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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
RELAÇÃO ENTRE ESTRESSE OXIDATIVO E OSTEOPENIA
DIABÉTICA EM RATAS PRÉ-MENOPAUSADAS
VALÉRIA MORGIANA GUALBERTO DUARTE MOREIRA LIMA
Natal
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
RELAÇÃO ENTRE ESTRESSE OXIDATIVO E OSTEOPENIA
DIABÉTICA EM RATAS PRÉ-MENOPAUSADAS
TESE APRESENTADA AO PROGRAMA DE
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA
SAÚDE, COMO PARTE DOS REQUESITOS
PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE
DOUTOR.
Valéria Morgiana Gualberto Duarte Moreira Lima
Orientadora: Profª Drª. Adriana Augusto de Rezende
Co-Orientadora: Profª Drª. Maria das Graças Almeida
Natal
2010
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L732r Valéria Morgiana Gualberto Duarte Moreira Lima.
Relação entre estresse oxidativo e oesteopenia diabética em
ratas pré-menopausadas / Valéria Morgiana Gualberto Duarte
Moreira Lima.- Natal (RN), 2010.
63f.
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende
Co-orientadora: Maria das Graças de Almeida
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação
em Ciências da Saúde. 1. Farmácia. 2. Estresse
oxidativo – Ratas pré-menopausadas. 3. Peroxidação lipídica. 4.
Osteopenia diabética - estudo experimental.
UFPB/BC CDU: 615.12(043)
4
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenadora: Prof
a
. Dr
a
. Técia de Oliveira Maranhão
Natal
2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
RELAÇÃO ENTRE ESTRESSE OXIDATIVO E OSTEOPENIA
DIABÉTICA EM RATAS PRÉ-MENOPAUSADAS
Banca examinadora:
Presidente da Banca: Profª. Drª. Adriana Augusto de Rezende
Membros da Banca:
Prof. Dr. João Modesto Filho
Profª. Drª. Margareth de F. F. Melo Diniz
Profª. Drª. Técia Maria de Oliveira Maranhão
Profª. Drª. Aline Schwarz
Natal
2010
6
DEDICATÓRIA
À Deus,
que durante toda a minha existência, têm mostrado a cada amanhecer o
seu amor infinito, me agraciando com as presenças incondicionais de “Jesus
Cristo e Maria de Nazaré” .
7
Aos meus pais, Socorro e Expedito
Exemplos vivos de amor, esperança, fé, dignidade e superação.
8
À Fábio, Daniele, Thiago e Felipe
“Meus tesouros” que preenchem afetuosamente a minha vida de
amor, alegria, e confiança que Deus está sempre a nos guiar pelos seus
caminhos.
9
Aos meus irmãos, Elizabeth, Hernandro, Evandro, Edinalda, Eliana, Erivaldo,
José Gualberto e Assis (In memorian)
Verdadeiros amigos e valiosos companheiros de existência.
10
AGRADECIMENTOS
À Profª. Dr
a
. Adriana Augusto de Rezende, “Minha amiga e eterna
orientadora”, alicerce fundamental para o desenvolvimento desse trabalho científico,
bem como para a construção da minha formação acadêmica. Oportunamente,
mesmo na ausência de palavras capazes de expressar os meus sentimentos,
agradeço imensamente pelos seus inúmeros e inesquecíveis ensinamentos que
certamente direcionam todos os meus passos pessoais e profissionais. À você o
meu eterno obrigada.
À Profª. Dr
a
. Maria das Graças Almeida, “Minha amiga e co-orientadora”,
mente brilhante e insubstituível no planejamento e desenvolvimento desse trabalho
científico. Dessa maneira, ao longo da nossa convivência, você tornou-se uma das
minhas maiores referências de vida, especialmente pela capacidade inigualável de
dividir os seus conhecimentos. À você o meu infinito obrigada.
Ao Prof. Dr. José Brandão Neto, “Meu amigo”, mago da ciência que de
maneira ímpar sabe encantar a todos com os seus ensinamentos. Oportunamente,
agradeço pelo apoio e confiança que sempre depositou em mim. À você o meu
infinito obrigada.
À Profª. Dr
a
. Ana Maria de Oliveira, “Pilar de sustentação do meu projeto de
pesquisa”, pela sua primorosa colaboração no desenvolvimento metodológico desse
trabalho científico.
Á colaboração da Universidade de Ribeirão Preto – UNAERP, através da
Profª. Dr
a
. Luciana Augusto de Rezende e Prof. Dr. Manoel Sousa Neto, a quem
dedico os mais sinceros agradecimentos.
11
À parceria com a Unidade de Diagnóstico da Densidade Óssea, na pessoa de
Dr. Luiz Fernando Malvestiti.
Ao Laboratório Multidisciplinar – LABMULTI e o Laboratório de
Toxicologia Clínica – UFRN, pelos apoios recebidos durante todas as etapas desse
trabalho científico.
Ao Prof. Dr. Aldo Medeiros, pela sua prestimosa colaboração.
À Alberto Ferraz, pelo seu apoio incondicional ao longo dessa caminhada
científica.
À todos os amigos, que de um modo especial contribuíram para essa vitória
profissional.
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
EROS Espécies Reativas de Oxigênio
IL Interleucina
IL-1 Interleucina -1
IL-6 Interleucina -6
INF- Interferon
TNF- Fator de Necrose Tumoral
TNF- Fator de Necrose Tumoral
TGF- Fator de Crescimento de Transformação
TGF- Fator de Crescimento de Transformação
O2
-
Ânion Superóxido
H
2
O
2
Peróxido de Hidrogênio
GPx Glutationa Peroxidase
OPG Osteoprotegerina
RANK Receptor Ativador do Fator de Transcrição k
RANKL Ligante do Receptor Ativador do Fator de Transcrição
SRAT Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
MDA Malonildialdeído
GSH Glutationa Reduzida
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior
DMO Densidade Mineral Óssea
DEXA Absorciometria por Raio X de Dupla Energia
SOD Superóxido Dismutase
13
CAT Catalase
G-6PD Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase
PPGCSA Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
PIBIC Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica
CNPQ Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
FINEP Financiadora de Estudos e Projetos
14
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
TABLE I - Glucose, body weight, oxidant and antioxidant parameters in the
brain of premenopausal Wistar rats………………………………………….………..14
TABLE II - Histomorphometry measurements, biomechanical testing and bone
mineral density in femoral of the premenopausal Wistar rats……………………15
FIGURE 1- Simultaneous demonstration of the trabecular separation,
trabecular thickness, and trabecular bone volume in femur sections of control
rats (A, C, E) and diabetic rats (B, D, F), on day 5 (A, B) after induction of
experimental diabetes, on day 45 (C, E) and day 120 post-onset of experimental
diabetes. H&E, X200. ...............................................................................................16
15
SUMÁRIO
Dedicatória
Agradecimentos
Lista de abreviaturas
Lista de tabelas e figuras
Resumo
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................. 3
2.1. Estresse oxidativo e osteopenia diabética ............................................... 5
3. ANEXAÇÃO DO ARTIGO ................................................................................. 9
ARTIGO “Relationship between oxidative stress and diabetic osteopenia
in premenopausal rats” (Impresso) .............................................................. 10
4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES .............................................. 21
5. APÊNDICE ............................................................................................... .......39
6 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 43
ABSTRACT . .......................................................................................................... 47
16
RESUMO
A relação entre peroxidação lipídica, defesa antioxidante e osteopenia diabética
permanece obscura. Este estudo avaliou a associação entre índice de peroxidação
lipídica, parâmetro de defesa antioxidante e metabolismo ósseo em um modelo
diabético pré-menopausado através de medidas como a concentração de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT) e conteúdo de glutationa
reduzida (GSH) no homogenato cerebral, análises histomorfométricas, teste
biomecânico e densidade mineral óssea (DMO). Ratas Wistar com ciclo estral
regular foram distribuídas em dois grupos: Grupo 1 - ratas controle (n = 15) e Grupo
2 - ratas diabéticas (n = 15). O diabetes mellitus foi induzido pela aloxana e
confirmado pela glicemia 250 mg/dL. O período experimental compreendeu 1 e 5
dias após a indução e 45, 75 e 120 dias após a instalação do diabetes mellitus. O
índice de peroxidação lipídica, medido pela concentração de SRAT, demonstrou um
aumento significativo (p<0.05) nos animais diabéticos, em relação aos animais
controle. Entretanto, o parâmetro de defesa antioxidante, mensurado pelo conteúdo
de GSH, foi reduzido significativamente (p<0.05) nos animais diabéticos. As análises
histomorfométricas mostraram um aumento significativo (p<0.05) da separação
trabecular do fêmur, associado à diminuição significativa da espessura trabecular
(p<0.05) e volume ósseo trabecular reduzido nas ratas diabéticas. Além disso, o
teste biomecânico, medido pela força máxima de compressão, e valores de DMO
foram reduzidos significativamente (p<0.05) no grupo diabético. Dessa maneira,
nossos resultados demonstraram que a peroxidação lipídica aumentada e defesa
antioxidante modificada podem estar relacionadas ao desenvolvimento do estresse
oxidativo e osteopenia diabética em ratas pré-menopausadas.
