( PDF ) Efeito antinociceptivo da toxina TX3-3 isolada do veneno da aranha Phoneutria nigriventer em modelos animais de dor

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

FACULDADE DE MEDICINA – INCT MEDICINA MOLECULAR

PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA BIOQUÍMICA E MOLECULAR

GERUSA DUARTE DALMOLIN

EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA TOXINA TX3-3 ISOLADA DO

VENENO DA ARANHA Phoneutria nigriventer EM MODELOS

ANIMAIS DE DOR

Santa Maria

2010

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GERUSA DUARTE DALMOLIN

EFEITO ANALGÉSICO DA TOXINA TX3-3 ISOLADA DO

VENENO DA ARANHA Phoneutria nigriventer EM MODELOS

ANIMAIS DE DOR

Orientador: Dr. Juliano Ferreira

Co-orientador: Dr. Marcus Vinícius Gomez

Santa Maria

2010

Tese submetida ao Curso de Pós-

graduação em Farmacologia Bioquímica

e Molecular da Faculdade de Medicina,

Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia

– Medicina Molecular da Universidade

Federal de Minas Gerais como requisito

parcial para obtenção do grau de doutor

em Ciências.

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A Helvio e Maria Tereza

AGRADECIMENTOS

Ao professor Juliano Ferreira, pela orientação ao longo do Mestrado e

Doutorado. Pelo exemplo, pelo incentivo e por compartilhar de sua visão

científica, que motivou um novo olhar sobre a ciência.

Ao professor Marcus Vinícius Gómez, pela oportunidade de participar de

um projeto tão grandioso do qual este trabalho faz parte. Obrigada pela

confiança e pelos momentos de conversa amigável e ensinamentos científicos.

Aos professores Maribel Antonello Rubin e Carlos Fernando de Mello,

pela acolhida no LabNeuro desde a época da minha iniciação científca e pelos

ensinamentos ao longo da minha trajetória acadêmico-científica.

Aos colegas do LabNeuro, os tantos que tive a oportunidade de

conhecer e conviver ao longo desses anos de jornada científica, pela ajuda na

execução dos experimentos, pelas discussões científicas e pelos tantos

momentos que compartilhamos na bancada, na „mesa de estudos‟ ou mesmo

no „bosque‟, que certamente tornaram o fazer ciência muito mais agradável.

Em especial ao Guilherme, pela ajuda inestimável na finalização desta tese.

Aos „colegas de Minas‟, pela acolhida afetuosa, pelos poucos mas

fascinantes experimentos na „sala do confocal‟ e pelas conversas e discussões

científicas sempre enriquecedoras que estão impressas, de alguma maneira,

neste trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia Bioquímica e

Molecular, à Universidade Federal de Minas Gerais e à Universidade Federal

de Santa Maria, pela disponibilização de recursos para a realização deste

trabalho.

Ao Istituto do Milênio, CNPq, CAPES, FAPEMIG e PRONEX pelo auxílio

financeiro.

“ O prazer é o primeiro dos bens.

É a ausência de dor no corpo

e de inquietação na alma.”

Epicuro

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................vii

RESUMO............................................................................................................ ix

ABSTRACT.................................................................................................X

I. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 11

II. OBJETIVOS ................................................................................................. 15

II.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 16

II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................... 16

III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................ 17

III.1. UMA BREVE HISTÓRIA SOBRE A DOR ........................................................ 18

III.1.2. PANORAMA ATUAL: A IDÉIA DE DOR HOJE .............................................. 23

III.2. O CAMINHO DA DOR – VIAS DE TRANSMISSÃO DA DOR .............................. 25

III.3. DOR CRÔNICA: SINALIZAÇÃO CELULAR E NEUROPLASTICIDADE ................. 31

III.4. TRATAMENTO FARMACOLÓGICO: ANALGÉSICOS E ALVOS POTENCIAIS NO

TRATAMENTO DA DOR CRÔNICA .......................................................................... 36

IV. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 53

IV.1. ANIMAIS ................................................................................................ 54

IV.2. DROGAS ................................................................................................ 54

IV.3. ADMINISTRAÇÃO DAS DROGAS ................................................................ 55

IV.4. TESTES COMPORTAMENTAIS .................................................................. 56

IV.4.1. AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS EXPERIMENTAIS DE DOR ........................ 56

IV.4.1.1. TESTE DA RETIRADA DA CAUDA .................................................... 56

IV.4.1.2. TESTE DO VON FREY ................................................................... 57

IV.4.2. AVALIAÇÃO DE EFEITOS COLATERAIS ................................................. 58

IV.4.2.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA .............................................. 58

IV.4.2.1.1.TESTE DE LOCOMOÇÃO FORÇADA EM CILINDRO GIRATÓRIO

(ROTAROD) .................................................................................................... 58

IV.4.2.1.2.TESTE DO REFLEXO DE ENDIREITAMENTO (RIGHTING REFLEX

TEST) ............................................................................................................. 59

IV.4.2.2. AVALIAÇÃO DE COMPORTAMENTOS MOTORES ANORMAIS ............ 59

IV.5. MODELOS ANIMAIS DE DOR CRÔNICA ...................................................... 60

IV.5.1. MODELO DE DOR INFLAMATÓRIA INDUZIDA PELO ADJUVANTE COMPLETO

DE FREUND (CFA) ......................................................................................... 60

IV.5.2. MODELOS DE DOR NEUROPÁTICA....................................................... 60

IV.5.2.1. MODELO DE NEUROPATIA CAUSADA POR TRAUMA .......................... 60

IV.5.2. 2. MODELO DE NEUROPATIA DIABÉTICA ............................................ 61

IV.6. MODELO DE TOLERÂNCIA A OPIÓIDE ....................................................... 61

IV.7 .ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 63

V. RESULTADOS ............................................................................................. 64

V.1. EFEITOS ANTINOCICEPTIVO E COLATERAIS PRODUZIDOS PELA

ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 E -CONOTOXINA MVIIC EM

CAMUNDONGOS ................................................................................................. 65

V.2. EFEITOS ANTINOCICEPTIVO E COLATERAIS PRODUZIDOS PELA

ADMINISTRAÇÃO INTRATECEREBROVENTRICULAR DE TX3-3 E -CONOTOXINA

MVIIC EM CAMUNDONGOS ................................................................................. 68

V.3. EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 EM MODELO ANIMAL DE

DOR INFLAMATÓRIA ............................................................................................ 71

V.4 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 EM MODELO ANIMAL DE DOR

NEUROPÁTICA......................................................................................................74

vii

V.5. EFEITO DA PRÉ-ADMINISTRAÇÃO DE TX3-3 NA ANTINOCICEPÇÃO CAUSADA

PELA ADMINISTRAÇÃO SISTÊMICA DE UMA DOSE SUB-EFETIVA DE MORFINA .......... 76

VI. DISCUSSÃO ............................................................................................... 83

VII. CONCLUSÕES ........................................................................................ 104

VIII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 106

IX. APÊNDICES ............................................................................................. 135

APÊNDICE A - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 NO

COMPORTAMENTO NOCICEPTIVO EVOCADO POR FORMALINA............................ 137

APÊNDICE B - EFEITO DA INIBIÇÃO DA CAMKII ESPINHAL NO EFEITO

ANTINOCICEPTIVO DA MORFINA ......................................................................... 138

APÊNDICE C- MANUSCRITO SUBMETIDO À REVISTA PAIN.................................. 140

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA

Análise de variância

AINES

Antiinflamatórios não esteirodais

AMP

Adenosina 3‟, 5‟ – monofosfato cíclico

CaMKII

Proteína cinase dependente de cálcio calmodulina II

CCDV

Canais de cálcio dependentes de voltagem

CFA

Adjuvante completo de Freund

CGRP

Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

DAG

Diacilglicerol

Dose efetiva 50

DRG

Gânglios da raiz dorsal

ECA

Enzima conversora da angiotensina

máx

Efeito máximo

EMEA

European Medicines Agency

FDA

Food and Drug Administration

FUNED

Fundação Ezequiel Dias

GIRK

Canais de potássio retificadores de influxo de corrente

i.c.v.

Intracerebroventricular

i.p.

Intraperitoneal

i.t.

Intratecal

IASP

Associação Internacional para o Estudo da Dor

ICK

Inhibitory cystine knot

Trifosfato de inositol

MPE

Máximo efeito possível

NMDA

N-metil-D-aspartato

P2X

Receptor purinérgico ionotrópico 3

PAG

Substância cinzenta periaquedutal

PBS

Salina tamponada com fosfato

PGE

Prostaglandina E

PKA

Proteína cinase A

PKC

Proteína cinase C

Ret

Receptor para o fator neurotrófico derivado da glia

RVM

Porção rostral da medula oblonga ventromedial

RVM

Medula oblonga ventromedial

SNC

Sistema Nervoso Central

SNK

Student-Newman-Keuls

STZ

Estreptozotocina

Glânglio da raiz trigeminal

TrkA

Receptor para o fator de crescimento do nervo

WDR

Neurônios polimodais

RESUMO

O veneno de animais peçonhentos representa uma fonte valiosa para a

busca de novos tratamentos para a dor. O presente estudo se propôs a avaliar

os efeitos antinociceptivo e motores adversos causados pela Tx3-3, uma toxina

peptídica isolada do veneno da aranha Phoneutria nigriventer, que inibe canais

de cálcio dependentes de voltagem (CCDV), com maior afinidade para os

CCDV do tipo P/Q e R. Inicialmente, foi avaliado o efeito da Tx3-3 em teste de

nocicepção aguda, evocada por estímulo térmico (o teste da retirada de cauda)

e em modelos animais de dor crônica inflamatória (induzida pelo adjuvante

completo de Freund – CFA) e neuropática (pela ligação parcial do nervo ciático

ou através da indução de neuropatia diabética por STZ). A seguir, foi avaliado o

efeito da injeção intratecal de Tx3-3 na eficácia antinocieptiva da morfina em

animais neuropáticos ou tolerantes a opióides. A injeção intratecal (i.t.) ou

intracerebroventricular (i.c.v.) de Tx3-3 em camundongos causou efeito

antinociceptivo fugaz (15 min de duração), sem promover alterações

detectáveis em funções motoras. Em comparação, a -conotoxina MVIIC, uma

toxina peptídica isolada do veneno do molusco marinho Conus magus, que

inibe CCDV do tipo P/Q e N, causou prejuízo na atividade motora em doses

muito próximas àquelas capazes de causar antinocicepção no teste da retirada

da cauda. Quando testada nos modelos de dor neuropática, a Tx3-3 causou

um efeito antinociceptivo mais duradouro (até 2 h de duração). A

administração i.t. de Tx3-3 (30 pmol/sítio) reduziu a alodínia mecânica

produzida por ligação parcial do nervo ciático de camundongos assim como a

alodínia mecânica causada pela neuropatia diabética em camundongos e ratos.

Por outro lado, a toxina Tx3-3 não apresentou efeito antinociceptivo no modelo

de dor inflamatória. A Tx3-3 não foi apenas eficaz no alívio da dor neuropática,

como também restabeleceu a eficácia antinociceptiva da morfina em

camundongos neuropáticos e tolerantes a opióides. Os resultados aqui

descritos apontam a Tx3-3 como uma toxina promissora para o tratamento da

dor crônica refratária a opióides

Palavras chave: dor neuropática; tolerância a opióides; canal de cálcio do tipo

P/Q; canal de cálcio do tipo R; bloqueador iônico; toxina peptídica;

antinocicepção.

ABSTRACT

Venom peptides have produced exceptional lead compouds for drug

development to treat pain. In the present study, we examined the

antinociceptive and motor effects of Tx3-3, a peptide toxin isolated from

Phoneutria nigriventer venom, which inhibit high voltage-dependent calcium

channels (VDCC), preferentially P/Q and R-type VDCC. First, we tested the

effects of Tx3-3 on nociceptive (tail-flick test), neuropathic (partial sciatic nerve

ligation and STZ-induced diabetic neuropathy) and inflammatory (intraplantar

Complete Freund's Adjuvant - CFA) animal models of pain. Additionally, we also

tested the effect of Tx3-3 on morphine antinociception in opioid-tolerant and

neuropathic mice. In the tail-flick test, both intrathecal (i.t.) and

intracerebroventricular (i.c.v.) injection of Tx3-3 caused a short-lasting

antinociceptive effect in mice, without impair motor functions, at least in doses

that were 10-30 time higher than the effective dose. By comparison, -

conotoxin MVIIC, a P/Q and N-type VDCC blocker derived from Conus magus

venom, caused significant motor impairment at doses close to the efficacious

dose in tail-flick test. Tx3-3 caused a long-lasting antinociceptive effect in

neuropathic pain models. Intrathecal injection of Tx3-3 (30 pmol/site) decreased

both mechanical allodynia produced by sciatic nerve injury in mice and STZ-

induced allodynia in mice and rats. On the other hand, i.t. injection of Tx3-3 did

not alter inflammatory pain. Furthermore, the i.t. injection of Tx3-3 before

morphine challenge reestablished the morphine effectiveness in opioid-tolerant

mice and allowed morphine antinociception in neuropathic mice. Taken

together, our data show that Tx3-3 presentes good antinociceptive activity in

neuropathic pain models and enables morphine-induced antinociception in

opioid-tolerant and neuropathic hyperalgesic states. These findings suggest that

Tx3-3 may be of interest in the management of pain states refractory to opioids.

Keywords: neuropathic pain; opioid tolerance; P/Q- type calcium channel; R-

type calcium channel; calcium channel blocker; peptide toxin; antinociception

__________________________________________________________Introdução

I. INTRODUÇÃO

__________________________________________________________Introdução

I. Introdução

A maioria dos analgésicos utilizados na clínica hoje foram descobertos

de forma empírica, ou tiveram seu uso baseado na medicina popular. É o caso

das substâncias derivadas do ópio (morfina) e da casca do salgueiro (aspirina).

Atualmente, com a identificação dos mecanismos neurobiológicos responsáveis

por determinados tipos de dor, a descoberta de novos fármacos analgésicos

envolve a busca por substâncias capazes de atuar especificamente em alvos

moleculares envolvidos na transmissão e modulação da dor crônica.

A dor crônica difere substancialmente da dor aguda não somente em

relação ao seu caráter persistente, mas está principalmente associada com

alterações adaptativas em vários níveis do sistema nervoso. Os neurônios

localizados na medula espinhal, de suma importância na transmissão dos

estímulos nociceptivos, são freqüentemente alvo de tais alterações. A

estimulação facilitada das fibras aferentes nociceptivas, que ocorre sob

circunstâncias patológicas, como em doenças inflamatórias ou após a lesão

nervosa, acaba por induzir o aumento na liberação de neurotransmissores

como o glutamato, que ao se ligarem nos seus alvos pós-sinápticos na medula

espinhal iniciam uma série de sinalizações celulares (como a ativação de

segundos mensageiros, de proteínas cinases e fosfatases) que alteram de

maneira transitória ou permanente a detecção do estímulo nocivo, produzindo

hipersensibilidade dolorosa, a hiperalgesia. Esses eventos não são uniformes

e dependem do tipo e da etiologia da dor.

A dor crônica tem etiologia diversa. As dores crônicas mais comuns

incluem as neuropáticas (como as causadas por trauma ou diabetes) e as

inflamatórias (como a artrite reumatóide). Quando não tratada de forma

__________________________________________________________Introdução

adequada, a dor crônica pode ter conseqüências nefastas, sendo

frequentemente associadas a quadros de depressão, isolamento social e

afastamento do trabalho. A dor neuropática é especialmente problemática, pois

geralmente apresenta resistência aos fármacos analgésicos tradicionais, sendo

refratária até mesmo à analgesia da morfina.

Recentemente, a ziconotida - versão sintética da -conotoxina MVIIA,

uma toxina descoberta no veneno do caracol marinho Conus magus - foi

aprovada para o tratamento de dores intensas, refratárias à morfina, em

pacientes que requerem analgesia intratecal. No entanto, a sua reduzida janela

terapêutica limita o tratamento de muitos pacientes. A ação analgésica da

ziconotida está relacionada ao bloqueio de canais de cálcio dependentes de

voltagem (CCDV), especificamente os CCDV do tipo N.

Os CCDV são classificados de acordo com suas propriedades biofísicas

e farmacológicas em canais tipo L, N, P, Q , R (ativados por alta voltagem) e T

(ativados por baixa voltagem). Os CCDV do tipo N, P/Q e, em menor grau, do

tipo R estão localizados em terminais pré-sinápticos, onde interagem com

proteínas envolvidas na exocitose de vesículas sinápticas. A ativação desses

canais promove a liberação de neurotransmissores em várias áreas do sistema

nervoso central, inclusive naquelas envolvidas na transmissão e modulação

nociceptiva. Ademais, esses canais estão envolvidos no fenômeno de

sensibilização central que acompanha a dor crônica e a tolerância a opióides.

Desde a descoberta do potencial analgésico da -conotoxina MVIIA, há

um crescente interesse por toxinas peptídicas presentes no venenos de

animais peçonhentos como possíveis tratamentos para a dor. O veneno da

aranha Phoneutria nigriventer, conhecida popularmente como aranha

__________________________________________________________Introdução

armadeira, apresenta uma vasta gama de toxinas peptídicas com ações sobre

canais iônicos. Dentre as frações isoladas do veneno, a fração PnTx3

apresenta toxinas capazes de bloquear os CCDV, o que a torna uma fonte

interessante na busca de toxinas com potencial analgésico. De fato, uma das

toxinas que compões essa fração, a Ph1, capaz de inibir correntes de cálcio

do tipo N, mostrou eficácia similar mas índece terapêutico superior à -

conotoxina MVIIA em testes pré-clínicos. É também da fração PnTx3 a toxina

alvo desse estudo.

