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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CIPHARMA
Nanocápsulas : variação das características
superficiais, caracterização e efeitos após
administração intravenosa
Líliam Teixeira Oliveira
ORIENTADOR:
PROF. DRA VANESSA CARLA FURTADO MOSQUEIRA
CO-ORIENTADOR:
PROF. DR. ALEXANDRE BARBOSA REIS
Ouro Preto
2009
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CIPHARMA
Nanocápsulas : variação das características
superficiais, caracterização e efeitos após
administração intravenosa
Líliam Teixeira Oliveira
Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Ouro
Preto como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre em
Farmácia.
Orientador: Prof
a
. Dra Vanessa
Carla Furtado Mosqueira
Co-Orientador: Prof. Dr. Alexandre
Barbosa Reis
Ouro Preto
2009
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iii
_________________________________________
Líliam Teixeira Oliveira- Mestranda
_________________________________________
Prof
a
. Dra. Vanessa Carla Furtado Mosqueira
________________________________________
Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis
Local de realização do projeto
Laboratório de desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia/ Departamento de
Farmácia – Escola de Farmácia- Universidade Federal de Ouro Preto
iv
Agradecimentos
Agradeço a minha orientadora Prf
a
Dra. Vanessa Carla Furtado Mosqueira pela
oportunidade e confiança.
Ao Prof. Dr. Alexandre Barbosa Reis pela co-orientação no meu trabalho, pela
receptividade em seu laboratório e pela colaboração, especialmente do Bruno,
que me auxiliou nos testes por citometria de fluxo.
À Prof
a
. Dra Eunice Kano pela colaboração com os testes de validação da
metodologia analítica.
À Margareth Spangler pela oportunidade de realização da microscopia de força
atômica no Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC) e ao Vilela pela
ajuda na obtenção das imagens de microscopia de força atômica.
À Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto e ao programa
de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas CIPHARMA pela formação
acadêmica.
À Capes e a rede NANOBIOMG/FAPEMIG pelo auxílio financeiro.
Aos professores da Escola de Farmácia pela contribuição na minha formação
profissional.
Aos amigos da pós-graduação pela agradável convivência e pelos momentos
compartilhados: Kemile, Simone, Renato Fontes, Ricardo, Alessandra,
Gleicielly, Kelly Kato, Renata Branquinho, Patrícia, Karina e Giane. À Elaine
pela disponibilidade durante as análises de potencial zeta.
Agradecimento especial a Raquel pela ajuda nos momentos mais difíceis desta
conquista, pela amizade e paciência.
À Andressa, Taty Antônia e a Érica pela boa convivência e amizade.
Aos meus pais, Cleusa e José, pelo apoio incondicional; aos meus irmãos, Ana
Paula, Lívia e Felipe, pelo carinho; aos meus sobrinhos, Ana Luísa e João
Víctor, por tornarem a minha vida mais alegre; à minha avó Odete pelas
orações; e aos meus tios e primos pelo carinho.
v
SUMÁRIO
Lista de Figuras ........................................................... Erro! Indicador não definido.
Lista de Tabelas ...................................................................................................... xi
Lista de Abreviaturas e símbolos ............................................................................. xiii
RESUMO ............................................................................................................... xv
ABSTRACT ........................................................................................................... xvii
INTRODUCAO GERAL ............................................................................................. 1
1- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 7
1.1- Sistemas Nanoparticulados Convencionais Carreadores de Fármacos ................ 8
1.2- Polímeros Utilizados no Desenvolvimento de Sistemas Nanoparticulados .......... 11
1.3- O Destino das Nanopartículas In Vivo - Biodistribuição das Nanopartículas ........ 13
1.4- Marcador fluorescente de Nanocápsulas: ftalocianina........................................ 19
2- OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 22
Capítulo 1: ............................................................................................................. 23
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA
QUANTIFICAÇÃO DA AlClPC EM NANOCÁPSULAS, EM PLASMA E FÍGADO DE
CAMUNDONGOS ................................................................................................... 23
1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................ 24
2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 25
2.1- Materiais .......................................................................................................... 25
2.2- Desenvolvimento e Validação do Método Analítico para Quantificação de AlClPC
em Nanocápsulas Poliméricas ................................................................................. 25
2.2.1- Condições cromatográficas ................................................................................... 25
2.2.2- Linearidade .............................................................................................................. 25
2.2.3- Precisão ................................................................................................................... 26
2.2.4- Exatidão ................................................................................................................... 26
2.3- Validação do Método para Quantificação de AlClPC em Plasma e Fígado de
Camundongo .......................................................................................................... 27
2.3.1- Condições Cromatográficas................................................................................... 27
vi
2.3.2- Preparo de Amostras de Plasma Padrão da Curva de Calibração .................... 27
2.3.3- Preparo de Amostras de Fígado Padrão da Curva de Calibração ..................... 28
2.3.4- Especificidade ......................................................................................................... 29
2.3.5- Recuperação ........................................................................................................... 29
2.3.6- Limite de Quantificação Inferior ............................................................................. 30
2.3.7- Linearidade .............................................................................................................. 30
2.3.9- Exatidão ................................................................................................................... 32
2.3.10- Estabilidade ........................................................................................................... 32
2.3.10.1- Estabilidade de Curta Duração ........................................................................ 33
2.3.10.2- Estabilidade em Ciclos de Congelamento e Descongelamento.................... 33
2.3.10.3- Estabilidade Pós-Processamento .................................................................... 33
2.3.10.4- Estabilidade de Longa Duração ....................................................................... 33
2.3.10.5- Estabilidade das Soluções Padrão .................................................................. 34
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 35
3.1- Validação do Método Analítico para Quantificação de AlClPC em Nanocápsulas
Poliméricas ............................................................................................................. 35
3.1.1- Linearidade .............................................................................................................. 35
3.1.2- Precisão ................................................................................................................... 37
3.1.3- Exatidão ................................................................................................................... 37
3.2- Validação do Método Analítico para Quantificação de AlClPC em Plasma e Fígado
de Camundongo ..................................................................................................... 38
3.2.1- Especificidade ......................................................................................................... 38
3.2.2- Recuperação ........................................................................................................... 39
3.2.3- Limite de Quantificação Inferior ............................................................................. 41
3.2.4- Linearidade .............................................................................................................. 41
3.2.5- Precisão ................................................................................................................... 43
3.2.6- Exatidão ................................................................................................................... 44
3.2.7- Estabilidade ............................................................................................................. 44
vii
3.2.7.1- Estabilidade de Curta Duração........................................................................... 45
3.2.7.2- Estabilidade em Ciclos de Congelamento e Descongelamento ...................... 45
3.2.7.3- Estabilidade Pós-Processamento ...................................................................... 48
Capítulo 2 .............................................................................................................. 50
PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS COM
DIFERENTES CARACTERÍSTICAS SUPERFÍCIAIS ............................................... 50
1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................ 51
2- MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 52
2.1- Materiais .......................................................................................................... 52
2.2- Preparação das Nanocápsulas ......................................................................... 52
2.3- Caracterização Físico-Química das Nanopartículas ........................................... 54
2.3.1- Distribuição de Tamanho ....................................................................................... 54
2.3.2- Potencial Zeta ......................................................................................................... 54
2.2- Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ...................................................... 54
2.3- Análise Morfológica das Nanocápsulas ............................................................. 56
2.4- Análise Estatística dos Dados ........................................................................... 57
3-RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 58
3.1- Preparo das nanocápsulas ............................................................................... 58
3.2- Caracterização Físico-Química das Nanocápsulas Selecionadas ....................... 61
3.2.1- Distribuição de Tamanho ....................................................................................... 61
3.2.2- Potencial Zeta (ζ) .................................................................................................... 65
3.3- Porcentagem e Eficiência de Encapsulação ...................................................... 67
3.4- Avaliação Morfológica ...................................................................................... 70
Capítulo 3 .............................................................................................................. 74
NANOCÁPSULAS: EFEITO DAS CARACTERÍSTICAS SUPERFÍCIAIS E DA DOSE
ADMINISTRADA IN VITRO E IN VIVO .................................................................... 74
1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................ 75
viii
2- MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 76
2.1- Animais ........................................................................................................... 76
2.2- Avaliação da estabilidade da marcação fluorescente dos diferentes tipos de
nanocápsulas em meios biológicos .......................................................................... 76
2.2.1- Metodologia de separação das células mononucleares ..................................... 76
2.2.2- Avaliação da interação marcador encapsulado com células sem contato ........ 77
2.3- Análise Estatística ............................................................................................ 78
2.4- Estudo de Biodistribuição de Nanopartículas Poliméricas in vivo ........................ 78
2.4.1- Efeito da Dose Administrada na saturação da capacidade fagocítica ............... 78
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 78
3.1- Avaliação da estabilidade da marcação fluorescente dos diferentes tipos de
nanocápsulas em meio biológico ............................................................................. 80
3.2- Estudo de Biodistribuição de Nanopartículas Poliméricas in vivo ........................ 82
DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................. 91
CONCLUSÕES ...................................................................................................... 95
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 97
Lista de Figuras
ix
Figura 1- Estrutura molecular da AlClPC. ................................................................. 20
Figura 2- Curva de calibração média do método analítico para quantificação de AlClPC
em NC. ................................................................................................................... 36
Figura 3- Cromatogramas de Padrão AlClPC (PA) a 0,025ug/mL (em vermelho) e 5,0
ug/mL (em preto)Correspondentes aos limite de quantificação superior e inferior,
respectivamente. .................................................................................................... 36
Figura 4- Cromatogramas de especificidade: matrizes poliméricas PLA; PLA-PEG;
PLA-QUI e demais componentes das formulações, sobreposto a cromatogramas de
PA (AlClPC) a 0,25 ug/mL. ...................................................................................... 37
Figura 5- Cromatograma referente à especificidade de plasma branco (verde),
sobreposto a uma amostra na concentração de 20 ng/mL de padrão (PA) e 500 ng/mL
de padrão interno (PI) em preto. .............................................................................. 38
Figura 6- Cromatogramas referente à especificidade de plasma hemolisado (azul),
sobreposto a uma amostra na concentração de 20 ng/mL de PA e 500 ng/mL de PI
(preto). Com tempos de retenção para PA de 1,8 minutos e para PI de 4,85 minutos 39
Figura 7- Cromatogramas referente à especificidade de fígado isento de PA (AlClPC) e
PI (marron), sobreposto a uma amostra na concentração de 20 ng/mL de PA e 500
ng/mL de PI (preto). Com tempos de retenção para PA de 2,3 minutos e para PI de
5,05 minutos ........................................................................................................... 39
Figura 8- Curva de calibração do método analítico para quantificação de AlClPC em
plasma por cromatografia líqüida de alta eficiência. .................................................. 42
Figura 9- Curva de calibração do método analítico para quantificação de AlClPC em
fígado por cromatografia líqüida de alta eficiência. ................................................... 42
Figura 10- Cromatogramas de amostras de plasma extraído nas concentrações de
20ng/mL (vermelho) e 100 ng/mL (preto) PI=500 ng/Ml. ........................................... 43
Figura 11: Figura 11- Cromatogramas de amostras de plasma extraído nas
concentrações de 20ng/mL (vermelho) e 100 ng/mL (preto) PI=500 ng/Ml. ............... 43
Figura 12- Etapas da Preparação de Nanocápsulas. 1) A solução orgânica é vertida na
solução aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por10 minutos; 4) Os
solventes e o excesso de água são evaporados. ...................................................... 53
Figura 13- Representação esquemática das dosagens de AlClPC realizadas nas
formulações de NP para determinação da porcentagem de encapsulação, eficiência de
encapsulação e porcentagem de fármaco precipitado. ............................................. 56
Figura 14- Representação esquemática da estrutura de constituição das NP. (A)
nanocápsula convencional, (B) nanocápsula furtiva e (C) nanocápsula revestida com
quitosana. ............................................................................................................... 58
Figura 15- Esquema representativo da dupla camada elétrica. ................................. 66
x
Figura 16- Imagem de altura (A) e fase (B) de um agrupamento de NC de PLA vazias.
As NC foram depositadas na superfície da mica. Área: 2µm x 2µm. ......................... 71
Figura 17- Imagem de altura (A) e fase (B) de um agrupamento de NC de PLA
contendo AlClPC 0,1mg/mL. As NC foram depositadas na superfície da mica. Área:
3µm x 3µm. ............................................................................................................ 71
Figura 18- Imagens de altura de NC de PLA-PEG vazias (A) e encapsulando
0,1mg/mL de AlClPC (B), depositadas sobre a superfície da mica. Área: 2µm x 2µm. 71
Figura 19- Imagem de altura (A) e fase (B) de NC de PLA-QUI depositadas sobre a
mica. ...................................................................................................................... 72
Figura 20- Representação esquemática dos inserts utilizados para validar a
transferência do marcador para as células em ausência de contato. ......................... 77
Figura 21- Comparação da porcentagem de linfócitos (A), monócitos (B) e neutrófilos
(C) que apresentaram fluorescência após incubação com NC encapsulando VN
(vermelho) e a AlClPC (verde) na placa com insert. Cada população foi comparada
com o grupo controle............................................................................................... 81
Figura 22- Comparação da porcentagem de células que apresentaram fluorescência
após incubação com NC de PLA encapsulando AlClPC na placa com insert. Cada
população foi comparada com o grupo controle, incubado na ausência de NC. ......... 82
Figura 23- Dosagem de AlClPC em plasma de camundongo após 20 minutos da
administração de NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI com a administração de doses
crescentes de polímero, n=4 para cada ponto da curva. * diferença estatística
(p<0,05), (n=4). ....................................................................................................... 84
Figura 24- Dosagem de AlClPC em fígado de camundongo após 20 minutos da
administração de NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI em doses crescentes de polímero.
* representa diferença estatística (p<0,05), (n=4). .................................................... 85
Figura 25- Porcentagem da dose administrada de AlClPC em plasma de camundongo
após 20 minutos da administração de NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI em doses
crescentes de polímero. Sendo que * diferença estatística (p<0,05), (n=4). ............... 86
Figura 26- Porcentagem da dose administrada de AlClPC em fígado de camundongo
após 20 minutos da administração de NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI em doses
crescentes de polímero Sendo que * representa diferença estatística comparando com
a menor dose administrada. .................................................................................... 86
xi
Lista de Tabelas
Tabela 1-Parâmetros relativos à curva de calibração média do método analítico para
quantificação de AlClPC. ......................................................................................... 36
Tabela 2- Precisão do método analítico utilizado para quantificação de AlClPC em NC.
DP = desvio padrão, CV = coeficiente de variação. Cada valor representa a média de
cinco determinações. .............................................................................................. 37
Tabela 3- Exatidão do método analítico utilizado para quantificação de AlClPC em NC,
calculada como porcentagem recuperada. Cada valor representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 37
Tabela 4- Recuperação média do procedimento de purificação das amostras de
plasma e fígado de controle de qualidade adicionadas de AlClPC (padrão) e ZnPc
(padrão interno). Cada valor representa a média de seis determinações. DP = desvio
padrão, CV=coeficiente. .......................................................................................... 40
Tabela 5- Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para
quantificação de AlClPC em plasma por cromatografia líquida de alta eficiência. ...... 42
Tabela 6- Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para
quantificação de AlClPC em fígado por cromatografia líquida de alta eficiência. ........ 43
Tabela 7- Resultados de precisão e exatidão intra e inter-ensaios do método analítico
para quantificação de AlClPC em plasma e fígado. Os resultados expressam a média
da análise de 6 amostras, durante 3 dias. ................................................................ 44
Tabela 8- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas após
permanência à temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média
de três determinações. ............................................................................................ 45
Tabela 9- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas após
permanência à temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média
de três determinações. ............................................................................................ 45
Tabela 10- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de
congelamento e descongelamento. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 46
Tabela 11- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de
congelamento e descongelamento. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 47
Tabela 12- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de
xii
congelamento e descongelamento. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 47
Tabela 13- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de
congelamento e descongelamento. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 47
Tabela 14- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de
congelamento e descongelamento. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 48
Tabela 15- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas imediatamente
após o preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de
congelamento e descongelamento. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 48
Tabela 16- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, purificadas e mantidas a
temperatura ambiente por 24 horas. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 49
Tabela 17- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, purificadas e mantidas a
temperatura ambiente por 24 horas. Cada resultado representa a média de três
determinações. ....................................................................................................... 49
Tabela 18- Comparação das propriedades de tamanho entre NC de PLA. ................ 59
Tabela 19- Comparação do tamanho entre formulações de NC de PLA-PEG. ........... 60
Tabela 20- Comparação das propriedades de tamanho médio e potencial zeta entre
Nc de PLA-QUI para diferentes formulações. ........................................................... 61
Tabela 21- Comparação das propriedades de tamanho médio e potencial zeta entre
NC produzidas com diferentes polímeros e concentrações de AlClPC ...................... 64
Tabela 22- Eficiência de encapsulação, porcentagem de fármaco precipitado e
rendimento de encapsulação de formulações de NC com 0,1mg/ml de AlClPC. ........ 68
xiii
Lista de Abreviaturas e símbolos
%- porcentagem
ζ- potencial zeta
°C - grau Célsius
µg – micrograma
µm – micrômetro
AlClPC - ftalocianina de cloro e alumínio
ANOVA – Análise de Variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BPL - Boas Práticas de Laboratório
CETEC - Centro Tecnológico de Minas Gerais
CLAE - Cromatografia Líquida de alta Eficiência
cm - centímetro
Cmédia - concentração média determinada
CQA - controle de qualidade concentração alta
CQB - controle de qualidade concentrações baixa
CQ - controle de qualidade
CQM - controle de qualidade concentração media
CV(%) - coeficiente de variação em porcentagem
DMF - dimetilformamida
DP - desvio-padrão
ELL - Extração líquido-líquido
FDA - Food and Drug Administration
FL1- Intensidade de fluorecência
FL2- Intensidde de fluorescência
FL3 – Intensidade de fluorescência
FL4 - Intensidade de fluorescência
FSC – forward scatter signal
g – grama
P.I. - índice de polidispersão
kHz – Kilohertz
kDa – kilodaltons
K
d
- constante de distribuição
xiv
LD - limite de detecção
LIQ - Limite inferior de quantificação
LQ - limite de quantificação
LSQ - Limite superior de quantificação
MFA - microscopia de força atômica
mg/Kg – miligrama por kilo
mg/mL – miligramas por mililitro
min - minuto
mL - mililitros
mm- milímetro
mV – milivolt
NC – nanocápsulas
ng – nanogramas
nm - nanometros
NP – nanopartícula
PA - Padrão
PI- Padrão interno
PC - ftalocianinas
PCL - poli-ε-caprolactona
PCS - espectroscopia de correlação de fótons
PDT ou TFD – photodynamic therapy e terapia fotodinâmica, respectivamente
PEG - polietilenoglicol
PEO – poly-ethylenoxide
PHA - polihidroxialcanoatos
PLA – ácido poliláctico
PLGA – ácido poli(lático-co-glicólico)
rpm - rotações por minuto
SFM - sistema fagocítico mononuclear
SSC- side scatter signal
VN – Vermelho do Nilo
ZnPc - ftalocianina de zinco
xv
RESUMO
As nanocápsulas (NC) poliméricas, à semelhança de outros
transportadores de fármacos nanométricos ou coloidais, como os lipossomas e
as nanoesferas, são rapidamente capturados pelas células do sistema
fagocitário mononuclear após administração intravenosa. As células
responsáveis são os monócitos, plaquetas, leucócitos, e as células dendríticas
no sangue e os fagócitos residentes, como as células de Kupffer do fígado, as
células dendríticas dos linfonodos e os macrófagos do baço. Assim,
principalmente o fígado e o baço, constituem obstáculos para a distribuição e o
direcionamento eficiente de transportadores coloidais a alvos distintos do
sistema fagocitário mononuclear (SFM). Recentemente numerosas
investigações têm sido destinadas a reduzir o acúmulo dos nanocarreadores no
SFM visando aumentar a concentração das nanopartículas em diferentes
tecidos e células. Algumas das estratégias seguidas até agora baseiam-se na
redução do tamanho das partículas e na incorporação de cadeias hidrofílicas
na superfície dessas partículas, que efetivamente reduzem e retardam o
reconhecimento e a captura pelo sistema imune. As nanocápsulas com
superfície modificada tornando as NC mais hidrofílicas escapam da captura
pelos fagócitos e, com o conseqüente aumento do seu tempo de residência
plasmática, permitem que uma maior concentração de fármaco encapsulado
possa atingir os tecidos alvos. Entretanto, aspectos relativos às concentrações
saturantes do sistema imune, à capacidade de clearance em função das doses
administradas e às características superficiais das NC poliméricas
permanecem ainda pouco investigadas.
Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo principal preparar e
caracterizar suspensões coloidais de NC com cargas superficiais diferentes
com vistas à avaliação do efeito das doses administradas na concentração
plasmática e na acumulação no SFM do fígado em camundongos. As
partículasnegativas foram obtidas a partir do ácido poliláctico (PLA), ácido
poliláctico-co-polietilenoglicol (PLA-PEG) e as carregadas positivamente
obtidas pelo revestimento do ácido poliláctico com quitosana (PLA-QUI). Um
marcador fluorescente hidrofóbico e insolúvel foi encapsulado, a ftalocianina de
cloro e alumínio (AlClPC) como traçador fluorescente para os estudos in vitro e
in vivo. Para quantificação do marcador fluorescente nas formulações
xvi
farmacêuticas, no plasma e no fígado de camundongos, foi desenvolvido e
validado, pela primeira vez, um método de doseamento da AlClPC por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) usando detecção
espectrofluorimétrica. As suspensões de nanocápsulas foram preparadas pela
técnica de deposição interfacial do polímero preformado e apresentaram
tamanho médio de 192, 145 e 255 nm e potencial zeta de -41, -35 e + 9 mV,
para as nanocápsulas de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI, respectivamente. A dose
de polímero administrada por via endovenosa em camundongos (51-350 mg/kg
de animal) e o tipo de polímero demonstraram ser importantes na
biodistribuição das NC. Com o aumento da dose dos polímeros observou-se
uma diminuição do acúmulo de NC fluorescentes no fígado dos animais,
sugerindo uma saturação da capacidade de captura dos sistemas
nanoparticulados pelas células de Kupffer do fígado. A diminuição percentual
do acúmulo no fígado com conseqüente aumento da concentração no sangue
foi mais pronunciada para as NC convencionais de PLA. Na menor dose
administrada, as NC furtivas de PLA-PEG apresentaram uma maior
concentração plasmática que as outras NC avaliadas. As NC de PLA-QUI
apresentaram um perfil de biodistribuição bem diferenciado das outras NC; as
concentrações percentuais plasmáticas e hepáticas foram muito mais baixas
que para as NC de PLA e PLA-PEG, sugerindo acúmulo em outros tecidos. Até
o presente momento o efeito da dose administrada por via intravenosa na
biodistribuição de nanocápsulas não foi avaliado em trabalhos anteriores. No
presente trabalho foi observada a existência de diferentes perfis de
biodistribuição de acordo com o tipo de polímero utilizado e com a dose do
polímero administrada evidenciando-se um efeito de saturação do sistema
imune mais evidente com nanocápsulas carregadas negativamente que com
nanocápsulas revestidas de PEG ou carregadas positivamente.
xvii
ABSTRACT
Nanoparticles, like other colloidal carriers such as liposomes, after
intravenous administration typically are retained mainly by Kupffer cells of the
liver and spleen macrophages. The cells responsible are monocytes, platelets,
leukocytes, and dendritic cells in the blood and the resident phagocytes such as
Kupffer cells of liver, lymph node dendritic cells and macrophages in the spleen.
