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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR
RESPOSTA AO TRATAMENTO COM ACETAMINOFENO E RADIAÇÃO
IONIZANTE EM LINHAGENS CELULARES DE GLIOMAS HUMANOS:
PARTICIPAÇÃO DA ENZIMA GLUTATIONA PEROXIDASE
Dissertação para obtenção do Título de
Mestre em Diagnóstico Genético e
Molecular
FÁBIO DAL BELLO
Orientadora: Dra. Ivana Grivicich
Canoas
2009
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
2
DEDICATÓRIA
Quero dedicar esse trabalho única e
exclusivamente aos meus pais: Vicente e Vera.
Eu devo toda minha realização pessoal e
profissional ao esforço, ao amor, ao carinho, ao
respeito, à dedicação e ao incentivo destas duas
pessoas maravilhosas durante todas as etapas
da minha vida. Pai e mãe, muito obrigado por
vocês existirem. Deus, muito obrigado por haver
me presenteado com essas duas pessoas tão
especiais.
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3
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar à Deus, pela vida e pela oportunidade de estar finalizando mais
uma etapa importante de minha vida.
À minha esposa, Natalia Parra, por ter entendido tantos finais de semana sem
poder dar a atenção que ela merecia e mesmo assim ter ajudado tanto nesta
vitória. Por ter aceitado a distância como necessidade e não como vontade, pois
só nós dois sabemos como foi difícil estarmos longe por longos períodos. Te amo
muito!
À minha orientadora, Professora Dra. Ivana Grivicich, por ter sido mais que
professora e orientadora. Muito obrigado por ter sido uma grande educadora e
amiga. Mesmo nos momentos difíceis sua dedicação foi algo indescritível.
As acadêmicas do Centro de Pesquisas em Ciências Médicas (ULBRA) Luciana
de Leon, Tatiane Baes e Priscila Rodriguez pelo inestimável auxilio com os
experimentos.
Ao Serviço de radioterapia do hospital São Lucas da PUCRS pela possibilidade
de irradiar nossas amostras.
À minha irmã Verônica, meu cunhado Luciano e meu afilhado Pedro Henrique,
pelos ensinamentos de vida, pela parceria e pelo amor incondicional.
Ao Centro Universitário Feevale pela confiança depositada desde o início e pelas
oportunidades pessoais e profissionais que me proporcionam.
À toda turma (secretárias, colaboradores, colegas, amigos e pacientes) do CAD,
da Centrobesi e da QuiroSaúde.
Aos meus amigos, os quais seria difícil nomear cada um, mas que sabem meu
verdadeiro sentimento e respeito por todos.
4
ÍNDICE
RESUMO.........................................................................................................................................5
ABSTRACT.....................................................................................................................................6
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................................................7
1.1 Epidemiologia............................................................................................................................7
1.2 Classificação dos Gliomas........................................................................................................8
1.3 Biologia e Patogenia dos Glioblastomas.................................................................................9
1.4 Características Clínicas...........................................................................................................13
1.5 Tratamentos............................................................................................................................14
1.5.1 Terapias Convencionais......................................................................................................14
1.5.2 Tratamentos Experimentais.................................................................................................15
1.6 Radioterapia e Resposta Celular ao Tratamento....................................................................17
1.7 Glutationa Peroxidase.............................................................................................................20
1.8 Acetaminofeno........................................................................................................................21
2 OBJETIVOS..............................................................................................................................23
3 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................................24
3.1 Linhagens Celulares e Manutenção das Culturas.................................................................24
3.2 Tratamento com Acetaminofeno............................................................................................24
3.3 Tratamento com Radiação.....................................................................................................24
3.4 Determinação do Efeito Citotóxico do Acetaminofeno...........................................................25
3.5 Avaliação da Sobrevivência Celular.......................................................................................25
3.6 Determinação da Atividade da Glutationa Peroxidase...........................................................26
3.7 Análise Estatística..................................................................................................................26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................................27
5 CONCLUSÕES.........................................................................................................................36
6 PERSPECTIVAS.......................................................................................................................37
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................................38
5
RESUMO
Os glioblastomas compreendem 50-60% dos tumores cerebrais e estão
associados com um prognóstico ruim. Apesar dos avanços das técnicas
neurocirúrgicas, do aperfeiçoamento do tratamento radioterápico e do surgimento
de novos agentes quimioterápicos, o prognóstico dos pacientes com esta
neoplasia permanece insatisfatório. Sabidamente, o sucesso limitado da
radioterapia no manejo dos gliomas malignos está associado à manifestação de
características moleculares que resultam num comportamento radioresistente. O
efeito da radioterapia está associado a produção de espécies reativas do oxigênio
(EROs) que levam ao dano celular. Porém, também tem como conseqüência a
formação de enzimas antioxidantes, como a glutationa redutase (GPx), que
tendem a proteger as células levando às falhas nos tratamentos. O conhecimento
dos mecanismos associados à radioresistência dos gliomas humanos pode
contribuir no desenvolvimento de estratégias terapêuticas que aumentem a
eficácia aos tratamentos com radioterapia. Uma destas estratégias, é a utilização
de agentes que aumentem a sensibilidade à radiação. Entre os agentes
estudados para este fim, está o antiinflamatório não esteroidal, acetaminofeno.
Neste sentido, nós avaliamos o potencial radiosensibilizante do acetaminofeno
nas linhagens celulares de gliomas humanos U-87 e MO59J. Além disso
avaliamos a participação da enzima GPx nas respostas observadas. Para isto, as
células foram expostas ao acetaminofeno ou à radiação ionizante e avaliadas
quanto a sua citotoxicidade pelo método SRB ou método clonogênico,
respectivamente. Após, foram selecionadas doses não letais do acetaminofeno
(0,5 mM) e da irradiação (2 Gy) para testarmos o efeito de ambos combinados,
através do ensaio clonogênico. As respostas celulares foram relacionadas com a
atividade da enzima GPx, mensurada pelo ensaio de oxidação do NADPH. Os
estudos de citotoxicidade do acetaminofeno demonstraram que as linhagens
celulares U-87 e MO59J não apresentam diferenças significativas na sensibilidade
ao acetaminofeno após 24 h de tratamento. Por outro lado foi observada diferença
na sensibilidade à radiação entre as linhagens celulares estudadas. Desta forma,
a linhagens MO59J foi considerada radiosensível e a U-87 radioresistente. O
efeito da combinação do acetaminofeno com a radiação demonstrou uma redução
no número de colônias formadas, quando comparado com a radiação isolada,
sugerindo um aumento de radiosensibilidade nas duas linhagens celulares
estudadas. A atividade basal da GPx foi diferente entre as linhagens U-87 (maior
atividade) e a MO59J (menor atividade). A exposição ao acetaminofeno não
alterou a atividade da GPx em nenhuma das linhagens celulares. Por outro lado o
tratamento com 2 Gy de radiação, mostrou um aumento na atividade da GPx nas
duas linhagens. Quando as células foram tratadas com a combinação do
acetaminofeno e radiação, a atividade desta enzima foi semelhante ao observado
com a radiação isolada. Em suma, nossos resultados indicam que o
acetaminofeno aumenta a sensibilidade à radiação nas linhagens celulares
derivadas de glioblastoma humanos U-87 e MO59J, mas a GPx não está ligada a
este efeito.
