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Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde – Área de Concentração
em Neurociências
MARIA JULIA MACHLINE CARRION
Análise da Factibilidade e Segurança do Transplante Autólogo de Células Tronco de
Medula Óssea em Pacientes com Epilepsia
Porto Alegre
2010.
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2
MARIA JULIA MACHLINE CARRION
Análise da Factibilidade e Segurança do Transplante Autólogo de Células Tronco de
Medula Óssea em Pacientes com Epilepsia
Dissertação apresentada como requisito para a
obtenção do titulo de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Medicina e Ciências da Saúde da
Faculdade de Medicina da Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul
Orientador: Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa
Porto Alegre
2010
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3
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Rosária Maria Lúcia Prenna Geremia
Bibliotecária CRB 10/196
C318a Carrion, Maria Julia Machline
Análise da segurança e factibilidade do transplante autólogo de
células tronco de medula óssea em pacientes com epilepsia / Maria
Julia Machline Carrion. Porto Alegre: PUCRS, 2010.
109 f.: gráf. tab.
Orientador: Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa.
Dissertação (Mestrado) – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande
do Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Medicina.
Mestrado em Neurociências.
1. EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL/diagnóstico. 2.
RESISTÊNCIA A MEDICAMENTOS. 3. TRANSPLANTE AUTÓLOGO.
4. TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO. 5. TRANSPLANTE DE
MEDULA ÓSSEA. 6. LEUCÓCITOS MONONUCLEARES. 7. ADULTO.
8. ESTUDOS PROSPECTIVOS. 9. SOBREVIVÊNCIA DE TECIDOS. I.
Costa, Jaderson Costa da. II. Título.
C.D.D. 616.8
4
MARIA JULIA MACHLINE CARRION
Análise da Factibilidade e Segurança do Transplante Autólogo de Células Tronco de
Medula Óssea em Pacientes com Epilepsia
Dissertação apresentada como requisito para a
obtenção do titulo de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Medicina e Ciências da Saúde da
Faculdade de Medicina da Pontifícia Universidade
Católica do Rio Grande do Sul
Aprovada em 30 de setembro de 2010.
Banca Examinadora
Prof. Dr. André Luis Fernandes Palmini
Prof.Dra. Magda Lahorgue Nunes
Prof. Dr. Marino Muxfeld Bianchin
5
Dedico essa dissertação aos meus pais pelo apoio
incondicional ao meu crescimento profissional
6
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa pela orientação, incentivo e oportunidade de
aprendizado.
À toda a equipe de pesquisa: Danielle Irigoyen da Costa, Dr. Lucas Porcello Schilling,
Dra. Carolina Machado Torres, Daniel Marinowic, Dr. Eduardo Floriani Raupp, Dra. Denise
Cantarelli Machado, Dr. Bernardo Garicochea pela participação de todos durante o projeto.
À técnica Maria Dall Pozzo pela disposição à qualquer hora.
7
RESUMO
A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) é a manifestação convulsiva mais comum em
adultos e que comumente se apresenta como uma síndrome refratária aos tratamentos
farmacológicos. Alterações anatômicas e fisiológicas estão geralmente presentes em pacientes
com ELT, como a atrofia hipocampal vista em estudos de RM. As células tronco mostraram ter
a habilidade de regenerar estruturas hipocampais em modelos experimentais. O objetivo do
presente estudo é avaliar a segurança e factibilidade de uma nova estratégia terapêutica - o
transplante autólogo de células tronco mononucleares da medula óssea (CTMMO) no
tratamento de pacientes com ELT com esclerose hipocampal unilateral refratária. Foram
avaliados 9 pacientes adultos com diagnóstico de ELT confirmado por história clínica, RM com
volumetria hipocampal, vídeo EEG prolongado para registro de crises e exames laboratoriais.
Após consentimento informado e preenchendo todos os critérios de congruência para
lateralidade, os pacientes foram submetidos ao transplante de CTMMO. O transplante de células
tronco foi realizado através de arteriografia seletiva da artéria cerebral posterior infundindo-se
de 1,51 x 10
8
a 5,51 x 10
8
células mononucleares. Nenhum efeito adverso significativo foi
registrado durante o procedimento nem durante o tempo de seguimento. Três pacientes (44.5%)
permaneceram na Classe IA de Engel, 04 na classe IB e 02 pacientes na classe IIA. Dados os
resultados obtidos, concluímos que o transplante de CTMMO parece factível e seguro em
pacientes com ELT refratária. O controle de crises alcançado nessa população nos dá um
potencial terapêutico promissor no tratamento dessa população.
Palavras Chave: Epilepsia Refratária . Células Tronco . Segurança . Factibilidade
8
ABSTRACT
Temporal Lobe Epilepsy (TLE) is the most common convulsive presentation in adults
and commonly presents as refractory to pharmacological treatment. Anatomical and
physiological changes are often present in patients with TLE such as Hippocampal Atrophy
seen in MRI studies. Stem cells are proven to have the ability of regenerating hipocampal
structures in experimental models. The aim of this study is to evaluate safety and feasibility of
bone marrow mononuclear stem cells (BMMSC) transplant for the treatment of patients with
refractory TLE with unilateral hipocampal sclerosis. Nine TLE adult patients were studied, with
diagnose confirmed by clinical history, MRI study and hippcocampal volumetry, prolonged
video EEG for seizure recording and laboratory tests. After informed consent and fulfilling all
criteria for side congruence patients underwent BMMSC transplant. The transplant was
performed by selective posterior cerebral artery catheterism, transplanting from 1.51 x 10
8
to
5.51 x 10
8
mononuclear cells. No significative adverse effect was registered neither during
procedure nor during follow up period. Three patients (44.5%) remained at Engel Class IA, ) 04
patients at IB and 02 patients IIA. Given the results obtained, we conclude that BMMSC
transplant seems to be feasible and safe so far in patients with refractory TLE. Seizure control
achieved in this first population gives us a promising therapeutic potential in treatment of this
population,
Key words: Refractory Epilepsy . Stem Cells . Stem Cells . Feasibillty
9
LISTA DE SIGLAS
AHS Amigdalo-Hipocampectomia Seletiva
AVC Acidente Vascular Cerebral
CA 1 Corno de Amon 1
CA 2 Corno de Amon 2
CA 3 Corno de Amon 3
CA 4 Corno de Amon 4
CPC Crises Parciais Complexas
CPS Crises Parciais Simples
CEP Comitê de Ética e Pesquisa
CMN Células Mononucleares
CONEP Comitê Nacional de Ética e Pesquisa
CT Células Troncos
CTMMO Células Tronco Mononucleares de Medula Óssea
EEG Eletroencefalograma
EH Esclerose Hipocampal
ELA Esclerose Lateral Amiotrófica
ELT Epilepsia do Lobo Temporal
EMT Esclerose Mesial Temporal
FAE Fármaco Antiepilético
FAEs Fármacos Antiepiléticos
ILAE International League Against Epilepsy
IR Inversion Recovery
KTTP Tempo de Tromboplastina
ml mililitro
mm milímetros
mT miliTesla
MO Medula Óssea
10
µm micrometro
RM Ressonância Magnética
STIR Supression T2 Inversion Recovery
T Tesla
T1 Seqüencia de aquisição de RNM
T2 Seqüência de aquisição de RNM
TCI Termo de Consentimento Informado
TGO Transaminase Oxalacética
TGP Transaminase Pirúvica
TP Tempo de Protrombina
TIRDA Atividade Delta Rítmica Intermitente Temporal
TIRTA Atividade Theta Rítmica Intermitente Temporal
µl microlitros
11
SUMÁRIO
1 Fundamentação Teórica.......................................................................................... 12
1.1 Epilepsia ................................................................................................................... 12
1.1.1 Epilepsia do Lobo Temporal ............................................................................... 12
1.3 Células Tronco ..................................................................................................... 16
1.3.1 Células Tronco de Medula Óssea ....................................................................... 17
1.3.4 Terapia Celular em Epilepsia ............................................................................ 21
1.3.4.1 Terapia Celular em Epilepsia - Estudos Pré-Clínicos...........................................22.
2 Objetivos....................................................................................................................25
2.1 Objetivos Gerais.............................................................................................. .......... 25
2.2 Objetivos Específicos................................................................................................. 25
3 Material e Métodos.................................................................................................... 26
3.1 Delineamento ........................................................................................................ 26
3.2 Variáveis ......... ..........................................................................................................26
3.3 Pacientes .................................................................................................................... 26
3.4 Exames Complementares.......................................................................................... 26
3.5 Coleta de Medula Óssea ............................................................................................ 29
3.6 Processamento das Células Mononucleares............................................................. 29
3.7 Transplante de Células Tronco de Medula Óssea via Cateterismo Seletivo de
Artéria Cerebral Posterior.............................................................................................. 30.
