Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação da atividade antiplasmódica in vitro dos óleos de
Andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e Pimenta-de-macaco
(Piper aduncum L).
Raimundo Nonato Cardoso Miranda Júnior
BELÉM - PA
2010
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Raimundo Nonato Cardoso Miranda Júnior
Orientador: Prof. Dr. José Guilherme Soares Maia
Co-orientadora: Prof
a
. Dr
a
Maria Fâni Dolabela
Avaliação da atividade antiplasmódica in vitro dos óleos de
Andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e Pimenta-de-macaco
(Piper aduncum L).
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, área de concentração:
Fármacos e Medicamentos, do Instituto
de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Pará como requisito para
obtenção do título de mestre em
Ciências Farmacêuticas.
BELÉM - PA
2010
ads:
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
Biblioteca Central/UFPA, Belém - PA
MOISÉS MESSIAS SÁ DA CUNHA
Miranda Júnior, Raimundo Nonato Cardoso, 1978 –
Avaliação da atividade antiplasmódica in vitro dos óleos de andiroba
(Carapa guianensis Aubl.) e pimenta-de-macaco (Piper aduncum L.) /
Raimundo Nonato Cardoso Miranda Júnior ; orientador, José Guilherme
Soares Maia ; co-orientadora, Maria Fâni Dolabela. – 2010.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará, Instituto de
Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Belém, 2010.
1. Matéria médica vegetal 2. Antimaláricos 3. Andiroba 4. Pimenta-
de-macaco I. Título.
CDD: 22. ed. 615.10724
Raimundo Nonato Cardoso Miranda Júnior
Avaliação da atividade antiplasmódica in vitro dos óleos de
Andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e Pimenta-de-macaco
(Piper aduncum L).
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas, área de concentração:
Fármacos e Medicamentos, do Instituto
de Ciências da Saúde da Universidade
Federal do Pará como requisito para
obtenção do título de mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Aprovado em: ______/_______/_______
Banca Examinadora:
Prof. Dr.: José Guilherme Soares Maia
Instituição: UFPA Assinatura:___________________________
Prof. Dr.: Milton Nascimento Silva
Instituição: UFPA Assinatura:___________________________
Prof. Dr.: José Luiz Fernandes Vieira
Instituição: UFPA Assinatura:___________________________
A Dolores e Nonato Miranda, meus queridos pais,
com amor e gratidão.
AGRADECIMENTO
A Deus por tudo que me concede na vida.
Ao meu orientador Prof. Dr. José Guilherme Maia pela orientação, apoio,
conhecimento, oportunidade de executar o projeto e por ter acreditado no meu
trabalho.
A minha co-orientadora Prof
a
. Dr
a
. Maria Fani Dolabela pela força, sabedoria e
grande ajuda durante o transcorrer do projeto.
A Universidade Federal do Pará pela formação acadêmica e de pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas.
A agência financiadora CAPES pelo patrocínio.
Ao Prof. Dr. Milton Nascimento da Silva, chefe do laboratório de cromatografia da
UFPA, pela valiosa contribuição, realizando e disponibilizando a análise fitoquímica
do óleo de andiroba e fração rica em limonóides.
A pesquisadora Dr
a
Marinete Póvoa, chefe do setor de malária do Instituto Evandro
Chagas, por permitir o desenvolvimento dos testes antimaláricos na referida
instituição.
A Prof
a
. Msc. Joyce Kelly do Rosário da Silva pela ajuda no tratamento estatístico
dos dados e pela colaboração no trabalho.
Ao Prof. Olinto Miranda pela ajuda com as fotografias dessa dissertação.
A aluna Ana Carolina do Laboratório de cromatografia, pela ajuda com o
fracionamento do óleo de andiroba.
Aos técnicos do Instituto Evandro Chagas José Maria e José Mário pelo apoio e
ajuda nos testes antimaláricos.
Aos professores do programa de pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da
faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Pará pelos ensinamentos de
tantos anos.
Aos meus pais, Dolores e Nonato Miranda, por toda dedicação, amor, compreensão
incentivo e apoio durante toda a minha vida.
Ao meu irmão Charles Miranda por toda compreensão, respeito e carinho.
A minha família: Maria, Fyamma, Felipe Gabriel, Lisbella, Nathália, Conceição e
Cláudia, pelo respeito e amor de sempre.
A Caroline Franco pelo amor, afeto e incentivo ao longo desses anos de
convivência.
Ao meu grande amigo, meu compadre, Mário Nunes por longos anos de amizade e
confiança.
Aos grandes amigos; Marcelo Marques, Paulo Neto, André Franco e Thiago Heleno
pela convivência e amizade.
Ao Médico Clayton Alencar e toda sua equipe, por ter me proporcionado melhores
condições de saúde
Aos colegas de turma pela força durante esses dois anos.
Aos funcionários da pós-graduação em Ciências Farmacêuticas pela ajuda sempre
dispensada.
A todos que contribuíram de alguma forma para realização e concretização de mais
essa etapa.
“A mente que se abre a uma nova idéia
jamais voltará ao seu tamanho original”
Albert Einstein.
RESUMO
MIRANDA JÚNIOR, R. N. C. Avaliação da atividade antiplasmódica in vitro dos
óleos de Andiroba (Carapa guianensis Aubl.) e Pimenta-de-macaco (Piper
aduncum L). 2010. 93f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal do Pará, Belém, 2010.
Na busca de novos antimaláricos, duas espécies típicas da região Amazônica e uma
fração rica em limonóides foram objeto deste estudo: Carapa guianensis Aubl.
(Meliaceae), conhecida popularmente como andiroba, utilizada tradicionalmente
como inseticida e no combate da malária. A espécie Piper aduncum L. (Piperaceae),
conhecida popularmente como pimenta-de-macaco, usada para tratar doenças
inflamatórias e a fração rica em limonóides fracionada do óleo de andiroba. Tanto os
óleos brutos como a fração foram submetidos a ensaios in vitro, segundo
metodologia descrita por Rieckman e colaboradores (1980) modificada por Carvalho
(1990) com os clones do Plasmodium falciparum W
2
e Dd
2
. Estes ensaios
demonstraram que os óleos apresentaram atividade antiplasmódica, sendo que na
concentração de 0,82ng/mL e 8,2μg/mL do óleo de andiroba a inibição do clone W
2
foi de 100% e do Dd
2
de 71% após 72h de exposição, respectivamente. Para a
fração na concentração de 3,1µg/mL o clone W
2
foi de 100% e do Dd
2
a de 82%
após 72h de exposição. O óleo de pimenta-de-macaco teve na concentração de
1,30ng/mL para o clone W
2
a inibição de 100% e para o Dd
2
a de 77%, após 72h de
exposição, para a concentração de 10,3µg/mL. Os resultados com o óleo de
pimenta-de-macaco, na concentração de 1,30ng/mL a inibição foi de 100% para
clone W
2
e para o clone Dd
2
, na concentração de 10,3µg/mL, a inibição foi de 77%
após 72h de exposição.
Palavras-chaves: Andiroba, Limonóides, Pimenta-de-macaco e Plasmodium
falciparum.
ABSTRACT
MIRANDA JÚNIOR, R. N. C. Evaluation of the activity antiplasmódica in vitro of
the oils of Andiroba (Carapa guianensis Aubl.) and Pimenta-de-macaco (Piper
aduncum L). 2010. 93f. Dissertation (Master's degree) – Faculdade de Farmácia,
Universidade Federal do Pará, Belém, 2010.
In search of new antimalarial drugs, two typical species of the Amazon region and a
fraction rich limonoids were the object of this study: Carapa guianensis Aubl.
(Meliaceae), known popularly as andiroba traditionally used as an insecticide and
fighting malaria, the species Piper aduncum L. (Piperaceae), known popularly as the
pimento-de-macaco, used to treat inflammatory diseases and the fraction rich
limonoids obtained from Carapa guianensis. Crude oil and fraction were tested in
vitro using methods described by Rieckman and col. (1980) modified by Carvalho
(1990) with Plasmodium falciparum clones W
2
and Dd
2
. These studies showed that
the oils had antiplasmodial activity, with a concentration of 0.82ng/mL and 8.2mg/mL
andiroba oil showed an inhibition he W
2
clone was 100% and Dd
2
to 71% (IC
50
9.4
µg/ml) after 72h of exposure respectively. For the fraction at a concentration of
3.1mg/mL, clone W
2,
was 100% and Dd
2
to 82% (IC
50
0.4 µg/ml), after 72h of
exposure. The pimento-de-macaco oil overalls had a concentration of 1.30ng/mL for
the W
2
clone inhibition of 100% and the Dd
2
to 77% after 72h of exposure to a
concentration of 10.3mg/mL. The results with the chili oil overalls at a concentration
of 1.30ng/ml the inhibition was 100% in clone W
2
and Dd
2
clone at a concentration of
10.3mg/mL, inhibition was 77% after 72h of exposure.
Keyword: Carapa guianensis, limonoids, Plasmodium falciparum and Piper aduncum
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
17
Figura 2
18
Figura 3
23
Figura 4
23
Figura 5
24
Figura 6
24
Figura 7
25
Figura 8
27
Figura 9
28
Figura 10
30
Figura 11
32
Figura 12
36
Figura 13
48
Figura 14
49
Figura15
51
Figura 16
52
Figura 17
53
Figura 18
53
Figura 19
54
Figura 20
54
Figura 21
55
Figura 22
56
Figura 23
58
Figura 24
62
Figura 25
63
LISTA DE QUADROS
Quadro 1
Comparação da atividade antiplasmódica de espécies de
Meliaceae-----------------------------------------------------------------------
69
Quadro 2
Atividade antiplasmódica do óleo de P. aduncum -------------------
73
Quadro 3
Comparação da composição química do óleo de P. aduncum
obtido neste projeto ao descrito na literatura--------------------------
74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Concentrações dos OA e OPM para o clone Dd
2
--------------------
59
Tabela 2
Concentrações dos OA e OPM para o clone W
2
---------------------
59
Tabela 3
Estabilidade das emulsões e presença de hemólise----------------
61
Tabela 4
Percentual de inibição do OA pelo tempo para o clone Dd
2
-------
62
Tabela 5
Taxa de inibição da fração rica em limonóides frente ao clone
Dd
2------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
63
Tabela 6
Taxa de inibição do OA e FR contra o clone Dd
2
---------------------
64
Tabela 7
Taxa de inibição do OA e FR contra o clone W
2
----------------------
64
Tabela 8
Taxa de inibição do OPM contra o clone Dd
2
--------------------------
65
Tabela 9
Taxa de inibição do OPM contra o clone W
2
---------------------------
65
Tabela 10
CI
50
do OA, FR, OPM e Cloroquina--------------------------------------
66
Tabela 11
Constituintes identificados no óleo de P. aduncum------------------
67
LISTA DE ABREVIATURAS
CEM
Campanha de Erradicação da Malária
CI
50
Concentração inibitória 50%
CIM
Concentração inibitória mínima
CL
50
Concentração letal 50%
CT
Concentração tóxica
DDT
Dicloro-Difenil-Tricloroetano
DEET
N.N-dietil-meta-toluamida
DL
50
Dose letal 50%
FUNASA
Fundação Nacional de Saúde
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IPA
Índice de Parasitário Anual
OA
Óleo de andiroba
OPM
Óleo de pimenta-de-macaco
PIACM
Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária
PNCM
Plano de Nacional Controle da Malária
UR
Umidade Relativa
LISTA DE SÍMBOLOS
°C
Graus Celsius
cm
Centímetro
cm
3
Centímetro cúbico
ev
Eletronsvoltos
g
Grama
m
3
Metro cúbico
mL
Mililitro
mm
Milímetro
ng
Nanograma
ppm
Parte por milhão
RPM
Rotação por minuto
mg
Micrograma
μL
Microlitro
SUMÁRIO
Resumo
Abstract
Lista de Figuras
Lista de Quadros
Lista de Tabelas
Lista de Abreviaturas
Lista de Símbolos
1
INTRODUÇÃO-----------------------------------------------------------------
16
2
REVISÃO DA LITERATURA-----------------------------------------------
21
2.1
Carapa guianensis------------------------------------------------------------
21
2.2
Pipe aduncum------------------------------------------------------------------
31
2.3
Malaria e suas ferramentas para a busca de novos fármacos---
37
3
OBJETIVOS--------------------------------------------------------------------
40
3.1
OBJETIVO GERAL-----------------------------------------------------------
40
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS-----------------------------------------------
40
4
METODOLOGIA---------------------------------------------------------------
41
4.1
Materiais e Métodos---------------------------------------------------------
41
4.1.1
Equipamentos------------------------------------------------------------------
41
4.1.2
Material e Reagentes---------------------------------------------------------
41
4.1.3
Meio de Cultivo-----------------------------------------------------------------
42
4.1.4
RPMI 1640----------------------------------------------------------------------
42
4.1.5
Meio de Lavagem--------------------------------------------------------------
42
4.1.6
Meio Completo-----------------------------------------------------------------
42
4.1.7
Solução de estoque de Giemsa--------------------------------------------
43
4.1.8
Solução salina a 1,6% e 12%----------------------------------------------
43
4.1.9
Solução salina a 0,9%--------------------------------------------------------
43
4.1.10
Água Tamponada--------------------------------------------------------------
43
4.1.11
Azul de Metileno---------------------------------------------------------------
44
4.1.12
Plasma Humano---------------------------------------------------------------
44
4.1.13
Hemácias Humanas----------------------------------------------------------
44
4.2
Óleo de Andiroba--------------------------------------------------------------
44
4.2.1
Técnica para separação e purificação-----------------------------------
45
4.2.1.1
Cromatografia------------------------------------------------------------------
45
4.2.1.2
Cromatografia em coluna----------------------------------------------------
45
4.2.1.3
Cromatografia em Camada Delgada Comparativa-------------------
46
4.2.1.4
Reveladores de placas-------------------------------------------------------
46
4.3
Obtenção do OPM-------------------------------------------------------------
46
4.3.1
Material botânico---------------------------------------------------------------
46
4.3.2
Obtenção do óleo--------------------------------------------------------------
47
4.3.3
Análise do óleo essencial----------------------------------------------------
47
5
Avaliação da Atividade Antiplasmódica----------------------------------
47
5.1
Descongelamento dos clones de P. falciparum------------------------
47
5.2
Cultivo do P.falciparum-------------------------------------------------------
48
5.3
Coloração da gota espessa e esfregaço e determinação da
parasitemia----------------------------------------------------------------------
49
5.4
Sincronização dos Parasitas------------------------------------------------
50
5.5
Criopreservação dos clones de P.falciparum---------------------------
50
5.6
Microteste in vitro--------------------------------------------------------------
50
5.6.1
Padronização da emulsão---------------------------------------------------
50
5.6.1.1
Óleo de andiroba--------------------------------------------------------------
50
5.6.1.2
Óleo de pimenta-de-macaco------------------------------------------------
55
5.6.1.3
Cálculo da densidade---------------------------------------------------------
56
5.6.1.4
Ensaio para avaliação da atividade antiplasmódica------------------
57
6
RESULTADOS-----------------------------------------------------------------
60
6.1
Fracionamento da amostra--------------------------------------------------
60
6.2
Avaliação da atividade antiplasmódica-----------------------------------
60
6.3
Composição do OPM---------------------------------------------------------
66
7
DISCUSSÃO--------------------------------------------------------------------
68
7.1
Carapa guianensis------------------------------------------------------------
68
7.2
Fração rica em limonóides--------------------------------------------------
70
7.3
Piper aduncum-----------------------------------------------------------------
72
6
CONCLUSÕES----------------------------------------------------------------
76
7
REFERÊNCIAS----------------------------------------------------------------
77
16
1. INTRODUÇÃO
A malária é uma doença que se caracteriza por acessos intermitentes de
febre, calafrios, cefaléia e sudorese. É causada por protozoários do gênero
Plasmodium, filo Apicomplexa, classe Sporozoa, ordem Hemosporidiida e família
Plasmodiidae. Apenas as espécies Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum,
Plasmodium malarie e Plasmodium ovale infectam o homem (FERRAZ, 2002;
MILLER et al., 2002; BRASIL, 2005; QUEIROZ et al., 2008).
A malária representa um problema de saúde pública, visto que milhões de
pessoas são infectadas por ano, principalmente em países como os da África Sub-
Saariana. Trata-se de uma doença endêmica com uma incidência anual de 350-500
milhões de casos, que resultam na morte de 1,5-2 milhões de pessoas,
especialmente em decorrência da forma complicada da doença, que ocorre
principalmente em crianças e gestantes. A África Tropical congrega mais de 90%
dos casos clínicos de malária no mundo, sendo que 75% dos quais incidem sobre
crianças com menos de 5 anos (ALVES et al., 2000; WHO, 2002; WHO, 2005).
Na América Latina, o maior número de casos (99%) é registrado na Amazônia
brasileira, com uma incidência de 400-700 mil ao ano (BRASIL, 2005). As infecções
no Brasil mais freqüentes são causadas pelos P. vivax, (79.6%) e P. falciparum
(19.3%) (BRASIL, 2008). A Incidência Parasitária Anual (IPA) (Figura 1, pág. 17) é o
índice que classifica o grau de risco de se adoecer de malária no Brasil: alto risco
(IPA ≥50/1.000 habitantes), médio risco (entre 10 – 49/1.000 hab.) e baixo risco (IPA
< 10/1.000 hab.) (SILVEIRA et al., 2001, WHO, 2004).
17
Figura 1: Mapa de risco de transmissão da malária por município de infecção, 2007.
Fonte: Sivep malária/SVS/MS, Brasil, 2008 - *n: número de municípios
A doença é transmitida pela fêmea do mosquito do gênero Anopheles, que
durante o repasto sanguíneo inocula no homem, o protozoário Plasmodium (Figura
2, pág. 18), passando a retransmiti-lo, sendo o Anopheles darling e o A. albitarsis as
espécies mais importantes na transmissão da malária na Amazônia (PÓVOA et al.,
2006). Durante o repasto sanguíneo inocula os parasitas (esporozoítos) no tecido
subcutâneo e com menor freqüência na corrente sanguínea. Há evidências que
estas formas passam por vários hepatócitos, antes do desenvolvimento da infecção.
Nas células do fígado, os esporozoítos se diferenciam em trofozoitas, que se
reproduzem assexuadamente, por esquizogonia, dando origem aos esquizontes
teciduais e posteriormente aos merozoítas que invadem os eritrócitos terminando a
fase exo-eritrocítica (MILLER et al., 2002).
A invasão das hemácias ocorre quando os parasitas reconhecem os
receptores destas células, e os canais se reorganizam formando um cruzamento e
uma sinalização. O parasita induz a formação de um vacúolo na membrana
plasmática das hemácias, por onde entram. Quando os merozoítas teciduais
invadem as hemácias, se inicia o ciclo eritrocítico. O desenvolvimento do parasita no
eritrócito também ocorre por esquizogonia, com formação de novos merozoítas que
18
invadirão outras hemácias. Após algum tempo estes merozoítas sanguíneos sofrem
diferenciação em estágios sexuados, os gametócitos que não mais se dividem,
serão injetados pelo mosquito, durante o repasto sanguíneo, completando o ciclo
(MILLER et al., 2002).
Figura 2: Ciclo do Plasmodium sp
Fonte: modificada de Winzeler, 2008.