6
ABSTRACT
Glioblastoma accounts for 50-60% of all brain tumors and is associated with poor
prognosis. Despite the advances in standard therapy, including surgical resection
followed by radiation and chemotherapy, the prognosis for patients with gliomas
remains unsatisfactory. It is well know that the efficacy of this therapeutic modality
is often limited by the occurrence of radioresistance. Exposure of cells to ionizing
radiation leads to formation of reactive oxygen species (ROS) that are associated
with radiation-induced cytotoxicity. ROS scavengers, therefore, are one of the
important factors in protecting cells against ROS injury during ionizing radiation
exposure. One of these is the enzyme glutathione peroxidase (GPx). The
understanding of molecular mechanisms associated to radioresistance can
contributed to the development of new strategies in the radiotherapy treatment of
this neoplasia. One of these strategies is the use of agents that increase the
radiotherapy-sensitivity. Among these agents is the non-steroidal anti-
inflammatory drug acetaminophen. In the present study, we investigated whether
the acetaminophen induce radiosensitivity in human glioma cell lines. We also
determined if the GPx is associated to the effect observed. To this end the U-
87MG and MO59J human glioma cell lines were treated with acetaminophen (0 -
10 mM) or irradiated at 2, 5 and 10 Gy and the citotoxic effects were determined
using SRB assay or clonogenic assay, respectively. Further, the cells were
exposed to non-lethal doses of acetaminophen (0,5 mM) and radiation (2 Gy)
simultaneously and evaluated using the clonogenic assay. The cellular responses
were correlated to the activity of GPx, determined by the method of NADPH
oxidation. After 24 h both cell lines demonstrated similar sensitivity to
acetaminophen. On the other hand, following irradiation, MO59J demonstrated to
be more sensitive to radiation than U-87. The combination of acetaminophen and
radiation induce a decrease in the number of colony formed, suggesting that the
acetaminophen increase the sensitivity to radiation in both cell lines. The basal
activity of GPx was different among U-87 (higher activity) and MO59J (lower
activity) cell lines. The exposure to acetaminophen did not alter the basal activity
of GPx. But after the irradiation (at 2 Gy) GPx activity increased in the U-87 and
MO59J cells. However, the combination of acetaminophen and radiation
demonstrated levels of GPx similar with the radiation alone. Together, our data
demonstrated that acetaminophen can increase the radiosensitivity in the U-87
and MO59J glioma cell lines, but this effect is not associated to the GPx activity.
7
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia
Os tumores do Sistema Nervoso Central (SNC) constituem 2-5% de todas
as neoplasias humanas. No Brasil, os tumores cerebrais primários são a sétima
causa de morte entre as neoplasias malignas, o que corresponde a 4% das
mortes por todas as neoplasias por ano (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007). Os
tumores do SNC podem se originar de células gliais (gliomas, astrocitoma e
oligodendroglioma), células ependimárias (ependimoma) ou tecido de suporte
(meningioma, schwanoma e papiloma do plexo corióide) (BURZYNSKI et al.,
2006). Dentre as neoplasias malignas cerebrais, os gliomas são os mais
prevalentes demonstrando alto índice de mortalidade, pobre prognóstico e curto
tempo de sobrevida aos portadores desta patologia (BEHIN et al., 2003).
Os gliomas correspondem a 51% das neoplasias primárias que acometem
o SNC (GUPTA & SARIN, 2002), cerca de 12-15% de todas as neoplasias
intracranianas e 60-70% de todos os tumores astrocitários (WEN & KESARI,
2008). Acometem todas as faixas etárias, contudo, vêm sofrendo um aumento de
ocorrência entre a população idosa, sendo que o pico de incidência destes
tumores ocorre na sétima década de vida, onde há o predomínio das espécies
mais agressivas de gliomas, particularmente astrocitomas malignos (MANSKI &
HAMILTON, 2001). Ente estes, o Glioblastoma Multiforme (GBM), que representa
25 % de todas as neoplasias do SNC (BRANDES et al., 2008).
Aproximadamente 5% dos pacientes portadores de glioma maligno
apresentam história familiar de gliomas. Alguns destes casos familiares estão
associados com síndromes genéticas como neurofibromatose tipo 1 e 2, síndrome
de Li-Fraumeni e síndrome de Turcot. Porém, a maioria dos casos familiares não
tem uma causa genética identificada (FARREL & PLOTKIN, 2007).
8
1.2 Classificação dos Gliomas
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) os gliomas podem ser
classificados em quatro estágios conforme a presença das seguintes alterações
celulares: atipias celulares, atividade mitótica, proliferação endotelial, celularidade
e presença de necrose (FULLER & SCHEITHAUER, 2007). Isto é, à medida que o
tumor apresenta alterações morfológicas mais pronunciadas o seu estágio
aumenta. Portanto, um tumor estágio IV é tipicamente caracterizado por
proliferação celular descontrolada, necrose tecidual e infiltração de tecidos
adjacentes (GROSSMAN & BATARA, 2004), e é denominado de Glioblastoma
Multiforme (KLEIHUES & CAVENEE, 2000).
A classificação demonstrada na Tabela 1 apresenta os estágios de
malignidade de gliomas de mesma origem ou grupos que progridem
independentemente, pois o desenvolvimento de um glioblastoma pode ocorrer a
partir de gliomas de menor grau, resultando no glioblastoma secundário, ou
aparecer como um glioblastoma primário, sem evidências clínicas de lesões pré-
existentes. Um aspecto clínico de extrema relevância é a alta predisposição
destes tumores em evoluírem a neoplasias mais agressivas, transformando-se em
tumores de grau III e grau IV. Este aumento no comportamento maligno coincide
com a maior capacidade de invasão e proliferação de maneira multifocal, assim
sendo, a transição de um tumor grau III para um tumor de grau IV envolve um
aumento na neovascularização e o aparecimento de áreas necróticas.
Conseqüentemente, a progressão tumoral ao longo destes estágios antecipa um
mau prognóstico, com decréscimo na sobrevida de cerca de cinco anos para
menos de um ano (BEHIN et al., 2003).
As diferentes classificações dos astrocitomas ou glioblastomas são
atribuídas aos fatores histológicos que traduzem suas diferenciações (Tabela 1).
O grau I corresponde a astrocitomas bem diferenciados, baixa celularidade, com
raras mitoses ou ausência delas, sem necrose e sem proliferação vascular. No
grau II, a celularidade é maior, há atipias nucleares e algumas mitoses enquanto
no grau III, observa-se necrose pouco extensa e moderada proliferação vascular.
9
O grau IV corresponde ao glioblastoma multiforme apresentando polimorfismo
celular, alta celularidade, mitoses, inclusive atípicas, necrose, capacidade
infiltrativa e proliferação vascular (BEHIN et al., 2003).
Tabela 1 – Estadiamento dos astrocitomas
Grau de malignidade Denominação
I Astrocitoma Pilocítico
II Astrocitoma
III Astrocitoma Anaplásico
IV Glioblastomas Multiforme
Adaptado de Kleihues & Ohgaki (1997).
1.3 Biologia e Patogenia dos Glioblastomas
A patogênese do GBM é um processo multifatorial que apresenta diversas
mutações em genes supressores tumorais e em proto-oncogenes (BEHIN et al.,
2003). Estas mutações ocasionam a perda dos mecanismos de controle do ciclo
celular e da diferenciação, o que produz instabilidade genômica e facilita a
ocorrência de mutações adicionais à célula tumoral (MILLER & PERRY, 2007).
Os oncogenes derivam de genes expressos em células normais,
denominados proto-oncogenes. Estes codificam proteínas que estimulam a
proliferação celular, inibem a diferenciação celular e bloqueiam a apoptose
(PÉREZ-ORTIZ et al., 2000). A conversão de um proto-oncogene em oncogene é
denominada “ativação oncogênica”, sendo que se um oncogene for ativado por
uma mutação ou por alterações do controle externo, a célula sofre um
crescimento descontrolado e é convertida em uma célula maligna. É importante
salientar que nem sempre a atividade oncogênica se origina por amplificação
10
direta de um proto-oncogene, podendo resultar de mutações estruturais ou
translocação dos mesmos (FUEYO & GÓMEZ-MANZANO, 1998; BEHIN et al.,
2003).