Thus, the liver and spleen are the major obstacle to the efficient distribution and
targeting of colloidal carriers to sites other than those of the reticuloendothelial
system (RES). Recently, numerous investigations have been aimed at reducing
the uptake of nanocarriers in RES and to increase the concentration of carrier
particles to desired targets tissues. One of the different strategies followed is to
reduce the size of the particles and cover the particles´ surface with layers of
hydrophilic polymers. These particles sometimes called “stealth”, escape from
capture by the macrophages and show increased plasma residence time and
enhanced concentration of drug in the target tissues other than RES. However,
aspects relating to saturating concentrations of the immune system, the
clearance capacity in function of doses administered and the surface
characteristics of the NC polymer are poorly investigated.
The present study aimed to prepare and characterize colloidal
suspensions of conventional and stealth nanocapsules with different surface
characteristics in order to evaluate the effects of their dose on the plasmatic
concentration and clearance. The Nc were prepared from the polylactic acid
(PLA), polylactic-co-polyethylene glycol (PLA-PEG) and polylactic polymer
coated with chitosan (PLA-QUI). The hydrophobic fluorescent dye, aluminum
phthalocyanine chloride (AlClPC) was encapsulated as fluorescent marker for
studies in vitro and in vivo. The suspensions of nanocapsules were prepared by
interfacial deposition of polymer followed by the solvent evaporation. A method
to quantify the AlClPC fluorescent marker in pharmaceuticals preparations,
plasma and liver of mice has been developed and validated for the first time by
high performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection.
The nanocapsules of PLA, PLA-PEG and PLA-QUI prepared had sizes of 192,
145 and 255 nm and zeta potential of -41, -35 and + 9, respectively. The effect
of polymer dose administered intravenously in mice (51-350 mg / kg of animal)
and the type of polymer proved to have important effects on the biodistribution
xviii
of NC. Increasing the dose of polymers the accumulation of fluorescent NC in
the liver of animals decreases, suggesting an overflow of catch of nanoparticles
by liver cells. The % reduction in the liver accumulation results in increased
concentration in the blood for the conventional PLA NC. In the lowest dose, the
NC stealth PLA-PEG showed a higher concentration than the other NC
evaluated. The PLA-QUI NC showed a biodistribution profile differentiated from
other NC, where the % of injected doses on plasma and liver were much lower
than for the PLA and PLA-PEG NC, suggesting accumulation in other tissues.
In this study we observed the existence of different biodistribution profiles
according to the type of polymer used and the dose of administered polymer is
showing a saturation effect of the immune system more evident with the
negatively charged nanocapsules than PEG-coated nanocapsules or positively
charged.
INTRODUCAO GERAL
2
Historicamente, a base para o desenvolvimento de novas
terapias medicamentosas tem residido na optimização da ação do fármaco
e, conseqüentemente, no aumento do índice terapêutico. A resposta
farmacológica está diretamente correlacionada com a concentração de
fármaco que alcança o sítio de ação e os efeitos adversos relacionados à
concentração plasmática máxima. A distribuição da substância ativa no
sangue está essencialmente baseada nas suas propriedades físico-
químicas, muitas vezes dificilmente adaptáveis para aumentar a
seletividade da mesma pelo alvo de ação, exigindo a administração de
doses excessivamente grandes. A toxicidade então surge em decorrência
da penetração do fármaco em tecidos e órgãos saudáveis que não são
alvo da ação (Couvreur et al., 2002).
A vetorização de fármacos, baseada na teoria das “magic
bullets” de Paul Ehrlich (1965) que trata da capacidade de minúsculas
partículas em carrear moléculas ativas aos sítios específicos de ação, tem
sido considerada uma das principais linhas da pesquisa biofarmacêutica
das últimas décadas, fazendo parte de uma grande área que rapidamente
emergiu no Brasil e no mundo, denominada nanotecnologia farmacêutica.
É consenso que a utilização de sistemas coloidais nanoestruturados, tais
como os lipossomas, nanoemulsões e as nanopartículas poliméricas,
constitui-se numa alternativa que visa alterar a biodistribuição de fármacos
após administração por diferentes vias. O sistema de liberação vetor-
orientado direcionaria o fármaco seletivamente para seu sítio de ação de
maneira a oferecer a atividade terapêutica máxima, prevenir a degradação
ou inativação durante o trânsito até o sítio alvo e proteger o corpo de
reações adversas devido à biodistribuição inapropriada
(Banker e Rhodes, 1996).
O conceito de vetorização surgiu como resposta aos
inconvenientes apresentados pela terapia sistêmica convencional. Assim,
as características físico-químicas do vetor, e não mais aquelas do fármaco
isoladamente passam a governar o perfil de distribuição tecidual da
molécula ativa. Os sistemas utilizados são de natureza variável, e variados
na sofisticação, mas o princípio geral da vetorização é o mesmo e consiste
na liberação do fármaco de forma preferencial no órgão ou célula-alvo,
3
permitindo deste modo, acentuar o efeito farmacológico e reduzir os efeitos
colaterais adversos (Puisieux e Roblot-Treupel, 1989; Calvo, 1995).
Os sistemas carreadores de fármacos atualmente propostos
apresentam-se divididos em três grupos principais: os vetores de primeira,
segunda e terceira geração. São vetores de primeira geração aqueles
capazes de liberar o fármaco em um determinado sítio de ação, desde que
sejam administrados no local onde devem agir. A este grupo pertencem as
microesferas e microcápsulas para a quimioembolização, usados em
diferentes doenças, principalmente em tumores. Os vetores de segunda
geração são os vetores propriamente ditos, pois transportam a substância
ativa para o local alvo, após administração pelas vias de administração
usuais. Esses podem ainda ser diferenciados em vetores ativos, onde a
distribuição no organismo é induzida e controlada for variações de pH e
térmicas, tais como os lipossomas termo ou pH-sensíveis e nanoesferas
magnéticas, e em vetores passivos, onde a distribuição do fármaco é
imposta pelas características dimensionais e físico-químicas da partícula
(lipossomas, nanoesferas e nanocápsulas) e fisiológicas dos tecidos. E
finalmente, os vetores de terceira geração, que são os vetores capazes de
reconhecer o alvo de ação de forma específica. A este grupo pertencem,
entre outros, os vetores pilotados por ligantes e biomoléculas, tais como os
anticorpos monoclonais (Benoit et al, 1986; Puisieux e Roblot-Treupel,
1989; Barratt, 2003). Desse modo, o desenvolvimento de novos sistemas
carreadores de fármacos permitiria a racionalização da terapia
medicamentosa levando à redução da dose e dos efeitos colaterais
indesejáveis, assim como a adesão do paciente ao tratamento.
A vetorização apresenta múltiplas aplicações, como por
exemplo, o tratamento de infecções parasitárias no sistema fagocitário
mononuclear por via endovenosa, o tratamento de inflamações crônicas e
agudas, e o tratamento do câncer, entre outros (Mosqueira et al., 2004;
Brigger et al., 2002, Pereira et al., 2009). Especialmente no caso do
câncer, o aumento da permeabilidade vascular no tecido tumoral pode
possibilitar o extravasamento de carreadores de fármacos com tamanho
entre 10 a 700 nanômetros de diâmetro (Maeda et al., 2000), devido ao
aumento da permeabilidade capilar dos tecidos tumorais, conhecido como
4
efeito de retenção e permeabilidade (Maeda et al., 2000). Assim, a
aplicação dos sistemas de transporte vetorizado tem potencial para
melhorar a quimioterapia de uma gama variada de doenças (Gupta, 1990).
Nanocápsulas (NC) são sistemas coloidais de tamanho
inferior a um micrômetro, do tipo reservatório, constituídos por um núcleo
oleoso recoberto por uma camada polimérica (Legrand et al., 1999). Nas
NC, o fármaco encontra-se predominantemente dissolvido ou disperso no
núcleo oleoso, embora possa se adsorver na superfície das partículas
(Vila Jato, 1997). Os métodos de preparação dos sistemas
nanoparticulares são vários e empregam em sua maioria alta energia para
o cisalhamento de uma fase dispersa no seio da fase dispersante seguida
de evaporação dos solventes e formação definitiva das nanopartículas
(Quintanar-Guerreiro et al., 1998, Vauthier, C. e Bouchemal, K., 2008).
Outros métodos baseiam-se na polimerização de monômeros na interface
de uma nanoemulsão (Vauthier, C. e Bouchemal, K., 2008). Entre eles, um
método relativamente simples, comumente denominado de
nanoprecipitação, baseia-se na precipitação de um polímero previamente
formado e previamente dissolvido em um solvente orgânico, após sua
adição em um não solvente do mesmo. Este método proposto por FESSI
et al.,1989, leva à obtenção de nanocápsulas mediante a incorporação de
uma fase oleosa na solução do solvente do polímero miscível com a fase
aquosa (Calvo, 1995). Devido à difusão espontânea do solvente orgânico é
gerada uma turbulência interfacial levando à formação de partículas de
tamanho reduzido, denominado efeito Marangoni (Legrand et al., 1999).
Com a alteração da polaridade do meio, o polímero precipita na superfície
das nanogotículas do óleo formando as nanocápsulas (Soppimath et
al., 2001).
As propriedades das nanocápsulas poliméricas podem ser
controladas pela modificação das propriedades físico-químicas dos
polímeros empregados. Polímeros tais como o ácido poli-D,L-láctico (PLA),
ácido poli-lático-co-glicólico (PLGA), os polihidroxialcanoatos (PHAs), poli-
ε-caprolactona (PCL), quitosana e seus derivados (Prego et al,.2005) e
copolímeros são os mais comumentes utilizados por serem biodegradáveis
e biocompatíveis (Couvreur et al., 2002). Os sistemas nanoparticulados
5
preparados a partir de tais polímeros permitem a encapsulação de
fármacos com vistas à liberação controlada dos mesmos ou ainda fornecer
uma atividade terapêutica maior ou mais durável, quando comparada com
aquela produzida pela administração do fármaco livre. Além disso, tais
sistemas possibilitam a administração intravenosa de moléculas
hidrofóbicas, em elevadas concentrações, melhorando ainda a estabilidade
proporcionada pela presença da barreira polimérica, frente à degradação
química e enzimática em meio fisiológico (Mosqueira et al., 2001,
Pereira et al., 2008).
Entretanto, quando administrados intravenosamente, os
vetores nanoparticulares convencionais são rapidamente removidos da
circulação sangüínea pelo sistema fagocítico mononuclear (SFM),
principalmente representado pelas células Kupffer do fígado e macrófagos
do baço. Esta remoção da circulação geralmente ocorre através do
reconhecimento específico destes vetores pelos receptores celulares, em
um mecanismo intermediado pela adsorção de proteínas plasmáticas
(opsonisação) nas partículas. Deste modo, a remoção realizada pelo SFM
é a maior limitação para a vetorização de fármacos destinados a outros
sítios no corpo humano, apesar deste fenômeno ter sido vantajosamente
empregado no tratamento de infecções intracelulares no fígado e baço
(Barratt et al., 2000).
Muitas técnicas têm sido desenvolvidas e testadas para a
modificação da superfície das nanopartículas que impeçam a adsorção
das proteínas plasmáticas. Os polietilenoglicóis (PEG) são os polímeros
mais utilizados para modificar a superfície destas partículas
(Bazile et al., 1995; Gref et al., 1995; Peracchia et al, 1999;Gref et al., 2000
; Li et al., 2001; Mosqueira et al., 2001). Estes polímeros não são
imunogênicos, são hidrofílicos, pouco tóxicos e neutros, aprovadas pelo
Food and Drug Administration (FDA) para uso interno humano, podendo
ser adsorvido fisicamente ou ligado covalentemente na superfície das
nanocápsulas (Mosqueira et al., 2001). O mecanismo é baseado na
formação de um revestimento hidrofílico, que impede estericamente a
opsonização pelas proteínas plasmáticas (Gref et al., 1995). Estas
partículas denominadas furtivas escapam da captura pelos macrófagos e,
6
apresentam aumento do seu tempo de circulação sanguínea e
consequentemente uma maior concentração de fármaco atinge os tecidos
alvos.
Portanto, este trabalho visa o desenvolvimento de
nanocápsulas apresentando três características de superfície diferentes,
nanocápsulas hidrofóbicas com carga negativa (PLA), nanocápsulas
revestidas pelo PEG ligado covalentemente ao polímero PLA (PLA-PEG) e
nanocápsulas possuindo carga superficial positiva obtida pelo revestimento
superficial por adsorção da quitosana sobre NC de PLA (PLA-QUI). A
influência das propriedades de superfície dessas nanocápsulas sobre o
sistema fagocitário mononuclear in vitro e in vivo ainda não foi encontrada
na literatura e este representa, portanto um dos objetivos deste trabalho.
Além disso, nós também avaliamos o efeito das doses administradas por
via intravenosa desses vetores sobre a saturação do sistema imune no
tocante à capacidade fagocítica. Para tal, NC fluorescentes foram
desenvolvidas e um método analítico validado para detecção do traçador
fluorescente em nanocápsulas e em matrizes biológicas foi desenvolvido
utilizando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção
espectrofluorimétrica (CLAE-FD).
7
1- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
8
1.1- Sistemas Nanoparticulados Convencionais Carreadores de
Fármacos
Nanopartículas são definidas como um sistema coloidal
submicrônico (<1 μm) formadas por polímeros biodegradáveis ou não.
Conforme a metodologia de preparação utilizada e as características do
produto final obtido podem ser denominadas de nanoesferas ou de
nanocápsulas. As nanoesferas são nanopartículas constituídas de uma
matriz polimérica em que a droga está dispersa por toda a partícula.
Enquanto que as nanocápsulas são constituídas de um sistema
reservatório na qual uma cavidade oca ou oleosa está circundada por uma
fina parede polimérica, onde o fármaco encontra-se confinado na cavidade
interna (Legrand et al., 1999; Barrat, 2000). Nas nanoesferas, a
substância ativa encontra-se dispersa na rede polimérica formada,
enquanto nas nanocápsulas, ela se encontra preferencialmente dissolvida
em um núcleo interno oleoso que se encontra revestido por uma
membrana polimérica. Em ambos os casos, o fármaco pode ainda se
adsorver na superfície das partículas (Montasser et al., 2000). A maior
vantagem das nanocápsulas sobre nanosferas reside na sua capacidade
de encapsular maiores quantidades de fármacos hidrofóbicos, além de
possuírem um conteúdo polimérico reduzido em relação às nanoesferas.
Além disso, em virtude do confinamento do fármaco no núcleo oleoso, o
efeito de liberação inicial rápida (ou efeito burst) pode ser reduzido
(Couvreur et al., 2002) em alguns casos.
Nanopartículas poliméricas são sistemas coloidais que têm
recebido considerável atenção nos últimos anos, particularmente àquelas
preparadas a partir de polímeros biodegradáveis. A utilização destes
sistemas para a encapsulação de moléculas terapeuticamente ativas
apresenta numerosas vantagens potenciais, tais como: proteção frente à
degradação, diminuição dos efeitos tóxicos, obtenção de perfis
farmacocinéticos mais favoráveis, maior conforto do paciente
proporcionado pela redução do número de administrações e em certas
condições, a vetorização em direção a tecidos e células específicas do
organismo (Dellacherie et al., 2001).
9
As nanopartículas foram introduzidas nos anos 70 como
potenciais carreadores para liberação controlada de fármacos utilizando,
na época, polímeros não biodegradáveis. A aplicação de nanopartículas no
desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de fármacos foi
reavaliada na década de 80, após o advento da síntese de polímeros
biodegradáveis pela equipe de Couvreur et al. (Couvreur et al., 1978;
Marty et al., 1978; El-Samaligy et al., 1985; Couvreur et al., 1985; Couvreur
et al., 1989). Posteriormente, outros grupos de pesquisas desenvolveram
sistemas nano e microparticulados contendo diferentes substâncias ativas
tais como proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, partículas virais e
vacinas (Damgé et al., 1997; Ferdus et al., 1998; Benns & Kim, 2000); e
bem como fármacos como antibióticos, analgésicos, imunossupressivos e
anticancerígenos (Fattal et al., 1998; Tóbio et al., 1998).
Os métodos de obtenção de nanopartículas podem ser
divididos em dois grandes grupos; aqueles que envolvem a polimerização
interfacial de monômeros in situ e aqueles que utilizam polímeros
previamente formados. Os métodos para obtenção de nanopartículas a
partir de polímeros pré-formados podem ainda ser classificados em quatro
categorias: emulsão-evaporação, difusão do solvente, emulsificação-
difusão e salting-out. Estas técnicas são similares quanto aos
procedimentos empregados, pois envolvem a preparação de uma solução
orgânica contendo os componentes da nanopartícula e de uma solução
aquosa contendo um tensioativo ou estabilizante interfacial. É Importante
observar que, embora todas possam ser utilizadas para a preparação de
nanoesferas, somente as técnicas de difusão do solvente e de
emulsificação-difusão permitem a obtenção de nanocápsulas, segundo
Quintanar-Guerrero et al, (1998). No que diz respeito às dimensões, o
menor tamanho de nanopartículas é geralmente em torno de 5 a 10 nm e o
maior tamanho é de aproximadamente 1000 nm (1 μm), embora a média
comumente obtida, em especial para os métodos que utilizam polímeros
pré-formados, esteja situada entre 100 a 500 nm (Quintanar-
Guerrero et al, 1998).
A nanoprecipitação, também conhecida como deposição do
um polímero pré-formado seguida de evaporação do solvente, é uma
10
técnica simples, reprodutível e facilmente transponível para a produção de
nanopartículas em grande escala (Couvreur et al., 2002,
Legrand et al., 1999, Pereira et al., 2009). Este método consiste
basicamente em injetar uma solução contendo o fármaco e polímero,
dissolvidos num solvente orgânico miscível com a água, numa fase
aquosa contendo um tensoativo hidrofílico como estabilizante.
Imediatamente após a injeção, o solvente orgânico rapidamente difunde-
se na água, dando origem a uma suspensão coloidal de nanoesferas. Para
a obtenção de nanocápsulas, um óleo e um tensoativo lipofílico são
adicionados à fase orgânica da preparação. Após a formação das
partículas, as suspensões são submetidas à evaporação para remoção do
solvente orgânico e concentração até volume desejado (Fessi et al, 1989;
Ammoury et al,1990; Montasser et al, 2000).
O mecanismo de formação de nanopartículas pela técnica de
nanoprecipitação tem sido explicado pela turbulência interfacial gerada
durante a difusão do solvente, como conseqüência da redução localizada
da tensão interfacial entre as duas fases. Pequenas gotas de solvente,
provavelmente de tamanho nanométrico, são separadas da interface e
rapidamente estabilizadas pelo tensoativo até que a difusão do solvente
seja completa e a agregação do polímero ocorra com o aumento da
polaridade do meio. Para a obtenção de nanocápsulas, um pequeno
volume de óleo é incorporado na fase orgânica da formulação e, neste
caso, a rápida difusão do solvente induz a deposição do polímero ao redor
das gotículas do mesmo. A utilidade desta técnica limita-se ao uso de
solventes miscíveis em água, onde a velocidade da difusão deve ser
suficientemente grande para garantir a emulsificação espontânea da fase
orgânica. Além disso, este método não é eficiente para encapsular
fármacos hidrossolúveis (Quintanar-Guerrero et al., 1998,
Couvreur et al., 2002).
As nanopartículas podem ser formuladas para liberação
direcionada ao sistema linfoide, cérebro, fígado, baço ou preparadas para
serem administradas na circulação sistêmica com tempo de meia vida
plasmática prolongada. Numerosos protocolos existem na produção de
nanopartículas baseado no tipo de fármaco usado e na rota de liberação.
11
A escolha do polímero é um dos fatores mais importantes, sendo os
biodegradáveis os mais indicados para compor matrizes ou cápsulas de
sistemas nanoparticulados. Uma vez escolhido o protocolo, os parâmetros
devem ser avaliados com o objetivo de criar as melhores características
para as nanopartículas. Entre uma variedade de características quatros
são considerados mais Importantes: o tamanho, a eficiência de
encapsulação, o potencial zeta (carga da superfície) e características de
liberação do fármaco (Barrat, 1999)
1.2- Polímeros Utilizados no Desenvolvimento de Sistemas
Nanoparticulados
Os polímeros mais utilizados são os poliésteres
biodegradáveis, aprovados pela agência de vigilância sanitária americana
Food and Drug Administration (FDA), tais como derivados do ácido lático
(PLA), do ácido glicólico (PGA), polietilenoglicol (PEG), derivados da
caprolactona (PCL) e especialmente os copolímeros de ácido lático e
glicólico (PLGA) e do PEG. Copolímeros são polímeros compostos de
várias unidades monoméricas diferentes e classificados em quatro tipos de
acordo com o arranjo dos monômeros na cadeia polimérica: copolímeros
de arranjo aleatório, de arranjo alternado, enxertado e em bloco
(Kumar et al., 2001). Os polímeros de arranjo aleatório são os
copolímeros que apresentam unidades repetidas de monômeros colocados
de forma aleatória na cadeia polimérica. Copolímeros de arranjo alternado
são sintetizados pela adição de monômeros de forma alternada. Ambos
copolímeros em bloco e enxertados são compostos de vários segmentos
que diferem no segmento do sítio de interligação: os copolímeros
enxertados são definidos como sendo pares de homopolímeros ligados
quimicamente, enquanto que os copolímeros em bloco são constituídos de
estruturas ligadas nas conexões terminais, como por exemplo os
polímeros anfifílicos do tipo PLA-PEG.