3.8 Sequência do Prototocolo ..................................................................................... 31
3.9 Considerações Éticas................................................................................................ 32
3.10 Análise Estatística ................................................................................................ 32
4 Resultados ............................................................................................................ 34
4.1 Perfil e Variáveis Demográficas .......................................................................... 34
4.2 Intercorrências durante o procedimento de cateterismo e durante o seguimento 35
4.3 Volume de medula coletado e Fenotipagem ........................................... 35
4.4 Análise da Video monitorização Eletroencefalográfica .................................... 40
4.5 Análise do EEG durante o seguimento ................................................................ 46
4.6 Avaliação por neuroimagem do hipocampo ........................................................ 48
4.7 Análise das Crises Epilépticas Durante o Seguimento........... ................................ 52
5 Discussão...................................................................................................................... 55
12
1 Fundamentação Teórica
1.1 Epilepsia
Epilepsia é um distúrbio cerebral caracterizado por predisposição a geração de crises
epilépticas e pelas conseqüências neurobiológicas, cognitivas, fisiológicas e sociais dessa
condição (Loddenkemper 2008). As manifestações clínicas da epilepsia (crises) são recorrentes
e espontâneas, isto é, que recorrem mesmo na ausência de doença tóxica metabólica ou estado
febril (Gastaut 1973; Rogawski and Porter 1990) Estas manifestações clínicas são causadas pelo
disparo intenso, sincronizado e rítmico de populações neuronais no sistema nervoso central
(McNamara 1994).
A incidência de epilepsia tem sido estimada em até 100 casos por 100 000 pessoas em
países em desenvolvimento (Sander 1999). Cerca de 10-20% dos pacientes têm suas crises
inadequadamente tratadas e 30% apresenta resistência à terapia medicamentosa. Entre as
epilepsias refratárias ao tratamento clínico, aquelas com crises parciais complexas com origem
no lobo temporal são as mais freqüentes
1.1.1 Epilepsia do Lobo Temporal
A forma mais comum de manifestação convulsiva é a Epilepsia do Lobo Temporal
(ELT), reconhecida como uma síndrome altamente prevalente que atinge 40% dos indivíduos
que apresentam convulsões, usualmente é refratária aos fármacos antiepilépticos e é
cirurgicamente tratável.
A maior parte dos pacientes com ELT apresentam, à ressonância magnética do encéfalo,
sinais indicativos de Esclerose Mesial Temporal (EMT) (Cendes, Brodie e Anderman 2005). A
EMT é definida por suas particularidades anatômicas, caracteristicamente esclerose hipocampal
13
(EH) associada a graus variáveis de gliose e perda neuronal no hipocampo, subiculum, giro
parahipocampal e córtex temporal ínfero-medial. A EH consiste na perda neuronal e gliose
marcadas no campo CA 1 de Sommer e hilo hipocampal, menos visível em CA 3 e CA4 , com
preservação relativa da estrutura de CA2 ( Falconer 1974; Valerio e Rosemberg 1995; Lüders
2008).
Os indivíduos portadores de EH têm história clínica característica, crises convulsivas
prolongadas na infância, freqüentemente associadas com hipertermia (Cendes et al 2005). Os
danos neuronais evidenciados no hipocampo parecem ser decorrentes de uma liberação
excessiva de glutamato no decorrer dos episódios comiciais, que produz nos neurônios pós-
sinápticos um excessivo influxo de cálcio (Blumcke, Beck et al. 1996)
Clinicamente, a ELT manifesta-se por crises parciais simples (CPS) com desconforto e
calor epigástrico ascendente associados a distúrbios comportamentais como o medo. Ocorrem
igualmente crises parciais complexas (CPC) nas quais existe comprometimento da consciência
associada à fixação do olhar, automatismos orofaciais e gestuais, (Cendes et al 2005),
automatismos ipsilaterais ao hipocampo lesado e postura distônica do membro superior
contralateral ao hipocampo lesado (Kotagal et al 1989) podendo evoluir para generalização
secundária (Cendes et al 2005) Apesar da maioria dos pacientes com diagnóstico de EMT
responderem de forma adequada ao tratamento clínico, 40% dos pacientes tornam-se refratários
aos fármacos antiepilépticos (Semah 1998; Palmini et al 1998). Nestes casos, a cirurgia da
epilepsia – Amigdalo-hipocampectomia Seletiva (AHS) – com a ressecção das estruturas
mesiais do lobo temporal, uncus, amígdala e hipocampo é uma opção terapêutica (Palmini 1998;
Paglioli, Palmini et al. 2004; Palmini 2001), mas que tem sua morbimortalidade e, mesmo nos
melhores centros, há um grupo de 20-30% dos pacientes que continuam com crises epilépticas e
necessitam de tratamento medicamentoso associado. (Paglioli et al. 2004)
Os critérios diagnósticos da Epilepsia de Lobo temporal utilizados mundialmente são
baseados na história clínica do paciente, avaliação neuropsicológica, achados
eletroencefalográficos interictais e ictais e dados de neuroimagem por Ressonância
Magnética(Watson e Cendes 1998; Palmini et al 2001). A história de crises parciais complexas,
com ou sem generalização secundária, não provocadas e recorrentes constitui o pilar da
avaliação. A história típica é a do paciente com episódios inesperados de um “mal-estar
epigástrico” (aura epigástrica ascendente) evoluindo com desconexão do ambiente,
automatismos oro alimentares e gestuais e posturas distônicas nos membros superiores. Esta
14
manifestação pode, ou não, evoluir com uma generalização secundária. Na ELT refratária, a
despeito do uso de altas doses de fármacos antiepilépticos em mono ou politerapia, não há
remissão completa destas crises (Cendes et al 2005); (Lüders 2008).
A avaliação neuropsicológica evidencia alteração da memória verbal ou da memória
não-verbal nos pacientes com comprometimento de estruturas hipocampais no hemisfério
dominante ou não dominante, respectivamente. O teste do amital utilizado em casos pré-
operatórios para definição da lateralidade em relação à memória nos casos em que o lado
acometido é o hemisfério dominante. (Portuguez 1998) (Paglioli et al. 2006)
A avaliação eletroencefalográfica interictal dos pacientes com ELT costuma evidenciar
paroxismos epileptiformes do tipo pontas (descargas epileptiformes) envolvendo a região
ântero-mesial do lobo temporal, com repercussão nos eletrodos Fp1-F7 e Fp2-F8 na montagem
bipolar longitudinal segundo o sistema 10-20 internacionalmente utilizado na
eletroencefalografia. A evidência de um predomínio de descargas em um dos lobos temporais,
mais do que 70% , é aceita para identificação da lateralidade provável. Além destas descargas
epileptiformes, comumente há atividade lenta associada, representada por TIRDA (Atividade
Delta Rítmica Intermitente Temporal) ou TIRTA (Atividade Theta Rítmica Intermitente
Temporal) no lado correspondente ao início das crises(Lüders 2008).
A avaliação eletroencefalográfica ictal é obtida através da avaliação de vídeo-
monitorização eletroencefalográfica prolongada. Neste procedimento, o paciente é mantido
conectado ao aparelho de eletroencefalografia, com registro simultâneo de vídeo. Esta parte da
investigação pode durar em torno de 24-72hs ou até mais tempo, dependendo da obtenção ou
não de eventos ictais (crises). O objetivo é o registro de crises típicas do paciente. O estudo
detalhado da semiologia da crise (fornecido pelas imagens do vídeo) e do traçado
eletroencefalográfico simultâneo, permite, na maioria dos casos, identificar a zona de início
ictal.
Os estudos de RM utilizam os seguintes parâmetros para a interpretação da EMT: 1)
atrofia do lobo temporal anterior; 2) assimetria dos cornos temporais; 3) atrofia hipocampal e 4)
alteração de sinal do hipocampo nas seqüências Flair e T2. A atrofia hipocampal e as alterações
de sinal são os indicadores mais confiáveis de esclerose hipocampal (Kuzniecky 1987; Berkovic
1991; Jackson 1995). A volumetria hipocampal obtida através da RM correlaciona-se com
15
intensidade da esclerose hipocampal vista à análise patológica (Watson et al 1995), permitindo
assim prever a gravidade da esclerose hipocampal através da RM (Watson and Cendes 1995).
Os achados clínicos, neuropsicológicos, eletroencefalográficos e de neuroimagem
permitem realizar um diagnóstico preciso de ELT (Portuguez 1998; De Paola 2001; Palmini
2001; Paglioli et al. 2006). Em resumo:
História clínica de crises têmporo–límbicas recorrentes
Evidências de comprometimento da memória verbal ou não-verbal
EEG interictal com mais 70% das descargas em um dos lobos temporais e ou atividade
lenta temporal
RM crânio com alteração de sinal do hipocampo e redução volumétrica do mesmo.
1.2 Por que pesquisar novas terapêuticas?
Pesquisas realizadas nas últimas décadas trouxeram muitos avanços no desenvolvimento de
fármacos antiepilépticos (FAEs). No entanto um número significativo de pacientes não obtém
resposta com a terapêutica medicamentosa, e, além disso, tais medicações não previnem o
desenvolvimento e progressão da doença.
