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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
DOUGLAS HERRERA MONTENEGRO
RNA DUPLA FITA EM Guignardia citricarpa: OBTENÇÃO, CURA, TRANSMISSÃO E
ALTERAÇÕES FENOTÍPICAS
CURITIBA
2010
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DOUGLAS HERRERA MONTENEGRO
RNA DUPLA FITA EM Guignardia citricarpa: OBTENÇÃO, CURA, TRANSMISSÃO E
ALTERAÇÕES FENOTÍPICAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Genética, Setor de
Ciências Biológicas, Universidade Federal
do Paraná, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas, área de concentração: Genética.
Orientadora: Prof. Dra. Vanessa Kava-
Cordeiro
CURITIBA
2010
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À Prof. Dra. Vanessa Kava-Cordeiro
Dedico
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que tornaram possível e colaboraram com a realização
deste trabalho.
Aos meus pais, Diogenes Dantas Montenegro Filho e Tânia Mara Herrera
Montenegro, que proporcionaram meus estudos e me deram a oportunidade para eu
fazer parte da Universidade Federal de Paraná, o que sempre foi motivo de muito
orgulho para mim.
Ao meu irmão, Guilherme Herrera Montenegro, pela “compreensão”,
novamente.
A toda minha família, por sempre me incentivar a dar um passo além e me
ensinar a priorizar minha educação.
À Lili, minha namorada que amo muito, que sempre esteve comigo
compartilhando meus dramas, incentivando-me e torcendo para que tudo desse
certo.
À Carol Silvano, Thabata Alvarez e Vanessa Zulkievicz, pela grande amizade,
por acreditarem no trabalho e por escolherem fazer suas iniciações científicas me
acompanhando. Sem a ajuda de vocês, essa dissertação estaria incompleta.
À Lis, minha amiga querida que desde a graduação esteve junto comigo, e
que apesar de trocarmos farpas algumas vezes, já está deixando muitas saudades.
À Andressa Bini, ao Douglas Adamoski e à Mariana Ogg, meus amigos
graduandos, com quem muito aprendi, pela grande amizade em todos os momentos,
pelas críticas construtivas, e por algumas vezes dispensarem tempo e energia se
dispondo a me ajudar.
Aos amigos da pós-graduação, Angela Ikeda, Carol Waculicz, Danyelle
Stringari, Eduardo Lemons, Fabiana Tonial, Henrique Gomes, Josiane Figueiredo,
Renata Rodrigues e Shenia Bom, por me acompanharem durante o cumprimento de
créditos e tornarem as disciplinas mais divertidas.
Aos amigos do laboratório, Allan, Arthur, Camila, Daiani, Devânia, Eduardo,
Elisandro, Felipe, Josiele, Juliana Fabris, Juliana Marta, Micheli, Natália, Patrícia,
Rodrigo Schuh e Yuri, pela convivência ao longo de toda minha estadia no LabGeM.
À Dona Isolde Gaertner, por todos os serviços prestados ao laboratório, pela
amizade, carinho e por sempre me trazer um cafezinho no meio da tarde.
À professora Patrícia Dalzoto, por já acompanhar minha vida acadêmica ao
longo de cinco anos, pela amizade dentro e fora da sala de aula e pela ajuda com os
testes estatísticos.
Às professoras Chirlei Glienke e Lygia V. Galli-Terasawa, pelo exemplo
profissional de liderança no laboratório e por fazerem o LabGeM funcionar.
À professora Vanessa Kava-Cordeiro, por acreditar em mim desde 2005,
quando comecei a estagiar sob sua orientação, pela grande amizade, incentivos e
puxões de orelha, e por ser a maior responsável pela concretização deste trabalho e
do meu mestrado.
“O mundo é um contínuo marulhar.
Pequenos peixes cantam e dançam, nadam
espertamente ao sabor das ondas que vêm e vão.
Quem no entanto é capaz de saber o que se passa
nas recônditas profundezas desse mar sem fim?
Quem algum dia já mediu sua exata profundidade?”
Eiji Yoshikawa, em Musashi
RESUMO
Guignardia citricarpa é um ascomiceto de extrema importância para a citricultura
brasileira, pois é o agente causal da Mancha Preta dos Citros. Alguns isolados desta
espécie apresentam infecção por vírus de RNA dupla fita (RNAdf) com efeitos
fenotípicos ainda desconhecidos. No presente estudo, sete isolados de G. citricarpa,
previamente identificados como portadores de RNAdf, foram estudados. Estes
isolados foram obtidos de 1996 a 2008, sendo um proveniente do estado do Paraná,
cinco de São Paulo e um da África do Sul. Diferentes protocolos de purificação de
RNAdf foram investigados e o melhor rendimento foi com a utilização de fenol ácido
(pH 4,7). Uma das formas de se analisar a influência do RNAdf é através da
obtenção de linhagens isogênicas, que diferem entre si pela presença ou ausência
de RNAdf. Com o objetivo de obtenção de linhagens isogênicas, dois protocolos de
cura do RNAdf e um de transmissão de RNAdf foram utilizados. Para a cura, foi feito
o repique em meio com ciclohexamida, conforme relatado na literatura. Para G.
citricarpa este método não foi eficiente, pois o fungo teve seu crescimento
completamente inibido mesmo em baixas concentrações (0,5 µg/mL). Outro
protocolo de cura utilizado foi repique de pontas de hifas em condições de cultura a
35ºC, ao invés da cultura a 28ºC, criando uma condição de estresse térmico para o
fungo. Dos sete isolados investigados, apenas três apresentaram crescimento
nestas condições. Destes, dois isolados produziram onze setores que foram
investigados quanto à presença de RNAdf. Em nove não foram observadas bandas
de RNAdf após eletroforese de gel de agarose. Neste momento, estes foram
considerados curados do RNAdf. Para a transmissão, foi necessário selecionar
isolados de G. citricarpa com características que os diferenciassem, além da
presença/ausência de RNAdf. Isolados foram investigados quanto ao padrão de
bandas de RAPD, porém, não foi possível diferenciá-los. Optou-se por utilizar uma
característica morfológica, a presença ou ausência de halo amarelo em meio aveia.
Os isolados com RNAdf são positivos para esta característica. Foram selecionados
doze isolados de G. citricarpa sem RNAdf, negativos para esta característica. Após
avaliar a compatibilidade destes isolados com um isolado com RNAdf, experimentos
de transmissão foram conduzidos. 27 colônias que não formaram halo em meio
aveia, provenientes de conídios da área de contato entre os isolados, foram
investigadas quanto à presença de RNAdf e 7 delas (28,92%) receberam RNAdf. As
linhagens isogênicas foram investigadas quanto à morfologia da colônia e foi
possível verificar que as linhagens com RNAdf apresentam um menor diâmetro da
colônia após 15 dias de cultura. Testes estatísticos comprovaram esta observação.
Com o objetivo de sequenciar o genoma deste vírus, foi aperfeiçoado o protocolo de
obtenção de seu cDNA. Este foi obtido e nas próximas etapas desta pesquisa,
deverá ser sequenciado. Esta sequência servirá para completar a análise
filogenética de vírus da família Totiviridae realizada neste trabalho. Os respectivos
fungos hospedeiros destes vírus também foram enquadrados filogeneticamente por
meio de sequências da região ITS1-5,8S-ITS2. No entanto, a análise dessa região
não forneceu indícios de co-evolução entre vírus e hospedeiro.
PALAVRAS-CHAVE: Guignardia citricarpa, RNA dupla fita, isogenia, cura,
transmissão.
ABSTRACT
Guignardia citricarpa is an ascomycete of extreme importance for the brazilian citrus
culture, since it´s the causal agent of Citrus Black Spot. Some isolates of this species
are infected with a double stranded RNA virus (dsRNA), which causes unknown
phenotypical symptons, yet. Seven isolates from this species previously identified as
bearing dsRNA, were studied. These isolates were obtained from 1996 to 2008, one
from the state of Paraná, five from the state of São Paulo and one from South Africa.
Different dsRNA purification protocols were investigated and the best dsRNA yield
was made with the use of acid phenol (pH 4,7). One of the ways to analyze the
influence of dsRNA is through isogenic strains, which differ from one another by the
presence or absence of this genetic material. Two cure and one transmission
protocol were used for the obtainment of isogenic strains. Regarding the cure
experiment, cycloheximide was added to the medium where mycelial plugs were
placed, as described in the literature. This method wasn´t efficent for G. citricarpa
because the fungal growth was completely inhibited, even when 0,5 µg/mL of the
compound was used. The other cure protocol consisted of growth of hyphal tip
sections at 35 ºC, instead of 28 ºC, which is a stressing condition. From the seven
isolates submitted to this treatment, only three managed to grow at these conditions.
From these, only two produced eleven sectors which were investigated regarding the
presence of dsRNA. In nine, no dsRNA bands were observed in agarosis gel after
electrophoresis. At this moment they were considered cured from the dsRNA. For the
transmission of dsRNA, it was necessary to select G. citricarpa isolates with some
characteristics that would allow their differentiation from other strains, asides from the
presence/absence of dsRNA. Isolates were investigated regarding their RAPD
banding pattern, however, they were all the same. It was opted to use a
morphological characteristic, the presence or absence of a yellow halo in oatmeal
medium. All isolates with dsRNA are positive for this characteristic, and twelve
isolates with no dsRNA and negative for the halo were chosen. After hyphal
compatibility was assessed on these isolates, by pairing a dsRNA bearing isolate
with a dsRNA-free one, transmission experiments were performed. Twenty seven
colonies that didn´t present the yellow halo in oatmeal medium, all of which came
from conidia from the contact zone between isolates, were investigated for the
presence of dsRNA and seven of them (28,92%) received this molecule. Isogenic
strains were then tested for colony morphology and it was possible to verify that
dsRNA bearing strains had a significant smaller size after fifteen days of growth.
Statistical analysis corroborated this trait. Aiming to sequence this viral genome, the
cDNA production protocol was optimized. This molecule was yielded and in the next
phases of this research, should be sequenced. This sequence will allow completing
the phylogenetic analysis of viruses from the Totiviridae family performed in this
study. The respective fungal hosts of these viruses were also phylogenetically
grouped by their ITS1-5,8S-ITS2 region sequences, in order to identify a co-evolutive
trait among these viruses and their hosts. However, the analysis of this region didn´t
provide evidences of this relation.
KEYWORDS: Guignardia citricarpa, double stranded RNA, isogeny, cure,
transmission
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
QUADRO 1
FUNGOS FITOPATOGÊNICOS COM RNAdf...............................
27
QUADRO 2
PRESENÇA DE RNAdf, HALO, ANO E PROCEDÊNCIA DOS
ISOLADOS DE G. citricarpa UTILIZADOS NO TRABALHO.........
32
QUADRO 3
SEQUÊNCIAS DOS “PRIMERS” UTILIZADOS NO RAPD...........
44
FIGURA 1
ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DO ISOLADO PC33/05
OBTIDOS COM FENOL E 2-MERCAPTOETANOL......................
47
FIGURA 2
ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DO ISOLADO PC33/05..............
48
QUADRO 4
QUANTIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO E RNA DUPLA-FITA...
49
FIGURA 3
ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DO ISOLADO PC33/05
TRATADOS COM DNASE E NUCLEASE S1...............................
49
QUADRO 5
QUANTIFICAÇÃO E ESTIMATIVA DO TAMANHO DA
BANDA DE RNA DUPLA-FITA DE PC33/05.........................
50
QUADRO 6
RESULTADOS DO EXPERIMETNO DE CURA APÓS
ESTRESSE TÉRMICO E REPIQUES DE PONTAS DE HIFA
PARA TODOS OS ISOLADOS TESTADOS................................
.
53
FIGURA 4
MORFOLOGIA DO ISOLADO ECLaP APÓS 21 DIAS A 35º C....
54
FIGURA 5
MORFOLOGIA DO ISOLADO ECLaP..........................................
54
FIGURA 6
MORFOLOGIA DO ISOLADO PC7LD6 CULTIVADO A 35 ºC
POR 21 DIAS................................................................................
54
FIGURA 7
ELETROFORESE DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DOS
SETORES DO ISOLADO PC7LD6...............................................
55
FIGURA 8
ELETROFORESE DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DOS
SETORES DO ISOLADO ECLaP..................................................
55
FIGURA 9
TAMANHO DA COLÔNIA DOS ISOLADOS SELVAGENS E
RESPECTIVOS SETORES, APÓS 15 DIAS DE CULTURA........
56
FIGURA 10
TESTE DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA ENTRE
ISOLADOS DE Guignardia sp......................................................
59
FIGURA 11
TESTE DE COMPATIBILIDADE ENTRE ISOLADOS DE G.
citricarpa......................................................................................
59
FIGURA 12
ENSAIO COMPATIBILIDADE ENTRE ISOLADOS ......................
61
FIGURA 13
COLÔNIAS MONOSPÓRICAS OBTIDAS ENTRE PC33/05 E
FTMI2.5.........................................................................................
62
FIGURA 14
COLÔNIAS REPICADAS EM MEIO AVEIA PARA AVALIAÇÃO
DO MARCADOR MORFOLÓGICO...............................................
62
FIGURA 15
ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DOS ISOLADOS QUE NÃO
APRESENTARAM HALO..............................................................
63
FIGURA 16
TAMANHO DA COLÔNIA DOS ISOLADOS SELVAGENS E
RESPECTIVAS COLÔNIAS QUE RECEBERAM O VÍRUS,
APÓS 15 DIAS DE CRESCIMENTO.............................................
64
FIGURA 17
PRODUÇÃO DE cDNA APÓS RT-PCR DE RNAdf DE G.
citricarpa........................................................................................
67
QUADRO 7
NOMENCLATURA DOS INDIVÍDUOS UTILIZADOS PARA
ANÁLISE FILOGENÉTICA............................................................
69
FIGURA 18
ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A
PARTIR DO ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE
NUCLEOTÍDEOS DA ORF PROTEÍNA DO
CAPSÍDEO....................................................................................
70
FIGURA 19
ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A
PARTIR DO ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE
AMINOÁCIDOS DAS PROTEÍNAS DO
CAPSÍDEO....................................................................................
70
FIGURA 20
ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A
PARTIR DO ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIA DE
NUCLEOTÍDEOS DAS ORFS RNA POLIMERASES
DEPENDENTES DE RNA.............................................................
71
FIGURA 21
ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A
PARTIR DO ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE
AMINOÁCIDOS DAS RNA POLIMERASES DEPENDENTES
DE RNA.........................................................................................
71
FIGURA 22
ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A
PARTIR DO ALINHAMENTO DAS REGIÕES 1ITS-5,8S-2ITS
DE FUNGOS PORTADORES DE TOTIVIRUS.............................
73
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
RESULTADOS DOS EXPERIMENTOS DE TRANSMISSÃO...........
63
SUMÁRIO
1
14
1.1
15
1.2
15
2
16
2.1
16
2.2
17
2.3
19
2.4
21
2.4.1
22
2.4.2
23
2.4.3
24
2.4.4
28
2.4.5
30
3
32
3.1
32
3.2
33
3.2.1
33
3.2.2
33
3.2.3
34
3.3
34
3.3.1
34
3.3.2
34
3.3.3
35
3.3.4
35
3.3.5
35
3.3.6
35
3.3.7
36
3.3.8
36
3.3.9
36
3.3.10
36
3.3.11
36
3.3.12
37
3.3.13
37
3.3.14
37
3.3.15
38
3.3.16
38
3.3.17
38
3.3.18
38
3.3.19
39
3.3.20
39
3.4
39
3.4.1
39
3.4.2
40
3.4.2.1
40
3.4.2.2
41
3.4.2.3
41
3.4.2.4
42
3.4.2.5
42
3.4.3
42
3.4.4
42
3.4.5
43
3.4.6
44
3.4.7
45
3.4.8
45
3.4.9
46
4
47
4.1
47
4.2
51
4.2.1
51
4.2.1.1
51
4.2.1.2
53
4.2.2
58
4.3
67
4.4
68
5
75
6
76
7
88
14
1. INTRODUÇÃO
A espécie fúngica Guignardia citricarpa é considerada fitopatogênica, pois é
normalmente encontrada como causadora da Mancha Preta de Citrus (MPC), uma
doença que acomete plantas cítricas e possui grande importância econômica para o
Brasil. Recentemente, foi relatada a infecção por vírus de RNA dupla-fita (RNAdf) em
isolados dessa espécie.
Micovírus estão amplamente difundidos em fungos fitopatogênicos e,
geralmente, são associados com infecções latentes em seus hospedeiros. Os
sintomas induzidos por esses vírus parecem variar de severos até nulos na fisiologia
de fungos, e podem levar à atenuação (hipovirulência) ou intensificação
(hipervirulência) de sua virulência.
Os micovírus de RNAdf são divididos em cinco famílias: Hypoviridae,
Totiviridae, Partitiviridae, Chrysoviridae e Reoviridae. Essas famílias são
diferenciadas entre si principalmente por meio da caracterização de seus capsídeos
protéicos e polimerases, quantidade de segmentos de genoma e hospedeiro,
considerando que diferentes famílias de micovírus podem estar infectando o mesmo
indivíduo. Alguns estudos recentes mostram que é possível que vírus de RNAdf
estejam envolvidos em vias de RNA-interferência (silenciamento gênico ou
degradação de mRNA) dos genes de virulência do fungo.
Em relação à agricultura, micovírus tem muito a contribuir como agentes de
controle biológico de pragas, como já observado na espécie Cryphonectria
parasitica. Há evidências de seu papel como responsável pela debilitação de
espécies de fungos fitopatogênicas como Helminthosporium victoriae, Sclerotinia
sclerotiorum e Botrytis cinerae.
Estudos de caracterização, transferência entre isolados, sequenciamento e
cura destes RNAdf são importantes para se descobrir a influência destes em G.
citricarpa e possivelmente avaliar seu potencial de biocontrole.
15
1.1 OBJETIVO GERAL
- Contribuir para o conhecimento de relação vírus e fungo em G. citricarpa
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
-
Aperfeiçoar protocolos de extração de ácidos nucléicos totais para
obtenção de RNAdf de G. citricarpa
-
Desenvolver e validar métodos de cura de RNAdf para G. citricarpa
-
Avaliar possíveis alterações morfológicas entre isolados submetidos
ao protocolo de cura em relação aos portadores do RNAdf
-
Promover a transmissão de RNAdf entre isolados geneticamente
compatíveis de G. citricarpa
-
Avaliar possíveis alterações morfológicas entre isolados que
receberam o vírus por anastomose e seus respectivos fenótipos
selvagens
-
Validar um protocolo de obtenção de cDNA para o RNAdf de G.
citricarpa
-
Caracterizar filogeneticamente os micovírus da família Totiviridae
disponíveis no Genbank comparando com o padrão filogenético de
seus hospedeiros
16
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 FUNGOS FITOPATOGÊNICOS
Ainda não existe uma distinção exata entre microrganismos epifíticos,
endofíticos e fitopatogênicos. Um microrganismo epifítico pode ser encontrado,
eventualmente, dentro de um vegetal. Um endofítico, em certas condições, pode se
tornar um patógeno e um patógeno pode não afetar seu hospedeiro, e assim ser
considerado endofítico (AZEVEDO, 1998).
O sucesso nas etapas de colonização e infecção de plantas por fungos
fitopatogênicos depende das habilidades do fungo em utilizar as fontes de nutrientes
disponíveis na planta, penetrar nesta e também evitar seus mecanismos de defesa.
Estudos com alguns fungos, mutantes para determinadas vias metabólicas,
mostraram que estes devem apresentar diferentes estratégias de infecção e
colonização já que mantiveram seu potencial patogênico, enquanto que alguns
mutantes perderam a sua patogenicidade (SOLOMON, TAN e OLIVER, 2003).
O sucesso da penetração na planta hospedeira pela maioria dos fungos,
patogênicos ou não, depende da diferenciação do micélio em estruturas
especializadas, denominadas apressórios (KUBO et al., 1996). Algumas espécies de
Colletotrichum, Magnaporthe e Phyllosticta produzem apressório complexo e
fortemente pigmentado com melanina (SHAW, KUO, e HOCH, 1998). Este pigmento
media a formação de uma pressão hidrostática essencial para a ação mecânica do
apressório (HOWARD e FERRARI, 1989; BOURETT e HOWARD, 1990). O
tratamento de conídios com inibidores de síntese de melanina como Triciclazol e
Piroquilon, resulta na produção de apressórios não pigmentados e não funcionais,
acarretando a incapacidade do fungo penetrar na planta (WOLOSHUK e SISLER,
1982; BELL e WHEELER, 1986; DEAN, 1997).
O uso de testes morfológicos e moleculares foi bem sucedido em diferenciar
fungos isolados tanto de plantas cítricas sadias como sintomáticas para a Mancha
Preta de Citrus (MPC). Foi possível classificar os isolados, por marcadores RAPD,
como pertencentes às espécies Guignardia citricarpa, G. magniferae e Phyllosticta
spinarum. O fato de haver alta similaridade genética entre indivíduos de G.
17
mangiferae e um isolado patogênico de goiaba indica que a mesma espécie pode
ser endofítica num hospedeiro e patogênica em outro (STRINGARI et al., 2009).
O uso de marcadores morfológicos (taxa de crescimento e caracterização de
conídios) e moleculares, como sequenciamento da região do DNA ribossomal ITS1-
5,8S-ITS2 (“Internal Trancribed Spacer regions of ribosomal DNA”), PCR espécie-
específica e RAPD possibilitou a diferenciação de diferentes isolados de
Colletotrichum em C. boninense e C. gloesporioides, todos isolados de Maytenus
ilicifolia, uma planta medicinal conhecida popularmente como espinheira-santa
(PILLEGI et al., 2009)
Diferentes estratégias são utilizadas para identificar a rota de infecção de
fungos fitopatogênicos. Um protocolo de transformação para o fungo Cochliobolus
heterostrophus, patogênico de milho, utiliza o gene GFP (“Green Fluorescent
Protein”) como marcador. Um isolado de C. heterostrophus transformado foi utilizado
para infectar uma planta sadia e acompanhar o desenvolvimento da infecção (MAOR
et al., 1998).
Recentemente, foi descrita uma estratégia de transformação de G. citricarpa
com Agrobacterium tumefasciens, ATMT (Agrobacterium tumefasciens mediated
transformation), utilizando o gene GFP. As linhagens transformantes permaneceram
mitoticamente estáveis, e concluiu-se que o uso de ATMT é uma ferramenta
poderosa para se estudar a genômica funcional de fungos filamentosos, além de
aumentar o escopo do estudo da relação entre patógenos e hospedeiros
(FIGUEIREDO et al., 2010).
2.2 OS GÊNEROS Guignardia E Phyllosticta
O gênero Guignardia, descrito em 1892 por Viala e Ravaz, compreende as
formas teleomórfas de espécies de Phyllosticta e de alguns outros gêneros
relacionados de fungos mitospóricos geralmente saprófitos ou semiparasitas de
folhas (SIVANESAN, 1984).
Diversos autores isolaram espécies de Phyllosticta de plantas aparentemente
sadias, descrevendo-as como endofíticas (CARROLL e CARROLL, 1978; PETRINI,
1986; LEUCHTMANN et al., 1992; GLIENKE, 1995; PENNA, 2000). No entanto
18
existe um grande número de relatos citando este gênero como fitopatogênico de
diversas culturas com grande importância econômica como arroz (SUGHA, SINGH e
SHARMA, 1986), cana-de-açúcar (PONS, 1990), tabaco (PATEL, PATEL e TILVA,
1988), eucalipto (CROUS et al., 1993) e também frutíferas como abacate, tomate,
manga, mamão, uva (IBRAHIM e BAYCA, 1989), e principalmente em citros
(McONIE, 1964a, 1964b; HERBERT e GRECH, 1985; JOHNSTON e FULLERTON,
1988; STRINGARI et al., 2009).
A separação de espécies em Phyllosticta é baseada principalmente no
hospedeiro de onde é isolado e, menor importância é dada a características como
sintomatologia e estruturas morfológicas (picnídio, conídio e micélio) (VAN DER AA,
1973).
Fungos do gênero Guignardia (anamorfo: Phyllosticta) foram isolados de
folhas sadias de plantas da família Ericaceae. Morfologicamente, o anamorfo
Phyllosticta, apresentou-se muito semelhante à espécie P. capitalensis P. Henn.,
conhecido como patógeno de orquídeas. Dados de sequenciamento de regiões ITS1
e ITS2 incluindo 5,8S rDNA, demonstraram a identidade dos isolados com P.
capitalensis. Com estes resultados, os autores descreveram o endofítico ascomiceto
como a nova espécie Guignardia endophyllicola, cujo anamorfo correspondente é
Phyllosticta capitalensis. Previamente descrito apenas como patógeno de orquídeas,
este fungo foi comprovadamente identificado como endofítico de plantas da família
Ericaceae (OKANE, NAKAGIRI e ITO, 2001). Outros autores caracterizaram
linhagens de Phyllosticta isoladas de folhas de árvores tropicais por meio de análise
de ITS-RFLP e sequenciamento de regiões ITS e identificaram estes isolados como
P. capitalensis. Desta forma, comprovaram que este fungo, apesar de inicialmente
descrito como patógeno de orquídeas, pode ser encontrado como endofítico de
várias espécies vegetais (PANDEY, REDDY e SURYANARAYANAN, 2003).
Dezenas de linhagens patogênicas e endofíticas de Guignardia spp,
Phyllosticta spp e G. citricarpa isoladas de diferentes espécies vegetais de diversas
regiões da Ásia, África, Austrália e América foram comparadas. Os autores
utilizaram dados morfológicos e também moleculares (sequências ITS e AFLP) para
este estudo. Linhagens patogênicas apresentam crescimento lento em comparação
com linhagens endofíticas, que apresentam crescimento mais rápido e fácil
produção de peritécio e ascósporos em meio de cultura. Com os dados moleculares
foi possível agrupar os isolados estudados em quatro grupos. Os grupos I e II foram
19
os mais numerosos, sendo que no grupo I ficaram os isolados (38 no total) de lesão
de citros (MPC), com crescimento mais lento e que foram então, identificados como
G. citricarpa. No grupo II (43 isolados), os dados moleculares apontaram para uma
grande identidade destes isolados com o fungo G. mangiferae, sendo que estes
isolados eram provenientes de citros e também de outras plantas assintomáticas ou
com sintomas bem discretos (pequenas manchas). Com base nestes dados, estes
isolados foram classificados como Guignardia mangiferae. Os grupos III e IV
apresentaram apenas um isolado cada e os dados moleculares apontaram para as
espécies Phyllosticta telopeae e P. spinarum, respectivamente (BAAYEN et al.,
2002).
A variabilidade genética de linhagens endofíticas e patogênicas do fungo
Guignardia spp, isoladas em diversos países e hospedeiros, através de marcadores
RAPD, foi analisada. Neste estudo, também foi relatada a existência de, pelo menos,
três espécies distintas de Guignardia, morfologicamente muito semelhantes, co-
existindo em Citrus spp. O autor sugere que as linhagens isoladas de lesões de
MPC pertencem à espécie G. citricarpa, enquanto as linhagens endofíticas isoladas
de Citrus spp devem pertencer à espécie G. mangiferae (CHRISTO, 2002).
Dados moleculares foram utilizados para diferenciar isolados pertencentes às
espécies G. citricarpa, G. mangiferae e Phyllosticta spinarum. Quatro populações
distintas foram formadas após realização de AMOVA. Este fato revela a dificuldade
de se diferenciar isolados dentro dessas espécies, como foi sugerido pelos autores
(STRINGARI et al., 2009).
2.3 MANCHA PRETA DE CITROS
A citricultura brasileira, em 2006, foi responsável pela exportação de 2 bilhões
de dólares em suco de laranja e alcançou um domínio de 81% de todo esse
mercado internacional. Apesar da grande importância econômica e social que
representa a citricultura para o país, este setor ressente-se de vários problemas de
natureza fitossanitária e vem sofrendo com o avanço de pragas naturais. Desde
1990, a área plantada diminuiu 21%. Um grave problema que ajuda a aumentar o
prejuízo decorre da Mancha Preta de Citros, uma doença que ocasiona o surgimento
20
de lesões superficiais em frutos e prejudica a exportação brasileira de laranja “in
natura” (SALOMÃO, 2007).
O primeiro relato da doença foi descrito em 1895 na Austrália, ocasionando
elevadas perdas na produção e pós-colheita. Por volta da década de 30, a
enfermidade foi encontrada na região litorânea da província de Transvaal, tornando
impróprios para a exportação mais de 90% dos frutos de pomares não protegidos
(ROBBS, 1990). Hoje a MPC apresenta uma ampla distribuição geográfica,
registrada na África, Ásia, Oceania, América Central, América do Sul e Antilhas
(ROBBS e BITTENCOURT, 1995).
Recentemente, em abril de 2010, a preocupação de citricultores do estado da
Florida, nos Estados Unidos da América, aumentou com a chegada da MPC em
seus pomares, pois sua ocorrência foi reconhecida pelo governo estadunidense.
Alguns pesquisadores já verificaram que frutas da região estão infectadas com a
doença e expressam preocupação com a falta de medidas eficientes para o controle
da doença (BOUFFARD, 2010).
No Brasil, o primeiro relato da doença ocorreu em 1940, em frutos coletados
em Piracicaba, São Paulo. Em 1980 a doença ressurgiu no Rio de Janeiro, afetando
Mexerica do Rio (ROBBS, PIMENTEL e RIBEIRO, 1980). No início da década de 90
a MPC foi identificada atingindo o município de Conchal, uma importante região
citrícola do Estado de São Paulo (GOES e FEICHTENBERGER, 1993). A evolução e
a distribuição geográfica da MPC ocorreram de forma muito rápida, e encontrou-se,
de forma endêmica, em mais de quarenta municípios produtores do Estado de São
Paulo (BALDASSARI et al., 2001).
As medidas de controle incluem, basicamente, a erradicação de plantas e
frutos afetados e a proteção de pomares sadios. Quanto às medidas de erradicação,
sugere-se a eliminação dos frutos afetados antes do início da florada, suprimindo a
principal fonte de inóculo representada pelos picnídios (ROBBS e BITTENCOURT,
1995).
O controle químico com fungicidas, além de antieconômico, não é totalmente
eficaz contra a doença. Porém, é necessário recorrer a este recurso quando a MPC
ataca de forma severa e quando a produção destina-se ao consumo da fruta fresca
(SPÓSITO, 1999). O principal problema da utilização sucessiva destes produtos é a
seleção de linhagens resistentes, conforme observado na África do Sul (HERBERT e
GRECH, 1985).
21
A espécie G. citricarpa foi capaz de crescer em meio de cultura mesmo após
adição do fungicida estrolilurina (10 μg/μL), apesar de apresentar uma redução na
taxa de esporulação, quando comparada com linhagens cultivadas sem esse
composto. Quando linhagens do fungo foram testadas com benomil, até uma
concentração de apenas 0,5 μg/μL foi capaz de parar o crescimento micelial de 90%
das colônias testadas (POSSIEDE et al., 2009).
2.4 RNA DUPLA-FITA
Em 1948, os irmãos La France perceberam que alguns fungos da espécie
Agaricus bisporus tinham corpos de frutificação malformados, o que causava
grandes perdas na produção destes cogumelos. A presença de pelo menos três
tipos de VLPs (“Virus Like Particles”, ou partículas semelhantes a vírus) nos
esporóforos de cogumelos doentes desta espécie foi considerada como o evento
que marca o nascimento da micovirologia (HOLLINGS, 1962).
Os trabalhos pioneiros em relação à RNAdf mostram que, em Saccharomyces
cerevisiae, há duas bandas em gel de eletroforese que correspondem a esse ácido
nucléico pois resistem a tratamentos com DNAse e são sensíveis quando RNAse é
utilizada. Esses RNAdf estão associados ao fenótipo “killer” do fungo (secreção de
toxina e resistência a essa toxina) além de apresentarem segregação não-
mendeliana (SWEENEY, TATE e FINK, 1976). Os autores também consideraram
que esses RNAdf correspondem a plasmídeos destes microrganismos.
Foi relatada a presença de um micovírus em Aspergillus foetidus composto de
três RNAdf: RNAdf 1, RNAdf 2 e RNAdf 3. A transcrição neste vírus obedece a um
padrão semiconservativo, no qual ocorre disjunção de uma das fitas do RNAdf 2
pela cadeia que está sendo sintetizada de forma que no final de cada rodada de
transcrição, a fita que foi liberada se solta do seu molde e do vírus, e o RNAdf 2
restante contem uma sequência antiga e outra recém-sintetizada (RATTI e BUCK,
1978).
Algumas linhagens em S. cerevisae são incapazes de manter as formas L-B e
L-C de RNAdf dentro de suas células, e por isso foram designadas clo-. Os autores
22
que estudaram indivíduos clo- relataram que a baixa concentração dessas
moléculas permitiu a visualização de outras formas deste material genético,
designadas T e W, encontradas em menor concentração. O fato destas linhagens
aumentarem o número de cópias desses RNAdf em torno de 10 vezes quando
mantidas a 37º C foi considerado inusitado pelos pesquisadores (WESOLOWSKI e
WICKNER, 1984).
2.4.1 Origem e Evolução De Vírus
A origem dos vírus ainda não é conhecida devido à ausência de evidências
fósseis e a alta taxa de variação dentro de seus genomas. Análises comparativas
têm sido feitas para mostrar similaridades entre vírus e entre proteínas virais e
celulares, as quais fornecem subsídios para mostrar como eles possivelmente se
originaram e evoluíram (GORBALENYA, 1995).
Há teorias que suportam que as origens da vida no planeta Terra iniciaram
com RNA como material genético, e em seguida surgiram as células com genomas
de DNA. A natureza dos vírus mais antigos nunca poderá ser determinada, mas já
foi sugerida que a forma de vida envolvendo “replicons” de RNA pode ter sido a
origem dos vírus de RNA atuais (BECKER, 2000). Tais moléculas primitivas de RNA
fornecem um domínio de replicação para os primeiros vírus verdadeiros de RNA, os
quais podem ter surgido quando “replicons” ancestrais adquiriram genes para
formação de capsídeos (GORBALENYA, 1995).
Vírus de RNA possuem a taxa de mutação mais alta de todos os seres vivos,
pois suas RDRPs (RNA Polimerases Dependentes de RNA) não possuem atividade
de revisão após a inserção de nucleotídeos durante a replicação de seus genomas.
A taxa normal de incorporação errada de novos nucleotídeos é de 10
-4
, ou 1 erro a
cada 10.000 bases. Além da mutação, eventos de recombinação também são
considerados como um dos maiores mecanismos agindo na evolução de vírus, pois
podem acontecer através de recombinação homóloga entre dois RNAs muito
parecidos ou recombinação não-homóloga, entre dois RNAs com algum segmento
complementar (ZACCOMER, HAENNI e MACAYA, 1995).
23
Vírus de fungos, ou micovírus, estão presentes em numerosos fungos e
tipicamente contêm genomas de RNA fita-dupla (BUCK, 1986). O fato de muitos
micovírus serem latentes ou assintomáticos em seus hospedeiros serve de
evidência de que fungos e seus vírus co-evoluíram e se adaptaram num grau
considerável (GHABRIAL, 1998). A patogenicidade do vírus e morte da célula
hospedeira pode levar a eliminação viral, devido à falta de uma via de infecção
extracelular. Análises genéticas comparativas das sequências correspondentes às
enzimas RDRP, que são consideradas as mais conservadas entre vírus de RNA,
mostram pouca similaridade entre eles (KOONIN, 1992; BRUENN, 2003;
KOZLAKIDIS et al., 2006).
Acredita-se que micovírus tenham origens muito antigas. Alguns trabalhos
mostram que os grupos de RNAdf originais infectavam células antes da divergência
evolutiva entre protozoários e fungos. Essa teoria é suportada pelo fato de que o
vírus Hv190SV, encontrado no fungo fitopatogênico Helminthosporium victoriae, é
mais aparentado com um vírus encontrado em protozoários (Leishmaniavirus LRV1
e LRV2) do que com vírus de leveduras, o que sugere que Hv190SV e LRV existiam
antes da divergência de protozoários e fungos (GHABRIAL, 1998).
2.4.2 Taxonomia de Micovírus de RNAdf
Há 7 famílias de vírus de RNAdf: Hypoviridae, Totiviridae, Partitiviridae,
Chrysoviridae, Reoviridae, Birnaviridae e Cystoviridae, sendo que as 5 primeiras são
encontradas em fungos. Essas famílias diferem entre si quanto ao número de
segmentos de RNAdf apresentados, sequências de aminoácidos das suas
polimerases, tipo e tamanho da partícula viral (MERTENS, 2004). Este organizou
estas famílias de acordo com características apresentadas a seguir:
A família Hypoviridae apresenta genoma linear com um fragmento de RNAdf.
O material genético encontra-se dentro de vesículas sem capsídeo protéico com
diâmetro variável entre 50 a 80 nm. Alguns membros dessa família ocasionam
hipovirulência em seus hospedeiros.
A família Totiviridae apresenta dois gêneros, Totivirus e Victorivirus
(GHABRIAL e SUZUKI, 2009). Aparentemente, três formas de expressão da enzima
24
RDRP são usadas pelos membros dessa família: fundida com a CP (Proteína do
Capsídeo), devido a uma mudança na matriz de leitura; fundida com a CP sem a
mudança na matriz de leitura; como uma proteína separada. Apresenta um único
fragmento de RNAdf, capsídeo icosaédrico com diâmetro variando entre 30 a 40 nm.
A família Chrysoviridae apresenta genoma com quatro segmentos, que são
montados separadamente, e capsídeos com diâmetro variando entre 35 a 40 nm. O
maior segmento (RNAdf 1) codifica para a RDRP, o RNAdf 2 para a CP, e os outros
dois provavelmente estão relacionados com a transcrição, ligação e empacotamento
do RNA.
A família Partitiviridae apresenta dois segmentos de RNA e capsídeo de 35 a
40 nm. Há três gêneros descritos para essa família, mas apenas um deles,
Partitivirus, infecta fungos. Os outros dois gêneros são encontrados infectando
plantas.
A família Reoviridae apresenta 10, 11 ou 12 segmentos de RNA,
empacotados em capsídeos icosaédricos de 70 a 90 nm.
2.4.3 Genômica e Fisiologia de Vírus de RNAdf
Como processos de polimerização dependentes de RNA codificados nas
células hospedeiras são raros, os vírus de RNAdf desenvolveram atividades de
polimerase muito específicas para multiplicação do seu genoma, entre elas as das
enzimas RDRP e RDDP (“RNA-dependent DNA polymerase”), que são
transcriptases reversas. As RDRP dos RNAdf possuem oito motivos conservados
que refletem a sua função: reconhecimento do molde de RNA a ser utilizado e/ou
atividade de polimerase. A conservação dessas sequências entre as RDRP
analisadas sugere a existência de um elemento genético ancestral com atividade de
polimerase (POCH et al., 1989; BRUENN, 2003).
Um RNAdf linear isolado de linhagens hipovirulentas de D. ambigua
representa a forma replicativa de um vírus de RNA. Após a obtenção de uma
biblioteca de cDNA da molécula, observou-se que a proteína provável p125 é
traduzida do genoma de 4,1 kb através de uma leitura que passa por três códons de
25
término, e a extremidade C-terminal dessa proteína contém o domínio RDRP
(PREISIG et al., 2000).
Uma caracterização do vírus 1 do fungo Pleurotus ostreatus (PoV-1) mostrou
a presença de dois fragmentos de RNAdf chamados RNAdf-1 e RNAdf-2 compondo
seu genoma. Cada um desses RNAdf contêm uma ORF (“Open Reading Frame”) na
sua fita positiva enquanto que na fita negativa, não. As sequências dos aminoácidos
que foram deduzidas das ORFs codificam para proteínas com muita similaridade às
sequências de RDRP e CP de partitivirus. As regiões 5’-UTR (“Untranslated Region”)
dos dois segmentos possuem uma parte conservada entre Partitivirus e também
uma sequência rica em AC, com função desconhecida. Já a região 3’-UTR contém
uma região rica em AU chamada “cauda poli-A interrompida”, que pode ter a função
de estabilizar a molécula de RNA durante a replicação (LIM et al., 2004).
No fungo fitopatogênico Helicobasidium mompa, encontrado nas raízes de
macieiras, foram observados três bandas de RNAdf, chamadas RNAdf 1, RNAdf 2 e
RNAdf 3, num gel de poliacrilamida (5%). Utilizando o programa BLAST, foi feita
uma análise comparativa dos produtos prováveis expressos pelo RNAdf 1, a qual
mostra similiaridade com RDRPs de três outros micovírus da família Partitiviridae
(OSAKI et al., 2004).
Em Sclerotinia sclerotiorum, fungo fitopatogênico de mais de 400 espécies de
plantas, relatou-se a presença de três formas de RNAdf: RNAdf L, RNAdf M e RNAdf
S. O RNAdf M, associado com hipovirulência, foi sequenciado e possui 5419
nucleotídeos, excluindo a cauda poli(A). Há uma única ORF do nucleotídeo 93 até o
5195 que codifica uma proteína com grande similaridade às replicases dos vírus de
RNAdf. Nesse caso, o RNAdf M contém um domínio conservado referente à metil
transferase, helicase e RDRP parecidos com os de Flexiviridae e do vírus F de
Botrytis. Quando foi feita a transmissão do RNAdf entre linhagens com e sem esse
material genético, o isolado receptor apresentou o fenótipo debilitado semelhante ao
do doador, Ep-1PN (XIE et al., 2006).
O genoma de um micovírus de Magnaporthe oryzae foi sequenciado e revelou
possuir 5193 pares de base de tamanho, com duas ORFs: uma codificando para
uma CP com grande similaridade para capsídeos de vírus da família Totiviridae e a
outra para uma RDRP de 91 kDA de massa molecular, também similar com o
encontrado nessa família. Além disso, a proteína possui 8 motivos conservados para
as RDRP de micovírus que infectam fungos (MAEJIMA et al., 2008).
26
Moléculas de RNAdf são ineficazes como modelos de RNA mensageiro para
tradução, além de não funcionarem como alvo para transcriptases da célula
hospedeira. Esses vírus devem ter então suas próprias enzimas de transcrição e as
levar junto à célula hospedeira para que sintetizem seus próprios mRNA para iniciar
a síntese das proteínas virais (MERTENS, 2004).
O quadro 1 mostra, de forma resumida, exemplos de fungos fitopatogênicos
nos quais RNAdf foram encontrados e classificados taxonomicamente.
27
ESPÉCIE FÚNGICA
FAMÍLIA VIRAL
REFERÊNCIA
Agaricus bisporus
Chrysoviridae
VAN DER LENDE, 1996
Alternaria alternata
Totiviridae
AOKI et al., 2009
Aspergillus nidulans
Totiviridae
HAMMOND, 2008
Aspergillus ochraceous
Partitiviridae
LIU et al., 2008
Botryotinia fuckeliana
Totiviridae
DE GUIDO et al., 2007
Chalara elegans
Totiviridae
PARK, JAMES e PUNJA, 2004.
Coniothyrium minitans
Totiviridae
CHENG et al., 2003
Cryphonectria parasitica
Reoviridae
HILLMAN et al., 2004
Cryphonectria parasitica
Hypoviridae
SHAPIRA e NUSS, 1991
Discula destructiva
Partitiviridae
RONG et al., 2002
Epichloe festucae
Totiviridae
ROMO et al., 2007
Fusarium poae
Partitiviridae
COMPEL et al., 1999
Fusarium solani
Partitiviridae
NOGAWA et al., 1996
Gremmeniella abietina
Totiviridae
TUOMIVIRTA e HANTULA, 2005
Helicobasidium mompa
Totiviridae
SUZAKI, K, 2005
Helminthosporium
victoriae
Totiviridae
HUANG e GHABRIAL, 1996
Helminthosporium
victoriae
Chrysoviridae
SOLDEVILA et al., 2004
Heterobasidium annosum
Partitiviridae
IHRMARK et al., 2001
Magnaporthe oryzae
Totiviridae
YOKOI, YAMASHITA e HIBI, 2007.
Ophistoma sp.
Totiviridae e Partitiviridae
DOHERTY et al., 2007
Pleurotus ostreatus
Partitiviridae
QIU, LI e LYU et al., 2009
Rhizoctania solani
Partitiviridae
STRAUSS, LAKSHMAN e TAVANTZIS,
2000
Rosellinia necatrix
Partitiviridae
SASAKI et al., 2005
Rosellinia sp.
Reoviridae
WEI et al., 2004
Sclerotinia sclerotiorum
Partitiviridae
LIU, FU e JIANG, 2009
Sphaeropsis sapinae
Totiviriade
PREISIG, WINGFIELD e WINGFIELD, 1998
Zygosaccharomyces bailii
Totiviridae
REHFELDT e SCHMITT, 2000
QUADRO 1 - FUNGOS FITOPATOGÊNICOS COM RNAdf
Fonte: O autor (2010)
28
2.4.4 Cura, Transmissão e Influência do RNAdf no Hospedeiro
A presença de RNAdf confere uma redução na virulência (hipovirulência) do
fungo Cryphonectria parasitica (Endothia parasitica). Essas partículas virais são
transmitidas de linhagens hipovirulentas para virulentas por fusão de hifas
(anastomose). Além de hipovirulência, linhagens do fungo com esses micovírus
podem exibir colônias com morfologia alterada, que incluem redução na esporulação
e mudanças na pigmentação (ELLISTON, 1985).
O gene Vir2, responsável pelo fenótipo virulento de C. parasitica, é regulado
negativamente na presença de RNAdf. No entanto, não foram observadas
evidências de metilação diferencial ou outras alterações genômicas em sequências
dentro ou próximas do gene para explicar como o RNAdf realiza essa regulação
(ZHANG et al., 1993).
Em Fusarium graminearum, a presença de RNAdf está associada com uma
coloração vermelho-escura, crescimento reduzido e formato irregular da colônia,
além de hipovirulência, no trigo. A transferência deste material genético para um
isolado livre dele resultou na apresentação do fenótipo do indivíduo doador. Além
disso, quando linhagens isogênicas com e sem RNAdf foram comparadas, as
alterações fenotípicas obedeceram à regra geral daquelas infectadas (CHU et al.,
2002).
Trabalhos feitos com grupos homocarióticos e heterocarióticos do fungo
Heterobasidium annosum mostram que houve transmissão horizontal de RNAdf
entre o micélio de todos os isolados pareados, exceto no isolado 95163, que não
transmitiu o vírus para os outros. A taxa de transmissão vertical de RNAdf, do
micélio para os conídios nas duas linhagens em que isto foi avaliado, foi de 3% até
55%, de um total de 104 e 176 esporos, respectivamente (IHRMARK et al., 2002).
Um isolado do fungo E. parasitica foi curado de RNAdf ao se utilizar
ciclohexamida no meio de cultura. Outros dois indivíduos estudados não foram
curados possivelmente devido a fatores nucleares que garantem a estabilidade
dessas moléculas. No entanto, a linhagem curada apresentou um grande aumento
na virulência, o que indica um fenótipo hipovirulento associado ao RNAdf
(FULBRIGHT, 1984).
29
Resultados interessantes foram obtidos com o entomopatógeno Beauveria
bassiana. Em bioensaio contra o percevejo marrom da soja, Euschistus heros, um
isolado de B. bassiana com RNAdf foi menos virulento que o isogênico, o que
evidencia o caráter de hipovirulência do RNAdf neste fungo (DALZOTO et al., 2006).
Em estudos com o fungo endofítico Epichlöe festucae, um vírus de RNAdf foi
identificado como pertencente à família Totiviridae. As tentativas feitas para curar
linhagens portadoras dessas partículas virais através de calor falharam, e o que se
observou é que em temperaturas elevadas, a concentração do vírus aumenta nesta
espécie. Segundo os autores, este fato sugere a destruição de mecanismos
mantenedores da homeostase nas células (ROMO et al., 2006).
O fenômeno de micocinogenia (“fenótipo killer”) também foi relatado para o
isolado VKM Y-2897 da espécie Cystofilobasidium infirmominiatum, quando ele foi
cultivado em condições de pH 3,5 a 5,5, a 18 ºC e a 5 ºC, e pareado com VKM Y-
1265. Nestes casos, foi observado o surgimento de uma zona de inibição em placa
(halo azulado) composta por células mortas, evidenciado com a adição de azul de
metileno. RNAdf foi encontrado nesse isolado, e após experimentos de cura em que
essas moléculas foram eliminadas, o fenótipo micocinogênico desapareceu
(GOLUBEV et al., 2003).
Um isolado selvagem de Aspergillus niger, com RNAdf, formou setores sem
conídios e com taxa de crescimento reduzida. Observou-se que esse fenótipo
anormal possui uma concentração de micovírus elevada quando comparada com o
micélio adjacente da colônia, devido a intensidade das bandas de RNAdf. A isolado
Ind1.8.16 foi o único que foi curado através de isolamento sequêncial de ponta de
hifa de um total de 10 indivíduos (DIAPENINGEN, DEBETS e HOEKSTRA, 2006).
Os micovírus em Fusarium poae foram classificados como crípticos, pois não
foram observadas alterações morfológicas nas colônias devido à infecção. Alguns
desses elementos de RNAdf estavam encapsulados enquanto que outros não
possuiam capsídeo protéico, e ambos os tipos estavam presentes no mesmo
isolado. As sequências de aminoácidos obtidas para os clones de cDNA do isolado
FUPO-1 sugerem que os dois fragmentos observados em gel de agarose codificam
um para uma RDRP e outro para o capsídio. Essa organização genômica é típica de
vírus da família Partitiviridae (COMPEL et al., 1999).
30
2.4.5 Silenciamento Gênico e Vias de RNA-interferência
A produção de RNAdf em células eucarióticas, geralmente como resultado de
replicação viral ou transcrição de elementos transponíveis e sequências de DNA
repetitivo, constitui diferentes tipos de respostas de defesa celular. Num deles, o
RNAdf é reconhecido e clivado pela RNAse III (Dicer) para produzir dúplices de
siRNAs (“short-interfering RNA”) de 20 a 25 nucleotídeos (MEISTER; TUSCHL,
2004).
A introdução de transgenes ou RNAdf em células eucarióticas pode disparar
uma série de mecanismos PTGS (“Post-Transcription Gene Silencing”) nos quais o
RNAdf, depois de ser processado em siRNAs, foi identificado como forte indutor de
degradação de mRNA (CATALANOTTO, NOLAN e COGONI, 2005).
A produção de siRNA inicia a via de RNA-interferência (RNAi), também
chamada de silenciamento gênico pós-transcricional. Os siRNAs são dirigidos ao
RISC (“RNA Induced Silencing Complex”) com uma proteína da família Argonauta
(Ago) no cerne, e guiam este complexo no reconhecimento e clivagem de mRNA
homólogos ou no silenciamento transcricional do locus de DNA homólogo. Proteínas
Dicer e Argonauta são centrais no processo de RNAi (HAMMOND, 2005).
Os primeiros estudos em relação às vias de interferência de genes, em
fungos, foram realizados com Neurospora crassa (COGONI e MACINO, 1997). Os
autores, sabendo que a introdução de transgenes em fungos pode levar à inativação
gênica, introduziram o gene al-1, naturalmente encontrado no fungo e responsável
pelo fenótipo alaranjado, em um isolado específica de N. crassa. Isso estabeleceu
um sistema genético no qual a cor pôde ser usada para identificar linhagens
silenciadas (albinas) e com silenciamento defectivo (alaranjadas). Num isolado
silenciado, foi observado uma redução no nível de mRNA de al-1 endógeno, nível
normal do RNA precursor de al-1 e a presença de transcritos al-1 transgênicos. Por
outro lado, num isolado qde (“Quelling Deficient”, ou seja, deficiente no
silenciamento), havia um nível aumentado de mRNA al-1 endógeno. Esse
experimento constituiu o primeiro passo na identificação de fatores necessários para
o silenciamento gênico.
Foi demonstrado pela primeira vez em eucariotos não-vertebrados que a
introdução de RNAdf na forma de plasmídeos leva a indução da expressão dos
31
genes qde-2, dcl2 (para a enzima Dicer 2) e outros envolvidos na via de RNAi em N.
crassa. O RNAdf regula QDE-2 (proteína Argonauta) tanto transcricional quanto pós-
transcrionalmente, e esse último modo é dependente de enzimas Dicer
(CHOUDHARY et al., 2007).
Foram estudados três micovírus de Aspergillus: vírus 1816, vírus 178 e vírus
341 e suas associações com micovírus de outros fungos foram caracterizadas por
comparação com as RDRP expressadas. O vírus 1816 bloqueia a via de
silenciamento de RNA através de um mecanismo que altera o nível de siRNAs. O
virus 178 parece não afetar o silenciamento, enquanto foi observada a presença de
siRNA derivados do vírus 341, o que demonstra que ele é um alvo para a
maquinaria de RNAi de Aspergillus (HAMMOND et al., 2008).
Estudos de silenciamento gênico também foram feitos na espécie C.
parasitica. Foram obtidas colônias com mutantes que anulavam os genes dcl-1, dcl-
2 e ambos (dcl-1/dcl-2), por recombinação homóloga. Todas elas apresentavam
fenótipos indistinguíveis da colônia selvagem. Para testar se as proteínas Dicer
dessa espécie estavam envolvidas numa resposta antiviral, as colônias foram
infectadas por transfecção de esferoplastos contendo transcritos virais e
anastomose. As colônias com dcl-2 e dcl-1/dcl-2 mutantes apresentaram algumas
mudanças fenotípicas, como alteração na pigmentação do micélio e taxa de
crescimento reduzida. Após complementação da colônia mutante para dcl-2 com o
gene selvagem dcl-2, o fenótipo foi revertido para o selvagem. Os autores
identificaram, então, o gene dcl-2 como um componente primário para uma via
antiviral (SEGERS et al., 2007).
Após hibridação por “Northern blotting” com uma sonda correspondente a
uma sequência específica do vírus CHVI-EP713 de C. parasitica de um isolado
infectado por RNAdf, evidenciou-se uma banda em gel com mais ou menos 21
nucleotídeos, que mostra a presença de vsRNA (RNA vírus-específico) na amostra.
vsRNA ocorre após a clivagem, por Dicer, de RNAdf. Não houve formação de uma
banda correspondente quando a hibridação foi realizada num isolado livre de RNAdf.
Clonagem e sequenciamento desses vsRNA mostraram que 73% dos clones obtidos
eram homólogos à seqüência de RNA do micovírus (ZHANG et al., 2008).
32
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO
Os isolados utilizados no trabalho foram coletados de Citrus sp., conforme
apresentado no Quadro 2, e armazenados na micoteca do Laboratório de Genética
de Microrganismos, UFPR.
CADASTRO LABGEM
ISOLADOS
RNAdf E HALO
ANO
ISOLAMENTO
LGMF13
ECLAP
+
2008
Paranavaí - PR
LGMF434
PC3C
+
-
África do Sul
-
PCIAC19/02
+
2002
Cordeirópolis – SP
-
PC7LD6
+
1996
Mogi-Guaçú - SP
LGMF4
PC28/05
+
2005
Jaboticabal – SP
LGMF6
PC33/05
+
2005
Jaboticabal - SP
-
PC7LE10
+
2002
Mogi-Guaçú - SP
LGMF49
FTMi3.1
-
2009
Doutor Ulysses - PR
LGMF86
FTMO9.2
-
2009
Doutor Ulysses - PR
LGMF187
FTP25.6
-
2009
Cerro Azul - PR
LGMF195
FTP27.3
-
2009
Cerro Azul - PR
LGMF201
FTP31
-
2009
Cerro Azul - PR
LGMF206
FTP33.4
-
2009
Cerro Azul - PR
LGMF48
FTMi2.5
-
2009
Cerro Azul - PR
LGMF111
FTP3.12
-
2009
Cerro Azul - PR
LGMF126
FTP4.11
-
2009
Cerro Azul – PR
LGMF137
FTP6.15
-
2009
Cerro Azul – PR
LGMF140
FTP7.1
-
2009
Cerro Azul – PR
LGMF148
FTP11.3
-
2009
Cerro Azul – PR
QUADRO 2 – PRESENÇA DE RNAdf, HALO, ANO E PROCEDÊNCIA DOS ISOLADOS DE G.
citricarpa UTILIZADOS NO TRABALHO
Também foi utilizado um isolado de G. mangiferae, EC13C, para se avaliar a
compatibilidade genética entre indivíduos de diferentes espécies.
33
3.2 MEIOS DE CULTURA
3.2.1 Meio Completo (MC) (PONTECORVO et al., 1953, modificado por AZEVEDO;
COSTA, 1973)
NaNO
3
6,0 g
KH
2
PO
4
1,5 g
MgSO
4
.7H
2
O 0,5 g
KCl 0,5 g
FeSO
4
0,01 g
ZnSO
4
0,01 g
Glicose 10,0 g
Extrato de levedura 2,0 g
Peptona 2,0 g
Caseína hidrolizada 1,5 g
Solução de vitaminas 1,0 mL
Água destilada p/ 1.000 mL
O pH foi ajustado para 5,8 com NaOH 1 mol/L. Para MC sólido, foi acrescentado
1,5% de ágar. O meio foi autoclavado e armazenado em temperatura ambiente.
3.2.2 Meio Citros (STRINGARI, 2009)
Solução de folhas de Citros 28 g
Glicose 20 g
Água destilada p/ 1000 mL
O pH foi ajustado para 5,8 com NaOH 1 mol/L. Para meio citros sólido, foi
acrescentado 1,5% de ágar. O meio foi autoclavado e armazenado em temperatura
ambiente.
34
3.2.3 Meio Aveia (BAAYEN et al., 2002)
Aveia em flocos 20 g
Água destilada p/ 1000 mL
Ágar 15 g
A aveia foi adicionada em 800 mL de água destilada e aquecida por 20
minutos em forno microondas. A solução foi filtrada em gaze e o volume completado
para 1000 mL. O pH foi ajustado para 5,8 com NaOH 1N e o ágar acrescentado
diretamente aos frascos. O meio foi autoclavado e armazenado em temperatura
ambiente.
3.3 SOLUÇÕES E TAMPÕES
3.3.1 Tampão de Extração de DNA (RAEDER; BRODA, 1985)
Tris-HCl pH 8,0 200 mM
NaCl 250 mM
EDTA 25 mM
SDS (p/v) 1%
A solução foi preparada e aquecida a 60ºC no momento do uso.
3.3.2 Solução Tris-HCl 1 M pH 8,0 (estoque)
O pH desta solução foi ajustado para 8,0 com HCl 5 mol/L. A solução foi
autoclavada e mantida a 4°C. Ocasionalmente o pH foi ajustado para outros valores.
35
3.3.3 Solução Salina
NaCl 0,85% (p/v) em H
2
O destilada. A solução foi autoclavada e mantida a 4°C.
3.3.4 Solução EDTA 0,5 M pH 8,0 (estoque)
O pH desta solução foi ajustado para 8,0 com pastilhas de NaOH 10 mol/L. A
solução foi autoclavada e mantida a 4°C.
3.3.5 SDS 20% (p/v)
Dodecil Sulfato de Sódio 20 g
H2O Milli-Q 100 mL
A solução foi autoclavada e mantida em temperatura ambiente.
3.3.6 Fenol (SAMBROOKS, FRITSCH, MANIATIS, 1989)
A solução estoque de fenol foi derretida em banho-maria a 60ºC até obtenção
de uma fase líquida. Um volume foi transferido para um Becker e a ele foi adicionado
0,1% de 8-hidroxiquinolina, que torna a solução amarela e evita a oxidação da mesma.
Em seguida foram realizados banhos com Tris-HCl pH 8,0 em que o volume utilizado
deve ser o mesmo do Fenol. O primeiro banho foi realizado com Tris-HCl 0,5 M e os
outros com Tris-HCl 0,2 M. Ao final de cada lavagem deve se medir o pH do fenol com
uma fita indicadora. Quando ele estava superior a 7,6, foi considerado equilibrado, e
conservado a uma temperatura de 4ºC até o momento do uso.
36
3.3.7 Acetato de Sódio pH 4,7
O pH foi ajustado para 4,7 com ácido acético glacial (CH3COOH) 5 mol/L.
3.3.8 Clorofane
Fenol equilibrado e clorofórmio P.A. na proporção de 1:1.
3.3.9 Clorofil
Clorofórmio 24 volumes
Álcool Isoamílico 1 volume
3.3.10 Tampão EBA
Tris-HCl pH 8,0 50 mM
EDTA 50 mM
SDS 3%
2-Mercaptoetanol 1%
3.3.11 Tampão STE
Tris-HCl pH 8,0 10 mM
NaCl pH 8,0, 100 mM
EDTA pH 8,0 1 mM
37
3.3.12 Tampão de amostra (“gel loading buffer”)
Sacarose 38%
Azul de bromofenol 1%
EDTA 67 mM
3.3.13 Tampão TBE 5x (solução estoque)
Tris-base 54 g
Ácido Bórico 27,5 g
EDTA 0,5 M pH 8,0 20 mL
H
2
O destilada p/ 1000 mL
A solução foi autoclavada e mantida em temperatura ambiente. No momento
do uso, foi diluída convenientemente em água destilada.
3.3.14 Solução de Brometo de Etídio
O brometo de etídio foi dissolvido (1,0% p/v) em água destilada. No momento
do uso, foram adicionados 3 μl em 100 mL de água destilada. A solução foi mantida
em temperatura ambiente.
38
3.3.15 Solução de Gelred
TM
(BioAmerica)
Adicionou-se 1 μL de GelRed
TM
10.000 x concentrado em DMSO a 1000 μL
de tampão de amostra. Aplicou-se 30 % do volume total da amostra diretamente a
ela.
3.3.16 DNase (Invitrogen)
A enzima foi fornecida na concentração de 160 U/μL. Foi preparada na
concentração de 1 U/μL em tampão de reação (Tris-HCl 200 mM pH 8.4, MgCl2 20
mM, KCl 500 mM) e estocada a -20º C e utilizada conforme indicações do fabricante.
3.3.17 Nuclease S1 (Invitrogen)
A enzima foi fornecida na concentração de 1000 U/μL. Foi preparada na
concentração de 10 U/μL em Nuclease Dillution Buffer, já fornecido. Estocada a -20º
C e utilizada conforme indicações do fabricante.
3.3.18 Solução de Ciclohexamida (20 mg/mL)
Ciclohexamida 0,61g
Acetona 0,5mL
H
2
O MilliQ 30mL
A solução foi esterilizada por filtração. No momento do uso, foi diluída
convenientemente.
39
3.3.19 Solução de Tween 80
Tween 80 0,1% (v/v) em H
2
O destilada. A solução foi autoclavada e mantida a
4°C.
3.3.20 Solução de Vitaminas
Ácido Nicotínico 100,0 mg
Ácido p-Aminobenzóico 10,0 mg
Biotina 0,2 mg
Piridoxina 50,0 mg
Riboflavina 100,0 mg
Tiamina 50,0 mg
H
2
O destilada esterilizada p/ 100 mL
A solução foi aquecida em banho-maria a 98°C por 15 minutos e armazenada
em frasco escuro, previamente autoclavado, a 4°C.
3.4 PREPARO DO MATERIAL
3.4.1 Esterilização
Meios de cultura, soluções, espátulas, grais de porcelana, pistilos e alça de
transferência foram esterilizados em autoclave, à pressão de 1 atmosfera, por 20
minutos.
Vidrarias foram esterilizadas em forno Pasteur a 180º C por 4 horas.
40
3.4.2 Extração de ácidos nucléicos totais
Para a extração de ácidos nucléicos totais das linhagens estudadas foi utilizado
o protocolo de RAEDER e BRODA (1985) modificado por GLIENKE (1995).
Foram feitos pontos de repique de cada isolado em 3 placas contendo Meio
Completo (item 3.2.1) coberto por um disco de celofane. Este material foi incubado em
estufa por um período de 5 a 6 dias, dependendo do crescimento das colônias.
Após este período, os micélios foram raspados das placas utilizando espátulas
esterilizadas, vedados com filme de parafina em recipientes de vidro e mantidos em
freezer, a uma temperatura inferior a 4ºC até serem liofilizados.
Posteriormente a esta etapa, foram testados 5 tipos diferentes de extração de
ácidos nucléicos.
3.4.2.1 Extração de ácidos nucléicos totais com fenol pH 8,0
O início da extração de ácidos nucléicos totais se dá pela adição de nitrogênio
líquido aos micélios, que foram triturados em gral com um pistilo até se formar um pó
fino. Este pó foi transferido para 4 tubos eppendorf (40 – 60 mg/tubo) e 1 mL de
tampão de extração (item 3.3.1) foi adicionado, aquecido a 60ºC.
Os tubos foram homogeneizados em Vortex até a obtenção de uma solução
homogênea, e mantidos em banho-maria a 70ºC, sem submersão, por 30 minutos.
Esses tubos foram centrifugados por 10 minutos a 7618 g. O líquido sobrenadante foi
coletado e transferido para outros tubos.
Adiciona-se um volume de fenol equilibrado pH 8,0 (item 3.3.6) a cada um dos
tubos, que foram centrifugados por 15 minutos a 7618 g. Em seguida, a fase
sobrenadante foi coletada e transferida para outros tubos, aos quais se adicionou
clorofane (item 3.3.8). Foram centrifugados nas mesmas condições. Repetiu-se o
procedimento com adição de clorofil (item 3.3.9) e centrifugação por 15 minutos a 7618
g. A fase sobrenadante foi transferida para tubos novos e um volume de 60% de
isopropanol foi adicionado a ela.
41
Estes tubos foram mantidos a -20 ºC por no mínimo 1 hora, para haver
precipitação dos ácidos nucléicos. Os tubos foram centrifugados novamente por 20
minutos a 11802 g e o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi lavado com
etanol 70% (200 μL por tubo) e centrifugado por 5 minutos a 11802 g.
O etanol foi descartado e os tubos foram deixados abertos a 50ºC por 1 hora em
estufa de secagem, ou durante a noite em temperatura ambiente. Os ácidos nucléicos
foram ressuspendidos em água Milli-Q esterilizada.
3.4.2.2 Extração de ácidos nucléicos totais com fenol pH 4,7
Visando a otimização da extração de RNA foi proposta uma modificação no
protocolo de RAEDER e BRODA (1985) modificado por GLIENKE (1995). Em pH
maior que 7,0, DNA e RNA separam-se em fase aquosa. Em pH menor que 7,0, o
DNA é desnaturado, precipitando para a fase orgânica, de forma que na fase aquosa
(sobrenadante), encontre-se apenas RNA (SAMBROOK et al., 1989). O fenol (item
3.3.6) foi equilibrado com tampão ácido (obtido com ácido acético glacial P.A.) acetato
de sódio pH 4,7, aplicando-se 65 μL deste tampão a cada 1 ml da solução de fenol.
(BIOAGENCY BIOTECNOLOGIA, 2009).
3.4.2.3 Extração de ácidos nucléicos totais com 2-mercaptoetanol (BALLIJA,
KVARNHEDEN e TURCHETTI, 2008)
Num tubo eppendorf, 40 – 60 mg desse pó foram ressuspendidos em 600 μL
do tempão EBA (item 3.3.10). A suspensão foi centrifugada a 4º C por 15 minutos a
11500 rpm e o sobrenadante foi coletado e ajustado a uma concentração final de
20% etanol. Adicionou-se o tampão STE-20% E (item 3.3.11) e centrifugou-se o tubo
por 15 minutos a 11500 rpm. O “pellet” obtido foi lavado com etanol e o tubo foi
colocado para secar.
42
3.4.2.4 Viral Nucleic Acid Extraction Kit (RBC BIOSCIENCE)
O kit foi utilizado conforme instruções do fabricante.
3.4.2.5 AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (AXYGEN BIOSCIENCES)
O kit foi utilizado conforme instruções do fabricante.
3.4.3 Eletroforese
A eletroforese foi conduzida em gel de agarose 1% banhado por tampão TBE 1x
(item 3.3.13) a 3 V/cm, para quantificação, ou em agarose 1,5%, após PCR. O
padrão de peso molecular foi o DNA do fago λ clivado com a enzima HindIII, ou
Ladder de DNA 100 pb (Invitrogen). A observação das bandas foi feita em
transiluminador de luz ultravioleta após imersão em solução de brometo de etídio
(item 3.3.14), ou com o corante Gelred
TM
(Uniscience) (item 3.3.15) aplicado
diretamente no gel.
3.4.4 Cura do RNAdf
Dois procedimentos para a obtenção de linhagens livres de RNAdf foram
utilizados. O primeiro envolve o uso de ciclohexamida (item 3.3.18), um inibidor da
síntese protéica que impede a liberação do tRNA desacilado do sítio peptidil (P) do
ribossomo (BOTTGER, BLANAR e FLAVELL, 1988). Após a fusão do meio, quando
este apresenta uma temperatura entre 45 e 50ºC, adicionou-se ciclohexamida em
concentrações variadas (100, 50, 15, 10, 5, 1 e 0,5 μg/mL). Logo depois o meio foi
homogeneizado para ser vertido em placas de Petri.
43
O outro procedimento foi através da incubação das colônias em temperatura
moderadamente alta (35ºC) por duas gerações. De início, para cada isolado foi
realizado um repique em Meio Completo. As placas de Petri ficaram em estufa a
35ºC por 20 dias e, a partir das colônias que se desenvolveram, foi realizado mais
um repique para obter a 2ª geração nessa temperatura. Após 20 dias foi realizado o
3º repique, porém, neste, as placas ficaram em estufa a 28ºC.
Todos os repiques foram feitos com auxílio de lupa para a secção das pontas
das hifas crescidas nos meios de cultura (repiques de pontas de hifas).
3.4.5 Caracterização dos isolados com e sem vírus
Para se diferenciar linhagens dentro da espécie G. citricarpa foram realizados
dois procedimentos. O primeiro incluiu o uso da técnica de RAPD para a tentativa de
obtenção de um marcador molecular capaz de identificar isolados portadores de
RNAdf de outros sem infecção.
Para o RAPD, uma alíquota de 1 µL do DNA extraído foi diluído na proporção
de 1:100 μL ou diluição apropriada para a concentração final de 50 ng/μL de DNA
em H
2
O Milli-Q. As reações de RAPD foram preparadas em tubos novos
esterilizados de 0,2 mL. Para cada “primer” utilizado foi feito um “mix” contendo 3
mM de MgCl
2
, tampão PCR 1x, 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 U de Taq polimerase
(0,3 µL) em um volume final de 25 µL.
A amplificação foi realizada em um termociclador Eppendorf (Modelo:
Mastercycler gradient) de acordo com as seguintes etapas: desnaturação inicial a
95ºC por 4 minutos, 40 ciclos de 1 minuto a 92ºC, 1,5 minuto a 37ºC, 2 minutos a
72ºC e extensão final de 3 minutos a 72ºC. Os “primers” utilizados foram da Operon
Technologies, conforme indica o Quadro 3.
44
PRIMER
SEQUÊNCIA
OPX 11
5’ GGAGCCTCAG 3’
OPX 14
5’ ACAGGTGCTG 3’
OPX 17
5’ GACACGGACC 3’
OPX 19
5’ TGGCAAGGCA 3’
QUADRO 3 - SEQUÊNCIAS DOS “PRIMERS” UTILIZADOS NO RAPD
FONTE: Operon Technologies®
A identificação morfológica das linhagens de G. citricarpa foi realizada de
acordo com BAAYEN et al., 2002.
As colônias foram inoculadas em meio Aveia (item 3.2.3) e incubadas por 7 a
10 dias, à 22ºC na ausência de luz. As linhagens foram analisadas quanto à
presença ou ausência de um halo amarelo ao redor da colônia. STRINGARI, 2009,
relatou algumas linhagens desta espécie que não formam halo neste meio (Quadro
2).
3.4.6 Transmissão horizontal de RNAdf
Duas linhagens foram inoculadas no centro de uma placa de Petri com Meio
Citrus (item 3.3.2) a uma distância de um centímetro entre os inóculos. A morfologia
das colônias foi observada após o crescimento por 14 dias a 28ºC.
As linhagens de G. citricarpa que apresentaram compatibilidade foram
utilizadas para a transferência horizontal de RNAdf. O isolado PC 33/05, portador do
vírus de RNAdf, foi inoculado com outros livres do vírus e não formadores de halo,
em Meio Citrus (item 3.3.2). Foram realizadas 3 repetições desses repiques,
totalizando 36 placas. Depois de 25 dias de crescimento a 28ºC, foi feita uma coleta
dos esporos da região de encontro entre os isolados. Foi feita uma suspensão de
esporos num tubo Falcon com 2 mL de solução Tween (item 3.3.19). Com o auxílio
de um bastão de vidro esse material foi macerado contra as paredes do Falcon até a
solução ficar levemente turva, e na sequência foi plaqueada com auxílio de uma alça
de Drigalski em placas contendo Meio Citrus (item 3.3.2). As colônias monospóricas
45
obtidas foram repicadas em Meio Aveia (item 3.3.3). Aquelas que se desenvolveram
sem o surgimento do halo foram investigadas quanto a presença de RNAdf.
3.4.7 Comparação da morfologia e crescimento radial de linhagens isogênicas
Linhagens submetidas aos protocolos de cura e de transmissão de RNAdf
foram avaliadas quanto a presença ou ausência da banda de RNAdf em gel de
agarose. Em seguida, as linhagens sem banda de RNAdf, submetidas ao protocolo
de cura e as com banda, após o protocolo de transmissão foram analisadas quanto
ao crescimento radial das colônias. As linhagens selvagens submetidas ao
experimento de cura foram comparadas com seus respectivos setores formados. As
linhagens sem RNAdf submetidas a anastomose de hifas foram comparadas com as
colônias que possivelmente receberam o vírus após contato de hifas.
As linhagens foram repicadas em Meio Completo (item 3.3.1) com um furador
de rolha de 8 mm e incubadas em estufa a 28 ºC. Após 15 dias de crescimento, o
tamanho da colônia foi mensurado. Cinco repetições foram feitas para cada isolado.
Testes estatísticos para a comparação de linhagens portadoras e não-
portadoras dos vírus de RNAdf foram feitos com o programa ASSISTAT 7.5 beta
(SILVA, 2010). Para estes testes, foi utilizado o delineamento estatístico inteiramente
casualizado (DIC) e a partir dos dados obtidos, foi realizada a análise de variância
(ANOVA) e o teste de Tukey para médias.
3.4.8 Produção de cDNA
Foi utilizado o protocolo descrito por PARK et al. (2004) para produção de
cDNA de RNAdf de Chalara elegans, com algumas modificações.
Uma amostra de 2,5 μL de RNAdf foi misturada com 2 μL de Random Primers
(3 μg/μL) (Invitrogen), fervida por 10 minutos para desnaturação da fita dupla e
imersa imediatamente em gelo. O cDNA da primeira fita foi sintetizado usando 3,5
μL da amostra previamente obtida junto de 1 μL de DTT 100 mM (Invitrogen), 2 μL
46
de “First Strand Buffer” 5x (Invitrogen), 0,5 μL de cada dNTP (10 mM), 0,5 μL de
“Superscript L1 Reverse Transcriptase” 50 U (Invitrogen) e 2 μL de água Milli-Q. A
mistura foi incubada a 42
o
C por 45 minutos e desnaturada a 99
o
C por 5 minutos. O
cDNA da segunda fita foi sintetizado em reações de PCR contendo 14 μL do produto
da primeira fita, 1 μL de cada dNTP (10 mM), 1,5 μL de MgCl
2
(50 mM), 1 μL de
“Random Primers” (3 μg/μL), 0,5 μL de Taq polimerase (5 U/μL), 2,5 μL de tampão
de Taq polimerase e 30,5 μL de água Milli-Q. As condições de amplificação foram: 1
ciclo a 94
o
C por 5 minutos, 35 ciclos a 94
o
C por 1 minuto, 55
o
C por 45 segundos,
72
o
C por 2 minutos e um ciclo a 72
o
C por 10 minutos, para a extensão final. Os
produtos amplificados após RT-PCR foram submetidos à eletroforese, 3 V/cm por 2
horas em gel 1% e visualizados com auxílio de luz ultravioleta.
3.4.9 Filogenia
Com base nas sequências de regiões codificadoras dos genomas de vírus da
família Totiviridae obtidas no NCBI, foi formado um alinhamento de nucleotídeos
através do BioEdit versão 7.0.5.3 (HALL, 1999), programa Clustal W (LARKING et
al., 2007). A tradução para a sequência de aminoácidos foi feita pelo programa
MEGA versão 4 (TAMURA et al., 2007). Em seguida, foram submetidas ao programa
PAUP 4.0b10 (SWOFFORD, 2002), no qual foi feita uma análise de parcimônia com
bootstrap = 1000, com o fitovírus “Black raspberry Virus F” como “outgroup”. As
árvores obtidas foram desenhadas com o programa Mesquite 2.72 (MADDISON e
MADDISON, 2009). Também foram analisadas as regiões ITS1-5,8S-ITS2 das
espécies fúngicas hospedeiras destes micovírus, seguindo a mesma metodologia.
47
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 COMPARAÇÃO DOS DIFERENTES PROTOCOLOS DE EXTRAÇÃO DE
ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS
Um isolado positivo para teste de patogenicidade de G. citricarpa, PC33/05,
previamente descrito por SILVA et al., (2008) como portador de vírus de RNAdf, foi
selecionado como modelo para o estudo.
A Figura 1 mostra resultados obtidos após tratamentos com fenol e 2-
mercaptoetanol.
FIGURA 1 – ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DO ISOLADO PC33/05 OBTIDOS COM FENOL E 2-
MERCAPTOETANOL
NOTA: M: DNA do fago λ clivado com Hind III. A: PC33/05 após extração com 2-mercaptoetanol. B:
PC33/05 após extração com fenol pH 8,0. C: extração com 2-mercaptoetanol, protocolo
modificado. Seta indica banda de RNAdf.
FONTE: O autor (2010)
O protocolo de extração com 2-mercaptoetanol apresenta melhorias quanto
ao que utiliza fenol, devido à velocidade da obtenção de resultados além da pureza
das amostras obtidas (BALIJJA; KVARNHEDEN; TURCHETTI, 2008). Como não
foram utilizadas micro-colunas tratadas com celulose CF-11, a qual possui afinidade
com RNA dupla-fita, como o autor sugere, nenhum material genético pode ser
visualizado utilizando essa metodologia (FIGURA 1, A). No entanto, o uso de etanol
23130pb
9416pb
6557pb
4361pb
2322pb
2027pb
48
a 4 ºC permitiu que o material genético extraído precipitasse (Figura 1, C). O DNA
genômico nesta canaleta pode ser observado e apresentou 10,8 ng, após
quantificação em espectofotômetro, mas ainda assim a banda de RNAdf, não.
Dados da literatura mostram que a concentração de RNAdf obtida após purificação
de ácidos nucléicos totais é pequena quando comparada com o DNA genômico total
da amostra. Por isso, existe a possibilidade da concentração de RNAdf não ter sido
suficiente para ser visualizada em eletroforese.
Também foram testados um protocolo de extração com fenol ácido e dois kits
comerciais para extração de RNA: Viral Nucleic Acid Extraction Kit (RBC Bioscience)
e AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences), conforme
instruções dos fabricantes.
Separações de ácidos nucléicos por fenol são pH dependentes, por isso pode-
se utilizar tampões para auxiliar na separação do ácido nucléico desejado. O uso de
fenol equilibrado com acetato de sódio pH 4,7 produziu resultados melhores que fenol
pH 8,0 e que os “kits” testados (Quadro 4).
Foram utilizados 30 mg de micélio triturado em nitrogênio líquido para cada
um dos testes, e após eletroforese, observou-se o seguinte padrão de bandas
(Figura 2). A e B.
FIGURA 2 – ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DO ISOLADO PC33/05
NOTA: M: DNA do fago λ clivado com Hind III. A: PC33/05 após extração com fenol pH 8,0. B:
PC33/05 após extração com fenol ácido pH 4,7. C: PC33/05 após extração com Viral Nucleic
Acid Extraction Kit (RBC Bioscience). D: PC33/05 após extração com AxyPrep Multisource
Total RNA Miniprep Kit (Axygen Biosciences). Seta indica banda de RNAdf.
FONTE: O autor (2010)
23130pb
9416pb
6557pb
4361pb
2322pb
2027pb
49
Fenol pH 8,0
Fenol pH 4,7
Kit RBC
Kit Axygen
DNA
RNAdf
DNA
RNAdf
DNA
RNAdf
DNA
RNAdf
54,88 ng
5,62 ng
-
9,4 ng
65,63 ng
-
62,80 ng
7,2 ng
QUADRO 4 – QUANTIFICAÇÃO DE DNA GENÔMICO E RNA DUPLA-FITA
FONTE: O Autor (2010).
Na quantificação dos ácidos nucléicos totais, observou-se a degradação da
banda de DNA genômico pelo fenol ácido e aumento da purificação do RNAdf. O
resultado obtido com “Viral Nucleic Acid Extraction Kit” (FIGURA 2, C) apresenta
grande arraste de material na canaleta, o que revela um baixo potencial de
purificação para RNAdf de fungos filamentosos, como a G. citricarpa. O resultado
obtido com “Axyprep Multisource Total RNA Miniprep Kit” (FIGURA 2, D), embora
melhor que a anterior em relação à banda de RNAdf, ainda assim apresenta arraste
de material no gel. Para obtenção de uma amostra contendo apenas RNAdf, pronta
para ser submetida a RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR), foram realizados
tratamentos enzimáticos utilizando DNase e Nuclease S1 (FIGURA 3).
FIGURA 3 – ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DO ISOLADO PC33/05 TRATADOS COM DNASE E
NUCLEASE S1
NOTA: M: DNA do fago λ clivado com Hind III. A: PC33/05 após tratamento com DNase e Nuclase
S1. Seta indica banda de RNAdf.
FONTE: O Autor (2010)
23130pb
9416pb
6557pb
4361pb
2322pb
2027pb
50
Utilizando o programa Kodak D-1, foi feita uma estimativa do tamanho do
fragmento de RNAdf em nucleotídeos, além de uma quantificação mais precisa
deste material (Quadro 5).
λ Hind III
PESO MOLECULAR (pb)
λ Hind III
MASSA (ng)
RNAdf
PESO MOLECULAR (pb)
RNAdf
MASSA (ng)
23130
476,9
3795
36,19
9416
194,1
6557
135,2
4361
89,9
2322
47,9
2027
41,8
QUADRO 5 – QUANTIFICAÇÃO E ESTIMATIVA DO TAMANHO DA BANDA DE RNA DUPLA-FITA
DE PC33/05
FONTE: O Autor (2010)
O vírus de RNAdf do fungo Magnaporthe oryzae, recentemente sequenciado,
possui 5193 pares de base. Como apenas uma única banda foi apresentada no gel,
acredita-se que esse vírus é pertencente da família Totiviridae (MAEJIMA et al.,
2008), pois além do sequenciamento do genoma e análise das subunidades da
proteína RDRP, este é um critério que possibilita a classificação taxonômica destes
vírus em nível de família (MERTENS, 2004).
O vírus PoV-1, do basidiomiceto Pleurotus ostreatus, possui dois segmentos
de 2,3 kb e 2,2 kb, cada um contendo uma ORF na fita positiva (codificante), o que
possibilita enquadrar esse vírus na família Partitiviridae. Após o sequenciamento
dessas duas moléculas e análise computacional dos aminoácidos deduzidos das
ORFs, observou-se uma alta similaridade com as proteínas encontradas na família
Partitiviridae. Com base nisso, e pelo fato do vírus infectar um fungo, ele foi inserido
no gênero Partitivirus (LIM et al., 2004).
Em Fusarium graminearum encontrou-se uma molécula de RNAdf de 7,5 kb
relacionada com hipovirulência no trigo. Após o sequenciamento parcial de dois
clones dela, não foram encontraram os 8 motivos conservados para a RDRP, já
relatados em outros vírus. Uma identificação taxonômica com outros vírus de RNAdf
não foi possível, provavelmente pela grande diversidade de nucleotídeos das
regiões sequenciadas (CHU et al., 2002).
51
O sequenciamento do vírus EfV1 (“Epichloe festucae virus 1”), de 5109
nucleotídeos, revelou a existência de 2 ORFs comuns para vírus da família
Totiviridae: a primeira codifica para a CP e a segunda para a RDRP. Ambas
apresentaram homologia com proteínas de vírus desta família, e os 8 motivos
conservados em replicases de vírus de RNA foram encontrados na ORF 2 (ROMO et
al., 2006). Os autores também encontraram isolados de E. festucae em diferentes
regiões da Espanha contendo moléculas de RNAdf. Estas apresentavam 5,1 kb e
hibridaram com EfV1 após “Northern blotting” com sondas específicas para este
vírus. Isto sugere que além da alta incidência do vírus, ele está geograficamente
espalhado nesta espécie em diferentes ecossistemas.
Apesar do tamanho do genoma do vírus de G. citricarpa estar mais próximo
do descrito para a família Partitiviridae, a presença de um único fragmento de RNAdf
indica que ele pertence à família Totiviridae. O sequenciamento desse genoma,
assim como a análise das regiões 3’UTR (cauda poli-A) e 5’UTR são importantes
para uma confirmação da posição taxonômica destes micovírus, pois já foi relatado
que vírus da família Totiviridae possuem um segmento de 4,6 a 6,7 kb, enquanto
que da família Partitiviridae esse tamanho se encontra entre 1,4 a 3,0 kb (WICKNER
et al., 2000).
4.2 Obtenção das linhagens isogênicas
As três formas de obtenção de isogenia no fungo G. citricarpa testadas foram
cura de linhagens por ciclohexamida, repiques de ponta de hifa em temperatura
moderadamente elevada (estresse térmico) e anastomose de hifas.
4.2.1 Cura do RNAdf em G. citricarpa
4.2.1.1 Ciclohexamida
52
As linhagens relacionadas no Quadro 1, que apresentam RNAdf, foram
avaliadas quanto às consequências de ciclohexamida adicionada ao meio de cultura.
O ensaio com ciclohexamida não forneceu resultados positivos – as linhagens
que foram tratadas com essa substância, inclusive na menor concentração utilizada
(0,5 μg/μL), não apresentaram crescimento mesmo após 30 dias, incubadas a 28º C.
Desta forma, foi verificado que esta substância inibe completamente o
desenvolvimento desta espécie.
Um isolado de Endothia parasítica foi curado da sua infecção por RNAdf
utilizando ciclohexamida. Dois outros isolados não foram curados, possivelmente
devido a uma alta concentração do vírus nos hospedeiros. As linhagens curadas
apresentaram aumento na virulência, o que sugere que um fenótipo hipovirulento
está associado a este RNAdf (FULBRIGHT, 1984).
Três isolados de Fusarium oxysporum contendo RNAdf (1, 3 e 6) foram
cultivados com ciclohexamida acrescentada ao meio, em concentrações variadas
(15, 20, 40, 60, 140 e 280 µg/ml). Nenhuma tentativa de cura resultou em linhagens
livres de RNAdf, e o crescimento das linhagens foi mais lento nas placas com maior
concentração de ciclohexamida (KILIC, 1998).
A cura de um isolado do fungo Nectria radicicola de seus quatro tipos de
RNAdf (L1, L2, M e S) foi obtida após mais de 3000 tentativas com o uso de
ciclohexamida (10 ppm). As linhagens livres dos vírus L2, M e S não mostraram
diferenças significantes na morfologia geral da colônia. No entanto, o isolado que foi
curado do vírus L1 cresceu com uma coloração branca e não mostrou sintomas de
virulência em testes de patogenicidade (AHN e LEE, 2001), o que sugere a
associação do vírus com hipervirulência do fungo.
O isolado BK18 do fungo Chalara elegans foi submetido ao tratamento com
ciclohexamida (5 e 10 µg/ml) para tentativa de eliminar seu RNAdf. Após dois terços
da placa estar coberta pelo micélio fúngico, “plugs” da margem da colônia foram
transferidos a novas placas com ciclohexamida na mesma concentração, por 4
gerações. O indivíduo não foi curado, pois o padrão de bandas observado em gel de
agarose foi o mesmo do isolado BK18 selvagem (PARK, CHEN e PUNJA, 2006).
53
4.2.1.2 Repique de ponta de hifa em cultura a 35º C
Resultados positivos foram observados em relação ao estresse térmico
(Quadro 6). Apesar de grande parte das repetições desse experimento ter sido
negativa devido à alta sensibilidade da espécie G. citricarpa a mudanças bruscas de
temperatura (Figura 4), os isolados PC7LD6 e ECLaP apresentaram setorização
(Figuras 5 e 6). Os setores obtidos tiveram seus ácidos nucléicos totais extraídos
para se verificar o sucesso do protocolo de cura do vírus (Figuras 7 e 8).
Isolado
Crescimento a 35º C
Setorização a 28 ºC
Presença de bandas de RNAdf
PC33/05
-
-
-
ECLAP
+
+ (Setor A)
-
+ (Setor B)
-
+ (Setor C)
-
+ (Setor D)
+
+ (Setor E)
+
PC3C
-
-
-
PCIAC19/02
+
-
-
PC7LD6
+
+ (Setor 1)
-
+ (Setor 2)
-
+ (Setor 3)
-
+ (Setor 4)
-
+ (Setor 5)
-
+ (Setor 6)
-
PC28/05
-
-
-
PC7LE10
-
-
-
QUADRO 6 – RESULTADOS DO EXPERIMENTO DE CURA APÓS ESTRESSE TÉRMICO E
REPIQUES DE PONTAS DE HIFA PARA TODOS OS ISOLADOS TESTADOS
NOTA: (+) presente, (-) ausente
FONTE: O Autor (2010).
54
FIGURA 4 – MORFOLOGIA DO ISOLADO ECLaP APÓS 21 DIAS A 35º C
NOTA: A: aparência macroscópica das colônias. B: micélio observado com lupa, aumento de 4x.
FONTE: O Autor (2010).
FIGURA 5 – MORFOLOGIA DO ISOLADO ECLaP
NOTA: A: colônia cultivada a 28 ºC. B: colônia obtida após 2 gerações a 35ºC
FONTE: O Autor (2010).
FIGURA 6 – MORFOLOGIA DO ISOLADO PC7LD6 CULTIVADA A 35 ºC POR 21 DIAS
Fonte: O Autor (2010).
A
B
A
B
55
FIGURA 7 – ELETROFORESE DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DOS SETORES DO ISOLADO
PC7LD6
NOTA: M: DNA do fago λ clivado com Hind III. Números de 1 a 6 indicam os setores, sem RNAdf
FONTE: O Autor (2010).
FIGURA 8 – ELETROFORESE DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DOS SETORES DO ISOLADO
ECLaP
NOTA: M: DNA do fago λ clivado com Hind III. Canaletas D e E revelam bandas de RNAdf, enquanto
que as outras, não. Setas indicam bandas de RNAdf
FONTE: O Autor (2010).
A banda de RNAdf não foi observada em nenhum dos setores do isolado
PC7LD6 (Figura 7).
Cinco setores obtidos a partir do isolado ECLaP foram investigados para
averiguar a possível cura do RNAdf. Destes, em três não foi possível identificar
banda de RNAdf após eletroforese em gel de agarose. A partir dos ácidos nucléicos
purificados de dois setores, foi possível identificar bandas tênues de RNAdf (Figura
23130pb
9416pb
6557pb
4361pb
2322pb
2027pb
23130pb
9416pb
6557pb
4361pb
2322pb
2027pb
56
8). Portanto, este protocolo apresenta uma taxa de sucesso variável para G.
citricarpa. O estresse térmico provavelmente diminuiu a concentração do vírus no
fungo, e ocasionou a eliminação dele em alguns casos.
Esse fato corrobora com os resultados obtidos com a caracterização
morfológica do tamanho das colônias observadas. Estatisticamente, após a medida
do tamanho da colônia de 15 dias, os setores de 1 a 6 do isolado PC7LD6 não
formaram um grupo que contrasta com o isolado selvagem (APÊNDICE 1, FIGURA
9).
A mesma observação foi feita no isolado ECLaP. Não há diferença estatística
que envolva o tamanho da colônia com diferentes concentrações de RNAdf entre
seus setores. Inclusive, os setores D e E, que não perderam o vírus durante as
gerações em que foram submetidos a estresse térmico, também mostram
semelhança entre os isolados em que a banda de RNAdf não foi detectada em gel
de agarose e o isolado original que não sofreu tratamento (APÊNDICE 2, FIGURA
9).
FIGURA 9 – TAMANHO DA COLÔNIA DOS ISOLADOS SELVAGENS E RESPECTIVOS SETORES,
APÓS 15 DIAS DE CULTURA
FONTE: O Autor (2010).
57
Trabalhos anteriores relataram a obtenção de setores livres de RNAdf de
isolados de G. citricarpa submetidos ao tratamento de cura por estresse térmico
(SILVA, 2008). No entanto, uma investigação posterior destes setores mostrou a
banda de RNAdf presente em gel de agarose (SILVANO, 2008). A autora considera
que este protocolo não é eficaz para eliminar o vírus dessa espécie de fungo, mas
apenas para baixar a concentração dele em níveis não visualizados em gel.
Aproximadamente 25 anos atrás, foi relatado que mutantes clo- de S.
cerevisae não eram capazes de manter as formas L-B e L-C de RNAdf dentro de
suas células, e que a baixa concentração dessas moléculas permitiu a visualização
de outras formas desse material genético, então chamados de T e W, normalmente
encontrados numa concentração baixa. Quando essas linhagens foram mantidas a
37ºC, houve um aumento de 10x na concentração destes RNAdf. (WESOLOWSKI e
WICKNER, 1984)
A espécie Cystofilobasidium infirmominiatum, que apresenta micocinogenia
resultante da presença de RNAdf, também foi curada através de estresse térmico.
Linhagens micocinogênicas são imunes à toxina que elas mesmas secretam, mas
matam células que não possuem as formas L e M de RNAdf. Indivíduos que não são
capazes de matar os outros representaram 4% da população restante que foi
submetida ao processo de cura. A maioria foi sensível à toxina secretada pelo
isolado parental, o que é um indicativo que os RNAdf responsáveis por esse
fenômeno foram eliminados (GOLUBEV et al., 2003).
Secção de pontas de hifa foi feita para obter a cura em Rosellinia necatrix,
além de crescimento em meio aveia empobrecido (apenas 1/5 da quantidade de
aveia foi utilizada). O isolado w790, que foi curado, mostrou virulência e taxa de
crescimento similares a outros isolados semelhantes. Quando w790 apresentava
RNAdf, cresceu de forma mais lenta quando comparado com outras linhagens
(IKEDA, NAKAMURA, MATSUMOTO, 2005).
Um isolado selvagem de Aspergillus niger com RNAdf, encontrado na
Holanda, formou setores sem conídios e com taxa de crescimento reduzida.
Observou-se que esse fenótipo anormal possui concentração de micovírus elevada
quando comparada com o micélio adjacente da colônia, devido à intensidade das
bandas de RNAdf. Este foi o único isolado que foi curado através de isolamento
sequencial de ponta de hifa de um total de 10 indivíduos. (DIAPENINGEN, DEBETS
e HOESKSTRA, 2007)
58
Um vírus de RNAdf que infecta o endofítico Epichlöe festucae foi identificado
como pertencente a família Totiviridae. Após submeterem as linhagens infectadas a
temperaturas elevadas (37º C), os autores observaram que ao invés da cura dos
indivíduos, a concentração do vírus aumentou. Este fato sugere a destruição de
mecanismos mantenedores da homeostase nas células (ROMO et al., 2007).
A perda de “fitness” em populações de vírus é comum após vários eventos de
gargalo, como consequência do acúmulo de mutações deletérias previstas pelo
processo de Muller (Muller´s ratchet). Isso se deve a ausência de um mecanismo de
revisão nas polimerases virais (IGLESIA e ELENA, 2007). O protocolo de cura por
temperatura moderadamente elevada pode levar a um evento de gargalo na
população dos micovírus. Em populações grandes, genomas contendo mutações
reversas ou compensatórias são mais comuns, enquanto que isso pode não
acontecer em populações pequenas. Os autores relatam que isso foi observado para
o vírus do mosaico do pepino (CMV), em que cada evento de infecção de plantas
por afídios era considerado como um potencial gargalo de garrafa. Essa foi a
primeira vez que o processo de Muller foi relatado em fitovírus, enquanto que para
micovírus essa relação nunca foi descrita.
4.2.2 Transmissão de RNAdf entre linhagens
Quatro isolados de G. mangiferae (EC13C, EC21C, ECOL13 e PG1515)
foram testados com isolados de G. citricarpa (PC3C, PC7LD6 e PC7LE10) para se
testar a compatibilidade entre eles. No entanto, em nenhum dos casos houve
contato entre as hifas (FIGURA 10), impossibilitando o uso destes para os ensaios
de transmissão.
59
FIGURA 10 – TESTE DE COMPATIBILIDADE VEGETATIVA ENTRE ISOLADOS DE Guignardia sp
NOTA: PC3C, À ESQUERDA, E EC13C, À DIREITA, APÓS 25 DIAS EM MC, 28ºC
FONTE: O Autor (2010).
Os ensaios de compatibilidade foram restringidos apenas entre isolados da
espécie G. citricarpa, os quais apresentaram compatibilidade vegetativa (Figura 11).
FIGURA 11 – TESTE DE COMPATIBILIDADE ENTRE ISOLADOS DE G. citricarpa
NOTA: A: PCIAC19/02 pareada com PC3G, B: PCIAC19/02 pareada com PC13/96. APÓS 25 DIAS
EM MC, 28ºC
FONTE: O Autor (2010).
Alvarez et al. (2009) relatou a dificuldade em se obter marcadores
morfológicos de rápida identificação, como crescimento, morfologia da colônia ou
coloração, por exemplo, para a espécie G. citricarpa.
Tentou-se a identificação de bandas de RAPD que fossem capazes de
diferenciar esses indivíduos. No entanto, o uso dos “primers” OPX11, OPX14,
OPX17 e OPX19 não foi capaz de separar intraespecificamente os isolados
estudados. Esses dados corroboram com os obtidos por STRINGARI (2009), em que
o sequenciamento das regiões ITS e EF não mostraram variabilidade entre isolados,
e os marcadores RAPD permitiram apenas detectar a baixa variabilidade entre
A
B
60
isolados de G. citricarpa sem, entretanto, serem observados grupos com bom
suporte “bootstrap”.
Um marcador morfológico descrito por Baayen et al., (2002), foi definido para
esse fungo. Segundo os autores, quando G. citricarpa é cultivada em Meio Aveia pH
5,8 a 22º C, na ausência de luz, após 7 ou 10 dias, pode-se observar um halo
amarelo ao redor da colônia. STRINGARI, 2009, também estudou esse marcador e
observou que alguns isolados apresentam falso-negativos, ou seja, mesmo
pertencendo a essa espécie, não formam halo: 12 indivíduos com essas
características foram utilizados para formar o grupo de isolados não portadores de
RNAdf (não formadores de halo), ensaiados com PC33/05, portador de RNAdf
(formador de halo).
O ensaio de compatibilidade apresentou 100% de sucesso entre esses
grupos (FIGURA 12).
61
PC33/05 x FTMi3.1
PC33/05 x FTMO9.2
PC33/05 x FTP25.6
PC33/05 x FTP27.3
PC33/05 x FTP31
PC33/05 x FTP33.4
PC33/05 x FTMi2.5
PC33/05 x FTP3.12
PC33/05 x FTP4.11
PC33/05 x FTP6.15
PC33/05 x FTP7.1
PC33/05 x FTP11.3
FIGURA 12 – ENSAIO DE COMPATIBILIDADE ENTRE ISOLADOS DE G. citricarpa.
NOTA: PC33/05 à esquerda e isolados não formadores de halo à direita, após 25 dias em mc, 28ºC.
FONTE: O Autor (2010).
62
Foi feita uma solução de esporos da região de contato entre os isolados que
foi vertida em 108 placas. Após quatro dias de incubação a 28ºC, observou-se o
crescimento de aproximadamente 2500 colônias monospóricas dos 12 ensaios
(FIGURA 13).
FIGURA 13 – COLÔNIAS MONOSPÓRICAS OBTIDAS ENTRE PC33/05 E FTMI2.5
FONTE: O Autor (2010).
As colônias monospóricas resultantes foram incubadas em placas com Meio
Aveia, pH 5,8, a 22º C, no escuro. Após 7 e 10 dias de crescimento, foram
analisadas quanto a ausência de halo (Figura 14), pois os isolados de G. citricarpa
que são considerados falso-negativos para este marcador são aqueles que devem
ter recebido o vírus de PC33/05.
FIGURA 14 – COLÔNIAS REPICADAS EM MEIO AVEIA PARA AVALIAÇÃO DO MARCADOR
MORFOLÓGICO
FONTE: O Autor (2010).
Dentre as 2500 colônias, apenas 27 pertencentes a 4 isolados (FTMi2.5,
FTMi3.1, FTP7.1 e FTP11.3) não apresentaram halo e foram investigadas quanto a
presença de RNAdf. Apenas 7 (28,92%) possivelmente receberam o RNAdf
(TABELA 1, FIGURA 15).
63
FIGURA 15 – ÁCIDOS NUCLÉICOS TOTAIS DOS ISOLADOS QUE NÃO APRESENTARAM HALO
NOTA: M : DNA do fago λ clivado com Hind III. 1: FTMi2.5. 2: FTMi3.1. 3: FTP7.1. 4: FTP11.3. Setas
indicam bandas de RNAdf.
FONTE: O Autor (2010).
TABELA 1 – RESULTADOS DO EXPERIMENTO DE TRANSMISSÃO
Isolado
Colônias monospóricas sem halo
Colônias que receberam o vírus
FTMi2.5
8
3
FTMi3.1
4
1
FTP7.1
7
1
FTP11.3
8
2
Total
27 (100%)
7 (28,92%)
Fonte: O Autor (2010).
Após a realização do teste Tukey para determinar a influência do vírus de
RNAdf na taxa de crescimento das colônias infectadas, foi possível criar dois grupos
bem definidos, em que o isolado sem vírus apresenta maior crescimento radial do
que seus respectivos isogênicos, com vírus (APÊNDICES 3, 4 e 5, FIGURA 16).
23130pb
9416pb
6557pb
4361pb
2322pb
2027pb
64
Uma linhagem isogênica de FTP11.3, que apresentou a banda de RNAdf num
primeiro momento, perdeu o vírus espontaneamente. Isso foi percebido após a
comparação das medidas das colônias, pois ela agrupou com o isolado selvagem,
(APÊNDICE 6, FIGURA 16). Após uma nova investigação de seus ácidos nucléicos
totais, percebeu-se a ausência da banda de RNAdf.
FIGURA 16 – TAMANHO DA COLÔNIA DOS ISOLADOS SELVAGENS E RESPECTIVAS
COLÔNIAS QUE RECEBERAM O VÍRUS, APÓS 15 DIAS DE CRESCIMENTO
FONTE: O Autor (2010).
Geneticamente, o que ocasiona que a população de vírus de um clone se
comporte de maneira diferente da população existente em outros hospedeiros,
quando sob as mesmas condições ambientais, é a deriva genética viral. Cada vez
que um afídio transmitiu o vírus do mosaico do pepino (CMV) para o hospedeiro
vegetal, houve uma perda de 35% do fitness da população resultante (IGLESIA e
ELENA, 2007). Tanto no trabalho descrito pelos dois autores como nos
experimentos realizados com G. citricarpa, tratou-se de transmissão horizontal do
vírus para diferentes indivíduos.
Em transmissões horizontais, gargalos surgidos nas populações são bastante
severos, indicando que o efeito fundador aliado com a deriva genética é
65
importantíssimo quando se modela a evolução de vírus (BETANCOURT et al.,
2008).
Micovírus não são capazes de entrar nas células hospedeiras de forma
extracelular, pois não secretam nenhuma enzima que poderia realizar essa ação.
Eles são transmitidos intracelularmente durante a divisão celular, esporogenese e
fusão celular (NUSS, 2005).
A transmissão de vírus de RNAdf entre outros isolados é um fenômeno
altamente variável. A ocorrência de transmissão horizontal foi verificada entre
isolados homocarióticos e heterocarióticos de Heterobasidium annosum, tanto de
pontas de hifa como por conídios. Isto contrasta com outros estudos em que a
incompatibilidade vegetativa inibiu a transmissão viral (IHMARK, 2002).
RNAdf foi transmitido após anastomose entre diferentes isolados de Fusarium
gramineraum. Colônias infectadas compartilharam o mesmo fenótipo que a colônia
de onde o vírus veio. Esse fenótipo consistiu de crescimento lento, bordas
irregulares da colônia e uma coloração vermelho-escura (CHU, 2002).
Foi observada uma frequência de 10% de sucesso em tentativas de
transmissão em Helicobasidium mompa, o fungo que causa uma podridão na raiz de
macieiras, quando um isolado doador dicariótico foi pareado com dois isolados
monocarióticos. O indivíduo recém infectado foi então usado como doador para
outros doze isolados, todos monocarióticos, dos quais sete receberam o vírus. Não
houve diferenças morfológicas entre as linhagens isogênicas, no entanto, quando
elas foram inoculadas em Malus prunifolia, a intensidade da virulência foi muito mais
baixa quando comparada com a inoculação de fungos sem vírus (SUZAKI et al.,
2005).
Foi possível curar duas linhagens de Rosellinia necatrix de múltiplos
fragmentos de RNAdf através de secções de pontas de hifa, e as reinfectar
novamente por pareamento com os isolados originais. Essas linhagens foram as
únicas levemente virulentas, e como elas mostraram um aumento na virulência
quando foram consideradas livres de RNA, concluiu-se que o vírus foi responsável
por essa característica (IKEDA, NAKAMURA e MATSUMOTO, 2005).
Linhagens de C. parasitica, Phomopsis tipo-G e Valsa cerastoperma foram
infectadas com o vírus CHV1-EP713, o vírus responsável pela hipovirulência em C.
parasitica. Tanto biolística de um clone de cDNA quanto anastomose foram bem
sucedidos, e as linhagens recipientes manifestaram morfologia similares às suas
66
respectivas doadoras – níveis diferentes de hifas aéreas, taxas diferentes de
esporulação (tanto aumento quanto diminuição foi observada), margens irregulares
das colônias e taxas de crescimento reduzidas (SASAKI et al., 2002).
Em Sclerotinia sclerotiorum foi relatada a presença de um único RNAdf,
possivelmente da família Totiviridade por apresentar uma única banda, que não foi
transmitido por esporos sexuais para outras linhagens. No entanto, resultados
positivos foram observados para anastomose (XIE et al., 2006).
Entretanto, não é sempre que resultados positivos são encontrados para a
transmissão. No patógeno de batata Phytopthora infestans, um oomiceto, a
transmissão e a cura de RNAdf não foram realizadas, portanto fica impossível
determinar a influência do vírus para este organismo. (CAI et al., 2009).
Um estudo clássico, envolvendo controle biológico e vírus de fungos, foi feito
com a espécie C. parasitica, responsável pelo cancro da castanheira. Observou-se
que linhagens que não possuíam vírus de RNAdf eram as responsáveis pela causa
da doença. Algum tempo depois que se realizou transmissão do RNAdf para as
colônias de C. parasitica encontradas causando a doença nas árvores, percebeu-se
que as lesões regrediram consideravelmente e as árvores foram curadas
(ANAGNOSTAKIS, 1982).
A sequência de nucleotídeos da ORF codificadora para a RDRP do vírus
encontrado em Helicobasidium mompa foi determinada. Depois que repiques
pareados foram feitos entre linhagens portadoras e livres de RNAdf, os autores
realizaram uma reação de Reverse Transcriptase-PCR para observar se a
sequência para aquela ORF foi amplificada, e assim garantiram o sucesso da
transmissão viral (SUZAKI et al., 2005).
67
4.3 Obtenção de cDNA
Para que se possa fazer o sequenciamento do RNAdf é necessária a
obtenção do DNA complementar (cDNA) à sequência de RNA.
O isolado PC33/05, previamente descrito, foi repicado e submetido a extração
de ácidos nucléicos totais com uso de fenol ácido, e a solução obtida foi tratada com
as enzimas DNase e Nuclease S1, até obtenção de uma concentração de 50 a 100
ng/μL de RNAdf.
Utilizando o protocolo descrito por Park et al. (2004) para a obtenção de
cDNA não foi observado nenhum produto de amplificação. Com uma modificação no
protocolo descrito pelos autores, ou seja, aumento da concentração de primers para
2 μL (3 μg/μL) , foi possível produzir cDNA a partir do RNAdf de G. citricarpa.
(Figura 17).
FIGURA 17 – PRODUÇÃO DE cDNA APÓS RT-PCR DE RNAdf DE G. citricarpa
NOTA: M: DNA do fago λ clivado com Hind III. A: seta indica o produto de amplificação, o cDNA.
FONTE: O autor (2010).
Este cDNA seria utilizado para o sequenciamento porém dificuldades técnicas
e falta de tempo hábil inviabilizaram a obtenção do genoma sequenciado destas
partículas virais.
23130pb
9416pb
6557pb
4361pb
2322pb
2027pb
564pb
125pb
68
4.4 Análise de sequências de nucleotídeos e aminoácidos de genes de vírus da
família Totiviridae
Considerando a possibilidade de produzir um oligonucleotídeo iniciador
específico para a identificação de vírus da família Totiviridae, várias sequências
genômicas destes vírus foram pesquisadas e importadas do “GenBank”.
As sequências de dois genes, presentes nos genomas destes vírus foram
avaliadas. Foram investigados os genes codificantes do capsídeo protéico e da
RDRP. Após alinhamento com o Programa Clustal W (LARKING et al., 2007) foi
observado que as sequências de nucleotídeos não possuem uma região conservada
o suficiente para o desenho dos oligonucleotídeos iniciadores.
Estas sequências de nucleotídeos obtidas no “GenBank”, bem como as
respectivas sequências de aminoácidos, foram utilizadas para análise filogenética.
Após obtenção dos alinhamentos das sequências codificantes completas e
das possíveis proteínas codificadas das duas ORFs presentes nos micovírus
pertencentes à família Totiviridae, foram obtidas as topologias das árvores
filogenéticas baseadas em parcimônia (Figuras 18, 19, 20 e 21). Considerando a
possibilidade da existência de co-evolução entre vírus e seu hospedeiro
(GHABRIAL, 1998), foi feita uma análise filogenética das regiões ITS1-5,8S-ITS2
das espécies fúngicas portadoras destas partículas virais (Figura 22). Para estas
árvores, os vírus foram nomeados de acordo com o Quadro 7.
