão ser
publicados sem revelar a sua identidade e suas imagens poderão ser
divulgadas desde que você não possa ser reconhecido. Entretanto, se
necessário, os seus registros médicos estarão disponíveis para a equipe
envolvida no estudo, para o Comitê de Ética em Pesquisa, para as Autoridades
Sanitárias e para você.
Você pode e deve fazer todas as perguntas que julgar necessárias antes de
concordar em participar do estudo, assim como a qualquer momento. O seu
médico deverá oferecer todas as informações necessárias relacionadas à sua
saúde, aos seus direitos, e a eventuais riscos e benefícios relacionados à sua
participação neste estudo.
Procedimentos, exames e testes que serão utilizados:
Inicialmente haverá coleta de informações sobre a doença; exame médico
geral e exame da pele com descrição e documentação fotográfica ou filmagem
das lesões; exame interno do nariz e da garganta com um aparelho chamado
fibra ótica, que permite ver lesões pequenas ou em locais de difícil acesso,
para descrição e documentação fotográfica ou filmagem das lesões (se
necessário será aplicado "spray" anestésico local). Retirada, com anestesia
114
local, de um pequeno fragmento de pele doente (lesão ativa ou cicatrizada) ou
de pele sadia, para realização de exames para identificar células e outros
componentes do organismo, assim como a possível presença de leishmanias.
Quando indicados, outros exames poderão ser realizados para diagnosticar
outras doenças possíveis de ser confundidas com a LTA e para avaliar a
resposta do organismo contra as leishmanias: um teste cutâneo (injeção da
décima parte de um mililitro de um reativo para LTA na pele da região anterior
do antebraço, a qual deverá ser revista cerca de 2 dias após a injeção); e
exames de sangue (quantidade equivalente a 2 colheres de sopa).
Inconvenientes e riscos principais conhecidos até os dias atuais:
A coleta de sangue poderá causar alguma dor no momento da punção
venosa e, eventualmente, poderá haver a formação de uma área arroxeada no
local, que voltará ao normal dentro de alguns dias.
Ocasionalmente, o teste na pele poderá, apresentar uma reação forte com
inflamação do local, mais raramente, formação de bolhas e de ferida. Todo o
processo costuma regredir dentro de alguns dias a poucas semanas.
Tanto o teste na pele quanto o anestésico injetado no momento da biópsia
(retirada de um pequeno fragmento de pele para exame) poderão causar
alergia, geralmente limitada ao aparecimento de áreas vermelhas, empoladas e
com coceira na pele e que respondem bem a medicamentos anti-alérgicos.
Mais raramente poderá haver uma reação mais severa com dificuldade de
respirar e necessidade de cuidados mais intensos, existentes no IPEC.
Eventualmente, no local da biópsia, poderá ocorrer inflamação e dor,
acompanhados ou não de infecção por bactérias. Mais raramente a cicatriz
poderá reabrir. Caso isso ocorra, poderá ser necessário o uso de
medicamentos para dor e antibióticos ou de repetir o tratamento para LTA.
Formas de ressarcimento:
Sempre que necessário, nos dias de seu atendimento, poderá ser fornecida
alimentação conforme rotina do Serviço de Nutrição e Serviço Social do IPEC
para pacientes externos.
Benefícios esperados:
115
Espera-se que os exames realizados indiquem que, neste momento, você
esteja curado ou necessite de nova investigação ou tratamento. Entretanto, as
consultas de retorno regulares por vários anos após o tratamento são indicadas
para a confirmação da cura. Os resultados deste estudo poderão não beneficiá-
lo diretamente, mas no futuro, poderão beneficiar outras pessoas.
Declaro que li e entendi todas as informações referentes a este estudo e que
todas as minhas perguntas foram adequadamente respondidas pela equipe
médica, a qual estará à disposição para responder minhas perguntas sempre
que eu tiver dúvidas.
Recebi uma cópia deste termo de consentimento e pelo presente consinto,
voluntariamente, em participar deste estudo de pesquisa.
_________________________________________________ _______________
Nome paciente: Data
_________________________________________________ _______________
Nome médico: Data
________________________________________________ _______________
Nome testemunha
2
: Data
_________________________________________________ _________________
Nome testemunha
2
: Data
2
Apenas no caso de pacientes impossibilitados de manifestar o seu consentimento por escrito.
No caso de menores de 18 anos, deverá ser assinado pelo pai, mãe ou responsável legal.
116
3. Termo de compromisso e responsabilidade
TERMO DE COMPROMISSO E RESPONSABILIDADE
Eu, _____FÁTIMA CONCEIÇÃO-SILVA__ _______
, coordenadora e
FERNANDA NAZARÉ MORGADO
, aluna do projeto de pesquisa
intitulado “ANÁLISE DA RESPOSTA IMUNE CELULAR IN SITU E
IN VITRO DE PACIENTES COM LESÃO ATIVA OU CICATRIZ
DE LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA.”, comprometo
manter a confidencialidade assim como a privacidade dos participantes do
projeto.
A identidade dos participantes, assim como os resultados obtidos com este
projeto, serão mantidos em um banco de dados sob a minha
responsabilidade.
Os resultados obtidos com esta pesquisa serão divulgados em
comunicações científicas mantendo o anonimato dos participantes e o
material utilizado não será empregado em outras pesquisas, a não ser
quando abertos novos protocolos.
Rio de Janeiro,15/04/2005.
_________________________________
Fátima Conceição Silva
__________________________________
Fernanda Nazaré Morgado
117
4. Carta de aprovação CEP-IPEC/FIOCRUZ.
Livros Grátis
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