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Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Pós-graduação em Ciências Biológicas
Fisiologia e Farmacologia
PAPEL DOS RECEPTORES DE INOSITOL
1, 4, 5-TRISFOSFATO NA SECREÇÃO
BILIAR
Mateus Tavares Guerra
Belo Horizonte
Minas Gerais
2010
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Livros Grátis
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Mateus Tavares Guerra
PAPEL DOS RECEPTORES DE INOSITOL
1, 4, 5-TRISFOSFATO NA SECREÇÃO
BILIAR
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas – Fisiologia e Farmacologia, ICB-
UFMG, como requisito parcial à obtenção do título de
doutor
Orientadora: Dr
a
Maria de Fátima Leite
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
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Apoio financeiro
________________________________________________________________________
i
Este trabalho foi desenvolvido com auxilio das seguintes instituições de
fomento:
- Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
- Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Superior (CAPES)
- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
(FAPEMIG)
- Howard Hughes Medical Institute, (HHMI, EUA)
- National Institutes of Health (NIH, EUA) grants RO1 e PO1
________________________________________________________________________
ii
...Calma
Tudo está em calma
Deixe que o beijo dure
Deixe que o tempo cure
Deixe que a alma
Tenha a mesma idade
Que a idade do céu...
Jorge Dexler / Moska
Agradecimentos
________________________________________________________________________
iii
Aos meus pais, Graça e Chico e às minhas irmãs, Carol e Bel, por estarem
sempre ali à distancia de um abraço
A Romina per portare l'amore sereno che cercavo
À Viviane “Maria” pela generosidade e paciência ao longo destes nossos
anos de doutorado.
À Flávia Marques de Melo e Maria Jimena pela amizade e inspiração.
Às meninas do lab Patrícia Valério, Carla Jeane, Camila, Lídia, Rose e
Marina por agüentarem o meu humor nem sempre simpático
Ao Gilson Nogueira por segurar a barra burocrática e psicológica de todos
nós do lab
A todos em Roma, Dr. Marco Tripodi, Dr. Tonino Alonzi, Corina, Verônica,
Marco Corazzari, Gaia, Vicky, Alice Conigliaro, Claudio Cavallari e em
especial, Beatrice Conti por me “adotarem” durante minha temporada na
Città Eterna.
Agradecimentos
________________________________________________________________________
iv
Ao Dr. Michael Nathanson e membros do Nathanson’s Lab, Emma Kruglov,
Michael Fiedler e Laura Cruz por me acolherem durante meu segundo tempo
em Yale.
À Maria de Fátima Leite por ser minha professora, orientadora e zelosa
amiga.
Às Professoras Adelina Martha dos Reis, Maria José Campagnole e à
Celinha por deixarem a burocracia de fora destes anos de formação
científica.
Aos Professores Lígia Naves, Christopher Kushmerick e André Ricardo
Massensini pelos valiosos conselhos durante o exame de qualificação.
Ao Professor Oscar Bruna-Romero pela ajuda na purificação de adenovírus.
À Kathy Augustine pelo isolamento de hepatócitos e Al Menone pelo auxílio
nos experimentos de coleta de bile e fluxo biliar.
Índice
________________________________________________________________________
v
Índice
Lista de abreviaturas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Resumo
Abstract
Introdução
Sinalização de Ca
2+
Sinalização de Ca
2+
no fígado
Camundongos Knock out para InsP
3
R
Transportadores hepáticos e secreção biliar
Objetivos
Material e métodos
Resultados
Discussão
Conclusão
Referências bibliográficas
Produção bibliográfica
vi
vii
viii
ix
x
13
14
18
20
22
26
28
39
65
73
75
89
Lista de Abreviaturas
________________________________________________________________________
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh
AS
ATP
AVP
BAPTA
Bsep
Ca
2+
i
cAMP
cDNA
CMFDA
DAG
DsRed
GFP
HEPES
InsP
3
InsP
3
R
Mdr3
Mrp2
Ntcp
PIP2
PKA
PKC
PLC
RE
RyR
SDS
TIRFM
TLCA
TUDCA
Acetilcolina
Anti-senso
Adenosina trisfosfato
Arginina
8
-vasopressina
Ácido 1,2-bis(o-aminofenoxietano)-N,N,N',N'-tetraacético
Bomba exportadora de sais biliares
Cálcio intracelular
Adenosina monofosfato cíclica
Acído desoxiribonucléico complementar
Carboximetilfluoresceína
Diacilglicerol
Proteína fluorescente vermelha de Discosoma sp.
Proteína verde fluorescente
Ácido 1-etanosulfônico 4-(2-hidroxietil piperazina)
Inositol 1, 4, 5 trisfosfato
Receptor de Inositol 1, 4, 5 trisfosfato
Proteína de múltipla resistência 3
Proteína associada à múltipla resistência 2
Proteína co-transportadora de sódio e taurocolato
Fosfatidil inositol 4, 5 bisfosfato
Proteína cinase A
Proteína cinase C
Fosfolipase C
Retículo endoplasmático
Receptor de rianodina
Dodecilsulfato de sódio
Microscopia de reflexão interna total
Ácido taurolitocólico
Ácido tauroursodeoxicólico
Lista de Figuras
________________________________________________________________________
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura I: Mecanismo de formação de InsP
3
e liberação de Ca
2+
intracelular
Figura II: Localização dos transportadores envolvidos na captação e secreção de
ácidos biliares, bilirrubina e ânions orgânicos em hepatócitos
Figura 1: Localização de InsP
3
R2 em fatias de fígado de rato e distribuição do
retículo endoplasmático e estoques intracelulares de Ca
2+
em hepatócitos isolados.
Figura 2: Avaliação da eficiência e especificidade de anti-senso para InsP
3
Rs em
células AR4-2J
Figura 3: Sinalização de Ca
2+
em células AR4-2J
Figura 4: Análise da eficiência e especificidade dos anti-senso para InsP
3
Rs in vivo
Figura 5: Expressão de InsP
3
Rs em fígado de animais WT e InsP
3
R2 KO
Figura 6: Localização de InsP
3
Rs em fígados de camundongos WT e InsP
3
R2 KO
Figura 7: Sinalização de Ca
2+
em hepatócitos camundongos WT e InsP
3
R2 KO
Figura 8: Fluxo biliar em camundongos WT e InsP
3
R2 KO em modelo de infusão de
ácidos biliares
Figura 9: Expressão de Mrp2 em hepatócitos WT e InsP
3
R2 KO
Figura 10: Distribuição de Mrp2 em fígados de camundongos WT e InsP
3
R2 KO
Figura 11: Atividade de Mrp2 em culturas sanduíche de hepatócitos WT e InsP
3
R2
KO
Figura 12: : Localização de InsP3R2 e Mrp2 em culturas sanduíche de hepatócitos
Figura 13: Inserção de GFP-Mrp2 na membrana plasmática de células HepG2
Figura 14: Sinais de Ca
2+
induzidos por ATP em células HepG2
Figura 15: Biotinilação de proteínas de membrana e análise de expressão de Mrp2
16
23
41
43
44
46
48
49
50
53
55
56
57
59
60
62
64
Lista de Tabelas
________________________________________________________________________
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequências utilizadas para construção de anti-senso para as três
isoformas de InsP
3
R de rato
Tabela 2: Fluxo biliar e concentração sérica de bilirrubina basais em animais
WT e InsP
3
R2 KO
31
52
Resumo
________________________________________________________________________
ix
RESUMO
Sinais de Ca
2+
em hepatócitos dependem da atividade de InsP
3
R2, os quais se
localizam no pólo apical deste tipo celular. Acredita-se que a liberação de Ca
2+
polarizada
induzida por estes receptores controle diversas funções hepáticas, incluindo o fluxo biliar.
A atividade dos dois principais transportadores de solutos biliares presentes na
membrana apical, Mrp2 e Bsep, é regulada via reciclagem e reinserção na membrana
plasmática por exocitose. No presente trabalho, avaliou-se a contribuição dos sinais de
Ca
2+
mediados por InsP
3
R2 na regulação da atividade de Mrp2. Utilizou-se sequências
anti-senso para a reduzir a expressão de InsP
3
R2 tanto in vitro quanto in vivo. Além disso,
camundongos "knock out" para InsP
3
R2 foram utilizados para medidas de fluxo biliar em
condições basais e após infusão com ácidos biliares. Hepatócitos isolados foram
empregados para a caracterização da sinalização de Ca
2+
, bem como para estudos da
atividade de Mrp2 em cultura sanduíche. Utilizou-se ainda microscopia TIRF para o
monitoramento da inserção de GFP-Mrp2 na membrana plasmática de células HepG2.
Nossos resultados demonstram que: 1) As sequências anti-senso foram eficientes na
redução de expressão de InsP
3
R2; 2) hepatócitos InsP
3
R2 KO apresentam sinalização de
Ca
2+
deficiente, a qual está associada a uma redução do fluxo biliar em condições de
estresse hepático; 3) a ausência de InsP
3
R2 resulta em comprometimento da atividade
transportadora de Mrp2 e 4) a liberação de Ca
2+
via InsP
3
R2 é importante para a
mobilização de Mrp2 de um reservatório intracelular para a membrana plasmática. Em
resumo, demonstrou-se que os sinais de Ca
2+
dependentes de InsP
3
R2 são essenciais
para a regulação de curto prazo do fluxo biliar através da modulação da atividade e
localização de Mrp2.
Abstract
________________________________________________________________________
x
ABSTRACT
Ca
2+
signals in hepatocytes are mediated by InsP
3
R2, which localizes to the apical
pole and gives rise to a polarized release of Ca
2+
that is believed to regulate a variety of
liver functions, including bile flow. Specifically, Mrp2 and Bsep, the two major apical
transporters of bile solutes, activities are regulated by recycling and membrane insertion.
Here we have studied the contribution of InsP
3
R2-mediated Ca
2+
signaling to the
regulation of Mrp2 activity. We have used antisense oligonucleotides to reduce the
expression of InsP
3
R2 both in vitro and in vivo. Moreover, InsP
3
R2 KO mice were used to
study basal and bile acid-induced bile flow, Ca
2+
signaling in isolated hepatocytes, and
Mrp2 activity in hepatocyte sandwich culture. In addition, total internal reflection
microscopy of HepG2 expressing GFP-Mrp2 was used to monitor exocytic insertion of this
transporter into the plasma membrane. Our results demonstrate that: 1) Antisense
sequences are efficient in knocking down InsP
3
R2 expression; 2) InsP
3
R2 KO hepatocytes
have defective Ca
2+
signals, which are associate with reduced bile flow under stress
conditions; 3) Hepatocytes lacking InsP
3
R2 have impaired Mrp2 transport activity and 4)
InsP
3
R-mediated Ca
2+
signaling is important for mobilization of Mrp2 from an intracellular
vesicular pool to the plasma membrane. In summary, we demonstrated that InsP
3
R2-
induced Ca
2+
signals are essential regulators of bile flow via regulation of Mrp2 localization
and activity.
Introdução
________________________________________________________________________
13
INTRODUÇÃO
Introdução
________________________________________________________________________
14
INTRODUÇÃO
Sinalização de Ca
2+
O cálcio intracelular constitui um dos principais segundos-mensageiros
intracelulares (Berridge et al., 2003). A elevação transitória dos níveis citoplasmáticos de
Ca
2+
pode induzir a liberação de neurotransmissores, a contração muscular, a secreção
de enzimas digestivas pelas células acinares pancreáticas, além de modular respostas
celulares a princípio antagônicas como a proliferação celular (Whitaker and Patel, 1990) e
a apoptose (Orrenius et al., 2003).
A concentração intracelular de Ca
+2
([Ca
2+
]
i
), definida como a concentração basal
de Ca
2+
livre no citoplasma, é mantida em torno de 100 nM, enquanto a concentração
extracelular varia entre 1 e 2 mM (Rizzuto and Pozzan, 2006). Tal gradiente de
concentração é resultado da atividade de diversos canais, trocadores e bombas iônicas
localizados primariamente na membrana plasmática e na membrana do retículo
endoplasmático (RE), organela esta que constitui o principal estoque intracelular de Ca
2+
.
Na membrana plasmática estão localizados o trocador de Na
+
Ca
2+
(NCX) e a Ca
2+
ATPase (PMCA) os quais promovem a retirada do Ca
2+
do meio intracelular para o meio
extracelular. Já na membrana do RE está localizada a Ca
2+
ATPase do retículo sarco-
endplasmático (SERCA) cuja principal função é bombear íons Ca
2+
para o interior do RE
quando a concentração do mesmo encontra-se transitoriamente diminuída no
sarcoplasma. Há ainda a participação de mitocôndrias e lisosomos como organelas
acessórias na manutenção da [Ca
2+
]
i
(Csordas et al., 2006)
.
