( PDF ) Imunopatologia da dengue: receptores de quimiocinas CC e células iNKT

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

IMUNOPATOLOGIA DA DENGUE:

RECEPTORES DE QUIMIOCINAS CC E

CÉLULAS iNKT

Rodrigo Guabiraba Brito

2010

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Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS:

FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

IMUNOPATOLOGIA DA DENGUE:

RECEPTORES DE QUIMIOCINAS CC E

CÉLULAS iNKT

Tese apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Biológicas:

Fisiologia e Farmacologia, do Instituto de

Ciências Biológicas, Universidade Federal

de Minas Gerais, como pré-requisito para a

obtenção do título de doutor em Ciências

Biológicas: Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira

(Depto. de Bioquímica e Imunologia, ICB/UFMG)

Co-Orientador: Profa. Dra. Danielle G. Souza

(Depto. de Microbiologia, ICB/UFMG)

Aluno: Rodrigo Guabiraba Brito

Belo Horizonte

2010

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III

Aos sempre magníficos condutores do

livre pensamento e do conhecimento

cientifico e social, Frank Zappa, Jack

Kerouac e Manoel de Barros.

"The only people for me are the mad ones,

the ones who are mad to live, mad to talk,

mad to be saved, desirous of everything at the same time,

the ones who never yawn or say a commonplace thing,

but burn, burn, burn,

like fabulous yellow roman candles

exploding like spiders across the stars

and in the middle you see the blue centerlight pop

and everybody goes “Awww!"

Jack Kerouac

“...que a importância de uma

coisa não se mede com fita

métrica nem com balanças nem

barômetros etc. Que a

importância de uma coisa há

que ser medida pelo

encantamento que a coisa

produza em nós.”

Manoel de Barros

“…The pojama people are boring me

to pieces; They make me feel like I am

wasting my time…”

Frank Zappa, Po-Jama People, 1975

Este trabalho foi desenvolvido com o apoio financeiro do CNPq

(CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E

TECNOLÓGICO).

Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Dr. Mauro Teixeira, pelos já 10 anos de ensinamentos e apoio.

Sou-lhe eternamente grato pela base cientifica e pela forma pratica de encarar

algumas das dificuldades inerentes a vida acadêmica, as quais ele lida com

habilidade invejável. Este trabalho é mais um reflexo de sua orientação aberta, mas

criteriosa, e tantos outros ainda virão...

Ao Dr. Bernhard Ryffel e a Dra. Valérie Quesniaux (IEM/CNRS, Orléans, França),

por me acolherem em seu laboratório, me integrarem sem restrições as suas

respectivas equipes e me darem a liberdade de conduzir os experimentos que

compõe esta tese de doutorado.

Ao Dr. François Trottein e Dra. Joelle Renneson (Institute Pasteur Lille, França), pela

colaboração aberta e frutífera que geraram resultados que também compõem a

presente tese.

A Dra. Danielle G. Souza, a Dani, pela desenvoltura cientifica, pelo apoio, amizade e

sinceridade. Você me apresentou a Imunofarmacologia. Serei sempre grato.

A coordenação e membros da Pós-Graduação em Fisiologia e Farmacologia, pelo

incentivo.

Ao CNPq pelo apoio financeiro durante todo o doutorado, além do período de

doutorado sanduíche no exterior.

Aos membros da banca pelo interesse e disponibilidade.

A minha mãe, um exemplo de coragem e superação, pelo apoio incondicional desde

sempre. Estarei ao seu lado, buscando com carinho e entendimento o melhor a se

viver neste caminhar.

Agradecimentos

VII

Ao amigo Rafael Elias, companheiro de trabalho e amizade garantida para qualquer

momento. Devo parte deste trabalho ao seu apoio técnico e intelectual, sem contar o

constante encorajamento em face das atribulações inexoráveis desta vida cientifica.

Aos colegas de hoje e de sempre do Laboratório de Imunofarmacologia e anexos,

pela diversão e ciência em uma escala difícil de quantificar. Em especial ao amigo

Remo, pelas varias discussões recheadas de novidades, questionamentos e idéias,

a Cris, pela amizade e paciência valiosas, a Ester, Adriano, Talvani e Lucíola pelo

companheirismo desde muito cedo, ao Prof. Antônio Lucio, pela amizade e bom

senso e também aos essenciais: Angélica, Flávio, Flavio Lopes, Caio, Daniel

Cisalpino, Gustavo, Fred, Dani Sachs, Vanessa, Kátia, Michele (in memoriam),

Rafael Souza, Pedro Elias, Bráulio, Vivian, Mila, Fernando Lopes, Letícia, Márcia,

David, Norinne, Barbara, Ciça, Roberta, Landa, Valdinéria, Ilma, Gil e tantos outros

bons amigos sem os quais a convivência diária nestes últimos 10 anos seria muito

menos interessante.

Aos queridos amigos franceses do Laboratoire d'Immunologie et d'Embryologie

Moléculaires, em Orléans, França onde passei o melhor ano de minha vida cientifica

e pessoal. Em especial a Anne-Gaëlle, por me mostrar a verdadeira França e suas

raízes: ainda maior e mais viva do que eu imaginava. E aos amigos para sempre:

Thomas Secher, Virginie Vasseur, Paméla Gasse, Nicolas Riteau, Louis Fauconnier,

Mathilde Fauconnier, Johan Leyritz, Isabelle Maillet e Rachel Vacher. Vous me

manquez touts !

Aos grandes amigos desta vida, Daniel Camargos, Vinicius Fonseca e Mateus

Guerra, companheiros inconstantes e ainda assim tão responsáveis por toda esta

forma nada convencional de “estudar” as coisas da natureza humana.

Aos amigos inclassificáveis, caríssimos Daniel Mansur, Chico Lobo, Bruno Eduardo,

Diogo Magnani e Gabriel Magno. Porque o mundo será como realmente deve ser,

mesmo que ainda demore: infinito. Estamos esperando.

Aos amigos da Biologia e do DA Biologia pelo apoio, companheirismo, diversão e

excentricidade, dentro e fora deste Instituto de Ciências Biológicas.

Agradecimentos

VIII

A querida professora Salete, pela forma apaixonante de traduzir ciência e vida em

momentos mais do que agradáveis. Este aprendizado é para a vida toda.

LISTA DE ABREVIATURAS,

SIGLAS E SÍMBOLOS

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

 aa - aminoácidos 



 APC - Antigen-presenting cell - Célula apresentadora de antígenos 



 ADE - Antibody-dependent enhancement - Intensificação dependente de

anticorpos 



 ALT - alanina aminotransferase 



 AST - aspartato aminotransferase 



 BSA - Bovine serum albumin - Albumina de soro bovino 



 C - core protein - proteína do capsídeo 



 CCL2 (MCP-1) - Monocyte chemoattractant protein-1 



 CCL3 (MIP-1α) - Macrophage inflammatory protein-1 alpha 



 CCL5 (RANTES) - Regulated upon Activation, Normal T Cell Expressed and 



Secreted 



 CCL17 (TARC) - TGF-beta1-mediated regulation of thymus and activation-

regulated chemokine 



 CD () - cluster of differentiation () 



 cm - centímetro - unidade de comprimento 



 CO

- Dióxido de carbono 



 CTLs - Linfócito T citolítico ou citotóxico 



 CXCL1 (KC) - keratinocyte derived chemokine 



 DCs - Dendritic cells - células dendríticas 



 DC-SIGN - Dendritic cell - specific intracellular adhesion molecule 3(ICAM-3)-

grabbing nonintegrin 



 DENV-2 - vírus da dengue sorotipo 2 



 DL

- dose necessária para matar 50% de animais (Dose letal 50) 



 DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 



 DNA - ácido desoxirribonucléico 



 E - proteína E do envelope 



 E-NS1 - proteína do envelope - proteína não-estrutural 1 



 EDTA - EthyleneDiamineTetracetic acid - Ácido etilenodiamino tetraacético 



 ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay 



 EPM - Erro padrão da média 

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

 FcγR - Fc gamma receptor. Receptor Fc γ 



 FD - Febre do dengue 



 FHD - Febre hemorrágica do dengue 



 g - grama - unidade de massa 



 GRP78/BiP - 78-kDa glucose-regulated protein/immunoglobulin binding

protein 



 h - hora - unidade de tempo 



 H

- Peróxido de hidrogênio 



 H

- Ácido sulfúrico 



 HCV - Hepatitis C virus - Vírus da Hepatite C 



 HLA - Human leukocyte antigen 



 Hsp () - heat shock protein() 



 HTAB - hexadecyltrimethylammonium 



 i.c. - intracerebral 



 i.p. - intraperitoneal 



 i.v. - intravenoso 



 IFN-αβ - Interferon alfa-beta 



 IFN-γ - Interferon gamma 



 IL- () - interleucin - () 



 iNOS - Inducible Nitric Oxide Synthase 



 JNK - Janus kinase 



 KO - Knock-out - geneticamente deficiente para determinado gene ou função 



 L-SIGN - liver/lymph node- specific ICAM-3-grabbing nonintegrin 



 M - molar - unidade de medida de concentração 



 MEM - Modified Eagle’s Medium 



 MHC () - complexo principal de histocompatibilidade () 



 mRNA - RNA mensageiro 



 min - minutos – unidade de tempo 



 ml - mililitro – unidade de volume 



 mm

- milímetro quadrado – unidade de área 



 MPO – Myeloperoxidase/Mieloperoxidase 



 N ou n - número de repetições ou animais 

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

 NaCl - Cloreto de sódio 



 NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato 



 NaPO

- Fosfato de sódio 



 ND - não detectável 



 NK - Natural Killer 



 NKT- Natural killer T cells 



 NS1 - Proteína não-estrutural 1 



 NS2a - Proteína não-estrutural 2a 



 NS2b - Proteína não-estrutural 2b 



 NS3 - Proteína não-estrutural 3 



 NS4a - Proteína não-estrutural 4a 



 NS4b - Proteína não-estrutural 4b 



 NS5 - Proteína não-estrutural 5 



 nm - nanômetro - unidade de comprimento 



 NO - Nitric oxide - Ó xido nitrico 



 NOS - Nitric Oxide Synthase - Óxido nítrico sintase 



 °C - grau Celsius, escala de medida de temperatura 



 OD - optical density 



 OPD - o-phenylenediamine dihidrocloride 



 OMS - Organização Mundial de Saúde 



 p/v - peso por volume - unidade de medida de concentração 



 PBMCs - (células mononucleares do sangue periférico) 



 PBS - phosphate-buffered saline 



 UFP - unidade formadora de placas 



 pg - picograma - unidade de massa 



 PKR - protein kinase regulated by double-stranded RNA 



 RE – Retículo endoplasmatico 



 RNA - ribonucleic acid - ácido ribonucléico 



 SCD - Síndrome de Choque do Dengue 



 SDS - Sodium dodecyl sulfate 



 SFB - soro fetal bovino 



 STAT - Signal Transducers and Activators of Transcription protein 

XII

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

 Th() - linfócitos T auxiliares do tipo () 



 TNF-α - Tumor necrosis factor-alpha/Fator de necrose tumoral-alfa 



 U/mL - unidade por mililitro, unidade de medida de concentração 



 WT - Wild type 



 WHO - World Health organization 



 WNV – West nile virus – Vírus da febre do oeste do nilo 



 µg/ml - micrograma por mililitro, unidade de medida de concentração 



 µl - microlitro - unidade de volume 

XIII

Resumo

RESUMO

O Dengue virus (DENV), um flavivirus transmitido por mosquitos, é um sério

problema de saúde publica em países tropicais. Meca nismos da resposta imune na

infecção ainda não estão bem elucidados. Dados clín icos têm mostrado uma

associação entre níveis de quimiocinas CC no plasma e a severidade da doença.

Neste contexto, avaliamos o papel de receptores de quimiocinas CC, CCR1, CCR2 e

CCR4, na infecção pelo dengue utilizando animais KO para estes receptores. Além

disso, avaliamos in vivo a contribuição de células NKT invariantes (iNKT), linfócitos T

αβ não convencionais, na resposta do hospedeiro utili zando uma amostra de DENV-

2 adaptada em camundongos que leva a uma infecção que se assemelha ao quadro

de FHD/SCD. Camundongos C57/Bl6 (WT) apresentam sinais clínicos e dano

tecidual, incluindo trombocitopenia, hemoconcentração, níveis elevados de

transaminases e citocinas pró-inflamatórias, além de mortalidade. Quimiocinas CC,

como CCL2, CCL3 e CCL5, são produzidas no baço e fígado de animais WT.

Animais CCR1

-/-

possuem fenótipo moderado, com doença e mortalidade similares a

animais WT. Em animais CCR2

-/-

a mortalidade, dano hepático, níveis de IL-6 e IFN-

γ, e ativação de leucócitos foram atenuadas. Entretanto, trombocitopenia,

hemoconcentração e níveis sistêmicos de TNF- α foram similares aos de animais

WT. CCL17, um ligante de CCR4, é produzido durante a infecção. Em

animais CCR4

-/-

a mortalidade, lesão tecidual e inflamação sistêmi ca estão

fortemente reduzidas. Mesmo com diferenças no perfil de doençaem animais KO,

não houve alterações na carga viral. Células iNKT esplênicas e hepáticas são

ativadas e produzem IFN-γ na infecção. Animais deficientes em iNKT (Jα18

-/-

) são

bastante resistentes a infecção, comparados a animais WT. Este fenótipo é

parcialmente revertido pela transferência de células iNKT purifi cadas para animais

Jα18

-/-

. Estes animais apresentam resposta inflamatória reduzida, com baixos níveis

de IL-6, IFN-γ e CXCL1, reduzida lesão hepática e menor ativação d e células NK e

neutrófilos. A carga viral no baço e fígado também foi reduzida. Tratamento com

αGalCer e a deleção de CD1d não alteram o fenótipo observado em animais WT.

Em resumo, receptores de quimiocinas CC têm papeis diferentes na infecção pelo

DENV-2 e a ativação endógena de células iNKT durante a infecção contribui de

forma importante para a resposta sistêmica e local associada a síndr ome do choque

pelo dengue em camundongos.

XIV

Abstract

ABSTRACT

Dengue virus (DENV), a mosquito-borne flavivirus, is a serious public health

problem in many tropical countries. Immune mechanisms involved in the

pathogenesis of DENV infection are not fully elucidated. Recent clinical data showed

an association between levels of different CC chemokines in plasma and severity of

dengue. In this regard, we evaluated the role of CC chemokine receptors CCR1,

CCR2 and CCR4 in dengue infection using KO mice for these receptors.

Furthermore, we assessed the in vivo contribution of invariant Natural Killer T (iNKT)

cells, non-conventional αβ T lymphocytes, to the host response using a mouse-

adapted DENV-2 strain that causes a disease resembling severe dengue infection.

Infected C57/Bl6 mice (WT) presented clinical disease and tissue damage, including

thrombocytopenia, hemoconcentration, increased levels of transaminases and pro-

inflammatory cytokines, and lethality. CC chemokines, such as CCL2, CCL3 and

CCL5, are strongly produced in spleen and liver of WT mice. CCR1

-/-

mice had a mild

phenotype with disease presentation and lethality similar to those of WT mice. In

CCR2

-/-

mice, lethality, liver damage, levels of IL-6 and IFN-γ, and leukocyte

activation were attenuated. However, thrombocytopenia, hemoconcentration and

systemic TNF-α levels were similar to infected WT mice. CCL17, a CCR4 ligand, is

produced upon infection. In CCR4

-/-

mice, lethality, tissue injury and systemic

inflammation were markedly decreased. Despite differences in disease presentation

in CCR-deficient mice, there were no significant differences in viral load. Splenic and

hepatic iNKT cells became activated and produce IFN-γ upon infection. Mice

deficient in iNKT cells (Jα18

-/-

) are highly resistant to the infection when compared to

WT animals. The phenotype was partially recovered by adoptive transfer of iNKT

cells to Jα18

-/-

animals. Jα18

-/-

mice presented decreased systemic and local

inflammatory responses, with lower levels of IL-6, IFN-γ and CXCL1, reduced liver

injury and diminished activation of NK cells and neutrophils. Viral load in spleen and

liver was also lower in Jα18

-/-

mice relative to WT mice. αGalCer treatment and CD1d

ablation had no effects in disease progression. In conclusion, CC chemokine

receptors have discrete roles in DENV-2 and endogenous iNKT cell activation during

DV infection contributes to the systemic and local inflammatory responses that lead

to shock and death, suggesting that CC chemokine receptors and iNKT cells may be

associated to the inflammatory response involved in dengue shock syndrome in

mice.

Sumario

XVI

SUMARIO

I. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................................21

1. IMUNIDADE, OS VÍRUS E A DENGUE...........................................................................22

1.2. A FAMÍLIA FLAVIVIRIDAE E A BIOLOGIA DO DENGUE VÍRUS...............................25

1.2.1.

NTERAÇÕES COM O HOSPEDEIRO

.............................................................................28

1.2.2.

ANIFESTAÇÕES DA DOENÇA E MODELOS EXPERIMENTAIS

.........................................30

1.2.3.

S CONTROVÉRSIAS E A INFECÇÃO SECUNDÁRIA PELO DENGUE

..................................31

1.3. A RESPOSTA INFLAMATÓRIA NA INFECÇÃO PELO DENGUE...............................33

1.3.1.

EDIADORES INFLAMATÓRIOS

CITOCINAS E QUIMIOCINAS

..........................................34

1.3.1.1.

ITOCINAS E A INFECÇÃO PELO DENGUE

.................................................................35

1.3.1.2.

UIMIOCINAS

FUNÇÃO E ESTRUTURA

.....................................................................36

1.3.1.3.

UIMIOCINAS DA FAMÍLIA

E INFECÇÕES VIRAIS

...................................................41

1.3.1.4.

UIMIOCINAS NA RESPOSTA A INFECÇÃO PELO DENGUE

...........................................42

1.4. CÉLULAS NKT INVARIANTES (INKT)........................................................................46

1.4.1.

EFINIÇÃO E DISTRIBUIÇÃO

.......................................................................................46

1.4.2.

MOLÉCULA

CD1

..................................................................................................47

1.4.3.

ECONHECIMENTO DE ANTÍGENOS GLICOLIPÍDICOS POR CÉLULAS I

NKT ......................48

1.4.4.

IAS DE ATIVAÇÃO DE CÉLULAS I

NKT........................................................................49

1.4.5.

APEL DE CÉLULAS I

NKT

EM INFECÇÕES MICROBIANAS

..............................................50

1.4.6.

ÉLULAS I

NKT,

TLR

S E EVASÃO

...............................................................................53

1.4.7.

PAPEL DE CÉLULAS I

NKT

NA RESPOSTA IMUNE EM INFECÇÕES VIRAIS

......................54

1.4.8.

UIMIOCINAS E O TRAFEGO DE CÉLULAS I

NKT...........................................................58

II. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS......................................................................................61

2.1. JUSTIFICATIVA...........................................................................................................62

2. 2. OBJETIVOS................................................................................................................63

2.1.1.

BJETIVOS ESPECÍFICOS

1.......................................................................................63

2.1.2.

BJETIVOS ESPECÍFICOS

2.......................................................................................64

III. MATERIAL E METODOS...............................................................................................66

3.1. ANIMAIS.......................................................................................................................67

3.2. VÍRUS...........................................................................................................................67

Sumario

XVII

3.3. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL..................................................................................68

3.4. COMITÊ DE ÉTICA......................................................................................................72

3.5. AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS................................................72

3.6. TITULAÇÃO DO VÍRUS DA DENGUE.........................................................................72

3.7. DOSAGEM DE TRANSAMINASES HEPÁTICAS TGO E TGP....................................73

3.8. DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE CITOCINAS E QUIMIOCINAS.............................73

3.9. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA MIELOPEROXIDASE (MPO) TECIDUAL...............74

3.10. PREPARAÇÃO DOS CORTES PARA ANÁLISE HISTOLÓGICA.............................74

3.11. PURIFICAÇÃO DE CÉLULAS INKT E TRANSFERÊNCIA ADOTIVA.......................75

3.12. TRATAMENTO COM O ATIVADOR DE CÉLULAS NKT ΑGALCER ........................75

3.13. ANÁLISE DE POPULAÇÕES CELULARES POR CITOMETRIA DE FLUXO (FACS)

............................................................................................................................................75

3.13.1.

BTENÇÃO DE LEUCÓCITOS DO BAÇO E FÍGADO

.......................................................75

3.13.2.

ARCAÇÃO COM ANTICORPOS ESPECÍFICOS

............................................................76

3.14. ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................................78

IV. RESULTADOS...............................................................................................................80

4.1. MORTALIDADE E PERDA DE PESO EM CAMUNDONGOS INFECTADOS PELO

DENV-2 ...............................................................................................................................81

4.2. PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E CARGA VIRAL...............................................83

4.3. INFLAMAÇÃO E LESÃO HEPÁTICA..........................................................................86

4.4. CITOCINAS E QUIMIOCINAS NA RESPOSTA SISTÊMICA.......................................90

4.5. NÚMERO E ATIVAÇÃO DE LEUCÓCITOS NO BAÇO APÓS INFECÇÃO PELO

DENV-2 ...............................................................................................................................94

4.6. ATIVAÇÃO DE CÉLULAS INKT DURANTE A INFECÇÃO PELO DENV-2.................98

4.7. MORTALIDADE E PERDA DE PESO EM CAMUNDONGOS DEFICIENTES PARA

CÉLULAS INKT (JΑ18

-/-

) OU PARA CD1D.......................................................................102

4.8. CAMUNDONGOS JΑ18

-/-

DESENVOLVEM DOENÇA MENOS GRAVE APÓS A

INFECÇÃO........................................................................................................................104

4.9. CAMUNDONGOS JΑ18

-/-

APRESENTAM MENOR PRODUÇÃO DE CITOCINAS PRO-

INFLAMATÓRIAS.............................................................................................................107

Sumario

XVIII

4.10. REDUÇÃO DA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS NK E NEUTRÓFILOS DURANTE A

INFECÇÃO PELO DENV-2 EM CAMUNDONGOS JΑ18

-/-

................................................112

4.11. RELAÇÃO ENTRE CÉLULAS INKT E CARGA VIRAL EM CAMUNDONGOS

INFECTADOS PELO DENV-2...........................................................................................116

4.12. EFEITOS DO TRATAMENTO COM ΑGAL-CER SOBRE A MORTALIDADE E

PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DURANTE A INFECÇÃO COM DENV-2 ................118

V. DISCUSSÃO.................................................................................................................121

5. DISCUSSÃO .................................................................................................................122

VI. CONCLUSÃO ..............................................................................................................135

6. CONCLUSÃO................................................................................................................136

VII. REFERËNCIAS...........................................................................................................137

BIBLIOGRAFICAS............................................................................................................137

7. REFERËNCIAS BIBLIOGRAFICAS..............................................................................138

VIII. ANEXOS....................................................................................................................157

ANEXO I............................................................................................................................158

ROLE OF THE CHEMOKINE RECEPTORS CCR1, CCR2 AND CCR4 IN THE

PATHOGENESIS OF EXPERIMENTAL DENGUE INFECTION IN MICE..........................158

ANEXO II...........................................................................................................................159

A DETRIMENTAL ROLE FOR INVARIANT NATURAL KILLER T CELLS IN THE

PATHOGENESIS OF DENGUE VIRUS INFECTION.........................................................159

Lista de figuras

XIX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição dos sorotipos do Dengue vírus entre os continentes 24

Figura 2: Óbitos por febre hemorrágica do dengue no Brasil em 2009 25

Figura 3: Transmissão do vírus da Dengue 25

Figura 4. Esquema simplificado para a replicação de um flavivirus

na célula do hospedeiro 29

Figura 5. Quimiocinas e seus receptores 37

Figura 6. Receptores para quimiocinas CC e sua sinalização 40

Figura 7. Vias de ativação propostas para células iNKT 51

Figura 8. Alinhamento da seqüência do DENV-2 adaptado em camundongos 70

Figura 9. Design experimental esquemático proposto para os Objetivos 1 e 2 71

Figura 10. Determinação das regiões (gates) referentes às populações leucocitárias

analisadas nos órgãos alvo 80

Figura 11. Mortalidade e perda de peso após infecção pelo DENV-2 em animais WT ou KO

para receptores de quimiocinas 82

Figura 12. Alterações hematológicas e carga viral após infecção pelo DENV-2 em animais

WT ou KO para receptores de quimiocinas 85

Figura 13. Níveis de transaminases e acúmulo de neutrófilos no tecido após infecção pelo

DENV-2 em animais WT ou KO para receptores de quimiocinas 87

Figura 14. Produção de citocinas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais WT ou

KO para receptores de quimiocinas 88

Figura 15. Alterações histológicas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais WT ou

KO para receptores de quimiocinas 89

Figura 16. Produção de quimiocinas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais WT

ou KO para receptores de quimiocinas 91

Figura 17. Produção de citocinas no soro após infecção pelo DENV-2 em animais WT ou

KO para receptores de quimiocinas 91

Figura 18. Produção de citocinas quimiocinas no baço após infecção pelo DENV-2 em

animais WT ou KO para receptores de quimiocinas 93

Figura 19. Leucócitos e perfil de ativação após infecção pelo DENV-2 em animais WT ou

KO para receptores de quimiocinas 95

Figura 20. Perfil de células NK, macrófagos e neutrófilos após infecção pelo DENV-2 em

animais WT ou KO para receptores de quimiocinas 97

Lista de figuras

Figura 21. Ativação de células iNKT durante a infecção pelo DENV-2 100

Figura 22. Produção de IFN-γ por células iNKT e NK durante a infecção pelo DENV-2 101

Figura 23. Variação do peso corporal e mortalidade induzida pelo DENV-2 em animais WT e

deficientes para iNKT (Jα18-/-) 103

Figura 24. Variação do peso corporal e mortalidade induzida pelo DENV-2 em animais WT e

deficientes para CD1d 105

Figura 25. Cinética de hemoconcentração após infecção pelo DENV-2 em animais WT e

Jα18-/- 105

Figura 26. Alterações hematológicas após infecção pelo DENV-2 em animais WT e Jα18-/-

106

Figura 27. Produção de citocinas no soro após infecção pelo DENV-2 em animais WT e

Jα18-/- 108

Figura 28. Alterações histológicas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais WT e

Jα18-/- 108

Figura 29. Produção de citocinas e quimiocinas no baço após infecção pelo DENV-2 em

animais WT e Jα18-/- 109

Figura 30. Produção de citocinas no baço após infecção pelo DENV-2 em animais WT e

Jα18-/- 111

Figura 31. Produção de citocinas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais WT e

Jα18-/- 111

Figura 32. Porcentagem e ativação de células NK durante a infecção pelo DENV-2 em

animais WT e Jα18-/- 113

Figura 33. Porcentagem e ativação de linfócitos T durante a infecção pelo DENV-2 em

animais WT e Jα18-/- 115

Figura 34. Carga viral no baço e fígado de camundongos WT e Jα18-/- após infecção pelo

DENV-2 117

Figura 35. Mortalidade, perda de peso e hematologia em camundongos WT tratados com

αGal-Cer e infectados com DENV-2 119

Figura 36. Carga viral no baço e fígado de camundongos WT tratados com αGal-Cer e

infectados com DENV-2 120

I. REVISÃO DA LITERATURA

Revisão da literatura

1. Resposta imune, os vírus e a dengue

Em termos históricos, imunidade se origina de “proteção” contra doenças

infecciosas. Células e moléculas envolvidas na imunidade formam o sistema

imunológico (ou sistema imune), componente essencial da fisiologia do organismo, e

a sua resposta coletiva e coordenada à introdução de substâncias estranhas ao

individuo é então classificada como resposta imune. O sistema imune tem como

função fisiológica essencial a defesa contra substâncias estranhas, sejam elas

macromoléculas, proteínas ou polissacarídeos, por exemplo, ou microrganismos

infecciosos (Abbas e Lichtman, 2009). A origem do termo imunidade remete ao latim

immunitas, o que se referia a proteção contra processos legais os quais senadores

romanos possuíam durante o seu mandato (Abbas e Lichtman, 2005). Tucídides,

ainda no século V a.C., foi quem utilizou o termo referindo-se a uma infecção a qual

chamou vagamente de “peste”. O conceito de imunidade pode ser ainda mais

remoto, como sugere o antigo costume na China de se estimular a imunidade das

crianças contra a varíola através da inalação de um pó da lesão cutânea obtida da

pele de pacientes se recuperando da doença (Abbas e Lichtman, 2005). Dentre a

plêiade de agentes infecciosos capazes de desencadear uma resposta por parte de

um hospedeiro destacamos aqui os vírus.

A descrição inicial dos vírus os classificou como “agentes filtráveis”, devido ao

seu reduzido tamanho permitir a passagem através de filtros utilizados então para

reter bactérias (Tortora et al., 2002). Dmitri Iwanowski descreveu o fenômeno em

1892, onde buscava desvendar a etiologia da doença do mosaico do tabaco (TMD).

Estes primeiros pesquisadores não podiam imaginar, naquela época, que partículas

submicroscópicas poderiam ser agentes causadores de doenças. Este tipo de

agente infeccioso foi então classificado como um contagium vivum fluidum ou “fluido

contagioso”. Por volta de 1930 a utilização do termo vírus, do latim “veneno”, já era

comum para descrever os chamados “agentes filtráveis”. Em 1935, Wendell Stanley

isolou finalmente o vírus do mosaico do tabaco, permitindo o desenvolvimento de

estudos químicos e estruturais com um vírus purificado, fato inédito até o momento.

De forma também importante, a invenção do microscópio eletrônico possibilitou, pela

primeira vez, a visualização de um vírus (Tortora et al., 2002).

A primeira doença humana associada a um vírus foi a febre amarela

(Chambers et al., 1990; Tortora et al., 2002). Diferentemente do observado para

Revisão da literatura

outros microrganismos, os vírus são agentes infecciosos que necessitam da

maquinaria bioquímica celular do hospedeiro para sua replicação, sendo, portanto,

classificados como parasitas intracelulares obrigatórios. São constituídos no geral

por um genoma de ácido nucléico (desoxirribonucléico) (DNA) ou ribonucléico

(RNA); empacotados em uma estrutura de constituição protéica (capsídeo) podendo

ainda apresentar uma membrana externa de origem protéica ou lipídica denominada

envelope. O vírion ainda pode conter enzimas essenciais e/ou acessórias, além de

outras proteínas (Murray et al., 2005; Madigan et al., 2006). Os vírus são capazes de

infectar uma grande variedade de populações celulares utilizando as moléculas

fisiológicas da superfície celular, como receptores para permitir sua adsorção às

células alvo. A replicação viral interfere com a síntese e função das proteínas

celulares normais e leva à lesão e, por fim, à morte da célula infectada. Em

infecções virais latentes pode haver prejuízo pelo estímulo da síntese de proteínas

que alteram determinadas funções celulares. Os mecanismos envolvendo estas

respostas são diversos e ainda não completamente descritos (Tortora et al., 2002;

Abbas e Lichtman, 2009)

O vírus da dengue merece atenção especial dentre os diversos vírus capazes

de infectar e causar doenças na espécie humana. O relato de uma infecção

semelhante à causada pelo vírus da dengue consta em uma enciclopédia de

medicina chinesa datada do ano 992 d.C. (Gubler, 1998). Benjamin Rush descreveu

na Filadélfia, em 1780, uma epidemia caracterizada por febre, dor de cabeça,

náusea e vômitos, além de intensas dores musculares e articulares, com eventuais

manifestações hemorrágicas (Rigau-Perez, 2006). Esta síndrome foi denominada

“febre quebra-ossos”. Em Madrid (1801), uma síndrome similar foi nomeada

“dengue”, que em espanhol significa melindre ou lamúria, e se refere ao estado

bastante deteriorado dos acometidos (Rigau-Perez, 1998). Ao final do século XVIII

uma doença caracterizada como dengue causou epidemias intermitentes na Ásia e

nas Américas. Entre os séculos XIX e XX o vírus se disseminou por áreas tropicais e

subtropicais (Hayes e Gubler, 1992; Monath, 1994).

A febre hemorrágica do dengue (FHD), a forma mais grave da doença, tem

seu primeiro registro datado de 1953 em Manila, no leste asiático (Halstead, 1980).

Nos últimos 60 anos, este tipo de manifestação se tornou um grave problema de

saúde pública no leste asiático e na região pacífica ocidental (Holmes e Twiddy,

2003). A cada década o número de casos, de países afetados e a distribuição

Revisão da literatura

geográfica da doença têm crescido rapidamente (Figura 1). Estima-se hoje que

cerca de três bilhões de pessoas, distribuídas por mais de 100 países, estão sob o

risco de infecção pelo vírus da Dengue (WHO). Por volta de 50 a 100 milhões de

pessoas são infectadas a cada ano e, dentre esses casos, 250 a 500 mil pessoas

desenvolvem a forma mais grave da doença (WHO).

Areas infestadas por Aedes aegypti

Areas com Aedes aegypti e epidemias de dengue

Areas infestadas por Aedes aegypti

Areas com Aedes aegypti e epidemias de dengue

Figura 1. Distribuição dos sorotipos do Dengue vírus entre os continentes. A

associação entre a presença de mais de um sorotipo do vírus com a presença de um

mosquito vetor, no caso o Aedes aegypti, é considerado como fator determinante para

estabelecimento da epidemia em determinado local. America latina e sudeste asiático são

as áreas mais criticas. Adaptado de http://www.chikungunya.in/what-causes-chikungunya-

fever.shtml.

No que diz respeito ao Brasil, o Ministério da Saúde brasileiro registrou em

2007, no período de janeiro a julho, 438.949 casos de dengue clássica, 926 casos

de FHD e a ocorrência de 98 óbitos. Outro aspecto epidemiológico relevante em

2007 relaciona-se a concentração de casos de FHD, sendo 68% das notificações

nos estados do Ceará, Rio de Janeiro, Maranhão, Pernambuco, Mato Grosso do Sul,

Amazonas e Piauí. A mesma característica é observada em relação aos óbitos,

concentrando-se 50% nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Pará e Piauí. A

análise destes dados demonstra a expressiva ocorrência dos casos de dengue em

municípios que não constituem aglomerados urbanos complexos, ou seja, aqueles

Revisão da literatura

com menos de 1.000.000 de habitantes. Por outro lado demonstra também o

impacto positivo das iniciativas realizadas em alguns grandes centros urbanos, a

exemplo do Plano Integrado de Ações de Controle da Dengue na Região

Metropolitana de Belo Horizonte, o “Pan Sem Dengue” na região metropolitana do

Rio de Janeiro e o Plano de Intensificação Verão 2007 no município de São Paulo,

que foram capazes de conter a explosão de casos nestes grandes aglomerados

urbanos. Os números relativos à epidemia de dengue no Brasil, segundo dados do

Ministério da Saúde, têm aumentado e ainda são alarmantes na esfera da saúde

publica como mostram os registros até 2009 (Figura 2).

Figura 2: Óbitos por febre hemorrágica do dengue no Brasil em 2009. Dados obtidos da

Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS) e atualizados em 15/03/2009. Adaptado de

http://portal.saude.gov.br/portal/saude/Gestor/area.cfm?id_area=1498.

1.2. A família Flaviviridae e a biologia do Dengue vírus

Os membros da família Flaviviridae representam um importante grupo de

vírus envelopados cujo genoma é constituído por RNA de fita simples positivo.

Possuem importante impacto saúde pública em função de sua ampla distribuição e

de sua grande habilidade em causar significativa morbidade e mortalidade em

humanos. Compreendem mais de 70 espécies já identificadas sendo que

Revisão da literatura

aproximadamente metade é capaz de causar doença em humanos. A maioria dos

flavivírus é transmitida aos humanos através da picada de mosquitos ou carrapatos,

mesmo que ainda existam espécies sem vetor conhecido (Chambers et al., 1990;

Mackenzie et al., 2004; Gould e Solomon, 2008; Pierson e Diamond, 2008). As

infecções causadas pelos flavivírus resultam em manifestações clínicas que variam

desde uma doença febril branda até as formas mais graves como a encefalite e a

febre hemorrágica. Dentre os importantes representantes deste grupo podemos

citar: o vírus da febre amarela, os quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV 1-4), o

vírus da encefalite japonesa, o vírus da encefalite do oeste do Nilo (West nile virus

ou WNV), o vírus da encefalite de Powassan e o vírus da encefalite de St. Louis,

entre outros. Dentre estes, os DENV 1-4 e o WNV, são considerados emergentes ou

re-emergentes, dado que nas últimas décadas a incidência de doença humana

causada por estes tem aumentado em uma taxa elevada (Chambers et al., 1990;

Pierson e Diamond, 2008).

O vírus da dengue (DENV) é o agente etiológico da mais importante

arbovirose da atualidade (Shresta, Kyle, Robert Beatty, et al., 2004). A dengue é

associada com inúmeras epidemias urbanas e é hoje a maior ameaça de saúde

pública nos países em desenvolvimento. No momento não existem tratamentos

específicos ou vacina disponível para a doença (Holmes e Twiddy, 2003; Shresta,

Kyle, Robert Beatty, et al., 2004; Pang et al., 2007; Kyle e Harris, 2008).

O DENV possui um genoma constituído por uma fita única de RNA, de

sentido positivo, como os outros flavivirus, formada por cerca de onze mil bases.

Sua tradução dá origem a uma poli-proteína grande, cujo processamento co-

traducional por enzimas virais e do hospedeiro origina três proteínas estruturais

(proteínas C, prM e E) e sete não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b

e NS5), envolvidas na replicação viral (Chambers et al., 1990). Os humanos são os

principais hospedeiros do vírus da dengue sendo que a transmissão se dá pela

picada de fêmeas do mosquito do gênero Aedes, especificamente Aedes aegypti e

Aedes albopictus (HOLMES & TWIDDY, 2003).

O modelo de desenvolvimento encontrado em países endêmicos para a

doença, especialmente nas áreas urbanas, é um dos principais fatores que fazem da

doença um grave problema de saúde publica. Suprimentos de água potável e de

serviços de saneamento inadequados levaram a um aumento na reprodução dos

mosquitos transmissores (Rigau-Perez, 1998). A grande concentração de humanos

Revisão da literatura

susceptíveis à infecção em proximidade aos mosquitos favorece dispersão do vírus

nos dois hospedeiros. O aumento da circulação de pessoas, o desenvolvimento dos

meios de transporte modernos e a negligência nas políticas de controle dos vetores

são outros fatores apontados para a disseminação da doença (Rigau-Perez, 2006).

O ciclo de transmissão do vírus da dengue tem início a partir da picada do

mosquito em uma pessoa contaminada, onde o vírus presente na circulação é

ingerido pelo artrópode (Whitehead et al., 2007) (Figura 3).