O ácido poli-D,L-láctico (PLA) é um polímero amplamente
utilizado em formulações de nano e micropartículas, tendo sido aprovado
pelo F.D.A. para uso intravenoso e intramuscular. Este polímero é
hidrofóbico, insolúvel em água e solúvel em vários solventes orgânicos.
12
Devido à presença de um centro assimétrico, formas levorotatória (L),
dextrorotatória (D) ou racêmica (D,L) do polímero podem ser obtidas
(Merkli et al., 1998). Este polímero pode ser considerado como um poli-
metabólito, pois seu produto de degradação é o ácido láctico gerado pela
quebra da porção terminal da cadeia polimérica. Nas células, o ácido
láctico é convertido em piruvato pela lactato desidrogenase presente como
diferentes isoenzimas no coração, músculos e fígado, e sua eliminação
ocorre via ciclo de Krebs, principalmente pelos pulmões e rins, na forma
de dióxido de carbono e água (Makino et al., 2002; Bazile et al., 1992;
Dellacherie et al., 2001).
Os copolímeros PEG são hidrofílicos, flexíveis e não iônicos,
apresentando, portanto, excelente biocompatibilidade. Podem ser ligados
covalentemente à superfície de nanopartículas, criando um revestimento
hidrofílico e, por conseguinte, impedindo a captura rápida das
nanopartículas pelo sistema fagocitário mononuclear (SFM).
Nanopartículas revestidas com PEG são, por isso, nomeadas de furtivas.
Uma atenção crescente vem sendo demonstrada para nanopartículas
furtivas como carreadores injetáveis de fármacos, os quais permitem um
maior tempo de circulação sistêmica das nanopartículas (Gref et al., 1994
e 1995; Peracchia et al., 1999; Quellec et al., 1999; Mosqueira et al.,2001).
A síntese de novos copolímeros utilizando PEG permitiu a utilização como
revestimento hidrofílico de nanopartículas formadas com matriz de
policaprolactona, PLA ou PLGA (Allen et al., 1994 e 1995,
Chull Há et al., 1999; Kim et al., 2000).
A quitosana é um polímero natural interessante que ocorre
em abundância no meio ambiente. Sua biocompatibilidade e diversas
vantagens devido ao seu carácter único como polímero catiônico o tornam
extremamente útil para aplicação farmacêutica (Thanoo et al., 1992; Illum,
1998). A quitosana é um polissacarídeo semelhante à celulose,
compreendendo copolímeros de glucosamina e N-acetil-glucosamina. A
quitosana pode ser obtida por desacetilação parcial da quitina de conchas
de crustáceos. Em contraste com a maioria dos outros polímeros naturais,
tem uma carga positiva e é mucoadesiva (Berscht et al., 1994). Além de
outras aplicações (Felt et al., 1998), a quitosana tem sido avaliada por seu
13
potencial no desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de
drogas (Kawashima et al., 1985; Thanoo et al., 1992; Akbuga, 1993) e
estas formulações tem sido estudadas na forma de géis de quitosana
(Kristl et al., 1993), comprimidos (Nigalaye et al., 1990) e cápsulas
(Tozaki et al., 1997), além de microesferas, microcápsulas (Nishioka et al.,
1990; Aiedeh et al., 1997) e nanocápsulas (Prego et al., 2005). Um dos
aspectos menos estudados da quitosana é sua biodistribuição,
especialmente através de vias de administração intravenosa. A falta de
informações referentes à biodistribuição está relacionada com todos os
aspectos da formulação de quitosana, com o peso molecular e grau de
desacetilação da quitosana e com o tamanho das nanopartículas formadas
por ela.
1.3- O Destino das Nanopartículas In Vivo - Biodistribuição das
Nanopartículas
No que concerne à composição química das nanopartículas,
o uso de numerosos polímeros naturais ou sintéticos tem sido descrito.
Entre eles, os poliésteres como a poli-ε-caprolactona (PCL), o ácido poli-
D,L-láctico (PLA) e o ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA) são os
polímeros de escolha. Estes compostos são de fácil obtenção, originando
uma gama de polímeros de diferentes massas molares, além de
apresentam a vantagem de serem biodegradáveis e preponderantemente
amorfos e não tóxicos (Dellacherie et al, 2001).
O tamanho de partícula, a composição química do polímero,
a sua massa molar e a presença de aditivos na formulação. e a localização
in vivo estão entre os fatores que afetam a velocidade de degradação de
nano e micropartículas de PLA. Outros fatores como a cristalinidade são
importantes na biodegradação dos mesmos. O (D,L)-PLA é completamente
amorfo e é degradado in vivo mais rapidamente do que o (L)-PLA, a
correspondente forma cristalina, em decorrência da maior penetração de
água nas regiões amorfas do polímero (Thies, 1989).
A natureza do vetor nanoparticular desempenha um
importante papel no perfil de distribuição in vivo e conseqüentemente, na
eficácia terapêutica da preparação. Em particular, a natureza da superfície
14
da partícula e a carga superficial são parâmetros determinantes, pois de
acordo com a composição química, influenciam a travessia de certas
barreiras biológicas e favorecem ou mesmo impedem a penetração em
certas células (Dellacherie et al, 2001).
Após administração intravenosa, os carreadores coloidais de
fármacos são captados da circulação sangüínea pelo sistema fagocítico
mononuclear. O SFM é formado por um grupo de células mononucleares
originadas na medula óssea, que têm como função remover pequenas
partículas estranhas do espaço vascular. Monócitos sangüíneos e
macrófagos teciduais pertencem a esta linhagem de células
(Becker, 1988). Uma característica que distingue os macrófagos entre as
outras células mononucleares, e que por muitos anos foi uma função
atribuída somente a estas células, é sua habilidade em fagocitar e destruir
microorganismos e elementos sangüíneos senescentes, ingerir restos
celulares, materiais particulados estranhos e substâncias pinocitose-
solúveis. Dentro do repertório de proteínas secretadas por macrófagos,
temos componentes do complemento, proteases e inibidores de proteases,
fibronectina, certas proteínas de resposta de fase aguda, assim como
componentes da cascata de coagulação e da fibrinólise. Devido a sua
presença em todos os órgãos e tecidos no organismo e sua habilidade de
migrar em resposta ao estímulo quimiotáxico, o macrófago pode liberar
seus produtos no sítio da infecção ou injúria, com isso influenciando o
resultado das reações inflamatórias extravasculares (Becker, 1988).
A interação do macrófago com um material estranho, como
as nanopartículas, requer a opsonização destas últimas, seguida da
interação com os receptores Fc (FcR), receptores para complemento (CR)
ou receptores de açúcar/lectina situados sobre a superfície do macrófago.
Clássicos exemplos de moléculas opsônicas incluem várias subclasses de
imunoglobulinas, proteínas do complemento como C3q e fragmentos
gerados de C3 (C3b, iC3b), apolipoproteínas, fator de von Willebrand,
trombospondina, fibronectina e proteína manose ligante (Frank e Fries,
1991; Vittaz et al, 1996; Moghimi et al, 2001).
Devido à natureza protéica dos componentes sangüíneos, os
fatores que determinam a adsorção de proteínas nas superfícies sólidas,
15
como composição química, carga e hidrofilicidade, sem dúvida
desempenham um papel importante na opsonização. A carga da superfície
das partículas influencia a interação eletrostática com os componentes do
meio circundante, sendo esta determinada pelas propriedades
eletrostáticas do polímero. É consenso que superfícies carregadas
negativamente conduzem à maior eliminação das partículas da circulação
sistêmica quando comparada àquelas neutras (Stolnik et al, 1995). A
hidrofilicidade/ hidrofobicidade da superfície afeta sua força atrativa,
influenciando desse modo no processo de opsonização e na força de
interação; assim, quanto mais hidrofóbica a partícula maior é a adsorção
de proteínas e mais rápida é a sua remoção da circulação
(Stolnik et al, 1995).
A utilização de suspensões de nanocápsulas é limitada pelo
reconhecimento das partículas pelo SFM e em particular pela sua
distribuição preferencial e rápida para o fígado e baço, após administração
intravenosa. Uma alternativa para uso de nanocápsulas pela via parenteral
consiste em utilizar carreadores com a superfície modificada por polímeros
diversos visando sua hidrofilização (Mosqueira et al., 2001). Estas
nanocápsulas chamadas „furtivas‟, são menos reconhecidas pelas células
fagocíticas, particularmente aos monócitos sangüíneos e as células de
Kupffer, permanecendo mais tempo na circulação sangüínea, e estando
assim aptas a liberar o fármaco em outros locais (Mosqueira et al., 2001a,
2001b; Couvreur et al., 2002).
Duas estratégias foram propostas para obter nanopartículas
que permaneçam um maior tempo na circulação sistêmica: i) a adsorção
de surfactantes, tais como os poloxamers, na superfície das partículas e ii)
o desenvolvimento de copolímeros biodegradáveis contendo segmentos
hidrofílicos, tais como os polietilenoglicóis (Vittaz et al., 1996;
Legrand et al.,1999; Brigger et al., 2002). No caso das nanocáspulas, a
última estratégia tem demonstrado ser mais adequada para obter uma
camada hidrofílica protetora sobre as nanocápsulas, pois evita a
possibilidade da rápida dessorção do revestimento hidrofílico após a
diluição ou o contato com componentes sangüíneos (Mosqueira et al.,
2001ª, 2001b).
16
O polietilenoglicol (PEG) é um polímero hidrossolúvel e não
tóxico geralmente produzido por polimerização aniônica do óxido de
etileno. A reação de polimerização pode ser modulada e polímeros
apresentando uma ampla variedade de massas molares (1000-50000)
podem ser obtidos com baixos valores de polidispersão. Além disso, a
presença de dois grupos hidroxilas terminais na cadeia do PEG torna
possível a formação de um grande número de derivados éter e hidroxi, que
são disponíveis comercialmente. A derivatização química dos grupos finais
é o primeiro passo na preparação de bioconjugados. Substratos
modificados com PEG incluem compostos de baixo peso molecular, entre
eles diferentes classes de macromoléculas biológicas, bem como
partículas e superfícies de materiais artificiais. Tais polímeros se dissolvem
em solventes orgânicos e água, sendo eliminados pelo fígado e rins, o que
os torna ideais para uma aplicação farmacêutica. De fato, o FDA aprova o
PEG para uso intravenoso, oral e tópico (Zalipsky, 1995;
Bhadra et al, 2002; Greenwald et al, 2003).
As propriedades do PEG têm sido exploradas para a
modificação da superfície das nanopartículas com o intuito de prevenir a
opsonização das mesmas. Para uma partícula apresentar comportamento
“furtivo”, dois critérios devem ser reunidos: o polímero adsorvido não deve
ser removido facilmente pelo fluxo in vivo, e a densidade da barreira
estérica imposta deve ser suficientemente grande para suprimir a
opsonização endógena ou prevenir a interação da superfície com os
potenciais receptores dos macrófagos (Moghimi e Hunter, 2001). Para tal,
cadeias de polietilenoglicóis (PEG) são ligadas covalentemente na
superfície das nanopartículas. Além disso, a flexibilidade das cadeias de
PEG permite a sua mobilidade na superfície, resultando numa densa
nuvem de várias conformações intercambiáveis entre si. Isto faz com que o
sistema imune tenha dificuldades em modelar um anticorpo em volta desta
estrutura flexível. Este fenômeno explicaria a razão pela qual uma
molécula hidrofílica como o dextrano, no entanto mais rígida, ligada à
superfície das partículas, não aumenta o tempo de permanência das
mesmas na circulação sanguínea (Jeon et al, 1991a, 1991b; Allen, 1994).
17
Estudos in vivo realizados em camundongos evidenciaram
um aumento significativo no tempo de permanência circulação sangüínea
de nanoesferas de PLGA revestidas com PEG. Após 5 minutos da
administração, 66% das nanopartículas convencionais foram removidas
pelo fígado, em contraste com os resultados obtidos com as nanoesferas
revestidas com PEG 20 kD, onde apenas 30% das partículas foram
capturadas 2 horas após a injeção. Neste estudo foi observado que o
tempo de permanência na circulação sistêmica aumenta com o aumento
da massa molar da cadeia de PEG no copolímero (PLGA-PEG) (Gref et al,
1994). Mosqueira et al.,(1999) investigaram as interações de nanocápsulas
de PLA contendo um marcador fluorescente hidrofóbico com células
fagocíticas, onde o poloxamer 188 foi adsorvido ou o PEG foi
covalentemente ligado à superfície das partículas. Este estudo foi
realizado in vitro usando como modelo células fagocitárias J774A1, uma
linhagem de macrófagos de camundongos de alto poder fagocítico. Os
autores verificaram que a interação das nanocápsulas de PLA-PEG com
as células foi 3 a 13 vezes menor que com as nanocápsulas de PLA
revestidas de PEG. Além disso, uma dramática redução da fluorescência
associada às células foi demonstrada somente para as nanocápsulas de
PLA-PEG, indicando que a ligação covalente do PEG é importante para a
redução da captura das partículas pelos macrófagos. A redução da
interação célula–partícula foi mais eficiente com PEG 20 kD do que PEG 5
kD, ambos apresentando uma mesma distância entre as cadeias ligadas à
superfície (Mosqueira et al., 1999, 2001a ).
Em outro trabalho Gref et al., (2000) estudaram a influência
da composição das partículas na adsorção protéica pela técnica de
eletroforese em gel bidimensional. Suspensões de nanopartículas foram
preparadas usando diferentes copolímeros do PLA, PCL e PLGA com o
PEG em diferentes massas molares. Estes autores observaram que a
adsorção de proteínas plasmáticas sobre as nanopartículas revestidas de
PEG foi drasticamente reduzida quando comparada com as partículas
convencionais. A quantidade de proteínas detectada sobre nanopartículas
de PLA 45 kDa - PEG 2 kDa foi 57% menor do que a quantidade adsorvida
sobre as nanopartículas constituídas apenas de PLA 40 kDa. Um
18
decréscimo acentuado da adsorção protéica também foi verificado quando
a massa molar do PEG foi alterada de 2000 para 5000. Entretanto, para
copolímeros apresentando PEG com massa molar maior que 5000, não foi
verificada uma redução proporcional na adsorção de proteínas às
partículas.
Estudos farmacocinéticos e de biodistribuição das
nanocápsulas de PLA-PEG, empregando polímeros radiomarcados, foram
realizados por Mosqueira et al., (2001). Nanocápsulas contendo cadeias
de PEG covalentemente ligadas à superfície das NC demonstraram um
perfil de biodistribuição modificado, particularmente para aquelas
partículas preparadas a partir de PLA-PEG 20 kDa e apresentando um teor
de PEG de 30% em relação à massa total do polímero. Essas
apresentaram um aumento de 12 vezes na concentração plasmática
versus tempo (AUC) em relação às nanocápsulas onde o poloxamer
estava revestindo as NC por adsorção (Mosqueira et al., 2001b). Estes
estudos reforçaram a necessidade da ligação covalente do PEG no
polímero formador das nanocápsulas, assim como o efeito do aumento do
comprimento da cadeia e da densidade de PEG no tempo de permanência
das partículas na circulação sangüínea.
Lenaerts et al., (1995) encapsularam ftalocianinas,
importantes agentes na terapia fotodinâmica tumoral, em nanocápsulas
cujas superfícies foram modificadas pela adsorção com poloxamers. Com
isso, os autores obtiveram a redução da fagocitose destas partículas
aumentando a concentração de ftalocianinas em tumores primários. O
emprego das nanocápsulas revestidas permitiu um acúmulo de
ftalocianinas cerca de 200 vezes maior nos tumores do que no sangue,
atingindo o valor máximo 12 horas após a injeção, demonstrando assim
que tal sistema pode fornecer um eficiente meio para vetorização em
tumores.
Reszka et al., (1997) compararam a biodistribuição de
mitoxantrona encapsulada em lipossomas unilamelares carregados
negativamente e em nanopartículas de polibutilcianocrilato revestidas ou
não com poloxamina 1508, em camundongos inoculados com células de
melanoma B16. Após determinação do fármaco por CLAE, os autores
19
verificaram uma diferença significativa na distribuição do mesmo para as
diferentes formulações testadas. Especialmente relevante foi o aumento da
concentração de mitoxantrona nos tumores, após administração das
nanopartículas, em comparação com as concentrações obtidas após a
administração dos lipossomas e da solução do fármaco. Igualmente maior
foi o efeito proporcionado pelas nanopartículas, na redução do crescimento
do tumor, após um período de 22 dias sem o aumento da toxicidade.
Bourdon et al., (2000) avaliaram o potencial de suspensões
coloidais de nanocápsulas preparadas a partir do PLA, PLA-poloxamina e
PLA-PEG, como veículo para liberação de meta-tetra-(hidroxifenil)-clorina
(mTHPC), empregado como um modelo de fotosensibilizante lipofílico na
terapia fotodinâmica do câncer. A captura, localização subcelular e
fototoxicidade desta substância foi verificada em macrófagos J774A1 e em
células tumorais de adenocarcinoma (HT 29). Estes autores observaram
que a captura das nanocápsulas pelos macrófagos foi limitada pela
presença de polietilenoglicol ligado covalentemente à parede das
nanocápsulas e que, para uma dose de 0,25 μg/mL de mTHPC, a sua
fototoxicidade foi reduzida, quando comparada com a solução da mesma
substância.
Enfim, nanocápsulas e nanopartículas contendo RU 58668,
um fármaco antiestrogênico utilizado no tratamento de câncer de ovário,
foram avaliadas quanto suas ações antitumoral e antiuterotrófica. Este
fármaco na forma não encapsulada (livre) diminui o tumor em doses
equivalentes a 50 mg/Kg/semana. Neste estudo, um efeito equivalente foi
observado por meio da utilização das nanoesferas na dose de 4,3
mg/Kg/semana, ou seja, cerca de 10 vezes menor, indicando assim o
aumento da eficácia terapêutica do fármaco na forma nanoencapsulada.
As nanocápsulas foram igualmente eficazes, mas a mesma resposta
terapêutica foi observada numa dose 2,5 vezes menor, sugerindo uma
melhor eficiência do fármaco liberado de nanocápsulas do que de
nanoesferas (Ameller et al, 2003a).
1.4- Marcador fluorescente de Nanocápsulas: ftalocianina
20
As ftalocianinas foram descobertas no início dos anos 1900
como impurezas em preparações industriais de ftalamida e
subseqüentemente identificadas como parentes da família das porfirinas
(Gorman et al., 2006). As porfirinas são compostos exclusivamente
sintéticos que podem ser facilmente preparados por métodos clássicos e
minuciosos processos de purificação (Sharman et al., 1999).
N
N
N
N
Al
+
Cl
-
Figura 1- Estrutura molecular da AlClPC.
Estes compostos estão sendo intensivamente investigadas
quanto as suas potencialidades como agentes em terapia fotodinâmica
(PDT), como uma nova modalidade no tratamento do câncer. Nestes
casos as ftalocianinas são absorvidas pelos tecidos e posteriormente são
fotossensibilizadas (excitadas) usando laser, gerando radicais livres
citotóxicos e oxigênio singleto. As ftalocianinas (PC) constituem-se de uma
unidade cíclica tetrapirrólica com as unidades pirrólicas unidas por átomos
de nitrogênio, sendo que a conjugação do macrociclo é estendida por
anéis benzênicos sobre as quatro unidades pirrólicas, resultando em uma
forte banda de absorção na região do vermelho do espectro visível.
Constituem-se de moléculas planas e simétricas, sendo que seus cristais
moleculares são brilhantes e, às vezes, metálicos. Sua estabilidade
térmica e química favorece sua utilização tecnológica (Toma et al., 2005).
Esses compostos apresentam alta absorção em comprimento de onda de
650-680nm, faixa de ótima penetração da luz pelo tecido e também de
grande seletividade em relação a absorção dos componentes biológicos.
21
As ftalocianinas e, também, as naftalocianinas não absorvem luz entre
400-600nm, o que reduz o risco de causarem fotosensibilidade devido à
exposição à luz solar (Moan e Berg, 1992; Jori, 2004). No entanto, as
ftalocianinas mais utilizadas in vivo, como a ZnPc e AlClPC (Figura 01) são
insolúveis em água e na maioria dos solventes orgânicos compatíveis com
a administração em animais. Por outro lado, a insolubilidade das
ftalocianinas em água e suas propriedades físico-químicas, tornam esta
molécula um marcador fluorescente atrativo para a incorporação no interior
hidrofóbico de nanocápsulas. A produção de nanocápsulas fluorescentes
com uma marcação estável permite o estudo do comportamento dessas
nanoestruturas in vitro e in vivo de maneira confiável. (Paula et al., 2008,
Nunes et al.,2004, Gomer et al., 1991).
22
2- OBJETIVO GERAL
Desenvolver suspensões de nanocápsulas com diferentes
características de superfície (natureza e carga superficial) contendo um
marcador fluorescente, o AlClPc, para avaliar o efeito do aumento das
doses administradas sobre o sistema fogocitário mononuclear in vitro e in
vivo, especialmente na concentração plasmática e tecidual (fígado) das
suspensões coloidais.
23
Capítulo 1:
DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO
ANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DA AlClPC EM
NANOCÁPSULAS, EM PLASMA E FÍGADO DE
CAMUNDONGOS
24
1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver e validar metodologia analítica para quantificação da
ftalocianina de cloro e alumínio em formulações farmacêuticas.
Desenvolver e validar metodologia analítica para quantificação da
AlClPC em plasma e fígado de camundongos utilizando a
ftalocianina de Zinco (ZnPc) como padrão interno.
25
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1- Materiais
AlClPc e ftalocianina de zinco (ZnPc) foram adquiridas pela
Sigma-Aldrich (Brazil). Acetona, metanol, dimetilformamida grau CLAE
usados para a análise em CLAE foram forncecidos pela Tedia (Brazil).
Água Milli-Q foi purificada pelo sistema Symplicity
®
System (Millipore,
Beldford, USA) e foi utilizada para preparo de todas as soluções. Acetato
de etila, grau analítico, foi fornecido Vetec (Rio de Janeiro, Brazil).
2.2- Desenvolvimento e Validação do Método Analítico para
Quantificação de AlClPC em Nanocápsulas Poliméricas
2.2.1- Condições cromatográficas
Empregou-se para separação coluna de marca
Phenomenex®, modelo Gemini 5μ C18(2), de 150 mm de comprimento e
4,60 mm de diâmetro interno, contendo partículas de 5 μm e pré-coluna de
marca Phenomenex®, modelo AJ0-4287 C18, de 0,5 cm de comprimento
4,6 mm de diâmetro interno, contendo partículas de 5 μm. A fase móvel foi
constituída pela mistura de metanol, dimetilformamida (DMF) e acetona, na
proporção de 90:5:5 (v/v/v). Filtrou-se a solução em membrana de acetato
de celulose, com 47 mm de diâmetro e poro de 0,22 μm. Para
degaseificar, levou-se a solução ao banho ultrassônico por trinta minutos.
