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RAFAEL BUENO NOLETO
CARIÓTIPO E MAPEAMENTO CROMOSSÔMICO DE SEQÜÊNCIAS
REPETITIVAS EM PEIXES MARINHOS COM ÊNFASE EM
TETRAODONTIFORMES DO LITORAL PARANAENSE
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Genética, Setor de Ciências
Biológicas da Universidade Federal do
Paraná, como parte dos requisitos para a
obtenção do título de Doutor em Ciências
Biológicas área de concentração: Genética.
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Marta Margarete Cestari
Co-Orientador: Prof. Dr. Roberto Ferreira Artoni
CURITIBA
2009
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iii
Dedico este trabalho à minha família pelo
apoio e o amor
iv
“Muitas grandes idéias estão no ar, e
vários sábios puxam simultaneamente
suas redes”
S J Gould
v
AGRADECIMENTOS
Expresso aqui os meus sinceros agradecimentos aos que de alguma forma
contribuíram e auxiliaram na realização deste trabalho:
Ao Programa de Pós-Graduação em Genética (PPG-GEN) pelo suporte e as
oportunidades oferecidas. E ao Conselho de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), pelo auxílio financeiro.
O meu especial agradecimento aos professores que me orientaram. À Profa.
Dra. Marta Margarete Cestari, pela oportunidade para o desenvolvimento deste e de
outros projetos, pelo apoio, amizade e sobretudo pela confiança nestes vários anos
de convivência. Muito obrigado Marga! Ao meu co-orientador Prof. Dr. Roberto
Ferreira Artoni, amigo idealizador de temas, agradeço seu incentivo, as inúmeras
contribuições para os trabalhos e principalmente sua atenção.
Ao Prof. Dr. Marcelo Vicari, grande amigo que sempre me ajudou muito,
acolhendo em sua casa e compartilhando comigo seu conhecimento em FISH.
Obrigado fio!
Ao Prof. Dr. Ives Sbalqueiro meu amigo, igualmente admirador do glorioso
Verdão! com quem eu tive o primeiro contato com os cromossomos. Agradeço a
você também Ives, por ter feito parte da banca e aprovado meu projeto de
progressão.
Agradeço aos Membros da banca examinadora desta tese, Professores
Doutores Alberto Sérgio Fenocchio, Orlando Moreira-Filho e à Profa. Dra. Mara
Cristina por terem aceitado o convite e pelas correções, sugestões e críticas
apresentadas.
À toda equipe do Laboratório de Citogenética Animal – UFPR pelos auxílios e
principalmente pelo divertido convívio. Em especial à Wanessa Ramsdorf, Cristina
Cortinhas e o figurão Marcos Ferraro. Valeu gente! Também meu muito obrigado ao
Fernando Guimarães com seu brinquedinho citométrico e à Katia Paludo pelas
vi
análises confocais. Ao Zão Fávaro e ao Elton Bradock, pelo oportunismo nas suas
coletas e ajudas em geral.
Ao pessoal do Laboratório de Citogenética e Evolução – UEPG, que sempre
me acolheram com simpatia, em especial o comédia Miguel e a Viviane Vicari.
Aos meus amigos, tanto o pessoal da turminha “melrose” especialmente o Zé,
quanto os de longa data contribuindo para os momentos de descontração.
Aos meus pais, Antonio Rêgo Noleto e Vercélia Noleto. Pai e Mãe, vocês são
fundamentais em minha vida, sempre apostaram e priorizaram a educação. Muito
obrigado, eu os amo! Igualmente a vocês Ale e Edu, sempre torcendo pelo meu
sucesso. E suas respectivas famílias, especialmente meus sobrinhos com suas
energizantes conversas fiadas.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................viii
LISTA DE TABELAS...............................................................................................................xi
RESUMO................................................................................................................................xii
ABSTRACT...........................................................................................................................xiii
H1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................H1
H1.1. Diversidade de peixes teleósteos com ênfase na filogenia de Tetraodontiformes....... H1
H1.2. Estado atual da citogenética em peixes marinhos ....................................................... H3
H1.3. O genoma dos Tetraodontiformes................................................................................H6
H1.4. DNA Satélite e a Citogenética molecular em Peixes.................................................... H9
H2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS ....................................................................................H14
H3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................................H15
H3.1. Material e Locais de Coletas ...................................................................................... H15
H3.2.1. Obtenção de metáfases mitóticas .......................................................................H17
H3.2.2. Bandamento C..................................................................................................... H18
H3.2.3. Coloração Ag-RON.............................................................................................. H18
H3.2.4. Dupla Coloração CMA
3
/DAPI ..............................................................................H19
H3.2.5. Localização cromossômica de genes ribossomais 18S, 5S e DNA C
0
t-1 por
hibridização in situ com sondas fluorescentes (FISH)...................................................
H19
H3.2.6. Hibridização genômica in situ (GISH).................................................................. H21
H3.2.7. Isolamento de DNAs repetitivos através da cinética da reassociação................ H23
H3.2.8. Determinação das áreas dos núcleos interfásicos.............................................. H24
H3.2.9. Determinação do conteúdo de DNA por citometria de fluxo ............................... H25
H3.2.10. Montagem e Análise dos Cariótipos..................................................................H26
H4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................H26
H4.1. CAPÍTULO I ...............................................................................................................H27
H4.2. CAPÍTULO II ..............................................................................................................H37
H4.3. CAPÍTULO III .............................................................................................................H52
H4.4. CAPÍTULO IV ............................................................................................................. H66
H5. CONSIDERAÇÕES FINAIS..............................................................................................H82
H6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................H85
viii
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO
FIGURA 1 - Escala de tamanho de genomas das famílias de Tetraodontiformes
(filogenia baseada em caracteres morfológicos)……………………………..……..……..
MATERIAL E MÉTODOS
FIGURA 1 - Mapa mostrando a região de coleta. Em destaque os pontos amostrados
dentro da Baía de Paranaguá – PR: (1) Foz do rio Baguaçu, (2) Ilha da
Cotinga……………………………………………………………………..…………………..
FIGURA 2 - Espécies utilizadas no estudo: Sphoeroides greeleyi (A), Sphoeroides
spengleri (B), Sphoeroides testudineus (C) (todos da família Tetraodontidae) e
Chilomycterus spinosus (D) (família Diodontidae). Barras representam 20 mm............
CAPÍTULO I
FIGURA 1 - Cariótipos em coloração convencional Giemsa de Sphoeroides greeleyi
(A), Sphoeroides testudineus (B) e Chilomycterus spinosus (C). Os cromossomos
portadores das RONs são mostrados após impregnação por nitrato de prata (boxes
brancos) e dupla coloração CMA
3
/DAPI (boxes pretos). Barra = 5
µm…………………………………………………………………...…………………………..
FIGURA 2 - Metáfases após FISH com sondas 18S e 5S rDNA, respectivamente: S.
greeleyi (A, B), S. testudineus (C, D) e C. spinosus (E, F). As cabeças de seta
indicam os sinais de hibridização. Em (F) as setas mostram blocos IP-positivos que
correspondem às RONs. (G) Dupla coloração CMA
3
/DAPI em C. spinosus
evidenciando regiões ricas em GC nos cromossomos em associação (seta). Barra =
5 µm……………………………………………………………………………………………..
CAPÍTULO II
FIGURA 1 - Histogramas de fluorescência relativa de núcleos corados com iodeto de
propídeo, submetidos a citometria de fluxo utilizando eritrócitos de galinha como
7
15
35
36
16
ix
padrão interno. A curva relativa aos peixes é aproximadamente 2x maior do que da
galinha, em razão de sua concentração na amostral ser
2:1……………………………………………………………………………………………….
FIGURA 2 - Relação entre a área de eritrócito (A) e área nuclear (B) com o tamanho
de genoma. Ambas áreas também são correlacionadas positivamente (C). Todas as
correlações foram altamente significantes (todas r
2
> 0.72 e P < 0.0001)………………
FIGURA 3 - Efeito causal da variação do tamanho de genoma sobre o tamanho da
célula e dos cromossomos. Imagens de microscopia confocal de células vermelhas
do sangue: morfologia nuclear analisada após coloração com laranja de acridina (A–
E) e morfologia celular visualizada por contraste diferencial de interferência (F–J).
Metáfases mitóticas coradas com Giemsa de: Gallus gallus domesticus (K),
Sphoeroides spengleri (L), S. greeleyi (M), S. testudineus (N) e Chilomycterus
spinosus (O). Bar = 10µm..............................................................................................
CAPÍTULO III
FIGURA 1 - Cariótipo de Sphoeroides spengleri em coloração convencional
(Giemsa). Em destaque o par cromossômico portador das Ag-RONs. A barra
representa 5 µm……………………………………………………………………………….
FIGURA 2 - Metáfases de S. spengleri: (A) corada com Giemsa destacando a
presença de 3 microcromossomos Bs (setas); (B) Bandamento C evidenciando os
sítios Ag-RONs (cabeça de setas) e cromossomos Bs (setas). Os asteriscos indicam
heterocromatinas detectadas por FISH com sondas C
0
t-1 (Capítulo IV); (C) FISH
mostrando a localização do rDNA 18S e (D) DUPLA-FISH comprovando a não
sintenia das famílias ribossomais 5S (setas) e 45S (cabeça de setas)…………………
FIGURA 3 - Cariótipos de C. spinosus fêmea em coloração convencional com
Giemsa (A) e bandamento C (B). A barra representa 5 µm………………………………
50
51
62
62
64
49
x
FIGURA 4 - Cariótipos de C. spinosus macho em coloração convencional com
Giemsa (A) destacando o par Ag-RONs (caixa) e bandamento C (B). Em (C) meiose
I (diplóteno final) com 25 bivalentes e 1 univalente correspondente ao cromossomo B
(seta). A barra representa 5 µm…………………………………………………………...
CAPÍTULO IV
FIGURA 1 - Cariótipos de S. greeleyi (A), S. testudineus (B) e C. spinosus (C)
evidenciando o padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva. A barra
representa 5 µm……………………………………………………………………………….
FIGURA 2 - Cariótipos de S. testudineus (A-B) e S. greeleyi (C-D) após dupla
coloração CMA
3
/DAPI, mostrando sítios quanto a riqueza de base GC e AT
respectivamente. Em destaque os pares portadores das RONs com os sítios de
rDNA 18S. Em (C) as setas indicam uma compartimentalização de domínios AT…….
FIGURA 3 - Preparação do DNA C
0
t-1 de C. spinosus. (M) Marcador Low mass; (1)
DNA genômico total de C. spinosus; (2) DNA genômico após ser autoclavado 5 min;
(3) DNA C
0
t-1…………………………………………………………………………………..
FIGURA 4 - FISH com DNA C
0
t-1 em suas respectivas espécies: (A-B) S. spengleri e
(C-D) S. greeleyi. As setas indicam sinais fluorescentes sobre uma das poucas
regiões onde o bandamento C evidenciou bandas conspícuas (ver Figura 2 -
Capítulo III)…………………………………………………………………………………...
FIGURA 5 - Distribuição de DNAs repetitivos em cromossomos de C. spinosus
revelado por FISH com sonda DNA C
0
t-1…………………………………………………..
FIGURA 6 - Hibridização genômica in situ (GISH) sem a presença de um DNA
competidor utilizando sonda de DNA genômico de S. testudineus sobre os
cromossomos de C. spinosus………………………………………………………………..
65
79
78
79
80
81
80
xi
FIGURA 7 - GISH na presença de um DNA competidor. As setas indicam sinais
negativos de hibridização sobre os principais sítios heterocromáticos de C. spinosus.
O asterisco indica o cromossomo B…………………………………………………………
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO II
TABELA 1 - Valores haplóide em picogramas (pg) dos genomas das espécies
analisadas. (N) número de indivíduos analisado, (2n) número diplóide (SD) desvio
padrão e (CV) coeficiente de variação………………………………………………………
TABELA 2 - Sumário de número diplóide e de tamanho de genoma em baiacus das
famílias Tetraodontidae e Diodontidae. (n) Haplóide……..……………..……………….
CAPÍTULO III
TABELA 1 - Freqüência de cromossomos B relacionada com o sexo em S. spengleri
da Baía de Paranaguá-PR. (N) Número de peixes analisados......................................
TABELA 2 - Ocorrência de cromossomo B em C. spinosus da Baía de Paranaguá-
PR. (N) Número de peixes analisados...........................................................................
81
47
48
63
63
xii
RESUMO
Peixes Tetraodontiformes têm-se tornado modelos puramente genômicos,
devido a notável compactação de seus genomas. Esta característica parece ser o
resultado de uma perda de DNA, uma vez que uma duplicação genômica total
ocorreu na base da filogenia dos teleósteos. Este estudo apresentou uma análise
citogenética em quatro espécies de baiacus: Sphoeroides greeleyi, Sphoeroides
spengleri e Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Chilomycterus spinosus
(Diodontidae) todas provenientes da Baía de Paranaguá-PR. As análises tiveram
seu enfoque tanto na citogenética comparativa, utilizando metodologias
convencionais como bandamento C e Ag-RONS quanto no mapeamento
cromossômico com sondas ribossomais, espécie-específicas e genômicas. Em C.
spinosus (Diodontidae) o 2n = 50 cromossomos representou um caráter derivado,
frente ao conservado 2n = 46 cromossomos das espécies do gênero Sphoeroides.
Diferenças quanto ao NF estão relacionadas principalmente a inversões
pericêntricas e acúmulo de heterocromatina em ambas as famílias. No Capítulo I o
mapeamento cromossômico com sondas de rDNA revelou a ocorrência de ambas as
famílias multigênicas em 1 par de cromossomos e a não sintenia entre elas, embora
em C. spinosus os genes 5S foram localizados em dois pares cromossômicos e
ocupando sítios terminais. No Capítulo II a citometria de fluxo foi utilizada para
estimar o tamanho do genoma em todas as espécies, revelando o menor genoma
dos vertebrados em S. spengleri com 0.34 pg (332 Mb). A diferença no tamanho de
genoma em Tetraodontiformes não está relacionada com o nível de ploidia, mas
diretamente relacionado com o tamanho do núcleo, célula e caracteres reprodutivos.
Dois Capítulos abordaram aspectos inerentes às espécies. O Capítulo III teve como
escopo a ocorrência de cromossomos B em Sphoeroides spengleri e Chilomycterus
spinosus, com a freqüência estando relacionada com uma preferencial segregação
de acordo com o sexo em ambas espécies. Já no Capítulo IV o objetivo foi investigar
o componente heterocromático do tão famoso e estudado genoma dos
Tetraodontiformes. Resultados de fluorescência por CMA
3
/DAPI, FISH com sondas
de DNA C
0
t-1 e GISH corroboraram com padrões de evolução em concerto das
heterocromatinas, além de indicar que estas últimas são um componente
intimamente relacionado com a variação do C-value entre espécies. Em vista do
atual interesse em genômica de baiacus, novas contribuições ao conhecimento dos
seus genomas e cariótipos são fornecidas e discutidas sob perspectivas
citotaxonômicas, biogeográficas e evolutivas.
xiii
ABSTRACT
Tetraodontiformes fish had become pure genomic models, because of the
remarkable compaction of their genomes. This characteristic seems to be the result
of a loss of DNA, given a events whole-genome duplications that occurred in the ray-
finned fish lineage. This study presented a cytogenetic analysis in four species of
pufferfish: Sphoeroides greeleyi, Sphoeroides spengleri and Sphoeroides
testudineus (Tetraodontidae) and Chilomycterus spinosus (Diodontidae) all
proceeding from Paranaguá Bay -PR. The analyses had their approach in
comparative cytogenetics, using from conventional methods as C banding and Ag-
NORs, until chromosomal mapping with ribossomal, species-specific and genomic
probes. In C. spinosus (Diodontidae) 2n = 50 chromosomes represents a derived
character, in contrast with the conserved 2n = 46 chromosomes of the species of the
genus Sphoeroides. Differences in the NF are related with mainly with occurrence of
pericentric inversions and heterochromatin accumulation in both the families. In
Chapter I the chromosomal mapping with rDNA probes revealed the localization of
both multigenic families in one pair of chromosomes and the not syntenical
organization, although in C. spinosus the 5S genes had been located in two
chromosomal pairs and occupying terminal position in short arms. In Chapter II the
flow cytometry was used for estimate the genome size of all the species, discovering
the small genome of the vertebrates in S. spengleri with 0.34 pg (332 Mb). The
differences in genome size in Tetraodontiformes are not related with ploidy level, but
directly linked with cell / nucleus sizes and reproductive characters. Two Chapters
had approached inherent aspects to the species. Chapter III had as aim the
occurrence of B chromosomes in Sphoeroides spengleri and Chilomycterus
spinosus, with their frequency being related with a preferential segregation in
accordance with the sex in both species. While in Chapter IV the purpose was to
investigate the heterochromatic component of the so famous one and studied
genome of the Tetraodontiformes. Results of fluorescence for CMA
3
/DAPI, FISH with
probes of C
0
t-1 DNA and GISH corroborated with patterns of concerted evolution of
the heterochromatin, beyond indicating that this last, are a component closely related
with the C-value variation between species. In view of current interest in pufferfish
genomics, new contributions to the knowledge their genomes and karyotypes are
supplied and discussed under cytotaxonomic, biogeographic and evolutive
perspectives.
INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Diversidade de peixes teleósteos com ênfase na filogenia de
Tetraodontiformes
Os peixes formam o grupo mais numeroso e diversificado entre os
vertebrados, distribuindo-se nas águas do mundo em grande variedade morfológica
e comportamental. Aproximadamente 58% das espécies são marinhas, 41%
dulciaquícolas e 1% são encontradas em ambientes de transição, como os estuários
(MOYLE e CECH, 1982). Aproximadamente 78% dos peixes marinhos vivem em
águas rasas, de até 200 metros de profundidade, e 13% estão associados às águas
oceânicas. Este grupo é um dos mais antigos e se divide em quatro grandes
Classes: Agnatha, ou vertebrados desprovidos de mandíbulas (ciclóstomos,
lampréias e peixes-bruxa), Placodermi, peixes já extintos que possuíam carapaças e
mandíbulas, Chondrichthyes ou peixes cartilaginosos (tubarões, raias e quimeras), e
Osteichthyes ou peixes ósseos (ORR, 1986).