Em contraste com a atividade dos oncogenes, outro tipo de alteração
genética resulta na diminuição das funções celulares. Os genes supressores de
tumor, como o nome indica, inibem o desenvolvimento tumoral mediante a
regulação dos genes que participam no crescimento celular (KIM & HARSH,
1993).
O desenvolvimento e a proliferação dos tumores do SNC provavelmente
ocorrem por mutações que promovem a hiperativação em proto-oncogenes e
inativação em genes supressores de tumor (BEHIN et al., 2003). Entre as
alterações mais freqüentes temos a super-expressão ou amplificação do gene do
receptor do fator de crescimento epidérmico (rEGF) (BENJAMIN et al., 2003;
KESARI et al., 2005; OHGAKI, 2005), perda da heterozigose do cromossomo 10,
super-expressão ou amplificação do murine double minute 2 (mdm-2) (TYSNES &
MAHESPARAN, 2001). A compreensão das alterações genéticas (Tabela 2) têm
fundamental importância na busca do tratamento adequado para cada tipo de
tumor cerebral.
Tabela 2 – Principais alterações genéticas dos gliomas
Tipo de Tumor Alta Freqüência Baixa Freqüência
Glioblastoma Multiforme Primário LOH10q
Alterações PTEN
Amplificação rEGF
Mutação p53
Glioblastoma Multiforme
Secundário
LOH10q
Mutação p53
Alterações PTEN
Amplificação rEGF
Oligodendroglioma LOH10q
LOH19q
Alterações PTEN
Oligoastrocitoma Mutação p53
Fonte: Kleihues & Ohgaki (1997).
11
As mutações no gene supressor p53 são observadas em cerca de 60% dos
astrocitomas de todos os graus, sugerindo que a inativação deste gene é
fundamental na origem de tumores de baixo grau, assim como na progressão até
glioblastoma secundário (BEHIN et al., 2003). A proteína p53 é uma das principais
reguladoras do checkpoint G1, que representa um ponto de controle estratégico
do ciclo celular, onde a integridade do DNA é verificada. Normalmente, o
checkpoint é controlado por danos no DNA que promovem aumento e ativação
transitória da p53. Este evento induz parada em G1 e bloqueio da DNA
polimerase via inibidor de cdk (quinase dependente de ciclina) – p21
waf1/cip1
.
Assim, são estabelecidas as condições para que se inicie o reparo das lesões do
DNA envolvendo um complexo sistema enzimático, dentre eles a proteína de 45
kD-GADD45 (Growth Arrest upon DNA Damage) e a subunidade da DNA
polimerase – PCNA (antígeno de proliferação nuclear). Ao término deste
processo, o avanço para a fase S do ciclo celular é promovido quando a proteína
mdm-2 (murine double minute) se associa à p53, revertendo o bloqueio do ciclo
(BOGLIOLO, 2006).
Quando os danos não são reparáveis, a ativação do checkpoint G1 pode
levar a apoptose, seqüência de eventos geneticamente programados que
resultam na morte celular (BLAGOSKLONNY, 1999). A apoptose pode ser
desencadeada por uma variedade de estímulos, incluindo agentes citotóxicos,
radiação ionizante, ausência de fatores de crescimento e ativação de receptores
promotores de morte celular. Tais estímulos podem conduzir a subprogramas,
podendo envolver, além da p53, compostos como ceramida, cálcio e espécies
reativas de oxigênio (EROs). Quando desencadeados, convergem para o
checkpoint de apoptose, no qual complexas interações entre as proteínas
supressoras e promotoras de apoptose desempenham um importante papel na
decisão da morte celular (BLAGOSKLONNY, 1999).
A perda do p53 funcional resulta em descontrole do checkpoint G1,
podendo conduzir as células danificadas a iniciarem a fase S sem reparar as
lesões com potencial carcinogênico. A probabilidade de tais anormalidades serem
transmitidas para células-filhas é aumentada quando ocorrem simultaneamente
mutações em elementos da cascata apoptótica, como, por exemplo, a bcl-2. A
12
instabilidade genômica resultante cria não apenas condições para a ocorrência de
futuras mutações oncogênicas, mas também pode induzir resistência às drogas
citotóxicas e radiação ionizante. De fato, a perda da p53 e a superexpressão do
bcl-2 têm sido associadas à resistência a tais tratamentos nos glioblastomas
(WATANABE et al, 1997). Quanto maior a perturbação do checkpoint G1 e do
ciclo celular por recorrentes mutações oncogênicas maior o grau da malignidade.
A superexpressão do mdm-2 foi identificada em mais de 50% dos glioblastomas
primários (BIERNAT et al., 1997), causando a permanente inativação da p53,
resultando no avanço descontrolado e acelerado para a fase S. Outra proteína
funcional crítica para o chekpoint G1 é a pRb, que atua suprindo a transição do
G1-S até o término da checagem do DNA. A perda desta proteína ocorre em 25%
dos astrocitomas grau II e tem sido associada com a elevada atividade mitótica
dos astrocitomas anaplásicos (ICHIMURA et al., 1996).
Outras mutações, que podem atingir até 60% dos astrocitomas, incluem as
amplificações ou superexpressão dos genes que codificam fatores de crescimento
ou seus receptores. A hiperativação ou amplificação é observada, por exemplo,
em relação aos receptores do fator do crescimento epidérmico (EGF), do fator de
crescimento transformante β (TGF-β), bem como do fator de crescimento derivado
de plaquetas (PDGF). Um aumento na produção dos próprios fatores, sem
alterações nos receptores, pode ser exemplificado pelo PDGF, fator de
crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento endotelial vascular
(VEGF). Em ambos os casos, podem gerar sinais aberrantes, capazes de induzir
descontrole de mitogênese, migração celular, síntese de proteínas ou
angiogênese. Desta forma, tais alterações não intensificam apenas o crescimento
tumoral, mas criam condições para a expansão do tumor para tecidos vizinhos
(BRANDES et al., 2008). A ativação persistente das vias mediadas por fatores de
crescimento tumoral e o contínuo descontrole do ciclo celular culminam no
fenótipo mais avançado atingido por um astrocitoma, sendo que este fenótipo
apresenta características de alta malignidade e não responsividade às
modalidades terapêuticas e, devido ao acúmulo de alterações moleculares, estas
neoplasias estão associadas à resistência a agentes quimioterápicos e à
radioterapia (COSTELLO et al., 1997).
13
1.4 Características Clínicas
Os tumores do SNC são extremamente variáveis em relação à evolução
clínica, dependendo diretamente da localização e da razão do crescimento do
tumor. Um dos sintomas mais comuns da hipertensão intracraniana causada pelo
crescimento tumoral é a cefaléia. Esta queixa pode ser referida no local do tumor
mas é mais comumente difusa. Outro sinal presente nos pacientes com
neoplasias cerebrais é o papiledema, observado no exame de fundo de olho
(ANDREOLI et al., 1998; MANSKI & HAMILTON, 2001). As convulsões
generalizadas ou parciais ocorrem em cerca de 20 a 30% dos pacientes com
tumores hemisféricos. Em crianças com maior susceptibilidade, ou sabidamente
portadoras de epilepsia, pode-se observar episódios convulsivos devido a
hipertensão intracraniana e não à localização primária do tumor. Em casos de
portadores de tumores no SNC com menos de dois anos de idade, geralmente se
observa uma combinação de sinais decorrentes da hipertensão intracraniana com
sinais focais e distúrbios sensitivo-motores, sendo que a irritabilidade e o retardo
no desenvolvimento neuropsicomotor são freqüentes (BAST et al., 2000).