A toxina Tx3-3, assim como a -conotoxina MVIIA, apresenta uma

seqüência de aminoácidos que prediz uma estrutura tridimensional peculiar,

comum a toxinas capazes de interagir com canais iônicos. De fato, a Tx3-3 já

mostrou ser capaz de inibir correntes de cálcio e a liberação de glutamato de

vesículas sinápticas, através do bloqueio preferencial de CCDV do tipo P/Q e

R. Essas características fazem da Tx3-3 uma toxina promissora na busca de

novas moléculas analgésicas.

Assim, o presente estudo se propôs a avaliar os efeitos antinociceptivo e

adversos produzidos pela administração da toxina Tx3-3 em camundongos e

ratos submetidos a modelos experimentais de dor.

Parte dos dados que compõem esta tese foram submetidos a publicação

na revista Pain sob o título “Antinociceptive effect of the armed spider toxin Tx3-

3 in acute and chronic animal models of pain” (Apêndice C) e os demais

resultados irão compor o manuscrito intitulado “The armed spider toxin Tx3-3

restores the analgesic effect of morphine in neuropathic and opioid-tolerant

mice” que encontra-se em fase de elaboração.

____________________________________________________________Objetivos

II. OBJETIVOS

____________________________________________________________Objetivos

II. OBJETIVOS

II.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar os possíveis efeitos antinociceptivo e adversos da toxina Tx3-3

isolada do veneno da aranha Phoneutria nigriventer em modelos experimentais

de dor em camundongos e ratos.

II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Avaliar o efeito da administração intratecal e intracerebroventricular da

toxina Tx3-3 em teste de nocicepção aguda em camundongos;

2. Avaliar o desenvolvimento de efeitos motores adversos pela

administração intratecal ou intracerebroventricular de Tx3-3 em

camundongos;

3. Comparar os efeitos antinociceptivo e motores adversos causados pela

administração de Tx3-3 com aqueles produzidos pela administração

intratecal e intracerebroventricular da -conotoxina MVIIC em

camundongos;

4. Avaliar o efeito da administração intratecal da Tx3-3 em modelo animal

de dor inflamatória;

5. Avaliar o efeito da administração intratecal da Tx3-3 em modelo animal

de dor neuropática induzida por trauma e diabetes;

6. Avaliar o efeito da administração intratecal da Tx3-3 na eficácia

antinociceptiva da morfina em modelos animais de dor resistente a

opióides.

______________________________________________Revisão Bibliográfica

III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

______________________________________________Revisão Bibliográfica

III. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

III.1. UMA BREVE HISTÓRIA SOBRE A DOR

Nenhuma outra experiência está tão embutida de significados quanto a

dor. As próximas linhas, no entanto, limitar-se-ão ao aspecto físico da dor, que

restringe o significado da dor a uma experiência consciente, associada a uma

lesão tecidual.

Virginia Woolf ao escrever: “The merest schoolgirl, when she falls in love,

has Shakespeare or Keats to speak her mind for her, but let a sufferer try to

describe pain in his head to a doctor and language at once runs dry”

exemplifica a dificuldade de descrever a dor enquanto experiência física. O

entendimento da dor, como experiência física, dotada de vias anatômicas e

mecanismos neurais e moleculares específicos, teve grande avanço a partir do

século XIX, quando técnicas neuroanatômicas proveram subsídios para o

entendimento do funcionamento do sistema nervoso central (SNC).

No início do século XIX, o trabalho pioneiro de Bell and Magendie propôs

diferentes funções para os neurônios localizados nas raízes ventral e dorsal da

medula espinhal, sendo aqueles responsáveis por funções motoras e estes por

funções sensoriais O anatomista escocês Bell defendia a ideia de que os

nervos sensoriais possuíam funções especializadas para detectar e prover

informações somáticas, incluindo a dor

(CRANEFIELD, 1974; BELL, 1811;

revisado por PERL, 2007). De acordo, o fisiologista alemão Müller, em 1840,

postulou a “doutrina das energias nervosas específicas”, que defendia o

1. Virginia Woolf, sobre a inefabilidade da dor em seu ensaio, "On Being Ill", publicado na

revista inglesa sobre literatura The Criterion, Ed. Thomas Stearns Eliot, em 1926.

______________________________________________Revisão Bibliográfica

conceito de especificidade sensorial, em que cada modalidade sensorial (visão,

olfato, audição e sensações somáticas) seria provida por um conjunto distinto

de estruturas presentes nos nervos periféricos e no cérebro (MÜLLER, 1840).

A teoria de Müller foi reforçada por estudos eletrofisiológicos de DuBois-

Reymond, que demonstraram que os impulsos nervosos produzidos pela

estimulação de diferentes fibras aferentes eram similares, o que implicava na

necessidade das fibras aferentes serem constituídas de estruturas

especializadas para informar a respeito na natureza de diferentes estímulos

(DUBOIS-REYMOND, 1848). Em meados do século XIX, Schiff, aluno de

Magendie, demonstrou que lesões específicas na medula espinhal resultavam

em perda de sensações táteis e dolorosas de maneira independente (SCHIFF,

1858). Esses achados levaram Schiff a propor que a dor é uma sensação

independente das demais, corroborando a tese de Avicenna, filósofo e médico

persa, que um milênio antes postulou que a dor podia ser dissociada das

sensações táteis e térmicas, sendo, portanto, uma sensação independente

(revisado por PERL, 2007). Entre 1880 e 1890, o anatomista Edinger identificou

uma longa via ascendente com origem em neurônios espinhas, que viria a ser

chamada de via espinotalâmica (EDINGER, 1890). Estudos pré-clínicos e

clínicos (BROWN-SÉQUARD, 1860;1868; GOEWERS, 1878) já demonstravam

que o quadrante antero-lateral da medula espinhal constituía a via anatômica

que levaria a informação dolorosa da periferia até o cérebro. Anos mais tarde, a

observação de portadores de síndromes que alteravam a percepção dolorosa

ou de pacientes afetados por lesões cerebrais levou Dejerine e Roussy, em

1906, e Head e Holmes, em 1911, a considerar o tálamo uma estrutura

encefálica fundamental para a produção de dor (DEJERINE, E ROUSSY, 1906;

______________________________________________Revisão Bibliográfica

HEAD E HOLMES, 1911). Assim, no final do século XIX diversas evidências

sustentavam a tese de que a dor é uma sensação independente, com via

anatômica específica para sua detecção.

No entanto, desde 1874, outra corrente teórica sobre a origem da dor

contradizia o conceito de especificidade da dor. O neurologista alemão Erb,

notando que estímulos intensos são, em geral, desagradáveis, postulou que a

dor é o resultado da ativação vigorosa de vias nervosas comuns a outras

modalidades sensoriais (ERB, 1874). Essa observação originou, então, uma

nova teoria sobre a dor, oposta àquela cuja dor seria uma sensação específica

e independente (a Teoria da Especificidade – „The Specificity Theory‟), que

propunha que a intensidade do estímulo gerador é que determinaria ou não a

resposta de dor, a Teoria da Intensidade („The Intensity Theory‟). Anos mais

tarde, a interpretação de registros eletrofisiológicos de fibras nervosas isoladas

(ADRIAN, E ZOTTERMAN, 1926), levou Nafe, um psicólogo americano, a

intensificar o debate. Nafe postulou que não apenas a intensidade do estímulo,

mas o padrão de atividade neuronal gerado por ele é que determinaria a

resposta de dor, teoria chamada, por esse motivo, de Teoria Padrão („The

Pattern Theory‟) (NAFE, 1929). Logo, no final do século XIX e início do século

XX, pelo menos três correntes teóricas sobre a natureza da dor dividiam

médicos e fisiologistas.

As observações feitas por von Frey em 1896/1897 de que as diferentes

experiências sensoriais determinadas pela estimulação de distintas áreas da

pele estavam diretamente relacionadas à estrutura dos terminais nervosos de

tais áreas reforçou a idéia de especificidade da dor. No entanto, uma objeção

sobre a dor como sensação específica se devia ao fato de estímulos não-

______________________________________________Revisão Bibliográfica

específicos (podendo ser esses mecânicos, térmicos ou químicos) serem

capazes de gerar dor. Essa questão foi solucionada por Charles Sherrington

que, percebendo que a dor era gerada por estímulos lesivos, resolveu chamar

todo e qualquer estímulo capaz de gerar dor “nocivo”, independente da sua

característica física. Sherrington cunhou, ainda, o termo “nociceptor” para o

aparato responsável por dectectar o estímulo nocivo (SHERRINGTON, 1906).

No entanto, tal “aparato” não havia ainda sido precisamente identificado.

No início início do século XX, registros de sinais nervosos obtidos em

osciloscópio levaram Bishop, Gasser e seus colaboradores a sugerir as fibras

delgadas ou finamente mielinizadas (A) e as fibras não mielinizadas (C) como

aquelas responsivas aos estímulos nocivos (HEINBECKER E BISHOP, 1933;

ZOTTERMAN, 1933; CLARK, HUGHES, E GASSER, 1935; LANDAU E

BISHOP, 1953; COLLINS, NULSEN E RANDT, 1960). Em meados do século

XX, Iggo e outros investigadores identificaram, em gatos, fibras aferentes de

condução lenta, que requeriam estímulo intenso para serem ativadas, capazes

de responder seletivamente a estímulos térmicos e mecânicos nocivos (IGGO,

1959; 1960; HUNT E MCINTYRE, 1960). Embora esses estudos apoiassem a

Teoria da Especificidade, a ambivalência de dados histológicos e registros de

sensibilidade cutânea relatada em diferentes estudos, somada à ausência de

provas da existência de receptores específicos para a dor, levaram os

membros do Departamento de Anatomia da Universidade de Oxford, entre os

anos de 1940 e meados de 1950, a expressarem forte repúdia à Teoria da

Especificidade. Nesse período, Patrick Wall era estudante de medicina na

Universidade de Oxford. Anos mais tarde, em 1965, Patrick Wall e o psicólogo

Ronald Melzack postularam a Teoria do Portão (The Gate Theory), em

______________________________________________Revisão Bibliográfica

oposição ao conceito de especificidade da dor. De acordo com essa teoria, o

balanço entre a ativação de fibras aferentes de pequeno (C) e grande (A)

diâmetro localizadas na substância gelationosa da medula espinhal é que

determinaria a condução, ou não, do estímulo nocivo: quando a ativação das

fibras C sobressai àquela das fibras A o “portão‟‟ abre, e o estímulo é então

conduzido. Caso a ativação das fibras A predomine, o portão fecha, e o

estímulo nocivo não é levado a centros supra-espinhais (MELZACK E WALL,

1965). A Teoria do Portão foi a expressão mais articulada da Teoria Padrão e,

embora equivocada quanto aos aspectos neurobiológicos, a teoria de Wall e

Melzack foi precursora no conceito de modulação da dor, sugerindo, desde

então, que estruturas supra-espinhais estariam envolvidas na modulação da

transmissão da dor na medula espinhal, o que veio a ser confirmado anos mais

tarde (BASBAUM E FIELDS, 1984).

Com o refinamento das técnicas eletrofisiológicas, as estruturas

envolvidas na condução da dor foram pouco a pouco sendo identificadas e

caracterizadas. A partir de estudos realizados em 1967 por Bessou, Burgess e

Perl, um grande número de evidências apoiou a existência de fibras aferentes

capazes de discriminar entre estímulos inócuos e nocivos (PERL, 1968;

BESSOU E PERL, 1969; BESSOU, BURGESS E PERL, 1971). A identificação

dos nociceptores facilitou a identificação de regiões responsivas a estímulos

nocivos no sistema nervoso central: em 1970 Christensen and Perl

demonstraram que neurônios presentes na lâmina I do corno dorsal da medula

espinhal eram seletivamente ativados por estímulos nocivos e térmicos

(Christensen e Perl, 1970); em 1975 Price e Mayer identificaram neurônios

presentes em lâminas espinhais mais profundas (V-VI) capazes de responder

______________________________________________Revisão Bibliográfica

tanto a estímulos mecânicos inócuos quanto a estímulos térmicos e mecânicos

nocivos, denominados neurônios polimodais (wide dynamic range neurons -

WDR), achado que remete às premissas da Teoria Padrão. Hoje se sabe que a

medula espinhal apresenta uma arquitetura organizada em lâminas, compostas

por neurônios nociceptivos e polimodais, estando as lâminas mais superficiais

(lâmina I e II) particularmente envolvidas na condução de estímulos nocivos

(CRAIG, 2003). Portanto, a dor possui estruturas especializadas para a sua

detecção e condução. No entanto, como demonstrado por Clifford Woolf em

1983, a arquitetura da medula espinhal está sujeita a alterações plásticas

quando submetida à estimulação continuada, o que leva à manifestação de

respostas de dor alteradas, ou seja, Wall e Melzack não estavam

completamente errados ao inferir que a resposta de dor é modulada na medula

espinhal. Os mecanismos envolvidos na condução e modulação da dor

continuam a ser desvendados. A ideia que emerge é que a dor, enquanto

experiência física deve ser entendida, não através de uma teoria única, mas

como um processo fisiológico, com características anatômicas e moleculares

estabelecidas que, por ser dinâmico, está sujeito a alterações e modulações.

III.1.2. PANORAMA ATUAL: A IDEIA DE DOR HOJE

O termo “nocicepção”, desde sua introdução por Sherrington há um

século, vem sendo usado para descrever os processos neurais de

decodificação de estímulos nocivos, ou seja, estímulos capazes de produzir

dano tecidual. É, portanto, um termo utilizado para descrever um processo

fisiológico. O termo dor, como definido pela IASP (Associação Internacional

para o Estudo da Dor), descreve não somente uma sensação, mas também

______________________________________________Revisão Bibliográfica

uma emoção desagradável associada a um estímulo lesivo ou potencialmente

lesivo. A definição de dor proposta pela IASP desde 1979, aponta para a

natureza subjetiva da dor e, assim, ajudou a estabelecer o direito e a

necessidade do paciente receber tratamento para qualquer tipo de dor, seja a

queixa acompanhada ou não de dano tecidual. De fato a dor é uma experiência

subjetiva complexa, cuja percepção é resultado dos processos fisiológicos

sensoriais somados a características pessoais – que compõem o aspecto

emocional da dor. Um estímulo será percebido como doloroso independente da

sua natureza, de acordo com o contexto em que a pessoa está inserida - é o

caso analgesia que precede situações de fuga ou luta, mesmo na presença de

uma lesão tecidual – e das emoções e memórias que a acompanham.

“Nocicepção” e “dor” não devem ser confundidas. Uma pode ocorrer na

ausência da outra. É o que acontece por exemplo no caso da anestesia do

nervo mandibular, utilizada em procedimentos odontológicos, em que a

nocicepção periférica é mantida, sem que o paciente sinta dor. Ou nos casos

de assimbolia à dor, condição geralmente associada a lesões de áreas

cerebrais relacionadas ao processamento do componente emocional da dor,

como o córtex cingulado anterior ou o córtex pré-frontal, em que o paciente é

capaz de localizar e discriminar um estímulo nocivo sem que o mesmo

provoque qualquer tipo de desconforto ou emoção desagradável associada

(PRICE, 2002). Casos de assimbolia à dor ou condições de insensibilidade

dolorosa, que ocorre nos indivíduos portadores da insensibilidade congênita à

dor (MOGIL et al., 2000), são em geral dramáticos, uma vez que a habilidade

de detecção, proteção e defesa de estímulos nocivos é essencial para a

manutenção da integridade física e sobrevivência.

______________________________________________Revisão Bibliográfica

A transmissão da dor envolve a integração de mecanismos de detecção

do estímulo nocivo periférico e sua condução até regiões do SNC que irão

determinar a resposta de defesa. Esse caminho seguido pelo estimulo nocivo,

habilmente caracterizado através de técnicas de biologia molecular, de

eletrofisiologia e de imagem, permite a detecção da dor aguda. Alterações

nesse intrincado caminho podem, todavia, alterar a percepção dolorosa. É o

que acontece, por exemplo, em situações de dor crônica.

III.2. O CAMINHO DA DOR – VIAS DE TRANSMISSÃO DA DOR

Estímulos tais como compressão, frio ou calor e algumas substâncias

químicas são interpretados como nociceptivos quando promovem a

estimulação de fibras aferentes primárias que apresentam propriedades

biofísicas e moleculares próprias para a detecção de estímulos potencialmente

lesivos, os nociceptores. Existem duas principais classes de nociceptores, uma

composta por neurônios não mielinizados, as fibras C, e outra formada por

neurônios finamente mielinizados, as fibras A (MEYER et al, 2008). As fibras

A diferem consideravelmente das fibras mielinizadas de grande diâmetro, A,

que respondem a estímulos mecânicos inócuos, como um leve toque, por

exemplo. Os corpos celulares dos neurônios dos nociceptores estão

localizados nos gânglios da raíz dorsal (dorsal root ganglion - DRG) e

trigeminal (trigeminal ganglion - TG), que conectam-se com neurônios do corno

dorsal da medula espinhal e do núcleo trigeminal pars caudalis na ponte,

respectivamente (BESSON, 1999). As fibras C, na sua maioria, são

nociceptores polimodais que respondem a várias formas de estímulos nocivos

(térmicos, mecânicos e químicos). Essas fibras são classificadas em dois

______________________________________________Revisão Bibliográfica

grupos, de acordo com o seu conteúdo de peptídeos e a localização de seus

terminais sinápticos no corno dorsal da medula espinhal (HUNT e ROSSI,

1985). As fibras C que expressam o receptor purinérgico P2X

, o receptor para

o fator neurotrófico derivado da glia Ret e sítios de ligação para a isolecitina B4,

cujos terminais sinápticos localizam-se mais internamente na substância

gelationsa da medula espinhal (lâmina II), são classificadas como fibras C não-

peptidérgicas. O outro grupo de fibras C sintetiza peptídeos como a substância

P e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (calcitonin gene-related

peptide - CGRP) e expressa receptores TrkA para o fator de crescimento do

nervo (nerve growth factor – NGF). Essas fibras, denominadas fibras C

peptidérgicas, fazem conexões com neurônios da lâmina mais externa do corno

dorsal da medula (especialmente na lâmina I) (CUELLO et al.,1993; AVERIL et

al., 1995). As fibras A também compõem um grupo heterogêneo, cujos

terminais sinápticos projetam-se até a porção mais externa da lâmina II além

de porções mais profundas do corno dorsal da medula espinhal (lamina V).