O fluxo e temperatura utilizados foram de 1,0 mL/min e 30°C,
respectivamente. Para análise foram injetados 10 μL de cada amostra, e o
comprimento de onda empregado no detector de fluorescência foi de 610
nm para excitação e 675 nm para emissão. O tempo de corrida de cada
amostra foi de 5 minutos.
2.2.2- Linearidade
A linearidade indica a faixa de concentração do fármaco em
que as respostas obtidas pela metodologia são diretamente proporcionais
26
à quantidade de fármaco presente na amostra (United States
Pharmacopeia, 2007). A avaliação foi realizada por meio da construção de
cinco curvas de calibração com soluções-padrão de AlClPC que variaram
de 0,025 μg/mL a 5 μg/mL. A equação da reta foi obtida por regressão
linear, através do método dos mínimos quadrados (Brasil, 2003b).
2.2.3- Precisão
A precisão de um método indica o grau de concordância
entre resultados individuais obtidos pela aplicação repetitiva do método à
mesma amostra (United States Pharmacopeia, 2007). Avaliou-se este
parâmetro analisando-se três diferentes concentrações (0,05; 2,0 e 4,0
µg/mL), em réplicas de cinco, num mesmo dia (precisão intra-ensaio). Os
resultados foram expressos pelo coeficiente de variação dos resultados
destas análises, conforme equação abaixo:
CV(%) = DP ×100
Cmédia
no qual:
CV(%) = coeficiente de variação em porcentagem
DP = desvio-padrão
Cmédia = concentração média determinada
2.2.4- Exatidão
A exatidão é definida como a proximidade entre os resultados
obtidos utilizando-se o método proposto e o valor real, podendo ser
expressa em termos de porcentagem de recuperação (United States
Pharmacopeia, 2007). A determinação deste parâmetro foi realizada
conforme recomendado pela AOAC (Association of Official Analytical
Chemistis, 1995). Adicionaram-se quantidades conhecidas e crescentes de
padrão de AlClPC a soluções amostras. Neste caso, a exatidão foi
expressa como porcentagem recuperada. A avaliação da exatidão como
porcentagem recuperada pode indicar possíveis interferências de
excipientes da formulação.
Exatidão= Cmédia x100
Cteórica
27
no qual:
Cmédia = concentração média determinada
Cteórica = concentração teórica, nominal
2.3- Validação do Método para Quantificação de AlClPC em Plasma e
Fígado de Camundongo
A validação da metodologia foi realizada por meio da
determinação dos parâmetros de especificidade, recuperação, curva de
calibração, limite de quantificação, precisão, exatidão e estabilidade
conforme a Resolução 899 (Brasil, 2003b).
2.3.1- Condições Cromatográficas
Foram utilizadas as mesmas coluna e pré-colunas citadas
anteriomente, entretanto pequenas modificações foram feitas na fase
móvel. A fase móvel foi constituída por mistura de metanol,
dimetilformamida (DMF) e acetona, na proporção de 80:5:15 (v/v/v).
Filtrou-se a solução em membrana de acetato de celulose, com 47 mm de
diâmetro e poro de 0,22 μm. Para degaseificar, levou-se a solução ao
banho ultrassônico por trinta minutos. O fluxo e temperatura utilizados
foram de 1,0 mL/min e 30°C, respectivamente. Para análise foram
injetados 25 μL de cada amostra, e o comprimento de onda empregado no
detector de fluorescência foi de 610 nm para excitação e 675 nm para
emissão. O tempo de corrida de cada amostra foi de 7 minutos.
2.3.2- Preparo de Amostras de Plasma Padrão da Curva de Calibração
As amostras de plasma padrão da curva de calibração foram
preparadas a cada dia de análise das amostras de plasma dos
camundongos a partir de soluções-padrão de 150 a 1000 ng/mL de
ftalocianina de cloro e alumínio (AlClPC) em solução etanólica, conforme
descrito no Quadro 01. Adicionaram-se 10 μL de solução-padrão de
ftalocianina de zinco na concentração de 5000 ng/mL (ZnPc, padrão-
interno) aos tubos de ensaio. Em seguida, acrescentaram-se 10 μL das
soluções-padrão de AlClPC e 80 μL de plasma branco. As amostras foram
homogeneizadas em agitador de tubo tipo vórtex por 15 segundos, e
28
submetidas ao procedimento de purificação imediatamente após o
preparo. As amostras de plasma padrão da curva de calibração foram
purificadas adicionando-se 0,5 mL de acetato de etila e homogeneizando-
se em agitador vórtex por 10 minutos. Após centrifugação a 10000 rpm por
10 minutos, a solução resultante foi filtrada em unidade filtrante Millex com
membrana Durapore® de 13 mm de diâmetro e poro de 0,45 μm. Este
procedimento foi repetido mais duas vezes. O solvente foi evaporado sob
baixa pressão em um dessecador ao abrigo da luz. Ressuspendeu-se o
resíduo em 100 μL de fase móvel para injeção em CLAE.
2.3.3- Preparo de Amostras de Fígado Padrão da Curva de Calibração
A cada 0,2g de fígado foram acrescentados solução de PBS
até completar o volume de 1 mL. O tecido foi triturado em um aparelho
sonicador Vibra Cell™ VCX750 (40%) em banho de gelo por 1 minuto.
As amostras de fígado padrão da curva de calibração foram
preparadas a cada dia de análise das amostras de plasma dos
camundongos a partir de soluções-padrão de 150 a 1000 ng/mL de AlClPC
em solução etanólica, conforme descrito no Quadro 01. Adicionaram-se 10
μL de solução-padrão de ftalocianina de zinco na concentração de 5000
ng/mL (ZnPc, padrão-interno) a tubos de ensaio. Em seguida,
acrescentaram-se 10 μL das soluções-padrão de AlClPC e 80 μL do
homogenato de fígado. As amostras foram homogeneizadas em agitador
de tubo tipo vórtex por 15 segundos, e submetidas ao procedimento de
purificação imediatamente após o preparo. As amostras de fígado padrão
da curva de calibração foram purificadas adicionando-se 0,5 mL de acetato
de etila e homogeneizadas em agitador vórtex por 10 minutos. Após
centrifugação a 10000 rpm por 10 minutos, a solução resultante foi filtrada
em unidade filtrante Millex com membrana Durapore® de 13 mm de
diâmetro e poro de 0,45 μm. Este procedimento foi repetido mais duas
vezes O solvente foi evaporado sob baixa pressão em um dessecador ao
abrigo da luz. Ressuspendeu-se o resíduo em 100 μL de fase móvel para
injeção em CLAE.
29
2.3.4- Especificidade
A especificidade é definida como a capacidade do método
em distinguir a substância analisada das outras presentes na amostra
(Causon, 1997). Na análise de amostras biológicas, interferentes
potenciais incluem componentes endógenos, metabólitos, produtos de
decomposição ou medicação administrada concomitantemente ao estudo,
além dos anticoagulantes, quando utilizados.
Tal parâmetro foi investigado pela análise de seis amostras
de fígado e plasma branco (plasma obtido de seis animais sadios), sendo
quatro plasmas normais e dois plasmas hemolisados para verificação da
existência de interferência por parte de componentes endógenos
(Brasil, 2003b). A amostra de plasma hemolisado foi obtida por
congelamento do sangue e posterior centrifugação por 10 minutos a
3000 rpm.
2.3.5- Recuperação
A recuperação indica a eficiência do procedimento de
purificação das amostras estabelecido no método e indica a quantidade do
fármaco obtida após a amostra de plasma ser processada, ou seja, avalia
se as condições empregadas no método são adequadas o suficiente para
purificar a amostra. Assim, a recuperação corresponde ao resultado obtido
após análise de amostra de plasma “branco” acrescida de padrão (PA),
submetida ao pré-tratamento, expresso como porcentagem do resultado
obtido após análise de padrão puro, não submetido ao pré-tratamento
(Causon, 1997).
Esse parâmetro foi determinado comparando-se resultados
de análises de amostras de controle de qualidade submetidas ao processo
de purificação a resultados de análises de amostras de soluções padrões
não submetidos a esse processo, mas que foram adicionadas as amostras
de brancos submetidas ao processo de purificação. A resposta das
amostras não submetidas ao processo de purificação representa a
quantidade total de fármaco presente na amostra de plasma, ou seja,
100%, enquanto que a resposta das amostras submetidas ao processo de
30
purificação representa a porcentagem recuperada. Embora porcentagens
próximas a 100 de recuperação sejam desejáveis, admitem-se valores
menores de recuperação, desde que o método seja preciso e exato
(Brasil, 2003b).
Este parâmetro foi investigado em três diferentes
concentrações (concentrações das amostras de plasma e fígado do
controle de qualidade) e cinco repetições, conforme recomendado pela
Resolução no. 899 (Brasil, 2003b).
2.3.6- Limite de Quantificação Inferior
O limite de quantificação inferior deve representar a menor
concentração que pode ser determinada com exatidão e precisão
aceitáveis (Brasil, 2003b). O limite de quantificação foi determinado
utilizando-se cinco amostras de concentrações decrescentes e conhecidas
do fármaco até o menor nível determinável, com precisão e exatidão
aceitáveis. A exatidão deve estar entre ± 20 % do valor nominal da
concentração, com coeficiente de variação de, no máximo, 20 %
(Bressolle et al., 1996).
2.3.7- Linearidade
A linearidade indica a relação entre concentração de analito e
resposta do método (Bressolle et al., 1996), representada, neste estudo,
pela área do sinal cromatográfico. A linearidade é obtida através da
construção da curva de calibração, que representa a relação entre a
resposta do instrumento e a concentração conhecida do analito
(Brasil, 2003b). A curva foi construída de acordo com os dados
apresentados no quadro 01.
Na construção da curva de calibração utilizaram-se amostras
de plasma e fígado padrão da curva de calibração em sete concentrações
diferentes de AlClPC e cinco repetições. O intervalo da curva de calibração
foi definido entre o limite de quantificação inferior e 120% da concentração
mais alta que se pretendia analisar. Estabeleceu-se correlação linear entre
concentração, considerada variável independente (x), e razão entre as
áreas dos sinais cromatográficos do padrão e padrão interno, considerada
31
variável dependente (y). Os parâmetros de correlação foram estimados
através do método dos mínimos quadrados (Brasil, 2003b).
Juntamente com a curva de calibração, realizou-se a análise
da amostra de plasma e fígado “branco” (amostra de plasma e fígado
isento de padrão e padrão interno), e da amostra “zero” (plasma e fígado
isento de padrão adicionado de padrão interno) com a finalidade de
garantir a ausência de picos interferentes (Brasil, 2003b).
Quadro 1: Preparo das amostras de plasma - padrão da curva de
calibração -utilizadas para quantificação de AlClPC em plasma e fígado
Concentração da
solução-padrão
(ng/mL)
Volume de
solução-
padrão
(μL)
Volume de plasma ou
homogenato de fígado
branco (μL)
Concentração final
presente na curva
de calibração
(ng/mL)
150
10
80
15
200
10
80
20
400
10
80
40
500
10
80
50
800
10
80
80
900
10
80
90
1000
10
80
100
2.3.8- Precisão
A precisão de um método analítico representa o grau de
concordância dos resultados obtidos quando um procedimento analítico é
aplicado repetidamente, sendo expressa como coeficiente de variação
(CV) dessas medidas. A precisão intra-dia refere-se ao CV obtido por
repetição do método com o mesmo analista, utilizando o mesmo
equipamento e os mesmos reagentes, em curto intervalo de tempo (por
exemplo, no mesmo dia). A precisão inter-dias é obtida por meio de
alteração de condições, como mudança de analista ou reagentes e
utilização do método durante várias semanas ou meses (Causon, 1997).
Este parâmetro foi determinado analisando-se amostras de plasma de
controle de qualidade em três concentrações diferentes e em cinco
réplicas no mesmo dia (precisão intra-dia) e em dias consecutivos
32
(precisão inter-dias), e foi calculado segundo a Equação descrita no item
3.2.3.
2.3.9- Exatidão
A exatidão de métodos analíticos é uma medida de erro
sistemático e é definida como concordância entre o valor determinado e o
valor real (Causon, 1997). O referido parâmetro foi determinado pela
análise de amostras de plasma de controle de qualidade em três diferentes
concentrações e em cinco repetições em um mesmo dia (exatidão intra-
dia) e em dias diferentes (exatidão inter-dias), e foi calculado segundo a
equação:
Exatidão= Cmédia x100
Cteórica
2.3.10- Estabilidade
A determinação da estabilidade de um fármaco numa matriz
biológica depende de vários fatores, tais como propriedades químicas do
fármaco, condições de armazenamento da amostra, tipo de matriz
biológica e material de acondicionamento. A determinação da estabilidade
de uma amostra é fundamental para garantir que a concentração da
substância a ser analisada não sofreu alteração entre a sua coleta e o
momento da análise (Causon, 1997). Assim, é importante que se
determine a estabilidade das amostras de AlClPc em plasma em
temperatura ambiente, em ciclos de congelamento e descongelamento e
após longos períodos de armazenamento. A avaliação da estabilidade pós-
processamento das amostras permite que amostras processadas possam
ser avaliadas após longos períodos de espera no autoinjetor do sistema
cromatográfico. Além disso, o monitoramento da estabilidade das
soluções-padrão é fundamental para garantir a confiabilidade dos
resultados obtidos das análises das amostras de plasma de voluntários.
Conforme recomendado pela Resolução no. 899 (Brasil, 2003b), foram
determinadas as estabilidades descritas a seguir.
33
2.3.10.1- Estabilidade de Curta Duração
Foram utilizadas três amostras de plasma padrão de controle
de qualidade em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas a
descongelamento natural e mantidas à temperatura ambiente durante 4
horas e submetidas ao processo de purificação. Os resultados foram
comparados com amostras descongeladas e imediatamente analisadas.
2.3.10.2- Estabilidade em Ciclos de Congelamento e
Descongelamento
Foram utilizadas três amostras de plasma padrão de controle
de qualidade (CQ) em três concentrações (baixa, média e alta),
submetidas às seguintes condições: congelamento a –80°C por, no
mínimo, 12 horas, descongelamento e recongelamento por, no mínimo, 12
horas e assim sucessivamente até completar três ciclos. A concentração
do fármaco nas amostras de plasma padrão de controle de qualidade foi
determinada nos três ciclos, inclusive no tempo zero, correspondente à
preparação das amostras de plasma de controle de qualidade e análise
das mesmas sem submetê-las ao congelamento.
2.3.10.3- Estabilidade Pós-Processamento
Foram utilizadas três amostras de plasma padrão de controle
de qualidade em três concentrações (baixa, média e alta), submetidas a
descongelamento natural, a temperatura ambiente, e analisadas nas
mesmas temperatura e condições em que foram analisadas as amostras
de plasma de voluntários. A avaliação deste parâmetro contemplou o
período máximo de espera das amostras processadas no auto-injetor do
cromatógrafo (até 48 horas).
2.3.10.4- Estabilidade de Longa Duração
Amostras de plasma padrão de controle de qualidade em três
concentrações (baixa, média e alta) foram mantidas a –80°C por um
período correspondente ao tempo em que as amostras de plasma de
34
camundongos ficariam armazenadas. Estas amostras foram analisadas no
dia de sua preparação e após 60 dias, em triplicata.
2.3.10.5- Estabilidade das Soluções Padrão
Para avaliar a estabilidade das soluções-padrão em solução
de etanol, estas foram analisadas diariamente durante as etapas de
validação e análise de amostras de plasma dos animais, com
monitoramento diário dos sinais cromatográficos obtidos. Os resultados
obtidos foram comparados com os resultados de soluções-padrão recém-
preparados.
35
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1- Validação do Método Analítico para Quantificação de AlClPC em
Nanocápsulas Poliméricas
A validação de um método, através de estudos
experimentais, deve garantir que o método analítico empregado atenda às
exigências das aplicações analíticas, assegurando a qualidade e a
confiabilidade dos resultados (Kano, 2002). Apesar de muitos estudos
estarem sendo feitos para avaliação das atividades farmacológicas das
ftalocianinas, como atividades antitumoral e antimicrobiana, não há relatos
na literatura de estudos feitos no sentido do desenvolvimento de métodos
analíticos para quantificação das ftalocianinas em preparações
farmacêuticas e em meios biológicos. Alguns estudos realizam a
quantificação dessa classe de composto em meios biológicos por
espectroscopia (de Paula, 2008). Como esta técnica não permite a
separação de possíveis interferentes na amostra, principalmente em
presença de componentes biológicos, desenvolvemos e validamos um
método por CLAE com detecção de fluorescência para quantificação da
ftalocianina de cloro e alumínio (AlClPC) em formulações de nanocápsulas
poliméricas, e em presença de plasma e fígado de camundongos, visando
os estudos de biodistribuição e farmacocinéticos posteriores.
3.1.1- Linearidade
O método foi linear na faixa de concentração de 0.025 μg/mL
a 5 μg/mL. A Figura 02 representa a curva de calibração média obtida a
partir da análise de diferentes concentrações do padrão de AlClPC em
etanol, em seguida, análise cromatográfica com excitação a 610 nm e
emissão a 675 nm. A Tabela 01 apresenta os parâmetros relativos à curva
de calibração média. Os resultados expressam a média de cinco
determinações por concentração. Na figura 03 estão plotados os
cromatogramas dos limites de quantificação superior e inferior.
36
Figura 2- Curva de calibração média do método analítico para quantificação de AlClPC em NC.
Tabela 1-Parâmetros relativos à curva de calibração média do método analítico para quantificação
de AlClPC.
Parâmetro
Valor
Coeficiente angular (a)
13159189
Coeficiente linear (b)
2094953
Coeficiente de correlação (r)
0,9969
Em um segundo momento, foi avaliado se as matrizes
poliméricas utilizadas para preparo das nanocápsulas interfeririam na
detecção da AlClPC. Como pode ser observado nos cromatogramas
apresentado na figura 04, não foi observada a presença de nenhum
interferente para os componentes presentes na formulação de
nanocápsulas.
Figura 3- Cromatogramas de Padrão AlClPC (PA) a 0,025ug/mL (em vermelho) e 5,0 ug/mL (em
preto)Correspondentes aos limite de quantificação superior e inferior, respectivamente.
37
Figura 4- Cromatogramas de especificidade: matrizes poliméricas PLA; PLA-PEG; PLA-QUI e
demais componentes das formulações, sobreposto a cromatogramas de PA (AlClPC) a 0,25 ug/mL.
3.1.2- Precisão
A Tabela 02 apresenta os resultados referentes à precisão do
método, em três diferentes concentrações e cinco réplicas. O método
desenvolvido foi preciso dentro da faixa de linearidade avaliada, pois
apresentou valores de precisão entre 1,80 e 10,63.
Tabela 2- Precisão do método analítico utilizado para quantificação de AlClPC em NC. DP = desvio
padrão, CV = coeficiente de variação. Cada valor representa a média de cinco determinações.
Concentração µg/mL
0,05
2,0
4,0
Média 0,06
2,09
4,12
DP 0,006
0,37
0,22
CV(%) 10,63
1,80
5,44
3.1.3- Exatidão
O método foi exato dentro da faixa de linearidade avaliada. A
exatidão do método, avaliada como porcentagem recuperada, variou entre
101,43 e 105,55%. Os resultados estão apresentados na Tabela 03.
Tabela 3- Exatidão do método analítico utilizado para quantificação de AlClPC em NC, calculada
como porcentagem recuperada. Cada valor representa a média de três determinações.
Concentração µg/mL
0,05 (%)
2,0(%)
4,0(%)
Média 101,43
104,67
105,55
DP 9,37
1,88
1,62
CV 9,23
1,80
1,54
38
3.2- Validação do Método Analítico para Quantificação de AlClPC em
Plasma e Fígado de Camundongo
3.2.1- Especificidade
A seletividade e/ou especificidade de um método bioanalítico
é um importante parâmetro a ser avaliado para garantir que a quan-
tificação do analito de interesse não seja afetada pela presença de
metabólitos, produtos de degradação, fármacos co-administrados ou
compostos endógenos (Lang et al., 1991, Buick et al., 1990).O método
desenvolvido apresentou boa separação dos analitos entre si e entre estes
e os componentes do plasma branco e hemolisado (Figuras 05 e 06) e
fígado (Figura 07). Os sinais cromatográficos referentes à AlClPC e seu
padrão interno apresentaram adequada resolução, com tempos de
retenção de 1,8 e 4,85 minutos respectivamente (Figura 05). A
comparação entre os cromatogramas obtidos de plasma branco normal e
hemolisado e plasma obtido após adição de padrão de referência de
AlClPC e padrão-interno, assim como as amostras de fígado branco e
fígado após a adição do padrão não revelaram a presença de interferentes
nos tempos de retenção dos mesmos.
Figura 5- Cromatograma referente à especificidade de plasma branco (verde), sobreposto a uma
amostra na concentração de 20 ng/mL de padrão (PA) e 500 ng/mL de padrão interno (PI) em preto.
39
Figura 6- Cromatogramas referente à especificidade de plasma hemolisado (azul), sobreposto a
uma amostra na concentração de 20 ng/mL de PA e 500 ng/mL de PI (preto). Com tempos de
retenção para PA de 1,8 minutos e para PI de 4,85 minutos
Figura 7- Cromatogramas referente à especificidade de fígado isento de PA (AlClPC) e PI (marron),
sobreposto a uma amostra na concentração de 20 ng/mL de PA e 500 ng/mL de PI (preto). Com
tempos de retenção para PA de 2,3 minutos e para PI de 5,05 minutos
3.2.2- Recuperação
A recuperação avalia a eficiência do método de tratamento
das amostras biológicas. Este parâmetro é calculado comparando-se a
resposta obtida para o analito adicionado na matriz biológica e extraído
com a resposta obtida para o analito em amostras preparadas em solvente
e, conseqüentemente, não extraídas, as quais representam 100%
(ANVISA e FDA).
Para a avaliação da recuperação, devem-se utilizar
concentrações em três níveis: baixo, médio e alto, de acordo com a curva
de calibração. Comumente, utilizam-se as mesmas concentrações
empregadas como controles de qualidade do método. Nos métodos
bioanalíticos, a recuperação deve ser também avaliada para os compostos
40
utilizados como padrão interno, independente da concentração usada.
Aceita-se uma variação de até 15% do valor de recuperação determinado
para os analitos de interesse.
Embora altos valores de recuperação sejam desejáveis para
maximizar a sensibilidade do método, não é necessário que este valor seja
de 100% e, sim, que a recuperação seja consistente, precisa e reprodutiva
(Shah et al., 2000).