Sabe-se que a deterioração da memória e das habilidades cognitivas ocorre nas epilepsias
crônicas, particularmente em pacientes com epilepsia do lobo temporal, e é principalmente
relacionada à idade e à duração da patologia. (Helmstaedter e Kurthen 2001; Helmstaedter,
Kurthen et al. 2003). Também é importante salientar o alto risco de morte súbita nesses
pacientes com epilepsia refratária ao uso de fármacos antiepilépticos (Walczak et al. 2001;
Almeida et al 2010) Face a essas considerações, torna-se imprescindível a tentativa de cura ou
de, pelo menos melhora na qualidade de vida desses pacientes.
A ressecção cirúrgica focal de áreas cerebrais epileptogênicas é considerada a única
terapêutica curativa disponível para pacientes com epilepsia. No entanto, é restrita a pacientes
com epilepsia refratária ao tratamento medicamentoso, e muitos deles ainda necessitam manter
o uso dessas medicações após a cirurgia. Há também muitas formas de epilepsia refratária que
não são passíveis de tratamento cirúrgico. Ademais, a cirurgia de epilepsia implica em custo
financeiro elevado e, em algumas situações, riscos que devem ser considerados. O risco de
16
ocorrerem complicações neurológicas pós-cirúrgicas varia entre 0-25% e a mortalidade de 0-3%
(De Paola 2001). Dessa forma, a busca de estratégias terapêuticas menos invasivas e que
possam possibilitar o tratamento da epilepsia a um maior número de pacientes é plenamente
justificada.
1.3 Células Tronco
Durante a embriogênese, um único oócito fertilizado dá origem a um organismo
multicelular cujas células e tecidos adotam características ou têm destinos diferentes para dar a
cada órgão do corpo estrutura e funções específicas. À medida que o embrião se desenvolve, as
células vão proliferando, permitindo que os tecidos e órgãos cresçam. No entanto, mesmo
quando um animal já está completamente desenvolvido, muitos tecidos e células mantêm a
homeostase, onde células que morrem, seja por morte natural ou lesão, precisam ser
substituídas. Esta característica notável tem origem filogenética muito antiga, e mesmo que
pareça que durante a evolução os mamíferos perderam uma parte desta plasticidade, seu fígado,
por exemplo, pode regenerar-se parcialmente (se a lesão não for muito grave). Outros exemplos
são a epiderme e o sistema hematopoiético. A incrível capacidade que certos tecidos têm de
regenerar-se durante a vida ou a capacidade de um embrião de diversifica-se é resultado direto
de plasticidade das células tronco (Fuchs e Segre 2000).
As células tronco representam uma unidade natural do desenvolvimento embrionário e
da reparação tecidual e constituem um subconjunto de células imaturas, que têm como
característica serem indiferenciadas e não-especializadas. Assim, estas células apresentam a
capacidade tanto de se auto-regenerar, ou seja, dividir-se e criar outras células tronco, quanto de
se diferenciar em linhagens celulares específicas (Morrison et al. 1997).
As células tronco podem ser classificadas segundo a sua potencialidade de diferenciação.
São chamadas de totipotentes as células capazes de gerar todos os tipos celulares embrionários e
extra-embrionários, como o zigoto; podem originar todas as células que formam o embrião
(propriamente dito) e são provavelmente da camada interna do blastocisto (5º ao 7º dia de vida).
As células tronco adultas ou somáticas (pós-natal) são mulipotentes capazes de gerar tipos
celulares que compõem tecidos e órgãos específicos de seu local de origem, mas também
17
pluripotentes, ou seja, com capacidade de gerar células de outros órgãos e tecidos. São
pluripotentes, mas com habilidade de diferenciação mais restrita (Krause et al. 2001)
As células tronco adultas são denominadas somáticas por encontrarem-se na intimidade
dos tecidos corporais (soma). Acreditava-se que estas células teriam opções mais restritas de
diferenciação, podendo selecionar um programa de diferenciação dentre apenas poucas vias
possíveis, ou seja, já comprometidas com determinada linhagem celular, não seriam pluripotentes
a exemplo das embrionárias. Atualmente discute-se até que ponto isso é verdade, já que
evidências apontam que estas células poderiam sim ignorar as restrições de sua linhagem
específica, transdiferenciando-se em células com origem germinativa distinta. Estudos com
células isoladas a partir do encéfalo de camundongos transgênicos mostraram diferenciação
celular em células hematopoiéticas (Bjornson et al. 1999). Da mesma forma a diferenciação de
células neurais a partir de células hematopoiéticas também já foi demonstrada (Mezey et al.
2000).
1.3.1 Células Tronco de Medula Óssea
A medula óssea (MO) é uma fonte permanente de células tronco pluripotentes, que
podem originar não somente linhagens celulares hematógenas e mesenquimais (osso,
cartilagem, adipócitos), mas também células de vasos sangüíneos (musculares lisas e
endoteliais), (Korbling e Estrov 2003) e linhagens embriologicamente mais distantes tais como
hepatócitos e células do sistema nervoso (Mezey et al. 2003; Silani e Corbo 2004; Mezey 2005).
Uma das populações de células da medula óssea, as células tronco hematopoiéticas, é
responsável pela formação de todos os tipos de células sanguíneas do corpo. A população de
células estromais da medulam óssea pode gerar osso e cartilagem(Petersen et al. 1999; Korbling
e Estrov 2003). Essa população que se diferencia em células endoteliais foi identificada como
sendo originária da medula óssea (Shii et al. 1998).
Muito se discute a respeito da plasticidade de células tronco adultas, incluindo as células
tronco da medula óssea. Já foi demonstrado, por exemplo, que células da medula óssea de
18
camundongos podem originar microglia (Eglitis et al. 1999) e neurônios in vivo (Brazelton et al.
2000; Mezey, Chandross et al. 2000). Porém, ainda não se sabe quais subpopulações da medula
são capazes de expressar este desenvolvimento neuronal. Além disso, a transdiferenciação de
células da medula óssea em neurônios no sistema nervoso central foi também demonstrada em
humanos (Cogle et al. 2004). Parece que a incorporação destas células no tecido nervoso é
intensificada frente a um dano tecidual, Ainda, mesmo que estas células não regenerem o tecido
lesado por transdiferenciação em determinado tipo celular é provável que a recuperação ou
estabilização da doença neurológica ocorra por outros mecanismos biológicos tais como a fusão
celular, a liberação de fatores tróficos, citocinas ou ativação de células endógenas (Terada et al.
2002)
. Em um estudo em mulheres que haviam recebido transplantes de indivíduos do sexo
masculino para tratar suas doenças hematológicas percebeu-se que células da medula óssea
podem penetrar no sistema nervoso e se diferenciar em neurônios(Goh et al. 2003; Mezey 2005)
Em uma série de estudos animais, pesquisadores de diferentes grupos mostraram que células de
MO injetadas na corrente sangüínea melhoraram significativamente a resposta comportamental
de animais submetidos à isquemia cerebral focal. Estas células migram da corrente sangüínea
para a área isquêmica e uma percentagem pequena delas expressaram marcadores neurais(Azizi
et al. 1998; Eglitis et al. 1999) (Silani e Corbo 2004) (Chen et al. 2001; Li, Chen et al. 2001).
Células tronco adultas podem ser convertidas em neurônios e/ou células gliais in vivo (Silani e
Corbo 2004) (Kopen et al. 1999; Brazelton et al. 2000) (Mezey et al. 2000; Li, Chen et al.
2002; Mezey et al. 2003; Butovsky et al. 2006)
A expressão de marcadores neuronais e/ou gliais em células derivadas da medula óssea
já foi amplamente demonstrada Na quadro 2 abaixo relacionamos a espécie animal estudada, o
tipo celular obtido e a referência dos estudos realizados.
19
Quadro 1- Efeitos obtidos em modelos animais de doenças neurológicas
Espécie
Tipo Celular ou
efeito obtido
Referências
Camundongo/Niemann-Pick
Purkinje
Jin et al, 2002(Jin, Carter
et al. 2002)
Camundongo/Desmielinização
Remielinização
Akiyama et al., 2002
(Akiyama, Radtke et al.
2002)
Camundongo/MPS VII
Melhora Clínica
Sakurai et al, 2004
(Sakurai, Iizuka et al.
2004)
Camundongo/ALS
Neurônios e Glia
Corti et al, 2004(Corti,
Locatelli et al. 2004)
(Corti S 2004)
Ratos/lesão
Neurônio e Glia
Lu et al, 2001 (Lu,
Mahmood et al. 2001)
Mahmood et al, 2004
(Mahmood, Lu et al.
2004)
Ratos/AVC
Glia
Li et al, 2002 (Li, Chen et
al. 2002)
Ratos/AVC
Neurônio e Glia
Zhao et al, 2002 (Zhao,
Duan et al. 2002)
Ratos/Parkinson
Glia
Dezawa et al, 2004
(Dezawa, Kanno et al.
2004)
20
Quadro 2 - Tipos celulares obtidos em diferentes espécies animais
Espécie
Tipo Celular
Referências
Camundongo
Microglia
Eglitis & Mezey, 1997(Eglitis, Dawson et al.