A quimioterapia da malaria teve inicio no século XVII. Os jesuítas que vieram
para a America do Sul observaram que os índios do Peru utilizavam plantas do
gênero Cinchona spp (familia Rubiaceae), conhecidas popularmente por quinas,
para o tratamento de doenças febris. Estudos fitoquímicos de Cinchona spp na
Europa, no inicio do século XIX, levaram ao isolamento do quinina que apresentou
atividade antimalárica (VALE et al., 2005; FRANÇA et al., 2008; NKRUMAH et al.,
2009; OLIVEIRA et al., 2009). Devido a alta toxicidade da quinina (FRANÇA et al.,
2008), tornou-se necessário buscar drogas menos tóxicas, sendo obtida a cloroquina
(COOPER & MAGWERE, 2008). Este fármaco foi amplamente utilizado para o
tratamento da malária causado por P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. falciparum
(CRAVO & VIRGILIO, 2002).
19
No século XX, se acreditava que a combinação do uso de inseticida,
principalmente o dicloro-difenil-tricloroetano (DDT), e o tratamento dos doentes fosse
suficiente para a erradicação da malaria no Brasil. Sendo assim, em 1965 foi criada
a Campanha de Erradicação da Malária (CEM), que apresentou bons resultados em
várias regiões do país menos na região Amazônica, devido às questões geográficas
e de ocupação (LOIOLA et al., 2002 ). Contudo, com o emprego destas medidas foi
observado crescente resistência dos mosquitos aos inseticidas e do P. falciparum
aos fármacos. Assim nos anos 90, a luta contra malária se baseava em fornecer
diagnóstico precoce efetivo, tratamento imediato e eficaz da doença e planejamento
e programação de medidas preventivas. Entretanto estas medidas não foram
suficiente, o que levou a implantação do Plano de Intensificação das Ações de
Controle da Malária (PIACM) e posteriormente ao Plano Nacional de Controle da
Malária (PNCM) com objetivo de fornecer diretrizes no combate da malária, aos
governos federal, estadual e municipal (ROCHA et al., 2006).
A grande exposição do P. falciparum à cloroquina contribuiu para o
aparecimento de cepas resistentes (CRAVO & VIRGILIO, 2002; KETEMA et al.,
2009). Hoje, além da cloroquina, o P. falciparum apresenta resistência a diversos
outros antimaláricos, tornando o seu tratamento um desafio (BRASIL, 2005).
No inicio do século XXI preconizou-se a utilização dos derivados da
artemisinina associado a outros fármacos para o tratamento da malária falciparum,
porém em estudos recentes envolvendo 40 pacientes infectados com Plasmodium
falciparum em Palin, Camboja, e outros 40 em Wang Pha, noroeste da Tailândia,
demonstrou que no grupo cambojano o tempo de depuração do parasita foi de 84h e
48h para o grupo tailandês, sendo que a parasitemia diminui em 72h com a
artemisinina (DONDORP et al., 2009). Tendo em vista, esses casos de resistência a
artemisinina (extraída da Artemisia annua L) e seus derivados na Ásia (WALKER et
al., 2000; MUGITTU et al., 2006; RODRIGUES et al., 2006; HUNT et al., 2007;
WHO, 2007). Esse fato tem servido de alerta para órgãos governamentais e
científicos para a importância de buscar novos fármacos (MARQUES et al., 2005;
SAEWAN et al., 2006; LEE et al., 2007; MOHAMAD et al., 2009).
Nesse contexto, este trabalho se justifica, pois se baseou em informações
etnofarmacêutica, isto é, a família Meliaceae muito utilizada para tratamento da
20
malária (RASOANAIVO et al., 1992; LEAMAN et al., 1995; CARABALLO et al.,
2004). Assim como, a família das Piperaceae, também, popularmente utilizados para
tratamento de várias doenças inflamatórias, bacterianas e parasitárias, dentre elas a
malária (FENNER et al., 2006; PENIDO et al., 2006; FOURNET et al., 1996; GAZIM
et al., 2007; REGASINI et al., 2009; KAOU et al., 2008).
Sendo assim, a avaliação antiplasmódica do óleo de andiroba (OA), rico em
limonóides (AMBROZIN et al., 2006), extraído da Carapa guianensis (Meliaceae),
como do Piper aduncum do qual se extraiu o óleo de pimenta-de-macaco (OPM) são
pertinentes. A avaliação do potencial antimalárico das plantas utiliza extratos, como
o extrato aquoso e metanólico da Lansium domesticum (Meliaceae) com atividade
antiplasmódica frente ao plasmódio 3D
7
reduzindo a parasitemia em mais 50%
(YAPP et al., 2003) e o extrato etanólico de Piper sp que também apresentou boa
atividade antiplasmódica contra o Plasmodium falciparum resistente a cloroquina
(VALADEAU et al., 2009), substâncias puras como os diterpenos em que da
Scoparia dulcis um ácido tetracíclico diterpeno (ácido scopaducíclico A), apresentou
atividade contra o clone D
6
e W
2
(CI
50
27 e 19μM, respectivamente) (KIRANDEEP et
al., 2009) e limonóides como azaradiona e epoxidoazaradiona com atividade
antiplasmódica frente ao P.falciparum (K
1
) com de CI
50%
2,91μg/mL e 3,18μg/mL
(MANEERAT et al., 2008), respectivamente.
21
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Carapa guianensis
Carapa guianensis Aubl., conhecida popularmente como andiroba, andiroba-
saruba, iandiroba, carapa e nandiroba (FISCH et al., 1995; LORENZI, 1992; BICKII
et al., 2000; MUELLNER et al., 2003), pertence à família Meliaceae que é composta
por 50 gêneros e aproximadamente 575 espécies. A família Meliaceae pertence à
ordem das Rutales, subdividida em quatro subfamílias, se destacando as Melioideae
e Swietenioideae que são as maiores, constituídas de 7 tribos e 35 gêneros e 3
tribos e 13 gêneros, respectivamente (PENNINGTON e STYLES, 1975 apud
MUELLNER et al., 2003). No Brasil é representada por 7 gêneros, Cedrela,
Cabralea, Swietenia, Carapa, Guarea, Trichilia e Khaya (GUIMARÃES et al., 2004).
O gênero Carapa pertencente à subfamília Swietenioideae sendo composto por
duas espécies, C. procera e C. guianensis (PENNINGTON et al., 1981).
A família tem distribuição nos trópicos de todo o planeta, com pequena
penetração nas zonas temperadas (JOLY, 1987). A primeira espécie C. procera
ocorre na África e América do Sul, em especial na Guiana Francesa, Suriname e
Brasil. Já a C. guianensis ocorre da América Central até o norte da América do Sul,
sendo encontrado na Venezuela, Equador, Colômbia, Peru e Brasil. No Brasil as
duas espécies ocorrem principalmente no estado do Amazonas e são conhecidas
como andiroba, andirova, carapinha e iandiroba (FISCH et al., 1995; FERRAZ &
SAMPAIO, 1996; VINSON et al., 2005; AGRA et al., 2007).
Plantas pertencentes à Meliaceae, em geral, são arbóreas e de grande porte,
com folhas grandes, de crescimento apical (da raque), sem estípulas, ás vezes com
pulvinos na base, pinadas, bipinadas ou unifoliadas. Flores pequenas actinomorfas,
em inflorescências paniculadas terminais ou nas axilas superiores, hermafroditas,
cíclicas, diclamídeas, de simetria radical. Sépalas e pétalas livres. Estames em
número duplo ao das pétalas em geral com filetes alargados soldados em um tubo,
com as anteras fixas na porção superior interna. Ovário súpero, com 4 a 5 carpelos e
outros tantos lóculos, cada qual com 1 ou 2 óvulos. Fruto drupa, baga ou capsular
loculicida ou baciforme. Sementes com arilo ou aladas presas à columela. As não
aladas podem ser elipsódes, plano-convexas ou angulosas, cobertas ou não por
22
sarcotesta ou um arilóide. O embrião é geralmente reto, com cotilédones planos ou
planos-convexos, com eixo radícula-hipocótilo incluso ou externo. No gênero
Carapa, os cotilédones são muito crassos, fusionados entre si (GEMTCHÚJNICOU,
1976; JOLY, 1987; BARROSO, 1991; MUELLNER, 2003).
Carapa guianensis (Figura 3, pág., 23) é constituída por folíolos medindo de
80 a 110 mm de comprimento, podendo atingir 30m de altura e 1,20m de largura,
ocorrendo em toda a região Amazônica, em várzeas secas e alagadiças, beiras de
rios e igarapés do Pará até a Bahia. A madeira (Figura 4, pág., 23) moderadamente
pesada (densidade de 0,73g/cm
3
), dura, porém fácil de fender, superfície
ligeiramente áspera ao tato, textura média, pouco resistente às intempéries, contudo
inatacável por insetos, alburno pouco diferenciado. Floresce duas vezes ao ano,
agosto-setembro e janeiro-fevereiro, já os frutos amadurecem em junho-julho e
fevereiro-março (LORENZI, 1992; AMBROZIN et al., 2006). A casca (Figura 5, pág.,
24) cinzenta e grossa; folhas (Figura 6, pág. 24) impinadas ou abrupto-impinada
composta por inúmeros folíolos subopostos, elíptico-oblongo; flores pequenas,
amarelas ou vermelhas, axilares; fruto capsular ovóide semi-globoso, lenhoso;
número variado de sementes vermelhas, coriáceas e quase lenhosas, convexas,
angulosas ou irregularmente tetraédricas, achatadas lateralmente (CORRÊA, 1926).
Quanto à floração essa ocorre de agosto a outubro, e a frutificação de janeiro a abril
(SHANLEY et al., 1998). Também foi contatada a ocorrência de floração no estado
do Pará, durante a estação chuvosa (fevereiro e março) (SAMPAIO, 2000).
23
Figura 3: Árvore de andiroba (Carapa guianensis Aubl.)
Fonte: Boufleuer, 2004
Figura 4: Madeira de andiroba
Fonte: modificado de LOREZZI, 1992
24
Figura 5: Casca de andiroba
Fonte: modificado de LOREZZI, 1992
Figura 6: Folhas de andiroba
Fonte: LOREZZI, 1992
Em termos econômicos, a madeira das Meliaceas possui ótima qualidade, por
isso são bastante usadas na indústria de móveis, construção de barcos e navios
(MENDONÇA, et al., 2007). Por suas propriedades físicas e mecânicas a madeira de
andiroba alcançou o mercado de países como o Japão, EUA e Alemanha. Na
primeira metade da década de 90, a produção de madeira serrada exportada pelo
estado do Pará variou ano a ano, porém alcançando valores superiores a 13.400 m
3
,
com preço médio de US$ 227,00/m
3
(FERRAZ et al., 2003). Com a espécie C.
25
guianensis, além da madeira, as sementes (Figura 7, pág., 25) são utilizadas para
extração do óleo. As indústrias farmacêuticas e de cosméticos têm grande interesse
utilizando-o em alguns produtos como; shampoos, condicionador, sabonetes e
cremes hidratantes (BOUFLEUER, 2004; FERRARI et al., 2007).
Diferente da extração madeireira, a coleta das sementes demanda um
pequeno investimento e os subprodutos oriundos do óleo, como sabonetes e velas,
são revendidos em feiras livres do Norte do país, tendo um grande impacto na
economia de alguns estados da região (MENDONÇA et al., 2007).
A produção de uma árvore de andiroba pode variar de 50 a 200Kg de
semente/ano (RIZZINI & MORS, 1976; SHANLEY et al., 1998). As sementes
quando acondicionadas em sacos plásticos permanecem viáveis por um longo
período, até sete meses, desde que mantidas em câmara úmida (14
o
C e 80% de
U.R) ou câmara seca (12
o
C e 30% de U.R) (FERRAZ & SAMPAIO, 1996).
Figura 7: Sementes de andiroba
Fonte: Lorenzzi, 1992
26
O óleo obtido de C. guianensis é utilizado popularmente para o tratamento de
doenças febris, malária, como repelente para insetos (MILLIKEN, 1997), coceiras em
geral, cicatrizantes de ferimentos, antiinflamatório (AMBROZIN et al., 2006), dores
no pescoço (torcicolo) e traumatismos (MENDONÇA et al., 2007). Também tem sido
utilizado pelos raizeiros e vendedores de mercados populares para a prevenção do
câncer de pele, pois de acordo com a informação popular este óleo proteger a pele
dos danos do sol, apresentando assim uma suposta atividade fotoprotetora
(FERRARI et al., 2007).
Alguns estudos avaliando o potencial farmacológico deste óleo já foram
realizados. A avaliação da atividade repelente foi realizada utilizando larvas de
Aedes aegypti, onde se observou um elevado potencial (MENDONÇA et al., 2005).
Em estudo realizado com voluntários, que submeteram seus antebraços recobertos
com óleo de andiroba a 100%, DEET 50% (N.N-dietil-meta-toluamida) como controle
positivo, óleo de soja refinado, óleo de andiroba a 15% e na ausência de produto
(controle negativo), a picada das fêmeas do Aedes sp. Após aferição do tempo da
primeira e terceira picada, foi observado um discreto efeito repelente do óleo de
andiroba a 100%, quando comparado ao óleo de soja refinado, óleo de andiroba a
15% e o controle negativo, sendo significativamente inferior ao inseticida (DEET
50%) (MIOT et al., 2004).
O potencial carapaticida do óleo de andiroba foi avaliado sobre fêmeas
ingurgitadas de Anocentor nitens e Rhipicephalus sanguineus, coletadas
manualmente, respectivamente, de equinos e de cães naturalmente infestados.
Observou-se mortalidade das fêmeas ingurgitadas e redução de postura, neste caso,
com ovos inférteis, demonstrando eficácia de 100% nas duas espécies em todas as
diluições testadas e a potencialidade do uso do extrato de andiroba contra estes
parasitas (FARIAS et al., 2009).
Outro estudo avaliou o potencial fotoprotetor, e ao analisar a fitoquímica do
óleo de andiroba (CORRÊA, 1984; QI et al., 2004) verificou-se que não há
metabólitos com possível ação fotoprotetora. Quando submetido à avaliação de seu
potencial fotoprotetor confirmou-se que este óleo não apresentar ação fotoprotetora
(FERRARI et al., 2007), porém possui atividades emoliente (FRANQUILINO, 2006),
antiinflamatória (FERRARI, 1998; PENIDO et al., 2006) e de repelente de insetos
27
(MIOT et al., 2004; MENDONÇA et al., 2005) que podem ser benéficas para o
consumidor em formulações fotoprotetoras e até mesmo servir como um apelo de
marketing para o produto (FERRARI et al., 2007).
Em estudos de toxicidade reprodutiva com ratas Wistar, durante 45 dias com
administração oral do óleo de andiroba, após analise dos índices de fertilidade,
viabilidade, lactação, gestação, relação prole/mãe, percentual de natimorto e massa
corpórea da prole, foi visto que o óleo de andiroba não induziu toxicidade materna,
efeito abortivo, assim como não alterou o desenvolvimento normal da prole e seus
parâmetros comportamentais (COSTA-SILVA et al., 2006). Estes resultados
sugerem que o possui baixo potencial teratogênico.
O óleo é constituído de ácido palmítico (1), oléico (2) (cerca de 50%) e
linoléico (3) (Figura 8, pág., 27) (CASTRO et al., 2006), além de uma fração
insaponificável (2 a 5%) constituída principalmente de substâncias amargas,
chamadas meliacinas ou limonóides, que provavelmente são responsáveis pela
atividade biológica do óleo (AMBROZIM et al., 2000; AMBROZIM et al., 2006). Já
foram isolados deste óleo sete limonóides: 17β-hidroxiazadiradiona (4), 6α-acetoxi-
gedunina (5), 7-deacetoxi-7-oxogedunia (6), deacetilgedunina (7), andirobina (8),
gedunina (9) , metil-angolesato (10) (Figura 9, pág., 28) (AMBROZIN et al., 2006;
SILVA et al., 2009).
Figura 8: Constituintes do óleo de andiroba
28
Figura 9: Limonóides isolados da C. guianensis.
29
Quimicamente, os limonóides são tetranortriterpenóides altamente
oxigenados (SILVA, 2009; MOHAMAD et al., 2009) polaridade moderada, insolúvel
em água, todavia solúvel em hidrocarbonetos, álcool e acetona (ROY et al., 2006)
isolados tanto de Meliaceae, quanto de Rutaceae e Cneoraceae. Sua rota
biossintética tem origem em um triterpeno que gera um tetranortriterpenóide pela
perda de quatro átomos de carbono do precursor original, essa rota envolve várias
reações que levam a formação de diferentes estruturas, mas que, geralmente,
possuem 26 átomos de carbono no esqueleto básico (SIMÕES, 2007).
A atividade antiplasmódica de alguns limonóides presentes no óleo de
andiroba foi avaliada utilizando dois clones de Plasmodium falciparum, o primeiro
sensível à cloroquina (D
6
) e o segundo resistente a cloroquina (W
2
). Dentre os
limonóides a gedunina mostrou maior potencial antimalárico, visto possuir menor
concentração inibitória média para o clone Plasmodium falciparum resistente a
cloroquina W
2
(CI
50
20ng/mL) (MACKINNON et al., 1997). Outro estudo avaliou a
atividade antiplasmódica gedunina (9) frente ao Plasmodium falciparum sendo
observada uma CI
50
em cerca 1µM, depois de 48h de exposição e 0,3µM, depois de
96h de exposição. (KHALID et al., 1986). Segundo Rochanakij e colaboradores
(1985) a gedunina apresentou atividade antiplasmódica frente ao clone D
6
de
Plasmodium falciparum (CI
50
= 720ng/mL) (KIRANDEEP et al., 2009).
Além da gedunina outros limonóides também demonstraram atividade
antimalárica como os limonóides trichirubina A e B (CI
50
0,3 e 0,2µg/mL,
respectivamente) isolados da Trichilia rubescens. Esses limonóides têm sua
atividade atribuída à presença de grupos fortemente reativos no anel A com a
carbonila no carbono C-3 e à insaturação nos carbonos C-1/C-2 (KIRANDEEP et al.,
2009).
Quando se compara a gedunina (9) a 1,2-dihidro-gedunina (11), onde foi
realizada uma redução na dupla ligação no anel A, a atividade antiplasmódica da
1,2-diidro-gedunina foi muito menor (CI
50
> 10.000 ng/mL) que o da gedunina (CI
50
39ng/mL) para o clone sensível a cloroquina D
6
(MACKINNON et al., 1997).
Outra modificação molecular da gedunina foi realizada, isto é através da
epoxidação foi obtido a 1,2-epoxi-gedunina (12). Seu potencial antiplasmódico foi
avaliado, sendo este inferior ao da gedunina (CI
50
2580ng/mL e CI
50
980ng/mL) para
30
os clones D
6
e W
2
, respectivamente. Outra alteração estudada foi à troca do grupo
acetato do anel B nos derivados 7-deacetoxi-gedunina (13) (CI
50
2610ng/mL) e 7-
cetogedunina (14) (Figura 10, pág., 30) (CI
50
> 10.000ng/mL) para o clone D
6
, que
demonstraram também a diminuição de atividade frente ao clone de P. falciparum
(MACKINNON et al., 1997).