Unitermos: Estresse oxidativo. Peroxidação lipídica. Diabetes mellitus. Osteopenia
diabética/estudo experimental.
17
1. INTRODUÇÃO
Diabetes mellitus é um grupo de desordens metabólicas caracterizado pela
hiperglicemia resultante de deficiências na secreção e/ou ações da insulina. Dentre
as várias complicações associadas ao diabetes destacam-se as alterações do
metabolismo mineral e ósseo [1]. A osteopenia diabética causa um aumento no
risco das fraturas ósseas, retarda a sua cicatrização e afeta indiscutivelmente a
qualidade de vida [1,2]. Entretanto, a relação entre diabetes e desordem óssea é
complexa e os mecanismos envolvidos ainda permanecem controversos [1].
Recentemente, diversas publicações sugerem que o estresse oxidativo
aumentado, acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROs), além de reduzido
potencial antioxidante enzimático e não-enzimático podem estar envolvidos na
patogênese da osteopenia diabética [1,3]. O estresse oxidativo corresponde ao
desequilíbrio entre as substâncias pró-oxidantes e antioxidantes em favor das pró-
oxidantes. Dessa maneira, causando danos importantes dos componentes celulares
através das oxidações de lipídios e proteínas [3,4].
Considerando o metabolismo ósseo, estudos in vitro têm demonstrado que o
estresse oxidativo desencadeado pela hiperglicemia crônica pode inibir a
diferenciação osteoblástica e induzir a sua apoptose [5]. Adicionalmente, estudos “in
vivo” têm associado à osteopenia diabética com estresse oxidativo aumentado [3,6].
Assim, o estresse oxidativo pode ser um importante fator na patogênese da
osteopenia diabética [6]. Contudo, a relação entre osteopenia diabética e estresse
oxidativo ainda permanece obscura [1,3].
Embora vários estudos tenham investigado a osteopenia diabética em
modelos experimentais, a maioria desses relatos envolve ratas pós-menopausadas
[6,7,8]. A partir desta constatação, realizamos uma revisão sistemática e detalhada
1
18
dos bancos de dados do Medline, Pubmed, Web of Science, em relação ao modelo
diabético tipo 1 pré-menopausal. Encontramos um grupo reduzido de trabalhos
envolvendo animais diabéticos tipo 1 com o ciclo estral regular, sendo um deles a
minha dissertação de mestrado [9], que objetivamente demonstra a influência
deletéria do diabetes mellitus no metabolismo mineral e ósseo, resultando no
desenvolvimento da osteopenia diabética em ratas pré-menopausadas.
A interpretação subestimada, associada à carência de publicações na
literatura científica sobre esse modelo experimental, nos fez supor que a relação
entre peroxidação lipídica, defesa antioxidante e osteopenia diabética em ratas pré-
menopausadas precisaria ser melhor estudada. Consequentemente, estas
considerações supra-citadas nos motivou a investigar e analisar diferentes
parâmetros, bem como tentar estabelecer uma relação entre eles no
desenvolvimento do estresse oxidativo e no processo de instalação e progressão da
osteopenia diabética.
Baseado no modelo experimental descrito previamente [9], foi desenvolvido
este projeto de tese de doutorado com o objetivo de avaliar a relação entre índice de
peroxidação lipídica, parâmetro de defesa antioxidante e metabolismo ósseo em
modelo diabético pré-menopausa. Para este fim, foram medidos a concentração de
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT) e conteúdo de glutationa
reduzida (GSH) no homogenato cerebral, associadas às análises
histomorfométricas, teste biomecânico e medida da densidade mineral óssea
(DMO).
Dessa maneira, justificamos o título do projeto de pesquisa “Relação entre
peroxidação lipídica, parâmetro antioxidante e osteopenia diabética em ratas pré-
menopausadas”.
2
19
2. REVISÃO DA LITERATURA
O osso é um órgão dinâmico apto a desenvolver funções importantes como
crescimento, locomoção e proteção a órgãos vitais como o cérebro, medula
espinhal, coração e medula óssea. Além disso, representa um grande reservatório
de minerais, como o cálcio, fósforo, magnésio e zinco, essenciais para a
manutenção celular normal, atividades neurológicas e vasculares do corpo [10].
Além dos minerais, o osso é constituído por componentes orgânicos e uma
população heterogênea de células, incluindo os osteoblastos e osteoclastos. Essas
células são responsáveis pela produção de uma variedade de reguladores
biológicos que controlam a distribuição dos componentes inorgânicos (hemostasia
mineral), bem como a reabsorção e formação contínua da matriz óssea (hemostasia
esquelética). Os osteoblastos estão envolvidos na formação da matriz óssea,
diferentemente dos osteoclastos que estão envolvidos na reabsorção óssea [11].
Existe considerável interesse nos hormônios, citocinas e fatores de
crescimento atuantes na regulação fisiológica da hemostasia óssea. Dentre esses,
destacam-se a insulina, estrógeno, interleucina 1 (IL-1, IL-1), IL-6, interferon
(INF), fatores de necrose tumoral (TNF- e TNF-) e fatores de crescimento de
transformação (TGF-, TGF-) [12]. É importante relatar que a deficiência de
estrógeno é reconhecida como um fator de risco para osteopenia e osteoporose em
mulheres em pré e pós-menopausa, bem como em modelos experimentais
ooforectomizados [3].
Durante as últimas décadas tem sido descrita a participação das espécies
reativas de oxigênio (EROs) no processo da reabsorção óssea [3,11]. Existe uma
contribuição direta dos osteoclastos na geração de ânion superóxido (O
2
-
) e
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) [11]. Entretanto, não está completamente esclarecido
3
20
o mecanismo pelo qual as EROs participam ativamente da destruição acelerada do
tecido ósseo, bem como da reabsorção óssea [3].