1999);Kennedy & Abkowitz, 1997(Kennedy and
Abkowitz 1997)
Camundongo
Neurônios e Glia
Kopen et al, 1999(Kopen, Prockop et al. 1999) ;Corti et
al, 2002 (Corti, Locatelli et al. 2004)
Camundongo
Neurônios
Mezey et al. 2000(Mezey, Chandross et al. 2000)
Camundongo
Neurônios e
Microglia
Brazelton et al., 2000 (Brazelton, Rossi et al. 2000)
Camundongo
Purkinje e Células.
Gliais
Priller et al, 2001 (Priller, Persons et al. 2001)
Camundongo
Glia
Nakano et al, 2001 (Nakano, Yanagita et al. 2001)
Camundongo
Oligodendrócitos
Bonilla et al, 2002 (Bonilla, Alarcon et al. 2002)
Camundongo
Purkinje
Weimann et al, 2003(Weimann, Charlton et al. 2003),
Alvarez-Dolando et al, 2003(Alvarez-Dolado, Pardal et
al. 2003)
Humanos
Neurônios
Mezey et al, 2003(Mezey, Key et al. 2003)
Em humanos o transplante autólogo de células tronco de medula óssea já se mostrou bem
sucedido no tratamento de cardiopatias. O procedimento foi efetivo na regeneração do músculo
cardíaco humano e na revascularização da área infartada e mostrou-se seguro(Perin, Dohmann
et al. 2003; Vilas-Boas, Feitosa et al. 2006)
Em doenças neurológicas a maior experiência é em acidente vascular cerebral (AVC).
Primeiro estudo clínico com terapia celular em humanos com AVC incluiu 12 pacientes tratados
com implante de neurônios derivados de um teratocarcinoma (Bjorklund e Lindvall 2000).Os
estudos já realizados em pacientes com AVC e conduzidos por nosso grupo evidenciaram a
segurança do procedimento (Araújo 2008)
21
1.3.4 Terapia Celular em Epilepsia
Os modelos experimentais de ELT utilizam o processo de kindling das estruturas
límbicas (como amídala e hipocampo) ou indução de status epilepticus induzido por lítio-
pilocarpina (ou outras substâncias como ácido kaínico), baseado nesses experimentos formulou-
se o conceito de que um dano neuronal inicial desencadeia uma cascata de eventos
neurobiológicos que levam à ocorrência de crises espontâneas. (Morimoto et al. 2004)
Ao longo
dos anos esses experimentos também auxiliaram na quebra do conceito de que células neuronais
adultas não poderiam se regenerar.
Até bem pouco tempo, a ciência desconhecia a capacidade regenerativa do cérebro.
Sabe-se hoje que, a despeito do que se acreditou por décadas, novos neurônios podem sim ser
integrados a determinadas regiões do encéfalo adulto a partir de células progenitoras neurais ou
células-tronco adultas neurais, em um processo chamado neurogênese (Gross 2000).
Na maioria
dos mamíferos, a neurogênese ocorre ao longo de toda a vida na zona subventricular do
ventrículo lateral e na zona subgranular do giro denteado no hipocampo(Ming e Song 2005).
A neurogênese induzida por crises epiléticas e também por outros insultos como
isquemia cerebral já foi amplamente demonstrada (Parent 1997;Parent 2003). O conceito de
neurogênese no cérebro adulto, hoje já amplamente conhecido, principalmente a que ocorre na
zona subventricular e na zona subgranular do giro denteado, motivou o desenvolvimento de
técnicas que aproveitassem esse mecanismo na tentativa de obtenção de efeitos
antiepileptogênicos e reparadores (Fisher et al 1998). Estudos já demonstraram que a terapia
celular em modelos experimentais de epilepsia aguda e crônica resulta em efeitos
anticonvulsivantes, talvez antiepileptogênicos e neuroprotetores/neuroreparadores. (Loscher,
Ebert et al. 1998) (Costa-Ferro 2010). A maior parte dos estudos em vigência hoje, e que
buscam tal finalidade, trabalha o uso de transplante de células progenitoras neurais ou de células
fetais em modelos experimentais (Shetty and Hattiangady 2007; Loscher, Gernert et al. 2008).
Células tronco embrionárias, neurais, e de medula óssea são candidatas ideais para o transplante
terapêutico em diversas doenças neurológicas e também em epilepsia em estudos clínicos e
experimentais (Zhao et al. 2002; Cogle et al. 2004; Silani e Corbo 2004)(Costa-Ferro 2010). No
22
entanto a terapêutica com células tronco de medula óssea parece bastante interessante e
promissora.
Em doenças neurológicas a maior experiência é em acidente vascular cerebral (AVC).
Primeiro estudo clínico com terapia celular em humanos com AVC incluiu 12 pacientes tratados
com implante de neurônios derivados de um teratocarcinoma (Bjorklund and Lindvall 2000). Os
estudos já realizados em pacientes com AVC e conduzidos por nosso grupo evidenciaram a
segurança do procedimento (Araújo 2008).
1.3.4.1 Células tronco e Epilepsia: Estudos pré-clínicos
Os efeitos do transplante celular foram investigados em uma série de modelos
experimentais de epilepsia como, por exemplo, em ratos geneticamente epilépticos (genetically
epilepsy-prone), hipocampo subcorticalmente denervado e administração de ácido caínico ou
pilocarpina (Eglitis, Dawson et al. 1999) A supressão das crises foi demonstrada em vários
destes modelos. A maioria destes estudos foram realizados utilizando o modelo do kindling em
ratos, que se assemelha ao tipo mais comum de epilepsia em indivíduos adultos (epilepsia do
lobo temporal, crises parciais complexas). Lesões neuronais por neurotoxinas em vias
noradrenérgicas, serotoninérgicas ou colinérgicas são utilizadas para facilitar o desenvolvimento
do kindling. (Nestes animais, o transplante de neurônios embrionários noradrenérgicos,
serotoninérgicos ou colinérgicos é eficiente em restaurar o desenvolvimento de crises induzidas
pelo kindling Clough, Statnick e Maring-Smith 1996). Este efeito antiepileptogênico se
correlaciona bem com a extensão da inervação noradrenérgica ou colinérgica derivada do
enxerto e estabelecida na estrutura cerebral onde é aplicado o estímulo elétrico para a indução
do kindling. Transplante de neurônios gabaérgicos estriatais fetais determinam efeito
anticonvulsivante com supressão da propagação e generalização das crises em animais pós-
kindling (Kokaia, Cenci et al. 1994; Loscher, Ebert et al. 1998) vide tabela. Células tronco
quando transplantadas no cérebro, podem migrar para o tecido lesado recuperando a função
neurológica(Azizi, Stokes et al. 1998; Akiyama, Radtke et al. 2002; Lee, Kuroda et al. 2003).
23
Alguns estudos utilizando células tronco humanas transplantadas para o cérebro de ratos com
epilepsia induzida pelo modelo da pilocarpina mostraram redução no número de crises
epilépticas(Chu, Kim et al. 2004). O benefício desta terapêutica no que diz respeito à redução de
crises epilépticas e recuperação da estrutura hipocampal na epilepsia temporal já foi
demonstrado no modelo experimental do lítio-pilocarpina (Costa 2006; Venturini 2008) (Costa-
Ferro 2010),porém sua utilização até então não havia sido testada em humanos.
Evidências experimentais no modelo de crises induzidas por eletro choque evidenciam
aumento da neurogênese angiogênese hipocampal, sugerindo um mecanismo de reparo(Hellsten,
West et al. 2005) (Madsen, Treschow et al. 2000). A possibilidade de “auxiliarmos” este
mecanismo fisiológico quando este falha nas epilepsias refratárias poderia ser a base do
tratamento com CT de medula óssea.
Quadro 3- Modelos de Epilepsia efeito do transplante de células tronco
Modelo de
Epilepsia
Tipo de transplante
Resultados
Correlação Clínica
Kindling em
ratos depletados
de serotonina ou
acetilcolina
Neurônios embrionários
no hipocampo
(noradrenalina ou
acetilcolina) ou bulbo
olfatório (serotonina)
Retardo no
desenvolvimento das
crises relacionado com
a extensão do enxerto
Efeito
antiepileptogênico
Kindling em
ratos epilépticos
Neurônios gabaérgicos
embrionários estriatais
Redução da
propagação e
generalização das
crises
Efeito
anticonvulsivante
Pilocarpina em
ratos
CT fetais humanas
Efeito
anticonvulsivante
Lítio-
Pilocarpina em
ratos
Xenotransplante Fração
mononuclear de medula
óssea, pós-status
epilepticus
Não desenvolveram
epilepsia
Efeito
antiepileptogênico
(Costa et al, 2006)
(Costa 2006)
Lítio-
Pilocarpina em
ratos
Xenotransplante Fração
mononuclear de medula
óssea, pós crises
epilépticas crônico-
recidivantes
Redução em 50% na
freqüência de crises
epilépticas
Efeito
anticonvulsivante
(Costa et al, 2006;
Venturini 2008;
Costa-Ferro 2010)
24
25
2 Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a factibilidade e segurança do procedimento proposto (transplante autólogo de
células tronco da medula óssea em pacientes com epilepsia).