A divisão Teleostei, é considerada a mais derivada constituinte da Classe
Actinopterygii (BRUM e MOTA, 2002), representando o mais numeroso e bem
sucedido grupo de peixes, devido a sua abundância e diversidade entre os
vertebrados. Correspondem à cerca de 96% de todos os peixes existentes, contendo
segundo NELSON (1994) cerca de 24.000 espécies distribuídas em 45 ordens e
aproximadamente 435 famílias. Este número é mais da metade do número de
espécies de vertebrados conhecido. Dentro dos teleósteos destacam-se os
Acantopterígios, representando um grupo monofilético caracterizado por algumas
estruturas e suas especializações funcionais, tais como aparelho mandibular
faríngeo e um mecanismo mandibular próprio, que promove versatilidade na
capacidade de protrusão. Os Acantopterígios possuem 13 Ordens, as quais estão
INTRODUÇÃO
2
divididas em 3 séries: os Atherinomorpha, os Mugilomorpha e os Percomorpha
(NELSON, 1994). Na última é que estão incluídos os mais especializados tipos de
peixes atuais, como os Perciformes e os Tetraodontiformes.
Dentre a grande diversidade de peixes marinhos, a Ordem Tetraodontiformes
se destaca por exibir características morfológicas e genéticas bastante singulares,
representando um dos principais ramos derivados da diversificação dos teleósteos.
Seus representantes, conhecidos popularmente como cangulos, peixes-porco e
baiacus, não apresentam comportamento migratório podendo permanecer em um
mesmo local durante todo o ano (FIGUEIREDO e MENEZES, 2000) implicando
uniformidade nos padrões genéticos populacionais. Possui aproximadamente 400
espécies distribuídas em dez famílias (Triacanthodidae, Triacanthidae, Balistidae,
Monacanthidae, Ostraciidae, Triodontidae, Tetraodontidae, Diodontidae, Molidae e
Aracanidae) de ampla distribuição circuntropical, ocupando águas tropicais e
temperadas, marinhas e doces, como a espécie Colomesus asellus (NELSON,
1994). Morfologicamente são muito mais diversificados em relação a outros grupos
de peixes com um comparável número de espécies. Atualmente há um consenso da
origem monofilética do grupo, baseado em peculiaridades morfológicas (TYLER,
1980) e em análises filogenéticas utilizando marcadores moleculares (HOLCROFT,
2004). Com relação ao parentesco dos Tetraodontiformes com os demais peixes,
acredita-se na hipótese deles serem grupo irmão dos Acanthuroidea, uma subordem
dos Perciformes (PATTERSON, 1964; TYLER, 1980; NELSON, 1994; HOLCROFT,
2004).
Dentre as famílias de Tetraodontiformes, destaca-se Diodontidae e
Tetraodontidae, que reúnem os peixes popularmente conhecidos como baiacus. A
primeira agrupa os baiacus com apenas duas placas dentárias e recobertos por
espinhos, que podem ser permanentemente eretos ou dobrados para baixo quando
INTRODUÇÃO
3
o animal não está inflado, e a segunda os peixes com 4 placas dentárias na boca e o
tegumento liso. Os baiacus são basicamente marinhos, mas várias espécies
ocorrem em águas salobras e doces, em regiões tropicais e subtropicais, nos
oceanos Atlântico, Índico e Pacífico. De acordo com FIGUEIREDO e MENEZES
(2000), o gênero Sphoeroides ocorre desde Nova Jersey (EUA) até o estado de
Santa Catarina (Brasil). Segundo NELSON (1994), os tetraodontídeos são
representados por 9 gêneros e 121 espécies, já a família Diodontidae por 6 gêneros
e 19 espécies. No litoral Paranaense a família Tetraodontidae é representada pelas
espécies simpátricas Sphoeroides greeleyi, S. spengleri e S. testudineus e a família
Diodontidae pela espécie Chilomycterus spinosus.
O estômago desses peixes é altamente modificado, possuindo um divertículo
de modo a permitir que eles inflem a tamanhos notáveis, o que os caracteriza como
puffers. O processo de inflação ocorre quando o peixe, sob situação de stress,
engole água ou ar para dentro do divertículo estomacal. No Brasil possuem baixo
valor econômico devido à presença da tetrodotoxina (TTX), que pode ser fatal se
ingerida, agindo no sistema nervoso central e periférico. No peixe ela se concentra
na pele, no fígado e nas gônadas, onde atua como ferormônio (MATSUMURA,
1995).
1.2. Estado atual da citogenética em peixes marinhos
Embora informações detalhadas referentes à citogenética de peixes estejam
cada vez mais disponíveis devido ao desenvolvimento de técnicas de pesquisa
nesta área, o conhecimento de dados cariotípicos de peixes é ainda bastante
reduzido frente à diversidade do grupo. Possíveis razões seriam o reduzido tamanho
dos cromossomos da maioria dos peixes se comparado ao de outros grupos animais
INTRODUÇÃO
4
e as técnicas de bandamento não serem tão resolutivas no estudo de cromossomos
de peixes (BRUM, 1995). Entretanto algumas dificuldades enfrentadas pelos
citogeneticistas de peixes, foram resolvidas com o advento da técnica de
hibridização in situ que é bastante informativa na detecção e localização de
seqüências específicas de DNA sobre os cromossomos.
Na ictiofauna brasileira, poucos peixes marinhos têm sido cariotipados quando
comparados às espécies de água doce. Até o momento, entre as milhares de
espécies existentes, foram cariotipadas aproximadamente 104 espécies distribuídas
em 40 famílias e 71 gêneros (SÁ-GABRIEL, 2004), todas pertencentes a divisão
Teleostei. A maioria das espécies estudadas ocorrem na costa do Rio de Janeiro, e
as demais nas costas do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo e
Rio Grande do Norte. Os níveis de variação genética inter-populacional de peixes
marinhos detectados por diversos métodos moleculares e enzimáticos são,
geralmente inferiores aos peixes de água doce. Os Teleósteos marinhos apresentam
uma pequena variabilidade quanto ao número cromossômico e grande uniformidade
cariotípica. Como observado entre os Percomorpha, a maioria das espécies
apresenta 48 cromossomos (BRUM e GALETTI Jr., 1997; CORRÊA e GALETTI Jr.,
1997; AGUILAR e GALETTI Jr., 1997).
Em Perciformes, a maior ordem entre os Teleósteos atuais, o número diplóide 2n
= 48 cromossomos aparece em aproximadamente 65% das espécies analisadas até
o momento (AFFONSO, 2000). Neste cenário, utilizando a macroestrutura, as
transformações cariotípicas são difíceis de serem interpretadas tanto em análise de
populações de uma mesma espécie como para espécies relacionadas. Contudo,
quando espécies próximas são comparadas, cariótipos similares são considerados
indicadores de uma separação relativamente recente, enquanto cariótipos
consideravelmente diferentes parecem indicar uma separação mais antiga. No
INTRODUÇÃO
5
entanto, esta proposta nem sempre é válida, já que nos teleósteos marinhos por
exemplo, um cariótipo com 48 cromossomos acrocêntricos ocorre não somente em
espécies relacionadas mas também em espécies que são filogenéticamente
distantes. Segundo BRUM (1995), 2n = 48 e NF = 48 deveriam ser consideradas
sinapomorfias dos grupos Euteleostei e Clupeiformes, conservadas principalmente
nas espécies marinhas. Esta peculiaridade parece estar associada às estruturas
populacionais das espécies marinhas, onde o fluxo gênico é menos restrito e a
formação de barreiras geográficas é bem inferior à detectada em águas continentais.
Com isso têm-se grandes populações em ambiente marinho e uma tendência à
homogeneização genética entre elas (BRUM, 1995).
Também incluídas na série Percomorpha, as espécies da ordem
Tetraodontiformes são as que apresentam os cariótipos mais variáveis com números
diplóides variando entre 28 e 52 cromossomos, que BRUM e GALETTI (1997)
consideraram estas variações como derivações a partir do cariótipo base dos
Percomorpha. Enquanto espécies da família Triacanthidae apresentam 2n = 48 e
número fundamental (NF) igual a 48 (CHOUDHURY et al., 1982), outras famílias tais
como Balistidae, Monacanthidae, Ostraciidae, Tetraodontidae e Diodontidae
possuem cariótipos mais derivados, com valores diplóides variando de 28 a 50 e NF
de 33 a 78.
Das 428 espécies de Tetraodontiformes existentes, apenas 57 (13,3%) tiveram
suas fórmulas cariotípicas estabelecidas (SÁ-GABRIEL, 2004). Dentre as famílias,
se destacam os Tetraodontidae, juntamente com os Balistidae, que apresentam uma
maior quantidade de informações sobre seus cariótipos. Esta carência de estudos
provavelmente reside no fato deste grupo de peixes possuírem um genoma bastante
compacto, devido à existência de pequenos íntrons e poucas seqüências repetitivas
INTRODUÇÃO
6
(MANDRIOLI et al., 2000), gerando dificuldade nas análises cromossômicas
principalmente no que se refere a alguns tipos de bandamentos.
As características citogenéticas das espécies da Ordem Tetraodontiformes,
como a reduzida quantidade de DNA, as tornam especialmente indicadas para a
identificação in situ de genes. Futuras análises envolvendo seqüências de DNA,
neste grupo, podem ser facilitadas pelo conhecimento prévio da sua estrutura
cariotípica e do mapeamento físico de certos genes.
1.3. O genoma dos Tetraodontiformes
As evidências paleontológicas sugerem que a radiação dos teleósteos
ocorreu entre 150 e 250 milhões de anos atrás. Após a separação da linhagem dos
tetrápodes é provável que os peixes sofreram uma duplicação inteira do genoma em
um teleósteo ancestral, sendo este evento a matéria-prima genética para explicar a
diversificação dos teleósteos, (VENKATESH, 2003; VOLFF, 2003).
O tamanho do genoma, medido em picogramas (pg) de DNA por célula
diplóide (1 pg = 978 Mb ou 1 Mb = 1,022 × 10
−3
pg) (DOLEZEL et al., 2003), varia
grandemente nos vertebrados, sendo o maior observado em Protopterus aethiopicus
com 284 pg (PEDERSEN, 1971). Estudos têm mostrado que os baiacus lisos
(família Tetraodontidae) têm o menor genoma de todos os vertebrados, estimado em
0,7 – 1,0 picograma haplóide (~400 Mb) (HINEGARDNER e ROSEN, 1972;
BRENNER et al., 1993), equivalente a oito vezes menor do que o genoma humano.
Entretanto, este tamanho minúsculo do genoma não é uniforme para todos os
baiacus nem característico de todos os Tetraodontiformes, variando de 1,14 a 2,26
pg (Figura 1). Em contrapartida, baiacus espinhos, membros da família Diodontidae
(grupo irmão de Tetraodontidae) possuem um genoma que é quase duas vezes
INTRODUÇÃO
7
maior (~800 Mb). Contudo mesmo possuindo o menor genoma, os tetraodontídeos
têm um repertório similar de genes a de outros vertebrados, que se encontram
densamente organizados em cerca de 6kb por gene, o que é próximo ao encontrado
em invertebrados (5 kb/gene), supostamente devido à redução do número e
comprimento dos íntrons (VENKATESH et al., 2000; ELMEROT et al., 2002). Tal
especulação se aplica mesmo para genes housekeeping, os quais geralmente têm
seqüências intrônicas mais curtas do que genes expressos em tecidos específicos,
uma vez que a transcrição e a tradução são energeticamente onerosas
(VINOGRADOV, 2004).
FIGURA 1 - Escala de tamanho de genomas das famílias de Tetraodontiformes
(filogenia baseada em caracteres morfológicos).
As diferenças quanto ao tamanho do genoma em diversas linhagens sugere
que a expansão ou a contração dos genomas ocorreu independente em cada táxon.
Enquanto a expansão parece ser o resultado de duplicações em tandem, inserções,
poliploidia, atividade de elementos de transposição ou ainda da acumulação de
FONTE: BRAINERD et al., 2001 – baseado em caracteres morfológicos
Triacanthoidea Monacanthidae Balistidae Ostarciidae Triodontidae Molidae Diodontidae Canthigasterinae Tetraodontinae
? pg 1.14- 1.27 pg 1.28- 1.49 pg 1.70- 2.26 pg ? pg 1.70 pg 1.55- 1.80 pg 0.86- 0,94 pg 0.70- 1.00 pg
INTRODUÇÃO
8
seqüências repetitivas, um genoma compacto é o resultado de deleções acumuladas
ou representa o estado primitivo (VENKATESH et al., 2000; PETROV, 2001).
HARTL (2000) sugere que o tamanho do genoma resulta de um equilíbrio
dinâmico e constante entre deleções lentas e proliferação rápida de elementos de
transposição. No milho é reconhecido o fato de que o genoma duplicou de tamanho
nos últimos 3 milhões de anos pela atividade explosiva destes elementos
(GREGORY, 2004). A diversidade de retrotransposons é característica dos genomas
de peixes e também está presente no genoma compacto dos tetraodontídeos. Em
Tetraodon nigroviridis, alguns retrotransposons aglomeram-se com outras repetições
e pseudogenes em regiões heterocromáticas específicas do genoma. Desconfia-se,
que embora uma grande variedade de elementos de transposição integre
repetidamente o genoma dos baiacus, sua amplificação e capacidade de dispersão
são bastante limitadas quando comparadas com outros eucariotos. Isto pode estar
relacionado com o fato que estes genomas são os menores entre os vertebrados, ou
seja, um genoma compacto tem poucos locais disponíveis e seguros para a inserção
de transposons (CROLLIUS et al., 2000).
Embora seja mais fácil explicar um ganho de DNA não codificante, não existe
um consenso sobre os mecanismos de perda de DNA. É proposto que uma taxa
mais elevada de deleções, lentas mas constantes, neutralizando inserções
(pequenos indels) podem explicar a contração do tamanho do genoma na família
Tetraodontidae. Logo, sugere-se que o tamanho do genoma dos baiacus lisos tem
diminuído gradualmente em todas as linhagens da família desde sua divergência, há
50-70 milhões de anos, dos baiacus espinhos (Diodontidae) (TYLER, 1980;
BRAINERD et al., 2001; NEAFSEY e PALUMBI, 2003). Porém quando convertido à
unidades do tempo, a perda do DNA por este processo se mostra incrivelmente lenta
e com um potencial limitado para alterar o tamanho do genoma (GREGORY, 2003).
INTRODUÇÃO
9
A polarização de indels pode ser relevante sob algumas circunstâncias, mas é
necessário considerar outros fatores responsáveis pela modulação de tamanhos de
genomas, e a maneira pela qual a perda de DNA pode interagir com estes
(GREGORY, 2004).
Neste contexto, os baiacus são particularmente úteis para estudos
genômicos. O segundo vertebrado a ter seu genoma totalmente seqüenciado foi o
tetraodontídeo Takifugu rubripes (http://www.fugu-sg.org) (APARICIO et al., 2002) e
uma segunda espécie também já teve seu genoma sequenciado, Tetraodon
nigroviridis (http://www.genoscope.cns.fr/spip/Tetraodon-nigroviridis-a-fish-with.html)
(JAILLON et al., 2004). Estas informações revelam a importância de se usar um
genoma compacto de vertebrado como referência para genomas complexos,
auxiliando desta forma a descobrir genes complexos, regulatórios e a arquitetura
genômica. Seus genomas também oferecem um modelo interessante para
compreender as forças evolutivas que conduzem a uma redução no tamanho do
genoma (NEAFSEY e PALUMBI, 2003; BRAINERD et al., 2001; VENKATESH et al.,
2000).
1.4. DNA Satélite e a Citogenética molecular em Peixes
Diferentes aspectos do DNA satélite de muitos invertebrados, bem como de
mamíferos, já foram extensivamente abordados por inúmeros autores. Em peixes,
entretanto, ainda é pequeno o número de informações que se tem a respeito da
organização molecular dessa fração do genoma e de sua localização cromossômica,
especialmente se for considerado o grande número de espécies existentes nas
águas continentais e marinhas. Contudo a distribuição e localização da fração
heterocromática, na qual se supõe estar concentrada boa parte do DNA satélite, tem
INTRODUÇÃO
10
sido largamente estudada por métodos citológicos convencionais de coloração ou de
bandamentos cromossômicos, em muitas espécies. As informações apresentadas
até o momento mostram que muitas das seqüências satélites já identificadas
encontram-se localizadas principalmente na região centromérica dos cromossomos
e, como mostrado para outros organismos, devem desempenhar papel importante
na estrutura e função do centrômero dos peixes (GALETTI e MARTINS, 2004).
A presença constante de DNAs repetitivos nos cromossomos sexuais e
supranumerários das espécies de peixes reforça a idéia de que estudos objetivando
o isolamento e a caracterização da organização genômica dessas seqüências
representam fontes certas e seguras na obtenção de respostas sobre a origem e
evolução desses tipos cromossômicos, amplamente distribuídos nos peixes.
Diversos outros tipos de elementos repetitivos de DNA, como genes de histonas,
SINES, LINES e repetições teloméricas, têm sido estudados em relação a sua
localização nos cromossomos dos peixes. Embora algumas dessas seqüências
tenham sido muito estudadas quanto à seqüência nucleotídica e alguns aspectos da
organização genômica, poucos são os trabalhos acerca de sua localização
cromossômica.
Vertebrados, de peixes a humanos, compartilham uma seqüência repetitiva
telomérica, (TTAGGG)n, comum. Em algumas espécies de trutas e salmões por
exemplo, a hibridização in situ localizou seqüências teloméricas em regiões
correspondentes às Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs) (ABUÍN et al.,
1996). Também sob condições de baixa estringência, foi possível identificar sítios
teloméricos intersticiais em um par cromossômico de Salmo salar, sugerindo que
possíveis eventos de fusão ocorreram durante a evolução da espécie (ABUÍN et al.,
1996). A presença de sítios teloméricos intersticiais resultados de fusões
cromossômicas não são facilmente detectados, uma vez que essas seqüências se
INTRODUÇÃO
11
modificam rapidamente após a fusão, provavelmente como decorrência da perda da
função de telômero.
A disponibilização de técnicas que unem a citogenética convencional com a
genética molecular tem se mostrado como ótimas estratégias para abordagens
genômica e evolutiva, ao correlacionar a informação molecular de seqüências de
DNA com sua posição física ao longo dos cromossomos. Além disso as inferências
não se limitam à forma ou tamanho de cromossomos, mas são baseadas em sinais
fluorescentes. A Hibridização Fluorescente in situ (FISH) é uma delas. Embora
seqüências gênicas de cópia única possam ser detectadas por essa metodologia,
aquelas que se apresentam em multiplicidade são mais facilmente visualizadas e as
mais amplamente utilizadas em peixes. Dentre esses casos, destacam-se a
identificação de clusters ribossomais, através das sondas de DNA 18S e 28S
(seqüências formadoras das RONs) que constitui um método mais sensível que a
marcação pela prata e/ou fluorocromos GC específicos na detecção de sítios
contendo poucas cópias de rDNA. Por sua vez, os genes de rDNA da subunidade
5S também podem ser localizados através da FISH. O rDNA 5S compõe uma
segunda família de rDNA com alto número de cópias de seqüências com cerca de
120 pb dispostas em tandem nos cromossomos de grande parte dos vertebrados.
Estas regiões não são identificáveis pelas metodologias convencionais de
visualização das RONs e parecem seguir um mecanismo de evolução independente
dos sítios 45S de rDNA (MARTINS e GALETTI, 1999).
Embora a FISH tenha sido utilizada como procedimento clássico na
localização de seqüências de DNA nos cromossomos dos peixes, outras tecnologias
têm-se mostrado muito promissoras. Uma destas metodologias, a Zoo-FISH,
possibilita que a organização das seqüências de DNA isoladas de uma espécie seja
investigada em outras espécies. Até o momento, os trabalhos envolvendo Zoo-FISH
INTRODUÇÃO
12
têm se relacionado principalmente ao mapeamento de seqüências repetitivas (genes
ribossomais e DNAs satélite) nos cromossomos. Em geral, pouco se sabe sobre a
organização genômica dos peixes. A grande característica que difere o genoma dos
peixes do dos vertebrados de sangue quente é a compartimentalização genômica.
As espécies de sangue quente apresentam o genoma organizado em mosaicos
isocóricos, ou seja, segmentos de DNA caracterizados por uma composição de
bases similares. Nos peixes, bem como nos anfíbios, o grau de
compartimentalização composicional é menor, e acredita-se que esse fato per si
seria o responsável pela ausência de bandas longitudinais (tipo G) em seus
cromossomos (BERNARDI, 1992), ou pelo menos dificulta a resolução em nível da
microscopia ótica.
Além da FISH, a hibridização de genomas inteiros, através da GISH
(Hibridização Genômica in situ), tem fornecido dados interessantes sobre o estudo
de espécies proximamente relacionadas. Em vegetais tem sido comum a utilização
desta técnica para analisar a composição genômica de híbridos somáticos, de
poliplóides e na determinação das relações taxonômicas e evolutivas entre os
genomas presentes (COLLONNIER et al., 2003; SÁNCHEZ-MORÁN et al., 1999;
HARRISON et al., 1999; SHIBATA e HIZUME, 2002). Em peixes neotropicais não
existe qualquer dado relativo à utilização da GISH. O princípio da GISH está
baseado no uso de sondas de DNA nuclear total de espécies próximas, as quais
compartilham portanto, seqüências homeólogas em seus cromossomos. Os sítios de
hibridização serão visíveis através de sinais fluorescentes coloridos, e os
cromossomos dos genomas parentais podem ser visualizados e diferenciados nas
células mitóticas ou meióticas do organismo híbrido. Translocações inter-genômicas
também podem ser reveladas no genoma híbrido indicando que os genomas
parentais sofreram alguns rearranjos após o processo de hibridização (BRYSTING et
INTRODUÇÃO
13
al., 2000). Da mesma forma as hibridizações podem informar discrepâncias quanto
ao tamanho dos genomas das espécies envolvidas. Conseqüentemente tornam-se
possíveis inferências sobre os mecanismos envolvidos durante o processo evolutivo
que resultaram nas divergências no tamanho e na organização do genoma ao se
analisar a afinidade genômica entre espécies, o que contribui para determinar as
relações taxonômicas e evolutivas entre os genomas presentes.
14
2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
Este projeto visou estudar espécies de peixes marinhos enfocando
principalmente a Ordem Tetraodontiformes, interessante pelos compactos genomas
de seus representantes. A área de estudo se concentrou no litoral Paranaense –
Baía de Paranaguá buscando o conhecimento do tamanho e da organização dos
genomas deste grupo de vertebrados. O principal objetivo foi contribuir para um
cenário mais consistente a cerca da evolução genômica e cariotípica de peixes da
costa brasileira como também inferir sobre as forças evolutivas que podem
influenciar o tamanho do genoma.
Para tanto, foram propostas:
Caracterização cariotípica de Tetraodontiformes Neotropicais através de
metodologias convencionais e de citogenética molecular:
Mapeamentos cromossômicos utilizando:
- sondas ribossomais (rDNA 5S e 18S)
- sondas genômicas
- DNAs repetitivos isolados
Realizar uma análise comparativa a partir de marcadores cromossômicos
identificados;
Quantificação por citometria de fluxo do conteúdo de DNA das espécies;
Inferir a respeito do processo de ganho e perda de DNA no genoma das
espécies analisadas de Diodontidae e Tetraodontidae.
MATERIAL E MÉTODOS
15
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material e Locais de Coletas
Foram estudados representantes da ordem Tetraodontiformes com ocorrência
na costa paranaense. Em dois pontos na baía de Paranaguá (Figura 2), exemplares
das espécies de Sphoeroides greeleyi, Sphoeroides spengleri e Sphoeroides
testudineus (Tetraodontidae) e Chilomycterus spinosus (Diodontidae) (Figura 3)
foram coletados com rede de arrasto com malha de 1,2 cm entre nós. Os peixes
capturados foram mantidos em recipientes com água e devidamente aerados para o
transporte ao Laboratório de Citogenética Animal no Setor de Ciências Biológicas –
UFPR (Curitiba-PR). No laboratório os espécimes foram submetidos à anestesia
com Benzocaína 100 mg/L e então sacrificados. Imediatamente foram protocolados
com número, sexo e procedência sendo então tombados no acervo do laboratório
como testemunho. O sexo dos animais foi determinado e catalogado através da
análise microscópica de suas gônadas.
FIGURA 1 - Mapa mostrando a região de coleta. Em destaque os pontos amostrados
dentro da Baía de Paranaguá – PR: (1) Foz do rio Baguaçu, (2) Ilha da Cotinga.
MATERIAL E MÉTODOS
16
FIGURA 2 - Espécies utilizadas no estudo: Sphoeroides greeleyi (A), Sphoeroides
spengleri (B) e Sphoeroides testudineus (C) (todos da família Tetraodontidae) e
Chilomycterus spinosus (D) (família Diodontidae). Barras representam 20 mm.
MATERIAL E MÉTODOS
17
3.2. Métodos
3.2.1. Obtenção de metáfases mitóticas
Cultura celular de curta duração (FENOCCHIO et al., 1991)
1. Anestesiar o exemplar colocando-o em um recipiente contendo benzocaína
diluída a 0,01%, sacrificando-o em seguida;
2. Retirar a porção anterior do rim com aproximadamente 3 mm
3
e transferir
para uma placa de Petri contendo 5 mL de meio de cultura RPMI (filtrado)
com antibiótico e 20% de soro bovino fetal;
3. Desagregar o material com pinças e com o auxílio de uma seringa de vidro
desprovida de agulha;
4. Incubar a cultura celular em estufa à 29
o
C por 6 – 8 horas;
5. Ao fim das 6 horas, acrescentar uma solução diluída de colchicina 0,025%
deixando agir por 1 hora;
6. Transferir o material para um tubo de ensaio e centrifugá-lo por 10 minutos a
800–900 rpm;
7. Descartar o sobrenadante e acrescentar cerca de 10 mL de solução
hipotônica (KCl 0,075M). No tubo de centrífuga o material será mantido à 37
ºC por 40 minutos;
8. Pré-fixar adicionando cerca de 10 gotas de fixador (3 metanol: 1 ácido acético
glacial) e centrifugar por 10 minutos a 800–900 rpm;
9. Descartar o sobrenadante e acrescentar 10 mL de fixador gelado
ressuspendendo suavemente com pipeta Pasteur.
10. Repetir o passo anterior três vezes, e após a última centrifugação, manter o
tubo com 1,5 mL de fixador. Ressuspender o botão celular no fixador e
armazenar em microtubo do tipo Eppendorf em freezer à –20 ºC;
MATERIAL E MÉTODOS
18
11. Corar as preparações cromossômicas com Giemsa 5% em tampão fosfato por
10 minutos.
3.2.2. Bandamento C
(SUMNER, 1972)
1. Depois de montadas, as lâminas foram “envelhecidas” em estufa de 45 °C;
2. As preparações cromossômicas foram mergulhadas em ácido clorídrico (HCl)
0,2M por 15 minutos a temperatura ambiente, em seguidas lavadas com água
destilada;
3. Em seguida foram mergulhadas por 2 minutos numa solução de Hidróxido de
Bário (Ba(OH)
2
) 5% a temperatura ambiente;
4. A lâmina foi rapidamente lavada em HCl 1N e depois em água destilada;
5. A lâmina foi então colocada em solução salina de 2xSSC a 60 °C em banho
termostático por 30 minutos;
6. Por fim foi lavada com água destilada e corada com Giemsa a 10% por 20
minutos;
3.2.3. Coloração Ag-RON
(HOWELL e BLACK, 1980)
1. Após o envelhecidas as lâminas foram mergulhadas em ácido clorídrico (HCl)
0,2M por 3 minutos e posteriormente lavadas;
2. Em seguida foram colocadas sobre o filme celular 2 gotas de Nitrato de Prata
(AgNO
3
) a 50% e 1 gota de gelatina;
3. As gotas foram misturadas suavemente e cobertas em seguida com uma
lamínula;
4. A lâmina foi colocada dentro de uma câmara úmida e incubada em estufa a
60 °C até que a preparação adquiriu uma coloração marrom-dourado;
5. Em seguida a lâmina foi lavada com água corrente e deixada secar ao ar.
MATERIAL E MÉTODOS
19
3.2.4. Dupla Coloração CMA
3
/DAPI
(SCHWEIZER et al., 1976)
1. Colocar cerca de 80 µL de solução de cromomicina sobre cada lâmina, cobrir
com uma lamínula e deixar por 1 hora;
2. Escorrer a lamínula e lavar com água corrente e secar levemente;
3. Colocar cerca de 80 µL de solução DAPI/Antifading, retirar o excesso em
papel filtro;
4. Analisar após 15 minutos.
3.2.5. Localização cromossômica de genes ribossomais 18S, 5S e DNA C
0
t-1
por hibridização in situ com sondas fluorescentes (FISH)
(PINKEL et al., 1986)
Foram utilizadas dois tipos de sondas para a localização dessas seqüências nos
cromossomos: uma sonda de DNA ribossômico do fragmento 18S (cerca de 1800pb)
obtida por amplificação via polimerização em cadeia (PCR) dessa seqüência do DNA
genômico do peixe neotropical Prochilodus argenteus (HATANAKA e GALETTI,
2004) e uma sonda de DNAr 5S (cerca de 120 pb) que corresponde a um plasmídeo
recombinante contendo o gene RNAr 5S obtido a partir da espécie Leporinus
obtusidens (MARTINS e GALETTI, 1999).
As etapas foram as seguintes:
1. Lavar das lâminas com as preparações cromossômicas em tampão PBS 1X
(NaCl 0,137 M, KCl 2,6 mM, Na
2
HPO
4
8 mM, KH
2
PO
4
1,46 mM) por 5 minutos
em temperatura ambiente sob agitação;
2. Desidratar em série de etanol gelado (70, 85 e 100%) por 5 minutos;
MATERIAL E MÉTODOS
20
3. Incubar as lâminas com 90 µL de RNAse 10 mg/mL (0,4% RNAse/2xSSC),
sob lamínula a 37
o
C por uma hora em câmara umedecida com água;
4. Lavar as lâminas três vezes por 5 minutos cada com 2xSSC sob agitação,
removendo as lamínulas após a primeira lavagem;
5. Lavar as lâminas uma vez em PBS 1X durante 5 minutos;
6. Fixar em formaldeído 1% em PBS 1X com MgCl
2
50 mM por 10
minutos à
temperatura ambiente;
7. Lavar em PBS 1X por 5 minutos;
8. Desidratar as lâminas em série de etanol gelado (70, 85 e 100%) por 5
minutos cada;
9. Preparar solução de formamida 70% em 2xSSC na qual as lâminas serão
imersas. O DNA cromossômico será desnaturado nas lâminas a 70
o
C por 5
minutos;
10. Passar as lâminas em etanol gelado 70% a –20
o
C por 5 minutos;
11. Desidratar em etanol (85 e 100%) cada por 5 minutos;
12. Colocar 50 µL de solução de hibridização em cada lâmina que será coberta
por lamínula. Esta solução é constituída por 50% formamida, sulfato de
dextrano com concentração final de 10%, 2xSSC e a sonda (18S ou 5S) já
marcada por reação de nick translation). A solução deve antes ser colocada a
95
o
C para desnaturar o DNA do fragmento;
13. Incubar as lâminas em câmara úmida a 37
o
C por 12 horas (overnight);
14. Passado o tempo de hibridização, lavar duas vezes as lâminas em formamida
15% em 0,2xSSC pH 7,0 por 10 minutos, sob agitação a 42
o
C. Remover as
lamínulas após a primeira lavagem;
15. Lavar as lâminas três vezes por 5 minutos cada, com 0,1XSSC em banho-
maria a 60
o
C;
16. Lavar as lâminas por 5 minutos em solução de Tween 20 (0,05% / 2xSSC);
MATERIAL E MÉTODOS
21
17. Adicionar 90 µL de solução de NFDM (non fat dry milk) 5% em 4XSSC sob
lamínula por 15 minutos em câmara umedecida;
18. Lavar as lâminas duas vezes por 5 minutos cada com Tween 20, removendo
a lamínula após a primeira lavagem;
19. Incubar as lâminas com Streptavidina-FITC diluída (1 µL Strpvd / 500 µL
NFDM), colocando 80 µL por lâmina e deixando agir por 30 minutos em
câmara úmida à temperatura ambiente protegida da luz;
20. Lavar 3X com Tween 0,5% / 4XSSC, à temperatura ambiente sob agitação
21. Desidratar as lâminas em série de etanol gelado (70, 85 e 100%) durante 5
minutos cada;
22. Montar as lâminas com 25 µL para cada solução de iodeto de propídeo
(proporção de 25 µL de antifading com 1 µL de iodeto de propídeo
concentrado em 20 µg/mL);
23. Analisar em fotomicroscópio de epifluorescência.
3.2.6. Hibridização genômica in situ (GISH)
(SCHWARZACHER et al., 1992)
A. Extração de DNA Genômico (SAMBROOK, FRITSCH e MANIATIS, 1989)
1. Extrair um pequeno pedaço de tecido (músculo) e armazenar em etanol 96%;
2. Retirar uma amostra de tecido muscular ou de fígado de ±100 mg, colocar
num cadinho, adicionar nitrogênio líquido e macerar;
3. Adicionar 500 µL de tampão TH (mexer levemente), 500 μL de tampão PS
(mexer levemente) e 3 µL de proteinase K (20 mg/mL);
4. Deixar em banho-maria a 37 ºC cerda de uma hora (após 30 minutos do
tempo inicial adicionar mais 3 µL de proteinase K);
MATERIAL E MÉTODOS
22
5. Dividir a amostra em dois microtubos;
6. Adicionar 250 µL de fenol e 250 µL de clorofórmio;
7. Agitar levemente cerca de 100 vezes;
8. Centrifugar a 13.000 rpm durante de 10 minutos;
9. Retirar o sobrenadante e colocar em um tubo novo;
10. Adicionar 250 µL de fenol e 250 µL de clorofórmio;
11. Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 minutos;
12. Retirar o sobrenadante e transferir para outro microtubo adicionando o
mesmo volume de clorofórmio (mexer levemente);
13. Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 minutos;
14. Retirar o sobrenadante e adicionar NaCl 5 M na proporção: 20 µL de NaCl
para cada 480 µL de amostra e o dobro do volume total de etanol 100%;
15. Mexer levemente (observar-se-á a precipitação do DNA);
16. Deixar no freezer overnight;
17. No dia seguinte, a amostra será centrifugada a 13.000 rpm durante 10
minutos e o sobrenadante será descartado;
18. Adicionar 700 µL de etanol 70%;
19. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos;
20. Descartar o sobrenadante (tomar cuidado para não deslocar o DNA do fundo
do tubo);
21. Lavar com 500 µL de etanol 100% (PA);
22. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 minutos;
23. Descartar o sobrenadante e secar o pellet ao ar até evaporar bem o álcool;
24. Ressuspender o pellet em 1/10 de tampão TE+ RNAse (10 mg/mL);
25. Levar ao banho-maria à 37 ºC por aproximadamente 1 hora, após guardar em
freezer;
MATERIAL E MÉTODOS
23
26. Medir a concentração do DNA utilizando o ladder low mass (Invitrogen) em
gel de agarose 0,8% a 90 Volts durante 20 minutos.
B. Preparação das lâminas, marcação e detecção da sonda
Conforme a metodologia descrita anteriormente para obtenção de metáfases
(3.2.1.), as lâminas com preparações cromossômicas são submetidas às mesmas
etapas já descritas no item 3.2.5., exceto pelas seguintes modificações:
1. o DNA genômico a ser utilizado como sonda, antes de ser marcado, foi
submetido ao autoclave (121 °C, 1.034 × 10
5
Pa) para obter fragmentos entre
100 e 1000 pb;
2. adição de um DNA competidor (genoma da espécie receptora da sonda) no
mix de hibridização na proporção 10 : 1 sonda*;
3. a estringência da hibridização e dos banhos pós- também foi alterada para
50% (2xSSC + Formamida a 5% a 37 °C).
*A quantidade de DNA competidor depende da distância filogenética entre as
espécies envolvidas na hibridização.
3.2.7. Isolamento de DNAs repetitivos através da cinética da reassociação
WEI et al. (2005)
Este procedimento está baseado na técnica de C
0
t–1 DNA (DNA enriquecido
com seqüências alta e moderadamente repetitivas). O procedimento consistiu
basicamente em:
1. Diluir o DNA genômico a 100–500 ng/µL em NaCl 0,3M;
2. Colocar 500 µL de DNA em tubos de 1,5 mL;
3. Autoclavar por 5 minutos a 1.4 atm / 120
o
C;
MATERIAL E MÉTODOS
24
4. Aplicar 3µL do DNA autoclavado em gel de agarose 1% para checar a o
tamanho dos fragmentos obtidos (ideal obter fragmentos entre 100 e 1.000
pb);
5. Desnaturar uma alíquota com 50 µL do DNA autoclavado em banho a 95
o
C
por 10 minutos;
6. Passar o tubo para gelo por 10 segundos: colocar o tubo em banho a 65
o
C
para renaturação.
7. Após 1 minuto, retirar o tubo e tratar com S1 nuclease. Para o tratamento com
S1 nuclease, utilizar 1U da enzima para 1 µg de DNA e 5,5 µL tampão 10X
para o volume final de 55 µL. Incubar a 37
o
C por 8 minutos;
8. Congelar imediatamente em nitrogênio líquido;
9. Adicionar igual volume de fenol/clorofórmio (1:1);
10. Centrífugar por 5 minutos a 13.000 rpm. Coletar a fase aquosa e passar para
um tubo novo;
11. Precipitar o DNA com 2,5 volumes de etanol absoluto gelado;
12. Deixar no freezer a –75
o
C por 30 minutos ou a – 20 ºC overnight;
13. Centrifugar por 15 minutos a 15.000 rpm a 4
o
C. Secar e ressuspender em 50
µL de água milliQ autoclavada.
14. Checar o DNA em gel de agarose 1%.
3.2.8. Determinação das áreas dos núcleos interfásicos
As áreas dos núcleos interfásicos serão determinadas pelo programa Image
Tools for Windows versão 3.00, a partir de imagens obtidas por captura digital em
aumento de 1000X. As mensurações serão realizadas em 50 núcleos interfásicos
selecionados por apresentarem tamanho médio em esfregaços de sangue periférico
das espécies analisadas. Através do programa BioEstat 2.0, utilizando o teste t de
MATERIAL E MÉTODOS
25
“Student” para amostras independentes, será possível comparar os valores das
áreas dos núcleos interfásicos das espécies analisadas. Deste modo indireto, porém
resolutivo e rápido, inferências serão realizadas quanto ao tamanho dos genomas,
uma vez que uma maior área de núcleo interfásico corresponde a uma maior
quantidade de DNA. Para efeito de padronização se utilizará a espécie Gallus gallus
(Aves) como grupo externo.
3.2.9. Determinação do conteúdo de DNA por citometria de fluxo
A preparação das amostras foi baseada na fixação e na permeabilização
celular conforme DARZYNKIEWICZ et al. (2006). Células sangüíneas foram
coletadas a partir da artéria caudal usando uma seringa heparinizada e em seguida
fixadas com formaldeído 1% por uma hora. Após duas lavagens em tampão fosfato
(PBS) pH 7.4, as células foram permeabilizadas em etanol 70% overnight a –20 ºC.
Alíquotas contendo aproximadamente 1x 10
6
células foram pré-tratadas com RNAse
a 37ºC por 1 hora antes da coloração com iodeto de propídio. Sangue fresco de
galinha Leghorn preparado como acima, foi adicionado a cada amostra como padrão
interno na concentração final de 0.5x 10
6
células/mL. As mensurações do conteúdo
de DNA foram realizadas em citômetro FACSCalibur (Becton Dickinson
Biosciences). Para cada amostra, 20.000 células foram adquiridas usando o
software Cell Quest (Becton Dickinson Biosciences). O tamanho do genoma
(conteúdo diplóide de DNA) em picogramas de cada espécie, foi calculado a partir
da intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias), multiplicando a razão das
fluorescências G1 dos peixes e da galinha pelo valor conhecido de tamanho de
genoma (galinha = 2.54 pg – Rasch et al., 1971):
MATERIAL E MÉTODOS
26
3.2.10. Montagem e Análise dos Cariótipos
As metáfases selecionadas foram adquiridas em microscópio com objetiva 100 X
de imersão, através do sistema Applied Spectral Imagem de captura digital de
imagens acoplado ao microscópio Carl Zeiss Axiophot. As análises cromossômicas
foram realizadas no computador através do software Case Data Manager Expo 4.0, e
as medições cromossômicas foram feitas com o software Corel Draw 9 para a
determinação da relação entre os braços (RB).
Para o cálculo do NF os cromossomos metacêntricos (m), submetacêntricos
(sm) e subtelocêntricos (st) serão considerados como bibraquiais, enquanto que os
cromossomos acrocêntricos (a) constituídos por um único braço.
A classificação dos cromossomos quanto à relação entre os braços seguirá
conforme LEVAN, FREDGA e SANDBERG (1964), determinando os tipos a seguir:
Metacêntrico (m) RB = 1,00 a 1,70
Submetacêntrico (sm) RB = 1,71 a 3,00
Subtelocêntrico (st) RB = 3,01 a 7,00
Acrocêntrico (a) RB > 7,01
26
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e discussão estão apresentados na forma de capítulos, os
quais correspondem a artigos científicos já publicados, submetidos ou em fase de
preparação. As referências bibliográficas estão reunidas no final desta tese.
27
4.1. CAPÍTULO I
LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DOS GENES RIBOSSOMAIS 5S E 18S EM
TETRAODONTIFORMES
NOLETO RB, VICARI MR, CIPRIANO RR, ARTONI RF & CESTARI MM (2007). Physical
mapping of 5S and 45S rDNA loci in pufferfishes (Tetraodontiformes). Genetica
130: 133–138.
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
28
Resumo
As características cromossômicas, localização e variação das duas famílias
multigênicas de genes ribossomais foram estudadas em três espécies de baiacus:
Sphoeroides greeleyi e Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Chilomycterus
spinosus (Diodontidae). A localização da maior família de rDNA (45S) foi revelada
com uma sonda 18S em dois locos para todas as espécies. O menor gene
ribossomal (5S rDNA) foi localizado em um par de cromossomos nos
tetraodontídeos e sobre dois pares cromossômicos distintos em C. spinosus. Não foi
observada organização sintênica entre as duas famílias. Colorações com os
fluorocromos base preferenciais Cromomicina A
3
e DAPI evidenciaram uma
heterogeneidade principalmente nas Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs), as
quais se mostraram sempre ricas em GC. O cariótipo das espécies da família
Tetraodontidae apresentou 2n = 46 cromossomos, um número diplóide já
encontrado em outras espécies do gênero Sphoeroides estudadas. Em
contrapartida, o cariótipo de C. spinosus, descrito pela primeira vez, mostrou 2n = 50
cromossomos (4m + 18sm + 12st + 16a). O conhecimento prévio da estrutura
cariotípica e o mapeamento físico de certos genes neste grupo, podem ser de
grande relevância em futuras análises envolvendo seqüências de DNA.
Abstract
Chromosomal features, location and variation of the major and minor rDNA
genes cluster were studied in three pufferfish species: Sphoeroides greeleyi and
Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) and Chilomycterus spinosus
(Diodontidae). The location of the major rDNA was revealed with an 18S probe in two
loci for all species. The minor rDNA loci (5S rDNA) was found in one chromosome
pair in tetraodontid fishes and four sites located on two distinct chromosomal pairs in
C. spinosus. A syntenical organization was not observed among the ribosomal
genes. Signal homogeneity for GC/AT-DNA specific fluorochromes was observed in
diodontid fish except in the NORs regions, which were CMA3-positive. Giemsa
karyotypes of tetraodontid species presents 2n = 46, having the same diploid value of
other Sphoeroides species that have been investigated. On the other hand, the
karyotype of C. spinosus, described for the first time, shows 2n = 50 chromosomes
(4m + 18sm + 12st + 16a). The foreknowledge of the karyotypic structure of this
group and also the physical mapping of certain genes could be very helpful for further
DNA sequence analysis.
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
29
Introdução
Peixes da ordem Tetraodontiformes têm ampla distribuição circuntropical
sendo principalmente marinhos, ainda que muitas espécies possam ocorrer em água
doce (NELSON, 1994). Possui aproximadamente 350 espécies que exibem
peculiaridades genéticas e morfológicas representando um dos principais ramos da
radiação dos teleósteos (TYLER, 1980; LAUDER e LIEM, 1983). Recentes análises
filogenéticas baseadas em caracteres morfológicos (Nelson, 1994) e em marcadores
moleculares (HOLCROFT, 2004) confirmam a monofilia do grupo e corroboram com
a hipótese dos Tetraodontiformes serem grupo irmão dos Acanthuroidea uma
subordem dos Perciformes.
Devido ao reduzido tamanho, os cromossomos dos peixes tetraodontiformes
são de difícil obtenção e pareamento incerto para alguns pares. O número
cromossômico na ordem varia de 2n = 28 a 2n = 52 cromossomos (SÁ-GABRIEL e
MOLINA, 2005). Os chamados baiacus lisos da família Tetraodontidae têm o menor
genoma entre os vertebrados com um conjunto haplóide de cerca de 400 milhões de
bases (Mb). Já os baiacus espinho (Diodontidae, grupo irmão) possuem um genoma
cerca de duas vezes maior ~800 Mb (HINEGARDNER e ROSEN, 1972). Estas
peculiaridades cromossômicas fazem deste grupo de peixe o indicado para a
identificação in situ de seqüências repetitivas do genoma, e entre estas seqüências
os genes ribossomais tem recebido uma particular atenção. Em eucariotos
superiores estes genes estão organizados em duas distintas famílias multigênicas,
uma contendo o rDNA 45S que codifica para 18S, 5.8S e 28S rRNAs, e a menor que
codifica para o rDNA 5S. As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) que contém
o rDNA 45S podem ser facilmente identificadas nos cromossomos por nitrato de
prata (Ag-RONs) ou podem ser investigadas, especialmente em peixes e anfíbios,
utilizando certos fluorocromos como a Cromomicina A
3
(SCHMID, 1980; AMEMIYA e
GOLD 1986), ainda que estes fluorocromos possam somente indicar
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
30
heterocromatinas ricas em GC (ARTONI et al., 1999) e em alguns casos como
espaçadores dos genes ribossomais (PENDÁS et al., 1993). Em contrapartida o
rDNA 5S é pouco estudado cariotipicamente e é detectado apenas por hibridização
in situ.
Neste estudo portanto, nós detectamos o número e localização dos locos 5S
e 45S rDNA em três diferentes espécies de baiacus. Nossos resultados fornecem
informações adicionais sobre a citogenética dos Tetraodontiformes, permitindo
melhores inferências sobre a evolução cariotípica e relações filogenéticas, além de
contribuir para a citotaxonomia do grupo.
Materiais e métodos
Trinta e dois indivíduos de Sphoeroides greeleyi (21 fêmeas e 11 machos), 26
de Sphoeroides testudineus (17 fêmeas e 9 machos) e quatro espécimes de
Chilomycterus spinosus (uma fêmea, dois machos e um não identificado) foram
coletados na Baía de Paranaguá – PR (25º33’ S e 48º23’ O). Os cromossomos
mitóticos foram obtidos a partir do rim anterior utilizando cultura de curto tempo e
preparação convencional airdrying (FENOCCHIO et al., 1991). Nomenclatura
cromossômica foi de acordo com Levan et al. (1964). As espécies foram depositadas
no Museu de História Capão da Imbuia (MHNCI) (Curitiba– PR, Brasil).
As RONs foram detectadas usando nitrato de prata (Ag –RONs), de acordo
com HOWELL e BLACK (1980). Coloração combinada com os fluorocromos
diamidino-2-phenylindole (DAPI) e Cromomicina A
3
evidenciaram regiões
heterocromáticas ricas em pares de base AT e GC, seguindo a metodologia de
SCHWEIZER (1980). Sondas fluorescentes foram utilizadas para detectar os locos
da maior e menor família de rDNA sobre os cromossomos. As sondas das
subuniades ribossomais 18S e 5S dos peixes Prochilodus argenteus (HATANAKA e
GALETTI, 2004) e Leporinus obtusidens (MARTINS e GALETTI, 1999)
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
31
repectivamente, foram marcadas com biotina-14-dATP por reação de nick translation
de acordo com instruções do fabricante (BioNick
TM
Labeling System, Invitrogen). Os
sinais de hibridização foram detectados usando os conjugados avidina-fluoresceína
isotiocianato (FITC) e anticorpo anti-avidina biotinilado. Os cromossomos foram
contracorados com iodeto de propídeo (IP) (50 µg/mL) e analisados com um
microscópio de epifluorescência Zeiss Axiophot. O software Case Data Manager
Expo 4.0 (Applied Spectral Imaging) foi usado para a captura das imagens.
Resultados e Discussão
Devido a alguns fatores como variações inter-individuais e grau de
compactação dos cromossomos, a qualidade das metáfases apresentadas nas
figuras é variável. A preparação cromossômica pelo método indireto origina um
número razoável de metáfases, mas com diversos níveis de condensação da
cromatina.
Os baiacus lisos (Tetraodontidae) têm o menor genoma dos vertebrados já
mensurado. Devido ao reduzido tamanho dos cromossomos o número fundamental
(NF) não é seguramente determinado, de modo que alguns pares submetacêntricos
ou subtelocêntricos parecem ser telocêntricos. Estudos citogenéticos anteriores têm
mostrado que S. greeleyi (BRUM e MOTA, 2002) e S. testudineus (SÁ-GABRIEL e
MOLINA, 2005) possuem 46 cromossomos, mas com diferentes valores de NF. No
presente estudo nós confirmamos estes dados (Figura 1A, B) e apresentamos o
cariótipo de C. spinosus pela primeira vez, com 2n=50 cromossomos: 2 pares de
metacêntricos (m), 9 pares de submetacêntricos (sm), 6 pares de subtelocêntricos
(st) e 8 pares de acrôcentricos (a), NF = 84 (Figura 1c). Este cariótipo representa um
estado derivado, uma vez que o 2n = 46 pode ser considerado uma plesiomorfia
para as famílias Balistidae, Ostraciidae, Tetraodontidae e Diodontidae
(CHOUDHURY et al., 1982; BRUM et al., 1995).
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
32
Hibridização fluorescente in situ com sondas específicas de rDNA 18S
resultou em marcações sobre um par de cromossomos, cuja localização
corresponde às RONs evidenciadas pelo nitrato de prata Ag-RONs. Em todas as
espécies esta região se mostrou positiva após coloração com CMA
3
, apresentando
portanto a riqueza característica de pares de base GC (Figura 1A, B e 2G). Em S.
greeleyi estes sinais foram observados na região telomérica do braço longo de
cromossomos acrocêntricos (19º par) (Figura 2A). Em S. testudineus (8º par) e
também em C. spinosus (5º par) o rDNA 45S foi evidenciado no braço curto de
cromossomos submetacêntricos (Figura 2C e 2E, respectivamente). Freqüentemente
foi observada associação destas regiões em C. spinosus, o qual é um fenômeno
comum em peixes. Este padrão de RONs simples, em que apenas 2 cromossomos
apresentam marcações é considerado comum não só para os teleósteos, mas para
a grande maioria dos vertebrados (AMEMIYA e GOLD, 1986).
Não foi possível nas três espécies, identificar precisamente o par
cromossômico no qual o 5S rDNA estava localizado. Em S. greeleyi estes genes
foram localizados próximo à região pericentromérica de um par de cromossomos
metacêntricos (Figura 2B). Situação diferente foi observada para S. testudineus, no
qual estes genes ocupam uma posição subterminal no braço curto de cromossomos
submetacêntricos (Figura 2D). Estes resultados suportam a idéia das inversões
pericêntricas estarem envolvidas na modelagem do cariótipo de teleósteos marinhos
(CANO et al., 1982; GALETTI et al., 2000). No diodontídeo C. spinosus o menor
rDNA foi localizado na região terminal do braço curto de dois pares
submetacêntricos. Esta é possivelmente uma situação derivada em relação à
condição plesiomórfica encontrada nos tetraodontídeos aqui analizados. Estes pares
cromossômicos podem ser facilmente distinguidos dos pares portadores das RONs
devido às marcações positivas para CMA
3
e IP e negativas para DAPI (Figura 2F e
G, respectivamente). RAB et al. (1996) mostrou que o conteúdo GC aumenta a
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
33
temperatura de fusão do DNA, conseqüentemente as RONs permanecem dupla fita
durante a desnaturação, aumentando assim, a afinidade pelo IP. Uma
homogeneidade de sinal para ambos fluorocromos (CMA
3
/DAPI) ao longo dos
cromossomos sugere que a cromatina não é compartimentalizada nesta espécie,
mas a razão entre AT e GC é igualmente interespaçada em ambas eucromatina e
heterocromatina.
Por coloração sequencial Ag-RONs sobre a FISH 5S (dados não mostrados),
os sítios 5S não estão em associação com as RONs, corroborando com resultados
já observados em outras espécies de baiacus (FISCHER et al., 2000; MANDRIOLI e
MANICARDI, 2001). Esta divergência de localização das RONs e os sítios rDNA 5S
parece ser a situação mais comum observada em peixes (MARTÍNEZ et al., 1996) e
também em vertebrados (SUZUKI et al., 1996), ainda que os locos do 5S e 45S
rDNA podem assumir uma organização sintênica no mesmo cromossomo (PENDÁS
et al., 1994, MORÁN et al., 1996). Conversão gênica e recombinação desigual são
importantes mecanismos evolutivos que atuam sobre seqüências repetidas em
tandem (DOVER, 1986), os quais podem originar translocações indesejadas de
seqüências 5S dentro do sítio 45S ou vice-versa (MARTINS e GALETTI, 1999)
explicando o fato de que a maioria dos vertebrados têm estes clusters em
cromossomos distintos.
Na maioria dos organismos, inclusive nos peixes, o 5S rDNA está geralmente
localizado em apenas um par cromossômico (PENDÁS et al., 1994). Esta condição é
provavelmente a mais ancestral dentre este grupo, embora estes clusters podem
ocorrer em diversos pares em anfíbios (SCHMID et al., 1987) e em algumas
espécies de peixes (MARCO FERRO et al., 2001; MARTINS e GALETTI, 1999).
Além disso a ocorrência dos genes 5S em mais de um par cromossômico, como em
C. spinosus, sugere que estes clusters ribossômicos podem estar evoluindo
separadamente. As regiões teloméricas são propensas à transferência de material
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
34
genético devido a proximidade entre elas dentro do núcleo interfásico (SCHWEIZER
e LOIDL, 1987). Em adição, o mapeamento destes genes em diferentes espécies de
peixes tem mostrado que estes sítios estão geralmente localizados em segmentos
intersticiais dos cromossomos (MARTINS e GALETTI, 2001). O ambiente intersticial
das cromátides pode estar protegido de eventos evolutivos, como a transposição por
exemplo, que poderiam atuar na dispersão de seqüências localizadas em posição
terminal de cromossomos. Este fato pode explicar a maior variação observada em
peixes com os locos de rDNA 45S e da mesma forma o padrão encontrado em C.
spinosus (Diodontidae) para o 5S rDNA. Por outro lado pode ser simplesmente uma
conseqüência de um maior tamanho de genoma em comparação com o grupo irmão
(Tetraodontidae), uma vez que PROKOPOWICH et al. (2003) encontrou uma forte
associação entre o número de cópias de rDNA e o tamanho de genoma entre os
eucariotos.
A investigação sobre a divergência do número de genes rDNA entre as
famílias Diodontidae e Tetraodontidae e a sua relação com o tamanho do genoma
se mostra como um interessante estudo a ser realizado. Além disso fornece
informações adicionais sobre a distribuição taxonômica desta característica e
também sobre a estrutura do genoma dos Tetraodontiformes.
Referências
As referências bibliográficas deste capítulo estão reunidas no final desta tese.
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
35
FIGURA 1 - Cariótipos em coloração convencional Giemsa de Sphoeroides greeleyi
(a), Sphoeroides testudineus (b) e Chilomycterus spinosus (c). Os cromossomos
portadores das RONs são mostrados após impregnação por nitrato de prata (boxes
brancos) e dupla coloração CMA
3
/DAPI (boxes pretos). Barra = 5 µm.
CAPÍTULO I – GENES RIBOSSOMAIS EM TETRAODONTIFORMES
36
FIGURA 2 - Metáfases após FISH com sondas 18S e 5S rDNA, respectivamente: S.
greeleyi (a, b), S. testudineus (c, d) e C. spinosus (e, f). As cabeças de seta indicam
os sinais de hibridização. Em (f) as setas mostram blocos IP-positivos que
correspondem às RONs. (g) Dupla coloração CMA
3
/DAPI em C. spinosus
evidenciando regiões ricas em GC nos cromossomos em associação (seta). Barra =
5 µm.
37
4.2. CAPÍTULO II
EVOLUÇÃO DO TAMANHO DE GENOMA: NOVAS CONTRIBUIÇÕES PARA O
GRUPO TETRAODONTIFORMES
NOLETO RB, GUIMARÃES FSF, PALUDO KS, VICARI MR, ARTONI RF and CESTARI
MM (2009). New contributions to the knowledge of genome size evolution in
Tetraodontiform fishes.
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
38
Resumo
Peixes da família Tetraodontidae têm-se tornado modelos puramente
genômicos devido a notável compactação de seus genomas. Esta característica
parece ser o resultado de uma perda de DNA que se seguiu desde a divergência do
seu grupo irmão, família Diodontidae, cujos representantes têm genomas maiores.
Nós usamos a citometria de fluxo para estimar o tamanho do genoma de quatro
baiacus da região Neotropical. Dados citogenéticos aliados à microscopia confocal
também foram usados na tentativa de estabelecer relações entre o conteúdo de
DNA e parâmetros citológicos. O tamanho dos genomas (N) encontrados foram 0.71
± 0.03 pg em Sphoeroides greeleyi, 0.34 ± 0.01 pg para S. spengleri, 0.82 ± 0.03 pg
em S. testudineus (todos Tetraodontidae) e 1.00 ± 0.03 pg para Chilomycterus
spinosus (Diodontidae). O valor para S. spengleri representa o menor genoma entre
os vertebrados até então. A diferença no tamanho de genoma não está relacionada
com o nível de ploidia, pois 46 cromossomos é considerado basal para ambas as
famílias. Além disso, nossas análises demonstraram que o tamanho da célula e do
núcleo de eritrócitos está fortemente correlacionado com o tamanho do genoma, e
neste contexto tal variação de tamanho é considerada sob perspectivas adaptativas
e evolutivas.
Abstract
Smooth pufferfish of the family Tetraodontidae had become pure genomic
models because of the remarkable compaction of their genome. This trait seems to
be the result of DNA loss following its divergence from the sister family Diodontidae,
which possess larger genomes. Here we use flow cytometry for estimate the genome
size of four pufferfish species from the Neotropical region. Cytogenetic data and
confocal microscopy were also used attempting to find relationships between DNA
content and cytological parameters. The haploid genome size was 0.71 ± 0.03 pg for
Sphoeroides greeleyi, 0.34 ± 0.01 pg for S. spengleri, 0.82 ± 0.03 pg for S.
testudineus (all Tetraodontidae) and 1.00 ± 0.03 pg for Chilomycterus spinosus
(Diodontidae). The value for S. spengleri represents the smallest vertebrate genome
size recorded to date. The differences in genome size are not related with ploidy
level, since that 46 chromosomes is considered basal for both families. Moreover our
analyses demonstrate that erythrocyte cell and nuclear sizes are strongly correlated
with genome size, and in this context the genome size variation is considered under
both adaptive and evolutionary perspectives.
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
39
Introdução
A ordem Tetraodontiformes compreende dez famílias, e nelas estão incluídas
350 espécies distribuídas principalmente em mares tropicais, embora algumas
espécies sejam também encontradas em águas continentais (NELSON, 1994). O
grupo mostra um excepcional grau de diversidade morfológica e peculiaridades
genéticas, tais como o baixo conteúdo de DNA. Os baiacus lisos da família
Tetraodontidae têm o menor genoma entre os vertebrados já mensurado, um
tamanho haplóide com cerca de 400 milhões de pares de base (Mb)
(HINEGARDNER e ROSEN 1972; BRENNER et al., 1993). Apesar deles terem um
complemento similar de genes a de outros vertebrados, o pequeno tamanho é
aparentemente o resultado de perda de introns e de DNA repetitivo (ELGAR et al.,
1999; LOH et al., 2008). Assim, devido a esta notável compactação do genoma, os
baiacus tornaram-se uma ferramenta atrativa para a genômica comparativa,
essencial no entendimento da evolução genômica e cariotípica de vertebrados.
Em eucariotos o tamanho de genoma varia por mais de cinco ordens de
magnitude e está correlacionado com várias características fenotípicas de aparente
significado seletivo, principalmente com o tamanho de células e núcleos
(CAVALIER-SMITH, 1982; GREGORY e HEBERT, 1999). Quanto a esta
consideração, várias hipóteses têm sido propostas para explicar esta importante
variação. As evidências disponíveis favorecem a teoria nucleotípica, a qual postula
uma influência causal da quantidade de DNA sobre o fenótipo celular, como a taxa
de divisão, o tamanho da célula e o do núcleo (BENNETT 1971; GREGORY 2001a;
HARDIE e HERBERT, 2004). Portanto estes parâmetros citológicos são relevantes
fenotipicamente para o organismo e conseqüentemente são passíveis de seleção.
A determinação do conteúdo de DNA constitui uma importante consideração a
ser utilizada em estudos genômicos e pode fornecer importantes informações para o
estabelecimento de um cenário mais consistente da evolução genômica. Entre as
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
40
diferentes técnicas usadas para a quantificação do genoma, a citometria de fluxo é
atualmente o método mais preciso e reprodutível, e tem sido utilizada para
determinar o conteúdo de DNA nuclear de muitas espécies animais (VINOGRADOV,
1998).
A relação entre tamanho de genoma e parâmetros celulares foi previamente
questão de controvérsia em peixes (CHANG et al., 1995; LAY e BALDWIN 1999).
Contudo, neste estudo, mais uma vez positivas correlações foram confirmadas.
Análises de citometria de fluxo associada com dados citogenéticos e de microscopia
confocal é conduzida pela primeira vez em quatro representantes da ordem
Tetraodontiformes que ocorrem na região Neotropical. As implicações destes
resultados com respeito ao significado adaptativo do tamanho de genoma bem como
a evolução genômica do grupo é discutida.
Materiais e Métodos
Amostra e preparação de suspensão celular
A amostra, coletada na Baía de Paranaguá–PR (25º30’42’’ S e 48º25’15’’ O)
foi composta de 51 indivíduos de quatro espécies de baiacus: Sphoeroides greeleyi
(n = 17), S. spengleri (n = 19), S. testudineus (n = 10), e Chilomycterus spinosus (n =
5). Os espécimes foram tombados no Museu de História Natural Capão da Imbuia
(MHNCI) (Curitiba-PR, Brasil). Os procedimentos usados neste trabalho estão de
acordo com as normas do Comitê de Ética em Experimentação Animal da
Universidade Federal do Paraná (UFPR 01/03BL) e com a atual legislação brasileira
(CONCEA 1153/95). Preparações cromossômicas foram obtidas a partir de cultivo
celular de curto tempo (FENOCCHIO et al, 1991), e coradas com Giemsa 5.0%.
Para a determinação do conteúdo de DNA, a preparação das amostras foi baseada
na fixação e na permeabilização celular conforme DARZYNKIEWICZ et al. (2006).
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
41
Células sangüíneas foram coletadas a partir da artéria caudal usando uma seringa
heparinizada e em seguida fixadas com formaldeído 1.0% por uma hora. Após
lavagens em tampão fosfato (PBS) pH 7.4, as células foram permeabilizadas em
etanol 70% por 12 hs a –20 ºC. Alíquotas contendo aproximadamente 1x 10
6
células
foram pré-tratadas com RNAse a 37 ºC antes da coloração com iodeto de propídio.
Sangue fresco de galinha Leghorn preparado como acima, foi adicionado a cada
amostra como padrão interno na concentração final de 0.5x 10
6
células/mL. Para
análises de microscopia confocal, eritrócitos secos foram corados com laranja de
acridina.
Citometria de fluxo e Microscopia Confocal
Mensurações do conteúdo de DNA foram realizadas em citômetro
FACSCalibur (Becton Dickinson Biosciences). Para cada amostra, 20.000 células
foram adquiridas usando o software Cell Quest (Becton Dickinson Biosciences). O
tamanho do genoma (conteúdo diplóide de DNA) em picogramas de cada espécie,
foi calculado a partir da intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias),
multiplicando a razão das fluorescências G1 dos peixes e da galinha pelo valor
conhecido de tamanho de genoma (galinha = 2.54 pg – RASCH et al., 1971):
tamanho do genoma (2C) = [ (curva G1 peixe) ÷ (curva G1 galinha) ] x (2.54 pg)
A curva G1 dos peixes mostrou-se sempre maior em relação à da galinha
devido ao fato desta última estar representada pela metade do número de células
contidas nas amostras dos peixes. Imagens fluorescentes foram adquiridas usando
um filtro óptico apropriado para o corante laranja de acridina e também por DIC
(diferencial contraste). No mínimo, áreas de 50 células e núcleos foram mensuradas
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
42
para todas as espécies. A relação entre conteúdo de DNA e as áreas celular e
nuclear foram analisadas por regressão linear de dados transformados para escala
logarítima (log
10
). Procedimentos estatísticos padrões foram aplicados e estão
apresentados nos Resultados, usando o pacote estatístico Biostat 5.0 (AYRES et al.,
2007).
Resultados
Mensurações do tamanho de genoma (convertido para conteúdo haplóide de
DNA) das quatro espécies de Tetraodontiformes examinadas estão apresentadas na
Tabela 1. De acordo com o padrão interno, os valores para S. greeleyi, S. spengleri,
S. testudineus e C. spinosus foram 0.71 ± 0.03 pg, 0.34 ± 0.01 pg, 0.82 ± 0.03 pg e
1.00 ± 0.04 pg, respectivamente. Coeficientes de variação das curvas de
fluorescência dos núcleos foram geralmente inferiores a 5% em todas as espécies.
Histogramas da fluorescência relativa de eritrócitos corados com iodeto de propídio
das quatro espécies de baiacus e da galinha estão apresentados na Figura 1. Para
comparações com nossas medições, na Tabela 2 também estão incluídos tamanhos
de genoma disponíveis na literatura (convertido para pg· e Mb).
Ambas, celular e nuclear áreas dos eritrócitos, mostraram uma relação
positiva altamente significante com o tamanho do genoma (Figura 2A e B,
respectivamente). Tais áreas também foram correlacionadas positivamente entre
elas em todas as espécies (Figura 2C). A microscopia confocal confirmou estas
correlações, ou seja, quanto maior o conteúdo de DNA, maior o tamanho da célula e
do núcleo (Figura 3 A–J).
Quanto ao número cromossômico, as três espécies do gênero Sphoeroides
(Tetraodontidae) mostraram 2n = 46 e C. spinosus (Diodontidae) 2n = 50
cromossomos (Figura 3 K–O), corroborando com estudos anteriores (BRUM e
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
43
MOTA, 2002; SÁ-GABRIEL e Molina, 2005; NOLETO et al., 2007; ALVES et al.,
2008).
Discussão
Peixes da ordem Tetraodontiformes, em particular a família Tetraodontidae,
tornaram-se modelos interessantes para estudos genômicos devido aos seus
genomas altamente compactos (aproximadamente 400Mb) (BRENNER et al., 1993).
Esta notável compactação, a qual facilita a identificação de genes e projetos de
seqüenciamento, está diretamente relacionada a redução no comprimento de
íntrons, regiões intergênicas e à falta de seqüências repetitivas (ELGAR et al., 1996;
ELGAR et al., 1999; VENKATESH et al., 2000; LOH et al., 2008). Nossas
mensurações confirmaram esta peculiaridade além de evidenciar um dos menores
genomas de vertebrados, de Sphoeroides spengleri, o qual pode ser mais compacto
do que os que ocupavam este posto até então, os genomas de Takifugu rubripes
(APARICIO et al., 2002) e Tetraodon nigroviridis (JAILLON et al., 2004). Contudo,
um pequeno genoma não é uma comum característica em todos os peixes
Tetraodontiformes, desde que os baiacus-espinho (Diodontidae) possuem em média
genomas maiores, que variam de 0.8 a 0.9 pg (NEAFSEY e PALUMBI, 2003). Em
adição, no presente estudo, C. spinosus apresentou o maior valor para a família (1.0
pg). Como para a maioria dos organismos, as diferenças no tamanho do genoma
entre diodontídeos e tetraodontídeos não está relacionada a diferenças quanto a
ploidia, mas quanto ao tamanho dos cromossomos, o qual é claramente diferenciado
entre as espécies, principalmente entre os diminutos cromossomos de S. spengleri e
os grandes de C. spinosus (Figura 3L e O, respectivamente). A independência do
tamanho de genoma e o número cromossômico é reforçada pelo fato que na maioria
das espécies de teleósteos estudadas, o complemento permanece extremamente
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
44
constante ao redor de 48 cromossomos, mesmo entre espécies que diferem
significativamente no conteúdo de DNA (OHNO, 1974; KLINKHARDT et al.,1995). O
número de cromossomos na ordem Tetraodontiformes varia de 2n=28 a 2n=52 (SÁ-
GABRIEL e MOLINA, 2005, GALETTI et al., 2006), de modo que o 2n = 46
cromossomos observado em espécies do gênero Sphoeroides previamente
estudadas (BRUM e MOTA, 2002; SÁ-GABRIEL e MOLINA, 2005, NOLETO et al.,
2007; ALVES et al., 2008) é considerado o cariótipo basal para as famílias
Balistidae, Diodontidae e Tetraodontidae (ARAI, 1983; BRUM, 2000).
Numerosos estudos têm confirmado eventos de duplicação total ocorridos na
linhagem dos peixes com nadadeiras raiadas (AMORES et al., 1998; ROBINSON-
RECHAVI et al., 2001; TAYLOR et al., 2003; JAILLON et al., 2004), e estes
episódios certamente contribuíram para sua diversidade fenotípica e genômica.
Neste cenário, o ancestral dos Tetraodontidae apresentou um genoma relativamente
maior mas uma tendência de perder DNA foi adquirida nos últimos 50 milhões de
anos desde sua divergência dos Diodontidae (BRAINERD et al., 2001; SANTINI e
TYLER, 2003). Neste contexto, de acordo com os resultados aqui apresentados, o
processo de eliminação do DNA não codificante pode ter sido mais intenso em S.
spengleri do que em outros representantes.
Este estudo claramente estabelece que o conteúdo de DNA afeta o tamanho
do eritrócito e do seu núcleo em peixes. Alguns estudos anteriormente detectaram
uma falta de associação entre tais parâmetros celulares e o tamanho do genoma,
tanto em peixes ósseos (LAY e BALDWIN, 1999) quanto em cartilaginosos (CHANG
et al., 1995), embora os métodos usados nestes estudos tenham sido questionados
(GREGORY, 2001a; GREGORY, 2001b). Seria uma surpresa não encontrar tal
relação em peixes, desde que as primeiras observações já reportavam a evolução
em concerto da quantidade de DNA com o tamanho da célula e do seu núcleo, em
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
45
todos os reinos, protista, planta e animal (CAVALIER-SMITH, 1991; GREGORY e
HEBERT, 1999). A existência de uma forte associação citogenômica é a base para
uma interpretação adaptativa. A constância cito– e nucleogenômica em
neopoliplóides em comparação com seus progenitores diplóides promove adicional
suporte à natureza causal destas correlações, indicando que a teoria nucleotípica é
a justificativa mais parcimoniosa para o entendimento da diversidade do tamanho de
genoma (MIRSKY e RIS, 1951; NURSE, 1985).
Associações entre tamanho do genoma com caracteres tais como: taxas
metabólicas e de desenvolvimento, crescimento, complexidade e amplitude
ecológica, etc, estão presentes em muitos grupos de organismos, e derivam
principalmente da relação entre o conteúdo de DNA das células, seu tamanho e sua
taxa de divisão. A diversidade do tamanho de genoma em peixes, bem como em
outros grupos, varia positivamente ao longo de um continuum r–K (CAVALIER-
SMITH, 1978). Entre as indicações da natureza adaptativa da acumulação do DNA
não codificante, está o fato de que peixes de água doce possuem genomas maiores
em relação às espécies marinhas (HARDIE e HERBERT, 2004) da mesma forma os
cartilaginosos em relação aos ósseos (STINGO e ROCCO, 2002). Em adição, em
peixes com nadadeiras raiadas, o conteúdo de DNA não está correlacionado com a
taxa metabólica, mas associado positivamente com aspectos reprodutivos incluindo
tamanho de ovo e cuidado parental (HARDIE e HERBERT, 2004). Os baiacus, r
estrategistas, com rápido crescimento e ligeira maturidade, ausência de cuidado
parental e alta fecundidade, têm neste cenário, experimentado uma seleção a favor
de um pequeno tempo de desenvolvimento (menos DNA a ser replicado
conseqüentemente uma curta divisão celular).
É improvável que o tamanho de um genoma seja afetado somente por forças
seletivas, pois existem claras evidências de mecanismos mutacionais de adição e
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
46
perda de DNA, tais como expansão de DNA satélite, contração e/ou expansão de
heterocromatina (veja Capítulo IV), atividade de elementos de transposição entre
outros, também atuando na remodelagem genômica. Diferentes fatores evolutivos
comportam-se de maneiras distintas, conforme o organismo, o habitat e período
evolutivo (PETROV, 2001), especialmente em peixes, dada a sua extrema
diversidade. Portanto uma análise da complexa interação de fatores é necessária
para um robusto entendimento a cerca da evolução do tamanho do genoma.
Referências
As referências bibliográficas deste capítulo estão reunidas no final desta tese.
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
47
TABELA 1 - Valores haplóide em picogramas (pg) dos genomas das espécies
analisadas. (N) número de indivíduos analisado, (2n) número diplóide (DP) desvio
padrão e (CV) coeficiente de variação.
Espécie N 2n média conteúdo DNA ± DP CV(%)
Sphoeroides greeleyi
17 46 0.71 ± 0.03 4.79
S. spengleri
19 46 0.34 ± 0.01 3.82
S. testudineus
10 46 0.82 ± 0.03 3.90
Chilomycterus spinosus
5 50 1.00 ± 0.04 3.70
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
48
TABELA 2 - Sumário de número diplóide e de tamanho de genoma em baiacus das
famílias Tetraodontidae e Diodontidae. (n) Haplóide.
a
calculado assumindo que 1 pg de DNA representa 978 x 10
6
pb (DOLEZEL et al.
2003).
b
from PIZON et al. 1984.
c
from OJIMA e YAMAMOTO 1990.
d
from HARDIE e HERBERT 2004.
e
from BRAINERD et al. 2001.
f
presente estudo.
g
from HINEGARDNER e ROSEN 1972.
h
from BRENNER et al. 1993.
i
from VINOGRADOV 1998.
j
from NOLETO et al. 2007.
k
from MIYAKI et al. 1995.
l
from FISHER et al. 2000.
conteúdo DNA (n)
Família Espécie 2n pg Mb
a
Tetraodontidae
Arothron diadematus
– 0.45
b
440
A. hispidus
42
c
0.46
c
450
A. manilensis
– 0.50
d
489
A. meleagris
38
c
0.38
c
372
Canthigaster bennetti
– 0.38
d
372
C. rostrata
– 0.45
e
440
C. valentini
– 0.44
d
430
Lagocephalus lunaris
– 0.44
d
430
Sphoeroides greeleyi
46
j
0.71
f
694
S. maculatus
– 0.50
g
489
S. nephelus
– 0.47
e
460
S. spengleri
46
j
0.34
f
332
S. testudineus
46
j
0.82
f
802
Takifugu niphobles
44
c
0.42
c
411
T. rubripes
44
k
0.40
h
391
Tetractenos hamiltoni
– 0.51
d
499
Tetraodon cutcutia
– 0.41
i
401
T. nigroviridis
42
l
0.35
d
342
T. palembangensis
42
g
0.48
g
469
T. fluviatilis
42
g
0.40
g
391
Diodontidae
Chilomycterus schoepfi
– 0.85
e
831
Chilomycterus spinosus
50
j
1.00
f
978
Diodon holocanthus
– 0.78
e
763
D. hystrix
– 0.80
e
782
D. liturosis
– 0.85
c
831
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
49
FIGURA 1 - Histogramas de fluorescência relativa de núcleos corados com iodeto de
propídeo, submetidos a citometria de fluxo utilizando eritrócitos de galinha como
padrão interno. A curva relativa aos peixes é aproximadamente 2x maior do que da
galinha, em razão de sua concentração na amostral ser 2:1.
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
50
FIGURA 2 - Relação entre a área de eritrócito (A) e área nuclear (B) com o tamanho
de genoma. Ambas áreas também são correlacionadas positivamente (C). Todas as
correlações foram altamente significantes (todas r
2
> 0.72 e P < 0.0001).
CAPÍTULO II – TAMANHO DE GENOMA EM TETRAODONTIFORMES
51
FIGURA 3 - Efeito causal da variação do tamanho de genoma sobre o tamanho da
célula e dos cromossomos. Imagens de microscopia confocal de células vermelhas
do sangue: morfologia nuclear analisada após coloração com laranja de acridina (A–
E) e morfologia celular visualizada por contraste diferencial de interferência (F–J).
Metáfases mitóticas coradas com Giemsa de: Gallus gallus domesticus (K),
Sphoeroides spengleri (L), S. greeleyi (M), S. testudineus (N) e Chilomycterus
spinosus (O). Bar = 10µm.
52
4.3. CAPÍTULO III
IDENTIFICAÇÃO E DESCRIÇÃO DA OCORRÊNCIA DE CROMOSSOMOS Bs
RELACIONADA AO SEXO EM TETRAODONTIFORMES
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
53
Resumo
A análise citogenética em duas espécies simpátricas de baiacu, Sphoeroides
spengleri (Tetraodontidae) e Chilomycterus spinosus (Diodontidae) reveleou a
presença de 2n = 46 e 2n = 50 cromossomos, respectivamente. Além disso
cromossomos supranumerários foram detectados em ambas as espécies, contudo
em S. spengleri eles se apresentaram como microcromossomos variando de 0 – 3 e
sendo mais frequente em fêmeas do que em machos, reflexo de uma segregação
preferencial. Tal peculiaridade também foi presente em C. spinosus, porém o
cromossomo extra presente nesta espécie está restrito aos machos. Tais elementos
se mostraram parcial e/ou totalmente heterocromáticos, além do que análises
meióticas descartaram a hipótese de ser um cromossomo sexual em C. spinosus.
Em S. spengleri, a dupla FISH com sondas rDNA 5S e 18S evidenciou uma
organização não sintênica, com ambas as famílias multigênicas ocupando regiões
terminais. Diante da diversidade cariotípica e outras peculiaridades genéticas em
Tetraodontiformes, este corresponde ao segundo relato da ocorrência de
cromossomos B no grupo. No presente estudo aspectos sobre a sua acumulação,
manutenção e freqüência são discutidos, contribuindo para o conhecimento a cerca
destes parasitas genômicos.
Abstract
Cytogenetic analysis in two sympatric species of pufferfish, Sphoeroides
spengleri (Tetraodontidae) and Chilomycterus spinosus (Diodontidae) revealed the
presence of 2n = 46 and 2n = 50 chromosomes, respectively. Moreover
supernumerary chromosomes were detected in both the species, however in S.
spengleri they presented as microchromosomes varying of 0 – 3 and being more
frequent in females than in males, consequence of a preferential segregation. Such
peculiarity also was present in C. spinosus, but the extra chromosome in this specie
was restricted to the males. Such elements showed partial and/or total
heterochromatinized, beyond that meiotic analysis (discarded the hypothesis of a
sexual chromosome in C. spinosus. In S. spengleri, double–FISH with 5S and 18S
probes evidenced a not syntenical organization, with both multigene families
occupying terminal regions. Ahead of the karyotypic diversity and other genetic
peculiarities in Tetraodontiformes, this corresponds the second report of the
occurrence if chromosomes B in the group. In the present study aspects on their
accumulation, maintenance and frequency are argued, contributing for the
knowledge about this genomic parasite.
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
54
Introdução
A ordem Tetraodontiformes compreende aproximadamente 350 espécies
derivadas do grupo acantomorfa e agrupadas atualmente em 10 famílias, cada uma
delas representando um grupo monofilético bem definido (HOLCROFT, 2004). São
notáveis pelo excepcional grau de diversidade morfológica e modos de vida. A
diversificação evolutiva dos Tetraodontiformes tem sido acompanhada pela
tendência à redução, seja ela morfológica (especialmente elementos ósseos), ou
genômica com a intensa e independente compactação dos genomas dos
tetraodontídeos frente aos vertebrados (BRAINERD et al., 2001 e referências
contidas).
Uma extensiva diversidade cariotípica também caracteriza o grupo,
representada desde o padrão Perciformes (cariótipos compostos por 48
cromossomos acrocêntricos) presente em espécies de Triacanthidae (CHOUDHURY
et al., 1982), até cariótipos derivados com números diplóides variando de 28 a 52
nas outras famílias (Balistidae, Ostraciidae, Tetraodontidae e Diodontidae) (GALETTI
et al., 2006). Além disso, sistemas de cromossomos sexuais simples e múltiplos
também têm sido descritos para algumas espécies (SÁ-GABRIEL e MOLINA 2004 e
referências contidas).
Cromossomos supranumerários, amplamente distribuídos entre os eucariotos,
representam extras cromossomos dispensáveis, presentes em alguns indivíduos de
algumas populações em certas espécies. Como acontece em outros grupos, em
peixes Neotropicais a ocorrência de cromossomos Bs é um evento esporádico,
sobretudo em espécies marinhas (PAULS et al., 1996). Em Tetraodontiformes o
primeiro e único relato da presença destes elementos é em Sphoeroides spengleri
(Tetraodontidae) do litoral de São Paulo (ALVES et al., 2008).
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
55
No presente estudo nós estabelecemos uma caracterização cariotípica
baseada tanto em procedimentos convencionais quanto por citogenética molecular
em S. spengleri da costa Paranaense. Além disso é descrita a ocorrência de
cromossomos supranumerários em S. spengleri e em Chilomycterus spinosus
(Diodontidae). Aspectos da acumulação, manutenção e freqüência são discutidos,
contribuindo para o conhecimento a cerca destes parasitas genômicos neste grupo.
Material e Métodos
A amostra composta de 31 indivíduos de Sphoeroides spengleri (18 fêmeas e
13 machos) e 36 de Chilomycterus spinosus (15 fêmeas e 21 machos) foi coletada
na Baía de Paranaguá–PR (25º30’42’’ S e 48º25’15’’ O). Os espécimes foram
tombados no Museu de História Natural Capão da Imbuia (MHNCI) (Curitiba-PR,
Brasil). Os procedimentos usados neste trabalho estão de acordo com as normas do
Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Paraná
(UFPR 01/03BL) e com a atual legislação brasileira (CONCEA 1153/95).
Cromossomos mitóticos foram obtidos a partir do rim anterior utilizando
cultura de curto tempo (FENOCCHIO et al., 1991). Preparações meióticas a partir de
espermatócitos de um macho adulto foram realizadas conforme BERTOLLO e
MESTRINER (1998).
A localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram
detectadas usando nitrato de prata conforme HOWELL e BLACK (1980) e a
heterocromatina constitutiva foi localizada pelo bandamento C (SUMNER, 1972). A
nomenclatura cromossômica foi de acordo com LEVAN et al. (1964).
A hibridização fluorescente in situ (FISH) foi empregada para localizar os
genes de rDNA nos cromossomos. Foram utilizadas as sondas de rDNA 18S obtida
do peixe Prochilodus argenteus (HATANAKA e GALETTI Jr., 2004) e uma sonda de
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
56
rDNA 5S obtida de Leporinus elongatus (MARTINS e GALETTI Jr., 1999). As sondas
18S e 5S foram marcadas pela incorporação com biotina 14–dATP por nick
translation (BioNick
TM
Labeling System, Invitrogen) e com digoxigenina 11–dUTP
(Roche Applied Science) por PCR Polymerase Chain Reaction, respectivamente. Os
sinais de hibridização foram detectados usando os conjugados streptavidina–
fluoresceína isotiocianato (FITC) e anti–digoxigenina–rodamina. Os cromossomos
foram contracorados com iodeto de propídeo (IP) (25 µg/mL) e DAPI (0,4 mg/mL) e
analisados com um microscópio de epifluorescência Zeiss Axiophot. O software
Case Data Manager Expo 4.0 (Applied Spectral Imaging) foi usado para a captura
das imagens.
Resultados
Análises de duas espécies simpátricas de baiacus mostrou dois distintos
padrões cariotípicos relacionados principalmente com a presença de cromossomos
supranumerários. Comparativamente em S. Spengleri os Bs se apresentaram como
microcromossomos variando intraindividualmente de 0 a 3, enquanto que em C.
spinosus o B, exclusivo de machos, é compatível em morfologia com o par 25 do
complemento padrão.
Sphoeroides spengleri
A população de S. spengleri proveniente da baía de Paranaguá – PR
apresentou um cariótipo padrão com 2n=46 cromossomos, em concordância com
estudos anteriores (BRUM et al., 1995; ALVES et al., 2008), mas com diferente
fórmula cariotípica: 12 pares de metacêntrico/submetacêntrico e 11 pares de
subtelocêntrico/acrocêntrico cromossomos. Em adição, 100% dos indivíduos
apresentaram microcromossomos extras, os quais variaram intraindividualmente em
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
57
número de 0 a 3 (Figura 1 e 2A, respectivamente). Entretanto, machos apresentaram
no máximo 1B, enquanto que em fêmeas foi muito mais freqüente (62,3%) a
presença de 2 Bs, embora 1B (32,5%) e 3 Bs (5,2%) também fizeram parte da
amostra de células analisadas deste sexo (Tabela 1). O bandamento C mostrou a
presença de sutis marcações centroméricas sobre todos os cromossomos, no braço
curto de um par de cromossomos submetacêntrico (coincidentes em localização com
as RONs) e os cromossomos B se mostraram totalmente heterocromáticos (Figura
2B). Os sítios de rDNA 45S foram evidenciados na região telomérica do braço curto
do par 2 (Figura 1 e 2C, respectivamente). Em adição, não foi detectada uma
organização sintênica para as famílias ribossomais, uma vez que os sítios de rDNA
5S foram localizados em região terminal do braço curto de um par de cromossomos
subtelocêntricos não identificado (Figura 2D).
Chilomycterus spinosus
No presente estudo um total de 412 metáfases de 36 espécimes de C.
spinosus foram analisadas (Tabela 2). Todos os exemplares fêmeas (15 indivíduos)
apresentaram o cariótipo básico com 2n=50 cromossomos diferenciados em
4m+20sm+16st+10a (Figura 3A). No entanto, 90,5% dos machos (19 indivíduos)
mostraram o cariótipo padrão mais a presença de um cromossomo acrocêntrico
supranumerário (Figura 4). Análises meióticas (diplóteno) de machos com o 2n=51
revelaram 25 bivalentes e um univalente correspondendo ao cromossomo B (Figura
4C). A heterocromatina constitutiva foi evidenciada nos centrômeros de todo o
complemento, coincidentes com as RONs e ocupando quase todo um braço de
certos cromossomos como o par 1 e alguns submetacêntricos. Em adição, o
cromossomo B mostrou bandas C sobre ambos, centrômero e telômero (Figura 4B).
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
58
O mapeamento cromossômico de genes ribossomais nesta espécie está descrito no
Capítulo I.
Discussão
Inúmeros estudos previamente realizados com espécies do gênero
Sphoeroides do Atlântico (BRUM, 1995; BRUM, 2000; SÁ-GABRIEL e MOLINA,
2005; NOLETO et al., 2006) têm indicado que este gênero mostra uma evidente
conservação numérica, com todas as espécies apresentando 2n = 46 mas distinções
quanto ao número fundamental, atribuídas a inversões pericêntricas. Entre os
Tetraodontiformes, o valor diplóide 46 corresponde a uma simplesiomorfia para as
famílias Balistidae, Ostraciidae, Tetraodontidae e Diodontidae (CHOUDHURY et al.,
1982; BRUM et al., 1995). Por outro lado, as espécies de Diodontidae, mostram uma
clara diversidade numérica (SÁ-GABRIEL e MOLINA, 2005 e referências contidas).
Os números diplóides maiores do que 46, como em C. spinosus (2n = 50)
representam o estado derivado, e provavelmente sua origem tenha ocorrido por
fissão cêntrica, o mesmo rearranjo cromossômico envolvido em Ostraciidae (ARAI,
1983).
Em S. spengleri a localização da maior família de rDNA foi visualizada por Ag-
RONs e com uma sonda de rDNA 18S em região telomérica de um único par
cromossômico, como na maioria dos peixes (AMEMIYA e GOLD, 1986). Os sítios 5S
não apareceram em sintenia com o 45S, situação já detectada anteriormente em
outras espécies de baiacu (FISHER et al., 2000; MANDRIOLI e MANICARDI, 2001;
NOLETO et al., 2007).
Um peculiar aspecto encontrado nas espécies do presente estudo
corresponde à divergência do padrão de bandamento C, com uma pequena
quantidade de regiões heterocromáticas em S. spengleri em contraste com
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
59
conspícuas bandas C em C. spinosus. A redução no conteúdo de DNA parece ser
um mecanismo característico envolvido na evolução genômica dos tetraodontídeos
(veja Capítulo II), e neste contexto provavelmente as diferenças no tamanho do
genoma estão associadas com uma significante perda de heterocromatina em
alguns grupos como por exemplo em Tetraodontidae (KLOC e ZAGRODZINSKA,
2001; veja Capítulo IV). Isto se torna evidente na comparação dos cariótipos das
duas famílias analisadas, os quais apresentam notáveis diferenças quanto ao
tamanho dos cromossomos (Figura 3 K-O, Capítulo II). Ambas espécies mostraram
cromossomos supranumerários total ou parcialmente heterocromáticos, situação
comumente encontrada na qual a heterocromatinização de extra elementos
(imprinting genômico) pode representar a base para a diferenciação destes extras
cromossomos (THOMAS, 1995), embora haja casos de cromossomos B
eucromáticos (OLIVEIRA e FORESTI, 1993). No sentido de neutralizar a dispersão
de parasitas genômicos, a heterocromatinização possivelmente co-evoluiu como um
mecanismo de defesa do genoma hospedeiro, uma vez que a metilação do DNA
nestas regiões pode identificar e manter o estado heterocromático e assim
permitindo um aumento na taxa mutacional (degradação) de seqüências parasitas
(YODER et al., 1997).
Em peixes, cromossomos B têm sido encontrados em aproximadamente 5%
dos peixes Neotropicais já analisados citogeneticamente (OLIVEIRA et al., 2008).
Eles têm sido descritos predominantemente em certos grupos, embora a maior
freqüência de cromossomos B em alguns táxons provavelmente reflete a intensidade
e facilidade técnica com as quais cada grupo tem sido explorado. Nas espécies
marinhas a ocorrência de cromossomos supranumerários ainda é menos comum,
sobretudo em Tetraodontiformes, em vista da sua diversidade cariotípica e
genômica.
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
60
A presença de cromossomos B detectados em ambas espécies do presente
estudo mostrou interessantes peculiaridades relacionadas com uma segregação
preferencial. S. spengleri apresentou uma distorção na freqüência, muito mais
comum em fêmeas do que em machos, visto que em C. spinosus o cromossomo B
foi restrito aos machos e ausente em fêmeas. Muitos cromossomos supranumerários
registram uma taxa de transmissão claramente maior do que 0.5 (acumulação), uma
das mais importantes propriedades de cromossomos B parasitas e que os qualifica
como elementos egoístas. Acumulação meiótica tem sido descrita para fêmeas em
várias espécies de plantas e animais sendo baseada na assimetria intrínseca de
produtos meióticos (um corpo polar é naturalmente inviável), o que oferece uma rota
de escape usada por parasitas genéticos que se comportam como univalentes na
meiose. S. spengleri provavelmente tem estes cromossomos na linhagem
germinativa de fêmeas e machos, mas apresenta uma forte tendência de
acumulação através das fêmeas e são parcialmente eliminados nos machos, uma
situação similar reportada em pintassilgos (PIGOZZI e SOLARI, 1998).
Em contrapartida, C. spinosus apresentou um cromossomo B exclusivo de
machos. Análises do comportamento meiótico de vários tipos de univalentes (X, As e
Bs cromossomos) em machos sugeriu a existência de “estratégias cromossômicas”
para a adaptação à univalência (REBOLLO et al., 1998). Assim, similar ao
comportamento do cromossomo X em gafanhotos (AULT, 1986), o cromossomo B
de C. spinosus teria um comportamento estático, permanecendo em um dos pólos
sem se movimentar. Tal fenômeno sugere a existência de mecanismos de
ancoragem no fuso mitótico (GORDON et al., 2001) que aumentaria a efetividade da
transmissão. A outra característica deste cromossomo foi a freqüência de 100% em
indivíduos com 2n = 51 cromossomos, ou seja, uma ausência de variação
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
61
intraindividual, indicando grande estabilidade deste cromossomo no genoma da
espécie.
O número máximo de cromossomos B que uma espécie é capaz de tolerar
varia grandemente e pode envolver um significante acréscimo no conteúdo de DNA
nuclear, embora em animais seja raro encontrar indivíduos com mais do que três
cromossomos Bs em populações naturais (CAMACHO, 2000). Micro Bs têm a
tendência de serem mitoticamente instáveis, o que justifica uma variação
intraindividual. No entanto o polimorfismo encontrado em S. spengleri pode ser
melhor interpretado como um sistema dinâmico no qual a freqüência flutua
continuamente devido à uma disputa coevolutiva entre A e B cromossomos,
envolvendo uma variedade de mecanismos de ataque e defesa de ambos os lados
(FRANK, 2000). Em adição um sistema de microcromossomos Bs já foi descrito para
Sphoeroides spengleri da baía de Ubatuba – SP (ALVES et al., 2008). Este cenário
pode representar uma comum origem deste cromossomo, além de que a recente
formação dos estuários ao longo da costa brasileira (SUGUIO et al., 1985) suporta
esta hipótese.
Em vista da atualmente bem explorada, natureza do genoma dos
Tetraodontiformes, investigações a respeito da composição e estrutura de
cromossomos Bs representam interessantes questões a serem estudadas. Análises
adicionais envolvendo o isolamento e caracterização de seqüências repetitivas,
mapeamento cromossômico de elementos transponíveis e microdissecção auxiliarão
a esclarecer prováveis origens destes extras elementos além de contribuir para uma
melhor perspectiva da evolução genômica e cariotípica.
Referências
As referências bibliográficas deste capítulo estão reunidas no final desta tese.
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
62
FIGURA 1 - Cariótipo de Sphoeroides spengleri em coloração convencional
(Giemsa). Em destaque o par cromossômico portador das Ag-RONs. A barra
representa 5 µm.
FIGURA 2 - Metáfases de S. spengleri: (A) corada com Giemsa destacando a
presença de 3 microcromossomos Bs (setas); (B) Bandamento C evidenciando os
sítios Ag-RONs (cabeça de setas) e cromossomos Bs (setas). Os asteriscos indicam
heterocromatinas detectadas por FISH com sondas C
0
t-1 (Capítulo IV); (C) FISH
mostrando a localização do rDNA 18S e (D) DUPLA-FISH comprovando a não
sintenia das famílias ribossomais 5S (setas) e 45S (cabeça de setas).
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
63
TABELA 1 - Freqüência de cromossomos B relacionada com o sexo em S. spengleri
da Baía de Paranaguá-PR. (N) Número de peixes analisados.
*variação intraindividual
TABELA 2 - Ocorrência de cromossomo B em C. spinosus da Baía de Paranaguá-
PR. (N) Número de peixes analisados.
Células* (n°) com
SEXO N 0 B 1 B 2 Bs 3 Bs
Total
F
18 25 48 4 77
M
13 9 52 61
Total 31 9 77 48 4 138
Indivíduos (n°) com
SEXO N 0 B 1 B
F
15 15
M
21 2 19
Total 36 17 19
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
64
FIGURA 3 - Cariótipos de C. spinosus fêmea em coloração convencional com
Giemsa (A) e bandamento C (B). A barra representa 5 µm.
A
B
CAPÍTULO III – CROMOSSOMOS Bs
65
FIGURA 4 - Cariótipos de C. spinosus macho em coloração convencional com
Giemsa (A) destacando o par Ag-RONs (caixa) e bandamento C (B). Em (C) meiose
I (diplóteno final) com 25 bivalentes e 1 univalente correspondente ao cromossomo B
(seta). A barra representa 5 µm.
A
B
C
66
4.4. CAPÍTULO IV
ANÁLISE COMPARATIVA DE SEQÜÊNCIAS REPETITIVAS COM FISH E GISH
EM TETRAODONTIFORMES: CONCERTO EM C MENOR
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
67
Resumo
DNAs repetitivos têm sido amplamente utilizados em mapeamentos
cromossômicos, identificação de rearranjos cromossômicos e análise evolutiva de
cariótipos. Aqui nós realizamos um estudo comparativo das heterocromatinas
enfocando a sua equilocalidade, sua divergência entre espécies e sua relação com o
tamanho de genoma em Tetraodontiformes. Uma análise composicional com
fluorocromos base preferenciais em Sphoeroides greeleyi e Sphoeroides testudineus
corroborou com modelos de evolução em concerto em seqüências repetitivas. O
mapeamento cromossômico com DNAs C
0
t-1 (DNA enriquecido com seqüências alta
e moderadamente repetitivas) em S. greeleyi, S. spengleri e Chilomycterus spinosus
mostrou a predominância destes elementos repetitivos principalmente sobre os
centrômeros de todas as espécies. A hibridização genômica in situ (GISH) utilizando
como sonda o DNA genômico total de S. testudineus (Tetraodontidae) sobre os
cromossomos de C. spinosus (Diodontidae) revelou inúmeros sítios de homeologias,
exceto nas regiões heterocromáticas, o que confirma o fato das heterocromatinas
serem um componente intimamente relacionado com a variação do C-value. Em
vista do atual interesse em genômica de baiacus, novas contribuições ao
conhecimento dos seus genomas e cariótipos são fornecidas e discutidas sob uma
perspectiva evolutiva.
Abstract
The repetitive DNAs have been widely used in chromosome mapping,
identification of rearrangements and in karyotypes evolution analysis. Here we carry
through a comparative study of the heterochromatin, focusing their equilocality, the
divergence between species and the relation with the genome size in
Tetraodontiformes. A composicional analysis with base-preferential fluorochromes in
Sphoeroides greeleyi and Sphoeroides testudineus corroborated with models of
concerted evolution in repetitive sequences. The chromosome mapping with C
0
t-1
DNAs (DNA enriched for highly and moderately repetitive DNA sequences) in S.
greeleyi, S. spengleri and Chilomycterus spinosus showed to the predominance of
these repetitive elements on centromeres of all the species. The genomic in situ
hybridization (GISH) with total genomic DNA of S. testudineus (Tetraodontidae) on
the chromosomes of C. spinosus (Diodontidae) revealed numerous homeologies,
except in heterochromatic regions. These results confirm the fact, which the
heterochromatin to be a component closely related with the variation of the C-value.
In view of the current interest in the comparative genomics, new contributions to the
knowledge of their genomes and karyotypes are supplied and discussed under an
evolutive perspective.
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
68
INTRODUÇÃO
A heterocromatina media diversas funções no núcleo da célula, incluindo a
função centromérica, silênciamento gênico e organização nuclear. A estrutura
condensada das heterocromatinas pericentroméricas está associada com a regular
disposição de nucleossomos, uma organização que em parte pode estar associada
com a seqüência do DNA repetitivo. Desde seu descobrimento (HEITZ, 1928), a
heterocromatina tem sido objeto de discussão. Compensação de dose, coesão de
cromátides irmãs e manutenção de telômeros são funções específicas em adição a
outros efeitos, como eliminação de DNA (diminuição de cromatina), replicação
diferencial e variegação por efeito de posição. Além disso este componente
genômico apresenta padrões preferenciais de distribuição característicos em
cariótipos, embora possa ocorrer virtualmente em qualquer posição do cromossomo,
além do que pode contribuir para o tamanho do genoma dada sua vasta capacidade
de amplificação. Neste contexto, a grande variação da porção heterocromática nos
genomas eucarióticos tem sido o fator responsável pelas diferenças no C-value entre
espécies (CAVALIER-SMITH, 1985; BRENNER et al., 1993).
As porções variáveis de famílias de DNA repetitivo no genoma, geralmente
correspondem a regiões de heterocromatina constitutiva, reveladas pelo
convencional bandamento C (SUMNER, 1972). Outros métodos de bandamento
cromossômico mostram que tais seqüências podem ser qualitativamente uniformes
ocupando a mesma região cromossômica em cromossomos não homólogos
(equilocalidade) ou a situação oposta, na qual existe uma distinção entre domínios
cromossômicos (heterogeneidade) (GREILHUBER e LOIDL, 1983; SCHWEIZER e
LOIDL, 1987). O conceito de equilocalidade tem recebido adicional suporte a partir
de estudos que, além das convencionais bandas C, têm usado o mapeamento
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
69
cromossômico de DNAs repetitivos como poderosas ferramentas para definir a
localização e composição das regiões heterocromáticas (YAMADA et al., 2006).
Como parte de um esforço na caracterização cromossômica de
Tetraodontiformes Neotropicais, neste estudo nós apresentamos uma investigação
qualitativa da heterocromatina constitutiva, baseada em uma combinação de
técnicas de citogenética molecular. O DNA C
0
t-1 (DNA enriquecido por seqüências
alta e moderadamente repetitivas) foi isolado e localizado in situ no genoma de três
espécies de baiacus. Em adição, hibridização genômica in situ (GISH) foi realizada
com o objetivo de investigar possíveis homeologias entre genomas de diferentes
tamanhos, e assim auxiliando a entender como tais seqüências contribuem na
evolução genômica.
Material e Métodos
Amostra e preparações cromossômicas
Foram analisados 32 espécimes de Sphoeroides greeleyi (21 fêmeas e 11
machos), 31 de Sphoeroides spengleri (19 fêmeas e 12machos), 26 de Sphoeroides
testudineus (17 fêmeas e 9 machos) e 21 de Chilomycterus spinosus (9 fêmeas e 12
machos) todos coletados na Baía de Paranaguá–PR (25º30’42’’ S e 48º25’15’’ O).
Os procedimentos usados neste trabalho estão de acordo com as normas do Comitê
de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Paraná (UFPR
01/03BL) e com a atual legislação brasileira (CONCEA 1153/95). Preparações
cromossômicas foram obtidas a partir do rim anterior utilizando cultura de curto
tempo e preparação convencional airdrying (FENOCCHIO et al., 1991). A
nomenclatura cromossômica foi de acordo com LEVAN et al. (1964).
Detecção de regiões heterocromáticas
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
70
A heterocromatina constitutiva foi analisada tanto pelo bandamento C
(SUMNER, 1972), quanto pela dupla coloração com emprego dos fluorocromos
Cromomicina A
3
+ DAPI (SCHWEIZER, 1980), indicativos de regiões GC e AT ricas,
respectivamente.
Extração de DNA e isolamento de DNA C
0
t-1
A extração de DNA genômico foi conforme SAMBROOK, FRITSCH e
MANIATIS (1989), e está detalhada no item 3.2.6.A. C
0
t-1 DNA foi isolado conforme
WEI et al. (2005). Brevemente, o DNA genômico foi diluído para uma concentração
final de 300 ng/μL em uma solução de NaCl 0,3 mol/L. A amostra foi autoclavada
(121 °C, 1,034 x 10
5
Pa) por 5 min para obter fragmentos entre 100 e 1000 pb. O
DNA foi desnaturado a 95 °C por 10 min e colocado a 65 °C para re-anelamento, e
posteriormente tratado com nuclease S1 (Promega) a 37 °C por 8 min. Os
fragmentos de DNA obtidos foram usados como sondas para hibridização
fluorescente in situ (FISH).
Hibridização Fluorescente in situ (GISH)
O protocolo seguido foi conforme (SCHWARZACHER et al., 1992), e está
detalhado no item 3.2.6.B. Brevemente, esta metodologia em relação à FISH
tradicional, apresenta a adição de um DNA bloqueador (genoma da espécie
receptora da sonda) no mix de hibridização na proporção 10:1, respectivamente. A
estringência da hibridização e dos banhos pós- também sofreram alterações para
50%, (2xSSC + Formamida 5% a 37 °C). As sondas C
0
t-1 e de DNA genômico foram
marcadas pela incorporação com biotina 14–dATP por nick translation (BioNick
TM
Labeling System, Invitrogen) e os sinais de hibridização foram detectados usando os
conjugados streptavidina–fluoresceína isotiocianato (FITC). Os cromossomos foram
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
71
contracorados com iodeto de propídeo (IP) (25 µg/mL) ou DAPI (0,4 mg/mL) e
analisados em microscópio de epifluorescência Zeiss Axiophot. O software Case
Data Manager Expo 4.0 (Applied Spectral Imaging) foi usado para a captura das
imagens.
Resultados
Tanto nas espécies do gênero Sphoeroides (Tetraodontidae) quanto em
Chilomycterus spinosus (Diodontidae) foram evidenciadas bandas C positivas
localizadas principalmente em regiões pericentroméricas. Adicionalmente alguns
pares de cromossomos mostraram seus braços curtos parcial ou totalmente
heterocromáticos, além das RONs se mostrarem também heterocromáticas (Figura
1A, B, C). A dupla coloração CMA
3
/DAPI em S. testudineus e S. greeleyi foi
resolutiva em evidenciar a riqueza relativa de bases correspondente às bandas C.