A elevação transitória da [Ca
2+
]
i
pode ocorrer tanto pelo influxo através da
membrana plasmática quanto pela liberação dos estoques de Ca
2+
presentes no RE e em
menor extensão em lisosomos. O primeiro destes mecanismos é mediado principalmente
Introdução
________________________________________________________________________
15
por canais de Ca
2+
sensíveis à voltagem, canais de Ca
2+
controlados por ligante ou pelos
canais iônicos da famílias Orai (canais ativados pela depleção dos estoques intracelulares
de Ca
2+
) e TRPC (transient receptor potential cation) (Ramsey et al., 2006). O segundo
mecanismo por sua vez é mediado por três famílias de canais de Ca
2+
intracelulares: os
receptores de rianodina (RyR), os receptores de inositol 1,4,5-trisfosfato (InsP
3
R) e os
canais de dois poros (TPC) (Calcraft et al., 2009; Clapham, 2007).
A família dos receptores de rianodida é constituída por três isoformas (RyR1, RyR2
e RyR3). Inicialmente descritos em células musculares estriadas esqueléticas e
cardíacas, estes canais de Ca
2+
localizam-se na membrana do RE e são responsáveis
pelo fenômeno conhecido como liberação de Ca
2+
induzida por Ca
2+
(CICR) essencial
para o processo de contração de células musculares esqueléticas (Berridge, 1997). Os
canais de pois poros por sua vez, localizam-se na membrana de lisosomos e são ativados
pela nicotinamida ácida dinucleotídeo fosfato (NAADP) que induz uma liberação
localizada de Ca
2+
cuja função é a de sensibilizar os estoques de Ca
2+
presentes no
interior do RE (Calcraft et al., 2009).
A terceira família de canais de Ca
2+
intracelulares é constituída pelos InsP
3
Rs, dos
quais foram descritas três isoformas (InsP
3
R1, InsP
3
R2 e InsP
3
R3). Assim como os RyRs,
InsP
3
Rs localizam-se na membrana do retículo endoplasmático (Taylor et al., 2009) e
quando ativados promovem a saída de Ca
2+
desta organela. No entanto, podem também
ocorrer na membrana plasmática, porém em densidades extremamente baixas e
detectáveis apenas raramente por técnicas de eletrofisiologia (Dellis et al., 2006). Estes
receptores apresentam distribuição tecidual difusa sendo encontrados em virtualmente
qualquer tipo celular. Além disso, um mesmo tipo celular pode expressar mais de uma
isoforma destes canais. A abertura destes canais é induzida pela ligação de InsP
3
, o qual
é formado a partir da hidrólise de fosfatidilinositol bisfosfato (PIP2) pela ação
Introdução
________________________________________________________________________
16
da enzima fosfolipase C. Esta por sua vez é ativada, via proteína G, pela ligação de um
hormônio ao seu receptor como ilustrado na figura 1.
Figura I: Representação esquemática da sinalização de Ca
2+
induzida por InsP
3
. A
ligação de um hormônio ao seu receptor de membrana ativa a proteína G correspondente,
que por sua vez ativa uma isoforma de PLC, que hidrolisa fosfolípideos de membrana
(PIP2) em diacilglicerol (DAG) e InsP
3
. InsP
3
então difunde-se para a membrana do
retículo endoplasmático, onde se liga a uma das isoformas do InsP
3
R promovendo assim
a liberação de Ca
2+
do interior do retículo para o citosol. Modificado de Ca
2+
signaling in
the liver (Leite et al., 2009).
A atividade dos InsP
3
Rs é modulada pelos próprios íons Ca
2+
, por adenosina
trisfosfato, por fosforilação via proteínas cinase A (Yule et al., 2003) e C (Ferris et al.,
1991) e também por glicosilação em resíduos de serina e treonina (Gibson and Ehrlich,
2008). Além disso, interações de InsP
3
Rs com diversas proteínas, seja na face
citoplasmática seja na face luminal destes receptores (Ando et al., 2006; Schlecker et al.,
2006; Thrower et al., 2003; van Rossum et al., 2006) contribuem para a regulação da
Introdução
________________________________________________________________________
17
atividade destes canais. No entanto, cada isoforma apresenta particularidades do ponto
de vista regulatório. Quando estudados isoladamente em membranas lipídicas artificiais,
os InsP
3
R3 têm sua atividade potencializada por concentrações crescentes de Ca
2+
(Hagar et al., 1998) diferentemente do que ocorre para InsP
3
R1 que, em concentrações a
partir de 2 µM (Ramos-Franco et al., 1998), apresentam redução de atividade. Um
comportamento semelhante é exibido por InsP
3
R2 recombinantes (Ramos-Franco et al.,
2000).
A sinalização de Ca
2+
observada nos diversos tipos celulares depende não apenas
das propriedades biofísicas de cada isoforma de InsP
3
R mas também da localização
subcelular de cada uma delas. Em células HepG2 por exemplo, demonstrou-se que sinais
de Ca
2+
nucleares podem ser induzidos por estimulação com baixas concentrações de
ATP, efeito este que foi atribuído à maior expressão relativa de InsP
3
R2 no núcleo (Leite
et al., 2003).
As propriedades biofísicas associadas à distribuição subcelular de cada uma das
isoformas determina padrões espaciais e temporais dos sinais de Ca
2+
como: ondas,
oscilações e aumentos localizados. Estes padrões temporais e espaciais por sua vez
determinam o resultado fisiológico dos sinais de Ca
2+
. Empregando metodologias
semelhantes, Li e cols. e Dolmetsch e cols. (Dolmetsch et al., 1997; Li et al., 1998)
demonstraram que a freqüência das oscilações de Ca
2+
determina a eficiência de
transcrição gênica e a secreção de interleucina 2 em linfócitos. Já quando a elevação
ocorre de forma global e prolongada, Ca
2+
pode induzir morte celular neuronal, como
observada em decorrência de intoxicação glutamatérgica pós-isquemia (Berridge et al.,
1998). Outro exemplo interessante da influência dos diferentes padrões de Ca
2+
nas
respostas celulares é observado em células acinares pancreáticas. A elevação de Ca
2+
restrita à porção apical destas células é suficiente para promover a exo-
Introdução
________________________________________________________________________
18
citose dos grânulos de zimogênio (Maruyama et al., 1993). Já em células acinares de
glândulas parótidas, elevações de Ca
2+
globais, em forma de uma onda que migra do pólo
apical para o basolateral, são responsáveis pela ativação de canais de cloreto (Cl
-
)
basolaterais e canais de Ca
2+
apicais que controlam a secreção de íons e eletrólitos
formadores da saliva (Giovannucci et al., 2002). Sabe-se também que a fusão de
vesículas sinápticas e liberação de neurotransmissores é dependente de uma elevação
localizada de Ca
2+
restrita a membrana pré-sináptica (Sudhof and Rothman, 2009).
Medidas realizadas com indicadores fluorescentes de Ca
2+
demonstram que a
despolarização neuronal eleve a concentração global deste íon para cerca de centenas
de nanomolar, no entanto estima-se que o influxo de Ca
2+
mediado pela abertura de
canais de Ca
2+
dependentes de voltagem gere concentrações de Ca
2+
da ordem de
milimolar, nas proximidades da membrana (Augustine et al., 2003). Esta elevação
localizada origina um micro domínio de alta concentração de Ca
2+
que é então capaz de
induzir a fusão de vesículas com a membrana pré-sináptica (Paddock et al., 2008).
Sinalização de Ca
2+
no fígado
Hepatócitos constituem cerca de 95% do parênquima hepático, que dentre outros
tipos celulares também é formado por colangiócitos (epitélio de revestimento dos ductos
biliares), células de Kupfer e fibroblastos portais. Hepatócitos maduros são células
epiteliais polarizadas que apresentam membranas apical ou canalicular e basolateral ou
sinusoidal separadas por junções de oclusão. Como ocorre em outros tecidos epiteliais
polarizados, o complemento de proteínas presente na membrana apical é diverso daquele
encontrado na membrana basolateral. A distribuição de InsP
3
Rs em hepatócitos também
apresenta certa polarização visto que os InsP
3
R2, que constituem cerca de 80% do total
Introdução
________________________________________________________________________
19
(Wojcikiewicz, 1995), concentram-se próximos à membrana apical enquanto que os
InsP
3
R1 (20% restantes) distribuem-se difusamente pelo citoplasma (Hirata et al., 2002b).
Os receptores de Rianodina não são expressos em hepatócitos, embora uma forma
truncada de RyR1 que não é capaz de iniciar sinais de Ca
2+
tenha sido identificada
recentemente (Pierobon et al., 2006). Assim como observado em outros tipos celulares
(Leite et al., 2002), a distribuição característica de InsP
3
Rs em hepatócitos determina os
padrões espaciais da sinalização de Ca
2+
neste tipo celular. Quando estimulados com
vasopressina (1 nM), por exemplo, hepatócitos exibem uma onda de Ca
2+
que migra do
pólo apical para o basolateral (Hernandez et al., 2007). Assim, a região apical de
hepatócitos funciona como zona iniciadora dos sinais de Ca
2+
de maneira semelhante ao
que ocorre em células acinares pancreáticas, nas quais o pólo apical concentra os
InsP
3
R3 e inicia os sinais de Ca
2+
(Ito et al., 1997).
Embora não se conheçam os mecanismos responsáveis pelo endereçamento de
InsP
3
R2 para a região pericanalicular de hepatócitos (Sehgal et al., 2005), sabe-se que
lipid rafts são importantes para a manutenção de InsP
3
R2 nesta porção do retículo, já que
o tratamento com β−ciclodextrina redistribui estes canais pelo interior do hepatócito com
conseqüente perda do padrão de sinalização apical para basolateral (Nagata et al., 2007).
Foi demonstrado que no fígado, sinais de Ca
2+
intracelulares controlam funções
como a utilização de glicose pelos hepatócitos (Blackmore et al., 1986), a secreção de
bicarbonato pelo epitélio dos ductos biliares (Fiorotto et al., 2007; Minagawa et al., 2007),
a proliferação de células hepáticas tumorais (Rodrigues et al., 2007), além da secreção de
bile. Os efeitos da sinalização de Ca
2+
sobre o fluxo biliar são contraditórios e os dados da
literatura apresentam uma dicotomia entre o que é observado em hepatócitos isolados e o
que ocorre no órgão intacto. Por um lado,
Introdução
________________________________________________________________________
20
Ca
2+
estimula a exocitose em hepatócitos (Bruck et al., 1994) porém, em fígados isolados,
a perfusão de vasopressina ou A23187 reduze o fluxo biliar (Nathanson et al., 1992).
Além disso, demonstrou-se que o único fármaco utilizado clinicamente para tratamento de
patologias colestáticas, o ácido ursodeoxicólico (UDCA), promove aumento do fluxo biliar,
ao menos parcialmente, via mobilização de Ca
2+
(Beuers et al., 1993b).
Ca
2+
intracelular também regula a atividade secretora das células do epitélio biliar,
os colangiócitos. Este tipo celular é essencial para a alcalinização e regulação do volume
final da bile (Strazzabosco, 1997), através da secreção de íons bicarbonato e cloreto. A
secreção de ânions Cl
-
se dá por dois mecanismos complementares: 1) efluxo mediado
pelo regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e 2) efluxo
mediado por canais de Cl
-
dependentes de Ca
2+
. O gradiente de Cl
-
assim formado entre o
interior do ducto biliar e o citosol dos colangiócitos constitui a força motriz para a troca de
Cl
-
por HCO
3
-
via trocador de ânions (AE2) (Alpini et al., 2002). A liberação de Ca
2+
induzida por acetilcolina ou ATP, aumenta a concentração de HCO
3
-
na secreção dos
colangiócitos, o que demonstra que o Ca
2+
i
pode induzir atividade colerética.
Colangiócitos apresentam todas as três isoformas de InsP
3
R (Hirata et al., 2002a) e sua
expressão diminui significativamente em diferentes modelos animais de colestase ou em
patologias humanas do ducto biliar como a cirrose biliar primária e a colangite
esclerosante primária (Shibao et al., 2003). Assim a participação da sinalização de Ca
2+
mediada por diferentes isoformas de InsP
3
R na formação de bile envolve ações tanto em
hepatócitos quanto em colangiócitos.
Camundongos Knock out para InsP
3
R
Linhagens de camundongos knock out (KO) para as três isoformas de InsP
3
R
foram geradas visando individualizar o papel fisiológico de cada uma destas isoformas.