Figura 10: Estruturas químicas dos derivados da gedunina
Além do óleo, alguns extratos obtidos de C. guianensis foram submetidos a
diferentes tipos de ensaios biológicos e farmacológicos. O extrato etanólico obtido
das folhas de C. guianensis foi avaliado quanto à atividade antibacteriana e
cicatrizante, sendo a taxa de cura avaliada pela taxa de contração da ferida, período
de epitelização,
força de ruptura da pele, peso de tecido de granulação. Os
resultados indicaram ausência de atividade antibacteriana, porém apresentou
atividade cicatrizante (NAYAK et al., 2009).
31
Através do ensaio fluorimétrico e com Hipoxantina marcada avaliou-se a
atividade antiplasmódica do extrato C. guianensis, onde se obteve CI
50
(concentração inibitória 50%) superior a 50
para o P. falciparum (CORBETT et al.,2004).
Em estudo, in vitro, da atividade antineoplásica e citotóxica de dois extratos:
metanólico e etéreo das sementes de C. guianensis, contra linhagens de células
tumorais de carcinoma de boca (KB) e adenocarcinoma de mama (MCF7) e não-
tumoral de fibroblastos (NIH/3T3), contatou-se que o extrato metanólico teve ação
antineoplásica, mas não citotóxica, contra células KB, CI
50
58,74µg/mL e CT
(concentração tóxica) de 65,01 µg/mL, e que o extrato etéreo frente as célula não-
tumoral (3T3) revela crescimento e não leva à morte celular. Ou seja, o extrato
etéreo não possui atividade antiproliferativa e/ou citotóxica nesta linhagem celular,
permitindo o crescimento normal da célula (OLIVEIRA et al., 2008).
2.2. Piper aduncum
A família Piperaceae pertence à ordem das Piperales sendo composta por 10
a 12 gêneros com cerca de 2000 espécies distribuídas em todas as regiões tropicais.
No Brasil, a família é representada por 5 gêneros, tendo o gênero Piper como um
dos maiores, com cerca de 260 espécies, sendo que a Amazônia abriga próximo de
140 espécies (MAIA et al., 1998; JARAMILLO & MANOS, 2001; GUIMARÃES et al.,
2004). O gênero Piper é um dos maiores da família, com cerca de 1.000 espécies,
dentre elas o Piper aduncum L. (NUNES et al., 2007).
Esta família inclui plantas com hábitos predominantemente herbáceos
(trepadeiras, arbustos e até arvores), de distribuição pantropical. Quanto aos
aspectos botânicos, as folhas são inteiras, com predomínio da disposição alternada,
com estípulas, que muitas vezes estão soldadas simulando uma bainha.
Inflorescência em geral espiciforme. Flores muito pequenas, aclamídeas,
hermafroditas, raramente diclinas, protegidas por uma ou duas bractéolas
pediceladas ou sésseis, geralmente petaladas. O caule se apresenta articulado (com
nós e entre nós) com articulações intumescidas. Androceu composto por 1 a 10
estames livres, com anteras bitecas ou unitecas, risomas. Ovário súpero com 2 a 5
32
carpelos, unilocular com um único óvulo, basal, ortótropo. Estilete comumente
faltando e estigma papiloso. Fruto pequeno, drupáceo, carnoso. Semente com
perisperma e endosperma escasso e embrião reduzido (GEMTCHÚJNICOU, 1976;
JOLY, 1987; BARROSO, 1978).
A espécie Piper aduncum L conhecida popularmente como pimenta-de-
macaco e aperta-ruão (MAIA et al., 2000), é arbusto ou arvoreta de 2 a 7m (Figura
11, pág., 32), bastante nodoso; folhas membranáceas ou cartáceas, elípticas,
elíptico-ovaladas ou elíptico-lanceoladas ápices curtamente acuminado, base
assimétrica arredondada ou codiforme, opacas em ambas as faces, sendo a inferior
finamente pubescente, nervação com pêlos quase adpressos espigas alongadas,
flores minúsculas e frutos obpiramidais; frutos drupa amarelada, com minúsculas
sementes marrons (ALBUQUERQUE apud MAIA et al., 2000).
Figura 11: Piper aduncum L
Fonte: MAIA et al., 2000
No Brasil distribuem-se pelos Estados da região Norte e Nordeste (MAIA et
al., 2000). Esta espécie é considerada uma planta oportunista que invade áreas
desflorestadas após exploração de madeira, de alta rusticidade e elevada resistência
às mudanças climáticas (SOUSA et al., 2008).
33
O gênero Piper apresenta boa representatividade comercial e destaque no
cenário econômico, sendo a espécie indiana Piper nigrum, produtora da pimenta-do-
reino, a mais difundida no mundo. O Piper hispidinervum, uma espécie nativa da
Amazônia brasileira, conhecida como pimenta-longa, tem despertado grande
interesse como fonte para obtenção de safrol. As maiores aplicações do safrol é a
sua conversão para piperonal e butóxido de piperolina, sendo o primeiro um fixador
de fragrância e o último um agente sinérgico das piretrinas, na formulação e
estabilização e potencialização de um inseticida biodegradável (SOUTO, 2006;
NUNES et al., 2007).
O gênero Piper é muito utilizado na medicina popular da America Latina e
Oeste da Índia. O extrato clorofórmio de P. aborescens apresentou significativa
atividade contra cultura de células KB e em culturas de células de leucemia
linfocítica, P-388, e o P. sylvaticum como antídoto eficaz, contra picadas de serpente
na Índia (PARMAR et al., 1997). Na Jamaica foi constatado o uso de 11 espécies do
gênero Piper dentre elas o Piper aduncum no combate de dores estomacais e
repelentes de insetos. As raízes e frutos do P. chaba utilizado contra asma,
bronquite e febre. O P. amalago, distribuído do México ao Brasil, utilizado com ação
antiinflamatória (PARMAR et al., 1997).
As folhas de Piper futokatsura Sieb., nativa da Taiwan e Japão são utilizadas
como inibidores da alimentação para larvas de Spodoptera litura Fabricius (MATSUI
e MUNSKATA, 1975) e também as folhas de Piper umbellatum L., Piper hispidum
Sw., Piper auritum Kunth, nativas da América Central e Nordeste da bacia
Amazônica, são utilizadas pela população local na prevenção da malária e para
remover piolhos. (SCHULTES, 1980 apud SOUTO, 2006).
Estudos com adultos de Sitophilus zeamais, para avaliação do efeito
inseticida por ação de contato (impregnação em papel de filtro), tópica e fumigação
com os óleos de Piper hispidinervum e P. aduncum. Foi observado que os óleos
apresentam efeitos inseticidas, dependendo da via de exposição. O Piper
hispidinervum foi mais eficaz pela via de contato (CL
50
0,51µL. cm
-2
) e o P. aduncum
pela via de exposição por fumigação (CL
50
0,56g/mL). Entretanto no método de
contato por aplicação tópica, os índices de toxicidade dos óleos foram semelhantes,
34
DL
50
de 0,04µL/mL para o P. hispidinervum e DL
50
de 0,03µL/mL para o P. aduncum
(ESTRELA et al., 2006).
A atividade antifúngica dos óleos essenciais de Piper aduncum, Piper
arboretum e Piper tuberculatum foi realizada por bioautografia em placas de CCD.
Os óleos essenciais dos frutos de Piper tuberculatum e Piper aduncum,
demonstraram alta atividade, com concentração inibitória mínima de10µg/mL contra
os fungos Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium cladosporioides,
respectivamente (NAVICKIENE et al., 2006). O óleo também foi testado contra
Crinipellis perniciosa, fungo patogênico que ataca o cacau, apresentando inibição de
100% nas concentrações de 50 e 100ppm. (MAIA et al., 1998).
Em testes in vitro e in vivo para avaliar a ação fungitóxica contra o fungo
Colletotrichum musae. Nos testes in vitro nas concentrações acima de 100µg/mL a
inibição foi de 100% do crescimento micelial e na germinação de conídios. No teste
in vivo utilizando frutos de banana “Prata” para se avaliar a podridrão foi observado
que o óleo de P. aduncum na concentração de 1% foi capaz de inibi a manifestação
de podridão nos frutos (BASTOS e ALBUQUERQUE, 2004).
Utilizando clone de o P. falciparum resistente a cloroquina, com o teste da
hipoxantina marcada, avaliou-se a atividade antiplasmódica de P. aduncum, sendo
observado alto potencial antimalárico desta espécie (CI
50
< 10µg/mL) (VALADEAU et
al., 2009). Outras espécies de Piper apresentaram alto potencial antimalárico (KAOU
et al., 2008).
Com relação à toxicidade na determinação da dose letal 50% (DL
50
) do óleo
essencial de Piper aduncum o valor obtido por interpolação semi-logarítmica,
correspondeu a 2.400 ± 191,7 mg/kg de massa corpórea. Segundo a Organização
da Cooperação Econômica e Desenvolvimento (2001) o óleo de P. aduncum
pertence à classe dos agentes xenobióticos, de baixa toxidade (SOUSA et al., 2008).
Em estudos fitoquímicos do gênero Piper revelaram uma variada constituição
de componentes químicos como alcalóides/amidas, ligninas e terpenos (PAMAR et
al., 1997).
35
Dentre as Piperáceas da Amazônia, O P. aduncum é uma excelente
produtora de óleo essencial, de elevado padrão de oxigenação (MAIA et al., 1998;
FAZOLIN et al., 2007). Na investigação fitoquímica da espécie numerosos composto
com atividade biológica já foram isolados como; aduncamida (15) uma nova amida
isolada do P. aduncum com ação bactericida contra o Bacillus subtilis e Micrococus
luteus, fenilpropanóides como o dilapiol (16), miristicina (17) e apiol (18), sendo
esses compostos sinérgicos de inseticidas naturais e sintéticos. Compostos
terpênicos como piperitona (19), com ação inseticida (VIDAL et al., 2008). As
chalconas como piperaduncina A (20), B (21) e C (22) (Figura 12, pág., 35), com
ação bactericida (PAMAR et al., 1997). Dentre os fenilpropanoides, o dilapiol é o
composto majoritário do P. aduncum (PARMAR et al., 1997). No óleo de P. aduncum
o dilapiol, constituído por um grupo metilenodioxidofenila, varia de 58% a 88,4%
(SMITH & KASSIM, 1979; BELZILE et al., 2000; GOTTLIEB et al., 1981; FAZOLIN et
al., 2005; MAIA et al., 1998; FAZOLIN et al., 2007). Por se tratar de um
fenilpropanóide, origina-se da fenilalanina pela ação da enzima fenilalanina
amonialiase (PAL) (SIMÕES, 2007).
36
Figura 12: Componentes do óleo de P. aduncum.
O dilapiol teve uma alta toxidade sobre a larva de Tenebrio molitor L. isso
devido provavelmente a ação conjunta deste constituinte e outros compostos
bioativos minoritários na composição do óleo essencial, tais como o sarisan (BIZZO
et al., 2001; FANZOLIN et al., 2007). Esse exibiu completa inibição (95-98,9%)
contra os basidiósporos do fungo Clinipellis perniciosa, CIM 0,6 ppm (ALMEIDA et
al., 2009).
Nos ensaios larvicida e inseticida contra Anopheles marajoara e Aedes
aegypti, o dilapiol promoveu 100% da mortalidade das larvas, após 48h de
exposição, na concentração de 100 ppm. Para o ensaio inseticida a mortalidade de
100% dos adultos dos mosquitos de A. marajoara e A. aegypti foi conseguida depois
37
de 60 e 180 minutos, com Cl
50
de 417 e 325 ppm para o A. marajoara e Cl
50
401 e
361 ppm para o A. aegypti, respectivamente. (ALMEIDA et al., 2009).
2.3. Malária e suas ferramentas para a busca de novos fármacos.
Conforme relatado anteriormente, inicialmente o P. falciparum mostrou-se
resistente a cloroquina (YAYON et al., 1984; CRAVO & ROSÁRIO, 2002; VALE et
al., 2005), em seguida a sulfadoxina (MAYOR et al., 2001; FERNANDES et al.,
2007) e mais recentemente aos derivados da artemisinina (ECKSTEIN-LUDWIG et
al., 2003; MUGITTU et al., 2006). Neste contexto, a busca de novos fármacos torna-
se prioridade.
Nesta busca, o primeiro problema a ser enfrentado é o fato da malária ser
espécie específica, isto é espécies que infectam o homem como P. vivax, P.
malariae e P. ovale não infectam nenhuma outra espécie animal (FRANÇA et al.,
2008). Já P. falciparum pode infectar macacos após complexo procedimento
cirúrgico (CARVALHO et al., 2000).
Os testes in vivo utilizam alguns modelos, dentre eles o galináceo, com
roedores e primatas não humanos. Os primeiros testes foram com o modelo
galináceo, único disponível a época para testar atividade de drogas contra espécies
de Plasmodium, em 1947 através de estudos realizados com 600 espécies de
plantas de 126 famílias foi observado que dentre essas, várias foram inativas, porém
foi destacado, nesse estudo, às famílias Simaroubaceae e Amaryllidaceae, devido o
número de espécies ativas. Entretanto esses testes utilizando galinhas e patos não
garantiam necessariamente que drogas ativas contra espécies de Plasmodium
desses animais fossem ativas contra as espécies de Plasmodium infectantes nos
humanos. Além disso, as técnicas químicas de avaliação e de fracionamentos de
extratos de plantas, como a cromatografia, espectroscopia de massas e
espectroscopia de ressonância magnética não eram satisfatórias para realização dos
bioensaios. (PHILLIPSON, 2001).
O segundo modelo utiliza o Plasmodium berghei, uma das espécies de
parasita, da malária, que infecta roedores murinos na África Ocidental. Esse parasita
38
é utilizado, por possui aspectos semelhante aos da malária humana e de outros
primatas como; a biologia básica do parasita de roedores e humanos é semelhante,
como alto teor de bases nitrogenadas adenina e timina (A+T = 82%) no DNA nuclear
(MCCUTCHAN et al., 1984); a base molecular de sensibilidade as drogas e
resistência apresentam características compatíveis e a organização do genoma é
conservada entre os parasitas, (CARTER & DIGGS 1977). Além disso, o P. berghei
tem dois elementos de DNA extra nuclear, compatíveis com o P. falciparum o DNA
mitocondrial e DNA plastídio (YAP et al., 1997). Tornando os parasitas de roedores
um modelo valioso para a investigação da biologia e do desenvolvimento das
interações parasita-hospedeiro do parasita da malária, apesar do desenvolvimento
de técnicas de cultivo do Plasmodium falciparum in vitro.
Considerando outros animais de experimentação, os primatas não humanos
ocupam um lugar de destaque em relação ao homem. Devido elevado grau de
parentesco ao ser humano considerando semelhanças, anatômicas e
comportamentais e bioquímicas, sendo assim, estas peculiaridades credenciam
esses animais para estudos comparativos, em relação às enfermidades que
acometem o homem. Por causa dessa estreita relação estudos com macacos podem
fornecer informações e compreensão sobre várias doenças dentre elas a malária
(WHO, 1988; CENP, 2009).
Os parasitas da malária humana adaptados aos primatas não humanos
como P. falciparum, já foram testados em vários gêneros de macacos, Aotus e
Saimiri, na tentativa de se buscar novas vacinas, fármacos e drogas. Sendo a
espécie Aotus lemurinus griseimembra, encontrada na Colômbia, a espécie mais
susceptível as formas de esprozoítos e estágio infectante de eritrócitos dos P.
falciparum e P. malariae (CARVALHO et al., 2000; CARVALHO et al., 2003).
Entretanto um fator limitante desse modelo experimental é a variabilidade genética,
fenotípica e cromossômica, entre espécies e subespécies de Aotus, muito embora
seja encontrada do Panamá a Argentina, assim como, a espécie Saimiri que também
se distribuem pela América Central, mas com uma variedade de morfológica e
cariotípica entre diferentes animais de diferentes regiões. Além disso, a barreira
imune natural dos animais também limita a adaptação dos protozoários da malária,
39
ou seja, o Plasmodium não consegue se desenvolver em todas as espécies de
macacos (WHO, 1988; CARVALHO et al., 2003).
Em 1975 a OMS envolve-se em busca de novos programas para o
desenvolvimento de vacina para malária. Nesse período cultivar o parasita seria
essencial, contudo esbarrava no problema de desenvolvimento intra-eritrocítico in
vitro. Entretanto Trager descobriu que o P. coatneyi, parasita de macacos rshesus,
possuía uma biologia similar ao do P. falciparum se desenvolvia bem em uma fina
camada de células vermelhas e que o P. coatneyi no meio RPMI 1640 (desenvolvido
por C. Moore para leucócitos humanos) adicionados com tampão Hepes e soro seria
o melhor meio. Jensen contribui resolvendo o problema do controle da fase gasosa
incubando as culturas em jarra com vela e com isso consolidam a metodologia de
cultura continua in vitro, a partir disso, essa metodologia passou a ser utilizada para
estudar o modo de entrada do parasita no hospedeiro, à triagem de substâncias com
potencial antimalárico, através dos alvos moleculares específicos do Plasmodium,
tendo este modelo, in vitro, sido responsável por grandes avanços na pesquisa de
antimaláricos (HAYNES et al., 1976; TRAGER & JENSEN, 1976; ANDRADE–NETO,
2000).
Na metodologia in vitro desenvolve-se o microteste, de maneira fácil, com uso
de poucos equipamentos, permite o controle das condições experimentais e possui
custo reduzido (NOEDL et al., 2003). Além disso, são requeridas pequenas
quantidades de sangue e das substâncias a serem testadas (ANDRADE–NETO,
2000).
O microteste tradicional é um dos microtestes utilizados nessa triagem de
novas drogas antimaláricas, em que cultivos sincronizados, contendo
predominantemente trofozoítas são distribuídos em placas de 96 poços contendo o
fármaco ou droga em diferentes concentrações (DOLABELA, 2007).
40
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL.
Avaliar a ação antiplasmódica dos óleos de “andiroba” (Carapa guianensis) e
“pimenta-de-macaco” (Piper aduncum), bem como da fração enriquecida de
limonóides (fração insaponificável do óleo de andiroba).
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1. Obter o óleo de pimenta-de-macaco por arraste a vapor.
2. Elaborar extratos orgânicos do óleo de andiroba para obtenção de fração rica em
limonóides.
3. Purificar a fração de limonóides, separada do óleo de andiroba.
4. Determinar a composição do óleo de pimenta-de-macaco.
5. Testar frações purificadas, óleo de andiroba e o óleo de pimenta-de-macaco, em
testes antiplasmódicos in vitro.
41
4. METODOLOGIA
4.1. MATERIAIS E MÉTODO
4.1.1. Equipamentos
1. Centrifuga – Fanem – modelo 206-R.
2. Banho-Maria – Fanem.
3. Câmara de fluxo laminar – Vego.
4. Estufa incubadora – Fanem – Modelo 347.
5. Microscópio óptico – Axiostar – Zeiss.
6. Agitador de tubos – Vortex – Phenix – Modelo AT 56.
7. Balança de precisão – Quimis – BG 440.
8. HPLC composto por duas bombas LC-10 AD (Shimadzu), com sistema de
injeção manual (looping de 20 μL), detector SPD 10 AV UV-Visivel (operando no λ =
212nm e 220nm), uma interface CBM, software Class 3.1 e sistema de
degaseficador de membrana DGU-14.
9. Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear: VARIAN modelo
MERCURY-300 (300MHz).
10. Câmara de Análise de Fluorescência por Luz Ultravioleta: Cabine tipo
SPECTROLINE modelo CM-10 com luz tipo SPECTROLINE - Modelo ENF-269C.
11. Evaporadores Rotativos: BÜCHI modelo 461 e QUIMIS - Modelo Q-344-2.
4.1.2. Material e reagentes
1. Placas com 96 poços.
2. Garrafas para cultivo de Plasmodium de 50 mL e de 250 mL.
42
3. Tubos de 15 mL e 50 mL (Falcon).
4. Solventes deuterados: (TEDIA BRASIL).
5. Solventes - Grau HPLC (TEDIA BRASIL).
6. Água ultra-pura.
7. Cromatoplacas de alumínio.
Obs: Todos os solventes foram filtrados em membrana de nylon de 0,45 μm.
4.1.3. Meio de cultivo.
4.1.4. RPMI 1640 (Solução de Estoque)
Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute)
Sem NaHCO
3
e com L-glutamina, HEPES, glicose, Hipoxantina, Gentamicina e Água
Milliq ou bidestilada q.s.p.
A solução estoque foi preparada medindo-se 100mL de água ultra-pura,
adicionando-se 5,94g do tampão HEPES, 2g de Glicose e 0,05g de Gentamicina.
Completando-se o volume para 1000mL e colocando-se no agitador para
homogeneizar a solução. O pH foi ajustado para 7 e após esse processo a solução
foi filtrada em membrana de 0,22µm, sendo estocada a - 20°C.
4.1.5. Meio de Lavagem
A 100mL do meio RPMI, solução de estoque, acrescentou-se 3,2mL de
bicarbonato de sódio a 7,5%, homogeneizando-se a solução e posteriormente
acondicionado em geladeira.
4.1.6. Meio Completo.
O meio completo foi preparado adicionando-se soro ou plasma humano
(grupo sanguíneo do tipo A+) a solução do meio RPMI solução de estoque (9:1).
43
Para cada 100 mL de meio foi adicionado 3,2mL solução de bicarbonato de sódio a
7,5% (pH 7,2-7,4).
4.1.7. Solução estoque de Giemsa.
Pulverizou-se 7,5g de Giemsa em pó, com um pistilo e adicionou-se 350mL
de glicerol ou glicerina lentamente, transferindo a solução para um vidro âmbar.
Posteriormente, foi adicionado lentamente 650mL de álcool metílico.
Homogeneizando-se a solução, com o auxílio de algumas pérolas de vidro. Após o
processo de homogeneização filtrou-se em papel de filtro acondicionando-a em
garrafa âmbar a temperatura ambiente.
4.1.8. Soluções salinas a 1,6% e 12%
Utilizaram-se soluções salinas a 12%, a 1,6% e a 0,9% glicosada. A primeira
foi preparada pesando-se 12g de cloreto de sódio, dissolvidos em 100mL de água
destilada. Após essa fase a solução foi filtrada em membrana de 0,22µm. A segunda
solução foi preparada de forma semelhante à primeira, contundo utilizando-se, 1,6g
de cloreto de sódio.
4.1.9. Soluções salinas a 0,9% glicosada.
Foi pesado 0,9g de cloreto de sódio, dissolvidos em 100mL q.s.p de água
destilada. Após essa fase, adicionou-se 0,2g de glicose a solução, sendo
homogeneizada, e em seguida filtrada em membrana de 0,22µm.
4.1.10. Água tamponada (pH 6,8).
Pesou-se 4g de fosfato de potássio monobásico, depois adicionou-se 6g de
fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado. Os dois sais foram misturados com a
ajuda de um pistilo e de uma proveta, aferindo-se a solução com água destilada para
1000mL.
44
4.1.11. Azul de metileno.
Triturou-se 1,0g de azul de metileno, 3,0g de ortofosfato dissodico anidro e
1,0g de ortofosfato monobásico anidro. Dissolveu-se em 1,25mL de água
bidestilada, homogeneizou-se a solução que foi filtrada em papel de filtro.
4.1.12. Plasma humano.
O sangue foi cedido pelo Banco de Sangue do Hemocentro do Pará
(HEMOPA), Belém-PA. Esse sangue foi proveniente de pacientes doadores do
grupo sanguíneo A fator Rh positivo (A+), sendo o mesmo colhido com citrato de
sódio e centrifugado a 500rpm\20 min. O plasma sobrenadante foi isolado,
aliquotado e conservado sob refrigeração.
4.1.13. Hemácias humanas.
As hemácias foram colhidas de doador de sangue tipo O+. A coleta foi feita
seguindo as normas de biosegurança. Após a coleta o sangue foi armazenado em
tubo com CPDA (Citrato Fosfato Dextrose Adenosina) a 4°C por 30 dias.
Semanalmente, uma alíquota desse sangue foi transferida para um tubo contendo
heparina sendo depois centrifugado (600rpm/10min), o plasma e a camada de
leucócitos foram desprezadas e após serem lavadas, duas a três vezes, com meio
RPMI 1640, as hemácias foram re-suspensas em meio completo na proporção 1:1 e
estocadas a 4° C, por uma semana.
4.2. Óleo de Andiroba
O óleo de Carapa guianensis (andiroba) foi extraído de modo artesanal: as
castanhas coletadas foram cozidas até o amolecimento, em torno de 1 a 2 horas,
posteriormente foram colocadas em depósitos e amontoadas umas sobre as outras
e cobertas com folhas de açaizeiro, e ali permaneceram por um período em torno de
25 a 45 dias. Em seguida, uma massa levemente rosada foi retirada do interior da
castanha e amassada utilizando as mãos e os pés, logo em seguida a massa foi
posta na tábua de extração (também conhecida como calha), disposta de forma
encurvada e inclinada (separando a massa da tabua através de folhas plásticas)
sobre duas estacas, para facilitar a fluidez do óleo. Após 4 dias o óleo começa a fluir,
permanecendo por mais 3 dias para garantir total desidratação da massa. Quando a
45
massa se apresentava mais rígida, a mesma foi introduzida num recipiente de malha
de madeira, que apertando a massa, obteve-se, uma quantidade a mais de óleo.
Esse óleo foi obtido da região do alto Tocantins e fornecido pelo Sr. Roberto Morais,
gerente de bioprospecção da empresa Beraca Brasmazom Indústria de Oleaginosas
e Produtos da Amazônia Ltda.
4.2.1. Técnica para separação e purificação
4.2.1.1. Cromatografia
Processo físico, químico ou mecânico de separação que envolve a migração
diferencial dos componentes de uma mistura entre uma fase fixa (FF) e uma fase
móvel (FM).
A fase fixa é sólida, neste caso foi usado silica-gel 60-230 Mesh
(cromatografia em coluna) e sílica gel GF e PF (cromatografia em placa). Já a fase
móvel é líquida, neste caso foram utilizados os solventes: hexano, acetato de etila,
metanol, diclorometano, acetona e água.
O processo de separação é ocasionado pelo fenômeno de
adsorção/dessorção, ocorrendo devido à atração eletrostática ou dipolo-dipolo
4.2.1.2. Cromatografia em coluna
Realizado em colunas de vidro. O diâmetro e a altura variam em função da
quantidade de amostra.
A sílica é colocada na coluna após ser misturada a um solvente de escolha
prévia. A amostra escolhida é fracionada com misturas de solventes em polaridades
crescentes. Este processo é utilizado para separações que precisam de maior
cuidado.
Foi pesado 150 g de óleo e solubilizado em 150mL de solução de Hex/AcOEt
10%.
46
A solução foi inoculada para fracionamento através de cromatografia em
coluna, utilizando um sistema de solventes binário Hex./AcOEt, com gradiente de
polaridade crescente: 10%, 30%, 50% e 100% de acetato de etila.
4.2.1.3. Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC)
Cromatoplacas de alumínio (ALUGRAM SIL G/UV
254
), plana de 20x20cm, já
produzidas com uma fina camada de sílica-gel 60GF – Macherey-Nagel de 0,20mm
de espessura. Cada placa e cortada em pequenos pedaços de 5x4cm. Usadas para
monitorar o processo de separação.
As frações foram analisadas por cromatografia em camada delgada
comparativa, a fim de se obter o sistema cromatográfico para melhor separação dos
constituintes, com os seguintes sistemas de fases móveis: Hex/dicloro/AcOEt,
Hex/Acetona e Hex/dicloro/AcOEt.
4.2.1.4. Reveladores de placa
Para as substâncias orgânicas, as placas foram reveladas utilizando-se a
solução aquosa de Sulfato Cérico. Em relação as substâncias com grupos
cromóforos utilizou-se a câmera de luz UV.
4.3. Obtenção do OPM
4.3.1. Material Botânico
As partes aéreas (folhas e talos finos) foram coletadas no Município de Santo
Antonio do Tauá, em propriedade particular, onde há um experimento agronômico
com matrizes de P. aduncum. A espécie é conhecida na região como pimenta-de-
macaco. Exemplares da planta estão depositados no Herbário do Museu Paraense
Emílio Goeldi, sob o registro 150.678. A planta foi identificada pela Dra Elsie F.
Guimarães, do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, especialista da família
Piperaceae.
47
4.3.2. Obtenção do óleo
O material da planta foi seco à temperatura ambiente por 3 dias e, em
seguida, em estufa a 40 °C por mais 2 dias. Após ser moído foi submetido à
destilação por arraste a vapor durante 3 horas, usando-se aparato de vidro tipo
Clevenger. O óleo foi seco, em Dean-Stark, utilizando o sulfato de sódio anidro e
tolueno na separação das fases e para medição do teor de umidade e o seu
rendimento calculado com base no peso seco da planta.
4.3.3. Análise do óleo essencial
O óleo foi analisado qualitativamente em um GC-MS Thermo DSQ II, com as
seguintes condições: coluna capilar de sílica DB-5ms (30 m x 0,25 mm e 0,25 µm de
espessura do filme); temperatura programada de 60 a 240 °C (3°C/min); temperatura
do injetor a 250 °C; hélio como gás de arraste, ajustado para fornecer uma
velocidade linear de 32 cm/s (medidos a 100 °C); tipo de injeção splitless (1 µl de sol
1:1000 em hexano); split flow foi ajustado para fornecer uma relação 20:1; o
detector de massas trabalhou no modo impacto eletrônico com 70 eV e a
temperatura da fonte de íons e conexões foi de 200 °C. Os dados quantitativos dos
constituintes voláteis foram obtidos por normalização da área do pico, usando-se um
cromatógrafo Thermo Focus, com detector de ionização de chamas, operando nas
mesmas condições do GC-MS, exceto o gás de arraste que foi nitrogênio. Um índice
de retenção foi calculado para todos os constituintes voláteis usando-se uma série
homóloga de n-alcanos.
5. Avaliação da atividade antiplasmódica
5.1. Descongelamento dos clones de P. falciparum W
2
e Dd
2
A amostra foi retirada do crio-banco do Laboratório de Malária do Instituto
Evandro Chagas (IEC) Ananindeua-PA, e colocada em banho–maria (37°C). Após
completo descongelamento, adicionou-se, para cada 1mL da suspensão, 0,4 mL de
solução salina a 12%, gota a gota, sob agitação, por fim, a solução final foi deixada
em repouso por 5 min. Transcorrido o tempo de repouso, na segunda etapa
acrescentou-se 9,0 mL da solução salina 1,6%, gota a gota, sob agitação, e
48
centrifugou-se a 1000rpm/10 min., A terceira etapa ocorreu separando-se e
desprezando-se o sobrenadante. Ao sedimento adicionou-se 9,0 mL de solução
salina 0,9% glicosada, em condições semelhantes à anterior completando-se assim
a quarta etapa. O novo sedimento obtido foi diluído em 20mL de meio completo a
20% e distribuído em garrafas de cultivo, acrescentando-se 100µl de hemácias
lavadas não parasitadas a mistura gasosa (5% de O
2
, 90% de N
2
e 5% de CO
2
) e
por fim incubando-se a 37°C.
5.2. Cultivo do Plasmodium falciparum
O cultivo dos clones (Figura 13, pág., 48) foi realizado de acordo com Trager
e Jensen (1976) tendo sido usados clones W
2
e Dd
2
, o clone W
2
tem como perfil a
resistência total a cloroquina e, o Dd
2
resistência parcial a cloroquina e total a
pirimidina e mefloquina. Após o descongelamento e, até o crescimento do parasito
em fase exponencial, utilizou-se meio completo a 20%. Uma vez em crescimento
exponencial, passou-se a utilizar meio completo a 10%. A cultura foi mantida em
estufa a 37° C em atmosfera de 3 a 5% de CO
2
conseguida com a queima de vela
em dessecador (CARVALHO, 1990; ANDRADE-NETO, 2004). E a parasitemia foi
diariamente determinada e, quando maior que 6%, a placa foi diluída ou submetida à
sincronização com sorbitol.
Figura 13: Cultivo dos clones W
2
e Dd
2
49
5.3. Coloração de gota espessa e esfregaço e determinação da parasitemia
Diariamente, durante o cultivo de P. falciparum, uma gota de material foi
retirada e utilizada para a confecção de lâmina (Figura 14, pág., 49) contendo a gota
espessa e o esfregaço. A lâmina foi seca a temperatura ambiente, seguindo-se sua
desemoglubinização com azul de metileno e o esfregaço foi fixado com metanol e
corado com Giemsa, por 20 minutos (Figura 14, pág., 49). As lâminas foram lavadas
com água tamponada, secas a temperatura ambiente e examinadas ao microscópio
óptico, com objetiva de imersão (1000x).
Figura 14: Coloração das lâminas
As parasitemias nos esfregaços corados foram determinadas pela contagem
do numero de hemácias infectadas. No caso de parasitemia elevada >10%
contavam-se 2000 células. Para parasitemia inferior a 10%, fez-se uma estimativa
do numero de hemácias por campo e calculou-se o numero de campos que
deveriam ser contados para se obter um total de 5.000 a 10.000 hemácias.
Para sincronização ou microteste, determinou-se a parasitemia diferencial,
contando-se um total de 100 parasitas classificando-os como trofozoítas ou
esquizontes.
50
5.4. Sincronização dos parasitos
O meio foi removido das garrafas contendo predominantemente trofozoítas e
com parasitemia superior a 5% e adicionada solução aquosa contendo 5% de
sorbitol e 0,5% de glicose. Passado 15 min. adicionou-se 7mL de meio completo e
centrifugou-se a 1000rpm/10min.. O sobrenadante foi desprezado, adicionou-se
meio completo e novamente foi determinada a parasitemia diferencial (CARVALHO,
1990). Após 48h da sincronização, caso observado a predominância de trofozoítas
(>90%), realizou-se o ensaio.
5.5. Criopreservação dos clones P. falciparum
O congelamento dos clones foi realizado de acordo com a técnica descrita por
Meryman & Hornblower (1972). Na câmara de fluxo laminar o sangue da garrafa de
cultivo foi transferida para um tubo de 15mL e posteriormente centrifugado a
1000rpm/5min. O sobrenadante foi descartado e foi adicionada, a papa de
hemácias, o volume de 15mL do sobrenadante descartado, sendo em seguida
novamente centrifugado a 1000rpm/5min.repetindo-se assim a fase anterior.
Adicionando-se ao sedimento de hemácias igual volume da solução congelante
(glicerol ou Glicerolite) 1 gota/segundo, sob leve agitação. A solução resultante foi
distribuída, 1mL da solução, em ampolas de criopreservação, sendo deixadas em
over-night no freezer a -70°C para posteriormente serem acondicionadas em
nitrogênio líquido.
5.6. Microteste in vitro
5.6.1. Padronização da emulsão.
5.6.1.1. Óleo de Andiroba
Para a realização dos microtestes o primeiro procedimento adotado foi
resolver o problema da solubilização do óleo de andiroba, haja vista que o mesmo
por ser muito lipofílico é de difícil solubilização em meio aquoso, conseqüentemente
51
foi necessário utilizar um agente solubilizante ou emulsificante para estabilizar a
solução de trabalho (RPMI 1640 a 20%). Com isso, inicialmente as soluções foram
preparadas a temperatura ambiente em cinco concentrações que variaram de 10%;
1%; 0,1%; 0,01% e 0,001% v/v (Figura 15, pág., 51). A primeira solução foi feita
dispondo de 295µl de óleo de andiroba (OA) e 5µl (concentração de 0,0017%) de
dimetilsulfóxido (DMSO), postos em banho-maria a 37°C. Posteriormente foi
adicionado 2700µl de meio completo a 20% (Figura 16, pág., 52) também a 37°C
tendo assim uma solução a 10% v/v. Partindo-se de 300µl da solução a 10% foi
elaborada a concentração de 1%, com a adição de 2700µl de meio completo, que
serviu de base para preparação da concentração de 0,1% e, assim por diante, até a
concentração de 0,001%.
Figura 15: Soluções de OA
52
Figura 16: Padronização da solução de OA.
Além do DMSO também se utilizou o Tween20, como agente emulsificante,
respeitando as mesmas concentrações e condições do teste anterior. Todavia com
os ensaios usando-se Tween 20 foi observada acentuada hemólise tanto nas placas
de testes (figura 17, pág., 53) quanto nos tubos de preparação da solução (Figura
17, pág., 53), fato que invalidou o processo, pois parte do ciclo do Plasmodium
desenvolve-se na hemácia. Após a análise das lâminas ao microscópio foi
constatada a ausência de hemácias parasitadas o que impediu a utilização do
Tween.
53
Figura 17: hemólise da solução com Tween 20
As soluções utilizando DMSO foram preparadas nas concentrações
inicialmente estabelecidas, contudo, foi constatada uma solução instável na
concentração a 10% (Figura 18, pág., 53).
Figura 18: Soluções de óleo de andiroba e DMSO
Após preparo, as soluções, as mesmas foram distribuídas nas placas de
microtestes de 96 poços para observação da estabilidade considerando o tempo. O
preenchimento dos poços foi feito com 10µl de solução de hemácias não parasitadas
mais 290µl de meio completo e o controle com hemácias mais o DMSO. Passado
24h foi observado hemólise nas concentrações de 10% e 1% (Figura 19, pág., 54),
54
demonstrando que o óleo teve potencial hemolítico, haja vista que o controle
permanecia sem hemólise.
Figura 19: hemólise na concentração de 1% e 10% do OA
Sendo assim, a instabilidade imediata na maior concentração (10%) e
também a hemólise, após período de 24h, nas concentrações de 1 e 10% fez com
que as concentrações do testes fossem diminuídas com a intenção de solucionar o
problema da instabilidade e hemólise.
O segundo ensaio foi realizado diminuindo a concentração tanto do óleo
quanto de agente tensoativo (DMSO). Partiu-se, assim, de 1% de óleo mais
0,0001% de DMSO, constatando-se, ainda hemólise na concentração de 1% (Figura
20, pág., 54) sem contudo observar hemólise no controle.
Figura 20: hemólise na concentração de 1% segundo ensaio do OA.
55
O terceiro e último ensaio foi realizado partindo-se de uma concentração de
0,1% até 0,00001% v/v, obtendo-se nessas concentrações, soluções estáveis e sem
hemólise imediata.