Tais fibras podem ser divididas em Tipo I e Tipo II, de acordo com o limiar de

estimulação necessário para promover a despolarização e ativação das

mesmas. As fibras do Tipo I respondem tanto a estímulos mecânicos quanto a

estímulos químicos nocivos, mas apresentam alto limiar de estimulação para o

calor (>50ºC). Essas fibras são, no entanto, susceptíveis à sensibilização, caso

o estímulo térmico se mantenha, passando a apresentar menor limiar de

estimulação e a responder a menores temperaturas. As fibras do Tipo II

apresentam um limiar de ativação para calor muito menor do que as do Tipo I,

mas possuem um alto limiar para estímulos mecânicos (revisado por

BASBAUM et al, 2009). A organização da medula espinhal em lâminas

______________________________________________Revisão Bibliográfica

compostas por fibras distintas quanto às características moleculares e

eletrofisiólogicas reflete o papel das diferentes porções da medula na condução

de diferentes estímulos, por exemplo, análises eletrofisiológicas mostram que

os neurônios presentes na lâmina I são geralmente responsivos a estímulos

nocivos (via fibras C e A), enquanto que os neurônios das lâminas III e IV são

primariamente responsivos a estimulação inócua (via fibras A). Já a porção

mais profunda do corno dorsal da medula espinhal, a lâmina V, recebe

projeções convergentes de neurônios que respondem a estímulos nocivos (via

fibras A) e daqueles que reconhecem estímulos inócuos (via fibras A)

(BASBAUM et al, 2009). Cabe salientar que a porção mais ventral (ou externa)

da lamina II, que recebe predominantemente projeções de fibras C não

peptidérgicas, é caracterizada pela presença de interneurônios que expressam

a isoforma gamma da proteína cinase C (gamma isoform of protein kinase C -

PKC), implicada na dor neuropática causada por lesão nervosa periférica

(MALMBERG et al., 1997b), além da proteína cinase dependente de cálcio

calmodulina II (calcium/calmodulin-dependent protein kinase - CaMKII), co-

localizada com os receptores opióides MOR (também referidos como µ),

sabidamente envolvidos em processos nociceptivos (BRÜGGEMANN et al.,

2000). Os nociceptores apresentam, ainda, a peculiaridade de serem formados

por neurônios pseudo-unipolares, cujos terminais periféricos e centrais

emanam de um mesmo axônio. Essa característica permite que as proteínas

sintetizadas no DRG sejam expressas tanto na periferia como nos terminais

sinápticos centrais e facilita a comunicação entre ambos os terminais (revisado

por HUNT E MANTYH, 2001).

______________________________________________Revisão Bibliográfica

Os terminais sinápticos centrais dos nociceptores fazem conexão com

neurônios de segunda ordem (neurônios de projeção), localizados

especialmente nas lâminas I-II e V da medula espinhal, pela liberação de

neurotransmissores, como o glutamato e a substância P (revisado por

BASBAUM et al., 2009). Essa conexão está, no entanto, sujeita ao governo de

interneurônios inibitórios e excitatórios (localizados na lâmina II, ou substância

gelatinosa) que podem inibir ou fortalecer tal sinapse, causando,

respectivamente, a inibição ou a exacerbação do impulso nociceptivo (GU et

al., 1996; MILLAN, 1999; YASAKA et al., 2010). Uma vez estimulados, os

neurônios de segunda ordem irão ativar, conforme a sua localização no corno

dorsal da medula espinhal, vias paralelas que irão distribuir informações para

circuitos supraespinhais responsáveis pela produção das dimensões sensoriais

(discriminativa) e afetiva/motivacionais (descontentamento) da dor (HUNT e

MANTYH, 2001; PRICE, 2002).

A via espino-talâmica clássica origina-se na lâmina II da medula espinhal

e se estende até o tálamo. No tálamo, neurônios de terceira ordem enviam

terminações ao córtex somatosensorial, onde ocorre a discriminação do

estímulo. A via espino-talâmica clássica está anatomicamente interconectada

com estruturas límbicas através da via somatosensorial córtico-límbica. Essa

via forma conexão das áreas somatosensoriais do córtex (S

e S

) com áreas

corticais parietais posteriores e com o córtex insular. O córtex insular envia

eferências para estruturas como amígdala, córtex perirrinal e hipocampo, que

conferem o caráter emocional à dor (FRIEDMAN et al., 1986). A via espino-

talâmica córtico-límbica converge para as mesmas estruturas límbicas e

subcorticais que são diretamente acessadas por outra via ascendente da dor, a

______________________________________________Revisão Bibliográfica

via espino-parabraquial-amigdalóide (BERNARD et al., 1989; BERNARD e

BESSON, 1990). A via espino-parabraquial-amigdalóide origina-se na lâmina I

da medula espinhal e conecta-se com a área parabraquial. Os neurônios da

área parabraquial, que são ativados especificamente por estímulos

nociceptivos, enviam projeções para a amígdala, hipotálamo, substância

cinzenta periaquedutal (PAG) e medula oblonga ventrolateral (GAURIAU e

BERNARD, 2002). O núcleo central da amígdala, bem como o hipotálamo,

envia eferências para a PAG, que através de conexões com neurônios da

porção rostral da medula oblonga ventromedial (RVM), modula a via

descendente da dor (FIELDS, HEINRICHER E MASON, 1991).

Desde a descoberta, por Wall (1967), de que os neurônios presentes

nas lâminas I, II e IV-VI da medula espinhal estão sujeitos à modulação por

estruturas supra-espinhais, o entendimento do circuito modulatório

descendente da dor tem progredido drasticamente. Esse circuito é formado por

conexões de áreas encefálicas como o córtex cingulado anterior, regiões do

córtex pré-frontal, o hipotálamo e o núcleo central da amígdala com a PAG, no

mesencéfalo. A PAG, por sua vez, controla indiretamente a transmissão

nociceptiva no corno dorsal da medula através de conexões com neurônios da

RVM (revisado por FIELDS, 2004)

Uma das descobertas mais interessantes a respeito do circuito

modulatório da dor é que esse pode tanto facilitar quanto inibir a transmissão

nociceptiva (LIEBESKIND et al, 1973; URBAN et al., 1999a; 1999b; PORRECA

et al, 2002). Por exemplo, estimulação elétrica de diversas estruturas que

compõem esse circuito promove redução da dor (MAYER et al., 1971;

LIEBESKIND et al., 1973). Além disso, o circuito modulatório descendente

______________________________________________Revisão Bibliográfica

parece estar envolvido no efeito analgésico da morfina (MANNING et al., 1994;

McGARAUGHTY et al., 2004). Por outro lado, a estimulação de alguns

neurônios na RVM é capaz de exacerbar as respostas a estímulos nociceptivos

(URBAN et al., 1999a; NEUBERT et al., 2004). Além disso, estimulações

nocivas persistentes presentes, por exemplo, na inflamação ou na lesão de

nervos, produz um quadro de hiperalgesia que é revertido por lesões ou pela

inativação da RVM (MORGAN et al., 1994; URBAN et al., 1999b; PORRECA et

al, 2002). Portanto, a estimulação de neurônios da RVM pode tanto facilitar

como inibir a transmissão nociceptiva. Essa ação dual pode ser explicada pela

presença de duas subpopulações neuronais presentes na PAG e na RVM que

modulam de maneira oposta os estímulos nociceptivos periféricos. Através de

análises eletrofisiológicas de neurônios da RVM, constatou-se que a

estimulação térmica da cauda de ratos causava mudanças no disparo de duas

subpopulações de neurônios, enquanto um grupo parava, o outro grupo

aumentava o disparo imediatamente antes da resposta de retirada da cauda do

animal. A partir dessas observações, os diferentes grupos de neurônios foram

chamados células off e células on, respectivamente. Enquanto a ativação das

células on facilita a transmissão nociceptiva, a ativação das células off inibe tal

ação (FIELDS et al., 1983; FIELDS e HEINRICHER, 1985). Logo, o balanço

entre a ativação dessas duas subpopulações de neurônios determina a

resposta a um estímulo nocivo periférico.

A transmissão dolorosa se dá, portanto, sob o comando de fibras

especializadas em detectar e conduzir a informação nociceptiva da periferia até

o sistema nervoso central, onde vias anatômicas serão imediatamente ativadas

para levar a informação até áreas encefálicas que irão integrar a informação

______________________________________________Revisão Bibliográfica

nociceptiva com informações contextuais e com a memória e, dessa forma,

determinar a resposta individual de dor. Essa percepção supra-espinhal da dor

produz várias respostas autonômicas, neuroendócrinas e comportamentais

relacionadas à defesa (CRAIG, 2003), que são cruciais para a manutenção da

vida.

No entanto, em situações de nocicepção persistente, devido a não

resolução de uma lesão ou quando ocorre neuroplasticidade após uma lesão,

alterações fenotípicas e adaptações funcionais nas estruturas envolvidas na

transmissão e modulação da dor podem resultar na detecção inadequada do

estímulo nociceptivo, produzindo uma resposta de dor exagerada e persistente,

a dor crônica. A dor crônica, diferente da dor aguda com propósito protetor, é

uma doença debilitante com consequências nefastas. Seus portadores relatam

sensações que guardam pouca relação com a função primordial de defesa da

dor.

III.3. DOR CRÔNICA: SINALIZAÇÃO CELULAR E NEUROPLASTICIDADE

A lesão de tecidos ou nervos não apenas ativa as fibras nociceptivas

produzindo dor aguda como também inicia uma série de mudanças nas

propriedades dos nociceptores e dos neurônios da medula espinhal (revisado

por JI E WOOLF, 2001). Essas alterações, dependendo do grau e da duração,

podem gerar um estado de dor persistente, em que há uma resposta

exacerbada de dor a estímulos nociceptivos (hiperalgesia) ou inócuos

(alodínia), ou ainda podem produzir sensação de dor na ausência de qualquer

estímulo externo (dor espontânea) (BESSON, 1999). Esse estado álgico

______________________________________________Revisão Bibliográfica

alterado e persistente é chamado de dor crônica (ASHBURN E STAATS,

1999).

É considerada dor crônica toda a dor que persiste por mais de 12

semanas ou aquela que persiste além do tempo normal de cura (MERSKEY E

BOGDUK, 2002). A dor crônica é um problema de saúde grave, que afeta

centenas de milhões de pessoas por todo o mundo, altera funções físicas,

induz ansiedade e depressão, diminuindo a qualidade de vida e dificultando a

capacidade de trabalho, o que acarreta prejuízos substanciais para a

sociedade (RUSSO E BROSE, 1998; ASHBURN E STAATS, 1999; TANG E

CRANE, 2006).

As dores crônicas mais comuns incluem a dor neuropática – decorrente

de lesão ou doença que afete o sistema somatosensorial (como a neuropatia

diabética, a neuropatia causada por trauma e as neuropatias associadas a

doenças como o câncer e a AIDS) - e a dor inflamatória - causada por doenças

inflamatórias (como a artrite reumatóide, a gota e outras doenças reumáticas).

Nessas situações o processamento sensorial está alterado. Mudanças nas

propriedades eletrofisiológicas e moleculares dos neurônios dos nociceptores e

da medula espinhal produzem hipersensibilidade dolorosa, a hiperalgesia.

(BESSON, 1999; WOOLF e SALTER, 2000). A hiperalgesia é caracterizada por

um desvio para a esquerda na função que relaciona a magnitude do estímulo

com a intensidade da resposta de dor ao estímulo, ou seja, um estímulo

(doloroso ou não) passa a evocar uma resposta de dor mais intensa (LOESER

E TREEDE, 2008). A hiperalgesia é resultado da sensibilização neuronal. A

sensibilização dos neurônios dos nociceptores periféricos é chamada de

hiperalgesia primária, e está relacionada a uma diminuição no limiar de

______________________________________________Revisão Bibliográfica

estimulação e a uma resposta aumentada dos nociceptores a estímulos

aplicados na área da lesão. A sensibilização de neurônios da medula espinhal

é chamada de hiperalgesia secundária, caracterizada por atividade ectópica ou

espontânea aumentada de neurônios nociceptivos e de neurônios não

nociceptivos, como aqueles associados a sensações táteis, que adquirem a

capacidade de evocar dor (fenômeno chamado de alodínia). A hiperalgesia

primária é importante para a proteção e recuperação do tecido lesionado. A

hiperalgesia secundária está associada à cronicidade da dor.

A dor crônica está intimamente relacionada ao fenômeno de

sensibilização central (WOOLF, 1983). A sensibilização central envolve uma

série de eventos que acabam por alterar a neurobiologia da dor. Sob

circunstâncias patológicas em que a estimulação dos nociceptores encontra-se

aumentada, a transmissão nociceptiva é alterada: mudanças no potencial de

membrana celular levam à ativação de canais iônicos, como canais de sódio e

canais de cálcio dependentes de voltagem (CCDV), ocorrendo, então, um

aumento na liberação de neurotransmissores, como o glutamato, e a facilitação

da transmissão excitatória que, através da ativação de canais iônicos

dependentes de voltagem ou operados por ligantes e da liberação de estoques

intracelulares, produz elevação nos níveis de cálcio. O aumento da

concentração de cálcio intracelular inicia inúmeros processos de sinalização

celular. Dentre eles está a ativação direta ou indireta de uma série de proteínas

cinases que podem, em primeira instância, produzir alterações pós-

transcricionais, como a fosforilação de receptores e canais iônicos, e, em última

instância, induzir à síntese de novas proteínas envolvidas na transmissão

nociceptiva (WOOLF E THOMPSON, 1991; WOOLF E COSTIGAN, 1999;

______________________________________________Revisão Bibliográfica

revisado por JI E WOOLF, 2000). Tais eventos ocorrem em intervalos de

tempo precisos durante o desenvolvimento da hiperalgesia, e estão

diretamente relacionados a alterações drásticas no fenótipo celular (expressão

de neurotransmissores, enzimas, canais iônicos e receptores) e a mudanças

estruturais, como a perda de interneurônios espinhais, rearranjos inapropriados

de neurônios na medula espinhal e a proliferação de fibras simpáticas nos

gânglios sensoriais (WOOLF, SHORTLAND E COGGESHALL, 1992;

MCLACHLAN et al., 1993; MOORE, BABA e WOOLF, 2000; MOORE et al.,

2002). Essas mudanças não são uniformes e dependem do tipo e da etiologia

da dor (DRAY URBAN E DICKENSON, 1994).

Embora compartilhem de mecanismos em comum, a dor de origem

inflamatória e neuropática apresenta algumas características únicas. Por

exemplo, a sensibilização decorrente da ação de mediadores inflamatórios

como a bradicinina, a prostaglandina E

(PGE

), a serotonina e a histamina nos

nociceptores, embora presente na fase inicial da dor neuropática, é uma

característica que predomina na dor inflamatória (TAIWO E LEVINE, 1989;

1992; RUEFF E DRAY, 1993; MIZUMURA, 1997). Por outro lado, a lesão de

nervos periféricos produz atividade ectópica e espontânea de fibras sensoriais

(WALL E GUTNICK, 1974; WALL E DEVOR, 1983, revisado por WOOLF E

MANNION, 1999) e as torna sensíveis à estimulação pela noradrenalina

(McLACHLAN et al., 1993). Ademais, parece haver diferenças quanto à

participação de segundos mensageiros e de cascatas de sinalização celular na

geração da dor inflamatória e da dor neuropática (HUCHO E LEVINE, 2007). É

amplamente estudada a sinalização via adenosina 3',5'-monofosfato cíclico

(AMPc) e ativação de proteína cinase A (protein kinase A - PKA) na geração de

______________________________________________Revisão Bibliográfica

dor inflamatória (TAIWO et al., 1989; ALEY E LEVINE, 1999). Enquanto que a

dor neuropática parece estar mais atrelada à ativação de determinadas

isoformas da proteína cinase C (protein kinase C - PKC) (MAO et al., 1995;

MALMBERG et al., 1997b; OHSAWA et al., 2000; 2001; YAJIMA et al., 2003).

Por exemplo, em camundongos, a ablação do gene que codifica a isoforma

neuronal da PKA que contém a subunidade regulatória RI causa diminuição

na nocicepção evocada por inflamação, mas não altera a dor neuropática

desses animais (MALMBERG et al., 1997a). Ainda, embora determinadas

isoformas de PKC, como a isoforma epsilon (PKC), estejam envolvidas em

processos de dor inflamatória (CESARE et al., 1996; 1999; ALEY et al., 2000),

evidências apontam para uma ação quase que exclusiva da isoforma gama

(PKC) nos mecanismos de dor neuropática (MAO et al., 1995; MALMBERG et

al, 1997b; OHSAWA et al., 2001).