Em 1996, Matsumoto e colaboradores publicaram os primeiros resultados obtidos em
Introdução
________________________________________________________________________
21
animais KO para InsP
3
R1 (Matsumoto et al., 1996). Demonstrou-se que a presença de
InsP
3
R1 é importante para o desenvolvimento embrionário visto que a freqüência de
animais KO no décimo dia pós-natal era de apenas 5.5%. Além disso, tanto peso
corporal quanto o peso do cerébro destes animais KO eram 50% e 40% daquele
observado nos animais selvagens e ainda, os animais KO que sobreviviam até o vigésimo
dia pós-natal apresentavam sinais de epilepsia, incluindo crises tónico-clônicas. As
possíveis implicações da ausência de InsP
3
R1 na função hepática não foram avaliadas
neste modelo animal.
Recentemente, dois grupos desenvolveram camundongos KO para InsP
3
R2
(Futatsugi et al., 2005; Li et al., 2005). Li e colaboradores avaliaram as implicações da
ausência de InsP
3
R2 na patofisiologia da arrtimia cardíaca induzida por endotelina, visto
que esta é a isoforma predominante em cardiomiócitos atriais e parece estar envolvida no
fenômeno de excitação-transcrição. Os autores demonstraram que a ausência de
InsP
3
R2 previne a liberação espontânea de Ca
2+
induzida pela endotelina, a qual
determina padrões eletrofisiológicos típicos de arrtimia. Futatsugi e colaboradores por sua
vez, avaliaram a sinalização de Ca
2+
e a atividade secretória de glândulas salivares e
pâncreas exócrino em animais KO para InsP
3
R2 ou InsP
3
R3 e em camundongos KO para
ambas as isoformas. Os autores observaram liberação de Ca
2+
diminuída e secreção
deficitária de enzimas digestivas nos dois órgãos analisados apenas nos animais duplo
KO, o que explica a incapacidade destes animais em ganhar peso após o desmame.
Estas alterações não foram observadas seja em camundongos
KO InsP
3
R2 ou InsP
3
R3. Os autores concluiram então que cada uma destas isoformas
isoladamentes não é essencial tanto para o desenvolvimento embrionário quanto para o
pós-natal. Em ambos os trabalhos, a função hepática não foi avaliada em detalhe.
Introdução
________________________________________________________________________
22
Transportadores hepáticos e secreção biliar
A secreção de solutos formadores da bile constitui uma das funções essenciais dos
hepatócitos. A bile é formada por uma mistura complexa de sais biliares, bilirrubina,
ânions orgânicos sulfatados ou conjugados a ácido glicurônico e fosfolipídios. E, como
descrito na seção anterior, tanto o volume quanto o pH da bile são modificados
posteriormente pelo epitélio biliar (Pusl and Nathanson, 2004).
O metabolismo e secreção de ácidos biliares ocorre em 4 etapas: 1) a captação via
NTCP (polipeptídeo co-transportador de Na
+
/taurocolato) ou OATPb1 (polipeptídeo
transportador de ânion orgânicos); 2) a hidroxilação por CYP3A, ou metabolismo primário;
3) a conjugação a sulfatos ou glicoronato, coletivamente denominadas metabolismo
secundário e 4) a excreção através da proteína associada a múltipla resistência 3 (Mrp3)
na membrana sinusoidal ou através da bomba de exportação de sais biliares (Bsep) na
membrana apical (Boyer, 2005). Este transportador apresenta distribuição tecidual restrita
ao fígado e mutações em seu gene são o fator etiológico da colestase intra-hepática
congênita progressiva do tipo 2 (PFIC2) (Jansen et al., 1999). Esta patologia é geralmente
diagnosticada na infância e caracteriza-se por icterícia, colestase e prurido intenso,
podendo evoluir para falência hepática.
Já a bilirrubina e ânions orgânicos sulfatados ou conjugados a ácido glicurônico
são secretados para o interior do canalículo biliar via transporte ativo mediado pela
proteína associada a resistência a múltiplas drogas 2 (Mrp2) (Buchler et al., 1996). Em
humanos, a síndrome de Dubin-Johnson é causada por mutações no gene codificadorde
Mrp2 que resultam na incapacidade de secreção de bilirrubina pelos hepatócitos com
conseqüente desenvolvimento de hiperbilirrubinemia (Kartenbeck et al., 1996). Uma
apresentação semelhante também é observada em ratos Wistar TR
-
(Kitamura et al.,
1990) e Sprague Dawley Eisai (Takikawa et al., 1991), nos quais a função de Mrp2
Introdução
________________________________________________________________________
23
encontra-se diminuída. Outro transportador presente na membrana apical é formado pela
proteína de múltipla resistência (Mdr3) que promove a secreção de fosfolipídios (Crawford
et al., 1997). A figura II apresenta uma visão esquemática da localização dos principais
transportadores de solutos formadores da bile em hepatócitos.
Figura II: Representação esquemática simplificada da localização e atividade dos
transportadores envolvidos na captação e secreção de ácidos biliares (AB
-
), bilirrubina e
ânions orgânicos (AO
-
) em hepatócitos. Adaptado de (Wolkoff and Cohen, 2003).
A secreção de bile pode ser dividida em dois componentes: 1) a fração dependente
de ácidos biliares e portanto diretamente ligada a atividade de Bsep e 2) a fração
independente de ácidos biliares, diretamente dependente da função de Mrp2 (Ballatori
and Truong, 1989). A regulação de ambos transportadores é complexa e envolve tanto
mecanismos transcricionais quanto pós-transcricionais. Dentre os fatores pós-
trancricionais podemos destacar a fosforilação (Wimmer et al., 2008), a degradação
protéica (Jones et al., 2005) e o tráfego intracelular. Este último parece estar envolvido
tanto em repostas fisiológicas, visando atender às variações na demanda por bile, quanto
em eventos patológicos, visto que em diferentes patologias do fígado (Trauner et al.,
Introdução
________________________________________________________________________
24
1997) que se manifestam com redução marcante do fluxo biliar, e em diferentes modelos
animais de colestase (Crocenzi et al., 2003; Kubitz et al., 1999; Mottino et al., 2002),
ocorre internalização tanto de Bsep quanto de Mrp2. Empregando microscopia eletrônica
de transmissão, Gerloff e colaboradores demonstraram a presença de Bsep não apenas
na membrana apical mas também em vesículas e estruturas semelhantes a vacúolos
próximas à membrana apical de hepatócitos de rato (Gerloff et al., 1998). Posteriormente,
estudos utilizando marcação metabólica com metionina marcada com S
35
e fracionamento
celular de hepatócitos de rato demonstraram que após a saída do complexo de Golgi,
Bsep é encontrado na membrana apical após 2 horas e neste intervalo, o transportador
pode ser detectado em uma fração endosomal (Kipp et al., 2001). Além disso, utilizando a
linhagem celular hepática polarizada WIF-B9 e expressão heteróloga de Bsep em fusão
com a proteína amarela fluorescente (YFP), Wakabayashi e colaboradores demonstraram
que este transportador se encontra em contínuo processo de reciclagem entre a
membrana apical e estruturas túbulo-vesiculares intracelulares (Wakabayashi et al.,
2004).
A localização de Mrp2 por sua vez foi estudada principalmente em pares de
hepatócitos de rato em cultura de curta duração. Após o isolamento destas células, Mrp2
se redistribui para o interior do hepatócito e espontaneamente (aproximadamente 2 horas)
retorna à membrana apical (Roelofsen et al., 1998). Este processo é acelerado por
tratamento com tapsigargina, composto que promove esvaziamento do conteúdo de Ca
2+
do RE e sua conseqüente liberação para o citosol, ou bloqueado tanto por tamponamento
de Ca
2+
intracelular com BAPTA/AM quanto por tratamento com o inibidor farmacológico
de calmodulina W7 (Roma et al., 2000). Assim, a liberação de Ca
2+
parece induzir a
reinserção de Mrp2 na membrana plasmática. No entanto, a ativação de isoformas
convencionais de PKC (dependentes de Ca
2+
) promove redução do fluxo biliar e parece
Introdução
________________________________________________________________________
25
mediar a internalização de Mrp2 induzida pelo agente colestático 17β-estradiol (Crocenzi
et al., 2008). Dessa maneira, o papel do Ca
2+
intracelular na regulação do tráfego de
transportadores apicais de hepatócitos ainda não foi esclarecido.
Outro segundo mensageiro envolvido na reinserção de Mrp2 na membrana apical
de hepatócitos é o AMP cíclico (Roma et al., 2008). Em hepatócitos de rato, a elevação
de cAMP, via ativação farmacológica da adenilato ciclase (Roelofsen et al., 1998), acelera
a inserção espontânea de Mrp2 na membrana plasmática (Boyer and Soroka, 1995). De
maneira análoga, tanto a injeção endovenosa de dibutirato de cAMP (dB-cAMP) em ratos
(Gatmaitan et al., 1997), quanto a perfusão desta droga em fígados de ratos isolados
(Misra et al., 2003), promovem inserção de Mrp2 e Bsep (Kipp et al., 2001) na membrana
apical e consequente aumento do fluxo biliar. A via de fosfatidil inositol trisfosfato cinase
(PI3K) é um dos alvos de cAMP já que o tratamento de hepatócitos com o inibidor
Wortmanina previne a mobilização de Mrp2 para a membrana plasmática induzida por
cAMP (Schonhoff et al., 2008).
Objetivo
________________________________________________________________________
26
OBJETIVO
Objetivo
________________________________________________________________________
27
OBJETIVO
Geral:
Investigar a contribuição do Ca
2+
liberado pelo InsP
3
R2 na regulação da atividade do
transportador de ânions orgânicos Mrp2 em hepatócitos e as possíveis implicações para a
secreção biliar.
Específicos:
1) Avaliar a eficiência de sequências anti-senso para redução da expressão de InsP
3
R2
tanto in vitro quanto in vivo, e o impacto deste silenciamento na sinalização de Ca
2+
intracelular.
2) Avaliar o fluxo biliar em animais "knock out" para InsP
3
R2
3) Avaliar a atividade de Mrp2 em hepatócitos isolados de camundongos InsP
3
R2 KO.
4) Avaliar o possível involvimento dos sinais de Ca2+ intracelulares na inserção de Mrp2
na membrana plasmática.
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
28
MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
29
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Ratos Holtzmann machos de 10 semanas foram utilizados para a avaliação da
eficiência de construções anti-senso para os InsP
3
R1 e InsP
3
R2 in vivo. Camundongos
machos de cerca de 8 semanas Swiss black (Taconic Laboratories) e “knock out” para
InsP
3
R2, gentilmente cedidos pelo Dr. Ju Chen (University of California, San Diego, EUA)
foram utilizados para isolamento de hepatócitos, medidas de fluxo biliar e obtenção de
soro para mensuração de bilirrubina sérica. Os animais foram mantidos em ciclo de 12/12
horas de luz e com acesso livre à ração e água. Todos os procedimentos aqui descritos
foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Federal de Minas Gerais (CETEA, UFMG) e pelo “Institutional Animal Care and Use
Committee” da Yale University (IACUC).
Linhagens celulares
Células AR4-2J, originadas de pancreatoma de rato, células RIN-m5F, isoladas de
insulinoma de ratos e células HepG2, derivadas de hepatocarcinoma humano e células
HEK 293 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em
meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (GIBCO), 100 unidades/mL de
Penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina (GIBCO) a 37
o
C em atmosfera umidificada
contendo 5% de CO
2
.
Construção de sondas anti-senso para as diferentes isoformas de InsP
3
R
RNA total de cérebro, fígado de ratos e de células RIN-m5F foi isolado segundo as
instruções do o kit RNeasy (Qiagen, EUA) e utilizado para a síntese de DNA
complementar
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
30
(cDNA) empregando-se oligo(d)T de acordo com protocolo do kit SuperScript II
(Invitrogen, EUA). Três sequências anti-senso específicas de cerca de 200 pares de base
para cada uma das isoformas de InsP
3
R de rato foram selecionadas considerando-se
regiões de baixa homologia entre as diferentes isoformas. A tabela 1 contêm as regiões
selecionadas para cada isoforma de InsP
3
R, as seqüência dos primers utilizados para
clonagem destes segmentos em orientação anti-senso, a extensão de cada segmento e o
tecido/célula de origem do cDNA empregado como molde para cada uma das isoformas.
Todas as sequências foram amplificadas por reação em cadeia da polimerase (PCR), a
qual introduziu sítios de restrição para as enzimas XbaI e HindIII nas extremidades 5’ e 3’
respectivamente. Após digestão e purificação, os fragmentos foram ligados no plasmídeo
pCRII (Invitrogen, EUA) entre os sítios para XbaI e HindIII. A identidade dos clones foi
confirmada por sequenciamento automatizado.