Exceto nas RONs, cuja região apresentou uma banda CMA
3
positiva e DAPI
negativa, as demais bandas C se mostraram DAPI+ (ricas pares AT) (Figura 2). Em
S. greeleyi uma maior compartimentalização da cromatina foi observada no par 18
(portador das RONs) (Figura 2C).
A clivagem do DNA genômico e isolamento do C
0
t-1 são mostrados na Figura
3. Esta metodologia foi realizada nas espécies: S. greeleyi, S. spengleri e C.
spinosus. O DNA genômico íntegro tem seu tamanho acima de 20 kb (dado não
mostrado, mas baseado em comparações com λ DNA), e torna-se clivado entre 100-
2000 pb por autoclavagem. O DNA C
0
t-1 isolado passível de localização in situ teve
o tamanho de seus fragmentos entre 100-200 pb aproximadamente. A FISH com tais
fragmentos localizou estas seqüências principalmente congruentes às
heterocromatinas centroméricas (Figura 4). Em S. spengleri os sinais foram pálidos
exceto em um par de cromossomos (Figura 4B), que apresentou conspícuas bandas
C sobre o braço curto (Figura 2B - Capítulo III). Em S. greeleyi sinais coincidiram
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
72
com todas as bandas C (Figura 4D) da mesma forma em C. spinosus, incluindo as
heterocromatinas do par 1, foram evidenciadas (Figura 5). Os DNAs C
0
t-1 se
mostraram espécie-específicos, visto que a hibridização de sondas de uma espécie
sobre outras e vice-versa não gerou sinais positivos.
A hibridização genômica in situ (GISH) foi realizada utilizando o genoma total
de S. testudineus sobre cromossomo mitóticos de C. spinosus. Foram testadas
hibridizações utilizando somente o genoma doador (de S. testudineus) como sonda
(Figura 6) e na presença de um genoma competidor (de C. spinosus) adicionado a
solução de hibridização (Figura 7). A presença do competidor se mostrou essencial
para detectar diferenças entre os dois genomas, revelando sinais negativos
sobretudo na porção heterocromática (centrômeros e região das RONs) dos
cromossomos de C. spinosus. A GISH também se mostrou negativa sobre o
cromossomo B de C. spinosus, indicando uma ausência de homeologia entre este
elemento e o menor genoma (sonda). Isto é totalmente esperado visto que este
elemento é intrínseco ao genoma maior e com evolução independente. A coloração
de fundo com iodeto de propídeo mostrou melhores contrastes em comparação com
DAPI.
Discussão
A formação das heterocromatinas e sua amplificação dentro e entre genomas
estão relacionados com a estrutura e o processo replicativo de pequenas
seqüências de DNA repetitivo. Uma expansão de DNA pode ser disparada
facilmente por pequenas repetições (CAG)
n
e (CGG)
n
, as quais têm potencial em
promover erros na replicação e/ou recombinações desiguais (HANCOCK, 1996).
Este fenômeno de dispersão em um domínio cromossômico específico também pode
ter sua origem a partir de um rearranjo cromossômico. Um modo comum de
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
73
evolução cromossômica é a formação de braços curtos heterocromáticos
(progressiva acumulação de seqüências repetitivas) sobre cromossomos que, em
espécies relacionadas, se mostram como acrocêntricos ou telocêntricos (JOHN et
al., 1985). Dado o padrão de distribuição das bandas C nas espécies das famílias
Diodontidae e Tetraodontidae observado no presente estudo, permite sugerir que a
situação descrita acima faz parte da evolução cromossômica em Tetraodontiformes,
uma vez que membros da família Triacanthidae apresentam cariótipos compostos
por 48 cromossomos acrocêntricos (CHOUDHURY et al., 1982). Portanto, o acúmulo
de heterocromatina juntamente com as inversões pericêntricas (GALETTI et al.,
2000) contribuem para a diversificação cariotípica e competem na explicação das
variações de NF encontradas não só em membros do grupo Tetraodontiformes mas
também, e principalmente, em Perciformes marinhos.
Os genomas nucleares de vertebrados superiores são mosaicos isocóricos
(seqüências >100 kb homogêneas na sua composição de bases), tais como as cinco
famílias de isocores em mamíferos, L1, L2, H1, H2 e H3, em contraste com os de
peixes anfíbios que se apresentam mais homogêneos (MEDRANO et al., 1988).
Análises fluorescentes com a dupla coloração CMA
3
/DAPI tornam-se mais
resolutivas quanto a composição de domínios específicos, pois a intensidade do
sinal fluorescente é otimizada devido a competição entre os fluorocromos por
regiões adjacentes. Aqui esta metodologia em S. greeleyi e S. testudineus
evidenciou a riqueza de bases AT em praticamente todas as bandas C, exceto nas
RONs.
Não somente dados do presente estudo mas inúmeros outros trabalhos
indicam que grupos cromossomos em uma dada espécie, geralmente tendem a
acumular heterocromatinas com similar tamanho, composição e localização (JOHN
et al., 1985). Isto suporta o fato de que mudanças que afetam o conteúdo
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
74
heterocromático de um genoma não somente atuam de forma equilocal mas também
são claramente não aleatórias. Porém nem todos domínios heterocromáticos que
ocupam similar posição sobre cromossomos de uma espécie, concordam em
tamanho e/ou composição, logo esta heterogeneidade sugere que a equilocalidade
definida por Heitz, não se aplica para estrutura. Conforme o modelo de Rabl
(SCHWEIZER et al., 1987) DNAs repetitivos dentro de uma dada banda C podem
ser transferidos para outros sítios equilocais como conseqüência de uma específica
disposição espacial de telômeros, centrômeros e braços cromossômicos no núcleo
interfásico. Neste contexto, a partir de um segmento primário rico em AT, a
dispersão destas seqüências nos baiacus foi facilitada por sua localização (braços
curtos) conforme mecanismos de amplificação em concerto, incluindo conversão
gênica, recombinação desigual e atividade de transposons (DOVER, 2002). Este
último pode ter sido o responsável no estabelecimento do padrão de domínios
presentes no par 18 de S. greeleyi.
Diante do escopo de investigação deste estudo, os dados também suportam o
fato de que a evolução em concerto também é uma característica geral de famílias
de DNA repetitivo centromérico. Embora a metodologia C
0
t-1 não evidencie a
composição de bases, as propriedades de reassociação de tais seqüências nos
permitem inferir uma similaridade, o que em última análise reflete a homogeneização
delas dentro do genoma de C. spinosus. FERREIRA e MARTINS (2007), tiveram
sucesso na clonagem de DNAs C
0
t-1 de Oreochromis niloticus, e o alinhamento de
tais seqüências via GenBank - NCBI, as identificou principalmente como sendo
elementos de transposição. Esta peculiaridade possivelmente seja comum em
peixes, uma vez que esta classe de DNA repetitivo também já foi detectada em
centrômeros de peixes Antárticos (OZOUF-COSTAZ et al., 2004) e no baiacu
Tetraodon nigroviridis (DASILVA et al., 2002; BOUNEAU et al., 2003; FISCHER et
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
75
al., 2004). Em adição os DNAs C
0
t-1 se apresentaram como bons marcadores
citotaxonômicos, reflexo da evolução em unidades evolutivas distintas, fato
confirmado pela técnica de GISH.
No presente estudo foi realizado um mapeamento cromossômico do DNA
genômico de S. testudineus (Tetraodontidae – 0,82 pg) nos cromossomos de C.
spinosus (Diodontidae – 1,00 pg). O propósito da hibridização genômica foi
investigar as diferenças entre tamanhos de genoma em Tetraodontiformes. A
utilização do DNA competidor foi de fundamental importância no estabelecimento de
um padrão passível de análise. A utilização desta estratégia se baseou no fato de
que em geral, espécies filogeneticamente distantes apresentam poucas seqüências
de DNA repetitivo em comum, e conseqüentemente é necessário ponderar a
estringência e a razão DNA bloqueio x sonda.
A GISH mostrou que as regiões bandas C+ de C. spinosus não responderam
à hibridização. Isto mostra que hibridizações futuras podem ser otimizadas ao utilizar
como competidor DNAs C
0
t-1 ao invés do genoma total. Além disso, tal resultado
torna a heterocromatina, um dos candidatos a explicar a diferença de tamanho de
genoma entre as espécies, muito embora deleções exageradas detectadas
sobretudo na diminuição do comprimento ou perda total de íntrons (ELGAR et al.,
1999; LOH et al., 2008), tem sido o mecanismo preferido para explicar a
compactação genômica dos tetraodontídeos. Uma significante perda de
heterocromatina provavelmente está correlacionada com diferenças no tamanho de
genoma em alguns grupos (KLOC e ZAGRODZINSKA, 2001) como ocorre em
Tetraodontidae.
A variação no conteúdo de DNA satélite e mudanças no tamanho do genoma
são consistentes com teorias que explicam a expansão/contração de genomas pela
adição/deleção de seqüências repetitivas (HARTL, 2000). Tal consideração torna-se
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
76
evidente em comparações entre os cariótipos das diferentes famílias analisadas e a
notável diferença no tamanho dos cromossomos, por exemplo S. spengleri
(Tetraodontidae) e C. spinosus (Diodontidae) (veja Figura 3 - Capítulo II). As RONs
de C. spinosus também foram uma região na qual não houve hibridização.
Possivelmente, além dos blocos repetitivos de genes ribossomais estarem
empacotados dentro de heterocromatinas, a divergência na seqüência de
espaçadores intergênicos entre as espécies provavelmente seja suficiente para tal
resultado, já que Diodontidae se separou do seu grupo irmão Tetraodontidae há 70
milhões de anos (NEAFSEY e PALUMBI, 2003).
Citologicamente detectável ou não, a heterocromatina participa da imensa
variação do C-value entre vertebrados (JOHN, 1988). O tamanho crítico detectado
para a detecção de bandas C+ está entre 10,5 e 17,5 Mb (KUNZE et al., 1996;
WEICHENHAN et al., 1998), de modo que a falta de conspícuas bandas C, como em
S. spengleri, não indica a ausência de heterocromatina. Mesmo nos menores
genomas de vertebrados, os tetraodontídeos têm um mínimo de heterocromatina
(~10%) (ELGAR et al., 1996 BRENNER et al. 1993), que representa um componente
indispensável na regulação e expressão gênica durante o desenvolvimento (REDI et
al., 2001).
A porção heterocromática de genomas representa um fator muito ainda a ser
explorado em questões evolutivas, dada sua relevância em diversos aspectos
estruturais e funcionais. A clonagem de famílias de DNA repetitivo é de fundamental
necessidade, pois dados sobre a composição e localização in situ auxiliarão a
esclarecer certas lacunas deixadas, igualmente como a promissora estratégia de
mapear Retrotransposons. Os Tetraodontiformes são um dos grupos atualmente nos
quais se concentra inúmeros projetos genômicos, pois servem de referência para
estudos em genomas maiores e mais complexos. Além das análises em um genoma
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
77
compacto serem otimizadas, o entendimento da estrutura, fenômenos e mecanismos
servem de base na elucidação de cenários evolutivos em outros grupos.
Referências
As referências bibliográficas deste capítulo estão reunidas no final desta tese.
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
78
FIGURA 1 - Cariótipos de S. greeleyi (A), S. testudineus (B) e C. spinosus (C)
evidenciando o padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva. A barra
representa 5 µm.
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
79
FIGURA 2 - Cariótipos de S. testudineus (A-B) e S. greeleyi (C-D) após dupla
coloração CMA
3
/DAPI, mostrando sítios quanto a riqueza de base GC e AT
respectivamente. Em destaque os pares portadores das RONs com os sítios de
rDNA 18S. Em (C) as setas indicam uma compartimentalização de domínios AT.
FIGURA 3 - Preparação do DNA C
0
t-1 de C. spinosus. (M) Marcador Low mass; (1)
DNA genômico total de C. spinosus; (2) DNA genômico após ser autoclavado 5 min;
(3) DNA C
0
t-1.
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
80
FIGURA 4 - FISH com DNA C
0
t-1 em suas respectivas espécies: (A-B) S. spengleri e
(C-D) S. greeleyi. As setas indicam sinais fluorescentes sobre uma das poucas
regiões onde o bandamento C evidenciou bandas conspícuas (ver Figura 2 -
Capítulo III).
FIGURA 5 - Distribuição de DNAs repetitivos em cromossomos de C. spinosus
revelado por FISH com sonda DNA C
0
t-1.
CAPÍTULO IV – AS HETEROCROMATINAS NOS TETRAODONTIFORMES
81
FIGURA 6 - Hibridização genômica in situ (GISH) sem a presença de um DNA
competidor utilizando sonda de DNA genômico de S. testudineus sobre os
cromossomos de C. spinosus.
FIGURA 7 - GISH na presença de um DNA competidor. As setas indicam sinais
negativos de hibridização sobre os principais sítios heterocromáticos de C. spinosus.
O asterisco indica o cromossomo B.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
82
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo apresentou uma abrangente análise citogenética em quatro
espécies de baiacus: Sphoeroides greeleyi, Sphoeroides spengleri e Sphoeroides
testudineus (Tetraodontidae) e Chilomycterus spinosus (Diodontidae) todas com
ocorrência no complexo estuarino Baía de Paranaguá-PR. As análises tiveram seu
enfoque tanto na caracterização e comparação citogenética das espécies, utilizando
metodologias convencionais e mapeamento cromossômico com sondas, desde as
usuais subunidades ribossomais às espécie-específicas, como as de DNAs C
0
t-1 e
genômicas. Aspectos específicos inerentes à algumas espécies também foram o
escopo de certos Capítulos, como a ocorrência de cromossomos B em Sphoeroides
spengleri e Chilomycterus spinosus e aspectos do tão famoso e estudado genoma
dos Tetraodontiformes. As discussões tiveram envolvidas por perspectivas
biogeográficas, citotaxonômicas e evolutivas.
Todas as espécies do gênero Sphoeroides apresentaram 2n = 46
cromossomos, um caráter considerado plesiomórfico para as famílias Balistidae,
Ostraciidae, Tetraodontidae e Diodontidae (CHOUDHURY et al., 1982; BRUM et al.,
1995). As distinções quanto ao número fundamental e, portanto, diversificação
cariotípica, são explicadas por inversões pericêntricas e acúmulo de heterocromatina
(GALETTI et al., 2000), a qual foi localizada sobretudo em centrômeros e regiões
terminais de braços curtos. Porém, em C. spinosus (Diodontidae) o 2n = 50
cromossomos provavelmente teve sua origem por fissão cêntrica, o mesmo rearranjo
cromossômico envolvido na família Ostraciidae (ARAI, 1983).
O mapeamento cromossômico com as sondas ribossomais 5S e 18S,
comumente utilizadas na citogenética de peixes, revelou padrões conservados,
como a ocorrência de ambas as famílias multigênicas em 1 par de cromossomos e a
não sintenia entre elas. Contudo, em C. spinosus (Diodontidae) os genes 5S foram
CONSIDERAÇÕES FINAIS
83
localizado em dois pares cromossômicos distintos, fato provavelmente relacionado
com a evolução do tamanho do genoma.
Peixes da família Tetraodontidae têm-se tornado modelos puramente
genômicos, devido a notável compactação de seus genomas, reflexo de uma perda
excessiva de DNA repetitivo e íntrons (LOH et al., 2008). Aqui nós usamos a
citometria de fluxo para estimar o tamanho do genoma, metodologia jamais
empregada em baiacus da região Neotropical, sendo evidenciado que S. spengleri
representa o menor genoma entre os vertebrados até então com 0.34 pg (332 Mb). A
diferença no tamanho de genoma em Tetraodontiformes não está relacionada com o
nível de ploidia, além de que nossas análises mais uma vez demonstraram a íntima
relação do tamanho da célula e do núcleo de eritrócitos com o tamanho do genoma.
Em peixes, indicações de natureza adaptativa da divergência no conteúdo de DNA
está o fato de que espécies de água doce possuem genomas maiores em relação às
espécies marinhas (HARDIE e HERBERT, 2004) e cartilaginosos em relação aos
ósseos (STINGO e ROCCO, 2002). Adicionalmente não existe uma relação com a
taxa metabólica, mas associado positivamente com características reprodutivas
(HARDIE e HERBERT, 2004).
Para incrementar ainda mais aspectos da evolução cariotípica e genômica
dos Tetraodontiformes foi detectada a presença de cromossomos B em duas
espécies do estudo. Em Sphoeroides spengleri (Tetraodontidae) e Chilomycterus
spinosus (Diodontidae) a presença destes elementos supranumerários tiveram
características próprias relativo a cada espécie: em S. spengleri se apresentaram na
forma de microcromossomos com uma ocorrência superior em fêmeas,
conseqüência de uma segregação preferencial para o pólo meiótico viável. Em
oposição C. spinosus teve este parasita genômico na forma de um pequeno
CONSIDERAÇÕES FINAIS
84
cromossomo acrocêntrico restrito aos machos, reflexo possivelmente de um
fenômeno de ancoragem ao fuso mitótico (GORDON et al., 2001).
O estudo comparativo das heterocromatinas com a análise composicional
com CMA
3
/DAPI em Sphoeroides greeleyi e Sphoeroides testudineus confirma um
usual padrão justificado por uma evolução em concerto das heterocromatinas. Os
DNAs C
0
t-1 além de evidenciar por FISH, a predominância destas seqüências sobre
as regiões bandas C+, se mostram como ferramentas promissoras a serem
utilizadas em hibridizações genômicas com a finalidade de bloquear homeologias
inespecíficas. A GISH forneceu subsídios bastante resolutivos para confirmar que a
porção heterocromática de genomas influencia o seu tamanho atual (KLOC e
ZAGRODZINSKA, 2001).
No fechamento deste trabalho, podemos concluir que uma proeminente
parcela foi adicionada no cenário evolutivo em Tetraodontiformes. Além disso
lançamos mão de metodologias jamais realizadas para o propósito específico, o que
fornece um modelo de estudo aplicável em outros grupos de peixes.
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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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