EpidêmicoSelvagem

Primatas

Humanos

EpidêmicoSelvagem

Primatas

Humanos

Figura 3: Transmissão do vírus da Dengue. Devido à alta viremia resultante da infecção

pelo vírus da Dengue em humanos, os vírus são eficientemente transmitidos entre

mosquitos e humanos, sem necessidade de outro hospedeiro para amplificação. O vírus é

disseminado especialmente pelo mosquito Aedes aegypti Um ciclo silvestre também é

descrito para o vírus no oeste africano e sudoeste asiático. Modificado de (Whitehead et al.,

2007).

Uma vez presente no mosquito, o vírus se multiplica no intestino médio e,

após algum tempo, são encontrados vírus também no ovário, sistema nervoso e nas

glândulas salivares, local este por onde o vírus é passível de transmissão. Uma vez

na circulação sanguínea de um novo hospedeiro o vírus passa a se multiplicar em

células permissivas de órgãos específicos, como baço, fígado e tecidos linfáticos.

Revisão da literatura

1.2.1. Interações com o hospedeiro

O vírus da Dengue tem tropismo por um amplo espectro de células humanas

e o principal alvo da infecção pelo vírus ainda é controverso. Há um consenso geral

de que células da linhagem fagocítica mononuclear (células dendríticas,

monócitos/macrófagos, células de Langerhans) são os alvos primários (Clyde et al.,

2006). No entanto, existem evidências de que o vírus é capaz de infectar também

linfócitos B, linfócitos T, células natural killer, células endoteliais, hepatócitos e

neurônios (Scott et al., 1980; King et al., 2002; Neves-Souza et al., 2005; Clyde et

al., 2006).

O ciclo de replicação do vírus da dengue inicia-se com a ligação do vírion e

sua entrada na célula hospedeira pelo processo de endocitose mediada por

receptor. Vários receptores celulares distintos são candidatos a mediadores da

adsorção viral, entre eles o sulfato de heparana (Chen et al., 1997; Germi et al.,

2002), heat shock protein (Hsp)-70 e Hsp-90 (Reyes-Del Valle et al., 2005),

GRP78/BiP (Jindadamrongwech et al., 2004), CD14 (Chen et al., 1999), bem como

DC-SIGN (Dendritic cell- specific intracellular adhesion molecule 3(ICAM-3)-grabbing

nonintegrin) (Navarro-Sanchez et al., 2003; Tassaneetrithep et al., 2003; Lozach et

al., 2005), LSIGN (liver/lymph node- specific ICAM-3-grabbing nonintegrin)

(Tassaneetrithep et al., 2003) e o receptor para manose (Miller et al., 2008). Após

internalização e acidificação do endossoma ocorre a fusão da membrana vesicular

com a membrana viral, permitindo a passagem do nucleocapsídeo viral para o

citoplasma e a liberação do genoma do vírus. A tradução do genoma é então

conduzida e é seguida pela síntese de uma fita de RNA de sentido negativo. Esta

fita intermediária serve como molde para a produção de múltiplas cópias da fita do

RNA viral, de sentido positivo. Após vários ciclos de tradução, níveis elevados das

proteínas “Cerne” (C, do inglês “core”), “Pré-envoltório” (prM) e “Capsídeo” (E) são

sintetizadas. Estas proteínas são arranjadas juntamente com o RNA viral, dando

origem à progênie de vírions, que é transportada pelo complexo de Golgi e

secretada (CLYDE et al., 2006). A duração deste ciclo pode variar de quatro a sete

dias, período que coincide com o aparecimento dos primeiros sintomas na infecção

humana (Figura 4).

Revisão da literatura

adsorção

entrada

liberação

tradução

replicação

montagem

liberação ESTRUTURA DO VIRION

Mecanismo de replicação

Microscopia eletronica

Nucleocapsideo

adsorção

entrada

liberação

tradução

replicação

montagem

liberação ESTRUTURA DO VIRION

Mecanismo de replicação

Microscopia eletronica

Nucleocapsideo

Figura 4. Esquema simplificado para a replicação de um flavivirus na célula do

hospedeiro. Iniciando-se com o processo de adsorção na membrana do hospedeiro,

observamos a internalização e acidificação do endossoma (entrada), fusão da membrana

vesicular com a membrana viral, liberação do nucleocapsídeo viral para o citoplasma e a

liberação do genoma do vírus. A tradução do genoma é então conduzida no rER (reticulo

endoplasmático), seguida pela síntese de uma fita de RNA de sentido negativo. Esta fita

intermediária serve como molde para a produção de múltiplas cópias da fita do RNA viral, de

sentido positivo (replicação). Após vários ciclos de tradução, níveis elevados das proteínas

estruturais são sintetizadas. Estas proteínas são arranjadas juntamente com o RNA viral,

dando origem à progênie de vírions, que é transportada pelo complexo de Golgi e secretada

(montagem e liberação). À direita: Estrutura básica de um vírion, mecanismo de replicação

do RNA e microscopia eletrônica mostrando a replicação viral intracelular. Adaptado de Tan,

2006.

Revisão da literatura

1.2.2. Manifestações da doença e modelos experimentais

A infecção pelo vírus da Dengue é caracterizada por um amplo espectro de

manifestações. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), além das

infecções assintomáticas, as infecções pelo vírus da dengue podem ser

classificadas em três categorias distintas: febre indiferenciada, febre do dengue (FD)

e febre hemorrágica do dengue (FHD) (Deen et al., 2006). A primeira apresenta

sintomas semelhantes ao de qualquer síndrome viral. A FD é a forma clássica da

infecção, e se manifesta como um quadro gripal, caracterizado por febre alta,

cefaléia, dor retro-orbital, mialgia, artralgia, náusea, vômito, diarréia, hipotensão

postural, dor abdominal, lombar e de membros inferiores. Além disso, pode haver

alterações de pele e mucosas, tais como petéquias. Mesmo sendo a forma clássica,

podem-se observar manifestações hemorrágicas como epistaxe, gengivorragia e

hemorragia digestiva (Deen et al., 2006). A FHD, forma grave da doença, possui

inicialmente as mesmas manifestações da forma clássica. Os fenômenos

hemorrágicos ocorrem no segundo ou terceiro dia da doença e manifestam-se

principalmente na pele e tubo digestivo, podendo surgir metrorragias, epistaxes,

gengivorragia e outros sangramentos (Deen et al., 2006).

Outros eventos característicos da FHD são plaquetopenia e aumento da

permeabilidade vascular, evidenciados por hemoconcentração e desenvolvimento de

efusões pleurais. A FHD pode também ser dividida em quatro graus de gravidade,

de acordo com a presença ou ausência de sangramento espontâneo e o grau de

extravasamento plasmático. A Síndrome de Choque do Dengue (SCD) se refere aos

graus III e IV da FHD, sendo que no primeiro há queda da pressão arterial e choque

hipovolêmico moderado, ao passo que no último há choque profundo, com pressão

sanguínea não detectável (Deen et al., 2006)

Até o presente momento não há tratamento específico para a doença

causada pelo vírus da dengue. O tratamento sintomático apropriado é a opção de

escolha. No entanto, o principal meio de prevenção do dengue é o controle do

mosquito vetor, um método dispendioso e geralmente ineficiente, como pode ser

comprovado pela expansão do número de casos ocorrida nos últimos anos. O

desenvolvimento de tratamentos específicos ou de uma vacina efetiva contra o vírus

tem sido considerado prioridade, inclusive pela Organização Mundial da Saúde

(Rothman, 2003). Desta forma, o desenvolvimento de modelos animais para a

Revisão da literatura

infecção pelo vírus é uma abordagem importante para estudo de potenciais alvos

terapêuticos e vacinais.

A maioria dos modelos experimentais hoje utilizados não reproduz de maneira

fidedigna as características da infecção vista em humanos (Rothman, 2003). Além

de não mimetizar as características fisiopatológicas da doença humana, os modelos

animais utilizados atualmente utilizam inóculos com cargas virais elevadas, o que

leva a uma infecção disseminada, aparentemente inconsistente com o que é visto

durante a infecção humana (Green e Rothman, 2006). Por fim, tais modelos utilizam

animais com idades precoces, muitas vezes com o sistema imune ainda em período

de maturação, o que impede a extrapolação das informações obtidas para infecção

em indivíduos adultos, como acontece na doença humana (Rothman, 2003). Souza

e colaboradores (2009) desenvolveram recentemente um modelo que reproduz as

manifestações observadas nos quadros graves da doença em humanos. Trata-se de

um modelo de infecção primária baseado na injeção de um isolado clínico do vírus

de dengue adaptado ao hospedeiro murino. A injeção do vírus adaptado é capaz de

induzir as principais manifestações características da doença humana, entre elas

plaquetopenia e hemoconcentração, na maioria das vezes com fenômenos

hemorrágicos e mortalidade apreciável. Além disso, camundongos infectados com o

vírus adaptado desenvolvem dor inflamatória, outro sintoma marcante da patologia

humana mais branda. O modelo em questão parece ser uma ferramenta

interessante para o estudo da fisiopatologia da infecção pelo dengue e novos

estudos têm elucidado mecanismos importantes envolvidos na progressão da

doença através do presente modelo (Atrasheuskaya et al., 2003; Assuncao-Miranda

et al., 2010).

1.2.3. As controvérsias e a infecção secundária pelo dengue

Existem controvérsias a respeito dos mecanismos envolvidos na

manifestação da forma hemorrágica da doença, seja durante uma infecção primária

ou secundária. Hipóteses contrastantes têm atribuído a gravidade da doença a

fatores virais e do hospedeiro (Rosen, 1977; Halstead, 1989; Rothman, 2003).

Estudos recentes no Peru e Sri Lanka demonstraram a associação da forma

hemorrágica da doença a determinados genótipos virais. Alguns determinantes

Revisão da literatura

genéticos específicos que explicariam tal associação foram identificados (Watts et

al., 1999; Messer et al., 2002; Messer et al., 2003). Estudos ainda pouco conclusivos

associam outros fatores à gravidade da doença, tais como idade, fatores genéticos e

o estado nutricional do hospedeiro (Rothman, 2003). Estudos epidemiológicos têm

associado a resposta imune do hospedeiro ao vírus e o desenvolvimento da forma

hemorrágica da infecção. Para tal, vários mecanismos têm sido considerados, tais

como deposição de complexos imunes, reação cruzada de anticorpos com endotélio

vascular, intensificação da infecção mediada por anticorpos, ativação do sistema do

complemento e seus produtos, liberação exacerbada de mediadores solúveis, como

citocinas, dentre outros (Bokisch et al., 1973; Theofilopoulos et al., 1976; Halstead,

1979; Malasit, 1987; Halstead, 1989; Markoff et al., 1991; Chungue et al., 1994;

Kurane et al., 1994; Morens, 1994; Falconar, 1997; Chaturvedi et al., 2000; Libraty et

al., 2002; Mangada et al., 2004; Lin et al., 2005)

A maioria dos dados epidemiológicos tem sugerido que o desenvolvimento da

FHD/SCD é mediado pela resposta imune do hospedeiro. Na Tailândia foi

demonstrado que em mais de 99% dos casos de FHD os indivíduos apresentaram

anticorpos heterólogos contra o sorotipo que causou a FHD (Kurane, 2007). Na

epidemia de dengue ocorrida em Cuba em 1981 pelo sorotipo 2 do vírus, a maioria

dos casos de FHD ocorreram naqueles indivíduos que adquiriram previamente

anticorpos em outras epidemias contra o sorotipo 1 nos anos de 1977 e 1978

(Guzman et al., 1990). Esses resultados sugerem que a presença de anticorpos

heterólogos após a segunda infecção pelo vírus da dengue é um fator de risco

importante para o desenvolvimento da FHD/SCD (Navarro-Sanchez et al., 2005)

Além disso, já foi demonstrado que a transferência passiva de anticorpos contra os

DENV em primatas não-humanos previamente infectados foi responsável pelo

aumento da viremia nestes animais. Estudos ainda mais recentes em humanos

demonstram correlação positiva entre o pico da viremia e a gravidade da doença,

suportando a idéia da importância do fenômeno de ADE para a patogênese.

(Vaughn et al., 2000; Rothman, 2004). Mais um exemplo importante que reforça

essa teoria é justificado pela ocorrência de FHD durante a infecção primária pelos

DENV em crianças durante o primeiro ano de vida nascidas de mães imunes aos

DENV, onde essas crianças teriam adquirido anticorpos pela via transplacentária,

fato que também sugere o papel in vivo do fenômeno de ADE nas infecções pelos

DENV (Stephenson, 2005; Halstead, 2007). Além dos anticorpos de reatividade

Revisão da literatura

cruzada contra outros sorotipos, alguns trabalhos têm relatado que anticorpos anti-

dengue podem apresentar reação cruzada com plaquetas, fatores de coagulação e

células endoteliais (Falconar, 1997). Tais anticorpos poderiam contribuir para a

patogênese durante a infecção pelo dengue por causar destruição de plaquetas

(Saito et al., 2004; Lin et al., 2006). Anticorpos anti- NS1 também parecem se ligar a

células endoteliais, levando as mesmas ao processo de apoptose (Lin et al., 2003;

Lin et al., 2006). Todos estes eventos parecem favorecer o aumento da

permeabilidade vascular característico da FHD/SCD.

Brevemente, essa teoria, chamada em inglês de antibody-dependent

enhancement (ADE), sugere que os anticorpos heterólogos pré-existentes para o

vírus da dengue reconhecem o novo vírus infectante e formam um complexo

antígeno-anticorpo de baixa avidez (incapaz de neutralizar o novo sorotipo),

entretanto, este complexo ainda assim é capaz de interagir e ser internalizado pelos

receptores Fcγ (FcγR) de imunoglobulinas presentes na membrana celular dos

leucócitos, especialmente dos monócitos e macrófagos. Esses anticorpos são

denominados anticorpos sub-neutralizantes. Uma vez que o anticorpo é heterólogo e

o vírus não é neutralizado, este permanece livre para se replicar dentro da

maquinaria celular das células da linhagem mononuclear, especialmente. O aumento

da replicação dos vírus da dengue nessas células-alvo é provavelmente responsável

pelos elevados níveis de viremia nos estágios inicias da doença, no qual também

tem sido correlacionado com a maior incidência dos casos de FHD/SCD. (Gubler,

1998; Vaughn et al., 2000; Rothman, 2004; Navarro-Sanchez et al., 2005;

Stephenson, 2005; Pang et al., 2007; Kyle et al., 2008; Yauch e Shresta, 2008)

1.3. A resposta inflamatória na infecção pelo dengue

A inflamação é definida como uma reação secundária a lesões traumáticas,

danos químicos ou físicos, de natureza auto-imune ou em resposta a agentes

infecciosos, visando a restauração da estabilidade do organismo. Ela atua de forma

importante como mecanismo de regulação fisiológica, conservado ao longo da

história evolutiva e buscando o bem estar do indivíduo (Nathan, 2002). Este tipo de

resposta do sistema imune é guiado inicialmente por componentes inatos, tais como

proteínas sinalizadoras, seus receptores e alguns grupos celulares, e posteriormente

Revisão da literatura

com participação de elementos da imunidade adquirida. Modificações na micro-

circulação, migração leucocitária através do leito vascular e liberação de moléculas

solúveis nos tecidos danificados são as principais características do processo

(Nathan, 2002).

1.3.1. Mediadores inflamatórios: citocinas e quimiocinas

Os mediadores inflamatórios são moléculas solúveis de atuação local ou

sistêmica que são liberadas ou produzidas em face a uma lesão ou estimulo. São

originários do plasma, de células inflamatórias ou dos tecidos lesados, e apresentam

redundância funcional. Sistemas derivados do plasma, tais como complemento,

cininas e fibrinogênio, são ativados e seus produtos serão responsáveis pelos

efeitos inflamatórios, assim como os produtos de células que produzem mediadores

lipídicos, espécies reativas de oxigênio, citocinas e quimiocinas (Margolius, 1995;

Carroll, 1998; Nathan, 2002).

As citocinas são proteínas secretadas e possuem como função regular a

resposta imune, podendo regular também o tráfego e organização celulares em

órgãos linfóides. As citocinas, em geral, agem como fatores de crescimento na

diferenciação e proliferação celular, e também na maturação de células na medula

óssea. Algumas são quimiotáticas e possuem propriedades ativadoras e

supressoras, incluindo indução da morte celular programada nos mais diversos

grupos celulares que determinam a natureza da resposta imune (Borish e Steinke,

2003; Commins et al., 2010). Dentre elas, destacamos algumas citocinas pró-

inflamatórias clássicas, como a IL-1β (Interleucina-1 β), IL-6 e TNF-α, que causam

modificações locais, tais como edema e exsudação, ou podem agir de forma

sistêmica quando sinalizando de forma parácrina, maturando e recrutando leucócitos

da medula e até desencadear febre (Nathan, 2002; Borish e Steinke, 2003; Steinke e

Borish, 2006). O Interferon-γ (IFN-γ) é um mediador relacionado a respostas virais,

inibindo muitas vezes sua replicação, e é produzido especialmente por linfócitos e

células Natural Killer, atuando também na apresentação de antígeno, expressão de

moléculas de MHC (Complexo de Histocompatibilidade Principal) do tipo I e II, e

estimulação da secreção de citocinas nos demais leucócitos (Borish e Steinke,

2003). Pertencentes a família das citocinas, as quimiocinas, denominadas citocinas

Revisão da literatura

quimioatrativas (Murphy, 1994), desempenham um importante papel em processos

inflamatórios, primeiramente por guiarem o recrutamento e ativação de leucócitos no

sítio inflamatório e também por participarem dos processo de resolução e reparo

(Wynn, 2008).

1.3.1.1. Citocinas e a infecção pelo dengue

Existe uma grande produção de citocinas durante a FHD/SCD, liberadas

principalmente por linfócitos T, monócitos/macrófagos e células endoteliais; e a

expressão de muitos de seus receptores é encontrada no soro dos pacientes com

FHD/SCD em relação aos pacientes com a forma clássica da doença (FD). As

citocinas comumente encontradas em altos níveis no soro de pacientes com FHD

incluem TNF-α, IFN-γ e várias interleucinas: IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-1β

(Chaturvedi et al., 2000; Dewi et al., 2004; Green e Rothman, 2006; Kurane, 2007;

Pang et al., 2007). As citocinas desempenham papel fundamental na

imunopatogênese da infecção pelo vírus da dengue. Isto se deve especificamente

ao papel pró-inflamatório que elas exercem sobre as células endoteliais. O TNF-α foi

a primeira citocina a ser implicada na patogênese da FHD (Chaturvedi, 2006). Ela

pode atuar localmente na ativação de macrófagos, entretanto a sua atividade

sistêmica pode levar ao aumento da permeabilidade vascular (Clyde et al., 2006;

Kurane, 2007). O soro de pacientes com infecção aguda pelos DENV tem níveis

aumentados de TNF-α (Vitarana et al., 1991; Hober et al., 1993; Hober et al., 1996;

Chaturvedi et al., 2000; Chaturvedi, 2006). A associação de TNF-α com as

manifestações mais graves da doença é também confirmada por diferentes modelos

animais (Atrasheuskaya et al., 2003; Shresta et al., 2006) e por estudos in vitro

(Dewi et al., 2004; Chua et al., 2005). O papel do TNF-α no aumento da

permeabilidade vascular das células endoteliais já é bem conhecido. Além disso, o

TNF-α é capaz de induzir a liberação de uma gama de outras citocinas e

quimiocinas com atividade pró-inflamatória (Dewi et al., 2004).

Revisão da literatura

1.3.1.2. Quimiocinas: função e estrutura

Quimiocinas são grupos de moléculas relativamente pequenas (8 a 12 kDa)

pertencentes a classe das citocinas, as quais exercem importante papel na biologia

dos leucócitos, uma vez que controlam atividades de recrutamento e de ativação nos

estados basal e inflamatório, guiando e direcionando os movimentos dos leucócitos

(Luster, 1998). Além disso, outros tipos celulares, incluindo células epiteliais,

endoteliais, do músculo liso e parênquimais, sofrem ação das quimiocinas

(Mantovani, 1999; Locati et al., 2002). São atribuídas às quimiocinas e seus

receptores as propriedades de haptotaxia de leucócitos, controle da proliferação,

embriogênese. Durante um processo patofisiológico, as quimiocinas contribuem para

angiogênese, recrutamento e transmigração de leucócitos, remodelamento vascular

e tecidual, eliminação de patógenos, apresentação de antígenos, cronificação da

inflamação e reparo/cicatrização de tecidos, fibrose, tumorogênese e também são

co-receptores para HIV (Murphy, 1994; Locati e Murphy, 1999; Mantovani, 1999;

Locati et al., 2002; Rosenkilde e Schwartz, 2004; Dorner et al., 2009). Desta forma,

quimiocinas são consideradas importantes tanto na homeostase quanto na

patogênese de doenças.

O sistema de quimiocinas em mamíferos é complexo, compreendendo cerca

de 50 ligantes, constitutivos ou induzidos, e 20 receptores de sete domínios

transmêmbranares pertencentes à classe A dos receptores acoplados a proteína G

(GPCR) do tipo rhodopisin-like (Thelen e Stein, 2008). As quimiocinas são

consideravelmente promíscuas quanto à ativação de receptores (Figura 5). Neste

sistema encontramos uma redundância funcional: a maioria dos receptores interage

com vários ligantes e a maioria das quimiocinas interage com mais de um receptor

(Mantovani, 1999). Atualmente são conhecidas 28 quimiocinas CC (CCL1-28), 16

quimiocinas CXC (CXCL1-16), duas quimiocinas C (XCL1-2), uma CX3C (CX3CL1)

e uma C6C (CCL21) que interagem com 10 receptores CC (CCR1-10), seis

receptores CXC (CXCR1-6), um receptor XC (XCR1) e um receptor CX3C

(CX3CR1), respectivamente (Locati et al., 2002); alguns receptores não possuem

ligantes conhecidos e são classificados como sendo do tipo órfão. Os receptores de

quimiocinas são estruturalmente relacionadas e sub-classificados de acordo com a

posição relativa dos resíduos de cisteína conservados.

Revisão da literatura

Quimiocinas

Nomes Nomes

Comuns sistematicos

Receptores

Quimiocinas

Nomes Nomes

Comuns sistematicos

Receptores

Figura 5. Quimiocinas e seus receptores. Estão representados no esquema (a direita),

classificadas por seus nomes comuns e sistemáticos, as quimiocinas das famílias CC

(CCL1-28), CXC (CXCL1-16), C (XCL1-2) e CX3C (CX3CL1) que interagem com 10

receptores, representado a direita, sendo CC (CCR1-10), seis receptores CXC (CXCR1-6),

um receptor XC (XCR1) e um receptor CX3C (CX3CR1). Adaptado de (Proudfoot, 2002).

Revisão da literatura

Os membros do grupo de quimiocinas mais numeroso, CC ou a subfamília de

quimiocinas–β, tem as primeiras duas cisteínas adjacentes. As 28 quimiocinas que

compõem esse grupo (CCL1-CCL28) interagem com 10 receptores (CCR1-CCR10),

sendo que um mesmo receptor pode interagir com mais de uma quimiocina e uma

mesma quimiocina pode se ligar com alta afinidade a mais de um tipo de receptor

desta classe (Mantovani, 1999; Locati et al., 2002).

As quimiocinas são peptídeos que tem afinidade de ligação a heparanas

sulfatadas, heparina e glicosaminoglicanas na matriz extracelular, que servem de

sítio de ancoragem destes mediadores e possuem a capacidade de criar um

gradiente de quimiocinas essencial para o processo de haptotaxia (Proudfoot et al.,

2003; Johnson et al., 2004). Durante um processo inflamatório, várias proteases, tais

como serino-proteases, metaloproteinases e dipeptidil peptidases, regulam a

atividade biológicas das quimiocinas. Através de clivagem estas são liberadas de

seus sítios de fixação na matriz, de forma a criar um gradiente de concentração

causado pela sua solubilização, podendo também se tornar ativas ou inativas, ou

mudar funcionalmente de agonistas para antagonistas de seus receptores (Allen et

al., 2007). Quimiocinas também agem naturalmente como antagonistas de

receptores de sua mesma classe, independente de clivagem. Como exemplo,

podemos citar alguns agonistas de receptores do tipo CXCR, que exercem funções

como antagonistas de receptores CCR. Desta forma, uma quimiocina é agonista de

seu respectivo receptor, mas exibe capacidade inibitória de outros receptores de

quimiocinas, impedindo ou competindo pela ligação (Ogilvie et al., 2001; Ogilvie et

al., 2003).

Como visto na Figura 6, o domínio de interação dos receptores de

quimiocinas consiste em três voltas extracelulares e uma porção amino-terminal, que

se unem para ligar ao núcleo da quimiocina ligante (Allen et al., 2007). A sinalização

mediada pela formação do complexo quimiocina:receptor causa uma mudança

conformacional na estrutura terciária deste receptor e subseqüente endocitose, que

dispara sinais de ativação intracelulares. A dissociação das subunidades Gα e Gβγ

causada pela sinalização do receptor de quimiocinas disparam a ativação de

adenilato ciclase, fosfolipase-Cβ, PI3K, GTPases pequenas e canais iônicos, que

levam ao aumento dos níveis de AMP (adenosina monofosfato) cíclico, inositol

trifosfato (IP3) e cálcio intracelular, alterando o estado de ativação celular (Murphy,

1994). Dentre estas alterações encontramos a polimerização de filamentos de actina

Revisão da literatura

e polarização celular, aumento da capacidade fagocítica e aumento da sobrevida

celular, translocação de NF-kB e transcrição de genes pró-inflamatórios, com

aumento de produção de quimiocinas e expressão de seus receptores via de novo

(Mantovani, 1999; Allen et al., 2007; Thelen e Stein, 2008).

A interação da quimiocina com seu receptor, além de ativar as vias de

sinalização intracelular leva à modificação de vacúolos e organelas citoplasmáticas,

necessária para duas funções básicas: (i) reciclagem de receptores, e (ii)

degradação de quimiocinas e receptores. Estas duas funções são de extrema

importância para a regulação dos níveis de receptores na membrana, proferindo

capacidade regulatória sobre a atividade celular e, também, como mecanismo de

controle pós-transcricional dos níveis de quimiocinas pela sua atividade como

scavenger natural, tanto em condições patológicas como homeostáticas,

respectivamente (Mantovani et al., 2006; Cardona et al., 2008; Mantovani e Locati,

2008). Após a ligação da molécula com seu receptor, este é internalizado

rapidamente via endocitose mediada por clatrina, associada principalmente a duas

moléculas adaptadoras, adaptina 2 (AP-2) e B-arrestina, em um processo

dependente de GTPases pequenas. Então, os complexos quimiocina:receptor são

dissociados pela acidificação dos endossomas, que se fundem aos lisossomos

imaturos (early) onde as quimiocinas são degradadas pela ação do baixo pH destas

vesículas. Posteriormente, os receptores são ubiquitinados e degradados nos

lisossomos maduros (late). Alternativamente, os endossomos ácidos contendo

receptores se fundem ao retículo endoplasmático com posterior fusão com a

membrana celular, completando a reciclagem do receptor. Várias modificações nos

receptores, tais como nas quimiocinas, também alteram a citrulinação, palmitolação,

sulfatação e glicosilação, interferindo na sua sinalização, tráfego e reciclagem (Neel

et al., 2005; Marchese, 2009)

Os receptores de quimiocinas estão distribuídos na superfície celular e

funcionam como sensores do meio externo atuando de forma dinâmica, quando

transmitem sinais químicos extracelulares até o seu núcleo. Precisamente, estão

localizados em “lipid rafts”, que são micelas flutuantes de colesterol presentes na

membrana celular, importantes para o processo de oligodimerização de receptores,

tanto na forma homodímera como heterodímeros, contribuindo para uma alteração

da estrutura quaternária destes. A mudança estrutural atribui novas propriedades

funcionais como co-internalização e até dessensibilização cruzada do receptor. Da

Revisão da literatura

mesma forma, quimiocinas se homo- ou hetero-oligomerizam de forma natural nos

organismos quando presentes em altas concentrações, potencializando suas

atividades sobre seus receptores (Thelen e Stein, 2008; Thelen et al., 2010).

Figura 6. Receptores para quimiocinas CC e sua sinalização. O presente esquema

mostra como os receptores para quimiocinas, neste caso da família CC, são agrupados de

acordo com sua especificidade relacionada ao tipo de interação entre proteínas G. O

esquema identifica as subunidades heterotrimericas das proteínas G normalmente

relacionadas a diversos receptores de quimiocinas da família CC, assim como as vias de

sinalização comuns a maioria dos tipos celulares relacionados à resposta inflamatória. As

linhas pontilhadas indicam alguns mecanismos de ativação onde proteínas envolvidas ainda

não foram completamente identificadas. Varias vias de sinalização e proteínas, incluindo

MAP quinases, JNK e ERK, e fatores de transcrição como NFkB, estão envolvidos na

produção, por exemplo, de citocinas e quimiocinas em respostas a patógenos e outros

estimulos (New e Wong, 2003).

Revisão da literatura

1.3.1.3. Quimiocinas da família CC e infecções virais

Além de constituir o grupo mais numeroso de quimiocinas e de possuir um

amplo espectro de funções na resposta inflamatória, diversas evidências

experimentais e epidemiológicas sugerem um importante papel para as quimiocinas

CC e seus receptores em infecções virais. Dentre as fisiopatologias mais estudadas,

e intimamente ligadas com o sistema de quimiocinas, se encontram as infecções

pelo HIV (vírus da Imunodeficiência humana), pelo WNV e pelo HCV (vírus da

hepatite C).

O HIV usa moléculas de membrana como o CD4 e os receptores para

quimiocinas CCR5 e CXCR4 para invadir a célula do hospedeiro. Os linfócitos T,

macrófagos, células dendríticas e outras células apresentadoras de antígenos

expressam a molécula CD4 primariamente. As células de Langerhans ou monócitos/

macrófagos expressam o co-receptor CCR5 de quimiocinas e permitem a infecção

por cepas com tropismo por monócitos (M-Tropic). Já os linfócitos T CD4+

expressam o co-receptor CXCR4, que se liga somente em cepas virais com tropismo

para células T (T-Tropic). As células T CD4+ primárias possuem ambos co-

receptores (CCR5 e CXCR4), podendo ser infectadas tanto pelas cepas virais M

quanto T (Fauci, 1996; Moriuchi et al., 1996). A afinidade do HIV-1 a co-receptores

específicos é um fator determinante para o tropismo celular das diferentes cepas do

vírus. A importância fisiopatológica destes co-receptores é demonstrada pelo fato de

que indivíduos que possuem mutações nos genes ccr5 e cxcr4 são resistentes à

infecção pelo HIV-1 (Harouse, Bhat, et al., 1991; Harouse, Laughlin, et al., 1991),

talvez porque estes co-receptores se ligam às quimiocinas controladoras da ativação

e migração de vários leucócitos aos sítios de infecção.

O WNV induz febre e, menos comumente, complicações neurológicas,

incluindo encefalite, que é o alvo dos modelos experimentais em uso. Em

camundongos observa-se o recrutamento maciço de células B, T (CD8+ e γδ),

células NK, além de macrófagos. Dentre as moléculas mais estudadas nestes

modelos estão o receptor CCR5 e seus ligantes CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β e

CCL5/RANTES. O receptor CCR1, o qual compartilha ligantes com o CCR5, também

tem sua expressão aumentada. Os receptores CCR2 e CCR3 parecem ser os

menos proeminentes. Camundongos KO para estes receptores de quimiocinas

mostram graus diferentes de susceptibilidade, sendo que o animal CCR5 KO é o

Revisão da literatura

mais susceptível deles, uma vez que o receptor CCR5, na infecção por WNV é quem

regula o recrutamento leucocitário para o SNC. Aproximadamente 20% dos linfócitos

T, células NK e macrófagos presentes no SNC de animais infectados por WNV

expressam CCR5. O uso de anticorpos anti-quimiocinas ligantes de CCR5, 1 ou 3

também levam a um fenótipo similar ao dos animais CCR5 KO, demonstrado que o

sistema de quimiocinas rege a infecção viral em nível de receptor e ligante (Glass et

al., 2005; Lim et al., 2006; Lim et al., 2008; Lim et al., 2010). A função do CCR5, e

receptores para quimiocinas associados, parecem mediar diretamente o clearance

viral e a progressão da doença do que modular a resposta imune de forma indireta,

como em outros modelos experimentais de infecção viral ou por outro microrganismo

(Klein e Diamond, 2008).

O recrutamento de células T para o fígado na infecção pelo HCV é um passo

essencial para a eliminação do vírus. O movimento leucocitário a favor do gradiente

de quimiocinas e a expressão seletiva de receptores para quimiocinas em células T

são eventos chave no processo de recrutamento na infecção por HCV. Lichterfeld e

colaboradores (2002) demonstraram a diminuição na expressão do receptor CCR5

na superfície de células CD4+ e CD8+ de pacientes com HCV, resultando em um

menor recrutamento de leucócitos em resposta a CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β e

CCL5/RANTES. O mecanismo pelo qual o HCV interfere na expressão de CCR5

parece ser resultante da interação de proteínas virais com receptores de membrana,

como CD81 (Nattermann et al., 2004; Nattermann et al., 2006). CCL5/RANTES, em

face da donwregulation de CCR5 por interação por interação proteína viral-CD81,

tem sua produção aumentada e parece potencializar a internalização de mais

receptores CCR5, e também CCR1 e CCR3, uma vez que é capaz de se ligar a

estes dois receptores. CCL3/MIP-1α e CCL4/MIP-1β parecem não contribuir para

este fenômeno. Este mecanismo leva a deficiência de recrutamento leucocitário para

órgãos alvo, o que favorece a proliferação viral e a cronificação da doença

(Lichterfeld et al., 2002; Ajuebor et al., 2004).

1.3.1.4. Quimiocinas na resposta a infecção pelo dengue

Estudos clínicos recentes têm sugerido um papel fundamental para citocinas

na patogênese da FHD (Rothman, 2003; Navarro-Sanchez et al., 2005; Green e

Revisão da literatura

Rothman, 2006). TNF-α, IL-1β e IL-6 têm sido especialmente associadas com a

severidade da doença, sendo considerados marcadores de ativação e severidade da

infecção. Embora o sistema de citocinas/quimiocinas seja complexo e mal elucidado

no contexto da infecção pelo vírus da dengue, estas moléculas parecem representar

marcadores interessantes para a triagem de pacientes e para o prognostico da

doença. O interesse em definir marcadores e elucidar sua associação com os

eventos que culminam no quadro grave da infecção pode levar a futuras estratégias

terapêuticas e atenuar o impacto social e econômico da doença nas regiões mais

afetadas. Nestes termos, quimiocinas e citocinas já têm sido usadas como

marcadores em doenças como a hepatite C, ARDS (Síndrome da Angústia

Respiratória Adulta) e sepse (Bouros et al., 2004; Wright et al., 2005; Bozza et al.,

2007).

No que diz respeito à quimiocinas, a carência de modelos experimentais e a

variabilidade de cepas virais controladas para estudo não permitiram até o momento

a caracterização satisfatória do sistema de quimiocinas na infecção por este vírus.

Alguns estudos com amostras de pacientes apresentado tanto FD como FHD têm

sido feitos em busca de correlações que ajudem a entender a fisiopatologia em

termos celulares e moleculares. Já existem alguns trabalhos demonstrando o papel

da quimiocina MCP-1/CCL2 e MIP-1α/ CCL3 na infecção pelo dengue. Estas

quimiocinas são capazes de recrutar monócitos, linfócitos T e células natural killer,

sendo estas envolvidas na fisiopatologia da infecção. Elas são capazes também,

quando produzidas em grandes concentrações, de atuar em células endoteliais

causando permeabilidade vascular e contribuindo para o extravasamento de plasma,

evento critico na FHD (Stamatovic et al., 2003; Deshmane et al., 2009).

A maioria dos estudos envolvendo MCP-1/CCL2 e MIP-1α/ CCL3 em dengue

estão focados na ação destas quimiocinas em células endoteliais, o que levaria a

redução das junções entre estas células, facilitando o fenômeno de extravasamento.

Entretanto, a função destas quimiocinas é provavelmente subestimada. Pouco se

sabe sobre os tipos celulares envolvidos nesta produção e a cinética de

aparecimento destas moléculas quando correlacionada com a severidade da

doença. Sierra e colaboradores (2010) demonstraram de forma importante que

MCP-1/CCL2 e MIP-1α/ CCL3 possuem um papel importante na resposta inicial a

infecção em estudos de ADE ex vivo, onde estas quimiocinas são produzidas em

altos níveis em pacientes imunizados com DENV-1 e DENV-3, o que coincide com a

Revisão da literatura

produção maciça de TNF- α e IFN-γ (Sierra et al., 2010). Desta forma, os autores

sugerem que uma re-infecção com diferente sorotipo do vírus parece contribuir para

uma maior produção destas quimiocinas do que o observado na infecção primaria.

Além do mais, linfócitos T CD4+ e CD8+, incluindo células T de memória, são

capazes de produzir tanto MCP-1/CCL2 como MIP-1α/ CCL3 após re-estimulação

(Riley et al., 1998; Yang e Mosmann, 2004). CCL2 e CCL3 podem estar associados

então a uma expansão preferencial de células de T de memória com reatividade

cruzada a determinados sorotipos, o que tem sido atribuído como importante fator

para a FHD, onde estes pacientes apresentam ativação de células T bastante

aumentada em comparação a pacientes com FD. Este fenótipo é associado ao

aumento significativo de TNF- α e IFN-γ (Kalayanarooj et al., 1997; Rothman, 2003;

2004; Green e Rothman, 2006).

MCP-1/CCL2 tem seus efeitos mediados pelo receptor CCR2. O papel pró-

inflamatório de CCR2 depende basicamente de sua expressão em APCs (células

apresentadoras de antígeno) e em células T (Deshmane et al., 2009). A

superexpressão de MCP-1/CCL2 induzida pelo DENV em pacientes é transiente e

sistemática quando comparada a doenças crônicas. Avirutnan e colaboradores

(1998) foram os primeiros a demonstrar a superexpressão de CCL2 no soro de

pacientes com dengue. Lee e colaboradores (2006) demonstraram que a expressão

de CCL2 em pacientes com FHD é muito maior do que a observada em pacientes

com FD. Lin e colaboradores (2005) demonstraram de forma interessante que o

anticorpo anti-DENV NS1 se liga a células endoteliais vasculares e induz a

expressão de CCL2, o que leva a expressão de ICAM-1 e a uma maior adesão de

leucócitos ao endotélio. Entretanto os autores não demonstraram se MCP-1/CCL2

produzido por monócitos infectados são capazes de estimular a expressão de

moléculas de adesão e contribuir para a inflamação no contexto de recrutamento e

ativação de leucócitos.