A recuperação média do procedimento de purificação de
amostras de plasma e fígado está apresentada na tabela 04.
O padrão-interno utilizado no presente trabalho foi a ZnPc, que sendo
estruturalmente semelhante à AlClPC, apresentou adequada sensibilidade,
seletividade e % de recuperação, tanto nas amostras de plasma quanto
nas de fígado. Além disso, o ZnPc já foi utilizado em outros trabalhos
como padrão interno (Bohn e Walczyk, 2004).
Tabela 4- Recuperação média do procedimento de purificação das amostras de plasma e fígado de
controle de qualidade adicionadas de AlClPC (padrão) e ZnPc (padrão interno). Cada valor
representa a média de seis determinações. DP = desvio padrão, CV=coeficiente.
Concentração
Recuperação (%)
(ng/mL)
PA (CV%)
PI (CV%)
Plasma
20
94,10
96,58
40
95,67
95,33
80
98,56
98,13
Média
96,11
96,68
DP
1,92
1,14
CV
1,92
1,18
Fígado
20
96,32
89,96
40
101,53
96,34
80
99,96
100,97
Média
99,27
95,76
DP
2,67
5,52
CV
2,69
5,77
41
3.2.3- Limite de Quantificação Inferior
O limite de quantificação foi de 15ng/mL, com precisão e
exatidão de 11,80% e 105,64%, respectivamente para o plasma e com
precisão e exatidão de 12,93% e 99,27%, respectivamente para o fígado.
Valores adquiridos das curvas de linearidade para o plasma e fígado.
3.2.4- Linearidade
A curva de calibração corresponde ao modelo matemático
que estabelece uma relação entre a resposta instrumental (área/altura da
banda cromatográfica) e a concentração do analito. É necessário elaborar
uma curva de calibração para cada analito que se deseja determinar e
para cada corrida analítica, de acordo com ANVISA e FDA.
O modelo de calibração deve ser construído a partir da
análise de, no mínimo, 6 a 8 concentrações conhecidas do analito
(padrões de calibração) adicionadas na mesma matriz biológica para a
qual o método foi desenvolvido e será aplicado (superposição de
matriz)(Ribani, et al., 2004) As concentrações estabelecidas devem
contemplar o intervalo de variação esperado, desde o LQ até 120% da
máxima concentração que se pretende analisar.(ANVISA, FDA) Além
disso, deve-se realizar análise da amostra branco (matriz isenta da adição
do analito e do padrão interno, quando for o caso) e da amostra zero
(matriz adicionada do padrão interno, quando for o caso).
Os critérios para aceitação da curva de calibração seguem
normas estabelecidas por guias de validação publicados por agências
reguladoras oficiais. De acordo com as normas atualmente em vigor da
ANVISA e FDA aceita-se um coeficiente de variação menor ou igual a 20%
em relação à concentração nominal para o LQ e menor ou igual a 15%
para as demais concentrações. Além disso, o coeficiente de correlação
linear (r) deve ser igual ou superior a 0,98.
Obteve-se correlação linear entre concentração de fármaco e
resposta do método na faixa de concentração de 15 ng/mL a 100 ng/mL de
AlClPC em plasma e fígado. A Figura 08 apresenta a curva de calibração
definida no método, e os parâmetros relativos a ela estão representados
42
na Tabela 05 para o plasma. A Figura 09 apresenta a curva de calibração
definida no método, e os parâmetros relativos a ela estão representados
na Tabela 06 para o fígado. Nas figuras 10 e 11 estão plotados
cromatogramas de plasma e fígado respectivamente.
Figura 8- Curva de calibração do método analítico para quantificação de AlClPC em plasma por
cromatografia líqüida de alta eficiência.
Tabela 5- Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação de
AlClPC em plasma por cromatografia líquida de alta eficiência.
Parâmetro
Valor
Coeficiente angular (a)
0,0235
Coeficiente linear (b)
0,0207
Coeficiente de correlação (r)
0,9873
Figura 9- Curva de calibração do método analítico para quantificação de AlClPC em fígado por
cromatografia líqüida de alta eficiência.
43
Tabela 6- Parâmetros relativos à curva de calibração do método analítico para quantificação de
AlClPC em fígado por cromatografia líquida de alta eficiência.
Parâmetro
Valor
Coeficiente angular (a)
0,0221
Coeficiente linear (b)
0,1650
Coeficiente de correlação (r)
0,9913
Figura 10- Cromatogramas de amostras de plasma extraído nas concentrações de 20ng/mL
(vermelho) e 100 ng/mL (preto) PI=500 ng/Ml.
Figura 11- Cromatogramas de amostras de plasma extraído nas concentrações de 20ng/mL
(vermelho) e 100 ng/mL (preto) PI=500 ng/Ml.
3.2.5- Precisão
A precisão do método esteve entre 4,59% e 10,56% para
amostras de plasma analisadas no mesmo dia (intra-ensaio) e entre 6,24%
e 10,94% para amostras analisadas em dias diferentes (inter-ensaios). Os
resultados estão apresentados na Tabela 07. Para as amostras de fígado
a precisão do método esteve entre 7,34% e 11,41% para amostras
analisadas no mesmo dia (intra-ensaio) e entre 8,64% e 15,11% para
44
amostras analisadas em dias diferentes (inter-ensaios). Os resultados
estão apresentados na Tabela 07.
3.2.6- Exatidão
Todas as amostras de controle de qualidade em plasma
adicionadas de AlClPC apresentaram desvios em relação aos valores
nominais menores que 15%. A exatidão do método para amostras
analisadas no mesmo dia variou de 98,27 % a 107,31% e para amostras
analisadas em diferentes dias variou de 93,81% a 104,02%. Os resultados
estão resumidos na Tabela 07. As amostras de fígado para controle de
qualidade adicionadas de AlClPC apresentaram desvios em relação aos
valores nominais menores que 15%. A exatidão do método para amostras
analisadas no mesmo dia variou de 100,97 % a 100,85% e para amostras
analisadas em diferentes dias variou de 90,95% a 104,02%. Os resultados
estão resumidos na Tabela 07.
Tabela 7- Resultados de precisão e exatidão intra e inter-ensaios do método analítico para
quantificação de AlClPC em plasma e fígado. Os resultados expressam a média da análise de 6
amostras, durante 3 dias.
Concentração
Precisão (%)
Exatidão (%)
ng/mL
Intra-ensaio
Inter-ensaios
Intra-ensaio
Inter-ensaios
Plasma
20
5,50
8,23
107,31
96,14
40
8,77
9,40
98,27
93,81
80
0,99
6,24
101,32
104,02
Fígado
20
12,71
11,52
90,95
99,48
40
12,44
13,87
99,95
104,48
80
10,06
11,44
103,15
103,45
3.2.7- Estabilidade
Em relação aos critérios de aceitação dos estudos de
estabilidade, algumas considerações são encontradas na literatura. Não há
uma concordância sobre o critério de aceitação que define a estabilidade
45
aceitável para as soluções-padrão. Entretanto, o consenso é que a
degradação deve ser pequena, uma vez que estas soluções são usadas
no preparo dos padrões de calibração e amostras CQ. (Shah et al., 2007)
Para os demais estudos de estabilidade, as amostras serão consideradas
estáveis quando não se observar desvio superior a 15% do valor obtido
para as amostras recém-preparadas.
3.2.7.1- Estabilidade de Curta Duração
Os resultados da avaliação da estabilidade de curta duração
mostraram que amostras de plasma e fígado de controle de qualidade
mantidas à temperatura ambiente por 4 horas mantiveram-se estáveis
(Tabela 08 e 09).
Tabela 8- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas após permanência à
temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Amostras processadas após 4 horas à
nominal
imediatamente após o preparo
temperatura ambiente
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,43
5,08
92,14
20,94
7,05
104,75
12,61
40
38,07
6,53
95,17
40,44
0,97
101,09
5,92
80
85,89
4,45
107,37
75,51
2,42
94,38
-12,99
Tabela 9- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas após permanência à
temperatura ambiente por 4 horas. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Amostras processadas após 4 horas à
nominal
imediatamente após o preparo
temperatura ambiente
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,19
13,28
90,95
17,36
13,05
86,80
-4,15
40
39,79
14,02
99,48
35,78
10,77
89,44
-10,04
80
79,96
14,06
99,95
83,65
1,33
104,56
4,61
3.2.7.2- Estabilidade em Ciclos de Congelamento e Descongelamento
Freqüentemente, as amostras do estudo são congeladas e
descongeladas para re-análises. Por esse motivo, deve ser avaliada a
estabilidade do analito na matriz biológica após, no mínimo, três ciclos de
46
congelamento e degelo. Um experimento para avaliar este tipo de
estabilidade é proposto nos guias para validação de métodos bioanalíticos
elaborados pelo FDA e pela ANVISA, amostras CQ devem ser congeladas
na temperatura pretendida para o armazenamento das amostras do estudo
(normalmente a –20 ̊C ou –80 ̊C) e mantidas nessa temperatura por 24
horas. Depois desse período, as amostras devem ser submetidas ao
descongelamento à temperatura ambiente. Quando completamente
descongeladas, as amostras devem ser novamente congeladas, na
mesma temperatura, por 12 a 24 horas e, então, descongeladas. Este ciclo
de congelamento e degelo é repetido, no mínimo, mais duas vezes. O
analito deve ser quantificado após o último ciclo de congelamento e degelo
ou após cada ciclo. Em ambos os casos, os resultados devem ser
comparados com aqueles obtidos nas análises das amostras recém-
preparadas ou com os valores nominais dos CQ.
A avaliação dos resultados da estabilidade das amostras de
plasma de controle de qualidade avaliadas por três ciclos de congelamento
e descongelamento mostrou que estas se mantiveram estáveis (Tabelas
10,12 e 14). Os resultados de estabilidade das amostras de fígado de
controle de qualidade estão resumidos nas Tabelas 11,13 e 15, mostrando
que também se mantiveram estáveis após os ciclos de congelamento e
descongelamento.
Tabela 10- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o
preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de congelamento e
descongelamento. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Ciclo 1
Nominal
imediatamente após o preparo
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,43
5,08
92,14
20,50
12,32
102,52
10,38
40
38,07
6,53
95,17
33,96
5,96
86,78
-8,39
80
85,89
4,45
107,37
75,41
8,62
94,27
-13,10
47
Tabela 11- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas imediatamente após o
preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a um ciclo de congelamento e
descongelamento. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Ciclo 1
Nominal
imediatamente após o preparo
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,19
13,28
90,95
20,63
14,99
103,15
12,20
40
39,79
14,02
99,48
36,91
3,59
92,28
-7,20
80
79,96
14,06
99,95
81,91
2,28
102,38
2,43
Tabela 12- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o
preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de congelamento e
descongelamento. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Ciclo 2
Nominal
imediatamente após o preparo
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,43
5,08
92,14
18,55
2,35
92,76
0,62
40
38,07
6,53
95,17
40,72
5,38
101,81
6,64
80
85,89
4,45
107,37
80,02
7,86
100,02
-7,35
Tabela 13- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas imediatamente após o
preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a dois ciclos de congelamento e
descongelamento. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Ciclo 2
Nominal
imediatamente após o preparo
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,19
13,28
90,95
20,49
14,23
102,47
11,52
40
39,79
14,02
99,48
38,43
3,88
96,07
-3,41
80
79,96
14,06
99,95
84,30
11,17
105,38
5,43
48
Tabela 14- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, analisadas imediatamente após o
preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de congelamento e
descongelamento. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Ciclo 3
Nominal
imediatamente após o prepare
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,43
5,08
92,14
18,40
2,32
92,02
-0,12
40
38,07
6,53
95,17
38,36
2,36
95,89
0,72
80
85,89
4,45
107,37
81,45
12,53
101,82
-5,55
Tabela 15- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, analisadas imediatamente após o
preparo, mantidas à temperatura de -80°C e submetida a três ciclos de congelamento e
descongelamento. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Ciclo 3
Nominal
imediatamente após o preparo
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,19
13,28
90,95
20,99
9,31
104,95
14,00
40
39,79
14,02
99,48
42,23
6,34
105,59
6,11
80
79,96
14,06
99,95
81,71
0,05
102,14
2,19
3.2.7.3- Estabilidade Pós-Processamento
Problemas de instabilidade podem ocorrer não somente na
matriz biológica e/ou durante o tratamento das amostras, mas também nas
amostras processadas. Portanto, é necessário testar a estabilidade do
analito no solvente em que foram extraídos ou reconstituídos, na
temperatura do auto-injetor e também em temperaturas mais baixas (sob
refrigeração), caso os extratos das amostras sejam armazenados antes
das análises. Em relação ao tempo, o mesmo deve ser superior ao
esperado para a duração da análise cromatográfica, o que possibilita, se
necessário, a reinjeção dos extratos ou um tempo de espera devido a
circunstâncias não previstas como, por exemplo, o mau funcionamento do
sistema cromatográfico.
Foi avaliada a estabilidade pós-processamento por 24 horas
a temperatura ambiente. Os resultados estão apresentados nas Tabelas
16 e 17 para o plasma e fígado respectivamente. Tanto as amostras de
49
controle de qualidade de plasma e fígado não apresentaram variações
acima de 15% comparando com as amostras processadas logo após o
preparo.
Tabela 16- Estabilidade de AlClPC em amostras de plasma, purificadas e mantidas a temperatura
ambiente por 24 horas. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Amostras analisadas 24 horas após a
nominal
imediatamente após o prepare
purificação
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,43
5,08
92,14
20,93
5,08
103,23
11,09
40
38,07
6,53
95,17
43,22
7,46
108,05
12,88
80
85,89
4,45
107,37
81,46
7,94
101,83
-5,54
Tabela 17- Estabilidade de AlClPC em amostras de fígado, purificadas e mantidas a temperatura
ambiente por 24 horas. Cada resultado representa a média de três determinações.
Conc.
Amostras processadas
Amostras analisadas 24 horas após a
nominal
imediatamente após o prepare
Purificação
(ng/mL)
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Conc.det.
Precisão
Exatidão
Desvio
(ng/mL)
(%)
(%)
(ng/mL)
(%)
(%)
(%)
20
18,19
13,28
90,95
20,15
8,10
100,77
9,82
40
39,79
14,02
99,48
41,81
9,48
104,53
5,05
80
79,96
14,06
99,95
85,76
9,91
107,20
7,25
Diante dos resultados apresentados o método foi
considerado validado, pois permitiu a análise de todos os parâmetros
necessários que se encontraram dentro dos limites de especificação.
Embora a ftalocianina de cloro e alumínio seja um analito de difícil
quantificação, pois possui alto poder contaminante, esse método permitiu
sua detecção em concentrações aceitáveis para sua posterior aplicação
em estudos in vivo.
50
Capítulo 2
PREPARO E CARACTERIZAÇÃO DE
NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS COM DIFERENTES
CARACTERÍSTICAS SUPERFÍCIAIS
51
1- Objetivos Específicos
Preparar suspensões de nanocápsulas contendo AlClPC a partir
dos polímeros do ácido poli-lático (PLA), do polímero ácido
polilático-co-polietilenoglicol (PLA-PEG) e do PLA revestido de
quitosana.
Optimizar os parâmetros da formulação e do método de fabricação;
Caracterizar as nanocápsulas contendo AlClPC quanto ao tamanho,
potencial zeta;
Avaliar a morfologia e as características de superficiais por
microscopia de força atômica;
Avaliar a eficiência de encapsulação e o teor de AlClPC nas
nanocápsulas.
52
2- MATERIAL E MÉTODOS
2.1- Materiais
Foram utilizados os seguintes fármacos e reagentes: AlClPC,
Cloro (29H, 31H-ftalocianato) de alumínio e a ZnPc, ftalocianina de zinco
(Sigma-Aldrich Brasil), lecitina de soja (fosfatidilcolina ~70%) (Epikuron
170
®
, Lucas Meyer, França), Velsan (triglicéride cáprico/caprílico) (Brasil),
poloxamer 188 (Synperonic) (Aldrich, Brasil), poly(D,L-lactide) (PLA) Mw
42.000Da, quitosana de baixo peso molecular (QUI) (Sigma-Aldrich,
Brasil), PLA-PEG (Mn 66.000kDa copolimerizado com PEG 5kDa)
(Alkermes, EUA), etanol grau CLAE (Tedia, Brasil), acetona grau CLAE,
glicose P.A., fosfato de sódio monobásico P.A. e fosfato de sódio dibásico
P.A. (Vetec®, Brasil). A água de qualidade MilliQ foi purificada no sistema
Symplicity/System 185, da Millipore®.
2.2-Preparação das Nanocápsulas
As nanocápsulas foram preparadas pelo processo de
deposição interfacial de um polímero pré-formado, descrito por
Fessi et al., 1989. O processo consiste da mistura de uma fase orgânica
miscível em água em uma solução aquosa contendo um surfactante
hidrofílico (Figura 12). Na fase orgânica, 60mg do polímero poli-(D,L-ácido
lático) (PLA) 42000 Da foram dissolvidos, com auxílio de uma chapa
elétrica com agitação magnética, em 10mL de uma solução de acetona
contendo 75mg de lecitina e 250µL de óleo. Essa solução foi vertida em
uma solução aquosa (20mL) contendo 75mg de Poloxamer 188, também
em agitação magnética. A mistura resultante foi mantida sob agitação por
mais 10 minutos para permitir a formação das nanocápsulas.
Posteriormente, o excesso de solvente foi evaporado a pressão reduzida
em rotavapor (Heidolph Instruments, Alemanha) em uma temperatura de
45˚C até o volume final de 10 mL.
53
Para obtenção das formulações de NC contendo o marcador
fluorescente, foi necessário modificar o método descrito anteriormente
conforme estudos previamente realizados (Paula, 2008) adicionando-se
um solvente à fase orgânica, para solubilização do AlClPC. Adicionou-se
na fase orgânica, portanto, um volume da solução estoque de AlClPC de
forma a se obter NC com a concentrações de 0,1mg/ml de AlClPC. As
nanocápsulas furtivas (NC de PLA-PEG) foram preparadas pelo método
descrito por Mosqueira et al., (2001b), o qual é semelhante ao descrito
anteriormente, entretanto, utiliza-se 75mg do copolímero PLA-PEG em 10
mL de fase orgânica na ausência do poloxamer. No preparo das NC de
quitosana, primeiramente foi dissolvida a quitosana em solução de ácido
acético 0,05 molar. Em 10 mL de fase orgânica foi adicionado 25mg de
PLA e 250µL de óleo. Essa solução foi vertida em uma solução aquosa
(20mL) contendo 25 mg de quitosana e 75 mg de Poloxamer 188. A fase
orgânica foi vertida sobre a aquosa sob agitação. Após 10 minutos de
agitação o excesso de solvente foi evaporado sob vácuo até o volume final
de 10 mL.
Fase orgânica:
Polímero + Epikuron +
Migliol + Acetona
+AlClPc em etanol
Fase aquosa:
Água + Pluronic
Agitação magnética
durante 10 minutos
Evaporação do
solvente e do
excesso de água
sob pressão
reduzida
Fase orgânica:
Polímero + Epikuron +
Migliol + Acetona
+AlClPc em etanol
Fase aquosa:
Água + Pluronic
Fase orgânica:
Polímero + Epikuron +
Migliol + Acetona
+AlClPc em etanol
Fase aquosa:
Água + Pluronic
Agitação magnética
durante 10 minutos
Evaporação do
solvente e do
excesso de água
sob pressão
reduzida
Figura 12- Etapas da Preparação de Nanocápsulas. 1) A solução orgânica é vertida na solução
aquosa; 2) A suspensão obtida é mantida em agitação por10 minutos; 4) Os solventes e o excesso
de água são evaporados.
A influência da presença de lecitinas no tamanho das NC, no
índice de polidispersão e no potencial zeta foi avaliada para as
suspensões de NC de PLA e de PLA-QUI, assim como a volume de
solventes orgânico e aquoso nas formulações de NC de PLA, PLA-PEG e
54
PLA-QUI, sempre mantendo a proporção de 1:2 de solvente
orgânico/água. Para desenvolvimento das NC de PLA-QUI foram avaliadas
varias concentrações e as proporções dos dois polímeros utilizados.
2.3- Caracterização Físico-Química das Nanopartículas
2.3.1- Distribuição de Tamanho
O tamanho médio das NC, e o índice de polidispersão das
suspensões de nanopartículas foram determinados por espectroscopia de
correlação de fótons (PCS), utilizando o equipamento Nanosizer N5 PLUS
Beckmann Coulter (Fullerton, EUA). As medidas de tamanho foram
realizadas em triplicata em alíquotas da mesma amostra e os resultados
obtidos foram expressos como média + desvio padrão. O índice de
polidispersão determinado pelo equipamento reflete a homogeneidade no
tamanho das nanopartículas presentes na amostra, sendo que as
amostras que apresentaram índice de polidispersão inferior a 0,3 foram
consideradas monodispersas, segundo instruções do fabricante do
equipamento (Beckmann Coulter).
2.3.2- Potencial Zeta
O potencial zeta foi determinado pela técnica de microeletroforese
associada à anemometria de laser dopler (ALD) utilizando-se um
equipamento Zetasizer 3000 HS (Malvern Instruments, UK). As amostras
foram analisadas diluindo-se 20 µL da suspensão de nanopartículas em
4980µL de NaCl 1mM, obtendo-se, assim, suspensões coloidais com
forças iônicas semelhantes (1,2 ± 0,2 mS/cm
2
). As medidas de potencial
zeta foram realizadas em triplicata em alíquotas da mesma amostra e os
resultados obtidos foram expressos como média + desvio padrão.
2.2- Porcentagem e Eficiência de Encapsulação
A porcentagem e a eficiência de encapsulação foram
determinadas por meio da cromatografia de líquida de alta eficiência
(CLAE) no aparelho Waters Alliance 2695 acoplado a um detector de
55
fluorescência Waters 2475, por um método de doseamento previamente
validado, descrito no capítulo 1. A porcentagem de encapsulação objetiva
determinar o teor de fármaco incorporado à nanopartícula em relação ao
total de fármaco na formulação. A porcentagem foi calculada pela
diferença entre a quantidade total de AlClPC na suspensão coloidal após a
retirada do precipitado grosseiro da formulação, por meio da filtração em
membrana de 0,8m (Nalgene®), e a quantidade de AlClPC livre solúvel
na fase aquosa externa, dividida pela quantidade total de AlClPC na
suspensão após a filtração x 100. A porcentagem de encapsulação foi
calculada, portanto, pela seguinte fórmula:
% encapsulação = (AlClPC total na suspensão após filtração (mL) - AlclPC no ultrafiltrado (mL)x100
AlClPC total na suspensão após filtração (mL)
O AlClPC total, foi determinado pela completa dissolução de
400µL da suspensão de NP, após filtração em 0,8µm, em
acetonitrila/etanol (1:1). O AlClPC livre solúvel na fase externa aquosa foi
obtido pelo método de ultrafiltração/centrifugação de 400µL da suspensão
de NP a 500 × g por 30 minutos em unidades AMICON (membranas
MICROCON de 100kDa, Millipore
®
) (Figura 13). A quantidade de AlClPC
ligado à membrana foi determinado após a ultrafiltração/ centrifugação.