Além disso, os efeitos das EROs na função osteoblástica também são
parcialmente conhecidos [1,5]. Os osteoblastos produzem antioxidantes como a
glutationa peroxidase (GPx) para a proteção contra as EROs, mas também
produzem TGF- que está envolvido no processo da reabsorção óssea [5].
Adicionalmente, as interações entre EROs e seus receptores (receptores de
EROS) encontrados em diversos tipos celulares podem também estar envolvidas na
patogênese de diversas doenças ósseas, como a osteopenia diabética e
osteoporose [5].
Mais recentemente, outros fatores foram descritos como envolvidos na
regulação dos osteoblastos e osteoclastos. Correspondem à osteoprotegerina
(OPG), conhecida como fator inibidor de osteoclastogênese, RANK (receptor
ativador do fator de transcrição k) e seu ligante (RANKL), identificados como
reguladores diretos de osteoclastogênese [13]. O RANKL, expresso na superfície
dos osteoblastos, induz à sua diferenciação, ativação e maturação, além de inibir a
apoptose osteoclástica através da ligação com seu receptor funcional, RANK,
expresso nestas células ósseas ou em seus precursores [3]. Todavia, a interação
RANKL/RANK é controlada negativamente pela OPG, que atua como um receptor
solúvel que se liga ao RANKL solúvel inibindo consequentemente a interação do
RANKL com seu receptor RANK [13,14].
Dessa maneira, a OPG e/ou a modulação da função RANK/RANKL
representam caminhos promissores para o tratamento e prevenção de condições
osteopênicas como o diabetes mellitus, deficiência estrogênica ou mesmo a
4
21
osteoporose, que cursam semelhantemente com desequilíbrios no balanço redox
[3,15].
Assim, contextualizando a avaliação global do processo do envelhecimento,
a osteoporose raramente é reconhecida como uma condição patológica isolada.
Dessa maneira, a identificação de fatores de risco para a osteoporose e,
subseqüentemente, de altos riscos individuais para desenvolvimento de diversas
desordens correlacionadas, tais como diabetes mellitus, hipertensão, câncer e
doenças cardiovasculares, pode propiciar melhores estratégias de prevenção à
perda da massa óssea na população mundial [14,16].
2.1. ESTRESSE OXIDATIVO E OSTEOPENIA DIABÉTICA
Diabetes mellitus é um conjunto de desordens metabólicas de etiologias
múltiplas, caracterizadas por hiperglicemia crônica com distúrbios nos metabolismos
dos carboidratos, lipídeos e proteínas, os quais resultam no comprometimento de
vários órgãos e sistemas de forma progressiva e generalizada [17].
Atualmente, a sua classificação engloba quatro classes clínicas: diabetes
mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, outros tipos específicos de diabetes mellitus
e diabetes mellitus gestacional. O diabetes mellitus tipo 1, forma presente em 5 a
10% dos casos em humanos, é o resultado da destruição das células pancreáticas
com conseqüente ausência de insulina. Enquanto que o diabetes mellitus tipo 2,
forma presente em 90 a 95% dos casos, caracteriza-se por defeitos na ação e
secreção da insulina [17].
As principais complicações crônicas do diabetes incluem retinopatia, com
potencial perda de visão; nefropatia, neuropatia periférica, com risco de úlceras e
amputação de membros; neuropatia autônoma, causando sintomas gastrointestinais,
geniturinários e cardiovasculares, disfunções sexuais e desordens ósseas [1,4,17].
5
22
Adicionalmente, existe uma maior predisposição à hipertensão, anormalidades no
metabolismo de lipoproteínas e doenças vasculares [17].
A maioria dos mecanismos envolvidos nas complicações crônicas associadas
ao diabetes apresenta-se descritos numa diversidade de relatos científicos [1,4].
Entretanto, diversos questionamentos relacionados ao tempo de instalação e
progressão da doença óssea associada ao diabetes, tanto em modelos
experimentais [6,7,9] quanto em humanos [2,18,19] ainda permanecem obscuros.
Diversos estudos mostram que as EROs não estão somente envolvidas no
processo do envelhecimento, mas também relacionadas às patogêneses de várias
doenças, como o diabetes melitus, osteoporose, arteriosclerose, câncer, catarata e
doença de Parkinson [3].
No diabetes mellitus, a persistente hiperglicemia pode causar estresse
oxidativo a partir de uma variedade de mecanismos, incluindo as reações de auto-
oxidação da glicose, glicação não-enzimática com formação de EROs, aumentos do
estresse carbonil e fenômeno poliol. Tem sido descritas que as glicações não-
enzimáticas de proteínas relacionadas ao metabolismo ósseo, tais como colágeno,
fosfatase alcalina ósseo-específica e osteocalcina tem resultado na produção
aumentada de EROs que alteram as funções, estruturas e estabilidades dessas
proteínas. Desse modo, essas alterações comprometem a adesão celular,
crescimento e acúmulo de matriz óssea, podendo favorecer a instalação e
progressão da osteopenia diabética [20]. Além disso, os osteoblastos possuem
membranas ricas em ácidos graxos poliinsaturados que são altamente susceptíveis
ao estresse oxidativo [7]. Em adição, outros fatores circulantes que são elevados no
diabetes, como os ácidos graxos livres e leptina, também contribuem para aumentar
a produção de EROs [1,4].
6
1
23
Portanto, dentre as diversas possibilidades relacionadas à patogênese da
osteopenia diabética destacam-se os efeitos deletérios decorrentes do acúmulo de
EROs no processo da formação óssea, defesas antioxidantes diminuídas,
insulinopenia, microangiopatia óssea, atividade osteoblástica reduzida, alteração na
síntese protéica, retardo na formação de matriz de colágeno, diminuição do turnover
ósseo e aumento no tempo de mineralização do osteóide, [1,3,5].
Diversos ensaios laboratoriais têm sido empregados na avaliação do estresse
oxidativo induzido pelo diabetes, incluindo a medida da peroxidação lipídica, através
de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (SRAT). Assim, é possível a análise
dos produtos finais da peroxidação lipídica (peróxidos lipídicos, malonildialdeído e
demais aldeídos de baixo peso molecular) que ao reagirem como o ácido 2-
tiobarbitúrico, formam bases de Schiff [21]. O malonildialdeído (MDA) é.o principal
aldeído formado durante o último estágio da quebra de endoperóxidos, é o resultado
de rearranjos intramoleculares na estrutura de ácidos graxos poliinsaturados, que
ocorrem durante a peroxidação lipídica [21].
Vários estudos envolvendo pacientes ou modelos diabéticos mostram o
aumento da concentração de MDA em plasma, eritrócitos, sangue total, além de
tecidos como cerébro, fígado, rins e coração [22,23]. Assim, o diabetes está
associado à condição de estresse oxidativo aumentado que representa um
importante mecanismo no desenvolvimento das complicações crônicas associadas
a essa desordem metabólica [22,23].
O cérebro é um órgão vulnerável aos danos oxidativos por possuir
membranas ricas em ácidos graxos poliinsaturados, bem como regiões altamente
ricas em ferro, as quais podem catalisar a produção de EROs. Além disso, possui
baixas concentrações de substâncias antioxidantes enzimáticas ou não-enzimáticas.
7
24
Assim, a susceptibilidade do cérebro ao estresse oxidativo explica a utilização desse
tecido em estudos in vitro [21,24].
Diversos relatos demonstram a diminuição na capacidade de defesa
antioxidante em humanos e modelos animais diabéticos [22,23]. Essas modificações
possivelmente decorrem de alterações nas enzimas antioxidantes, diminuição do
metabolismo da glutationa (GSH), além de concentrações diminuídas de GSH e
vitaminas A, C, D e E [1,4,23].