5.6.1.2. Óleo de Pimenta-de-macaco
Semelhante ao ocorrido com o OA, ensaios com o OPM em concentrações de
10%, 1%, 0,1%, 0,01% 0,001% v/v (Figura 21, pág., 55) foram realizados. O primeiro
ensaio foi feito partindo de uma concentração a 10% de óleo mais 5µl de DMSO
q.s.p 5mL de meio completo. Na concentração a 10% (Figura 22, pág., 56)
observou-se uma solução instável e de difícil dispersão.
Figura 21: Padronização da solução de OPM
56
Figura 22: separação de fases na concentração de 10% do OPM
A seguir, as concentrações foram sendo diminuídas até se chegar a
concentrações com soluções estáveis e solúveis que foram de 0,1%, 0,01%,
0,001%, 0,0001%, 0,0001%, 0,00001% v/v.
Por fim solucionado o problema de solubilidade, foi estabelecido por
padronização às concentrações a serem utilizadas no microteste tradicional nesse
trabalho.
5.6.1.3. Cálculo da Densidade relativa
Segundo a Farmacopéia Brasileira IV Ed. (1988), com um picnômetro de 5
mL capacidade, previamente tarado, fez-se o preenchimento do mesmo com o
líquido padrão (água recém destilada e fervida) sendo então pesado. Em seguida o
picnômetro foi preenchido com 5mL da amostra (óleo) e novamente pesado. A
relação entre o peso da amostra e do padrão, em um volume fixo à temperatura de
20 ºC forneceu o valor da densidade relativa.
57
Com o valor da densidade tanto do óleo de andiroba (0,82g/ml) como de
pimenta-de-macaco (1.03g/ml) foi possível fazer o ajuste das concentrações.
5.6.1.4. Ensaio para avaliação da atividade antiplasmódica.
Os parasitas foram postos em cultura de hemácias humanas suspensas em
meio RPMI 1640 a 10% segundo Trager e Jensen (1976). A atividade
antiplasmódica dos óleos e fração de limonóides foi observada em placas de 96
poços (Figura 23, pág., 58) como descrita por Rieckman e colaboradores (1980),
modificado por Carvalho (1990).
58
Figura 23: Placa de 96 poços
O teste constituiu-se de diluições sucessivas dos óleos de andiroba e
pimenta-de-macaco e/ou fração limonoídica em metanol e DMSO, acrescidas de
meio de cultivo, postas nos poços das placas de microtestes em concentrações
determinadas após padronização explicitada anteriormente. Uma suspensão de
hemácias parasitadas (0,5%-1% de parasitemia e hematócrito de 2,5%) contendo
predominante trofozoitas também foi acrescentada aos poços completando um
volume de 100μl. As placas foram então incubadas a 37°C em atmosfera de 3 a 5%
de CO
2
, por meio da queima de velas, em dessecador, durante 24h, 48h e 72h.
Passado 24h, o meio foi trocado e as placas foram postas para escorrer sendo
desprezado o sobrenadante e realizada a confecção dos esfregaços sangüíneos
com o resíduo de hemácias para coloração e, posteriormente, a análise da
parasitemia percentual, sendo essa operação realizada após 48h.
A cloroquina foi utilizada como droga de controle positivo para o clone Dd
2
e a
quinina como a droga de controle para o clone W
2
.
Os testes foram divididos em placas numeradas de 1 a 4, sendo a placa 1 da
cloroquina, placa 2 do OA (Tabela 1, pág., 59), placa 3 do óleo de OPM (Tabela 2,
pág., 59) e placa 4 da fração limonoídica. Para o clone Dd
2,
as concentrações
padronizadas foram de 0,1%, 0,01%, 0,001%, 0,0001% e 0,00001% v/v em µg/ml.
Após o cálculo da densidade relativa de cada óleo essas concentrações foram
convertidas para os valores abaixo.
59
Tabela 1: Concentrações dos óleos de Andiroba e Pimenta-de-macaco para o clone Dd
2
Concentrações do OA/OPM
(v/v)
Concentrações do OA
(µg/ml)
Concentrações do OPM
(µg/ml)
0,1
820
1030
0,01
82,0
103,0
0,001
8,20
10,3
0,0001
0,820
1,03
0,00001
0,0820
0,103
Para os testes com o clone W
2
as concentrações variaram de 0,01% a
0,0000001% v/v tanto para o OA quanto para o OPM (Tabela 2). Sendo convertidas
para os valores abaixo:
Tabela 2: Concentrações dos óleos de Andiroba e Pimenta-de-macaco para o clone W
2
Concentrações do OA/OPM
(v/v)
Concentrações do OA
(µg/ml)
Concentrações do OPM
(µg/ml)
0,01
82,0
103,0
0,001
8,2
10,3
0,0001
0,820
1,03
0,00001
0,0820
0,103
0,000001
0,00820
0,0103
0,0000001
0,000820
0,00103
Após realização dos testes e leitura das lâminas foi contabilizada a
parasitemia percentual, através da leitura de 10 campos uniformes, de cada tempo
de exposição e calculada a CI
50
referente a esses períodos.
60
6. RESULTADOS
6.1. Fracionamento do Óleo de andiroba.
Dos 150 g de óleo solubilizado em 150mL de solução de Hex/AcOEt 10%.
Obtiveram-se após a secagem, quatro frações; C
1,
C
2,
C
3,
C
4.
Da fração C
1
foi obtido
45g (AcOEt 10%), 32g de C
2
(AcOEt 30%), 18g de C
3
(AcOEt 50%) e 22g da fração
C
4
(AcOEt 100%).
As frações após análise por cromatografia em camada delgada comparativa,
com as seguintes fases móveis: Hex/dicloro/AcOEt (55:45:5), Hex/Acetona (60:40) e
Hex/dicloro/AcOEt (50:40:10) e, também, por RMN de hidrogênio. Após análise dos
espectros de RMN de hidrogênio, a fração C
4
foi escolhida, uma vez que esta
apresentou sinais característicos de limonóides.
6.2. Avaliação da atividade antiplasmódica
Inicialmente foi necessário realizar a padronização do ensaio, sendo
utilizando óleos de andiroba e óleo de pimenta-de-macaco nas concentrações de
10%, 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% v/v, como emulsificante utilizou-se o tween 20 ou
dimetilsufoxido (0,05% v/v), meio completo e hemácias não parasitadas. Os critérios
observados foram: estabilidade das emulsões durante 72h a 37º C e a integridade
das hemácias.
Em relação à estabilidade das emulsões, observou-se que nas concentrações
a 10% da emulsão contendo o óleo de andiroba não foi observada estabilidade, pois
houve a formação de duas fases, assim como hemólise nas concentrações 1% e
10%. Então a partir de 0,1% não foi observado nem hemólise e a emulsão foi estável
(Tabela 3, pág., 61).
Já em relação ao óleo de pimenta-de-macaco também se observou que nas
concentrações de 1% e 10% houve hemólise e a emulsão não teve estabilidade
(Tabela 3, pág., 61). Desta forma foram estabelecidas as concentrações do óleo
61
utilizado nos ensaios para a atividade antiplasmódica, que foram as seguintes para o
óleo de andiroba: 820, 82, 8,20, 0,82 e 0,082µg/mL. Concentrações semelhantes
foram utilizadas para o ensaio de pimenta-de-macaco; 1030, 103,0, 10,30, 1,030 e
0,103 µg/mL. Considerando-se para o cálculo das concentrações as respectivas
densidades, do óleo de andiroba e pimenta-de-macaco, para a conversão de v/v
para µg/mL.
Tabela 3: Estabilidade das emulsões e presença de hemólise.
Óleo
Sem hemólise
Estabilidade da emulsão
Andiroba
≤ 0,1v/v
Estável
Pimenta-de-macaco
≤ 0,1v/v
Estável
A atividade antiplasmódica do óleo de andiroba foi avaliada nos clones W
2
e
Dd
2
, em diferentes tempos de exposição (24h, 48h e 72h). Para o clone Dd
2
após
24h de exposição apenas a concentração de 820µg/mL observou-se uma discreta
inibição (31%). Em 48h, 100% de inibição foram observados em 820µg/mL e
82µg/mL, sendo de 71% na concentração de 8,2µg/mL e nas demais concentrações
não foi observado inibição; em 72h houve apenas um aumento no percentual de
inibição da concentração 8,2µg/mL 88% (Tabela 4, pág., 62). Em síntese, parece
que quanto maior o tempo de exposição, maior a inibição.
Em relação ao clone W
2
, o óleo de andiroba apresentou uma inibição de
100% nas concentrações de 0,082µg/mL, 0,0082µg/mL e 0,00082µg/mL após 24h
de exposição. Em 48h e 72h houve uma manutenção no percentual de inibição em
todas as concentrações (Figura 24, pág., 62).
62
Tabela 4: Percentual de inibição do OA pelo tempo para o clone Dd
2
.
24h
48h
72h
Concentrações (µg/mL)
Inibição (%) ± DP
820
31±2,61
100
100
82
0
100
100
8,2
0
71±1,43
88±2,19
0,82
0
0
0
0,082
0
0
0
Figura 24: Percentual de inibição do OA pelo tempo para o clone W
2
Com a fração rica em limonóides para o clone Dd
2
após 24h foi observado
que taxa de inibição variou de 100% na concentração de 100µg/mL até 56% na
menor concentração 3,125µg/mL (Tabela 5, pág., 63). Em 48h a taxa de inibição
também sofreu variação de 100% na maior concentração a 64% na menor
concentração (Tabela 5, pág., 63). Transcorrido 72h a inibição de 100% foi
observada tanto na concentração de 100µg/mL, como também em 50µg/mL e
25µg/mL e tendo uma percentual de 82% na menor concentração 3,125µg/mL
(Tabela 5, pág., 63). Sendo assim, foi observado um aumento na inibição em todas
as concentrações, após a transcorrer do tempo. Para o clone W
2
após 24h de
63
exposição foi observada uma inibição de 100% na maior concentração 100µg/mL,
assim como, nas demais concentrações 50µg/mL, 25µg/mL, 12,5µg/mL, 6,25µg/mL
inclusive na menor concentração de 3,125µg/mL. Esse fato também foi observado
nos períodos de 48h e 72h, quando a taxa de inibição foi mantida em 100% para
todas as concentrações (Figura 25, pág., 63).
Tabela 5: Taxa de inibição da fração rica em limonóides frente ao clone Dd
2
– DP – Desvio padrão.
24h
48h
72h
Concentrações (µg/mL)
Inibição (%) ± DP
100
100
100
100
50
98±1,15
100
100
25
92±1,53
96±1,1
100
12,5
76±1,52
86±2,51
100
6,25
72±2,3
82±1,41
88±2,12
3,125
56±2,1
64±2,08
82±2,62
Figura 25: Percentual de inibição da Fração rica em limonóides pelo tempo para o clone W
2
A tabela 6 sumariza a inibição do óleo de andiroba, fração rica em limonóides
e cloroquina. Em relação à andiroba, para o clone Dd
2
, observa-se inibição 31% na
64
concentração de 820µg/mL, sendo que em 48h e 72h já se observa inibição em
8,2µg/mL (71% e 88%, respectivamente).
Tanto a cloroquina (0,031µg/mL) quanto a fração rica em limonóides
(3,1µg/mL), também no clone Dd
2
, observa-se aumento da inibição de forma tempo
dependente (Tabela 6, pág., 64).
Tabela 6: Taxa inibição do OA e FR contra o clone Dd
2
- DP – Desvio padrão
Dd
2
(µg/mL e % inibição ± DP)
24h
48h
72h
Óleo de Andiroba
820µg/mL
31±2,61
8,2µg/mL
71±1,43
8,2µg/mL
88±2,19
Fração rica em
Limonóides
(3.1 µg/mL)
56±2,1
64 ±2,08
82±2,62
Cloroquina
(0,031µg/mL)
0
35±1,05
60±0,9
Em relação ao óleo de andiroba, quando testado no clone W
2
foi
observado uma inibição de 100% em todas as concentrações. Para a fração de
limonóide (3,1µg/mL) observou-se, também, em todos os tempos inibição de
100%. Em relação a quinina houve um discreto aumento da atividade com
aumento do tempo de exposição (Tabela 7, pág., 64)
Tabela 7: Taxa inibição do OA e FR contra o clone W
2
- DP – Desvio padrão
W
2
(ng/mL e % inibição ± DP)
24h
48h
72h
Óleo de Andiroba
0,82ng/mL= 100
Fração rica em
Limonóides
(3.1 µg/mL)
100
100
100
Quinina
(0,015µg/mL)
71±0,64
73±1,52
75±1,76
65
Semelhante ao óleo de andiroba avaliou-se a atividade antiplasmódica do
óleo de pimenta-de-macaco (OPM). Após 24h de exposição, no clone Dd
2
não houve
nenhuma inibição em qualquer concentração (1030µg/mL, 103µg/mL, 10,3µg/mL,
1,03µg/mL e 0,103µg/mL) (Tabela 8, pág., 65). Após 48h de exposição foi observado
uma inibição de 83% na concentração de 103µg/mL e de 56% na concentração de
10,3µg/mL (Tabela 8). Em 72h constatou-se um aumento no percentual de inibição
nas mesmas concentrações 94% e 77% em 103µg/mL e 10,3µg/mL,
respectivamente (Tabela 8, pág., 65).
Tabela 8: Taxa de inibição do OPM contra o clone Dd
2 –
- DP - Desvio padrão
Dd
2
(µg/mL e % inibição ± DP)
24h
48h
72h
Óleo de
Pimenta-de-macaco
0
10,3µg/mL
56±1,35
10,3µg/mL
77±1,14
Cloroquina
(0,031µg/mL)
0
35±1,05
60±0,9
A atividade antiplasmódica do óleo de pimenta-de-macaco (OPM) também foi
avaliada no clone W
2
, sendo observada uma inibição de 100% em todas as
concentrações (Tabela 9, pág., 65). Em relação a quinina houve um discreto
aumento da atividade com aumento do tempo de exposição (Tabela 9, pág., 65)
Tabela 9: Taxa de inibição do OPM contra o clone W
2
- *DP - Desvio padrão
W
2
(ng/mL e % inibição ± *DP)
24h
48h
72h
Óleo de Pimenta-de-macaco
(1,3ng/ml)
100
Quinina
(0,015µg/mL)
71±0,64
73±1,52
75±1,76
66
Das inibições percentuais foi calculada a CI
50
dos óleos e da fração rica em
limonóides para o clone Dd
2
, através da interpolação semi-logarítimica dos dados
utilizando o programa Microsolf Office Excel 2007, que estão expressos na tabela
10.
Com relação tanto aos óleos de andiroba como pimenta-de-macaco a CI
50
foram maiores que a CI
50
da cloroquina após a exposição em 24h, 48h e 72h. Com a
fração rica em limonóides também foi constatado uma CI
50
maior que a cloroquina
em todos os períodos analisados. Contudo, tanto para os óleos como para a fração
a CI
50
variou com o tempo, ou seja, após 72h os valores observados foram bem
menores que os constatados em 24h e 48h como mostram a tabela 10.
Tabela 10: CI
50
do OA, FR, OPM e Cloroquina - *ND - não determinado – DP – Desvio padrão
CI
50
(Dd
2
µg/mL ± DP)
24h
48h
72h
Óleo de andiroba
>820
9,4±0,05
8,4±0,15
Fração rica em limonóides
2,8±0,05
2,4±0,1
0,4±0,05
Óleo de pimenta-de-macaco
ND*
74±1,52
17±1,73
Cloroquina
> 1
0,1±0,005
0,01±0,003
6.3. Composição do OPM
Os componentes voláteis do OPM foram identificados por comparação dos
seus espectros de massas e índices de retenção com aqueles de padrões
autênticos, previamente analisados e armazenados no sistema de dados do
instrumento. Outras identificações foram feitas por comparação de seus espectros
de massas com aqueles existentes em sistemas de dados de bibliotecas de
referências e citados na literatura (ADAMS, 2007; NIST, 2005). O rendimento do
óleo foi de 3,0% e seu constituinte principal foi o dilapiol (76,5%) (Tabela 11, pág.,
67), seguido de piperitona (6,1%), terpinen-4-ol (2,3%), miristicina (2,1%), (E)-
cariofileno (1,5%), γ-terpineno (1,3%), germacreno D (1,2%) e apiol (1,2%) entre
67
outros. Na Tabela 11 estão listados todos os constituintes identificados no óleo
essencial de P. aduncum.
Tabela 11: Constituintes identificados no óleo de P. aduncum.
Constituintes
Índice de Retenção
Óleo (%)
α-pineno
927
0,7
β-pineno
937
0,5
Limoneno
1030
0,8
(Z)-β-ocimeno
1041
0,2
(E)-β-ocimeno
1048
0,4
γ-terpineno
1060
1,3
terpinen-4-ol
1179
2,3
Piperitona
1258
6,1
(E)-cariofileno
1422
1,5
germacreno D
1482
1,2
Miristicina
1523
2,1
Dilapiol
1628
76,5
Apiol
1687
1,2
68
7. DISCUSSÃO
7.1. Carapa guianensis
A avaliação da atividade antiplasmódica do óleo de andiroba demonstrou que
esta atividade é tempo dependente, isto é, quanto maior o tempo de exposição ao
óleo maior a atividade (Tabela 4, pág., 62 e Tabela 6, pág., 64). Inicialmente, estes
resultados sugerem tratar-se de um esquizonticida sanguíneo lento. Outras
substâncias, como por exemplo, a pirimetamina, também possui a atividade
esquizonticida sangüínea lenta e em geral é utilizada associada a um fármaco
esquizonticida sangüíneo rápido.
Quando se compara a atividade antiplasmódica do óleo de andiroba no clone
resistente a cloroquina (W
2
) ao clone multiresistente (Dd
2
) (Tabela 4, pág., 62 e
Figura 24, pág., 62) observa-se uma maior atividade para o clone W
2
, sugerindo que,
talvez, o óleo de andiroba tenha potencial para cepas de P. falciparum resistentes a
cloroquina, porém não possui potencial para clone de P. falciparum multiresistente.
Sabe-se que, atualmente, a tendência é que se tenha isolados com perfil de
resistência múltipla (COUTO et al., 1993), e isto poderia limitar o uso deste óleo
como antimalárico.
Outra espécie de Meliaceae, Lansium domesticum Corr. Serr., mostrou- se
ativa no clone D
6
, clone sensível a cloroquina, e W
2
resistente a cloroquina do P.
falciparum, isto é, o extrato etanólico, in vitro, apresentou a CI
50
que variou de >
20µg/mL, 12,8µg/mL e 9,3µg/mL para o clone D
6
dependendo da amostra (LEAMAN
et al., 1995). Também o extrato metanólico e aquoso obtido das folhas e os extratos
etanólico e aquoso da casca do fruto da L domesticum mostraram-se ativo para o
clone 3D
7
(sensível a cloroquina) (YAPP e YAP, 2003). O quadro 1, pág., 69,
compara os resultados obtidos nesse trabalho com o trabalho de Leaman e
colaboradores, onde podemos observar que o óleo de andiroba foi eficaz contra o
clone Dd
2
com uma CI
50
de 8,4 após 72h de exposição quando comparado com o
extrato de Lansium domesticum que apresentou uma CI
50
maior quando testado
contra o clone D
6
. Em relação ao percentual de inibição dos extratos etanólico,
aquoso e metanólico da Lansium domesticum frente ao clone 3d
7
(Quadro 1, pág.,
69) o extrato mais eficiente foi o aquoso da casca do fruto com um percentual de
69
inibição de 75%, entretanto o óleo de andiroba frente ao clone W
2
apresentou um
percentual de inibição de 100% (Quadro 1, pág., 69). Sendo assim é pertinente a
continuidade do estudo do óleo de andiroba com ação antiplasmódica.