Tais diferenças justificam o uso de diferentes abordagens terapêuticas

no tratamento da dor crônica inflamatória e neuropática. Por exemplo, a

inibição da síntese de PGE

pelos antiinflamatórios não esteirodais (AINES) é

efetiva no tratamento da dor inflamatória mas não da neuropática. Ademais

quadros de dor inflamatória respondem bem à morfina, que apresenta até

mesmo eficácia analgésica superior nessas situações (STANFA E

DICKENSON, 1995; PRZEWŁOCKI E PRZEWŁOCKA, 2001; OBARA et al.,

2009). Já em situações de dor neuropática a morfina tem sua eficácia

drasticamente reduzida (PRZEWŁOCKI E PRZEWŁOCKA, 2001; OBARA et al.,

2009).

______________________________________________Revisão Bibliográfica

III.4. TRATAMENTO FARMACOLÓGICO: ANALGÉSICOS E ALVOS POTENCIAIS NO

TRATAMENTO DA DOR CRÔNICA

A maioria dos analgésicos utilizados na clínica hoje foram descobertos

de forma empírica, ou tiveram seu uso baseado na medicina popular. É o caso

das substâncias derivadas do ópio (morfina) e da casca do salgueiro (aspirina).

Atualmente, com a identificação dos mecanismos neurobiológicos responsáveis

por determinados tipos de dor, a descoberta de novos fármacos envolve a

busca por substâncias capazes de atuar especificamente em alvos moleculares

envolvidos na transmissão e modulação da dor crônica.

A identificação de moléculas cuja expressão ou função encontram-se

alteradas em situações de sensibilização central tem revelado novos alvos para

o tratamento da dor. Os receptores glutamatérgicos N-metil-D-aspartato

(NMDA) representariam alvos óbvios para o tratamento da dor crônica não

fosse sua expressão disseminada no SNC, que determina o aparecimento de

efeitos colaterais indesejados. (FELSBY et al., 1996; SCHOLZ E WOOLF,

2002). Portanto, uma alternativa conveniente para conter a sensibilização

central é a redução da transmissão glutamatérgica através da redução na

liberação de glutamato pela inibição de CCDV. De fato, drogas capazes de

bloquear CCDV tem demonstrado boa eficácia em testes pré-clinícos e clínicos

(MATTHEWS E DICKENSON, 2001; SNUTCH, 2005; YAKSH, 2006,

MATTHEWS et al., 2007; MCGIVERN, 2007; MENG et al., 2008). Ademais, a

expressão da subunidade regulatória 2, que modula a atividade desses

canais, está aumentada em neuropatias (GEE et al., 1996; LUO et al., 2001;

2002; NEWTON et al., 2001), achado que contribuiu consideravelmente para o

uso do fármaco gabapentina, e de seus congêneres (como a pregabalina),

______________________________________________Revisão Bibliográfica

originalmente desenvolvido para tratar convulsões, no tratamento da dor

neuropática (LUO et al., 2002; DOOLEY et al., 2007). Ainda, a inibição de

alterações pós-transcricionais pela inibição de proteínas cinases, como a PKA,

PKC, CaMKII parece ser uma estratégia terapêutica interessante (TANG,

SHUKLA E WANG, 2006b; CHEN et al., 2009). Por outro lado, a modulação de

sistemas envolvidos no controle da transmissão nociceptiva, como o sistema

opióide, continua sendo uma alternativa interessante para o tratamento da dor

crônica (BALLANTYNE E MAO, 2003; ROSENBLUM et al., 2008).

III.4.1. O SISTEMA OPIOIDE

O sistema opióide consiste de três receptores MOR, DOR E KOR

(também referidos como mu - µ, delta -  e kappa - ) e seus ligantes

endógenos. O estudo do sistema opióide deriva do milenar uso do ópio,

extraído das sementes da papoula – Papaver somniferum – cujo principal

ingrediente ativo é a morfina (SNYDER E PASTERNAK, 2003).

O sítio de ligação para opióides foi identificado em 1973, por meio de

ensaios de ligação específica, em preparação de membrana de cérebro de

ratos, utilizando como radioligante a naloxona tritiada (PERT E SNYDER, 1973

- 14). Dois anos mais tarde, Hughes e Kosterlitz isolaram e sequenciaram os

primeiros ligantes endógenos, dois pentapeptídeos, Tyr-Gly-Gly-Phe-Met e Tyr-

Gly-Gly-Phe-Leu (HUGHES E KOSTERLITZ, 1975), que foram batizados, pelos

seus descobridores, „encefalinas‟ – do grego, „na cabeça‟. Ironicamente mais

tarde se soube que a maior concentração de encefalina do corpo está situada

na glândula adrenal (SNYDER E PASTERNAK, 2003). Muitos outros ligantes

______________________________________________Revisão Bibliográfica

endógenos foram identificados na sequência. Encefalinas, dinorfinas, -

endorfinas e outros peptídeos, todos contendo em comum a seqüência N-

terminal, Tyr-Gly-Gly-Phe –[Met/Leu], responsável pela interação com os

receptores opióides (AKIL et al., 1998).

Os receptores opiódes integram a família dos receptores de sete

domínios transmembrana acoplados à proteína G (SHACHAM et al., 2001). A

ativação desses receptores, acoplados à proteína G inibitória (Go/Gi) - cuja

ativação causa a inibição de CCDV e a ativação de canais de potássio

retificadores de influxo de corrente (GIRK), resultando na redução da

excitabilidade neuronal - é responsável pela ação antinociceptiva dos seus

agonistas, como a morfina (LAW, WONG E LOH, 2000).

Os receptores opióides são amplamente expressos no sistema nervoso

central e periférico, e regulam diversas funções fisiológicas, como a respiração,

o trânsito gastro-intestinal e respostas imunológicas e endócrinas (LE

MERRER et al., 2009). Sobretudo, esses receptores desempenham um papel

central na dor. Técnicas autoradiográficas, de imunohistoquímica e de imagem

permitiram o mapeamento dos receptores opióides em diversas áreas

envolvidas na transmissão e modulação da dor (PERT, KUHAR E SNYDER,

1976; SHFROST et al., 1985; BESSE et al., 1990a; 1990b). Na medula

espinhal, os receptores MOR, DOR e KOR são expressos, em grande parte,

nas lâminas mais superficiais (I e II), sendo que os receptores MOR

correspondem a maioria (70%). Os receptores MOR são predominantemente

expressos, em torrno de 70%, nos terminais pré-sinapticos de fibras C e A,

enquanto que os 30% restantes são expressos em interneurônios e neurônios

de projeção (BESSE et al., 1990a; 1990b). Em áreas supraespinhais, como a

______________________________________________Revisão Bibliográfica

PAG e a RVM, a expressão de receptores opióides está relacionada com a

modulação da dor através da regulação do sistema descendente (FIELDS,

2004). Além disso, estruturas límbicas como a amígdala, de suma importância

na modulação das emoções, exibem uma grande densidade de receptores

opióides (PERT, KUHAR E SNIDER, 1976; HILLER et al., 1973). Da mesma

maneira, a porção medial do tálamo, que manda informações a respeito do

componente emocional da dor para áreas corticais, contém uma alta

concentração desses receptores, apresentando aproximadamente 4 vezes

mais receptores opióides do que a porção lateral do tálamo, envolvida no

processamento de sensações táteis não dolorosas (HILLER, PEARSON E

SIMON, 1973). A importância do sistema opióide no controle da dor é também

evidenciada em estudos com animais knockout em que foi evidenciada a

participação dos receptores MOR, DOR e KOR e de seus ligantes endógenos

na transmissão nociceptiva e confirmado o papel essencial dos receptores

MOR nos mecanismos de analgesia e tolerância à morfina (revisado por

KIEFFER E GAVÉRIAUX-RUFF, 2002).

Logo, não é por acaso que poucos analgésicos são tão potentes e

eficazes quanto a morfina. O uso de opióides como analgésicos é, no entanto,

anterior à descoberta e caracterização dos seus receptores, data mais de 2000

anos, e até hoje a morfina continua sendo o tratamento de escolha para dores

moderadas e intensas, como a dor relacionada ao câncer (FOLEY, 1985;

BRUERA et al., 2004; ROSENBLUM et al., 2008). Uma das razões para tal

escolha é que, além de reduzir a transmissão nociceptiva, a morfina também

produz bem-estar e euforia, promovendo o completo alívio da dor. Apesar

disso, o uso crônico desse e de outros opióides para o tratamento de dores

______________________________________________Revisão Bibliográfica

crônicas é limitado pelo desenvolvimento de tolerância analgésica (CORBETT

et al., 2006; PUD et al., 2006; BALLANTYNE E SHIN, 2008).

Além do mais, o uso prolongado de opióides pode, paradoxalmente,

produzir hiperalgesia (ARNER E MEYERSON, 1988; MAO, PRICE E MAYER,

1994; MAO, 2002; PUD et al., 2006; CHEN et al., 2009). A hiperalgesia

induzida por opióides parece ser resultado da plasticidade de neurônios do

corno dorsal da medula espinhal (MAYER et al., 1999; MAO E MAYER, 2001).

Um conceito que tem ganho força recentemente é que o estado hiperalgésico

decorrente da administração prolongada de opióides seria responsável pela

diminuição do efeito da morfina com o seu uso crônico (OSSIPOV, 2003). Da

mesma forma, o estado hiperalgésico decorrente da neuropatia seria

responsável pela diminuição da eficácia da morfina na dor neuropática (MAO,

PRICE E MAYER, 1995; MAO E MAYER, 2001). A tolerância a opióides seria,

portanto, conseqüência da sensibilização central.

Diversos estudos tem mostrado que a hiperalgesia induzida por opióides

compartilha de muitos mecanismos de neuroplasticidade comuns à neuropatia

(MAO et al., 1995b; MAO, 1999; MAO, PRICE E MAYER, 1995; MAYER et al.,

1999) e guarda semelhanças com a dor neuropática, apresentando-se como

dor em choque e queimação, hiperestesia e hiperalgesia, que comumente se

manifesta em áreas do corpo não relacionadas primariamente à queixa de dor

que resultou na prescrição de opióides (revisado por BANNISTER E

DICKENSON, 2010). De fato, a dor neuropática apresenta, por si só, tolerância

a opióides (CHANG, CHEN E MAO, 2007). O tratamento de escolha para a

maioria dos casos de dor neuropática é constituído de associações de

medicamentos como anticonvulsivantes, antidepressivos, anestésicos locais e

______________________________________________Revisão Bibliográfica

alguns opióides (MENDEL E SAHENK, 2003; O'CONNOR E DWORKIN, 2009).

No entanto, na maioria das vezes, esse tratamento não é satisfatório pois não

proporciona o alívio completo da dor (GALLUZZI, 2007).

No final da década de 70, estudos com -conotoxinas obtidas do veneno

de caramujos marinhos do gênero Conus (OLIVERA et al., 1985)

impulsionaram a pesquisa básica e clínica de novos tratamentos para a dor

crônica. Após mais de duas décadas de pesquisa, a versão sintética da -

conotoxina MVIIA extraída do veneno do Conus magus, a ziconotida, foi

aprovada para uso em pacientes com dor crônica refratária a outros

tratamentos. A ziconotida representa a primeira toxina peptídica extraída de

veneno animal em uso na clínica para o tratamento da dor.

III.4.2. ZICONOTIDA - DO CONUS MAGUS PARA A CLÍNICA

A -conotoxina MVIIA foi originalmente descoberta pelo grupo de

Baldomero Olivera, da Universidade de Utah, nos Estados Unidos, em 1979.

Através da administração intracerebroventricular de toxinas provenientes de

moluscos marinhos do gênero Conus, foram identificadas toxinas com ação

neurotóxica em camundongos. A ação neurotóxica era manifestada como

tremores, que iniciavam poucos minutos após a administração

intracerebroventricular e cuja duração variava de acordo com a dose

administrada (doses > 2 nmol/camundongo produziam tremores que duravam

até 5 dias!). Essas toxinas, chamadas então de “shaker peptides” foram

posteriormente caracterizadas como bloqueadores de CCDV (OLIVERA et al.,

1985; OLIVERA et al., 1987).

______________________________________________Revisão Bibliográfica

A -conotoxina MVIIA é formada por uma cadeia de 25 aminoácidos

interligados através de 3 pontes dissulfeto formadas por resíduos de cisteína

(Cys; C), que estabilizam e definem a estrutura tridimensional do peptídeo

(CHUNG et al., 1995; PRICE-CARTER et al., 1998). Tal estrutura apresenta

uma porção na forma de uma dobradura compacta, formada pela ponte cistina

(Cys-Cys) entre os resíduos Cys 8 e Cys15, contendo um resíduo de tirosina

(Tyr ou Y) na posição 13, que é fundamental para a sua ligação em CCDV

(OLIVERA et al., 1987).

Estudos pré-clinicos demonstraram que a administração intratecal da



conotoxina MVIIA causa antinocicepção em modelos animais de dor crônica,

inclusive, em alguns casos, com potência superior à morfina (BROSE et al.,

1997). A atividade antinociceptiva observada em estudos com animais permitiu

que a ziconotida fosse testada em ensaios clínicos nos Estados Unidos e na

Europa para o tratamento de dores crônicas (SNUTCH, 2005). A natureza

peptídica e o aparecimento de efeitos adversos (relacionados a sua ação no

sitema simpático) limitam a administração sistêmica da ziconotida (MOLINSKI

et al., 2009), que deve ser administrada por via intratecal, em regime de infusão

lenta e contínua, com auxílio de bomba de infusão (STAATS, YEARWOOD E

CHARAPATA, 2004; RAUCK et al, 2006; WALLACE, 2008). Em 22 de

dezembro de 2004, a ziconotida (Prialt



) foi aprovada pelo Food and Drug

Administration (FDA) e dois meses depois pela European Medicines Agency

(EMEA) para o tratamento de dores intensas, refratárias à morfina, em

pacientes que requerem analgesia intratecal. A ação analgésica da ziconotida

está relacionada ao bloqueio de CCDV do tipo N.

______________________________________________Revisão Bibliográfica

III.4.3. CANAIS DE CÁLCIO DEPENDENTES DE VOLTAGEM

Os CCDV são classificados de acordo com suas propriedades biofísicas

e farmacológicas em canais tipo L, N, P, Q , R (ativados por alta voltagem:

~ -30 mV) e T (ativados por baixa voltagem: ~ -60 mV). Os CCDV são ainda

agrupados em três famílias, de acordo com o gene que codifica sua

subunidade 1, que forma o poro do canal. Os genes da família Cav1 codificam

canais do tipo L (Cav1.2, Cav1.3 e Cav1.4); os da família Cav3 codificam os

canais do tipo T (Cav3.1, Cav3.2 e Cav3.3) e os da família Cav2 codificas os

canais do tipo N (Cav2.2), R (Cav2.3) e P/Q, sendo que os canais do tipo P e Q

são variantes de splicing do gene Cav2.1 (BOURINET et al., 1999;

CATTERALL 2000; EVANS E ZAMPONI, 2006). A subunidade formadora do

poro permeável a íons cálcio, 1, compreende 4 domínios homólogos (I-IV),

com 6 segmentos transmembrana (1-6) cada um. O segmento transmembrana

4, rico em resíduos de arginina, é o sensor de voltagem do canal, cujo poro é

formado pela união dos segmentos transmembrana 5 e 6 dos 4 domínios.

Tanto a porção N- quanto a C-terminal são citoplasmáticas. A subunidade 1

dos membros da família Cav1 e Cav2 está associada às subunidades

auxiliares  (codificada por 4 genes diferentes: 

-

), 2 (codificada por 4

genes diferentes: 2-1 - 2-4) e, possivelmente, à subunidade  (codificados

por 8 genes diferentes: 

- 

) (EVANS E ZAMPONI, 2006), que regulam a

expressão e as propriedades biofísicas desses canais (ARIKKATH E

CAMPBELL, 2003; KLUGBAUER et al., 2003). Além disso, as correntes de

cálcio, especialmente as do tipo N e P/Q, podem sofrer modulação pela

proteína G (DEWAARD et al., 1997; ZAMPONI et al., 1997; TEDFORD E

______________________________________________Revisão Bibliográfica

ZAMPONI, 2006), pela calmodulina (LEE et al, 1999; HALLING et al., 2006) e

por proteínas cinases (SWARTZ, 1993; STEA et al., 1995; JIANG et al., 2008).

Os CCDV se distribuem no sistema nervoso de acordo com as suas

propriedades biofísicas. Os membros da família Cav2 são exclusivamente

neuronais. Os CCDV do tipo N, P/Q e, em menor grau, do tipo R estão

localizados em terminais pré-sinápticos, onde interagem com proteínas

envolvidas na exocitose de vesículas sinápticas (JARVIS E ZAMPONI, 2001;

MOCHIDA et al., 2003; revisado por ZAMPONI, 2003,). A ativação desses

canais promove a liberação de neurotransmissores em várias áreas do sistema

nervoso central, inclusive naquelas envolvidas na transmissão e modulação

nociceptiva (WESTENBROEK et al., 1998; KNIGHT et al., 2002; HEINKE et al.,

2004; MURAKAMI et al., 2004). Além disso, esses CCDV, estão envolvidos na

neuroplasticidade que ocorre no sistema nervoso durante a dor crônica

(ALTIER E ZAMPONI, 2004). De particular relevância, os CCDV localizados em

terminais pré-sinápticos são alvo da porção  do complexo trimérico () da

proteína G acoplada aos receptores MOR. O bloqueio das correntes de cálcio

pela porção , juntamente com a ativação de canais de potássio, promove a

diminuição da hiperexcitabilidade celular e a conseqüente ação analgésica da

morfina (SWARTZ, 1993; DEWAARD et al., 1997; ZAMPONI et al., 1997;

SOLDO E MOISES, 1998). Ademais, os CCDV também parecem estar

envolvidos no desenvolvimento de tolerância a opióides (WELCH E OLSON,

1991; MICHALUK et al., 1998; DOGRUL et al., 2005; MENG et al., 2008).