Portanto, o presente estudo tem por objetivo investigar a influência da
peroxidação lipídica e modificação da defesa antioxidante não-enzimática na
instalação e progressão da osteopenia diabética em modelo experimental de
osteopenia diabética simulando mulheres pré-menopausadas com diabetes mellitus
tipo 1.
8
25
3. ANEXAÇÃO DO ARTIGO
Artigo: “Relationship between oxidative stress and diabetic osteopenia in
premenopausal rats”
Periódico: Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences
Status da publicação: Aceito para publicação no vol. 46, n.3, 2010.
CAPES/Qualis: B3
Impacto: Submetido à avaliação da Capes
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27
11
28
12
29
13
30
14
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1
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34
18
1
35
19
36
20
37
4. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES
Considerando-se que o estresse oxidativo possui um papel principal na
patogênese das complicações diabéticas, incluindo osteopenia diabética [1,3],
tornou-se necessária a sua investigação num modelo experimental com perda óssea
progressiva semelhante à observada em mulheres pré-menopausadas com diabetes
mellitus avançado [9].
Em decorrência do desenvolvimento do nosso anteprojeto inicial estruturou-se
uma linha de pesquisa do Laboratório Multidisciplinar - LABMULT, sob a
coordenação das professoras Adriana Augusto de Rezende e Maria das Graças de
Almeida, contemplando estudos do estresse oxidativo associado à condição de peri,
pré e pós-menopausa em modelo animal bem como em humanos.
Ao longo dos últimos anos, vêm sendo desenvolvidos diversos projetos que
efetivamente contribuem para o fortalecimento desta linha de pesquisa. Essa
coletânea de estudos contempla teses em andamento, dissertações defendidas ou
em andamento, bem como alunos de iniciação científica Desse modo, a nossa
produção científica pode ser representada através de alguns trabalhos dos seguintes
integrantes da base de pesquisa:
Aluno: Francisco Paulo Freire Neto
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende
Co-orientadora: Maria das Graças Almeida
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - UFRN
Nome da dissertação: “Influência do tratamento com ácido lipóico sobre o
metabolismo ósseo e perfil antioxidante de mulheres na perimenopausa”.
Ano de obtenção: 2010.
Identificação do Processo
21
38
Número: 481011/2007-2
Edital Chamada
Edital MCT/CNPq 15/2007 - UNIVERSAL - FAIXA B - De R$ 20.001,00 a 50.000,00
Aluno: Raul Hernandes Bortoli
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende.
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - UFRN
Nome da dissertação em andamento: ”Avaliação da osteopenia em ratos diabéticos
suplementados com cálcio, fósforo, vitamina E, zinco”.
Aluna: Yonara Monique da C. Oliveira
Orientadora: Maria das Graças Almeida
Co-orientadora: Adriana Augusto de Rezende
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas – UFRN
Nome da dissertação em andamento: “Associação da expressão e polimorfismos
dos genes SOD1, SOD2 e GPx-1 com o desenvolvimento da nefropatia diabética”.
Aluno: Rand Randall Martins
Orientadora: Maria das Graças Almeida.
Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde – UFRN
Nome da tese em andamento: “Influência do ácido alfa-lipóico na adaptação
antioxidante ao exercício físico: correlação com os níveis séricos estrogênicos”.
Aluna: Maria do Socorro Medeiros Morais
Orientadora: Maria das Graças de Almeida
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - UFRN
Nome da dissertação em andamento: ”Suplementação com ácido lipóico e terapia
hormonal com tibolona: relação sobre a condição de estresse oxidativo, sintomas
climatéricos e qualidade de vida em mulheres na perimenopausa”.
22
39
Aluno: Ulisvaldo Brunno de Oliveira Macedo
Orientadora: Maria das Graças Almeida
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas – UFRN
Nome da dissertação: “Influência do hipoestrogenismo por ooforectomia na
adaptação antioxidante em ratas wistar exercitadas regularmente”.
Ano de obtenção: 2009
Aluno: Marcela Abbott Galvão Ururahy.
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende
Co-orientadora: Maria das Graças Almeida
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - UFRN
Nome da dissertação: “Associação do receptor toll-like 2 com o estado pró-
inflamatório do diabetes tipo 1”.
Ano de obtenção: 2009.
Aluno: Melina Bezerra Loureiro.
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende
Co-orientadora: Maria das Graças Almeida
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - UFRN
Nome da dissertação: “Avaliação da presença de osteopatia decorrente do diabetes
mellitus tipo 1em crianças e adolescentes do Rio Grande do Norte”.
Ano de obtenção: 2008.
Aluno: Elaine Cristina da Silva Ferreira
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende
Co-orientadora: Maria das Graças Almeida
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - UFRN
23
40
Nome da dissertação: “Osteopenia diabética e pós-menopausa: efeito anabólico do
zinco na recuperação do volume trabecular ósseo”.
Ano de obtenção: 2007.
Aluno: Maria Margareth Câmara de Almeida
Orientadora: Adriana Augusto de Rezende
Co-orientadora: Maria das Graças Almeida
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas - UFRN
Nome da dissertação: “Efeito do tamoxifeno no metabolismo ósseo: avaliação em
ratos diabéticos experimentais”.
Ano de obtenção: 2006.
Resumos de trabalhos publicados em congressos:
Resumo: FREIRE-NETO, F. P., MORAIS, M. S. M., SOUZA, K. S. C., SILVA, H. P.
V., OLIVEIRA, Y. M. C., MORAIS, L. V. F., URURAHY, M. A. G., BEZERRA, J. F.,
BORTOLIN, R. H., LUCHESSI, A. D., HIRATA, R. D. C., HIRATA, M. H., BRANDÃO-
NETO, J., ALMEIDA, M. G.
;
REZENDE, A. A. Effects of acid lipoic treatment on blood
antioxidants parameters in perimenopausal women with dyslipidaemia: influence over
bone metabolism. In: XXXIX Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e
Biologia Molecular – SBBq. 1
st
Latin American Symposium on the Molecular
Mechanisms of Skeletal Mineralization , no período de 18 a 21 de Maio de 2010, Foz
do Iguaçu, Paraná, Brasil.
Resumo: SOUZA, L. C. A.; FREIRE NETO, F. P.; SILVA, H. P. V.; SOUZA, K. S. C.;
MORAIS, L. V. F.; OLIVEIRA, Y. M. C.; URURAHY, M. A. G.; BEZERRA, J. F.;
BORTOLIN, R. H.; MORAIS, M. S. M.; ARAÚJO, D. M.; AZEVEDO, G. D.;
BRANDÃO NETO, J.; ALMEIDA, M. G.; REZENDE, A. A. Avaliação das alterações
no perfil lipídico de mulheres na perimenopausa. In: 1 Simpósio Nacional em
24
41
Ciências Farmacêuticas Básicas e Aplicadas: Fronteiras do Conhecimento e
Políticas de Inovação”, realizado pelo Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte no dia 27 de
novembro de 2009, Natal/RN, Brasil.
Resumo: BEZERRA, A. A. M.; FREIRE NETO, F. P.; SILVA, H. P. V.; SOUZA, K. S.
C.; FERNANDES, F. E. M.; SOUZA, H. F.; OLIVEIRA, Y. M. C.; URURAHY, M. A.