Quadro1: Comparação da atividade antiplasmódica de espécies de Meliaceae.
Amostras
Clone de P.
falciparum
CI
50
(µg/mL)
Referência
bibliográfica
Óleo de andiroba
Dd
2
24h- > 820
48h- 9,4
72h-8,4
Neste trabalho
Lansium domesticum
-Extrato etanólico
D
6
Variou de:
> 20
12, 8
9,3 para amostras
diferentes.
LEAMAN et al.,
1995.
Óleo de andiroba
W
2
Inibição de 100% em
todos os períodos.
Neste trabalho
L domesticum:
-Extrato metanólico
(Folha)
-Extrato aquoso
(Folha)
-Extrato etanólico
(Casca do fruto)
-Extrato aquoso
(Casca do fruto)
3d
7
Inibição de 65%.
Inibição de 55%.
Inibição de 60%
Inibição de 75%
YAPP e YAP,
2003.
Os resultados obtidos no presente estudo estão confirmando o uso popular,
pois diferentes espécies de Meliaceae são utilizadas na América Latina, Índia e
Sudão para o tratamento da malária (DEHARO et al., 2001; SIMONSEN et al., 2001;
SCHWIKKARD et al., 2002; CARABALLO et al., 2004; LAGOS et al., 2006;
MANEERAT et al., 2008). Vale ressaltar a importância de avaliar a toxicidade destas
espécies.
O óleo da semente (OS) de C. guianensis foi submetido à avaliação de
toxicidade aguda e subcrônica em ratos Wistar, sendo avaliados os parâmetros
bioquímicos, hematológicos e reprodutivos. Os resultados mostraram que na
toxicidade aguda o OS não produziu morte dos animais em doses de até 5,0 g/kg. A
administração por 30 dias do OS não alterou os parâmetros bioquímicos e
70
hematológicos, exceto, para a alanina aminotransferase (ALT) que na maior dose
induziu aumento de 29,3 ± 5,3% em relação ao grupo controle, e houve aumento da
massa hepática. Na toxicidade reprodutiva em fêmeas, a administração do OS não
modificou os índices reprodutivos no período de organogênese (7º ao 14º dia da
prenhez) e no período integral da gestação (1º ao 21º dia). Contudo, nesse último
período, observou-se aumento da atividade motora da prole proveniente de mães
tratadas com o óleo. No desempenho reprodutivo, o tratamento por 45 dias com OS
não induziu alterações nos índices reprodutivos, na massa relativa dos órgãos
reprodutivos (epidídimo, vesícula seminal e ducto deferente), no número de
espermatozóides dos testículos e na histologia do testículo e do epidídimo. Em
síntese, o óleo de Carapa guianensis, quando administrado por via oral, apresentou
baixa toxicidade em roedores (SILVA, 2006). Esta baixa toxicidade, mais uma vez,
sugeri que vale a pena continuar a investigação da atividade antimalárico deste óleo.
7.2. Fração rica em limonóides
Após o fracionamento do óleo de andiroba obteve-se uma fração rica em
limonóides. Alguns estudos têm demonstrado a atividade inseticida de limonoides
(NAKATANI et al., 1985; KUBO e KLOCKE, 1982; SIMMONDS et al., 2001;
RODRÍGUEZ et al., 2003). Seis dos limonóides, isolados de Carapa guianensis e
Cedrela fissilis, foram submetidos a ensaios com formigas Atta sexdens rubropilosa
e apresentaram atividade inseticida moderada (AMBROZIN et al., 2006).
A atividade biológica dos limonóides e de extratos vegetais contendo
limonóides tem sido investigada. A atividade de prevenção do câncer em linhagens
de células animais e humanas dos limonóides tem sido relacionada à atividade
antioxidante e indução de apoptose (POULOSE, HARRIS e PATIL, 2005).
Alguns limonoides, isolados de Cipadessa fruticosa (Meliaceae), foram
moderadamente ativos sobre T. cruzi (LEITE et al., 2010), vale ressaltar que este
parasito é um protozoário. O extrato bruto da casca preparado com cloreto de
metileno-matanol, e das sementes de K. grandifoliola foi testado in vitro contra o P.
falciparum (W
2
), apresentando uma CI
50
com valor de 13,23 µg/mL, porém quando
fracionado foram obtidos 7 limonóides com maior potencial antiplasmódico:
71
metilangolesato (1), 6-metil-hidro-angolensato (2), gedunina (3), 7-deacetilquivorina
(4), 1-deacetilquivorina (5), sietenolida (6) e 6-acetilsietenolida (7). Os limonóides 1,
3, 4, 5 e 7 apresentaram a CI
50
entre 1-10µg/mL, sendo o limonóides 3, gedunina, o
de melhor resultado CI
50
1,14µg/mL, ratificando a continuação do trabalho com a
fração rica em limonóides que apresentou CI
50
de 0,4µg/mL contra o clone Dd
2
e
uma taxa de inibição de 100% contra o clone W
2
(BICKII, et al., 2000).
. Quando se analisa os resultados obtidos no presente estudo, a fração rica
em limonóide obtida do óleo de andiroba, a partir de 24h de exposição, inibiu em
100% a parasitemia, na concentração 3,1µg/mL, para o clone W
2
(Tabelas 6, pág.,
64 e Tabela 7, pág., 64) e de modo tempo dependente para o clone Dd
2
. Resultado
semelhante já foi observado para a gedunina que foi avaliada em Parasita FCMSU/
Sudão e FCR
3TC
após 48h de exposição obteve-se uma CI
50
de 1µM, porém quando
se aumento o tempo de exposição houve uma redução da CI
50
(0,3µM) (KHALID et
al., 1986).
As características genéticas destes clones podem explicar tal resultado. O
clone Dd
2
cuja resistência a cloroquina é conhecida, traz na suas membranas o gene
Pfmdr1 (WILSON et al., 1993) entre outros, o gene denominado Pfmdr1 (P.
falciparum multi-drug resistance 1), após sofrer mutações pontuais codificando
alterações nos aminoácidos 1034, 1042 e 1246, podendo modular a sensibilidade à
cloroquina (CRAVO & ROSARIO, 2002). O que difere do clone W
2
que após o
cruzamento genético entre o clone resistente (W
2
) e um parasita sensível, P.
falciparum, cloroquina (HB
3
), caracterizou o gene cg2 (kb da região 36 do
cromossoma 7) como responsável para a resistência do cloroquina. O genótipo cg2
é caracterizado por doze mutações de ponto e por três polimorfismos do
comprimento (kappa, gama, e ômega), que são associados com os clones que têm
fenótipos de resistência a cloroquina (VIANA et al., 2006).
Uma estratégia muito adotada para aumentar a atividade biológica é
fracionamento, que pode levar ao isolamento do “principal” limonóide envolvido na
atividade. Vale ressaltar que, algumas vezes, o fracionamento pode levar a redução
da atividade, visto que esta é devido ao sinergismo entre seus componentes. De
qualquer forma, vale à pena fazer o isolamento e avaliação do potencial
antiplasmódico dos limonóides puros.
72
Algumas vezes o fracionamento, além de aumentar a atividade, pode levar ao
isolamento de substâncias com maior toxicidade. Logo, além de determinar a
Concentração Inibitória 50% (CI
50
), deve-se determinar a concentração citotóxica
50% (CC
50
), estes indicadores permitiram o calculo do Índice de seletividade
(CC
50
/CI
50
). A substância e/ou fração com maior índice de seletividade deve ser
priorizada para os estudos subseqüentes.
Outro fator que deve ser analisado é esta resposta tempo dependente da
fração rica em limonóides, que pode estar relacionada à tolerância do parasito a
amostra ou sinalizar uma resistência. Porém, por se tratar de tratar e uma estudo
preliminar, não se pode avaliar se está ou não ocorrendo tolerância e/ou resistência
deste clone a esta amostra.
7.3. Piper aduncum
Semelhante ao óleo de andiroba, a atividade antiplasmódica do óleo de Piper
foi tempo dependente para o clone Dd
2
(Tabela 8, pág. 65), porém não foi observada
esta relação para o clone W
2
(Tabela 9, pág., 65) Outro estudo, avaliou a atividade
antiplasmódica dos extratos etanólico do fruto e das partes aéreas do Piper
cumanense e Piper holtonii, respectivamente, onde foi obtida uma CI
50
< 1µg/mL
para os dois extratos frente ao clone FcB
2
(GARAVITO et al., 2006). Nesse trabalho
o óleo de Piper aduncum foi testado contra os clones Dd
2
e W
2
sendo que no
primeiro foi observada uma CI
50
17µg/mL (Quadro 2, pág., 73) após 72h de
exposição, entretanto contra o clone W
2
uma inibição de 100% em todos os períodos
analisados 24h, 48h e 72h (Quadro 2, pág.,73), sendo assim podemos inferir que o
óleo de Piper aduncum foi muito eficaz contra o clone W
2
e também apresentou
certa ação contra o clone multiresistente Dd
2
o que nos habilita a continuar o estudo
com essa planta para fins antiplasmódico.
73
Quadro 2: Atividade antiplasmódica do óleo de Piper aduncum *ND – Não determinado.
Clones
CI
50
(µg/mL)
Referência bibliográfica
Dd
2
24h - *ND
48h - 74
72h - 17
Neste trabalho
FcB
2
< 1
GARAVITO et al, 2006
W2
Inibição de 100% em
todos os períodos
analisados.
Neste trabalho
As possíveis diferenças entre as CI
50
do óleo de Piper aduncun podem estar
relacionadas às diferenças metodológicas entre o método tradicional e beta
cintilação. Além disso, os diferentes perfis de sensibilidade dos clones utilizados em
cada trabalho, em geral, em clones multiresistentes são obtidas CI
50
mais elevadas
do que clones sensíveis a cloroquina. Este fato foi observado nesta comparação
entre os clones W
2
e Dd
2
utilizados nesse trabalho (Tabela 4, pág., 62 e Figura 24,
pág., 62).
O extrato clorometileno de Piper capense foi submetido à avaliação da
atividade antiplasmódica em clone W
2
, sendo obtida a seguinte CI
50
7µg/mL (KAOU
et al., 2008). Contundo nesse trabalho o óleo de Piper aduncum quando colocado
frente ao mesmo clone (W
2
) apresentou uma inibição de 100% em todas as
concentrações, considerando-se todos os períodos de exposição, podendo assim
inferir que o óleo foi mais ativo que o extrato de Piper capense, o que nos credencia
a continuar o estudo dessa planta, Piper aduncum, como possível agente
antiplasmódico.
No presente estudo foi avaliada a composição do óleo de Piper aduncun,
sendo observado que o dilapiol (76,5%) é o constituinte predominante. Ainda foram
detectadas as presenças de miristicina (2,1%), e compostos como monoterpenos
74
(E)-β-ocimeno, sesquiterpeno hidrocarboneto germacreno D, sesquiterpeno
oxigenado (E)-cariofileno (Tabela 11, pág., 67). Quando se compara a literatura
constata-se que a composição do óleo é compatível, o dilapiol é constituinte
majoritário (FAZOLIN et al., 2005) como também, em estudos feitos com várias
amostras de Piper aduncum coletadas em Estados da Amazônia (MAIA et al., 1998),
com o Piper aduncum var. aduncum e Piper aduncum var. cordulatum, também da
Amazônia (GOTTLIEB et al., 1981) e com o Piper aduncum da Malásia e Fiji
(SMITH & KASSIM, 1979). Além do dilapiol, que também foi o componente
majoritário nesse trabalho, também os outros constituintes são compatíveis com a
literatura (MAIA et al., 1998; ALMEIDA et al., 2009). Em síntese, existe uma
correlação entre a composição química deste óleo descrita na literatura com os
resultados obtidos no presente estudo dispostos no quadro 3.
Quadro 3: Comparação da composição química do óleo de Piper aduncum obtido neste projeto ao
descrito na literatura.
Estudo
Composição
Presente trabalho
Dilapiol (76,5%), piperitona, terpinen-4-ol, miristicina,
(E)-cariofileno, γ-terpineno, germacreno D, apiol, α-
pineno, β-pineno, limoneno, α-ocinemo, β-ocinemo.
MAIA et al, 1998
Dilapiol (31,5% a 97,3%), limoneno, α-ocinemo, β-
ocinemo, piperitona, terpinen-4-ol, miristicina, (E)-
cariofileno, γ-terpineno, germacreno D, apiol, α-pineno,
β-pineno, α-copaeno, linalol.
ALMEIDA et al., 2009
Dilapiol (79,9%), α-pineno, α-copaeno, limoneno, α-
ocinemo, β-ocinemo, γ-terpineno, terpinen-4-ol,
piperitona, β-cariofileno, apiol.
Alguns estudos têm demonstrado o alto potencial inseticida desta planta.
Bernard e col. (1995) apontam o P. aduncum como o Piper de maior potencial
inseticida para larvas de segundo instar de Aedes atropalpus (Coquillett). Nesse
ensaio, extrato aquoso de plantas frescas de P. aduncum aplicado diretamente na
água, na concentração de 10 ppm, causaram a mortalidade de 50% das larvas de
75
segundo instar desse culicídeo. Já o dilapiol isolado e purificado, apresentou, nas
mesmas condições experimentais, 92% de eficiência no controle das larvas na
concentração de 1 ppm. Logo, provavelmente o dilapiol é o responsável pela
atividade inseticida.
Analisando o potencial genotóxico e clastogênico do Piper cubeba, espécie
das Piperaceae, com extrato, hidroalcoólico, em células de roedores utilizando o
teste do micronúcleo (MNT) e o ensaio cometa - SCGE (single cell gel
electrophoresis) em três concentrações do extrato; 25, 50 e 75% da DL
50
(2g/Kg)
foram observados nesse estudo que efeito genotóxico e clastogênico moderado em
células de roedores, ou seja, o efeito genotóxico e clastogênico foi constatado
apenas em altas doses nos testes in vivo, a partir da concentração de 50% da DL
50
(JUNQUEIRA, 2006)
O efeito genotóxico também foi analisado com o Piper aduncum em larvas e
pupa do Aedes aegypti. Devido à atividade inseticida do dilapiol, esse
fenilpropanóide tem sido usado como alternativa no controle de vetor como o A.
aegypti, sendo assim o efeito genotóxico do óleo de dilapiol foi analisado por meio
do teste de micronúcleo (MNT), através de anormalidades nucleares e anomalias
cromossômicas em larvas e pupas do vetor. Nesse estudo foi detectado
micronúcleos em células interfásicas, metafásicas diplóides e tetraplóides e em
anáfase, além de um ou mais núcleos (cromatina condensada), anomalias
nucleares, cromossomos fragmentados e retardatários, sendo assim o dilapiol nas
concentrações de 200µg/mL e 400µg/mL pode ter causado dano cromossômico
estrutural ou no aparelho mitótico do A. aegypti. Sendo assim, o óleo de dilapiol
causou dado genético apenas em altas concentrações o que viabiliza a continuação
do estudo do Piper aduncum, pois neste trabalho as concentrações trabalhadas
foram muito menores que as concentrações danosas (ROJAS, 2007)
76
8. CONCLUSÕES
Baseado nos resultados, conclui-se que tanto o óleo de andiroba quanto a
fração rica em limonóides apresentam atividade antiplasmódica, em baixa
concentração, podendo ser considerados candidatos promissores ao tratamento da
malária.
Quanto ao óleo de pimenta-de-macaco foi constatada uma ação
antiplasmódica menor, sendo necessários estudos mais aprofundados para
confirmação dessa atividade.
77
9. REFERÊNCIAS.
ADAMS, R. P. Identification of essential oil components by gas
chromatography/mass spectrometry. London: Allured Pub. Corp. 804p. 2007.
AGRA, M. F; BARACHO, G. S, NURIT, K; BASÍLIO, I. J. L. D; COELHO, V. P. M.
Medicinal and poisonous diversity of the flora of “Cariri Paraibano”, Brazil. Jounal
Ethnopharmacology. 111 (2). pp. 383-395, 2007.
ALMEIDA, R. R. P.; SOUTO, R., N., P.; SILVA, M., H., L.; MAIA, J. G., S.. Chemical
Variation in Piper aduncum and Biological Properties of Its Dillapiole-Rich Essential
Oil. Chemistry & Biodiversity, v 9, n 6, pp1427-1434. 2009.
ALVES, M. J. C. P; RANGEL, O; SOUZA, S. S. A. L. Malária na região de Campinas,
São Paulo, Brasil, 1980 a 1994. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical. 33 (1), 53-60, 2000.
AMBROZIN, A. R. P; LEITE, A. C.; BUENO, F. C; VIEIRA, P. C; FERNANDES, J. B.;
BUENO, O. C; SILVA, M. F. G. F; PAGNOCCA, F. C. HEBLING, M. J. A.; BACCI
JÚNIOR, M. Limonoids from andiroba oil and Cedrela fissilis and their insecticidal
activity. Journal of the Brazilian Chemical Society. 17(3), 542-547, 2006.
AMBROZIN, A. R. P; VIEIRA, P. C; FERNANDES, J. B; SILVA, M. F. G. F.
Limonóides do óleo das sementes de andiroba (Carapa guianensis). In: 23a RA da
SBQ, 2000.
ANDRADE NETO, V. F. Avaliação da atividade antimalárica de extratos vegetais
e substâncias purificadas como esquizonticidas sanguíneos e teciduais. 2004.
144f. (Tese de Doutorado), Depto de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas -
Universidade Federal de Minas Gerais, 2004.
ANDRADE–NETO, V. F. Atividade antimalárica de extratos brutos, frações semi-
purificadas e de compostos quimicamente definidos isolados de plantas
utilizadas na medicina popular. 2004. 111f. (Dissertação de Mestrado), Depto de
Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de minas
Gerais, 2000,
BARROSO, G. M. et al. Sistemática de Angiosperma do Brasil. vol. I.
LTC/EDUSP. Rio de Janeiro. 254p. 1978.
BARROSO, G. M.. et al Sistemática de Angiospermas do Brasil. vol. II. Imprensa
Universitária. Viçosa. 377p., 1991
BASTOS, C.N. & ALBUQUERQUE, P.S.B. Efeito do óleo de Piper aduncum no
controle em pós-colheita de Colletotrichum musae em banana. Fitopatologia
Brasileira 29:555-557. 2004.
BELZILE, A. S; MAJERUS, S., L.; PODESZFINSKI, C. ; GUILLET, G. ; DURST, T. ;
ARNASON, J., T. . Dillapiol derivatives as synergists: struture – activity relationship
analysis. Pesticide Biochemistry and Physiology 66, 33-40, 2000.