O envolvimento dos CCDV do tipo N, P/Q e R na transmissão e

modulação nociceptiva é evidenciado através do uso in vivo de toxinas

peptídicas bloqueadoras desses canais. A participação dos CCDV do tipo N em

______________________________________________Revisão Bibliográfica

modelos animais de dor tem sido copiosamente estudada através da

administração intratecal de -conotoxinas extraídas do veneno de moluscos

marinhos do gênero Conus (GVIA, GVID, MVIIA) (revisado por LEWIS, 2009).

Ainda que em menor número, estudos com bloqueadores de canais do tipo P/Q

e do tipo R também demonstram a importância desses canais na transmissão

nociceptiva em algumas situações, como por exemplo na dor neuropática

(BAYER et al., 2004; SAEGUSA et al., 2000; LUVISETTO et al., 2006;

MATTHEWS E DICKENSON, 2001; MATTHEWS et al., 2007).

A geração de animais nocaute para os CCDV do tipo N (SAEGUSA et

al., 2001; SAEGUSA, MATSUDA E TANABE, 2002), P/Q (JUN et al., 1999;

LUVISETTO et al. 2006) e R (SAEGUSA et al., 2000; SAEGUSA, MATSUDA E

TANABE, 2002) também contribuíram para a análise dos diferentes canais na

transmissão dolorosa. De particular importância, a ablação de qualquer um dos

genes da família Cav2 - Cav2.1, Cav2.2 ou Cav2.3 - que codificam a

subunidade 1 dos canais do tipo P/Q, N ou R, respectivamente, reduz a

hiperalgesia em modelo animal de neuropatia.

Em humanos, o bloqueio de canais do tipo N, pela administração

intratecal de ziconotida, mostrou ser eficaz no tratamento de dores crônicas

neuropáticas (WALLACE et al., 2006; RAUCK et al., 2006) e relacionadas ao

câncer, de difícil tratamento, inclusive em casos de dor refratária à analgesia da

morfina (STAATS, YEARWOOD E CHARAPATA, 2004). No entanto, a

administração intratecal de ziconotida produz efeitos adversos tanto em

animais como em humanos. Em animais são observadas disfunções motoras,

como tremores e movimento serpenteado de cauda (OLIVERA et al., 1985;

MALMBERG E YAKSH, 1994; 1995). Em humanos, a administração intratecal

______________________________________________Revisão Bibliográfica

de ziconotida produz, muitas vezes, efeitos relacionados à sua ação no sistema

nervoso central, como vertigens, confusão mental, alucinações, alterações de

humor, ataxia, alterações na marcha, náusea e vômitos (PENN E PAICE, 2000;

WALLACE et al., 2006; 2008). De maneira interessante, o bloqueio de CCDV

pela ziconotida não produz os sintomas relacionados ao bloqueio desses

canais por drogas opióides, como depressão respiratória, constipação, euforia

ou sedação (WALLACE et al., 2006). Ainda, a administração prolongada de

ziconotida não causa tolerância analgésica (STAATS, YEARWOOD E

CHARAPATA, 2004).

A ziconotida foi a primeira droga bloqueadora de CCDV aprovada para

uso clínico no tratamento de dores crônicas e representa uma forma inovadora

de intervir nos mecanismos relacionados a dores crônicas resistentes à

analgesia da morfina. No entanto, a sua reduzida janela terapêutica limita o

tratamento de muitos pacientes. Logo, estratégias terapêuticas que minimizem

o desenvolvimento de efeitos adversos decorrentes do uso da ziconotida, ou,

ainda, a descoberta de novos bloqueadores de CCDV com maior índice

terapêutico são alternativas interessantes para o aprimoramento do tratamento

da dor crônica. Venenos de animais peçonhentos são considerados fontes

valiosas para a busca dessas moléculas.

III.5. VENENO DE ARANHAS: FONTE DE TOXINAS PEPTÍDICAS BIOLOGICAMENTE

ATIVAS

O veneno de aranhas é constituído por uma mistura complexa de

substâncias biologicamente ativas. Eles contêm moléculas orgânicas de baixo

peso molecular (<1000 Da), como acilpoliaminas, uma variada gama de

______________________________________________Revisão Bibliográfica

polipeptídeos com peso molecular entre 3000 e 10000 Da e proteínas de alto

peso molecular (>10000 Da). Os polipeptídeos, juntamente com as

acilpoliaminas, representam o principal arsenal tóxico das aranhas, utilizados

para paralisar e capturar as suas presas (ESCOUBAS et al., 2000). Essas

moléculas, embora originalmente destinadas a atingir alvos moleculares em

insetos, também reconhecem muitos receptores e canais iônicos de mamíferos,

representando, por esse motivo, um arsenal farmacológico bastante

interessante.

Os peptídeos provenientes do veneno de aranhas apresentam

comumente uma estrutura tridimensional classificada como inhibitory cystine

knot (ICK), formada por folhas  antiparalelas estabilizadas por um “nó” de

cistina. Para tanto, a sequência de aminoácidos deve conter resíduos de Cys

localizados em pontos estratégicos para estabelecer duas pontes dissulfeto

como o ponto de sustentação central da molécula tridimensional, e uma

terceira ponte cistina unindo a extremidade N-terminal com a superfície da alça

(ou „loop‟) resultante da dobradura da sequência primária, de acordo com o

esquema mostrado na Figura 1 (NORTON E PALLAGHY, 1998; ESTRADA et

al., 2007). A sequência de aminoácidos exposta na alça externa da molécula é

responsável pela ligação em diferentes canais iônicos (como canais de K

, Na

e Ca

, por exemplo). Essa sequência é também capaz de reconhecer regiões

além do poro do canal iônico e, dessa maneira, causar alterações nas

propriedades cinéticas voltagem-dependentes do canal (ESTRADA et al.,

2007). Coincidentemente, a estrutura da -conotoxina MVIIA apresenta

estrutura tridimensional similar a de toxinas peptídicas presentes no veneno de

______________________________________________Revisão Bibliográfica

aranhas, contendo o mesmo padrão de pontes dissulfeto (CHUNG et al., 1995;

MCGIVERN JG, 2007).

Além disso, algumas toxinas peptídicas isoladas de venenos de aranhas

também bloqueiam os CCDV (ESCOUBAS et al., 2000). A aranha Agelenopsis

aperta foi a primeira fonte de toxinas bloqueadoras de canais de cálcio

identificada em venenos de aranha (ADAMS et al., 1993; ADAMS E OLIVERA,

1994). Conhecidas como ω-agatoxinas, a toxinas da Agelenopsis aperta são

capazes de bloquear canais de cálcio do tipo L, P, Q e N, com alta afinidade e

seletividade variável (OLIVERA et al., 1994). Em seguida, uma grande

variedade de toxinas peptídicas bloqueadoras de CCDV foi descrita, como as

-phonetoxinas isoladas do veneno da aranha Phoneutria nigriventer

(REZENDE et al., 1991; CORDEIRO et al., 1993; GOMEZ et al., 1995; PRADO

et al., 1996; GUATIMOSIN et al., 1997MIRANDA et al., 1998; CASSOLA et al.,

1998; LEÃO et al., 2000; VIERA et al., 2005), a ω-gramotoxina SIA isolada do

veneno da tarântula Grammostola spatulata (LAMPE et al., 1993), a toxina

SNX-325, isolada do veneno da aranha Segestria florentina (NEWCOMB et al.,

1995), a toxina DW13.3, isolada do veneno da Filistata hibernalis (SUTTON et

al., 1998). Uma importante descoberta proveniente do veneno da tarântula

Hysterocrates gigas, foi uma toxina bloqueadora seletiva de CCDV do tipo R,

chamada de SNX-482 (NEWCOMB et al., 1998), que permitiu a caracterização

de correntes do tipo R em vários sistemas, e proveu ferramenta para elucidar o

envolvimento dos canais codificados pelo gene Cav2.3 (PIEDRAS-RENTERÍA

E TSIEN, 1998) em modelo animal de dor neuropática (MATTHEWS et al.,

2007; YANG E STEPHENS, 2009).

______________________________________________Revisão Bibliográfica

Devido ao grande e variado número de compostos farmacologicamente

ativos presentes no seu veneno, as aranhas são consideradas por muitos

aracnólogos “farmacêuticas de oito pernas” (ESCOUBAS et al., 2006;

ESTRADAS, VILLEGAS E CORZO, 2007), daí o crescente interesse da

academia e da indústria farmacêutica no veneno dessas preciosidades

científicas.

Figura 1. Sequência de aminoácidos da phonetoxina Tx3-3 e da -conotoxina MVIIA e

estrutura tridimensional determinada pelo padrão inhibitory cystine knot – ICK.

III.5.1. Phoneutria nigriventer, A ARANHA ‘ARMADEIRA’ E SUAS PHONETOXINAS

“O povo conhece-a por „armadeira‟ pois, quando ameaçada por um

animal ou uma pessoa, costuma „armar-se para o bote‟, isto é, coloca-se

rapidamente em pé, encolhe os dois últimos pares de pernas como dois feixes

de molas enrolados, eleva seu corpo em posição quase vertical, ergue as patas

dianteiras e distende suas presas de veneno. Nessa „defesa armada‟ observa

atentamente todos os movimentos de seu inimigo, acompanhando-o com o

balançar de seu corpo. Ai do incauto ou desavisado que, sem vê-la, lhe

chegasse a uma distância de vinte ou trinta centímetros! Ela saltaria

______________________________________________Revisão Bibliográfica

incontinenti, encravando ferozmente na vítima seus curvos e pontiagudos

„punhais‟ veneníferos.”

A aranha Phoneutria nigriventer, juntamente com as aranhas

classificadas sob os gêneros Latrodectus (viúva negra) e Loxosceles (aranha

marrom), integra o grupo das espécies de aranhas consideradas perigosas. O

próprio nome Phoneutria, que quer dizer “feroz matadora”, já define o quão

perigosa é esta aranha (PERTY, 1833 – revisado por BRASIL E VELLARD,

1985).

A Phoneutria nigriventer é comumente encontrada no sul e sudeste do

Brasil. É um ser solitário, irascível – não tolerando nem mesmo a presença de

companheiras da mesma espécie, errante – não constrói teia, seu sucesso

como predadora se dá pela potência do seu veneno, crepuscular ou noturna –

esconde-se durante o dia em locais escuros, entre folhagem de arbustos,

dentro das bainhas das bananeiras, não raro nos sapatos, daí a ocorrência de

um grande número de acidentes com essa aranha. A picada de uma armadeira

é muito dolorosa. A dor é imediata, violenta, local no princípio, irradiando-se por

todo o membro após alguns minutos e persistindo intensa durante horas. Em

adultos, em geral, não é letal. Mas dependendo da quantidade de veneno

injetado e do peso da vítima – crianças são mais suscetíveis, os sintomas

evoluem além da dor, manifestando-se como febre, sudorese, câimbras,

tremores, paralisia espástica, priapismo, arritmias, distúrbios visuais e, em

casos raros, morte (BRAZIL e VELLARD,1925; SCHEMBERG e LIMA, 1966;

LUCAS, 1998).

Trecho retirado do livro “Acúleos que matam”, Livraria Kosmos Editora, São Paulo, 1980, p.

35- escrito por Wolfgang Bücherl, que narra a sua experiência com animais peçonhentos no

Instituto Butantã.

______________________________________________Revisão Bibliográfica

O poder tóxico do seu veneno se dá pelas diversas toxinas, capazes de

interagir com canais iônicos, que o compõe. A porção tóxica do veneno é

comumente dividida em 4 frações: PhTx1, PhTx2, PhTx3 e PhTx4 (REZENDE

et al., 1991; CORDEIRO et al., 1990; 1992; 1993; FIGUEIREDO et al., 1995;

GOMEZ et al., 2002). À parte a ação em canais de sódio, mediada por toxinas

presentes na fração PhTx2 (ARAÚJO et al., 1993), que está diretamente

relacionada à dor evocada pela inoculação do veneno, grande parte das ações

neurotóxicas do veneno da armadeira são atribuídas às toxinas presentes na

fração PhTx3 (CORDEIRO et al., 1993; GOMEZ et al., 2002). A administração

intracerebroventricular dessa fração produziu paralisia flácida em

camundongos (REZENDE et al., 1991), o que mais tarde foi atribuído à sua

ação inibitória na liberação de neurotransmissores (GOMEZ et al.,1995;

PRADO et al., 1996). A fração PhTx3 é composta por seis toxinas peptídicas

(Tx3-1 a Tx3-6) que atuam quase que exclusivamente em canais de cálcio

(Cordeiro, 1993). Exceto pela Tx3-1, que bloqueia correntes de potássio tipo IA

(KUSHMERICK et al., 1999), as demais toxinas dessa fração inibem diferentes

tipos de correntes de cálcio (PRADO et al., 1996; GUATIMOSIN et al., 1997;

KALAPOTHAKIS ET AL., 1998; LEÃO et al., 2000; DOS SANTOS et al., 2002;

VIEIRA et al., 2005;). Uma delas, originalmente chamada de Tx3-6 e hoje

conhecida como Ph1, bloqueia correntes de cálcio do tipo N (VIEIRA et al.,

2006) e é tão eficaz quanto a -conotoxina MVIIA em causar antinocicepção

em modelos animais de dor inflamatória e neuropática, porém com melhor

janela terapêutica que a conotoxina (SOUZA et al 2008). A toxina Tx3-3,

também presente na fração PhTx3 do veneno da aranha Phoneutria

nigriventer, é o alvo da presente tese.

______________________________________________Revisão Bibliográfica

A toxina Tx3-3 foi originalmente isolada por Cordeiro e colaboradores,

em 1993. Foi uma das primeiras toxinas da fração PhTx3 que teve sua ação

farmacológica estudada (GOMEZ et al., 2002). A Tx3-3 bloqueia correntes de

cálcio em terminais pré-sinápticos e inibe a liberação de glutamato em

preparações de sinaptossoma de encéfalo de ratos (PRADO et al., 1996;

GUATIMOSIN et al., 1997). Essas ações são mediadas pelo bloqueio de canais

de cálcio ativados por alta voltagem, descrito por LEÃO e colaboradores em

2000, que, por esse motivo, chamaram a Tx3-3 de -PhTx3-3. A Tx3-3

bloqueia os CCDV de maneira não seletiva, inibindo preferencialmente

correntes do tipo P/Q e R (LEÃO et al., 2000).

A toxina Tx3-3 foi posteriormente clonada, por Cardoso e colaboradores

(2003), e teve sua seqüência de aminoácidos deduzida:

GKCADAWESCDNYPCCVVNGYSRTCMCSANRCNCDDTKTLREHFG.

A seqüência de aminoácidos da Tx3-3 prediz uma estrutura tipo ICK e

apresenta um resíduo de tirosina (Y) na posição 13, da mesma maneira que a

-conotoxina MVIIA e a -conotoxina MVIIC (também isolada do veneno do

Conus magus, que bloqueia CCDV do tipo P/Q e N, de forma não seletiva:

>P/Q > N - HILLYARD et al., 1992).

A toxina Tx3-3 apresenta, portanto, características que a tornam um

peptídeo em potencial para o desenvolvimento de novos fármacos analgésicos.

Assim, o presente estudo foi realizado com o intuito de avaliar os efeitos

antinociceptivo e adversos da toxina Tx3-3 em camundongos e ratos

submetidos a modelos experimentais de dor.

_____________________________________________________Material e Métodos

IV. MATERIAL E MÉTODOS

_____________________________________________________Material e Métodos

IV. MATERIAL E MÉTODOS

IV.1. ANIMAIS

Foram utilizados camundongos Swiss machos e fêmeas adultos (30-40

g) e ratos Wistar machos adultos (180-220 g), fornecidos pelo Bioterio Central

da UFSM. Os animais foram mantidos em ciclo claro-escuro de 12 horas, em

temperatura de 22 ± 1

C e com livre acesso à água e ração. Os animais foram

deixados ambientar ao local de experimentação por aproximadamente 1 hora

antes dos experimentos. Os experimentos foram conduzidos de acordo com as

orientações de cuidados com animais de laboratório e considerações éticas

para a investigação de dor experimental em animais conscientes

(ZIMMERMANN, 1983). O número de animais empregado e os estímulos

utilizados foram o mínimo suficiente para demonstrar efeitos consistentes dos

procedimentos e dos tratamentos empregados. O projeto foi encaminhado ao

Comitê de Ética em Pesquisa e Bem Estar Animal da UFSM e aprovado,

estando registrado sob o número 23081.005024/2010-88.