G.; BEZERRA, J. F.; BORTOLIN, R. H.; MORAIS, M. S. M.; ARAÚJO, D. M.;
AZEVEDO, G. D.; BRANDÃO NETO, J.; ALMEIDA, M. G.; REZENDE, A. A.
Avaliação da terapia de reposição hormonal com tibolona em mulheres na
perimenopausa: aspectos lipêmicos e da remodelagem óssea. In: 1 Simpósio
Nacional em Ciências Farmacêuticas Básicas e Aplicadas: Fronteiras do
Conhecimento e Políticas de Inovação”, realizado pelo Programa de Pós-Graduação
em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte no dia
27 de novembro de 2009, Natal/RN, Brasil.
Resumo: REZENDE, A. A.; FERRREIRA, E. C. S.; REZENDE, L. A.; RAMOS, A. M.
O.; BRANDAO NETO, J.; HIRATA, M. H.; HIRATA, R. D.; ALMEIDA, M. G. . Zinc
supplementation for the treatment or prevention of diabetic osteopenia: study in STZ-
induced diabetes and ovariectomized model. In: AACC Annual Meeting, 2008,
Washington, DC. Abstracts of the Scientific Posters, 2008. AACC Annual Meeting, v.
54. p. 70-70, 2008.
Resumo: BORTOLIN, R. H.; KIKUGAVA, G.; SILVA, D. G. C.; PERUCHI, J.; PINHO,
A.; ALMEIDA, M. G.; SILVA, T. C. P.; REZENDE, A. A. ; REZENDE, L. A. Zinc
supplementation and diabetic osteopenia: evaluation in STZ-induced diabetes model.
In: XXXVII Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular
Biology (SBBq) and XI Congress of the Pan American Association for Biochemistry
25
42
and Molecular Biology (PABMB), 2008, Águas de Lindóia, São Paulo, Brazil. Anais
do XXXVII Annual Meeting of SBBq and XI Congress of the PABMB, 2008.
Resumo: ROBERTO, P. G.; BORTOLIN, R. H.; SILVA, D. G. C.; SILVA, D. F. C.;
COSTA, T. M. B.; KIKUGAVA, G.; SILVA, V. F.; SILVA, T. C. P.; REZENDE, A. A.;
REZENDE, L. A. Expressão dos genes RANK/RANKL/OPG em fêmures de ratos:
marcadores moleculares sensíveis para alterações do metabolismo ósseo. In: XXIII
Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental - FeSBE,
2008, Águas de Lindóia, São Paulo, Brasil. Anais da XXIII Reunião Anual da
Federação de Sociedades de Biologia Experimental, 2008.
Resumo: BORTOLIN, R. H. KIKUGAVA, G.; SILVA, D. G. C.; PERUCHI, J.; PINHO,
A.; ALMEIDA, M G.; REZENDE, A. A.; SILVA, T. C. P.; REZENDE, L. A. Zinc
supplementation and diabetic osteopenia: evaluation in STZ-induced diabetes model.
In: 9º Congresso de Iniciação Científica e Pesquisa da Universidade de Ribeirão
Preto - CONIC, 2008, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. Anais de Pesquisa do 9º
Congresso de Iniciação Científica e Pesquisa da Universidade de Ribeirão Preto -
CONIC, 2008.
Resumo: REZENDE, L. A.; KIKUGAVA, G.; BORTOLIN, R. H.; PERUCHI, J.;
TRIMAILOVAS, M.; SILVA, D. G. C.; ALMEIDA, M. G.; REZENDE, A. A. ; LEONE, F.
A. The mineral and vitamine E suplementation study on bone metabolism of diabetic
rats. In: XXXVI Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and
Molecular Biology (SBBq) and 10 th International Union of Biochemistry and
Molecular Biology (IUBMB) Conference Infectious Diseases: Biochemistry of
Parasites, Vectors and Hosts, Salvador, Bahia, Brazil - May 21-25, 2007. Anais do
XXXVI Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular
26
43
Biology (SBBq) and 10 th International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(IUBMB) Conference Infectious Diseases: Biochemistry of Parasites, 2007.
Resumo: REZENDE, L. A.; KIKUGAVA, G.; BORTOLIN, R. H.; PERUCHI, J.;
TRIMAILOVAS, M.; SILVA, D. G. C.; PEREZ, D. E. C.; COSTA, T. M. B.; PINHO, A.;
ALMEIDA, M. G. ; REZENDE, A. A. Análise da osteopenia em ratos diabéticos
suplementados com minerais e vitamina E. In: XXII Reunião Anual da Federação de
Sociedades de Biologia Experimental - FeSBE, 2007, Águas de Lindóia, São Paulo,
Brasil. Anais da XXII Reunião Anual da Reunião Anual da Federação de Sociedades
de Biologia Experimental - FeSBE, 2007.
Resumo: REZENDE, A. A.; ALMEIDA, M. M. C.; OLIVEIRA, L. R. A.; RAMOS, A. M.
O.; BRANDAO NETO, J.; ALMEIDA, M. G. The anabolic effect of tamoxifen in bone:
study in streptozotocin-induced diabetes model. San Diego - USA. In: AACC 2007
Annual Meeting and Clinical Lab Exposition, 2007, San Diego- CA. American
Associantion of Clinical Chemistry, 2007.
Resumo: KIKUGAVA, G.; BORTOLIN, R. H.; PERUCHI, J.; TRIMAILOVAS, M.;
SILVA, D. G. C.; ALMEIDA, M. G.; REZENDE, A. A. ; LEONE, F. A.; REZENDE, L.
A. The mineral and vitamine E suplementation study on bone metabolism of diabetic
rats. In: 8º Congresso de Iniciação Científica e Pesquisa da Universidade de
Ribeirão Preto CONIC, 2007, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil. Anais de Pesquisa
do 8º Congresso de Iniciação Científica e Pesquisa da Universidade de Ribeirão
Preto CONIC, 2007.
Resumo: KIKUGAVA, G.; BORTOLIN, R. H.; PERUCHI, J. ; TRIMAILOVAS, M.;
SILVA, D. G. C.; PEREZ, D. E. C.; COSTA, T. M. B.; PINHO, A.; ALMEIDA, M. G.;
REZENDE, A. A.; REZENDE, L. A. Análise da osteopenia em ratos diabéticos
suplementados com minerais e vitamina E. In: 8º Congresso de Iniciação Científica e
27
44
Pesquisa da Universidade de Ribeirão Preto CONIC, 2007, Ribeirão Preto, São
Paulo, Brasil. Anais de Pesquisa do 8º Congresso de Iniciação Científica e Pesquisa
da Universidade de Ribeirão Preto CONIC, 2007.
Resumo: REZENDE, L. A.; BORTOLIN, R. H.; SILVA, D. G. C.; KIKUGAVA, G.;
PERUCHI, J.; TRIMAILOVAS, M.; ALMEIDA, M. G.; REZENDE, A. A. The mineral
and vitamine E suplementation study on bone metabolism of diabetic rats. In: 6th
International Congress of Pharmaceutical Sciences - CIFARP, 2007, Ribeirão Preto,
são Paulo, Brasil. Anais do 6th International Congress of Pharmaceutical Sciences,
2007.
Particularmente, com o desenvolvimento metodológico inicial do nosso projeto
de pesquisa denominado de “Relação entre estresse oxidativo e osteopenia em
modelo experimental diabético pré-menopausal”, nos foi possível a apresentação do
tema livre “Oxidative stress role in diabetic osteopenia”, na forma de pôster, na
XXXVI Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular
Biology (SBBq) - 10
th
International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(IUBMB) Conference: “Infectious Diseases Biochemistry of Parasites, Vectors and
Hosts - Salvador, Bahia, Brazil - May 21-25, 2007.