O diagnóstico histopatológico da neoplasia ocorre, em muitos casos, após
longos períodos do aparecimento dos sinais e sintomas, devido ao fato destes
não se apresentarem de maneira tão relevante no início da patologia (BAST et al.,
2000; GUPTA & SARIN, 2002). O diagnóstico inicial dos tumores intracranianos
pode ser obtido por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Tomografia Axial
Computadorizada (TAC) e Tomografia por Fótons. As técnicas de imagem
revelam a presença, mas não a natureza exata de uma lesão (ADAMS & VITOR,
1996; LOUIS et al., 2001). Sendo assim, a biópsia e a graduação histológica
tumoral são necessárias para uma confirmação de diagnóstico e a utilização de
marcadores moleculares juntamente aos métodos existentes, a fim de realizar um
diagnóstico e um estadiamento mais preciso dos gliomas, tem sido proposta
(RASHEED et al., 2002).
14
1.5 Tratamentos
1.5.1 Terapias Convencionais
O tratamento de primeira linha para os tumores cerebrais é a cirurgia
associada à radioterapia e à quimioterapia (BRADES, 2003). Os principais
benefícios desta modalidade terapêutica são o estabelecimento do diagnóstico
preciso e a diminuição da massa tumoral, sendo que a ressecção completa do
tumor é limitada pelo grande poder de invasão dos gliomas em tecidos normais.
Estudos randomizados demonstraram que a cirurgia, como modalidade única de
tratamento, sem ressecção agressiva, aumenta a sobrevida, em média, em 14
semanas, quando comparada a aplicabilidade de nenhuma terapia. Por outro
lado, a radioterapia pós-operatória promove aumento da sobrevida para cerca de
35 semanas (VIVES & PIEPMEIER, 1999; GROSSMAN & BATARA, 2004).
Pacientes com gliomas de baixo grau podem ser tratados com cirurgia
exclusiva, caso seja possível a remoção completa do tumor. É o caso dos
astrocitomas pilocísticos, que podem chegar à sobrevida de cinco anos, após sua
remoção total. A radioterapia nesses tumores é reservada apenas para situações
de progressão da doença.
Desde que se iniciaram as pesquisas para os tumores do SNC, inúmeros
quimioterápicos têm sido testados em tumores primários de SNC porém, muitas
drogas demonstraram eficácia limitada, especialmente em astrocitomas de alto
grau. Estes resultados negativos podem, parcialmente, ser explicados pela
ausência de especialidade terapêutica das drogas citotóxicas contra tais
neoplasias, pela quimiorresistência intrínseca destes tumores, a baixa tolerância
do tecido nervoso normal aos efeitos tóxicos decorrentes da terapia e o limite
apresentado pela barreira hemato-cefálica à entrada de quimioterápicos ao SNC
(REARDON & WEN, 2006).
A combinação de técnicas cirúrgicas, radioterapia e quimioterapia tem se
mostrado eficaz quanto ao aumento da sobrevida dos pacientes com gliomas
15
malignos (HALL, 2000: REARDON & WEN, 2006).
1.5.2 Tratamentos Experimentais
Os tratamentos quimioterápicos para os tumores primários do SNC não
têm demonstrado a eficácia esperada pelos pesquisadores bem como o
tratamento cirúrgico e a radioterapia pós-operatória. Desta forma, tem-se buscado
novos desenvolvimentos e aprimoramentos no campo das modalidades
terapêuticas. Em relação aos novos agentes citotóxicos que estão sendo
investigados, merecem destaque o irinotecan, a oxaliplatina e a temozolamida,
esta última, um agente análogo da decarbazina, foi avaliada em pacientes com
astrocitoma anaplásico e glioblastoma multiforme, induzindo respostas parciais
entre 9-43% (NAJMAN & GADELHA, 2002; SIPOS et al., 2004). Estudos recentes
com temozolamida demonstraram bons resultados em pacientes com
glioblastoma recorrente e, quando associada à radioterapia concomitante
observou-se aumento significante na sobrevida dos pacientes com glioblastoma
multiforme (SIPOS et al., 2004; STUPP et al., 2005).
Outra terapia citotóxica pesquisada é inibição da tirosina-quinase, que está
associada aos receptores de EGF (rEGF) e induzem o crescimento tumoral,
sendo que com a inibição da ação da tirosina-quinase se observa a frenagem do
crescimento tumoral (KUAN et al., 2001; JENDROSSEK et al., 2003). Estudos
realizados demonstraram que em uma determinada amostra, 40% dos indivíduos
tratados com inibição da tirosina-quinase apresentaram mutações no rEGF e, por
conseqüência, diminuição do crescimento tumoral (JENDROSSEK et al., 2003;
KESARI et al., 2005). Em outra pesquisa com inibidores da tirosina-quinase
associada à temozolamida, pôde-se observar que oito pacientes estabilizaram o
crescimento tumoral na primeira fase do estudo (PRADOS et al., 2005). Porém,
com os avanços nos estudos, iniciaram os achados citotóxicos não favoráveis ao
tratamento com inibidores de tirosina-quinase nos quais observou-se uma grande
limitação na evolução dessa terapia relacionada à quimiorresistência e a
permeabilidade de membrana do sistema nervoso (HASS-KOJAN et al., 2005).
16
A supressão da angiogênese também está sendo desenvolvida como
terapêutica anticâncer, já que a neovascularização representa uma condição
pontual na proliferação tumoral. Estudos iniciais testando agentes bloqueadores
de angiogênese tiveram início em pacientes com astrocitoma de alto grau nos
quais foram observados resultados iniciais promissores, demonstrando que trata-
se de uma linha terapêutica de grande valia para o tratamento dos gliomas
(BROWN & GIAVAZZI, 1997; YUNG, 1997). A inibição da angiogênese continuou
sendo estudada, pois o crescimento e a sobrevivência tumoral dependem da
nutrição oriunda da nova vascularização provinda das células tumorais, porém
não se obtiveram resultados muito satisfatórios, mesmo que ao longo das
pesquisas o tempo de sobrevida dos pacientes com glioblastoma multiforme
tenha aumentado (KESARI et al., 2005). Novos estudos têm sido desenvolvidos
através da injeção intra-arterial de DNA plasmático de agentes anti-angiogênicos
nos tumores cerebrais. Um estudo com injeção intra-arterial do gene da
endostatina, um supressor de angiogênese, em um modelo de rato com
gliossarcoma demonstrou uma diminuição de 80% no volume total do tumor e um
aumento da sobrevida de 47% (BARNETT et al., 2004).
Nos primeiros estudos realizados com a finalidade de pesquisar a evolução
e o prognóstico dos GBMs, relatou-se um tempo de sobrevida não maior que um
ano nos portadores desta patologia (DAUMAS-DUPPORT et al., 1988). Com a
intensa realização de pesquisas nesta área e a evolução das técnicas de
microcirurgias, radioterapia e quimioterapia, estudos recentes têm demonstrado
um aumento da sobrevida dos pacientes de 9-15 meses para até dois anos
(GROSSMAN & BATARA, 2004), porém existem diversos fatores que contribuem
para o mau prognóstico dos gliomas de alto grau como o aparecimento dos
sintomas quando os tumores atingem entre 30 e 60 gramas de peso e tornam-se
fatais quando atingem 100 gramas de peso; outra característica que torna o
prognóstico ruim desta patologia é a ausência de drenagem linfática a qual
impede a remoção de debris necróticos, podendo resultar em edema
intracraniano podendo acarretar em lesões expansivas em estruturas vitais tais
como as camadas meníngeas, induzindo a riscos de paradas respiratórias e
morte. Assim sendo, o prognóstico depende do grau de diferenciação do tumor e
17
do grau de ressecção cirúrgica obtida nos casos de terapêutica cirúrgica
(SIMMONS et al., 2001; NAJMAN & GADELHA, 2002).