IV.2. DROGAS

O isolamento, purificação e sequenciamento de aminoácidos da toxina

Tx3-3 foram realizados na Fundação Ezequiel Dias (FUNED), Belo Horizonte,

MG, em colaboração com a Dra. Marta N. Cordeiro. A toxina Tx3-3 foi isolada

da fração 3 (PhTx3) do veneno da aranha Phoneutria nigriventer e purificada

por uma combinação de filtração em gel e cromatografia líquida de alta

eficiência, de troca iônica, em fase reversa, tal como descrito previamente

(CORDEIRO et al., 1993). A toxina Tx3-3 foi recebida na forma liofilizada e

_____________________________________________________Material e Métodos

dissolvida em salina tamponada com fosfato (PBS, composição mmol/L: NaCl

137, KCl 2.7 e tampão fosfato 10; pH 7,4) apenas no momento do uso. Após

ser diluída, a solução de Tx3-3 foi aliquotada e armazenada, em eppendorfs

siliconizados, a -20

C até o uso. Para minimizar a geração de resíduos,

procurou-se preparar apenas a quantidade de drogas e reagentes necessária

para a execução de cada experimento. A ω-conotoxina MVIIC foi obtida da

Latoxan (Valence, França); Adjuvante completo de Freund (CFA),

estreptozotocina (STZ), KN62 e sulfato de morfina foram obtidos da Sigma

(USA).

IV.3. ADMINISTRAÇÃO DAS DROGAS

As toxinas Tx3-3 e ω-conotoxina MVIIC foram administradas por via

intratecal ou intracerebroventricular. A administração intratecal (i.t.) foi realizada

de acordo com a metodologia descrita por HYLDEN E WILCOX (1980). Em

suma, os animais foram imobilizados envoltos em uma toalha, e a injeção foi

feita através da inserção de uma agulha (30 G

1/2

) entre as vértebras L4 e L5.

Um reflexo da cauda do animal foi o indicativo do posicionamento adequado da

agulha no espaço subaracnóide da medula espinhal. A administração

intracerebroventricular (i.c.v) foi feita à mão livre, visando atingir o ventrículo

lateral direito ou esquerdo (de forma aleatória), de acordo com as coordenadas

propostas por LAURSEN E BELKNAP (1986). As injeções i.t. e i.c.v foram

feitas em um volume de 5 µl/sítio, quando em camundongos, ou em 10 µl/sítio,

quando em ratos. A administração da morfina e da estreptozotocina foi feita por

via intraperitoneal (i.p.), em um volume de 10 e 1 ml/Kg, em camundongos e

ratos, respectivamente. O CFA (1 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis

inativado por calor) foi administrado por via subcutânea (s.c.) na região plantar

_____________________________________________________Material e Métodos

da pata traseira direita, em um volume de 20 µl/sítio. As toxinas Tx3-3 e ω-

conotoxina MVIIC foram dissolvidas em PBS (pH 7,4); o inibidor da CaMKII,

KN62, em DMSO (1%); a morfina em salina (NaCl 0,9%); a STZ em tampão

citrato (pH 4,5) e o CFA em 85% de óleo de parafina e 15% de monoleato de

manida.

IV.4. TESTES COMPORTAMENTAIS

IV.4.1. AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS EXPERIMENTAIS DE DOR

IV.4.1.1. TESTE DA RETIRADA DA CAUDA (TAIL-FLICK TEST – TF)

A nocicepção aguda, evocada por estímulo térmico, foi medida através

do teste da retirada da cauda, segundo metodologias descritas por D‟AMOUR

E SMITH (1941) e HARGREAVES et al. (1988).

Em um grupo de experimentos, os animais foram submetidos ao teste de

imersão da cauda em água quente (D‟AMOUR E SMITH, 1941), que consistiu

na medida do tempo que o animal permanece com a cauda submersa num

banho-maria com água a 48 ± 1º C, temperatura que determina uma latência

de retirada basal média de 10 ± 2 s, o que permite a detecção tanto de

hiperalgesia quanto de analgesia nos animais. Os resultados foram expressos

como % latência basal, da seguinte maneira:

%latência basal = (latência após o tratamento – latência basal)/(latência basal)

x 100.

Em outro grupo de experimentos, foi projetado um estímulo térmico

radiante na cauda dos animais e medida a latência da resposta de retirada

(HARGREAVES et al., 1988). A intensidade do estímulo térmico foi suficiente

para obter uma latência de retirada média de 10 ± 2 s, ideal para a detecção

_____________________________________________________Material e Métodos

tanto de hiperalgesia quanto de analgesia. Os resultados foram expressos em

segundos (s) ou como máximo efeito possível (%MPE), calculado da seguinte

maneira: %MPE = (latência após o tratamento – latência basal)/(40 – latência

basal) x 100.

Para ambos os testes, a medida de latência de retirada da cauda foi

determinada, através da média de duas medidas isoladas, antes do tratamento

(latência basal) e em diferentes tempos após o tratamento. Afim de evitar dano

tecidual, foi permitido um tempo máximo de exposição à fonte de calor de 40 s

em ambos os testes.

IV.4.1.2. TESTE DO VON FREY

A alodínia mecânica foi avaliada com filamentos de von Frey (0,02-10 g

e 2-100g para camundongos e ratos, respectivamente). O limiar de 50% de

resposta foi determinado pelo método de up-and-down de DIXON (1980), de

acordo com CHAPLAN et al. (1994). Para isso, a pata traseira dos animais foi

estimulada com um de uma série de filamentos de von Frey com incrementos

logaritmos crescentes. O primeiro filamento utilizado foi aquele que

normalmente é capaz de evocar a resposta de retirada em 50% dos animais

testados (0,4 g em camundongos e 15 g em ratos). O filamento era aplicado

durante 5 segundos. Na ausência de retirada da pata, a resposta foi

considerada negativa, e o próximo filamento, mais calibroso, era então

utilizado. No caso de resposta de retirada positiva, o filamento imediatamente

menos calibroso era então aplicado. Foi considerada como resposta positiva a

retirada da pata do contato com o filamento ou comportamento de sacudir ou

lamber a pata no momento ou imediatamente após a estimulação. Em casos de

_____________________________________________________Material e Métodos

ambulação ou de movimentos não relacionados à resposta nociceptiva no

momento da aplicação do filamento, a resposta foi considerada ambígua, e foi

realizada nova estimulação. Foram realizadas 6 medidas, com um intervalo de

aproximadamente 30 segundos entre cada uma. No caso de 4 respostas

positivas ou negativas desde a primeira aplicação, o teste era finalizado

(CHAPLAN et al., 1994). O conjunto de 6 ou 4 respostas obtido foi utilizado

para o cálculo do limiar 50% de resposta (DIXON, 1980), como mostrado a

seguir:

Limiar 50% (g) = 10

[Xf+kδ]

onde X

= valor do último filamento de von Frey usado (em log); k = valor

tabelado

para o padrão de respostas positivas/negativas obtidas (DIXON, 1980); δ =

diferença média (em log) entre os estímulos (0,4695).

Uma redução significativa do limiar 50% de resposta dos animais foi

considerada alodínia mecânica.

IV.4.2. AVALIAÇÃO DE EFEITOS COLATERAIS

IV.4.2.1. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA

IV.4.2.1.1.TESTE DE LOCOMOÇÃO FORÇADA EM CILINDRO GIRATÓRIO (ROTAROD)

A coordenação motora de camundongos foi avaliada pelo teste de

locomoção forçada, que permite verificar se o tratamento produz ataxia

(DUNHAM E MIYA, 1957). O cilindro giratório (rotarod) consiste em um cilindro

de 3,7 cm de diametro que gira em uma velocidade constante de 8 rpm. Vinte e

quatro horas antes do teste, todos os animais foram treinados no rotarod. O

treino consistiu em forçar o animal a andar no aparato sem cair, durante 1

_____________________________________________________Material e Métodos

minuto ininterrupto. No dia do teste, os animais foram colocados no cilindro

giratório e durante 2 minutos foi contado o número de quedas e a latência para

a primeira queda de cada animal. A administração de morfina em altas doses

(70 nmol/sítio, i.t. e 35 nmol/sítio, i.c.v), capazes de causar ataxia (LUGER et

al., 1995) foi utilizada como controle positivo do teste.

IV.4.2.1.2.TESTE DO REFLEXO DE ENDIREITAMENTO (RIGHTING REFLEX TEST)

O aparecimento de flacidez muscular nos camundongos após a

administração das toxinas por via i.t. ou i.c.v. foi avaliada através da

observação do reflexo de endireitamento, de acordo com o método descrito por

(LUVISETTO et al, 2006). O teste parte do princípio de que quando

posicionado com o dorso voltado para baixo o camundongo imediatamente

apresenta o reflexo de endireitamento, que nada mais é do que retornar à

posição normal, com o dorso voltado para cima. Logo, o teste consistiu em

posicionar o animal na horizontal, com o dorso voltado para a bancada e

cronometrar o tempo gasto para retornar à posição normal.

IV.4.2.2. AVALIAÇÃO DE COMPORTAMENTOS MOTORES ANORMAIS

Foi observado o aparecimento de comportamentos anormais atribuídos

ao bloqueio de CCDV, como paralisia, flacidez muscular, tremores, giros em

sentido horário ou anti-horário e serpenteado de cauda (OLIVERA et al., 1985;

REZENDE et al., 1991; MALMBERG E YAKSH, 1994). Os dados foram

expressos como a relação entre o número de animais que manifestaram

qualquer um dos comportamentos acima citados e o número total de animais

avaliados.

_____________________________________________________Material e Métodos

IV.5. MODELOS ANIMAIS DE DOR CRÔNICA

IV.5.1. MODELO DE DOR INFLAMATÓRIA INDUZIDA PELO ADJUVANTE COMPLETO DE

FREUND (CFA)

O modelo experimental de inflamação crônica foi induzido através da

injeção intraplantar de 20 µl de CFA (1 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis

inativado por calor e diluído em 85% de óleo de parafina e 15% de monoleato

de manida) em camundongos previamente anestesiados por inalação de

halotano (2-3 minutos), de acordo com FERREIRA et al (2001). O

desenvolvimento de alodínia mecânica foi avaliado através do teste de von

Frey.

A toxina Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) foi administrada imediatamente antes

(pré-tratamento) ou 48 horas após (pós-tratamento) a administração de CFA.

IV.5.2. MODELOS DE DOR NEUROPÁTICA

IV.5.2.1. MODELO DE NEUROPATIA CAUSADA POR TRAUMA

O modelo de dor neuropática produzida por trauma foi produzido através

da lesão parcial do nervo ciático, de acordo com a metodologia descrita por

SELTZER et al. (1990), para ratos, e adaptada por MALMBERG e BASBAUM

(1998), para camundongos. Para tanto, os camundongos foram anestesiados

com cetamina + xilazina (90 + 3 mg/Kg, i.p.) e então foi feita uma pequena

incisão na região glútea, a musculatura entre o ilíaco e o músculo glúteo foi

divulsionada e o nervo ciático exposto. Utilizando a agulha do fio cirúrgico 8-0,

1/3 a 1/2 do nervo foi perfurado e amarrado. Como grupo controle, um grupo de

animais passou por todo o procedimento cirúrgico acima descrito, exceto pelo

fato do nervo ciático, embora tenha sido exposto, não ter sido amarrado. Por

_____________________________________________________Material e Métodos

esse motivo o grupo controle foi chamado de grupo falso-operado. Sete dias

após a indução da neuropatia, o desenvolvimento de alodínia mecânica e

hiperalgesia térmica foi verificado através do teste do von Frey e da retirada da

cauda, respectivamente.

IV.5.2. 2. MODELO DE NEUROPATIA DIABÉTICA

O modelo de dor neuropática produzido por diabetes foi feito através da

administração sistêmica de estreptozotocina em camundongos (200 mg/kg, i.p.)

e ratos (50 mg/kg, i.p), de acordo com metodologia descrita por OHSAWA E

KAMEI (1999) e CALCUTT E CHAPLAN (1997), respectivamente. O valor de

glicemia (medida pelo sistema de tiras dosadoras de glicemia Accu-Check,

Roche Diagnostics, Brazil) e o desenvolvimento de alodínia mecânica (avaliada

no teste de von Frey) foram medidos 15 e 21 dias após a administração de STZ

em camundongos e ratos, respectivamente. Apenas os animais que

apresentaram valores de glicemia > 300 mg/dl (CALCUTT E CHAPLAN, 1997)

e limiar de resposta a estímulo mecânico reduzido (caracterizando alodínia

mecânica) foram incluídos no grupo de animais neuropáticos.

IV.6. MODELO DE TOLERÂNCIA A OPIÓIDE

A tolerância a opióides foi induzida utilizando o protocolo de

administração repetida de morfina, descrito por MARSHALL E WEINSTOCK

(1971). O protocolo consistiu na administração de doses crescentes de morfina

(50+50+75;75+75+100;100+100+125 mg/kg, i.p.) durante 3 dias. Em suma, os

camundongos receberam 3 injeções intraperitoneais de morfina por dia, com

um intervalo de 4 a 5 horas entre cada injeção. Foi administrado 50, 50 e 75

_____________________________________________________Material e Métodos

mg/Kg de morfina no primeiro dia; 75, 75 e 100 mg/Kg no segundo dia, e assim

sucessivamente. O incremento de 25 mg/kg na última injeção de cada dia do

tratamento teve como propósito minimizar a precipitação de síndrome de

abstinência durante a noite. No quarto dia, o limiar térmico dos camundongos

foi verificado através do teste da retirada da cauda, (HARGREAVES et al.,

1988) e então os animais receberam a dose-desafio de morfina (10 mg/kg, i.p.)

e tiveram seu limiar térmico novamente mensurado, afim de verificar o

desenvolvimento de tolerância.

Um dia antes de iniciar o protocolo de indução de tolerância os

camundongos tiveram seus limiares térmicos medidos e foi então administrada

morfina (10 mg/kg) ou salina (NaCl 0,9%) por via intraperitoneal. Trinta minutos

após a administração, os animais foram novamente submetidos ao teste de

retirada da cauda a fim de verificar a resposta antinociceptiva usual da morfina.

Os animais foram então divididos em dois grupos; um grupo recebeu

administrações repetidas de salina e o outro de morfina por 3 dias (MARSHALL

E WEINSTOCK, 1971). No quarto dia, os animais receberam PBS (5 µl/sítio) ou

Tx3-3 (30 pmol/sítio) por via intratecal 15 minutos antes da administração da

dose-desafio de morfina (10 mg/Kg, i.p.). Foi medida a latência de retirada da

cauda de ambos os grupos aos 5, aos 15 e aos 45 (ou 30 minutos após a

administração de morfina) minutos após a administração das drogas por via

intratecal.

O protocolo de administração de drogas executado no quarto dia (Tx3-3

i.t. + morfina i.p.) foi também utilizado na avaliação da Tx3-3 na hiperalgesia

térmica induzida por neuropatia, conforme o esquema a seguir.

_____________________________________________________Material e Métodos

Desenho experimental para avaliação da Tx3-3 em modelos de dor resistentes a

opióides; TF = teste da retirada da cauda.

IV.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados através do teste t de Student ou por análise

de variância (ANOVA) de uma ou duas vias, seguida, quando necessário, de

teste post- hoc de Student-Newman-Keuls (SNK) ou Bonferroni,

respectivamente. Os resultados foram considerados estatisticamente

significantes quando p<0,05.

____________________________________________________________Resultados

V. RESULTADOS

____________________________________________________________Resultados

V. RESULTADOS

V.1. EFEITOS ANTINOCICEPTIVO E COLATERAIS PRODUZIDOS PELA ADMINISTRAÇÃO

INTRATECAL DE TX3-3 E -CONOTOXINA MVIIC EM CAMUNDONGOS

A administração intratecal da toxina Tx3-3 causou antinocicepção no

teste de retirada da cauda. O valor de DE

estimado a partir da curva dose-

resposta (1-100 pmol/sítio) foi de 8,8 (4,1-18,8) pmol/sítio e o efeito máximo

max

), obtido a partir da administração de 30 pmol/sítio de Tx3-3, foi de

51±14% de aumento na latência de retirada da cauda em relação à latência

basal (Figura 1A). Esse efeito foi observado aos 5 minutos após a

administração e cessou em aproximadamente 15 minutos (Figura 1B). É

importante salientar que não foi observada diferença na duração ou na

magnitude do efeito da Tx3-3 entre camundongos machos e fêmeas (46±9% e

56±17% de E

max

observado em camundongos machos e fêmeas,

respectivamente). A administração intratecal de Tx3-3 não causou disfunção

motora nem mesmo numa dose 10 vezes maior que a dose efetiva (300

pmol/sítio).

A ausência de alterações na coordenação motoras foi confirmada

através do teste de locomoção forçada em cilindro giratório (Tabela 1).

Ademais, os animais administrados com Tx3-3 não tiveram o reflexo de

endireitamento alterado em relação ao grupo controle (os animais tratados com

Tx3-3 e PBS demoraram 0,11±0,02 e 0,12±0,03 segundos para retornar à

posição normal, respectivamente).

A seguir, foi testado o efeito da administração intratecal da -conotoxina

MVIIC, uma toxina extraída do veneno do molusco Conus magus, capaz de

____________________________________________________________Resultados

bloquear CCDV de forma não seletiva similar à Tx3-3, mas com maior afinidade

por canais que permeiam correntes do tipo P/Q e N (HILLYARD et al., 1992;

MCDONOUGH et al., 1996). A administração de 300 pmol/sítio de -

conotoxina MVIIC, embora tenha produzido um acentuado aumento no limiar

de resposta a estímulo térmico nos primeiros 15 minutos (Figura 1D), causou

efeitos tóxicos. Esses efeitos tornaram-se evidentes cerca de 20 minutos após

a administração e manifestaram-se como uma flacidez muscular que evolui

para paralisia nos membros inferiores. Tal disfunção motora foi quantificada

através do teste do reflexo de endireitamento. Os animais administrados com a

-conotoxina MVIIC tiveram o reflexo de endireitamento alterado (2,78±0,67

segundos) em relação ao grupo administrado com PBS (0,12±0,03 segundos).