Por fim, o desfecho do nosso projeto de pesquisa, foi representado pelo
aceite da publicação literária intitulada: “Relationship between oxidative stress and
diabetic osteopenia in premenopausal rats”, na forma de original article, no periódico
internacional “Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences - vol. 46, n.3, 2010” (in
press), que possui ampla divulgação científica.
Este estudo apresentou características multidisciplinares, interdisciplinares e
transdisciplinares, o qual proporcionou as participações de diferentes profissionais,
alunos em nível de iniciação científica, mestrado e doutorado.
28
45
No âmbito da diversidade profissional contemplada neste estudo, tivemos as
participações de farmacêuticos-bioquímicos habilitados nas áreas de análises
clínicas e/ou toxicológicas, químicos, médicos, com atuações nas áreas de
endocrinologia, fisiologia, patologia clínica e medicina nuclear, biólogos e o
estatístico.
Os resultados oriundos deste projeto realizado em modelo animal
promoveram a realização de um estudo em humanos, o qual apresentou um
desenho experimental complementar e que incluiu a avaliação de marcadores
moleculares e o tratamento com um agente antioxidante. O estudo foi realizado em
mulheres em estágio de peri-menopausa dentro de uma dissertação de mestrado
através do PPgCF/UFRN sob orientação e co-orientação das mesmas professoras a
qual foi defendida em março de 2010.
Dentre os riscos e dificuldades metodológicas contempladas no presente
estudo, destacou-se a obtenção de um grupo diabético adequado ao longo do
período experimental. Nesse sentido, a dificuldade experimental foi associada à
perda de animais decorrente do diabetes mellitus avançado sem tratamento com
insulina.
Com base nos objetivos deste projeto, o modelo animal usado correspondeu
amplamente às expectativas do estudo, pois caracterizou a condição de diabetes
mellitus tipo 1 em ratas pré-menopausadas.
O modelo animal apresentou um quadro de hiperglicemia crônico instalado e
mantido ao longo do período estudado. Foi realizado o acompanhamento quinzenal
dos animais mostrando a elevação da glicemia capilar, obtida pela coleta caudal,
além da observação do quadro clinico característico de poliúria, polidipsia, polifagia e
perda de peso corporal.
29
46
As fases do ciclo estral foram identificadas através do exame histológico do
esfregaço vaginal, pois é um método preciso, sensível e rápido que permite suas
identificações sem sacrificar o animal. Neste trabalho experimental, o modelo animal
usado mostrou uma manutenção do ciclo estral regular, que foi identificada através
dessa metodologia [9]. Assim, o ciclo estral regular das ratas condiz com a condição
de regularidade menstrual característico do período de pré-menopausa apresentado
em mulheres, sendo dessa forma bastante plausível o uso do modelo experimental
para representar osteopenia pré-menopausa [9,25].
Dentro deste contexto, é importante destacar que na instalação da
menopausa, os ciclos inicialmente se tornam irregulares, às vezes são anovulatórios
e finalmente desaparecem. Condição esta que não foi evidenciada nos animais
utilizados.
Neste projeto de pesquisa, as fases do ciclo estral da rata, que se repetem
num intervalo de 4 a 6 dias, foram avaliadas durante, pelo menos, 3 períodos
consecutivos antes da indução do diabetes mellitus seguido do acompanhamento
diário durante a integralidade do estudo. Essa etapa metodológica foi bastante
complexa e exigiu do pesquisador uma gama de conhecimentos para a sua
realização. Dentre estas exigências, destacamos a habilidade manual no trato com
os animais, durante a coleta da secreção vaginal, bem como conhecimentos
citológicos para a realização da leitura microscópica diária das 3 lâminas colhidas
para cada animal. Dessa maneira, representando o procedimento de triagem para a
inserção ou exclusão do animal no referido grupo de estudo durante o período
experimental.
É importante mencionar que não houve modificações do modelo inicial, pois o
experimento transcorreu dentro do previsto.
30
47
O protocolo experimental foi realizado após um projeto piloto com pelo menos
três séries de experimentações, até que se consegui sistematizar a técnica da
indução do diabetes mellitus com aloxana, bem como a técnica da coleta da
secreção vaginal seguida da leitura microscópica dos esfregaços a fresco.
Adicionalmente, o treinamento da técnica da perfusão in situ do cérebro e as
padronizações das determinações das SRAT e o conteúdo de glutationa reduzida
em homogenatos de cérebro. Além disso, as padronizações dos procedimentos
técnicos necessários para a utilização dos fêmures nas análises
histomorfométricas, teste biomecânico e medida da densidade mineral óssea pelo
DEXA. Os experimentos pilotos realizados se basearam nas regulamentações para
pesquisas envolvendo animais, bem como em relatos literários previamente
publicados.
Dessa maneira, tornou-se imprescindível à realização de diversas reuniões
visando o entendimento científico, padronização e o treinamento das etapas
metodológicas que foram desenvolvidas neste estudo experimental. Assim,
promovendo amplo e efetivo compromisso profissional entre os alunos e
pesquisadores envolvidos no projeto, resultando numa relação de confiança entre
os membros da Base de Pesquisa.
Em adição, também foi necessário investir em parcerias científicas com
outras instituições de ensino superior pública ou privada, além de clínicas
particulares de medicina nuclear e empresas de produtos e reagentes para
laboratórios de análises clínicas e análises toxicológicas.
Infelizmente, não foi possivel a determinacao da atividade das enzimas
antioxidantes, como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa
peroxidase (GPx) e glicose-6-fosfato-desidrogenase (G-6PD) em homogenatos de
31
48
cérebro. Isso decorreu do alto custo dos kits comerciais disponíveis no mercado
nacional. Além disso, não obtivemos êxito nas padronizações das técnicas de
bancadas para as determinações destes parâmetros antioxidantes.
No presente estudo, não foram contempladas as determinações das SRTAs e
o conteúdo de GSH reduzida diretamente nos fêmures analisados. Estas
determinações no tecido esquelético não foram realizadas em decorrência das
indisponibilidades de técnicas padronizadas bem como de condições disponíveis no
laboratório para padronizá-las .
Entretanto, embora os resultados tenham sido obtidos em outro tecido, o
homogenato de cérebro representa uma amostra estável para investigar danos
oxidativos e defesas antioxidantes. Diversos artigos previamente publicados
reportam a conveniência do uso do homogenato cerebral para as determinações de
dano oxidativo e atividade antioxidante uma vez que o cérebro é vulnerável ao dano
oxidativo pelo conteúdo lipídico rico em ácidos graxos poliinsaturados. Modificações
nas defesas antioxidantes favorecem a oxidação dos ácidos graxos poliinsaturados,
bem como inibem as suas funções. Além disso, o cérebro também possui baixas
concentrações de antioxidantes como GSH e vitamina E [21,24].
Nesse sentido, a nossa opção por dosar SRATs no homogenato cerebral e
não na circulação fundamentou-se em relatos científicos, acrescido da
disponibilidade de padronização da técnica em nosso laboratório.
Assim, é possível contemplar a relevância desta investigação para a
instalação do estresse oxidativo e seu provável envolvimento na patogênese da
osteopenia diabética em ratas pré-menopausadas. Especialmente nesta última
década, tornou-se intrigante o panorama científico vislumbrado à cerca da temática
em foco, pois diversos grupos de pesquisa têm se empenhado em desenvolver
32
49
trabalhos experimentais e/ou clínicos esclarecedores à cerca da possível
participação do estresse oxidativo no desenvolvimento da osteopenia diabética.