Construção de adenovírus recombinantes
Uma vez clonadas no vetor pCRII, as sequências anti-senso para InsP
3
R1 (AS1),
InsP
3
R2 (AS2) e InsP
3
R3 (AS3) foram amplificadas e sub-clonadas, em orientação anti-
senso, no vetor de transição pCMVPLPASR entre os sítios de restrição HindIII e XbaI.
Após confirmação por seqüenciamento, os plasmídeos resultantes foram co-transfectados
com o plasmídeo pJM17 em células HEK-293 utilizando-se o método de precipitação com
fosfato de cálcio. Esta etapa promove a recombinação homóloga responsável pela
geração dos adenovírus sorotipo 5 recombinantes que expressam as três diferentes
sequências anti-senso e pode ser visualizada pela formação de placas de lise em
monocamada de células HEK 293. A formação de partículas virais positivas, contento as
sequências anti-senso na orientação correta, foi confirmada por reação de PCR. Estas
partículas virais foram amplificadas em células HEK 293 e em seguida purificadas em
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
31
gradiente de CsCl e dialisadas em membrana de 10.000 daltons submersa em solução de
Tris 10 mM.
Utilizou-se o Adeno-X Rapid Titer Kit (Clontech, EUA) para obtenção da
concentração dos vírus purificados que está expressa em unidades formadoras de placa
por mililitro (pfu/mL).
Tabela 1: Sequências utilizadas para construção de anti-senso para as três
isoformas de InsP
3
R de rato. Os nucleotídeos em letras minúsculas denotam os
sítios de restrição.
Nome
Primer direto (5’-3’)
Primer inverso (5’-3’)
Extensão
AS1
aagctttACATCTGCAGGGCCTGTAACAA
ctagaGCAGTGGTAAACTCGGAACACG
196 pb
AS2
agctttTTCTCAGCCCTCCTTTGGGTAG
tctagaTTCCCACAAAACTCACCAGGA
199 pb
AS3
aagctttTGTGGGGTAGCATCTCCTTCAA
tctagaGAAGGACCAGTGCCACAATGAG
203 pb
Cultura sanduíche de hepatócitos
Hepatócitos foram isolados na Cell Isolation Core Facility (Liver Center, Yale
School of Medicine) por perfusão com colagenase B conforme descrito por Graf et al (Graf
and Boyer, 1990). Hepatócitos em suspensão foram contados e plaqueados em lamínulas
de 22x22 mm previamente recobertas com colágeno I de rato. Duas horas após o
plaqueamento, as células foram cobertas com uma segunda camada de solução de
colágeno I de rato (concentração final 1mg/mL) e mantidas por 24 horas em meio
William’s E suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 mM Hepes, 2 mM L-
glutamina, 100 µg/mL Gentamicina, 250 µM Dexametasona, 400 ng/mL Insulina bovina e
100 mM de dextrose. No dia seguinte o meio de cultura era substituído por meio William’s
E sem glicose. Os hepatócitos foram utilizados entre 4 a 5 dias após o isolamento.
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
32
Imunofluorescência em fatias de fígado de rato
Ratos Holtzmann foram anestesiados por inalação de mistura de isoflurano (5%
v/v) e oxigênio (95% v/v) e submetidos a laparotomia e canulação da veia porta, pela qual
foi perfundida solução de tampão fosfato (PBS). Em seguida, os fígados foram removidos,
cortados em cubos de aproximadamente 10 mm, os quais foram incluídos em solução
Tissue Tek (Sakura Finetek, EUA) e congelados em nitrogênio liquido. Os blocos foram
então seccionados em criostato (fatias de cerca de 6 µM) e armazenadas a -80
o
C. Para a
realização de imunofluorescência as fatias foram fixadas em acetona (-20
o
C) por 10
minutos e lavadas em PBS. Sítios de ligação não especifica foram bloqueados com
solução de PBS contendo 10% (v/v) de soro normal de cabra (NGS) e 1% (p/v) de
albumina bovina (BSA) por 1 hora a temperatura ambiente. Em seguida as fatias foram
incubadas overnight a 4
o
C com solução de PBS/1%BSA contendo os seguintes
anticorpos: monoclonal anti-Mrp2 (Alexis Biochemcials, EUA) diluído 1:100 e policlonal
anti-InsP
3
R2 (doado pelo Dr. Richard J Wojcikiewicz, State University of New York, EUA)
diluído 1:10. As fatias foram então lavadas em PBS e incubadas por 2 horas a
temperatura ambiente com solução contendo Rodamina Faloidin (Invitrogen, EUA),
diluída 1:200, para detecção de actina filamentosa; e anticorpos anti-camundongo
conjugado a Alexa Fluor 488 e anti-coelho conjugado a Alexa Fluor 647. Apos lavagem
adicional em PBS as laminas foram imersas em solução de montagem Hydromount
(National Diagnostics, EUA) com lamínulas numero 1.5 de 22x40 mm.
Visualização do reticulo endoplasmático em hepatócitos de rato isolados
Hepatócitos de rato, isolados como descrito anteriormente, foram plaqueados em
placas de 6 poços (1,0x10
6
células/poço) contendo lamínulas de vidro previamente
cobertas com Cell Tak (Becton Dickinson, EUA) em meio Leibovitz L15 contendo 10% de
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
33
soro fetal bovino, 100 unidades/mL de Penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina. Apos 2
horas de incubação com a 37
o
C em atmosfera umidificada, as células foram incubadas
por 30 minutos em meio L15 suplementado com 100 nM do marcador fluorescente para
reticulo endoplasmático ER-Traker (Invitrogen, EUA). O meio de cultura foi então
substituído por solução salina contendo (em mM): NaCl 130; KCl 5; MgSO
4
1; KH
2
PO
4
1,2; C
8
H
18
N
2
O
4
S (Hepes) 19,7; CaCl
2
1.25; e as lamínulas transferidas para uma câmara
de perfusão, a qual foi montada na platina de um microscópio confocal (BioRad MRC
1024) acoplado a um laser de dois fótons de Titanio-Safira – Ti:S (Spectra Physics, EUA).
O laser Ti:S foi ajustado para um comprimento de onda de 790 nm para excitação do
marcador fluorescente, cuja emissão foi detectada por fotomultiplicadores externos entre
500 e 540 nm. A microscopia de dois fótons foi utilizada como alternativa à microscopia
de fluorescência com iluminação por laser ultra-violeta (UV) pois a primeira permite a
excitação eficiente de fluoróforos na região do UV sem a redução acentuada de
fluorescência por "photobleaching" típica da segunda.
Para a visualização dos estoques intracelulares de Ca
2+
, hepatócitos isolados de
rato foram plaqueados como descrito acima e incubados com a sonda fluorescente de
Ca
2+
de baixa afinidade Mag-Fluo4/AM por 1 hora a 37
o
C. Utilizando estas condições de
carregamento, o marcador tende a se acumular no interior de organelas e, uma vez que o
mesmo apresenta um coeficiente de dissociação do Ca
2+
de cerca de 22 µM, sua
fluorescência é mais intensa em regiões de alta concentração de Ca
2+
no intracelular
como o interior do retículo endoplasmático (Echevarria et al., 2003). Após este período de
incubação, as células foram observadas por microscopia confocal (Zeiss LSM 510)
utilizando-se o comprimento de onda de 488 nm para a excitação do marcador
fluorescente, sendo a emissão coletada entre 505 e 530 nm.
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
34
Medidas de Ca
2+
intracelular por microscopia de fluorescência
Para as medidas de liberação de Ca
2+
intracelular, células HepG2 foram
plaqueadas em lamínulas de 22x22 mm dois dias antes de serem transferidas para meio
L15 e incubadas com 6 µM de Fluo-4/AM por 30 minutos a 37
o
C. As lamínulas eram
então transferidas para a câmara de perfusão e montadas na platina de um microscópio
confocal Zeiss LSM 510. Utilizou-se o comprimento de onda de excitação de 488 nm
proveniente do laser de Argônio acoplado ao microscópio. A fluorescência emitida foi
coletada por fotomultiplicadores dotados de filtros cobrindo a região do espectro entre 505
a 550 nm. Após perfusão por cerca de 1 minuto com tampão HEPES contendo 0.1% de
BSA, iniciava-se a perfusão de com o mesmo tampão contendo ATP 100 µM. Em
determinados experimentos, as células foram pré-incubadas por 30 minutos a 37
o
C com
os seguintes compostos:
1) BAPTA-AM (agente quelante do Ca
2+
intracelular): 50 µM
2) Xestospongin C (bloqueador não-seletivo dos InsP
3
Rs): 1 µM
3) U73122 (bloqueador da fosfolipase C): 10 µM.
Os valores de fluorescência de fluo-4, obtidos após seleção de regiões de interesse
correspondentes estão expressos como porcentagem de variação de fluorescência (%∆F)
sobre a fluorescência basal (F
o
), de acordo com a fórmula: ∆F/F
o
x100%. O mesmo
protocolo foi utilizado em células AR4-2J porém as estas foram plaqueadas com três dias
de antecedência e infectadas com os adenovirus recombinantes (100 MOI) para
expressão de ASI, ASII ou ASIII, 24 horas após o plaqueamento.
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
35
Microscopia de reflexão interna total (Total Internal Reflection Microscopy - TIRFM)
Células HepG2, plaqueadas em lamínulas de 22x22 mm, foram transfectadas com
plasmideo para expressão de Mrp2 de rato em fusão com a proteína verde fluorescente
(eGFP), utilizando-se Lipofectamina 2000 (Invitrogen, EUA) de acordo com o protocolo
sugerido pelo fabricante. Após 24 horas, as células foram transferidas para câmara de
perfusão e visualizadas em um microscópio Olympus acoplado a sistema de reflexão
interna total e objetiva de 60X (N.A 1,45). Células transfectadas foram identificadas em
modo de epifluorescência utilizando-se lâmpada de Xenônio e filtros adequados para a
excitação de GFP. Em seguida, células expressando GFP-Mrp2 foram visualizadas em
modo TIRF utilizando um laser de argônio para excitação em 488 nm e filtros para a
coleta de excitação entre 515 e 550 nm e câmera CCD iXon 897 (Andor Technologies,
EUA). Fluorescência de GFP-Mrp2 em uma região de aproximadamente 200 nm próxima
a membrana plasmática foi monitorada em tempo real por 20 minutos com taxa de
aquisição de 0,5 Hz em células controle, células estimuladas com ATP (100 µM) ou
células estimuladas com a mesma concentração de ATP mas pré-incubadas com o
agente quelante de Ca
2+
intracelular BAPTA/AM (50 µM). Os dados estão expressos
como variação da intensidade de fluorescência em função do tempo em regiões de
interesse de 6x6µm.
Biotinilação de proteínas de membrana e detecção de Mrp2 por western blot
Hepatócitos isolados de camundongos selvagens (WT) ou knock out para InsP
3
R2
(KO) foram plaqueados (1,0x10
6
células/poço) em placas de 6 poços cobertas com
colágeno de rato do tipo I (Becton Dickinson) em meio L15 sem soro ou antibióticos. Após
2 horas de incubação a 37
o
C, o meio de cultura foi substituído por tampão Hepes e as
células foram incubadas por 20 minutos a 37
o
C. Em seguida, adicionou-se Hepes ou
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
36
Hepes + ATP 100 µM por 3 minutos a temperatura ambiente. As células foram então
transferidas para um banho de gelo e lavadas com tampão PBS (pH 8,5) e em seguida,
incubadas com Sulfo-LC-NHS Biotina (Pierce, EUA) diluída no mesmo tampão. Após
incubação em gelo por 45 minutos, o excesso de biotina não ligada foi removido por 3
lavagens com solução de glicina (100 mM) e o lisado protéico total foi preparado
utilizando-se o seguinte tampão de lise: Tris-base (20 mM), NaCl (150 mM), EDTA (1
mM), EGTA (1 mM), Na
4
P
2
O
7
(2,5 mM) glicerofostato (1mM) e Triton X-100 (1% v/v).
Após centrifugação a 4
o
C (13200 rpm por 10 minutos), o sobrenadante
correspondente ao lisado total foi conservado e a concentração de proteína mensurada
pelo método de Bradford. Parte deste lisado (1mg de proteína) foi incubada com resina de
agarose conjugada a estreptavidina (Pierce, EUA) por 30 minutos a temperatura
ambiente. A resina foi então lavada com o tampão de lise e recuperada por centrifugação
a 6000 rpm por 2 minutos. A resina assim obtida foi incubada por 10 minutos a 70
o
C em
tampão Laemmli. Após breve centrifugação, o sobrenadante obtido constituía a fração
biotinilada. A fração biotinilada e 25 µg do extrato protéico total foram separados por
SDS/PAGE e transferidos para membrana de PVDF para detecção da expressão de Mrp2
por western blot utilizando-se um anticorpo primário policlonal diluído 1:2000 (Cui et al.,
1999). Os resultados estão expressos como quantidade de MRP2 na membrana em
relação a quantidade total deste transportador no lisado celular.