Em conjunto, os estudos acerca de CCL2 e CCL3 ainda estão bastante

restritos a fenômenos vasculares pontuais e a ativação de tipos celulares em

situações não naturais. Entretanto estes dados já sugerem que a produção inicial,

especialmente de MCP-1/CCL2, parece contribuir de forma importante para o

fenômeno de extravasamento vascular observado na FHD (Avirutnan et al., 1998;

Lin et al., 2005; Lee et al., 2006; Sierra et al., 2010)

Revisão da literatura

RANTES/CCL5 (regulated upon activation, normal T cell expressed and

secreted) é uma quimiocina ligante dos receptores CCR1 e CCR5 com atividade

quimiotática para linfócitos T, monócitos, células NK, entre outras (Schall et al.,

1990). Algumas infecções causadas por vírus podem levar a expressão de CCL5 em

uma grande variedade de células (Avirutnan et al., 1998; Matsukura et al., 1998;

Thomas et al., 1998), sendo que a expressão de CCL5 parece ser um evento

importante na resposta do hospedeiro a infecções.

Lin e colaboradores (2005) encontraram uma importante correlação entre a

produção de RANTES/CCL5 em células hepáticas e a infecção pelo dengue. De

forma interessante, esta produção parece estar intimamente associada à ativação de

vias de estresse oxidativo e com a produção de IL-6, ambos importantes mediadores

da resposta inflamatória e comumente associados ao choque. Entretanto, a relação

entre a produção de CCL5 e os níveis de transaminases hepáticas, marcadores de

lesão, não esta correlacionada, sugerindo que níveis elevados de RANTES/CCL5

não podem ser diretamente correlacionados com disfunção ou lesão hepática.

Hepatocitos parecem ser grandes produtores de RANTES/CCL5, e apesar desta

correlação não estar estabelecida, a quimiocina parece mediar outros eventos, como

por exemplo, o recrutamento e ativação de leucócitos durante a infecção,

favorecendo a perpetuação da resposta inflamatória (Lin et al., 2000; King et al.,

2002; Glass et al., 2003; Lin et al., 2005; Conceicao et al., 2010). Assim como MCP-

1/CCL2, a literatura para RANTES/CCL5 na infecção pelo DENV permanece pouco

fundamentada.

Dentre os mais importantes eventos do processo inflamatório em doenças

infecciosas podemos citar o recrutamento, acúmulo e ativação de leucócitos em

órgãos alvo, onde contribuem para a produção de citocinas/quimiocinas e para

eventual lesão tecidual. Evento este que se retro-alimenta e contribui muitas vezes

para a morte do hospedeiro em função de uma exacerbação da resposta contra o

patógeno. Não existem estudos em dengue onde se correlaciona eventos essenciais

como a produção de mediadores inflamatórios (citocinas/quimiocinas), o papel de

seus respectivos receptores e seus efeitos em determinados tipos celulares. Células

T CD4, CD8 e NK têm sido sugeridas como fundamentais na infecção pelo vírus da

dengue (Liu et al., 2002; Shresta, Kyle, Robert Beatty, et al., 2004; Shresta, Kyle,

Snider, et al., 2004; Chau et al., 2008). Entretanto, estudos restritos a amostras de

pacientes e modelos experimentais em camundongos imunodeficientes levam a

Revisão da literatura

conclusões um tanto quanto precipitadas se colocarmos a infecção pelo dengue em

um contexto maior, como por exemplo, quando comparada a outras infecções

melhor estabelecidas, como HCV ou WNV.

A carência de modelos experimentais apropriados assim como a escassez de

literatura contundente envolvendo pacientes torna urgente este tipo de estudo. Uma

estruturação um pouco mais elaborada de tipos celulares e mediadores chave

envolvidos na infecção pelo dengue contribuiria para tanto para a compreensão da

fisiopatologia como para o estudo de drogas capazes de reduzir os sintomas e

manifestações das formas graves da doença.

1.4. Células NKT invariantes (iNKT)

1.4.1. Definição e distribuição

As células iNKT fazem parte de um subtipo único de linfócitos T e apresentam

um fenótipo hibrido de células NK e células T convencionais. Por esta razão, uma

origem tímica e extra- tímica para células NKT tem sido sugeridas (Levitsky et al.,

1991; Makino et al., 1996). No entanto, existem poucas evidências de que a via

extra-timica possui um papel fundamental no desenvolvimento de células NKT.

iNKTs expressam a lectina do tipo c CD161 (também conhecida como NK1.1 e

encontrada em algumas linhagens de camundongos) além de um TCR invariante.

Embora a maioria das células NKT pertença às populações CD4- CD8- (duplo-

negativas) ou CD4+ CD8-, um subtipo destas células caracterizadas como CD4-

CD8+ são encontrados em humanos (Cerundolo et al., 2009; Yuling et al., 2009).

Células NKT são geralmente divididas em dois subtipos: tipo I e tipo II (Swain,

2008). A maioria das células NKT pertence ao tipo I e expressam um TCR invariante

ao contrario de células T convencionais, vindo daí a sua classificação como “iNKT”.

Diversas evidências bastantes consistentes levantadas na ultima década ressaltam

a importância destas células em respostas imunes contra diversos agentes

infecciosos. Por outro lado, células NKT do tipo II, também conhecidas como vNKT

(não-clássicas ou não-invariantes) expressam um repertório mais diversificado de

TCR, e seu papel na regulação ou ativação da resposta imune são ainda pouco

estudados (Ambrosino et al., 2007; Halder et al., 2007; Arrenberg et al., 2009).

Revisão da literatura

No que diz respeito a sua distribuição, as células iNKT são encontradas em

pequeno número no timo, baço, medula óssea, sangue e linfonodos. E ao contrario

do encontrado em outros tecidos, células iNKT de camundongos são encontradas

em abundância no fígado (representam 40% dos linfócitos intra-hepáticos) (Eberl et

al., 1999). Este número esta reduzido para aproximadamente 12% no fígado de

humanos (Swain, 2008).

Em camundongos, as células iNKT expressam um rearranjo Vα14-Jα18 com

uma região invariante CDR3 que é tipicamente co-expressa com cada uma das mais

diversas cadeias Vβ8.2, Vβ2 ou Vβ7. Em humanos, as células iNKT expressam um

rearranjo invariante Vα24-Jα18 com Vβ11, que são os ortólogos humanos de Vα14 e

Vβ8 presentes em camundongos, respectivamente (Kronenberg, 2005). Os TCRs de

células iNKT reconhecem tipicamente antígenos de estrutura glicolipídica,

apresentados através de moléculas CD1d presentes em APCs como células

dendriticas (DCs), macrófagos e células B. Após apresentação via APCs e estímulo

de seu TCR, as células iNKT são ativadas e produzem grandes concentrações de

citocinas do tipo Th1 (i.e. IFN-γ) e/ou do tipo Th2 (i.e. IL-4). A sua importância na

regulação da resposta imune e na prevenção de doenças auto-imunes já é

conhecida (Sharif et al., 2001; Sharif et al., 2002; Wu e Van Kaer, 2009). Além de

seus papéis imunoregulatórios, as células iNKT participam de forma importante no

reconhecimento e resposta em infecções microbianas (Kinjo et al., 2005).

1.4.2. A molécula CD1d

Logo após a síntese no reticulo endoplasmático (RE), as moléculas CD1d se

ligam a fosfolípides endógenos que facilitam a saída do RE e seu transporte para a

superfície celular (Joyce e Van Kaer, 2003; Major et al., 2006; Barral e Brenner,

2007). Trabalhos recentes indicam que a ligação de fosfolípides a CD1d no RE

envolvem a ação da proteína de transferência de triglicerídeo microssomal, que se

trata de uma proteína de transferência de lipídios (PTL) capaz de desempenhar um

importante papel na montagem da apolípoproteina B (apoB) com lipídeos no RE.

A molécula CD1d de superfície é então internalizada por endocitose mediada

por clatrina, processo este que depende de um motivo baseado em tirosina presente

na cauda citoplasmática da molécula CD1d. Em complemento a esta via, já foi

Revisão da literatura

relatado que um subtipo de moléculas CD1d alcançam compartimentos

endossomais após associação com a cadeia invariante associada ao MHC de

classe II no RE. Em endossomas mais tardios, os fosfolipídios formados no RE são

trocados por lipídios antigênicos que podem ativar células iNKT. Estes glicolípides

podem ser derivados de fontes endógenas, como, por exemplo, o iGb3 lisossomal,

ou então de fontes exógenas. Múltiplas vias podem ser acionadas para fornecer

glicolípides exógenos ao compartimento de formação de CD1d: (a) fagocitose de

micróbios ou seus produtos, (b) associação de manose com glicolípides através do

receptor de manose, (c) associação de proteínas de baixa densidade (LDL)

modificadas por receptores scavenger, e (d) internalização de complexos lipídicos

contendo apoE (apolipoproteina E) através do receptor para LDL ou receptores para

outras lipoproteínas relacionadas.

Após a sua chegada em compartimentos endossomais tardios, glicolípides

endógenos ou exógenos podem passar por processamento (i.e. por hidrolases de

carboidratos), seguido por sua associação com CD1d com a ajuda de uma

variedade de PTLs, incluindo saposinas. Estes complexos antigênicos CD1d-

glicolípides são então disponibilizados na superfície celular para o reconhecimento

por células iNKT. Têm ficado claro nos últimos anos que uma grande variedade de

patógenos virais, como o herpes vírus associado ao Sarcoma de Kaposii, o HIV-1, o

herpes simplex-1, o vírus da estomatite vesicular e o Vaccinia virus podem interferir

no trafico intracelular de CD1d e, desta forma, impedir a apresentação de

glicolípides antigênicos às células iNKT (Van Kaer e Joyce, 2006). Além do mais,

Chlamydia trachomatis é capaz de regular negativamente a expressão de CD1d em

células epiteliais humanas através de sua degradação, utilizando tanto proteasomas

celulares como clamidiais (Kawana et al., 2007).

1.4.3. Reconhecimento de antígenos glicolipídicos por células iNKT

Devido a sua limitada diversidade, o TCR de células iNKT é mais associado

aos receptores de reconhecimento de padrões expressos em células do sistema

imune inato do que os variados receptores antígeno-especificos expressos por

células da resposta imune adaptativa. Por haver uma propensão em reagir com

células autólogas, tem se considerado que células iNKT reconhecem tanto

Revisão da literatura

glicolípides endógenos como exógenos (Joyce et al., 1998; De Silva et al., 2002). O

iGb3 foi o primeiro ligante endógeno de CD1d a ser identificado, o que facilitou o

estudo da ativação de células iNKT na ausência de um lipídeo antigênico, neste

caso utilizando um camundongo deficiente em iGb3 (hexB

-/-

) (Zhou et al., 2004).

Entretanto, muito pouco ainda se conhece sobre os ligantes endógenos que podem

ser ativadores de células iNKT. Além do mais, a importância de iGb3 como um

ligante fisiológico para células iNKT é ainda bastante contestado.

Todas as células iNKT de camundongos e humanos são capazes de reagir

com o αGal-Cer (α-Galactosil-Ceramida) (Kawano et al., 1997), um glicoesfingolipide

isolado da esponja marinha Agelas mauritianus durante uma triagem de produtos

naturais com atividade anti-metastatica em camundongos. Muitos pesquisadores

têm especulado que este composto pode ter se originado de microrganismos

presentes na esponja (Kinjo et al., 2005). O αGal-Cer é um potente agonista de

células iNKT e tem sido bastante estudado, principalmente no que diz respeito a sua

interação com CD1d e com a o TCR invariante de células iNKT, suas atividades

imunomodulatórias e suas propriedades terapêuticas.

Como já citado, as células iNKT reconhecem glicolípides apresentados por

moléculas semelhantes ao MHC-I, mas essencialmente por moléculas menos

polimórficas, CD1d, presentes em APCs. O mecanismo de ligação do antígeno nos

bolsos hidrofóbicos da molécula CD1d e sua interação com o TCR de células iNKT

já foram descritos anteriormente em detalhes (Godfrey et al., 2005).

1.4.4. Vias de ativação de células iNKT

Na maioria das respostas imunes onde células iNKT parecem estar

implicadas, o mecanismo de ativação destes tipos celulares ainda é pouco

compreendido (Figura 7). Estudos com patógenos microbianos têm sugerido duas

vias para a ativação de células iNKT (Van Kaer e Joyce, 2005; Barral e Brenner,

2007). Na chamada “via direta”, que pode ser ativada por espécies do gênero

Novosphingobium e por B. burgdorferi, onde lipídios derivados destes patógenos são

associados a moléculas de CD1d em endossomas e então apresentados na

superfície de APCs para reconhecimentos pelo TCR de células iNKT. Entretanto,

células iNKT também podem ser ativadas por vários microrganismos que não

Revisão da literatura

possuem antígenos a serem reconhecidos diretamente via CD1d (Tupin et al., 2007).

Este tipo de ativação durante infecções, assim chamada de “ativação indireta”, é

geralmente mediado por citocinas.

Após a ativação de receptores de reconhecimento de padrões associados a

patógenos, ou receptores do tipo TOLL (TLRs), seja na superfície da célula ou

intracelulares, ocorre a ativação de cascatas de sinalização com a conseqüente

ativação de fatores de transcrição e produção de citocinas. Dentre estas citocinas

ativadoras de células iNKT podemos citar notadamente IL-12, IL-18 e/ou interferons

(IFNs) do tipo I. Este tipo de ativação é o mais relatado em processos infecciosos

(Van Kaer e Joyce, 2005). Para alguns microorganismos a ativação de células iNKT

também requer a expressão de CD1d em APCs. Neste caso as citocinas parecem

funcionar na amplificação da resposta, onde, por exemplo, ocorram interações de

baixa afinidade entre células iNKT e o complexo CD1d/glicolípides endógenos, como

o iGb3. Mecanismos similares parecem estar envolvidos em condições inflamatórias

agudas e crônicas (Van Kaer e Joyce, 2005; Yu e Porcelli, 2005; Tupin et al., 2007).

1.4.5. Papel de células iNKT em infecções microbianas

A descoberta de que células iNKT são ativadas diretamente pelo

reconhecimento de certos glicolípides antigênicos e, subseqüentemente, produzem

grandes quantidades de citocinas proporcionalmente a quantidade de células

participantes da resposta, levou a investigação intensa de varias formas de

antígenos lipídicos de uma variedade de espécies de microrganismos. Células iNKT

parecem desempenhar um papel protetor em varias infecções, como aquelas

causadas por Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, Leishmania

major e Plasmodium berghei (Yu e Porcelli, 2005; Emoto e Emoto, 2009).

Em alguns casos, entretanto, as células iNKT parecem estar envolvidas na

exacerbação da resposta inflamatória associada ao patógeno, levando a efeitos

deletérios para o hospedeiro, como por exemplo, em infecções causadas por

Salmonella choleraesuis e Escherichia coli (Shimizu et al., 2002; Hiromatsu et al.,

2003; De Lalla et al., 2004; Dong et al., 2007). A infecção por E. coli, por exemplo,

leva a lesão hepática caracterizada por necrose, inflamação local, dano celular a

hepatócitos e grande infiltrado linfocítico em camundongos selvagens.

Revisão da literatura

Figura 7. Vias de ativação propostas para células iNKT. Células iNKT ativadas e suas

diversas funções no organismo em condições patológicas estão representadas na figura.

Em A: Células iNKT possuem uma potente atividade pró-inflamatória e são capazes de

produzir uma grande diversidade de mediadores, incluindo citocinas, quimiocinas e fatores

citotóxicos, como granzima B. Em B: Podem ativar e cooperar com diversos outros tipos

celulares da imunidade inata e adquirida, dependendo do tecido e do estimulo. Diversos

mecanismos para a ativação de iNKT por patógenos já foram identificados. Em C:

Microrganismos que possuem glicolípides restritos a apresentação via CD1d

(Sphingomonas, Borrelia) podem ativar diretamente células iNKT via TCR, na ausência de

co-estimulação. Em D: Bactérias que possuem LPS (Salmonella) ativam TLR4 expresso em

APCs que então podem ativar indiretamente células iNKT através da apresentação de

glicolípides próprios, utilizando IL-12 como co-estimulo. Em E: Uma variação do citado em

D, com a participação do eixo IL-12/IL-18 e CD1d-independente. Em F: Patógenos

intracelulares podem estimular TLR7/9 para induzir a apresentação de antígenos

glicolipídicos próprios, restritos a CD1d, para células iNKT. Neste caso, co-estimulação por

IFN-α/β é requerida. (Matsuda et al., 2008).

Revisão da literatura

Estas alterações fisiopatológicas estão bastante reduzidas em camundongos

Jα18

-/-

, animais deficientes em células iNKT (Hiromatsu et al., 2003). Além do mais,

já se sabe que células iNKT intra-hepáticas, que expressam mRNA para o receptor

TOLL do tipo 2 (TLR2), são ativadas in vitro em resposta a uma lipoproteína sintética

ligante de TLR2 (Hiromatsu et al., 2003). O mesmo foi relatado por Shimizu e

colaboradores (2002), que demonstraram aumento de dano hepático em animais

selvagens após infecção por S. choleraesuis em comparação com animais Jα18

-/-

Estes dados reforçam a idéia de que a lesão hepática mediada por células NKT

parece ser, em parte, dependente de interações entre TLR2 e seus ligantes.

Outros tipos de receptores associados ao reconhecimento de patógenos,

principalmente do tipo TOLL, são amplamente conhecidos por desencadear a

ativação de vias de sinalização intracelulares e conseqüentemente a translocação

de fatores de transcrição para o núcleo, o que acarreta a expressão e conseqüente

produção de um amplo espectro de citocinas (Iwasaki e Medzhitov, 2004; Medzhitov,

2007). Nagarajan e Kronenberg (2007) mostraram o aumento da produção de IFN-γ

e TNF-α por células iNKT em resposta ao LPS (Lipopolissacarideo) de E. coli, um

ligante de TLR4, o que é TCR-independente mas requer a produção de IL-12 e IL-18

por DCs. O mesmo grupo demonstrou que DCs primadas com um agonista de TLR9

(CpGODN) podem ativar células iNKT e leva-las à produção de IFN-γ, um fenômeno

independente de IL-12 (Tyznik et al., 2008). Importante frisar que a expressão de

TLR-2, -4, -5 mas não TLR9 foi demonstrado em células NKT em nível transcricional

(Shimizu et al., 2002). De maneira geral, estes estudos sugerem que células iNKT

podem reconhecer sinais, diretos ou indiretos, gerados por interações entre TLRs e

seus ligantes. Entretanto, embora exista a expressão de certos TLRs em células

iNKT, não existem evidências da ativação direta destes subtipos celulares por

agonistas de TLR. Estes dados reforçam a idéia de que APCs são essenciais para a

transmissão de sinais associados à TLRs para células iNKT, com sua subseqüente

ativação e produção de citocinas.

Todos estes estudos supracitados se tornaram possíveis com o advento de

ferramentas experimentais mais adequadas, incluindo o isolamento de células iNKT

e a geração de animais deficientes para este subtipo celular. Tais ferramentas

abriram as portas para estudos envolvendo microrganismos mais complexos, com

fisiopatologia muitas vezes pouco elucidada, o que inclui muitas infecções virais.

Dois animais deficientes geneticamente têm sido utilizados no estudo de células

Revisão da literatura

iNKT: o Jα18

-/-

e o CD1d

-/-

. Como já citado, o animal Jα18

-/-

não possui células iNKT,

enquanto o CD1d

-/-

não expressa a molécula CD1d, que é necessária para a seleção

positiva de células iNKT e vNKT durante o desenvolvimento tímico. Desta forma,

estes animais são deficientes para estes dois tipos de células. Em alguns casos,

entretanto, estes animais são responsivos a algum tipo de células T convencionais

ditas “CD1d-reativas”. O estudo com anticorpos contra CD1d se torna complementar

e necessário nestes casos.

1.4.6. Células iNKT, TLRs e evasão

Como se têm discutido em relação à ativação e participação de células iNKT

em infecções, interações entre TLRs e padrões moleculares associados a vírus

podem ser requeridos para ativação e execução da função efetora por células iNKT.

Um estudo recente demonstrou que células NKT humanas são capazes de se

expandirem e aumentarem a produção de IFN-γ quando PBMCs (células

mononucleares do sangue periférico) são tratadas com agonistas TLR3, -7 e -9

(Raftery et al., 2008). O mesmo foi também observado para PBMCs tratadas com

HSV-1 inativado por luz UV. De forma importante, a depleção de células dendríticas

plasmocitoides (pDCs) dentre as PBMCs reduz significativamente a ativação de

células iNKT no mesmo sistema. Estes dados sugerem a importância de pDCs e de

citocinas produzidas por estas células, como IFN-γ, na ativação de células NKT.

Outro dado interessante demonstra que PBMCs tratadas com LPS levam a redução

da produção de IFN-γ e o aumento da produção de IL-10, sugerindo que a interação

DC-iNKT deve compreender uma regulação fina para o tipo de sinal derivado de

DCs após ativação de TLRs específicos (Raftery et al., 2008).

Um papel similar para pDCs e IFN-γ na ativação de células iNKT foi

demonstrado em PBMCs tratadas com um ligante de TLR9 (CpG-ODN) (Suzuki et

al., 2004). Tyznik e colaboradores (2009) demonstraram que a co-cultura de DCs

expostas a ligantes TLR7 e -9 com células iNKT purificadas do baço de

camundongos selvagens leva a uma grande produção de IFN-γ no meio. Além do

mais, a ativação de células iNKT e a produção de IFN-γ também foram

demonstradas em camundongos durante a infecção por citomegalovirus (CMV),

sendo esta resposta dependente de TLR-9 e IL-12 (Raftery et al., 2008).

Revisão da literatura

Complementar a estas interações TLRs-virus, é possível que antígenos virais

possam ativar células iNKT diretamente através de seu TCR. Considerando que

vírus não possuem nenhum antígeno lipídico, ao contrario de bactérias e

protozoários, é difícil especular como se daria este tipo de interação. A melhor

explicação é que, durante infecções virais, ocorreria a síntese de lipídeos

endógenos, e células iNKT podem ser ativadas por estas moléculas, auxiliadas por

citocinas produzidas por APCs neste microambiente. Neste panorama, células

infectadas, apresentando antígenos no contexto de moléculas CD1d, podem ser

alvos para a atividade citotóxica exercida por células iNKT. Um estudo recente

demonstrou que um acilpeptídeo, o peptídeo dodecamérico de N-acil glicina (lipo-

12), capaz de mimetizar lipoproteínas e produzido por células e vírus, pode ser

apresentado por moléculas CD1c a células T humanas (Van Rhijn et al., 2009). De

qualquer forma a apresentação via CD1d em infecções virais, por mecanismos ainda

não bem esclarecidos, não deve ser uma hipótese descartada.

Os vírus desenvolveram estratégias de evasão contra o sistema imune do

hospedeiro, incluindo a já citada regulação negativa da expressão de CD1d por

APCs (Van Kaer e Joyce, 2006). O exemplo melhor estudado sobre a interferência

viral sobre a função de CD1d é a proteína NEF, do HIV, e a manosiltransferase, o

receptor para o trifosfato de inositol e o receptor de rianodina para o Sarcoma de

Kaposi (um herpes vírus), que são reconhecidamente capazes de interferir no

transporte de CD1d do complexo de Golgi para a superfície assim com a endocitose

de moléculas CD1d de superfície (Cho et al., 2005)

1.4.7. O papel de células iNKT na resposta imune em infecções virais

No contexto da infecção pelo vírus da hepatite B (HBV, um flavivirus), poucos

trabalhos têm sido feito em modelos animais da doença. Kakimi e colaboradores

(2000) mostraram um aumento de mRNA para IFN-γ e IFN-α/β no fígado de animais

tratados com αGal-Cer, o que foi também associado com um aumento do clearance

viral no órgão. Este efeito foi temporalmente associado com uma rápida queda de

células NKT no fígado acompanhada por um recrutamento de células NK para este

órgão. O desaparecimento de células NKT parece estar relacionado a uma

regulação negativa do TCR ou de NK1.1 após a ativação. De qualquer forma a

Revisão da literatura

possibilidade de recrutamento para outros órgãos não foi investigada (Kakimi et al.,

2000). Os mesmo autores demonstraram que o clearance viral mediado por células

NKT durante a infecção por HBV não era dependente do recrutamento de células

inflamatórias (Kakimi et al., 2001). Importante frisar que o papel de células iNKT na

resposta imune contra o HBV não é conhecido. Um estudo recente demonstrou que

o tratamento de pacientes com HBV crônica utilizando αGal-Cer não resultou no

clearance viral, o que pode sugerir que células NKT não estão envolvidas na

resposta imune ao HBV em humanos (Woltman et al., 2009).

Um importante papel tem sido sugerido para as células iNKT na infecção pelo

vírus da hepatite C (HCV, também flavivirus) (Inoue et al., 2006). Pacientes que

sofrem de hepatite crônica induzida por HCV possuem números elevados de células

NKT no fígado, incluindo uma grande regulação positiva de CD1d em células

hepáticas (Yamagiwa et al., 2008). Yamagiwa e colaboradores (2008) mostraram

também um aumento significativo da proporção e número absoluto de células NK e

NKT no fígado de pacientes infectados por HCV e que estavam recebendo terapia

antiviral, incluindo IFN-α. Outros estudos têm demonstrado uma alta freqüência de

células NKT hepáticas CD1d-reativas, que apresentam perfil Th1, mas são do tipo

não invariante ou vNKT (Exley et al., 2002). Estas células são abundantes no fígado

e baço em humanos, sugerindo uma nova linhagem celular, especialmente no

fígado. Além do mais, o IFN-γ produzido por estas células esta associado com dano

tecidual em resposta a infecção por HCV, reforçando a idéia de uma melhor

caracterização destes tipos celulares em órgãos alvo durante a infecção. O papel

protetor ou deletério de células vNKT ou iNKT nas infecções por HBV ou HCV é

questionável, especialmente devido às diferenças entre as populações de células

NKT no fígado em humanos e camundongos, o que impede maiores extrapolações

no que diz respeito as suas funções.

Dados recentes indicam que células iNKT e vNKT podem ter papeis opostos

na resposta imune, pelo menos no contexto de resposta contra tumores (Ambrosino

et al., 2007; Halder et al., 2007; Arrenberg et al., 2009). A estimulação seletiva de

células vNKT é capaz de suprimir a atividade de “vigilância” antitumoral das células

iNKT, e a estimulação de células iNKT leva a proteção contra o crescimento de

tumores mesmo quando a resposta era dirigida em direção a um fenótipo Th2.

Quando os dois tipos celulares são ativados simultaneamente, as células vNKT

Revisão da literatura

parecem suprimir a ativação e o efeito protetor de células iNKT in vivo (Ambrosino et

al., 2007).

De forma semelhante, seria interessante examinar o papel destes dois

subtipos celulares e suas interações na resposta imune antiviral. Um papel protetor

para células iNKT tem sido sugerido na infecção experimental pelo HSV-1 (cepa

SC16). Camundongos Jα18

-/-

e o CD1d

-/-

mostraram maior susceptibilidade a

infecção do que camundongos C57BL/6 selvagens. Os animais deficientes

apresentaram clearance viral inadequado na pele e em gânglios da raiz dorsal,

sugerindo um importante papel para células iNKT neste modelo de infecção (Grubor-

Bauk et al., 2003). De forma similar, em um modelo experimental de infecção vaginal

pelo HSV-2, células iNKT são necessárias para a resolução e controle da infecção

(Ashkar e Rosenthal, 2003). Mas ao contrario dos achados de Grubor-Bauk e

colaboradores (2003), outro estudo com camundongos CD1d

-/-

sugerem que células

iNKT não são necessárias para a resolução e controle da severidade da doença

Após infecção pelo HSV-1 (cepa KOS). Estas discrepâncias parecem estar

diretamente relacionadas com a virulência das cepas em questão: KOS é menos

virulenta que SC16 (Cornish et al., 2006).

Alguns poucos estudos também investigaram o papel de células CD1d-

reativas na infecção experimental com o vírus da encefalomiocardite (EMCV), um

picornavirus que pode causar diabetes aguda, paralisia e miocardite ainda nos

primeiros dias de infecção (Exley et al., 2003; Ilyinskii et al., 2006). Camundongos

CD1d

-/-

são bastante susceptíveis a infecção quando comparados a camundongos

selvagens, e esta resistência a infecção parece ser mediada por IL-12 e IFN-γ (Exley

et al., 2003). A depleção de células NK e NKT em camundongos selvagens

utilizando anticorpos anti-asialo GM1 também levaram a um aumento considerável

da susceptibilidade a infecção pelo EMCV-D, e a resposta a infecção em animais

CD1d

-/-

prevalece, mostrando que a resposta é essencialmente mediada por iNKT, e

não NK. Como camundongos Jα18

-/-

não foram utilizados no estudo, é possível que

células T CD1d-reativas estejam participando também da resposta. A eficácia do

anticorpo anti-asialo GM1 em depletar somente NKT é um ponto critico, uma vez

que anticorpos contra NK1.1 podem depletar tanto NKT como iNKT (Seki et al.,

1997).

Similar a infecção por HCV, o papel das células iNKT em um modelo

experimental murino de infecção pelo RSV (vírus respiratório sincicial) é bastante

Revisão da literatura

controverso, uma vez que o desenvolvimento da doença depende do background

genético do camundongo (Johnson et al., 2002). Linhagens resistentes ao RSV,

como BALB/c, respondem ao tratamento com αGal-Cer basicamente com o aumento

do clearance viral e com perfil de produção de citocinas tanto Th1 como Th2. De

forma relevante, existe uma expansão efetiva de células T CD8+ na infecção por

RSV, dependente de células NKT, realçando a importância deste subtipo no controle

da infecção. Resultados similares foram observados na infecção experimental por

Plasmodium berghei (Hansen et al., 2003). Estes dados reforçam a idéia de que

tanto o patógeno como o background genético do hospedeiro são aspectos

essenciais para se determinar a função e dinâmica de células iNKT em doenças

infecciosas.

Em infecções pelo HIV-1 tem sido demonstrado que subtipos celulares

iNKT/CD4+ são alvos do HIV-1 devido ao seu tropismo por células que co-

expressam CD4 com CCR5 e/ou CXCR4 (Motsinger et al., 2002; Li e Xu, 2008).

Células iNKT/CD4+ presentes em PBMCs humanos expressam altos níveis de

CCR5 em comparação a células T CD4+ convencionais, sendo altamente

responsivas a infecção após tratamento com αGal-Cer (Motsinger et al., 2002). No

geral, o HIV causa uma rápida queda no número total de células iNKT na circulação

a uma taxa mais rápida do que aquela observada para células T CD4+. Importante

frisar que estudos são necessários para se estabelecer a cinética de

ativação/freqüência de células iNKT durante os estágios crônicos e agudos da

infecção pelo HIV.

Em termos gerais, os dados discutidos aqui reforçam a evidência de que

células iNKT parecem participar de forma importante em diversas infecções virais.

Mesmo que em muitos casos o background genético e a virulência do patógeno,

associado a discrepâncias de resposta do hospedeiro em estágios agudos e

crônicos da doença contribuam para as lacunas existentes a respeito do fenótipo a

ser interpretado. O estudo destes subtipos celulares pode trazer novas informações

no âmbito das interações celulares e moleculares entre patógeno e hospedeiro.

Não existem estudos acerca do papel de células iNKT e vNKT em modelos

experimentais de infecção pelo vírus da dengue, assim como em amostras de

pacientes cometidos pela FD ou FHD, o que torna o presente estudo de importância

para a ampliação do conhecimento acerca de tipos celulares fundamentais

Revisão da literatura

envolvidos na infecção pelo Dengue vírus e sua contribuição para o

desenvolvimento da doença.

1.4.8. Quimiocinas e o trafego de células iNKT

O recrutamento de leucócitos para os tecidos é dependente de uma série de

passos de adesão e ativação mediados por moléculas e pela interação quimiocinas-

receptores, como revisto nos tópicos iniciais (Johnston e Butcher, 2002). A

expressão de receptores para quimiocinas e de moléculas de adesão em células T é

regulada durante o desenvolvimento, enquanto a expressão de quimiocinas é

geralmente controlada por citocinas e outros sinais que restringem sua distribuição

no microambiente tecidual. Isso resulta em padrões de migração distintos para

vários subtipos de leucócitos (Kunkel e Butcher, 2002).

Todas as células T naïve expressam uniformemente L-selectina e CCR7, que

medeiam o acesso a tecidos linfóides através de vênulas de endotélio alto (HEV) e

possuem e possuem um importante papel na localização de células T no paracortex

dos linfonodos. Em contraste, células T de memória e efetoras são heterogêneas no

que diz respeito à expressão de receptores de quimiocinas e moléculas de adesão,

além de exibirem comportamento diverso no que diz respeito ao seu recrutamento.

Subtipos distintos de células T foram caracterizados por terem como alvo a pele

(expressando antígeno cutâneo para linfócitos, ou CLA+, e CCR4+), intestino (α4β7

hi e CCR9+) e regiões de mucosa (CCR10+), assim como vários sítios inflamatórios

(i.e. CCR1+, CCR2+, CCR5+ e CXCR3+) (Kim et al., 2001; Johnston e Butcher,

2002; Kunkel e Butcher, 2002).

Células Vα24 iNKT se assemelham a células T efetoras neste caso, uma vez

que subtipos CD4+, CD8+ ou duplo-negativas (DN) expressam de forma homogênea

receptores de quimiocinas não relacionados ao recrutamento para o tecido linfóide,

como CCR2, CCR5 e CXCR3 (Gumperz et al., 2002; Kim et al., 2002; Lee et al.,

2002; Motsinger et al., 2002). Em contraste, somente 20% das células iNKT

expressam CCR7, e quase nenhuma célula iNKT do sangue expressa CXCR5

(Gumperz et al., 2002; Kim et al., 2002; Lee et al., 2002), sendo estes receptores

necessários para o recrutamento para as regiões T e B de órgãos linfóides. Isto é

consistente com a relativa escassez de células iNKT em órgãos linfóides

Revisão da literatura

secundários. Vários receptores para quimiocinas, como CCR1, CCR4, CCR6 e

CXCR6 são diferencialmente expressos por CD4+ e subtipos CD4-NKT.

Um número bem significativo de células CD4+NKT expressa CCR4 (Kim et

al., 2002), enquanto CCR1, CCR6 e CXCR6 são preferencialmente expressos por

duplo-negativas e células CD8+NKT (Gumperz et al., 2002; Kim et al., 2002; Lee et

al., 2002). Importante frisar que células NKT não-restritas a CD1d (CD3+CD56+)

compartilham padrões de expressão de receptores de quimiocinas com células Vα24

iNKT (Campbell et al., 2001), sugerindo que estas células com TCRs diversificados

podem migrar para regiões similares. Entretanto, CCR4 somente foi detectado em

níveis significativos em células CD4+ Vα24 iNKT, sugerindo que estas células

podem ainda migrar para outras regiões adicionais. Atualmente existem poucos

dados sobre o papel de quimiocinas no recrutamento de células NKT para diferentes

tecidos in vivo, sendo que os estudos raramente estão focados entre a relação

receptores de quimiocina versus acúmulo de células NKT. A discussão se atém

muito mais à produção e interação de citocinas e moléculas pró-inflamatórias

produzidas por estes subtipos celulares com as células residentes no microambiente

em questão.

Células NKT são capazes de migrar em resposta a CXCL2/MIP-2, ligante

natural de CXCR2, além de que CXCR2 é necessário para o acúmulo de células

NKT CD1d-restritas no baço durante a indução de tolerância em resposta a antígeno

pela via ocular. Entretanto, a migração de células Vα14 iNKT murinas (ou células

não restritas a CD1d) induzida por MIP-2 não é observada, o que sugere que a

necessidade de CXCR2 para este recrutamento é um perfil de outro tipo celular

(Faunce et al., 2001). No mesmo modelo, os autores mostraram que a produção de

CCL5/RANTES por células NKT murinas é importante para o recrutamento de APCs

e a para a indução de células T regulatórias (Tregs) (Faunce e Stein-Streilein, 2002),

sugerindo que células NKT podem participar da resposta imune através da geração

de quimiocinas em adição a citocinas.

Em outro estudo, CCL2/MCP-1 esta implicada no recrutamento de células

Vα14 iNKT para o pulmão, em camundongos, após infecção por criptococos

(Kawakami et al., 2001). Os autores, entretanto, não definem o quanto CCL2/MCP-1

é diretamente ativo em células NKT. Seria importante determinar as interações

quimiocina:receptor que medeiam tanto o trafego homeostático de subpopulações

de células NKT como o seu recrutamento para sítios de inflamação. Também existe

Revisão da literatura

uma heterogeneidade na expressão de moléculas de adesão em células Vα24 iNKT.

Mais de 20% das células NKT humanas expressam CLA (Gumperz et al., 2002; Kim

et al., 2002), associado com a ligação a E-selectina e direcionamento linfocitico para

a pele, enquanto uma maior proporção de células NKT expressa a integrina α4β7,

que interage com outra molécula de adesão, a MAdCAM-1 (Gumperz et al., 2002;

Kim et al., 2002). Em adição a estes dados, LFA-1 possui um papel crucial no

recrutamento de células NKT NK1.1+ (a maioria células Vα24 iNKT) para o fígado de

camundongos mas não para outros tecidos (Emoto et al., 1999). Entretanto, isto

pode ser um efeito indireto relacionado ao recrutamento de células NK antes do

recrutamento de células NKT para o órgão (Miyamoto et al., 2000).

A diversidade de combinações que resultam na expressão diferencial tanto de

receptores para quimiocinas como para moléculas de adesão contribuem de forma

importante para direcionar células NKT para diferentes tecidos. Quimiocinas também

produzidas em sítios específicos durante a resposta parecem tanto ativar como

recrutar mais tipos celulares para o microambiente. A diferença entre os subtipos de

células NKT parece também contribuir para esta diversidade imunoregulatória

observada em diversos estudos in vivo.

II. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Justificativa e objetivos

2.1. JUSTIFICATIVA

Enquanto a última década testemunhou importantes avanços na biologia do

DENV, incluindo as determinações estruturais da partícula viral e as proteínas-chave

envolvidas, as análises dos mecanismos de tradução e replicação viral, além da

caracterização funcional das proteínas virais, a patogênese do dengue permanece

pouco elucidada, onde a complexa inter-relação entre os fatores virais e do

hospedeiro ainda não são bem conhecidos. As observações clínicas da doença têm

fornecido algumas informações a respeito da patogênese da infecção pelos DENV,

principalmente no que diz respeito a mediadores inflamatórios como quimiocinas e

citocinas, além de populações celulares envolvidas nesta resposta, como DCs e

células T CD4+. Entretanto, a ausência de modelo animal adequado,

imunocompetente, tem atrasado as pesquisas acerca da fisiopatologia da doença,

principalmente os mecanismos celulares e moleculares que medeiam o seu

agravamento e possíveis interações sistêmicas, mecanismos chave na lesão

tecidual e no mau prognóstico da doença.