A maioria (6/8) dos animais administrados com 300 pmol/sítio de -conotoxina

MVIIC apresentou paralisia dos membros inferiores, a qual foi reversível em 24

horas (a duração de tal efeito não foi sistematicamente observada). Com a

administração de uma menor dose de -conotoxina MVIIC – 100 pmol/sítio –

não foi observado efeito no teste de antinocicepção térmica (Figura 1C) e,

como demonstrado na Tabela 1, o aparecimento de efeitos motores foi menos

freqüente. Devido à condição motora alterada, os animais administrados com a

-conotoxina MVIIC não foram submetidos ao teste de locomoção forçada em

cilindro giratório.

____________________________________________________________Resultados

Figura 1. Efeito antinociceptivo produzido pela administração i.t. de Tx3-3 ou -

conotoxina MVIIC no teste de retirada da cauda. Curva dose-resposta (A e C) e decurso

temporal do efeito antinociceptivo (B e D) causado pela administração i.t. de Tx3-3 (1-100

pmol/sítio) ou MVIIC (100-300 pmol/sítio) em camundongos. Os resultados estão expressos

como %latência basal. Nos casos de curva dose-resposta, o %latência basal foi calculado aos

5 minutos. Cada coluna ou ponto representam a média de 6 a 9 animais e as linhas verticais

expressam o erro padrão. A análise estatística foi executada utilizando ANOVA de uma (A e C)

ou de duas vias (B e D) seguida do teste post-hoc de Student-Newman-Keuls ou Bonferroni,

respectivamente. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001 denotam o nível de significância em

comparação ao grupo controle (tratado com PBS).

PBS

100

Tx3-3 (pmol/sítio, i.t.)

***

% latência basal

-20

105

PBS (5 l/sítio, i.t.)

Tx3-3 (48 pmol/sítio, i.t.)

5 10 15 30 600

Tempo (min)

% latência basal

PBS

100

300

100

150

200

250

300

MVIIC (pmol/sítio, i.t.)

***

%l atência basal

100

150

200

250

PBS (5 l/sítio, i.t.)

MVIIC (0.3 nmol/sítio, i.t.)

5 10 15 30 60

-50

***

Tempo (min)

% latência basal

____________________________________________________________Resultados

V.2. EFEITOS ANTINOCICEPTIVO E COLATERAIS PRODUZIDOS PELA ADMINISTRAÇÃO

INTRATECEREBROVENTRICULAR DE TX3-3 E -CONOTOXINA MVIIC EM

CAMUNDONGOS

A ação da toxina Tx3-3 em áreas supraespinhais, através da

administração por via intracerebroventricular, também produziu efeito

antinociceptivo no teste de retirada da cauda. De maneira similar à

administração intratecal, o efeito foi observado a partir dos 5 minutos e durou

aproximadamente 10 minutos (Figura 2B). O valor de DE

, estimado a partir da

curva dose-resposta (1-30 pmol/sítio), foi de 3,7 (1,6-8,4) pmol/site e o E

max

foi

de 84±16% de aumento na latência de retirada da cauda em relação à latência

basal (Figura 2A).

A administração de até 300 pmol/sítio de Tx3-3 por via i.c.v não causou

efeitos colaterais perceptíveis. Afim de confirmar a ausência de efeitos na

atividade motora dos animais, os mesmos foram testados no teste de

locomoção forçada em cilindro giratório. Como demonstrado na Tabela 1, a

administração intracerebroventricular de Tx3-3 (1-300 pmol/sítio) não alterou a

performance dos animais no teste, enquanto que a morfina (35 nmol/sítio,

i.c.v.), utilizada como controle positivo do teste, piorou o desempenho dos

animais no rotarod.

O efeito causado pela administração intracerebroventricular da toxina

Tx3-3 foi também comparado com aquele produzido pela administração

supraespinhal de -conotoxina MVIIC. A -conotoxina MVIIC causou efeito

antinociceptivo, com potência, eficácia e duração similar ao produzido pela

administração de Tx3-3 (Figura 2C e 2D). A DE

, calculada a partir da curva

dose-resposta (0,3-3,0 pmol/sítio) de -conotoxin MVIIC, foi de 0,6 (0,1-2,8)

____________________________________________________________Resultados

pmol/sítio e o E

max

foi de 62±13% de aumento no limiar térmico em relação ao

limiar basal.

Porém, diferente da Tx3-3, a administração i.c.v de -conotoxin MVIIC

causou efeitos colaterais a partir da dose de 10 pmol/sítio. Foi observado

comportamento anormal (giros no contralaterais ao lado da injeção), tremor,

fraqueza muscular e alteração na coordenação motora em poucos minutos

após a administração. (Tabela 1). A administração de 100 e 300 pmol/sítio de

-conotoxin MVIIC produziu disfunção motora grave, o que impossibilitou testar

os animais no teste de locomoção forçada em cilindro giratório.

Figura 2. Efeito antinociceptivo produzido pela administração i.c.v. de Tx3-3 ou -

conotoxina MVIIC no teste de retirada da cauda. Curva dose-resposta (A e C) e decurso

temporal do efeito antinociceptivo (B e D) causado pela administração i.c.v. de Tx3-3 (1-30

pmol/sítio) ou MVIIC (0,3-3 pmol/sítio) em camundongos. Os resultados estão expressos como

%latência basal. Nos casos de curva dose-resposta, o %latência basal foi calculado aos 5

minutos. Cada coluna ou ponto representam a média de 8 a 11 animais e as linhas verticais

expressam o erro padrão. A análise estatística foi executada utilizando ANOVA de uma (A e C)

PBS

100

Tx3-3 (pmol/sítio i.c.v.)

% latência basal

-20

105

PBS (5 l/sítio, i.c.v.)

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.c.v.)

5 10 15 30 60

Tempo (min)

% latência basal

PBS

0.3

100

MVIIC (pmol/sítio, i.c.v.)

% latência basal

-20

105

PBS (5  l/sítio, i.c.v.)

MVIIC (3 pmol/sítio, i.c.v.)

5 10 15 30 600

Tempo (min)

% latência basal

____________________________________________________________Resultados

ou de duas vias (B e D) seguida do teste post-hoc de Student-Newman-Keuls ou Bonferroni,

respectivamente. *P<0,05 e **P<0,01 denotam o nível de significância em comparação ao

grupo controle (tratado com PBS).

Tabela 1. Efeitos colaterais produzidos pela administração intratecal ou

intracerebroventricular de Tx3-3 ou MVIIC em camundongos

Tratamento/via

Dose

(pmol/sítio)

Tremor

Flacidez

Muscular

Paralisia

Rotarod:

nº de quedas

Rotarod:

Latência (s)

PBS/i.t.



0/6

0,9 ± 0,4

84,3 ± 14,3

Morfina/i.t.

70 x 10³



0/5

3,0 ± 0,9***

31,6 ± 6,6*

Tx3-3/i.t.

0/5

0,4 ± 0,2

99,8 ± 12,5

0/4

0,3 ± 0,3

108,3 ± 11,8

0/4

0,3 ± 0,3

94,8 ± 25,3

0/4

0,5 ± 0,3

115,0 ± 5,0

0/4

0,8 ± 0,6

85,0 ± 22,1

100

0/4

0,8 ± 0,5

96,6 ± 15,7

300

0/4

0,2 ± 0,5

106,4 ± 13,6

MVIIC/i.t.

100

0/6

2/6



300

0/8

6/8



PBS/i.c.v.



0/6

0,8 ± 0,7

93,5 ± 16,8

Mofina/i.c.v.

35 x 10³



0/4

7,8 ± 1,8***

25,3 ± 13,7*

Tx3-3/i.c.v.

0/6

0,2 ± 0,2

112,5 ± 7,5

0/6

0,3 ± 0,2

91,2 ± 18,9

0/5

0,8 ± 0,6

91,0 ± 18,7

0/5

0,8 ± 0,4

86,6 ± 14,4

100

0/6

0,7 ± 0,4

98,8 ± 13,8

300

0/6

1,3 ± 0.5

74,6 ± 20,5

MVIIC/i.c.v.

0,3

0/5

0,8 ± 0.4

92,2 ± 14,2

0/5

1,6 ± 0.6

60,8 ± 17,2

0/6

0,6 ± 0.3

92,0 ± 38,9

3/4

0/4

7,3 ± 2.5**

40,3 ± 26,7

6/8

0/8

4,8 ± 2.3*

7,3 ± 3,0**

100

3/3

0/3



300

2/2

0/2



Os dados estão expressos como média ± erro padrão ou como a relação entre o número de animais afetados e o

número total de animais avaliados (n = 2 a 8 animais). *P<0.05, **P<0.01 ***P<0.001 denotam diferença

significativa em relação ao grupo tratado com PBS; ANOVA de uma via, seguida do teste post-hoc de Student-

Newman-Keuls.

____________________________________________________________Resultados

Uma vez que a administração intratecal e intracerebroventricular de Tx3-

3 produziu efeitos semelhantes, a via intratecal - utilizada na clínica para a

administração de fármacos analgésicos – foi escolhida para a administração de

Tx3-3 nos demais experimentos.

V.3. EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 EM MODELO ANIMAL DE

DOR INFLAMATÓRIA

Foi avaliado o efeito da administração intratecal de Tx3-3 em modelo de

dor inflamatória induzida por CFA. Para tanto, foi administrado 20 µl de CFA (1

mg/ml de Mycobacterium tuberculosis inativado por calor) na pata direita

traseira dos camundongos e a toxina Tx3-3 foi administrada no momento da

indução do processo inflamatório (imediatamente antes da injeção do CFA), ou

48 horas após a indução. Na Figura 3 pode-se observar que a administração

intraplantar de CFA produziu um decréscimo significativo no limiar de reposta

dos animais ao estimulo mecânico, desde os primeiros minutos após a injeção,

caracterizando o desenvolvimento de alodinia mecânica. Contudo, a

administração de 30 pmol/sítio de Tx3-3 imediatamente antes (Figura 3A) ou 48

horas após a injeção de CFA (Figura 3B) não alterou a alodínia desses

animais. A administração intratecal de Tx3-3 (30 pmol/sítio) também não

alterou a sensibilidade mecânica normal dos animais, avaliada pelo teste de

von Frey (Figura 3C).

____________________________________________________________Resultados

Figura 3. Efeito da administração intratecal de Tx3-3 em modelo de dor inflamatória

crônica. (A) Efeito do pré-tratamento com Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) na alodínia mecânica

causada por CFA (20 µl/paw) em camundongos. (B) Efeito do pós-tratamento com Tx3-3 (30

pmol/sítio, i.t.) na alodínia mecânica prduzida por CFA (20 µl/paw) em camundongos. (C) Efeito

da administração intratecal de Tx3-3 (30 pmol/sítio) na sensibilidade mecânica de

camundongos. Os resultados estão expressos como Limiar 50%, em gramas (g). Cada ponto

representa a média de 8 a 11 animais e a linha vertical expressa o erro padrão. A análise

estatística foi avaliada através de ANOVA de duas vias.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

PBS (5 l/sítio, i.t.)

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

B 10 30 60 120 2400

Tempo (min)

Limiar 50% (g)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

B 010 30 60 120 240

3.5

Tempo (min)

Limiar 50% (g)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

B 10 30 60 120 240

Tempo (min)

Limiar 50% (g)

____________________________________________________________Resultados

V.4. EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 EM MODELO ANIMAL DE

DOR NEUROPÁTICA

A ligação parcial do nervo ciático de camundongos causou alodínia

mecânica, caracterizada pela diminuição do limiar de resposta ao estímulo

mecânico de 1,46 ± 0,25 g para 0,19 ± 0,05 g (Figura 4A). O grupo falso

operado não teve o limiar de resposta ao estímulo mecânico alterado (o limiar

de resposta 50% foi de 1,85 ± 0,33 g e 2,21 ± 0,29 antes e depois do

procedimento cirúrgico, respectivamente). A administração de Tx3-3 (30

pmol/sítio, i.t.) reduziu a alodínia mecânica desde os 30 minutos após a sua

administração (46±13 % de inibição), e foi efetiva por 1 hora (53±22% de

inibição).

A administração de Tx3-3 também reduziu a alodínia mecânica causada

por neuropatia diabética (Figuras 4B). Os camundongos tratados com STZ

apresentaram, aos 15 dias após a administração de STZ, valor de glicemia

aumentado (455,0 ± 17,5 mg/dl e 125,5 ± 4,8 mg/dl para o grupo tratado com

STZ e grupo controle, respectivamente), e alodínia mecânica (limiar de

resposta 50% de 2,68 ± 0,36 g e 0,73 ± 0,23 g para o grupo tratado com STZ e

o grupo controle, respectivamente) em relação ao grupo controle. A

administração de Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) reduziu a alodínia mecânica dos

camundongos diabéticos. O efeito anti-alodínico da Tx3-3 foi observado a partir

de 30 minutos (69±9% de inibição), atingiu seu ponto máximo em 1 hora

(83±15% de inibição) e foi observado até 2 horas após a administração

(57±11% de inibição).

____________________________________________________________Resultados

Figura 4. Efeito da administração intratecal de Tx3-3 em modelo de dor neuropática. (A)

Efeito da Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) na alodínia produzida por modelo de dor neuropática

causada por trauma em camundongos. (B) Efeito da Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) na alodínia

causada por neuropatia diabética em camundongos. Os resultados estão expressos como

limiar 50%, em gramas (g). O Limiar 50% foi medido 7 (A) ou 15 (B) dias após a indução de

neuropatia. Cada ponto representa a media de 7 a 11 animais e as linhas verticais expressam

o erro padrão. A análise estatística foi executada utilizando ANOVA de duas vias seguida do

teste post-hoc de Bonferroni. *P<0,05 e ***P<0,001 denotam o nível de significância em

comparação ao grupo controle (tratado com PBS).

De maneira similar, a administração de Tx3-3 (30 pmol/sítio,i.t.) reduziu

a alodínia mecânica de ratos diabéticos. Nos ratos tratados com STZ, foi

verificado valor de glicemia aumentado (488,5 ± 41,4 mg/dl e 120,4 ± 12,1

mg/dl para o grupo diabético e o grupo controle, respectivamente) e alodínia

mecânica (limiar de resposta 50% de 8,1 ± 1,3 g, e 27,5 ± 4,8 g para o grupo

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

***

B 010 30 60 120 240 360

***

3.5

Tempo (min)

Limiar 50% (g)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Tx3-3 (30 pmol/sítio i.t.)

PBS (5 l/sítio, i.t.)

B 10 30 60 120 240

A 3.5

Tempo (min)

Limiar 50% (g)

____________________________________________________________Resultados

diabético e controle, respectivamente) 21 dias após o tratamento com STZ.

Embora tenha sido observado efeito siginificativo desde os 10 minutos após a

administração (70 ± 19% de inibição), tanto a eficácia quanto a duração do

efeito anti-alodínico da Tx3-3 em ratos foi similar ao verificado em

camundongos (Figura 5A). A administração intratecal de Tx3-3 também não

alterou a sensibilidade mecânica de ratos (Figura 5B)

Figura 5. Efeito da administração intratecal de Tx3-3 em modelo de dor neuropática

causada por diabetes em ratos. (A) Efeito da Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) na alodínia causada

pela neuropatia diabética em ratos. (B) Efeito da administração intratecal de Tx3-3 (30

pmol/sítio, i.t.) na sensibilidade mecânica de ratos. Os resultados estão expressos como limiar

50%, em gramas (g) e foram medidos 21 dias após a indução de neuropatia. Cada ponto

representa a media de 5 a 6 animais e as linhas verticais expressam o erro padrão. A análise

estatística foi executada utilizando ANOVA de duas vias seguida do teste post-hoc de

Bonferroni. *P<0,5 e **P<0,01 denotam o nível de significância em comparação ao grupo

controle (tratado com PBS).

50 PBS (5 l/sítio, i.t.)

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

B 10 30 60 120 240 360

Tempo (min)

Limiar 50% (g)

B10 30 60 120 240 360

Tempo (min)

Limiar 50% (g)

____________________________________________________________Resultados

V.5. EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 NO EFEITO

ANTINOCICEPTIVO DA MORFINA

Embora fármacos opióides sejam, em geral, o tratamento de escolha em

casos de dor intensa, o uso desses medicamentos para o tratamento de dores

crônicas é limitado pelo aparecimento de tolerância analgésica. Além disso, em

algumas circunstâncias, como por exemplo em alguns casos de dor

neuropática, a morfina apresenta eficácia analgésica reduzida. Por esse

motivo, foi testado o efeito da administração intratecal de Tx3-3 na

antinocicepção causada pela administração sistêmica de morfina, numa dose

em que esse opióide não apresenta boa eficácia antinociceptiva e em situações

em que há diminuição da eficácia antinocieptiva da morfina.