Fluxo biliar e concentração sérica de bilirrubina
Camundongos WT e InsP
3
R2 KO foram anestesiados com uma mistura de
oxigênio e isoflurano (2,5 a 3,0% v/v) e submetidos a laparotomia e inserção de tubo de
polietileno na vesícula biliar. A bile foi coletada em tubos pré-tarados por intervalos de 15
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
37
minutos durante 1 hora. Para os experimentos envolvendo tratamento com ácido
taurolitocólico (TLCA) e ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA), a veia porta dos animais foi
canulada para infusão dos ácidos biliares. O valores de fluxo biliar foram normalizados
pela massa total do fígado e estão expressos como µL/g/minuto. Os valores de
concentração sérica de bilirrubina foram utilizando-se kit para teste colorimétrico de
acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Total bilirubin reagent, Thermo
Scientific).
Atividade de Mrp2 em cultura sanduíche de hepatócitos
Lamínulas contendo hepatócitos isolados de camundongos WT e InsP
3
R2 KO,
mantidos em cultura sanduíche, foram transferidas para tampão Hepes, montadas em
câmara de perfusão e visualizadas por microscopia confocal. As lamínulas foram
perfundidas com tampão Hepes contendo 5 µM do substrato fluorescente de Mrp2,
diacetato de 5-cloro metilfluoresceína (CMFDA). Dada a sua hidrofobicidade, CMFDA
passa livremente pela membrana plasmática e, uma vez em contato com as esterases
intracelulares, e convertido em composto polar que fica retido no interior da célula. A
conversão pelas esterases intracelulares gera carboxifluoresceína (CFA), que ao contrario
de CMFDA, fluoresce após excitação com comprimento de onda de 488 nm. CFA por sua
vez pode ser conjugado a glutationa que, em hepatócitos, e secretado via Mrp2 para o
interior do canalículo biliar. Como em cultura sanduíche os hepatócitos formam extensas
redes de canalículos biliares, a perfusão com CMFDA resulta no acúmulo de CFA no
interior destas estruturas permitindo a visualização em tempo real da atividade
transportadora de Mrp2.
Materiais e Métodos
________________________________________________________________________
38
Análise estatística
Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média de pelo menos
três experimentos independentes. Para comparação das médias foram utilizados o teste t-
Student e análise de variância (ANOVA one way) sendo nível de significância de 5%.
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software GraphPad Prism
(versão 4.0).
Resultados
________________________________________________________________________
39
RESULTADOS
Resultados
________________________________________________________________________
40
RESULTADOS
Localização dos receptores de InsP
3
R2 e Mrp2 em fatias de fígado e distribuição do
retículo endoplasmático em hepatócitos isolados
A figura 1a apresenta um campo representativo de uma fatia de fígado de rato na
qual a localização de Mrp2 está mostrada em verde, InsP
3
R2 em azul e a actina sub-
membranosa em vermelho. Ocorre co-localização de InsP3R2 com actina (cor púrpura)
porém não há co-localização de nenhuma das duas proteínas com Mrp2 apical. Esta
figura evidencia a proximidade de InsP
3
R2 em relação à membrana plasmática apical de
hepatócitos e por conseqüência, a proximidade destes canais de Ca
2+
intracelulares e os
transportadores responsáveis pela secreção de solutos componentes da bile.
Já a figura 1b (painel à esquerda) demonstra a distribuição do RE e dos estoques
intracelulares de Ca
2+
em hepatócitos de rato isolados. A marcação com ER tracker
demonstra que o RE está distribuído uniformemente por todo o citoplasma, incluindo
regiões próximas ao canalículo biliar. Um padrão semelhante de marcação (figura 1b,
painel à direita) também foi obtido quando os hepatócitos foram incubados com o
indicador de Ca
2+
mag-fluo4/AM. Visto que a constante de dissociação deste indicador é
de cerca de 22 µM, a sua fluorescência é mais intensa em regiões de alta concentração
deste íon, como o retículo endoplasmático (Echevarria et al., 2003). Em conjunto, estes
resultados confirmam que InsP
3
R2 e os estoques de Ca
2+
localizam-se nas proximidades
dos transportadores apicais como Mrp2. Assim pode-se especular que próximo à
membrana apical de hepatócitos de rato exista um micro domínio de sinalização de Ca
2+
que pode regular por exemplo, a atividade de Mrp2.
Resultados
________________________________________________________________________
41
Figura 1: InsP
3
R localizam-se na região pericanalicular de hepatócitos. (a) Fila
superior: em vermelho temos a marcação para actina sub-cortical; em azul a localização
de InsP
3
R2 e em verde a marcação para a proteína de membrana MRP2. Na fila inferior,
a colocalização entre InsP
3
R2 e actina é evidenciada pela cor rosa. Não ocorre
colocalização entre actina e o transportador MRP2. O último painel mostra a imagem
combinada para as três proteínas. (b) O retículo endoplasmático apresenta localização
difusa em hepatócitos isolados. Painel à esquerda apresenta dupla de hepatócitos
marcados com ER-Tracker e observados por microscopia de 2-fótons. Nota-se a
distribuição difusa do retículo endoplasmático. O painel à direita mostra a distribuição dos
estoques intracelulares marcados pela sonda fluorescente mag-fluo-4/AM. O padrão de
distribuição é semelhante ao do RE.
Caracterização bioquímica das sequências anti-senso para silenciamento de isoformas de
InsP
3
R
Em seguida utilizamos a técnica de redução de expressão gênica por anti-senso
para estudar a possível participação de InsP
3
R2 neste microdomínio de sinalização. Para
tanto células AR4-2J foram utilizadas para a caracterização inicial da eficiência e
especificidade das sequências anti-senso. Este tipo celular foi escolhido por ser originado
de rato e porque apresenta composição de InsP
3
Rs similar àquela encontrada em
hepatócitos de rato, ou seja, cerca de 20% de InsP
3
R1 e 80% de InsP
3
R2 (Wojcikiewicz,
1995). Dois dias após infecção com 40 MOI dos diferentes adenovírus, lisados celulares
Resultados
________________________________________________________________________
42
totais foram analisados por western blot. Como mostrado na figura 2, o anti-senso para
InsP
3
R1 (AS1) reduziu de maneira específica a expressão desta isoforma e não afetou a
expressão de InsP
3
R2 (figuras 2a e 2b). De maneira análoga, o anti-senso para InsP
3
R2
(AS2) promoveu redução específica de InsP
3
R2 mas não alterou a expressão de InsP
3
R1
(Figuras 2c e 2d). Como controle, utilizamos células não infectadas ou infectadas com um
adenovírus que codifica a expressão da proteína fluorescente DsRed e demonstramos
que estes não modificam a expressão de nenhuma das isoformas de InsP
3
R analisadas.
Sinalização de Ca
2+
em células AR4-2J após silenciamento de InsP
3
Rs
Para avaliar o efeito do silenciamento de cada isoforma na sinalização de Ca
2+
, células
AR4-2J foram infectadas com AS1 e AS2 e após 48 horas, marcadas com o indicador de
Ca
2+
fluorescente fluo-4/AM e analisadas por microscopia confocal. Nestes experimentos
células não-infectadas foram utilizadas como controle. Diversos parâmetros da
sinalização de Ca
2+
foram analisados em células estimuladas com diferentes
concentrações de acetilcolina (ACh), visto que este mediador promove liberação de Ca
2+
intracelular via ativação de receptores muscarínicos M1 e M3 neste tipo celular (Turner et
al., 2001). Como mostrado na figura 3, a diminuição na expressão tanto de InsP
3
R1
quanto de InsP
3
R2 reduz significativamente a amplitude do sinal de Ca
2+
, além de reduzir
a porcentagem de células que respondem ao estímulo com ACh e de prolongar o
intervalo entre o início da perfusão e o início do sinal de Ca
2+
. Em conjunto, estes
resultados demonstram que a redução de ambas as isoformas de InsP
3
R reduzem ou
dificultam a liberação de Ca
2+
intracelular em células AR4-2J.
Resultados
________________________________________________________________________
43
Figura 2: Avaliação da eficiência e especificidade de anti-senso para InsP
3
Rs em
células AR4-2J. Extratos protéicos de célulasnão infectadas (CT), infectadas com Ad-
DsRed (DsRed), infectadas com o anti-senso para InsP
3
R1 (AS1) ou infectadas com anti-
senso para InsP
3
R2 (AS2) foram separados por SDS/PAGE e analisados por imunoblots.
(a) e (b) AS1 reduziram a expressão de InsP
3
R1, mas não a do receptor do tipo 2. (c) e
(d) AS2 foi eficiente em reduzir a expressão de InsP
3
R2 entretanto não afetou a
expressão de InsP
3
R1. Note que a infecção com adenovírus controle (DsRed) não afetou
a expressão de InsP
3
Rs.
Resultados
________________________________________________________________________
44
Figura 3: Sinalização de Ca
2+
em células AR4-2J. (a) Gráfico representativo da
variação de fluorescência ao longo do tempo em células estimuladas com 10 µM de ACh.
O traço azul representa uma célula controle, o traço vermelho uma célula infectada com
AS1 e o traço verde corresponde a uma célula infectada com AS2. (b) Amplitude do sinal
de Ca
2+
em células estimuladas com diferentes concentrações de ACh. Células com
expressão reduzida de InsP
3
R1 ou InsP
3
R2 apresentam menor amplitude dos sinais de
Ca
2+
em resposta a concentrações elevadas de ACh (*p<0,05). (c) Porcentagem de
células que apresentam sinais de Ca
2+
em resposta a diferentes concentrações de ACh.
As células cuja expressão de InsP
3
R1 ou InsP
3
R2 foram silenciadas apresentam menor
sensibilidade a baixas concentrações de ACh (*p<0,05). (d) Intervalo entre o início da
perfusão com diferentes concentrações de ACh e o início do sinal de Ca
2+
(Δt). Em células
onde InsP
3
R1 e InsP
3
R2 foram silenciados o início do sinal de Ca
2+
é tardio em relação às
células controle. Para os resultados mostrados em (b) a (d) ao menos 130 células foram
analisadas para cada uma das concentrações de ACh.
Resultados
________________________________________________________________________
45
Caracterização das sequências anti-senso in vivo
Uma vez que nossas construções adenovirais se mostraram eficientes e
específicas na redução tanto de InsP
3
R1 quanto de InsP
3
R2 in vitro, nosso próximo passo
foi avaliar sua atividade in vivo. Para tanto, ratos Holtzamm machos de aproximadamente
90g foram injetados via veia caudal com 1,0x10
9
pfu/kg de cada um dos adenovirus anti-
senso. Ratos não infectados foram utilizados como controle. Dois dias após esta injeção,
os animais foram sacrificados e seus fígados removidos para extração de proteína. Como
mostrado nos imunoblots da figura 4, também in vivo, os adenovírus foram eficientes e
específicos, embora o percentual de redução de InsP
3
R1 não tenha ultrapassado 50% e o
de InsP
3
R2 tenha alcançado cerca de 65%. Estes resultados demonstram que os anti-
senso podem ser utilizados tanto in vitro quanto in vivo para estudarmos funções
hepáticas dependentes do Ca
2+
intracelular liberado via ativação de InsP
3
Rs. Durante a
realização desta fase inicial do nosso trabalho de caracterização das sequências anti-
senso, dois trabalhos descrevendo a geração de camundongos knock out para os
receptores de InsP
3
R2 foram publicados (Futatsugi et al., 2005; Li et al., 2005). Embora
tenham utilizado estratégias ligeiramente diversas e linhagens de camundongo diferentes,
os dois grupos relataram que os animais deficientes para InsP
3
R2 são férteis, tem
desenvolvimento embrionário normal e não apresentam nenhuma anormalidade
fenotípica aparente. Visto que nosso colaborador na Universidade de Yale conseguiu
estabelecer uma colônia destes animais gentilmente cedidos pelo Dr. Ju Chen (UCSD,
San Diego, EUA), nosso trabalho de caracterização do papel dos InsP
3
R2 na função
hepática concentrou-se na utilização destes camundongos knock out.
Resultados
________________________________________________________________________
46
Figura 4: Análise da eficiência e especificidade dos anti-senso para InsP
3
Rs in vivo.
(a) Extratos protéicos totais de fígados foram separados por SDS/PAGE e submetidos à
detecção de InsP
3
R1. Actina foi utilizada como controle da quantidade de proteína
separada em cada canaleta. O gráfico à direita mostra a quantificação densitométrica do
blot representativo. Em ratos infectados com AS1 houve redução de cerca de 50% na
expressão de InsP3R1 o que não ocorreu em fígados de animais infectados com AS2. (b)
Imunoblot representativo e quantificação densitométrica do mesmo mostrando redução de
cerca de 70% na expressão de InsP
3
R2 após infecção com AS2. A infecção com anti-
senso para o tipo 1 não promoveu alteração significativa na expressão de InsP
3
R2.
Sinalização de Ca
2+
em hepatócitos de camundongos InsP
3
R2 KO
Em primeiro lugar, comparamos a expressão das isoformas de InsP
3
R presentes
em hepatócitos de animais WT e InsP
3
R2 KO. Como mostrado na figura 5, a expressão
de InsP
3
R1 é semelhante nos dois grupos. Como esperado, a expressão de InsP
3
R2 não
foi detectada em hepatócitos isolados de animais InsP
3
R2 KO. Como ocorre em
hepatócitos de rato, tanto em animais WT quanto InsP
3
R2, InsP
3
R3 não foi detectado. A
Resultados
________________________________________________________________________
47
localização das isoformas de InsP
3
R também foi analisada por imunofluorescência. Como
mostrado na figura 6, em fatias de fígado de camundongos WT, InsP
3
R1 encontra-se
difuso no citoplasma enquanto InsP
3
R2 concentra-se na região pericanalicular. Já em
animais knock out, InsP
3
R2 não está presente e InsP
3
R1 apresenta distribuição
semelhante àquela observada nos animais selvagens. Estes resultados confirmam a
ausência de InsP
3
R2 nos camundongos KO e demonstram que não há alteração
compensatória aparente seja na expressão ou localização de InsP
3
R1 nos hepatócitos
destes animais.
Nosso próximo passo foi caracterizar a sinalização de Ca
2+
em hepatócitos de
animais WT e InsP
3
R2 KO por microscopia confocal. Hepatócitos foram isolados,
plaqueados em lamínulas de vidro e após 2 a 4 horas, carregados com indicador de Ca
2+
fluorescente fluo-4/AM. A fluorescência deste indicador foi monitorada em tempo real
enquanto os hepatócitos eram perfundidos com Arg
8
-vasopressina (AVP) ou adenosina
trisfosfato (ATP). A figura 7a, apresenta sinais de Ca
2+
representativos de um hepatócito
WT e um InsP
3
R2 KO estimulados com AVP 10 nM. A partir de gráficos como este,
calculou-se dois parâmetros cinéticos da sinalização de Ca
2+
como indicado na figura: 1)
amplitude do sinal e 2) tempo de subida. A amplitude é definida como a diferença entre o
valor basal da fluorescência e o valor máximo da mesma.
Resultados
________________________________________________________________________
48
Figura 5: Expressão de InsP
3
Rs em fígado de animais WT e InsP
3
R2 KO. (a)
Sessenta microgramas de extrato protéico total de hepatócitos foram separados em cada
canaleta e transferidos para membrana PVDF. Extratos protéicos de cerebelo de rato
foram utilizados como controle positivo uma vez que este tecido apresenta abundante
expressão de InsP
3
R1. A expressão de α tubulina foi utilizada como controle da
quantidade total de proteína separada em cada canaleta. O blot representativo demonstra
que a expressão de InsP
3
R1 é semelhante em animais WT e InsP
3
R2 KO. (b) Blot para
InsP
3
R2 confirma a ausência desta proteína nos animais InsP
3
R2 KO (numerados de 1 a
3). (c) Assim como ocorre em hepatócitos de rato, InsP
3
R3 não foi detectado tanto em
hepatócitos WT quanto em InsP
3
R2 KO. Extratos de células Mz-Cha-1 foram utilizados
como controle positivo.
Resultados
________________________________________________________________________
49
Figura 6: Localização de InsP
3
Rs em fígados de camundongos WT e InsP
3
R2 KO. (a)
Imunofluorescência e microscopia confocal foram utilizadas para determinar a distribuição
subcelular dos InsP
3
Rs. InsP
3
R1 distribui-se uniformemente pelo citosol dos hepatócitos
de ambos animais. O painel superior mostra a distribuição difusa de InsP
3
R1 em verde, a
localização de f-actina na periferia celular em vermelho, e os núcleos em azul em uma
fatia de fígado WT. A figura da direita apresenta a sobreposição das três imagens
anteriores. O painel inferior mostra os resultados de um campo representativo de uma de
fígado InsP
3
R2 KO. (b) InsP
3
R2 concentra-se na região apical dos hepatócitos WT
enquanto nos hepatócitos InsP
3
R2 KO, esta isoforma não é detectada. Barra = 50 µM.
Resultados
________________________________________________________________________
50
Figura 7: Sinalização de Ca
2+
em hepatócitos isolados de camundongos WT e
InsP
3
R2 KO. Entre 2 e 4 horas após isolamento, hepatócitos foram incubados com Fluo-
4/AM e estimulados com ATP (100 µM) ou AVP (10 nM) por 3 minutos enquanto as
alterações de fluorescência eram monitoradas por microscopia confocal. (a) Traços
representativos da variação de fluorescência em função do tempo em um hepatócito WT
e um InsP
3
R2 KO perfundidos com AVP. (b) Média da amplitude máxima do sinal de Ca
2+
em células WT e InsP
3
R2 KO estimuladas com AVP 10 nM (165 ± 3 %, n=309 células
versus 148 ± 2 %, n=423 células; p<0,0001), respectivamente. (c) Amplitude em células
estimuladas com ATP 100 µM (152,9 ± 1,16 %, n= 149 versus 146,2 ± 1,18 %, n= 176;
p<0,001). (d) Tempo de subida do sinal de Ca
2+
induzido por AVP é menor em
hepatócitos WT em comparação com InsP
3
R2 (11,43 ± 0,71 seg, n= 251 versus 29,96 ±
1,30 seg, n= 256; p<0,0001). (e) Tempo de subida também foi menor em células WT do
que em InsP
3
R2 KO estimuladas com ATP 100 µM (1,89 ± 0,08 seg, n=149 células versus
2,81 ± 0,17 seg, n=176; p<0,0001).
Resultados
________________________________________________________________________
51
Já o tempo de subida é calculado tomando-se os valores correspondentes a 25 e 75% da
amplitude e os tempos nos quais estes valores são alcançados, t
25
e t
75
, respectivamente.
A diferença (t
75
– t
25
) corresponde ao tempo de subida. Como mostrado na figura 7b,
quando estimulados com AVP (10nM), os hepatócitos WT apresentaram maior amplitude
dos sinais de Ca
2+
em comparação aos hepatócitos InsP
3
R2 KO. Assim como ocorre para
AVP, a perfusão com ATP 100 µM promoveu maior liberação de Ca
2+
em células WT do
que em KO (figura 7c). Como mostrado nas figuras 7d e 7e, o tempo de subida foi
significativamente menor em células WT do que InsP
3
R2 KO para ambos os agonistas.
Em conjunto, estes dados demonstram que os hepatócitos deficientes em InsP
3
R2
apresentam comprometimento na sinalização de Ca
2+
intracelular.
Sinalização de Ca
2+
e regulação do fluxo biliar em animais InsP
3
R2 KO
Considerando que a sinalização de Ca
2+
está associada à regulação de diferentes
funções hepáticas, dentre as quais a formação e secreção de bile, os próximos
experimentos foram realizados para elucidar uma possível conexão entre a sinalização de
Ca
2+
deficiente em animais InsP
3
R2 KO e o fluxo biliar. Para tanto, o volume de bile
formado durante um período de 1 hora foi avaliado em animais WT e InsP
3
R2 KO. Como
listado na tabela 2, o fluxo biliar, expresso como o volume de bile em micro litros por
grama de peso do fígado por minuto, não apresentou diferenças significativas entre os
dois grupos de camundongos, demonstrando que, em condições basais, não ha déficit no
fluxo biliar dos animais InsP
3
R2 KO. Em diferentes modelos experimentais de colestase,
alterações de fluxo biliar são detectadas apenas quando os animais são submetidos a
fatores de estresse hepático, como a exposição a lipopolissacarídeos de origem
bacteriana, a 17β-estradiol ou mesmo após perfusão com ácidos biliares como o acido
litocólico (TLCA). Neste último modelo, a perfusão portal de TLCA de maneira aguda
Resultados
________________________________________________________________________
52
promove redução do fluxo biliar, o qual pode ser restabelecido por perfusão sequencial do
ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA) (Denk et al., 2008). Assim, passamos à comparação
do fluxo biliar nos dois grupos de animais utilizando este modelo de estresse hepático.
Como mostrado na figura 8, a perfusão com àcido litocólico isoladamente reduziu o fluxo
biliar tanto em animais WT quanto em InsP
3
R2 KO. A perfusão de TUDCA após
tratamento com TLCA promoveu o efeito colerético esperado nos dois grupos de animais,
no entanto, este aumento do fluxo biliar foi mais acentuado em camundongos selvagens
quando comparados com o grupo InsP
3
R2 KO. Estes resultados demonstram que
camundongos InsP
3
R2 KO apresentam fluxo biliar comprometido em situações de
estresse hepático.
Tabela 2: Fluxo biliar e concentração sérica de bilirrubina basais em animais WT e
InsP
3
R2 KO.
Fluxo biliar (ml/g/min)
Bilirrubina sérica (mg/dL)
WT
0.9486 ± 0.0618, n = 9
0.2170 ± 0.01813, n = 10
InsP
3
R2 KO
1.116 ± 0.030, n= 6
0.2096 ± 0.02917, n = 9
Resultados
________________________________________________________________________
53
Figura 8: Fluxo biliar em camundongos WT e InsP
3
R2 KO em modelo de infusão de
ácidos biliares. Infusão de TLCA (5 µM) promoveu redução semelhante do fluxo biliar
nos animais WT (azul, n=3) e InsP
3
R2 KO (verde, n=4). Em contrapartida, a colestase
induzida por infusão de TLCA foi revertida pelo tratamento com TUDCA (25 µM) em
animais WT (vermelho, n=3) e em menor grau nos animais InsP
3
R2 KO (cinza, n=4;
p<0,02 por análise de variância). A seta indica momento da infusão de TUDCA.
Avaliação da expressão, localização e atividade transportadora de Mrp2
Estudos prévios demonstraram uma relação indireta entre a sinalização de Ca
2+
e
o fluxo biliar independente de ácidos biliares. Assim sendo, Mrp2 constitui um potencial
alvo da sinalização defeituosa de Ca
2+
observada em hepatócitos InsP3R2 KO.
Inicialmente, verificamos se a expressão basal de Mrp2 era semelhante nos
camundongos WT e InsP
3
R2 KO. Como mostrado no western blot representativo da
Resultados
________________________________________________________________________
54
figura 9a e na densitometria de 3 blots semelhantes utilizando extratos protéicos de
diferentes animais (figura 9b), ocorre uma ligeira redução de cerca de 12% (não
significativa estatisticamente) nos hepatócitos InsP
3
R2 KO. No entanto, a localização de
Mrp2 em fatias de fígado não está alterada nos animais InsP
3
R2 KO, como demonstrado
na imunofluorescência representativa da figura 10. Assim como ocorre nos camundongos
WT, Mrp2 concentra-se na região apical dos hepatócitos, delimitando os canalículos
biliares. Estes resultados demonstram que não ocorre variação significativa seja na
expressão ou na localização de Mrp2 em animais InsP
3
R2 KO quando comparados aos
animais selvagens.
Em seguida, avaliou-se a atividade de Mrp2 em um modelo de secreção de
substrato fluorescente previamente descrito na literatura adaptado para realização em
cultura sanduíche de hepatócitos. O ensaio se baseia na conversão do composto não
fluorescente diacetato de 5-cloro metilfluoresceina (CMFDA) no composto fluorescente
carboxifluoresceína (CFA) no citoplasma dos hepatócitos e sua subsequente conjugação
a glutationa. O conjugado assim formado é prontamente secretado, via Mrp2, para o
interior do canalículo biliar. A atividade deste transportador pode então ser estimada pelo
aumento de fluorescência em regiões de interesse correspondentes ao canalículos.
A figura 11a apresenta uma série de imagens de um campo representativo de
hepatócitos WT perfundidos com CMFDA e observados por um período de 15 minutos.