Com um modelo animal reprodutível e capaz de mimetizar a doença e seus

sintomas assim como observados em humanos, tornou-se possível o estudo de

moléculas chave na doença. A maioria já é relatada na clinica e possuem notável

associação com eventos observados em quadros de FHD, como os elevados níveis

de quimiocinas da família CC. Além do mais, populações celulares com importante

função na resposta imune, e que participam de uma complexa rede de ativação

celular e produção de mediadores inflamatórios, como as células NKT invariantes

(iNKT), se tornam um importante alvo de estudo em infecções virais. Uma possível

relação entre quimiocinas CC e células iNKT na infecção pela dengue pode trazer

novas abordagens e estratégias para o estudo da fisiopatologia da infecção pelo

vírus, além de abrir possibilidades para o estudo de alvos terapêuticos. A escassez

de literatura envolvendo modelos experimentais de infecções por flavivírus e sua

resposta inflamatória sistêmica, o que inclui choque e hemorragia, acaba também

por validar o objeto de trabalho.

Justificativa e objetivos

2. 2. Objetivos

O presente trabalho de tese foi baseado em dois objetivos principais de estudo,

consistindo em se investigar o papel dos receptores de quimiocinas CCR1, CCR2 e

CCR4 na patogênese da dengue experimental em camundongos (Objetivo 1) além

de se avaliar também o papel deletério das células NKT invariantes (iNKT) na

patogênese da infecção pelo vírus da dengue, utilizando-se o mesmo modelo

experimental (Objetivo 2).

2.1.1. Objetivos específicos 1

1. Investigar se os receptores para quimiocinas CC, respectivamente CCR1,

CCR2 e CCR4, são importantes para a mortalidade e perda de peso

associada à infecção pelo DENV-2 em camundongos WT ou

geneticamente deficientes para estes receptores (KO).

2. Investigar se os receptores CCR1, CCR2 e CCR4 são importantes para o

clearance viral no fígado e se também participariam das alterações

hematológicas associadas à infecção pelo DENV-2 no presente modelo

experimental, incluindo analise de plaquetas, hematócrito e granulócitos

em camundongos WT ou geneticamente deficientes para estes receptores

(KO) no dia 6 pós-infecção.

3. Investigar a participação dos receptores CCR1, CCR2 e CCR4 na lesão

hepática associada à infecção experimental pelo DENV-2, avaliando-se

por ELISA os níveis de citocinas (IL-6 e IFN-γ) e quimiocinas (CCL2/JE,

CCL3/MIP-1α e CCL5/RANTES) no fígado, além do acúmulo neutrofílico

por MPO, analise histopatológica e dosagem de transaminases hepáticas

no soro de camundongos WT ou geneticamente deficientes para estes

receptores (KO) no dia 6 pós-infecção.

4. Investigar a participação dos receptores CCR1, CCR2 e CCR4 na resposta

inflamatória sistêmica associada à infecção experimental pelo DENV-2,

Justificativa e objetivos

avaliando-se por ELISA os níveis de citocinas (TNF-α, IL-6, IFN-γ) e/ou

quimiocinas (CCL2/JE, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES e CCL17/TARC) no

soro e baço, além do acúmulo neutrofílico por MPO no baço de

camundongos WT ou geneticamente deficientes para estes receptores

(KO) no dia 6 pós-infecção.

5. Investigar por citometria de fluxo a freqüência e perfil geral de ativação de

células T CD4+, T CD8+ NKT (CD3+ DX5+), NK (CD3-, DX5+), neutrófilos

(CD11b+ Ly6G+), e macrófagos (CD11b+ F4/80+) no baço de animais WT

e deficientes para os receptores CCR1, CCR2 e CCR4 após a infecção

pelo DENV-2, a fim de se avaliar a contribuição destes receptores para o

trafego e ativação de tipos celulares relevantes para a infecção no dia 6

pós-infecção.

2.1.2. Objetivos específicos 2

1. Investigar por citometria de fluxo a participação, cinética de ativação

(CD69) e produção de IFN-γ por células iNKT após infecção pelo DENV-2

em animais WT entre os dias 3 e 5 pós-infecção.

2. Investigar se células iNKT participam da mortalidade e perda de peso

associada a infecção pelo DENV-2 em camundongos WT, Jα18

-/-

e CD1d

-/-

.Investigar também se a transferência de células iNKT purificadas do

fígado (CD5+ NK1.1+) de animais WT para animais Jα18

-/-

é capaz de

reverter o fenótipo observado.

3. Investigar se células iNKT participam do clearance viral em órgãos alvo

(baço e fígado) e também das alterações hematológicas e inflamatórias

associadas a infecção pelo DENV-2 no presente modelo experimental,

incluindo analise de plaquetas, hematócrito, monócitos e linfócitos, lesão

hepática por analise histológica, além da produção de citocinas (IL-1β, IL-

6, IFN-

γ, TNF-α e IL-12p40) e/ou quimiocinas (CXCL1/KC), por ELISA, no

Justificativa e objetivos

soro, baço e/ou fígado de animais WT e Jα18

-/-

entre os dias 4 e 6 pós-

infecção.

4. Investigar por citometria de fluxo o perfil geral de ativação de células NK

(CD3- NK1.1+), neutrófilos (CD11c+ Ly6G+), células T CD4+ e T CD8+

após a infecção pelo DENV-2 em animais WT e Jα18

-/-

, utilizando-se

marcadores de ativação e/ou produção de IFN-γ afim de se avaliar a

colaboração entre células iNKT e estas populações no presente modelo no

dia 5 pós-infecção.

5. Investigar a ativação de células iNKT utilizando estratégias de pré-

tratamento e pós-tratamento com o glicolípide αGalCer em animais WT

durante a infecção experimental pelo DENV-2, afim de se investigar o

efeito da ativação desta população sobre a mortalidade, perda de peso e

alterações hematológicas (plaquetas, hematócrito e granulócitos) e carga

viral em órgãos alvo (baço e fígado) no dia 6 pós-infecção.

III. MATERIAL E METODOS

Material e métodos

3.1. Animais

Foram utilizados neste estudo camundongos selvagens (WT, wild type)

C57BL/6 (H-2D

) machos ou fêmeas, com 8 a 10 semanas de idade, adquiridos da

empresa Janvier (Le Genest-St-Isle, França). Camundongos CCR1

-/-

, CCR2

-/-

CCR4

-/-

machos ou fêmeas, de 8 a 10 semanas de idade, cruzados pelo menos 10

vezes em background C57BL/6, foram criados e mantidos até o momento dos

experimentos no centro de criação do Instituto de Transgenose (CNRS, Orléans,

França). O estudo com estes animais foi parte de um projeto colaborativo com o Dr.

Bernhard Ryffel no Laboratoire d'Immunologie et d'Embryologie Moléculaires (IEM),

UMR 6218 CNRS, Université d'Orléans, França, financiado pelo CNPq (Bolsa SWE

PhD 04/2009-04/2010).

Animais Jα18

-/-

e CD1d

-/-

, machos ou fêmeas, de 8 a 10 semanas de idade,

cruzados pelo menos 10 vezes em background C57BL/6, foram cedidos como parte

de um projeto colaborativo com o Dr. François Trottein (Center for Infection and

Immunity of Lille, Institut Pasteur de Lille, INSERM U1019, CNRS UMR8204,

University Lille Nord de France, França) e mantidos no Instituto de Transgenose

(CNRS, Orléans, França) até o momento dos experimentos. Todos os animais foram

mantidos sob temperatura controlada (23°C) com um c iclo claro/escuro controlado

de 12 horas, ração autoclavada ad libitum, sob condições isentas de patógenos, em

caixas com ventilação individual (SPF, specific pathogen–free conditions).

3.2. Vírus

O vírus da dengue, sorotipo 2 (DENV-2), amostra P23085, foi obtido do State

Collection of Viruses, Moscou, Rússia, e isolado de amostra clínica pelo Dr. George

Ignatyev no SRC VB “Vector”, Koltsovo, Rússia, em nível de biosegurança 3 (BSL-

3). Para se aumentar a virulência da amostra no hospedeiro murino, o vírus foi

injetado intracerebralmente em camundongos. De forma resumida, o vírus foi

submetido a duas passagens no cérebro de camundongos neonatos. Os cérebros

dos camundongos apresentando morbidade, no 5° dia a pós infecção, foram

recolhidos e preparados em uma solução de homogenato de cérebro em meio MEM

(modified Eagles’s médium, Gibco) a 10% (p/v). Após este procedimento, 8

passagens seqüenciais foram realizadas em camundongos BALB/c de diferentes

Material e métodos

idades (1-4 semanas), por via intraperitoneal (i.p.). Duas passagens seqüências

foram feitas em cada grupo de cada idade. Após cada passagem, os cérebros de

camundongos moribundos, no 5° dia após infecção, fo ram recolhidos e preparados

em uma solução de homogenato de cérebro em meio MEM a 10% (p/v), estocados a

-80°C, e então utilizados em infecções posteriores, além da padronização do modelo

(Atrasheuskaya et al., 2003). As últimas passagens do vírus adaptado DENV-2

P23085 foram feitas em células LLC-MK2 (rim de macaco Rhesus, ATCC) para

produzirem estoques virais em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,

Sigma-Aldrich), sendo então armazenados a -80°C.

Para se calcular o titulo viral em sobrenadante de células LLC-MK2, expresso

como a DL

(dose letal média), grupos de 10 camundongos BALB/c, 4 semanas,

foram inoculados com DENV-2, em diluições seriais, por via i.p. e a curva de

letalidade foi calculada. O titulo do estoque de DENV-2 utilizado neste trabalho foi

determinado por titulação convencional em placa (ver a seguir) e representa 2 x 10

UFP/ml ou 10

/ml de sobrenadante de LLC-MK2 assim como calculado em

camundongos BALB/c, uma linhagem mais susceptível (Shresta, Kyle, Robert

Beatty, et al., 2004). A seqüência das porções dos genes das proteínas E e NS1 do

vírus DENV-2 adaptado forem depositadas no GenBank sob o número de acesso

AY927231 (Atrasheuskaya et al., 2003) e apresentam 99% de identidade com

seqüências completas de DENV-2 já depositadas (Figura 8).

3.3. Estratégia experimental

Para os dois grandes grupos de experimentos descritos, componentes dos

Objetivos 1 e 2 desta tese, a estratégia experimental seguiu basicamente o mesmo

padrão, diferenciado-se apenas por determinadas dosagens ou abordagens em

órgãos ou sistemas específicos (Figura 9).

Durante o protocolo de infecção pelo vírus DENV-2, até o momento do

sacrifício, os animais foram mantidos em nível de biosegurança 2 (BSL-2) no

Instituto de Transgenose (CNRS, Orléans, França).

Para avaliação da letalidade e inflamação, os camundongos foram

inoculados, por via intraperitoneal, com 100µl de uma solução contendo DENV-2 a

10 ou 30DL

diluídos em DPBS (Gibco) estéril (10DL

para os experimentos

componentes do Objetivo 1, 30 DL

para os experimentos componentes do

Material e métodos

Objetivo 2, inóculos escolhidos de acordo com o tipo de resposta desejada ainda no

inicio de cada estudo. Importante frisar que não há diferença apreciável na letalidade

entre os dois inóculo). Camundongos dos grupos controles não infectados

receberam injeção de sobrenadante de células LLC-MK2, não infectadas, diluído em

DPBS estéril da mesma forma que o vírus. Uma DL

corresponde ao inóculo

necessário para matar 50% de camundongos BALB/c com 4 semanas, e

corresponde a aproximadamente 20 UFP, como calculado por titulação em células

LLC-MK2 e citado anteriormente. A taxa de letalidade e perda de peso foram

avaliadas a cada 12h até o dia 14 pós-infecção (p.i.). Em todos os experimentos, os

camundongos que sobreviviam até o dia 14 não possuíam mais sinais de doença,

como piloereção, perda de peso ou prostração.

Os outros parâmetros foram avaliados geralmente nos dias 4 ou 6 p.i.

(experimentos para avaliar a resposta inflamatória) ou 3, 5 ou 6 p.i. (experimentos

para análise de populações celulares por citometria de fluxo), pontos de sacrifício

definidos pelo momento onde a doença começa a apresentar sinais clínicos ou onde

a maioria dos animais ainda estava viva e apresentavam sinais clínicos da doença

grave. Em todos os experimentos utilizando-se camundongos geneticamente

modificados (KO), experimentos com os controles não infectados foram realizados.

Nos dias definidos para o sacrifício p.i., os camundongos foram anestesiados

por via intraperitoneal com uma solução de Quetamina (100 mg/Kg) e Xilazina (10

mg/Kg) diluídas em DPBS estéril. O sangue foi recolhido após incisão no plexo

braquial e separado para preparação de soro ou para análise hematológica. Logo

após, os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e amostras

homogêneas de baço e fígado foram recolhidas para avaliação de citocinas,

atividade de MPO, citometria de fluxo (FACS) e/ou carga viral. Todas as amostras

foram estocadas a -80°C após o sacrifício. Preparaç ões de fígado para análise

histológica também foram realizadas. Para todos os experimentos foram utilizados

um n experimental de 4 a 7 animais (experimentos para investigar resposta

inflamatória) ou de 10 a 12 animais (letalidade e perda de peso)

Material e métodos

Figura 8. Alinhamento da seqüência do DENV-2 adaptado em camundongos. Em A,

alinhamento da seqüência parcial do dengue vírus sorotipo-2 adaptado em camundongos

(AY927231) com seqüências completas e parciais de DENV-2 utilizando-se o BLAST. Em B,

alinhamento da seqüência AY927231 com a seqüência completa do DENV-2 com maior

identidade (HM582117), mostrando que AY927231 corresponde as regiões do genoma de

DENV-2 referentes às proteínas E e NS1 (traços em preto).

Material e métodos

Figura 9. Design experimental esquemático proposto para os Objetivos 1 e 2.

Material e métodos

3.4. Comitê de Ética

Todos os procedimentos experimentais utilizados neste trabalho estão de

acordo com as regulamentações vigentes sobre ética e experimentação animal do

governo francês assim como foram aprovados pelo Comité National de Réflexion

Ethique sur l’Expérimentation Animale, CNRS, Orléans, França (documento CLE

CCO 2009-013).

3.5. Avaliação de parâmetros hematológicos

O sangue foi obtido através do plexo braquial de animais anestesiados

utilizando-se seringas e pipetas heparinizadas nos dias de sacrifício p.i.

anteriormente indicados. Após coleta, o sangue foi estocado em tubos heparinizados

(50 U/ml de heparina) e deixado sob leve agitação durante todo processo de

aquisição dos dados. Número de plaquetas e porcentagens de hematócrito e

granulócitos foram obtidas através de contagem no aparelho Coulter Counter (S-

Plus Jr, Beckman Coulter), utilizando-se 60µl de sangue para duas leituras por

amostra. Os resultados estão expressos como porcentagem de hematócrito ou

granulócito, além do número de plaquetas por µl de sangue.

3.6. Titulação do vírus da Dengue

Células LLC-MK2 foram crescidas em meio DMEM completo com 5% de SFB

(soro fetal bovino, Cultilab) e antibióticos (penicilina 100 U/ml e gentamicina 50

µg/ml), sendo cultivadas em placa de seis poços (Techno Plastic Products AG) a

uma densidade média de 1,5x10

células/poço. Tecidos de animais infectados foram

macerados utilizando-se cadinho e pistilo, em ambiente estéril, a fim de se preparar

uma solução 10% (p/v) em DMEM incompleto (sem SFB) com antibióticos que foi

então diluída serialmente. Alíquotas de 500 µl desta série de diluições foram

inoculadas em células com monocamadas recém fechadas, utilizando-se como

controle um poço com células não infectadas, um com sobrenadante de células LLC-

MK2 não infectadas e outro com alíquota do vírus DENV-2 utilizado. Após uma hora

de incubação sob agitação a cada 20 minutos, o meio foi desprezado, e as células

lavadas com uma solução de tampão fosfato estéril (PBS, pH 7.4). Em seguida, foi

adicionado meio 199 (Earle's salts, Gibco) com L-glutamina, antibióticos, 3% de SFB

Material e métodos

e 1.5% de carboximetilcelulose, sendo as placas incubadas a 37ºC por 9 dias. As

placas foram coradas com solução 1% (p/v) de cristal violeta para a determinação do

título das amostras, os quais foram expressos em UFP/mL (unidades formadoras de

placas por mililitro de material utilizado). Os dados da titulação viral são aqui

expressos como UFP/100 mg de tecido.

3.7. Dosagem de transaminases hepáticas TGO e TGP

A transaminase glutâmico oxalacética (TGO), também chamada de aspartato

aminotransferase (AST), e transaminase glutâmico pirúvica (TGP), também

conhecida como alanina aminotransferase (ALT), ou alanina transaminase, são

indicadores sensíveis de dano hepático em diferentes tipos de doenças, incluindo as

formas severas da infecção pelo Dengue vírus. As enzimas foram dosadas em

amostras de soro não-hemolisado nos dias 4 e 6 p.i. O ensaio colorimétrico utilizado

foi feito seguindo as recomendações do fabricante, utilizando-se kit diagnostico já

estabelecido (Quibasa, Bioclin, Brasil).

3.8. Determinação dos níveis de citocinas e quimiocinas

Amostras de baço ou fígado, previamente estocadas a -80°C, foram

homogeneizadas em DPBS estéril contendo um coquetel de inibidores de proteases

Roche® (F. Hoffmann-La Roche Ltd) utilizando-se um homogeneizador de tecidos

(Power Gen 125 - Fisher Scientific Pennsylvania, USA). Amostras de soro ou

sobrenadante do homogeneizado tecidual foram utilizados para as dosagens, após

diluição em albumina do soro bovino (BSA, Sigma) a 0,1%. Os níveis de TNF-α, IFN-

γ, IL-1β, IL-6, IL-12p40/IL-23, CXCL1/KC, CCL2/JE, CCL5/RANTES, CCL3/MIP-1α e

CCL17/TARC foram medidos diferencialmente no soro, baço ou fígado utilizando-se

kits de anticorpos adquiridos do fabricante (R & D Systems, Minneapolis, USA),

seguindo o protocolo recomendado. Todos os ensaios foram realizados em placas

de 96 poços (96 MicroWell™ Plates, NUNC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,

USA ). Os anticorpos de captura foram diluídos em PBS, pH 7.4 e incubados

overnight a 4º C. A reação foi bloqueada com uma solução de BSA a 1% em PBS. A

reação foi detectada por incubação com estreptavidina conjugada com peroxidase

(HRP-Streptavidin Pharmingem diluída a 1:4000) e revelada com OPD (o-

phenylenediamine dihidrocloride, Sigma). Após 30 minutos a reação foi parada com

Material e métodos

a 1M. A leitura foi feita em leitor de ELISA com filtro para um comprimento de

onda de 492 nm. Os ensaios têm uma sensibilidade de 8-16 pg/ml de acordo com o

fabricante.

3.9. Avaliação da atividade da Mieloperoxidase (MPO) tecidual

Para a análise da atividade da MPO, como um parâmetro indireto para avaliar

o acúmulo de neutrófilos no tecido após a infecção (Souza et al., 2003), amostras de

baço e fígado de animais infectados e não infectados, foram homogeneizadas

(Dispomix, Medic Tools) em DPBS estéril na proporção de 10% (p/v) contendo 0,5%

de Hexadecil-Trimetil Brometo de Amônia (HTAB) e 5 mM de EDTA. As amostras

foram então incubadas a 60°C por 1 hora para inativação da catalase endógena e

centrifugadas a 10.000 g por 10 mins., a 4°C. Uma a líquota de 100 µl do

sobrenadante obtido foi colocada em microtubos com 600 µL de HBSS (Hank’s

Balanced Salt Sodium, Gibco), 100 µl de dihidrocloreto de o-dianisidina (1.25 mg/ml)

e 100 µl de uma solução a 0.1% de H

(Merck). Após cerca de 15 mins. de

incubação a 37°C sob agitação, a reação foi parada com 100 µl de uma solução de

NaN

a 1% e 200 µl da solução final foram transferidos para placas de 96 poços

(NUNC, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). A atividade da MPO foi

determinada por absorbância a 460 nm, com o branco como correção. Os resultados

são expressos como unidades arbitrarias (O.D. 460 nm).

3.10. Preparação dos cortes para análise histológica

No dia 6 p.i, os animais foram sacrificados e amostras homogêneas de fígado,

órgão de escolha pelo tipo de lesão peculiar e representativa da manifestação grave

da infecção, foram coletadas e guardadas em tubos de 15 ml (Falcon) contendo uma

solução de formaldeído a 10% em PBS (pH 7.4) por no maximo 2 dias e depois

transferidas para tubos contendo uma solução de etanol a 70%, até o

processamento e inclusão. O processamento para histologia e inclusão em parafina

foi feito no IEM, Orléans, França seguindo protocolo padrão estabelecido no

laboratório. A preparação das lâminas, incluindo corte em micrótomo, fixação em

lâminas histológicas e coloração com Hematoxilina e Eosina (HE) foram gentilmente

realizados no Institute of Infectious Disease and Molecular Medicine, University of

Cape Town, África do Sul (Prof. Frank Brombacher). As fotos foram obtidas

Material e métodos

utilizando-se o programa QCapture Pro 6.0 (QImaging, Canadá) e são

representativas de 10-15 campos por lâmina, no aumento de 200X ou 400X.

3.11. Purificação de células iNKT e transferência adotiva

Para os experimentos de células adotivas, células do fígado de camundongos

selvagens doadores (C57BL/6) foram marcadas com anticorpos anti-NK1.1 (PE-

conjugado) e anti-CD5 (APC-Conjugado), ambos adquiridos da BD Pharmigen. As

células marcadas foram isoladas utilizando o separador de células BD FACSAria e o

programa BD FACSDiva (BD Biosciences). Células iNKT representam

aproximadamente 80-90% do total de células NKT presentes no fígado.

Camundongos recipientes Jα18

-/-

receberam por via intravenosa (i.v.) 100µl de

DPBS contendo 1x10

células NKT purificadas ou somente DPBS (controle). Após

aproximadamente 16 horas estes camundongos foram infectados com DENV-2,

seguindo o mesmo protocolo já citado.

3.12. Tratamento com o ativador de células NKT αGalCer

O glicolípide αGalCer (αGalactosil-Ceramida), ativador de células NKT, foi

gentilmente cedidos pelo Prof. François Trottein para os experimentos presentes no

Objetivo 2. Animais C57BL/6, WT, de 8 a 10 semanas foram tratados com 200µl, por

via intraperitoneal, de uma solução de DPBS estéril contendo αGalCer levando a

uma dose final de 2µg/animal. Animais controle foram tratados com DPBS. Foi

realizado um tratamento único 1 hora antes da infecção (pré-tratamento) ou 2 dias

depois da infecção (pós-tratamento). Letalidade, e perda de peso foram analisadas

até o dia 14 para os animais sobreviventes. Um experimento com o pós-tratamento

foi realizado, com sacrifício no dia 6, a fim de se investigar parâmetros

hematológicos.

3.13. Análise de populações celulares por citometria de fluxo (FACS)

3.13.1. Obtenção de leucócitos do baço e fígado

Amostras de baço foram coletadas nos dias 3, 5 ou 6 p.i. para se investigar o

perfil das populações leucocitárias nos tecidos durante a infecção pelo DENV-2. Os

Material e métodos

pontos para avaliação foram escolhidos considerando-se o inicio da doença e

recrutamento celular (dia 3 p.i., Objetivo 2), ou momentos anteriores ao dia onde a

maioria dos animais sucumbem a doença, para se evitar células em

apoptose/necrose ou em estado de ativação exacerbado (dia 5 p.i. para Objetivo 2,

ou dia 6 p.i. para o Objetivo 1). Importante frisar que as diferenças para os dias 5 ou

6 reside principalmente no inóculo, no caso 3 vezes maior para os experimentos

realizados no dia 5, referentes aos resultados obtidos no Objetivo 2. Amostras de

fígado foram utilizadas nos dias 3 e 5 p.i. para os experimentos ex vivo de ativação

celular demonstrados no Objetivo 2.

Para a obtenção de leucócitos viáveis, amostras homogêneas de baço foram

maceradas em peneiras estéreis (cell strainers de 100 µm, BD Biosciences, USA) e

resuspendidas em DPBS suplementado com 2% de SFB. Após centrifugação,

hemácias foram lisadas com tampão de lise (Sigma-Aldrich). Para os experimentos

onde as marcações foram feitas em número definido de células, as mesmas foram

contadas em azul de trypan e plaqueadas considerando-se o número de células

viáveis.

Antes da extração dos leucócitos do tecido, o fígado dos animais foi

perfundido com DPBS estéril para a remoção de células circulantes. Amostras

homogêneas de fígado foram removidas e passaram por 20 mins. de digestão em

meio RPMI contendo 1 mg/ml colagenase tipo VIII (Sigma-Aldrich) e 1 µg/ml de

DNase tipo I (Sigma-Aldrich), a 37°C sob agitação. Após centrifugação a 2.300 RPM,

10 mins. a 4°C, as células foram lavadas e resuspen didas em gradiente de Percoll™

36%, cuidadosamente depositado sobre outro gradiente de Percoll™ 72%. A

preparação foi centrifugada por 30 mins. a 2.300 rpm a 22°C. As populações

coletadas na interface foram lavadas em DPBS suplementado com 2% de SFB e

posteriormente contadas em azul de trypan.

3.13.2. Marcação com anticorpos específicos

Leucócitos murinos hepáticos e esplênicos foram marcados para identificação

de subtipos celulares e perfil de ativação utilizando-se anticorpos monoclonais para

determinadas moléculas de interesse. Objetivo 1: CD3 (PerCP-Cy5-conjugado),

DX5 (FITC- conjugado), CD4 (Pacific Blue- conjugado), CD8 (APC-Cy7- conjugado),

F4/80 (PE- conjugado) CD69 (PE- conjugado), CD11b (PerCp-Cy5.5- conjugado),

Material e métodos

Ly6G (PE-Cy7- conjugado), CD86 (APC- conjugado) e controles de isotipo. Objetivo

2: TCRβ (FITC-conjugado), NK1.1 (PE- ou PerCp-Cy5.5- conjugado), CD5 (FITC- or

APC- conjugado), CD4 (FITC- conjugado), CD8 (APC- conjugado), CD69 (PE-,

PerCp-Cy5.5- ou APC- conjugado), IFN-γ (Alexa Fluor

647- conjugado), IL-4 (APC-

conjugado), CD11c (PE-Cy7- conjugado), CD11b (PerCp-Cy5.5- conjugado), Ly6G

(Alexa Fluor

647- conjugado), CD62-L (PE- conjugado), granzima B (FITC-

conjugado), CD107α (PE- conjugado) e controles de isotipo. Todos os anticorpos

foram adquiridos da BD Pharmigen (Le Pont de Claix, France). O anticorpo PE-

tetrâmero CD1d carregado com PBS-57, foi adquirido do NIAID Tetramer Facility

(Emory University, Atlanta, GA).

A fim de se analisar células iNKT, suspensões de leucócitos obtidas como

citado anteriormente foram incubadas com diluições do tetrâmero CD1d por 30 mins

em DPBS contendo 2% de SFB e 0,01% de NaN

. As células foram então lavadas e

marcadas com outros marcadores de superfície. Para marcação intracelular, as

células foram incubas por 20 mins a 4°C com tampão de fixação (BD Biosciences),

lavadas, e então incubadas com tampão de permeabilização (Cytofix/Cytoperm, BD

Biosciences). Após lavagem, a células foram incubadas com IFN-γ (Alexa Fluor

647- conjugado), IL-4 (APC- conjugado) ou granzima B (FITC- conjugado). Em todos

os casos, entre 5x10

a 1x10

eventos totais foram adquiridos para análise posterior

através do citômetro de fluxo BD FACSCanto II (BD Biosciences).

As populações analisadas foram selecionadas através da delimitação de

gates em que as células em estudo situam-se de acordo com o seu tamanho e

granulosidade (Figura 10). As análises de uma determinada população definida nos

gates foram feitas levando em consideração o marcador constitutivo daquela

população, por exemplo, CD3 para linfócitos ou, em, em outros casos, pelo controle

de isotipo. Após a determinação dos quadrantes de marcações -/-, +/-, -/+, e +/+, os

dois quadrantes positivos para o marcador constitutivo eram selecionados para a

análise do segundo marcador, por determinação de picos de histograma. Com base

nesses picos, definiam-se as duas subpopulações positivas para o primeiro

marcador, sendo uma negativa para o segundo marcador e a outra positiva para o

segundo marcador. No caso onde foram avaliados também os marcadores

constitutivos individualmente, foi utilizado o valor referente à porcentagem da

população nos dois quadrantes positivos para aquele marcador, em relação aos

eventos adquiridos. Os valores utilizados para a determinação dessas duas

Material e métodos

subpopulações utilizados foram as porcentagens daquelas subpopulações em

relação aos eventos totais adquiridos ou os dados foram expressos em número

absoluto de células, ajustando-se a porcentagem da subpopulação com a contagem

de células após a extração destas dos tecidos. As análises finais foram realizadas

utilizando-se o programa FlowJo 7.5.3 (TreeStar Inc.).

3.14. Análise Estatística

Todos os dados foram expressos como média ± erro padrão da média (EPM).

As diferenças entre as médias foram comparadas utilizando-se análise de variância

(ANOVA) com pós-testes de Student-Newman-Keuls. Na comparação entre dois

grupos foi utilizado o teste t de Student não pareado. Os resultados foram

considerados significativos quando valor foi de p< 0.05. Para a construção dos

gráficos, foi utilizado o software GraphPad PRISM 4. A exclusão de valores que se

portaram como outlyers foi feita através do teste de Grubbs, com nível de

significância igual a 0.05. As curvas de letalidade, construídas no mesmo software,

foram comparadas utilizando o teste Log-rank qui-quadrado. Todos os dados

apresentados são representativos de pelo menos 2 experimentos.

Material e métodos

Figura 10. Determinação das regiões (gates) referentes às populações leucocitárias

analisadas nos órgãos alvo. À esquerda: Exemplificação do método empregado para

determinação das freqüências das subpopulações avaliadas. À direita: No primeiro quadro,

é mostrada a delimitação do gate para linfócitos; em seguida, os quadrantes foram divididos

com base na densidade da distribuição de células. Por último, foi selecionada uma área em

que as células são, no caso, CD3+. Essa área é analisada em forma de histograma para o

segundo marcador, no caso CD8 e a subpopulação positiva em relação ao esse marcador é

expressa em freqüência do total de eventos adquiridos.

IV. RESULTADOS

Resultados

Objetivo 1

PAPEL DOS RECEPTORES DE QUIMIOCINAS CCR1, CCR2 E CCR4 NA

PATOGÊNESE DA DENGUE EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS

4.1. Mortalidade e perda de peso em camundongos infectados pelo DENV-2

Camundongos infectados com a amostra adaptada do DENV-2 apresentam

manifestações clinicas que se assemelham a FHD/SCD em humanos, incluindo

trombocitopenia e aumento de permeabilidade vascular, o que eventualmente pode

levar ao choque e morte (Atrasheuskaya et al., 2003; Souza et al., 2009; Assuncao-

Miranda et al.). Como visto na Figura 11A, animais WT infectados com um inóculo

de 10 DL

apresentam mortalidade de aproximadamente 80% entre os dias 6 e 8

p.i. A taxa de mortalidade em camundongos CCR1

-/-

infectados foi bastante similar a

observada em camundongos WT. Em contraste a mortalidade observada em

camundongos CCR1

-/-

camundongos CCR2

-/-

e CCR4

-/-

apresentam maior sobrevida

e um perfil de proteção apreciável em relação a camundongos WT (P=0,0312 e

P=0,0091, respectivamente). Nestes estudos de mortalidade após infecção pelo

DENV-2 é possível observar uma rápida perda de peso, começando no dia 4 p.i. e

levando a uma perda de cerca de 5% em torno do dia 7 p.i. para os animais

sobreviventes. Esta perda de peso é freqüentemente associada com uma baixa

mobilidade na caixa e prostração. Camundongos CCR1

-/-

perderam peso de uma

forma similar a camundongos WT, sendo que esta perda foi significativamente

reduzida em camundongos CCR2

-/-

e CCR4

-/-

, que perderam cerca de 3% a menos

quando comparados a camundongos WT (Figura 11B). O dia 6 p.i. foi escolhido para

as demais analises subseqüentes.

Resultados

Figura 11. Mortalidade e perda de peso após infecção pelo DENV-2 em animais WT ou

KO para receptores de quimiocinas. Animais WT ou CCR1

-/-

, CCR2

-/-

e CCR4

-/-

(KO)

foram infectados por via intraperitoneal com 10 LD

da amostra adaptada de DENV-2 e

monitorados para avaliação da mortalidade e perda de peso até o dia 14 p.i. No painel A:

Porcentagem de sobrevida (n=10-12 animais). No painel B: Variação do peso corporal

associada à infecção pelo DENV-2 em animais WT e KO. Resultados foram expressos como

média ± EPM e são representativos de pelo menos 2 experimentos. * P< 0.05 quando

comparado a animais WT infectados. NI: animais não infectados.

Resultados

4.2. Parâmetros hematológicos e carga viral

A trombocitopenia, ou redução do número de plaquetas circulantes, é um

fenômeno comumente observado em pacientes com a febre do dengue ou com

FHD/SCD, mesmo que já se tenha sugerido que esta não parece relacionar-se com

a severidade da doença ou com o seu resultado (Gubler, 1998; Guzman et al.,

2002). A trombocitopenia é primeiramente observada nos dia 3 após a infecção,

apresentando seu pico entre os dias 6 e 7 após a infecção (Balmaseda et al., 2006;

Bozza et al., 2008; Binh et al., 2009). No presente estudo, o número de plaquetas foi

avaliado no dia 6 p.i., momento onde estes números eram mínimos e a porcentagem

de animais vivos era máxima. O número de plaquetas em um animal WT infectado

foi cerca de 30% do número observado em animais não infectados (Figura 12A).

Ouve uma queda similar no número de plaquetas tanto em camundongos CCR1

-/-

como CCR2

-/-

infectados em comparação a seus controles. Entretanto, esta

trombocitopenia esta significativamente reduzida em animais CCR4

-/-

infectados

quando comparados a WT infectados (Figura 12A).

O extravasamento vascular, e conseqüente hemoconcentração, é um evento

tardio e comumente observado em pacientes com o quadro de dengue grave (Green

e Rothman, 2006; Lee et al., 2006; Srikiatkhachorn et al., 2007; Binh et al., 2009;

Srikiatkhachorn, 2009). A infecção pelo DENV-2 levou a uma hemoconcentração

significativa em camundongos WT, como visto pela porcentagem de hematócrito

(Figura 12B). Aumento similar foi observado em camundongos CCR1

-/-

e CCR2

-/-

quando comparados ao controle. Apesar de apresentar hemoconcentração,

camundongos CCR4

-/-

infectados apresentam redução significativa neste parâmetro

quando comparados a camundongos WT infectados (Figura 12B).

Uma importante alteração hematológica observada neste modelo

experimental é um aumento significativo da porcentagem de granulócitos circulantes

em camundongos WT após infecção, com inicio no dia 4 e pico no dia 6. Neste

estudo, camundongos infectados pelo DENV-2 apresentam apreciável aumento na

porcentagem de granulócitos circulantes (Figura 12C). De forma interessante,

camundongos CCR1

-/-

e CCR2

-/-

infectados apresentam um aumento nesta

porcentagem de granulócitos quando comparados aos animais WT controles.

Entretanto, esta granulocitóse esta significativamente reduzida em animais CCR4

-/-

infectados (Figura 12C). A porcentagem de monócitos circulantes se apresenta

Resultados

discretamente reduzida em todos os animais infectados estudados e deficientes para

CCRs, em comparação a animais WT controles, um dado razoavelmente esperado

(dados não mostrados).

Embora os camundongos CCR1

-/-

CCR2

-/-

e CCR4

-/-

infectados apresentem

diferenças significativas na letalidade e nas alterações hematológicas decorrentes

da infecção pelo DENV-2, quando comparados a animais WT, incluindo proteção em

animais CCR2

-/-

e CCR4

-/-

não foi observada

alteração na carga viral presente no

fígado no dia 6 p.i. em animais WT e KO para os receptores em estudo (Figura 12D).

O fígado foi escolhido como órgão alvo para estudo do titulo viral, tanto por ser alvo

da doença durante a infecção experimental, gerando lesão, quanto pelo fato de

hepatócitos serem alvos clássicos do vírus, onde estes podem se replicar (Jessie et

al., 2004; Suksanpaisan et al., 2007; Souza et al., 2009; Conceicao et al., 2010).

Dados anteriores do grupo sugerem que a replicação viral no fígado e no baço

segue o mesmo perfil, com uma cinética bastante próxima, na maioria das vezes

independente do fenótipo em estudo (Souza et al., 2009)

Mesmo com as diferenças observadas durante a infecção nas curvas de

letalidade, perda de peso e parâmetro hematológicos analisados, não foi observada

diferenças entre os níveis basais de cada parâmetro entre camundongos não

infectados WT e KO.

Resultados

Figura 12. Alterações hematologicas e carga viral Após infecção pelo DENV-2 em

animais WT ou KO para receptores de quimiocinas. Analise hematológica foi feita no dia

6 p.i. para se avaliar alterações no número de plaquetas (A), porcentagem de hematócrito

(B) e porcentagem de granulócitos (C) no sangue de animais não infectados e infectados

WT e KO. Painel D: Carga viral avaliada no fígado de animais WT e KO no dia 6 p.i.

expressa como log de UFP/100 mg de tecido. Resultados foram expressos como média ±

EPM e são representativos de pelo menos 2 experimentos (n=5-6 animais). * P< 0.05, *** P

< 0.001 quando comparado a animais não infectados. # P < 0.05, ## P < 0.01 quando

comparado a animais WT infectados. NI: animais não infectados.

Resultados

4.3. Inflamação e lesão hepática

O fígado é um dos órgãos alvo afetados em casos severos de infecção pelo

dengue (Gubler, 1998; Suksanpaisan et al., 2007; Martina et al., 2009). A infecção

pelo DENV-2 no dia 6 p.i. resultou em um aumento significativo nos níveis séricos

das transaminases TGO e TGP em animais WT, marcadores de disfunção hepática

(Figura 13A e B). Granulócitos, notadamente neutrófilos, são ativados durante a

infecção pelo dengue e podem se acumular e contribuir para lesão em órgão alvos

(Juffrie et al., 2000). Existe um acúmulo significativo de neutrófilos no fígado e

também no baço de camundongos WT infectados, como avaliado pelos níveis

teciduais da enzima MPO (Figura 13C e D). Estas alterações patológicas foram

acompanhadas pelo aumento significativo das citocinas IL-6 e IFN-γ no fígado de

animais WT após infecção pelo DENV-2, citocinas pró-inflamatórias associadas à

infecção (Figura 14A e B).

Cortes histológicos de animais WT infectados mostraram alterações

representativas do fenótipo observado, incluindo congestão, focos de hemorragia,

degeneração de hepatócitos assim como necrose, levando a alterações patológicas

no parênquima hepático (Figura 15).

Em uma visão geral, animais CCR1

-/-

infectados apresentaram grau similar de

lesão quando comparados a animais WT, com discreto aumento na atividade de

MPO assim como nos níveis de IL-6 e IFN-γ no fígado (Figuras 13 e 14). Os cortes

histológicos não revelam diferenças apreciáveis (Figura 15). Camundongos CCR2

-/-

infectados também apresentaram níveis elevados de MPO, mas este aumento não

parece estar associado a dano hepático, uma vez que os níveis de transaminases

hepáticas encontram-se significativamente reduzidos (Figura 13). Estes achados

encontram-se associados tanto a uma menor concentração local de IL-6 e IFN-γ

além de menor lesão hepática avaliada pela histológica, com redução apreciável de

áreas de hemorragia e necrose (Figuras 14 e 15). De forma importante, o acúmulo

de neutrófilos nos tecidos, assim como os níveis de transaminases e citocinas

avaliadas encontram-se significativamente reduzidos em animais CCR4

-/-

infectados,

um achado consistente com a reduzida lesão tecidual observada no parênquima

hepático destes animais quando comparados a animais WT infectados.

Resultados

Figura 13. Niveis de transaminases e acúmulo de neutrofilos no tecido Após infecção

pelo DENV-2 em animais WT ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO

foram infectados com 10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i para analise de

amostras de sangue e tecido. As transaminases TGO (A) e TGP (B) foram dosados no soro

de animais WT e KO, como marcadores de lesão hepatica. A atividade de MPO, como

índice para o acúmulo de neutrófilos no tecido, foi avaliada no baço e no fígado de animais

WT e KO. Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo

menos 2 experimentos (n=5-6 animais). ** P< 0.05, *** P < 0.001 quando comparado a

animais não infectados. # P < 0.05, ## P < 0.01, ###P<0.001 quando comparado a animais

WT infectados. NI: animais não infectados.

Resultados

Figura 14. Produção de citocinas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais WT

ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO foram infectados com 10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i para analise de amostras de tecido. Produção

das citocinas IL-6 (A) e IFN-γ (B) em homogenato de figado foi avaliada por ELISA. Os

dados estão expressos em pg por 100 mg de tecido. Resultados foram expressos como

média ± EPM e são representativos de pelo menos 2 experimentos (n=5-6 animais). ** P<

0.05, *** P < 0.001 quando comparado a animais não infectados. # P < 0.05, ## P < 0.01,

quando comparado a animais WT infectados. NI: animais não infectados.

Resultados

Figura 15. Alterações histológicas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais

WT ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO foram infectados com

10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i para analise de amostras de tecido.

Cortes histológicos corados com HE em animais infectados ou não mostram sinais de

congestão, hemorragia, degeneração de hepatócitos e necrose em animais WT, mas em

menor grau em animais CCR2

-/-

e CCR4

-/-

infectados. Cada corte apresentado no painel é

representativo de pelo menos 15 campos. Aumento: 400X.

Não infectado

Resultados

Os níveis das quimiocinas CCL2/JE, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES e

CCL17/TARC foram também avaliadas em amostras de fígado de animais WT e

deficientes para os receptores para quimiocinas de interesse após infecção pelo

DENV-2. Com a exceção de CCL17, que não apresenta alterações significativas

após a infecção (dados não mostrados), houve um aumento significativo das

quimiocinas CCL2, CCL3 e CCL5 em animais WT, reforçando a importância do

sistema de quimiocinas no contexto da infecção pelo dengue (Figura 16A-C).

Animais CCR1

-/-

infectados apresentam níveis significativamente aumentados de

CCL3 em comparação ao grupo controle. Animais CCR2

-/-

apresentaram um discreto

aumento nos níveis de CCL2 e CCL5, dados consistentes com o aumento da

atividade de MPO no tecido. Entretanto, níveis das quimiocinas CCL2 e CCL5

encontram-se significativamente reduzidos no fígado de animais CCR4

-/-

(Figura 16).

Não foram observadas diferenças entre os níveis basais das

citocinas/quimiocinas avaliadas em animais não infectados WT e KO (dados não

mostrados).

4.4. Citocinas e quimiocinas na resposta sistêmica

Estudos anteriores demonstraram que as citocinas IL-6 e IFN-γ

apresentam

níveis sistêmicos elevados em pacientes com dengue ou em modelos experimentais

da infecção (Lin et al., 2000; Atrasheuskaya et al., 2003; Shresta, Kyle, Snider, et al.,

2004; Suksanpaisan et al., 2007; Bozza et al., 2008; Kyle et al., 2008; Fink et al.,

2009). Desta forma, animais WT infectados pelo DENV-2 apresentaram

concentrações bastante elevadas tanto de IL-6 como de IFN-γ no soro (Figura 17A e

B). Em camundongos CCR1

-/-

infectados

a concentração de IFN-γ foi similar a

encontrada em controles WT, embora haja um aumento significativo da produção de

IL-6 nestes animais. Em animais CCR2

-/-

e CCR4

-/-

infectados os níveis de IL-6 e

IFN-γ encontram-se significativamente reduzidos (Figura 17), o que vai de acordo

com o fenótipo de proteção contra a infecção descrito até o momento para estes

animais.

Resultados

Figura 16. Produção de quimiocinas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais

WT ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO foram infectados com

10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i para analise de amostras de tecido.

Produção das quimiocinas CCL2/JE (A), CCL3/MIP-1α (B) e CCL5/RANTES (C) em

homogenato de fígado foi avaliada por ELISA. Os dados estão expressos em pg por 100 mg

de tecido. Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo

menos 2 experimentos (n=5-6 animais). *** P < 0.001 quando comparado a animais não

infectados. ## P < 0.01, ### P < 0.001, quando comparado a animais WT infectados. NI:

animais não infectados.

Figura 17. Produção de citocinas no soro após infecção pelo DENV-2 em animais WT

ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO foram infectados com 10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i para analise de amostras de sangue. Produção

das citocinas IL-6 (A) e IFN-γ no soro foi avaliada por ELISA. Os dados estão expressos em

pg por ml. Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo

menos 2 experimentos (n=5-6 animais). **P< 0.01, *** P < 0.001 quando comparado a

animais não infectados. # P< 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001, quando comparado a

animais WT infectados. NI: animais não infectados.

Resultados

Níveis de TNF-α foram avaliados no baço de animais infectados pelo DENV-2,

citocina já demonstrada como importante fator envolvido na fisiopatologia da

infecção pelo dengue (Vitarana et al., 1991; Hober et al., 1993; Hober et al., 1996;

Atrasheuskaya et al., 2003), principalmente em termos sistêmicos. A produção de

quimiocinas de interesse neste estudo também foi avaliada a fim de se obter um

panorama conciso da resposta inflamatória sistêmica após infecção. Níveis de

outras citocinas no soro não foram avaliados por restrições relativas à quantidade de

amostra. O mesmo para o baço, onde em experimentos subseqüentes, analises por

citometria de fluxo neste órgão se fizeram necessárias. Entretanto as moléculas de

escolha são fatores já relativamente bem associados à infecção objeto de estudo.

Como visto na Figura 18A, os níveis de TNF-α estão significativamente

aumentados no baço de animais WT após a infecção experimental. De forma similar,

houve um aumento apreciável nos níveis de quimiocinas CCL2, CCL3, CCL5 e

CCL17 em amostras de baço de camundongos WT infectados (Figura 18B-E). Este

é também o primeiro relato da literatura a demonstrar a produção da quimiocina

CCL17/TARC na infecção pelo dengue, tanto em humanos como em modelos

experimentais. CCL2, CCL3, CCL5, além de TNF-α, encontram-se reduzidas no

baço de animais CCR4

-/-

infectados quando comparados a animais WT. Confirmando

o fenótipo de regulação negativa da resposta inflamatória após infecção neste grupo

de animais. Interessantemente, CCL17 apresenta níveis elevados nos animais

CCR4

-/-

infectados (Figura 18E)

o que corrobora a idéia de receptores de

quimiocinas como scavengers ou controladores de seus próprios ligantes em

condições patológicas (Cardona et al., 2008), fenômeno este observado para os

níveis de quimiocinas ligantes de receptores ausentes nos camundongos utilizados

no presente estudo. Os níveis de TNF-α foram similares aos encontrados em

camundongos CCR1

-/-

e CCR2

-/-

infectados quando comparados a camundongos

WT. Alterações menores mais significativas foram observadas no que diz respeito à

concentração de quimiocinas. Níveis de CCL3 encontram-se elevados no baço de

animais CCR1

-/-

infectados, enquanto níveis de CCL2 e CCL5 encontram-se

elevados no baço de animais CCR2

-/-

infectados, sempre quando comparados aos

níveis observados em animais WT. O maior aumento de CCL3 em animais CCR1

-/-

e de CCL2 e CCL5 em animais CCR2

-/-

podem explicar o acúmulo de neutrófilos no

baço (Figura 13D), mesmo que o fenótipo final, como para CCR2

-/-

não reflita a

resposta global de proteção contra a infecção.

Resultados

Figura 18. Produção de citocinas quimiocinas no baço após infecção pelo DENV-2 em

animais WT ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO foram infectados

com 10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i para analise de amostras de tecido.

Produção da citocina TNF-α (A) e quimiocinas CCL2/JE (B), CCL3/MIP-1α (C) e

CCL5/RANTES (D) em homogenato de baço foi avaliada por ELISA. Os dados estão

expressos em pg por 100 mg de tecido. Resultados foram expressos como média ± EPM e

são representativos de pelo menos 2 experimentos (n=5-6 animais). *P< 0.05, *** P < 0.001

quando comparado a animais não infectados. # P< 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001, quando

comparado a animais WT infectados. NI: animais não infectados.

Resultados

Já foi sugerido que, em determinadas respostas inflamatórias, neutrófilos

podem ser recrutados para o sitio inflamatório através de CCR1, CCR2 ou CCR5

(Cheng et al., 2001; Reichel et al., 2006; Furuichi et al., 2008). Não foram

observadas diferenças entre os níveis basais das citocinas/quimiocinas avaliadas

em animais não infectados WT e KO (dados não mostrados).

4.5. Número e ativação de leucócitos no baço após infecção pelo DENV-2

Em seguida avaliamos no dia 6 p.i. o número e perfil de leucócitos no baço de

camundongos WT e deficientes para os receptores para quimiocinas em estudo

após a infecção pelo DENV-2. Em termos gerais, a infecção experimental levou a

um aumento significativo no número total de linfócitos CD3

CD4

e CD3

CD8

, além

de células NKT (CD3

DX5

) no baço de animais WT infectados quando comparados

a animais não infectados (Figura 19A, C e E). Embora haja redução no número total

de leucócitos, células T CD4+, CD8+ e NKT ativadas, como avaliado pela expressão

do marcador de ativação CD69, se encontram aumentadas no baço de

camundongos infectados (Figura 19B, D e F). Esta linfopenia decorrente da

infecção, esta provavelmente relacionada à saída e/ou recirculação de células no

baço em direção a outros órgãos (ex: fígado), um fenômeno comumente observado

no presente modelo experimental, assim como a internalização do TCR.

Perfil similar foi observado em camundongos CCR1

-/-

infectados, tanto para a

linfopenia como para o perfil de ativação, quando comparados a animais WT. Em

contraste, animais CCR2

-/-

e CCR4

-/-

infectados apresentam uma reversão parcial do

fenótipo observado em animais WT. Uma menor redução de células T CD8+, CD4+

e NKT, assim como um menor perfil de ativação, foram parâmetros

significativamente diferentes nestes animais (Figura 19).

Resultados

Figura 19. Leucócitos e perfil de ativação após infecção pelo DENV-2 em animais WT

ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO foram infectados com 10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i. Leucócitos esplênicos foram marcados com

anticorpos específicos. Citometria de fluxo, de acordo com tamanho e granulosidade, foi

tomada como analise. O número absoluto das populações foi calculado em função do

número total de leucócitos. Linfócitos T CD3

CD4

(A) e CD3

CD8

animais WT e KO infectados, assim como células CD3

DX5

NKT (E). O perfil de ativação

destes tipos celulares foi avaliado pela expressão de CD69 para células CD4

(B), CD8

(D),

e NKT (F). Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo

menos 2 experimentos (n=5-6 animais). *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 quando

comparado a animais não infectados. # P< 0.05, ## P < 0.01, quando comparado a animais

WT infectados. NI: animais não infectados. MFI: Intensidade de fluorescência média.

Resultados

Em contraste à linfopenia observada essencialmente pela queda no número

de células T CD8+, CD4+ e NKT, a infecção pelo DENV-2 levou ao aumento de

células relacionadas à imunidade inata como NK (CD3

DX5

), macrófagos

(CD11b

F4/80

) e neutrófilos (CD11b

Ly6G

) no baço de animais WT (Figura 20A-

C). De forma similar aos achados anteriores, camundongos CCR1

-/-

infectados

apresentaram perfil celular semelhante ao observado em animais WT, com exceção

de um maior número de neutrófilos no baço. Os dados referentes à população de

neutrófilos no baço vão, inclusive, de acordo com os achados referentes à atividade

de MPO neste tecido (Figura 13). Camundongos CCR2

-/-

infectados apresentaram

diferenças discretas quanto ao número das células analisadas em relação a animais

WT, apesar de apresentarem uma significativa redução no número de macrófagos

(Figura 20B). Isto vai de acordo com o importante papel do receptor CCR2 no

recrutamento de monócitos/macrófagos (Mantovani, 1999; Zlotnik e Yoshie, 2000;

Locati et al., 2002). Já os camundongos CCR4

-/-

apresentaram redução dos 3 tipos

celulares aqui avaliados, corroborando o perfil de resposta linfocítica (Figura 19).

Não foram observadas diferenças no perfil de ativação de células NK (CD3

DX5

como avaliado por CD69 entre os grupos de camundongos estudados (dados não

mostrados). Como dado complementar, a ativação de macrófagos (CD11b

F4/80

avaliada pela expressão de CD86, apresenta aumento em animais WT infectados

mas se apresenta significativamente reduzida em camundongos CCR4

-/-

(dados não

mostrados), mais uma vez sugerindo um fenótipo pró-inflamatório reduzido neste

grupo de animais.

Resultados

Figura 20. Perfil de células NK, macrófagos e neutrófilos após infecção pelo DENV-2

em animais WT ou KO para receptores de quimiocinas. Animais WT e KO foram

infectados com 10DL

de DENV-2 e então sacrificados no dia 6 p.i. Leucócitos esplênicos

foram marcados com anticorpos específicos. Citometria de fluxo, de acordo com tamanho e

granulosidade, foi tomada como analise. O número absoluto das populações foi calculada

em função do número total de leucócitos. Células NK CD3

DX5

(A), macrófagos

CD11b

F4/80

(B) e neutrófilos infiltrados CD11b

Ly6G

e KO infectados. Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de

pelo menos 2 experimentos (n=5-6 animais). *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 quando

comparado a animais não infectados. # P< 0.05, ## P < 0.01, quando comparado a animais

WT infectados. NI: animais não infectados.

Resultados

OBJETIVO 2

PAPEL DELETÉRIO DAS CELULAS NKT INVARIANTES (iNKT) NA

PATOGÊNESE DA INFECÇÃO PELO VIRUS DA DENGUE

4.6. Ativação de células iNKT durante a infecção pelo DENV-2

Uma das importantes características das células iNKT é sua rápida ativação a

fim de iniciar sua participação na resposta imune inata e adaptativa. Perguntamos se

estas células participavam e tornavam-se mais ativadas na infecção experimental

pelo DENV-2 em camundongos WT. Como observado na Figura 21A, a freqüência e

o número absoluto (dados não mostrados) de células iNKT esplênicas permanecem

estáveis em comparação a animais WT controle (células tetrâmero CD1d carregado

com PBS-57

e TCRβ

) no dia 3 p.i., considerando-se o inicio da doença em termos

inflamatórios. Entretanto, há uma queda de aproximadamente 50% na freqüência

destes tipos celulares no dia 5 p.i., característico da linfopenia observada e citada no

Objetivo 1. Esta redução na freqüência de células iNKT durante a infecção é

comumente observada a fenômenos de ativação dependente de TCR e também

decorrente da internalização do TCR (Parekh et al., 2005; Chiba et al., 2008; Kim et

al., 2008).

O dia 5 p.i foi escolhido para análise por citometria de fluxo no presente

trabalho em função do inóculo (3 vezes maior do que o inóculo utilizado no Objetivo

1, além de que foi o momento onde observamos sinais clínicos da doença grave

associado a uma maior taxa de letalidade para os camundongos em estudo. O dia 6

p.i. foi considerado, por exemplo, para a maioria das analises de mediadores

inflamatórios e histologia). Importante frisar, que, no presente modelo experimental,

há uma evidente esplenomegalia observada em animais infectados, com aumento

do número de células no baço em relação a animais não infectados. Entretanto, em

diversos trabalhos do grupo, ao se observar diferenças apreciáveis entre animais

WT e deficientes para moléculas em estudo, mesmo havendo fenótipo de piora ou

mesmo de melhora em alguns casos, esta esplenomegalia e o aumento do número

de células parecem estar diretamente associados ao influxo de neutrófilos e

macrófagos, além de edema.

Resultados

A fim de se estudar o perfil de ativação de células iNKT, investigamos a

expressão de um marcador de ativação inicial em células linfocíticas, a molécula

CD69. Na Figura 21B, o nível de expressão de CD69 em células iNKT foi

significativamente aumentado no dia 5 p.i., não sendo observadas diferenças de

ativação no dia 3 p.i. De forma importante, células NK (CD5

NK1.1

) também

apresentaram a mesma cinética de ativação por CD69 (Figura 21B).

Durante infecções, células iNKT estão entre as primeiras células a produzir

citocinas que podem exercer efeitos diversos em células imunes e não-imunes

(residentes em geral, incluindo fibroblastos e células endoteliais)(Kim et al., 2008;

Tyznik et al., 2008). Desta forma, investigamos se células iNKT expressavam

citocinas comumente associadas ao fenótipo Th1 e/ou Th2, especificamente IFN-γ e

IL-4, durante o modelo de infecção experimental pelo dengue. Comparado a animais

controles não infectados, a infecção pelo DENV-2 levou a um aumento da freqüência

de células iNKT produtoras de IFN-γ, mas não de IL-4 (dados não mostrados) no dia

5 p.i. (Figura 22A). Em contraste, no dia 3 p.i. as células iNKT permanecem

negativas para a produção de IFN-γ, como avaliado por citometria de fluxo. De forma

similar, células NK também expressam IFN-γ intracelular no dia 5 p.i. (Figura 22B)

mas não no dia 3. Dados similares foram obtidos para células iNKT e NK isoladas do

fígado de animais WT infectados nos dias 3 e 5 p.i. (dados não mostrados).

Juntos estes dados sugerem que a infecção pelo DENV-2 leva a uma

ativação sistêmica de células iNKT no dia 5 p.i., momento este que precede o dia

onde a maioria dos animais apresentam mortalidade máxima, além de sinais clínicos

da doença grave, refletindo o pico da replicação viral no dia 6 p.i. (a ser discutido

posteriormente).

Resultados

100

Figura 21. Ativação de células iNKT durante a infecção pelo DENV-2. Animais WT foram

infectados com 30DL

de DENV-2 e então sacrificados nos dias 3 e 5 p.i. Leucócitos

esplênicos foram marcados com anticorpos específicos. Citometria de fluxo, de acordo com

tamanho e granulosidade, foi tomada como analise. Painel A: Freqüência de células iNKT

(Tetrâmero CD1d

TCRβ

) no baço de animais não infectados ou infectados com DENV-2.

Painel B: Expressão do marcador de superfície CD69 nas células iNKT ou NK (CD5

NK1.1

) marcadas nos dias 3 e 5 p.i. Histogramas de barras representam a expressão do marcador

em animais não infectados ou infectados pelo DENV-2 como expresso por MFI. Resultados

foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo menos 2 experimentos

(n=4 animais). ** P < 0.01 quando comparado a animais não infectados. NI: animais não

infectados ou mock. MFI: Intensidade de fluorescência média.

iNKT

Resultados

101

Figura 22. Produção de IFN-γ por células iNKT e NK durante a infecção pelo DENV-2.

Animais WT foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então sacrificados nos dias 3 e 5 p.i.

Leucócitos esplênicos foram marcados com anticorpos específicos. Citometria de fluxo, de

acordo com tamanho e granulosidade, foi tomada como analise. Painel A: Produção de IFN-

γ intracelular por células iNKT esplênicas (Tetrâmero CD1d

TCRβ

) em animais não

infectados ou infectados com DENV-2. Populações definidas quando comparadas ao isotipo

controle. Painel B: Porcentagem de células iNKT ou NK (CD5

NK1.1

) marcadas nos dias

3 e 5 p.i. positivas para IFN-γ. Histogramas de barras representam a porcentagem de

populações positivas para a citocina em animais não infectados ou infectados pelo DENV-2.

Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo menos 2

experimentos (n=4-10 animais). *** P < 0.001 quando comparado a animais não infectados.

NI: animais não infectados ou mock.

iNKT

Resultados

102

4.7. Mortalidade e perda de peso em camundongos deficientes para células

iNKT (Jα18

-/-

) ou para CD1d.

Como citado anteriormente, o presente modelo constitui uma ótima

ferramenta para o estudo da imunopatologia da infecção pelo dengue dadas as

similaridades com os fenômenos observados na clinica (Atrasheuskaya et al., 2003;

Souza et al., 2009; Assuncao-Miranda et al., 2010). A trombocitopenia,

extravasamento vascular e exacerbação da resposta inflamatória sistêmica foram

previamente discutidos (Objetivo 1). O choque e letalidade associados à infecção,

eventualmente presentes na FHD/SCD em humanos, se torna a base do presente

grupo de estudos.

Para identificar um potencial papel de células iNKT no desenvolvimento e/ou

controle da imunopatologia, camundongos WT, Jα18

-/-

e CD1d

-/-

(deficientes em uma

molécula fundamental envolvida na apresentação de antígeno para NKTs) foram

infectados com uma dose de 30DL

da amostra adaptada de DENV-2 e

monitorados diariamente para avaliação da mortalidade e perda de peso associadas

a infecção. Como visto na Figura 23A, camundongos WT infectados apresentaram

rápida perda de peso, começando no dia 4 p.i., com todos os camundongos

sucumbindo a infecção entre os dias 6 e 7 p.i. De forma interessante, camundongos

deficientes para células iNKT (Jα18

-/-

) não apresentam perda de peso significativa e

sobrevivem até 22 dias Após a infecção (Figura 23A, p < 0.01.).

Para se comprovar o envolvimento de células iNKT na mortalidade associada

a infecção pelo DENV-2, camundongos Jα18

-/-

foram reconstituídos com células

iNKT purificadas do fígado de animais WT e então infectados com 30DL

de DENV-

2. Como observado na Figura 23B, apenas 40% dos animais Jα18

-/-

que receberam

células iNKT sucumbiram a infecção entre os dias 6 e 10 p.i quando comparados a

Jα18

-/-

não reconstituídos (p=0.0291), não havendo inclusive perda de peso

significativa. Importante ressaltar que esta reversão considerada parcial, e não

completa, pode ocorrer devido aos vários fatores que podem interferir nesta re-

população de células iNKT, incluindo órgãos alvo após a transferência e estado de

ativação, sem excluir apoptose.

Resultados

103

Figura 23. Variação do peso corporal e mortalidade induzida pelo DENV-2 em animais

WT e deficientes para iNKT (Jα18-/-). Painel A: Camundongos WT ou Jα18

-/-

do mesmo

sexo e idade foram infectados com 30DL

de DENV-2 e monitorados diariamente para

avaliação da mortalidade e perda de peso. À esquerda, perda de peso expressa como a

porcentagem de peso em comparação ao peso inicial do animal. À direita, porcentagem de

sobrevida de camundongos WT e Jα18

-/-

após infecção. Painel B: À esquerda, variação do

peso corporal e mortalidade em camundongos Jα18

-/-

reconstituídos ou não com células

iNKT (1x10

células/animal) 18 horas antes da infecção. À direita, porcentagem de sobrevida

de animais WT, Jα18

-/-

ou Jα18

-/-

-reconstituídos. Resultados para a perda de peso foram

expressos como média ± EPM. * p <0.05. Todos os dados são representativos de pelo

menos 2 experimentos (n=10-25 animais).

Resultados

104

Complementar a estes achados, camundongos deficientes para a molécula

CD1d apresentaram mortalidade e perda de peso similar a animais WT (P= 0,1053)

Após infecção pelo DENV-2 (Figura 24). Sugerindo que provavelmente o papel de

células vNKT é adicional ou antagônico ao desempenhado por células iNKT. Estes

últimos dados confirmam o fenótipo encontrado em animais Jα18

-/-

e sugere o

importante papel de células iNKT na resposta a infecção, um achado inédito no que

diz respeito à associação das células iNKT com a fisiopatologia do dengue.

4.8. Camundongos Jα18

-/-

desenvolvem doença menos grave após a infecção

A hemoconcentração, importante alteração hematológica associada ao

extravasamento vascular decorrente da inflamação, foi observada tanto em

camundongos WT e Jα18

-/-

entre os dias 4 e 6 p.i. a fim de se validar o modelo e

identificar o fenótipo protetor anteriormente observado em Jα18

-/-

. De forma

importante, camundongos Jα18

-/-

apresentaram redução importante da

hemoconcentração no dia 6 p.i., momento de maior gravidade na infecção

experimental, associado à grande mortalidade e morbidade. O hematócrito

permanece em níveis basais nestes animais em todos os pontos avaliados. (Figura

25). Considerando-se a trombocitopenia e sua importante correlação com a clinica

em pacientes infectados, observamos na Figura 26A uma queda significativa no

número de plaquetas em camundongos WT e Jα18

-/-

no dia 5 p.i., embora no grupo

de animais deficientes para iNKT esta queda foi menos expressiva.

A freqüência de granulócitos e outras populações de células circulantes

tendem a se alterar durante a infecção pelo dengue, podendo inclusive estar

associada tanto com leucopenia como com leucocitose (Gubler, 1998; Green e

Rothman, 2006). Camundongos WT infectados apresentam aumento significativo na

freqüência de granulócitos quando comparados a animais controle. Este aumento

não foi observado no sangue de animais Jα18

-/-

durante a infecção pelo DENV-2

(Figura 26A). Não foram observadas diferenças apreciáveis nas freqüências de

monócitos e linfócitos entre camundongos WT e Jα18

-/-

infectados (Figura 26B).

Não foram observadas diferenças entre os níveis basais dos parâmetros

hematológicos avaliados em animais não infectados WT e KO (dados não

mostrados).

Resultados

105

Figura 24. Variação do peso corporal e mortalidade induzida pelo DENV-2 em animais

WT e deficientes para CD1d. Camundongos WT ou CD1d

-/-

do mesmo sexo e idade foram

infectados com 30DL

DENV-2 e monitorados diariamente para avaliação da mortalidade e

perda de peso. No alto: porcentagem de sobrevida de camundongos WT e Jα18

-/-

após

infecção. Embaixo: A perda de peso foi expressa como a porcentagem de peso em

comparação ao peso inicial do animal.

Figura 25. Cinética de hemoconcentração Após infecção pelo DENV-2 em animais WT

e Jα18-/-. Analise hematológica foi feita nos dias 4, 5 e 6 p.i. com 30 LD

de DENV-2 para

se avaliar alterações na porcentagem de hematócrito no sangue de animais não infectados

e infectados WT e KO. Resultados foram expressos como média ± EPM e são

representativos de pelo menos 2 experimentos (n=5-6 animais). *** P < 0.001. NI: animais

não infectados.

Resultados

106

Plaquetas

Granulocitos

Monocitos Linfocitos

Porcentagem

/ µl de sangue

Plaquetas

Granulocitos

Monocitos Linfocitos

Porcentagem

/ µl de sangue

Figura 26. Alterações hematológicas após infecção pelo DENV-2 em animais WT e

Jα18-/-. Painel A: Analise hematológica foi feita no dia 5 p.i. com 30 LD

DENV-2 para

se avaliar alterações no número de plaquetas (A) e porcentagem de granulócitos (B) no

sangue de animais não infectados e infectados WT e KO. Painel B: Porcentagem de

monócitos (C) e linfócitos (D) no sangue de animais não infectados e infectados WT e KO.

Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo menos 2

experimentos (n=6-11 animais). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. mock: animais não

infectados. Branco: WT. Preto: DENV-2 dia 5 p.i..

Resultados

107

O próximo passo foi associar a redução de mortalidade e alterações

hematológicas observadas em animais Jα18

-/-

com uma possível alteração na forte

resposta inflamatória associada à infecção. Como visto na Figura 27, os níveis

séricos de IL-6 e IFN-γ se encontram bastante aumentados entre os dias 4 e 6 p.i.

em animais WT. De forma importante, observamos uma redução significativa do

nível destas citocinas no soro de animais Jα18

-/-

, especialmente IL-6, sugerindo uma

menor resposta inflamatória sistêmica frente à infecção

Para se visualizar a extensão da lesão tecidual decorrente da infecção grave

pelo dengue, o fígado de animais WT e Jα18

-/-

foi analisado no dia 6 p.i. A coloração

por HE revelou claros sinais de hemorragia e degeneração de hepatócitos por todo o

parênquima hepático. Congestão e focos de necrose foram também evidenciados.

Nos animais Jα18

-/-

infectados estas alterações histopatológicas foram

significativamente menos evidentes, com apenas algumas regiões de hemorragia e

ainda algum infiltrado inflamatório (Figura 28). Em conjunto estes dados sugerem

que células iNKT contribuem significativamente para a mortalidade, resposta

inflamatória sistêmica e dano tecidual associados a infecção experimental pelo

DENV-2.

4.9. Camundongos Jα18

-/-

apresentam menor produção de citocinas pro-

inflamatórias

Em face da cytokine storm, ou produção exacerbada de citocinas observada

durante a infecção pelo dengue, normalmente correlacionada com a gravidade da

doença em pacientes (Martina et al., 2009), investigamos a produção de citocinas

pro-inflamatórias no baço de animais WT e Jα18

-/-

infectados. Como visto na Figura

29, foi observado um aumento significativo da produção das citocinas IL-6, IFN-γ e

IL-12p40 em animais WT entre os dias 4 e 6 p.i., importantes citocinas também

envolvidas na resposta dirigida por iNKT em infecções (Matsumoto et al., 2000;

Nagarajan e Kronenberg, 2007). O mesmo foi observado para o nível de expressão

de IFN-γ e IL-12p40 por QPCR (dados não mostrados).

Resultados

108

Figura 27. Produção de citocinas no soro após infecção pelo DENV-2 em animais WT

e Jα18-/-. Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então sacrificados

entre os dias 4 e 6 p.i para analise de amostras de sangue. Produção das citocinas IL-6 e

IFN-γ no soro foi avaliada por ELISA. Os dados estão expressos em pg por ml. Resultados

foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo menos 2 experimentos

(n=6-11 animais).

* p < 0.05, ** p < 0.01.

mock: animais não infectados. Branco: WT.

Cinza: KO.

40X

20X

40X

20X

Figura 28. Alterações histológicas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais

WT e Jα18-/-. Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então

sacrificados no dia 6 p.i para analise de amostras de tecido. Cortes histológicos corados

com HE em animais infectados ou não mostram sinais de congestão, hemorragia,

degeneração de hepatócitos e necrose em animais WT, mas em menor grau em animais

Jα18

-/-

. Cada corte apresentado no painel é representativo de pelo menos 15 campos.

Aumento: 20X e 40X. mock: animais não infectados.

Resultados

109

pg por 100 mg de baço

Figura 29. Produção de citocinas e quimiocinas no baço após infecção pelo DENV-2

em animais WT e Jα18-/-. Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e

então sacrificados entre os dias 4 e 6 p.i para analise de amostras de tecido. Produção da

citocina IL-6, IFN-γ, IL-12p40, CXCL1/KC em homogenato de baço foi avaliada por ELISA.

Os dados estão expressos em pg por 100 mg de tecido. Resultados foram expressos como

média ± EPM e são representativos de pelo menos 2 experimentos (n=4-8 animais).

* p <

0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

mock: animais não infectados. Branco: WT. Cinza: KO.

Resultados

110

De forma similar, a quimiocina CXCL1/KC é produzida em grandes

concentrações no baço de animais WT infectados. Análoga da IL-8 humana e

importante quimiocina produzida durante a infecção pelo dengue (Juffrie et al., 2000;

Medin et al., 2005), KC é associada ao recrutamento e acúmulo de neutrófilos para

órgãos alvo, este ultimo fenômeno já observado em nosso modelo experimental

(Objetivo 1).

Em paralelo ao exposto, camundongos Jα18

-/-

apresentaram níveis

significativamente reduzidos de todas as citocinas avaliadas entre os dias 4 e 6 p.i.

(Figura 29). Além do mais, níveis de TNF-α e IL-1β, apesar de apresentarem perfil

de produção irregular, tendem a uma redução nestes animais, especialmente TNF-α

nos dias associados à doença grave (Figura 30). Não foram observadas diferenças

significativas para as citocinas IFN-γ e IL-12p40 no fígado de animais WT e Jα18

-/-

infectados, fator muitas vezes relacionado ao alto background encontrado durante a

infecção, normalmente em função da acidez e metabolismo do órgão lesionado,

mascarando diferenças sutis possivelmente encontradas somente em nível

transcricional (Figura 31). Além do mais, não foram observadas diferenças entre os

níveis basais das citocinas/quimiocinas avaliadas em animais não infectados WT e

KO (dados não mostrados).

Em conjunto estes dados sustentam a relevância de células iNKT em mediar

parte importante da exacerbação da resposta inflamatória associada a infecção via

um cytokine storm.

Resultados

111

pg por 100 mg de baço

Figura 30. Produção de citocinas no baço após infecção pelo DENV-2 em animais WT

e Jα18-/-. Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então sacrificados

entre os dias 4 e 6 p.i para analise de amostras de tecido. Produção da citocina TNF-α e IL-

1β em homogenato de baço foi avaliada por ELISA. Os dados estão expressos em pg por

100 mg de tecido. Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de

pelo menos 2 experimentos (n=4-8 animais).

* p < 0.05.

mock: animais não infectados.

Branco: WT. Cinza: KO.

Figura 31. Produção de citocinas no fígado após infecção pelo DENV-2 em animais WT

e Jα18-/-. Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então sacrificados

entre os dias 4 e 6 p.i para analise de amostras de tecido. Produção da citocina IFN-γ e IL-

12p40 em homogenato de fígado foi avaliada por ELISA. Os dados estão expressos em pg

por 100 mg de tecido. Resultados foram expressos como média ± EPM e são

representativos de pelo menos 2 experimentos (n=4-8 animais).

* p < 0.05, ** p < 0.01.

mock: animais não infectados. Branco: WT. Cinza: KO.

Resultados

112

4.10. Redução da ativação de células NK e neutrófilos durante a infecção pelo

DENV-2 em camundongos Jα18

-/-

A ativação in vivo de células iNKT desencadeia uma estimulação seqüencial,

e as vezes expansão, de varias células componentes da resposta imune, incluindo

NK, neutrófilos e linfócitos T convencionais, importantes na resposta a infecção pelo

dengue (Liu et al., 2002; Van Dommelen e Degli-Esposti, 2004; Chau et al., 2008).

Desta forma confirmamos o impacto destas células durante a infecção experimental

pelo DENV-2 no dia 5 p.i e conseqüente relação com a ausência de células iNKT.

Como visto na Figura 32, a infecção pelo DENV-2 foi associada com a

redução na freqüência de células NK (Figura 32A) no baço de animais WT. De forma

contraria, a freqüência desta população não foi significativamente alterada em

animais Jα18

-/-

quando comparados a animais não infectados. No que diz respeito

ao perfil de ativação durante a infecção, células NK de animais WT infectados

apresentam maior expressão da molécula CD69 em comparação às células de

animais Jα18

-/-

. Além do mais, a expressão de granzima B (Figura 32B) e CD107α

(dados não mostrados) em células NK de animais WT encontram-se

significativamente aumentada em relação a animais Jα18

-/-

. As duas moléculas são

reconhecidamente importantes na resposta celular citotóxica.

Células NK do baço de camundongos WT infectados positivamente marcadas

para IFN-γ estão significativamente aumentadas no dia 5 p.i., enquanto este

fenômeno foi reduzido em camundongos Jα18

-/-

(Figura 32B).

A Figura 32C mostra que o acúmulo de neutrófilos no baço de animais WT foi

significativamente aumentado em decorrência da infecção pelo DENV-2 5 dias p.i..

Animais Jα18

-/-

apresentam níveis similares ao de animais não infectados. Em

termos de ativação, animais WT infectados expressam maior nível de ativação de

ativação, como observado pelo marcador CD62L (L-selectina, onde níveis menores

representam maior ativação ou células já transmigradas). Neutrófilos de animais

Jα18

-/-

apresentam perfil de ativação de neutrófilos similar ao de animais não

infectados, pelo menos termos de expressão de CD62L.

Resultados

113

Porcentagem

Neutrofilos

Porcentagem

Neutrofilos

Porcentagem

Neutrofilos

Figura 32. Porcentagem e ativação de células NK durante a infecção pelo DENV-2 em

animais WT e J

18-/-.

Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então

sacrificados nos dia 5 p.i. Leucócitos esplênicos foram marcados com anticorpos

específicos. Citometria de fluxo, de acordo com tamanho e granulosidade, foi tomada como

analise.

Painel A

: Freqüência de células NK (CD5

NK1.1

) no baço de animais não

infectados ou infectados com DENV-2 e expressão do marcador de superfície CD69.

Painel

Expressão de Granzima B e porcentagem de células positivas para IFN-γ nas células NK

(CD5

NK1.1

) marcadas no dia 5 p.i.

Painel C

: Freqüência de neutrofilos (CD11c

Ly6G

)

no baço de animais não infectados ou infectados com DENV-2 e expressão do marcador de

superfície CD62L. Histogramas de barras representam a expressão do marcador em

animais WT ou KO infectados pelo DENV-2 como expresso por MFI ou porcentagem.

Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de pelo menos 2

experimentos (n=3-8 animais). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. mock: animais não

infectados.

MFI

: Intensidade de fluorescência média.

Branco

: mock.

Preto

: DENV-2.

Resultados

114

A ativação de linfócitos T CD8

and CD4

tem sido comumente associada a

severidade da infecção pelo dengue (Chau et al., 2008), além de que em nosso

modelo experimental esta associação foi também demonstrada no Objetivo 1.

Não observamos diferenças na porcentagem de células T CD8

apesar de

haver uma redução significativa na porcentagem de células T CD4

após a infecção

pelo DENV-2 no dia 5 p.i. (Figura 33). Não houve diferenças entre as porcentagens

destas populações celulares para camundongos WT e Jα18

-/-

. Entretanto, linfócitos T

CD8

e CD4

apresentam elevada expressão de CD69 em camundongos WT

infectados no dia 5 p.i. De forma importante, esta ativação é significativamente

menos pronunciada em animais Jα18

-/-

(Figura 33).

Como nota, é importante ressaltar que algumas variações encontradas nas

porcentagens ou no perfil de certas populações aqui estudadas podem diferir

daquelas apresentadas no Objetivo 1, tanto pelo inóculo utilizado como pelo ponto

escolhido para avaliação. Estas diferenças foram estratégias escolhidas em função

das hipóteses avaliadas. De qualquer forma a mensagem segue o mesmo sentido

no que diz respeito à relevância destes tipos celulares nos dois estudos

componentes da presente tese.

Os dados aqui apresentados mostram uma menor ativação geral de células

da imunidade inata (NK e neutrófilos) e também de células da resposta adaptativa

na ausência de células iNKT durante a infecção experimental pelo DENV-2.

Apresentamos aqui um importante papel cooperativo entre estas populações

celulares durante a infecção experimental.

Resultados

115

Células T CD4+

Células T CD8+

Porcentagem

Células T CD4+

Células T CD8+

Porcentagem

Figura 33. Porcentagem e ativação de linfócitos T durante a infecção pelo DENV-2 em

animais WT e Jα18-/-. Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então

sacrificados nos dia 5 p.i. Leucócitos esplênicos foram marcados com anticorpos

específicos. Citometria de fluxo, de acordo com tamanho e granulosidade, foi tomada como

analise. Porcentagem de linfócitos T CD4+ (CD3

CD4

) e T CD8+ no baço de animais não

infectados ou infectados com DENV-2 e expressão do marcador de superfície CD69.

Histogramas de barras representam a expressão do marcador em animais WT ou KO

infectados pelo DENV-2 como expresso por MFI. Resultados foram expressos como média

± EPM e são representativos de pelo menos 2 experimentos (n=3-8 animais). * p < 0.05, ** p

< 0.01, *** p < 0.001. mock: animais não infectados. MFI: Intensidade de fluorescência

média. Branco: mock. Preto: DENV-2.

Resultados

116

4.11. Relação entre células iNKT e carga viral em camundongos infectados

pelo DENV-2

Como discutido até o momento, camundongos Jα18

-/-

apresentam doença

branda, além menor resposta inflamatória sistêmica e dano tecidual após infecção

experimental pelo DENV-2. Perguntamo-nos então se células iNKT contribuiriam

para a resposta do hospedeiro contra o vírus a infecção, como avaliado pela carga

viral em órgãos alvo.

Como evidenciado na Figura 34, foram observados títulos virais significativos

no baço e fígado de camundongos WT no dia 6 p.i. No dia 4 p.i. já é possível

detectar títulos virais nestes mesmos órgãos. Entretanto, a carga viral no fígado de

camundongos Jα18

-/-

infectados é significativamente menor do que a observada em

camundongos, tanto no dia 4 como no dia 6, representando em média 8.4 x 10

UFP/100 mg de tecido quando comparada a de camundongos WT (4.1 x 10

UFP/100 mg de tecido) no momento mais tardio da doença. Embora não significativa

no dia 6, a carga viral apresenta tendência a redução no baço de camundongos

Jα18

-/-

em comparação a animais WT (3.6 x 10

contra 1.8 x 10

UFP/100 mg de ,

respectivamente), pelo menos no tempo escolhido. No dia 4 p.i, entretanto,

camundongos Jα18

-/-

apresentam menor carga viral quando comparados a animais

WT (P=0.0139).

Assim, em nosso modelo experimental, a deficiência em células iNKT não

resulta em disfunção do clearance viral durante a infecção, mas, ao contrario, leva a

uma redução da carga viral em órgãos alvo da doença, como o fígado. Isto parece

estar associado a eventos iniciais, uma vez que no dia 4 p.i. o clearance em animais

Jα18

-/-

se mostra eficiente. Isto sugere que, neste modelo de infecção, células iNKT

não somente favorecem a resposta inflamatória sistêmica como também a

replicação viral. Fenômeno este que pode ser associado direta ou indiretamente com

a exacerbação da resposta inflamatória, o que culminaria em uma resposta

deficiente do hospedeiro ou falência, ao contrario do que se preconiza

freqüentemente em doenças inflamatórias de origem infecciosa. Considerando que

animais Jα18

-/-

não sucumbem a doença como animais WT, mecanismos

moleculares e celulares que medeiam a relação das células iNKT com o clearance

viral, principalmente em momentos anteriores ao choque hemorrágico, merecem

estudos mais aprofundados.

Resultados

117

Figura 34. Carga viral no baço e fígado de camundongos WT e Jα18-/- após infecção

pelo DENV-2. Animais WT e KO foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então

sacrificados nos dias 4 e 6 p.i para processamento das amostras de tecido e obtenção dos

títulos virais em células LLC-MK2. Os dados estão expressos em log de UFP (unidades

formadoras de placas) por 100 mg de tecido. Resultados foram expressos como a média

geométrica e são representativos de pelo menos 2 experimentos (n=5-10 animais). Baço: #

P=0.0139. Figado: #P=0,0159, *P=0,0026.

Resultados

118

4.12. Efeitos do tratamento com αGAL-CER sobre a mortalidade e parâmetros

hematológicos durante a infecção com DENV-2

Após demonstrarmos que a ausência de células iNKT leva a uma redução da

resposta inflamatória associada a infecção pelo DENV-2 e conseqüentemente menor

mortalidade e carga viral, resolvemos investigar o efeito da ativação destas células

in vivo. Para tanto, grupos de animais WT foram tratados com o glicolípide αGAL-

CER 1 dia antes da infecção (pré-tratamento) ou 2 dias depois da infecção (pós-

tratamento) em dose única. Apesar de estatisticamente significativas (P<0.05), tanto

o pré como o pos tratamento com αGAL-CER (2 µg/animal) levaram a pequenas

diferenças na letalidade e perda de peso, de aproximadamente 1 dia a mais de

sobrevida e menor perda de peso associada a infecção experimental em

camundongos WT (Figura 35A). Na abordagem de pós-tratamento/terapêutica, o

atraso observado para a mortalidade não refletiu em redução das alterações

hematológicas associadas à doença no dia 6 p.i., avaliado pela contagem de

plaquetas e porcentagem de hematócrito e granulócitos (Figura 35B). O tratamento

com αGAL-CER em animais WT não infectados não leva a perda de peso ou

alterações hematológicas (dados não mostrados).

No que diz respeito à carga viral, não foram observadas diferenças quanto

aos títulos encontrados no fígado e baço de animais WT e Jα18

-/-

nos dias 4 p.i.

(dados não mostrados) e no dia 6 p.i. (Figura 36)

Apesar de intrigantes, estes dados

sugerem que a ativação artificial de células iNKT durante a infecção não interfere na

progressão da doença, onde se esperaria uma possível exacerbação baseados nos

resultados apresentados até o momento. Tais fatos reforçam a idéia de que a

ativação natural de células iNKT é multifatorial e progressiva, dependendo de

componentes que parecem não ser disponibilizados somente com a ativação via

αGAL-CER/CD1d, como a produção diferencial de citocinas e a necessidade de a

presença e/ou ativação de certas populações celulares.

Resultados

119

Figura 35. Mortalidade, perda de peso e hematologia em camundongos WT tratados

com αGal-Cer e infectados com DENV-2. Painel A: Camundongos WT ou WT+αGal-Cer

(2 µg/animal), passando por pré (1 hora antes da infecção) ou pós-tratamento (2 dias p.i.),

do mesmo sexo e idade, foram infectados com 30DL

DENV-2 e monitorados diariamente

para avaliação da mortalidade e perda de peso. Painel A: No alto, porcentagem de

sobrevida de camundongos WT ou tratados com αGal-Cer. Embaixo, perda de peso

expressa como a porcentagem de peso em comparação ao peso inicial do animal.

Resultados para a perda de peso foram expressos como média ± EPM. Todos os dados são

representativos de pelo menos 2 experimentos (n=10-15 animais). Painel B: Analise

hematológica foi feita no dias 6 p.i. em animais WT infectados com 30DL

DENV-2 e pós-

tratados com 2µg de αGal-Cer (2 dias p.i.) para se avaliar alterações na contagem de

plaquetas e porcentagem de hematócrito e granulócitos no sangue de animais infectados

WT e tratados. Resultados foram expressos como média ± EPM e são representativos de

pelo menos 2 experimentos (n=5-6 animais). *** P < 0.001. NI: animais não infectados.

Resultados

120

Figura 36. Carga viral no baço e fígado de camundongos WT tratados com αGal-Cer e

infectados com DENV-2. Camundongos WT ou WT+αGal-Cer (2µg/animal) passando por

pós-tratamento (2 dias p.i.) foram infectados com 30DL

de DENV-2 e então sacrificados no

dia 6 p.i para processamento das amostras de tecido e obtenção dos títulos virais em

células LLC-MK2. Os dados estão expressos em log de UFP (unidades formadoras de

placas) por 100 mg de tecido. Resultados foram expressos como a média geométrica e são

representativos de pelo menos 2 experimentos (n=5-6 animais).

V. DISCUSSÃO

Discussão

5. Discussão

No presente trabalho investigamos o papel desempenhado pelos receptores

para quimiocinas da família CC, especificamente CCR1, CCR2 e CCR4, no contexto

da infecção experimental pelo Dengue vírus, sugerindo que estes receptores

desempenham papéis distintos na resposta inflamatória associada à infecção (i.e.

maior relação com a resposta inflamatória sistêmica e/ou com a resposta inflamatória

associada ao dano hepático). Além do mais, investigamos em paralelo o papel de

células iNKT neste mesmo modelo experimental, sugerindo que estas células

desempenham papel fundamental na progressão da doença, especialmente por

estarem associadas a produção maciça de mediadores inflamatórios, provavelmente

contribuindo para o dano tecidual e levando a falência do hospedeiro. Além do

mais, apesar de não demonstrado experimentalmente, receptores como CCR2 e

CCR4 podem estar envolvidos neste fenômeno, contribuindo para o menor

recrutamento e ativação de células iNKT neste modelo. O presente trabalho abre

portas para duas frentes de intervenção terapêutica a serem desenvolvidas: inibição

de receptores de quimiocinas e antagonismo/inibição de células iNKT.

Mais do que isso, esta tese aporta informações até então pouco discutidas em

termos práticos, devido essencialmente a ausência de modelos experimentais

viáveis, como o envolvimento de quimiocinas, import antes marcadores da resposta

inflamatória em doenças infecciosas, e sua associação com mortalidade e dano

tecidual, assim como células da resposta imune e sua relação com a produção de

mediadores e conseqüente contribuição para dano tecidual. O advento de um

modelo murino imunocompetente serviu como base para a fundamentação deste

estudo e tende a ser a melhor ferramenta para esclarecer minuciosamente os

diversos aspectos celulares e moleculares envolvidos na resposta ao vírus da

dengue em vertebrados.

No que diz respeito aos receptores para quimiocinas CC avaliados, nosso

maiores achados podem ser resumidos da seguinte maneira: 1) O receptor CCR1

parece não possuir um papel fundamental na patogêne se da infecção experimental

grave em camundongos; 2) o receptor CCR2 parece contribuir para a lesão hepática

associada à infecção pelo dengue, o que se refletiu em menor ativação leucocitária e

menor mortalidade em camundongos CCR2

-/-

. Entretanto não observamos

diferenças apreciáveis na resposta inflamatória sistêmica associada à infecção (i.e.

122

Discussão

citocinas/quimiocinas no baço) e 3) o receptor CCR4 também contribui para a

patogênese da infecção experimental pelo dengue e é relevante para o

dano hepático associado a infecção assim como para a res posta inflamatória

sistêmica. Menor ativação leucocitária global e menor mortalidade foram marcantes

em animais CCR4

-/-

Além do importante papel desempenhado por quimiocinas em doenças

infecciosas e o interesse emergente em se compreender e encontrar alvos

moleculares e celulares que possam servir como pontos de intervenção terapêutica

na infecção pelo dengue, o desenvolvimento de um modelo experimental que reflita a

FHD/SCD se faz necessário e permite maiores abordagens experimentais sobre o

assunto.

Os pontos avaliados para o estudo da infecção experimental pelo dengue

vírus, em geral entre os dias 4 e 6 p.i., estão de acordo com a dinâmica da infecção

encontrada em humanos, coincidindo com o momento em que estes procuram por

ajuda médica, seja na FD ou na FHD (Gibbons e Vaughn, 2002; Green e Rothman,

2006; Martina et al., 2009). Além do mais, o conhecimento prévio dos mecanismos

envolvidos em síndromes com choque associado, como SIRS e sepse, podem

contribuir para a elucidação e desenvolvimento de estratégias experimentais para o

controle da resposta inflamatória exacerbada, o que gera os maiores problemas de

saúde publica relacionados a infecção pelo dengue. Antes de tudo estamos lidando

com uma resposta inflamatória sistêmica multifatorial e com mecanismos de

desencadeamento e resolução praticamente desconhecidos.

O receptor CCR1 é amplamente expresso em populações tanto monocíticas e

como não-monocíticas (Murphy, 1994; Baggiolini, 199 8; Locati et al., 2002).

Ligantes para CCR1, como CCL3/MIP-1α e CCL4/ MIP-1β, são encontrados em

grandes concentrações no plasma de pacientes infectados pelo DENV, podendo

haver associação com a severidade da doença (Spain-Santana et al., 2001; Bozza et

al., 2008; Sierra et al.). Consistente com estes achados, níveis de CCL3/MIP-1α

estavam aumentados no baço e fígado de animais WT infectados pelo DENV-2.

Entretanto, observamos que o curso da infecção em animais CCR1

-/-

foi bastante

similar ao observado em camundongos WT, sem diferenças na letalidade ou perda

de peso. De forma interessante, a produção de CCL3/MIP-1α estava aumentada no

baço e fígado de animais CCR1

-/-

infectados. Isto vai de acordo com a idéia de

que receptores para quimiocinas funcionam como importantes moduladores da

123

Discussão

concentração de quimiocinas em tecidos inflamados, onde são capazes de

seqüestrar seus ligantes (ditos “ scavengers”) e assim reduzir esta concentração

(Cardona et al., 2008).

Uma vez que populações que expressam o receptor CCR1, como linfócitos e

células NKT, não apresentam freqüência e ativação diferentes das observadas

em animais WT após a infecção, o papel de células da imunidade inata, como NK e

neutrófilos, deve ser levado em consideração. Neste sentido, macrófagos parecem

desempenhar também um papel importante, uma vez que o acúmulo/ativação desta

população no baço de animais CCR1

-/-

esta aumentada em comparação a animais

WT, o que pode contribuir de forma importante para a produção de citocinas e

quimiocinas em sinergismo com neutrófilos, também aumentados neste órgão. Os

níveis de CCL2/JE estão significativamente aumentad os no baço de animais CCR1

-/-

, o que corrobora esta hipótese.

Embora os níveis de CCL3 estejam aumentados no pico de gravidade deste

modelo experimental, este achado não se relaciona diretamente com maior

letalidade, carga viral e acúmulo linfocitico em órgãos alvo através do receptor

CCR1. De forma complementar, a quimiocina CCL3 pode estar envolvida

indiretamente no recrutamento de neutrófilos, mecanismo já descrito em modelos de

sepse e que é dependente de uma cascata de fatores quimiotáticos (Ramos et al.,

2006). Já foi demonstrado também que CCL3/MIP-1 α pode, através dos receptores

CCR5 e CCR3, podem contribuir para o recrutamento e ativação de neutrófilos

em lesões isquêmicas e na inflamação sistêmica decorrente da infecção pelo

HIV (Jan et al., 2006; Reichel et al., 2006). Níveis elevados de CCL3 podem

também ativar outro receptor importante para esta quimiocina: CCR5. Especialmente

na infecção por outro flavivirus, a febre do oeste do Nilo (WNV), este receptor possui

um papel fundamental na patogênese da doença (Lim et al., 2006; Lim et al., 2008;

Lim et al., 2010). Não investigamos aqui o papel do receptor CCR 5 no presente

modelo experimental (Guabiraba et al, em preparação) mas sugerimos aqui que o

camundongo CCR1

-/-

não apresenta fenótipo diferente quando comparado a animais

WT infectados com um inóculo que causa doença similar a FHD/SCD em

camundongos. CCR1 parece desempenhar um papel discreto e não fundamental na

progressão e severidade da infecção pelo DENV. Este receptor, entretanto, parece

ter função consideravelmente complexa na resposta inflamatória, devido à sua

124

Discussão

variedade de ligantes e distribuição ubíqua entre populações celulares em diferentes

estágios da resposta.

A quimiocina CCL2/MCP-1 é produzida em diversas condições inflamatórias e

exerce suas funções através do receptor CCR2, expresso em monócitos,

macrófagos, algumas linhagens linfociticas e também neutrófilos. (Johnston et al.,

1999; Zlotnik e Yoshie, 2000; Locati et al., 2002; Speyer et al., 2004). Níveis de

CCL2 já estão associados com o mau prognostico em p acientes infectados

peloDENV (Lee et al., 2006; Bozza et al., 2008). No presente trabalho, a taxa de

mortalidade foi significativamente reduzida em animais CCR2

-/-

infectados pelo

DENV-2 e isto parece estar diretamente associado com uma menor concentração de

transaminases hepáticas assim como com a menor inflamação e lesão hepáticas.

Importante frisar que hepatócitos são alvos comuns do DENV e podem responder

ativamente através da produção de citocinas e quimiocinas, contribuindo para a

lesão local e conseqüente déficit de função hepática (Suksanpaisan et al., 2007). A

trombocitopenia e a hemoconcentração observadas em animais CCR2

-/-

foi similar a

observada em animais WT infectados, embora os níveis de IL-6 e IFN-γ, mas não

TNF- α, estarem reduzidos sistemicamente nos animais CCR2

-/-

. Estas alterações

hematológicas parecem ser secundárias ao pico de produção de citocinas pro-

inflamatórias. Níveis de CCL2 estão elevados tanto no baço como fígado destes

animais, corroborando a hipótese do controle fisiológico de quimiocinas. CCL3/MIP-

1α e CCL5/RANTES também aparecem em concentrações elevadas quando

comparadas a animais WT no dia 6 p.i., mesmo que o fenômeno não parece

contribuir para a maior ativação ou recrutamento leucocitário em animais CCR2

-/-

Observamos uma importante redução na ativação de populações celulares

envolvidas na infecção pelo DENV-2, notadamente células CD4+, CD8+, NKT e

macrófagos. Os achados envolvendo células NKT/iNKT vão de encontro com os

apresentados na presente tese (Objetivo 2), sugerindo um importante papel para

estas populações na resposta inflamatória (cytokine storm) associada ao DENV.

Alguns estudos demonstram que estas células respondem a CCL2/MCP-1 em

doenças infecciosas (Kawakami et al., 2001), assim como podem ser recrutadas

para sítios inflamatórios através do receptor CCR2(Kim et al., 2002; Thomas et al.,

2003). Além do mais, a menor ativação leucocitária, por si só, já pode ser um

indicativo da menor produção sistêmica de citocinas e a menor lesão hepática

nestes animais.

125

Discussão

Embora haja um acúmulo significativo de neutrófilos no baço e fígado de

animais CCR2

-/-

, isto não parece contribuir para o mau prognostico da doença,

incluindo mortalidade. A menor concentração de IL-6 observada no fígado de animais

CCR2

-/-

infectados, pode, por exemplo, contribuir para menor ativação e

degranulação de neutrófilos. Além do mais, esta ativação de neutrófilos dependente

de IL-6 e quimiocinas CC já foi demonstrada na seps e experimental (Speyer et al.,

2004). Estas diferenças no recrutamento e ativação de leucócitos não resultaram em

alterações na carga viral no fígado, sugerindo que animais CCR2

-/-

devem recuperar

precocemente o status hemodinâmico, que estaria associado a uma menor le são

tecidual, colaborando assim para um clearance efetivo após o pico da doença.

Um maior extravasamento plasmático decorrente da resposta inflamatória

associada à infecção pelo DENV pode levar a hemoconcentração, hipotensão e

morte (Green e Rothman, 2006; Lee et al., 2006; Srikiatkhachorn et al., 2007; Binh et

al., 2009; Srikiatkhachorn, 2009). Entretanto, não est á muito claro o porquê da

hemoconcentração observada em animais CCR2

-/-

no dia 6 p.i., uma vez que os

níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias estão significativamente reduzidos, assim

como a lesão hepática e conseqüente mortalida de associada. É possível que alguns

animais podem eventualmente se recuperar da permeabilidade vascular grave

observada na infecção, o que levaria a hemoconcentração e não necessariamente a

mortalidade uma vez que eles ainda possuiriam função hepática adequada. Uma

abordagem experimental para explicar este fenômeno se torna difícil uma vez que a

maioria dos animais WT está morta neste estágio da doença para fins de

comparação ao controle. Animais CCR2

-/-

que resistem à infecção possuem

parâmetros hematológicos inalterados em estágios tardios (dia 14), sugerindo uma

recuperação em detrimento do pico de permeabilidade vascular observado na fase

critica da doença (dados não mostrados).

Desta forma, o receptor para quimiocinas CCR2 desempenha papel

importante na patogênese da infecção experimental pelo DENV-2. A maior sobrevida

observada em animais CCR2

-/-

é provavelmente secundaria ao menor dano hepático,

menor ativação celular e menor produção d e citocinas/quimiocinas.

O receptor CCR4 é expresso em células T, especialmente linfócitos do tipo

Th2, e participa de diversas condições patológicas como, por exemplo, asma, câncer

e doença inflamatória intestinal (Vijayanand et

al.; Luster, 2001; Nouri-Aria et al.,

2002; Schuh et al., 2002; Yuan et al., 2007;

Di Stasi et al., 2009). De forma

126

Discussão

interessante, a deficiência no receptor CCR4 resulta na diminuição da resposta

inflamatória induzida pela sepse polimicrobiana em camundongos e no choque

endotóxico induzido por LPS, implicando este receptor na patogênese de condições

inflamatórias agudas (Chvatchko et al., 2000; Traeger et al., 2008). Outros

experimentos, entretanto, demonstraram um papel protetor para a quimiocina

CCL22/MDC, um dos ligantes para CCR4, em um modelo de sepse (CLP) em

camundongos (Matsukawa et al., 2000).

Em experimentos preliminares observamos que a quimiocina CCL17/TARC,

um dos ligantes para CCR4, era produzida em níveis relativamente altos no baço de

camundongos infectados pelo DENV-2. Até o presente momento não existem outros

relatos mostrando a produção desta quimiocina em uma infecção por flavivirus.

Experimentos com camundongos CCR4

-/-

revelaram que estes animais estão

protegidos da mortalidade e perda de peso associadas a infecção experimental pelo

DENV-2. Complementar a este achado, estes animais não apresentam

hemoconcentração apreciável e considerável redução na trombocitopenia,

granulocitóse, dano hepático, resposta inflamatória sistêmica e ativação de

leucócitos após a infecção experimental, incluindo reduzido acúmulo de neutrófilos

no baço e fígado. Toda esta forte regulação negativa da resposta inflamatória

associada ao DENV se reflete em maior sobrevida para animais CCR4

-/-

. Importante

frisar que apesar do fenótipo de proteção observado em animais CCR4

-/-

, não houve

diferença na carga viral quando comparada a de animais WT. Isto sugere que o

receptor CCR4 não parece estar envolvido com contro le da replicação viral ou

mesmo da entrada do vírus, e sim participaria na cascata de eventos que levam ao

dano tecidual e a resposta inflamatória sistêmica deletéria associada ao DENV.

Neste quesito, nossos resultados vão de acordo com o papel deletério do receptor

CCR4 na patogênese da sepse bacteriana (Chvatchko et al., 2000; Traeger et al.,

2008).

É difícil sugerir um mecanismo pelo qual o CCR4 contribuiria para a

patogênese da infecção pelo dengue. Entretanto, CCR 4 pode ser importante para o

trafego e ativação de células NKT e linfócitos T CD8+ por pelo menos duas vias de

quimiocinas independentes, incluindo CCL17/TARC e CCL22/MDC (Kim et al., 2002;

Semmling et al.). Considerando o importante papel atribuído a células NKT/iNKT na

patogênese do presente modelo experimental, é possí vel que CCR4, assim como

CCR2, estejam envolvidos no recrutamento e ativação destes tipos celulares,

127

Discussão

contribuindo assim para lesão e mortalidade. Desta forma, considerando

doenças/patologias com choque associado, no caso viral (presente estudo) e

bacteriano (sepse), o bloqueio do receptor CCR4 pode ser benéfico em termos

terapêuticos, um conceito que ainda deve ser melhor elucidado em modelos animais

e então testado em humanos. Até o momento não conhe cemos estudos sugerindo

intervenções terapêuticas ou o antagonismo funciona l do receptor CCR4 em

doenças virais envolvendo choque hemorrágico, o que torna esta abordagem inédita

e de relevância no campo da imunopatologia de doenç as infecciosas.

Em termos gerais, demonstramos nesta primeira seção que os receptores

para quimiocinas da família CC, especificamente CCR1, CCR2 e CCR4

desempenham papeis diferentes na patogênese da infe cção experimental pelo

DENV. Em contraste, estes receptores parecem não de sempenhar um papel

essencial na proteção contra a infecção primária pe lo vírus da dengue. Nossos

estudos sugerem que a produção exacerbada de quimiocinas (ou chemokine storm)

que se segue após desencadeada a infecção está associada principalmente ao

desenvolvimento da doença do que proteção. É possível, desta forma, inferir que

antagonistas para receptores de quimiocinas, notadamente CCR2 e CCR4, além de

ligantes solúveis para quimiocinas envolvidas nestas respostas, podem servir como

co-adjuvantes na terapia para as manifestações severas da infecção pelo dengue.

Tendo em vista o importante efeito que a deleção dos receptores CCR2

e CCR4 exercem sobre o recrutamento e ativação de populações linfociticas,

especialmente NKT, contribuindo para uma menor gravidade e maior sobrevida

associada à doença, nossos resultados apontam para um quadro onde quimiocinas

produzidas durante a infecção pela dengue parecem contribuir para o acúmulo e

função de células NKT/iNKT no presente modelo, o que discutiremos em seguida.

Não podemos ainda inferir se CCR2 e CCR4 seriam os receptores diretamente

envolvidos no acúmulo de células iNKT, mas nossas evidências sugerem que o

caminho a ser discutido na fisiopatologia do dengue deve passar pelas interações

quimiocinas/receptores versus populações celulares participantes da resposta.

Até o presente momento, os mecanismos responsáveis em desencadear a

doença e a resposta do hospedeiro são pouco definidos e a natureza da resposta

imune protetora versus a resposta deletéria na infecção pelo dengue ainda é pouco

conclusiva. Em particular, é importante definir o quanto a produção exacerbada de

citocinas (cytokine storm) e o choque relacionado aos quadros graves da doença

128

Discussão

são induzidos e eventualmente controlados. Consider ando o papel de células iNKT

na resposta do hospedeiro durante infecções virais e o controle e/ou estimulação da

resposta inflamatória em vários sistemas, nos perguntamos o quanto estas células

seriam importantes para a resposta do hospedeiro durante a infecção pelo DENV.

Mostramos desta forma que células iNKT possuem um papel deletério durante a

infecção pelo vírus, estando relacionadas de forma importante com a mortalidade e

fisiopatologia características do modelo em questão .

As células NKT invariantes desempenham diferentes papeis em infecções

virais, onde no geral trazem algum beneficio para o hospedeiro (Van Dommelen e

Degli-Esposti, 2004; Barral e Brenner, 2007; Bendelac et al., 2007). Nenhum estudo

envolvendo infecções pelos vírus da família Flaviviridae, que incluem o DENV, WNV

e o vírus da febre amarela, demonstram algum papel para células iNKT na

fisiopatologia associada. Existe, entretanto, um relato sugerindo a participação de

células iNKT na infecção pelo HCV (Inoue et al., 2006), que apesar de pouco

conclusivo sugere um importante papel para estas células na produção de IL-13

durante a infecção. Além do mais, é importante ressaltar que a infecção por alguns

destes vírus, notadamente o da febre amarela e o WNV, incluem sintomatologia e

aspectos clínicos similares ao DENV, o que incluem febre hemorrágica, resposta

inflamatória sistêmica exacerbada e em alguns casos encefalite (Gubler, 1998; Gould

e Solomon, 2008; Maximova et al., 2009; Suthar et al., 2009).

Embora a compreensão acerca de mecanismos celulare s envolvidos nestas

doenças esteja em pleno crescimento (Diamond, 2009; Sampath e Padmanabhan,

2009), incluindo o envolvimento de diferentes populações linfociticas, a participação

de células iNKT e vNKT em infecções por flavivirus é, em geral, desconhecida.

Infecções viras podem levar a ativação de células iNKT e no geral este

mecanismo é importante para o controle da resposta imune local e sistêmica. Em um

primeiro momento avaliamos a ativação e o perfil de células iNKT na infecção

experimental pelo DENV-2, assim como o seu possível recrutamento/acúmulo e

expansão no baço e fígado de animais infectados. Utilizando um inóculo capaz de

induzir mortalidade significativa em animais WT, nossos dados mostram uma

expansão massiva de células iNKT no baço e fígado, vista em termos de

recrutamento e ativação durante as fases iniciais da infecção.

De forma contraria, a freqüência e número de células iNKT diminui no 5° dia

após a infecção, um fenômeno provavelmente relacionado a internalização do TCR

129

Discussão

que se segue a ativação destas células. Esta linfopenia, comentada na seção de

resultados, pode estar também associada ao trafico de leucócitos no baço,

especialmente linfócitos, que estariam sendo recrutados para órgãos alvos, como o

fígado. Além do mais, este fenômeno observado para leucócitos esplênicos reflete

bastante a resposta sistêmica. Dados de nosso grupo mostram um aumento de

linfócitos CD4 e CD8, além de células NKT, no fígado de animais infectados a partir

do dia 4 p.i. (Guabiraba et al. 2010 em preparação), confirmando esta hipótese.

No que diz respeito ao status destas células no dia 5 após a infecção,

observamos que a expressão da molécula marcadora de ativação CD69 esta

bastante aumentada em células iNKT. Também neste contexto, as células iNKT

(assim como as células NK), tem a produção de IFN-γ intracelular aumentada sem

re-estimulação (i.e. PMA/ionomicina). Em conjunto, demonstramos pela primeira vez

que células iNKT são ativadas durante a infecção ex perimental pelo DENV-2, além

serem capazes de produzir IFN-γ, fenômeno já relatado na literatura para células T

CD4, CD8 e NK em humanos ou modelos experimentais de infecção pelo DENV

(Mangada et al., 2004; Shresta, Kyle, Robert Beatty, et al., 2004).

Os mecanismos pelos quais estas células se tornam ativadas durante a

infecção, seja através de CD1d e/ou de co-fatores, como as citocinas IL-12, IL-18 ou

IFN-γ, já demonstrados em outros modelos experimentais ( Exley et al., 2003; Van

Kaer e Joyce, 2005; Halder et al., 2007; Tyznik et al., 2008), estão atualmente sendo

estudados. No que diz respeito à molécula CD1d, envolvida no mecanismo de

ativação classificado como “direto”, demonstramos q ue camundongos CD1d

-/-

infectados apresentam letalidade similar a camundongos WT em nosso modelo.

Apesar do mecanismo de ativação de células iNKT não estar completamente

elucidado na infecção pelo DENV, sugerimos que no presente estudo a ativação e

função efetora de células iNKT é independente de CD1d. De fato, após

processamento pelas APCs, antígenos virais não poss uem estruturas lipídicas,

excluindo assim a apresentação clássica via CD1d. E stes dados realçam o conceito

de que APCs (i.e. células dendriticas) produtoras de citocinas como IL-12 e IFN-γ,

em momentos ainda iniciais da infecção, parecem ser fundamentais para este

processo. Além do mais, células vNKT parecem desempenhar um papel diferente

das iNKT em nosso modelo, provavelmente contrabalanceando a resposta mediada

por iNKT. Estudos mais aprofundados podem trazer informações mais precisas

sobre o balanço iNKT/vNKT na infecção pelo DENV.

130

Discussão

A inflamação sistêmica exacerbada observada na infe cção aguda pelo DENV-

2 em camundongos é um dos eventos essenciais que levam a mortalidade

associada à infecção. A trombocitopenia e extravasamento vascular associados ao

choque e a febre hemorrágica são pontos críticos na doença humana e nos

modelos experimentais. Além do mais, no presente modelo, é possível observar

apreciável dano tecidual, principalmente no parênquima hepátic o, associado à

produção de citocinas/quimiocinas pro inflamatórias e replicação viral não controlada

no baço, fígado e sangue (Souza et al., 2009; Assuncao-Miranda et al., 2010).

Em termos fisiológicos, as células iNKT podem aumentar ou diminuir a

resposta inflamatória associada a uma infecção ou lesão de outra origem por uma

variedade de mecanismos, dependentes essencialmente do contexto (i.e inflamação

estéril ou não estéril), o que inclui os tecidos afetados, células locais e células

recrutadas para o sitio de lesão/infecção. Diversos modelos experimentais têm

sugerido um papel benéfico para células iNKT na resposta inflamatória associada a

infecções virais e bacterianas (Van Dommelen e Degli-Esposti, 2004; Kim et al.,

2008; Emoto e Emoto, 2009; Brigl e Brenner, 2010). Entretanto, células iNKT podem

apresentar um perfil deletério em respostas locais e sistêmicas, como por exemplo

em modelos de hepatite induzida por concanavalina-A (Toyabe et al., 1997; Takeda

et al., 2000) ou no choque séptico induzido por LPS ou CLP (cecal ligation and

puncture) (Nagarajan e Kronenberg, 2007; Hu et al., 2009).

De forma importante, em experimentos com número ele vado de animais,

observamos que camundongos Jα18

−/−

, deficientes em células iNKT são resistentes

a infecção pelo DENV-2, apresentando mortalidade abaixo de 15% e sobrevivendo

por mais de 3 semanas sem nenhum sinal clinico. Complementar a estes achados, a

transferência adotiva de células iNKT isoladas do fígado de animais naïve para

animais WT foi capaz de reverter parcialmente a mortalidade encontrada em animais

Jα18

−/−

após a infecção. A reversão parcial do fenótipo, e não completa, pode ser

relacionada tanto com a distribuição destes tipos celulares em outros órgãos, que

não os imediatamente afetados pela infecção em estágios iniciais, assim como

mecanismos inibitórios/apoptóticos diversos aos quais estas podem ter sido

expostas no camundongo recipiente. Reversões comple tas e parciais do fenótipo já

foram encontradas em modelos experimentais do grupo do Dr. Trottein (artigos em

revisão). Importante também frisar que células iNKT isoladas do fígado são mais

puras, não passam por processo de ativação, além de que neste órgão ~90-95% das

131

Discussão

células CD5

NK1.1

são células iNKT, sendo que no baço esta freqüênci a é bem

menor, exigindo etapas que envolvem isolamento com tetrâmeros carregados com

glicolípides, o que levaria a ativação desta população.

Analise histológica do fígado de animais infectados no momento onde a

doença apresenta maior gravidade revelou menor lesão hepática em

animais Jα18

−/−

. Focos de hemorragia e necrose não foram observado s nos animais

deficientes para células iNKT, apesar de que alguns leucócitos podem ser

observados distribuídos pelo parênquima hepático. A pesar da dosagem de

transaminases não ter sido efetuada e as citocinas pró-inflamatórias não

apresentarem alteração quando comparamos animais WT e Jα18

−/−

infectados, a

menor lesão hepática parece ser secundária a respos ta sistêmica, o que mediaria,

ainda em momentos inicias, o desencadeamento de lesão e replicação viral em

órgãos alvo. Ainda podemos sugerir que outras citocinas, que não IL-12 e IFN- γ,

podem ser melhores marcadores desta proteção no sistema avaliado.

Portanto, em nosso modelo, a deficiência em células iNKT reduziu o dano

hepático e letalidade associada a infecção, sugerin do que células iNKT são

deletérias na resposta fisiopatológica em órgãos alvo, o que parece estar também

diretamente relacionado com a mortalidade em função de falência de sistemas

fisiológicos elementares, como aqueles dependentes da função hepática. Além do

mais, a analise da produção de citocinas indicou que células iNKT parecem

orquestrar, seja de forma direta ou indireta, a resposta inflamatória local e sistêmica.

Os mecanismos exatos ainda estão indefinidos, mas é possível que as células iNKT

estejam entre os maiores produtores de citocinas pro inflamatórias na infecção

experimental pelo DENV-2. Estas citocinas podem contribuir tanto para a ativação de

outros tipos celulares envolvidos na doença, como linfócitos e células NK, e

conseqüente manutenção da resposta sistêmica e local, como também podem

induzir, diretamente, danos em células e tecidos favorecendo, por exemplo, a

disfunção endotelial e a ativação de células residentes (i.e. células epiteliais,

hepatócitos e macrófagos).

Como descrito no modelo de hepatite induzida por concanavalina-A (Toyabe

et al., 1997; Takeda et al., 2000), e também possivel que células iNKT medeiem a

lesão hepática através da interação FasL-Fas, contr ibuindo para os efeitos

citotóxicos em hepatocitos. Outra possibilidade é que células iNKT participariam de

forma direta ou indireta com a produção de IL-17 durante a infecção pelo vírus da

132

Discussão

dengue. A citocina IL-17 e capaz de mediar o recrutamento de neutrófilos e a

ativação de células epiteliais contribuindo desta forma para a lesão local e para a

resposta inflamatória sistêmica (Kolls e Linden, 2004; Iwakura et al., 2008).

Camundongos Jα18

−/−

infectados apresentam menor expressão de IL-17 no baço em

comparação a animais WT (dados não mostrados), o qu e vai de acordo, por

exemplo, com o menor acúmulo e ativação de neutrófilos no baço. Além do mais,

demonstramos que IL-17/IL-22 participam de fenômenos envolvidos no controle da

resposta inflamatória observada neste modelo de infecção experimental pelo DENV-

2 (Guabiraba e colaboradores, em preparação).

De forma contraria a observada em outros modelos, a deficiência em células

iNKT não levou a deficiência do clearance viral no fígado e no baço de animais

infectados em nosso modelo. Alguns trabalhos já dem onstraram que células iNKT

são dispensáveis para o controle da carga viral em modelos experimentais de

infecção pelo HSV-1 e CMV (Van Dommelen et al., 2003; Cornish et al., 2006).

De forma importante, a carga viral se apresentou diminuída no fígado de

animais Jα18

−/−

infectados no dia 6 p.i quando comparada a de animais WT (~1 log

de diferença). Além do mais, no dia 4 p.i. esta diferença é ainda mais nítida, inclusive

no baço, sugerindo que os fenômenos envolvidos neste controle da replicação viral

acontece em momentos ainda iniciais da infecção. Estudos anteriores sugeriram que

a produção de mediadores inflamatórios favorece a replicação in vivo e/ou in vitro

(Lin et al., 2002; Mangada e Rothman, 2005; Kamau et al., 2009).

É possível então que no presente modelo experimental as células iNKT

favoreçam a replicação viral promovendo um maior background inflamatório, como

demonstrado. Uma vez que em camundongos Jα18

−/−

infectados a resposta

inflamatória esta fortemente reduzida, esta regulação positiva da replicação viral

estaria também regulada negativamente. Nossos dados demonstram também que,

durante a infecção pelo DENV-2, as células iNKT são capazes de produzir IFN-γ e

que estas células parecem trans-ativar células NK para produzir a citocina.

Considerando o importante papel de IFN-γ no controle da replicação do DENV

(Shresta, Kyle, Robert Beatty, et al., 2004; Azeredo et al., 2006), a ausência de uma

função para células iNKT/NK no clearance viral é de certa forma surpreendente. O

papel de células NK na infecção pelo DENV não é bem estabelecido, entretanto tem

sido proposto que estas podem exercer alguma função citotóxica em células

133

Discussão

infectadas, embora este tipo de atividade não tenha sido confirmada in vivo (Kurane

et al., 1984; Green et al., 1999; Azeredo et al., 2006).

De forma importante, a ausência de função para célu las iNKT/NK no controle

direto da replicação viral foi confirmada utilizando-se o glicolípide αGal-Cer. Nestes

termos, tanto o pré- como o pós-tratamento com αGal-Cer, conhecido por induzir

uma forte produção de IFN-γ por células iNKT e NK in vivo, não foi capaz de

aumentar de forma apreciável a sobrevida dos animais infectados assim como não

interferiu no controle da replicação viral e das alterações hematológicas decorrentes

da infecção. Este é o primeiro relato, até onde conhecemos, de que o αGal-Cer,

utilizado de uma forma profilática, se mostra incap az de intervir na replicação viral in

vivo. Estes dados confirmam a ausência de funções para c élulas iNKT após ativação

utilizando um agonista natural deste tipo celular. Além do mais, estes dados sugerem

que uma cascata de eventos envolvendo desde o reconhecimento do vírus por

APCs, até a produção de citocinas/quimiocinas por células da imunidade inata e

adquirida, são responsáveis por desencadear a ativação e função efetora de células

iNKT na fisiopatologia da infecção pelo DENV.

Em termos gerais, nossos dados demonstraram uma papel fundamental para

células iNKT no desenvolvimento da fisiopatologia e na mortalidade associadas a

infecção experimental pelo DENV-2. Uma melhor compreensão dos mecanismos

acerca da ativação in vivo desta população celular e suas funções durante a infecção

podem levar a estratégias terapêuticas como, por exemplo, a inibição desta

população em manifestações graves da doença. Este tipo de estratégia pode ser

principalmente através da co-inibição de quimiocinas envolvidas no recrutamento

destas células assim como possíveis antagonistas/inibidores da ativação de células

iNKT.

134

VI. CONCLUSÃO

Conclusão

6. CONCLUSÃO

Os resultados aqui discutidos sugerem um importante e ainda não discutido

papel para os receptores de quimiocinas da família CC, CCR1, CCR2 e CCR4, na

patogênese da infecção experimental pelo dengue. Estes receptores, especialmente

CCR2 e CCR4, parecem estar diretamente ligados com a progressão da doença e

sua associação direta com a inflamação sistêmica e local induzida pela produção

maciça de mediadores inflamatórios, especialmente quimiocinas. Neste contexto,

diversos tipos celulares recrutados e ativados durante a infecção podem participar

dos eventos que levam a FHD/SCD, sendo que células iNKT parecem ser

fundamentais e contribuem diretamente para a produção exacerbada de mediadores

inflamatórios, ainda em momentos iniciais da infecção, e estão associadas a

gravidade da doença. Apesar de ainda não relacionarmos os receptores para

quimiocinas diretamente envolvidos com células iNKT no presente modelo, é

possível que CCR2, CCR4 e outros CCRs colaborem neste processo de

recrutamento e ativação de células NKT invariantes. Acreditamos que o presente

trabalho de tese abre duas frentes de estudo para intervenções terapêuticas na

imunopatologia da dengue: receptores para quimiocinas da família CC e células

iNKT.

136

VII. REFERËNCIAS

BIBLIOGRAFICAS

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155

VIII. ANEXOS

ANEXO I

Role of the chemokine receptors CCR1, CCR2 and CCR4 in the pathogenesis of

experimental dengue infection in mice

PLoS One (Under review)

Role of the chemokine receptors CCR1, CCR2 and CCR4 in the 1

pathogenesis of experimental dengue infection in mice 2

Rodrigo Guabiraba

1,2

, Rafael Elias Marques

, Anne-Gaëlle Besnard

, Caio T. Fagundes

, 4

Danielle G. Souza

, Bernhard Ryffel

, Mauro M. Teixeira

1 Immunopharmacology, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, 7

Universidade Federal de Minas Gerais. 31270-901. Belo Horizonte, MG, Brazil. 8

2 Université d’Orléans and CNRS, UMR 6218, Molecular Immunology and Embryology. 45071. 9

Orléans, France. 10

3 Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas 11

Gerais. 31270-901. Belo Horizonte, MG, Brazil. 12

*Corresponding author: 15

Dr. Mauro Martins Teixeira, MD, PhD 16

Departamento de Bioquimica e Imunologia, Instituto de Ciencias Biológicas, Universidade Federal de 17

Minas Gerais, Av. Antonio Carlos, 6627 – Pampulha. 31270-901 BELO HORIZONTE-MG, BRAZIL. 18

Phone/Fax # 55 31 3409 2651 19

e-mail: [email protected] 20

Running head: CC chemokine receptors and dengue infection 22

Abstract 27

Dengue virus (DENV), a mosquito-borne flavivirus, is a public health problem in many 28

tropical countries. Recent clinical data have shown an association between levels of different 29

chemokines in plasma and severity of dengue. We evaluated the role of CC chemokine 30

receptors CCR1, CCR2 and CCR4 in an experimental model of DENV-2 infection in mice. 31

Infection of mice induced evident clinical disease and tissue damage, including 32

thrombocytopenia, hemoconcentration, increased levels of transaminases and pro-33

inflammatory cytokines, and lethality in WT mice. Importantly, infected WT mice presented 34

increased levels of chemokines CCL2/JE, CCL3/MIP-1α and CCL5/RANTES in spleen and 35

liver. CCR1

-/-

mice had a mild phenotype with disease presentation and lethality similar to 36

those of WT mice. In CCR2

-/-

mice, lethality, liver damage, levels of IL-6 and IFN-γ, and 37

leukocyte activation were attenuated. However, thrombocytopenia, hemoconcentration and 38

systemic TNF-α levels were similar to infected WT mice. Infection enhanced levels of 39

CCL17/TARC, a CCR4 ligand. In CCR4

-/-

mice, lethality, tissue injury and systemic 40

inflammation were markedly decreased. Despite differences in disease presentation in CCR-41

deficient mice, there was no significant difference in viral load. In conclusion, activation of 42

chemokine receptors has discrete roles in the pathogenesis of dengue infection. These studies 43

suggest that the chemokine storm that follows severe primary dengue infection associates 44

mostly to development of disease rather than protection. 45

Introduction 49

Dengue fever (DF) and its severe forms, dengue hemorrhagic fever (DHF) and dengue 50

shock syndrome (DSS), are mosquito-borne diseases caused by one of four serotypes of 51

Dengue virus (DENV 1-4) [1,2,3]. DENV is a single-stranded RNA virus that belongs to the 52

Flaviviridae family and is transmitted to humans mainly by Aedes mosquitoes [1,4]. They 53

constitute a serious public health problem in tropical and subtropical areas, where the 54

incidence, distribution and clinical severity of dengue cases have dramatically increased in the 55

last 60 years [4]. Treatment of DF or DHF/DSS is largely supportive and the lack of clinical 56

or laboratory markers for an efficient diagnostic associated to the lack of a vaccine or specific 57

treatment put a serious burden on health systems of low income countries [1,4,5]. 58

The pathogenesis of DENV remains poorly understood and involves a complex 59

interplay of viral and host factors, including viral serotype [6,7], genotype [6], and the genetic 60

background of the host [8,9]. Secondary infection by a heterologous serotype has been shown 61

to be the single greatest risk factor for DHF/DSS in human subjects [9,10,11,12] although 62

severe disease in primary infections is also reported [6,13,14,15]. 63

DHF/DSS is characterized by hemorrhagic manifestations, thrombocytopenia and 64

hemoconcentration [1,4,7], where the dysfunction of vascular endothelial cells that leads to 65

plasma leakage is mediated by host immune response [5,12,13]. DENV can interact with 66

immune cells such as dendritic cells (DCs), monocytes/macrophages, hepatocytes and 67

endothelial cells [7,16,17,18,19,20], resulting in the production of immune mediators that 68

shape innate and acquired immune responses. High levels of pro-inflammatory cytokines and 69

chemokines, including TNF-, IL-6, IL-8, CCL2/MCP-1 and IFN-, have been reported in 70

patients with severe dengue disease [2,21,22,23]. However, it is not clearly understood how 71

this massive cytokine production is induced and eventually controlled, a phenomenon that 72

also occurs in bacterial sepsis and other shock related syndromes [24,25]. 73

Chemokines are members of a structurally related family of cytokines involved in 74

leukocyte traffic during inflammation. They are classified according to the relative position of 75

conserved N-terminal cysteine residues, in which CC chemokines represent the most 76

abundant family and have the first 2 cysteines placed adjacently [26,27]. Chemokine receptors 77

are expressed on the surface of leukocytes and are G protein-coupled receptors containing 7 78

transmembrane domains [26,28,29]. They may also contribute to angiogenesis, recruitment 79

and transmigration of leukocytes, vascular and tissue remodeling, chronification of 80

inflammation, among others [27,28,30,31,32]. Experimental and epidemiological evidences 81

suggest an important role for chemokines, especially those from the CC family, and their 82

receptors in infectious diseases such as HIV, HSV-1 and other viral infections 83

[27,33,34,35,36]. 84

Recent clinical studies in endemic areas describe a correlation between dengue disease 85

outcome and levels of CC chemokines, including CCL4/MIP1- and CCL3/MIP1-α, both 86

ligands for the CCR1 receptor, and for CCL2/MCP-1, the ligand for CCR2 [37,38,39]. A link 87

between CCL5/RANTES, a CCR1/CCR5 ligand, and hepatic dysfunction had already been 88

shown [40,41]. In addition, CCL2/MCP-1 and IL-8 are intimately related to hypotension, 89

thrombocytopenia and hemorrhagic shock [21,22,37,41,42]. However, the relevance of 90

chemokines for the pathogenesis and host response in the context of dengue infection remains 91

to be determined. 92

We have recently developed a model of dengue infection in mice that resembles many 93

of the features of severe dengue infection in humans, including thrombocytopenia, increased 94

vascular permeability, cytokine storm, systemic inflammation and death [43,44,45]. Using 95

this model, we have investigated the role of CC chemokine receptors CCR1, CCR2 and CCR4 96

during experimental DENV infection. Ligands to these receptors have been shown to be 97

elevated in human and experimental dengue infection [21,37,38,39,40,41,46,47]. 98

Material and Methods 99

Ethics statement 100

All experimental procedures were approved and complied with the French government’s 101

ethical and animal experiment regulations and the Comité National de Réflexion Ethique sur 102

l’Expérimentation Animale, CNRS, Orléans, France (CLE CCO 2009-013). 103

104

Mice 105

Eight to ten week-old male wild type (WT) C57BL/6 (H-2D

) mice were purchased from 106

Janvier (Le Genest-St-Isle, France). CCR1



CCR2



and CCR4



male mice, eight to ten 107

week-old, backcrossed

at least 10 times in C57BL/6, were bred in the animal facility of the 108

Transgenose Institute (CNRS, Orléans, France). All animals were kept under controlled 109

temperature (23°C) with a strict 12 h light/dark cycle, autoclaved food and water available ad 110

libitum under SPF (specific pathogen–free conditions). 111

112

Virus 113

The mouse-adapted DENV serotype 2 strain (DENV-2) P23085 was obtained from the State 114

Collection of Viruses, Moscow, Russia, and adapted as previously described [44]. Sequence 115

of portions of E and NS1 genes of the adapted virus was deposited previously at GenBank 116

under the accession number AY927231. Virus adaptation was performed in a maximum 117

containment biosafety level-3 (BSL-3) of the SRC VB “Vector”, Koltsovo, Russia. For the 118

current set of experiments, the last 2 passages of the mouse-adopted DENV-2 strain was 119

performed in LLC-MK2 cells (Kidney, Rhesus monkey, ATCC) to produce stocks which 120

were stored in Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma-Aldrich) at -80°C. To 121

calculate virus titers in LLC MK2 cells supernatants, expressed as LD

50,

groups of ten mice 122

were inoculated i.p. with serial dilutions of the virus and lethality recorded. The titer of our 123

DENV-2 stock was 10

/ml or 2 x 10

PFU/ml of LLC MK2 supernatant, as calculated in 124

8-10-week-old BALB/c mice, a more susceptible lineage [48]. 125

126

Infection and experimental design 127

For DENV infection, mice were handled and kept in a biosafety level 3 (BSL-3) in the animal 128

facility of the Transgenose Institute (CNRS, Orléans, France). For the evaluation of lethality 129

and inflammation, mice were inoculated i.p. with DENV-2 virus (10 LD

)

diluted in 100 µl 130

of endotoxin-free DPBS (Gibco). One LD

corresponds to the innoculum necessary to kill 131

50% of 4 weeks old BALB/c mice and correspond to approximately 20 PFU, as assessed in 132

LLC-MK2 cells. Lethality rates and body weight loss were evaluated every 12 h until day 14 133

post infection (p.i.). The other parameters were evaluated at day 6 after i.p. inoculation of the 134

virus, a time point where animals were still alive and showed significant clinical signs of 135

disease. In all experiments using genetically deficient mice (KO mice), experiments with the 136

relevant WT controls were performed in parallel. Viral stocks were prepared in LLC MK2 137

cells and non-infected animals were inoculated with DMEM supernatants from non-infected 138

LLC MK2 cells diluted in a similar manner. At day 6 p.i., mice were anesthetized i.p. with a 139

ketamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) solution diluted in sterile DPBS and blood were 140

recovered for serum preparation and hematological analysis. Then, mice were killed by 141

cervical displacement and spleen and liver samples were recovered for cytokine dosage, 142

FACS analysis and/or viral titration. Samples were stocked at -80°C prior to the analysis. 143

Liver samples were also used for histological analysis. 144

145

Titration of virus 146

Mice were assayed for viral titers in the liver, as previously described [43,45]. Briefly, tissue 147

samples were prepared as 10% (w/v) homogenates in DMEM without fetal bovine serum (FBS). 148

Viral load in the supernatants of tissue homogenates was assessed by direct plaque assays using 149

LLC-MK2 cells. Samples of organ homogenates were diluted serially and placed in duplicate 150

into 6-wells plates (TPP, Techno Plastic Products AG) of LLC-MK2 cell monolayers and 151

incubated for 1 h. An overlay solution containing 199 medium (Gibco) with Earle's salts, L-152

glutamine and 3% FBS in 1,5% CMC (Carboxymethylcellulose, Sigma) was added to each well 153

and the cultures were incubated for 9 days. Cultures were stained with crystal violet for 154

enumeration of viral plaques. The results were measured as plaque forming units (PFU) per 100 155

mg of tissue weight. The limit of detection of the assay was 10 PFU/100 mg of tissue. 156

157

Evaluation of blood parameters 158

Blood was obtained from the brachial plexus of anesthetized mice in heparin-containing 159

syringes, at the indicated times, and stocked in heparinized tubes prior to analysis. The final 160

concentration of heparin was 50 U/ml. Platelets and hematocrit were evaluated in a Coulter 161

Counter (S-Plus Jr, Beckman Coulter). Results are presented as percentage of hematocrit and 162

platelets per µl of blood. 163

164

AST and ALT dosage 165

Aspartate aminotransferase (AST) and Alanine aminotransferase (ALT) were dosed in non-166

hemolyzed serum samples as marker enzymes associated to hepatic damage due to DENV-2 167

infection. The colorimetric assays to evaluate the aforementioned enzymes were conducted 168

following the manufacturer’s protocol (Quibasa, Bioclin, Brazil). 169

170

Determination of Myeloperoxidase (MPO) activity 171

For MPO analysis, as an indirect index of neutrophil accumulation, spleen and liver 172

homogenates were prepared in 1 ml of PBS containing 0.5% hexadecyltrimethyl ammonium 173

bromide (HTAB) and 5 mM EDTA using a Dispomix tissue homogenizer (Medic Tools) and 174

the protocol was followed as already described [49]. Results are expressed as arbitrary units 175

(OD 492 nm) and were corrected for the activity of other peroxidases, which were not 176

inhibited by 3-amino-1,2,4-triazole. 177

178

Quantification of cytokines and chemokines concentrations 179

The concentrations of TNF- IFN-IL-6, CCL17/TARC, CCL2/JE, CCL3/MIP-1α and 180

CCL5/RANTESin serum or tissue samples were measured by ELISA using commercially 181

available antibodies and according to the procedures supplied by the manufacturer (R&D 182

Systems, Minneapolis). ELISA measurements for a given experiment were conducted in the 183

same plate. Results are expressed as pg/ml or pg per 100 mg of tissue. The detection limit of 184

the ELISA assays was in the range of 4-8 pg/ml. 185

186

Histopathology 187

A portion of liver was obtained from mice at day 6, immediately fixed in 4% buffered 188

formalin and tissues fragments were embedded in paraffin. Tissue sections (4 µm thick) were 189

stained with hematoxylin and eosin (H&E) and examined under light microscopy. Pictures 190

were taken using the QCapture Pro 6.0 software (QImaging, Canada). 191

192

Flow cytometry 193

Spleens were collected, homogenized in sterile strainers and resuspended in PBS 2% FBS. 194

Red blood cells were removed with lysis buffer (Sigma-Aldrich). Cells were stained for 195

extracellular molecular expression patterns using monoclonal antibodies (mAb) against 196

mouse CD3 (PerCP-Cy5-conjugated), DX5 (FITC-conjugated), CD4 (Pacific Blue-197

conjugated), CD8 (APC-Cy7-conjugated), F4/80 (PE-conjugated) CD69 (PE-conjugated), 198

CD11b (PerCp-Cy5.5-conjugated), Ly6G (PE-Cy7-conjugated), CD86 (APC-conjugated) and 199

isotype controls. All antibodies were purchased from BD Pharmingen (Le Pont de Claix, 200

France). In all cases, 5x10

to 1x10

gated events were acquired for later analysis. The 201

frequency of positive cells was analyzed using a gate that included lymphocytes, granulocytes 202

and monocytes/macrophages. Limits for the quadrant markers were always set based on 203

negative populations and isotype controls. Cells were acquired on a BD FACSCanto II (BD 204

Biosciences) cytometer and analyzed using the FlowJo 7.5.3 software (TreeStar Inc.). 205

Analysis in FlowJo software took into account size and granularity of populations. Frequency 206

in number of an analyzed population in front of total acquired events was used in the 207

construction of graphs. 208

209

Statistical analysis 210

Results are shown as means ± S.E.M. Differences were compared by using analysis of 211

variance (ANOVA) followed by Student-Newman-Keuls post-hoc analysis. Differences 212

between lethality curves were calculated using Log rank test (Graph Prism Software 4.0). 213

Results with a P<0.05 were considered significant. All data are representative of at least 2 214

experiments. 215

216

217

218

219

220

221

222

Results 223

Lethality rate after DENV-2 infection in mice 224

Mice infected with a mouse-adapted DENV-2 strain have a clinical presentation that 225

resembles DHF/DSS in humans, including thrombocytopenia and increased vascular 226

permeability that eventually leads to shock and death [43,44,45]. As seen in Figure 1A, 227

infection of WT mice with an innoculum of 10 LD

killed approximately 80% of mice 228

around days 6 to 8 after inoculation. Lethality rate in CCR1



mice was similar to that of WT 229

mice. In contrast, there was significant protection of infected CCR2



and CCR4



mice 230

(P=0,0312 and P=0,0091, respectively). Indeed, 60% of animals were still alive till day 14 231

after inoculation. Infection of WT mice was associated with rapid weight loss starting at day 4 232

p.i. and leading to loss of about 5% at day 7 for surviving animals. Of notice, CCR1



mice 233

lost weight in a manner similar to that of WT animals and weight loss was significantly 234

decreased in CCR2



and CCR4



mice at about 3% (data not shown). 235

236

Hematological parameters and viral load 237

Thrombocytopenia is a common finding in patients with dengue fever and DHF/DSS, 238

but does not appear to correlate with disease severity or outcome [1,7]. Thrombocytopenia is 239

first observed at day 3 and peak at days 6-7 after infection [6,37,50]. In the present study, 240

platelet levels were evaluated at day 6 p.i, a time point at which levels were lowest and the 241

percentage of surviving animals maximal. Platelet number in infected WT mice was about 242

30% of non-infected animals (Figure 1B). There was a similar fall in platelet number in both 243

CCR1



and CCR2



infected mice. The decrease of platelet numbers in CCR4



mice was 244

slightly less than in WT mice (Figure 1B). 245

Plasma leakage and consequent hemoconcentration is a relatively late event and a 246

major finding in patients with severe dengue [21,50,51,52,53]. Infection of WT mice induced 247

significant increase in hemoconcentration (Figure 1C). Similar increase was observed in 248

infected CCR1

-/-

and CCR2

-/-

deficient mice. Hemoconcentration occurred but was of lower 249

magnitude in infected CCR4



mice than in their WT controls (Figure 1C). 250

Despite differences observed in lethality and hematology, there were no significant 251

differences in viral titers in liver of WT and CCR1, CCR2 and CCR4 KO mice (Figure 1D). 252

253

Liver inflammation and injury 254

The liver is a major target organ in severe cases of dengue infection [7,16,41]. 255

Infection of mice with DENV-2 resulted in significant increase in serum levels of the 256

transaminases AST and ALT at day 6 (Figure 2A and B). Granulocytes often become 257

activated, accumulate in tissues and may contribute to organ damage in the context of DENV 258

infection [54]. There was significant accumulation of neutrophils in the liver (Figure 2C) and 259

spleen (data not shown) of infected WT mice, as assessed by tissue levels of MPO. The 260

changes above were accompanied by an increase in liver concentration of IL-6 and IFN-γ 261

(Figure 2D and E). Liver sections of infected WT revealed signs of congestion, haemorrhage, 262

hepatocyte degeneration and necrosis (Figure 3). 263

Overall, CCR1

-/-

mice had similar degree of damage as WT mice, with only slightly 264

enhanced MPO activity and levels of both IL-6 and IFN-γ in liver (Figure 2). MPO levels 265

were also slightly increased in liver of CCR2

-/-

mice, but there was decreased liver injury, as 266

seen by decreased levels of transaminases in serum and by histology. Decreased liver damage 267

was associated with decreased local production of both IL-6 and IFN-γ (Figure 2). Systemic 268

levels of transaminases and local levels of MPO and cytokines were significantly decreased in 269

infected CCR4

-/-

mice, a finding consistent with the amelioration of liver damage as 270

demonstrated in tissues sections (Figure 3). 271

Levels of the chemokines CCL2/JE, CCL3/MIP-1α, CCL5/RANTES and 272

CCL17/TARC were evaluated in liver samples of infected WT and chemokine receptor-273

deficient mice. With the exception of CCL17, which did not rise above basal levels in the 274

liver (data not shown), there was significant increase of CCL2, CCL3 and CCL5 after DENV-275

2 infection (Figure 4A-C). In infected CCR1

-/-

mice, levels of CCL3 increased slightly above 276

levels found in WT mice. CCR2

-/-

mice showed slightly enhanced levels of CCL2 and CCL5, 277

a finding consistent with the enhanced MPO levels observed in these mice. Levels of CCL2 278

and CCL5 were decreased in liver samples of CCR4

-/-

mice (Figure 4A and C). There were no 279

differences in basal levels of cytokines/chemokines between both non-infected WT and KO 280

mice (data not shown). 281

282

Systemic cytokine and chemokine response 283

Previous studies have shown that IL-6 and IFN-γ are elevated systemically in patients 284

with dengue or in experimental models of the infection [37,41,44,47,55,56,57]. Indeed, very 285

large concentrations of both IL-6 and IFN-γ were detectable in serum of DENV-2-infected 286

WT mice (Figure 5A and B). In CCR1

-/-

mice, concentration of IFN-γ was similar to WT mice 287

and there was an increase in serum levels of IL-6. Levels of both cytokines were decreased in 288

serum samples of CCR2

-/-

and CCR4

-/-

mice, as compared to infected WT mice (Figure 5). 289

Levels of TNF- and chemokines were measured in spleen homogenates to get a 290

glimpse of the systemic inflammatory response to dengue infection and because available 291

serum samples were used for transaminases and IL-6/ IFN-γ determinations. As seen in 292

Figure 6A, levels of TNF- were significantly enhanced after infection of WT mice. 293

Similarly, there was marked increase in levels of CCL2, CCL3, CCL5 and CCL17 in spleen 294

homogenates of infected WT mice (Figure 6B-E). Levels of all chemokines and TNF- were 295

decreased in infected CCR4

-/-

mice when compared to WT mice, with the exception of 296

CCL17 (Figure 6E). Indeed, the levels of CCL17, which binds to CCR4, were greatly 297

enhanced in CCR4

-/-

mice. Levels of TNF- were similar in infected CCR1

-/-

and CCR2

-/-

298

mice when compared to WT mice. Levels of CCL3 are enhanced in CCR1

-/-

mice and levels 299

of CCL2 and CCL5 in spleen homogenates of infected CCR2

-/-

mice (Figure 6). There were 300

no differences in basal levels of cytokines/chemokines between both non-infected WT and 301

KO mice (data not shown). 302

303

Number and activation of leukocytes in spleen 304

Next, we evaluated the number of leukocytes in spleen of WT and chemokine receptor 305

deficient mice in the course of dengue infection. Overall, DENV-2 infection caused 306

significant reduction in the total number of CD3

CD4

, CD3

CD8

and NKT cells 307

(CD3

DX5

) in the spleen of infected when compared to non-infected WT mice (Figure 7A, 308

C and E). Despite reduction in total cell numbers, activated CD8

, CD4

T and NKT cells, as 309

determined by CD69 expression, were more abundant in spleen of infected mice (Figure 7B, 310

D and F). Similar findings were observed in CCR1

-/-

mice; ie. decreased number of cells but 311

available cells were more activated (Figure 7). In contrast, absence of CCR2 or CCR4 312

partially reversed the phenotype observed in WT mice. Indeed, there was a lesser decrease in 313

total CD8

, CD4

T and NKT number and cells tended to be less activated (Figure 7). 314

In contrast to the CD8

, CD4

T and NKT lymphopenia, DENV-2 infection caused 315

significant increase in the number of NK cells (CD3



DX5

), macrophages (CD11b

F4/80

) 316

and neutrophils (CD11b

Ly6G

) (Figure 8A-C). Again, infected CCR1

-/-

mice were similar to 317

infected WT mice, with the exception of an increase in number of neutrophils in spleen. 318

CCR2

-/-

mice had only mild changes in comparison to their WT controls, whereas CCR4

-/-

319

mice had decreased accumulation of all 3 cell types in spleen (Figure 8). 320

321

Discussion 322

In the present work we have investigated the putative role of CC chemokine receptors 323

CCR1, CCR2 and CCR4 in the context of experimental Dengue virus infection. Our major 324

findings can be summarized as follows: 1) CCR1 does not seem to have a major role in the 325

pathogenesis of severe experimental dengue infection; 2) CCR2 appeared to contribute to 326

dengue-associated liver damage and this was reflected on decreased leukocyte activation and 327

decreased lethality. However, there was no major difference in the systemic inflammatory 328

response associated with infection; 3) CCR4 also contributed to the pathogenesis of 329

experimental dengue infection and was relevant for virus-induced liver damage and associated 330

systemic inflammation. This was reflected on the decreased leukocyte activation and 331

decreased lethality. 332

CCR1 receptors are widely expressed in monocytic and non-monocytic populations 333

[29,30,31]. CCR1 ligands, such as CCL3/MIP-1α and CCL4/ MIP-1β, are found in elevated 334

concentrations in plasma of patients with DENV infection and may associated with disease 335

severity [37,38,39]. Consistently with the latter finding, levels of CCL3/MIP-1α are increased 336

in spleen and liver of infected mice. However, we found that the course of infection in CCR1

337

was similar to that in WT mice. Levels of CCL3 were greater in spleen and liver of infected 338

CCR1

-/-

than infected WT animals. This is in agreement with the idea that chemokine 339

receptors work as important negative modulators or scavengers of their own ligands and 340

lower their levels in tissues [58]. In that respect, elevated levels of CCL3 could then activate 341

the other CCL3 receptor, CCR5. We have not investigated here the role of CCR5 to infection 342

outcome but it is clear that CCR1

-/-

mice had no major phenotype when infected with an 343

innoculum which causes severe disease in mice. Therefore, CCR1 does not appear to play a 344

major role in the pathogenesis of severe experimental dengue infection. 345

CCL2/MCP-1 is produced under many inflammatory conditions and exerts its 346

functions mainly through the CCR2 receptor, which is expressed in monocytes, macrophages 347

and also neutrophils [25,27,31,59]. Levels of CCL2 have been positively associated with 348

worse prognosis in DENV-infected subjects [21,37]. In our experiments, survival rates were 349

reduced in CCR2

-/-

mice and this was associated to decreased levels of serum transaminases 350

and reduced liver inflammation and damage. Of interest, hepatocytes are common targets of 351

DENV and can actively respond to the infection by producing cytokines and chemokines [41]. 352

The degree of thrombocytopenia and hemoconcentration was similar in WT and CCR2

-/-

353

mice, but levels of IL-6 and IFN-γ, but not TNF-α, were decreased systemically in infected 354

CCR2

-/-

mice. There was also decreased activation of major cell types involved in DENV 355

infection, including CD4+, CD8+, NKT cells and macrophages. Interestingly, preliminary 356

data from our group shows that NKT cells contribute to the “cytokine storm” associated with 357

DENV infection in mice (Renneson et al, 2010, unpublished data). Therefore, decreased 358

leukocyte activation in infected CCR2

-/-

mice may explain the decreased cytokine storm and 359

decreased tissue damage observed in these animals. Increased plasma extravasation is thought 360

to lead to hemoconcentration, hypotension and death [21,50,51,52,53]. It is, therefore, not 361

clear why there is still significant hemoconcentration in CCR2

-/-

mice at day 6 after infection, 362

despite decreased cytokine levels, liver damage and lethality rates. It is possible that a few 363

animals may eventually recover from the massive vascular permeability which leads to 364

hemoconcentration because they have more adequate liver function. Experimentally, these are 365

difficult experiments to perform because control animals are mostly dead at later stages of 366

infection and there would be few control animals with which to compare the CCR2

-/-

mice. 367

Surviving CCR2

-/-

mice have normal blood parameters at later stages (day 14) of infection 368

(data not shown). Thus, CCR2 plays a role in the pathogenesis of severe experimental dengue 369

infection and it appears that enhanced survival in CCR2

-/-

mice is probably secondary to 370

decreased liver damage, decreased cell activation and decreased cytokine storm. 371

The CCR4 receptor is expressed on T cells, especially Th2-type lymphocytes, and may 372

contribute to the pathogenesis of severe conditions, including asthma [60,61,62,63,64,65]. 373

Interestingly, CCR4 deficiency results in attenuated severity of murine polymicrobial sepsis 374

and lipopolysaccharide-induced endotoxic shock, implicating this receptor in the pathogenesis 375

of acute conditions [66,67]. Other experiments, however, have found a protective role for 376

CCL22/MDC, a CCR4 ligand, in a cecal ligation and puncture (CLP) model of sepsis in mice 377

[68]. In preliminary experiments, we found that CCL17/TARC, one of the ligands for CCR4, 378

was detectable at high levels in spleen of infected mice. More importantly, experiments in 379

CCR4

-/-

showed that these animals were protected from DENV-associated disease. Indeed, 380

there was decreased hemoconcentration, thrombocytopenia, liver damage, systemic 381

inflammation and leukocyte activation in CCR4

-/-

mice. This resulted in significant protection 382

from lethality. These results imply a crucial role of this receptor in the pathogenesis of 383

DENV-associated severe disease. Importantly, viral load was not altered in CCR4-/- when 384

compared to WT animals. These results suggest that CCR4 does not play a major role in the 385

control of viral entry and replication, but contribute mostly to the cascade of events that lead 386

to tissue and systemic damage. In this respect, our findings are consistent with the protective 387

role of CCR4 in the pathogenesis of bacterial sepsis [66,67]. It is difficult to suggest the 388

mechanism by which CCR4 may contribute to the pathogenesis of dengue. However, CCR4 389

may be important for the trafficking and activation of NKT cells and naive CD8+ cells by at 390

least two independent chemokine pathways, including CCL17/TARC and CCL22 [69,70]. In 391

addition, excessive NKT activation contributes to the pathogenesis of severe disease in our 392

model (Renneson et al, 2010, unpublished data). Thus, at least in viral (present study) and 393

polymicrobial sepsis, blockade of CCR4 may be beneficial from the therapeutic point of view, 394

a tenet that must be tested further in patients. Indeed, we are unaware of studies 395

demonstrating the putative role of CCR4 ligands, such as CCL17 and CCL22, in the context 396

of DENV infection in humans. 397

In conclusion, CCR1, CCR2 and CCR4 play discrete roles in the pathogenesis of 398

disease in a model of DENV in mice. In contrast, these receptors appear not to play an 399

essential role in protection against primary infection. Our studies suggest that the chemokine 400

storm that follows severe primary dengue infection associates mostly to development of 401

disease rather than protection. It is, therefore, possible that blockade of the chemokine system 402

may be beneficial as co-adjuvant treatment for severe dengue infection. 403

404

Acknowledgements 405

We acknowledge I. Maillet and M. Fauconnier for their technical assistance (CNRS UMR 406

6218, Orléans, France) and Dr. R.C. Russo (UFMG) for his helpful discussions. 407

408

409

410

411

412

413

414

415

416

417

418

419

Figure 1. Lethality rate, hematological alterations and viral load upon DENV-2 420

infection. WT or CCR1



CCR2



and CCR4



(KO) mice were infected i.p. with 10 LD

421

of DENV-2 and then monitored for lethality until day 14. In panel A, percentages of survival 422

(n = 10-12). Hematological analysis were done at day 6 p.i. for changes in platelets count (B) 423

and hematocrit (C) in the blood of non-infected and infected-WT and KO mice. In panel D, 424

viral loads recovered from the liver of WT and KO mice at day 6 p.i. shown as the log of 425

PFU/100 mg of tissue. Results are expressed as mean ± SEM and are representative of at least 426

two experiments. * P< 0.05, *** P < 0.001 when compared to non-infected mice. # P < 0.05, 427

## P < 0.01 when compared to WT infected mice. NI: non-infected mice. 428

429

Figure 2. Liver inflammation and injury upon DENV-2 infection. WT or KO mice were 430

infected i.p. with 10 LD

of DENV-2 and then sacrificed at day 6 for blood and tissue 431

samples. AST (A) and ALT (B) were dosed in serum of WT and KO mice as markers of 432

hepatic injury. MPO activity, as an index of neutrophil accumulation, was evaluated in liver 433

(C). Concentrations of cytokines IL-6 (D) and IFN-γ (E) were evaluated in liver homogenates 434

by ELISA and are expressed as pg per 100 mg of tissue. Results are expressed as mean ± 435

SEM and are representative of at least two experiments (n = 5-6). * P< 0.05, *** P < 0.001 436

when compared to non-infected mice. # P<0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001 when compared 437

to WT infected mice. NI: non-infected mice. 438

439

Figure 3. Histological changes in liver upon DENV-2 infection in mice. WT or KO mice 440

were infected i.p. with 10 LD

of DENV-2 and then sacrificed at day 6 for tissue samples. 441

Hematoxylin & Eosin stained liver sections from non-infected and DENV-2 infected WT, 442

CCR1



CCR2



and CCR4



mice, showing different degrees of congestion, hemorrhage, 443

hepatocyte degeneration and necrosis. Each slide presented in the panel is representative of at 444

least 10 different fields. Magnification: 400X. 445

446

Figure 4. Chemokines production in liver upon DENV-2 infection in mice. WT or KO 447

mice were infected i.p. with 10LD

of DENV-2 and then sacrificed at day 6 for tissue 448

samples. CCL2/JE (A), CCL3/MIP-1α (B) and CCL5/RANTES (C) were evaluated in liver 449

homogenates by ELISA and are expressed as pg per 100 mg of tissue. Results are expressed 450

as mean ± SEM and are representative of at least two experiments (n = 5-6). *P < 0.05, *** P 451

< 0.001 when compared to non-infected mice. # P < 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001 when 452

compared to WT infected mice. NI: non-infected mice. 453

454

Figure 5. Cytokine production in serum upon DENV-2 infection in mice. WT or KO mice 455

were infected i.p. with 10 LD

of DENV-2 and then sacrificed at day 6 for blood samples. 456

IL-6 (A) and IFN-γ (B) were evaluated in serum by ELISA and are expressed as pg/ml. 457

Results are expressed as mean ± SEM and are representative of at least two experiments (n = 458

5-6). ** P < 0.01, *** P < 0.001 when compared to non-infected mice. # P < 0.05, ## P < 459

0.01, ### P < 0.001 when compared to WT infected mice. NI: non-infected mice. 460

461

Figure 6. Cytokine and chemokine production in spleen upon DENV-2 infection in mice. 462

WT or KO mice were infected i.p. with 10 LD

of DENV-2 and then sacrificed at day 6 for 463

tissue samples. TNF-α (A), CCL2/JE (B), CCL3/MIP-1α (C), CCL5/RANTES (D) and 464

CCL17/TARC (E) were evaluated in spleen homogenates by ELISA and are expressed as pg 465

per 100 mg of tissue. Results are expressed as mean ± SEM and are representative of at least 466

two experiments (n = 5-6). * P < 0.05, *** P < 0.001 when compared to non-infected mice. # 467

P < 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001 when compared to WT infected mice. NI: non-infected 468

mice. 469

470

Figure 7. Lymphocyte number and activation in CC chemokine receptors deficient mice 471

upon DENV-2 infection. WT or KO mice were infected i.p. with 10 LD

of DENV-2 and 472

then sacrificed at day 6. Splenic leukocytes were stained with specific antibodies. Flow 473

cytometry, according to size and granularity, were performed as analysis. The numbers of 474

specific cell populations are shown as compared to total number of leukocytes. Number of T 475

lymphocytes CD3

CD4

(A) and CD3

CD8

Activated T lymphocytes expressing CD69 were also evaluated for CD4

(B) and CD8

(D) 477

populations. The number of CD3

DX5

NKT cells (E) and their activation by CD69 478

expression as MFI, were also evaluated (F). Results are expressed as mean ± SEM and are 479

representative of at least two experiments (n = 5-6). *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 480

when compared to non-infected mice. # P < 0.05, ## P < 0.01 when compared to WT infected 481

mice. NI: non-infected mice. MFI: Mean fluorescence intensity. 482

483

Figure 8. NK, macrophages and neutrophils in CC chemokine receptors deficient mice 484

upon DENV-2 infection. WT or KO mice were infected i.p. with 10 LD

of DENV-2 and 485

then sacrificed at day 6. Splenic leukocytes were stained with specific antibodies. Flow 486

cytometry, according to size and granularity, were performed as analysis. The numbers of 487

specific cell populations are shown as compared to total number of leukocytes. Numbers of 488

CD3

DX5

NK cells (A), macrophages CD11b

F4/80

(B) and infiltrating neutrophils 489

CD11b

Ly6G

representative of at least two experiments (n = 5-6). *P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 491

when compared to non-infected mice. # P < 0.05, ## P < 0.01 when compared to WT infected 492

mice. NI: non-infected mice. 493

494

495

496

497

498

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500

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66. Traeger T, Kessler W, Assfalg V, Cziupka K, Koerner P, et al. (2008) Detrimental role of 771

CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis. Infect Immun 76: 5285-772

5293. 773

67. Chvatchko Y, Hoogewerf AJ, Meyer A, Alouani S, Juillard P, et al. (2000) A key role for 774

CC chemokine receptor 4 in lipopolysaccharide-induced endotoxic shock. J Exp Med 775

191: 1755-1764. 776

68. Matsukawa A, Hogaboam CM, Lukacs NW, Lincoln PM, Evanoff HL, et al. (2000) 777

Pivotal role of the CC chemokine, macrophage-derived chemokine, in the innate 778

immune response. J Immunol 164: 5362-5368. 779

69. Kim CH, Johnston B, Butcher EC (2002) Trafficking machinery of NKT cells: shared and 780

differential chemokine receptor expression among V alpha 24(+)V beta 11(+) NKT 781

cell subsets with distinct cytokine-producing capacity. Blood 100: 11-16. 782

70. Semmling V, Lukacs-Kornek V, Thaiss CA, Quast T, Hochheiser K, et al. Alternative 783

cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-784

licensed DCs. Nat Immunol 11: 313-320. 785

ANEXO II

A detrimental role for invariant Natural Killer T cells in the pathogenesis of

dengue virus infection

The Journal of Immunology (Under review)

A detrimental role for invariant Natural Killer T cells in the pathogenesis of

dengue virus infection

Joelle Renneson

* t ‡ §**

, Rodrigo Guabiraba

¶ ll**

, Rafael Elias M Pereira-Silva

, Stoyan Ivanov

t ‡ §

, Josette Fontaine

* t ‡ §

, Christophe Paget

* t ‡ §

, Bernhard Ryffel

, Valérie Quesniaux

Christelle Faveeuw

* t ‡

, Mauro M. Teixeira

and François Trottein

* t ‡ § 2

Institut Pasteur de Lille, Center for Infection and Immunity of Lille, F-59019 Lille, France;

Université Lille Nord de France, F-59000 Lille, France;

‡

CNRS, UMR 8204, F-59021 Lille, France;

Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U1019, F-59019 Lille, France;

Immunopharmacology, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências

Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, MG 31270-901, Belo Horizonte, Brazil;

Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6218, Molecular Immunology and

Embryology, Université d’Orléans, 45071 Orléans, France ;

** Both authors contributed equally to this work.

Address correspondence and reprint requests to Dr. François Trottein, Center for Infection and

Immunity of Lille, Inserm U1019-CNRS UMR 8204, Institut Pasteur de Lille, 1, rue du

Professeur Calmette, BP 245, 59019 Lille cedex, France. E-mail: francois.trottein@pasteur-

lille.fr

Keywords: Dengue virus, iNKT cells, inflammation, shock, cytokines

Running title: iNKT cells in dengue virus infection

Abstract

Dengue virus (DV), a mosquito-borne flavivirus, is a serious public health problem in many

tropical countries. Immune mechanisms involved in protection and pathogenesis of DV

infection have not been fully elucidated. In this report, we assessed the in vivo physiological

contribution of invariant Natural Killer T (iNKT) cells, a population of non-conventional αβ T

lymphocytes, to the host response during experimental DV infection. To this end, a mouse-

adapted DV serotype 2 that causes a disease that resembles severe dengue in humans was

used. We first show that splenic and hepatic iNKT cells became activated, in terms of CD69

up-regulation and IFN-

production, upon DV challenge. Strikingly, C57BL/6 mice deficient

in iNKT cells (Jα18

−/−

) resisted to lethal infection in comparison to wild-type (WT) animals,

which succumbed to infection around day 7 post-infection. The phenotype was partially

recovered by adoptive transfer of iNKT cells to Jα18

−/−

animals. Infection of Jα18

−/−

mice was

associated with decreased systemic and local inflammatory responses, as seen by lower levels

of IL-6, IFN-

and CXCL-1/KC, reduced liver injury and diminished activation of NK cells

and neutrophils. In parallel with the reduced inflammatory response, the viral load in the

spleen and liver was lower in Jα18

−/−

mice relative to WT mice. Taken together, these data

demonstrate for the first time that iNKT cell activation during DV infection contributes to the

systemic and local inflammatory responses that lead to shock and death.

Introduction

Dengue virus (DV)

is a serious public health problem in tropical and subtropical areas. In the

past 60 years, the incidence, distribution and clinical severity of dengue cases have increased

dramatically (1,2). There are estimated 50-100 million infections each year, of which there are

500,000 cases of severe dengue hemorrhagic fever and 24,000 deaths (2,3). DV is a single-

stranded RNA virus that belongs to the Flaviviridae family and is transmitted to humans by

Aedes mosquitoes, mainly Aedes aegypti. Infection with any of the four serotypes of DV

results in clinical symptoms that range from classical dengue fever to severe dengue

hemorrhagic fever and shock syndrome, as defined by WHO (4). Severe forms are life-

threatening and characterized by hemorrhagic manifestations, hemoconcentration,

thrombocytopenia and increased vascular permeability (1,5). Despite a growing public heath

problem, there is currently no vaccine and no specific therapeutic agents available. Therapy is

supportive and may require administration of intravenous fluids, which places a serious

burden on health systems of low income countries.

The pathogenesis of DV remains poorly understood and involves a complex interplay

of viral and host factors. Among the risk factors for severe disease, we can include age (1,6),

viral serotype (7) and genotype (8), the genetic background of the host and previous infection

with a distinct serotype (9). The latter factors appear to interact to enhance viral replication

and viral load. Ultimately, DV can interact with target cells, including dendritic cells (DCs),

monocytes/macrophages, hepatocytes and endothelial cells (10-13), resulting in the

production of immune and inflammatory mediators that shape innate and acquired immune

responses and the risk of disease. Indeed, studies have suggested that the dysfunction of

vascular endothelial cells leading to plasma leakage is mediated by host immune response

(14). The production of high levels of pro-inflammatory cytokines, including TNF-α, IL-1β,

IL-6 and IFN-γ, has been reported in patients with severe dengue disease (5,15). However, it

is not clearly understood how this massive cytokine production is induced and eventually

controlled. Similarly, the nature of effector and bystander cells able to control DV challenge

during the early phase of infection is still elusive.

Invariant natural killer T (iNKT) cells represent a unique subpopulation of αβ T

lymphocytes expressing markers associated with the NK lineage and recognizing lipid Ags

through their TCR (for reviews, (16-21)). These cells express an invariant TCRα chain

(Vα14-Jα18 rearrangement in mice and Vα24-Jα18 rearrangement in humans) that pairs with

a limited number of Vβ chains. Unlike conventional T lymphocytes that recognize

peptide:MHC complexes, the TCR of iNKT cells detects a limited number of self and foreign

(glyco)lipids presented by the non-polymorphic MHC class I-like protein CD1d expressed by

APCs, including DCs (for reviews, (16-21)). Exposure of iNKT cells with the synthetic, non-

physiological, glycolipid

-galactosylceramide (

-GalCer) promptly induces the production

of large amounts of Th1- and Th2-associated cytokines that leads to downstream activation of

DCs, NK cells, B cells and conventional T cells (22,23). This enables iNKT cells to influence

the outcome of developing or ongoing immune reactions with, in general, beneficial effects on

infection and cancer. Several in vivo models demonstrated that upon natural activation, iNKT

cells generally play part in the clearance of infectious agents (for reviews, (18,20,24-26)). For

instance, during viral infection, iNKT cells provide innate surveillance against virally infected

cells through the swift production of IFN-γ and other pro-inflammatory cytokines.

Considering the role of IFN-γ and other pivotal cytokines in the control of DV infection (27),

we investigated the role of iNKT cells during experimental DV infection in mice. To this end,

we used a model which was previously shown to develop a disease that resembles the severe

dengue infection that affects humans (28,29). Our findings reveal a crucial role of iNKT cells

in driving the systemic and local inflammatory responses that cause the disease associated

with DV infection. In contrast, iNKT cell functions appear not to be necessary for the control

of primary DV infection. Together, our data reveal a novel and critical role for iNKT cells in

the pathogenesis of severe dengue disease.

Material and methods

Mice

Eight to ten week-old female wild type (WT) C57BL/6 (H-2D

) mice were purchased from

Janvier (Le Genest-St-Isle, France) and kept with autoclaved food and water available ad

libitum under specific pathogen–free conditions in the animal facility of the Transgenose

Institute (CNRS, Orléans, France). Jα18

−/−

mice, backcrossed

at least 10 times in C57BL/6,

were a kind gift from Dr M. Taniguchi (RIKEN Institute, Yokohama, Japan) (22). For

infectious protocol, the mice were kept in isolated ventilated cages in the biohazard animal

unit. All experimental procedures were approved and complied with the French government’s

ethical and animal experiment regulations.

Virus

The mouse-adapted DV serotype 2 strain P23085 (GenBank: AY927231.1) was obtained

from the State Collection of Viruses, Moscow, Russia, and adapted as previously described

(30). For the current experiments, the DV strain was passaged in LLC MK2 cells (Kidney,

Rhesus monkey, ATCC) to produce stocks which were stored in MEM at

-70°C. To calculate virus titre, expressed as LD

, in LLC MK2 cells supernatants, groups of

ten mice were inoculated i.p. with serial dilutions of the virus and lethality was recorded. The

titre of DV stock was 10

/ml of LLC MK2 supernatant, as calculated in 8-10 week-old

BALB/c mice, a more susceptible lineage (27).

Infection and experimental procedure

For DV infection, mice were handled and kept in the biohazard animal unit of the

Transgenose Institute (CNRS, Orléans, France). The virus-containing LLC MK2 supernatants

were diluted in endotoxin-free PBS and injected i.p. into mice. Mock-treated animals were

inoculated with MEM supernatants from non-infected LLC MK2 cells diluted in a similar

manner. For the evaluation of lethality and inflammation, mice were inoculated i.p. with 30

of DV, a lethal dose (LD) that caused death of all animals between days 6 and 7.

Lethality and body weight loss were evaluated every 12 hrs. At day 5, blood was recovered

for serum preparation and haematological analysis. Platelets and relative percentages of

granulocytes, monocytes and lymphocytes were counted in a Coulter counter (S-Plus Jr,

Beckman Coulter, Paris, France). Spleen and liver samples were recovered for cytokine

measurement and viral titration. Liver samples were also used for histological analysis. At

days 3 and 5, spleen and liver were used for FACS analysis. At day 5, there was significant

disease but animals had not succumbed to infection.

Titration of virus

Mice were assayed for viral titers in spleen and liver. For virus recovery, the organs were

collected aseptically and stored at −70 °C until assayed for DV. Tissue samples were weighed,

grounded by using a pestle and mortar and prepared as 10% (w/v) homogenates in MEM without

fetal bovine serum. Viral load in supernatant of tissue homogenates was assessed by direct

plaque assays using LLC-MK2 cells overlayed on CMC (Carboxymethylcellulose, Sigma).

Briefly, samples of organ homogenates were diluted serially and a 0.5 ml volume placed in

duplicate into each of 6-wells of LLC-MK2 cell monolayers and incubated for 1 hr. An overlay

solution containing 199 medium (Gibco) with Earle's salts, L-glutamine and 3% FBS in 1,5%

CMC was added to each well and the cultures incubated for 9 days. Cultures were stained with

crystal violet for enumeration of viral plaques. The results were measured as plaque forming

units (PFU) per 100 mg of tissue weight. The limit of detection of the assay was 100 PFU/100

mg of tissue.

Quantification of cytokine and chemokine concentration

Sera and tissue extracts were analyzed for IFN-γ (eBiosciences, CliniSciences, Montrouge,

France) and IL-6, TNF-α, IL-1β, CXCL1/KC and IL-12 p40 (R&D systems, Abingdon, UK)

using ELISA kits, according to the manufacturer’s instructions.

Histopathology

A portion of liver was obtained from mice killed at day 6, immediately fixed in 4% buffered

formalin and tissue fragments were embedded in paraffin. Tissue sections (4 µm thick) were

stained with hematoxylin and eosin (H&E) and examined under light microscopy for

inflammatory changes using a semi-quantitative score.

Preparation of liver and spleen cells

Livers were perfused via the venous sinus with PBS to remove circulating blood cells.

Perfused livers were finely minced and treated by enzymatic digestion for 20 minutes at 37°C

in RPMI containing 1 mg/ml collagenase type VIII (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) and

1 µg/ml DNase type I (Sigma-Aldrich). After wash, cell suspensions were resuspended in a

36% Percoll™ gradient, carefully layered onto 72% Percoll™ and centrifuged for 30 min at

2300 rpm, without brake at 22°C. Hepatic leukocyte populations collected at the interface

were washed in PBS 2% FCS. Spleens were collected and homogenized using 100 µM cell

strainers (BD Biosciences, USA). Red blood cells were removed with lysis buffer (Sigma-

Aldrich).

Flow cytometry

Monoclonal Abs against mouse TCRβ (FITC-conjugated), NK1.1 (PE- or PerCp-Cy5.5-

conjugated), CD5 (FITC- or APC-conjugated), CD4 (FITC-conjugated), CD8 (APC-

conjugated), CD69 (PE-, PerCp-Cy5.5- or APC-conjugated), IFN-γ (Alexa Fluor

647-

conjugated), IL-4 (APC-conjugated), CD11c (PE-Cy7-conjugated), CD11b (PerCp-Cy5.5-

conjugated), Ly6G (Alexa Fluor

647-conjugated), CD62-L (PE-conjugated) and isotype

controls were all purchased from BD Pharmingen. Monoclonal Abs against granzyme B

(FITC-conjugated), CD107α (PE-conjugated) and isotypes control were purchased from

eBioscience. PE-conjugated PBS-57 glycolipid-loaded CD1d tetramer was from the NIAID

Tetramer Facility (Emory University, Atlanta, GA). To analyze iNKT cells, mononuclear cell

suspensions were incubated with appropriate dilutions of PBS-57-loaded CD1d tetramer-PE

for 30 min in PBS containing 2 % FCS and 0.01% NaN

. Cells were then washed and stained

for other cell surface markers. For intracellular staining, cells were fixed in PBS 1%

paraformaldehyde for 10 min, resuspended in PBS containing 2% FCS and 0.1 % saponin

(permeabilization buffer) and incubated with Alexa Fluor

647-conjugated mAb against IFN-

γ, IL-4 or control rat IgG1 mAb or with granzyme B-FITC or control rat IgG2b mAb. Cells

were acquired on a BD FACSCanto II (BD Biosciences) cytometer and analyzed using the

FlowJo software (TreeStar, Ashland, OR).

iNKT purification and adoptive transfer

For adoptive transfer experiments, liver cells from WT donor mice were stained with anti-

NK1.1 (PE-conjugated) and anti-CD5 (APC-conjugated) mAbs (BD Pharmingen). Labelled

cells were isolated using a FACSAria and BD FACSDiva software (BD Biosciences). Jα18

−/−

recipient mice were inoculated intravenously either with 1 x 10

purified NKT cells or with

the same volume of medium alone 18 hours before DV infection. Of note, iNKT cells

represent around 90% of the total NKT cells in the liver.

Statistical analysis

Data were analyzed with GraphPad Prism 4 Software (San Diego, USA). Results are

expressed as the mean ± SEM. Statistical significances of difference between experimental

groups were calculated using the two-tailed unpaired Student’s t test. Survival of mice was

compared using Kaplan-Meier analysis and log-rank test. Results with a P value of less than

0.05 were considered significant.

Results

iNKT cells become activated during DV infection

An important feature of iNKT cells during stressful conditions is to rapidly become activated

to initiate innate and adaptive immune responses. We first investigated the activation status of

iNKT cells during the course of DV infection. As depicted in Figure 1A (upper panel),

relative to mock-treated mice, the frequency and absolute number (data not shown) of splenic

iNKT (PBS-57-loaded CD1d tetramer

TCRβ

) cells remained stable 3 days post-infection

(p.i.), but decreased by ~50% at day 5 p.i.. This apparent disappearance of iNKT cells can

occasionally occur during infection, a phenomenon observed following TCR-dependent

activation of these cells and due to TCR internalization (31-33). To further study the

activation status of iNKT cells, we monitored the expression of the early activation marker

CD69. As revealed in Figure 1A (lower panel), the level of CD69 expression on iNKT cells

was dramatically increased at day 5 p.i., whereas it remained unchanged at day 3 p.i.. Of note,

NK (CD5

NK1.1

) cells increased CD69 expression with the same kinetic.

During infection, iNKT cells are among the first cells to produce cytokines that have

multiple effects on other immune and non-immune cells. Therefore, we determined whether

iNKT cells expressed the prototypical Th1- and/or Th2-associated cytokines, namely IFN-

and/or IL-4, during DV infection. Compared to mock-treated animals, DV infection resulted

in an increased frequency of iNKT cells positive for IFN-γ, but not for IL-4 (data not shown)

5 days p.i. (Fig. 1B). In contrast, 3 days p.i., iNKT cells remained negative for IFN-

γ. Similarly, NK cells also express IFN-γ intracellularly 5 days, but not 3 days, p.i.. Of note,

similar data were obtained when liver iNKT and NK cells were analyzed (data not shown).

Altogether, these results show that DV infection is accompanied by systemic activation of

iNKT cells 5 days p.i., a time point that just precedes the peak of viral replication at day 6.

Mice deficient in iNKT cells survive to lethal DV challenge

We have previously shown that mice infected with a mouse-adapted DV serotype 2 strain

have a disease that resembles the severe disease observed in humans (29,30,34). In this

system, disease is associated with an acute systemic inflammation, thrombocytopenia and

increased vascular permeability that eventually lead to shock and death. To address the

potential role of iNKT cells in the development and/or control of the immunopathology, WT

and Jα18

−/−

mice were infected with a lethal dose (30 LD

) of DV and monitored daily for

changes in body weight and survival. As seen in Figure 2A, infection of WT mice was

associated with rapid weight loss starting at day 4 p.i. and all mice succumbed to disease 6 to

7 days after infection. Strikingly, mice deficient in iNKT cells did not lose weight and

survived to the infection out to day 22 p.i. (Fig. 2A and data not shown). To further show the

involvement of iNKT cells in DV-associated mortality, Jα18

−/−

mice were reconstituted with

iNKT cells purified from naive animals and then challenged with a lethal dose of DV.

Although no significant weight loss was noticed, 40% of reconstituted Jα18

−/−

mice died from

DV infection between 6 and 10 days p.i. (Fig. 2B). Thus, our data show an unexpected role of

iNKT cells in DV-associated lethality.

iNKT cell-deficient mice develop less severe disease after DV infection

Thrombocytopenia occurs in around 70% of DV-infected patients but does not necessarily

correlate with disease severity or outcome. As seen in Figure 3A, there was significant

decrease of platelet counts in infected WT and Jα18

−/−

mice, albeit the decrease was less

intense in the latter group. Neutrophils may become activated, accumulate in tissues and

contribute to organ damage in the context of DV infection (35). In DV-infected WT mice, the

percentage of circulating granulocytes increased in a significant manner compared to mock-

treated WT mice. Of interest, this enhanced frequency was not observed in the blood of

infected J

−/−

mice. Finally, the frequencies of monocytes and lymphocytes were not

dramatically different between infected WT and Jα18

−/−

mice. We next measured the levels of

inflammatory cytokines in the serum of infected mice. As Figure 3B shows, the concentration

of IL-6 and IFN-

was strongly increased in plasma of infected WT animals. Strikingly, levels

of these cytokines were significantly lower in infected Jα18

−/−

mice. To compare the extent of

tissue injury, liver from WT and Jα18

−/−

mice were analysed at day 6 p.i.. H&E-stained liver

sections clearly revealed evident signs of congestion, haemorrhage, hepatocyte degeneration

and necrosis in infected WT mice (Fig. 3C). In marked contrast, relative to iNKT cell

competent animals, the structure of the liver was preserved in infected J

−/−

mice. Analysis

of liver section revealed a diminished inflammation and an absence of hepatocyte

degeneration and necrosis in iNKT cell deficient animals. In aggregate, these data suggest that

iNKT cells contribute significantly to DV-associated disease and tissue damage.

Mice deficient in iNKT cells display reduced production of inflammatory cytokines

The cytokine “storm” that follows infection correlates with dengue disease severity and is

believed to contribute to the pathogenesis of severe dengue (5). As revealed in Figure 4 (and

data not shown), there were increased levels of IL-6, IFN-γ and IL-12p40 transcripts and

proteins in the spleen of WT animals between days 4 and 6 after infection. Similarly, infected

WT mice produced a higher level of the inflammatory chemokine CXCL-1/KC, known to

rapidly mobilize neutrophils, from day 4 p.i. with a peak at day 6 p.i.. Strickingly, the

concentrations of these inflammatory markers were significantly reduced in the spleen of

infected Jα18

−/−

mice. Moreover, levels of TNF-α and IL-1β tended to be lower in infected

Jα18

−/−

mice than infected WT mice (data not shown). Altogether, the results above show that

iNKT cells drive the systemic inflammatory response that accompanies DV infection.

Jα18

−/−

mice exhibit decreased activation of NK cells and neutrophils during DV infection

In vivo activation of iNKT cells triggers downstream stimulation, and sometimes expansion,

of various immune cells including NK cells, neutrophils and conventional T lymphocytes,

known to be important during DV infection (35-37). We thus measured the impact of

endogenous iNKT cell activation on the frequency and activation status of these cells. As seen

in Figure 5, DV infection was associated with reduced frequency of NK cells (panel A) and

enhanced proportion of neutrophils (panel B) in the spleen of WT mice. In contrast, the

frequency of both NK cells and neutrophils was not modulated in infected Jα18

−/−

mice. We

next measured the level of surface markers associated with cell activation on these cell types.

As depicted in Figure 5A (upper right panel), NK cells from infected WT mice expressed

higher levels of CD69, whilst this induction was significantly lower on NK cells from infected

Jα18

−/−

mice. Moreover, the expression of granzyme B (lower left panel) and CD107α (data

not shown), two molecules known to participate in cellular cytotoxicity, was strongly up-

regulated in/on NK cells from WT mice. This induction was less intense in iNKT cell-

deficient animals. Activated iNKT cells can trans-stimulate NK cells to produce IFN-γ. As

seen in Figure 5A (lower right panel), splenic NK cells from WT infected mice labelled

positively for IFN-γ at day 5 p.i. whilst the frequency of IFN-γ positive NK cells was much

lower in iNKT cell-deficient animals. Neutrophils become activated during DV infection (35).

As Figure 5B shows, neutrophils expressed lower level of CD62-L (a sign of activation) upon

DV infection. Interestingly, neutrophils failed to be activated in infected Jα18

−/−

mice, at least

in term of CD62-L down-regulation. CD8

and CD4

T lymphocytes activation has been

suggested to be associated with dengue infection disease severity (36). We observed no

changes in the percentage of CD8

T cells and a small decrease in the percentage of CD4

cells in the spleen of DV infected WT and Jα18

−/−

mice (Fig. 5C). However, whilst both CD4

and CD8

T cells expressed more CD69 in DV-infected WT mice, this enhancement was less

important in infected Jα18

−/−

mice

. Altogether, these results show less activation of innate

(NK cells and neutrophils) and adaptive immune cells in the absence of iNKT cells upon DV

infection, revealing an important and new interplay between those cell types in this

experimental model.

iNKT cells favour DV replication in infected mice

As disease was less severe in Jα18

−/−

mice and iNKT cells may be important to deal with viral

replication, it was important to measure the effects of iNKT cell deficiency on viral load. As

seen in Figure 6, viral particles were detected at day 6 p.i. in the liver and spleen of both WT

and Jα18

−/−

mice. Nevertheless, viral loads were significantly lower in the liver of Jα18

−/−

mice (in average: 8.4 x 10

PFU/100 mg of tissue) when compared to their WT controls (4.1 x

PFU/100 mg of tissue). Although not significant, viral loads tended to be lower in the

spleen of Jα18

−/−

mice relative to WT animals (3.6 x 10

vs 1.8 x 10

PFU/100 mg of tissue).

Thus, in our experimental system, iNKT cell deficiency did not result in an impaired

containment and clearance of DV during infection but, on the contrary, led to a decreased

viral load. This suggests that, in this infectious system, iNKT cells not only favour

inflammatory injury but also virus replication.

Discussion

Dengue virus causes the most prevalent arthropod-borne viral illness in humans worldwide.

At present, the mechanisms of DV-induced disease and immunity are poorly defined and the

protective versus pathogenic nature of the immune response to DV infection is as yet unclear.

In particular, how the cytokine storm and shock, which characterize DV pathology, are

induced and controlled is still elusive. Considering the role of iNKT cells in host defence

mechanisms during viral infection and in the control/promotion of inflammatory responses in

many systems, we questioned whether these cells play a part in the host response during DV

infection. Using a mouse model of acute DV infection, our findings point to a detrimental role

for iNKT cells in severe DV-associated pathology and mortality.

Invariant NKT cells play a role during viral infection, with in general a beneficial

effect for the host (for reviews, (18,20,24-26,38)). No studies so far have addressed the role of

these cells during infection with a flavivirus. Flaviviruses, which include DV, West Nile virus,

yellow fever virus. Infection with the latter viruses induce symptomatology and clinical

symptoms which include encephalitis and hemorrhagic fever (7,39-42). Although the

understanding of cellular responses is growing (43,44), little is known about the participation

of iNKT cells in flavivirus infections. Viral infections can lead to the activation of iNKT cells

and this may strongly impact on the control of the local immune response. We first assessed

the activation status of iNKT cells as well as their potential recruitment/expansion to/in the

spleen and liver during DV infection. Using a lethal dose of DV, our data show that no

massive expansion occurs in splenic and hepatic tissues during the early phase of infection.

On the contrary, the apparent number of iNKT cells decreased 5 days p.i., a phenomenon

probably due to TCR internalization following activation of these cells. Of interest, at day 5

p.i., the expression of the early activation marker CD69 was strongly increased on iNKT cells.

Furthermore, iNKT cells (as well as NK cells) express IFN-

intracellularly at this time point.

In aggregate, iNKT cells become activated during DV infection. The mechanisms (role of the

CD1d molecule and/or co-factors) by which these cells become activated during infection are

presently being studied.

Excessive systemic inflammation is detrimental following DV challenge and infection

of mice with DV causes an acute inflammatory response, hemorrhagic manifestations and

thrombocytopenia that eventually lead to death. In our experimental system, the potent local

(liver) injury, systemic inflammation and uncontrolled virus replication are important

determinants of the fatal outcome. Physiologically, iNKT cells can augment or inhibit

inflammatory responses through a variety of mechanisms depending on the context (i.e. sterile

or non-sterile inflammation) and the targeted organ. Several experimental models have

highlighted the beneficial role of iNKT cells in bacterial and viral-associated inflammatory

responses (for reviews, (18,20,24-26,38)). On the other hand, iNKT cells can be deleterious in

local and systemic inflammation. For instance, iNKT cells strongly participate in

concanavalin A-induced hepatitis (45,46) and in LPS-induced (47) or cecal ligation and

puncture-mediated (48) acute septic shock. Here, we evaluated their potential regulatory

function in DV-induced pathology. Strikingly, in multiple repeated experiments, we

consistently observed that mice lacking iNKT cells are resistant to severe DV infection and

that the adoptive transfer of iNKT cells isolated from WT mice into healthy J

−/−

mice

partially restores mortality after DV challenge. Histological examination of liver sections

revealed that, compared to WT mice, infected J

−/−

developed a less acute pathology. Thus,

in our system, iNKT cell deficiency reduced hepatic injury and fatal outcome suggesting that

iNKT cells are detrimental in liver pathology and favour virus-associated mortality. Moreover,

analysis of cytokine production indicated that iNKT cells orchestrate, either directly or

indirectly, the high local and systemic inflammatory responses. The exact mechanisms by

which iNKT cells contribute to DV pathogenesis are yet to be defined. It is possible that they

act through the synthesis of inflammatory cytokines able to directly or indirectly promote

injury. As described in the concanavalin A-induced hepatic injury (46), it is also possible that,

through FasL-Fas interaction, iNKT cells mediate cytotoxic effects on hepatocytes, thus

contributing to liver pathology. Attempts are now underway to investigate these issues and to

identify more subtle functions of iNKT cells in DV-associated pathology. Another possibility

is that iNKT cells participate directly or indirectly in IL-17 production. Of note, as revealed

by quantitative RT-PCR, we noticed a decreased production of IL-17, a cytokine known to

promote recruitment of neutrophils and to mediate the progress of local and systemic

inflammatory processes (49,50) in the spleen of infected Jα18

−/−

mice (data not shown). This

is in line with the reduced neutrophilia observed in these mice. Attempts are now underway to

identify the cellular source of IL-17 production and the relevance of this cytokine during DV

infection in WT animals.

In contrast to other models, iNKT cell deficiency did not lead to an impaired

containment and clearance of DV in the liver and spleen in our experimental system. This

finding is not without precedent as iNKT cells have been shown to be dispensable to control

the virus load in some experimental systems (51,52). Surprisingly, the viral load was even

diminished (by ~10-fold) in J

−/−

mice relative to WT animals. Previous findings have

suggested that production of inflammatory mediators favours DV replication in vivo and/or in

vitro (53-55). Thus, it is likely that, in this infectious system, iNKT cells indirectly favour

virus replication by promoting inflammation. Since in Jα18

−/−

mice, the inflammatory

response is strongly reduced, this positive feedback for viral replication is also

downregulated. Our data show that during DV infection, iNKT cells produce IFN-

and that

iNKT cells trans-activate NK cells to produce it. Considering the critical function of IFN-

restricting DV replication (27,56), the lack of function of the iNKT cell/NK cell pathway in

virus containment in this system is somewhat surprising. The role of NK cells during DV

infection is unclear. It has been proposed that they could exert cytotoxic functions on infected

cells, although this activity has not yet been firmly proved in vivo (57-59). Of interest, the

lack of iNKT cell/NK cell functions on the control of DV replication was confirmed using

GalCer. Indeed, inoculation of

-GalCer, known to strongly activate the release of IFN-

iNKT cells and NK cells in vivo, at the time of DV infection, failed to affect DV replication

and was without effect on mouse survival (data not shown). Similar results were obtained

when

-GalCer was injected two days before DV challenge. This is the first time to our

knowledge that

-GalCer, used in prophylactic settings, is described to be ineffective during

virus infection. This finding confirms the lack of iNKT cell functions on DV replication after

natural activation.

As a whole, our data show a key role for iNKT cells in the development of pathology

and mortality associated to an acute model of DV infection. It is possible that a better

understanding of the mode of in vivo iNKT cell activation and the precise functions they exert

during DV infection will be beneficial to better harness these cells for therapeutic purposes in

the future, for instance through the use of iNKT cell antagonists.

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Acknowledgements

We acknowledge the generous support from the NIAID Tetramer Facility (Emory University,

Atlanta, GA) for supplying CD1d tetramers. We gratefully acknowledge Drs T. Nakayama

and M. Taniguchi (RIKEN Institute, Yokohama, Japan) for the gift of J

-/-

C57BL/6 mice.

The authors would like to thank I. Maillet, L. Fauconnier (CNRS UMR 6218, Orléans) and C.

Vendeville (CIIL, Institut Pasteur de Lille) for their technical assistance.

Disclosures

The authors have no financial conflict of interest.

Footnotes

This work was supported by the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale,

the CNRS, the University of Lille Nord de France, the Pasteur Institute of Lille, the French

national Research Agency (ANR), under reference ANR-08-MIEN-

R08066ES/RPV08036ESA and from the Conselho Nacional de Deselvovimento Cientifico e

Tecnologico (CNPq, Brazil). RG, REMPS and SI were recipients of a doctoral fellowship

from the Conselho Nacional de Deselvovimento Cientifico e Tecnologico (CNPq, Brazil) and

from the Ministère de l’Education Nationale de la Recherche et Technique, respectively. JR

was supported by a postdoctoral fellowship from the ANR. CF is supported by Inserm and BR

and FT by the CNRS.

Address correspondence and reprint requests to Dr. François Trottein,, Center for Infection

and Immunity of Lille, Inserm U1019-CNRS UMR 8204, Institut Pasteur de Lille, 1, rue du

Professeur Calmette, BP 245, 59019 Lille cedex, France. E-mail: francois.trottein@pasteur-

lille.fr.

Abbreviations used in this paper: DV, dengue virus ; DCs, dendritic cells; NK, natural killer;

iNKT, invariant NKT;

-GalCer,

-galactosylceramide; WT, wild type; LD, lethal dose; PFU,

plaque forming unit; H&E, hematoxylin and eosin ; p.i., post-infection.

Figure Legends

Figure 1. Activation of iNKT cells during the course of DV infection. A, iNKT cell

frequency and CD69 expression on iNKT cells during DV infection. Mice were inoculated

with a lethal dose (30 LD

) of DV and splenic iNKT cells were analyzed 3 and 5 days p.i.

Upper panels represent the percentages of gated PBS-57-loaded CD1d tetramer

TCRβ

(iNKT) cells in mock-treated or DV-infected mice, 3 days and 5 days p.i. Representative dot

plots are shown. Lower panels show the expression of CD69 on the surface of iNKT cells and

CD5

NK1.1

(NK) cells. The histogram overlay represents the expression of CD69 on gated

iNKT cells from either mock-treated or DV-infected 3 days or 5 days p.i. The bar histograms

represent the mean expression of CD69 (MFI) on iNKT and NK cells. Data represent the

mean MFI ± SEM (n = 3). Significant differences are designated by using the two-tailed

Student’s t-test, ** p < 0.01. B, Analysis of ex vivo cytokine production by iNKT cells 3 and 5

days p.i.. Gated iNKT and NK cells were analyzed for intracellular IFN-γ production. Gates

were set based on the isotype control. Representative dot plots are shown. The percentages of

iNKT or NK cells positive for IFN-γ are represented on the bar histograms. Data represent the

mean percentages ± SEM (n = 3-10). Significant differences are designated by using the two-

tailed Student’s t-test, *** p < 0.001.

Figure 2. Variation of body weight and survival rates in WT and iNKT cell-deficient

mice infected with a lethal dose of DV. A, Age-matched WT or Jα18

−/−

mice were infected

with a lethal dose (30 LD

) of DV and then followed for mortality and weighted daily. Left

panel, body weight loss expressed as a percentage of the animal’s initial weight. Right panel,

percentages of survival (n = 10-25, at least two independent experiments). Log-rank test for

comparisons of Kaplan-Meier survival curves indicated a significant increase in the mortality

of WT mice compared to Jα18

−/−

animals, p < 0.01. B, Weight loss and survival rate of

Jα18

−/−

mice reconstituted or not with iNKT cells. Jα18

−/−

mice were i.v. injected with either

1 x 10

cell-sorted iNKT cells or PBS 18 hours before DV challenge. Left panel, body weight

loss expressed as a percentage of the animal’s initial weight. Right panel, the survival of

reconstituted Jα18

−/−

mice was monitored and compared to WT mice (n = 10/group, two

independent experiments). Log-rank test for comparisons of Kaplan-Meier survival curves

indicated a significant increase in the mortality of J

-/-

mice reconstituted with iNKT cells

compared to J

-/-

animals, * p = 0.0291.

Figure 3. Analysis of the pathology in WT and iNKT cell-deficient mice infected with a

lethal dose of DV. A, Blood from mock-treated or DV-infected WT and Jα18

−/−

mice were

collected 5 days p.i. and analyzed for haematology parameters. The number of platelets is

shown as number x 10

/µl of blood. Granulocytes, monocytes and lymphocytes are shown as

percentages. B, Serum from mock-treated or DV-infected mice was collected at day 5 p.i. and

levels of IL-6 and IFN-γ were measured by ELISA. A and B, Data represent the mean ± SEM

(n = 6-11 mice/group, at least two independent experiments). Significant differences are

designated by using the two-tailed Student’s t-test, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. C,

Representative pictures of H&E-stained liver sections of mock-treated and DV-infected mice

6 days after inoculation.

Figure 4. Analysis of the inflammatory cytokine response in WT and iNKT cell-deficient

mice infected with a lethal dose of DV. Spleens from DV-infected WT and Jα18

−/−

mice

were collected at days 4, 5 and 6 p.i.. Tissues were homogenized and the concentrations of IL-

6, IFN-γ, IL-12 p40 and CXCL-1/KC were analyzed by ELISA. Values represent the mean ±

SEM (n = 4-8, two independent experiments). Significant differences between groups are

designated by using the two-tailed Student’s t-test, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

Figure 5. Analysis of NK cell, neutrophil and T lymphocyte frequencies and activation in

infected WT and iNKT cell-deficient mice. Five days p.i., splenocytes from infected mice

were recovered and analyzed for NK cell, neutrophil and T cell frequencies and activation

status. A, The average percentages ± SEM of gated CD5

NK1.1

cells from mock and

infected WT or Jα18

−/−

mice are shown (upper left panel). NK cells were also analyzed for

cell surface CD69 expression (mean MFI ± SEM) (upper right panel) and intracellular

granzyme B and IFN-γ expression (mean % positive cells ± SEM) (lower panels). B, The

frequency ± SEM of CD11c

Ly6G

cells (neutrophils) and the expression of CD62-L (mean

MFI ± SEM) on gated neutrophils are shown. C, The mean percentages of CD4

and CD8

cells ± SEM are shown in the upper panels. Expression of CD69 is represented in lower

panels as mean MFI ± SEM. A-C, Significant differences are designated by using the two-

tailed Student’s t-test, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 (n = 3-8, at least two

independent experiments).

Figure 6. Viral load in WT and iNKT cell-deficient mice infected with a lethal dose of

DV. Viral loads, as analyzed from infectious virus recovered from the liver and spleen of WT

and Jα18

−/−

mice, were assessed at 6 days p.i. with 30 LD

. Data are shown as the log of PFU

per 100 mg of tissue. Results are expressed as the geometric means and are representative of

at least two experiments.

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Figure 4

Figure 5

Figure 6

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