Pacientes com astrocitoma anaplásico recidivado apresentam um
prognóstico ruim, sendo observada sobrevida de 6 a 9 meses. Também
considera-se mau prognóstico os pacientes com glioblastoma multiforme, com
uma sobrevida que varia de 9 a 12 meses ou sobrevida em dois anos de 8-12%
(NAJMAN & GADELHA, 2002). O prognóstico do glioblastoma multiforme é
reservado e estudos têm sido conduzidos com intuito de estabelecer fatores
prognósticos para esta neoplasia entretanto, ainda não se estabeleceu um
consenso pois alguns trabalhos evidenciam maior sobrevida em pacientes jovens
(menores de 45 anos) porém observa-se maior prevalência de gioblastomas
secundários nesta faixa etária, os quais apresentam melhor prognóstico
(SIMMONS et al., 2001).
1.6 Radioterapia e Resposta Celular ao Tratamento
A radioterapia é considerada a principal forma terapêutica adjuvante em
astrocitomas malignos e glioblastomas sendo uma modalidade de tratamento
muito utilizada no manejo clínico das neoplasias do SNC (PETERSEN et al.,
2000; HUSSAINI et al., 2002). Entretanto, as respostas terapêuticas dos
astrocitomas malignos são tipicamente heterogêneas e incompletas, e
freqüentemente acompanhadas por radioresistência tumoral.
A radiação eletromagnética, caracterizada por comprimento longo de ondas
e por baixa freqüência é denominada como radiação não ionizante. Nas
moléculas biológicas, produzem vibração e rotação dos átomos. A energia da
radiação com comprimentos de onda curto e alta freqüência podem ionizar
moléculas-alvo e expulsar elétrons, sendo descrita como radiação ionizante. Dois
tipos de radiação ionizante são conhecidos: a radiação eletromagnética (raios X e
raios gama) e a radiação de partículas (alfa, beta, nêutrons e prótons) (KANE &
18
KUMAR, 2000). Segundo Bast et al. (2000), tanto os raios X (RX) quanto os raios
gama são utilizados na radioterapia. A unidade de exposição para o RX ou raio
gama é o roentgen (R), que representa uma medida de ionização no ar, enquanto
o rad representa a quantidade de radiação no tecido. Outra unidade utilizada é o
Gray (Gy), onde 1 Gy corresponde a 100 rad (GIGLIO, 1999; KANE & KUMAR,
2000).
Todas as estruturas celulares podem sofrer lesões moleculares na
interação da radiação ionizante com o material biológico. Mesmo que todas as
moléculas representem alvos para estes efeitos, as lesões mais prejudiciais são
aquelas que envolvem a estrutura e função do DNA, incluindo as ligações
cruzadas de DNA-proteína, ligações cruzadas nos filamentos de DNA, oxidação e
degradação de bases, clivagem das ligações açúcar-fosfato e quebras do DNA na
cadeia única ou de cadeia dupla. O mecanismo destas lesões difere entre os
vários tipos de radiação, podendo ser diretos ou indiretos (BAST et al., 2000;
SOUHAMI & TOBIAS, 2005). Os RX e raios gama, apresentam como processo
predominante a ação indireta, onde os elétrons reagem com a água formando
radicais livres. Quando os fótons da radiação ionizante de alta energia atingem os
tecidos, choca-se com os elétrons de seus átomos. Como resultado deste
choque, o elétron atingido pelo fóton recebe parte de sua energia e pode sair da
órbita do átomo de origem. A retirada de um elétron torna-o carregado
positivamente e muito reativo, gerando assim os radicais livres. Estes, por sua
vez, reagem com as moléculas vizinhas, podendo provocar lesão ao DNA da
célula (BAST et al., 2000; SOUHAMI & TOBIAS, 2005).
Os efeitos da radiação sobre os tumores e sobre células normais incluem
não somente as lesões e as vias metabólicas que conduzem à morte celular, mas
também aos mecanismos celulares envolvidos no reparo (COTRAN, 2000;
HOEIJMAKERS, 2001). As células também podem sofrer lesões sub-letais e
poderão ser regeneradas se houver tempo, energia e nutrientes. Portanto, células
lesadas de forma não letal, são reparadas, podendo aumentar a sobrevivência
quando uma segunda dose de irradiação é separada por um período de tempo.
Esta variabilidade na sobrevivência é causada pela sincronização do crescimento
exponencial de populações celulares induzida pela primeira dose de radiação e
19
subseqüente tratamento com uma segunda dose durante a fase S
(radioresistente) ou fase G2/M (radiosensível) (SOUHAMI & TOBIAS, 2005).
A radiação ionizante pode causar diferentes efeitos sobre o crescimento de
um tecido. Entre eles, o efeito tardio, que está relacionado ao modo clonogênico
de morte celular e o efeito imediato, associado a morte celular por apoptose. No
modo clonogênico, a morte celular não ocorre de imediato e sim na tentativa de
se reproduzir e gerar células-filhas. Quebras na cadeia de DNA são o objetivo
principal da radiação para iniciar esta via letal, seguida de reparo. Células mal
reparadas ou sem reparo conduzem a instabilidade genética, aumento na
freqüência de mutações e alterações cromossômicas (SOUHAMI & TOBIAS,
2005). A segregação incorreta do DNA, com lesão cromossômica durante a
mitose é a causa mais provável de morte celular mitótica induzida pela radiação
(BAST et al., 2000). Na apoptose os efeitos são imediatos, ocorrendo logo após a
exposição. Preferencialmente, este efeito acontece nos tecidos mais
radiossensíveis, que morrem sem entrar no processo de divisão celular (GIGLIO,
1999).
A radioresistência nas células tumorais tem sido freqüentemente associada
com defeitos nas vias que levam à morte celular programada. Diversos genes
estão envolvidos na resposta apoptótica de células irradiadas, sugerindo que a
avaliação do estado funcional de tais genes em tumores malignos, poderia auxiliar
na antecipação do resultado aos tratamentos. Os diferentes tipos de gliomas
possuem comportamentos distintos frente a radiação. Os glioblastomas, por
exemplo, são extremamente resistentes à radioterapia e 40-60% destes tumores
apresentam p53 mutado. Outros fatores associado com o aumento da resistência
à radiação é o aumento do gene bcl-2 e proteínas relacionadas e a atividade da
proteína PKC (ROCHA et al., 1999; HUSSAINI et al., 2002).
20
1.7 Glutationa Peroxidase
A radioterapia tem demonstrado efeitos benéficos na evolução dos gliomas
cerebrais com a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Estudos
evidenciaram que as EROs propiciam a ação da radiação ionizante e sua
produção no meio intracelular auxilia a lesão e a morte celular (LEE et al., 2002).
As lesões oxidativas ocorrem pelo desequilíbrio entre a produção de radicais
livres de oxigênio e os efeitos de enzimas antioxidantes tais como a glutationa
peroxidase (GPx), uma importante enzima no equilíbrio intracelular das espécies
reativas de oxigênio (Figura 1). Estas enzimas antioxidantes também são
conhecidas como fatores de radioresistência e quimioresistência (FREEMAN &
CRAPO, 1982).
Figura 1: Produção de espécies reativas do oxigênio e a ação das enzimas antioxidantes
(Adaptado de WAKAMATSU, et al., 2008).
As peroxidases são enzimas que utilizam uma variedade de redutores
celulares para inativar peróxidos (FRIDOVICH, 1998). A GPx é uma seleno-
enzima, cuja ação é baseada na oxidação da glutationa (GSH), ao dissulfeto
correspondente (GSSH) (SALVADOR & HENRIQUES, 2004). A GPx tem a função
21
de eliminar os excessos destas espécies para que não haja lesão ou morte
celular. Em células tumorais, um grande ponto no tratamento radioterápico é a
ação diminuída desta enzima, permitindo que os radicais livres de oxigênio
sensibilizem as células tumorais à irradiação ionizante a promovam a morte
celular (TANRIVERDI et al., 2007). Muitos tipos tumorais, além do GBM, têm sido
tratados com radioterapia tendo em vista a ação de enzimas antioxidantes
(PUNNONEN et al., 1993). Entretanto, os dados da participação da GPx na
radioresistência são conflitantes e indicam que este efeito seja dependente do tipo
celular (MANSUR et al., 2001).