Mais recentemente, foi publicado pelos autores: Yasuhiro Hamada, Hideki Fujii e
Masafumi Fukagawa, o trabalho intitulado “Role of oxidative stress in diabetic bone
disorder” no periódico internacional Bone. 45 (2009) S35-S38.
Nesse sentido, tomando como referência este grupo de pesquisadores o que
não nos falta é motivação para a ampliação desta nossa investigação científica, pois
estamos apenas dando os primeiros passos nessa longa jornada. Certamente,
mesmo que de maneira ainda incipiente, nos sentimos muito felizes em despontar
na literatura científica com resultados relevantes para um estudo experimental com
o modelo animal usado.
Como citado anteriormente, resultados obtidos no presente projeto realizado
em modelo animal promoveu a realização de uma linha de pesquisa do laboratório
que envolve estudos do estresse oxidativo associado à condição de peri, pré e pós-
menopausa em modelo animal bem como em humanos.
Recentemente, foi realizado um estudo em humanos, o qual apresentou um
desenho experimental complementar e que incluiu a avaliação de marcadores
moleculares e o tratamento com um agente antioxidante. O estudo foi realizado em
mulheres em estágio de peri-menopausa dentro de uma dissertação de mestrado
através do PPgCF/UFRN sob orientação e co-orientação das mesmas professoras a
qual foi defendida em março de 2010.
Estes resultados foram apresentados no XXXIX Annual Meeting of SBBq and
1st Latin american Symposium on the Molecular Mechanism of Skeletal
Mineralization, realizado em Foz de Iguaçu no período de 18 a 21 de maio de 2010,
sob a forma de Palestra “Diabetes mellitus and the pathophysiology of bone loss”
33
50
(Palestrante: Adriana Augusto de Rezende), e na forma de pôster (defesa de
mestrado 2010 do PPgCF, Francisco Paulo Freire Neto) intitulado “Effect of lipoic
acid treatment on blood antioxidants parameters in perimenopausal women with
dyslipidemia: influence over bone metabolism” .
No presente trabalho, houve uma correta aplicação da análise estatística no
conjunto de dados obtidos, através do programa STATISTICA Versão 6.0 (StatSoft
Inc., OK, USA). Esses resultados foram interpretados a partir das análises
estatísticas descritivas e exploratórias de seus valores, através da análise de
variância (ANOVA) seguida pelo teste de Turkey. Sequencialmente, os resultados
obtidos foram apresentados em tabelas. Empregou-se para fins de significância o
erro em 5%.
Este estudo demonstrou dados científicos originais que relacionam a
peroxidação lipídica aumentada e defesa antioxidante modificada como eventos
importantes no desenvolvimento do estresse oxidativo, sugerindo uma participação
do estresse oxidativo na patogênese da osteopenia diabética em ratas pré-
menopausadas. Nesse sentido, o efeito do balanço redox alterado poderia afetar a
atividade osteoblástica e contribuir para a instalação da osteopenia diabética em
ratas pré-menopausadas.
Nas avaliações histomorfométricas do fêmur, mostramos mudanças
importantes na arquitetura trabecular óssea dos animais diabéticos em relação aos
animais controle. Verificou-se uma redução numérica acentuada das trabéculas
ósseas com expansão do espaço medular existente entre elas, através do aumento
da separação trabecular, diminuição da espessura trabecular, além da redução
percentual do volume ósseo trabecular. Além disso, alteração da propriedade
mecânica do osso (diminuição da força de tração necessária para ruptura do osso),
34
51
bem como reduções significativas nos valores da medida da densidade mineral
óssea ao longo do período estudado. Assim, nos sendo possível sugerir a relação
entre estresse oxidativo e a osteopenia diabética em ratas pré-menopausadas.
Oportunamente, ao analisarmos as publicações científicas relacionadas à
participação do estresse oxidativo nas alterações ósseas associadas ao diabetes
mellitus, verificamos que o nosso estudo apresentou um perfil científico inovador em
relação à utilização de modelo diabético pré-menopausal, pois a grande maioria das
publicações envolve modelos menopausados após ooforectomia [6,7,8]. Além disso,
também mostrou-se diferenciado em relação à duração do período experimental,
120 dias sem administração de insulina, pois foi bastante superior aos demais
relatos previamente publicados na literatura científica [6,8].
Dessa maneira, com este estudo, nos foi possível promover uma importante
investigação experimental, além de contribuir para a promoção do enriquecimento
intelectual e científico do eixo temático abordado. Assim, com a publicação desta
investigação, vislumbramos um novo panorama científico para o nosso grupo de
pesquisa, possibilitando uma maior aplicação experimental do modelo animal
diabético pré-menopausal.
Este estudo também servirá como um subsídio importante nas novas
investigações que por ventura estejam sendo ou ainda serão desenvolvidas pelo
nosso grupo de pesquisa, incluindo estudos clínicos e a utilização de novos modelos
diabéticos experimentais. Dessa maneira, muito irá contribuir com o Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, e fortalecer amplamente a nossa base de pesquisa neste programa de pós-
graduação.
35
52
A realização deste projeto nos possibilitou uma importante ampliação do
conhecimento no âmbito das pesquisas acadêmicas e, conseqüentemente, nos
permitiu a obtenção da Titulação de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Saúde - PPGCSA/UFRN. Em adição, também proporcionou a minha
participação cada vez mais ativa na Base de Pesquisa da minha orientadora junto
ao PPGCSA/UFRN.
No curso das metas ainda a serem alcançadas existe o ingresso em uma
instituição de ensino superior federal como professor universitário. Além disso,
pleitear o post-doctoral no Brasil ou no exterior.
As realizações das diversas etapas deste estudo aconteceram de acordo com
o cumprimento do cronograma de atividades inicialmente propostas. A correta
delimitação de tempo, seguido do rigoroso cumprimento de cada prazo para o
desenvolvimento das etapas metodológicas foram fundamentais para o êxito da
pesquisa.
Com a realização deste estudo, foi reafirmada a minha vontade pessoal de
continuar desenvolvendo trabalhos científicos junto ao grupo de pesquisa
coordenado pelas Profas. Dras. Adriana Augusto de Rezende e Maria das Graças
de Almeida, bem como pelo Prof. Dr. José Brandão Neto. Assim, será possível a
realização de diversas investigações que contemplem estudos clínicos e/ou
experimentais relacionados ao diabetes mellitus, osteopenia diabética, estresse
oxidativo, defesas antioxidantes e o emprego de plantas hipoglicemiantes ou
antioxidantes.
Notoriamente, é evidente o nosso crescente interesse científico pelo uso
popular das plantas medicinais como alternativas farmacológicas eficazes no
tratamento das doenças e desordens crônicas, dentre elas o diabetes mellitus.
36
53
Assim, no nosso grupo de pesquisa, já estão sendo desenvolvidas etapas
importantes do cronograma de atividades pertencentes ao projeto de pesquisa
intitulado: “Estudo clínico com as folhas de Cissus sicyoides L. (insulina), como
alimento com propriedades de saúde no diabetes mellitus tipo 2: avaliação de
parâmetros densitométricos, moleculares e bioquímicos”.
O projeto visa avaliar o efeito do chá (infuso) das folhas de Cissus sicyoides
L., como alimento com propriedade de saúde, em pacientes menopausadas com
diabetes mellitus tipo 2. Para este fim, serão avaliados a densitometria óssea,
associada a marcadores moleculares e bioquímicos do metabolismo mineral e
ósseo, bem como do controle metabólico, durante o período de 365 dias.