78
BICKII, J; NJIFUTIE, N; FOYERE, J. A; BASCO, L. K. In vitro antimalarial activity of
limonoids from Khaya gradifoliola C.D.C (Meliaceae). J. Ethnopharmacol., 69, 27-
33, 2000.
BIZZO, H. R; LOPES, D; ABDALA, R. V; PIMENTEL, F. A; SOUZA, J. A; PEREIRA,
M. V. G; BERGTER, L; GUIMARÃES, E. F. Sarisan from leaves of Piper
hispidinervum C. DC (Long pepper). Flavour and Fragance Journal, Scotland, v.
16, 113-115, 2001.
BOUFLEUER, N. T. Aspectos ecológicos de andiroba (Carapa guianensis Aublet.,
MELIACEAE), como subsidio ao manejo e conservação. Dissertação de mestrado.
2004. 86f.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual de Diagnóstico laboratorial de
malaria, 2005. Disponível em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/malaria_diag_manual_final.pdf>
Acesso em: 15 de abril de 2009 b.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Situação Epidemiológica da malária no Brasil
2008. Disponível em:
<http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/folder_malaria_2008_final.pdf.>
Acesso em: 04 de dezembro de 2009.
CARABALLO, A; CARABALLO, B; RODRIGUEZ-ACOSTA, A. Preliminary
assessment of medicinal plants used as antimalarials in the southeastern
Venezuelan Amazon. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 37
(2), 186-188, 2004.
CARTER, R. and DIGGS, C. L. Plamodia of rodents. In: Parasitic Protozoa, vol. 3. pp
359-465. 1977.
CARVALHO, L. H. Quimioterapia experimental com extratos brutos de plantas
quimicamente definidos. Belo Horizonte: UFMG. (Dissertação Mestrado),
Departamento de Parasitologia, Universidade Federal de Minas Gerais, p. 146, 1990.
CARVALHO, L. J. M; ALVES, F. A; OLIVEIRA, S. G; VALLE, R. D. R; FERNANDES,
A. A. M; MUNIZ, J. A. P. C; DANIEL-RIBEIRO, C. T. Severe Anemia Affects Both
Splenectomized and Nonsplenectomized Plasmodium falciparum-infected Aotus
infulatus Monkeys. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 98(5): pp 679-686, 2003.
CARVALHO, L. J. M; OLIVEIRA, S. G; ALVES, F. A; BRÍGIDO, M. C. O; MUNIZ, J.
A. P. C; DANIEL-RIBEIRO, C. T. Aotus infulatus monkey is susceptible to
Plasmodium falciparum infection and may constitute an alternative experimental
model for malaria. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 95(3): pp 363-365. 2000.
CASTRO, L. H.; SANTOS, O., P.; BIAGGIO, R., M.; BELTRAME JÚNIOR, M.
Extração e estudo de óleos essenciais da semente da Andiroba. X Encontro latino
americano de Iniciação Cientifica e VI Encontro latino americano de pós-graduação.
pp 201-204. São José dos Campos. 2006
CENP. 2009. <http://www.cenp.org.br/artigos_ver.php?idConteudo=3 > Acesso em:
18 de abril de 2010.
79
COOPER, R., G. & MAGWERE, T. Chloroquine: Novel uses & manifestations. Indian
Journa of Medical Research, v. 127, 305-316, 2008
CORBETT, Y; HERRERA, L; GONZALEZ, J; CUBILLA, L; CAPSON, T. L; COLEY,
P. D; KURSAR, T. A; ROMERO, L. I; BARRIA, E. O. A novel dna-based
microfluorimetric method to evaluate antimalarial drug activity. Am. J. Trop. Med.
Hyg., 70(2), 119–124, 2004.
CORRÊA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas
cultivadas, Imprensa Nacional, Rio de Janeiro. v. 1, 1926.
CORRÊA, M. P. Dicionário de planta úteis do Brasil e exóticas cultivadas.
Brasília: IBDF, pp 113-114, 371-376. 1984
COSTA, M. S; FERREIRA, M. M. C. Estudo teórico da interação existente entre a
artemisinina e o Heme. Química Nova, v. 30, n 1. 25-31, 2007.
COSTA-SILVA, J. H; LYRA, M, M. A; LIMA, C. R; ARRUDA, V., M; ARAÚJO, A. V;
RIBEIRO, A. R; ARRUDA, A. C;.FRAGA, M. C. C A; LAFAYETTE, S. S. L;
WANDERLEY, A. G. Estudo Toxicológico Reprodutivo da Carapa guianensis Aublet
(Andiroba) em Ratas Wistar. Acta Farm. Bonaerense 25 (3): 425-8, 2006.
COUTO, A. A; CALVOSA, V. S; SANTOS, M. A; SOUZA, J. M. Resistência in vitro
de cepas do Plasmodium falciparum isoladas no Sul do Estado do Pará, em
diferentes períodos: emergência de casos de multirresistência. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 26(1): pp 5-9, 1993.
CRAVO, M. P; VIRGILIO, E. do R. Aspectos de genética molecular da resistência
aos fármacos antimaláricos. Bio-medicina e Saúde Pública: n. 73, pp. 2-8, dez.
2002.
DEHARO, E; BOURDY, G; QUENEVO, C; MUNÕZ, V; RUIZ, G; SAUVAIN, M. A
search for natural bioactive compounds in Bolivia through a multidisciplinary
approach. Part V. evaluation of the antimalarial activity of plants used by the Tacana
Indians. Jounal of Ethnophamacology. 77, 91-98, 2001.
DOLABELA, M. F. Atividade antiplasmódica e citotoxidade de Esenbeckia
febrífuga (A.St-Hil.) Juss. ex Mart. (RUTACEAE) e de espécies do gênero
Aspidosperma (APOCYNACEAE). 2007. 181f. (Tese de Doutorado). Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia UFMG.
2007.
DONDORP, A. M; NOSTEN, F; YI, P; DAS, D; PHYO, A. P; TARNING, J; LWIN, K.
M; et al. Artemisinin Resistance in Plasmodium falciparum Malaria. The new
England journal of medicine. 36 1:5. 2009.
ECKSTEIN-LUDWIG, U. WEBB, R. J; VAN GOETHEM, I. D. A; EAST, J. M; LEE, A,
G; KIMURA, M; OEILL, P. M; BRAY, P. G; WARD, S. A; KRISHNA, S. Artemisinins
target the SERCA of Plasmodium falciparum. Nature, n.424: 957-961, 2003.
EGAN, T.J.; HEMPELMANN, E.; MAVUSO, W.W. .Characterisation of synthetic
betahaematin and effects of the antimalarial drugs quinidine, halofantrine,
80
desbutylhalofantrine and mefloquine on its formation. Jounal of Inorganic
Biochemistry, v.73(1-2), p.101-7, 1999.
ESTRELA, J. L. V; FAZOLIN, M; CATANI, V; ALÉCIO, M. R; LIMA, M. S. Toxicidade
de óleos essenciais de Pier aduncum e Piper hipidinervum em Sitophilus zeamais
Pesq. Agropec., Basilia, v. 41, n. 2, 217-222, 2006.
FARIAS, M. P. O. SOUSA, D. P; ARRUDA, A. C; WANDERLEY, A. G; TEXEIRA, W.
C; ALVES, L. C; FAUSTINO, M. A. G. Potencial acaricida do óleo de andiroba
Carapa guianensis Aubl. sobre fêmeas adultas ingurgitadas de Anocentor nitens
Neumann, 1897 e Rhipicephalus sanguineus Latreille, 1806. Arq. Bras. Med. Vet.
Zootec., v.61, n.4, 877- 882, 2009.
FARIAS, M. P. O.; SOUSA, D. P.; ARRUDA, M. S. P.; WANDERLEY, A. G.; ALVES,
L. C.; FAUSTINO, M. A. G. Eficácia in vitro do óleo de Carapa guianensis Aubl.
(andiroba) no controle de Boophilus microplus (AcariIxodidae). Revista Brasileira
Pub Med., v.9, n.4, p.68-71, 2007
FARMACOPÉIA BRASILEIRA 4° ed. Parte 2, São Paulo: Atheneu, 1988
FAZOLIN, M, ESTRELA, J. L. V; CATANI, V; ALÉCIO, M. R; LIMA, M, S.
Propriedade inseticida dos óleos essenciais de Piper hispidinervum C. DC.; Piper
aduncum L. e Tanaecium nocturnum (Barb. Rodr.) Bur. & K. Shum sobre Tenebrio
molitor L., 1758. Ciênc. agrotec., v.31, n.1, 113-120, 2007.
FAZOLIN, M; ESTRELA, J. L. V; CATANI, V; LIMA, M, S; ALÉRCIO, M, R.
Toxicidade do óleo de Piper aduncum L. a adultos de Cerotoma tingomarianus
Bechyné (Coleoltera: Chrysomelidae). Neotropical Entomology. v. 34, n. 3, 2005.
FENNER, R; BETTI, A. H; MENTZ, L. A; RATES, S. M. K. Plantas utilizadas na
medicina popular brasileira com potencial atividade antifúngica. Rev. Bras. Cienc.
Farm., São Paulo, v. 42, n. 3, 2006.
FERNANDES, N. E. P; CRAVO, P; ROSÁRIO, V. E. Resistência à sulfadoxina-
pirimetamina em Maputo, Moçambique: presença de mutações nos genes dhfr e
dhps do Plasmodium falciparum. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical. 40 (4), pp 447-450, 2007
FERRARI, M, OLIVEIRA, M. S. C; NAKANO, A., K; ROCHA FILHO, P. A.
Determinação do fator de proteção solar (FPS) in vitro e in vivo de emulsões com
óleo de andiroba (Carapa guianensis). Rev. bras. farmacognosia, vol.17, n.4, 626-
630, 2007.
FERRARI, M. Obtenção e aplicação de emulsões múltiplas contendo óleos de
andiroba e copaíba. Ribeirão Preto, 147f. (Dissertação de Mestrado) Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 1998.
FERRAZ, I. D. K.; CAMARGO, J., L., C.; SAMPAIO, P., T., B. Manual de sementes
da Amazônia. 2003. Disponível em
<hftp://ftp.inpa.gov.br/pub/documentos/sementes/manuais/fasciculo1_carapa.pdf>
Acesso em: 29 de dezembro de 2009.
81
FERRAZ, I. D. K.; SAMPAIO, P. T. B. Métodos simples de armazenamento das
sementes de andiroba (Carapa guianensis Aublet. e Carapa procera D.C. –
Meliaceae). Acta Amazonica, v. 26, n. 3, p. 137-144, 1996
FERRAZ, R. J. V. Quimioterapia da malária: Síntese de duplos pró-farmacos da
primaquina. (Tese de Doutorado). Faculdade de Ciências da Universidade do Porto.
2002.
FISCH, S. T. V; FERRAZ, I. D. K; RODRIGUES, W. A. . Distinguishing Carapa
guianensis Aubl. from Carapa procera D.C. (Meliaceae) by morphology of young
seedlings. Acta Amazonica 25, 193-200, 1995.
FOLEY, M.; TILLEY, L. Quinoline antimalarials: mechanisms of action and resistance
and prospects for new agents. Pharmacology and Therapeutics, 9. p. 55-87, 1998.
FOURNET, A; FERREIRA, M. E; FUENTES, S; TORRES, S; INCHAUSTI, A;
YALUFF, G; NAKAYAMA, H; MAHIOU, V; HOCQUEMILLER, R; CAVÉ, A. In vitro
and in vivo leishmanicidal studies of Peperomia galioides (Piperaceae).
Phytomedicine
. 3 (3), 271-275, 1996.
FRANÇA, T. C. C; SANTOS, G; FIGUEROA-VILAR, J. D. Malária: aspectos
históricos e quimioterapia. Quím. Nova, São Paulo, v. 31, n. 5, 2008.
FRANQUILINO, E. Cosmet Toiletries edição temática, Ativos Amazônicos ed. Port.,
18: 18-53. 2006.
GARAVITO, G; RICON, J; ARTEAGA, L; HATA, Y; BOURDY, G; GIMENEZ, A;
PIZON, R; DEHARO, E. Antimalarial activity of some Colombian medicinal plants.
Jounal of Ethnopharmacol, v.11, 107(3), 460-462, 2006.
GAZIM, Z. C., FERREIRA, G. A; REZENDE, C. M; NAKAMURA, C. V; DIAS FILHO,
B. P; CORTEZ, D. A. G. Chemical compounds of the Calendula officinalis volatile
fraction produced in the Paraná State, Brazil, Horticultura Brasileira, 25(1), 118-
121, 2007.
GEMTCHÙJNICOV, I. D. de. Manual de Taxonomia Vegetal: Plantas de Interesse
Econômico. São Paulo: Ed. Agronômica Ceres. 368p. 1976.
GRIFFITH, K. S.; LEWIS, L., S.; MALI, S. et al. Treatment of malaria in the United
States: a systematic review. Jama. 297 (20). 2264-2277, 2007.
GUIMARÃES, K. V; MARINHO, P. S. B; SILVA, M. das G. F; FERNANDES, J. B;
VIEIRA, P. C; MULLER, M. W. limonóides isolados na família meliaceae. XXVI
Reunião Anual sobre Evolução, Sistemática e Ecologia Micromoleculares Instituto de
Química, Universidade Federal Fluminense, 2004.
HAYNES, J. D; DIGGS, C. L; HINES, F. A. e DESJARDINS, R. E. Culture of human
malaria parasites P. falciparum. Nature, 263, 767-769, 1976.
HUNT, P; AFONSO, A; CREASEY, A; CULLETON, R; SIDHU, A. B; LOGAN, J;
VALDERRAMOS, S. G; MCNAE, I; CHEESMAN, S; do ROSÁRIO, V; CARTER, R;
FIDOCK, D. A; CRAVO, P. Gene encoding a deubiquitinating enzyme is mutated in
82
artesunate- and chloroquine-resistant rodent malaria parasites. Molecular
Microbiology 65(1), 27–40, 2007.
JARAMILLO, M. S; MANOS, P. S. Phylogeny and patterns of floral diversity in the
genus Piper (Piperaceae). American Journal of Botany, n. 88: 706-716, 2001.
JOLY, A. B.. Botânica: introdução à taxonomia vegetal. 8
o
ed. São Paulo: Editora
Nacional. 777p, 1987.
JUNQUEIRA, A. P. F. Estudo do potencial clastogênico e genotóxico do extrato de
Piper cubela em células de roedores in vivo. (Dissertação de Mestrado), Programa
de Mestrado em Saúde, Universidade José Rosário Vellano, UNIFENAS 2006, 67p.
KAOU, A. M; MAHIOU-LEDDET, V; HUTTER, S; AIONOUDDINE, S; HASSANI, S;
YAHAYA, I; AZAS, N; OLLIVIER, E. Antimalarial activity of crude extracts from nine
African medicinal plants. Jounal of Ethnopharmacol, 28; 116(1): 74-83, 2008.
KETEMA, T; KETEMA, B; BIRHANU, T; PETROS, B. Chloroquine-resistant
Plasmodium vivax malaria in Serbo town, Jimma zone, south-west Ethiopia.
Malaria Journal. v. 8, n. 177, 1-8, 2009.
KHALID, S. A; FAROUR, A; GEARY, T, G; JENSEN, J. B. Potential antimalarial
candidates from African plants: an in vitro approach using Plasmodium falciparum.
Jounal of Ethnopharmacology. 15. 201-209, 1986.
KIRANDEEP, K.; MEENAKSHI, J.; TARANDEEP, K.; JAIN, R. Phytochemistry of the.
Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2009.
KRIEF, S; MARTIN, M, T. GRELLIER, P; KASENENE, J; SEVENET, T. Novel
antimalarial compounds Isolated in a survey of Self-Medicative Behavior of wild
Chimpanzees in Uganda. Antimicrobial agents and Chemotherapy, v. 48, n. 8,
3196–3199, 2004.
Kubo, I.; Klocke, J. A.; Experientia 64, 81. 1982.
LAGOS, J. B; MIGUEL, O. G; DUARTE, M. do R. Caracteres anatômicos de catuaba
(Trichilia catiguá A. Juss., Meliaceae). Latin Americam Jounal of Pharmacy. 26
(2), 185-190, 2007.
LEAMAN, D. J; ARNASON, J. T; YUSUF, R; SANGAT-ROEMANTYO, H;
SOEDJITO, H; ANGERHOFER, C. K; PEZZUTO, J. M.. Malaria remedies of the
Kenyah of the Apo Kayan, East Kalimantan, Indonesian Borneo: A quantitative
assessment of local consensus as an indicator of biological efficacy. Jounal of
Ethnopharmacology. v. 49, 1-16, 1995.
LEE, S. E. KIMB, M. R; KIMB, J. H et al, Antimalarial activity of anthothecol derived
from Khaya anthotheca (Meliaceae). Phytomedicine, 2007.
LEITE, A. C.; PLACERES NETO, A; AMBROZIN, A. R. P; FERNANDES, J. B.;
VIEIRA, P. C; SILVA, M. F. das G. F; ALBUQUERQUE, S. Trypanocidal activity of
83
flavonoids and limonoids isolated from Myrsinaceae and Meliaceae active plant
extracts. Rev. bras. farmacogn., , v.20, n1, pp.01-06. 2010.
LOIOLA, C. C. P.; SILVA, C., J., M., da; TAUIL, P., L. Controle da malária no Brasil:
1965 a 2001. Rev Panam Salud Publica, vol. 11, n. 4, pp 235-244, 2002.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: Manual de identificação e cultivo de plantas
arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa. Plantarum. 351p, 1992.
MACKINNON, S.; DURST, T.; ARNASON, J., T. Antimalarial Activity of Tropical
Meliaceae Extracts and Gedunin Derivatives. J. Nat. Prod.vol. 60, 336-341, 1997.
MADUREIRA, M. C.MARTINS, A. P; GOMES, M; PAIVA, J; CUNHA, A. P;
ROSÁRIO, V. Antimalarial activity medicinal plants used in tradicional medicine in S.
Tomé e Príncipe.Journal of Ethnopharmacology. 81, 23-29, 2008.
MAIA, J. G. S. et al. Plantas Aromáticas na Amazônia e Seus Óleos Essenciais.
Belém: Museu Paraense Emilio Goeldi, 186p, 2000.
MAIA, J. G. S; et al. Constituents of the essencial oil of Piper aduncum L. growing in
the Amazon Region, J. Flavour Frag. v. 13, 269-272, 1998.
MANEERAT, W; LAPHOOKIEO, S; CHANTRAPROMMA, K. Antimalarial,
antimycobacterial and cytotoxiclimonoids from Chisocheton siamensis.
Phytomedicine 15, 1130–1134. 2008.
MARQUES, A. C; et al. Manual de Terapêutica da Malária. Brasília: Ministério da
Saúde. Fundação Nacional de Saúde, 2001. 104 p. il.
MATSUI, K.; MUNSKATA, K. The structure of piperenone, a new insect antifeedant
substance from Piper futokadzura. Tetrahedron Letters, v.15, n.10, pp.1905-1908,
1975.
MAYOR, A. G; GOMEZ-OLIVE, X; APONTE, J. J; CASIMIRO, S; MABUNDA, S;
DGEDGE, M; BARRETO, A; ALONSO, P. L. Prevalence of the K76T mutation in the
putative Plasmodium falciparum chloroquine resistance transporter (pfcrt) gene and
its relation to chloroquine resistance in Mozambique. Journal of Infectious
Diseases. 183, pp1413-1416, 2001.