Para tal, a membrana do AMICON foi retirada, lavada com água MilliQ,
imersa em 500µL de etanol/acetonitrila (1:1), levada ao vórtex por 15
minutos, centrifugada e o AlClPC dosado no sobrenadante. A eficiência de
encapsulação das NP foi calculada pela quantidade de AlClPC
encapsulado em 400µL de suspensão de NP dividido pela quantidade de
AlClPC pesado e adicionado ao preparo de 400µL de suspensão de NP x
100. A eficiência de encapsulação foi calculada, portanto, pela seguinte
fórmula:
Eficiência de Encapsulação % = Quantidade total de AlClPC encapsulado (mL) x 100
Quantidade de AlClPC pesado colocado na NP (mL)
56
A porcentagem de AlClPC precipitado nas formulações de
NP também foi determinada. O AlClPC precipitado foi determinado pela
diferença ente a quantidade de AlClPC total em 400 µL de NP pela
quantidade de AlClPC total em 400µL de NP após filtração em filtro de
seringa 0,8µm.
Filtração em
0,8µm
Dosagem de
AlClPc total na NC
Dosagem de
AlClPc total na
NC sem
precipitado
Ultrafiltração/
centrifugação
500 g
30 minutos
Dosagem de AlClPc
livre solúvel
400µLde NC
Microcon
100 000Da
Dissolução em
etanol/ acetonitrila
(1:1)
Dissolução em
etanol/ acetonitrila
(1:1)
Filtração em
0,8µm
Dosagem de
AlClPc total na NC
Dosagem de
AlClPc total na
NC sem
precipitado
Ultrafiltração/
centrifugação
500 g
30 minutos
Dosagem de AlClPc
livre solúvel
400µLde NC
Microcon
100 000Da
Dissolução em
etanol/ acetonitrila
(1:1)
Dissolução em
etanol/ acetonitrila
(1:1)
Filtração em
0,8µm
Dosagem de
AlClPc total na NC
Dosagem de
AlClPc total na
NC sem
precipitado
Ultrafiltração/
centrifugação
500 g
30 minutos
Dosagem de AlClPc
livre solúvel
400µLde NC
Microcon
100 000Da
Dissolução em
etanol/ acetonitrila
(1:1)
Dissolução em
etanol/ acetonitrila
(1:1)
Figura 13- Representação esquemática das dosagens de AlClPC realizadas nas formulações de
NP para determinação da porcentagem de encapsulação, eficiência de encapsulação e
porcentagem de fármaco precipitado.
2.3- Análise Morfológica das Nanocápsulas
A análise morfológica das nanocápsulas foi realizada por
microscopia de varredura por sonda mecânica, utilizando o modo de força
atômica. Para realização da microscopia de força atômica (MFA) foram
utilizados os equipamentos Multimode e Dimension 300, ambos
monitorados por controlador Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa
Bárbara, EUA), do Centro Tecnológico de Minas Gerais (CETEC, MG). As
imagens foram obtidas no modo de contato intermitente (tapping mode)
utilizando sondas de silício de comprimento de 228µm, com uma
freqüência de ressonância de 75-98 kHz, força constante de 29-61 N/m e
raio de curvatura de 5 nm a 10 nm.
Para obtenção das imagens, aproximadamente 5µL das
amostras foram depositados em lâminas de vidro ou placas de mica
clivadas no momento do uso. Após a deposição das amostras nas
superfícies respectivas, essas foram secadas utilizando-se um jato de
argônio unidirecional. A varredura foi efetuada em uma velocidade de 1Hz
com resolução de 512 x 512 pixels. A análise das amostras foi realizada
utilizando o programa de análise do sistema (Section Analysis).
57
2.4- Análise Estatística dos Dados
O diâmetro médio e o potencial zeta das NC vazias e
contendo a AlClPC foram comparadas por análise da variância (ANOVA)
utilizando o programa Prisma versão 4.0. Adotou-se intervalo de confiança
de 95%, sendo os valores de p < 0,05 aceitos como estatisticamente
significativos.
58
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1- Preparo das nanocápsulas
As NC, sistemas reservatórios no qual um núcleo oleoso é
envolvido por uma parede polimérica (Fig. 14), são formadas
instantaneamente pela rápida difusão do solvente orgânico para o meio
aquoso, promovendo a deposição interfacial do polímero. Ocorre uma
rápida precipitação do polímero quando a solução polimérica é adicionada
ao não-solvente, processo que é cineticamente controlado. A rápida
formação das nanopartículas é governada pelo chamado efeito Marangoni,
que explica a geração de turbulência interfacial entre as interfaces do
solvente e não-solvente (Quintanar-Guerreiro et al., 1998). As
características estruturais e físico-químicas das nanocápsulas podem ser
grandemente influenciadas pela composição das formulações. Por esta
razão, várias formulações foram previamente testadas, empregando-se
diferentes componentes e proporções. As suspensões coloidais
resultantes foram avaliadas quanto tamanho de partícula, índice de
polidispersão e potencial zeta e estes resultados estão apresentados nas
Tabelas 18, 19 e 20.
Figura 14- Representação esquemática da estrutura de constituição das NP. (A) nanocápsula
convencional, (B) nanocápsula furtiva e (C) nanocápsula revestida com quitosana.
59
Tabela 18- Comparação das propriedades de tamanho entre NC de PLA.
N
o
Polímero
PLA
a
(mg)
Epikuron
(mg)
Acetona
(mL)
Água
(mL)
Tamanho
(nm) ± DP
Índice de
Polidispersão
(nm) ± DP
1
12
15
2
4
226,2±0,22
0,158±0,01
2
12
-
2
4
692,3±174,00
0,982±0,34
3
12
-
4
8
330,1±3,08
0,070±0,01
4
12
15
6
12
209,1±0,32
0,096±0,00
5
12
-
6
12
286,8±0,51
0,114±0,06
Volume final de 2 mL. Formulações de nanocápsulas constituídas ácido Poil-lático (PLA)
de PM = 42 000 Da. DP= desvio padrão. (n=3)
Parâmetros envolvidos na preparação das nanocápsulas
(volumes de fase orgânica e fase aquosa, tipo e proporção de polímeros e
presença de surfactantes) foram optimizados com a finalidade de obter
formulações monodispersas com partículas com diâmetro próximo a 200
nm. Como pode ser observada a partir dos dados da Tabela 18, a
presença do surfactante lecitina na fase orgânica diminui
significativamente o tamanho e o índice de polidispersão das NC de PLA
(p < 0,05). Por outro lado, mesmo na ausência da lecitina foi possível obter
partículas menores que 300 nm com o aumento do volume dos solventes.
Provavelmente, o aumento do volume dos solventes reduz a viscosidade
da fase orgânica e aumenta a velocidade de difusão do solvente em água,
resultados semelhantes foram obtidos por Legrand et al., 2007, que
observou que diminuindo a concentração do polímero na fase orgânica
provoca uma diminuição do tamanho das nanopartículas devido à
diminuição da viscosidade do meio. Sendo assim há uma precipitação
mais rápida do polímero impedindo a coalescência das nanogotas
poliméricas e gerando esferas estabilizadas com tamanho menor. Para as
nanocápsulas de PLA-PEG e PLA-QUI, Tabelas 19 e 20, respectivamente,
o aumento do volume dos solventes também diminui significativamente (P
< 0,05) o tamanho médio das nanocápsulas.
60
Tabela 19- Comparação do tamanho entre formulações de NC de PLA-PEG.
Polímero
PLA-PEG
a
(mg)
Acetona
(mL)
Água
(mL)
Tamanho
(nm) ± DP
Índice de
Polidispersão
(I.P.) ± DP
N
-o
1
15
2
4
232,8±1,32
0,159±0,043
2
15
4
8
207,4±10,09
0,354±0,085
3
15
8
16
155,3±2,06
0,172±0,032
4
15
10
20
133,9±4,18
0,271±0,036
As formulações foram evaporadas para o volume final de 2 mL.
b
Nc de PLA com cadeias
de Polietilenoglicol ligadas covalentemente à superfície (Nc de PLA-PEG), PM=66000.
DP= desvio padrão. (n=3)
Para preparo das nanocápsulas de PLA-QUI várias
concentrações e proporções dos polímeros PLA e QUI foram testadas,
como pode ser observado na Tabela 20. É evidente na tabela 20 o efeito
de redução do tamanho das nanocápsulas e do índice de polidispersão
com o aumento dos volumes das fases. Além disso, foi observado que a
adição de lecitina na fase orgânica leva ao aumento significativo no
tamanho das partículas (P < 0,05) e também no potencial zeta. É provável
que a lecitina provoque uma desestabilização da organização das NC em
presença de quitosana gerando uma competição pelos sítios de interação
iônica com o PLA, efeito este evidenciado pelo aumento do potencial zeta
em presença de lecitina. Isto provavelmente gera instabilidades
interparticulares e facilita a agregação das partículas no momento da
formação, o que leva ao aumento do tamanho médio. É necessário
também considerar o aumento da viscosidade do sistema em presença de
lecitina como provável contribuinte no aumento do tamanho.
É interessante observar as diferenças de potencil zeta entre
as formulações de nanocápsulas de quitosana preparadas com adição de
PLA e sem adicionar PLA. O PLA torna o potencial zeta mais positivo em
presença de quitosana, pois a presença do polímero aniônico ressalta a
carga superficial positiva da quitosana, provavelmente por algum tipo de
organização e interação entre os dois polímeros, ou simplesmente pela
maior disponibilidade de grupamentos amino disponíveis na superfície das
NC na presença do PLA. O potencia zeta positivo pode ser interpretado
61
como evidência da presença da quitosana na superfície da partícula, uma
vez que esse polímero se caracteriza pela presença de grupamentos
amino livres ao longo da cadeia polimérica na forma desacetilada que se
ionizam em presença de água. A proporção de 1:1 entre os polímeros na
concentração de 2,5 mg/mL de PLA e 2,5 mg/mL QUI sem adicionar
lecitina na formulação foi a mais adequada para obtenção de partículas
com tamanho nanométrico.
Tabela 20- Comparação das propriedades de tamanho médio e potencial zeta entre Nc de PLA-QUI
para diferentes formulações.
Polímero
PLA (mg)
Polímero
Qui (mg)
Epikuron
(mg)
Acetona
(mL)
Água
(mL)
Tamanho
(nm) ±
Índice de
Polidispersão
(I.P.) ±
Potencial
Zeta
(mV)
N
o
1
12
4
-
2
4
564,4±67,23
0,527±0,127
-
2
6
4
-
2
4
497,8±26,92
0,767±0,085
-
3
4
4
-
2
4
330,1±15,81
0,277±0,068
-
4
2
4
-
2
4
376,5±5,78
0,376±0,036
-
5
4
2
-
2
4
380,1±26,87
0,282±0,068
-
6
4
4
-
4
8
287,2±2,61
0,116±0,08
-
7
4
4
-
6
12
255,5±2,32
0,075±0,007
15,4
8
4
4
-
8
16
248,1±0,59
0,009±0,040
12,6
9
4
4
15
8
16
1432,7±524,8
1,741±0,106
23,2
10
0
4
15
8
16
583,2±141,29
0,172±0,032
26,1
11
0
4
-
8
16
283,3±5,48
0,084±0,037
8,4
12
5
5
-
8
16
225,4±2,32
0,057±0,007
6,9
As formulações foram evaporadas para o volume final de 2 mL.
b
Nc de PLA com cadeias
de Polietilenoglicol ligadas covalentemente à superfície
3.2- Caracterização Físico-Química das Nanocápsulas Selecionadas
3.2.1- Distribuição de Tamanho
A técnica de espalhamento dinâmico da luz ou
espectroscopia de correlação de fótons baseia-se na determinação das
flutuações na intensidade da luz espalhada pelas partículas, em função do
tempo, e no cálculo da respectiva função de autocorrelação. Uma grande
vantagem desta técnica sobre o espalhamento de luz estático é permitir a
62
determinação da distribuição do diâmetro das partículas, e não apenas um
valor médio de diâmetro. Para entendermos este fenômeno, devemos nos
lembrar de algumas definições. Partículas em um meio líquido movem-se
ao acaso (movimento Browniano), devido a colisões com as moléculas do
meio de dispersão. Partículas menores se movimentam mais rapidamente
que partículas grandes, portanto, possuem coeficiente de difusão (D)
maior. A medida da intensidade de luz espalhada por uma dispersão
permite detectar e analisar este movimento browniano das partículas. A luz
espalhada por uma dispersão em um dado instante é combinada,
formando um padrão de interferência que depende das posições relativas
das partículas. À medida que as partículas sofrem deslocamentos
aleatórios, o padrão de interferência acompanha estas modificações,
produzindo uma variação da intensidade de luz espalhada no detector.
Embora a flutuação da intensidade espalhada seja aleatória por natureza,
ela ocorre em uma escala de tempo de micro a milisegundos. O
movimento lento de partículas grandes causará lentas alterações na
intensidade da luz espalhada. Por outro lado, a movimentação rápida de
partículas pequenas provocará uma flutuação muito rápida na intensidade
de luz espalhada. Para uma dispersão de partículas com viscosidade η,
em uma temperatura constante T, o coeficiente de difusão D é
inversamente proporcional ao diâmetro hidrodinâmico d
H
das partículas,
como mostra a equação de Stokes-Einstein,
D = k T
3πηd
H
onde k é a constante de Boltzmann.
As flutuações de intensidade de luz espalhada ao longo do
tempo são representadas através de uma função de correlação. No caso
de partículas pequenas, essa função de correlação entre as intensidades
diminui mais rapidamente com o tempo, do que no caso de partículas
grandes. No tempo t = t0 = 0, a intensidade de espalhamento e a função
de correlação possui um valor máximo. Com o passar do tempo, a
intensidade de espalhamento em um tempo (t0 + τ) estará cada vez menos
correlacionada com a intensidade de espalhamento inicial, e a média dos
63
produtos das intensidades tende a zero. Para partículas esféricas e
monodispersas, a função decai exponencialmente num intervalo de tempo
t, e a constante de decaimento da curva exponencial gerada pela função
de correlação está relacionada com o coeficiente de difusão translacional
das partículas. A constante de decaimento depende do índice de refração
do líquido que dispersa as partículas, do ângulo de detecção da luz
espalhada e do comprimento de onda da luz incidente (Calvo, 1995). O
diâmetro médio efetivo das partículas e sua dispersão foram determinados
através da técnica de espalhamento dinâmico de luz, a um ângulo de
detecção da luz espalhada fixo em 90°, na temperatura de 20°C em meio
aquoso.
A PCS, além do diâmetro médio das nanoestruturas, fornece
através de cálculo, o índice de polidisperssão (P.I.) das formulações. O P.I.
é utilizado para determinar a distribuição de tamanho das partículas na
amostras. Formulações de NP com valores de P.I. menores ou iguais a 0,3
apresentam-se monodispersas, ou seja, representam uma única
população de nanopartículas com distribuição de tamanho gaussiana
(Scholes et al., 1993).
A determinação do tamanho das nanopartículas é muito
importante para a caracterização físico-química das formulações. Através
da determinação do tamanho das nanoestruturas é possível acompanhar a
estabilidade das formulações e a tendência das partículas presentes na
suspensão coloidal de se agregarem e de sedimentarem
(Magenheim e Benita, 1991). O tamanho das partículas representa um
aspecto importante, também, para sua biodistribuição e eliminação, sendo
que partículas maiores (acima de 300 nm) são mais rapidamente
reconhecidas pelo sistema fagocitário mononuclear e facilmente retiradas
da circulação. Além disso, quando se pretende uma administração
intravenosa, o tamanho das partículas deve ser estritamente controlado,
pois os pequenos capilares sanguíneos do corpo humano possuem de 4 a
7 mm de diâmetro e partículas maiores que 4mm podem causar sua
oclusão (Chorny et al., 2002), clinicamente conhecida como embolia. O
tamanho das nanocápsulas produzidas por nanoprecipitação, geralmente,
varia de 100 a 500 nm e depende de vários fatores, como o método de
64
preparação, a concentração do polímero e da droga encapsulada, a
proporção entre solvente orgânico e água e da velocidade de difusão da
fase orgânica na aquosa (Legrand et al., 1999 e Mosqueira et al., 2001).
Uma vez selecionadas as melhores formulações de
nanocápsulas, o marcador fluorescente AlClPC foi encapsulado para os
estudos posteriores in vivo. Os resultados obtidos na avaliação do
tamanho das partículas das suspensões de nanocápsulas contendo
AlClPC são demonstrados na Tabela 21 para as formulações
selecionadas. Populações monodispersas de partículas foram obtidas com
a utilização de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI após encapsulamento do
marcador. Além disso, o tamanho médio das partículas e o índice de
polidispersão obtidos foram considerados aceitáveis para uma
comparação in vivo com nanocápsulas dentro de uma mesma escala de
tamanho.
Tabela 21- Comparação das propriedades de tamanho médio e potencial zeta entre NC produzidas
com diferentes polímeros e concentrações de AlClPC
Formulação
de NC
Polímero
(mg/mL)
AlClPC
(mg/mL)
Diâmetro
médio
(nm)
± DP
IP
ζ (mV) ±
DP
NC PLA
6,0
6,0
−
0,10
150,3 ± 0,2
192,8 ± 1,0
0,169
0,164
-46,4±0,80
-41,6±0,30
NC PLA-PEG
7,5
7,5
−
0,10
117,8 ± 1,2
145,7 ± 2,1
0,179
0,044
-40,9±0,04
-35,3±0,50
NC PLA-QUI
1:1
2,5
2,5
−
0,10
230,4 ± 0,6
256,4 ± 0,1
0,113
0,100
+6,9±0,10
+9,6±0,02
DP = desvio padrão. Utilizou-se 50% de etanol nessas formulações de PLA e PLA-PEG na fase
orgânica.
Os valores de índice de polidispersão encontrados na Tabela
21, menores que 0,2 são característicos de suspensões apresentando uma
faixa estreita de tamanhos de partícula e/ou monodispersas. Por outro
lado, a utilização de copolímeros PLA-PEG conduziu à redução ainda
maior do tamanho das partículas quando comparado ao tamanho daquelas
preparadas a partir do PLA. Esta redução no tamanho das NC, produzida
pela presença da cadeia de PEG covalentemente ligada na superfície das
nanocápsulas, também foi observada por outros autores
65
(Tobio et al., 1998; Ameller et al., 2003a), e está provavelmente associada
à característica anfifílica do copolímero que conduz à redução da tensão
interfacial do sistema. A incorporação da quitosana provocou um aumento
significativo (P < 0,05) no tamanho das nanocápsulas, o que está
provavelmente associado ao alto peso molecular da quitosana e sua
organização na interface que pode alterar o diâmetro hidrodinâmico
medido por PCS.
Para explicar o aumento do tamanho quando adicionamos o
marcador há algumas hipóteses: a presença da AlClPC no meio altera o
tamanho crítico das gotas na separação de fase, o que pode indicar maior
solvatação pela água (cadeias mais relaxadas expõem melhor os grupos
carboxilato para o exterior) ou maior adsorção de poloxamer na superfície
de partículas bastante hidrofóbicas pela presença de AlClPC. Na literatura
vários casos de aumento no tamanho das NC após incorporação do
fármaco são encontrados (Govender et al.,1999; Guterres et al., 1995).
3.2.2- Potencial Zeta (ζ)
As medidas de potencial zeta se baseiam no seguinte
fenômeno relacionado à carga líquida na superfície da partícula que afeta
a distribuição de íons na sua vizinhança, aumentando a concentração de
contraíons junto à superfície. Assim, forma-se uma dupla camada elétrica
na interface da partícula com o líquido. Essa dupla camada divide-se em
duas regiões: uma região interna que inclui íons fortemente ligados à
superfície e uma região exterior onde a distribuição dos íons é
determinada pelo equilíbrio entre forças eletrostáticas e movimento
térmico. Dessa forma, o potencial nessa região decai com o aumento da
distancia da superfície até uma distância suficientemente grande, atingir o
potencial da solução. Esse potencial é convencionado como potencial
zero. Em um campo elétrico, como em microeletroforese, cada partícula e
os íons mais fortemente ligados à mesma se movem como uma unidade, e
o potencial no plano de cizalhamento entre essa unidade e o meio
circundante é chamado potencial zeta (Figura 14).
66
Quando uma camada de macromoléculas é adsorvida na
superfície da partícula, ela move o plano de cisalhamento para longe da
superfície, alterando o potencial zeta. O potencial zeta é função da carga
superficial da partícula, de qualquer camada adsorvida na interface com o
meio e da natureza e composição do meio que a circunda.
Figura 15- Esquema representativo da dupla camada elétrica.
O potencial zeta (ζ) reflete o potencial elétrico existente na
superfície das partículas e pode ser influenciado pela carga dos diferentes
componentes dessas estruturas, localizados na interface com o meio
dispersante, e pela adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão
(Legrand et al., 1999).
Os resultados de caracterização físico-química das
nanocápsulas estão apresentados na Tabela 21. As nanocápsulas de PLA
apresentaram valores negativos e mais altos que as nanocápsulas de
PLA-PEG. Isto tem sido explicado, pela presença de grupamentos
carboxílicos terminais ionizáveis do PLA na superfície das partículas. No
caso das nanocápsulas preparadas a partir dos polímeros peguilados
sugere-se que o mascaramento de tais grupamentos carboxílicos pelo
polietilenoglicol leva à redução da carga superficial das partículas
(Gref et al, 1999).
Os fosfolipídeos (lecitinas), os poloxamers (copolímeros dos
óxidos de etileno e de propileno) e os polímeros constituintes das
nanopartículas são os principais componentes presentes nas formulações
capazes de influenciar o potencial zeta. Especialmente os poliésteres,
como o PLA, e as lecitinas fornecem um potencial negativo à interface,
67
enquanto que, os poloxamers e polietilenoglicol (tensoativos não-iônicos)
tendem a reduzir o valor absoluto deste parâmetro. A utilização de 2,5
mg/mL de quitosana de baixo peso molecular nas formulações foi capaz
de conferir um potencial zeta positivo para as partículas, em torno de +10
mV, corroborando com valores positivos encontrados por outros
pesquisadores para nanopartículas com o mesmo revestimento
(Calvo et al., 1997b, Campos et al., 2003, Prego et al., 2005). O potencial
positivo é devido a presença de grupamentos amino do polissacarídeo
(Felt et al.,1998). A adição de AlClPC às NC levou a reduções nos valores
absolutos de potencial zeta sugerindo que nas formulações a ftalocianina
encontra-se associada a superfície da parede polimérica.
A determinação do potencial zeta possibilita a avaliação da
estabilidade das dispersões coloidais. Altos valores de potencial zeta
proporcionam maior estabilidade às suspensões de NP. Isso ocorre porque
a força de repulsão entre as partículas evita a agregação das mesmas
(Legrand et al., 1999 e Soppimath et al., 2001). O potencial de superfície
pode ainda influenciar a resposta biológica do vetor, uma vez que, após
administração i.v., carreadores coloidais convencionais que apresentam
superfície hidrofóbica são rapidamente captados por células do SFM
(Barratt, 2000). As características de superfície das partículas também
podem alterar a resposta biológica do fármaco associado. Quando se
administram intravenosamente sistemas de nanopartículas convencionais,
estes são rapidamente removidos da circulação sanguínea pela ação de
células do sistema fagocitário mononuclear, dificultando a chegada do
fármaco ao sítio de ação. Diferentes estratégias têm sido propostas para
modificar a distribuição in vivo das nanocápsulas, baseadas principalmente
na redução da hidrofobicidade da superfície das partículas.
3.3- Porcentagem e Eficiência de Encapsulação
A porcentagem de encapsulação objetiva determinar o teor
de fármaco incorporado a essas nanoestruturas em relação ao total de
fármaco presente na suspensão coloidal final de NP. A determinação da
quantidade de fármaco associada às nanopartículas é especialmente
complexa devido ao tamanho reduzido destas, que dificulta a separação
68
da fração de fármaco livre da fração associada. Uma técnica de separação
bastante utilizada é a ultracentrifugação, na qual a concentração de
fármaco livre, presente na suspensão, é determinada no sobrenadante,
após a centrifugação. A concentração total de fármaco, por sua vez, é
geralmente determinada pela completa dissolução das nanopartículas em
um solvente adequado. Por conseguinte, a concentração de fármaco
associada às nanoestruturas é calculada pela diferença entre as
concentrações de fármaco total e livre.
As NC são constituídas de um núcleo oleoso, no qual o
fármaco lipofílico pode estar dissolvido ou disperso, revestido por uma
parede polimérica (Legrand et al., 1999). Devido ao elevado caráter
hidrofóbico do AlClPC, as NC mostraram-se carreadores adequados para
a incorporação desse fármaco, pois todas as formulações apresentaram
um teor de encapsulação próximo de 100%. Não foi encontrado AlClPC
livre solúvel na fase aquosa da suspensão coloidal, ou aderido à
membrana de ultrafiltração utilizada para a separação das NP, em
concentrações detectáveis (Tabela 22). Por outro lado, a eficiência de
encapsulação, que leva em conta as perdas do processo de preparo das
NC variou de acordo com a formulação utilizada. O valor de 100% de
encapsulação possibilita a utilização dessas formulações de NC in vitro e
in vivo com menor risco de liberação do marcador do interior da NC.
Tabela 22- Eficiência de encapsulação, porcentagem de fármaco precipitado e rendimento de
encapsulação de formulações de NC com 0,1mg/ml de AlClPC.
Formulação
de NC
AlClPC
(mg/mL)
Eficiência de
encapsulação
± DP
(%)
% AlClPC
precipitado
± DP
%
encapsulação
NC PLA
a
0,1
71,9 ± 0,1
9,2±0,4
100
NC PLA-PEG
b
0,1
86,4 ± 2,0
7,1±1,3
100
NC PLA-QUI
c
0,1
35,3 ± 0,6
17,3±1,0
100
Como o AlClPC é pouco solúvel na acetona (solvente do
polímero), a quantidade de fármaco que precipita durante a mistura de
69
solventes é grande, com isso a quantidade retida dentro do nanosistema é
relativamente baixa ocorrendo perdas no processo devido ao
aparecimento de cristais macroscópicos de AlClPC na formulação.
Observou-se em trabalhos anteriores que o aumento da concentração de
etanol na fase orgânica da formulação, durante a nanoprecipitação,
aumenta significativamente a eficiência de encapsulação e reduz a
precipitação do AlClPC no meio, para NC contendo PLA
(Paula et al., 2008). Ou seja, o aumento da concentração de etanol na fase
orgânica teve um efeito positivo na eficiência de encapsulação do AlClPC.
Estes resultados encontram-se de acordo com os obtidos por
Labib et al., 1991 para NC contendo ftalocianina de zinco (ZnPc). A
eficiência de encapsulação foi melhor com o copolímero de PLA-PEG,
justamente pelo fato da melhoria da solubilidade do polímero com adição
do etanol na fase orgânica, o que propicia um precipitação mais controlada
com maior tempo para as interações AlClPC e material constituinte das
NC.Para preparo das NC de PLA-QUI observou-se a formação de
agregados do AlClPC com o polímero durante a nanoprecipitação.
Provavelmente, a mistura de acetona e etanol, sendo um não-solvente da
quitosana, induz a uma precipitação precoce e desorganizada, levando ao
aparecimento de agregados. Por outro lado, como as suspensões de NC
de PLA-QUI apresentaram pH ligeiramente ácido, aproximadamente 5, isto
pode ter alterado a solubilidade da AlClPC no meio aquoso, diminuindo a
eficiência de encapsulação. Além de que para o preparo das Nc de PLA-
QUI a adição de etanol na fase orgânica aumentava significantemente o
tamanho das partículas, por isso, adicionamos a menor quantidade
possível para manter o tamanho das partículas menor que 300nm. De
acordo com os estudos publicados, diversos fatores são capazes de
influenciar a quantidade de fármaco associada aos sistemas
nanoestruturados, dentre os quais destacam-se as características físico-
químicas do fármaco (Calvo et al., 1996), o pH do meio (Brasser et al.,
1991), as características da superfície das partículas ou a natureza do
polímero (Vila et al., 2002), a quantidade de fármaco adicionada à
formulação (Brasser et al., 1991). Modificando-se as características de
superfície das partículas, é possível obter diferentes taxas de associação
70
do fármaco por adsorção, para uma mesma concentração inicial do
mesmo.
3.4- Avaliação Morfológica
A avaliação morfológica de sistemas nanoestruturados é
realizada a partir da observação da forma, tamanho e superfície das
partículas por meio de técnicas de microscopia (Schaffazick et al., 2003).
As microscopias eletrônicas de varredura e a de transmissão são as mais
comumente utilizadas. Entretanto, recentemente, também a microscopia
de força atômica (MFA) tem sido uma ferramenta muito usada na
caracterização de nanoestruturas, como lipossomas (Li & Palmer, 2004),
nanoesferas (Gref et al., 1994) e nanocápsulas (Leite et al., 2005;
Mosqueira et al., 2005). A MFA é uma das modalidades de microscopia de
varredura por sonda mecânica e fornece informações com alta resolução,
em escala nanométrica e em três dimensões, sendo capaz ainda de
resolver detalhes de superfície ao nível atômico (Neves et al., 1998).
Apresenta várias vantagens em relação às microscopias eletrônicas de
varredura e de transmissão, entre elas: dispensar a utilização de vácuo ou
de recobrimento da amostra, possibilitar a realização de medidas diretas
de altura e rugosidade, além de possibilitar a obtenção de imagens da
superfície de materiais sob as mais variadas condições (ar, vácuo e em
meio líquido).
Nas imagens das figuras 16 e 17 podem ser observadas NC
depositadas sobre a mica recentemente clivada que indicam a presença
de estruturas esféricas. Na figura 16 observam-se NC envoltas por um
halo que provavelmente é constituído pelo poloxamer 188, como já
observado por outros autores (Leite et al., 2005, Pereira et al., 2008). Na
imagem de fase (Figura 17) observa-se que o núcleo das NC possui uma
textura diferente do entorno (mais escuro), o que pode indicar a presença
de uma fase líquida no interior das NC.
71
Figura 16- Imagem de altura (A) e fase (B) de um agrupamento de NC de PLA vazias. As NC
foram depositadas na superfície da mica. Área: 2µm x 2µm.
Figura 17- Imagem de altura (A) e fase (B) de um agrupamento de NC de PLA contendo AlClPC
0,1mg/mL. As NC foram depositadas na superfície da mica. Área: 3µm x 3µm.
Figura 18- Imagens de altura de NC de PLA-PEG vazias (A) e encapsulando 0,1mg/mL de AlClPC
(B), depositadas sobre a superfície da mica. Área: 2µm x 2µm.
As imagens das NC de PLA-PEG são bem definidas, pois as
formulações apresentam menor número de constituintes. Observam-se
A
B
A
B
A
B
72
halos bandados na superfície das NC de PLA-PEG que podem ser
indicativos da presença de camadas hidrofílicas altamente solvatadas na
superfície das NC devido à presença de PEG de alto peso molecular
(5kDa). A presença de AlClPC não alterou significativamente os diâmetros
encontrados, que foram confirmados por essa técnica.
Figura 19- Imagem de altura (A) e fase (B) de NC de PLA-QUI depositadas sobre a mica.
A obtenção de imagens com as NC de PLA-QUI (Figura 19)
se revelou extremamente difícil devido ao aparecimento de “nuvens” em
torno da partícula que reduziram a resolução da imagem. Entretanto, este
é um aspecto interessante desta formulação, pois a adsorção destes
polímeros na superfície das partículas e o aumento do tamanho observado
anteriormente por PCS indicam realmente que a quitosana modificou a
superfície dessas NC. Esses efeitos são então observados também em
relação à sua morfologia e estrutura por MFA.
Foram analisadas por MFA formulações de NC vazias e
contendo 0,1 mg/mL de AlClPC. Os tamanhos das NC obtido por MFA na
superfície da mica apresentados nas figuras 16, 17, 18, e 19 apresentaram
uma distribuição heterogênea de partículas na formulação. A
heterogeneidade pode ser resultante do processo de secagem que leva a
agregação das partículas durante a evaporação da água. O tamanho
médio da mesma amostra foi menor quando determinado por PCS. Essa
A
B
73
diferença entre as medidas de tamanho pode ser percebida em todas as
formulações de NC. Isso ocorre devido a uma possível agregação das NC
na superfície de deposição ou devido ao achatamento dessas estruturas
quando depositadas sobre a superfície da mica, como observado por
Leite et al., 2005.
74
Capítulo 3
NANOCÁPSULAS: EFEITO DAS
CARACTERÍSTICAS SUPERFÍCIAIS E DA DOSE
ADMINISTRADA IN VITRO E IN VIVO
75
1- Objetivos específicos
Optimizar o uso de um marcador fluorescente de NC (AlClPC e
Vermelho do Nilo) para ser utilizado na avaliação da interação das
nanocápsulas com diferentes características de superfícies com
células do sangue pela técnica de citometria de fluxo;
Avaliar a interação das nanocápsulas com células sanguíneas por
citometria de fluxo;
Avaliar o efeito da dose administrada por via endovenosa das
nanocápsulas de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI na clearence das NC
pelo sistema imune;
Estudar as doses saturantes do sistema fagocitário mononuclear em
camundongos.
76
2- MATERIAL E MÉTODOS
2.1- Animais
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas (25 a 30 g)
provenientes do Biotério da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).
Os animais foram mantidos no biotério da Escola de Farmácia da UFOP
em uma área com ciclos padronizados de claro/escuro e com livre acesso
a ração e água. Todos os experimentos seguiram as normas do Conselho
Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e o protocolo foi
previamente aprovado pelo Comitê de ética em experimentação animal da
UFOP.
2.2- Avaliação da estabilidade da marcação fluorescente dos diferentes
tipos de nanocápsulas em meios biológicos
As nanocápsulas de PLA encapsulando Vermelho do Nilo
foram preparadas pelo método de nanoprecipitação (Fessi et al., 1989)
como descrito anteriormente adicionando-se o marcador na fase oleosa da
preparação. A estabilidade da marcação permite evidenciar se o marcador
fluorescente é liberado das NC no meio biológico. Os testes foram
realizados para estudar a liberação por um período de 120 minutos. Uma
vez livre esse marcador possui a possibilidade de interagir sozinho com as
células mononucleares do sangue periférico.
2.2.1- Metodologia de separação das células mononucleares
Os leucócitos do sangue humano foram previamente
separados. Para obtenção das células mononucleares foram coletados 20
mL de sangue heparinizado que foi transferido para um tubos Falcon de 50
mL, centrifugados por 10 minutos a 2000 rpm a 18 ºC. O plasma foi
retirado do tubo e as células ressuspendidas em meio RPMI para volume
final de 50 mL. Distribuiu-se 4,0 mL de Ficoll em tubos Falcon de 50 mL,
aplicou-se 17,5 mL do sangue ressuspendido em RPMI sobre o Ficoll.
77
Centrifugou-se a amostra por 40 minutos a 2000 rpm. O anel de leucócitos
formado foi removido cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta de
pasteur estéril e transferido para um tubo, onde estas células foram
lavadas com PBS e ressuspendidas em RPMI. As células foram coradas
com o diluente de Turk e contadas em uma câmara de Newbawer.
2.2.2- Avaliação da interação marcador encapsulado com células sem
contato
Em cada poço da placa de cultura de 24 poços (COSTAR)
foram colocados 300 µL de uma suspensão de 1,0 x 10
7
células/mL. Foi
adicionado um insert (COSTAR) com membrana de 0,1 µm sobre cada
poço e neste foram adicionados 10 µL da suspensão de NC de PLA
fluorescentes contendo ou AlClPC ou Vermelho do Nilo, previamente
filtradas em filtros Millex estéreis de 0,8 µm (Millipore). As placas de
cultura de células foram incubadas a 37ºC por 120 minutos, após o tempo
de incubação as células forma lavadas duas vezes com PBS e
ressuspendidas em 300 µL de PBS (Figura 20).
Passagem do coranteSem passagem
do corante
Passagem do coranteSem passagem
do corante
Figura 20- Representação esquemática dos inserts utilizados para validar a transferência do
marcador para as células em ausência de contato.
A suspensão celular foi analisada no aparelho de citometria
de fluxo FACS Calibur (Becton Dckinson), usando os laseres de íon de
argônio com comprimento de onda de excitação de 488nm e de diodo
vermelho (red diodo laser) com comprimento de excitação de 635 nm. Foi
realizada uma aquisição de 10.000 eventos por amostra, avaliando os
parâmetros FSC (ângulo de dispersão frontal / avaliação de tamanho),
SSC (ângulo de dispersão lateral / avaliação de granulosidade), e os
78
canais de fluorescência FL1, FL2, FL3 (detector de fluorescência com filtro
que capta luz comprimento de ondas de aproximadamente 670 nm).
Foi avaliada a porcentagem de cada tipo celular que
apresentou fluorescência após o tempo de incubação.
2.3- Análise Estatística
Realizou-se análise estatística para os estudos in vivo
utilizando oteste estatístico ANOVA one way e de comparação múltipla de
Bonferroni considerando diferença estatística quando apresentasse p valor
< 0,05.
2.4- Estudo de Biodistribuição de Nanopartículas Poliméricas in
vivo
2.4.1- Efeito da Dose Administrada na saturação da capacidade fagocítica
Para injetar grandes concentrações de polímero nos
camundongos, preparamos as formulações conforme descrito
anteriormente, entretanto na última etapa, evaporamos a formulação até a
concentração final de 24 mg/mL de PLA, 30 mg/mL de PLA-PEG,
20mg/mL de PLA-QUI (1:1) e 0,1 mg/mL de AlClPC. As suspensões foram
filtradas em filtro de seringa com poros de 0,8 µm diâmetro para retirar o
precipitado de AlClPC. As concentrações de polímero injetadas nos
camundongos foram de 51,6 - 263,01 mg/kg animal para PLA; 57,1 –
349,5 mg/Kg de animal para PLA-PEG e 67,22 – 274,28 mg/Kg de animal
para PLA-QUI.
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas pesando entre
25-30 g. Os animais foram separados randomicamente, sendo 4 animais
por grupo, e os volumes de 50, 100, 200 e 300 µL da suspensão de
nanocápsulas foram injetados pela veia caudal do animal. Após 20 minutos
da injeção foram retirados aproximadamente 1,0 mL de sangue pela veia
do sinus retro-orbital de cada animal. Os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical e os seus órgãos retirados, lavados em solução de
PBS gelada, pesados e congelados a – 80ºC.O sangue foi centrifugado
por 10 minutos a 2500 rpm separando-se o plasma que foi congelado a –
80ºC até o momento da análise. Para determinar a quantidade de
79
fluorescência no plasma total, considerou-se que o volume total de plasma
corresponde a 4,9 % do peso corporal do animal (Auletta C. S., 1995). As
amostras foram preparadas conforme procedimento desenvolvido e
validado descrito anteriormente no capítulo 1. Foram realizados o
doseamento da AlClPC no plasma e fígado.Para calcular a porcentagem
da dose injetada no plasma e no fígado, dosamos a concentração de
AlClPC em cada uma das formulações de NC avaliadas.
80
3- RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1- Avaliação da estabilidade da marcação fluorescente dos diferentes
tipos de nanocápsulas em meio biológico
Este teste foi realizado para verificar se os marcadores
fluorescentes são eficientes na marcação das nanocápsulas e se eles se
mantêem associados às Nanocápsulas mesmo em meios biológicos sem
serem liberados das nanopartículas durante o maior tempo de incubação
utilizado nos testes. Falsos resultados são obtidos se o marcador difunde
pelo meio líquido e interage com as células, não sendo, portanto, neste
caso, um bom traçador das nanocápsulas. O vermelho do Nilo (VN) foi
descartado como marcador, pois após incubação das NC com as células
em meio de cultura, separadas pela membrana do insert de 100nm, 100 %
das células apresentaram fluorescência aos 15 minutos da incubação.
Provalvelmente parte do VN fica adsorvido na parede polimérica das NC e
quando liberado dos nanocarreadores interagem com a membrana
plasmática das células. Assim, a partir dos resultados deste estudo,
observou-se que o VN não é um bom marcador para estudo de interação
das NC de PLA com leucócitos por citometria de fluxo. Utilizando-se a
AlClPC observou-se que a intensidade de fluorescência apresentada pelas
três populações celulares avaliadas não foi alterada quando as NC foram
incubadas com as células e separadas pelo meio de cultura por uma
membrana de 100 nm. Como o marcador fluorescente (AlClPC)
encapsulado nas NC é muito hidrofóbico e praticamente insolúvel em água
e em meios hidrofílicos, sua liberação das NC é muito baixa. Além disso,
uma vez liberado ele tende a precipitação. A baixa liberação da AlClPC de
sistemas nanopartículados em meios aquosos foi observada anteriormente
em nosso grupo de pesquisa (Paula, 2008). Paula, (2008) conseguiram
quantificar a AlClPC livre após a sua liberação de NC apenas quando o
meio de liberação foi o n-octanol. Assim sendo a AlClPC foi considerado
um bom marcador fluorescente para estudos de biodistribuição de NC de
PLA, PLA-PEG e PLA-QUI in vitro. Além disso, ele poderá também ser
utilizado na avaliação dos efeitos da dose das NC no SFM in vivo.
81
Figura 21- Comparação da porcentagem de linfócitos (A), monócitos (B) e neutrófilos (C) que
apresentaram fluorescência após incubação com NC encapsulando VN (vermelho) e a AlClPC
(verde) na placa com insert. Cada população foi comparada com o grupo controle.
De acordo com os resultados apresentados na figuras 23 A e
24, observa-se que os linfócitos foram as células menos afetadas pela
incubação com as NC contendo AlClPC. Ao contrário, o corante
fluorescente vermelho do nilo marcou fortemente essas células. Sabendo-
se da baixa capacidade fagocítica dos linfócitos, evidencia-se uma
passagem do corante para as células através do meio de cultura.
A
B
C
82
Entretanto, sabe-se que uma pequena porção das NC com tamanho
inferior a 100nm pode passar pelos poros da membrana e pode, portanto
interagir com as células no meio de cultura. Este parece ter sido o caso
para os neutrófilos, que devido a sua maior capacidade fagocitária
interagiram mais com essas pequenas nanocápsulas, em porcentagem
superior ao controle. Isso pode ser observado pelo gráfico da figura 23 C e
24. Entretanto, estes dados não invalidam o uso do AlClPC, e sim
confirmam a sua utilidade, pois há necessidade de interação física entre
NC e célula para que exista algum tipo de associação entre o marcador, o
AlClPC, e a célula. Além disso, as análises foram realizadas nos canais de
fluorescência FL2 e FL3 para o vermelho do Nilo e a AlClPC. Testes
realizados posteriormente comparando os canais de fluorescência FL3 e
FL4 mostraram que os neutrófilos apresentam autofluorescência no canal
de fluorescência FL3, esta autofluorescência foi reduzida quando
empregamos a quarta cor (FL4) para realizar a leitura no citômetro de
fluxo.
Figura 22- Comparação da porcentagem de células que apresentaram fluorescência após
incubação com NC de PLA encapsulando AlClPC na placa com insert. Cada população foi
comparada com o grupo controle, incubado na ausência de NC.
3.2- Estudo de Biodistribuição de Nanopartículas Poliméricas in vivo
O fenômeno da fagocitose é a característica fisiológica mais
importante do sistema fagocítico mononuclear (SFM), sendo a capacidade
de remover rapidamente materiais antigênicos ou tóxicos. Essa atividade
envolve o SFM em numerosas atividades tais como a remoção de fibrina,
lipoproteínas, plaquetas agregadas, bactérias e endotoxinas, ou
83
metabolismo de ferro e bilirrubina via ingestão eritrocitária (Fernandez-
Urrusuno et al, 1996). Quando injetados na circulação sangüínea, sistemas
de liberação particulados são rapidamente reconhecidos e removidos da
circulação pelo SFM. Muitas estratégias têm sido propostas para evitar a
captura destas partículas após a administração. Entre elas, o revestimento
das partículas com polietilenoglicóis que fornecem uma camada hidrofílica,
formando uma barreira estérica que impede o reconhecimento das NC
pelas opsoninas e conseqüentemente diminui sua rápida eliminação do
sangue. O efeito protetor da cadeia de PEG e de outros polímeros
hidrofílicos tem sido explorado para a estabilização de nanopartículas na
circulação sistêmica (Cavalli et al, 1999). Entretanto, os efeitos da
modificação de superfície das nanocápsulas com esses polímeros não foi
ainda completamente avaliada in vitro e in vivo.