1.8 Acetaminofeno
Diversas evidências clínicas, experimentais e epidemiológicas
demonstraram que os antiinflamatórios não esteroidais (NSAIDs) possuem
potencial atividade anticancer (COOGAN et al., 2000). Os NSAIDs têm como
mecanismo de ação a inibição da síntese de prostaglandinas através da inibição
da enzima ciclooxigenase (COX). Esta enzima possui duas isoformas já
identificadas: COX-1 e COX-2. COX-1 é a forma constitutiva, enquanto que a
COX-2 somente se expressa após ser estimulada por fatores de crescimento,
citoquinas e mitógenos (SMITH et al., 2000).
O acetaminofeno é um medicamento amplamente utilizado devido ao seu
efeito analgésico, antipirético e antiinflamatório (BERTOLINI et al., 2006). Foi
demonstrado que o acetaminofeno reduz a proliferação em linhagens celulares de
glioblastomas (CASPER et al., 2000; JOKI et al., 2001; BERNARDI et al., 2006),
porém o mecanismo envolvido não está elucidado.
A radioresistência é um dos fatores associados à redução da eficácia do
tratamento em GBM (DAVIS, 1989; ROCHA et al., 2004). Com a maior
sensibilização das células tumorais, o efeito da radioterapia poderá ser mais
eficaz por ação dos radicais livres de oxigênio produzidos pela irradiação
22
ionizante. Para que essas espécies estejam em abundância nas células tumorais
se faz necessário a inibição de enzimas antioxidantes como a GPx, causando
desequilíbrio das mesmas no meio intracelular e favorecendo a morte celular
(FRIDOVICH, 1998). Casper et al. (2000), relatam um aumento da
radiosensibilidade em culturas de gliomas e uma redução do crescimento tumoral
com a administração de acetaminofeno.
23
2 OBJETIVOS
Considerando a limitada resposta aos tratamentos convencionais no
glioblastoma, faz–se necessária a investigação de novas estratégias terapêuticas.
Neste sentido, este estudo tem por objetivos:
-Investigar o potencial radiosensibilizante do acetaminofeno em linhagens
celulares de glioblastoma humano.
-Avaliar a participação da enzima glutationa peroxidase (GPx) na resposta
ao tratamento com radiação ionizante, na presença e ausência do acetaminofeno
em linhagens celulares de glioblastoma humano.
24
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Linhagens Celulares e Manutenção das Culturas
Foram utilizadas as linhagens celulares de glioblastoma humano U-87 e
MO59J, adquiridas da American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA). As
células foram mantidas em frascos de cultura de 25 cm
2
com meio de cultura
DMEM contendo 2% de L-glutamina (p/v) e 15% de soro fetal bovino (v/v), a 37 ºC
em atmosfera de 5% de CO
2
e umidade relativa de no mínimo 95%. As culturas
celulares foram mantidas em crescimento exponencial através do sub-cultivo das
células a cada dois dias em meio de cultura sem antibióticos.
3.2 Tratamento com Acetaminofeno
Culturas em triplicatas foram expostas ao acetaminofeno diluído em etanol
(concentração máxima 1%) com doses seriadas de 0; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 e
10 mM (CASPER et al., 2000) por 24 h.
3.3 Tratamento com Radiação
As linhagens celulares U-87 e MO59J foram expostas a doses de 2, 5 e 10
Gy de radiação ionizante, isolada ou associada ao acetaminofeno. Tal
procedimento foi realizado em acelerador linear Telecobalto Theratron Phoenix
Philips SR 7510 (Eindhoven, Holanda), disponível no Serviço de Radioterapia do
Hospital São Lucas da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
25
3.4 Determinação do Efeito Citotóxico do Acetaminofeno
As células foram retiradas dos frascos de cultura por digestão enzimática,
com tripsina (0,25%)/ácido etilenodiaminotetra-acetico (EDTA; 1mM) e
ressuspendidas em meio de cultura contendo 50 µg/mL de gentamicina e 0,25
µg/mL de fungizone. Vinte e quatro horas antes do tratamento as células foram
inoculadas em microplacas de 96 wells. Cada experimento incluiu um controle
contendo meio de cultura ou meio de cultura com droga e sem células, além de
cada microplaca ter culturas de células que não receberam drogas para servir de
controle do crescimento celular.
As respostas celulares ao tratamento com o acetaminofeno foram
avaliadas através da coloração com sulforodamina B (SRB) (SKEHAN P et al.,
1990). Após 24 h de tratamento, as células foram fixadas in situ com ácido
tricloroacético (TCA; 50%). O TCA foi removido com água destilada, e após
serem secas, as células foram coradas com solução SRB (0,4%). A seguir, o
excesso de SRB foi removido com acido acético (1%), e o SRB ligado às
proteínas e solubilizado com Trizma base (10 mM; pH 10.5). O SRB ligado às
proteínas celulares é proporcional a densidade celular e foi determinado através
das absorvâncias medidas em um comprimento de onda de 515 nm usando um
leitor de microplacas Elisa (Multiskan EX, Labsystems, Finlândia).
3.5 Avaliação da Sobrevivência Celular
Para avaliar o efeito tardio da radiação (PETERSEN et al., 2000), as
células foram irradiadas na presença ou ausência do acetaminofeno. Após
tratamento 400 células/2mL foram inoculadas em placas de 6 well, em triplicata.
Após a incubação por 14 dias, as células foram fixadas com etanol 70% e coradas
com violeta cristal (0,1%). Apenas as colônias contendo 50 ou mais células foram
contadas sob um microscópio. A fração de sobrevivência (FS) foi calculada como:
26
FS = T/C x 100
Onde:
T = número de colônias após tratamento e C = número de colônias nos controles
não tratados.
3.6 Determinação da atividade da glutationa peroxidase
Culturas de 5 x 10
6
foram tratadas com 2Gy de radiação; 0,5 mM de
acetaminofeno ou 0,5 mM de acetaminofeno por 4 horas seguidos de 2 Gy de rad.
Após foram removidas dos frascos de cultura, lavadas com PBS, sonicadas (3
pulsos, 5 segundos, 40 mA) e centrifugadas (150 x g por 10 min). O sobrenadante
foi coletado e uma alíquota utilizada para dosar proteína pelo método de Bradford
(BRADFORD, 1976). A atividade da GPx foi quantificada com base no consumo
do NAPH oxidado (LAWRENCE & BURK, 1976). O pellet resultante foi incubado
em solução de EDTA 1 mM, NaN
3
1 mM, glutationa 1 mM, glutationa redutase 1
U, por 10 min. Após a adição de H
2
O
2
1,5 mM, a oxidação do NADPH foi
mensurada em espectrofotômetro em comprimento de onda de 340 nm por 3 min
em intervalos de 20 seg. Uma unidade da GPx é definida como a quantidade de
proteína necessária para oxidar 1 µmol de NAPH por min. Os resultados foram
expressos em mM de GPX por mg de proteína.
3.7 Análise Estatística
Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão de três
experimentos individuais. A análise de variância seguida de pós-teste de Tukey foi
realizada e as diferenças foram consideradas significativas para valores de p <
0,05.
27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O GBM é o subtipo mais comum de tumor cerebral, é agressivo altamente
invasivo e neurologicamente destrutivo em meses (MILLER & PERRY, 2007).
Apesar do aprimoramento nas técnicas cirúrgicas, nos tratamentos empregando a
quimioterapia e a radioterapia, o prognóstico dos pacientes com glioma maligno
ainda é ruim (REARDON & WEN, 2006). A radioterapia é o principal tratamento
pós-operatório para os gliomas malignos e prolonga a sobrevida destes pacientes
em 6-8 meses (BOGLER & WELLER, 2002). Contudo a maioria dos gliomas está
dentre os tipos tumorais considerados de maior radioresistência e correspondem
a mais da metade de todas as neoplasias primárias que acometem o SNC
(BERNHARD et al., 1999). É amplamente aceito que a radioresistência inata de
alguns tumores é um fator limitante da resposta ao tratamento radioterápico
(SNEED et al., 1994). Neste sentido, diversos estudos têm buscado melhorias nas
respostas terapêuticas. Entre as estratégias mais investigadas, está a
radiossensibilização das células tumorais (CASPER et al., 2000; NIFTERIK et al.,
2007).
Neste estudo investigamos a capacidade do acetaminofeno em sensibilizar
as linhagens celulares derivadas de glioma humano U-87 e MO59J aos efeitos da
radiação ionizante, bem como a participação da enzima glutationa peroxidase nas
respostas obtidas.
O acetaminofeno foi avaliado quanto ao seu efeito antiproliferativo nas
linhagens celulares após 24 h de exposição à droga. Como demonstrado na
Figura 2, o acetaminofeno apresentou uma citotoxicidade dependente de dose
nas linhagens celulares estudadas. A análise dos valores de IC
50
(1,5 ± 0,2 mM e
1,0 ± 0,1 mM, respectivamente) demonstra que as linhagens U-87 e MO59J não
apresentam diferenças significativas na sensibilidade ao acetaminofeno. Estes
achados estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram inibição no
crescimento celular nas linhagens celulares de glioblastomas humanos SNB-19 e
28
U-138 com doses próximas a 1 mM de acetaminofeno após 24 h de tratamento
(CASPER et al., 2000; BERNARDI et al., 2006).
0 2 4 6 8 10
dose de acetaminofeno (mM)
0
50
100
crescimento celular (%)
Figura 2: Efeito do tratamento com acetaminofeno nas linhagens celulares derivadas de
glioma humano U-87 () e MO59J (
●
). Após o tratamento com acetaminofeno (1 - 10
mM), as células foram incubadas durante 24 h e avaliadas pelo método colorimétrico
SRB. Os valores representam valores de média e desvio padrão obtidos de 3
experimentos independentes.
A seguir, nós examinamos as respostas celulares aos efeitos da radiação
ionizante.
Considerando que muitos dos danos celulares desencadeados pela
radiação podem ser reparados, a determinação das conseqüências a longo prazo
sobre o crescimento do tumor é fundamental (HILL et al., 2004). Com esta
finalidade, o efeito tardio da radiação nos cultivos celulares foi avaliado pelo
número de colônias de células formado após 14 dias da irradiação.
Neste sentido, foram inicialmente realizados experimentos para que se
pudesse determinar o número de células necessário para a inoculação na
formação de colônias (dados não mostrados). A determinação do melhor número
29
de células para os ensaios com o método clonogênico foi estabelecida através do
valor de eficiência de formação de colônias (EFC). Este valor é derivado da razão
do número de colônias pelo número de células inoculadas (LI et al., 2000)
. Os
resultados mostraram que a densidade de inoculação mais favorável à formação
de colônias para as linhagens do estudo, foi de 400 células por well. Além disso,
foi possível verificar que as duas linhagens têm capacidade de estabelecer
colônias, apesar de apresentarem diferenças nos valores de EFC.
Após a determinação da densidade de inoculação, foram realizados
experimentos para verificar a respostas das linhagens celulares frente à irradiação
ionizante. Para isto as células foram irradiadas com 2, 5 ou 10 Gy e
posteriormente, inoculadas (400 células por well) em placas de cultivo. As frações
de sobrevivência foram calculadas a partir da divisão do número de colônias nos
controles.
Os resultados mostraram que com 2 Gy de irradiação não observamos
efeito significativo sobre a formação de colônias na U-87. Enquanto que com esta
dose, a linhagem MO59J apresentou significativa queda na fração de
sobrevivência (aproximadamente 80%). Após radiação com 5 Gy, a linhagem
celular U-87 apresentou uma diminuição de cerca de 35% na fração de
sobrevivência, quando comparada ao controle. Já, na linhagem MO59J
praticamente não se detecta praticamente nenhuma colônia de células com esta
dose. A dose de 10 Gy na linhagem U87 reduziu a fração de sobrevivência em
aproximadamente 92%. Para a linhagem MO59J não foi observada formação de
colônias com a dose de 10 Gy (Figura 3).
De um modo geral, é possível dizer que as linhagens estudadas são
sensíveis aos danos induzidos pela radiação, pois verificamos que as duas
linhagens demonstraram inibição de crescimento dependente da dose de
radiação administrada (Figura 3). Contudo a diferença na sensibilidade à radiação
fica evidente entre as linhagens celulares estudadas. Desta forma, a linhagen
MO59J pode ser considerada relativamente radiosensível e a U-87
radioresistente. De fato, estudos anteriores (LIEBMANN et al., 1995; STREFFER
et al., 2002; NIEFTERIK et al., 2007; KANG et al., 2007), verificaram que a
30
radiação induz uma redução no potencial clonogênico em diversas linhagens
celulares de GBM, incluindo a U-87. Além disso, Rocha et al. (2004) já haviam
demonstrado diferença na sensibilidade à radiação ionizante entre as linhagens
celulares U-87 e MO59J.
2 5 10
dose (Gy)
0
20
40
60
80
100
120
fração de sobrevivência (%)
células não irradiadas
*
*
*
*
*
n.d.
Figura 3: Fração de sobrevivência das linhagens U-87 ( ) e MO59J ( ) irradiadas com
2, 5 ou 10 Gy. Após 14 dias foram quantificadas as colônias contendo no mínimo 50
células. Os valores representam valores de média e desvio padrão obtidos de 3
experimentos independentes. Os dados são apresentados como fração de sobrevivência
obtida a partir da razão do número de colônias irradiadas pelo número de colônias
controle, expresso em percentual. n.d. = não detectada. *Valor considerado
significativamente diferente do controle p < 0,05.
Com o objetivo de determinar se o acetaminofeno poderia aumentar a
sensibilidade à radiação nas linhagens celulares U-87 (radioresistente) e MO59J
(radiosensível), foi realizado um ensaio clonogênico. Para isto as células foram
tratadas com uma dose sub-letal de acetaminofeno (0,5 mM) por 4 h e a seguir
irradiadas com 2 Gy (dose que apresentou pouco efeito na U-87 e grande efeito
na MO59J). Após os tratamentos as células foram inoculadas em uma densidade
31
de 400 células/well e mantidas por 14 dias. Os resultados são apresentados na
Figura 4.
rad acet acet+rad
0
20
40
60
80
100
120
fração de sobrevivência (%)
células não tratadas
*
*
,
**
*
,
**
*
Figura 4: Fração de sobrevivência das linhagens U-87 ( )e MO59J ( ) tratadas com
com 2 Gy de radiação (rad), 0,5 mM de acetaminofeno (acet) ou com 0,5 mM de
acetaminofeno por 4 h e após irradiadas com 2 Gy (acet+rad). Após 14 dias foram
quantificadas as colônias contendo no mínimo 50 células. Os valores representam
valores de média e desvio padrão obtidos de 3 experimentos independentes. Os dados
são apresentados como fração de sobrevivência obtido a partir da razão do número de
colônias tratadas pelo número de colônias controle, expresso em percentual. *Valor
considerado significativamente diferente das células não tratadas p < 0,01. **Valor
considerado significativamente diferente das células tratadas com radiação sozinha p <
0,05.
Nestas condições, o acetaminofeno (0,5 mM) não demonstrou efeito
citotóxico em nenhuma das linhagens celulares (Figura 4). Isto resultou na
ausência de diferença significativa no número de colônias formadas após o
tratamento com acetaminofeno (90±10,4% na U87 e 85±9,9 na MO59J) quando
comparado com as células não tratadas (98±11,1 na U-87 e 93±12,3% na
32
MO59J). Estes resultados estão de acordo com Casper et al., (2000) que também
não observaram toxicidade do acetaminofeno na formação de colônias. Mais
recentemente, um estudo na linhagem de glioblastoma humano U-87, com outro
antiinflamatório não esteroidal, o celecoxib, também não apresentou redução na
formação de colônias (KANG et al., 2007).
O efeito da combinação do acetaminofeno (0,5 mM) com a radiação (2 Gy)
demonstrou uma redução no número de colônias formadas, quando comparado
com a radiação isolada (Figura 4), sugerindo um aumento de radiosensibilidade
nas duas linhagens celulares estudadas. Na linhagem U-87 a combinação reduziu
em 20% o número de colônias formadas (Figura 4) em relação ao tratamento
coma radiação isolada (p < 0,05). Já na linhagem MO59J (mais radiosensível) a
redução no número de colônias formadas após tratamento com acetaminofeno e
radiação foi de 50% (Figura 4) em relação a células irradiadas (p < 0,05). Nossos
resultados estão de acordo com a literatura onde foi demonstrado que o
acetaminofeno aumentou a radiosensibilidade da linhagem celular de
glioblastoma humano SNB-19 em 40% (CASPER et al., 2000). Kang et al. (2007)
demonstraram que o celecoxib (antiinflamatório não esteroidal) reduziu a
formação de colônias em 50% na linhagem celular U-87 após 24 h de tratamento.
Em outro estudo, com o antiinflamatório não esteroidal SC-236, a
radiosensibilidade da linhagem celular de glioblastoma humano U-251 também foi
aumentada (PETERSEN et al., 2000).
Tem sido demonstrado que o acetaminofeno pode induzir fragmentação no
DNA (SHENOY & GOPALAKRISHNA, 1977; BAE et al., 2003). Além disso, está
bem fundamentado que a radiação ionizante causa lesões no DNA de forma
direta ou indireta através da formação de radicais livres (BAST et al., 2000;
SOUHAMI & TOBIAS, 2005). A remoção de parte das EROs pela GPx foi
proposta como uma das vias indução de resistência à radiação em linhagens
celulares humanas (MARKLUND et al., 1984).
Considerando o distinto padrão de radiosensibilidade entre as duas
linhagens estudadas, bem como a capacidade do acetaminofeno em induzir
33
radiosenbilização nestas células, avaliamos a participação da GPx nos efeitos
observados. A Figura 5 resume os resultados encontrados.
controle rad acet acet+rad
0
20
40
atividade da GPX (mU/mg proteína)
*
*
*
*
Figura 5: Atividade da enzima glutationa peroxidase nas linhagens U-87 ( ) e MO59J
( ) tratadas com 2 Gy de radiação (rad), 0,5 mM de acetaminofeno (acet) ou com 0,5
mM de acetaminofeno por 4 h e após irradiadas com 2 Gy (acet + rad), após 24 h. Os
valores representam valores de média e desvio padrão obtidos de 3 experimentos
independentes. Os dados são apresentados como mU da GPx/mg de proteína. *Valor
considerado significativamente diferente das células não tratadas p < 0,05.
As células não irradiadas demonstraram diferentes níveis de atividade
basal da GPx (Figura 5). A linhagem U-87 apresentou maior atividade da GPx
(20±3,3 mU/mg proteína) em relação a atividade da MO59J (11±1,7 mU/mg
proteína). Estes resultados estão de acordo com um trabalho analisando seis
linhagens celulares de glioblastoma humano, onde a linhagem U-87 teve maior
atividade da GPx (ZHONG et al., 1999).
34
Após exposição a 2 Gy de radiação, observamos um aumento de
aproximadamente 40% na atividade da GPx nas duas linhagens estudadas. Por
outro lado a exposição ao acetaminofeno (0,5 mM) não alterou os níveis basais
desta enzima nas duas linhagens (Figura 5). A adição do acetaminofeno à
radiação não alterou a atividade da GPx quando comparado com o efeito da
radiação isolada nas linhagens celulares estudadas (Figura 5). Estes achados
indicam que o acetaminofeno não interfere na atividade da GPx e que as
diferenças observadas foram causadas pela radiação.
Diversos estudos relacionam a atividade das enzimas antioxidantes com a
radioresistência (PUNNONEN et al., 1993; LIEBMAN et al., 1995; SUN et al.,
1998; MANSUR et al., 2001). Os dados da participação da GPx indicam que este
efeito seja dependente do tipo celular (MANSUR et al., 2001). No nosso estudo, a
diferença nos níveis basais da GPx pode ser explicada, em parte, pela diferença
nos níveis basais da GPx. Isto é, a linhagem mais sensível, MO59J, possui menor
atividade basal da GPx, o que lhe confere uma menor proteção ao efeito da
radiação. Por outro lado a linhagem U-87, mais resistente, apresenta uma maior
proteção contra a radiação, por ter uma maior atividade basal da GPx. De fato, foi
observado que, apesar de não ser o único mecanismo envolvido, a GPx pode
causar radioresistência na linhagem celular de ovário de hamster chinês CHO
(SUN et al., 1998).
Por outro lado, o mecanismo envolvido na radiosensibilização através do
uso do acetaminofeno não depende da atividade da GPx no nosso modelo de
estudo. De fato, foi sugerido que o efeito radiosensibilzante do acetaminofeno
está associado com uma maior indução de fragmentação do DNA (SHENOY &
GOPALAKRISHNA, 1977), ou ainda através da interferência sobre a capacidade
das células em entrarem em mitose (CASPER et al., 2000).
Em síntese, nossos dados indicam que o acetaminofeno aumenta a
radiosensibilidade à radiação nas linhagens celulares derivadas de glioblastoma
humanos U-87 e MO59J, como demonstrado pela redução na formação de
colônias. Também é possível sugerir que a diferença de sensibilidade à radiação
35
ionizante pode estar associada com diferenças na atividade intrínseca da enzima
glutationa peroxidase.
36
5 CONCLUSÕES
Usando as linhagens celulares derivadas de gliomas humanos U-87 e
MO59J mostramos neste estudo que:
As linhagens celulares estudadas apresentaram diferente perfil de resposta
frente a radiação. Assim, a linhagem U-87 mostrou ser mais resistente à radiação
enquanto que a linhagem MO59J é mais sensível.
-O acetaminofeno induz a radiosensibilização nas linhagens celulares
estudadas.
-O efeito radiosensibilizante do acetaminofeno foi maior na linhagem mais
radioresistente.
-A enzima glutationa peroxidase (GPx) está associada à resposta ao
tratamento com radiação ionizante, na presença e ausência do acetaminofeno
nas linhagens celulares U-87 e MO59J.
37
6 PERSPECTIVAS
Tendo como ponto de partida os resultados obtidos com este estudo,
alguns processos envolvidos nas respostas obtidas com a combinação
acetaminofeno e radiação ionizante merecem especial atenção. A participação do
dano oxidativo é um ponto que deve ser investigado mais profundamente. Por
exemplo, a identificação de aumento na produção de espécies reativas do
oxigênio com o tratamento combinando acetaminofeno e radiação ionizante, bem
como participação de outras enzimas de defesa antioxidante como a superóxido
dismutase.
38
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