2.2 Objetivos Específicos
1- Avaliar a factibilidade do procedimento de obtenção e transplante de CTMMO;
2-Verificar a ocorrência de possíveis intercorrências clínicas durante o procedimento e
durante o período de seguimento;
3- Quantificar a freqüência de crises epilépticas após 3 e 6 meses do procedimento e
comparar com o período anterior;
4- Identificar possíveis modificações no padrão do Eletroencefalograma interictal durante a
infusão de CTMMO e após 3 e 6 meses do procedimento;
5- Avaliar pelo exame de Ressonância Magnética de Encéfalo as estruturas mesiais
temporais e o volume do hipocampo antes do procedimento e 6 meses após.
26
3 Material e Métodos
3.1 Delineamento
O delineamento utilizado foi o de um estudo clínico prospectivo auto-controlado de casos
selecionados a partir de uma população de pacientes portadores de epilepsia que se
apresentaram como candidatos ao estudo. O fator em estudo foi o transplante autólogo de
células tronco mononucleares de medula óssea para tratamento de epilepsia. O desfecho foi o
surgimento ou não de intercorrências durante o procedimento e no período de seguimento.
3.2 Variáveis
As variáveis clínicas analisadas foram as seguintes: sexo, idade, tempo de evolução da
doença, freqüência de crises epilépticas e intercorrências durante o procedimento e seguimento,
padrão do EEG, volumetria hipocampal.
3.3 Pacientes
A partir de uma população de120 pacientes com epilepsia, encaminhados diretamente
por outros colegas ou avaliados após anúncio pela imprensa, selecionamos 12 pacientes,
27
excluímos 3 durante a fase pré – procedimentos e nove foram então submetidos ao protocolo
completo. Os nove indivíduos selecionados (quatro homens e 05 mulheres) fechavam critérios
diagnósticos de ELT com EH unilateral refratários ao tratamento medicamentoso (segundo os
critérios da ILAE: permanência de crises epilépticas em pacientes usando pelo menos dois FAEs
em dose plena há pelo menos 01 ano). Cada paciente devia preencher os critérios de
lateralização da doença: foco epiléptico e maior grau de atrofia hipocampal do mesmo lado, não
devendo ocorrer divergências quanto à lateralidade.
Critérios de Inclusão:
1- Idade acima de 18 anos.
2- Refratária ao tratamento medicamentoso.
3- Exame de neuroimagem (RM) com sinais de esclerose hipocampal (EH).
4- Assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido.
Critérios de Exclusão:
1- Impossibilidade de obter acesso vascular para procedimento percutâneo;
2- Neoplasias Malignas;
3- Doenças auto-imunes;
4- Outras doenças neurodegenerativas;
5- Insuficiência cardíaca aguda ou descompensada;
6- Doenças hematológicas primárias;
7- Osteopatias que traduzam aumento de risco à punção medular;
8- Coagulopatias;
9- Insuficiência hepática;
10- Insuficiência renal moderada (creatinina acima de 2 mg/dl);
11- Gravidez;
12- Participação em outro ensaio clínico.
3.4 Exames complementares
Todos os pacientes foram submetidos aos seguintes exames pré-procedimento:
1-Eletrocardiograma
28
2- Coleta de sangue para dosagem de: glicose, sódio, potássio, creatinina, hemograma,
plaquetometria, TGO, TGP, TP e KTTP.
3-Vídeo- EEG durante 24-72hs e EEG de 30minutos
Os eletroencefalogramas foram realizados em um aparelho EMSA BNT de 36 canais
utilizando montagens segundo o sistema internacional 10-20 tanto registro de crises epilépticas
(monitorizadas também por vídeo) quanto para a análise do padrão eletroencefalográfico
interictal (na internação e nos controles de 3 e 6 meses). A análise permitiu a localização do
foco epilético (temporal esquerdo ou direito). Foram selecionadas amostras de 5 minutos de
EEG em vigília tanto da monitorização por Vídeo EEG, quanto dos EEGs de controle. Dessas
amostras foram selecionados períodos aleatórios de registro em vigília para cada paciente nos
quais quantificou-se a quantidade de segundos em que aparecem ondas theta (Densidade de
Theta) e a quantidade de ondas agudas e pontas (Densidade de Pontas)
4-Ressonância Magnética do cérebro com estudo hipocampal
4.1 Seqüências de aquisição
Todos os pacientes foram examinados em um aparelho Siemens Magnéton
Vision Plus de 1,5 T com bobinas de gradiente de 25mT/m (amplitude máxima de
gradiente). As seqüências utilizadas, bem como os valores de referência para os volumes
hipocampais foram determinadas por um protocolo previamente utilizado no serviço
(Paglioli et al. 2004). (Hoefel Filho 2009). O volume hipocampal foi calculado com o
auxílio do software Image Pro Plus, versão 4.5.1.
1. Aquisição T1: Obtida com aquisição volumétrica no plano sagital com
uma seqüência Echo Gradiente 3D com 160 partições e espessura de
corte de 0,9mm. Estes parâmetros permitiram um voxel isotrópico.
2. Aquisição T2: Realizada nos planos axiais e coronais com espessura de
corte de 5 mm e espaçamento de 3,5. As aquisições foram feitas com e
sem supressão de gordura para identificação de alterações de sinal nas
estruturas encefálicas e aumento de sinal nos hipocampos
3. Aquisição Flair: Seqüência desenvolvida a partir o T2 com supressão
do sinal da água. Realizada com espessura de corte 5 mm e
espaçamento de 1,5. Nessa aquisição as alterações de sinal são
29
consideradas como decorrentes à lesão atual ou à seqüela de lesão
(gliose). Obtida nos planos axial com a mesma orientação do T2.
4. Aquisição IR ou Inversion Recovery ponderada em T1: Realizada com
espessura de corte 3mm e espaçamento de 0,9 mm. Avalia forma e
espessura da camada cortical e a interdigitação da substância branca.
Utilizada também para avaliação volumétrica quantitativa do
hipocampo através do pós processamento dos dados.
5. Aquisição STIR ou Supression T2 Inversion Recovery: Espessura de
corte de 3 mm de espaçamento 0,9mm. Obtida no plano coronal desde o
pólo temporal até a cruz dos fórnices. Identifica a alteração de sinal T2
dos hipocampos e estruturas para-hipocampais.
3.5 Coleta de Medula Óssea
As células-tronco foram coletadas diretamente por punção única da crista ilíaca
posterior, sob anestesia local, após antissepsia. O material foi coletado através de repetidas
aspirações através do redirecionamento/reposicionamento da agulha própria para coleta de
medula óssea em outras angulações, não sendo de forma alguma necessárias outras incisões de
pele e punções do osso do quadril. Foram utilizadas 10 seringas (contendo 0,5 ml de heparina
cada a fim de evitar a coagulação das amostras) de 20 ml para a coleta de um volume total
almejado de pelo menos 50 ml.
3.6 Processamento das Células Mononucleares
As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade com Ficoll-
Paque. A meta mínima foi a coleta de ao menos 4x 10
7
células mononucleares.
As células foram lavadas com soro fisiológico heparinizado contendo 5% de albumina
humana e passadas em filtro de nylon de 100 µm . As células são finalmente ressuspensas em
30
soro fisiológico 0,9% com 5% de albumina para infusão em uma solução final contendo cerca
de 5 ml. Cerca de 500µl da solução foram separados citometria de fluxo (técnica utilizada para
contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo)
imunofenotipagem ( processo de classificação de células do sistema imune – linfócitos T- em
subgrupos baseados em antígenos CD) As células em questão são as seguintes: CD 34 que
são células precursoras hematopoiéticas, células do endotélio vascular; CD 45 que são células
hematopoiéticas; CD 105 que são células endoteliais da medula óssea; CD 117 que são células
progenitoras hematopoiéticas Outros 500 µl foram separados para congelamento em
nitrogênio líquido, visando eventual necessidade de nova fenotipagem ou reavaliação de
viabilidade celular.
3.7 Transplante de Células Tronco de Medula Óssea via Cateterismo Seletivo da Artéria
Cerebral Posterior
Entre 1,51 e 5,59 x 10
8
células foram injetadas na artéria cerebral posterior, no mesmo
dia do isolamento das células, através de cateter, após arteriografia, utilizando técnica
semelhante à utilizada para realização do amital sódico (Teste de Wada) e habitualmente
realizada no nosso Serviço (Paglioli, et al. 2004). Inicialmente foi realizada uma arteriografia
dos 4 principais vasos cerebrais via punção femoral, utilizando um cateter 5F. Posteriormente,
foi escolhida a artéria vertebral menos tortuosa e mais calibrosa para a colocação de um
cateter guia 6F e a seguir foi introduzido um microcateter tipo Tracker 18. Com o paciente sob
heparinização de pelo menos 5000 UI o cateter foi conduzido com a ajuda de um fio guia até a
porção peduncular da artéria cerebral posterior do lado a ser injetado. Esta porção arterial é a
principal responsável pela vascularização das estruturas mesiais temporais (Raupp 1998)
O volume de infusão foi de aproximadamente 30 mililitros em infusão contínua durante
30 minutos. A solução consiste de células dissolvidas em plasma. Durante a infusão de
CTMMO os pacientes foram monitorizados clinicamente e com eletroencefalograma durante
todo o procedimento, para observação imediata de possíveis efeitos adversos.
31
3.8 Sequência do Protocolo de Pesquisa
Seleção de pacientes segundo os critérios mencionados anteriormente: utilizando o diário de
crises dos pacientes (os quais já traziam consigo agendas, cadernos ou folhas avulsas contendo a
a marcação dos dias em que apresentavam crises) como parâmetro para definir a freqüência de
crises ( no seguimento foi utilizada também a classificação de crises de Engel (Engel 1993)),
RM prévias ao estudo para análise visual das estruturas visuais temporais (o estudo volumétrico
do hipocampo é realizado somente após a internação ) , história clínica e exame neurológico
Internação dos pacientes durante um período de 7 dias seguindo o seguinte protocolo:
1ºdia: assinatura do termo de consentimento informado, internação, Ressonância
Magnética, realização de exames laboratoriais, avaliação neurológica e neuropsicológica
(dados que serão apresentados em outro trabalho de pós-graduação), eletrocardiograma,
retirada das medicações anticonvulsivantes, início da monitorização videoeletrencefalográfica.
2ºdia: vídeo EEG
3ºdia: vídeo EEG
4º dia: reintrodução das drogas anticonvulsivantes;
5º dia: coleta de medula óssea, processamento das células mononucleares de
medula, transplante de células tronco por arteriografia, monitorização por vídeo EEG.
O transplante é realizado no lado onde se observou menor volume hipocamapal,
predomínio de atividade epileptogênica interictal e início ictal registrados pelo vídeo
EEG
6º dia: termino da monitorização por vídeo EEG,
7º dia: alta hospitala mantendo FAEs em dose plena
3º mês: reavaliação neurológica e neuropsicológica, avaliação dos diários de
crises, EEG de 30 minutos; manutenção dos FAEs
6º mês: reavaliação neurológica e neuropsicológica, EEG de 30 minutos,
avaliação dos diários de crises, realização de RM
.
32
3.9Considerações Éticas
Esse estudo integra o projeto “Transplante Autólogo de Células-Tronco da Medula
Óssea em Pacientes com Epilepsia” foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da PUCRS
(CEP) em 12 de junho de 2007 (Ofício 0931/07) e pelo Comitê Nacional de Ética em Pesquisa
(CONEP) (parecer nº947/2007, CAAE 0194.0.002.000-07) em 11 de dezembro de 2007.
Todos os pacientes que preencheram os critérios de inclusão, sem ter critérios que os
excluam de participar neste protocolo receberam informações sobre o estudo, esclarecendo
riscos e benefícios. Além de receberem informações verbais, eles receberam duas vias de Termo
de Consentimento Informado (TCI), onde devem consentir na participação do estudo. Uma das
vias do TCI permanece com o paciente e a outra com o investigador.
Este estudo foi totalmente financiado pelo FINEP – Projeto número 146 – UBEA –
PUCRS –CTEP Ref. 5244/06.
3.10 Análise Estatística
As variáveis foram analisadas com o auxílio do software SPSS 18.9 através de análise
tabular simples, e teste t..
33
4 Resultados
4.1 Perfil e Variáveis Demográficas
Após uma seleção entre 120 candidatos, selecionamos 12 pacientes. Três deles foram
excluídos do estudo por quebra de protocolo (Tabela 1). Foram estudados então 9 pacientes
sendo 5 deles mulheres e 4 homens (Tabela 2)
Tabela 1- Pacientes excluídos do estudo
Pacientes
Motivo de Exclusão no Estudo
10
Sem comprovação de atrofia hipocampal à volumetria
11
Crises originadas na região rolândica
12
Presença de Disgenesia Hipocampal
Tabela 2 - Perfil dos pacientes submetidos ao transplante autólogo de células tronco de
medula óssea
4.2 Intercorrências durante o procedimento de cateterismo e durante o seguimento
Paciente
Escolaridade
SEXO
Idade da
1ª Crise Convulsiva
Crise Febril
Na infância
Tempo de Evolução
Da Doença (em anos)
História
Familiar de
Epilepsia
1
3º grau
Feminino
35
Não
5
Não
2
3º grau
Feminino
43
Não
15
Sim
3
1ºgrau incompleto
Masculino
8
Não
6
Não
4
1ºgrau incompleto
Masculino
2
Não
40
Não
5
3º grau
Masculino
10
Não
30
Sim
6
1ºgrau incompleto
Feminino
18
Sim
30
Sim
7
2ºgrau
Feminino
19
Não
30
Não
8
1ºgrau incompleto
Masculino
1
Sim
26
Não
9
2ºgrau
Feminino
2
Não
37
Não
34
Quatro pacientes (pacientes 1, 2,6 e 8) referiram cefaléia leve no dia que sucedeu o
procedimento. A paciente 2 permaneceu com cefaléia moderada durante 45 dias após o
procedimento, sendo que já tinha histórico de migrânea crônica.
Nenhum paciente desenvolveu hematomas no local de punção da arteriografia, também
nenhum paciente queixou-se de dor no local de punção para coleta de medula óssea.
Durante o procedimento de arteriografia, todos os pacientes foram acompanhados pela
equipe de pesquisa e monitorizados por Video EEG. Nenhum paciente apresentou qualquer
intercorrência durante todo o procedimento. Nenhuma crise epiléptica foi registrada, bem como
alteração adicional no traçado de base eletroencefalográfico.
Um paciente (paciente 3) apresentou quadro de psicose pós-ictal durante a monitorização
por Video EEG rapidamente revertido com uso de clobazan 20 mg. Este paciente também
apresentava histórico de depressão (além das drogas antiepilépticas usava também fluoxetina.
Este paciente também passou por um período de luto devido ao falecimento do avô no 4º mês de
seguimento.
A paciente 6 por conta própria parou de usar as medicações antiepilépticas no segundo
mês de seguimento, reiniciando o uso regular após o 3º mês.
4.3 Volume de medula coletado e Fenotipagem
Foram coletados entre 55 e 80 ml de medula óssea com média de 66,6 ml , o que propiciou a
obtenção de 1,9 a 5, 59 x 10
8
com média de 3,53 x 10
8
células mononucleares, (Tabela 3)
35
Tabela 3- Volume de medula óssea coletado, número de células mononucleares obtidas
A fenotipagem das células tronco obtidas pode ser observada nos gráficos de dispersão
abaixo, os quais são organizados em quadrantes (inferior direito, inferior esquerdo, superior
direito e superior esquerdo) a fim de verificar possível predomínio de um subtipo celular
específico (CD 45/CD 105, CD 117/CD34). Nos gráficos a seguir observamos que em sua
maioria as células caem no quadrante inferior esquerdo, no qual não é possível especificar qual
grupo celular predominante
Gráficos de Dispersão das células tronco CD 117/CD 34 e CD 105/CD 45 à citometria de
fluxo e seus percentuais em cada quadrante
Paciente 1
Paciente
Volume
coletado(ml)
Número de células x 10
8
células (x 10
8
)
1
55
3,6
2
65
1,9
3
70
3,59
4
60
3,12
5
80
3,9
6
70
4,41
7
60
5,59
8
70
4,2
9
70
1,51
36
Paciente 2-
Paciente 3 –
Paciente 4 –
37
Paciente 5 –
Paciente 6
Paciente 7
38
Paciente 8 –
Paciente 9
39
4.4 Análise da Video monitorização Eletroencefalográfica
Foram registradas entre 2 a 6 crises, sendo que 6 pacientes têm a origem de suas crises
no lobo temporal esquerdo (Tabela 4).
Tabela 4- Análise do Registro de Crises Epiléticas
Paciente
CRISES REGISTRADAS
Início Ictal
1
2
Temporal anterior e médio esquerdo
2
2
Temporal anterior e médio esquerdo
3
2
Temporal anterior e médio esquerdo
4
6
Temporal anterior e médio esquerdo
5
2
Temporal anterior e médio esquerdo
6
2
Temporal anterior e médio esquerdo
7
2
Temporal anterior e médio direito
8
2
Temporal anterior e médio direito*
9
5
Temporal anterior e médio direito
A semiologia das crises observadas nos pacientes do estudo é exibida na tabela abaixo
(Tabela 5)
40
Tabela 5 – Semiologia Ictal dos Pacientes Submetidos ao Transplante de CTMMO
Paciente
Semiologia Ictal
1
Comprometimento de consciência, fixação do olhar, distonia de membro superior
direito
2
Sensação inespecífica, comprometimento de consciência, fixação do olhar
automatismos gestuais
3
Sensação Epigástrica, comprometimento de consciência, fixação do olhar,
automatismos oroalimentares
4
Sensação epigástrica, comprometimento de consciência, automatismos de membro
superior, distonia membro superior direito
5
Déja vu, comprometimento de consciência, automatismos gestuais
6
Comprometimento de consciência, fixação do olhar, distonia de membro superior
direito, automatismo de membro superior esquerdo
7
Comprometimento de consciência, automatismos oroalimentares, automatismos
gestuais (“esfregando” o tórax)
8
Sensação epigástrica, comprometimento de consciência, fixação do olhar, poucos
automatismos gestuais
9
Sensação indefinida, comprometimento de consciência, fixação do olhar,
automatismos oroalimentares e gestuais
Abaixo se encontram as amostras dos 10 primeiros segundos de crise epilética de cada
um dos pacientes ocorridas antes do procedimento de transplante de CTMMO.