MCCUTCHAN, T. F; DAME, J. B; MILLER, L. H; BARNWELL, J. Evolutionary
relatedness of Plasmodium species as determined by the structure of DNA. Science
225, pp 808-811. 1984
MENDONÇA, A. P; FERRAZ, I, D. K. Óleo de andiroba: processo tradicional da
extração, uso e aspectos sociais no estado do Amazonas, Brasil. Acta Amaz., v.37,
n.3, 353-364. 2007.
MENDONÇA, F. A; SILVA, K. F; SANTOS, K. K; RIBEIRO JÚNIOR, K. A; Sant'Ana,
A. E. Activities of some Brazilian plants against larvae of the mosquito Aedes aegypti.
Fitoterapia. V 76, 7 - 8, pp. 629 - 636. 2005.
84
MERYMAN, H. T.; HORNBLOWER, M. A method for freezing and washing red blood
cell using a high glycerol concentration. Transfusion, v.12, p.145-156, 1972
MESQUITA, M. L.; et al. Antileishmanial and trypanocidal activity of Brazilian Cerrado
plants. Mem. Inst. Oswaldo Cruz.; 100 (7): 783-787. 2005.
MILLER H. L.; BARUCH, D. I; MARSH, K; DOUMBO, O. K.The pathogenic basic of
malaria. Nature. v. 415, 2002.
MILLIKEN, W. Algumas plantas usadas no tratamento de malária em Roraima.
Relatório preliminar. Kew: Royal Botanical Garden, 1995. 67 p
MIOT, H. A.; BATISTELLA, R. F; BATISTA, K. A; VOLPATO, D. E. C; AUGUSTO, L.
S. T; MADEIRA, N. G; HADDAD JÚNIOR, V; MIOT, L. D. B. Comparative study of
the tropical effectiveness of the Andiroba oil (Carapa guianensis) and DEET 50% as
repellent for Aedes sp. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo; v.46 (5), 253-256, 2004.
MOHAMAD, K; HIRASAWA, Y; LITAUDON, M; AWANG, K; HADI, H, A; TAKEYA, K;
EKASARI, W; WIDYAWARUYANTI, A; ZAINI, N, C; MORITA, H. Ceramicines B–D,
new antiplasmodial limonoids from Chisocheton ceramicus. Bioorganic & Medicinal
Chemical v. 17, 727–730, 2009.
MONTOYA, P. et al. Polimorfismos del gen pfmdr1 en muestras clínicas de
Plasmodium falciparum y su relación con la respuesta terapéutica a antipalúdicos y
paludismo grave en Colombia. Biomédica; 27, 204-15, 2007.
MUELLER, M. S; KARHAGOMBA, I. B; HIRT, H. M; WEMAKOR, E. The potencial of
Artemisia annua L. as a locally produced remedy for malaria in the tropics:
agricultura, chemical and clinical aspects. Journal of Ethnopharmacology. 73, 487-
493, 2000.
MUELLNER A. N. R; SAMUEL, R; JOHNSON, S, A.; CHEEK, M; PENNINGTON, T,
D. Molecular phylogenetics of Meliaceae based on nuclear and plastid DNA
sequences. American Journal of Botany 90: 471-480, 2003.
MUGITTU, K.; GENTON, B; MSHINDA, H; BECK, H. P. Molecular monitoring of
Plasmodium falciparum resistance to artemisinin in Tanzania. Malaria Journal,
5:126p, 2006.
NAKATANI, M.; IWASHITA, T.; NAOKI, H.; HASE, T.; Structure of a limonoid
antifeedant from Trichilia roka. Phytochemistry, 24, pp195-196. 1985.
NAVICKIENE, H. M. D. et al. Composition and antifungal activity of essencial oil from
Piper aduncum, Piper arboretum e Piper tuberculatum. Quimica nova. v. 29, n. 3,
467-470, 2006.
NAYAK, B. S; KANHAI, J; MILNE, D. M; PEREIRA, L. P; SWANSTON, W. H.
Experimental Evaluation of Ethanolic Extract of Carapa guianensis L. Leaf for Its
Wound Healing Activity Using Three Wound Models. 13, pp 1-7, 2009.
NIST. Mass Spectral Library. NIST Mass Spectral Search Program (NIST 05,
Version 2.0d). Gaithersburg, MD.: The NIST Mass Spectrometry Data Center. 2005.
85
NKRUMAH, L. J; RIEGELHAUPT, P. M; MOURA, P; JOHNSON, D. J; PATEL, J;
HAYTON, K; FERDIG, M. T; WELLEMS, T. E; AKABAS, M. H; FIDOCK, D. A.
Probing the multifactorial basis of Plasmodium falciparum quinine resistance:
Evidence for a strain-specific contribution of the sodium-proton exchanger PfNHE.
Molecular & Biochemical Parasitology, v. 165(2), 122-131, 2009.
NOEDL, H.; WONGSRICHANALAI, C. e WERNSDORFER, W. H. Malaria drug-
sensitivity testing: new assays, new perspectives. Trends in Parasitology. 19(4),
175-181, 2003.
NORONHA, E; ALECRIM, M. G; ROMERO, G. A. S; MACÊDO, V. Resistência à
mefloquina do tipo RIII em crianças com malária falciparum em Manaus, AM, Brasil.
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 33(2), 201-205, 2000.
NUNES, J. D; TORRES, G.A; DAVIDE, L.C; SALGADO, C.C. Citogenética de Piper
hispidinervum e Piper aduncum. Pesq. agropec. 42. 7. pp1049-1052. 2007.
OLIVEIRA, A. R. M; SZCZERBOWSKI, D. Quinina: 470 anos de história,
controvérsia e desenvlovimento. Química nova, vol. 32, n. 7, 1971-1974, 2009.
OLIVEIRA, S. G. D et al. Avaliação da atividade citotóxica e/ou antineoplásica dos
extratos de Carapa guianensis Aubl.em linhagens celulares tumorais e não-tumorais.
XVII Congresso de Iniciação Científica X Encontro de pós-graduação. 2008.
PARMAR, V, S;JAIN, S, C; BISHT, K, S; JAIN, R; TANEJA, P; JHA, A; TYAGI, O, M;
PRASAD, A, K; WENGEL, J; OLSEN, C, E; BOLL, P, M. Phytochemistry of the
genus Piper. Phytochemistry, vol. 46, n. 4, 597-673. 1997.
PENIDO, C.; CONTE, F. P; CHAGAS, M. S. S; RODRIGUES, C. A. B; PEREIRA, J.
F. G; HENRIQUES, M. G. M. O. Antiinflammatory effects of natural
tetranortriterpenoids isolated from Carapa guianensis Aublet on zymosan-induced
arthiris in mice. Inflamm. Res.; v. 55(11);64-457. 2006.
PENNINGTON, T. D; STYLES, B. T; TAYLOR, D. A. H. Meliaceae. Flora
neotropica, 28: pp 406-419. 1981
PETERS, W. Drug resistance in malaria parasites of animals and man. Adv
Parasitol 41, pp 1-62.1998.
PHILLIPSON, J. D. Phytochemistry and medicinal plants. Phytochemistry. 56, pp
237-243. 2001.
POULOSE, S. M; HARRIS, E. D. and PATIL, B. S. Citrus Limonoids Induce
Apoptosis in Human SH-SY5Y Neuroblastoma Cancer Cells. Hort. Science, 40:
1135 - 1136. 2005.
POVÓA, M. M; SOUZA, R. T. L; LACERDA, R. N. da L; ROSA, E. S; GALIZA, D;
SOUZA, J. R; WIRTZ, R. A; SCHLICHTING, C. D; CONN, J. E. The importance of
Anopheles albitarsis E and An. darlingi in human malaria transmission in Boa Vista,
state of Roraima, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 101(2): 163-
168, 2006.
86
PRICE, R. N; CASSAR, C; BROCKMAN, A; DURAISINGH, M; VAN VUGT, M;
WHITE, N. J; NOSTEN, F; KRISHNA, S. The pfmdr1 gene is associated with a
multidrug-resistant phenotype in Plasmodium falciparum from the Western Border of
Thailand. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 43, n 12, 1999.
QI, S. H; WU, D. G; ZHANG, S; LUO, X. D. Constituents of Carapa guianensis Aubl.
(Meliaceae). Pharmazie. 59: pp 488-490. 2004
QUEIROZ, N. L; et al Imunopatogênese da malária cerebral. Revista Brasileira de
Neurologia, 44 (1), 13-19. 2008.
RASOANAIVO, P; PETITJEAN, S; RATSIMAMANGA-URVERG; RATSIMAMANGA-
RAKOTO, A. Medicinal plants used to treat malaria in Madagascar. Jounal of
Ethnopharmacology, 37, pp 117-127. 1992.
REGASINI, L. O. et al. Trypanocidal activity of Piper arboreum and Piper
tuberculatum (Piperaceae). Rev. bras. farmacogn., João Pessoa, v. 19, n. 1b, 2009.
RIDLEY, R.G. Medical need, scientific opportunity and the drive for antimalarial
drugs. Nature, 415, 686-693, 2002.
RIECKMAN, K. H.;et al. Drug sensitivity of Plasmodium falciparum. an in vitro
microtchnique. The Lancet, v.311, n. 8054, 22-23,1978.
RIZZINI, C. T.; MORS, W. B. Botânica econômica brasileira. São Paulo: EDUSP,
1976. 206 p.
ROCHA, M. N. A. et al. Aspecto histórico da malária. Rev. Para. Med., v..20, n.3, 81-
82. 2006.
RODRIGUES, R et al: Otimização do processo de extração e isolamento do
antimalárico artemisinina a partir de Artemisia annua L. Quím. Nova, São Paulo, v.
29, n. 2, 2006.
RODRÍGUEZ, B; CABALLERO, C; ORTEGO, F; CASTAÑERA, P; A new
tetranortriterpenoid from Trichilia havanensis. J. Nat. Prod. 66, pp 452-454. 2003.
ROJAS, W. J. H. Efeito genotóxicodo extrato de Piper aduncum L. (dilapiol) em
biomarcadores nucleares, micronúcleos e cromossomos de Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae), MANAUS, AMAZONAS. 2007. 63f. (Dissertação de Mestrado)
Programa Integrado de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais,
Universidade Federal do Amazonas UFAM, 2007.
ROY, A; et al. Limonoids: Overview of Significant Bioactive Triterpenes Distributed in
Plants Kingdom. Biol. Pharm. Bull. v. 29 (2) 191-201. 2006.
SAEWAN, N; et al. Antimalarial tetranortriterpenoids from the sedes of Lansium
domesticum Corr. Phytochemistry, 67, 2288-2293. 2006.
SAMPAIO, P. de T. B. Andiroba (Carapa guianensis). In: CLAY, J. W.; SAMPAIO, P.
de T. B.; CLEMENT, C. R. Biodiversidade Amazônica: exemplos e estratégias de
87
utilização. Manaus: Programa de Desenvolvimento Empresarial e Tecnológico.,
pp 243-251. 2000.
SANTOS, D. L et al. Fenologia de Cedrela fissilis Vell. (Meliaceae) na região rural de
Itirapina, SP, Brasil. Acta bot. bras. 19(3): 625-632, 2005.
SCHWIKKARD et al, Antimalarial activity of plant metabolites. Nat. Prod. Rep. 19.
675-692, 2002.
SHANLEY, P.; CYMERYS, M.; GALVÃO, J. Frutíferas da mata na vida amazônica.
Belém: INPA, 1998, 127 p.
SILVA, J. H. C.: Avaliação toxicológica pré-clínica do óleo de Carapa guianensis
Aublet. 2006. 90f. (Dissertação de Mestrado), Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco UFPE, 2006.
SILVA, O. S, et al. The use of andiroba Carapa guianensis as larvicide against Aedes
albopictus. J Am Mosq Control Assoc. 20, 456–457, 2004.
SILVA, V. P; OLIVEIRA, R. R; FIGUEIREDO, M. R. Isolation of limonoids from seeds
of Carapa guianensis aublet (Meliaceae) by high-speed countercurrent
chromatography. Phytochemical Analysis, v.20 (1), 77-81. 2009.
SILVA, V. P; OLIVEIRA, R. R; FIGUEIREDO, M. R. Isolation of limonoids from Seeds
of Carapa guianensis Aublet (Meliaceae) by High-Speed countercurrent
chromatography. Phytochem. Anal. Vol. 20: 77–81, 2009.
SILVEIRA, A. C.; et al. de. Avaliação da estratégia global de controle integrado da
malária no Brasil. Brasília: Organização Pan-Americana da Saúde. 120p, 2001.
SIMAS, N. K. et al. Produtos naturais para o controle da transmissão da dengue:
atividade larvicida de Myroxylon balsamum (óleo vermelho) e de terpenóides e
fenilpropanóides. Quím. Nova, São Paulo, v. 27, n. 1, 2004.
SIMMONDS, M. S. J; STEVENSON, P. C; PORTER, E. A.; VEITCH, N. C. Insect
antifeedant activity of three tetranortriterpenoids from Trichilia pallida. J. Nat. Prod.,
64, pp 1117-1120. 2001.
SIMÕES, C. M. O. et al., Farmacognosia: da planta ao medicamento. 6
o
Ed. Porto
Alegre: Editora da UFRGS, 2007.
SIMONSEN, H. T.NORDSKJOLD, J. B; SMITT, U. W; NYMAN, U; PALPU, P; JOSHI,
P; VARUGHESE, G. In vitro screening of Indian medicinal plants for antiplasmodial
activity. Jounal of Ethnopharmacology. 74. 195-204, 2001.
SMITH, R. M & KASSIM, H. Essential oil of Piper aduncum from Fiji. New Zeal J.
Sci. 2: pp 127-128. 1979.
SOUSA, P. J. C; BARROS, C, A., L.; ROCHA, J, C, S; LIRA, D, S; MONTEIRO, G,
M; MAIA, J, G, S. Avaliação toxicológica do óleo essencial de Piper aduncum L..
Rev. bras. farmacognosia. v.18, n.2, 217-221, 2008.
88
SOUTO, R. N. P. Atividades repelente e inseticida de óleos essenciais de Piper
spp Linnaeus da Amazônia em Anopheles marajoara Galvão e Damasceno,
Stegomyia aegypti Linnaeus (Díptera:Culicidae) e Solenopsis saevissima Fr.
Smith (Hymenoptera:Formicidae). 2006. 246 f. Tese (Doutorado) - Programa de
Pós-Graduação em Zoologia, Museu Paraense Emílio Goeldi, Universidade Federal
do Pará, 2006.
TRAGER, W.; JENSEN, J. B. Human malaria parasites in continuous culture.
Science, v. 193, n. 4254, 673-675, 1976.
VALADEAU, C; PABON, A; DEHARO, E; ALBAN-CASTILHO, J; ESTEVEZ, Y;
LORES, F, A; ROJAS, R; GAMBOA, D; SAUVAIN, M; CASTILHO, D; BOURDY, G
Medicinal plants from the Yanesha (Peru): evaluation of the leishmanicidal and
antimalarial activity of selected extracts. Jounal of Ethnopharmacol, 25; 123(3),
413-22, 2009.
VALE, N; MOREIRA, R; GOMES, P. Quimioterapia da malaria. Um século de
desenvolvimento de antimaláricos. Química (99). p 61-73, 2005.
VIANA, G. M. R; MACHADO, R, L, D.; CALVOSA, V, S, P; POVÓA, M, M. .Mutations
in the pfmdr1, cg2, and pfcrt genes in Plasmodium falciparum samples from endemic
malaria areas in Rondonia and Pará State, Brazilian Amazon Region. Cad. Saúde
Pública, 22 (12): 2703-2711, 2006.
VIDAL, J; CARBAJAL, A; SISNIEGAS, M; BOBADILLA, M. Efecto tóxico de
Argemone subfusiformis Ownb. y Tagetes patula Link sobre larvas del IV estadio y
pupas de Aedes aegypti L. Rev. peru biol. v.15 n.2 Lima 2008.
VINSON, C. C; AZEVEDO, V. C. R; SAMPAIO, I; CIAMP, A. Y. Development of
microsatellite markers for Carapa guianensis (Aublet), a tree species from the
Amazon forest. Mol. Ecol. Notes 5 (3), pp. 33–34. 2005
WALKER, D. J; PITSCH, J., L.; PENG, M. M; ROBINSON, B. L; PETERS, W;
BHISUTTHIBHAN, J; MESHNICK, S.. Mechanisms of Artemisinin resistance in the
rodent malaria pathogen Plasmodium yoelii. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, v. 44, n. 2, 344-347, 2000.
WENIGER, B; ROBLEDO, S.; ARANGO, G., J.; DEHARO, E.; ARAGÓN, R.;
MUÑOZ, V.; CALLAPA, J.; LOBSTEIN, A.; ANTON, R. Antiprotozoal activities of
Colombian plants. Journal of Ethnopharmacology. 78. 193–200. 2001.
WHO, 2002. Malaria in Africa. Geneva: World Health Organization, RBM Newsletter
March 2002. < http://www.who.int/inf-fs/en/1InformationSheet03.pdf> Acesso em: 24
de dezembro de 2009.
WHO, 2004. Basic facts on malaria. Disponível em:.
<http://www.unesco.org/education/fresh> Acesso em: 15 de abril de 2009.
WHO, 2005. World malaria report.
<http://rbm.who.int/wmr2005/html/exsummary_en.htm>. Acesso em: 25 de dezembro
de 2009
89
WHO, 2007.Containment of Malaria Multi-Drug Resistance on the Cambodia-
Thailand. Border. Disponível em: <http://www.wpro.who.int/NR/rdonlyres/602064E7-
45FE-4BB1-A99A 834F20A98C0E/0/MAL246.pdf> Acesso em: 18 de junho de 2009.
WHO. Role of non-human primates in malaria vaccine development: Memorandum
from a WHO Meeting. Bulletin of the World Health Organization, 66 (6): pp719-728
1988.
WILSON, C. M.; VOLKMAN, S. K; THAITHONG, S; MARTIN, R. K; KYLE, D. E;
MILHOUS, W. K; WIRTH, D. F. Amplification of pfmdr 1 associated with mefloquine
and halofantrine resistance in Plasmodium falciparum from Thailand. Mol. Biochem.
Parasitol. 57(1), 151-160, 1993.
YAP, M. W; KARA, U. A.; HEGGELER-BORDIER, B.; TING, R. C.; TAN, T. M. Partial
nucleotide sequence and organisation of extrachromosomal plastid-like DNA in
Plasmodium berghei. Gene 200: 91-98. 1997.
YAPP, D. T. T; YAP, S. Y. Lansium domesticum: skin and leaf extracts of this fruit
tree interrupt the lifecycle of Plasmodium falciparum, and are active towards a
chloroquine-resistant strain of the parasite (T9) in vitro. Jounal of
Ethnopharmacology. v. 89. 145-150, 2003.
YAYON, A, CABANTCHIK, Z. I, GINSBURG, H. Identification of the acidic
compartment of Plasmodium falciparum-infected human erythrocytes as the target of
the antimalarial drug chloroquine. EMBO J. pp 2695-2700. 1984.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo