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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ISMAEL LEITE MARTINS
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS BIOANALÍTICOS PARA
QUANTIFICAÇÃO DA AMOXICILINA, NORFLOXACINO E OXCARBAZEPINA EM
ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS
FORTALEZA
2009
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ISMAEL LEITE MARTINS
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS BIOANALÍTICOS PARA
QUANTIFICAÇÃO DA AMOXICILINA, NORFLOXACINO E OXCARBAZEPINA EM
ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS
Tese submetida à coordenação do Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia, do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do Grau de Doutor em Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de
Moraes
Co-Orientadora: Profa. Dra. Maria Bernadete de Sousa
Maia
FORTALEZA
2009
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M343d Martins, Ismael Leite
Desenvolvimento e Validação de Métodos Bioanalíticos para
Quantificação da Amoxicilina, Norfloxacino e Oxcarbazepina em
Estudos Farmacocinéticos/ Ismael Leite Martins. - Fortaleza,
2009.
195 f. : il
Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Ceará.
Departamento de Fisiologia e Farmacologia. Fortaleza, Ceará.
1. Farmacocinética 2. Cromatografia 3. Amoxicilina 4.
Norfloxacino I. Moraes, Maria Elisabete Amaral de (Orient.). II.
Título
CDD: 615.7
ISMAEL LEITE MARTINS
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS BIOANALÍTICOS PARA
QUANTIFICAÇÃO DA AMOXICILINA, NORFLOXACINO E OXCARBAZEPINA EM
ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Farmacologia.
Aprovada em: 29 de julho de 2009.
BANCA EXAMINADORA
Dedico esta tese a todas as preciosidades
que Deus me deu: meu pai, minha mãe,
minha irmã, meu benzim, por todo amor e
incentivo em todas as etapas importantes
da minha vida.
A
A
G
G
R
R
A
A
D
D
E
E
C
C
I
I
M
M
E
E
N
N
T
T
O
O
S
S
À Deus, pela minha vida repleta de bênçãos, que hoje possibilitam a
concretização de um sonho.
Minha Família, pelo carinho, apoio, incentivo em todas as situações, e
pelo entusiasmo à conquista.
À minha futura esposa, Lígia Uchoa, pelo carinho, apoio, amor e
companhia constantes e por ter sempre um sorriso a me oferecer.
Aos fundadores da Unidade de Farmacologia Clínica, os professores Dra.
Maria Elisabete Amaral de Moraes, Dr. Manoel Odorico de Moraes, Dr.
Fernando Antonio Frota Bezerra, pela acolhida de todos esses anos, por dividirem
comigo seus conhecimentos, por tornar palpável o sonho da Farmacologia Clínica
no Estado do Ceará e por tão caloroso convívio.
À professora Dra. Maria Elisabete Amaral de Moraes, minha
orientadora, a qual me apoiou na construção do saber científico, por depositar
incondicionalmente sua confiança no meu trabalho e corrigindo minhas imperfeições.
À professora Dra. Maria Bernadete Sousa Maia, por colaborar sempre
com seus ensinamentos enriquecedores que muito contribuíram para o
desenvolvimento deste trabalho.
À professora Dra. Gisela Costa Camarão, pelo grande amor ao ensino e
à pesquisa, que se reflete em cada palavra proferida e, também, pela atenção a mim
dispensada.
À professora Dra. Gilmara Silva de Melo Santana, por compartilhar
comigo tantos momentos importantes para meu crescimento pessoal e profissional
tornando mais harmoniosa e gratificante a conquista de mais uma etapa em minha
vida.
Ao Dr. Vagnaldo Fechine pela atenção peculiar e colaboração na análise
dos dados contidos neste trabalho.
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação, por terem transmitido
com muita sapiência seus conhecimentos.
Aos Amigos da Unidade de Farmacologia Clínica, meu agradecimento
a todos vocês por terem colaborado na minha pesquisa científica, dividindo
experiências e amenizando o peso dos trabalhos.
À Maria Teresa pela colaboração e presteza, bem como pelos momentos
agradáveis que tivemos.
À Áura, secretária do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, que
sempre estive disposta a nos ajudar no que fosse preciso.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq), Fundação Cearense de
Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP), Financiadora
de Estudos e Projetos (FINEP), DECIT/MS/MCT e Instituto Claude Bernard
(InCB), por ter colaborado financeiramente no desenvolvimento da pesquisa.
A todos aqueles que de forma direta ou indireta contribuíram para a
realização deste trabalho, os meus sinceros agradecimentos.
“Não é com honras e riquezas que se contenta
o coração de um pensador, mas sim
apenas com o saber e a virtude.”
Platão
427 a.C. - id. c. 347 a.C.
RESUMO
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS BIOANALÍTICOS PARA
QUANTIFICAÇÃO DA AMOXICILINA, NORFLOXACINO E OXCARBAZEPINA EM
ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS. Ismael Leite Martins. Orientadora: Profª. Dra.
Maria Elisabete Amaral de Moraes. Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará para obtenção do Grau
de Doutor em Farmacologia. Fortaleza, 2009.
Foram desenvolvidos e validados três métodos robustos para a determinação
de amoxicilina, norfloxacino, oxcarbazepina (OXC) e 10,11-dihidro-10-
hidroxicarbamazepina (MHD) em plasma, utilizando cromatografia líquida de alta
eficiência em fase reversa (RP-HPLC) com detecção ultravioleta, fluorescência e
espectrometria de massa, respectivamente. Os métodos envolveram extração
líquido-líquido, com diclorometano (amoxicilina), acetonitrila (amoxicilina e
norfloxacino), éter etílico-diclorometano (60:40 v/v, oxcarbazepina), utilizando
cefadroxil, ciprofloxacino e d10-carbamazepina como padrões interno (PI).
Separações cromatográficas foram realizadas utilizando colunas Gemini C18 5 µm
(150 X 4,6 mm), Synergi RP-MAX 4 µm (150 X 4,6 mm) e Luna C18 µm (150 X 4,6
mm), com sistemas de eluição constituídos por mistura de tampão fosfato de 0,01 M
(pH 3,5)/acetonitrila (95:5 v/v), acetonitrila-tampão fosfato (85:15, v/v) e acetonitrila-
água (50:50 v/v) + 20 mM ácido acético, respectivamente. As curvas de calibração
foram lineares, nas faixas de 0,5 a 40 µg/mL, 30 a 3500 ng/mL, 20 a 5250 ng/ml e 40
a 10500 ng/ml. As recuperações nas concentrações de 1,5, 15 e 30 µg/ml foram de
59,4%, 60,5% e 67,1% para amoxicilina; 90, 1400 e 2800 ng/mL foram de 103,5%,
100,2% e 100,2% para norfloxacino, 60, 2000 e 4000 ng/ml foram de 105,4, 89,2 e
92,8% para OXC e 120, 4000 e 8000 ng/ml foram de 88,4, 88,7 e 90,6% para MHD,
respectivamente. Os métodos validados incluíram avaliação de precisão e exatidão
intra e interlote, assegurando que estes estavam dentro de limites admissíveis. Os
métodos foram então aplicados com sucesso em estudos de bioequivalência,
administrando 500 mg ou 400 mg das formulações referência/teste de amoxicilina e
norfloxacino, e em estudos farmacocinéticos com formulação de oxcarbazepina
suspensão (6%), em voluntários sadios.
Palavras-chave: Cromatografia. Amoxicilina. Norfloxacino. Oxcarbazepina.
Farmacocinética.
ABSTRACT
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS FOR
QUANTIFICATION OF AMOXICILLIN, NORFLOXACIN AND OXCARBAZEPINE
IN PHARMACOKINETIC STUDIES. Ismael Leite Martins. Adviser: Maria Elisabete
Amaral de Moraes. Thesis presented for the title of Doctor in Pharmacology.
Department of Physiology and Pharmacology, Faculty of Medicine, Federal
University of Ceará. Fortaleza, 2009.
A robust method for the determination of amoxicillin, norfloxacin,
oxcarbazepine (OXC) and its active metabolite, 10,11-dihydro-10-
hydroxycarbamazepine (MHD) in human plasma, using reversed-phase high-
performance liquid chromatography (RP-HPLC) with ultraviolet, fluorescence and
mass spectrometry detection, respectively, have been developed and valited. The
methods involve precipitation of plasma protein with dichloromethane (amoxicillin),
acetonitrile (amoxicillin and norfloxacin) and diethyl ether–diclhoromethane (60:40
v/v, oxcarbazepine), using cefadroxil, ciprofloxacin and deuterade carbamazepine
(d10-carbamazepine) as internal standard (IS). Chromatographic separations were
performed on a column Gemini C18 5 µm (150 X 4.6 mm), Synergi MAX-RP 4 µm
(150 X 4.6 mm) and Luna C18 5 µm (150mm X 4.6 mm) with an elution system
consisting of a mixture of 0.01 M buffer phosphate (pH 3.5)/acetonitrile (95:05 v/v),
phosphate buffer–acetonitrile (85:15, v/v) and acetonitrile/water (50:50 v/v) + 20mM
acetic acid, respectively. The calibration curve was linear, in the range of 0.5 to 40
µg/mL, 30 to 3500 ng/mL, 20 to 5250 ng/mL and 40 to 10,500 ng/mL. The recoveries
at concentrations of 1.5, 15 and 30 µg/mL were foram 59.4%, 60.5% and 67.1% for
amoxicillin; 90, 1400 and 2800 ng/mL were 103.5%, 100.2% and 100.2% for
norfloxacin, 60, 2000 and 4000 ng/mL were 105.4, 89.2 and 92.8% for OXC and 120,
4000 and 8000 ng/mL were 88.4, 88.7 and 90.6% for MHD, respectively. The
statistical evaluation of the developed method was conducted by examining within-
batch and between-batch precision data, which were within the required limits. The
methods were successfully applied in bioequivalence studies given 500 or 400-mg of
the reference formulation / test amoxicillin and norfloxacin, and pharmacokinetic
studies with formulation of oxcarbazepine suspension (6%) in healthy volunteers.
Keywords: Chromatography. Amoxicillin. Norfloxacin. Oxcarbazepine.
Pharmacokinetics.
LISTA DE QUADROS
1. Parâmetros de validação do Inmetro e Anvisa ........................................ 26
2. Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações .................. 51
3. Parâmetros utilizados na validação do método ....................................... 82
4. Parâmetros Farmacocinéticos do Norfloxacino ....................................... 87
5. Parâmetros Farmacocinéticos do Oxcarbazepina e MHD ...................... 89
LISTA DE TABELAS
1. Utensílios utilizados no desenvolvimento e validação dos métodos. 106
2. Validação da quantificação de amoxicilina em plasma: precisão intra e
interlote das amostras de controle de qualidade (n = 8) ......................... 130
3. Resultado da estabilidade (média ± desvio padrão) obtido com três
amostras de plasma com concentração baixa (1,5 µg/mL), média (15
µg/mL) e alta (30 µg/mL) de amoxicilina ................................................. 131
4. Parâmetros farmacocinéticos da formulação teste e referência
(amoxicilina 500 mg) depois da administração oral de 24 voluntários .... 132
5 Média, IC (90%) e conclusão para a razão das médias de C
max
, AUC
0-
ult h
e AUC
0-
Dados transformados em logaritmo natural.
133
6. Dados de precisão e exatidão intra e interlote para o norfloxacino para
validação em plasma ............................................................................... 140
7. Recuperação do norfloxacino e ciprofloxacino em plasma ..................... 141
8. Teste de estabilidade (teste de estabilidade pós-processamento,
estabilidade congelamento e descongelamento, estabilidade curta 15
horas e longa duração 44 dias). Número de replicatas: n = 5 ................. 142
9. Resultados das análises de bioequivalência para relação
teste/referência depois da transformação logarítmica dos parâmetros
AUC
0-∞
, AUC
(0-24h)
e C
max
......................................................................... 144
10. Precisão e exatidão intralote das curvas de calibração........................... 152
11. Precisão e exatidão na quantificação de OXC e MHD em amostras de
plasma (análise de amostras de plasma contaminado em quatro
concentrações diferentes) ....................................................................... 153
12. Estabilidade das amostras de controle de qualidade da OXC e MHD
em plasma sob diferentes condições de estoque (n=5) .......................... 156
LISTA DE FIGURAS
01. Determinação gráfica das curvas de linearidade através da: (a) curva
analítica clássica; (b) gráfico da razão sinal/concentração vs.
concentração em escala logarítmica..................................................... 32
02. Modos de diluição da solução estoque: a) diluição a partir de uma
solução estoque e b) diluição a partir de duas soluções estoques (1 e
2) preparadas com concentrações diferentes....................................... 37
03. Aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de
ultravioleta utilizado na quantificação das amostras contendo
amoxicilina. 56
04. Aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de
fluorescência utilizado na quantificação das amostras contendo
norfloxacino.
57
05. Esquema de funcionamento do sistema de espectrometria de massa 58
06. Aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao
espectrômetro de massa utilizado na quantificação das amostras
contendo oxcarbazepina. 59
07. Esquema demonstrativo da fragmentação de compostos utilizando
espectrômetro de massa triplo-quadrupolo no modo de
monitoramento de reação múltipla (MRM) ........................................... 60
08. Processo de absorção de formas farmacêuticas sólidas ..................... 62
09. Distribuição de fármacos no organismo ............................................... 63
10. Biotransformação de fármacos ............................................................. 65
11. Esquema do procedimento de coleta de sangue e separação de
amostras plasmáticas. 102
12. Esquema dos ensaios de estabilidade em ciclos de congelamento de
descongelamento 112
13. Esquema dos ensaios de estabilidade de longa duração. 113
14. Cromatograma representativo do plasma branco (A), plasma
contaminado com amoxicilina (30 µg/mL) e cefadroxil (padrão
interno) (B) e plasma de um voluntário após 1h da administração oral
de amoxicilina ....................................................................................... 128
15 Representação gráfica da curva de calibração y = 19,0642x +
0,000162149, r2= 0,999253..................................................................
129
16. Gráfico da curva de concentração plasmática (µg/dL) versus tempo
(h) da amoxicilina. Representa a média das concentrações
plasmáticas obtidas após a administração de duas formulações de
Amoxicilina 500 mg em volutários sadios.............................................. 133
17. Cromatografia de amostra de plasma branco extraído (A) e de
plasma contaminado contendo norfloxacino (90 ng/mL) e padrão
interno (B) ............................................................................................. 138
18 Representação gráfica da curva de calibração y = 985,11x – 2,52151,
r
2
= 0,999493.......................................................................................... 139
19. Curva de concentração plasmática média versus tempo após
administração de duas formulações de norfloxacino 400 mg em
voluntários sadios ................................................................................. 143
20. Full-scan dos espectros dos íons fragmento de [M+H]+ e as
estruturas da (a) OXC, (b) MHD e (c) d10-carbamazepina ..................
148
21. Cromatogramas MRM: (a) uma amostra de plasma em branco, (b)
uma amostra de plasma branco contaminada com OXC (20 ng / ml) e
MHD (40 ng / ml), (c) um voluntário amostra 1,5 h após a
administração oral de OXC suspensão (6%) em voluntários
saudáveis. Picos I-III referem-se ao MHD, OXC e PI,
respectivamente ................................................................................... 150
22. Perfil da curva de concentração plasmática média de OXC e MHD
versus tempo após administração de 10 ml de uma suspensão oral
de oxcarbazepina (6%) em voluntário sadios (n=8) ............................. 157
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% Porcentagem
Mais ou Menos
< Menor que
Menor ou igual a
m
Micrometro
L
Microlitro
o
C Grau Celsius
ANOVA Análise de Variância
Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CNS Conselho Nacional de Saúde
COMEPE Comitê de Ética em Pesquisa da UFC
CV Coeficiente de Variação
DP Desvio Padrão
g Grama
g/dL Grama por Decilitro
L Litro
mg Miligrama
Min Minuto
mL Mililitro
mm Milímetro
MS Ministério da Saúde
nm Nanômetro
Nº Número
OMS Organização Mundial da Saúde
UFC Universidade Federal do Ceará
AUC Area Under Curve
CAD Collisionally Activated Dissociation
CID Collision-Induced Dissociation
HPLC High Performance/Pressure Liquide Chromatography
C
max
Concentração Máxima
CQ Controle de Qualidade
CQA Controle de Qualidade Alto
CQB Controle de Qualidade Baixo
CQM Controle de Qualidade Médio
FDA Food and Drug Administration
ICH International Conference on Harmonisation
IES Ionização por Eletrospray
IMC Índice de Massa Corporal
ISO Internacional Standard Organization
Ke Constante de eliminação
LQ Limite de Quantificação
MRM Monitoramento de reação múltipla
MS/MS Mass spectrometry
t
1/2
Tempo da meia-vida plasmática
UNIFAC Unidade de Farmacologia Clínica
USP United States Pharmacopoeia
SUMÁRIO
PARTE I: INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
22
CAPÍTULO 1: Validação de Métodos Bioanalíticos
23
1 INTRODUÇÃO
23
2 CONCEITOS BÁSICOS DO PROCESSO DE VALIDAÇÃO
23
3 LEGISLAÇÃO
25
4 PROCESSO DE VALIDAÇÃO
27
5 PARÂMETROS ANALÍTICOS PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
28
5.1 Seletividade
28
5.2 Linearidade e Faixa de Aplicação
30
5.2.1 Padronização externa 33
5.2.2 Padronização interna 33
5.2.3 Superposição de matriz 34
5.2.4 Adição padrão 35
5.3 Precisão
37
5.3.1 Repetitividade 38
5.3.2 Precisão intermediária 39
5.3.3 Reprodutibilidade 39
5.4 Exatidão
40
5.4.1 Materiais de referência certificados (CRM) 41
5.4.2 Comparação de métodos 42
5.4.3 Ensaios de recuperação 43
5.4.4 Adição padrão 44
5.5 Limite de Detecção (LD)
45
5.5.1 Método visual 45
5.5.2 Método da relação sinal-ruído 45
5.5.3 Método baseado em parâmetros da curva analítica 46
5.6 Limite de Quantificação (LQ)
46
5.7 Robustez
47
6 ESTABILIDADE DOS PADRÕES E DAS AMOSTRAS
49
7 CONFORMIDADE DO SISTEMA
49
8 REVALIDAÇÃO
51
CAPÍTULO 2: Sistema de Detecção de Fármacos
52
1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)
52
1.1 Detector por Absorbância no Ultravioleta e no Visível
54
1.2 Detector por Fluorescência
56
1.3 Detector por Espectrometria de Massa
57
CAPÍTULO 3: Estudos Farmacocinéticos e Bioequivalência
60
1 ASPECTOS QUALITATIVOS
60
1.1 Absorção de Fármacos
61
1.2 Distribuição de Fármacos
63
1.3 Biotransformação de Fármacos
64
1.4 Eliminação de Fármacos
65
2 ASPECTOS QUANTITATIVOS
67
2.1 Modelos Farmacocinéticos
70
2.1.1 Modelos compartimentais 70
2.1.2 Modelo aberto de um compartimento 72
2.1.3 Modelos multicompartimentais 73
2.1.4 Modelo de dois compartimentos 73
2.1.5 Modelos não compartimentais 74
3 APLICAÇÕES DOS ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS
75
4 ESTUDOS DE BIOEQUIVALÊNCIA
78
4.1 Etapa Clínica
79
4.2 Etapa Analítica
81
4.3 Etapa Estatística e Farmacocinética
82
5 MEDICAMENTOS GENÉRICOS
83
CAPÍTULO 4: Medicamentos Avaliados
84
1 AMOXICILINA
84
2 NORFLOXACINO
86
3 OXCARBAZEPINA
89
CAPÍTULO 5: Justificativa
91
PARTE II: OBJETIVOS E METODOLOGIA
92
CAPÍTULO 1: Objetivos
93
1 OBJETIVO GERAL
93
2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
93
CAPÍTULO 2: Metodologia
94
1 PROTOCOLO CLÍNICO
94
1.1 Local de Confinamento dos Voluntários
94
1.2 Delineamento dos Estudos
94
1.3 Seleção dos voluntários
95
1.3.1 Sinais Vitais 95
1.3.2 Exame cardiológico 95
1.3.3 Exames laboratoriais 96
1.3.4 Valores de referência dos exames laboratoriais 97
1.4 Critérios de inclusão
97
1.5 Critérios de exclusão
98
1.6 Critérios para retirada do estudo
99
1.7 Entrada do voluntário no estudo
100
1.8 Restrições
101
1.9 Esquema experimental
101
1.10 Coleta de Sangue
102
1.11 Avaliação da segurança
103
1.12 Aspectos Éticos
104
1.13 Termo de consentimento livre e esclarecido
104
1.14 Confidencialidade
105
2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL PARA QUANTIFICAÇÃO DOS
ANALITOS
105
2.1 Sistema de Qualidade e Biossegurança
105
2.2 Substâncias químicas e Materiais Utilizados
106
2.3 Padrão Interno
107
2.4 Preparo das Soluções Padrão
107
2.5 Critérios para validação do método bioanalítico
108
2.5.1 Determinação do limite de quantificação (LQ) 108
2.5.2 Curva de calibração/linearidade 108
2.5.3 Precisão e exatidão 109
2.5.3.1 Precisão e exatidão intralote 110
2.5.3.1 Precisão e exatidão interlote 110
2.5.4 Especificidade 110
2.5.5 Recuperação 110
2.5.6 Estudo de estabilidade do fármaco no fluido biológico 111
2.5.6.1 Estabilidade no tempo e condições de análise (curta duração) 112
2.5.6.2 Estabilidade do fármaco em ciclos de congelamento e degelo 112
2.5.6.3 Estabilidade de longa duração 113
2.6 Desenvolvimento e Validação do Método para Quantificação
da Amoxicilina
114
2.6.1 Equipamentos e condições do HPLC 114
2.6.2 Preparação de amostras e processo de extração 114
2.6.3 Validação do método bioanalítico 115
2.7 Desenvolvimento e Validação do Método para Quantificação
do Norfloxacino
116
2.7.1 Equipamentos e condições do HPLC 116
2.7.2 Preparação de amostras e processo de extração 116
2.7.3 Validação do método bioanalítico 116
2.8 Desenvolvimento e Validação do Método para Quantificação
da Oxcarbazepina
118
2.8.1 Equipamentos e condições do HPLC 118
2.8.2 Preparação de amostras e processo de extração 118
2.8.3 Validação do método bioanalítico 119
2.9 Aplicação dos métodos propostos em estudos
farmacocinéticos
120
2.10 Análise Estatística
121
PARTE III: RESULTADOS E DISCUSSÃO
123
CAPÍTULO 1: Amoxicilina
124
1 ETAPA CLÍNICA
125
2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
BIOANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA AMOXICILINA
126
2.1 Seletividade do método
126
2.2 Linearidade do método
129
2.3 Precisão e Exatidão
129
2.4 Recuperação do método
130
2.5 Estudos de Estabilidade
130
2 APLICAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO EM ESTUDO DE
132
BIOEQUIVALÊNCIA ENTRE DUAS FORMULAÇÕES CONTENDO
AMOXICILINA (CÁPSULA DE 500MG) EM VOLUNTÁRIOS SADIOS
CAPÍTULO 2: Norfloxacino
134
1 ETAPA CLÍNICA
135
2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
BIOANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA NORFLOXACINO
136
2.1 Otimização dos Procedimentos Gerais
136
2.2 Linearidade do Método
139
2.3 Precisão e exatidão do método
140
2.4 Recuperação do método
140
2.5 Estudos de estabilidade do método
141
3 APLICAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO EM ESTUDO DE
BIOEQUIVALÊNCIA ENTRE DUAS FORMULAÇÕES CONTENDO
NORFLOXACINO (COMPRIMIDO DE 400MG) EM VOLUNTÁRIOS
SADIOS
143
CAPÍTULO 3: Oxcarbazepina
144
1 ETAPA CLÍNICA
146
2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO
BIOANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA OXCARBAZEPINA
147
2.1 Otimização dos Procedimentos Gerais
147
2.2 Linearidade do método
151
2.3 Precisão e exatidão do método
153
2.4 Recuperação do método
154
2.5 Estudos de estabilidade do método
155
3 APLICAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO EM ESTUDO
FARMACOCINÉTICO DE UMA FORMULAÇÃO CONTENDO
OXCARBAZEPINA (SUSPENSÃO 6%) EM VOLUNTÁRIOS SADIOS
156
CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO
158
REFERÊNCIAS
161
GLOSSÁRIO
177
ANEXOS
183
PARTE I: INTRODUÇÃO E
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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PARTE I: INTRODUÇÃO E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
CAPÍTULO 1: Validação de Métodos Bioanalíticos
1 INTRODUÇÃO
A necessidade de se mostrar a qualidade de medições químicas, através
de sua comparabilidade, rastreabilidade e confiabilidade, está sendo cada vez mais
reconhecida e exigida. Dados analíticos não confiáveis podem conduzir a decisões
desastrosas e a prejuízos financeiros irreparáveis. Para garantir que um novo
método analítico gere informações confiáveis e interpretáveis sobre a amostra, ele
deve sofrer uma avaliação denominada validação. A validação de um método é um
processo contínuo que começa no planejamento da estratégia analítica e continua
ao longo de todo o seu desenvolvimento e transferência. Para registro de novos
produtos, todos os órgãos reguladores do Brasil e de outros países exigem a
validação de metodologia analítica e, para isso, a maioria deles tem estabelecido
documentos oficiais que são diretrizes a serem adotadas no processo de validação
(ICH, 1995a; ICH, 1995b; ANVISA, 2003; US-FDA, 2001; US-FDA, 2000; US-FDA,
1994; EURACHEM WORKING GROUP, 1998; THOMPSON et al., 2002; INMETRO,
2003; SHABIR, 2003; ISO/IEC 17025, 1999; USP, 1999; WHO, 1992). Um processo
de validação bem definido e documentado oferece às agências reguladoras
evidências objetivas de que os métodos e os sistemas são adequados para o uso
desejado.
2 CONCEITOS BÁSICOS DO PROCESSO DE VALIDAÇÃO
Vários autores definem validação de métodos e pode-se dizer que os
conceitos continuam evoluindo e estão constantemente sob consideração pelas
agências reguladoras. Algumas definições podem ser transcritas:
- “A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o
método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a
confiabilidade dos resultados” (ANVISA, 2003).
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- “Validação é o processo de definir uma exigência analítica e confirmar
que o método sob investigação tem capacidade de desempenho consistente com o
que a aplicação requer” (EURACHEM WORKING GROUP, 1998).
- “Confirmação por testes e apresentação de evidências objetivas de que
determinados requisitos são preenchidos para um dado uso intencional” (ISO/IEC
17025, 1999).
- A validação de métodos assegura a credibilidade destes durante o uso
rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o “processo que fornece uma
evidência documentada de que o método realiza aquilo para o qual é indicado para
fazer” (USP, 1999).
- “Avaliação sistemática de um procedimento analítico para demonstrar
que está sob as condições nas quais deve ser aplicado” (WHO, 1992).
Vários artigos e revisões têm sido publicados a respeito de validação de
métodos analíticos (THOMPSON et al., 2002; SHABIR, 2003; HUBER, 1998;
JENKE, 1997; JENKE, 1998A; JENKE, 1998B; BRUCE et al., 1998; MASSART et
al., 1994; SWARTZ; KRULL, 1998; LEITE, 2002; SNYDER et al., 1997), os quais
descrevem definições, procedimentos, parâmetros e estratégias de validação.
Dentro do âmbito geral de validação de métodos é possível distinguir dois
tipos (THOMPSON et al., 2002; MASSART et al., 1994; HILL; REYNOLDS, 1999;
VAN DER VOET et al., 1999):
O primeiro, chamado de validação no laboratório (“in house validation”),
consiste das etapas de validação dentro de um único laboratório, seja para validar
um método novo que tenha sido desenvolvido localmente ou para verificar que um
método adotado de outras fontes está bem aplicado. A validação no laboratório é
utilizada nas etapas preliminares do desenvolvimento de uma metodologia e na
publicação de artigos para revistas científicas, em que são avaliadas todas as
características de desempenho da validação da metodologia, porém sem verificar a
reprodutibilidade. Pode-se considerar esta etapa como sendo preliminar à validação
completa (“full validation”) (THOMPSON et al., 2002).
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O segundo tipo, validação completa, envolve todas as características de
desempenho e um estudo interlaboratorial que é utilizado para verificar como a
metodologia se comporta com uma determinada matriz em vários laboratórios,
estabelecendo a reprodutibilidade da metodologia e a incerteza expandida
associada à metodologia como um todo. Só assim a metodologia pode ser aceita
como uma metodologia oficial para uma determinada aplicação. Protocolos
internacionalmente aceitos têm sido estabelecidos para a validação completa, mais
precisamente o Protocolo Harmonizado Internacional (HORWITZ, 1995) e o
procedimento ISO (ISO, 1994). Estes protocolos requerem um número mínimo de
laboratórios e materiais testes para serem incluídos no estudo interlaboratorial para
validação completa do método analítico. No Brasil os estudos de comparações
interlaboratoriais são coordenados pelo Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT),
através do Programa Brasileiro de Metrologia em Química.
3 LEGISLAÇÃO
Existem razões legais, técnicas e comerciais que justificam a implantação
da validação de métodos analíticos de separação, apesar de não haver uma norma
estabelecida de âmbito nacional ou internacional. Atualmente, para mostrar
competência técnica, os laboratórios que executam as análises devem submeter-se
a um credenciamento (“accreditation”) de um órgão vigente de âmbito nacional ou
internacional.
No Brasil, há duas agências credenciadoras para verificar a competência
de laboratórios de ensaios, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e o
INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial).
Estes órgãos disponibilizam guias para o procedimento de validação de métodos
analíticos, respectivamente, a Resolução ANVISA RE n° 899, de 29/05/2003 e o
guia INMETRO DOQ-CGCRE-008, de março/2003. Suas similaridades e diferenças
podem ser melhor visualizadas no quadro 1.
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Quadro 1 – Parâmetros de validação do Inmetro e Anvisa
Inmetro Anvisa
Especificidade/Seletividade Especificidade/Seletividade
Faixa de trabalho e Faixa linear de trabalho Intervalos da curva de calibração
Linearidade Linearidade
- Curva de Calibração
Limite de Detecção (LD) Limite de Detecção (LD)
Limite de Quantificação (LQ) Limite de Quantificação (LQ)
Sensibilidade (inclinação da curva) -
Exatidão e tendência (bias) Exatidão
Precisão Precisão
Repetitividade Repetibilidade (precisão intralote)
Precisão Intermediária Precisão intermediária (precisão interlote)
Reprodutibilidade Reprodutibilidade (precisão interlaboratorial)
Robustez Robustez
Incerteza de medição -
É importante esclarecer que resoluções são documentos com poder de
lei, que devem ser obedecidas e guias são documentos que sugerem uma linha a
ser seguida e são, portanto, abertos para interpretação. Os guias são
recomendações e são intencionalmente vagos para deixar aos analistas a
flexibilidade de adaptá-los de acordo com o método a ser usado (KRULL; SWARTZ,
1998).
Os parâmetros para validação de métodos têm sido definidos em
diferentes grupos de trabalho de organizações nacionais ou internacionais.
Infelizmente algumas definições são diferentes entre as diversas organizações. Uma
tentativa para harmonizar estas diferenças foi feita para aplicações farmacêuticas,
através da ICH (ICH, 1995a; ICH, 1995b), na qual representantes das indústrias e
agências reguladoras dos EUA, Europa e Japão definiram parâmetros,
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requerimentos e, em alguns casos, também metodologias para validação dos
métodos analíticos.
A IUPAC (“International Union of Pure and Applied Chemistry”) também
redigiu um documento técnico que define um guia para validação de métodos
analíticos que tem sido utilizado pela ISO10. A norma internacional ISO/IEC 17025,
que é uma norma específica para laboratórios de ensaio e de calibração, apresenta
a “validação de métodos” como um dos requisitos técnicos importantes na qualidade
assegurada dos laboratórios de ensaio, bem como a documentação do trabalho de
validação (ISO, 1999). O US-FDA (“United States Food and Drug Administration”)
também tem proposto guias sobre validação de métodos (FDA, 1993).
Assim, órgãos como ICH, IUPAC, ISO, ANVISA, INMETRO e outros
exigem o item validação de métodos analíticos como um requisito fundamental no
credenciamento para qualidade assegurada e demonstração de competência técnica
(ICH, 1995a; ICH, 1995b; ANVISA, 2003; FDA, 1985; FDA, 1998a, FDA, 1998b;
THOMPSON et al., 2002; INMETRO, 2003). O que se pode observar é que não há
um procedimento normatizado que estabeleça como executar a validação de
métodos instrumentais de separação. Como estes organismos são responsáveis por
acompanhar e credenciar a competência de laboratórios de ensaios, é importante
ressaltar que as diferentes terminologias e até algumas características de
desempenho do método têm, em sua maior parte, o mesmo significado, porém
descrito de uma maneira distinta, para aplicações diferentes.
4 PROCESSO DE VALIDAÇÃO
É essencial que os estudos de validação sejam representativos e
conduzidos de modo que a variação da faixa de concentração e os tipos de
amostras sejam adequados. Um método para um composto majoritário requer um
critério de aceitação e uma abordagem diferente de um método desenvolvido para
análise de traços. A freqüência com que o método será utilizado (muitas vezes em
um dia, uma vez em um dia para um estudo rápido, uma vez em um mês, etc.)
também influencia o tipo de estudo de validação que é necessário. Os parâmetros
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analíticos devem ser baseados na intenção do uso do método. Por exemplo, se um
método será usado para análise qualitativa em nível de traços, não há necessidade
de testar e validar a linearidade do método sobre toda a faixa linear dinâmica do
equipamento. O objetivo do método pode incluir também os diferentes tipos de
equipamentos e os lugares em que o método será utilizado, ou seja, se o método é
desenvolvido para ser utilizado em instrumento e laboratório específicos, não há
necessidade de usar instrumentos de outras marcas ou incluir outros laboratórios
nos experimentos de validação. Desta forma, os experimentos podem ser limitados
para o que realmente é necessário (RIBANI et al., 2004).
5 PARÂMETROS ANALÍTICOS PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
Os parâmetros analíticos normalmente encontrados para validação de
métodos de separação são: seletividade; linearidade e faixa de aplicação; precisão;
exatidão; limite de detecção; limite de quantificação e robustez. Estes termos são
conhecidos como parâmetros de desempenho analítico (SWARTZ; KRULL, 1998),
características de desempenho (THOMPSON et al., 2002; INMETRO, 2003) e,
algumas vezes, como figuras analíticas de mérito (SWARTZ; KRULL, 1998).
5.1 Seletividade
A seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade
de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença de
componentes que podem interferir com a sua determinação em uma amostra
complexa. A seletividade avalia o grau de interferência de espécies como outro
ingrediente ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação, bem como
outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura,
presentes. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do
composto de interesse (USP, 1999; VESSMAN et al., 2001). Se a seletividade não
for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente
comprometidas.
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O mesmo significado tem sido freqüentemente utilizado para o termo
especificidade (ICH, 1995; SHABIR, 2003; USP, 1999; BRUCE et al., 1998;
MASSART, et al., 1994). Esta situação gera confusão desnecessária e isto pode ser
evitado utilizando somente o termo seletividade, como sugerido pela IUPAC
(VESSMAN et al., 2001). Um método instrumental de separação que produz
resposta para uma única substância de interesse, normalmente um dado elemento,
pode ser chamado de específico e um método que produz resposta para vários
compostos químicos, com uma característica em comum, pode ser chamado de
seletivo (HUBER, 1998; BRUCE et al., 1998). Desde que há poucos métodos
cromatográficos que respondem a apenas uma substância, o termo seletividade é
mais apropriado, como sugerido pela IUPAC.
A seletividade é o primeiro passo no desenvolvimento e validação de um
método instrumental de separação e deve ser reavaliada continuamente durante a
validação e subseqüente uso do método. Algumas amostras podem sofrer
degradação, gerando compostos que não foram observados inicialmente, que
podem coeluir com a substância de interesse.
A seletividade pode ser obtida de várias maneiras. A primeira forma de se
avaliar a seletividade é comparando a matriz isenta da substância de interesse e a
matriz adicionada com esta substância (padrão), sendo que, nesse caso, nenhum
interferente deve eluir no tempo de retenção da substância de interesse, que deve
estar bem separada dos demais compostos presentes na amostra (CODEX, 1995;
ICH, 1995; SHABIR, 2003; SWARTZ; KRULL, 1998). Uma segunda maneira é
através da avaliação com detectores modernos (arranjo de diodos, espectrômetro de
massas), que comparam o espectro do pico obtido na separação com o de um
padrão e utiliza-se isto como uma indicação da presença do composto puro
(HUBER, 1998; JENKER, 1998a; VESSMAN et al., 2001). Estas duas maneiras são
as mais utilizadas. O método de adição padrão também pode ser aplicado para os
estudos de seletividade (USP, 1999; JENKER, 1998b), porém este método é
utilizado quando não é possível obter a matriz isenta da substância de interesse.
Neste caso é feita uma curva analítica com adição da substância de interesse na
amostra e comparada com uma curva analítica sem a presença da matriz.
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Comparam-se então as duas curvas analíticas e caso elas sejam paralelas, pode-se
dizer que não há interferência da matriz na determinação da substância de
interesse, portanto o método é seletivo. Outro procedimento para avaliar a
seletividade é através da coleta do composto de interesse e realização de nova
análise por outra técnica cromatográfica, ou com métodos e técnicas que são
específicos para a estrutura da substância de interesse como, por exemplo,
espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear, espectroscopia no
infravermelho ou bioensaios específicos (JENKER, 1998a).
5.2 Linearidade e Faixa de Aplicação
A linearidade corresponde à capacidade do método em fornecer
resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame,
dentro de uma determinada faixa de aplicação (ICH, 1995b; USP, 1999; SWARTZ;
KRULL, 1998).
A correlação entre o sinal medido (área ou altura do pico) e a massa ou
concentração da espécie a ser quantificada muito raramente é conhecida a priori. Na
maior parte dos casos, a relação matemática entre o sinal e a concentração ou
massa da espécie de interesse deve ser determinada empiricamente, a partir de
sinais medidos para massas ou concentrações conhecidas dessa espécie
(AUGUSTO et al., 2000). Essa relação matemática, muitas vezes, pode ser
expressa como uma equação de reta chamada de curva analítica (BARROS NETO
et al., 2002). Um exemplo de curva analítica pode ser visto na Figura 1a. Embora
somente dois pontos definam uma reta, na prática as linhas devem ser definidas por
no mínimo cinco pontos que não incluam o ponto zero na curva, devido aos
possíveis erros associados (THOMPSON et al., 2002).
Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva analítica a
partir de um conjunto de medições experimentais pode ser efetuada usando o
método matemático conhecido como regressão linear (CUSTODIO et al., 1997).
Além dos coeficientes de regressão a e b, também é possível calcular, a partir dos
pontos experimentais, o coeficiente de correlação r. Este parâmetro permite uma
31
estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a
dispersão do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes
de regressão estimados. Para verificar se a equação de regressão é
estatisticamente significativa podem ser efetuados os testes de ajuste do modelo
linear, validade da regressão, sua eficiência e sua eficiência máxima (CHUI et al.,
2001; BARROS NETO et al., 2001). Um coeficiente de correlação maior que 0,999 é
considerado como evidência de um ajuste ideal dos dados para a linha de regressão
(SHABIR, 2003; JENKER, 1998a; GREEN, 1996). A ANVISA (2003) recomenda um
coeficiente de correlação igual a 0,99 e o INMETRO (2003) um valor acima de 0,90.
Em qualquer técnica instrumental, a relação linear simples, descrita pela
equação y = ax + b, só é válida em um determinado intervalo de massa ou
concentração da espécie medida. Este intervalo de massas ou concentrações, no
qual se pode construir uma curva analítica linear, é a faixa linear dinâmica
(AUGUSTO et al., 2000). Ainda que as causas para a perda de linearidade sejam
características de cada técnica, este é um fenômeno que pode ocorrer com qualquer
conjunto de dados. Assim, o cálculo dos coeficientes de regressão de uma curva
analítica deve ser acompanhado de uma cuidadosa inspeção, para verificar se todos
os pontos a serem usados estão dentro da faixa linear dinâmica correspondente.
Augusto et al. (2000) descreveram uma forma de calcular se os pontos de uma
curva analítica estão inseridos na faixa linear, baseando-se em relações geométricas
do gráfico de regressão. Uma terceira abordagem é dividir os dados do sinal pelas
suas respectivas concentrações, fornecendo as respostas relativas (HUBER, 1998).
Um gráfico é construído com as respostas relativas no eixo y e as concentrações
correspondentes em escala logarítmica no eixo x. A linha obtida deve ser horizontal
sobre toda a faixa linear. São desenhadas outras linhas horizontais paralelas no
gráfico, para 95 e 105% da linha da faixa linear. Conclui-se que o método é linear
até o ponto onde a resposta relativa intercepta a linha de 95 ou 105%. A Figura 1
mostra uma comparação da determinação do intervalo linear dinâmico através da
curva analítica clássica (Figura 1a) e da sua representação logarítmica (Figura 1b).
A construção da curva com a concentração em escala logarítmica permite melhor
visualização da faixa linear.
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Figura 1. Determinação gráfica das curvas de linearidade através da: (a) curva
analítica clássica; (b) gráfico da razão sinal/concentração vs. concentração em
escala logarítmica.
A faixa de aplicação corresponde ao intervalo entre o valor superior e
inferior da substância em exame, que atenda aos requisitos de precisão e exatidão
(SWARTZ; KRULL, 1998). A faixa de aplicação é normalmente expressa nas
mesmas unidades dos resultados obtidos pelo método, e depende do uso em
questão. Várias recomendações são encontradas na literatura. Por exemplo, a
ANVISA especifica um intervalo compreendido entre 80-120% da concentração
teórica para fármacos e medicamentos e de até 120% do limite máximo especificado
para determinação de impurezas (ANVISA, 2003). Para resíduos, o GARP
(ASSOCIAÇÃO GRUPO DE ANALISTAS DE RESÍDUOS DE PESTICIDAS, 1999)
recomenda uma faixa de concentração com valores variando entre a metade e o
quíntuplo da concentração do limite de quantificação. A IUPAC especifica que os
pontos da curva analítica devem ser igualmente espaçados sobre a faixa de
concentração de interesse e que esta faixa compreenda 0–150% ou 50–150% do
valor esperado, dependendo de qual destas duas opções for mais adequada
(THOMPSON et al., 2002). Para produtos formulados, a ICH, entre outros,
recomenda uma variação de ± 20% do valor declarado ou esperado (ICH, 1995b;
USP, 1994; SHABIR, 2003).
As diretrizes da ICH (1995b) e da ANVISA (2003) especificam um mínimo
de cinco níveis de concentração, juntamente com certos mínimos de variação
especificados. O GARP também sugere cinco concentrações que devem ser
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injetadas no equipamento em ordem crescente de concentração, no mínimo três
vezes cada, com estimativa do desvio padrão relativo (RSD) entre as injeções
inferior a 5%. A IUPAC recomenda seis ou mais níveis de concentração
(THOMPSON et al., 2002).
A quantificação do composto de interesse em validação pode ser obtida
através dos seguintes métodos: padronização externa; padronização interna;
superposição de matriz; adição padrão.
5.2.1 Padronização externa
O método de padronização externa compara a área da substância a ser
quantificada na amostra com as áreas obtidas com soluções de concentrações
conhecidas preparadas a partir de um padrão. Preparam-se soluções da substância
a ser quantificada em diversas concentrações; obtém-se o cromatograma
correspondente a cada uma delas e, em um gráfico, relacionam-se as áreas obtidas
com as concentrações. Utilizando este gráfico ou a equação da curva resultante,
pode-se calcular a concentração desta substância na amostra a partir da área da
substância obtida no cromatograma resultante de uma injeção separada. Este
método é sensível a erros de preparo das amostras e dos padrões e de injeção das
soluções padrão e das amostras (SWARTZ; KRULL, 1998; CUADROS-RODRÍGUEZ
et al., 2001) e por isso deve ser feito a cada análise.
5.2.2 Padronização interna
O método de padronização interna consiste na preparação das soluções
padrão de concentrações conhecidas da substância de interesse, às quais se
adiciona a mesma quantidade conhecida de um composto chamado padrão interno.
Após análise dessas soluções, constrói-se um gráfico, relacionando a razão de
áreas (área da substância/área do padrão interno que tem concentração constante)
com a concentração (variada) da substância. A amostra também é analisada após a
adição da mesma quantidade conhecida do padrão interno. Através da razão de
áreas obtidas no cromatograma tem-se a concentração da substância na amostra.
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Idealmente, a substância usada como padrão interno deve ser similar à substância a
ser quantificada, ter tempo de retenção próximo a esta substância, não reagir com a
substância ou outro componente da matriz, não fazer parte da amostra e, quando
cromatografada, ficar separada de todas as demais substâncias presentes na
amostra (SWARTZ; KRULL, 1998; CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2001). Este
último requisito não é necessário quando a detecção é feita por espectrometria de
massas, na qual cada composto produz um espectro característico. O método de
padronização interna é extremamente útil, especialmente pelo fato de que
independe de pequenas mudanças em variáveis experimentais, como temperatura
da coluna e tamanho da amostra. Este método é bastante útil em cromatografia
gasosa, na qual se usa seringa para injeção de amostra (LANÇAS, 1993) e por isso
deve ser feito a cada análise.
5.2.3 Superposição de matriz
O método de superposição de matriz (“matrix-matched”) consiste na
adição do padrão da substância em diversas concentrações em uma matriz similar à
da amostra, isenta da substância, e construção do gráfico de calibração
relacionando as áreas obtidas com as concentrações dos padrões. O método de
superposição de matriz pode ser utilizado para calibração, tanto com a padronização
interna como com a padronização externa. Este método é usado para compensar o
efeito da matriz ou de possíveis interferentes e é de suma importância em
determinações quando a matriz pode interferir na pré-concentração, extração,
separação ou detecção da substância de interesse. Sua principal vantagem sobre o
método de padronização externa é que fornece uma melhor correspondência com a
composição da amostra. Por exemplo, se algumas substâncias são determinadas
em soro humano e uma solução padrão aquosa for usada na calibração, resultados
errôneos podem ser obtidos por causa do efeito da matriz; para tais medições, uma
matriz de soro humano seria melhor para realizar a calibração do que a solução
aquosa (CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2001). O método de superposição de matriz
tem o inconveniente de não proporcionar a magnitude do efeito de co-extratos, além
de aumentar o custo e o tempo das análises (EGEA-GONZÁLEZ et al., 2002).
Alguns autores acreditam que o efeito dos coextratos sobre a resposta da
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substância de interesse deveria ser avaliado pela comparação do método de
superposição de matriz com a padronização externa (padrões preparados nos
solventes) (HILL; REYNOLDS, 1999). Apesar de se obter uma calibração confiável
com o método de superposição da matriz, ele é somente uma forma para compensar
efeitos da matriz, mas não elimina situações analíticas típicas: a intensidade de um
efeito e a concentração de interferentes na matriz podem diferir de uma matriz ou
amostra para outra (CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2003). Assim, em amostras nas
quais pode ocorrer o efeito da matriz e não se tem disponível uma matriz isenta da
substância de interesse para utilizar o método de superposição de matriz, deve-se
utilizar o método de adição padrão (CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2003).
5.2.4 Adição padrão
O método de adição padrão consiste na adição de quantidades
conhecidas da substância de interesse que está sendo analisada a quantidades
conhecidas da amostra, antes do seu preparo. Estas amostras com o padrão
incorporado são utilizadas para a obtenção dos cromatogramas. Constrói-se uma
curva analítica relacionando as quantidades da substância adicionada à amostra
com as respectivas áreas obtidas. O ponto onde a reta corta o eixo das ordenadas
corresponde à área do pico da substância que está sendo determinada, sem
qualquer adição do padrão. A extrapolação da reta define, no eixo das abscissas, a
concentração da substância na amostra analisada (BERG et al., 1988). O método de
adição padrão é trabalhoso, mas é especialmente importante quando a amostra é
muito complexa, quando as interações com a matriz são significativas e quando
houver dificuldade de encontrar um padrão interno adequado ou uma matriz isenta
da substância de interesse (SNYDER et al., 1997).
Os métodos de quantificação não têm regras ou guias, exceto que o
método final selecionado deve fornecer a melhor exatidão possível e um alto nível
de precisão. O método escolhido para quantificação deve atingir estes objetivos em
um menor tempo possível, com um mínimo de envolvimento do operador, além de
utilizar pouca quantidade de amostra. O método de quantificação ideal dependerá da
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amostra específica, do número de amostras, da complexidade da matriz, da
possibilidade de automação e da disponibilidade de padrões.
Quanto aos aspectos práticos, o preparo das soluções padrão pode ser
realizado de diversas maneiras. Em uma delas, prepara-se uma solução mais
concentrada, a partir da pesagem do padrão, denominada solução estoque, que
deve ser preparada de acordo com o tempo de estabilidade da substância em
solução ou pelo menos a cada seis meses. As soluções preparadas por diluição são
chamadas soluções de trabalho e recomenda-se que sejam preparadas pelo menos
a cada duas ou três semanas (GARP, 1999). Duas abordagens ocorrem no preparo
das soluções por diluição. Na primeira, as soluções de trabalho podem partir de uma
única solução estoque, através de diluições sucessivas das soluções de trabalho
anteriormente preparadas ou através do preparo de todas as soluções diluídas,
partindo sempre da solução estoque. Este último modo é o mais recomendado,
porém, dependendo da faixa de concentração em questão, diluições diretamente da
solução estoque podem envolver medições de volumes tão pequeno que o erro se
torna grande. A Figura 2a mostra um esquema da seqüência utilizando este modo
de preparo. Outra abordagem para o preparo das soluções de trabalho é mostrada
na Figura 2b. Neste caso, são preparadas duas soluções estoque de concentrações
diferentes e as soluções de trabalho são preparadas a partir destas duas soluções,
seja por diluições sucessivas ou partindo das soluções estoque. Este modo de
preparo das soluções de trabalho é mais adequado, pois permite avaliar através da
curva analítica o erro embutido na solução estoque, decorrente da pesagem dos
padrões.
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Figura 2. Modos de diluição da solução estoque: a) diluição a partir de uma solução
estoque e b) diluição a partir de duas soluções estoques (1 e 2) preparadas com
concentrações diferentes.
Outra maneira de se preparar as soluções seria através da pesagem
separada de cada concentração do padrão da substância da curva analítica, ao
invés da utilização de diluições sucessivas de uma solução mais concentrada
(SWARTZ; KRULL, 1998). Esta é a maneira ideal de se preparar as soluções, pois a
preparação individual mostra o erro verdadeiro na preparação de todas as soluções
padrão e não, erros de diluição. Entretanto, este método torna-se inviável quando se
trabalha com análise de traços, já que a quantidade de padrão a ser pesada é tão
pequena que a sensibilidade da balança não permite tais pesagens, devido aos
erros associados.
5.3 Precisão
Representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes,
repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob
condições definidas (ICH, 1995b; INMETRO, 2003). A precisão é avaliada pelo
desvio padrão absoluto (σ), que utiliza um número significativo de medições,
normalmente maior que 20. Na prática, em validação de métodos, o número de
determinações é geralmente pequeno e o que se calcula é a estimativa do desvio
padrão absoluto (s).
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Outra expressão da precisão é através da estimativa do desvio padrão
relativo (RSD), também conhecido como coeficiente de variação (CV).
RSD (%) ou CV (%) = s/x * 100, onde x é a média aritmética de um
pequeno número de medições (média das determinações).
Normalmente, métodos que quantificam compostos em macro
quantidades requerem um RSD de 1 a 2%. Em métodos de análise de traços ou
impurezas, são aceitos RSD de até 20%, dependendo da complexidade da amostra
(HUBER, 1998). Uma maneira simples de melhorar a precisão é aumentar o número
de replicatas.
A precisão em validação de métodos é considerada em três níveis
diferentes: repetitividade; precisão intermediária; reprodutibilidade.
5.3.1 Repetitividade
A repetitividade (“repeatability”) representa a concordância entre os
resultados de medições sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as
mesmas condições de medição, chamadas condições de repetitividade: mesmo
procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento usado sob as mesmas
condições; mesmo local; repetições em um curto intervalo de tempo. O termo
repetitividade é adotado pelo Vocabulário Internacional de Metrologia (INMETRO,
2000), sendo utilizado pelo INMETRO. Por outro lado, a ANVISA utiliza o mesmo
conceito para o termo repetibilidade (ANVISA, 2003).
A repetitividade envolve várias medições da mesma amostra, em
diferentes preparações e é, algumas vezes, denominada precisão intra-ensaio
(SHABIR, 2003; GREEN, 1996) ou intralote. Pode ser expresso através da
estimativa do desvio padrão relativo (RSD).
Não se deve confundir repetitividade com precisão instrumental, a qual é
medida pelas injeções repetitivas, seqüenciais da mesma amostra (tipicamente 10
39
ou mais vezes), seguida pela média dos valores da área do pico ou altura do pico e
determinação da estimativa do desvio padrão relativo de todas as injeções.
Para a repetitividade, o INMETRO (2003) recomenda sete ou mais
repetições para o cálculo da estimativa do desvio padrão. A ICH (1995b) e ANVISA
(2003) sugerem que a repetitividade seja verificada a partir de um mínimo de nove
determinações cobrindo o limite especificado do procedimento (ex.: três níveis, três
repetições cada um), ou a partir de um mínimo de seis determinações a uma
concentração similar ao valor esperado.
5.3.2 Precisão intermediária
Indica o efeito das variações dentro do laboratório devido a eventos como
diferentes dias ou diferentes analistas ou diferentes equipamentos ou uma
combinação destes fatores (ICH, 1995b).
A precisão intermediária é reconhecida como a mais representativa da
variabilidade dos resultados em um único laboratório e, como tal, mais aconselhável
de ser adotada. O objetivo da validação da precisão intermediária é verificar que no
mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados.
O número de ensaios necessários para se avaliar a precisão intermediária
segue a mesma recomendação da ICH (1995b) e ANVISA (2003) para o cálculo de
repetitividade descrita acima. A precisão intermediária pode ser expressa através da
estimativa do desvio padrão relativo (RSD).
5.3.3 Reprodutibilidade
É o grau de concordância entre os resultados das medições de uma
mesma amostra, efetuadas sob condições variadas (mudança de operador, local,
equipamentos, etc.) (INMETRO, 2000). A reprodutibilidade refere-se aos resultados
dos estudos de colaboração entre laboratórios e deve ser considerada em situações
como a padronização de procedimentos analíticos a serem incluídos, por exemplo,
40
em farmacopéias, procedimentos do CODEX, etc. É muito comum encontrar
desacordo entre métodos analíticos. Isto aparece quando vários laboratórios
analisam uma amostra em comum, em estudos colaborativos. Freqüentemente,
altas variações são observadas entre os resultados. Assim, os dados provenientes
de apenas um laboratório não são suficientes para avaliar a reprodutibilidade do
método. Estudos colaborativos não são somente indispensáveis para avaliação da
reprodutibilidade, eles também podem ser de grande ajuda para testar a exatidão do
método (VIAL; JARDY, 2001).
A IUPAC não aconselha tirar conclusões com menos de cinco laboratórios
e recomenda oito laboratórios em seu guia atual (THOMPSON et al., 2002). Além
disso, mais crítico que o número de laboratórios envolvidos é que estes possuam
competência e habilidades similares àqueles que usarão o método em rotina.
A documentação que apóia os estudos de precisão em nível de
reprodutibilidade deve incluir estimativa do desvio padrão absoluto, estimativa do
desvio padrão relativo e intervalo de confiança. Horwitz et al. (1980) estabeleceram
uma relação matemática para expressar a dependência entre valores do RSD e
concentração da substância, pelo exame de resultados cumulativos de estudos
colaborativos envolvendo grande faixa de compostos de interesse, matrizes e
técnicas analíticas. Os valores obtidos por esta relação matemática são introduzidos
em um gráfico e originam a denominada Trombeta de Horwitz (HORWITZ et al.,
1980).
5.4 Exatidão
Representa o grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como
verdadeiro (ICH, 1995b; INMETRO, 2003). É importante observar que um valor
exato ou verdadeiro é o valor obtido por uma medição perfeita e este valor é
indeterminado por natureza (ISO, 1993).
41
A exatidão é sempre considerada dentro de certos limites, a um dado
nível de confiança (ou seja, aparece sempre associada a valores de precisão). Estes
limites podem ser estreitos em níveis de concentração elevados e mais amplos em
níveis de traços.
O número de ensaios varia segundo a legislação ou diretriz adotada e
também com as características da pesquisa. A ICH (1995b) estabelece que um
mínimo de nove determinações envolvendo um mínimo de três diferentes níveis de
concentração deve ser obedecido. Por exemplo, ensaios em triplicata para três
níveis de concentração. Esta recomendação é também adotada pela ANVISA
(2003).
Os processos mais utilizados para avaliar a exatidão de um método são:
materiais de referência; comparação de métodos; ensaios de recuperação; adição
padrão.
5.4.1 Materiais de referência certificados (CRM)
Os CRM são materiais de referência acompanhados de um certificado
que possui o valor de concentração de uma dada substância, ou outra grandeza
para cada parâmetro e uma incerteza associada. Os materiais de referência
certificados são fornecidos por organismos reconhecidos e confiáveis, como NIST
(“National Institute of Standards and Technology” - USA), LGC (“Laboratory of the
Government Chemist” - UK), USP, FAPAS (“Food Analysis Performance Assessment
Scheme” - UK), etc.
Os valores obtidos pelo laboratório (a média e a estimativa do desvio
padrão de uma série de replicatas) da mesma amostra padrão devem ser
comparados com os valores certificados do material de referência, para verificar a
exatidão do método.
42
5.4.2 Comparação de métodos
Consistem na comparação entre resultados obtidos empregando-se o
método em desenvolvimento e os resultados conseguidos através de um método de
referência, avaliando o grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos dois
métodos, ou seja, o grau de exatidão do método testado em relação ao de
referência. Esta abordagem assume que a incerteza do método de referência é
conhecida.
As análises são efetuadas em replicata, utilizando os dois métodos em
separado (o método em desenvolvimento e o método de referência), sobre as
mesmas amostras, em uma faixa de concentrações em que se pretende validar o
método.
5.4.3 Ensaios de recuperação
A recuperação (ou fator de recuperação), R, é definida como a proporção
da quantidade da substância de interesse, presente ou adicionada na porção
analítica do material teste, que é extraída e passível de ser quantificada
(THOMPSON et al., 1999). A informação de recuperação pode ser estimada de
CRM (em que a quantidade de substância é previamente conhecida), quando
disponíveis, ou de um composto substituto (“surrogate”). O substituto é definido
como um composto ou elemento puro adicionado ao material teste, no qual o
comportamento químico e físico é representativo da substância de interesse na
forma nativa (CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2001). Diz-se que o composto é um
substituto porque este é transferido para a amostra e pode não estar efetivamente
no mesmo equilíbrio que se encontra a substância na forma nativa, então se
determina a recuperação do substituto, fazendo uma “correção de recuperação” para
a substância de interesse (THOMPSON et al., 1999). Os compostos substitutos,
adicionados nas amostras, podem ser de vários tipos:
• padrão da substância adicionado à matriz isenta da substância ou à
amostra (fortificação, incorporação, dopagem, enriquecimento, termos provenientes
43
do inglês “spiking”); o US-FDA reconhece duas categorias de padrões de referência:
compendiais e não compendiais. Os padrões de referência compendiais são obtidos
de fontes como a USP e não necessitam de caracterização posterior. Os padrões de
referência não compendiais são substâncias com elevado teor de pureza, que
podem ser obtidas através de um esforço razoável e devem ser cuidadosamente
caracterizados para garantir sua identidade, potência e pureza. É recomendável que
fatores de correção de pureza sejam incluídos em qualquer cálculo existente no
método.
• uma versão da substância modificada isotopicamente e
• composto quimicamente diferente da substância de interesse, mas
representativo de seu comportamento. Algumas vezes este composto é denominado
padrão interno (LEITE, 2002; CUADROS-RODRÍGUEZ et al., 2001).
A limitação do procedimento de recuperação é a de que a substância
adicionada não está, necessariamente, na mesma forma que a presente na amostra.
Isso pode implicar, por exemplo, na presença de substâncias adicionadas em uma
forma que proporcione melhor detecção, ocasionando avaliações excessivamente
otimistas da recuperação. Pelo fato de outros componentes da matriz poderem
interferir na separação, detecção ou na quantificação da substância, efeitos dos
componentes da matriz devem ser investigados.
É importante considerar como a eficiência do método varia em função da
concentração da substância. Na maioria dos casos, a dispersão dos resultados
aumenta com a diminuição da concentração e a recuperação pode diferir
substancialmente a altas e baixas concentrações.
Por esse motivo, a recuperação deve ser avaliada na faixa de
concentração esperada para o composto de interesse. Isto pode ser feito
adicionando a substância em pelo menos três diferentes concentrações, por
exemplo, próximo ao limite de quantificação, próximo à concentração máxima
permitida pelo método em teste e em uma concentração próxima à média da faixa
de uso do método. Para análises em nível de resíduos, o GARP recomenda que se
trabalhe nos níveis de adição de 1, 2 e 10 vezes o valor de limite de quantificação
(GARP, 1999). Para componentes em maiores concentrações, os níveis de adição
44
podem ser 50, 75, 100, 125 e 150% do nível esperado para a substância (SNYDER
et al., 1997).
As medições de recuperação são as mais comuns devido à dificuldade
em se obterem CRM e são expressas em termos de porcentagem da quantidade
medida da substância em relação à quantidade adicionada na matriz (branco ou
placebo), em um determinado número de ensaios (BURNS et al., 2002).
Os intervalos aceitáveis de recuperação para análise de resíduos
geralmente estão entre 70 e 120%, com precisão de até ± 20%. Porém, dependendo
da complexidade analítica e da amostra, este valor pode ser de 50 a 120%, com
precisão de até ± 15% (GARD, 1999).
5.4.4 Adição padrão
Este método é usado quando for difícil ou impossível preparar um branco
da matriz sem a substância de interesse. Um exemplo seria a análise de β-caroteno
em amostras de mamão, nas quais o β-caroteno sempre estará presente.
No método de adição padrão, quantidades conhecidas da substância são
adicionadas em diferentes níveis numa matriz da amostra, antes do procedimento de
preparo da amostra, que já contenha quantidades (desconhecidas) da substância
(DE ANDRADE, 1987). A concentração da substância de interesse na amostra
original pode ser determinada gráfica e matematicamente, como já mostrado
anteriormente. Em geral, para adição padrão, uma boa abordagem é adicionar 25,
50 e 100% da concentração esperada da substância na matriz (SNYDER et al.,
1997). A amostra sem adição do padrão e cada uma das amostras com o padrão
adicionado devem ser analisadas e as quantidades medidas relacionadas com a
quantidade adicionada.
45
5.5 Limite de Detecção (LD)
O limite de detecção (LD) representa a menor concentração da
substância em exame que pode ser detectada, mas não necessariamente
quantificada, utilizando um determinado procedimento experimental (ICH, 1995b;
INMETRO, 2003).
O LD pode ser calculado de três maneiras diferentes: método visual,
método relação sinal-ruído, método baseado em parâmetros da curva analítica.
5.5.1 Método visual
É utilizado para determinar o limite de detecção utilizando a matriz com
adição de concentrações conhecidas da substância de interesse, de tal modo que se
possa distinguir entre ruído e sinal analítico pela visualização da menor
concentração visível (detectável). Este procedimento também pode ser feito através
do instrumento utilizando parâmetros de detecção no método de integração.
5.5.2 Método da relação sinal-ruído
Este método pode ser aplicado somente em procedimentos analíticos que
mostram o ruído da linha de base. Para determinar a relação sinal-ruído, é feita a
comparação entre a medição dos sinais de amostras em baixas concentrações
conhecidas do composto de interesse na matriz e um branco (matriz isenta do
composto de interesse) destas amostras. Assim, é estabelecida uma concentração
mínima na qual a substância pode ser facilmente detectada. A relação sinal-ruído
pode ser de 3:1 ou 2:1, proporções geralmente aceitas como estimativas do limite de
detecção.
46
5.5.3 Método baseado em parâmetros da curva analítica
O limite de detecção (LD) pode ser expresso como:
LD = 3,3 x s/S
onde s é a estimativa do desvio padrão da resposta, que pode ser a estimativa do
desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear
da equação e S é a inclinação (“slope”) ou coeficiente angular da curva analítica.
Para calcular estes dados, uma curva analítica deverá ser feita utilizando
a matriz contendo o composto de interesse na faixa de concentração próxima ao
limite de detecção. Softwares como Microsoft Excel® ou Microcal Origin® podem
calcular os parâmetros da curva e a estimativa do desvio padrão relativo destes
parâmetros. Para adquirir melhor compreensão dos cálculos envolvidos, podem-se
consultar livros de estatística (BARROS NETO et al., 2002; MILLER; MILLER, 1998;
BOX et al., 1987).
5.6 Limite de Quantificação (LQ)
O limite de quantificação (LQ) representa a menor concentração da
substância em exame que pode ser medida, utilizando um determinado
procedimento experimental (ICH, 1995b; INMETRO, 2003).
Como o LD, o LQ é expresso como uma concentração, sendo que a
precisão e exatidão das determinações também devem ser registradas. Esse critério
é uma boa regra a ser seguida, porém não se deve esquecer que a determinação do
LQ representa um compromisso entre a concentração, a precisão e a exatidão
exigidas. Isto significa que, quando decresce o nível de concentração do LQ, a
medição torna-se menos precisa. Se houver necessidade de maior precisão, uma
concentração maior deve ser registrada para o LQ. O método analítico e seu
respectivo uso ditam esse compromisso.
47
Os mesmos critérios de LD podem ser adotados para o LQ, utilizando a
relação 10:1, ou seja, o LQ pode ser calculado utilizando o método visual, a relação
sinal-ruído ou a relação entre a estimativa do desvio padrão da resposta (s) (que
pode ser a estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de
regressão ou do coeficiente linear da equação) e a inclinação da curva analítica (S),
em níveis próximos ao LQ, a partir da equação:
LQ = 10 x s/S
O método mais utilizado é o da relação sinal-ruído para técnicas analíticas
em geral, porém em técnicas analíticas de separação, como as cromatográficas e
eletroforéticas, a medição do ruído não é trivial e às vezes subjetiva (já que a curva
analítica é construída com a área e não somente o sinal do detector). Além disso,
tanto o LD quanto o LQ podem ser afetados pelas condições cromatográficas. Picos
maiores aumentam a relação sinal-ruído, resultando em LD e LQ mais baixos. Além
disso, a determinação cromatográfica desses parâmetros deve considerar tanto o
tipo quanto o tempo de uso da coluna.
O melhor caminho para resolver este problema do cálculo do LD e LQ é
utilizar o método baseado nos parâmetros da curva analítica, que é estatisticamente
mais confiável. A curva analítica deve conter a concentração correspondente ao LQ.
5.7 Robustez
De acordo com o INMETRO (2003), a robustez de um método
(“robustness”) mede a sensibilidade que este apresenta em face de pequenas
variações. Diz-se que um método é robusto quando ele não é afetado por uma
modificação pequena e deliberada em seus parâmetros. A robustez de um método
cromatográfico é avaliada, por exemplo, pela variação de parâmetros como a
concentração do solvente orgânico, pH e força iônica da fase móvel em HPLC,
programação da temperatura, natureza do gás de arraste em GC, bem como o
tempo de extração, agitação, etc. As mudanças introduzidas refletem as alterações
48
que podem ocorrer quando um método é transferido para outros laboratórios,
analistas ou equipamentos (HEYDEN, 1994).
Para determinar a robustez de um método, o INMETRO recomenda o
teste de Youden (INMETRO, 2003). Trata-se de um teste que permite não só avaliar
a robustez do método, como também ordenar a influência de cada uma das
variações nos resultados finais, indicando qual o tipo de influência de cada uma
dessas variações. Por este teste são realizados oito ensaios com uma combinação
fatorial dos efeitos e verifica-se qual o efeito ou combinação de efeitos que
apresentam variações.
A IUPAC (THOMPSON et al., 2002) utiliza o mesmo conceito de robustez
para a palavra “ruggedness”. A USP também utiliza o termo “ruggedness”, mas com
uma definição diferente, que lembra reprodutibilidade: “A robustez de um método
analítico é o nível de reprodutibilidade dos resultados dos testes obtidos pelas
análises de algumas amostras sob uma variedade de condições normais de teste,
tais como diferentes laboratórios, diferentes analistas, diferentes instrumentos,
diferentes lotes de reagentes, diferentes dias, etc.”(USP, 1999).
Em HPLC, a robustez pode ser avaliada, por exemplo, variando o
conteúdo de metanol na fase móvel em ± 2%, o pH da fase móvel em 0,1 unidades
de pH ou a temperatura da coluna em ± 5 ºC. Se estas mudanças estiverem dentro
dos limites de exatidão, e precisão e seletividade aceitáveis, então o método possui
robustez e tais variações podem ser incorporadas ao procedimento. Em trabalhos
nos quais há mudanças de fornecedores, marcas ou equipamentos ao longo do
desenvolvimento e validação das metodologias, sem alteração significativa nos
resultados, pode-se dizer que o método possui uma robustez intrínseca, pois
manteve sua resposta em meio a mudanças de ambiente de análise.
49
6 ESTABILIDADE DOS PADRÕES E DAS AMOSTRAS
Para gerar resultados confiáveis e reprodutíveis, as amostras, os padrões
e reagentes usados devem ser estáveis por um período razoável (por ex. um dia,
uma semana, um mês, dependendo da necessidade) (SHABIR, 2003).
Freqüentemente, em equipamentos automatizados, as corridas cromatográficas são
realizadas durante a noite para melhor aproveitamento do funcionamento do
laboratório. Esta prática requer maior estabilidade das soluções. A estabilidade das
amostras e padrões é importante em termos de temperatura e tempo. Se uma
solução não for estável em temperaturas ambientes, a diminuição da temperatura
pode aumentar a estabilidade das amostras e padrões. Com relação ao tempo,
estabilidade de dias ou meses é mais desejável, entretanto em alguns casos, as
soluções precisam ser preparadas cada vez que forem realizadas as análises
(SNYDER et al., 1997).
Em certos tipos de amostras, faz-se necessário avaliar a estabilidade da
substância para determinar o tempo de estocagem das amostras (GREEN, 1996).
Tempos longos de estocagem de amostras biológicas, por exemplo, aumentam a
probabilidade de degradação dos compostos de interesse, com subseqüente
formação de metabólitos. Conhecendo a estabilidade, as análises podem ser
completadas antes de ocorrer a degradação.
7 CONFORMIDADE DO SISTEMA
Antes de realizar experimentos de validação ou mesmo análises de
amostras, deve-se avaliar se o sistema utilizado para a análise é capaz de fornecer
dados de qualidade aceitável. Esta avaliação é alcançada com experimentos de
conformidade do sistema (“system suitability”), que pode ser definida como um
conjunto de testes para garantir que o equipamento utilizado está apto a gerar
resultados de exatidão e precisão aceitáveis. A conformidade do sistema pode
causar dúvidas quanto ao seu alcance e, por isso, é encontrada em duas
abordagens.
50
A primeira considera que a resolução e a repetitividade do sistema
cromatográfico sejam adequadas para a análise a ser realizada. Assim, a
conformidade do sistema é verificada antes que o desenvolvimento do método e a
validação tenham sido completados. Os critérios selecionados são baseados no
desempenho do método determinado durante a validação. Por exemplo, se o tempo
de retenção da amostra fizer parte do critério de conformidade do sistema, a sua
variação (estimativa do desvio padrão) pode ser determinada durante a validação,
que pode ter uma variação de 3%, por exemplo, (baseado nos resultados de
validação) durante o uso rotineiro.
A segunda abordagem considera o sistema como um todo e inclui, além
do sistema cromatográfico, a calibração e manutenção dos equipamentos e
instrumentos utilizados em todo o procedimento analítico, dentro das especificações.
Neste caso, a conformidade do sistema baseia-se no conceito de que o
equipamento, componentes eletrônicos, operações analíticas e amostras constituem
um sistema integral que pode ser avaliado como um todo. Pode-se dizer, então, que
a conformidade do sistema é a verificação de um sistema para garantir a sua
qualidade antes ou durante a análise de amostras desconhecidas.
Alguns autores consideram que, se o sistema estiver qualificado, a
validação do método pode ser desenvolvida. Algumas vezes os critérios para
avaliação da conformidade do sistema são definidos antes da validação e, quando
realizados durante as análises, estes testes garantem que o desempenho do
sistema está apropriado para o uso.
Os parâmetros a serem medidos e seus limites recomendados, de acordo
com a US-FDA, estão no quadro 2 (FDA, 2000). Tipicamente, no mínimo dois destes
critérios são requeridos para garantir a conformidade do sistema.
51
Quadro 2 – Parâmetros de conformidade do sistema e recomendações.
Parâmetro Recomendação
Fator de retenção (k)
O pico deve estar bem separado de
outros picos e do pico correspondente
ao tempo de retenção de um composto
não retido (tM), k > 2
Repetitividade (RSD) RSD < 1% para n > 5
Resolução (Rs)
Rs > 2 entre o pico de interesse e o
interferente potencial mais próximo
(impureza, produto de degradação)
Fator de alargamento (TF) TF ≤ 2
Número de pratos da coluna (N) Em geral deve ser > 2000 para HPLC
8 REVALIDAÇÃO
Dentro de um laboratório é provável que, após um período de tempo,
certos reagentes e equipamentos possam ter sofrido alterações, seja por mudança
de fornecedor, troca de componentes ou desgaste do equipamento provocado pelo
uso constante. É possível que o desempenho do método e, então, a validade dos
resultados gerados pelo método sejam afetados por estas mudanças. A revalidação,
que pode ser necessária em tal situação, é a reavaliação de um método analítico
validado em resposta a uma mudança em algum aspecto do método (JENKE, 1998;
HILL; REYNOLDS, 1999). É impraticável e provavelmente desnecessário revalidar
um método que tenha sofrido “pequenas mudanças”. Propõe-se que estas pequenas
variações sejam avaliadas durante a validação, no parâmetro de robustez, e que a
revalidação de método seja limitada às situações como mudanças de maiores
extensões. Para métodos de separação, alterações significativas poderiam ser
devido a mudanças no produto para o qual o método foi validado, no instrumento, no
reagente (tipo ou fabricante) ou no procedimento.
A revalidação também deve ser considerada quando a proposta e/ou o
nível de qualidade desejado do método são alterados, o procedimento é modificado,
ou mesmo quando um método é usado novamente após certo período de tempo.
52
Com respeito as quais parâmetros devem ser inclusos na revalidação,
pode-se dizer que quanto maiores as alterações no método, maior deve ser a
abrangência da revalidação.
CAPÍTULO 2: Sistema de Detecção de Fármacos
1 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)
Entre os métodos modernos de análise, a cromatografia ocupa um lugar
de destaque devido a sua facilidade em efetuar a separação, identificação e
quantificação das espécies químicas, por si mesma ou em conjunto com outras
técnicas instrumentais de análise, como, por exemplo, a espectrofotometria ou a
espectrometria de massa.
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes
entre duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece
estacionária enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase
móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre
as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido
pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes
(COLLINS et al., 1997).
Para o acompanhamento de fármacos in vivo são utilizadas metodologias
analíticas capazes de quantificar e identificar com precisão e exatidão os mesmos
em fluídos biológicos. Uma das técnicas mais empregadas para este tipo de análise
é a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
Na utilização desta técnica as amostras devem passar por um processo
de purificação. Na rotina, as técnicas mais utilizadas para extração e/ou pré-
concentração de compostos presentes no fluído biológico são: extração líquido-
líquido e extração em fase sólida (LOBO, 2001).
53
Para o uso da extração líquido-líquido em fluidos biológicos
primeiramente é necessária a escolha adequada do solvente orgânico e ajuste do
pH da amostra para que ocorra uma boa recuperação do analito. Vários tipos de
solventes orgânicos são utilizados para extração de drogas ácidas e básicas
presentes na amostra de fluídos biológicos. Quanto maior a afinidade do analito pelo
solvente orgânico maior a recuperação. Substâncias básicas são normalmente
extraídas em pH maior que 7,0 e extração de substância ácida em pH menor que
5,0. Este tipo de extração é muito utilizado para substâncias presentes em fluídos
biológicos (LOBO, 2001).
Esse tipo de extração é vantajoso por ser simples e pela variedade de
solventes, puros e disponíveis comercialmente, os quais fornecem uma ampla faixa
de solubilidade e seletividade. Além disso, ocorre a desnaturação das proteínas
presentes na amostra, eliminando, assim, a contaminação da coluna cromatográfica
(LOBO, 2001).
A extração líquido-líquido possui algumas desvantagens: as amostras que
possuem grande afinidade pela água, que são parcialmente extraídas pelo solvente
orgânico, resultam em perda do analito. É necessária a utilização de solventes
ultrapuros, uma vez que impurezas do solvente são concentradas junto com a
amostra. O grande volume de solvente utilizado acaba gerando problemas de
descartes, além de ser um processo susceptível a erros e de difícil automação.
Apesar destas desvantagens, a extração líquido-líquido é considerada uma técnica
clássica de pré-tratamento de amostra.
As técnicas de extração e/ou pré-concentração permitem que a análise
dos componentes de interesse se torne possível. A meta final é a obtenção de uma
fração da amostra original enriquecida com as substâncias de interesse analítico, de
forma que se obtenha uma separação cromatográfica livre de interferentes, com
detecção adequada e um tempo razoável de análise (LOBO, 2001).
A cromatografia líquida de alta eficiência é o mais importante membro de
uma família inteira de técnicas de separação. Utiliza instrumentos muito sofisticados
54
que podem ser totalmente automatizados. É um tipo de cromatografia líquida que
emprega pequenas colunas recheadas de materiais especialmente preparados e
uma fase móvel que é eluída sob altas pressões. As colunas utilizadas são muito
eficazes, porém oferecem grande resistência à vazão da fase móvel. Por esta razão,
é necessário empregar sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) que fazem
a fase móvel migrar a uma velocidade razoável através da coluna analítica
(COLLINS et al., 1997).
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) tem a capacidade de
realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de
compostos presentes em vários tipos de amostras, em escala de tempo de poucos
minutos, com alta resolução, eficiência e sensibilidade. A detecção contínua e com
grande reprodutibilidade fornecida por esta técnica eleva as análises qualitativa e
quantitativa a um alto nível de exatidão e precisão.
1.1 Detector por absorbância no ultravioleta e no visível
Nos detectores espectrofotométricos o seu funcionamento baseia-se na
absorbância de luz por parte da amostra ao passar através dela qualquer radiação
eletromagnética; normalmente isto ocorre no ultravioleta até o infravermelho, em um
dado comprimento de onda. Existem dois tipos de detectores de luz ultravioleta: o de
comprimento de onda variável (espectrofotômetros), que não só é de aplicação mais
variada e sensível, mas também é mais caro, e o chamado fotométrico que funciona
com um ou dois comprimentos de onda fixos. Este último é sensível, econômico e
mais que suficiente para se conseguir bons resultados com todos os compostos que
absorvem luz no comprimento de onda em que ele funciona. Este tipo de detector é
normalmente insensível a variações de vazão e temperatura. A maioria dos
detectores de comprimento de onda fixo, oferecidos no mercado, operam em um
comprimento de onda de 254 nm e um de 280 nm, resultado da absorbância de luz
em 254 nm e da emissão de luz em 280 nm por uma substância fosforescente. Em
ótimas condições, pode-se atingir sensibilidades de até 0,001 unidades de
absorbância e, se o composto absorve intensamente na faixa de UV, é possível
55
detectar quantidades de amostras da ordem de nanogramas (10
-9
g) (SKOOG;
LEARY, 1992; SNYDER et al., 1997).
Espectrofotômetros de comprimentos de onda variável UV-VIS, cobrindo
a faixa de 190-800 nm, através de monocromador que seleciona o comprimento de
onda desejado do feixe de luz emitido pelas lâmpadas de deutério (UV) ou
tungstênio (VIS), oferecem várias vantagens sobre os instrumentos de comprimento
de onda fixo:
a) Apresenta alta absorbância para vários componentes devido à escolha
de comprimento de onda e, conseqüentemente, tem maior sensibilidade.
b) Permite maior seletividade, desde que um determinado comprimento
de onda pode ser escolhido, onde o soluto de interesse absorve bastante e outros
não.
c) Promove eficiência em eluição por gradiente através da habilidade de
selecionar um comprimento de onda onde os componentes da fase móvel não
apresentam uma variação de absorbância para diferentes concentrações.
d) Permitir obter o espectro de absorbância de cada componente em
separado após parar a vazão da fase móvel.
Análises em diferentes comprimentos de onda também são possíveis com
os detectores espectrofotométricos através de um conjunto de fotodiodos. Esses
fotodiodos, seletivos a determinados comprimentos de onda, em grande número,
cerca de 250, permitem levantar o espectro da substância durante a eluição. Este
detector é denominado detector de rede de diodos (diode array detector). Os
detectores de rede de diodos eram, até a alguns anos, pouco sensíveis, mas na
atualidade, com a melhora dos computadores com programas dedicados para este
fim, com o aumento da sensibilidade dos diodo se com correções da aberração da
rede de difração, eles aumentaram sua sensibilidade e aplicabilidade (SKOOG;
LEARY, 1992; SNYDER et al., 1997).
56
Figura 3. Aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de
ultravioleta utilizado na quantificação das amostras contendo amoxicilina.
1.2 Detector por Fluorescência
A espectroscopia de fluorescência é um método de detecção dos mais
sensíveis da atualidade, específico para compostos que fluorescem. Em boas
condições é possível detectar quantidades da ordem de picogramas (10
-12
g), o que
é comparável aos detectores por captura de elétrons. Uma alta intensidade de
fluorescência é esperada de compostos que sejam conjugados simetricamente ou
que não podem produzir estruturas fortemente iônicas.
A fase móvel empregada nos detectores de fluorescência deve ser
cuidadosamente selecionada, pois a intensidade de emissão depende do meio em
que se encontra a amostra. Isto dificulta algumas de suas aplicações, tais como
análise quantitativa e eluição por gradiente, nas quais se devem selecionar os
componentes da fase móvel para não atrapalhar a fluorescência. Os detectores para
fluorescência também podem proporcionar espectros de emissão das amostras
retidas momentaneamente na sua cela. Desde que uma fonte de UV é necessária
em ambos os detectores, por absorbância no UV e por fluorescência, eles podem
57
ser combinados em um só detector (SKOOG; LEARY, 1992; SNYDER et al., 1997;
LEENHEER et al., 1988).
Figura 4. Aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de
fluorescência utilizado na quantificação das amostras contendo norfloxacino.
1.3 Detector por Espectrometria de Massa
A espectrometria de massa é uma técnica analítica poderosa usada para
identificar compostos desconhecidos, quantificar materiais conhecidos e elucidar as
propriedades químicas e estruturais das moléculas. A detecção de compostos pode
ser conseguida para quantidades tão pequenas como 10
-15
g para um composto de
massa de 1000 Dalton. Isto significa que os compostos podem ser identificados em
concentrações muito baixas (da ordem de 10
-12
) em misturas quimicamente
complexas. A espectrometria de massa fornece informação tanto para químicos,
quanto para físicos, engenheiros, bioquímicos e biólogos, entre outros profissionais.
Os princípios científicos em que a técnica se baseia são simples. A
essência da técnica envolve a geração de íons que são depois detectados. A
sofisticação surge nos métodos que são usados para a geração desses mesmos
íons e no modo de analisá-los (figura 5).
58
Figura 5. Esquema de funcionamento do sistema de espectrometria de massa.
O desenvolvimento da espectrometria de massa de ionização por
eletrospray (IES) permitiu novas possibilidades para análise de compostos de
elevada massa molecular de todos os tipos, incluindo proteínas, nucleotídeos e
polímeros sintéticos, sendo por isso uma técnica muito usada em diversas áreas de
pesquisa.
Comparável ao excitante desenvolvimento da ressonância magnética
nuclear durante as últimas três décadas, a espectrometria de massa entrou em uma
fase de crescimento acelerado nos anos oitenta, começando com a introdução de
métodos de ionização. É incrível a velocidade com a qual a espectrometria de
massa tem se expandido dentro de áreas de pesquisa, nas quais, tradicionalmente,
era limitado o seu uso (SIUZDAK, 2004).
A cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa (GC/MS)
tem sido considerada uma técnica analítica adequada para a análise de misturas
complexas. Tem, no entanto, a grande limitação de ser aplicável apenas a moléculas
relativamente voláteis e termicamente estáveis. Um acoplamento semelhante entre a
cromatografia líquida e a espectrometria de massa (LC/MS) era, por isso, de todo o
interesse, para a análise de compostos sem essas características, para os quais a
análise por GC/MS só podia ser utilizada recorrendo a derivações que tornam o
processo analítico muito demorado.
59
A IES através da espectrometria de massa sofreu um rápido crescimento,
tornando-se, assim, uma técnica analítica fundamental para análise de uma vasta
gama de compostos polares, não voláteis e termicamente instáveis, indo de
compostos de baixa massa molecular até biopolímeros de elevada massa molecular.
As principais características dos espectros de massa de biomoléculas são
as predominâncias de íons moleculares multiplamente carregados e as ausências de
fragmentação que permitem a determinação rigorosa de massas moleculares. No
entanto, no que diz respeito à estrutura molecular, pouca informação, em geral, é
obtida. A dissociação pode ainda ser provocada por ativação colisional na região de
decomposição de um espectrômetro acoplado a outro (MS/MS), sendo esta técnica
relevante na obtenção de informação estrutural de moléculas. Uma mistura de
compostos é introduzida e, com o primeiro espectrômetro de massa, seleciona-se
um íon de interesse. Este é depois dissociado entre os dois espectrômetros,
geralmente por colisão com gás argônio a certa pressão, transformando a energia
cinética em energia vibracional. O segundo espectrômetro separa e determina os
valores de m/z dos íons fragmentados para posterior detecção (ANTIGNAC et al.,
2000). A figura 6 e 7 mostra o aparelho e o esquema da fragmentação utilizando
espectrômetro de massa no modo de monitoramento de reação múltipla (MRM).
Figura 6. Aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência acoplado ao
espectrômetro de massa utilizado na quantificação das amostras contendo
oxcarbazepina.
60
Figura 7. Esquema demonstrativo da fragmentação de compostos utilizando
espectrômetro de massa triplo-quadrupolo no modo de monitoramento de reação
múltipla (MRM).
CAPÍTULO 3: Estudos Farmacocinéticos e Bioequivalência
1 ASPECTOS QUALITATIVOS
Quando um fármaco é introduzido num organismo vivo, este apresenta
propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas. A farmacodinâmica estuda o
efeito desses compostos no organismo bem como os mecanismos através dos quais
elas atuam. A farmacocinética é a parte da farmacologia encarregada de estudar os
fenômenos envolvidos nos processos de absorção, distribuição, metabolismo e
excreção de um medicamento (PAGE et al., 2002).
A absorção, a distribuição, a biotransformação e a eliminação de uma
substância envolvem a sua passagem através das membranas celulares. As
características mais importantes de um fármaco são sua estrutura e massa
molecular, sua solubilidade no local de absorção, o grau de ionização e a
lipossolubilidade relativa de suas formas ionizadas e não-ionizadas (GOODMAN;
GILMAN, 2007).
Quando uma substância penetra numa célula, precisa atravessar a
membrana plasmática celular, na qual as moléculas protéicas globulares também
Mistura de
compostos
Seleção do
íon de
interesse
Dissociação
Seleção do íon
fragmento de
interesse
FONTE Q1 Q2 Q3 DETECTOR
61
penetram ou a atravessam por completo uma dupla camada fluida de fosfolipídio
(SINGER; NICHOLSON, 1972).
Cada molécula de lipídio, na camada dupla, consegue mover-se
lateralmente conferindo à membrana fluidez, flexibilidade, elevada resistência
elétrica e impermeabilidade relativa às moléculas extremamente polares. Complexos
de proteínas intrínsecas da membrana e lipídios conseguem formar canais
hidrofóbicos e hidrofílicos que permitem o transporte de moléculas com
características diferentes (RIDOUT et al., 1988).
Os fármacos atravessam as membranas tanto através de processos
passivos como por mecanismos que envolvem a participação ativa dos
componentes da membrana. No primeiro caso, a molécula do fármaco costuma
atravessar por difusão passiva através de um gradiente de concentração graças à
sua solubilidade na camada lipídica. Esta transferência é diretamente proporcional à
magnitude dos gradientes de concentração através da membrana e a
lipossolubilidade do fármaco. Quanto mais lipossolúvel, maior é a concentração do
fármaco na membrana e mais rápida é a sua difusão. Após ter atingido um estado
de equilíbrio dinâmico, a concentração de fármaco livre é igual de ambos os lados
da membrana. No caso de compostos iônicos, as concentrações no estado de
equilíbrio dinâmico dependerão de diferenças de pH através da membrana,
influenciam a ionização da molécula de cada lado da membrana e o gradiente
eletroquímico do íon. A maioria das membranas biológicas é relativamente
permeável à água, seja por difusão ou pelo fluxo que resulta de diferenças
hidrostáticas ou osmóticas através da membrana. Este fluxo de água pode carrear
consigo pequenas substâncias hidrossolúveis. De modo geral, essas substâncias
não atravessam as membranas celulares quando suas massas moleculares são
superiores a 100 µm (BRODIE, 1964; PRESCOTT, 1981).
1.1 Absorção de Fármacos
A absorção descreve a velocidade com a qual o fármaco deixa seu local
de administração e a magnitude com que isso ocorre. Muitas variáveis, além dos
62
fatores físico-químicos que afetam o transporte através das membranas, influenciam
a absorção dos fármacos (GOODMAN; GILMAN, 2007).
As substâncias administradas em solução aquosa são absorvidas mais
rapidamente que aquelas administradas em soluções oleosas, suspensões ou forma
sólida; porque se misturam mais facilmente com a fase aquosa no local de absorção.
No caso de substâncias administradas na forma sólida, a velocidade de dissolução
será o fator limitante da sua absorção, como representado na figura 8 (PRESCOTT,
1981).
Figura 8. Processo de absorção de formas farmacêuticas sólidas.
A concentração de um fármaco influência a velocidade de sua absorção.
Os agentes ingeridos ou injetados em soluções de concentração elevada são
absorvidos mais rapidamente do que aqueles em solução de baixa concentração. A
circulação para o local da absorção também afeta a absorção do fármaco. O maior
fluxo sanguíneo aumenta a velocidade de absorção do fármaco, enquanto a redução
do fluxo sanguíneo diminui a absorção (PRESCOTT, 1981).
A área de superfície absorvente à qual um fármaco é exposto é um dos
determinantes mais importantes da velocidade de absorção. As substâncias são
absorvidas muito rapidamente a partir de grandes superfícies, como a mucosa
intestinal. Como a maior parte da absorção do trato gastrointestinal ocorre através
de processos passivos, a absorção é favorecida quando o fármaco se encontra na
forma não-ionizada, que é mais lipofílica (BRODIE, 1964).
63
1.2 Distribuição de Fármacos
Após ser absorvido ou injetado na corrente sanguínea, o fármaco
distribui-se para os líquidos intersticiais e celulares. Pode ser diferenciada uma fase
inicial de distribuição que reflete o débito cardíaco e o fluxo sanguíneo regional. O
coração, o fígado, os rins, o cérebro e outros órgãos bem perfundidos recebem
maior parte dos fármacos durante os primeiro minutos após sua absorção. O aporte
do fármaco à musculatura, à maioria das víceras, à pele e ao tecido adiposo é mais
lento, e estes tecidos exigem de minutos a algumas horas para atingir o estado de
equilíbrio, como representado na figura 9 (BENET, 1978).
Figura 9. Distribuição de fármacos no organismo.
Uma segunda fase de distribuição do fármaco pode então ser percebida e
está também limitada pelo fluxo sanguíneo; envolvendo uma fração muito maior da
massa corporal do que a primeira. Os fármacos, que não são lipossolúveis e
penetram mal nas membranas têm sua distribuição limitada e, portanto, seus locais
de ação potenciais também limitados. Além disso, a distribuição pode ser limitada
por uma ligação dos fármacos às proteínas plasmáticas, sobretudo à albumina (no
caso dos fármacos ácidos) e à glicoproteína ácida (no caso de substâncias básicas).
Um agente que apresenta ligação extensa e forte com as proteínas plasmáticas tem
acesso limitado aos locais de ação celulares e é metabolizado e eliminado
lentamente. Os fármacos podem acumular-se nos tecidos em concentrações
64
maiores do que o esperado nos equilíbrios de difusão, como resultado do gradiente
de pH, ligação com componentes intracelulares ou distribuição em lipídios
(ROBERTS et al., 1988). Os fármacos que se acumulam em determinado tecido
podem servir como reservatório que prolonga suas ações no mesmo tecido ou num
local distante atingido através da circulação (NEBERT; GOZALEZ, 1987).
Uma terceira fase de distribuição destes fármacos origina-se da lenta
captação do fármaco pelo tecido adiposo (limitada pelo fluxo sanguíneo). Esses
pontos podem tornar-se reservatórios para a manutenção da concentração
plasmática (BENET, 1978).
1.3 Biotransformação de Fármacos
A biotransformação enzimática de fármacos em metabólitos mais polares
e menos lipossolúveis aumenta sua excreção e reduz seu volume de distribuição.
Tal biotransformação alivia a carga de substâncias químicas estranhas e é essencial
à sobrevida do organismo (GOLDSTEIN et al., 1974).
Os sistemas enzimáticos responsáveis pela biotransformação de muitos
fármacos estão localizados no retículo endoplasmático liso dos hepatócitos no
fígado (fração microssômica). Tais enzimas também são encontradas em outros
órgãos como rins, pulmões e epitélio gastrointestinal. Os fármacos absorvidos pelo
intestino estão, portanto, sujeitos ao efeito de primeira passagem. Isto representa a
ação combinada de enzimas epiteliais gastrointestinais e hepáticas, que algumas
vezes podem impedir que concentrações efetivas do fármaco ativo atinjam a
circulação sistêmica após a administração oral, como já foi comentado antes
(NEBERT; GOZALEZ, 1987).
As reações químicas da biotransformação enzimática são classificadas
como reações em fase I ou II (figura 10). As reações de fase I convertem o fármaco
original em um metabólito mais polar através de oxidação, redução ou hidrólise. O
metabólito resultante pode ser farmacologicamente inativo, menos ativo ou mais
ativo que a molécula original. Quando o próprio metabólito é a forma ativa, o
65
composto original é denominado de pró-fármaco. As reações de fase II, que também
são denominadas reações de conjugação ou de síntese, envolvem a ligação do
fármaco ou de seu metabólito polar a um substrato endógeno como glicuronato,
sulfato, acetato ou um aminoácido (PAGE et al., 2002).
Figura 10. Biotransformação de fármacos.
Os estudos de biotransformação em animais de laboratório mostram que
um grande número de fatores genéticos, ambientais e fisiológicos afeta a
metabolização de um fármaco. No homem, os fatores mais importantes são
polimorfismos geneticamente determinados nas oxidações e conjugações dos
fármacos, influências ambientais, incluindo uso concomitante de outras substâncias
que induzam ou inibam enzimas metabolizadoras de fármacos, e a existência de
doenças hepáticas, quase sempre associadas à grave desnutrição (BRIDGES,
1987).
1.4 Eliminação de fármacos
Os fármacos são eliminados do organismo tanto na forma inalterada
como na forma de metabólitos. Os órgãos excretores, com a exclusão dos pulmões,
eliminam os compostos polares de forma mais eficientes do que as substâncias com
lipossolubilidade elevada. Os fármacos lipossolúveis, portanto, não são eliminados
até serem metabolizados em compostos mais polares. O rim é o órgão mais
importante de eliminação de fármacos e metabólitos (GUYTON, 1973).
Reações Fase I
Reações Fase II
- Oxidação
- Redução
- Hidrólise
- Conjugação com ácido glucurônico
- Conjugação com peptídeos
- Conjugação com sulfatos
- Metilação
- Acetilação
- Síntese de ácido mercaptúrico
66
As substâncias eliminadas nas fezes são, sobretudo, aquelas
administradas por via oral e que não são absorvidas ou metabólitos excretados na
bile que não são reabsorvidos pelo trato gastrointestinal. A excreção pulmonar é
importante, sobretudo, para a eliminação de vapores e gases anestésicos e, às
vezes, pequenas concentrações de outros fármacos ou metabólitos são eliminados
por esta via (GUYTON, 1973). A eliminação de fármacos e metabólitos na urina
envolve três processos: filtração glomerular, secreção ativa e reabsorção tubular
passiva (ATKINSON, 1988).
A concentração do fármaco que penetra na luz tubular por filtração
depende da sua ligação protéica plasmática fracional e da velocidade de filtração
glomerular. No túbulo proximal, determinados ânions e cátions orgânicos são
adicionados ao filtrado glomerular através de secreção tubular ativa mediada por
carreadores (ATKINSON et al., 2001; GUYTON, 1973).
Os sistemas carreadores são relativamente não seletivos e íons orgânicos
de carga elétrica semelhante competem pelo transporte. Os sistemas de transporte
também podem ser bidirecionais e pelo menos alguns fármacos são secretados e
ativamente reabsorvidos. Todavia, o transporte da maioria dos íons exógenos é
predominante secretório. Nos túbulos proximais e distais, as formas não ionizadas
de ácidos e bases fracos sofrem reabsorção passiva final. O gradiente de
concentração da retrodifusão é criado pela reabsorção da água com Na+ e outros
íons inorgânicos. Como as células tubulares são menos permeáveis às formas
ionizadas que ao eletrólito fraco, a reabsorção passiva dessas substâncias é pH
dependente. Quando a urina tubular se torna mais alcalina, os ácidos são eliminados
mais rapidamente, basicamente porque estão mais ionizados e diminuem a
reabsorção passiva. Quando a urina tubular é acidificada, diminui a excreção de
ácidos fracos. A alcalinização e a acidificação da urina têm efeitos opostos sobre a
excreção das bases fracas (GOODMAN; GILMAN, 2007).
Muitos metabólitos formados no fígado são eliminados na bile para o trato
intestinal. Esses metabólitos podem ser excretados nas fezes, reabsorvidos para o
sangue e por fim eliminados na urina. A excreção de fármacos pelo suor, saliva,
67
pelas lágrimas e leite materno não é importante do ponto de vista quantitativo
(ATKINSON et al., 1988).
2 ASPECTOS QUANTITATIVOS
Uma hipótese fundamental da farmacocinética clínica é que existe uma
correlação entre a resposta farmacológica ou tóxica a um fármaco e a sua
concentração na circulação sistêmica e que está relacionada à sua concentração
nos seus locais de ação (PAGE et al., 2002; ROWLAND; TOZER, 1995).
As inúmeras variáveis fisiológicas e fisiopatológicas que ditam os ajustes
posológicos em pacientes, freqüentemente o fazem como resultado de uma
modificação dos parâmetros farmacocinéticos. Os três parâmetros mais importantes
são: depuração (uma medida da capacidade do organismo de eliminar o fármaco),
volume de distribuição (uma medida no espaço aparente do corpo disponível para
conter o fármaco) e biodisponibilidade (a fração do fármaco absorvida como tal na
circulação sistêmica) (ATKINSON et al., 1988; SHORGET; ANDREW, 1941).
O conceito de depuração (Clearence – CL) é extremamente valioso na
famacocinética clínica, porque a eliminação de determinado fármaco costuma ser
constante na amplitude de concentrações encontradas clinicamente. Em níveis
simples, a depuração de um fármaco é a taxa de eliminação por todas as vias
normalizadas de acordo com a concentração do fármaco (C) em algum líquido
biológico (KLOTZ et al., 1975; ROWLAND; TOZER, 1995):
CL = Taxa de eliminação / C
É importante observar que a depuração não indica quanto do fármaco
está sendo eliminado, mas sim o volume de líquido biológico, como o sangue e o
plasma, que precisa estar completamente livre do agente para contribuir para sua
eliminação. A depuração é expressa como volume por unidade de tempo. Em geral,
a depuração costuma ser definida como depuração sanguínea (CLb), depuração
plasmática (CLp) ou depuração baseada na concentração de fármaco livre (CLu),
68
dependendo da concentração medida (Cb, Cp ou Cu) (BENET, 1984; ATKINSON et
al., 2001).
A depuração através de vários órgãos de eliminação é aditiva. A
eliminação do fármaco pode ser decorrente dos processos que ocorrem nos rins, no
fígado e em outros órgãos. A divisão da taxa de eliminação por cada órgão por uma
concentração do fármaco (concentração plasmática) fornecerá a depuração
respectiva deste órgão. Em conjunto, tais depurações separadas serão iguais à
depuração sistêmica total (GOODMAN; GILMAN, 2007; SHORGET; ANDREW,
1941; ROWLAND; TOZER, 1995):
CLrenal + CLhepática + CLoutros = CLsistêmica
Para uma única dose de um fármaco com biodisponibilidade completa e
cinética de eliminação de primeira ordem, a depuração sistêmica total poderia ser
(KLOTZ et al., 1975):
CL = Dose/AUC
Na qual AUC é a área total sob a curva que descreve a concentração do
fármaco na circulação sistêmica em função do tempo (de zero até o infinito) (KLOTZ
et al., 1975).
O volume é um segundo parâmetro fundamental na discussão dos
processos de distribuição farmacológica. O volume de distribuição (V) relaciona a
concentração de fármaco no organismo com a concentração de fármaco (C) no
sangue e no plasma, dependendo do líquido medido. Este volume não se refere
necessariamente a um volume fisiológico identificável, mas apenas ao volume de
líquido que seria necessário para conter todo o fármaco no organismo, na mesma
concentração em que se encontra no sangue ou no plasma (BENET; GALEAZZI,
1979; ROWLAND; TOZER, 1995):
69
O volume de plasma de um homem normal de 70 kg é de 3 litros, o
volume sanguíneo é de aproximadamente 5,5 litros, o volume de líquido extracelular
fora do plasma é de 12 litros e o volume de água corporal total é de
aproximadamente 42 litros. Entretanto, muitos fármacos exibem volumes de
distribuição muito superiores a estes valores. No caso de substâncias que
apresentam ligação substancial com as proteínas plasmáticas, mas que não se
ligam aos componentes teciduais, o volume de distribuição aproximar-se-á do
volume plasmático. Em contrapartida, determinados fármacos apresentam volume
de distribuição elevado, embora a maior parte do fármaco na circulação esteja ligada
à albumina, porque tais fármacos também são seqüestrados em outros pontos do
organismo (BENET et al., 1984; SHORGET; ANDREW, 1941).
A meia-vida de um fármaco é o tempo que leva para a concentração
plasmática ou a concentração da substância no corpo reduzir em 50%. No caso
mais simples, o modelo monocompartimental, a meia-vida pode ser determinada
rapidamente e usada para tomar decisões sobre posologia do fármaco (BENET,
1984).
A meia-vida é um parâmetro que varia de acordo com a depuração e o
volume de distribuição. Uma correlação aproximada entre a meia-vida clinicamente
importante, a depuração e o volume de distribuição é dada por (GOODMAN;
GILMAN, 2007; ROWLAND; TOZER, 1995):
t
1/2
= 0,693 x V/CL
A depuração é a capacidade do organismo em eliminar uma substância.
Entretanto, os órgãos de eliminação só podem retirar o fármaco do sangue ou do
plasma com o qual estão em contato direto (ATKINSON et al., 2001; SHORGET;
ANDREW, 1941). Embora possa ser um indicador satisfatório de eliminação do
fármaco, a meia-vida é um bom indicador do tempo necessário para atingir um
estado de equilíbrio dinâmico (KLOTZ et al., 1975).
70
2.1 Modelos Farmacocinéticos
Uma hipótese ou modelo é concebida usando termos matemáticos, os
quais são um meio conciso de expressar ralações quantitativas. Vários modelos
matemáticos podem ser usados para simular a velocidade ou taxa dos processos de
absorção, distribuição e eliminação, sendo denominados, modelos farmacocinéticos.
Estes modelos possibilitam o desenvolvimento de equações para descrever
concentrações do fármaco no organismo em função do tempo, as quais permitem
caracterizar com reprodutibilidade o ambiente e o destino de um fármaco no sistema
biológico, após sua administração por uma determinada via de administração e
forma farmacêutica (ROWLAND; TOZER, 1995).
Os parâmetros farmacocinéticos como Vd, t1/2 e clearance, são
determinados experimentalmente a partir de curvas de concentração (variável
dependente) em função do tempo (variável independente). Porém, para
interpretação destas curvas e obtenção dos parâmetros, um modelo farmacocinético
é estimado e testado quanto a validade a partir destas; e uma vez validado os
parâmetros farmacocinéticos são obtidos. Programas computacionais podem ser
usados para estimar parâmetros a partir de modelos farmacocinéticos complexos.
Devemos sempre lembrar que na verdade, como acabamos de ver, os parâmetros
farmacocinéticos são adaptados de modelos e, por isto, são sujeitos a erros de
estimativa que podem variar com as concentrações obtidas, técnicas analíticas de
dosagens e metodologias utilizadas na interpretação dos dados (ROWLAND;
TOZER, 1995).
2.1.1 Modelos compartimentais
O corpo pode ser representado como uma série, ou sistemas, de
compartimentos que comunicam-se reversivelmente entre si. Um compartimento não
é uma região anatômica ou fisiológica real, mas é considerada como um tecido ou
grupo de tecidos que devem possuir fluxo sangüíneo e afinidade pelo fármaco
similar. Dentro de cada compartimento considera-se que o fármaco distribua-se
71
uniformemente; a mistura do fármaco dentro do compartimento é rápida e
homogênea, tanto que sua concentração é representada como uma concentração
média e cada molécula do fármaco possui igual probabilidade de sair do
compartimento. Modelos compartimentais são baseados em hipóteses lineares
usando equações diferenciais e, embora os compartimentos farmacocinéticos não
corresponda a nenhuma das entidades anatômicas atuais, o compartimento, todavia,
apresenta dimensões numéricas de volume (ml, litro) como se fossem um volume
real (ROWLAND; TOZER, 1995).
O emprego de modelos compartimentais em farmacocinética leva,
geralmente, implícita a suposição de que os processos que se estudam, ou o fluxo
dos fármacos até o compartimento, se desenvolvem segundo cinética de primeira
ordem. Por exemplo, o resumo dos processos que retiram medicamentos do
organismo irreversivelmente, pode caracterizar-se por uma constante de velocidade
de eliminação de primeira ordem cinética, que compreenderia a excreção urinária, a
biotransformação e outros processos que contribuem na retirada do fármaco do
organismo (ROWLAND; TOZER, 1995).
A cinética de primeira ordem implica que a velocidade na qual se produz
um processo é proporcional à quantidade ou concentração do fármaco existente no
compartimento no qual se desenvolve. Assim, se é grande a quantidade de
medicamento no organismo também é, ou será, alta a velocidade de eliminação. Por
outro lado, a eliminação diminuirá proporcionalmente com a redução da quantidade
ou concentração (ROWLAND; TOZER, 1995).
Também a transferência do medicamento de um compartimento a outro
pode obedecer cinética de primeira ordem e o mesmo ocorre com a maioria dos
processos que os fármacos experimentam no organismo. Em geral, alguns deles
não são estritamente de primeira ordem, como por exemplo a biotransformação a
secreção tubular ou a transferência através de uma membrana quando processos
ativos estão envolvidos. Estes podem obedecer à uma cinética mais complexa, por
exemplo a processos enzimáticos regidos pela equação de Michaelis-Menten. No
entanto, as concentrações de fármaco com as quais normalmente se trabalha em
72
farmacocinética (terapêuticas), aparecem na maioria das vezes como de primeira
ordem (ROWLAND; TOZER, 1995).
Assim, podemos dizer que os processos farmacocinéticos correspondem
a uma cinética linear. Uma conseqüência desta linearidade é o fato de que a área
sob a curva (ASC) de concentração plasmática vs tempo, após injeção por via
intravenosa, é uma função linear da dose administrada (ROWLAND; TOZER, 1995).
Os modelos compartimentais consistem de um ou mais compartimentos
periféricos conectados à um compartimento central. O compartimento central é
representado pelo plasma e tecidos altamente perfundidos. Assim, quando uma
dose intravenosa do fármaco é administrada, ela entra diretamente no
compartimento central e também é deste compartimento que ocorre sua eliminação,
uma vez que é no compartimento central que se encontra os órgãos envolvidos na
eliminação, primariamente, rim, fígado e tecidos altamente perfundidos (ROWLAND;
TOZER, 1995).
2.1.2 Modelo aberto de um compartimento
É o modelo compartimental mais simples e pode representar fármacos
que após administração, se distribuem através da via circulatória para todos os
tecidos e se equilibra rapidamente em todo o organismo. Esta administração pode
ser na forma de injeção intravenosa rápida (IV bolus), através da qual toda a dose
do fármaco entra imediatamente no organismo e, portanto, a velocidade de absorção
é negligenciada nos cálculos; ou ainda por via extravenosa (VEV), onde a etapa de
absorção deve ser considerada (ROWLAND; TOZER, 1995).
O modelo de monocompartimental descreve, muitas vezes
adequadamente, as alterações sofridas ao longo do tempo, na concentração
plasmática ou na excreção urinária de fármacos que após a administração, se
distribuem rapidamente entre o plasma e os tecidos. Admitir a existência de tal
modelo não implica, necessariamente presumir que as concentrações plasmática e
tissular do fármaco sejam as mesmas, porém é essencial que as alterações que
73
ocorrem no plasma reflitam aquelas nos níveis tissulares do fármaco, ou seja que
exista uma relação constante entre estas duas variáveis (ROWLAND; TOZER,
1995).
2.1.3 Modelos multicompartimentais
Estes modelos são necessários para explicar a observação de que após
uma rápida administração IV a curva de nível plasmático vs tempo não declina
linearmente como uma única velocidade de primeira ordem. Em um modelo
multicompartimental o fármaco se distribui a várias velocidades dentro de diferentes
grupos de tecidos. Aqueles que apresentam elevado fluxo sangüíneo podem
equilibrar-se com o compartimento plasmático, assim somado ao sangue compõem
o compartimento central. Enquanto esta distribuição inicial do fármaco é efetuada, o
fármaco é liberado para um ou mais compartimentos periféricos compostos de
grupos de tecidos com menor fluxo sangüíneo e afinidade pelo fármaco. Esta
diferença é que leva à aparência não linear da curva de concentração sangüínea do
fármaco em escala logarítmica vs tempo. Após equilíbrio do fármaco nestes tecidos
periféricos a curva reflete, então, eliminação de primeira ordem do fármaco para fora
do organismo (ROWLAND; TOZER, 1995).
Com o objetivo de aplicar análise cinética em modelos
multicompartimentais, devemos assumir que a velocidade geral do processo de
passagem do fármaco entre os compartimentos é de primeira ordem. Com base
nesta suposição a curva de nível plasmático por tempo para um fármaco que segue
um modelo multicompartimental é melhor descrito pelo somatório de vários
processos com velocidade de primeira ordem (ROWLAND; TOZER, 1995).
2.1.4 Modelo de dois compartimentos
Apesar extremamente útil para muitos objetivos, o modelo de um
compartimento muitas vezes não se aplica ao perfil do movimento de fármacos pelo
organismo. A maioria destes casos pode ser resolvida aplicando-se um modelo um
74
pouco mais complexo, porém mais realístico, o de dois compartimentos (ROWLAND;
TOZER, 1995).
Neste quando o fármaco é introduzido diretamente no compartimento
central (VIV) o nível sangüíneo cai de maneira bifásica. A rápida queda inicial
representa a distribuição do fármaco do compartimento central para o periférico,
embora sua eliminação comece a ocorrer desde que é introduzido no organismo.
Num certo momento, é atingido um "pseudo-equilíbrio" de distribuição entre o central
e compartimento periférico; isto ocorre quando a razão do fármaco entre os
compartimentos se aproxima de um valor constante, mantido durante a segunda
fase, mais lenta do declínio da concentração sangüínea do fármaco, a qual reflete
principalmente sua eliminação. Durante essa segunda fase, a perda do fármaco pelo
organismo é descrita por um processo monoexponencial indicativo da
homogeneidade cinética entre os níveis do fármaco em todos os líquidos e tecidos
do organismo (ROWLAND; TOZER, 1995).
2.1.5 Modelos não compartimentais
Como sabemos os modelos compartimentais são uma simplificação do
organismo e por isto deve ser aplicado com cautela. Além disso esses modelos são
altamente dependentes da espécie e, embora tenham muitos usos clínicos, a
quantidade de informações básicas fornecidas, é limitada; isto é especialmente
verdadeiro para a previsão de níveis tissulares. Os modelos compartimentais não
levam em conta a ligação fármaco-proteína, embora possa ser afetado por ela
(ROWLAND; TOZER, 1995).
Devido à todas as limitações referidas dos modelos compartimentais e
visando a obtenção de dados cada vez mais fidedignos modelos não
compartimentais tem sido desenvolvidos e avaliados.
Estes modelos são anatômica e fisiologicamente realistas e
desenvolvidos com base nos fluxos sangüíneos e volumes reais dos órgãos,
levando-se em conta tanto o fármaco ligado quanto o livre, no sangue ou tecidos.
75
Assim, descrevem mais realisticamente a disposição do fármaco em cada tecido ou
órgão, no entanto, estes modelos são demasiadamente complexos à nível
matemático, perdendo universalidade (ROWLAND; TOZER, 1995).
A principal vantagem destes modelos é a possibilidade de prever o
comportamento farmacocinético de um determinado fármaco no homem, a partir de
dados obtidos em animais e adaptados matematicamente para tal aplicação.
3 APLICAÇÕES DOS ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS
O comportamento farmacocinético de um novo fármaco é, normalmente,
determinado em animais antes de ser utilizados em humanos. Os testes em animais
de laboratório seguem até o ponto em que se faz necessário obter resultados em
experimentos clínicos envolvendo seres humanos, pois existem variações nos
parâmetros farmacocinéticos quando comparamos resultados obtidos em animais e
em humanos (ROBERTS et al., 1988).
Um número cada vez maior de novos fármacos com potencial terapêutico,
bem como a comercialização de produtos similares por diferentes empresas, têm
estimulado o desenvolvimento de novos métodos para o controle de qualidade. Os
ensaios clínicos tornaram-se importantes ferramentas para avaliar isolada ou de
forma comparativa as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas
(ATKINSON et al., 2001).
O desenvolvimento e a regulamentação destes ensaios clínicos tornaram-
se reconhecidamente mais importante a partir da década de 50, quando passaram a
ser conduzidos de acordo com os interesses científicos e éticos (ATKINSON et al.,
2001). Entretanto, foi em 1753 que Lind planejou e desenvolveu um dos primeiros
ensaios clínicos de que se tem notícia. Em seu trabalho, utilizou 12 pacientes
portadores de escorbuto, dividindo-os em grupos e tratamentos diferentes. Louis
também executou importante estudo, demonstrando que a terapia de sangria,
quando efetuada para tratamento de pneumonia (78 casos), erisipela (33 casos) e
inflamação de garganta (23 casos), não causa qualquer benefício quando
76
comparado com o grupo controle. Este resultado foi fundamental para o fim da tal
prática (LOUIS, 1834). Sutton realizou o primeiro trabalho descrito, com o uso de
placebo como controle e demonstrou a tendência natural de cura em alguns casos
de febre reumática (SUTTON, 1865). Holmes indicou a necessidade de progressos
nas pesquisas clínicas dos Estados Unidos, para diminuir a incidência de
automedicação, num público que “insiste em ser envenenado” (HOLMES, 1891). Em
1915, Greenwood e Yule demonstraram a importância da distribuição dos pacientes
em grupo para a avaliação de resultados (GREENWOOD; YULE, 1915). Fergusson
et al., em 1927, foram provavelmente os primeiros a introduzir o conceito de “cegos”
aos estudos clínicos, fazendo testes em vacinas.
Na década de 30, as principais áreas geradoras de ensaios clínicos eram
as sulfonamidas e as drogas antimaláricas. Colebrook e Perdie mostraram uma
redução na mortalidade de 22 para 8%, com uso de sulfonamidas na febre pós-
parto, comparando com o grupo controle, com o histórico de pacientes tratados no
mesmo hospital (COLEBROOK; PURDIE, 1937).
A descoberta da penicilina pode ser considerada o mais importante
avanço terapêutico do século vinte, levando à elaboração de um ensaio clínico com
grande número de pacientes e médicos colaboradores que teve lugar no norte da
África. Após os primeiros resultados, os médicos passaram a utilizá-la em pacientes
mais graves do que aqueles propostos, quase chegando a prejudicar o resultado
final do estudo (BLUMBERG; STROMINGER, 1974).
É geralmente aceito que o primeiro ensaio clínico, com um grupo de
controle aleatório (randomizado), foi realizado para estreptomicina, em tratamento
de tuberculose pulmonar. Este ensaio foi notável pelo grau de cuidado com o
planejamento, execução e relato, traços desejados nos ensaios clínicos atuais.
Vários centros foram utilizados, além da distribuição aleatória para o tratamento. Os
grupos foram divididos em tratados com o fármaco e repouso e apenas repouso.
Colocadas em envelopes lacrados, as radiografias foram avaliadas por três médicos,
de forma independente e sem conhecimento prévio de outros laudos e do tratamento
aplicado ao paciente. Os resultados validaram amplamente o uso de estreptomicina.
77
Outro estudo, por sua vez, demonstrou que o uso de anti-histamínicos no tratamento
da gripe não apresenta vantagens ao ser comparado com o placebo. Neste estudo
foi introduzido o duplo cego, onde nem o médico nem paciente tinham conhecimento
prévio da formulação administrada (BULL, 1959).
Sir Austin Bradford Hill foi o principal pesquisador envolvido com ensaios
clínicos no “Medical Research Council” tendo organizado vários estudos clínicos e
publicado diversos artigos sobre condução destes protocolos, demonstrando a
importância da escolha dos pacientes, randomização, avaliação objetiva e análise
estatística (ATKINSON et al., 2001).
Os motivos que retardaram o progresso dos ensaios clínicos foram
“reverência à autoridade, relacionamento entre médico e paciente, poucos registros,
falta de facilidades para investigação e falta de remédios ativo”. A razão mais
importante para o desenvolvimento de novos estudos a crescente preocupação com
o tratamento de doenças não transmissíveis (BULL, 1959).
A indústria farmacêutica sofreu uma enorme expansão nos últimos 40
anos e, com isso, novas drogas foram descobertas e sintetizadas. Antes da II Guerra
Mundial não havia qualquer controle para que um fármaco fosse livremente
comercializado. Contudo nos Estados Unidos já existia, desde 1938, legislação para
uso de fármacos em animais. Foi apenas na década de 60, com a catástrofe da
talidomida, que tanto os Estados Unidos como a Inglaterra, intensificaram as
regulamentações para a execução de ensaios em humanos. A partir de 1963 é
obrigatória uma aprovação oficial para que o fármaco inicie um ensaio clínico e,
posteriormente, nova aprovação para ser comercializada no Reino Unido. Nos
Estados Unidos, o FDA (Food and Drug Administration) desenvolveu e aplicou
diretrizes (a partir da década de 70) para a elaboração de um modelo seguro de
pesquisa clínica, seguido por muitos outros países, diferindo do modelo britânico,
principalmente por valorizar sobremaneira a documentação dos dados obtidos
(ATKINSON et al., 2001).
78
É, sem dúvida, verdadeira a afirmação de que hoje se faz mais ensaios
clínicos do que em outras épocas, sendo em sua grande maioria financiados pela
própria indústria farmacêutica. Na última década tem-se investido em três linhas de
fármacos: as de ação antiinfecciosa, as que atuam no sistema nervoso central e as
ativas sobre sistema cardiovascular. Apenas um em dez mil fármacos sintetizados
atinge a fase de ensaio clínico, isso explica porque é gasto mais com ensaios pré-
clínicos do que com clínicos. Além disso, apenas cerda de 20% destas é geralmente
comercializada. Todo este processo gasta cerca de 7 a 10 anos para colocar um
novo fármaco no mercado, com um custo estimado de 54 milhões de dólares
(ATKINSON et al., 2001).
No Brasil houve um grande salto (tanto qualitativo como quantitativo) nos
trabalhos científicos relacionados à farmacologia clinica, com o surgimento da
política de medicamentos genéricos (ANVISA, 2001).
4 ESTUDOS DE BIOEQUIVALÊNCIA
A biodisponibilidade refere-se à quantidade de determinada droga
encontrada no sangue, após sua absorção no local onde foi administrada. Os
valores de concentração no sangue de um fármaco administrado por via oral,
quando comparados com os valores do mesmo fármaco administrado por via
intravenosa, dão-nos o parâmetro conhecido como biodisponibilidade absoluta.
Quando à comparação é feita com outro fármaco, chamado de referência,
administrado pela mesma via, chamamos de biodisponibilidade relativa. Diversos
fatores relacionados com o fármaco em teste – meia-vida, indução enzimática,
sinergismo – ou com o paciente – idade, sexo, jejum, uso de outros medicamentos –
podem causar importantes alterações na biodisponibilidade (ATKINSON et al., 2001;
FINK, 1998; FDA, 1985; FDAa, 1988; FDAb, 1988; FDA, 1993; GOODMAN;
GILMAN, 2007; PAGE et al., 2002).
Dois medicamentos são considerados equivalentes farmacêuticos quando
possuem os mesmos integrantes ativos e são idênticos quanto à formulação e a via
de administração. Para que possam ser considerados bioequivalentes devem
79
apresentar taxa e extensão de absorção do princípio ativo, bem como a excreção,
dentro dos limites aceitos por estatística adequada. Para tanto, os seguintes
parâmetros farmacocinéticos devem ser levados em consideração (ANVISA, 2001;
ATKINSON et al., 2001; FINK, 1998; FDA, 1985; FDAa, 1988; FDAb, 1988; FDA,
1993; GOODMAN; GILMAN, 2007; PAGE et al., 2002):
Cmax – Pico de concentração do fármaco no sangue, referindo-se ao
valor máximo atingido pelo fármaco após sua administração.
Tmax – Tempo no qual ocorre o pico de concentração do fármaco no
sangue após sua administração.
AUC – Área sob a curva de concentração numa unidade de tempo.
Enquanto Cmax e Tmax são obtidos apenas montando-se o gráfico das dosagens
do fármaco, a AUC pode ser determinada utilizando-se a regra da soma dos
trapézios.
Segundo a resolução da ANVISA, RDC Nº 10, de 02 de janeiro de 2001,
que estabelece os critérios para provas de bioequivalência de medicamentos
genéricos, estas deverão contemplar três etapas: clínica, analítica e estatística
(ANVISA, 2001).
4.1 Etapa Clínica
Os medicamentos a serem submetidos ao estudo de biodisponibilidade
deverão, inicialmente, ser analisados segundo sua monografia inscrita na
Farmacopéia Brasileira e, na falta desta, em outros códigos autorizados pela
legislação vigente. O estudo de biodisponibilidade é realizado, geralmente, por meio
da qualificação do fármaco ou do metabólito ativo na circulação (freqüentemente em
plasma ou soro), ou através de sua quantificação na urina, quando justificado
(ANVISA, 2001; ATKINSON et al., 2001; FINK, 1998; FDA, 1985; FDAa, 1988;
FDAb, 1988; FDA, 1993).
80
O estudo de biodisponibilidade é do tipo aberto, aleatório, cruzado. Os
voluntários recebem os medicamentos teste e referência (medicamento administrado
por via intravenosa ou, quando não for indicada, uma solução oral do fármaco) em
ocasiões separadas (períodos), em esquema de dose simples ou múltipla. O
intervalo entre os períodos deve ser de, no mínimo, sete meias-vidas de eliminação
do fármaco, ou do metabólito, quando o mesmo for ativo (ANVISA, 2001;
ATKINSON et al., 2001; FINK, 1998; FDA, 1985; FDAa, 1988; FDAb, 1988; FDA,
1993).
O cronograma de coleta das amostras deve contemplar um tempo igual
ou superior 3-5 vezes a meia-vida de eliminação do fármaco, ou do metabólito,
quando o mesmo for ativo e o número mínimo de voluntários sadios deverá ser de
24, com idade entre 18 e 50 anos e capazes de fornecer seu consentimento livre e
esclarecido. Os estudos podem ser conduzidos com voluntários do sexo masculino,
feminino ou ambos, sendo que neste caso, o número de homens e mulheres deve
ser o mesmo. A ANVISA pode exigir um número maior de voluntários para fármacos
que apresentem grande variabilidade (ANVISA, 2001).
O peso dos voluntários deve estar em um limite de +/- 15% do peso
considerado normal, levando-se em consideração a altura e estrutura física. Devem-
se evitar indivíduos fumantes e com histórico de abuso de álcool ou drogas. Caso
sejam incluídos fumantes, os mesmos devem estar identificados (ANVISA, 2001;
ATKINSON et al., 2001; FINK, 1998; FDA, 1985; FDAa, 1988; FDAb, 1988; FDA,
1993).
O projeto de pesquisa, o protocolo experimental e o termo de
consentimento livre e esclarecido devem ser submetidos a um Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP), credenciado no Comitê Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP)
do Conselho Nacional de Saúde/MS (ANVISA, 2001).
Os voluntários participantes dos estudos clínicos, que necessitem de
confinamento, devem permanecer em local apropriado que atenda às Boas Práticas
81
Clínicas (BPC), sob a responsabilidade de um médico (ANVISA, 2001; ATKINSON
et al., 2001; FINK, 1998; FDA, 1985; FDAa, 1988; FDAb, 1988; FDA, 1993).
4.2 Etapa Analítica
Todas as etapas do estudo devem ser realizadas de acordo com as
normas internacionais de Boas Práticas de Laboratório (BPL) e os métodos
analíticos devem ser validados. O protocolo analítico deve conter os critérios para
reanálise das amostras. Não mais do que 20% das amostras podem ser
reanalisadas e a perda de amostras em qualquer etapa do processo analítico deve
ser justificada (CAUSON, 1997).
A análise das amostras pode ser efetuada nas seguintes condições: sem
réplica, em duplicata ou triplicata. Para análise de amostras em duplicata, deve-se
utilizar o valor médio, e para triplicata, a média dos dois valores mais próximos
(ANVISA, 2001).
A determinação da adequabilidade e confiabilidade de um método
analítico para a realização de um estudo de bioequivalência é realizada através da
averiguação de sua sensibilidade, especificidade, linearidade, exatidão, precisão e
reprodutibilidade, levando-se ainda em conta a estabilidade dos compostos que
estejam sendo empregados (ANVISA, 2001; ATKINSON et al., 2001; FINK, 1998;
FDA, 1985; FDAa, 1988; FDAb, 1988; FDA, 1993).
O quadro 3 apresenta os parâmetros utilizados para a validação do
método desenvolvido (CHASIN et al., 1994).
82
Quadro 3 – Parâmetros utilizados na validação do método.
Parâmetro Definição Unidade
Recuperação Eficiência do processo de extração %
Linearidade Faixa de concentração plasmática com relação
linear entre concentração e resposta
ng/mL ou
ug/mL
Repetibilidade Precisão intra-ensaio: variação dos resultados em
análises realizadas no mesmo dia.
Precisão interensaio: variação dos resultados em
análises realizadas em dias consecutivos.
CV%
Exatidão Avalia a variação entre o valor real e o valor
obtido experimentalmente
%
LQ Limite de quantificação: menor concentração do
fármaco quantificado com erro inferior a 20%
ng/mL ou
ug/mL
Seletividade Interferentes endógenos min
* C.V. = coeficiente de variação.
4.3 Etapa Estatística e Farmacocinética
Os parâmetros farmacocinéticos são obtidos das curvas de concentração
sanguínea do fármaco versus tempo e analisados, estatisticamente, para
determinação da biodisponibilidade. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos
devem ser determinados (ANVISA, 2001; ATKINSON et al., 2001; FINK, 1998; FDA,
1985; FDAa, 1988; FDAb, 1988; FDA, 1993):
- Área sob a curva de concentração sanguínea versus tempo, calculada
pelo método dos trapezóides, do tempo zero ao tempo t (AUC
0-t
), onde t é o tempo
relativo à última concentração determinada experimentalmente.
- Área sob a curva de concentração sanguínea versus tempo, calculada
do tempo zero ao tempo infinito (AUC
0-inf
), onde AUC
0-inf
= AUC
0-t
+ Ct/Ke, onde Ct é
a última concentração do fármaco determinada experimentalmente e Ke é a
constante de eliminação da fase terminal. A AUC
0-t
deve ser igual ou superior a 80%
da AUC
0-inf
.
- O pico de concentração máxima (C
max
) do fármaco e/ou metabólito e o
tempo de atingir este pico (T
max
) devem ser obtidos diretamente sem interpolação
dos dados.
83
- A depuração (D), o volume aparente de distribuição (Vd) e a meia-vida
de eliminação (t
1/2
) do fármaco e/ou metabólito também devem ser determinados,
embora não haja necessidade de tratamento estatístico.
- A biodisponibilidade absoluta (F) do medicamento deve ser determinada
e correspondente à fração da dose administrada do fármaco efetivamente absorvida.
5 MEDICAMENTOS GENÉRICOS
Os genéricos são medicamentos que possuem o mesmo princípio ativo,
na mesma dose e na mesma forma farmacêutica, sendo administrados pela mesma
via e com a mesma indicação terapêutica do medicamento de referência, com o qual
devem ser intercambiáveis. A adoção de uma política de medicamentos genéricos,
envolvendo a produção, a garantia de qualidade, a prescrição, a dispensação e o
uso dos mesmos, é parte fundamental de uma diretriz para a promoção e o uso
racional de medicamentos em nosso País. A política de medicamentos genéricos
objetiva maior racionalidade no uso de medicamentos, bem como estimula a
concorrência, na qual os consumidores terão disponíveis produtos intercambiáveis
de diferentes preços. É previsível que a referida competição ocasione a redução dos
preços dos medicamentos, trazendo, então, benefícios a todos os segmentos
envolvidos na cadeia de produção, controle, comercialização e, principalmente, o
consumo. A adoção de política de medicamentos genéricos no Brasil objetivou
principalmente aumentar o acesso da população aos medicamentos, melhorar a
qualidade dos mesmos e diminuir o custo dos tratamentos médicos.
No Brasil, a questão dos genéricos começa a tomar fôlego, a partir da Lei
9787, sancionada pelo presidente da República Fernando Henrique Cardoso, em 10
de fevereiro de 1999, que estabelece o que é medicamento genérico e dispõe sobre
a utilização de nomes genéricos em produtos farmacêuticos, sob fiscalização da
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária). Essa legislação foi revista e
atualizada com o objetivo de melhor esclarecer as exigências, em relação aos
medicamentos genéricos através da RDC 210 de janeiro de 2001. Posteriormente,
foi editada a RDC 84, de março de 2002, com o intuito de detalhar as
regulamentações já previstas na RDC 10. Esta nova resolução transforma os anexos
84
da RDC 10 em Guias publicados na forma de resoluções (RE), como por exemplo, a
RE 478-Guia para provas de bioequivalência de medicamentos genéricos (RIBEIRO,
2000).
O surgimento dos produtos denominados genéricos aparece como uma
alternativa aos produtos tradicionais e podem revolucionar as questões inerentes à
falta de recursos dos governos para subsidiar a população de baixa renda (ABIFAM,
2001).
CAPÍTULO 4: Medicamentos Avaliados
1 AMOXICILINA
A penicilina é o protótipo dos antibióticos betalactâmicos. É o agente
antimicrobiano de escolha para o tratamento e profilaxia de varias enfermidades
infecciosas. A sensibilidade de um microorganismo aos antibióticos betalactâmicos
depende de sua capacidade de penetrar na parede bacteriana e ligar-se em sua
forma ativa ao local visado. O mecanismo de ação destes antibióticos ainda não é
totalmente conhecido, mas acredita-se que eles são capazes de interferir na síntese
da parede bacteriana dos organismos em atividade (TOMASZ, 1979a; TOMASZ,
1979b).
Após penetrar na bactéria, o antibiótico betalactâmico inativa
transpeptidases, carboxipeptidases e endopeptidases, interferindo na síntese da
parede celular (BLUMBERG; STROMINGER, 1974; WAXMAN; STROMINGER,
1983). A amoxicilina (alfa-amino-p-hidrobenzilpenicilina) é uma penicilina semi-
sintética estruturalmente relacionada com a ampicilina que apresenta atividade oral,
sendo que seu espectro de atividade é semelhante ao da ampicilina. Seu núcleo
consiste de um anel tiazolidínico, ligado a um anel B-lactâmico com uma cadeia
lateral. Esta cadeia lateral determina a maior parte da atividade farmacológica e
antimicrobiana da penicilina em questão. No caso da amoxicilina, a presença do anel
benzil na cadeia lateral estende sua atividade antimicrobiana a bactérias gram-
negativas. Pode ser utilizada por via oral e parenteral (sal sódico-C16H18N3NaO5S)
85
(GORDON et al., 1972; GORDON; WINSHELL, 1970; NEU; WINSHELL, 1970;
SUTHERLAND; ROLINSON, 1970). A amoxicilina apresenta elevada absorção após
administração oral, sendo que esta não é alterada pela ingestão concomitante a
alimentos. Mostra baixa ligação com proteínas plasmáticas (17%) e é rapidamente
distribuída pelo corpo, exibindo uma meia-vida de eliminação de 1h. A eliminação da
droga se dá preferencialmente pelos rins, com cerca de 60% da dose administrada
por via oral e 75% da parenteral sendo excretada inalterada (BARR et al., 1994;
GORDON et al., 1972; GORDON; WINSHELL, 1970; HANDSFIELD et al., 1973;
KOSMIDIS et al., 1972; NEU; WINSHELL, 1970; NEU, 1974; PAINTAUD et al.,
1992; SIMON; STILE, 1985).
As concentrações plasmáticas máximas da amoxicilina são duas a duas
vezes e meia maiores que as da ampicilina após administração oral da mesma dose.
Essas concentrações são obtidas em duas horas e atingem, em média cerca de 4
μg/mL quando se administram 250 mg. Apesar da meia-vida semelhante da
amoxicilina e da ampicilina, as concentrações plasmáticas eficazes da amoxicilina
administrada por via oral são detectáveis por um período duas vezes maior do que
quando se administrada a ampicilina, por causa da sua absorção mais completa
(GOODMAN; GILMAN, 2007).
Os métodos mais utilizados para a quantificação da amoxicilina em fluídos
biológicos empregam a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), sendo que
na maior parte destes métodos é aplicada a detecção no UV em baixos
comprimentos de onda, λ = 225 – 330 nm (MUTH et al., 1996; HOIZEY et al., 2002;
SOURGENS et al., 2001; YUAN et al., 1995; KRAUWINKEL et al., 1993; CHARLES;
CHULAVATNATOL, 1993). O LQ mais baixo obtido por essas metodologias foi 50
ng/mL. Contudo, os tempos de eluição da amoxicilina e do padrão interno,
cefadroxil, foram 31,8 e 32,8 min, respectivamente, o que dificulta sua aplicação na
análise de rotina (MUTH et al., 1996). A formação de um derivado para a detecção
por fluorimetria (MARSCHER; KIKUTA, 1990; WIBAWA et al., 2002; MIYAZAKI et
al., 1983), reagentes de formação de par iônico e técnicas especiais de detecção
como derivação pós-coluna ou acoplamento de colunas (MUTH et al., 1996;
MARSCHER & KIKUTA, 1990) também tem sido empregadas para aumentar a
86
sensibilidade e a seletividade, porém são procedimentos caros, trabalhosos e que
consomem muito tempo.
Diferentes métodos de extração da amostra têm sido aplicados antes da
análise cromatográfica, sendo que a maioria é baseada na precipitação de proteínas
(HOIZEY et al., 2002; CHARLES; CHULAVATNATOL, 1993; MARSCHER; KIKUTA,
1990), extração líquido-líquido (WIBAWA et al., 2002) ou procedimentos mais
complicados como a extração em fase sólida (YUAN et al., 1995; KRAUWINKEL et
al., 1993; MAURER, 1998; HENION et al., 1998). Dentre estas abordagens a
extração por precipitação será selecionada por ser mais simples, rápida e barata.
A amoxicilina é atualmente o antibiótico mais utilizado a nível mundial.
Para a determinação dos parâmetros farmacocinéticos da amoxicilina em humanos
é necessário utilizar um método quantitativo confiável.
2 NORFLOXACINO
O Norfloxacino é um fármaco antimicrobiano da classe das
fluoquinolonas, de estrutura química: C16H16FN3O3 - ácido-1-etil-6-fluor-1,4-
dihidro-4-oxo-7-(1piperazinil)-3-quinolinico-carboxílico. O norfloxacino é preparado
por síntese química. O composto é um pó branco ou amarelo fraco, cristalino e
desprovido de odor e com um sabor amargo.
O norfloxacino aparentemente, assim como outras quinolonas, inibe a
síntese e/ou conformação do DNA através da inibição da DNA girase
(topoisomerase II), uma enzima responsável pelo enovelamento negativo,
dependente de ATP do DNA bacteriano (COZZARELLI, 1990, WOLFSON;
HOOPER, 1985, BENBROOK; MILER, 1986, HOOPER; WOLFSON, 1989). Alguns
investigadores acreditam que o fármaco age produzindo um anexo covalente da
DNA girase diretamente no DNA, produzindo um complexo que é inacessível a DNA
polimerase (ENGLE et al., 1983). O efeito bactericida do norfloxacino é
antagonizado pela rifampicina e o cloranfenicol e parece envolver a interrupção da
87
síntese protéica. O mecanismo responsável pela ação letal sobre a bactéria não está
completamente esclarecido (CRUMPLIN et al., 1984).
As quinolonas podem ser conjugadas com o ácido glucorônico na posição
3, mas esta é o metabólito menor do norfloxacino. Os metabólitos principais são
derivados da substituição do anel piperazínico. Estes ocorrem pela transformação do
amino-nitrogênio e com a formação de derivados formil ou acetil, ou pela oxidação
do átomo de carbono no anel piperazínico em um grupo ceto designado como oxo-
derivativo. Os metabólitos do anel aberto são formados pela hidroxilação ou
carboxilação do anel piperazínico, levando à formação de compostos acetilaminoetil,
desentil e amino do metabolismo progressivo da estrutura do anel.
A oxo-piperazina é o metabólito mais encontrado na urina, perfazendo 5%
do total da dose. Os derivados acetil e formil piperazínicos do norfloxacino perfazem
apenas 0,5% do total excretado na urina. Entre os metabólitos do anel aberto, o
disentil perfaz mais do que os metabólitos acetilamino e amino combinados. Metade
da dose do norfloxacino é recuperada na urina, com compostos e metabólitos
similares, e a outra metade é excretada de forma extra-renal. Os metabólitos
excretados de forma extra-renal são quantificados de forma inadequada, mas
sugere-se que a proporção do fármaco metabolizado é maior do que a observada na
urina.
Quadro 4 – Parâmetros Farmacocinéticos do Norfloxacino.
Absorção oral
50 - 80%
Metabolismo pré-sistêmico
não observado
Meia-vida plasmática (faixa)
3 horas
Volume de distribuição
2,5-3,1 kg-1
Ligação protéica plasmática
15%
Após uma dose oral de 200 ou 400 mg o pico das concentrações séricas
alcançadas em 60 a 90 minutos são de 0,8 0,3 e 1,5 0,6 mg.L
-1
,
respectivamente. A absorção é levemente alterada quando o norfloxacino é
administrado juntamente com a comida, com uma redução de 30% no pico de
88
concentração. A administração de 400 mg a cada 12 horas provoca uma pequena
acumulação, sem alteração nas concentrações séricas.
Há pouca informação sobre a penetração do norfloxacino em diferentes
tecidos. Após a administração oral de norfloxacino, a concentração nos tecidos
vaginais, cervical, nas trompas, nos ovários, no córtex renal e na vesícula biliar foi
discretamente menor que a concentração sérica. A bílis, o fígado e a medula da
adrenal obtiveram concentrações de droga mais altas que as séricas. A
concentração do escarro foi relativamente baixa. O norfloxacino não foi encontrado
no leite humano após dose oral de 200 mg. Após a ingestão de 400 mg de
norfloxacino, o pico na urina foi de 300 mg.L
-1
, o que é centenas de vezes mais alta
do que a CIM da maioria das bactérias patogênicas que causam infecções entéricas.
O norfloxacino é excretado na urina através de excreção. A excreção
renal do norfloxacino ocorre através da filtração glomerular e da secreção tubular. O
clearance renal de 275 71mL/min. O probenecid reduz a excreção renal em 50%
(NORRBY, 1983; WISE, 1984; BERGERON et al., 1984; COFSKY et al., 1984;
SWANSON et al., 1983).
A meia-vida de eliminação é de 3 horas (2,5 - 4,5h). Dentro de 24 horas
da administração de 26 a 32% é eliminado na urina sob a forma de norfloxacino e de
5 a 8% como metabólitos adicionais. Captação fecal perfaz 30% da dose
administrada e 2 a 3% é eliminada pela bílis.
O método preferido para análise é o da cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC). A HPLC com detecção de fluorescência é recomendada, uma vez
que é rápida, sensível e específica. Os metabólitos também podem ser detectados
pelo HPLC. As limitações na sensibilidade de detectar compostos similares e
metabólitos variam de acordo com o método e o equipamento.
89
3 OXCARBAZEPINA
A oxcarbazepina é um análogo da carbamazepina. É um derivado
iminodibenzílicos com um grupo carbamila na posição 5, sendo estruturalmente
diferente nas posições 10 e 11. É rapidamente convertida em 10-hidroxi-10,11-
dihidrocarbazepina (monohidroxi derivado - MHD), o qual é responsável por grande
parte de sua atividade farmacológica. A oxcarbazepina possui atividade
anticonvulsivante, apresentando estrutura química semelhante aos antidepressivos
tricíclicos (ANDERSON; LEVY, 1995; BIALER, 2002; MCLEAN et al., 1994).
A oxcarbazepina e seu metabólito farmacologicamente ativo MHD
apresentam efeito antiepiléptico potente quando comparada em modelos animais
com a carbamazepina e fenitoína. Acredita-se que o mecanismo de ação da
oxcarbazepina e MHD seja baseado principalmente no bloqueio de canais do sódio
voltagem-dependentes, resultando então na estabilização de membranas neurais
hiperexcitadas, inibição da descarga neuronal repetitiva e diminuição da propagação
de impulsos sinápticos. Adicionalmente, o aumento na condutância de potássio e
modulação de canais de cálcio voltagem-dependentes ativados pode também
contribuir para os efeitos anticonvulsivantes das drogas (GLAUSER, 2001; GRANT;
FAULDS, 1992; HOUTKOOPER et al., 1987; LLOYD et al., 1994; MCLEAN et al.,
1994).
Quadro 5 – Parâmetros Farmacocinéticos do Oxcarbazepina e MHD.
Parâmetros Oxcarbazepina MHD
Absorção oral
~100% ---
Metabolismo hepático
Extenso
Meia-vida plasmática (faixa)
1,3 – 2,3 h 9,3 ± 1,8h
Tmax
1-2 horas 4-6 horas
Volume de distribuição
Conflituoso 0,3-0,8 L/kg
Clearance
13,6 – 20,8 mL/min
Ligação protéica plasmática
50-70% 35-50%
90
A oxcarbazepina é completamente absorvida. A alimentação não tem
nenhum efeito sobre a absorção desta droga, podendo ser administrado com ou sem
alimentação. Os picos de concentração plasmática da droga e de seu metabólito são
obtidos num período de 1-2 horas e 4-6 horas, respectivamente. Após a
administração oral da oxcarbazepina marcada radioativamente, apenas 2% da
radioatividade total no plasma é devida à molécula inalterada da oxcarbazepina e
aproximadamente 70% é devida ao metabólito MHD (MAY et al., 2003; LLOYD et al.,
1994).
Dados sobre o volume de distribuição da oxcarbazepina são conflituosos.
Hopper (1987) relatou um volume aparente médio desta droga de 3,9 L/Kg,
enquanto Dickinson e colaboradores calcularam uma média aparente do volume de
distribuição de 7,8 a 12,5 L/Kg.
A oxcarbazepina é rapidamente transformada no seu metabólito ativo
(MHD) por enzimas citosólicas no fígado. O MHD é metabolizado pelo ácido
glicurônico. Quantidades menores (4% da dose) são convertidas ao metabólito
farmacologicamente inativo da droga (KRISTENSEN et al., 1983; SCHIITZ et al.,
1986).
A oxcarbazepina é eliminada do organismo principalmente sob formas de
metabólitos, os quais são principalmente excretados pelos rins. Mais de 95% da
dose aparece na urina, com menos de 1% como oxcarbazepina inalterada. A
quantidade eliminada nas fezes representa menos de 4% da dose administrada
(ROUAN et al., 1994).
A oxcarbazepina é rapidamente eliminada do plasma com valor aparente
de meia-vida plasmática entre 1,3 e 2,3 horas. A meia-vida plasmática aparente do
MHD é 9,3 ± 1,8h. Quando a oxcarbazepina é administrada duas vezes ao dia, as
concentrações plasmáticas de estado de equilíbrio são alcançadas dentro de 2-3
dias. Em virtude de sua meia-vida curta, a oxcarbazepina é rapidamente eliminada
do plasma e apenas baixas concentrações de oxcarbazepina resultam em dosagens
terapêuticas. Valores publicados do clearance renal de MHD permaneceram no
91
intervalo entre 13,6 a 20,8 mL/min (NEDELMAN et al., 1999; PATSALOS et
al.,1990; PATSALOS et al., 2003).
De acordo com a literatura, os primeiros procedimentos utilizavam a
cromatografia gasosa para determinação da oxcarbazepina e MHD no soro ou no
plasma. Atualmente, pesquisadores têm se baseado em sistemas de cromatografia
líquida de alta eficiência. Além disso, a cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massa também vem sendo desenvolvida (VON UNRUH; PAAR,
1985; VON UNRUH; PAAR, 1986; MENGE; DUBOIS, 1983, MENGE et al., 1987;
MATAR et al., 1995; LEVERT et al., 2002; JUERGENS, 1987).
CAPÍTULO 5: Justificativa
A confiabilidade dos medicamentos pode ser assegurada por meio de
rígidos critérios de qualidade exigidos para a análise na concessão do seu registro,
previstos na legislação. A garantia desses padrões de qualidade constitui uma
ferramenta para a segurança, eficácia e qualidade dos medicamentos.
A fim de alcançar a qualidade dos medicamentos, além dos processos de
manufatura, observando as boas práticas de fabricação, é fundamental a realização
de estudos de farmacocinética comparada de fármacos, para verificar existência de
bioequivalência entre o medicamento teste e o medicamento referência adotado
como padrão pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa. Também se
torna necessário o desenvolvimento de metodologias de baixo custo e fácil
aplicação, com sensibilidade e seletividade adequadas para realização deste tipo de
estudo. Nesse contexto, cresce a necessidade e a importância do desenvolvimento
e validação de metodologias para quantificação dos fármacos amoxicilina,
norfloxacino, oxcarbazepina e 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, em plasma,
destacando a geração de dados reprodutíveis e confiáveis após execução de
estudos farmacocinéticos, uma vez que são medicamentos utilizados no Sistema
Único de Saúde (SUS).
92
PARTE II: OBJETIVOS E
METODOLOGIA
93
PARTE II: OBJETIVOS E METODOLOGIA
CAPÍTULO 1: Objetivos
1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver e validar uma metodologia para quantificação de amoxicilina,
norfloxacino, oxcarbazepina e seu metabólito, em plasma humano, por
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao detector ultravioleta,
fluorescência ou espectrometria de massa, respectivamente.
2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar o perfil farmacocinético e a bioequivalência de formas
farmacêuticas orais contendo amoxicilina, norfloxacino, oxcarbazepina e seu
metabólito em voluntários sadios.
Aplicar metodologia analítica para quantificação das formulações de
amoxicilina, cápsulas de 500mg, do laboratório Glenmark Pharmaceuticals Ltda
(teste) e laboratório GlaxoSmithKline Beecham (formulação referência) em estudo
de bioequivalência.
Aplicar metodologia analítica para quantificação das formulações de
norfloxacino, comprimido de 400mg, do laboratório Pharmascience Laboratórios Ltda
(formulação teste) e laboratório Merck Sharp & Dohme Farmacêutica Ltda
(formulação referência) em estudo de bioequivalência.
Aplicar metodologia analítica para quantificação das formulações de
oxcarbazepina e seu metabólito, comprimido de 400mg, do laboratório Novartis
Biociências S.A. na determinação do perfil farmacocinético.
94
CAPÍTULO 2: Metodologia
1 PROTOCOLO CLÍNICO
1.1 Local de Confinamento dos Voluntários
Os voluntários foram confinados na Unidade de Farmacologia Clínica do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará. Esta unidade de ensaios clínicos dispõe de uma
estrutura assistencial própria, que consiste de uma unidade para ensaios clínicos
com até 24 leitos e posto de enfermagem.
A Unidade de Farmacologia Clínica (UNIFAC) dispõe de carrinho de
emergência com desfibrilador e monitor cardíaco, oxímetro, respirador, material para
pequena cirurgia e com medicação de urgência para qualquer eventualidade. Além
disso, conta com apoio de uma Unidade de Terapia Intensiva (UTI) do Hospital de
Messejana. Sua estrutura laboratorial possui equipamentos para processamento e
armazenamento de amostras biológicas.
1.2 Delineamento do estudo
A pesquisa consistiu de três estudos abertos, randomizados, com
replicação para 48 voluntários sadios, incluídos para o estudo da Amoxicilina e
Norfloxacino, e uma administração simples de Oxcarbazepina para oito voluntários
sadios, sendo todos adultos, de ambos os sexos e com idade de 18 a 40 anos.
Depois da seleção e observado um período de pelo menos 4 semanas
sem fazer uso de qualquer medicação, os voluntários qualificados para participar do
estudo foram internados por dois períodos variando de 24 a 36 horas, com intervalo
de 7 dias entre os internamentos (wash-out), afim de se evitar efeitos residuais
(carry-over). Os voluntários apresentaram-se para internamento na UNIFAC, entre
20:00 e 22:00 horas da noite anterior à administração da medicação. Em cada
95
internamento, os voluntários receberam as formulações contendo Amoxicilina,
Amoxil
®
, Norfloxacino, Floxacin
®
e Oxcarbazepina.
1.3 Seleção dos voluntários
A avaliação clínica inicial (pré-estudo) consistiu em uma história clínica a
fim de pesquisar sintomas relativos a alergias, manifestações relativas aos olhos,
nariz, ouvidos, orofaringe, sistema respiratório, cardiovascular, gastrintestinal,
geniturinário, sistema nervoso central, linfo-hematopoético, endócrino e metabólico,
musculoesquelético e dermatológico. Aspectos relativos à estabilidade emocional,
antecedente de hipersensibilidade à drogas, antecedentes cirúrgicos, antecedentes
patológicos familiares e outros, considerados importantes no momento, também
foram investigados.
No exame físico foram registrados: a altura (em centímetros), o peso
corporal (em kilogramas), com posterior cálculo do Índice de Massa Corporal (IMC),
e a temperatura axilar (em graus Celsius). Exame dos segmentos corporal foi
efetuado, avaliando-se o aspecto geral, a pele, cabeça e pescoço, olhos, ouvidos,
nariz, boca, orofaringe, tórax e pulmões, coração, abdômen, coluna vertebral,
genitália, linfonodos, extremidades.
1.3.1 Sinais vitais
No período de realização do pré-estudo, pós-estudo e durante o estudo
clínico a pressão arterial diastólica e sistólica, a freqüência de pulso e a temperatura
axilar foram aferidas e registradas no Formulário de Relato de Caso (CRF).
1.3.2 Exame cardiológico
Eletrocardiograma convencional com 12 derivações foi realizado
juntamente com os outros exames laboratoriais antes e após o final da etapa clínica.
Os parâmetros: SÂP (vetor resultante da despolarização atrial), SÂQRS (vetor
resultante da despolarização ventricular), SÂT (vetor resultante da repolarização
96
ventricular), ritmo e freqüência cardíaca, duração do complexo QRS e dos intervalos
P-R e Q-T, foram registrados.
Foram observadas também a presença de distúrbios da condução
intraventricular e atrioventricular, sinais de sobrecargas de câmaras atriais e
ventriculares. O laudo final era referido como normal, anormal não clinicamente
significante ou anormal com significado clínico.
1.3.3 Exames laboratoriais
Os seguintes exames laboratoriais foram realizados nos períodos pré-
estudo (período de avaliação para seleção de voluntários saudáveis) e pós-estudo
(período após o segundo e último internamento).
a) Análise Hematológica: Hemoglobina, Hematócrito, Contagem total e
diferencial de leucócitos, Contagem de plaquetas e Velocidade de
Hemossedimentação (VHS).
b) Análise bioquímica: Uréia, Creatinina, Bilirrubina Total, Proteína Total,
Albumina, Glicose em jejum, Fosfatase alcalina, Aspartato-amino-transferase (AST),
Alanina-amino-transferase (ALT), Colesterol total, Triglicérides, Ácido úrico e Gama
GT.
c) Sumário de urina
d) Análise sorológica: Hepatite B, Hepatite C, HIV (Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida - AIDS) e teste sorológico para gravidez (Beta-HCG)
para voluntários do sexo feminino.
Exame realizado somente no pré-estudo: Análise Sorológica.
97
1.3.4 Valores de referência dos exames laboratoriais
Os valores utilizados como referência para os exames laboratoriais foram
fornecidos pelo laboratório de patologia clínica responsável por estas análises,
Laboratório Louis Pasteur .
Os parâmetros de normalidade para a análise sorológica para hepatite B,
C e HIV devem consistir de resultados negativos.
1.4 Critérios de inclusão
Os seguintes critérios devem ser satisfeitos para que o voluntário possa
participar do estudo:
a) Homem ou Mulher com idade entre 18 a 50 anos. As mulheres não
poderiam estar grávidas e nem em regime de amamentação.
b) Voluntário com índice de massa corpórea maior do que 19 e menor do
que 28.
c) Boas condições de saúde ou sem doenças significativas, a juízo
médico, de acordo com as regras definidas no protocolo, e avaliações a que foi
submetido: história clínica, medidas de pressão e pulso, exame físico e psicológico,
ECG e exames laboratoriais complementares.
d) Capaz de compreender a natureza e objetivo do estudo, inclusive os
riscos e efeitos adversos e com intenção de cooperar com o pesquisador e agir de
acordo com os requerimentos de todo o ensaio, o que vem a ser confirmado
mediante a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
98
1.5 Critérios de exclusão
A resposta positiva a qualquer um dos seguintes critérios excluirá o
voluntário do estudo:
a) O voluntário tem sabidamente uma hipersensibilidade ao fármaco
estudado ou a compostos quimicamente relacionados; história de reações adversas
sérias ou hipersensibilidade a qualquer fármaco.
b) História ou presença de doenças hepáticas ou gastrointestinais ou
outra condição que interfere com a absorção, distribuição, excreção ou metabolismo
do fármaco.
c) Uso de terapia de manutenção com qualquer droga, excetuando-se
anticoncepcionais por via oral.
d) Tem história de doença hepática, renal, pulmonar, gastrintestinal,
epiléptica, hematológica ou psiquiátrica; tem hipo ou hipertensão de qualquer
etiologia que necessite de tratamento farmacológico; tem história ou teve infarto do
miocárdio, angina e/ou insuficiência cardíaca;
e) Achados eletrocardiográficos não recomendados, a critério do
investigador, para participação no estudo.
f) Os resultados dos exames laboratoriais complementares estão fora dos
valores considerados normais, de acordo com as normas deste protocolo, a menos
que sejam considerados não clinicamente significativos pelo investigador.
g) Voluntário é fumante;
h) O voluntário ingere mais do que 5 xícaras de café ou chá por dia;
99
i) Tem história de abuso de álcool ou drogas;
j) Fez uso de medicação regular dentro das 2 semanas que antecederam
o início deste estudo, ou fez uso de qualquer medicação uma semana antes do
início deste estudo;
l) Foi internado por qualquer motivo até 8 semanas antes do início do
primeiro período de tratamento deste estudo;
m) Tratamento dentro dos 3 meses prévios ao início do tratamento deste
estudo com qualquer droga que se conheça ter um potencial tóxico bem definido nos
grandes órgãos.
n) O voluntário participou de qualquer estudo experimental ou ingeriu
qualquer droga experimental dentro dos três meses que antecedem o início do
tratamento deste estudo;
o) O voluntário doou ou perdeu 450 mL ou mais de sangue dentre dos
três meses que antecederam o estudo ou que doou mais de 1500 mL dentro dos 12
meses anteriores ao início do tratamento deste estudo.
p) Teste positivo de gravidez para as voluntárias mulheres.
q) O voluntário tem qualquer condição que o impede de participar do
estudo pelo julgamento do investigador
1.6 Critérios para retirada do estudo
a) Solicitação, por parte do voluntário, para se retirar do estudo a qualquer
momento
100
b) Voluntário não deseja continuar no estudo por razões pessoais (ou
mesmo sem relatar a razão);
c) Voluntário não deseja continuar no estudo devido os eventos adversos
da droga de estudo (efeitos não desejáveis possivelmente relacionados ao fármaco
em estudo)
d) Voluntário não deseja continuar por razões outras que não efeitos
adversos por exemplo indisponibilidade, intolerância aos procedimentos do estudo.
e) Não aderência às exigências do protocolo.
f) Eventos adversos ou sintomas ou sinais de possível toxicidade
g) Doença intercorrente requerendo medicação.
h) Resposta positiva à reavaliação de qualquer um dos critérios de
exclusão, no momento da admissão ao primeiro período de tratamento ou em
ocasião subseqüente.
i) Qualquer outra condição que, a juízo do investigador, seja do interesse
para manutenção da saúde do voluntário.
1.7 Entrada do voluntário no estudo
Os voluntários foram aceitos no estudo somente quando considerados
saudáveis como determinado pela história médica, exame físico e exames
laboratoriais que antecederam o início do estudo.
Uma vez avaliada a higidez, os voluntários foram submetidos a uma
entrevista para avaliação das condições emocionais para participar da investigação.
Após todas as dúvidas terem sido esclarecidas aos voluntários, e os mesmos tendo
101
concordado com o protocolo clínico, foi assinado o Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Anexo II) para participação no estudo.
1.8 Restrições
Todos os voluntários chegaram à Unidade de Farmacologia Clínica tendo
feito uma refeição normal (jantar). A partir das 21:00 horas, da noite do dia do
internamento, os voluntários ficaram em jejum até a manhã seguinte e durante o
período de 3 horas após a administração da medicação quando um desjejum foi
servido. O almoço foi servido entre 5 e 6 horas após a administração e o jantar após
12 horas. Não foram permitidos outros alimentos no período de internação. Nos dois
períodos os voluntários tiveram as refeições padronizadas, e líquidos ad libitum após
as refeições, mas bebidas contendo xantinas (incluindo chá, café e cola) foram
evitados.
Não foi permitido fumar durante o período do internamento. Medicações
concomitantes foram evitadas quando possível, mas em caso de necessidade, foram
registradas em formulário apropriado. O consumo de álcool foi limitado durante o
período de estudo e evitado completamente durante as 48 horas que antecederam
cada coleta de sangue.
1.9 Esquema experimental
Como relatado anteriormente, os estudos foram abertos e randomizados,
sem procedimentos de codificação cega. A seqüência de tratamento, atribuída a
cada voluntário nos períodos de estudo, foi determinada por uma lista de
randomização. O número apropriado do voluntário foi alocado seqüencialmente,
considerando-se, inicialmente, a ordem alfabética dos nomes do grupo de
voluntários, cuja entrada na parte randomizada do ensaio for confirmada.
Os voluntários receberam, conforme a randomização (ANEXO A e B), um
comprimido de amoxicilina, norfloxacino ou suspensão de oxcarbazepina como dose
102
única entre 7:00 e 8:00 da manhã do dia após o confinamento, acompanhado de 200
mL de água mineral sem gás, após pelo menos 10 horas de jejum.
1.10 Coletas de sangue
Figura 11. Esquema do procedimento de coleta de sangue e separação de
amostras plasmáticas.
As amostras de sangue para determinação da concentração plasmática
de amoxicilina, norfloxacino, oxcarbazepina e seu metabólito foram obtidas, através
de escalpe heparinizado introduzido em veia superficial do antebraço do voluntário,
imediatamente antes (tempo zero e pool) e aos seguintes intervalos, a partir da
administração: 20, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360, 480, 600; 20, 40, 60, 80, 100,
120, 150, 180, 240, 360, 480, 600, 720, 1080, 1440 e 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210,
240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450, 480, 540, 600, 720, 1080, 1440 e 2880
horas, respectivamente.
A cada intervalo de tempo, foram coletados 8 mL de sangue (exceto antes
da administração quando foram coletados dois tubos de 8 mL cada – tempo zero e
pool) e colocados em tubos vacutainer de vidro contendo 30 L de heparina. Após
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103
centrifugadas a 3.000 rpm, na temperatura de 8°C, durante 12 minutos, o plasma foi
separado, colocados em tubos e em seguida os tubos devidamente identificados
foram mantidos em freezer, numa temperatura de –20ºC, até sua análise (Figura
11).
1.11 Avaliação da segurança
Foi solicitado aos voluntários que relatassem qualquer evento adverso e a
sua data de ocorrência, para que fosse acompanhado clínica e laboratorialmente até
que os parâmetros alterados voltassem ao normal. Foi também solicitada informação
se houve ou não a necessidade de medicação adicional. As perguntas realizadas
para saber se os voluntários tiveram algum evento adverso foram limitadas a
perguntas gerais, tais como: Como vai você?
Definições de efeitos adversos quanto à intensidade
Leve - Experiência adversa facilmente tolerada
Moderada - Experiência adversa desagradável o bastante para interferir
na atividade cotidiana.
Severa - Experiência adversa que impossibilita a realização da atividade
cotidiana normal.
Relacionamento suposto com a droga experimental
Sem relação - A experiência adversa definitivamente não está relacionada
à droga em estudo.
Desconhecida - Há outras causas mais prováveis e não há suspeitas de
que a droga seja a causa.
104
Possível - Não foi demonstrado um relacionamento de causa e efeito
direto entre a droga e a experiência adversa, porém, há uma possibilidade razoável
de que a droga esteja envolvida.
Provável - Há um relacionamento direto de causa e efeito entre a
experiência e a droga em estudo.
1.12 Aspectos Éticos
O projeto de pesquisa, com o protocolo experimental e o termo de
consentimento, foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa com Seres
Humanos da Universidade Federal do Ceará, credenciado pelo CONEP - Conselho
Nacional de Saúde/MS.
O Estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque (1964)
e as revisões de Tóquio (1975), Veneza (1983), Hong Kong (1989), Somerset Oeste
(1996) e Edimburgo (2000), assim como as regulamentações locais (Resoluções
196/96 e 251/97 do CNS-MS, bem como Resolução 135/03 da ANVISA).
1.13 Termo de consentimento livre e esclarecido
Segundo a Declaração do Congresso Nacional de Bioética (SIBI),
realizado em junho de 2000, o art. 11º, dedicado aos temas da pesquisa e
experimentação, relata que “os sujeitos das experimentações deverão dar seu
consentimento livre e esclarecido e plenamente informado”.
Os voluntários selecionados para esse estudo receberam explanação
sobre a natureza e os objetivos do estudo. Foi enfatizado que o trabalho teria a
finalidade de pesquisa e que o voluntário não poderia esperar qualquer efeito
terapêutico. O voluntário também tinha conhecimento da sua liberdade para se
retirar a qualquer momento do estudo sem que isto lhe cause qualquer prejuízo no
seu atendimento junto à Unidade de Farmacologia Clínica ou ao Hospital de
Messejana. Foi solicitado a cada voluntário que, caso concordasse com o protocolo
105
de estudo, assine o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para a participação
do estudo.
1.14 Confidencialidade
Os resultados da avaliação médica, o eletrocardiograma e os exames
laboratoriais foram registrados em folha individual de cada voluntário. Uma cópia dos
exames laboratoriais realizados no período pré e pós-estudo foi fornecida aos
voluntários, quando solicitada.
2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL PARA QUANTIFICAÇÃO DOS ANALITOS
2.1 Sistema de Qualidade e Biossegurança
Os principais benefícios de sistemas de gestão da qualidade em
laboratórios de pesquisa são: maior credibilidade nos resultados e pesquisadores,
comparabilidade e reprodutibilidade de resultados publicados, aumento da confiança
entre as partes envolvidas e facilidade na aquisição de financiamentos.
Para garantir que os estudos realizados atendam às expectativas e
exigências das autoridades regulamentadoras e das organizações que fornecem
reconhecimento, a Unidade de Farmacologia Clínica tem seu escopo de trabalho e
Sistema de Qualidade baseados nas Normas e Resoluções: NBR ISO/IEC
17025:2001; Resolução ANVISA nº 41, de 28 de abril de 2000; Resolução ANVISA
nº 133, de 29 de maio de 2003; Resolução ANVISA nº 135, de 29 de maio de 2003;
Procedimento GGLAS nº 02/17025 e Procedimento GGLAS nº 02/BPL; Boas
Práticas Clínicas.
O objetivo da biossegurança adotada é reconhecer fontes de perigo,
avaliar as situações de risco que essa fonte oferece e controlá-la, tomando decisões
técnicas e/ou administrativas para promover mudanças. Ao adotarmos
procedimentos específicos para evitar ou minimizar os riscos de atividades
potencialmente perigosas, estamos aplicando a biossegurança.
106
Jaleco, óculos de segurança e luvas de procedimentos; são de uso
obrigatório durante os procedimentos e quando for necessária a manipulação de
soluções biológicas. Procedimentos de segurança utilizados em laboratórios bem
como procedimentos adequados para descarte de lixo químico e biológico são
seguidos no desenvolvimento dos ensaios.
2.2 Substâncias químicas e Materiais Utilizados
As substâncias analíticas, cefadroxil e ciprofloxacino foram grau USP,
enquanto que a amoxicilina, norfloxacino, carbamazepina, oxcarbazepina e 10,11-
dihidro-10-hidroxicarbamazepina (MHD) foram obtidos pela Farmacopéia Brasileira,
Sigma-Aldrich, CDN Isotopes, Aché Laboratórios Farmacêuticos S/A e Synefine
Researsh, respectivamente, todos com pureza maior que 98% (ANEXOS F, G, H, I,
J, L e M). Acetonitrila, diclorometano, metanol, ácido acético, ácido clorídrico, dietil
éter e diclorometano foram grau HPLC. Fosfato de potássio monobásico e dibásico,
ácido cítrico, hidróxido de sódio, ácido fórmico foram grau analítico. Foi utilizada
água purificada do sistema Milli-Q (Milipore EUA). Amostras de plasma humano
foram obtidas do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Ceará para utilização em
teste de especificidade dos métodos (Ceará, Brasil).
Tabela 1. Utensílios utilizados no desenvolvimento e validação dos métodos.
Utensílios Produtor, País
Micropipetas ajustáveis Gilson, França
Repipetador Gilson Gilson, França
Repipetador Eppendorf Eppendorf, EUA
Ponteiras para micropipetas ajustáveis Alfa-Lab, Brasil
Tubos plásticos de 50 e 15 mL TTP, Suíça
Tubos de vidro de 120 x 12 mm Laborglass, Brasil
Misturador Vortex Phoenix, Brasil
Balança Analítica Mettler Toledo, Suíça
Microvial de 300 uL OCP Diagnostics, Brasil
Banho Ultra-sônico Odontobrás, Brasil
107
2.3 Padrão interno
A escolha dos padrões internos utilizado nos processos de validação e
desenvolvimento dos métodos bioanalíticos propostos deu-se através da análise de
sua estrutura química, bem como do fármaco em estudo. Os critérios utilizados para
a escolha dos padrões internos foram: presença de grupos funcionais similares em
ambas às estruturas; semelhança quanto às características químicas de cada
molécula; e composição química elementar. Através desta análise preliminar foi
escolhido, como padrões internos, o cefadroxil, ciprofloxacino e carbamazepina.
2.4 Preparo das soluções padrão
As soluções máster (1mg/mL) foram preparadas em uma proporção de
metanol-água (1:1) para amoxicilina e cefadroxil; em NaOH 0,01M para norfloxacino
e ciprofloxacino; em acetonitrila para oxcarbazepina, MHD e carbamazepina. As
soluções de trabalho foram obtidas através de diluições das soluções máster em
metanol-água, água Milli-Q ou com acetonitrila-água (50:50 v/v), para os respectivos
estudos. Os padrões analíticos em plasma foram preparados adicionando volumes
específicos das soluções de trabalho em plasma livre de interferentes obtendo-se
concentrações finais na faixa de 0,5-40 µg/mL, 30 – 3500 ng/mL e 20/40 –
5250/10500 ng/ml, para os respectivos estudos. As soluções de controle de
qualidade foram fixadas em 1,5, 15 e 30 µg/mL, 90, 1400 e 2800 ng/mL e 60/120,
2000/4000 e 4000/8000 ng/mL (correspondendo à baixa, média e alta
concentração), para quantificação da amoxicilina, norfloxacino e
oxcarbazepina/MHD, respectivamente, e preparadas com as mesmas amostras de
plasma utilizadas no preparo da curva de calibração. As soluções de trabalho do
padrão interno (400 µg/ml, 5 µg/mL e 400 ng/mL) foram preparadas utilizando
solução de metanol-água, água Milli-Q e acetonitrila-água (50:50 v/v), para
cefadroxil, ciprofloxacino e carbamazepina, respectivamente. Todas as soluções
foram estocadas a 4ºC e trazidas à temperatura ambiente antes do uso.
108
2.5 Critérios para validação do método bioanalítico
2.5.1 Determinação do limite de quantificação (LQ)
O limite de quantificação do método analítico foi definido levando-se em
consideração a sensibilidade, especificidade, precisão e exatidão do método.
Para a determinação do LQ, foram feitas análises da matriz biológica
contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível quantificável
com precisão e exatidão aceitáveis. Com isto, tentou-se assegurar que os menores
valores possíveis fossem analisados, por meio de repetições de análises, com
valores sucessivamente menores, quando os inicialmente escolhidos fossem
quantificados com precisão e exatidão aceitáveis.
A determinação do LQ do método proposto seguiu os seguintes critérios:
a) A resposta de pico para o LQ deve ser, no mínimo, 5 vezes maior que
qualque interferência na amostra branco no tempo de retenção do fármaco;
b) O pico de resposta do fármaco no LQ deve ser identificável e
reprodutível com precisão de 20% e exatidão entre 80-120% em relação à
concentração nominal do padrão, através da análise de, no mínimo, cinco amostras
dos padrões.
2.5.2 Curva de calibração/linearidade
Para a determinação da curva de calibração analisaram-se amostras
extraídas da matriz biológica em seis concentrações distintas. A curva de calibração
incluiu a análise da amostra branco (matriz biológica isenta de padrão interno e do
padrão do fármaco), amostra zero (matriz biológica mais o padrão interno) e mais
seis amostras contendo padrão do fármaco e padrão interno contemplando o limite
109
de variação esperado. As amostras contendo padrão do fármaco e padrão interno
foram analisadas em triplicata.
As concentrações dos padrões foram definidas em testes preliminares,
incluindo a primeira quantificação de amostras, levando-se em consideração a
sensibilidade do método e a faixa prevista das concentrações das amostras a serem
determinadas.
A linearidade da curva de calibração foi avaliada dentro dos seguintes
critérios:
a) Desvio menor ou igual a 20% em relação à concentração nominal do
LQ, em pelo menos duas das triplicatas;
b) Desvio menor ou igual a 15% em relação a concentração nominal para
as outras concentrações da curva de calibração, em pelo menos duas das triplicatas;
c) No mínimo 4 de 6 concentrações da curva de calibração devem
cumprir com os critérios descritos, incluindo o LQ e a maior concentração da curva
de calibração;
d) O coeficiente de correlação será aceito se for igual ou maior do que
0,98.
2.5.3 Precisão e exatidão
Para avaliar a precisão e a exatidão do método bioanalítico, quatro
concentrações distintas, CQB, CQM, CQA e LQ foram analisadas. Cada amostra foi
analisada em quintuplicata. A precisão e a exatidão foram determinadas em um
mesmo lote (precisão e exatidão intralote) e em lotes diferentes (precisão e exatidão
interlotes). As análises foram realizadas em três baterias para cada parâmetro.
110
2.5.3.1 Precisão e exatidão intralote
A precisão e exatidão intralote foram definidas segundo os seguintes
critérios:
a) Precisão: para os controles CQB, CQM e CQA o coeficiente de
variação (CV) não deveria exceder 15%, e para o LQ admitiram-se valores menores
ou iguais a 20%;
b) Exatidão: o valor da exatidão para as amostras CQB, CQM e CQA não
deve exceder 15% do valor nominal e para o LQ admitiu-se desvios menores ou
iguais a 20%.
2.5.3.2 Precisão e exatidão interlote
A precisão e a exatidão interlote seguiu os mesmos critérios de validação
para a precisão e exatidão intralote.
2.5.4 Especificidade
Para avaliar a especificidade, foram analisadas amostras de plasma
humano branco obtidos de seis indivíduos do Centro de Hematologia e Hemoterapia
do Ceará. Cada amostra branco foi testada utilizando os procedimentos de extração
e as condições cromatográficas propostas, para avaliar interferência no tempo de
retenção do fármaco ou do padrão interno e os resultados foram comparados com
aqueles obtidos com uma solução padrão dos analitos (amoxicilina, norfloxacino,
oxcarbazepina ou MHD) em concentração próxima ao Limite de quantificação.
2.5.5 Recuperação
O cálculo da recuperação do fármaco é feito comparando-se as áreas dos
picos do analito (controles de qualidade baixo, médio e alto) das amostras extraídas
111
do plasma com as áreas dos picos do analito preparado em solução (solução não
extraída). As áreas correlacionadas com a concentração, considerando-se que as
áreas obtidas para os controles baixo, médio e alto, preparados em solução
(amostras não extraídas) correspondem, respectivamente, as concentrações
nominais dos analitos.
O cálculo da recuperação do padrão interno é feito de maneira análoga,
ou seja, comparando-se as áreas do pico do padrão interno extraída do plasma com
as áreas dos picos do padrão interno preparada em solução (amostra não extraída)
na concentração definida.
2.5.6 Estudo de estabilidade do fármaco no fluido biológico
Os procedimentos de estabilidade avaliaram a estabilidade do analito no
plasma humano sob condições distintas de temperatura e acomodação, bem como
sua estabilidade em soluções de estoque.
A estabilidade nos fluidos biológicos é dependente das condições de
armazenamento, das propriedades químicas da droga, da matriz empregada
(plasma humano) e sistema de armazenamento. O resultado do presente teste é
relevante somente sob as mesmas condições e não deve ser extrapolado para
outras matrizes e sistemas de armazenamento.
Para o teste de estabilidade, uma série de amostras padrão foi preparada
da solução estoque (preparada recentemente no mesmo solvente utilizado para a
análise). Os respectivos controles de qualidade baixo, médio e alto, incluindo todos
os analitos e padrões internos, foram usados. Amostras do plasma humano de cada
concentração foram preparadas em volume suficiente para ter alíquotas múltiplas.
Três alíquotas de cada concentração foram processadas e quantificadas
imediatamente para fornecer valores de referência (frescos) e outras três alíquotas
para cada concentração foram processadas para os testes desejados.
112
2.5.6.1 Estabilidade no tempo e condições de análise (curta duração)
Para avaliar a estabilidade do fármaco no tempo e condições de análise,
as amostras processadas foram mantidas dentro do auto-injetor à temperatura
ambiente. Cada amostra de controle de qualidade foi analisada em triplicata nos
tempos determinados a qual excede o tempo em que as amostras poderiam ser
mantidas em temperatura ambiente depois de serem descongeladas e antes de
serem analisadas. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos da análise
de amostras recém-preparadas.
2.5.6.2 Estabilidade do fármaco em ciclos de congelamento e degelo
Figura 12. Esquema dos ensaios de estabilidade em ciclos de congelamento de
descongelamento
Para avaliar a estabilidade dos analitos, durante três ciclos de
congelamento e descongelamento, foram analisadas cinco amostras de cada
controle de qualidade nas seguintes condições: Degelo 01 - as amostras foram
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113
congeladas a –20ºC e mantidas nesta temperatura por 24 horas. Degelo 02 - Após
este tempo, as amostras foram submetidas ao descongelamento natural, à
temperatura ambiente, extraídas e imediatamente analisadas. Depois de
completamente descongeladas, as amostras foram novamente congeladas a –20ºC,
mantidas nesta temperatura por mais 24 horas, descongeladas, extraídas e
analisadas. Degelo 03 - O mesmo procedimento foi repetido mais uma vez, com o
intuito de completar o 3º ciclo de congelamento e descongelamento (Figura 12).
2.5.6.3 Estabilidade de longa duração
Para avaliar a estabilidade do fármaco, em plasma, em condições de
longa duração, o tempo de armazenamento deve exceder o intervalo de tempo
compreendido entre a data da primeira coleta de amostra e a análise da última
amostra dos voluntários (Figura 13).
Figura 13. Esquema dos ensaios de estabilidade de longa duração.
Para verificação desta estabilidade, utilizaram-se cinco amostras de cada
controle de qualidade determinadas durante o processo de validação da metodologia
analítica proposta. As concentrações de todas as amostras de estabilidade foram
comparadas com as concentrações de amostras recém-preparadas.
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114
2.6 Desenvolvimento e validação do método para quantificação da amoxicilina
2.6.1 Equipamentos e condições do HPLC
As medidas cromatográficas foram obtidas usando equipamento
Shimadzu (Kyoto, Japão), composto por uma bomba LC-10AD, um auto-injetor SIL-
10AD e um detector diodo SPD-M10A controlado pelo software Class VP6.3 para
aquisição dos dados. A separação analítica foi realizada por uma coluna Gemini C18
5 µm (150 X 4,6 mm), (Phenomenex, EUA). A fase móvel consistiu de um tampão
fosfato de 0,01 M (pH 3,5)/acetonitrila (95:5 v/v) liberada a uma taxa de fluxo de
1,5mL/min em temperatura ambiente. O comprimento de onda utilizado para
detecção foi de 203 nm. As amostras foram introduzidas usando o auto-injetor e o
volume de injeção foi de 30 µl.
2.6.2 Preparação de amostras e processo de extração
As amostras de plasma foram contaminadas em quantidades definidas de
amoxicilina obtendo concentrações finais de 0,5, 1, 2, 4, 20 e 40 µg/mL. Um volume
de 20 µl de solução de padrão interno com concentração de 400 µg/mL e 200 µl da
solução de 0,1M de ácido cítrico foram adicionados à 400 µl de amostras de plasma
(contaminados com analito) ou de voluntários, contidos em tubos testes com tampa
rosqueada. A solução resultante foi agitada por 20 segundos, sendo posteriormente
adicionadas 800 µl de acetonitrila e agitada novamente por 40 segundos. Após a
centrifugação em 5500 rpm por 5 minutos, a solução do sobrenadante foi transferida
para um tubo de vidro e acrescentado 2 mL de diclorometano. As amostras foram
agitadas por 40 segundos e centrifugadas (5 minutos, 5500 rpm). A fase aquosa foi
transferida para vials e alíquotas de 30 µl foram injetadas no HPLC. As amostras
foram mantidas à temperatura ambiente no auto-injetor.
115
2.6.3 Validação do método bioanalítico
As curvas de calibração foram definidas pela relação entre concentração
da amostra e resposta do equipamento, utilizando-se três corridas em duplicatas
com amostras de plasma contaminadas nas concentrações 0,5, 1, 2, 4, 10, 20 e 40
µg/mL. As curvas de calibração foram construídas pela razão das áreas dos picos da
amoxicilina pelo padrão interno (cefadroxil). Utilizando a regressão linear (fator: 1/x
2
)
foi determinada a inclinação da curva, intercept e coeficiente de correlação.
Os controles de qualidade contendo amoxicilina (1,5, 15 e 30 µg/mL)
foram utilizados para determinar a precisão intra e interlote no processo de validação
e calculados através de três corridas analíticas por interpolação das curvas. Oito
replicatas de cada controle de qualidade foram determinadas em cada corrida
analítica.
A seletividade foi avaliada comparando os cromatogramas de seis
amostras de plasma branco com amostras de plasma contaminado com amoxicilina
e padrão interno. A determinação do menor limite de quantificação, definida como a
menor concentração analisada com exatidão e precisão, é de grande importância
em estudos farmacocinéticos. O limite de quantificação de concentração de 0,5
µg/mL foi calculado utilizando oito replicatas. A especificidade do estudo foi
determinada utilizando diferentes amostras de plasma. A recuperação absoluta da
amoxicilina em plasma foi determinada comparando as áreas dos picos obtidos nos
três níveis de amostras de plasma contaminada (1,5, 15 e 30 µg/mL) com as obtidas
depois da injeção direta de amoxicilina dissolvida em fase móvel nas mesmas
concentrações, através do sistema cromatográfico. A estabilidade da amoxicilina foi
investigada sob uma variedade de condições de processos e estocagem. Os
estudos de adequação do sistema também foram realizados e os parâmetros como
eficiência da coluna, resolução e assimetria de picos foram avaliados.
116
2.7 Desenvolvimento e validação do método para quantificação do
norfloxacino
2.7.1 Equipamentos e condições do HPLC
As medidas cromatográficas foram obtidas usando um equipamento
Shimadzu (Kyoto, Japan), composto por uma bomba LC-10AD, um autoinjetor SIL-
10AD e um detector fluorimétrico RF-10Axl configurado com 300 e 450 nm de
excitação e emissão, respectivamente. O sistema foi operado utilizando o programa
Class VP 6.3 para aquisição dos dados. A separação foi realizada em coluna
analítica Synergi MAX-RP 4µm (150x4,6 mm) (Phenomenex, Torrance, CA, USA)
sem pré-coluna. A fase móvel consistiu de uma solução de acetonitrila-fosfato de
potássio monobásico (pH, 3.0; 25 mM; 15:85 v/v), eluído em um fluxo de 1,0 mL/min.
O pH do tampão fosfato foi ajustado com ácido fosfórico. A coluna foi operada em
40ºC.
2.7.2 Preparação de amostras e processo de extração
Para elaboração dos padrões de calibração e amostras desconhecidas, o
plasma (200 µL) foi armazenado em tubo apropriado contendo 50 µL de padrão
interno de 5 µg/mL e 1,6 mL de acetonitrila. Os tubos foram agitados vigorosamente
por 40 segundos para ocorrer desproteinização e então centrifugados em 3500g por
10 minutos. O sobrenadante foi separado e evaporado (50ºC) sob fluxo de
nitrogênio. O resíduo foi reconstituído em 200 µL de tampão fosfato (25 mM), as
amostras foram transferidas para tubos vials e inseridas no autoinjetor à 8ºC, sendo
injetada no sistema cromatográfico.
2.7.3 Validação do método bioanalítico
As curvas de calibração são definidas pela relação entre concentração da
amostra e resposta do equipamento, utilizando-se três corridas em duplicatas com
amostras de plasma contaminadas, nas concentrações (30, 500, 1000, 1500, 2000,
117
2500, 3000 e 3500 ng/mL). As curvas de calibração foram construídas pela razão
das áreas dos picos do norfloxacino pelo padrão interno. Através da regressão linear
(fator: 1/x) foi determinada a inclinação da curva, intercept e coeficiente de
correlação. Os controles de qualidade contendo norfloxacino (90, 1400 e 2800
ng/mL) foram utilizados para determinar a precisão intra e interlote no processo de
validação e calculados através de três corridas analíticas por interpolação das
curvas. Oito replicatas de cada controle de qualidade foram determinadas em cada
corrida analítica.
O limite de quantificação (LQ) de concentração foi calculado utilizando
oito replicatas. A especificidade do estudo foi determinada utilizando seis diferentes
amostras de plasma. Cada amostra foi testada para verificar a presença de
interferentes com a utilização do procedimento proposto de extração e condições
cromatográficas, comparando com aqueles obtidos em solução aquosa contendo
analito em concentração próxima ao LQ.
A eficiência no processo de extração do norfloxacino e ciprofloxacino em
3 lotes diferentes de plasma foi determinada por análise das amostras de controle de
qualidade. As amostras foram extraídas de acordo com o processo descrito
anteriormente. A recuperação relativa foi determinada comparando as médias das
áreas de 5 amostras de plasma de cada controle de qualidade contaminadas antes e
após a extração (n = 5). De acordo com Matuszewski e colaboradores, este
procedimento leva em consideração o efeito matriz, obtendo uma recuperação real.
A recuperação do padrão interno foi também determinada pelo mesmo
procedimento.
A estabilidade do norfloxacino em três concentrações (90, 1400 e 2800
ng/mL) foi investigada sob diversas condições de tempo e temperatura. A
estabilidade do norfloxacino e ciprofloxacino foi determinada depois de 92 horas em
amostras extraídas e estocadas no autoinjetor (8ºC). A estabilidade por
congelamento e descongelamento de amostras de plasma foi conduzida em 3 ciclos
de congelamento e degelo durante 3 dias. A estabilidade de curta-duração depois de
15 horas de armazenamento em temperatura ambiente (20ºC) também foi avaliada
118
em amostras de controle de qualidade. Além disso, estabilidade longa-duração
depois de 44 dias de armazenamento (em -20ºC) foi determinada. Todas as
amostras (n=5) foram analisadas utilizando amostras para curva de calibração
recém preparadas.
2.8 Desenvolvimento e validação do método para quantificação da
oxcarbazepina
2.8.1 Equipamentos e condições do HPLC
As medidas cromatográficas foram obtidas usando um equipamento
Shimadzu (Kyoto, Japan), composto por uma bomba LC-10AD, um autoinjetor SIL-
10AD. A fase móvel consistiu de acetonitrila-água (50:50 v/v) + 20 mM ácido acético
em um fluxo de 1 mL/min através da coluna analítica Phenomenex Luna C18 5 µm
(150x4,6 mm), em temperatura ambiente. Um split da coluna eluente de
aproximadamente 1:10 foi inserido, entrando no espectrômetro de massa somente
50 µl/minuto. O volume de injeção foi de 5µl. O espectrômetro de massa (Micromass
Quattro LC) foi equipado com uma fonte de ionização eletrospray no modo positivo
(ES+) e configurado em monitoramento de múltiplas reações (MRM), monitorando as
transições m/z 253 > 208, m/z 255 > 194 e m/z 247 > 204 para oxcarbazepina, MHD
e carbamazepina (padrão interno), respectivamente. A fonte e a temperatura de
dessolvatação foram de 120 e 350 ºC, respectivamente. O cone e fluxo do gás de
dessolvatação (N2) foi de 107 e 353 l/h, respectivamente. O dwell time foi
configurado em 0,5 segundos, os valores de voltagem capilar, a energia do cone e
energia de colisão foram de 3 kV, 15V, 15 eV para oxcarbazepina, 3 kV, 20V, 20 eV
para MHD e 3 kV, 23V, 15 eV para carbamazepina, com pressão de gás (argônio)
de 2.83×10
−3
mbar. A aquisição e análise dos dados foram obtidas usando o
programa MassLynx (V 4.0 em Windows XP, Pentium PC).
2.8.2 Preparação de amostras e processo de extração
Uma alíquota de 25 µl de padrão interno (400 ng/ml) e 100 µl de água
foram adicionadas em 100 µl de plasma e agitados. Em seguida, foi adicionado 1 ml
119
de dietil éter-diclorometano (60:40 v/v) nos tubos e agitados em vortex por 5
minutos. Então, os tubos foram centrifugados em 2000g por 5 minutos em 8ºC. A
parte superior orgânica foi cuidadosamente removida, transferidos para novos tubos
e evaporados sob fluxo de nitrogênio à 50ºC. O resíduo foi reconstituído em 100 µl
de acetonitrila seguido de agitação por 30 segundos, transferido para vials e injetado
no sistema cromatográfico.
2.8.3 Validação do método bioanalítico
O procedimento descrito foi validado de acordo com recomendações
internacionais para métodos bioanalíticos (HUBERT; CHIAP, 1999; SHAH et al.,
2000). As curvas de calibração são definidas utilizando-se quatro corridas de
diferentes lotes de plasma em triplicatas com amostras de plasma contaminadas nas
concentrações (20, 750, 1500, 2250, 3000, 3750, 4500 e 5250 ng/ml para
oxcarbazepina e 40, 1500, 3000, 4500, 6000, 7500, 9000 e 10500 ng/ml para MHD).
As curvas de calibração foram construídas pela razão das áreas dos picos dos
analitos pelo padrão interno. O menor limite de quantificação (LQ) foi definido como
a menor concentração a qual pode ser quantificada com um valor de ruído abaixo de
20% e relação sinal-ruído menor que 15 (n=5). O efeito matriz foi determinado em
seis diferentes lotes de plasma branco (VAN ROOYEN et al., 2002). Cada amostra
branco foi testada para verificar interferências utilizando o procedimento de extração
e comparados com aqueles obtidos com solução aquosa do analito em uma
concentração próxima do LQ. A seletividade do sistema de detecção foi verificada
para avaliar a possibilidade de cross-talk. Este teste foi realizado com as seguintes
etapas: (1) injeção de branco extraído e monitorando a resposta na transição
oxcarbazepina, MHD e carbamazepina; (2) injetando separadamente uma amostra
de plasma contaminada somente com oxcarbazepina ou MHD na concentração mais
alta e monitorando a resposta na transição do padrão interno e MHD ou
oxcarbazepina; (3) injetando uma amostra de plasma contaminada somente com
padrão interno e monitorando a transição da oxcarbazepina e MHD. A precisão e
exatidão inter e intralote do método foram avaliadas realizando analises em
replicatas (n=8) das amostras em plasma dos controles de qualidade com curva de
calibração. O procedimento foi repetido em diferentes dias (n=4) para determinar a
120
precisão e exatidão interlote dos dados. A exatidão e precisão intralote foram
determinadas através de amostras contaminadas em replicatas no mesmo dia. A
exatidão (percentual do erro relativo (%ER)) foi calculada pela razão da
concentração experimental e a nominal das amostras de plasma contaminadas. A
precisão do método (análise inter e intralote) foi calculada pelo percentual do desvio
padrão relativo (DPR%) entre as medidas repetidas.
A eficiência do método de extração para oxcarbazepina e MHD em três
lotes diferentes de plasma foi determinada analisando as amostras do controle de
qualidade. A recuperação relativa foi determinada comparando a média das áreas
ou respostas de cinco amostras de plasma de cada controle contaminadas antes da
extração com as contaminadas após a extração (n=5). A recuperação do padrão
interno foi também determinada pelo mesmo procedimento.
A estabilidade da oxcarbazepina e MHD estocado em três concentrações
foi investigada sob diversas condições de tempo e temperatura. A estabilidade em
amostras extraídas e estocadas no autoinjetor (8ºC) foi determinada depois de 92
horas. A estabilidade por congelamento e descongelamento de amostras de plasma
foi conduzida com 3 ciclos de congelamento e degelo durante 3 dias. A estabilidade
curta-duração para amostras de controle de qualidade depois de 15 horas de
armazenamento em temperatura ambiente (20ºC) também foi avaliada. Além disso,
a estabilidade longa-duração depois de 30 dias de armazenamento (em -20ºC) foi
determinada. Todas as amostras (n=5) foram analisadas utilizando amostras para
curva de calibração recém preparadas.
2.9 Aplicação dos métodos propostos em estudos farmacocinéticos
Para avaliação dos parâmetros farmacocinéticos tais como área sob a
curva do tempo zero ao infinito (AUC
0-∞
), do tempo zero a última coleta (AUC
0-h
),
concentração máxima atingida (C
max
), tempo para atingir a concentração máxima
(T
max
), meia-vida plasmática (t
1/2
) foram calculados.
121
A meia-vida foi calculada através da fórmula (t
1/2
= ln2/K). A concentração
plasmática máxima observada (C
max
) e o tempo para obter esta concentração (T
max
)
foram obtidos diretamente da curva. A área sob a curva de concentração plasmática
versus tempo de (AUC
0-h
) foi calculada através do método trapezoidal. A
extrapolação dessa área para o infinito (AUC
[0-∞]
) foi feita adicionando o valor da
relação C
0-h
/K (onde C
0-h
é a concentração plasmática obtida da última coleta e K,
que é a constante de eliminação) a AUC
0-h
.
2.10 Análise Estatística
As análises estatísticas foram conduzidas após transformação
logarítmica, baseada em modelo aditivo para todos os valores de AUC e C
max
. T
max
,
t½, K e C
0-h
não serão avaliados estatisticamente.
Foi empregada a análise de variância apropriada para o modelo de 2
períodos cruzados, sob os dados de AUC e C
max
transformados logaritmicamente, a
qual levará em conta em seu modelo os efeitos de seqüência, voluntário dentro da
seqüência, tratamento e período. Para o delineamento crossover 2x2, o objetivo da
análise de variância é estudar a variabilidade de seqüência e período dos dados
estudados.
A verificação de existência de efeito residual foi realizada com base nos
testes de seqüência da ANOVA, utilizando-se como parâmetro o P_value, obtido
como base na F_stat do efeito de seqüência (Sequence Hypothesis of Model
Efects).
Foram calculados os pontos paramétricos e estimativa dos intervalos da
razão T/R (formulação "teste" / formulação "referência") para valores AUC e C
max
. A
biodisponibilidade relativa da formulação Teste versus Referência foi avaliada pelas
razões das médias geométricas (pontos estimados). O intervalo de confiança de
90% serviu como estimativa de intervalo e foi determinado por análises paramétricas
(dois testes t unicaudais – p=0.05).
122
Os medicamentos são considerados bioequivalentes quando IC de 90%
para a razão entre as médias dos dados transformados em logaritmo natural de C
max
e ASC
0-ulth
estiverem entre 80 e 125%, conforme legislação vigente (FDA, 1985;
FDA, 1993).
A análise realizada com o emprego dos seguintes softwares: WinNonLin
Professional Network Edition, Versão 5.0; Bioequivalence Program for “Two-Period
Crossover Studies - Versão 3.4”, por Jerman P Wijnand; Microsoft® Office Excel
2003 (11.5612.5606), MedCalc® Versão 7.2.1.0 e Graph Pad Prism Versão 3.02.
123
PARTE III: RESULTADOS E DISCUSSÃO
124
PARTE III: RESULTADOS E DISCUSSÃO
CAPÍTULO 1: Amoxicilina
Amoxicilina (4-amino-5-cloro-N-[(2-dietilamino) etil]-2-metoxi benzamida) é
um dos mais comuns antimicrobianos, possui largo espectro de ação e pertence ao
grupo das penicilinas. É freqüentemente prescrito na prática médica e veterinária,
individualmente ou combinado com outros fármacos, para o tratamento sistêmico de
infecções (YUAN et al., 1995; DOUSA; HOSMANOVA, 2005). A co-administração de
omeprazol (inibidor de bomba de prótons) com amoxicilina tem sido amplamente
usada para controlar os sintomas de gastrite e úlcera péptica associada à infecção
de Helicobacter pylori (ERAH et al., 1997).
Vários métodos, incluindo microbiológicos (BALL et al., 1980) e ensaio
enzimático (CULLMANN; DICK, 1986), foram utilizados para quantificar a
concentração de amoxicilina nos fluidos biológicos, individualmente e em
combinação com outros fármacos. Alguns deles, como bioensaio, requerem tempo e
não são específicos (MENELAOU et al., 1999). Assim, quando critérios tais como a
sensibilidade e especificidade precisam ser asseguradas, geralmente, é utilizada a
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Ao longo dos anos, vários métodos
cromatográficos com detecção fluorométrica ou ultravioleta têm sido desenvolvidos
para análise de amoxicilina (YUAN et al., 1995; DOUSA; HOSMANOVA, 2005;
MENELAOU et al., 1999; HOIZEY et al., 2002; WIBAWA et al., 2002). Mais
recentemente, a separação por HPLC com detecção por espectrometria de massa
tornou-se um método de escolha (KYUANG-HWAN, 2004). Com exceção ao
HPLC/MS, estes métodos geralmente requerem uma extração em fase sólida, como
processo de preparação das amostras, a fim de aumentar a sensibilidade e
seletividade. Embora esses métodos sejam aplicados com sucesso, nem sempre
são simples e, em muitos casos, ambos são morosos e dispendiosos.
Para compreender o comportamento farmacocinético da Amoxicilina em
seres humanos, foi necessário utilizar um método quantitativo confiável. Foram
125
desenvolvidos diversos métodos de cromatografia para detecção de amoxicilina em
fluídos biológicos, a maioria com detecção em ultravioleta (UV) utilizando
comprimentos de onda baixos (λ= 210 a 330 nanômetro). Após a avaliação de várias
condições cromatográficas, um método apropriado e simples para quantificação de
amoxicilina em plasma humano foi desenvolvido utilizando cromatografia líquida de
alta eficiência com detecção por ultravioleta (UV).
1 ETAPA CLÍNICA
O estudo foi delineado, de forma a permitir que se obtenham os
parâmetros farmacocinéticos relevantes para a comparação estatística, visando a
averiguação de biodisponibilidade. No caso em estudo, tais parâmetros foram
obtidos diretamente a partir da determinação da concentração plasmática de
norfloxacino, baseado na aplicação de um modelo não-compartimental próprio para
avaliação destas concentrações, após a administração do medicamento por via oral.
Por conseguinte, a finalidade primária da Etapa Clínica foi a coleta de
amostras de sangue dos voluntários para medir (na Etapa Analítica) níveis
plasmáticos das substâncias após sua administração oral.
O desenho consistiu de um estudo aberto, randomizado, com replicação,
de 24 voluntários sendo doze homens e doze mulheres não grávidas. O número de
voluntários sadios deve sempre assegurar poder estatístico suficiente para garantir a
confiabilidade dos resultados do estudo (BRASIL, 2003b). O termo voluntário normal
ou sadio deve ser interpretado como indivíduo adulto, sem anormalidades clínico-
laboratoriais capazes de prejudicar a interpretação do experimento ou aumentar a
sensibilidade do indivíduo ao potencial tóxico do fármaco em estudo. A idade variou
entre 20 e 47 anos (27,33 9,15 anos), altura variando de 151 a 176 cm (164,30
8,21 cm) e índice de massa corporal médio de 24,12 ± 2,65 kg/m2.
Os voluntários qualificados para participar do estudo foram internados por
02 períodos de aproximadamente 24 horas, com 3 dias de intervalo entre os
internamentos, para garantir que não houvesse um efeito residual do primeiro
126
fármaco administrado, que poderia inflar ou alterar artificialmente os resultados do
segundo e assim por diante (HOWARD et al., 2000).
O órgão responsável pelos medicamentos genéricos no Brasil, Agência
Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, determina que o cronograma de coletas
das amostras sanguíneas deverá contemplar tempo igual ou superior a 3 a 5 vezes
meias-vidas de eliminação do fármaco ou metabólito ativo (BRASIL, 2003b). Deve-
se incluir o maior número possível de amostras na região próximo a concentração
máxima atingida para que possibilite a determinação da área sob a curva de
concentração sangüínea (BRASIL, 2003a). Amostras sangüíneas para a
determinação dos níveis plasmáticos dos fármacos foram obtidas antes da
administração (tempo zero e pool) e após a administração, seguindo o seguinte
esquema:
Amoxicilina → 20, 40, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360; 480 e 600 minutos.
2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO PARA
QUANTIFICAÇÃO DA AMOXICILINA
2.1 Seletividade do método
Foi desenvolvido um método utilizando cromatografia líquida de alta
eficiência com detecção ultravioleta para determinação de amoxicilina em plasma
humano. É conhecido que a composição da fase móvel, bem como, a preparação
das amostras são fatores críticos para produzir uma satisfatória separação dos
compostos desejados e impurezas de fluidos biológicos. Diferentemente de alguns
métodos que requerem técnicas adicionais do sistema HPLC para quantificação da
amoxicilina em plasma durante as primeiras fases de desenvolvimento do método,
foram feitas tentativas (composição da fase móvel, preparação das amostras) para
produzir boa separação da amoxicilina e padrão interno dos compostos endógenos
sem haver mudança na técnica de separação.
127
Os cromatogramas livres de analitos apresentaram ausência de
interferentes endógenos da matriz ao longo da janela de eluição para amoxicilina e
padrão interno, os picos estão apresentados na figura 14. O tempo de retenção para
amoxicilina e padrão interno foram 4,2 e 5,5 minutos, respectivamente, que pode ser
considerado um tempo curto para corrida analítica. Assim, o tempo de retenção para
amoxicilina foi aproximadamente duas vezes mais curto que do método
anteriormente publicado (YUAN et al., 1997; MENELAOU et al., 1999; HOIZEY et al.,
2002).
128
Figura 14. Cromatograma representativo do plasma branco (A), plasma
contaminado com amoxicilina (30 µg/mL) e cefadroxil (padrão interno) (B) e plasma
de um voluntário após 1h da administração oral de amoxicilina contaminado com
cefadroxil (C).
A
Minutes
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Volts
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Volts
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
(amoxicilina)
(cefadroxila)
Detector A - 1 (202nm)
Branco Plasma No rm al Lot 0000487682-2
M ET006V01TBM 02-11
Retention Time
Area
Name
A
Minut es
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Volts
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Volts
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
4.175 1567338 amoxicilina
5.326 1097133 cefadroxila
Detector A - 1 (202nm)
CQA Amoxicilina 30 ug/mL
MET006V01VAL03-52
Retention Time
Area
Name
B
Minutes
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Volts
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Volts
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
4.109 144798 amoxicilina
5.243 879211 cefadroxila
Detector A - 1 (202nm)
VOL 10 DC280584 - 1ª FASE - 01:00
120-04DCV04-026
Retention Time
Area
Name
C
129
2.2 Linearidade do método
As curvas de calibração, definidas em três corridas analíticas em
duplicata, foram lineares para a faixa de concentração de 0,5 - 40 µg/mL para
amoxicilina em plasma, com um coeficiente de correlação maior que 0,99. A
linearidade foi definida pela seguinte equação: y = 19,0642x + 0,000162149, onde y
representa a relação da altura do pico da amoxicilina e padrão interno e x representa
a relação da concentração (Figura 15).
Figura 15. Representação gráfica da curva de calibração y = 19,0642x +
0,000162149, r
2
= 0,999253.
O limite de quantificação da amoxicilina foi de 0,5 µg/mL, sendo este a
menor concentração a qual pode ser quantificada com desvio abaixo de 20% e
relação sinal ruído menor que 5 (n=8). Este limite é realmente suficiente para realizar
estudos de biodisponibilidade e foi selecionado no que diz respeito à concentração
esperada das amostras no estudo de biodisponibilidade.
2.3 Precisão e exatidão do método
No estudo, a precisão foi avaliada intra e interlote. O percentual do
coeficiente de variação (%CV) foi utilizado como medida de precisão. Os dados para
130
precisão intra e interlote para amoxicilina são apresentados na tabela 2. A validação
estatística apresentou uma boa precisão (abaixo de 10%) para todas as
concentrações (1,5, 15 e 30 µg/mL) de amoxicilina. Para serem aceitáveis, os
valores devem estar dentro de ± 15% em todas as concentrações.
Tabela 2. Validação da quantificação de amoxicilina em plasma: precisão intra e
interlote das amostras de controle de qualidade (n = 8).
Intralote (n=8) LQ CQB CQM CQA
Concentração Nominal (µgml
-1
) 0,5 1,5 15 30
Média ± DP 0,52 ± 0,05 1,51 ± 0,09 14,88 ± 0,39 30,32 ± 0,90
Exatidão (%) 96,0 99,3 99,2 98,9
Precisão (%) 9,6 6,0 2,6 2,9
Interlote (n=8)
Média ± DP 0,51 ± 0,05 1,57 ± 0,08 14,50 ± 0,58 28,52 ± 1,49
Exatidão (%) 98,0 95,3 96,7 95,1
Precisão (%) 9,8 5,1 4,0 5,2
2.4 Recuperação do método
Os três níveis de concentração da amoxicilina (n=5) foram usados para
determinar a recuperação absoluta. Foram encontrados bons resultados para os
valores médios da recuperação de amoxicilina em 1,5 µg/mL (59,4 ± 3,66%), 15
µg/mL (60,5 ± 1,74%) e 30 µg/mL (67,1 ± 3,82%), sendo a recuperação global de
62,3%. Valores de recuperação não menores que 50, 80 e 90% têm sido utilizados
como limites de aceitação. Embora seja desejável atingir a recuperação o mais
próximo possível de 100% (KARNES et al., 1991), pode ser aceitável uma baixa
recuperação se for demonstrado um bom resultado reprodutível nessa faixa. Os
resultados do estudo foram reprodutíveis e precisos, sendo o desvio padrão relativo
inferior a 7%.
2.5 Estudos de Estabilidade do método
A determinação da estabilidade da amoxicilina foi realizada analisando
amostras de plasma imediatamente, horas ou dias subseqüentes do período de
estoque. Os valores médios e os desvios (%) calculados de três níveis de amostras
131
de plasma estão apresentados na tabela 3. Todas as amostras (n=5) foram
analisadas usando amostras recém-preparadas da curva de calibração. As análises
de três conjuntos de amostras de plasma contaminadas com concentrações baixa
(1,5 µg/mL), média (15 µg/mL) e alta (30 µg/mL) de amoxicilina estocadas à -18ºC e
expostas à três ciclos de congelamento e descongelamento não apresentaram perda
significante do analito. Também foi analisada a estabilidade das amostras de plasma
processado e estocados no autoinjetor à temperatura de 23ºC em um período de 59
horas. Os resultados mostraram que as áreas dos picos de amoxicilina
permaneceram praticamente sem alterações e picos adicionais não foram
observados. Posteriormente, para demonstrar a estabilidade de longa duração da
amoxicilina, três amostras de plasma contaminadas foram processadas e estocadas
à -20ºC por 39 dias, sendo encontrada estabilidade neste período.
Tabela 3 – Resultado da estabilidade (média ± desvio padrão) obtido com três
amostras de plasma com concentração baixa (1,5 µg/mL), média (15 µg/mL) e alta
(30 µg/mL) de amoxicilina.
1,5 µg/mL 15 µg/mL 30 µg/mL
Antes 3º Ciclo Antes 3º Ciclo Antes 3º Ciclo
Congelamento e degelo
(X ± DP)
1,42 ± 0,02 1,44 ± 0,07 15,30 ± 0,26 15,63 ± 0,14 30,93 ± 0,53 29,81 ± 0,75
Variação (%) 1,4 2,2 -3,6
Antes 59 h Antes 59 h Antes 59 h
Pós-Processamento
(X ± DP)
1,53 ± 0,11 1,32 ± 0,05 15,64 ± 0,39 13,82 ± 0,53 30,93 ± 0,49 26,66 ± 0,66
Variação (%) -13,7 -11,6 -13,8
Antes 18 h Antes 18 h Antes 18 h
Curta duração (X ± DP)
1,58 ± 0,14 1,42 ± 0,03 15,66 ± 1,49 14,47 ± 0,31 32,83 ± 0,49 28,92 ± 1,11
Variação (%) -10,1 -7,6 -11,9
Antes 39 dias Antes 39 dias Antes 39 dias
Longa duração (X ± DP)
1,47 ± 0,12 1,39 ± 0,08 15,91 ± 0,39 15,98 ± 0,10 30,23 ± 0,74 29,94 ± 0,33
Variação (%) -5,4 0,4 -1,0
132
3 APLICAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO EM ESTUDO DE
BIOEQUIVALÊNCIA ENTRE DUAS FORMULAÇÕES CONTENDO AMOXICILINA
(CÁPSULA DE 500MG) EM VOLUNTÁRIOS SADIOS
O ensaio foi aplicado para avaliar a biodisponibilidade de dois produtos
contendo 500 mg de amoxicilina, a fim de determinar se a formulação teste
produzida pela Glenmark Pharmaceuticals Ltda e referência produzida pela
GlaxoSmithKline Beecham são bioequivalentes. As curvas de concentração
plasmática média da amoxicilina após administração oral da formulação teste e
referência versus tempo estão apresentadas na figura 16. Os parâmetros
farmacocinéticos correspondentes estão descritos na tabela 4. Os resultados foram
semelhantes aos já publicados, em que a amoxicilina foi quantificada por RP-HPLC
com detecção em espectrômetro de massa (YOON et al., 2004; NASIR et al., 2004)
ou detecção UV (BAGLIE et al., 2005).
Tabela 4 – Parâmetros farmacocinéticos da formulação teste e referência
(amoxicilina 500 mg) depois da administração oral de 24 voluntários.
Formulação Teste Formulação Referência
C
max
(µg*mL
-1
)
T
max
(h)
AUC
0-10h
(µg*h*mL
-1
)
AUC
0-
(µg*h*mL
-1
)
t
1/2
(h)
C
max
(µg*mL
-1
)
T
max
(h)
AUC
0-10h
(µg*h*mL
-1
)
AUC
0-
(µg*h*mL
-1
)
t
1/2
(h)
Média
5,60 2,04 15,30 15,66 1,02 6,10 1,91 15,66 16,25 0,99
Mínimo
1,45 1,00 4,71 5,03 0,61 4,04 0,67 9,93 10,69 0,66
Máximo
9,63 3,00 22,93 23,42 1,90 9,39 3,00 21,82 22,92 1,90
D.P.
1,85 0,74 3,94 3,92 0,28 1,25 0,74 3,55 3,58 0,28
CV(%)
32,97
36,05
25,77 25,04 26,90 20,50 38,74 22,68 22,06 28,48
133
0 2 4 6 8 10
0
1
2
3
4
5
Referência
Teste
Tempo (h)
Amoxicilina (ug/mL)
Figura 16. Gráfico da curva de concentração plasmática (µg/dL) versus tempo (h) da
amoxicilina. Representa a média das concentrações plasmáticas obtidas após a
administração de duas formulações de Amoxicilina 500 mg em volutários sadios.
A concentração plasmática máxima observada (C
max
) e o tempo para
obter esta concentração (T
max
) foram obtidos diretamente da curva. A área sob a
curva de concentração plasmática versus tempo de (AUC
0-h
) foi calculada através do
método trapezoidal. A extrapolação dessa área para o infinito (AUC
[0-∞]
) foi feita
adicionando o valor da relação C
0-h
/K (onde C
0-h
é a concentração plasmática obtida
da última coleta e K, que é a constante de eliminação) a AUC
0-h
(Tabela 5).
Tabela 5 - Média, IC (90%) e conclusão para a razão das médias de C
max
, AUC
0-ult h
e AUC
0-
Dados transformados em logaritmo natural.
Razão:
Amoxicilina /
Amoxil
Média
Geométrica
IC (90%) CV (%) Bioequivalência
C
max
87,362 (76,46 – 99,82) 27,362 Não
AUC
0-ult h
97,388 (88,00 – 107,78) 20,661 Sim
AUC
0-
95,223 (87,05 – 104,17) 18,260 Sim
Na Tabela 5 notamos que o coeficiente de variação intraindividual para
C
max
foi de 27,362%, acima de 20%, o que determinou um intervalo de confiança
(90%) além dos limites permitidos (80 a 125%), estando em desacordo com o que
preconiza a legislação vigente. A análise estatística da AUC
0–t
, AUC
0–∞
e C
max
134
revelaram que não houve bioequivalência entre as 2 formulações. A Food and Drug
Administration (FDA) propõem que formulações farmacêuticas sejam consideradas
bioequivalentes quando a razão das médias de C
max
e AUC
(0-t)
apresentarem-se
entre 80–125% (considerando um intervalo de confiança de 90%) (FDA, 1985; FDA,
1993).
CAPÍTULO 2: Norfloxacino
Norfloxacino [1-etil-6-fluoro-1, 4-dihidro-4-oxo-7-(1-piperazinil)-3-ácido
quinolinocarboxilico] é um antimicrobiano fluoroquinolona droga da classe cujo
espectro de atividade inclui tanto gram-negativas e bactérias gram-positivas. É
frequentemente prescrito na prática médica para o tratamento de infecções
sistêmicas. Norfloxacino é administrado por via oral, como comprimidos revestidos
por película contendo 400 mg. Nesta dose, a concentração plasmática máxima
(C
max
), varia de 1,6 a 2,87 mg/mL (SETH et al., 1995).
Métodos cromatográficos têm sido descritos para a determinação
quantitativa do norfloxacino em fluidos biológicos. A maioria dos métodos para a
determinação quantitativa do norfloxacino inclui a cromatografia líquida de alta
eficiência com detecção ultravioleta (CÓRDOBA-BORREGO et al., 1999;
SAMANIDOU et al., 2003; SHERVINGTON et al., 2005; MYERS; BLUMER, 1987;
PISTOS et al., 2005) ou de fluorescência (HUSSAIN et al., 1995; HAN et al., 2005;
MASCHER; KIKUTA, 1998; WELL et al., 1998). No entanto, quando os critérios, tais
como a sensibilidade e especificidade, necessitam ser assegurados para análise de
rotina, a cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) com
detecção fluorimétrica é especialmente vantajosa. Esses métodos, as concentrações
de norfloxacino nem sempre eram detectáveis em pequenas amostras de plasma
(0,5-1 ml). Este fato os tornou impróprios devido o tempo de curso da análise, nos
casos em que pequenos volumes de plasma são utilizados (estudos
farmacocinéticos experimentais em animais ou crianças). Um menor volume
plasmático foi utilizado por Saramanidou et al. (2003) (50 µL) e Hussain et al. (1995)
(150 µL), mas com tempo de retenção do norfloxacino de 7,4 e 6,9 minutos,
135
respectivamente. Estes tempo de retenção relativamente longos do norfloxacino não
são adequados para a quantificação de um número elevado de amostras.
O presente método não é totalmente diferente daqueles descritos no
parágrafo anterior, porém combina menor volume plasmático, curto tempo de
retenção, um simples processo de extração através de precipitação das proteínas
plasmáticas, boa sensibilidade, exatidão, precisão e linearidade.
1 ETAPA CLÍNICA
O estudo foi delineado, de forma a permitir que se obtenham os
parâmetros farmacocinéticos relevantes para a comparação estatística, visando a
averiguação de biodisponibilidade. No caso em estudo, tais parâmetros foram
obtidos diretamente a partir da determinação da concentração plasmática de
norfloxacino, baseado na aplicação de um modelo não-compartimental próprio para
avaliação destas concentrações, após a administração do medicamento por via oral.
Por conseguinte, a finalidade primária da Etapa Clínica foi a coleta de
amostras de sangue dos voluntários para medir (na Etapa Analítica) níveis
plasmáticos das substâncias após sua administração oral.
O desenho consistiu de um estudo aberto, randomizado, com replicação,
de 24 voluntários sendo doze homens e doze mulheres não grávidas. O número de
voluntários sadios deve sempre assegurar poder estatístico suficiente para garantir a
confiabilidade dos resultados do estudo (BRASIL, 2003b). O termo voluntário normal
ou sadio deve ser interpretado como indivíduo adulto, sem anormalidades clínico-
laboratoriais capazes de prejudicar a interpretação do experimento ou aumentar a
sensibilidade do indivíduo ao potencial tóxico do fármaco em estudo. A idade variou
entre 18 e 48 anos (28,42 8,29 anos), altura variando de 152 a 177 cm (165,50
7,98 cm) e índice de massa corporal médio de 23,44 ± 2,43 kg/m2.
Os voluntários qualificados para participar do estudo foram internados por
02 períodos de aproximadamente 36 horas, com 7 dias de intervalo entre os
136
internamentos, para garantir que não houvesse um efeito residual do primeiro
fármaco administrado, que poderia inflar ou alterar artificialmente os resultados do
segundo e assim por diante (HOWARD et al., 2000).
O órgão responsável pelos medicamentos genéricos no Brasil, Agência
Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA, determina que o cronograma de coletas
das amostras sanguíneas deverá contemplar tempo igual ou superior a 3 a 5 vezes
meias-vidas de eliminação do fármaco ou metabólito ativo (BRASIL, 2003b). Deve-
se incluir o maior número possível de amostras na região próximo a concentração
máxima atingida para que possibilite a determinação da área sob a curva de
concentração sangüínea (BRASIL, 2003a). Amostras sangüíneas para a
determinação dos níveis plasmáticos dos fármacos foram obtidas antes da
administração (tempo zero e pool) e após a administração, seguindo o seguinte
esquema:
Norfloxacino → 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 240, 360, 480, 600,
720, 1080, 1440 minutos.
2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO PARA
QUANTIFICAÇÃO DA NORFLOXACINO
2.1 Otimização dos procedimentos gerais
Entre as diferentes técnicas possíveis de detecção que pode ser acoplado
a RP-HPLC para a determinação das fluoroquinolonas, a detecção
espectrofluorométrica foi superior à detecção no ultravioleta em métodos
bioanalíticos com desempenho satisfatório de seletividade e sensibilidade
(CÓRDOBA-BORREGO et al., 1999; HUSSAIN et al., 1995; HAN et al., 2005;
MASCHER; KIKUTA, 1998; WELL et al., 1998). As fluoroquinolonas, norfloxacino e
ciprofloxacino, são estruturas homólogas, classificadas como anfóteros que
apresentam propriedades semelhantes no tempo de retenção (PILORZ; CHROMA,
2004) que pode ser influenciado pela sua propensão para formar interações não
hidrofóbicas com o material de sílica gel da fase estacionária (PISTOS et al., 2005).
137
De acordo com Pilorz e Chroma (2004), deve-se ter em mente que a dissociação
dos analitos, bem como a troca iônica com silanois, são importantes fatores a serem
controlados durante a análise cromatográfica de fluoroquinolonas.
No presente trabalho foi desenvolvido e validado um método de HPLC-RP
com detecção fluorométrica de norfloxacino em plasma. O método foi aplicado com
sucesso no estudo de bioequivalência de duas formulações, referência e teste, de
norfloxacino 400 mg em voluntários sadios. Os cromatogramas livres de analitos
apresentaram ausência de interferentes endógenos da matriz ao longo da janela de
eluição para norfloxacino e padrão interno (figura 17A). Interferentes potenciais de
fármacos que são comumente administrados concomitantemente com o
norfloxacino, como amoxicilina, ainda não foram testadas. As condições
cromatográficas foram escolhidas para uma boa separação de norfloxacino e do
padrão interno (ciprofloxacino) de picos endógenos no plasma. Com o uso da coluna
de alta eficiência Synergi MAXRP C12, com 25% a mais de silanois livres que a C18
convencional, foi possível obter uma separação satisfatória (fator de resolução =
1,99) dos picos de norfloxacino e padrão interno utilizando uma fase móvel
consistida de acetonitrila–fosfato de potássio monobásico (pH, 3,0; 25 mM). Os
tempos de retenção do norfloxacino e ciprofloxacino foram 4,33 e 4,83 minutos,
respectivamente. A resolução da linha de base foi alcançada em 7 minutos. O perfil
cromatográfico (figura 17B) obtido nas condições estabelecidas foi semelhante ao
demonstrado por Vybíralová e colaboradores (2005), mas com uma melhor
separação dos analitos e com a vantagem do tempo de retenção ser cerca de 3
vezes mais curto, sem necessidade de gradiente de eluição.
138
Figura 17. Cromatografia de amostra de plasma branco extraído (A) e de plasma
contaminado contendo norfloxacino (90 ng/mL) e padrão interno (B).
Comparando nossos resultados com os de Espinosa-Mansilla e
colaboradores (2005), que utilizaram um maior volume de plasma (1 mL) que o
utilizado no desenvolvimento do método (0,2 mL), descobrimos que o presente
método apresenta melhor separação de picos e um menor tempo de retenção.
Minutes
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Volts
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
(Norfloxacin)
(Ciprofloxacin)
RF10Axl (Ex:300nm, Em:450nm)
BRANC O
E0106DCD08 005
Name
Retention Time
Area
A
Minutes
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Volts
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.425 567
Norfloxacin 4.334 41738
Ciprofloxacin 4.831 474316
RF10Axl (Ex:300nm, Em:450nm)
CQB Norf loxacino 90 ng/mL em PE
E0106DCD08 035
Name
Retention Time
Area
B
139
2.2. Linearidade do Método
O método descrito foi validado de acordo com as recomendações
internacionalmente aceitas para métodos bioanalíticos (HUBERT et al., 1999; SHAH
et al., 2000).
A curva de calibração, definida em três corridas analíticas em duplicata,
foi linear na faixa de concentração de 30 a 3500 ng/mL para o norfloxacino em
plasma, com todos os coeficientes de correlação maiores que 0,99. A linearidade foi
definida pela equação: y = 985,11x – 2,52151, onde y representa a relação da altura
do pico do norfloxacino e padrão interno e x representa a relação da concentração
(Figura 18).
Figura 18. Representação gráfica da curva de calibração y = 985,11x – 2,52151, r
2
=
0,999493.
O limite de quantificação (LQ), definido como o menor ponto da curva de
calibração com precisão e exatidão (tabela 10), é de grande importância em estudos
farmacocinéticos. O LQ do norfloxacino foi de 30 ng/mL. Este limite é quase 2% da
concentração máxima esperada (C
max
) do norfloxacino após uma dose padrão (400
mg) na farmacocinética humana e, portanto, apropriado para estudos de
biodisponibilidade/bioequivalência. O LQ obtido no presente estudo foi semelhante
ao obtido por Mascher e Kikuta (31 ng/mL), Samanidou e colaboradores (30 ng/mL)
140
e Hussain e colaboradores (25 ng/mL) com volumes de injeção de 20 e 50 µl, ou
seja, 2 e 5 vezes maior que o aplicado (10 µl).
2.3 Precisão e exatidão do método
Os testes de precisão do presente método, o qual foi confirmado a
recuperação e análise intra e interlote, foi comparável com métodos anteriores
(CÓRDOBA-BORREGO et al., 1999; MYERS; BLUMER, 1987; HUBERT et al.,
1999; ABANMI et al., 1996), O percentual do coeficiente de variação representa as
medidas de precisão. Os dados de precisão e exatidão intra e interlote para o
norfloxacino estão resumidos na tabela 6. A validação apresentou uma excelente
precisão e exatidão para todas as concentrações (30, 90, 1400 e 2800 ng/mL) de
norfloxacino.
Tabela 6 – Dados de precisão e exatidão intra e interlote para o norfloxacino na
validação em plasma.
Intralote LQ CQB CQM CQA
Concentração Nominal (ng ml
-1
) 30 90 1400 2800
Média ± DP 28,7 ± 0,27 90,2 ± 1,35 1450,6 ± 18,29 2873,9 ± 28,99
Exatidão (%) 95,8 100,2 103,6 102,6
Precisão (%) 0,9 1,5 1,3 1,0
Interlote
Média ± DP 29,8 ± 2,58 93,7± 3,91 1447,7 ± 41,83 2819,8 ± 63,54
Exatidão (%) 99,5 104,1 103,4 100,7
Precisão (%) 8,6 4,2 2,9 2,3
2.4 Recuperação do método
A recuperação das amostras, a qual envolve precipitação de proteínas
com acetonitrila, foi próxima a 100%. A recuperação média relativa do norfloxacino
bem como do padrão interno (ciprofloxacino) em plasma, determinada com 5
replicatas de cada nível (90, 1400 e 2800 ng/mL), estão resumidos na tabela 7. A
recuperação obtida com o método desenvolvido foi maior que a relatada por Hussain
141
et al. (1995) (87%) ou Mascher e Kikuta (1998) (88%) para norfloxacino na mesma
faixa de concentração. Em seus estudos, o pré-tratamento da amostra envolveu
precipitação de proteína com ácido tricloroacético ou acetonitrila (0,5 mL). O grande
volume de acetonitrila (1,6 mL) usado no presente estudo foi provavelmente
responsável (parcialmente, pelo menos) pelo aumento observado na recuperação.
Tabela 7 – Recuperação do norfloxacino e ciprofloxacino em plasma.
Norfloxacino
Concentração Nominal
(ng ml
-1
)
Não-extraído
Média ± DP
Extraída
Média ± DP
Recuperação
(n=15)
Média (%)
CV (%)
90 89,5 ± 2,2 92,6 ± 3,1 103,5 1,9
1400 1423,1 ± 84,5 1424,4 ± 28,6 100,2 2,9
2800 2855,5 ± 96,1 2918,1 ± 43,3 102,2 1,7
Ciprofloxacino
Concentração Nominal
(ng ml
-1
)
Não-extraído
Média ± DP
Extraída
Média ± DP
Recuperação
(n=15)
Média (%)
CV (%)
90 85,6 ± 3,7 88,9 ± 6,3 104,4 7,4
1400 1322,9 ± 64,0 1311,9 ± 61,7 99,2 2,8
2800 2651,8 ± 101,0 2688,1 ± 61,0 101,4 1,5
2.5 Estudos de estabilidade do método
A determinação da estabilidade do norfloxacino foi realizada analisando
as soluções de trabalho, bem como, amostras obtidas imediatamente, horas ou dias
subsequentes ao período de estoque. Todas as amostras (n=5) foram analisadas
usando amostras recém-preparadas da curva de calibração. Nenhuma alteração na
concentração do norfloxacino foi detectada na solução de trabalho após 30 dias de
armazenamento com a proteção da luz em 8ºC. No estudo de estabilidade pós-
processamento, nenhuma degradação significativa pode ser observada em amostras
resfriadas no autoinjetor por 92 horas. Os resultados mostraram que as áreas dos
picos de norfloxacino permaneceram praticamente inalteradas e picos extras não
foram observados no período estudado. Na análise de 3 conjuntos de amostras de
plasma contaminados com concentrações baixa (90 ng/mL), média (1400 ng/mL) e
alta (2800 ng/mL) de norfloxacino, foram preparados e estocados à 18ºC e
submetidos à 3 ciclos de congelamento e descongelamento. Os dados
142
demonstraram que as amostras de plasma podem sofrer congelamento e
descongelamento pelo menos 3 vezes antes das análises. Além disso, também foi
avaliada a estabilidade de curta duração de amostras de plasma contaminadas,
processadas e estocadas em temperatura ambiente (23ºC) por um período de 15
horas. Nenhuma perda significante de norfloxacino após 15 horas em temperatura
ambiente foi observada. Finalmente, para demonstrar a estabilidade de longa-
duração do norfloxacino, 3 conjuntos de plasma contaminados foram processados e
estocados à -20ºC por 44 dias. A análise das amostras de plasma contaminadas
antes e após estocagem à -20ºC nesse período não mostrou nenhuma perda
significante do analito (P > 0,05). A média e o desvio padrão (%) calculados para os
diferentes estudos de estabilidade estão demonstrados na tabela 8.
Tabela 8 – Teste de estabilidade (teste de estabilidade pós-processamento,
estabilidade congelamento e descongelamento, estabilidade de curta (15 horas) e
longa duração (44 dias). Número de replicatas: n = 5.
Teste de estabilidade pós-processamento (valor em ng/mL)
Valor de
Referência
Valor após
92h
Valor de
Referência
Valor após
92h
Valor de
Referência
Valor após 92h
CQB CQM CQA
Média 90.13 87.58 1418.73 1389.17 2760.08 2736.15
CV (%) 4.4 0.8 2.6 0.4 2.1 1.0
Variação -2.8 -2.1 -0.9
Teste de estabilidade congelamento e descongelamento (valor em ng/mL)
Valor de
Referência
Valor após
3 ciclos
Valor de
Referência
Valor após
3 ciclos
Valor de
Referência
Valor após 3
ciclos
CQB CQM CQA
Média 93.953 90.118 1447.215 1350.090 2814.286 2659.866
CV (%) 0.8 1.7 0.8 1.3 2.1 1.2
Variação -4.1 -6.7 -5.5
Teste de estabilidade acima de 15 dias (valor em ng/mL)
Valor de
Referência
Valor após
15h
Valor de
Referência
Valor após
15h
Valor de
Referência
Valor após 15h
CQB CQM CQA
Média 97.855 89.550 1409.439 1333.393 2767.454 2626.622
CV (%) 2.7 1.4 3.5 1.0 1.3 0.6
Variação -8.5 -5.4 -5.1
Teste de estabilidade acima de 44 dias (valor em ng/mL)
Valor de
Referência
Valor após
44 dias
Valor de
Referência
Valor após
44 dias
Valor de
Referência
Valor após 44
dias
CQB CQM CQA
Média 89.16 78.66 1375.96 1225.99 2742.21 2475.63
CV (%) 1.2 0.3 1.7 2.5 1.0 1.9
Variação -11.8 -10.9 -9.7
143
3 APLICAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO EM ESTUDO DE
BIOEQUIVALÊNCIA ENTRE DUAS FORMULAÇÕES CONTENDO
NORFLOXACINO (COMPRIMIDO DE 400MG) EM VOLUNTÁRIOS SADIOS
O ensaio foi aplicado para avaliar a biodisponibilidade de dois produtos
contendo 400 mg de norfloxacino, a fim de determinar se as formulações teste
produzida pela Pharmascience Laboratórios Ltda e referência produzida pela Merck
Sharp & Dohme Farmacêutica Ltda não são bioequivalentes em 24 voluntários. As
curvas de concentração plasmática média da amoxicilina após administração oral da
formulação teste e referência versus tempo estão apresentadas na figura 19. As
concentrações plasmáticas do norfloxacino se mantiveram na faixa padrão e acima
do limite de quantificação de 30 ng/mL por todo o período de quantificação.
0 5 10 15 20 25
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Time post-dose (h)
Comcentration (ng/mL)
Figura 19. Gráfico da curva de concentração plasmática (ng/mL) versus tempo (h)
de norfloxacino. Representa a média das concentrações plasmáticas obtidas após a
administração de duas formulações de norfloxacino 400 mg em volutários sadios.
Os parâmetros farmacocinéticos referentes às formulações teste e
referência estão descritos na tabela 9. A análise estatística da AUC
0–t
, AUC
0–∞
e
C
max
revelou que não houve bioequivalência entre as 2 formulações. A Food and
Drug Administration (FDA) propôs que formulações farmacêuticas sejam
Referência
Teste
144
consideradas bioequivalentes quando a razão das médias de C
max
e AUC
(0-t)
apresentarem-se entre 80–125% (considerando um intervalo de confiança de 90%)
(FDA, 1985; FDA, 1993). Entretanto, as 2 formulações não foram consideradas
bioequivalentes.
Tabela 9 – Resultados das análises de bioequivalência para relação teste/referência
após transformação logarítmica para os parâmetros AUC
0-∞
, AUC
(0-24h)
e C
max
.
Análise Estatística
Parâmetro de Análise
Teste/Referência
Média Geométrica
Intervalo de confiança
90% (80-125%)
Bioequivalência
AUC
0-∞
([ng.h]/mL) 91,121 (76,33 – 108,78) Não
AUC
(0-24h)
([ng.h]/mL) 90,497 (74,59 – 109,79) Não
C
max
(ng/mL) 92,879 (76,43 – 112,86) Não
CAPÍTULO 3: Oxcarbazepina
Nas últimas décadas várias fármacos antiepilépticos (Gabapentina,
Clobazan, lamotrigina e topiramato), foram introduzidos no mercado, entre os quais
a oxcarbazepina (10,11-dihidro-10-oxo-5H-dibenzo-[b, f] azepina-5-carboxamida) um
análogo da carbamazepina, que não se diferenciam em termos de eficácia
farmacológica, porém mostra menos efeitos colaterais indesejados, em comparação
com os tradicionais fármacos antiepilépticos (GLAUSER, 2001; CASTILLO et al.,
2000; VAN BELLE et al., 1995).
Oxcarbazepina (OXC) é considerada eficaz, não só como fármaco de
primeira escolha, bem como na terapia coadjuvante da epilepsia parcial (SALLAS et
al., 2003; LEVERT et al., 2002a). Atua principalmente na promoção da estabilização
das membranas excitáveis, por meio do bloqueio de canais voltagem-dependentes
canais de sódio (MAURER et al., 2002; SHORVON, 2000). Em humanos OXC é
rapidamente metabolizada por enzimas citosólicas no fígado para seu metabólito
ativo não-tóxico (10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina (MHD), que predomina no
plasma após administração oral, em comparação com OXC (ROUAN et al., 1994;
145
FLESCH, 2004; GONZALEZ-ESQUIVEL et al., 2000; SCHUTZ et al., 1986), e
mostram uma farmacocinética linear (MAY et al., 2003; SALLAS et al., 2003). Assim,
a identificação, separação e quantificação de OXC e MHD, seu metabólito
clinicamente relevante, é essencial para investigação e monitorização terapêutica de
medicamentos biologicamente relacionados, bem como, estudos de bioequivalência.
No passado, os métodos mais comumente utilizados para a determinação
de OXC e MHD em amostras biológicas envolviam a cromatografia em fase gasosa
(VON UNRUH; PAAR, 1985; VON UNRUH; PAAR, 1986). Atualmente, a
cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à detecção ultravioleta (VAN BELLE
et al., 1995; LEVERT et al., 2002a; ROUAN et al., 1994; GONZALEZ-ESQUIVEL et
al., 2000; MILES et al., 2004; LEVERT et al., 2002b) tem sido amplamente utilizada
para a quantificação simultânea de OXC e MHD em fluidos biológicos. Contudo, a
limitação comumente discutida de todos estes métodos de determinação de
fármacos antiepilépticos é o fato da existência da grande similaridade (propriedades
físico-químicas e estruturas) existente entre estes compostos (LEVERT et al.,
2002a). Por outro lado, geralmente não é comum a descrição da determinação
simultânea de OXC e MHD em plasma humano utilizando CLAE seguido de
separação seletiva por detecção de espectrometria de massa. Dois métodos foram
descritos para a quantificação simultânea de OXC e seu metabólito ativo (MHD) em
plasma humano por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa com
ionização química por pressão atmosférica (MAURER et al., 2002) ou ionização por
electrospray (BRETON et al., 2005) com um limite de quantificação (LQ) de 100
ng/ml e 300 e 400 ng/ml para OXC e MHD, respectivamente.
Desenvolveu-se um método seguro, rápido, sensível e seletivo utilizando
LC-MS/MS para quantificação simultânea de OXC e MHD no plasma humano com
menor LQ (20 e 40 ng/ml para OXC e MHD, respectivamente), que combina menor
volume de amostra de plasma, curto tempo de retenção e um simples preparo de
amostra, com precisão e exatidão adequadas.
146
1 ETAPA CLÍNICA
O estudo foi delineado, de forma a permitir que se obtenham os
parâmetros farmacocinéticos relevantes, visando a averiguação do perfil
farmacocinético. No caso em estudo, tais parâmetros foram obtidos diretamente a
partir da determinação da concentração plasmática de OXC e MHD, baseado na
aplicação de um modelo não-compartimental próprio para avaliação destas
concentrações, após a administração do medicamento por via oral.
Por conseguinte, a finalidade primária da Etapa Clínica foi a coleta de
amostras de sangue dos voluntários para medir (na Etapa Analítica) níveis
plasmáticos das substâncias após sua administração oral.
O desenho consistiu de um estudo aberto, sem replicação, de 8
voluntários sendo 4 homens e 4 mulheres não grávidas. O termo voluntário normal
ou sadio deve ser interpretado como indivíduo adulto, sem anormalidades clínico-
laboratoriais capazes de prejudicar a interpretação do experimento ou aumentar a
sensibilidade do indivíduo ao potencial tóxico do fármaco em estudo. A idade variou
entre 21 e 46 anos (22,75 8,91 anos), altura variando de 157 a 179 cm (147,38
0,09 cm) e índice de massa corporal médio de 20,25 ± 2,86 kg/m
2
.
Os voluntários qualificados para participar do estudo foram internados por
01 período de aproximadamente 24 horas. Amostras sangüíneas para a
determinação dos níveis plasmáticos dos fármacos foram obtidas antes da
administração (tempo zero e pool) e após a administração, seguindo o seguinte
esquema:
OXC e MHD → 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360,
390, 420, 450, 480, 600, 720, 1440 e 2880 minutos.
147
2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO PARA
QUANTIFICAÇÃO DA OXCARBAZEPINA
2.1 Otimização dos procedimentos gerais
No presente trabalho foi desenvolvido e validado um método para
quantificação de OXC e MHD em plasma. As condições cromatográficas e
parâmetros de espectrometria de massa foram otimizadas tal que a resultante de
cromatogramas MRM extraídos apresentaram todas as áreas integradas e relações
sinais-ruídos consistentes (S/N > 15) para OXC, MHD e padrão interno. Usando uma
coluna analítica Phenomenex Luna C
18
5µm (150mm×4,6 mm), foi possível obter
uma resolução de picos satisfatória para OXC, MHD e padrão interno utilizando uma
fase móvel constituída de acetonitrila-água (50:50 v/v) + 20mM ácido acético.
As estruturas químicas bem como o espectro de massa (íon precursor e
fragmento) dos analitos e padrão interno estão apresentados na figura 20. Vários
íons fragmento foram observados no produto dos íons para os analitos e padrão
interno. Os principais íons fragmentos em m/z 208, m/z 194 e m/z 204 foram
escolhidos na aquisição do MRM para OXC, MHD e padrão interno,
respectivamente.
148
Figura 20. Full-scan dos espectros dos íons fragmento de [M+H]+ e as estruturas da
(a) OXC, (b) MHD e (c) d10-carbamazepina.
149
Cromatogramas MRM de amostra de plasma branco e contaminado com
OXC, MHD e padrão interno submetidos ao procedimento extração líquido-líquido
estão representados na figura 21A e 21B, respectivamente. Um cromatograma de
uma amostra de voluntário após administração de OXC suspensão oral (6%) está
representado na figura 21C. Sob as condições do método proposto, nenhuma
interferência (efeito matriz) foi observada de compostos endógenos após a extração
de amostras de plasma contaminadas ao longo do tempo de eluição e encontraram-
se tempos de retenção de 2,44 ± 0,3, 1,87 ± 0,3 e 2,89 ± 0,2 minutos para OXC,
MHD e padrão interno, respectivamente. Não se observou efeito de cross-talk no
tempo de retenção dos compostos, demonstrado, dessa forma, boa seletividade.
150
Figura 21. Cromatogramas MRM: (a) uma amostra de plasma em branco, (b) uma
amostra de plasma branco contaminada com OXC (20 ng / ml) e MHD (40 ng / ml),
(c) um voluntário amostra 1,5 h após a administração oral de OXC suspensão (6%)
em voluntários saudáveis. Picos I-III referem-se ao MHD, OXC e PI,
respectivamente.
151
Foram publicados dois métodos para quantificação simultânea de OXC e
seu metabólito ativo (MHD) em plasma por cromatografia líquida acoplada a
espectrometria de massa (MAURER et al., 2002; BRETON et al., 2005). O primeiro
método (MAURER et al., 2002) foi concluído com êxito, porém envolve um prévio
tratamento das amostras biológicas e eluído por gradiente, de modo que o tempo
total de análise (a partir do pré-tratamento até a análise no equipamento) é maior,
existindo outras desvantagens, tais como: (1) maior volume de plasma (0,2 mL) em
relação ao presente método (0,1 ml). Um menor volume de amostra é especialmente
vantajoso quando em estudos farmacocinéticos em crianças; (2) a corrida analítica é
cerca de duas vezes maior (em torno de 6 minutos) do que a verificada no presente
método (3,5 minutos). Comparando com o segundo método (VOLOSOV et al.,
1999), observa-se que também há necessidade de utilização de gradiente de
eluição, maior volume de amostra (0,3 ml) e um tempo de retenção maior para OXC
(em torno de 18 minutos) e MHD (em torno de 12 minutos), em comparação com
aqueles encontrados no presente estudo para OXC (2,44 minutos) e MHD (1,87
minutos). Foi utilizada no estudo uma simples etapa no método de extração com
éter-diclorometano antes da corrida analítica, realizada com fase móvel isocrática.
Deve-se considerar que um rápido processo de extração é um fato importante para
análise de rotina. Além disso, é sabido que um método isocrático é geralmente
preferido por causa da sua conveniência, simplicidade e reprodutibilidade. Assim, o
presente método tem suficiente seletividade e pode ser aplicado com sucesso para a
quantificação da OXC e MHD em amostras de plasma. O procedimento
relativamente simples de preparação das amostras e um curto tempo de análise
cromatográfica apresentada permitem um grande número de quantificações de
amostras (150 a 200 amostras por dia).
2.2 Linearidade do método
A qualidade dos dados bioanalíticos é dependente da boa obtenção e
interpretação da curva de calibração. O teste de homoscedasticidade é um passo
importante a ser tomado no estudo da curva de calibração para verificar variâncias
dos dados (ALMEIDA et al., 2002). Neste estudo, o teste de homoscedasticidade foi
realizado plotando resíduo versus concentração obtida no ensaio intralote por HPLC-
152
MS/MS e mediante aplicação de um teste-F (CARDONE et al., 1990). Uma vez que
os dados apresentaram variância não-uniforme, o método de regressão com
diferentes pesos (1/x, 1/x
2
, 1/y e 1/y
2
) foi usado para escolher o menor percentual do
erro relativo da curva de calibração. De acordo com estas circunstâncias, o fator
escolhido foi 1/x
2
(tabela 10). Assim, as curvas de calibração foram definidas pela
equação: y = 0,00568 + 0,00296x−5,70−8x
2
para OXC e y = 0,00749 +
0,00178x−5,70−8x
2
para MHD, onde y é a relação das áreas dos picos do
analito/padrão interno e x é a concentração (ng/ml) do analito. Todos os coeficientes
de correlação (r
2
) foram próximos a 1 (0,9986 a 0,9994).
Tabela 10 – Precisão e exatidão intralote das curvas de calibração.
Concentração
plasmática (ng/ml)
Concentração calculada
(Média±DP)(ng/ml)
RSD (%)
(n=3)
Intralote
RE (%)
OXC
20 19,99 ±0,26 1,31 -0,05
750 768,82 ±16,46 2,14 2,51
1500 1558,17 ±25,50 1,64 3,88
2250 2115,04 ±62,20 2,94 -6,00
3000 3040,24 ±198,16 6,52 1,34
3750 3400,62 ±74,78 2,20 -9,32
4500 4659,85 ±120,48 2,59 3,55
5250 5469,95 ±51,35 0,94 4,19
Soma RE(%)
0,1
MHD
40 39,98 ±1,90 4,76 -0,05
1500 1529,95 ±18,82 1,23 2,00
3000 3086,33 ±56,46 1,83 2,88
4500 4260,31 ±231,44 5,43 -5,33
6000 6111,70 ±298,49 4,88 1,86
7500 6999,86 ±220,81 3,15 -6,67
9000 9123,15 ±477,68 5,24 1,37
10500 10935,65 ±200,52 1,83 4,15
Soma RE (%)
0,2
153
2.3 Precisão e exatidão do método
Os dados para precisão e exatidão intra e interlote para OXC e MHD
estão resumidos na tabela 11. Os erros relativos dos valores variam entre 1,7 e
4,5% e o desvio padrão relativo (% R.S.D.) de 0,15 a 7,1% para ambos compostos e
as amostras dos controles de qualidade apresentaram bom ajuste individual para a
linha de regressão aplicada.
Tabela 11 – Precisão e exatidão na quantificação de OXC e MHD em amostras de
plasma (análise de amostras de plasma contaminado em quatro concentrações
diferentes).
Intralote Interlote
Concentração
Plasma (ng/ml)
Concentração
calculada
(Média±DP) (ng/ml)
RSD
(%)
(n=8)
RE(%)
Concentração
calculada (Média±DP)
(ng/ml)
RSD
(%)
(n=8)
RE(%)
OXC
20 19,86 ±0,86 4,3 0,7 20,11 ±0,24 1,2 0,5
60 64,3 ±1,56 2,4 7,1 63,1 ±3,44 4,2 5,2
2000 2050,9 ±43,54 2,1 2,5 2050,3 ±84,12 2,9 2,5
4000 3804,6 ±114,4 3,0 −4,9 3880,2 ±282,29 2,3 −3,0
MHD
40 38,04 ±2,34 6,2 −4,9 38,586 ±2,01 5,2 −3,5
120 119,5 ±4,48 3,7 −0,41 119,7 ±5,30 4,4 −0,25
4000 3919 ±67,34 1,7 −2,0 4006,5 ±137,04 3,4 0,15
8000 7487,4 ±318,68 4,3 6,4 7736,6 ±350,89 4,5 −3,29
O limite de quantificação baseado no R.S.D. (%) e RE (%) foi 20 e 40
ng/ml para OXC e MHD, respectivamente. Este limite foi próximo a 1% da
concentração máxima (C
max
) de OXC e 2% para MHD, sendo suficiente para
realização dos estudos de biodisponibilidade. Comparando com os valores de LQ
obtidos por métodos anteriormente publicados utilizando cromatografia por ionização
química (MAURER et al., 2002) ou espectrometria de massa por electrospray
(BRETON et al., 2005), revela que o presente método é cerca de 5 e 20 vezes mais
sensível. Valores menores de LQ (1 ng/ml) foram registrados em estudos
envolvendo quantificação de OXC e MHD por LC-MS/MS em amostras de
154
microdialisis (LANCKMANS et al., 2006), porém deve-se ter em mente que essas
amostras estão livres de endógenos e proteínas, não sendo necessário o preparo
das amostras para análise. Pienimaki e colaboradores (PIENIMAKI et al., 1995)
publicaram um método por HPLC-UV que atingiram valores de LQ (55 e 24 ng/ml
para OXC e MHD, respectivamente) próximo ao do presente estudo, porém exige
um volume maior de amostra (500 µl) com dispendioso e trabalhoso tempo de
preparo. Calculou-se também a sensibilidade teórica do método proposto, para OXC
e MHD, estimando que com uma amostra de 100 µl, com reconstituição em 100 µl
de acetonitrila, volume de injeção de 5 µl e LQ de 20 ng/ml para OXC e 40 ng/ml
para MHD encontrou-se 100 pg e 200 pg, respectivamente. Isto representa um
considerável aumento da sensibilidade, em comparação com outros métodos
similares. Assim, estes aspectos refletem algumas vantagens do presente método
sobre os demais publicados anteriormente.
2.4 Recuperação do método
As recuperações relativas de OXC e MHD determinadas em três
concentrações diferentes (CQB, CQM e CQA) foram 105,4, 89,2 e 92,8%, e 88,4,
88,7 e 90,6%, respectivamente, sendo a média geral da recuperação de 95,8% para
OXC e 86,7% para MHD. Valores de recuperações (117% para OXC e 81% para
MHD) foram registrados por Breton et al. (2005) no intervalo de concentração de 500
a 20000 ng/ml, porém, como já mencionado, utilizando amostras de plasma com
maior volume de amostra (0,3 ml). No intervalo de concentração de 10 a 35 ng/ml e
utilizando uma amostra de plasma (0,2 mL) com pré-tratamento muito mais
complexo que o do presente estudo, Maurer e colaboradores (2002) relataram
recuperações de 59,6 a 79,2% para OXC e 57,4 a 63.9% para MHD. Assim, o
método proposto apresentou uma melhor recuperação para amostras de plasma
através da aplicação de um simples processo de extração e com menor tamanho de
amostra (0,1 ml).
155
2.5 Estudos de estabilidade do método
A análise da estabilidade da OXC e MHD foi realizada analisando as
soluções de trabalho, bem como, amostras imediatamente, horas ou dias
subsequentes do período de estoque. Todas as amostras (n=5) foram analisadas
usando amostras recém-preparadas da curva de calibração. Nenhuma alteração na
concentração da OXC e MHD foi detectada na solução de trabalho após 1 mês de
armazenamento com a proteção da luz em 8ºC. No estudo de estabilidade pós-
processamento, nenhuma degradação significativa pode ser observada em amostras
resfriadas (8ºC) no autoinjetor por 92 horas. Os resultados mostraram que as áreas
dos picos de OXC e MHD permaneceram praticamente inalteradas e picos extras
não foram observados no período estudado. Na análise de 3 conjuntos de amostras
de plasma contaminados (CQB, CQM, CQA) de OXC e MHD, foram preparados e
estocados à 18ºC e submetidos a 3 ciclos de congelamento e descongelamento. Os
dados demonstraram que as amostras de plasma podem sofrer congelamento e
descongelamento pelo menos 3 vezes antes das análises. Além disso, também foi
avaliada a estabilidade curta-duração de amostras de plasma contaminada
processadas e estocadas em temperatura ambiente (23ºC) por um período de 15
horas. Nenhuma perda significante de norfloxacino após 15 horas em temperatura
ambiente foi observada. Finalmente, para demonstrar a estabilidade de longa-
duração do norfloxacino, as amostras foram processadas e estocadas à -20ºC por
30 dias. A análise das amostras de plasma contaminadas antes e após estocagem à
-20ºC nesse período não mostrou nenhuma perda significante do analito (P > 0,05).
Os erros relativos (RE%) calculados para os diferentes estudos de estabilidade
estão demonstrados na tabela 12.
156
Tabela 12 – Estabilidade das amostras de controle de qualidade da OXC e MHD em
plasma sob diferentes condições de estoque (n=5).
OXC (ng/ml) MDH (ng/ml)
60 2000 4000 120 4000 8000
Teste de estabilidade pós-processamento (RE%)
0h 3,6 1,0 5,2 6,6 9,1 8,4
137h 0,8 3,7 3,9 5,1 5,9 6,2
Teste de congelamento e descongelamento (RE%)
0 ciclos 2,6 3,6 3,3 3,6 2,8 2,7
3 ciclos 1,7 2,2 3,3 5,2 2,6 2,2
Teste de estabilidade curta-duração (RE%)
0h 4,2 2,2 5,7 2,4 2,5 3,1
7h 3,3 2,7 7,4 1,2 2,1 3,2
Teste de estabilidade de longa
0 dias 1,2 2,2 2,0 3,5 2,8 1,6
30 dias 2,7 1,0 2,8 1,2 1,0 1,0
3 APLICAÇÃO DO MÉTODO BIOANALÍTICO EM ESTUDO FARMACOCINÉTICO
DE UMA FORMULAÇÃO CONTENDO OXCARBAZEPINA (SUSPENSÃO 6%) EM
VOLUNTÁRIOS SADIOS
Após validação, o método proposto foi aplicado em um estudo piloto para
análise de amostras de plasma retiradas de oito voluntários sadios imediatamente
antes e após 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390, 420, 450,
480, 600, 720, 1440 e 2880 minutos da administração oral de uma dose de 10 ml de
OXC suspensão (6%). O perfil da curva de concentração plasmática média da OXC
e MHD versus tempo está apresentado na figura 22. As concentrações plasmáticas
de OXC e MHD estavam na faixa de concentração normal e reais, acima da
quantificação limite para todo o período de amostragem.
157
Figura 22. Perfil da curva de concentração plasmática média de OXC e MHD versus
tempo após administração de 10 ml de uma suspensão oral de oxcarbazepina (6%)
em voluntário sadios (n=8).
158
CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO
159
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Considerando os dados obtidos, pode-se concluir que os métodos
analíticos propostos oferecem a oportunidade para obter parâmetros
farmacocinéticos com uma adequada precisão e exatidão, pois estão dentro dos
limites necessários exigidos pela legislação para os estudos bioequivalência e
farmacocinéticos. Além disso, os ensaios são rápidos e o tempo da corrida analítica
não ultrapassou os 7 minutos para os três estudos.
A capacidade de manterem-se inalterados em pequenas variações nos
parâmetros caracterizou a robustez dos métodos, possibilitando a intercambialidade
entre laboratórios e doseamento em outros fluidos biológicos. Possuem vantagens
em termos de custos, em comparação com outros métodos descritos, pois utilizam
procedimentos de preparo de amostras relativamente simples sendo desnecessária
a utilização de pré-tratamento em cartuchos e pré-colunas. Nas condições
cromatográficas descritas, as substâncias analíticas foram bem separadas dos
padrões interno com alta sensibilidade e reprodutibilidade.
As limitações da pesquisa são possíveis influências que podem ou não
ser controladas pelo pesquisador. Este tipo de abordagem está relacionado ao
emprego de recursos e técnicas estatísticas que visem quantificar os dados
coletados. No desenvolvimento da pesquisa de natureza quantitativa devem-se
formular hipóteses e classificar a relação entre as variáveis para garantir a precisão
dos resultados, evitando contradições no processo de análise e interpretação.
Assim, foi observada relativa dificuldade quanto à geração, interpretação e análise
dos resultados estatísticos uma vez que esses parâmetros farmacocinéticos foram
processados por empresa (Pharmacience Laboratórios Ltda) especializada e
autorizada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
Os métodos analíticos mostraram-se precisos, pois os coeficientes de
variação para os controles de qualidade, baixo, médio e alto permaneceram abaixo
de 15% e abaixo de 20% para o controle de qualidade com a mesma concentração
160
do limite de quantificação. Verificou-se acurácia, pois os valores médios
permaneceram dentro dos 15% do valor nominal para o controle de qualidade baixo,
médio e alto e não se desviou mais que 20% de limite de quantificação.
Os métodos foram considerados sensíveis, pois os menores limites de
quantificação dos métodos (LQ=0,5 µg/mL; 30ng/mL; 20/40 ng/mL, para amoxicilina,
norfloxacino e OXC/MHD, respectivamente) apresentaram um coeficiente de
variação inferior a 20%.
Os métodos mostraram-se específicos já que não houve interferência nos
tempos de retenção dos picos dos analitos superior a 20% da resposta do limite de
quantificação.
A estabilidade dos métodos foi assegurada, através dos testes de
congelamento e descongelamento, onde se verificou não haver degradação devido à
temperatura, em 3 ciclos de congelamento e descongelamento, bem como no pós-
processamento, curta e longa duração de estocagem.
Os métodos analíticos utilizados HPLC/RP e LC-MS-MS para
quantificação de norfloxacino e OXC/MHD em plasma humano, desenvolvido e
validado, apresentam vantagens sobre os já descritos. A quantificação de
amoxicilina demonstrou resultados semelhantes aos já publicados, embora
utilizando outras técnicas de detecção como espectrometria de massa.
CONCLUSÃO
Os três métodos bioanalíticos propostos foram desenvolvidos,
devidamente validados e quantificam com exatidão (acurácia) e precisão
(reprodutibilidade) os parâmetros farmacocinéticos de formas farmacêuticas orais de
amoxicilina, norfloxacino e oxcarbazepina em plasma de voluntários sadios, de
modo que são válidos para o emprego em estudos de bioequivalência que envolvam
esses fármacos.
161
REFERÊNCIAS
162
REFERÊNCIAS
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p. 93-99, 1995.
177
GLOSSÁRIO
178
GLOSSÁRIO
Biodisponibilidade Absoluta (F): a fração do fármaco sistemicamente absorvida e
a disponibilidade do fármaco da forma farmacêutica quando comparada com a
biodisponibilidade do fármaco após administração intravenosa. É usualmente
calculada como a razão da área sob a curva (ASC) da concentração plasmática
versus tempo, para a forma farmacêutica administrada oralmente em relação à ASC
obtida após administração intravenosa do fármaco. Um valor F de 0,80 ou 80%
indica que apenas 80% do fármaco ficou disponível sistemicamente da forma
farmacêutica.
Biodisponibilidade Oral: indica a velocidade e a extensão de absorção de um
princípio ativo em uma forma de dosagem, a partir de sua curva concentração
versus tempo na circulação sistêmica ou a partir de sua excreção urinária. É a fração
da dose de um medicamento, oralmente administrado, que foi absorvida e atinge a
circulação como princípio ativo (Lei nº 9.787, de 10/2/99).
Biodisponibilidade Relativa: disponibilidade sistêmica do fármaco a partir de sua
forma farmacêutica quando comparada a uma formulação de referência. É calculada
como a razão da área sob a curva da concentração plasmática versus tempo, ASC
para a forma farmacêutica em relação ao ASC do referência. Uma biodisponibilidade
relativa de F = 1,0 ou 100% implica que a biodisponibilidade a partir da forma
farmacêutica é a mesma, mas não indica a completa absorção sistêmica do
fármaco. A determinação da biodisponibilidade é muito importante em estudos de
medicamentos.
Denominação Comum Brasileira: denominação do fármaco ou princípio
farmacologicamente ativo aprovado pelo órgão federal responsável pela vigilância
sanitária (Lei nº 9.787, de 10/2/99).
Denominação Comum Internacional: denominação do fármaco ou princípio
farmacologicamente ativo recomendada pela Organização Mundial de Saúde (Lei nº
9.787, de 10/2/99).
179
Bioequivalência: dois medicamentos são ditos bioequivalentes quando são
administrados na mesma dose molar, nas mesmas condições experimentais e não
apresentam diferenças estatisticamente significativas em relação à
biodisponibilidade (BRASIL, 2003a).
Droga: é a matéria prima mineral, vegetal ou animal da qual se podem extrair um ou
mais princípios ativos. De acordo com esta acepção, os agentes terapêuticos de
origem sintética não são drogas.
Fármaco: é a substância química de constituição definida que pode ter aplicação
em Farmácia, seja como preventivo, seja como curativo, seja como agente de
diagnóstico; a ser aceita esta definição, a matéria prima mineral, vegetal ou animal
da qual se podem extrair uma ou mais bases medicamentosas não é fármaco, pois
sua constituição química não é necessariamente conhecida.
Medicamento: produto farmacêutico, tecnicamente obtido ou elaborado, com
finalidade profilática, curativa, paliativa ou para fins de diagnóstico". (Lei nº 5.991, de
17/12/73). É uma forma farmacêutica terminada que contém o fármaco, geralmente
em associação com adjuvantes farmacotécnicos.
Medicamentos Bioequivalentes: são medicamentos equivalentes farmacêuticos
que, ao serem administrados na mesma dose molar, nas mesmas condições
experimentais, não apresentam diferenças estatisticamente significativas em relação
à biodisponibilidade, segundo a Resolução RDC nº 135, de 29 de maio de 2003.
Medicamento Referência: medicamento inovador registrado no órgão federal
responsável pela vigilância sanitária e comercializado no País, cuja eficácia,
segurança e qualidade foram comprovadas cientificamente junto ao órgão federal
competente, por ocasião do registro (Lei nº 9.787, de 10/2/99).
Medicamento Genérico: medicamento similar a um produto de referência ou
inovador, que se pretende ser com este intercambiável, geralmente produzido após
a expiração ou renúncia da proteção patentária ou de outros direitos de
180
exclusividade, comprovada a sua eficácia, segurança e qualidade, e designado pela
DCB ou, na sua ausência, pela DCI (Lei nº 9.787, de 10/2/99).
Estudo Aberto: tanto o pesquisador responsável como o sujeito da pesquisa são
informados e têm conhecimento sobre a medicação que será administrada.
Estudo Cruzado: em uma das fases da pesquisa administra-se ao sujeito da
pesquisa (voluntário) o medicamento referência e na outra o medicamento teste, ou
vice–versa. O mesmo voluntário deve ser submetido às duas formulações.
Analito: composto químico específico a ser mensurado, podendo ser o fármaco
não-transformado, biomolécula ou seu derivado, metabólito ou produto de
degradação em uma matriz biológica (BRASIL, 2003c).
Matriz Biológica: material distinto de origem biológica, que pode ser amostrado e
processado de modo reprodutível (BRASIL, 2003c).
Controle de Qualidade: amostra de matriz biológica adicionada do analito, usada
para monitorar o desempenho de um método bioanalítico e para avaliar a
integridade e validade dos resultados das amostras desconhecidas, analisadas
numa corrida individual (BRASIL, 2003c).
Corrida Analítica: conjunto completo de amostras em estudo, com um número
apropriado de padrões e controles de qualidade para sua validação e que tem sua
análise completa nas mesmas condições (BRASIL, 2003c).
Padrão Interno: composto, geralmente, com características estruturais similares ao
analito, adicionado aos padrões de calibração e amostras em concentrações
conhecidas e constantes, para facilitar a determinação do analito (BRASIL, 2003c).
Padrão de Calibração: matriz biológica a qual foi adicionada uma quantidade
conhecida de analito. Os padrões de calibração são usados para construir a curva
de calibração, com a qual são determinadas as concentrações do analito nos
controles de qualidade e nas amostras desconhecidas em estudo (BRASIL, 2003c).
181
Precisão: representa o grau de repetibilidade entre os resultados de análises
individuais, quando o procedimento é aplicado diversas vezes numa mesma amostra
homogênea, em idênticas condições de ensaio (BRASIL, 2003c).
Exatidão: representa o grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados e um valor aceito como referência (BRASIL, 2003c).
Linearidade: corresponde à capacidade do método de fornecer resultados
diretamente proporcionais à concentração da substância em exame (analito)
(BRASIL, 2003c).
Limite de Detecção: menor concentração de um analito que o procedimento
bioanalítico consegue diferenciar confiavelmente do ruído de fundo (BRASIL,
2003c).
Limite Inferior de Quantificação: menor quantidade de um analito numa amostra
que pode ser determinada quantitativamente com precisão e exatidão aceitáveis
(BRASIL, 2003c).
Especificidade: habilidade do método bioanalítico de medir e diferenciar o analito
de componentes que possam estar presentes na amostra, tais como metabólitos,
impurezas, compostos de degradação ou componentes da matriz (BRASIL, 2003c).
Reprodutibilidade: precisão entre dois laboratórios. Também representa a precisão
do método sob as mesmas condições operacionais, num curto período de tempo
(BRASIL, 2003c).
Estabilidade: parâmetros que visa determinar se um analito mantém-se
quimicamente inalterado numa dada matriz sob condições específicas, em
determinados intervalos de tempo (BRASIL, 2003c).
Recuperação: eficiência de extração de um método analítico, expressa como a
porcentagem da quantidade conhecida de um analito, obtida da comparação dos
182
resultados analíticos de amostras branco acrescidas de padrão e submetidas ao
processo de extração, com os resultados analíticos de solução padrão não extraídas
(BRASIL, 2003c).
Área sob a Curva da Concentração Plasmática versus Tempo, de Zero ao
Infinito – ASC
0-
: relaciona-se com a quantidade ou a extensão de absorção do
fármaco. A quantidade da absorção sistêmica do fármaco é diretamente relacionada
com ASC que é geralmente calculado pelo método trapezoidal; onde ASC[
0-
] =
ASC[
0-t
] + Ct/K, e expresso em unidades de concentração vezes tempo.
Concentração Máxima Atingida no Plasma - C
max
: concentração mais elevada do
fármaco atingida na circulação sangüínea após administração de um fármaco.
Relaciona-se a intensidade da resposta farmacológica. O C
max
ideal deve estar
dentro da janela terapêutica.
Constante de Eliminação K: representa a soma de todas as taxas constantes para
remoção do fármaco do corpo, incluindo a taxa constante da excreção renal e
metabolismo (biotransformação) como descrito através da equação: K = K + Km,
onde K = constante de excreção renal e Km = constante de metabolismo. Determina
a taxa de eliminação do fármaco dos vasos sangüíneos. Serve para determinar a
concentração do fármaco em um tempo t. É inversamente relacionada à meia vida
do fármaco: K= 0,693/t
1/2
.
Meia Vida de Eliminação do Fármaco t
1/2
: representa o tempo em que a
concentração do fármaco no plasma é reduzida a metade. Calcula-se através do
logaritmo neperiano (ln) de 2 (ln2= 0,693) dividido pela constante de eliminação. t
1/2
= ln2/K.
Tempo correspondente à Concentração Máxima Atingida no Plasma - T
max
:
tempo correspondente para que o fármaco atinja a concentração máxima (C
max
).
183
ANEXOS
184
ANEXO A
LISTAS DE RANDOMIZAÇÃO PARA AMOXICILINA
Nº PERÍODO I PERÍODO II
1. ♀ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
2. ♀ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
3. ♀ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
4. ♂ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
5. ♂ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
6. ♂ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
7. ♂ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
8. ♀ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
9. ♀ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
10. ♀ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
11. ♂ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
12. ♂ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
13. ♂ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
14. ♂ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
15. ♂ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
16. ♂ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
17. ♂ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
18. ♂ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
19. ♀ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
20. ♀ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
21. ♀ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
22. ♀ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
23. ♀ Amoxicilina (cápsula AMOXIL®
24. ♀ AMOXIL® Amoxicilina (cápsula
185
ANEXO B
LISTAS DE RANDOMIZAÇÃO PARA NORFLOXACINO
Nº
PERÍODO I PERÍODO II
1.
♀
Floxacin Norfloxacino -
2.
♀
Norfloxacino - Floxacin
3.
♀
Floxacin Norfloxacino -
4. ♂ Norfloxacino - Floxacin
5. ♂ Floxacin Norfloxacino -
6. ♂ Norfloxacino - Floxacin
7. ♂ Floxacin Norfloxacino -
8.
♀
Norfloxacino - Floxacin
9.
♀
Floxacin Norfloxacino -
10.
♀
Norfloxacino - Floxacin
11. ♂ Floxacin Norfloxacino -
12. ♂ Norfloxacino - Floxacin
13. ♂ Floxacin Norfloxacino -
14. ♂ Norfloxacino - Floxacin
15. ♂ Floxacin Norfloxacino -
16. ♂ Norfloxacino - Floxacin
17. ♂ Floxacin Norfloxacino -
18. ♂ Norfloxacino - Floxacin
19.
♀
Floxacin Norfloxacino -
20.
♀
Norfloxacino - Floxacin
21.
♀
Floxacin Norfloxacino -
22.
♀
Norfloxacino - Floxacin
23.
♀
Floxacin Norfloxacino -
24.
♀
Norfloxacino - Floxacin
186
ANEXO C
PARECER PARA AMOXICILINA DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
187
ANEXO D
PARECER PARA NORFLOXACINO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
188
ANEXO E
PARECER PARA OXCARBAZEPINA DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
189
ANEXO F
CERTIFICADO DE QUALIDADE DO PADRÃO ANALÍTICO AMOXICILINA
190
ANEXO G
CERTIFICADO DE QUALIDADE DO PADRÃO ANALÍTICO CEFADROXIL
191
ANEXO H
CERTIFICADO DE QUALIDADE DO PADRÃO ANALÍTICO NORFLOXACINO
192
ANEXO I
CERTIFICADO DE QUALIDADE DO PADRÃO ANALÍTICO CIPROFLOXACINO
193
ANEXO J
CERTIFICADO DE QUALIDADE DO PADRÃO ANALÍTICO OXCARBAZEPINA
194
ANEXO L
CERTIFICADO DE QUALIDADE DO PADRÃO ANALÍTICO MHD
195
ANEXO M
CERTIFICADO DE QUALIDADE DO PADRÃO ANALÍTICO CARBAMAZEPINA
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