69
Nomenclatura
Nº de Acesso
Indivíduo
Hospedeiro
AspNid
EU289895.1
Aspergillus mycovirus 178
Aspergillus nidulans
BlkRsp
NC_009890.1
Black Raspberry totivirus F
Rubbus occidentalis
BotFuk
NC_009224.1
Botryotinia fuckeliana totivirus 1
Botryotinia fuckeliana
ConMin
NC_007523.1
Coniothyrium minitans RNA virus
Coniothyrium minitans
EpiFes
AM261427.1
Epichloe festucae virus 1
Epichole festucae
GremAbi
NC_003876.1
Gremmeniella abietina RNA virus L1
Gremmeniella abietina
GreAbi
NC_005965.1
Gremmeniella abietina RNA virus L2
Gremmeniella abietina
HelMom
AB253329.1
Helicobasidium mompa virus N10
Helicobasidium mompa
HelVic
NC_003607.2
Helminthosporium victoriae 190S
Helminthosporium victoriae
MagOry
NC_006367.1
Magnaporthe oryzae virus 1
Magnaporthe oryzae
SphSap
AF038665.1
Sphaeropsis sapinea RNA virus 1
Sphaeropsis sapinea
SphSap
NC_001964.1
Sphaeropsis sapinea RNA virus 2
Sphaeropsis sapinea
SacCer
NC_003745.1
Saccharomyces cerevisae L-A
Saccharomyces cerevisae
ThiBas
NC_005883.1
Thielaviopsis basicola RNA virus 1
Thielaviopsis basicola
ZygBai
NC_003874.1
Zygosaccharomyces bailii virus Z
Zygosaccharomyces bailii
QUADRO 7 – NOMENCLATURA E NÚMERO DE ACESSO NO “GENBANK” DOS INDIVÍDUOS
UTILIZADOS PARA ANÁLISE FILOGENÉTICA
FONTE: O Autor (2010).
70
FIGURA 18 – ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A PARTIR DO
ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DA ORF PROTEÍNA DO
CAPSÍDEO
NOTA: Árvore gerada com 1000 bootstraps e os valores representados demonstram os índices de
consistência dos ramos
FONTE: O autor (2010)
FIGURA 19 – ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A PARTIR DO
ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS PROTEÍNAS DO
CAPSÍDEO
NOTA: Árvore gerada com 1000 bootstraps e os valores representados demonstram os índices de
consistência dos ramos
FONTE: O autor (2010)
71
FIGURA 20 – ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A PARTIR DO
ALINHAMENTO DAS SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS DAS ORFS RNA
POLIMERASES DEPENDENTES DE RNA
NOTA: Árvore gerada com 1000 bootstraps e os valores representados demonstram os índices de
consistência dos ramos
FONTE: O autor (2010)
FIGURA 21 – ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A PARTIR DO
ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DAS RNA POLIMERASES
DEPENDENTES DE RNA
NOTA: Árvore gerada com 1000 bootstraps e os valores representados demonstram os índices de
consistência dos ramos
FONTE: O autor (2010)
72
É possível perceber que os dois principais grupos formados para a ORF CP
consistem dos vírus Botryotinia fuckeliana totivirus 1, Thielaviopsis basicola RNAdf
Vírus 1 e Helminthosporum victoriae virus 190S, seguido de Coniothyrium minitans
RNA virus, Epichlöe festucae vírus 1, Gremmeniella abietina RNA virus L1 e L2,
Sphaeropsis sapinae RNA virus 1 e Magnaporthea oryzae virus 1. Esses dois
grandes grupos consistem de micovírus que infectam fungos filamentosos, todos
fitopatogênicos. Em seguida, encontra-se os vírus de Zygossacharomyces bailii e de
Saccharomyces cerevisae, ambos com pouca identidade filogenética em relação aos
outros.
Os mesmos grandes grupos foram formados para a ORF RDRP, com
pequenas variações: Botryotinia fuckeliana totivirus 1 continua relacionado com
Helminthosporium victoriae virus 190S e Thielaviopsis basicola RNA Virus 1.
Coniothyrium minitans RNA virus, Epichloe festucae virus 1, Gremmeniella abietina
RNA virus L1 e L2, e Sphaeropsis sapinae RNA virus 1 continuam relacionados
quando avaliados para essa sequência de nucleotídeos.
Após o sequenciamento do genoma do partitivirus PoV1 (Pleurotus ostreatus
Virus 1), foi feita uma comparação filogenética das cadeias de aminoácidos que
compõem as ORFs de seus dois genes. Os autores perceberam que PoV1 formava
um clado distinto com outros partitivírus, além de se agruparem separadamente
quando testadas com membros da família Totiviridae. Houve também uma baixa
identidade da sequência de RDRP com outros vírus dessas duas famílias, que
chegou a valores de até 4,5% (LIM et al., 2004).
Observou-se co-infecção por dois membros da família Totiviridae num isolado
de Chalara elegans (Thielavipsis basicola) (PARK, DELANO e PUNJA, 2004). Os
autores sequênciaram ambos os vírus e compararam as sequências de aminoácidos
das RDRPs. Concluíram, a partir da árvore filogenética produzida, que os dois
fragmentos de RNAdf estavam mais aparentados com outros totivirus que infectam
fungos filamentosos, como Sphaeropsis sapinea, do que os totivirus encontrados em
leveduras e protozoários
73
FIGURA 22 - ÁRVORE FILOGENÉTICA DE PARCIMÔNIA CONSTRUÍDA A PARTIR DO
ALINHAMENTO DAS REGIÕES 1ITS-5,8S-2ITS DE FUNGOS PORTADORES DE
TOTIVIRUS
NOTA: Árvore gerada com 1000 bootstraps e os valores representados demonstram os índices de
consistência dos ramos
FONTE: O autor (2010)
PARK, DELANO e PUNJA (2004) fazem uma das poucas inferências de co-
evolução entre vírus e fungos relatadas na literatura: propõem que, como os vírus de
RNAdf na família Totiviridae podem ter estado presentes numa única célula antes da
divergência entre fungos e protozoários (GHABRIAL, 1998), alguns elementos de
RNAdf podem ter infectado uma célula fúngica antes da divergência entre as
espécies C. elegans e S. sapinea, e então co-evoluído em seus hospedeiros
respectivos, resultando em dois vírus diferentes com algum grau de homologia. No
entanto, observando as figuras 20 e 21, observa-se que há maior relação entre as
regiões ITS1-5,8S-ITS2 de Aspergilus nidulans e Sphaeropsis sapinea, enquanto
que analisando a sequência de aminoácidos da RDRP, T. basicola está mais
próxima da dupla B. fuckeliana e Helminthosporium victoriae, e S. sapinea possui
uma identidade menor.
Estudos feitos com o vírus CeMV, que infecta o fungo Chalara elegans,
possibilitaram os autores o classificar como membro da família Narnaviridae, por ele
não apresentar capsídeo protéico. A única ORF dele, que codifica uma proteína com
vários motivos conservados, assemelha-se a RDRP, com 34% de identidade com o
vírus do fungo Ophiostoma novo-ulmi. Tanto sequências de aminoácidos como de
74
nucleotídeos apoiaram a relação próxima de CeMV com outros mitovirus (PARK,
CHEN e PUNJA, 2005).
O cDNA completo do segmento L de SsDRV (Sclerotinia sclerotiorum
Debilititation associated RNA virus) foi sequenciado e analisado (LIU et al., 2008).
Pelo fato desse segmento não apresentar homologia, após hibridação Northern, com
o vírus SsDRV, os autores sugerem que ele representa um novo micovírus. Buscas
por homologia desse vírus indicaram que a enzima RDRP desse vírus está
relacionada com vários vírus animais pertencentes ao gênero Hepevirus, incluindo o
vírus da hepatite E humana, suína e aviária, além de vírus de insetos HaSV e DpTV.
É mais provável que o vírus SsDRV derivou independentemente de vírus de plantas,
pois vertebrados e insetos não são hospedeiros do fungo Sclerotinia sclerotiorum.
Foi sugerida a criação de um novo gênero dentro da família Partitiviridae,
Cryspovirus, para acomodar a classificação de um vírus de RNAdf proveniente do
protozoário Cryptosporidium parvum, chamado CSpV1. Esse vírus não se agrupa
dentro de nenhum gênero dessa família, pois análises filogenéticas indicam que os
gêneros Alphacryptovirus assim como Betacryptovirus comportam vírus provenientes
de plantas, e Partitivirus, vírus oriundos de fungos (GHABRIAL e NIBERT, 2009).
Nesse último caso, o autor sugere que a formação de subclados dentro do gênero
indica que micovírus tenham origens polifiléticas. CSpV1 está bem separado de
todos esses gêneros nas árvores para as duas ORFs.
Análises de BLAST usando a RDRP e a CP de do vírus La de S. cerevisae
revelaram a existência de genes de Totiviridae em cinco espécies fúngicas: P.
stipitis, Penicillium marneffei, D. hansenni, Uromyces appendiculatus e Candida
parapsilosis. Cada um dos genes fúngicos derivados de Totivirus possuiam uma
ORF não interrompida. Os mRNA produzidos de RDRP aparecem como RNA
polimerases II poliadeniladas nas bibliotecas de EST pesquisadas. O mesmo foi
observado para os produtos dos genes de CP. Após a realização de testes
filogenéticos de evolução neutra, revelou-se que esses genes fogem da neutralidade
para uma seleção purificadora, consistente com a seleção purificadora que mantém
a função gênica (TAYLOR e BRUENN, 2009).
75
5. CONCLUSÕES
-
O protocolo de extração que forneceu a maior quantidade de RNAdf em G.
citricarpa, numa maior pureza, foi o que utiliza fenol ácido (pH 4,7).
-
O protocolo de cura de RNAdf por crescimento do fungo em meio com
ciclohexamida não é viável para os isolados de G. citricarpa utilizados neste
trabalho.
-
O protocolo de cura de RNAdf por repiques de ponta de hifa e crescimento do
fungo em temperatura moderadamente elevada (35 ºC) pode gerar isolados de
G. citricarpa curados do seu RNAdf. Isolados considerados isogênicos obtidos
pela cura do RNAdf não apresentaram alterações morfológicas detectáveis. É
possível que estas linhagens estejam com baixa concentração de vírus, não
detectável em eletroforeses, e não totalmente curadas.
-
O protocolo de transmissão horizontal de RNAdf é viável para a obtenção de
linhagens isogênicas de G. citricarpa.
-
Linhagens que receberam RNAdf pela transmissão apresentaram menor taxa
de crescimento radial em placa de Petri que as respectivas linhagens selvagens
isogênicas, não portadoras dos vírus.
-
Foi possível obter cDNA do vírus de RNAdf de G. citricarpa.
-
Não foi possível identificar semelhanças significativas entre as árvores
filogenéticas dos vírus em relação à árvore obtida dos fungos hospedeiros. A
análise dessa região não forneceu indícios de co-evolução entre vírus e
hospedeiro.
76
6. REFERÊNCIAS
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88
APÊNDICES
APÊNDICE 1 – ANOVA E TESTE DE MÉDIAS (PROGRAMA ASSISTAT) DO
ISOLADO ECLaP E SEUS SETORES QUANTO AO
CRESCIMENTO MICELIAL EM MC APÓS 15 DIAS.
EXPERIMENTO INTEIRAMENTE CASUALIZADO
F.V.
G.L.
S.Q.
Q.M.
F
Tratamentos
5
22.35667
4.47133
3.2369*
Resíduo
24
33.15300
1.38138
Total
29
55.50967
* significativo ao nível de 5% de probabilidade (0.01 ≤ p < 0.05)
GL: 5, 24 F-krit(5%) = 2.6207 F = 3.2369 p = .02253
TESTE DAS MÉDIAS
ECLaP 1
4.38
A
ECLaP 2
4.08
A
ECLaP
3.42
A
B
ECLaP 3
3.39
A
B
ECLaP 4
2.75
A
B
ECLaP 5
1.76
B
DMS = 2.29695; MG = 3.29667; CV% = 35.65174
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
89
APÊNDICE 2 – ANOVA E TESTE DE MÉDIAS (PROGRAMA ASSISTAT) DA
LINHAGEM PC7LD6 E SEUS SETORES QUANTO AO
CRESCIMENTO MICELIAL EM MC APÓS 15 DIAS.
EXPERIMENTO INTEIRAMENTE CASUALIZADO
F.V.
G.L.
S.Q.
Q.M.
F
Tratamentos
6
45.83786
7.63964
18.6090 **
Resíduo
28
11.49500
0.41054
Total
34
57.33286
** significativo ao nível de 1% de probabilidade (p < 0.01)
GL: 6, 28 F-krit(1%) = 3.5276 F = 19.3177 p < 0.00100
TESTE DAS MÉDIAS
PC7LD6 1
5.89
A
PC7LD6 2
4.90
A
B
PC7LD6 3
4.20
B
D
PC7LD6 4
3.73
B
C
D
PC7LD6 5
3.42
C
D
E
PC7LD6 6
2.76
D
E
PC7LD6
2.30
E
DMS = 1.28453; MG = 3.88571; CV% = 16.48939
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
90
APÊNDICE 3 – ANOVA E TESTE DE MÉDIAS (PROGRAMA ASSISTAT) DA
LINHAGEM FTMi2.5 E ISOGÊNICAS QUANTO AO
CRESCIMENTO MICELIAL EM MC APÓS 15 DIAS.
EXPERIMENTO INTEIRAMENTE CASUALIZADO
F.V.
G.L.
S.Q.
Q.M.
F
Tratamentos
3
8.27666
2.75889
20.4540**
Resíduo
16
2.15812
2.15812
Total
19
10.43478
** significativo ao nível de 1% de probabilidade (p < 0.01)
GL: 3, 16 F-krit(1%) = 5.29; F = 20.4540 p < 0.001
TESTE DAS MÉDIAS
FTMi2.5
3.22
A
FTMi2.5 A
1.98
B
FTMi2.5 B
1.83
B
FTMi2.5 C
1.534
B
DMS = 0.66519; MG = 2.1410; CV% =17.15383
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
91
APÊNDICE 4 – ANOVA E TESTE DE MÉDIAS (PROGRAMA ASSISTAT) DA
LINHAGEM FTMi3.1E ISOGÊNICA QUANTO AO
CRESCIMENTO MICELIAL EM MC APÓS 15 DIAS.
EXPERIMENTO INTEIRAMENTE CASUALIZADO
F.V.
G.L.
S.Q.
Q.M.
F
Tratamentos
1
1.024
1.024
5.9535*
Resíduo
8
1.376
0.172
Total
9
2.4
* significativo ao nível de 5% de probabilidade (0.01 ≤ p < 0.05)
GL: 1, 8 F-krit(1%) = 5.3177 ; F = 5.9535 p = 0.4057
TESTE DAS MÉDIAS
FTMi3.1
2.47
A
FTMi3.1 A
1.83
B
DMS = 0.60464; MG = 2.15; CV% = 28.971
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
92
APÊNDICE 5 – ANOVA E TESTE DE MÉDIAS (PROGRAMA ASSISTAT) DA
LINHAGEM FTMi7.1E ISOGÊNICA QUANTO AO
CRESCIMENTO MICELIAL EM MC APÓS 15 DIAS.
EXPERIMENTO INTEIRAMENTE CASUALIZADO
F.V.
G.L.
S.Q.
Q.M.
F
Tratamentos
1
2.97025
2.97025
10.5515*
Resíduo
8
2.25200
0.28150
Total
9
5.22225
* significativo ao nível de 5% de probabilidade (0.01 ≤ p < 0.05)
GL: 1, 8 F-krit(1%) = 5.3177 ; F = 10.5515 p = 0.1173
TESTE DAS MÉDIAS
FTMi7.1
3.39
A
FTMi7.1 A
2.30
B
DMS = 0.77352; MG = 2.845; CV% = 18.64906
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
93
APÊNDICE 6 – ANOVA E TESTE DE MÉDIAS (PROGRAMA ASSISTAT) DA
LINHAGEM FTP11.3 E ISOGÊNICAS QUANTO AO
CRESCIMENTO MICELIAL EM MC APÓS 15 DIAS.
EXPERIMENTO INTEIRAMENTE CASUALIZADO
F.V.
G.L.
S.Q.
Q.M.
F
Tratamentos
2
1.58433
0.79217
15.8433**
Resíduo
12
0.60000
0.50000
Total
14
2.18433
** significativo ao nível de 1% de probabilidade (p < 0.01)
GL: 2, 12 F-krit(1%) = 6.9266 ; F = 15.8433 p < 0.001
TESTE DAS MÉDIAS
FTP11.3
2.30
A
FTMi11.3 A
2.21
A
FTMi11.3 B
1.57
B
DMS = 0.377; MG = 2.02667; CV% = 11.03323
As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si.
Foi aplicado o Teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
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