Pode-se acompanhar o aumento de fluorescência ao longo do tempo em regiões de
formato irregular, como aquela mostrada em amarelo, que correspondem a canalículos
biliares. A figura 11b, sumariza os dados de transporte de CFA ao longo do tempo para as
diferentes condições analisadas. Pode-se notar que o transporte do substrato
fluorescente foi reduzido significativamente seja em hepatócitos InsP
3
R2 KO ou em
hepatócitos isolados de animais WT porém pré-incubados com o agente quelante de Ca
2+
Resultados
________________________________________________________________________
55
Figura 9: Expressão de Mrp2 em hepatócitos WT e InsP
3
R2 KO. (a) Western blot
representativo mostra que a expressão de Mrp2 em hepatócitos de animais WT é
ligeiramente superior àquela presente em InsP
3
R2 KO. β actina foi utilizada como
controle para a normalização da quantidade total de proteína separada no gel. (b) Análise
densitométrica mostra que existe uma redução, não significativa, da quantidade total de
Mrp2 em animais InsP3R2 KO quando comparados aos animais WT (87,9 ± 10.5 % em
relação ao WT; p > 0,3).
intracelular, BAPTA/AM. Estes dados demonstram que, ao menos em cultura sanduíche,
hepatócitos InsP
3
R2 KO apresentam atividade de Mrp2 diminuída quando comparados
com a dos hepatócitos WT. Uma vez que esta atividade diminuída de Mrp2 poderia ser
causada por uma redução na quantidade desta proteína presente na membrana apical,
analisamos a distribuição subcelular de Mrp2 em hepatócitos em cultura sanduiche. Como
mostrado na figura 12, e assim como ocorre em fatias de fígado, Mrp2 concentra-se
quase exclusivamente na membrana apical dos hepatócitos tanto em células WT quanto
InsP
3
R2 KO.
Resultados
________________________________________________________________________
56
Figure 10: Distribuição de Mrp2 em fígados de camundongos WT e InsP
3
R2 KO. (a)
Imunofluorescência e visualização por microscopia confocal demonstram que Mrp2
concentra-se na região canalicular tanto em fígados WT quanto InsP
3
R2 KO. Distribuição
de Mrp2 está mostrada em verde, f-actina em vermelho e os núcleos em azul. O painel
superior mostra a marcação em fatia de fígado selvagem e o painel inferior mostra um
campo representativo de fígado InsP
3
R2 KO. Barra = 50 µM. (b) Visualização em maior
aumento de regiões canaliculares demonstra que em ambos os camundongos, Mrp2
(verde) encontra-se próximo, mas não se sobrepõe à f-actina subcortical. Barra = 5 µM.
B
Resultados
________________________________________________________________________
57
Figura 11: Atividade de Mrp2 em culturas sanduíche de hepatócitos WT e InsP
3
R2
KO. (a) Série de imagens de um campo de hepatócitos WT perfundidos com CMFDA (5
µM) demonstram o acúmulo de fluorescência do produto de conversão (CFA) no interior
dos canalículos. Os hepatócitos foram perfundidos por 15 minutos e as imagens
coletadas a cada 2,5 segundos. (b) Aumento médio de fluorescência, em regiões como a
delimitada pelo traço amarelo em (a), em função do tempo mostram que tanto em
hepatócitos InsP
3
R2 KO quanto em hepatócitos WT pré-tratados com BAPTA/AM ocorreu
diminuição significativa da secreção de CFA para o interior do canalículo. Resultados
representam média ± erro padrão da média em células WT (77 canalículos em 7
lamínulas, azul), células InsP
3
R2 KO (74 canalículos em 5 lamínulas, verde), WT pré-
incubadas com BAPTA/AM (82 canalículos em 6 lamínulas, cinza), além de células WT
pré-tratadas com DMSO (32 canalículos em 3 lamínulas). DMSO isoladamete, foi utilizado
como controle pois é solvente utilizado para dissolução do BAPTA/AM (c) Acúmulo de
CFA foi significativamente maior em hepatócitos WT (186,7 ± 10,2 a.u) em comparação
com InsP
3
R2 KO (48,2 ± 5,6 u.a) ou em comparação com o grupo pré-tratado com
BAPTA/AM (86,0 ± 8,4 u.a); p<0,0001 por análise de variância. Já o grupo DMSO
apresentou valor máximo de fluorescência semelhante ao do grupo WT (166,5 ± 20,8 u.a).
Resultados
________________________________________________________________________
58
Desta forma, a redução na atividade de Mrp2 em hepatócitos KO não pode ser atribuída à
alterações na localização deste transportador.
Até aqui nossos resultados demonstraram que existe um déficit na secreção biliar
de hepatócitos InsP
3
R2 KO em cultura sanduíche e que este transporte deficiente está
associado a um menor fluxo biliar quando estes animais são submetidos a um tratamento
colestático agudo. Uma possibilidade é a de que a liberação de Ca
2+
i
seja importante para
estimular a fusão de vesículas contendo Mrp2 com a membrana apical dos hepáticos,
aumentando assim a capacidade transportadora de ânions inorgânicos. Para testar esta
hipótese, utilizou-se duas técnicas complementares: 1) microscopia de reflexão interna
total e 2) biotinilação de proteínas de membrana plasmática e análise de expressão de
Mrp2 por western blot.
Inserção de Mrp2 na membrana plasmática pode ser induzida pela liberação de Ca
2+
intracelular
A variação de fluorescência de Mrp2-GFP nas proximidades da membrana
plasmática foi monitora por microscopia de reflexão interna total em células HepG2. Esta
técnica permite a visualização de uma região de cerca de 150 nm de espessura próxima a
membrana plasmática, o que a torna ideal para o registro de exocitose e endocitose
(Toomre and Manstein, 2001). A figura 13a mostra uma célula HepG2 antes e 15 minutos
após a aplicação de ATP 100 µM. A intensidade de fluorescência está codificada segundo
a escala de cores à direita para facilitar a visualização de regiões nas quais houve
variação de Mrp2-GFP na membrana. Utilizando este protocolo, comparamos a
intensidade de fluorescência em células controle e células estimuladas com ATP 100 µM
isoladamente ou após pré-incubação com BAPTA/AM.
Resultados
________________________________________________________________________
59
Figura 12: Localização de InsP3R2 e Mrp2 em culturas sanduíche de hepatócitos.
(a) Localização de InsP3R2 (verde) em hepatócitos WT em cultura sanduíche demonstra
que, assim como ocorre em fatias de fígado, estes se localizam próximos à membrana
apical que se forma entre os hepatócitos mantidos entre camadas de colágeno. F-actina
(vermelho), núcleos (azul). Barra = 20 µM. (b) Mrp2 (verde) mantém sua distribuição
apical em hepatócitos em cultura sanduíche.
Como mostrado na figura 13, a adição de ATP promoveu inserção de Mrp2-GFP na
membrana plasmática, efeito este que foi bloqueado quando o Ca
2+
intracelular foi
quelado com BAPTA/AM. Como controles adicionais para este experimento, mensuramos
a liberação de Ca
2+
induzida por ATP 100 µM na presença ou ausência de BAPTA/AM.
Resultados
________________________________________________________________________
60
Figura 13: Inserção de GFP-Mrp2 na membrana plasmática de células HepG2. (a)
Fluorescência próxima à membrana plasmática de uma célula HepG2 expressando GFP-
Mrp2 antes e 15 minutos após a aplicação de ATP 100 µM. A intensidade de
fluorescência foi codificada de acordo com a escala à direita. As setas amarelas indicam
regiões de aumento de fluorescência. (b) Visão ampliada da região indicada pelo
quadrado branco em (a) em intervalos de tempo de 2 minutos. A inserção de GFP-Mrp2
em múltiplos pontos resulta no acúmulo deste transportador na membrana. (c)
Quantificação da intensidade de fluorescência após 20 minutos demonstra que a adição
de ATP aumenta significativamente a fluorescência de GFP-Mrp2 na membrana
plasmática (124,9 ± 2,2 %, n=81 regiões em 19 células) quando comparadas com o
controle não estimuladas (106,7 ± 0,8 %, n=83; p<0.0001). O pré-tratamento com
BAPTA/AM previne a inserção de GFP-Mrp2 estimulada por ATP(112,9 ± 2,2 %, n=42;
p<0.001) por análise de variância.
Resultados
________________________________________________________________________
61
Como ilustrado nos traços representativos da figura 14a e no gráfico de barras da figura
14b, o pré-tratamento com BAPTA/AM bloqueou quase completamente os sinais de Ca
2+
no citoplasma de células HepG2. Concentrações altas de ATP, como a utilizada neste
experimento, podem promover influxo de Ca
2+
via receptores purigérnicos P2X7 além de
promover liberação de Ca
2+
do RE pela ativação de InsP
3
Rs, portanto mensuramos a
liberação de Ca
+2
induzida por ATP em células pré-incubadas com os seguintes
compostos: U73122 (inibidor de fosfolipase C) e Xestospongin C (bloqueador de
InsP3Rs). Como mostrado nas figuras 14c-d, U73122 e Xestospongin reduziram
significativamente a amplitude da resposta de Ca
2+
em 50 e 85% respectivamente. Estes
resultados demonstram que a inserção de Mrp2 na membrana plasmática pode ser
induzida por liberação de Ca
2+
intracelular mediada pelos receptores de InsP
3
.
Resultados
________________________________________________________________________
62
Figura 14: Sinais de Ca
2+
induzidos por ATP em células HepG2. (a) Variação de
fluorescência de Fluo4/AM em células Hep2 estimuladas com ATP 100 mM ou com ATP
+ BAPTA/AM. Traçados representam uma célula de cada grupo. (b) Média da amplitude
máxima dos sinais de Ca
2+
demonstram que o tratamento com BAPTA/AM (112,57% ±
0,36%, n=550 células) bloqueia quase completamente os sinais de Ca
2+
induzidos por
ATP quando comparados às células controle (209,5 ± 1,95%, n= 550; p<0,0001). (c)
Traçados representativos de células controle, pré-tratadas com U73122 ou Xestospongin
e estimuladas com ATP 100 mM. (d) Quantificação da amplitude máxima dos sinais de
Ca
2+
mostram que tanto U73122 (186,19 ± 5,87%, n=233), quanto Xestospongin C
(127,69 ± 2.31%, n= 184) reduziram significativamente a liberação de Ca
2+
intracelular
induzida por ATP quando comparados às células controle (278,3 ± 4,50%, n= 504, p <
0.0001) por análise de variância.
O segundo método empregado para investigar a possível participação dos InsP
3
Rs
na inserção de Mrp2 na membrana plasmática foi a biotinilação de proteínas de superfície
e análise em western blot (Gottardi et al., 1995). Nestes experimentos, hepatócitos
isolados de camundongos WT ou InsP
3
R2 KO foram estimulados com ATP
Resultados
________________________________________________________________________
63
100 µM por 3 minutos e em seguida incubados com solução de PBS contendo Sulfo-LC-
Biotina (0,5 mg/mL). As células foram então lisadas e o extrato obtido foi incubado com
resina de agarose conjugada à estreptavidina. Após eluição, obteve-se a fração
biotinilada que contém apenas proteínas de membrana plasmática. Western blots para
detecção de Mrp2 foram utilizados para comparar as quantidades relativas deste
transportador na membrana e no extrato total. Como mostrado na figura 15, o tratamento
com ATP promoveu aumento de Mrp2 na membrana de hepatócitos WT. Já em células
InsP
3
R2 KO, a quantidade de Mrp2 na membrana não sofreu alteração significativa. Estes
resultados demonstram que os InsP
3
R2 são necessários para a inserção de Mrp2 na
membrana apical de hepatócitos e ainda que a função de InsP
3
R2 pode estar relacionada
com a internalização de Mrp2, visto que a fração biotinilada de Mrp2 em hepatócitos
InsP
3
R2 KO é maior do que em hepatócitos selvagens.
Resultados
________________________________________________________________________
64
Figura 15: Biotinilação de proteínas de membrana e análise de expressão de Mrp2.
(a) Western blot representativo para Mrp2 em extratos biotinilado e total de hepatócitos
WT e InsP
3
R2 KO estimulados com ATP 100 µM. (b) Quantificação densitométrica
demonstra que ATP promove aumento de Mrp2 na membrana plasmática de células WT
porém não em células InsP3R2 KO (p>0,05, não significativo).
Discussão
________________________________________________________________________
65
DISCUSSÃO
Discussão
________________________________________________________________________
66
DISCUSSÃO
No presente trabalho, demonstrou-se que a técnica de silenciamento de genes por
sequências anti-senso é eficaz e específica na redução da expressão de InsP
3
Rs tanto in
vitro quanto in vivo. Demonstrou-se ainda que os receptores de InsP
3
R2 são necessários
para a atividade normal de Mrp2 e que sua ausência resulta em comprometimento do
fluxo biliar em situações de estresse hepático agudo. Demonstrou-se ainda que a
liberação de Ca
2+
intracelular via InsP
3
Rs induz inserção de Mrp2 na membrana
plasmática.