A manipulação das características físico-químicas, como
composição química, carga superficial e tamanho das partículas causam
alterações na biodistribuição destas partículas pelo organismo. É
necessário identificar as variáveis in vivo e estabelecer sua importância na
distribuição tecidual. Um aspecto que até o momento foi pouco explorado é
a relação existente entre a quantidade de NC administradas por via
endovenosa e a saturação da capacidade fagocitária do sistema imune.
Nesse aspecto, nem a dose de NC, nem os efeitos dos diferentes tipos de
cargas superficiais foram avaliados in vivo. A distribuição in vivo das
nanocápsulas foi determinada após inoculação das suspensões de
nanocápsulas por via intravenosa. 20 minutos após administração os
camundongos foram sacrificados e seus órgãos coletados para a
realização do doseamento do marcador fluorescente no plasma e tecidos
dos animais.
Observa-se que pelo perfil das curvas da figura 34 que as NC
de PLA saturam a capacidade fagocítica com doses inferiores de polímero
em relação às NC de PLA-PEG e PLA-QUI, conforme perfil exponencial da
curva de AlClPC versus dose de polímero. Como se sabe que as
nanocápsulas de PLA são fagocitadas avidamente por estas células
devido a sua hidrofobicidade (Mosqueira et al, 2001b), evidencia-se neste
estudo que doses de 100mg/Kg NC de PLA estão próximas do limite de
84
saturação do SFM. Entretanto, observa-se também que doses muito
maiores de PLA-PEG parecem ser necessárias para a saturação do
sistema, conforme perfil linear da curva obtido para esse tipo de NC.
Provavelmente, a estabilização estérica das NC com cadeias de PEG
confere a essas partículas uma redução significativa da opsonização e
reconhecimento pelo sistema imune, o que permite um aumento do volume
de distribuição bastante significativo para esse tipo de partícula
(Mosqueira et al., 2001b). Assim sendo, as doses saturantes tendem a
aumentar, como observado no gráfico da figura 34. Já as nanocápsulas
revestidas de quitosana apresentaram um perfil bastante distinto dos dois
outros tipos de NC com cargas negativas. As NC positivamente
carregadas de PLA-QUI parecem desaparecer da circulação sanguínea
muito rapidamente e de maneira dose independente, não indicando
saturação do sistema imune, mas evidenciando a distribuição rápida para
algum tecido não estudado neste trabalho. Além disso, a injeção
intravenosa de NC de PLA-QUI mostrou-se muito tóxica in vivo, sendo que
doses superiores a 280mg/Kg levam a efeitos tóxicos letais para os
animais em exprimentação.
Figura 23- Dosagem de AlClPC em plasma de camundongo após 20 minutos da administração de
NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI com a administração de doses crescentes de polímero, n=4 para
cada ponto da curva. * diferença estatística (p<0,05), (n=4).
*
*
*
*
*
*
85
Figura 24- Dosagem de AlClPC em fígado de camundongo após 20 minutos da administração de
NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI em doses crescentes de polímero. * representa diferença
estatística (p<0,05), (n=4).
Como um órgão responsável pela eliminação de material
particulado da circulação sanguínea juntamente com o baço, o fígado foi
avaliado na distribuição de NC. As concentrações teciduais no fígado
aumentaram de maneira geral com o aumento da dose de NC, entretanto,
essas concentrações aumentaram de maneira mais evidente com NC de
PLA do que com as NC de PLA-PEG e PLA-QUI. Observa-se que há uma
redução significativa da acumulação de NC de PLA-PEG no fígado em
relação às NC de PLA, onde a acumulação no fígado segue um perfil
linear em relação a dose. Observa-se um perfil de saturação do fígado em
termos da acumulação de NC de PLA-PEG com doses entre 200-
300mg/Kg, pois não apresentaram diferenças estatísticas significantes
entre a terceira e quarta dose administradas, inferiores as de PLA.
Já as NC revestidas de quitosana se acumulam de forma
dose-dependente no fígado, mas de maneira muito reduzida em relação às
demais formulações. Neste aspecto, a carga dessas NC poderá ser o
parâmetro que as distingue das demais e que determina uma
biodistribuição diferente e ainda não totalmente esclarecida. No caso de
PLA-QUI, doses maiores não puderam ser encontradas, pois a toxicidade
foi um fator limitante.
Conforme observado nos resultados da Figura 36, onde os
dados são expressos em % da dose administrada no plasma, existe uma
evidencia maior da saturação da capacidade fagocitária com as NC de
PLA em relação às demais. O perfil observado no sangue para PLA-PEG e
*
*
*
*
86
PLA-QUI são doses-independentes e evidenciam o maior volume de
distribuição desses dois tipos de partículas. Entretanto, os resultados
apresentados na Figura 37 evidenciam o efeito de saturação do fígado
muito claramente. Doses mais elevadas para as NC de PLA, seguidas de
NC de PLA-PEG e das NC de PLA-QUI são necessárias para o efeito de
saturação das células fagocitárias do SFM presentes no fígado.
Figura 25- Porcentagem da dose administrada de AlClPC em plasma de camundongo após 20
minutos da administração de NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI em doses crescentes de polímero.
Sendo que * diferença estatística (p<0,05), (n=4).
Figura 26- Porcentagem da dose administrada de AlClPC em fígado de camundongo após 20
minutos da administração de NC de PLA, PLA-PEG e PLA-QUI em doses crescentes de polímero
Sendo que * representa diferença estatística comparando com a menor dose administrada.
Na menor dose de polímeros administrada (57 mg/Kg), as
partículas fluorescentes de PLA-PEG apresentaram uma maior
*
*
*
*
87
porcentagem da dose (Figura 36) no plasma, resultados esperados visto,
que são partículas com superfície mais hidrofílicas quando comparadas
com as NC de PLA e possuem meia vida sanguínea prolongada
(Mosqueira et al., 2001a, Pereira, 2007). A concentração plasmática
apresentou um perfil linear dose dependente A dosagem percentual
plasmática com o aumento das doses das NC de PLA-PEG se manteve
praticamente constante, não sendo observada diferença estatísitca
(p<0,05) entre os pontos da curva. Panagi et al., (2001) em estudos
realizados com partículas de PLGA-PEG nas doses de 150-1050 µg do
polímero por camundongo observou um perfil farmacocinético linear e
dose-independente. Entretanto, houve diminuição do acúmulo da
porcentagem da dose administrada no fígado (Figura 37), sugerindo que
as nanocápsulas furtivas se acumularam em outros órgãos e possuem um
elevado volume de distribuição. Stolnik et al., 2001 observou que com o
aumento da razão de PEG/PLA ou PEG/PLGA administrada aumenta
inicialmente o tempo de permanência das NP na circulação sanguínea,
mas em tempos posteriores ocorre uma diminuição no tempo de
permanência das NP furtivas no sangue. Como um só tempo foi avaliado
neste trabalho, estudos posteriores precisam ser realizados para
investigação da farmacocinética dessas novas nanocápsulas no sangue.
O aumento da dose administrada de nanocápsulas
fluorescentes de PLA causou um aumento significativo (p< 0,05) da
porcentagem entre a menor e a maior dose administrada no sangue e uma
diminuição significativa (p<0,05) do acúmulo no fígado comparando a
menor e maior dose administrada, indicando uma saturação da capacidade
de captura de nanopartículas pelas células do fígado quando administrada
altas doses de nanocápsulas de PLA (Figura 36). Assim sendo a
concentração de polímero injetada de nanopartículas fluorescentes de PLA
afetam a distribuição da fluorescência entre o fígado e o sangue.
Resultados semelhantes foram observados por Panagi et al.(2001) para o
estudo de biodistribuição de nanopartículas de PLGA. As maiores doses
administradas de NC de PLA resultaram em concentrações plasmáticas
proporcionalmente maiores que para as doses de NC de PLA-PEG e PLA-
QUI. Assim, as NC de PLA, ditas convencionais, por não apresentarem
88
modificação de superfície, se acumulam nos órgãos do SFM ricos em
células fagocitárias e possuem maior dificuldade em atingir outros tecidos
no organismo. A exceção de serem administradas em doses superiores às
doses saturantes, onde agiriam como NC furtivas.
Administrando a maior dose de nanopartículas fluorescentes
de quitosana, 120mg/Kg observou-se a morte súbita dos animais.
Resultados de toxicidade semelhantes foram encontrados por Hass, 2007,
que verificou a toxicidade de nanocápsulas de quinina revestidas com
quitosana quando testadas in vivo. Para as nanocápsulas fluorescentes de
PLA-QUI a concentração plasmática aumentou (p<0,05) com o aumento
da dose polimérica administrada apresentando um perfil linear dose-
dependente como as Nc de PLA-PEG; enquanto que a porcentagem da
dose administrada no plasma se manteve constante (p<0,05). No fígado foi
observada uma redução percentual no acúmulo das Nc de PLA-QUI entre
a menor e maior dose administradas (p<0,05). A porcentagem destas
nanopartículas no plasma e no fígado foi bem menor que para as
partículas de PLA e PLA-PEG. A quitosana tem sido utilizada como
polímero para modificação de superfície de partículas (Hans and Lowman,
2001). Como a concentração porcentual destas partículas no plasma e no
fígado foi baixa, espera-se que tenham se acumulado em outros tecidos.
Estudos futuros serão destinados à localização do acúmulo das NC de
PLA-QUI, já que estas se mostraram capazes de evitar a acumulação no
fígado, sendo portanto promissoras para o direcionamento de fármacos em
outros alvos. Uma possibilidade que precisa ser investigada é a
acumulação dessas NC no baço, uma vez que elas possuem tamanho
superior ao das demais NC e o baço age como um órgão de filtração
captando partículas maiores.
Para as nanopartículas de PLA e PLA-QUI houve uma
diminuição no acúmulo da porcentagem de fluorescência no fígado com o
aumento da dose administrada, enquanto que não foi observado diferença
estatítica na porcentagem acumulada no fígado para as Nc de PLA-PEG.
Somente para as nanopartículas de PLA, foi observado um aumento
percentual da fluorescência no plasma estatisticamente significativo
(p<0,05). Aparentemente, ocorre uma diminuição da atividade das células
89
do SFM com o aumento da dose de nanopartícula polimérica, resultado
mais evidente para as nanopartículas de PLA. Este efeito pode ser
atribuído à saturação dos sítios de ligação e mecanismo de captura das
células do SFM e/ou a uma depleção das opsoninas plasmáticas, uma vez
que se considera que ocorre a opsonização das partículas por proteínas
plasmáticas, como a proteína do complemento C3, antes da fagocitose
pelos macrófagos (Artursson and Sjoholm, 1986).
Nanopartículas poliméricas convencionais são rapidamente
removidas da circulação sanguínea após administração intravenosa, pelos
macrófagos do SFM, principalmente células de Kupffer no fígado e os
macrófagos do baço (Gref et al., 1995). Esse efeito é devido
principalmente à característica de superfície das partículas, no que diz
respeito à polaridade da superfície e da presença de longas cadeias. O
PLA devido à sua característica hidrofóbica torna a superfície da
nanopartícula bastante acessível à opsonização e posterior fagocitose.
Devido a isso, tem havido um crescente interesse no desenvolvimento de
carreadores coloidais de fármacos que permaneçam por tempo prolongado
na circulação sanguínea. Entre esses, nanopartículas apresentando na
sua superfície cadeias de polímero hidrofílico tem mostrado ser um
sistema particularmente promissor (Gref et al., 1994; Verrechia et al., 1995;
Bazile et al., 1995). Entre os polímeros hidrofílicos, o polietilenoglicol
(PEG) tem mostrado ser particularmente efetivo como estabilizador
estérico, provavelmente devido a sua alta hidrofilia, flexibilidade das
cadeias, neutralidade elétrica e ausência de grupos funcionais, os quais
previnem interações com componentes biológicos in vivo (Gref et al.,1995).
Numerosos estudos nesta área foram realizados com
lipossomos (Abra et al., 1981, Allen et al., 1991). Esses estudos mostram
que a clearance de lipossomos é dependente de fatores como a
composição, o tamanho da partícula e a dose de lipídeos administrados
(Allen et al., 1991). Tem sido observado também que aumentando-se a
dose administrada de lipossomos ocorre um aumento no tempo de meia
vida sanguínea (Allen et al., 1991 e 1994). Acredita-se que este efeito é
devido à saturação dos macrófagos livres e fixos do SFM. O aumento da
90
dose de lipossomos resulta na diminuição da ligação de proteínas
importantes para o reconhecimento do SFM.
Em geral, a fração da dose associada com o fígado em um
determinado tempo diminui com o aumento da dose, um exemplo clássico
de saturação dos sítios de ligações e/ou uptake. Resultados semelhantes
aos encontrados no presente trabalho foram observados por Abra et al.,
1981 que verificou o efeito dose dependente na disposição in vivo de
lipossomas. Suspensões coloidais e emulsões lipídicas também exibiram
saturação hepática (Neill et al., 1972; Saba et al., 1969). O bloqueio da
captura hepática está veiculado a saturação dos sítios de ligações não
específicos do fígado e a depleção de substâncias sanguíneas, como as
opsoninas, responsáveis pela estimulação da captura de partículas
estranhas pelo sistema reticuloendotelial (Saba, 1970). Entretanto, não
foram encontrados na literatura estudos similares sobre o sistema imune in
vivo com nanocápsulas poliméricas, sendo que este trabalho apresenta,
portanto sua contribuição na compreensão do comportamento desse tipo
de vetor nanoparticulado.
91
DISCUSSÃO GERAL
O método desenvolvido e validado para quantificação da
AlPcCl em suspensões de nanocápsulas foi preciso, exato e linear entre
0,025 e 5,0 μg/mL, justificando sua utilização na quantificação do fármaco
nas formulações de nanocápsulas utilizado nos ensaios in vitro e in vivo. O
desenvolvimento desse método é de grande interesse, pois são inúmeros
os trabalhos in vitro com esses marcadores fluorescentes que apresentam
também propriedades fotosensitizadoras para terapia fotodinâmica do
câncer (Paula, 2008) Entretanto, como não há na literatura metodologia
para seu doseamento em CLAE, devido à dificuldade de separação,
detecção e solubilidade, os estudos in vivo ficaram até hoje limitados.
Os resultados da estabilidade de AlPcCl em amostras de
plasma mantidas a temperatura ambiente durante 4 horas não
demonstraram alteração significativa em relação à concentração das
amostras recém-preparadas. Os resultados da análise de amostras de
plasma mantidas à temperatura de -80°C e submetidas a ciclos de
congelamento e descongelamento permitiram concluir que as mesmas
permanecem estáveis por até três ciclos de congelamento e
descongelamento. A estabilidade pós-processamento foi avaliada
mantendo-se a amostra processada por 24 horas e 48 horas à temperatura
ambiente. Os resultados indicaram que não houve degradação significativa
em relação à concentração das amostras recém-preparadas, indicando
adequabilidade do método ao tempo, condições de análise e ao
armazenamento das amostras.
O procedimento de extração, por meio da extração líquido-
líquido com acetato de etila, mostrou-se simples e adequado para análise
de amostras de plasma e fígado contendo AlPcCl. O padrão-interno
utilizado no presente trabalho foi a ZnPC, que sendo estruturalmente
semelhante à AlPcCl, apresentou adequada sensibilidade e seletividade. A
comparação entre os cromatogramas obtidos de plasma branco normal,
hemolisado e plasma obtido após adição de padrão de referência de
AlPCCl e padrão-interno não revelaram a presença de interferentes nos
92
tempos de retenção dos mesmos. A recuperação média de AlPcCl e seu
padrão-interno foram excelentes, tanto no plasma quanto no fígado após o
procedimento de purificação das amostras.
A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com
detecção de fluorescência foi o método de escolha por apresentar
características adequadas à análise de amostras de origem biológica em
relação a sua sensibilidade, especificidade, precisão e exatidão. Os
valores dosados com o uso deste método apresentaram-se precisos, o que
justificou a utilização do método em ensaios de biodistribuição.
Para o preparo das nanocápsulas utilizamos o método de
nanoprecipitação, descrito primeiramente por Fessi et al., 1989. Para
optimização das formulações avaliamos parâmetros como a presença ou
ausência de lecitina e os volumes de solventes orgânicos e aquosos
empregados nas formulações. Observamos que para preparo das NC de
PLA a presença de lecitina diminui significantemente o tamanho das
partículas. Observou-se também que tanto para as NC de PLA, PLA-PEG
quanto para as NC de PLA-QUI aumentando-se o volume dos solventes
nas preparações diminui-se o tamanho das nanocápsulas, provavelmente
pela diminuição da viscosidade das fases involvidas no processo. Para
preparação das NC de PLA-QUI o método de nanoprecipitação foi
modificado para possibilitar o revestimento com a quitosana solúvel em
meio ácido. Usamos uma concentração de 2,5 mg/mL do polímero solúvel
em solvente orgânico, PLA, e igual concentração de quitosana solubilizada
em meio ligeiramente ácido foi adicionada no meio aquoso. A lecitina
adicionada na formulação eleva o tamanho das nanocápsulas de PLA-QUI.
As formulações de NC preparadas a partir de diferentes
polímeros apresentaram-se monodispersas com índice de polidispersão
menor que 0,2 e com tamanho variando de 145 a 256 nm. Sendo que as
formulações de PLA-PEG tiveram um tamanho médio significantemente
reduzido em relação às demais formulações. A porcentagem de
encapsulação da AlPcCl foi de 100% para todas as formulações.
Entretanto, a eficiência de encapsulação variou entre as formulações,
sendo que o maior valor foi encontrado para as NC de PLA-PEG. As NC
foram caracterizadas morfologicamente por microscopia de força atômica
93
(MFA) mostrando-se esféricas, sem diferença entre as partículas com e
sem AlPcCl. Os diferentes tipos de NC preparadas atenderam aos
requisitos de modificação de carga superficial, pois apresentaram potencial
zeta de -41,6, -35,3 e +9,6, para as suspensões preparadas a partir do PLA,
PLA-PEG e PLA-QUI, respectivamente.
Para seleção do marcador fluorescente mais adequado para
nossos estudos, fizemos um estudo comparativo entre a AlClPC e o
vermelho do Nilo. Foi observado por citometria de fluxo que o vermelho do
Nilo foi liberado rapidamente (<30min) das NC de PLA e marcavam os
leucócitos da amostra, sendo que resultados distintos foram observados
com o uso AlClPC. Não houve liberação significativa do marcador para os
meios de cultivo, assim sendo, a AlClPC foi escolhido como o marcador
fluorescente mais adequado para os estudos subseqüentes in vitro e in
vivo.
Os estudos in vitro realizados para avaliar a interação das
células do sangue humano com as Nc fluorescentes de PLA, PLA-PEG e
PLA-QUI por citometria de fluxo mostraram que os monócitos são as
principais células fagocitárias para as NC testadas. Em relação às NC, os
monócitos apresentaram índice fagocítico maior que os linfócitos e
neutrófilos, o que indica que após administração intravenosa os monócitos
podem ser as células responsáveis pela captura dessas NC no sangue
circulante. Outros autores avaliaram este aspecto em relação às
nanoesferas poliméricas revestidas por polietilenoglicol
(Zambaux et al,1999, Leroux et al.1994, Tsotume et al., 2009)
Concentrações crescentes de NC dos polímeros PLA, PLA-
PEG e PLA-QUI foram administradas para avaliação do efeito da dose de
polímero na concentração plasmática e hepática em camundongos. Na
menor dose administrada, as NC furtivas de PLA-PEG apresentaram uma
maior concentração plasmática. Em valores percentuais da dose
administrada, foi observado que para as NC de PLA-PEG e PLA-QUI os
níveis percentuais no plasma permanecem constantes e para as NC
convencionais de PLA há um aumento significativo da concentração no
plasma. Para as NC de PLA e PLA-QUI foi observada diminuição
percentual da dose administrada no fígado com o aumento da dose,
94
indicativo de saturação da capacidade fagocítica neste órgão. As NC de
PLA-QUI foram as que apresentaram menor concentração plasmática e
hepática, sugerindo o acúmulo destas partículas em outros tecidos não
avaliados no presente trabalho.
O presente trabalho abre várias frentes de investigação com
a necessidade de aprofundamento do efeito da dose de polímero
administrada em função do tempo, o estudo mais amplo de biodistribuição
dessas NC e a avaliação farmacocinética. A influência das características
de superfície das NC na distribuição in vivo se mostrou evidente neste
trabalho e a utilização dessas características no direcionamento de
fármacos para diferentes tecidos pode ser explorada em trabalhos futuros.
95
CONCLUSÕES
Neste trabalho foi desenvolvida metodologia validada de
quantificação do AlClPC em plasma e fígadopor CLAE,
preenchendo uma lacuna na literatura científica para a utilização
desta molécula como traçador e fotosensitizador. Neste sentido, foi
desenvolvido método sensível, simples, estável e adequado para
quantificação de AlClPC em amostras de plasma e fígado
provenientes do estudo in vivo. A validação do método garantiu a
qualidade e a confiabilidade dos resultados obtidos no estudo in
vivo, justificando seu uso em ensaios de biodistribuição.
A preparação de suspensões coloidais de nanocápsulas contendo o
marcador fluorescente AlClPC, a partir do ácido poliláctico (PLA),
PLA-PEG e quitosana (PLA-QUI), pela técnica de nanoprecipitação
do polímero, mostrou-se viável e foi optimizada neste trabalho,
resultando em três formulações com superfícies de natureza e
carga diferentes, mas com tamanhos próximos em uma mesma
escala para comparação in vivo. A % de encapsulação da AlClPC
nas nanocápsulas foi próxima de 100% garantindo uma boa
marcação das NC. Foram evidenciadas diferenças morfológicas na
superfície das NC por AFM de acordo com o tipo de polímero
utilizado.
A dose de polímero administrada por via endovenosa parece
influenciar na clearance das nanocápsulas pelas células do sistema
fagocitário mononuclear. Com o aumento da dose de polímero
administrada observou-se uma diminuição percentual do acúmulo
das nanocápsulas fluorescentes no fígado, resultando num aumento
da fluorescência no plasma, permitindo a distribuição das NC de
PLA-PEG e PLA-QUI para outros tecidos.
As doses utilizadas mostraram-se saturantes sugerindo uma
diminuição da captura das NC pelas células fagocíticas, seja pela
saturação dos sítios de ligação nas células, seja pela depleção das
opsoninas plasmáticas.
96
O tipo de polímero utilizado no preparo das nanocápsulas interfere
na carga superficial das partículas, na sua organização e na
distribuição tecidual dessas partículas.
97
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