Neste estudo clínico, denotamos um enriquecimento metodológico
contemplando diversos parâmetros, dentre os quais destacam-se as avaliações
dos polimorfismos dos genes RANKL; proteína 5 relacionada ao receptor de LDL;
IL-6 e TNF-.
No contexto acadêmico da graduação, eu pretendo lecionar, orientar bolsistas
de iniciação científica (PIBIC, voluntários, etc), orientar trabalhos de conclusão de
curso, bem como coordenar e/ou participar de projetos de pesquisa ou de extensão
com aprovação e/ou financiamento por órgãos de fomento (CNPq, Finep, etc.).
Em relação à pós-graduação, eu pretendo inicialmente desenvolver co-
orientações de mestrado junto as minhas orientadoras. Na seqüência natural dos
acontecimentos, também me inserir nas co-orientações de doutorado. Assim,
poderei obter as credenciais necessárias para a minha inserção no quadro efetivo
de orientadores do PPGCSA, nos níveis de mestrado e doutorado. Paralelamente,
também irei pleitear o ingresso em outros programas de pós-graduação existentes
na UFRN e em outras instituições de ensino superior. Além disso, eu também
37
54
desejo lecionar disciplinas obrigatórias ou eletivas que contemplem as exigências
curriculares destes programas de pós-graduação.
Dessa maneira, eu poderei desenvolver as atividades de ensino, pesquisa e
extensão, quando estas forem pertinentes nos níveis de graduação e/ou pós-
graduação.
Vislumbrando um universo científico promissor, eu pretendo constituir uma
base de pesquisa que englobe simultaneamente as doenças crônicas degenerativas
e as desordens hematológicas, pois representam importantes áreas do
conhecimento médico. Desse modo, objetivando desenvolver pesquisas clínicas
e/ou experimentais na intenção de colaborar na elucidação de mecanismos
fisiopatológicos ainda não completamente esclarecidos.
38
55
5- APÊNDICE
39
56
BRAZILIAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES
DECLARAÇÃO
Declaramos para os devidos fins que o trabalho: “Relationship between oxidative
stress and diabetic osteopenia in premenopausal rats” de autoria de Valéria
Morgiana Gualberto Duarte, Alanna de Sousa Rodrigues, Luciana Augusto de
Rezende, Ana Maria de Oliveira Ramos, Rodrigo Medeiros de Souza, Francisco
Paulo Freire Neto, Aldo da Cunha Medeiros, José Brandão Neto, Maria das Graças
Almeida e Adriana Augusto de Rezende, foi aceito para publicação no Brazilian
Journal of Pharmaceutical Sciences; CAPES/Qualis B3; e será publicado no vol. 46,
n.3, 2010.
São Paulo, 07 de junho de 2010
Leila Rangel de Carvalho Aranha
Executive Editor
40
57
O resumo intitulado: “Oxidative stress role in diabetic osteopenia”,
apresentado na forma de pôster, na XXXVI Annual Meeting of the Brazilian Society
for Biochemistry and Molecular Biology (SBBq) - 10
th
International Union of
Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) Conference: “Infectious Diseases
Biochemistry of Parasites, Vectors and Hosts - Salvador, Bahia, Brazil - May 21-25,
2007.
OXIDATIVE STRESS ROLE IN DIABETIC OSTEOPENIA
Lima, V.M.G.D.M.
1
, Ramos, A.M.O.
2
, Rezende, L.A.
3
, Rodrigues, A.S.
4
, Ururahy,
M.A.G.
4
, Brandão-Neto, J.
5
, Almeida, M.G.
4
, A.A. Rezende
4
1
Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPB, João Pessoa/PB;
2
Departamento
de Patologia Clínica, UFRN, Natal/RN;
3
Departamento de Química, UNAERP,
Ribeirão Preto/SP;
4
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, UFRN,
Natal/RN;
5
Departamento de Medicina Clínica, UFRN, Natal/RN.
Oxidative stress has been related to the onset and progression of diabetic
complications. This study aimed to evaluate oxidative stress condition influence in
diabetic osteopenia. In this way, female Wistar rats with regular estrous cycle were
randomly divided into two groups: control rats [n=15] and diabetic rats without insulin
treatment [n=15]. Diabetes was induced by alloxan injection and confirmed by
glycemia determination [250mg/dL]. Bone mineral density [BMD] was measured by
DEXA. Histomorphometry and bone biomechanical were also evaluated. Oxidant and
antioxidant parameters were measured in the animals’ brain. All the measurements
were done over a 120 days period after experimental diabetes onset. Results
revealed an about 2.5-fold increase in diabetic femoral trabecular distance when
compared to control. Conversely, trabecular thickness, bone trabecular volume and
maximum compressive force were reduced, 2.5-fold, 77% and 25%, respectively, in
diabetic. BMD in diabetic femur total and metadiaphyseal area were significantly
reduced. Lipid peroxidation indices, measured by malondialdehyde (MDA)
41
58
concentration, showed a significant increase in diabetic rats. However, antioxidant
defense system status, measured by glutathione (GSH) content, was significantly
reduced in diabetic when compared to control. Overall, these findings demonstrate
that oxidative stress may be related to diabetic osteopenia pathogenesis.
42
59
6. REFERÊNCIAS
1. Hamada Y, Fujii H, Fukagawa M. Role of oxidative stress in diabetic bone
disorder. Bone. 2009;45:S35-S38.
2. Brandao FR, Vicente EJ, Daltro CH, Sacramento M, Moreira A, Adan L. Bone
metabolism is linked to disease duration and metabolic control in type 1 diabetes
mellitus. Diabetes Res Clin Pr. 2007;78:334-339.
3. Wauquier F, Leotoing L, Coxan V, Guicheux J, Wittrant Y. Oxidative stress in
bone remodeling and disease. Trends Mol Med. 2009;15:468-477.
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ABSTRACT
The relationship between lipid peroxidation, antioxidant defense and diabetic
osteopenia remains unclear. This study evaluated the relationship between lipid
peroxidation index, antioxidant defense parameter and bone metabolism in a
premenopausal diabetic model by measurements such as thiobarbituric acid-reactive
substances concentration (TBARS) and reduced glutathione (GSH) content in brain
homogenates, histomorphometric analysis, biomechanical testing and bone mineral
density (BMD). Female Wistar rats with regular estrous cycle were divided into two
groups: Group 1: control rats (n = 15) and Group 2: diabetic rats (n = 15). Diabetes
mellitus was induced by alloxan and confirmed by glycemia 250 mg/dL. The
experimental period understood 1 and 5 after days induction and 45, 75 and 120
days after the installation of diabetes mellitus.The lipid peroxidation index, measured
by TBARS concentration, showed a significant increase (p<0.05) in diabetic animals
in comparison to animals control. However, the antioxidant parameter, measured by
GSH content, was significantly decrease (p<0.05) in diabetic animals.
Histomorphometric analysis showed a significant increase (p<0.05) in femoral
trabecular separation together with a significant decrease (p<0.05) in trabecular
thickness and reduced trabecular bone volume in diabetic rats. Moreover,
biomechanical testing and BMD values were significant decrease (p<0.05) in diabetic
group. Thus, our results demonstrated that increased lipid peroxidation and altered
antioxidant defense could be related to the development of oxidative stress and
diabetic osteopenia in premenopausal rats.
Uniterms: Oxidative stress. Lipid peroxidation. Diabetes mellitus. Diabetic
osteopenia/experimental study.
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