Assim como demonstrado em cardiomiócitos (Li et al., 2005) e células acinares
pancreáticas (Futatsugi et al., 2005), a ausência de InsP
3
R2 também resulta em
sinalização de Ca
2+
deficiente em hepatócitos. InsP
3
R2 concentram-se na região apical de
hepatócitos, próximos aos transportadores presentes neste domínio de membrana como
Mrp2 (figura 1). Considerando-se esta localização restrita em conjunto com a afinidade
deste receptor por InsP
3
pode-se caracterizar a região apical de hepatócitos como um
micro domínio de Ca
2+
, ou seja, uma região espacialmente restrita na qual a concentração
de Ca
2+
possa ser várias vezes maior do que a observada no citosol (Rizzuto and Pozzan,
2006). Na ausência de InsP
3
R2 este micro domínio encontra-se funcionalmente
comprometido resultando na liberação de Ca
2+
diminuída (figura 7). Além disso, este
micro domínio de Ca
2+
pode também ser desorganizado pela depleção de colesterol e
desarranjo de lipid rafts, já que o tratamento de hepatócitos com β-ciclodextrina redistribui
InsP
3
R2 e impede a formação normal das ondas de Ca
2+
do pólo apical para o basolateral
(Nagata et al., 2007).
Uma conseqüência adicional da ausência de InsP
3
R2 seria o comprometimento da
propagação intercelular dos sinais de Ca
2+
mediada por junções gap. Sabe-se que o
bloqueio farmacológico de junções do tipo gap não afetam o fluxo biliar basal em fígados
Discussão
________________________________________________________________________
67
de rato isolados (Nathanson et al., 1999) porém potencia a redução do fluxo biliar após
perfusão com vasopressina.
A regulação da atividade de transportadores da membrana apical de hepatócitos
ocorre por diversos mecanismos que incluem tanto regulação transcricional quanto pós-
transcricional. Um destes mecanismos é a regulação da expressão gênica destes
transportadores (Boyer, 2005). Os promotores dos genes destes transportadores
apresentam elementos de ligação para os receptores nucleares FXR (receptor farnesóide
X), RXR (receptor retinóide X), LXR (receptor hepático X) e PXR (receptor de pregnano
X). A ativação dos promotores se dá por ligação de homo ou heterodímeros destes
receptores aos elementos responsivos. Em hepatócitos, esta ativação tem efeitos
complexos sobre múltiplos transportadores, no entanto especial atenção tem sido dirigida
ao FXR (Guo et al., 2003) e ao desenvolvimento de fármacos, agonistas deste receptor,
uma vez que este é diretamente ativado por ácidos biliares e induz a expressão de Bsep
e Mdr3 (Fickert et al., 2001). Esta expressão aumentada de Bsep e Mdr3 por sua vez, é
responsável pela secreção destes ácidos biliares através das membranas apical e
basolateral, respectivamente. Assim, o acúmulo tóxico de ácidos biliares que ocorre em
patologias colestáticas, induz a expressão dos transportadores responsáveis pela
secreção dos mesmos.
A atividade de Mrp2 é modulada por diversos mecanismos. Em primeiro lugar, a
expressão de Mrp2 pode ser controlada seja em nível transcricional (regulação a longo
prazo) quanto pós-transcricional (regulação a curto prazo). Assim como ocorre para Bsep
e Mdr3, o controle da expressão gênica de Mrp2 também envolve ativação dos receptores
nucleares RXR, FXR, PXR e CAR. Um elemento responsivo a hormônio (RE-8) encontra-
se na região promotora do gene para Mrp2 e é ocupado por heterodímeros contendo uma
cópia de RXR associada a FXR, PXR e CAR (Kast et al., 2002). Sabe-se que
Discussão
________________________________________________________________________
68
ácidos biliares ativam FXR (Parks et al., 1999), assim a presença deste explicaria o fato
de que o tratamento com ácidos biliares como UDCA ou o acúmulo tóxico dos mesmos
que ocorre em conseqüência à obstrução experimental dos ductos biliares induz a
expressão de Mrp2.
Em hepatócitos, além de ativar diretamente FXR, ácidos biliares podem também
induzir aumento de Ca
2+
intracelular seja pela mobilização dos estoques do retículo
endoplasmático (Bouscarel et al., 1993; Combettes et al., 1990; Combettes et al., 1988),
seja por influxo através da membrana plasmática ou por uma combinação dos dois
mecanismos (Beuers et al., 1993a). Acredita-se que um dos mecanismos pelos quais
TUDCA promove aumento de fluxo biliar seria justamente através da mobilização de Ca
2+
e a consequente estimulação da exocitose em hepatócitos (Beuers et al., 1993b). Um
efeito adicional da mobilização de Ca
2+
induzida por ácidos biliares é a regulação de FXR,
já que a atividade deste receptor nuclear é positivamente regulada por fosforilação via
PKC em células HepG2 (Gineste et al., 2008).
A regulação pós-transcricional da atividade de Mrp2 pode ocorrer por três
diferentes mecanismos: 1) Degradação protéica, 2) Fosforilação e 3) Tráfego e
reciclagem intracelulares. A degradação de Mrp2 está envolvida na fisiopatologia de
doenças colestáticas, embora sua relevância seja relativa. Em modelos animais de
colestase gestacional por exemplo, a degradação parece não ser importante (Jones et al.,
2005). Já em modelo de colestase obstrutiva, como o de ligação do ducto biliar, ocorre
degradação de Mrp2 principalmente em hepatócitos periportais (Paulusma et al., 2000).
No presente trabalho, não observamos diferenças significativas na quantidade total de
Mrp2 em hepatócitos InsP
3
R2 quando comparados a hepatócitos selvagens (figura 9),
assim a ausência deste canal de cálcio intracelular parece não afetar a meia-vida de
Mrp2.
Discussão
________________________________________________________________________
69
Estudos in vitro utilizando Mrp2 imunoprecipitados de células HepG2 e incubados
com PKCα, PKCε e PKA revelaram que todas estas três cinases aumentam a
incorporação de P
32
nesta proteína (Wimmer et al., 2008). De maneira análoga,
tratamento de hepatócitos de rato com um ativador de PKC (PMA) promove fosforilação
de Mrp2. Além disso, a perfusão de fígados com o ácido biliar colerético TUDCA promove
ativação de PKCα, PKCε ou PKA. Embora estes achados sugiram que fosforilação de
Mrp2 promova aumento de sua atividade, nenhum estudo examinou o efeito direto da
fosforilação sobre a atividade transportadora de Mrp2 isolados. Nossos resultados nos
permitem especular que a ausência de InsP
3
R2 em hepatócitos e a conseqüente
liberação de Ca
2+
reduzida, poderiam dificultar a ativação de PKCs convencionais como
PKCα, o que contribuiria então para menor atividade deste transportador em células
InsP
3
R2 KO (figura 11).
O terceiro mecanismo pós-transcricional de regulação de Mrp2 é a modulação do
tráfego intracelular seja em condições fisiológicas quanto em patologias. Diversos relatos
da literatura demonstraram que transportadores hepáticos como Bsep e Mrp2 encontram-
se tanto inseridos na membrana apical quanto em estruturas tubulares e vesiculares
localizadas próximas à membrana apical. Outros relatos mostraram que, agonistas que
induzem formação de cAMP intracelular promovem inserção de Mrp2 na membrana
canalicular e assim melhoram a atividade secretora de hepatócitos. Em diferentes
modelos de colestase como a ligação do ducto biliar e a administração de 17β-estradiol
também ocorre relocalização de Mrp2. O transportador que, em condições basais,
localiza-se primordialmente na membrana apical de hepatócitos passa a ser encontrado
em vesículas de reciclagem no citosol. No presente trabalho, demonstramos que a
liberação de Ca
2+
via receptores de InsP
3
pode induzir a inserção de Mrp2 na membrana
plasmática de células HepG2, como demonstrado nos experimentos empregando
Discussão
________________________________________________________________________
70
microscopia de reflexão interna total (figura 13). Embora a inserção a princípio pareça
modesta, visto que o aumento de fluorescência de GFP-Mrp2 na membrana plasmática
foi de cerca de 18% após estimulação com ATP 100 µM, deve-se considerar que o tipo
celular utilizado não apresenta a polaridade típica de hepatócitos e portanto a área
disponível para inserção de Mrp2 em células HepG2 é mais extensa do que em
hepatócitos, o que em prática resulta em aumento médio de fluorescência menos
marcante.
Uma segunda limitação das células HepG2 como modelo para estudo da
sinalização de Ca
2+
em hepatócitos é o fato de que este tipo celular expressa InsP
3
R2 e
InsP
3
R3 (Leite et al., 2003) enquanto hepatócitos tanto de rato (Hirata et al., 2002b)
quanto de camundongo (figuras 5 e 6) apresentam InsP
3
R1 e InsP
3
R2. Sendo assim,
realizamos o experimento de biotinilação mostrado na figura 15, o qual demonstra que a
liberação de Ca
2+
induzida por ATP não promove inserção de Mrp2 na membrana
plasmática de hepatócitos InsP3R2 KO. Seria ideal demonstrarmos a inserção de GFP-
Mrp2 na membrana apical de hepatócitos porém este tipo celular não é transfectado
facilmente, tanto em culturas de curto prazo quanto em cultura sanduíche como a
utilizada aqui para os experimentos de secreção do substrato fluorescente de Mrp2 (figura
11).
A via de sinalização de cAMP também é essencial para a regulação a curto prazo
da atividade dos transportadores apicais de hepatócitos. A ativação farmacológica da
adenilato ciclase ou tratamento de hepatócitos com análogos de cAMP associados a
inibidores de fosfodiesterase demonstram que cAMP é um potente indutor da inserção de
Mrp2 (Schonhoff et al., 2008), Bsep (Misra et al., 2003) e NTCP (Dranoff et al., 1999) em
seus respectivos domínios de membrana. Sabe-se ainda que cAMP potencializa as
oscilações de Ca
2+
em hepatócitos de rato (Chatton et al., 1998; Sanchez-Bueno et al.,
Discussão
________________________________________________________________________
71
1993). Outro dado interessante que foi recentemente publicado, demonstra que existe
uma interação direta entre InsP
3
R2 e adenilato ciclase 6 (AC6) e que esta interação é
essencial para a potencialização da atividade de InsP
3
R2 por cAMP (Tovey et al., 2008).
Sendo assim seria interessante estudar a importância desta interação na regulação da
secreção biliar já que AC6 é uma das isoformas predominantes em hepatócitos de rato
(Strazzabosco et al., 2009).
Nosso trabalho se concentrou no papel dos receptores de InsP
3
R do tipo 2 na
regulação da localização/atividade de Mrp2 a curto prazo, no entanto a ausência destes
canais de Ca
2+
intracelulares pode ter implicações para a atividade de outros
transportadores hepáticos como Bsep e Mdr3. Assim como Mrp2, Bsep se localiza
primariamente na membrana apical de hepatócitos e em um compartimento próximo a
este domínio de membrana que serviria como depósito intracelular que pode ser
mobilizado de acordo com a demanda fisiológica por bile (Kipp and Arias, 2000). Outra
possível ramificação do presente trabalho seria a investigação do papel dos receptores de
InsP
3
R2 na regulação da formação da bile em patologias colestáticas. Sabe-se que a
maioria das patologias intra ou extra hepáticas que resultam em colestase são processos
crônicos, assim seria interessante analisar a secreção biliar em modelo de ligação do
ducto biliar em animais InsP
3
R2 KO ou ainda, investigar a ocorrência de modificações na
expressão ou localização de InsP
3
R e outros componentes da sinalização de Ca
2+
em
hepatócitos selvagens durante a evolução do quadro colestático neste modelo animal.
Sabe-se ainda que em patologias colestáticas humanas diretamente relacionadas a lesão
ou disfunção de ductos biliares, como a cirrose biliar primária e a colangite esclerosante
primária, ocorre redução da expressão de InsP
3
R3 (Shibao et al., 2003). Desse modo,
seria interessante investigar tanto a expressão quanto a localização de InsP
3
R1 e
InsP
3
R2 em hepatócitos de pacientes acometidos por este tipo de patologia.
Discussão
________________________________________________________________________
72
Embora não tenham sido foco do presente trabalho, os efeitos da ausência de
InsP
3
R2 na regulação do uso de glicose pelo fígado também poderiam ser estudos, visto
que Ca
2+
intracelular regula a atividade da glicogênio sintase (Blackmore et al., 1986),
além de modular a produção de ATP na matriz mitocondrial (Jouaville et al., 1999).
Em resumo, o presente estudo demonstra a importância da liberação de Ca
2+
pelos
receptores de InsP3 na regulação da atividade de Mrp2 e a sua influência sobre o
processo de secreção biliar.
Conclusão
________________________________________________________________________
73
CONCLUSÃO
Conclusão
________________________________________________________________________
74
CONCLUSÃO
A liberação de Ca
2+
mediada por InsP
3
R2 em hepatócitos regula a atividade
secretória de Mrp2.
Referências bibliográficas
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75
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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