41
Figura 1- EEG do paciente 1, montagem longitudinal temporal mostrando início ictal
(atividade recrutante) na região temporal anterior e médio esquerdo, presença de alguns
artefatos de moviumentação nos eletrodos T3 e T5
Figura 2 – EEG do paciente 2, montagem longitudinal para sagital e temporal obtido em
vigília, mostrando artefatos de movimento palpebral e início ictal temporal anterior e média
esquerda
42
Figura 3 – EEG do paciente 3 – montagem longitudinal temporal mostrando atividade theta
rítmica em amplitude crescente no região temporal esquerda
Figura 4 – EEG do paciente 4, montagem longitudinal temporal, observa-se atividade de pontas
de alta freqüência com início na região temporal anterior e média esquerda e propagação
contralateral
43
Figura 5 – EEG do paciente 5, montagem longitudinal temporal , mostrando atividade ictal
theta rítmica na região temporal anterior e média esquerda
Figura 6 – EEG do paciente 6, montagem longitudinal temporamostrando atividade theta
rítmica temporal esquerda l,
44
Figura 7 – EEG do paciente 7, montagem longitudinal temporal, mostrando dessincronização
temporal anterior e média direita e atividade rápida na freqüência beta.
Figura 8 – EEG do paciente 8, montagem longitudinal temporal, mostrando
atividade theta rítmica temporal direita.
45
Figura 9 – EEG do paciente 9, montagem longitudinal temporal.,mostrando atividade de pontas
sobrepostas à atividade theta rítmica máxima na região temporal anterior e média direita.
4.5 Análise do EEG durante o seguimento
Tanto a média de tempo em ritmo theta como a quantidade de pontas apresentaram
diminuição no decorrer do seguimento. Essa diminuição foi estatisticamente significativa entre
o pré-procedimento e 3º mês e entre pré-procedimento e 6º mês.(tabela 6).
46
Tabela 6 – Densidade de Ritmo Theta e de Pontas
Pré-Procedimento
3º mês
6º mês
Densidade de Ritmo Theta (média de segundos)
13,3
0,44*
2,67**
Densidade de Pontas (média)
26,1
1,11’
“2,67”
*p=0,001, **p=0,024, ‘p=0,002, “p=0,003, teste t de Student
4.6 Avaliação por neuroimagem do hipocampo
A análise visual das imagens por ressonância magnética não mostraram outras alterações
(tanto morfológicas como em intensidade de sinal) senão a redução volumétrica hipocampal e
hipersinal hipocampal em T2.
As imagens na seqüência STIR utilizadas para a volumetria hipocampal (pré e pós
procedimento) são demonstradas a seguir (utilizamos como base os valores de referência de 2,83
±0,28 cm
3
para o hipocampo direito e 2,89 ±0,33 cm
3
para o hipocampo esquerdo).
Figura 10 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 1
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,06 cm³; Esquerdo = 1,15 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 1,68 cm³; Esquerdo = 1,01 cm³)
47
Figura 11 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 2
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,69 cm³; Esquerdo = 2,46 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,23 cm³; Esquerdo = 2,44 cm³)
Figura 12 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 3
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,71 cm³; Esquerdo = 2,56 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,92 cm³; Esquerdo = 2,26 cm³)
48
Figura 13 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 4
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 3,17 cm³; Esquerdo = 1,86 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 3,08 cm³; Esquerdo = 1,73 cm³)
Figura 14 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 5
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 3,11 cm³; Esquerdo = 2,01 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,87 cm³; Esquerdo = 1,85 cm³)
49
Figura 15 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 6
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 3,49 cm³; Esquerdo = 2,42 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 3,26 cm³; Esquerdo = 2,07 cm³)
Figura 15 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 7
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 1,76 cm³; Esquerdo = 2,32 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 1,55 cm³; Esquerdo = 2,21 cm³)
50
Figura 16 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 8
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,19 cm³; Esquerdo = 2,79 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 2,29 cm³; Esquerdo = 2,88 cm³)
Figura 17 - Valores de volumetria hipocampal do Paciente 9
A) Pré-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 1,35 cm³; Esquerdo = 1,52 cm³)
B) Pós-transplante (Volumes do Hipocampo: Direito = 1,63 cm³; Esquerdo = 1,79 cm³)
51
A comparação das volumetrias hipocampais pré-procedimento e após seis meses de
procedimento não mostrou alteração significativa tanto nos hipocampos que foram infundidos com
células tronco (p=0,25) como os hipocampos contralaterais (p=0,18).
4.7 Análise das crises convulsivas durante o seguimento
Os pacientes apresentavam em média 14,67 ± 5,9 crises no período pré-procedimento e
2,25 ± 0,83 no período de seguimento até 6º mês, (p=0,55). Os pacientes 1,2, 6,7,8 e 9 foram os
que apresentaram modificação na freqüência e padrão de crises. Aqueles que ainda
apresentavam algumas crises no final do seguimento referiram espontaneamente que tinham
uma percepção quanto à incapacidade e intensidade das crises mais leve e que sentiam-se
melhor após as crises do que previamente ao procedimento. O comportamento individualizado
mês a mês de cada paciente pode ser observado no gráfico 1.
Gráfico 1- Evolução mensal de crises convulsivas
52
Analisando o percentual de redução de crises observamos em média 67%, variando de 0
a 100%. (Tabela 6) No seguimento de 6 meses 7 paciente foram incluídos na classe I, 3
pacientes ficaram completamente livres de crises desde o procedimento (classe IA, pacientes 1,2
e 7), 4 pacientes foram incluídos na classe IB (pacientes 5,6, 8 e 9).
Tabela 6 – Percentual de redução de crises epilépticas em cada paciente
Paciente
Nº de Crises Mensais
no Pré-procedimento
Nº de Crises com 3
meses (percentual de
redução)
Nº de Crises com 6
meses (percentual de
redução)
Classificação
de Engel
1
12
0 (100%)
0 (100%)
IA
2
6
0 (100%)
0 (100%)
IA
3
4
8 (0)
0 (0)
*
4
5
3(40%)
3 (40%)
II
5
3
0 (100%)
2 (33%)
IB
6
10
8 (20%)
5 (50%)
IB
7
12
0 (100%)
0 (100%)
IA
8
20
2 (90%)**
0 (100%)
IB
9
60
6 (90%)**
10 (80%)
IB
*não classificado em função do padrão variável de frequencia de crises
53
5 Discussão
Desde a demonstração da capacidade das células da medula óssea diferenciarem-se em
células neurais(Mezey et al. 2000) e gliais (Mezey et al. 2000; Sanchez-Ramos et al. 2000;
Woodbury et al. 2000; Bossolasco et al. 2005) in vitro e in vivo(Akiyama et al. 2002; Mahmood
et al. 2004), as pesquisas subseqüentes na última década levaram ao desenvolvimento de
terapias autólogas em humanos tendo a medula como fonte de células tronco (Mimeault e Batra
2006). Este é o primeiro estudo, que temos conhecimento, a avaliar o transplante autólogo de
células tronco mononucleares de medula óssea em pacientes com epilepsia refratária ao
tratamento medicamentoso.
O nosso objetivo principal que era o de demonstrar a factibilidade do método em um
grupo de pacientes bem selecionados foi alcançado com segurança. De fato, como observamos
anteriormente, nenhuma intercorrência grave ocorreu durante o procedimento e tempo de
seguimento.
A arteriografia seletiva de artéria cerebral posterior mostrou-se uma via de acesso adequada
à área desejada para o implante células. O procedimento transcorreu com tranqüilidade e
segurança em todos os pacientes; nenhum paciente apresentou alterações no traçado de base do
EEG (durante o cateterismo e nas 24 horas subseqüentes), também não registraram crises
convulsivas nesse período. Possíveis efeitos adversos associados ao cateterismo, sem relação
com as CTMMO em si, tais como hematoma ou dor no local de punção, acidente isquêmico
transitório, não foram observados. Alguns pacientes queixaram-se de cefaléia após nas horas
seguintes ao procedimento. Este é um evento que pode ocorrer e não costuma ser grave. Todos
os pacientes apresentavam exame neurológico normal após a arteriografia. Esses dados são
semelhantes aos de outros grupos que também utilizaram arteriografia como via de infusão de
CTMMO (Brazzini et al. ; Araújo 2008) Por ser um procedimento pouco invasivo, sem
intercorrências significativas como já visto, também propicia a brevidade da internação
hospitalar e retorno do paciente à suas atividades diárias. Sem dúvida devemos considerar como
fator contribuinte para o bom resultado, a habilidade técnica do neuroradiologista. Certamente a
experiência com esse procedimento (Araújo 2008) também contribui para melhores resultados
no quesito segurança.
54
“Primum non nocere”, ou “antes não prejudicar”, regra máxima da medicina, certamente foi
o que norteou o protocolo. A escolha da fonte de células tronco - a medula óssea, em detrimento
das células tronco embrionárias evita duas grandes controvérsias: a questão ética envolvendo o
uso das células derivadas de embrião e o potencial tumorigênico das mesmas(Gruen and Grabel
2006). Sendo o transplante autólogo, também não há risco de rejeição do mesmo.
O manejo das CTMO, realizado da forma mais natural, as quais foram somente
quantificadas através de citometria de fluxo, não sendo submetidas a qualquer outro método de
estimulação ou diferenciação, permitiu uma observação clínica que reflete os efeitos da
plasticidade normal dessas células no ambiente alvo. A aplicação via arteriografia seletiva da
artéria cerebral posterior assegura a maior concentração possível de CTMMO no local alvo. As
células tronco mesenquimais circulam fisiologicamente na circulação periférica (Mezey et al.
2003), uma injeção sistêmica levaria a uma significativa perda de concentração celular ma
região hipocampal. Por outro lado, o fato das CTMO não permanecerem viáveis por mais de
uma hora, diminui a possibilidade de efeitos adversos decorrentes do implante de células em
outros locais.
Um tipo celular predominante dentre os subgrupos CD 45/CD 105 e CD 34/CD117 nas
amostras infundidas não foi possível identificar através da fenotipagem. Tal distinção
possibilitaria estabelecer relação de causa e efeito e dessa forma, esclarecer melhor o
mecanismo de ação das células.
No que se refere às crises epilépticas, foram observadas não somente a diminuição na
freqüência de crises, mas também na percepção de intensidade das mesmas (referida pelos
pacientes). Dos 9 pacientes, 6 apresentaram diminuição na freqüência de crises epilépticas no
período referido; 3 pacientes não mostraram modificação nesse quesito. A análise da média de
crises (de todos os pacientes) pós-procedimento em relação à pré-procedimento mostrou que
realmente a tendência é o decremento de crises. A diminuição de crises epilépticas em estudos
experimentais já foi demonstrada por outros autores(Costa-Ferro et al. ; Chu et al. 2004) Vale
ressaltar que nos pacientes em que houve diminuição na freqüência de crises, houve também
uma atenuação na intensidade das mesmas. Os pacientes e\ou seus acompanhantes referiram
menor tempo de duração dos eventos; menor duração do período pós-ictal e menor intensidade
de manifestações motoras. Não há outro estudo semelhante na literatura, porem no estudo
experimental Costa Ferro (Costa-Ferro et al 2010) já foi observado comportamento semelhante
quando comparado um grupo controle
55
É interessante observar também a distribuição de crises segundo a classificação de Engel
pós-operatória (Engel 1993). Essa é uma classificação comumente utilizada em pacientes
submetidos à cirurgia de epilepsia. Não é o caso aqui, porém é uma classificação que julgamos
apropriada aplicar já que trata-se de um procedimento, ainda que minimamente invasivo.
Observamos que 77% permaneceram livres de crises incapacitantes desde o procedimento
(Engel Classe I). Em casos cirúrgicos com critérios de seleção semelhantes aos aqui expostos é
possível obter 89% de pacientes na classe IA no primeiro ano de seguimento (Paglioli et al
2004). É uma comparação pertinente ainda que entre dois métodos em estágios diferentes de
desenvolvimento. A cirurgia de epilepsia é o padrão ouro de tratamento para pacientes com ELT
com atrofia hipocampal unilateral refratária ao tratamento farmacológico. É um método
tecnicamente já bastante desenvolvido e avançado. O transplante de CTMMO nesses casos está
sendo realizado pela primeira vez. Certamente questões referentes à técnica, ao volume celular
injetado, tipo celular e número de procedimentos necessários para atingir resultados ainda
melhores deverão ser respondidas nos próximos anos.
Esse é um procedimento de impacto na vida de cada paciente, apesar de pouco invasivo.
Para os selecionados representou uma grande oportunidade de mudança significativa na rotina
dos mesmos, já que a expectativa era a de haver diminuição de crises epiléticas. Sabe-se que
procedimentos de grande impacto podem exercer um efeito placebo por si só (Tjomsland et al.
2001); no caso em discussão, o beneficio verificado poderia ser decorrente desse efeito, e não da
terapêutica. Alguns aspectos observados nesse estudo falam contra esse fator. A distribuição do
perfil de resposta ao tratamento instituído, na qual todos os pacientes que apresentaram resposta
favorável ao tratamento mantiveram esse padrão ao longo de todo o seguimento; naqueles em
que não houve modificação tão expressiva de freqüência, o padrão permaneceu equilibrado
durante o acompanhamento. No caso de efeito placebo poderíamos ter observado alguma queda
inicial na freqüência com posterior incremento. Possivelmente com o desenvolvimento de
estudos fase II e III observaremos melhor o padrão já verificado.
A análise eletroencefalográfica nas avaliações de controle trimestral e semestral em
comparação ao EEG pré-procedimento mostrou-se bastante favorável. Foi calculada a densidade
pontas e de ritmo theta. A avaliação geral mostrou diminuição de ambas que representa uma
melhora funcional significativa, sem haver incremento de atividade epileptogênica mesmo nos
pacientes em que não ocorreu melhora clínica,
56
Certamente o não surgimento de anormalidade no exame neurológico e alterações
morfológicas indesejadas (visualizadas à RM) comprova a segurança do método. Contudo, era
de fato esperada alguma modificação (incremento) na volumetria hipocampal, pelo menos nos
pacientes em que foi observada melhora clínica ( em alguns pacientes observou-se redução do
número absoluto do volume hipocampal, o que atribuímos à variação da técnica de mensuração
já que nenhuma modificação estatisticamente significativa foi verificada). É possível que o
tempo de observação não tenha sido suficiente para que detectássemos modificações no volume
hipocampal, também é possível que realização de um novo exame de RM mais adiante possa
demonstrar potencial recuperação hipocampal pós-transplante. No entanto, outra constatação
interessante chama a atenção nesse grupo de pacientes: a melhora funcional (clínica e
eletroencefalográfica) não diretamente relacionada à melhora imaginológica
Essa dissociação clínico-radiológica evoca algumas questões referentes ao mecanismo
de ação das CTMMO à sua plasticidade e a do microambiente alvo: quem é o responsável pelo
efeito observado? O que é mais importante: a morfológica ou o a fisiologia?
Sugere-se que as células mononucleares da medula óssea têm efeito neuroprotetor.
Estudos prévios sugeriram que as células da medula óssea induzem modificações no tecido
danificado através de diferentes mecanismos, como a produção de fatores neurotróficos (Eaton
and Whittemore 1996), através da estimulação de proliferação endógena, ou através de interação
de células-tronco, exógenas e endógenas, idealizadas para propiciar neuroproteção por suporte
trófico(Nomura et al. 2005).
A epileptogênese é um processo dinâmico com repercussão clínica que, além das crises
convulsivas inclui deterioração cognitiva (Engel 2002). O uso da tecnologia com CTMMO
nesse contexto é mais um fator em estudo. Nessa conjuntura torna-se imprescindível a
translação clínico-experimental, uma vez que no âmbito experimental o momento atual é de
responder questões referentes a mecanismos ainda desconhecidos sobre uma terapêutica que se
mostrou segura e com potencial efeito na redução das crises..
Ademais, foi possível avançar em conhecimento a respeito de uma terapêutica inovadora:
demonstrou-se também melhora neurofisiológica. Algumas questões, no entanto permanecem
em haver e podem ser respondidas com a realização de estudos subseqüentes. A inclusão de
mais pacientes no estudo permitiria a determinação de um perfil de pacientes com melhor
resposta ao tratamento, através de análise de subgrupos. Maior tempo de seguimento certamente
permite observar melhor a resposta terapêutica a longo prazo e a resolução da questão referente
57
à permanência ou não da dissociação clínico-radiológica.
58
CONCLUSÕES
O presente estudo que avaliou a factibilidade e segurança do transplante de CTMMO em
pacientes com ELT permitiu concluir que:
1- A obtenção e transplante de CTMMO por injeção seletiva na artéria cerebral posterior é
factível.
2- Não foram encontradas anormalidade no exame neurológico, EEG e RM induzidas pelo
procedimento.
3- Houve redução significativa na freqüência das crises epilépticas.
4- Houve redução significativa da atividade epileptogênica quando avaliada pelo EEG
interictal e não houve mudança no padrão de EEG durante a infusão
5- Não houve alteração significativa no volume hipocampal pós-transplante de CTMMO
59
PERSPECTIVAS
Nesse estudo apresentamos os resultados referentes aos critérios de segurança e
factibilidade do método de transplante autólogo de células tronco mononucleares de medula
óssea em pacientes com ELT e atrofia hipocampal , o qual deverá ser complementado em
investigação de nível II e III, ampliando o estudo a outros 11 pacientes e avaliando também
os dados de investigação neuropsicológica.
60
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