V.5.1. EFEITO DA PRÉ-ADMINISTRAÇÃO DE TX3-3 NA ANTINOCICEPÇÃO CAUSADA

PELA ADMINISTRAÇÃO SISTÊMICA DE UMA DOSE SUB-EFETIVA DE MORFINA

Inicialmente foi avaliado o efeito antinociceptivo de diferentes doses de

morfina no teste de retirada da cauda, afim de determinar a dose sub-efetiva

desse opióide. A DE

da morfina, calculada a partir da curva dose-resposta (1

– 30 mg/kg, i.p.) foi de of 7,5 (4,6 – 12,4) mg/kg e o E

max,

observado 30 minutos

após a sua administração, foi de 76,2 ± 16,5%. Como pode ser observado na

Figura 6B, a dose de 3 mg/kg de morfina não causou antinocicepção

significativa no teste da retirada da cauda. A seguir, os camundongos foram

administrados por via intratecal com Tx3-3 (30 pmol/sítio) e após 15 minutos

(momento em que não há mais efeito da Tx3-3 no limiar de resposta a estímulo

térmico – Figura 6A) foram injetados com morfina (3 mg/kg, i.p.). A pré-

administração de Tx3-3 aumentou efeito antinociceptivo obtido pela

____________________________________________________________Resultados

administração de 3 mg/Kg de morfina (o %MPE passou de 5,14 ± 4,02 para

63,47 ± 10,01 quando Tx3-3 foi previamente administrada – Figura 6C). A

seguir, foi investigado se a administração intratecal de uma dose de Tx3-3 (10

pmol/sítio, i.t.) que não causa efeito no limiar de resposta a estímulo térmico

(Figura 6A) também seria capaz de aumentar a eficácia da morfina. Como

demonstrado na Figura 6D, a administração intratecal de Tx3-3 na dose de 10

pmol/sítio, assim como a dose de 30 pmol/sítio, melhorou a eficácia da morfina

(%MPE de 34,79 ±13,57).

____________________________________________________________Resultados

Figura 6. Administração intratecal de Tx3-3 causa aumento na eficácia antinociceptiva da

morfina. (A) Decurso temporal do efeito da Tx3-3 (10 e 30 pmol/sítio, i.t.) no teste de retirada

de cauda em camundongos. (B) Curva dose-resposta (1-30 mg/Kg, i.p.) do efeito

antinociceptivo da morfina no teste de retirada da cauda em camundongos. (C) Efeito da

administração intratecal de Tx3-3 (30 pmol/sítio) 15 minutos antes da administração de morfina

(3 mg/Kg, i.p.) no teste da retirada de cauda em camundongos. (D) Efeito da administração

intratecal de Tx3-3 (10 e 30 pmol/sítio, i.t.) 15 minutos antes da da administração de morfina (3

mg/Kg, i.p.) no teste da retirada de cauda em camundongos. Os resultados estão expressos

como % MPE. Os dados da curva dose-resposta foram calculados 30 minutos após a

administração de morfina. Cada coluna ou ponto representam a méida de 5 a 9 animais e as

linhas verticais expressam o erro padrão. A análise estatística foi executada através de ANOVA

de duas (A e C) ou uma (B e D) via, seguida do teste post-hoc de Bonferroni e de Student-

Newman-Keuls, respectivamente. *P<0,05 e ***P<0,001 denotam o nível de significância em

comparação ao grupo controle (PBS em A,C e D e salina em B).

SAL

-25

100

morfina (mg/kg, i.p.)

***

%MPE

100

PBS (5 l/sítio, i.t.)

TX3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

0 5 15 45

Tx3-3 (10 pmol/sítio, i.t.)

***

Tempo (min)

%MPE

100

PBS (5L/sítio, i.t.)

TX3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

0 5 15 45

***

morfina

(3 mg/kg, i.p.)

Tx3-3 ou

PBS (i.t.)

Tempo (min)

%MPE

100

PBS (5l/sítio, i.t.)

Tx3-3 (10 pmol/sítio, i.t.)

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

salina (10 ml/kg, i.p.)

morfina (3 mg/kg, i.p.)

***

%MPE

____________________________________________________________Resultados

V.5.2. EFEITO DA PRÉ-ADMINISTRAÇÃO DE TX3-3 NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA

MORFINA EM ANIMAIS TOLERANTES A OPIÓIDES

O próximo passo foi avaliar se a administração intratecal da Tx3-3

também seria capaz de melhorar a resposta antinociceptiva da morfina em

camundongos tolerantes a opióides. Para tanto, após a indução de tolerância a

opióides, foi administrada Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) e após 15 minutos os

camundongos foram desafiados com 10 mg/kg de morfina. Como demonstrado

na Figura 7C a administração de Tx3-3 foi capaz de restabelecer o efeito

antinociceptivo da morfina em camundongos tolerantes (o %MPE da morfina foi

de 37.3±8.3 and 30.0±11.0 em camundongos não tolerantes e tolerantes

tratados previamente com Tx3-3, respectivamente). Além da tolerância

antinociceptiva (o %MPE da morfina diminui de 60,8 ± 11,3 to 6,8 ± 1,9 após a

indução de tolerância – Figura 7B), o protocolo de administração repetida de

morfina causou uma queda no limiar de resposta à estímulo térmico (a latência

de retirada da cauda diminui de 10.8±1.6s para 4.5±0.5s), o que caracteriza

hiperalgesia térmica (Figura 7A). Como pode ser visto na Figura 7D, a

administração de Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t) antes da administração sistêmica de

morfina (10 mg/Kg, i.p.) não apenas reverteu o estado hiperalgésico, como

também foi efetiva em recuperar a eficácia antinociceptiva da morfina nos

camundongos tolerantes

____________________________________________________________Resultados

Figura 7. Efeito da administração intratecal de Tx3-3 na eficácia analgésica da morfina

em camundongos tolerantes a opióides. (A) Limiar de resposta a estímulo térmico em

camundongos antes e depois da indução de tolerância a opióides. (B) Eficácia analgésica da

morfina (10 mg/kg, i.p.) antes e depois da indução de tolerância a opióides. (C) Efeito da

administração de Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) na eficácia analgésica da morfina (10 mg/Kg, i.p.)

em camundongos submetidos ao modelo de tolerância a opióides. (D) Efeito da administração

de Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) 15 minutos antes da administração de morfina (10 mg/Kg, i.p.) na

hiperalgesia térmica causada pelo modelo de tolerância a opióides. Os resultados estão

expressos como % MPE. Cada coluna ou ponto representam a media de 8 a 10 animais e as

linhas verticais expressam o erro padrão. Os símbolos * e # denotam os níveis de significância

em comparação aos grupos controle. *P<0,05 e ***P<0,001 referem-se à diferença significativa

em relação ao grupo tratado com salina (B) ou PBS (C e D);

P<0,05 refere-se à diferença

significativa em relação ao tratamento com salina – grupo não-tolerante.

pre

pós

pre

pós

adm. repetida de salina

adm. repetida de morfina

###

Latência (s)

-50

100

morfina (10 mg/kg, i.p.)

salina 0,9% (10 ml/kg, i.p.)

após adm.

repetida de salina

após adm.

repetida de morfina

basal antes

do tratamento

***

%MPE

100

5 15 45

***

PBS (5 l/sítio, i.t.)

TX3-3 site(30 pmol/sítio, i.t.)

Tx3-3 ou

PBS (i.t.)

TX3-3 (30 pmol/ sítio, i.t.)

morfina

(10 mg/kg, i.p.)

adm. repetida

de salina

adm. repetida

de morfina

***

Time (min)

%MPE

-50

-25

100

PBS (5l/sítio, i.t.)

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

salina (10 ml/Kg, i.p.)

morfina(10 mg/Kg, i.p.)

adm. repetida de salina

adm. repetida de morfina

***

%MPE

____________________________________________________________Resultados

V.5.3. EFEITO DA PRÉ-ADMINISTRAÇÃO DE TX3-3 NO EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA

MORFINA EM ANIMAIS NEUROPÁTICOS

Uma vez que o desenvolvimento de tolerância à morfina está

relacionado a mecanismos de neuroplasticidade na medula espinhal

semelhantes aos envolvidos na dor neuropática (MAYER et al., 1999), foi

investigado o efeito da administração intratecal de Tx3-3 em camundongos

submetidos ao modelo de neuropatia induzida pela ligação parcial do nervo

ciático (SELTZER et al., 1990; MALMBERG E BASBAUM, 1998) .

Assim como os camundongos submetidos ao protocolo de indução de

tolerância a opióides, os camundongos submetidos ao modelo experimental de

neuropatia por compressão do nervo ciático apresentaram hiperalgesia térmica

(a latência de retirada da cauda diminuiu de 11,5±1,95 para 6,22±0,78s), aos 7

dias após o procedimento cirúrgico (Figura 8A). Como demonstrado na Figura

8B, a hiperalgesia térmica foi acompanhada de redução na eficácia

antinociceptiva da morfina (o %MPE da morfina foi de 58,4 ± 10,2 to 2,7 ± 3,0

em camundongos falso-operados e camundongos neuropáticos,

respectivamente). O efeito da Tx3-3 foi avaliado através do mesmo desenho

experimental utilizado para testar o efeito da toxina em animais tolerantes. De

maneira similar aos achados em animais tolerantes,a administração prévia Tx3-

3 promoveu um aumento na resposta antinociceptiva da morfina (o %MPE da

morfina foi de 2,6±3,6 e 53,8±11 em camundongos neuropáticos tratados com

Tx3-3 ou PBS, respectivamente – Figura 8C e 8D).

____________________________________________________________Resultados

Figura 8. Efeito da administração intratecal de Tx3-3 na eficácia analgésica da morfina

em camundongos neuropáticos. (A) Limiar de resposta a estímulo térmico em camundongos

falso operados e camundongos neuropáticos. (B) Eficácia analgésica da morfina (10 mg/kg,

i.p.) em camundongos falso operados e camundongos neuropáticos. (C) Efeito da

administração de Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) na eficácia analgésica da morfina (10 mg/Kg, i.p.)

em camundongos neuropáticos. (D) Efeito da administração de Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) 15

minutos antes da administração de morfina (10 mg/Kg, i.p.) na hiperalgesia térmica induzida

por neuropatia. Os resultados estão expressos como % MPE. Cada coluna ou ponto

representam a media de 6 a 9 animais e as linhas verticais expressam o erro padrão. Os

símbolos * e # denotam os níveis de significância em comparação aos grupos controle.

*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001 referem-se à diferença significativa em relação ao grupo

tratado com salina (B) ou PBS (C e D);

P<0,05 refere-se à diferença significativa em relação

ao grupo falso operado.

100

PBS (5 L/sítio, i.t.)

TX3.3 (30 pmol/sítio, i.t.)

0 5 15 45

morfina

(10 mg/kg, i.p.)

Tx3-3

ou PBS (i.t.)

PBS (5 L/sítio, i.t.)

TX3.3 (30 pmol/sítio, i.t.)

falso operado

neuropático

***

Tempo (min)

%MPE

-50

-25

100

PBS (5l/sítio, i.t.)

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

salina (10 ml/Kg, i.p.)

morfina (10 mg/Kg, i.p.)

***

falso operado

neuropático

%MPE

pre

pós

pré

pós

falso operado

neuropático

###

Latência (s)

-50

-25

100

***

salina 0,9% (10 ml/kg, i.p.)

morfina (10 mg/kg, i.p.)

falso operado neuropático

%MPE

_____________________________________________________________Discussão

VI. DISCUSSÃO

_____________________________________________________________Discussão

VI. DISCUSSÃO

O veneno da aranha Phoneutria nigreventer apresenta uma vasta gama

de toxinas com propriedades farmacológicas interessantes, e constitui, deste

modo, uma fonte de ferramentas farmacológicas e de fármacos com potencial

para o uso clínico. A toxina Tx3-3, isolada da fração peptídica 3, PhTx3, do

veneno da aranha armadeira, demonstrou, na série de experimentos aqui

descritos, ser um peptído em potencial para o tratamento da dor neuropática ou

para aquelas dores que, assim como a produzida por neuropatia, não

respondem bem à analgesia da morfina.

A primeira parte do presente estudo (manuscrito 1- Apêndice C)

destinou-se a analisar o efeito da administração espinhal e supraespinhal da

toxina Tx3-3 em teste de nocicepção aguda, além de modelos animais de dor

crônica inflamatória e neuropática e avaliar o possível desenvolvimento de

efeitos motores indesejáveis produzidos pela administração dessa toxina. Em

seguida, foi avaliado o efeito da administração intratecal de Tx3-3 em modelos

de dor resistentes à analgesia da morfina.

A administração i.t. e i.c.v da toxina Tx3-3 causou efeito antinociceptivo

no teste da retirada de cauda, um teste que avalia a ação de drogas na

nocicepção aguda, evocada por estímulo térmico. O efeito da administração

espinhal ou supraespinhal da Tx3-3 foi fugaz, com pico de ação observado aos

5 minutos e duração de aproximadamente 15 minutos. A transmissão da dor

aguda envolve a liberação de glutamato em sítios espinhais e supraespinhais

(DMITRIEVA et al., 2004; MARABESE et al., 2007). Em estudos anteriores, a

Tx3-3 demonstrou ser capaz de inibir o influxo de cálcio (GUATIMOSIM et al.,

_____________________________________________________________Discussão

1997; MIRANDA et al., 1998) e a liberação de glutamato em preparação de

sinaptosoma de encéfalo de ratos (PRADO et al., 1996; GUATIMOSIM et al.,

1997). Esses efeitos foram posteriormente atribuídos à inibição de correntes de

cálcio do tipo P/Q e R exercida pela Tx3-3 (LEÃO et al., 2000). De fato, os

CCDV do tipo P/Q e R regulam o influxo de cálcio e a liberação de

neurotransmissores em sítios espinhais e supraespinhais (MILLER, 1987;

OLIVEIRA et al., 1994). Portanto, a ação inibitória da Tx3-3 na liberação de

glutamato dependente de cálcio justifica a sua ação antinociceptiva no teste de

retirada da cauda. É importante salientar que a resposta de retirada da cauda,

embora pareça um simples arco-reflexo, é controlada por estruturas

supraespinhias que modulam o sistema descendente da dor (WALL, 1967;

BASBAUM E FIELDS, 1984; FIELDS, HEINRICHER E MASON, 1991) e,

portanto, o efeito antinociceptivo observado pela administração i.c.v da Tx3-3

provavelmente se deve ao bloqueio dos CCDV alvo dessa toxina localizados

em estruturas supraespinhais, como a RVM e a PAG, que medeiam a ativação

do sistema descendente facilitatório da dor através da liberação de

neurotransmissores como o glutamato (SAEGUSA et al., 2000; PORRECA,

OSSIPOV E GEBHART, 2002; URBAN et al., 2005).

Além do efeito na nocicepção aguda, foi avaliado o eventual

aparecimento de efeitos motores indesejáveis, já relatados em estudos com -

conotoxinas bloqueadoras de CCDV (OLIVEIRA et al., 1985; MALMBERG et

al., 1994), após a administração i.t. e i.c.v da Tx3-3. Além disso, os efeitos da

administração da Tx3-3 foram comparados aos produzidos pela administração

da -conotoxina MVIIC, uma toxina peptídica extraída do veneno do molusco

Conus magus que, de maneira similar à Tx3-3, inibe a liberação de glutamato

_____________________________________________________________Discussão

dependente de cálcio (PRADO et al., 1996), pelo bloqueio não seletivo de

CCDV, com preferência para correntes de cálcio do tipo P/Q (HILLYARD et al.,

1992; MCDONOUGH et al., 1996). A administração i.t. ou i.c.v da -conotoxina

MVIIC, embora efetiva no teste da retirada de cauda, produziu inúmeros efeitos

adversos, como paralisia flácida e tremores, outrora relatados por Olivera e

colaboradores (OLIVERA et al., 1985). Esses, e outros efeitos motores

observados, não foram produzidos pela administração de até 300 pmol/sítio de

Tx3-3, uma dose pelo menos 10 vezes maior que a dose capaz de produzir

antinocicepção no teste da retirada da cauda. É possível especular que a

melhor janela terapêutica da Tx3-3 em comparação a da -conotoxina MVIIC

seja devido à ação da phonetoxina em CCDV do tipo R (LEÃO et al., 2000),

que desempenham considerável papel na transmissão nociceptiva (SAEGUSA

et al., 2000; SAEGUSA, MATSUDA E TANABE, 2002; MATTHEWS et al.,

2007), mas, diferente dos CCDV do tipo P/Q (JUN et al., 1999), não estão

essencialmente envolvidos na transmissão motora (WESTENBROEK,

HOSKINS E CATTERALL, 1998; JUN et al., 1999; SAEGUSA et al., 2000).

Alternativamente, a Tx3-3 pode estar operando em variantes de splicing de

VDCC do tipo P/Q que não são acessíveis à -conotoxina MVIIC (BOURINET

et al. 1999; GRAVES et al., 2008).

Outro ponto interessante a ser discutido é que, embora tenha

aumentado momentaneamente o limiar de resposta a estímulo térmico, a

administração intratecal da toxina Tx3-3 não alterou a sensibilidade mecânica

dos animais. Essa diferença pode ser explicada pelo padrão de expressão dos

CCDV alvo da Tx3-3 em diferentes fibras sensoriais. Normalmente a resposta a

estímulo térmico nocivo é determinada pela ativação de fibras C peptidérgicas,

_____________________________________________________________Discussão

enquanto que a ativação de fibras C não peptidérgicas e fibras A produz

resposta a estímulos mecânicos nocivos (D'MELLO E DICKENSON, 2008;

CAVANAUGH et al., 2009; SCHERRER et al., 2009). Fisiologicamente, os

CCDV do tipo N e R são expressos em fibras C peptidérgicas

(WESTENBROEK, HOSKINS E CATTERALL, 1998; FANG et al., 2007),

enquanto que os CCDV do tipo P/Q predominam nos terminais sinápticos de

fibras A e fibras C não peptidérgicas (WESTENBROEK, HOSKINS E

CATTERALL, 1998). Logo é possível supor que, em estado fisiológico, a ação

antinociceptiva da Tx3-3 seja resultado do bloqueio de CCDV do tipo R. Já em

situações patológicas, como em casos de neuropatia, ocorrem mudanças

fenotípicas, como a alteração na expressão de CCDV e rearranjos de fibras

nociceptivas no corno dorsal da medula espinhal (WOOLF, SHORTLAND E

COGGESHALL, 1992; MANNION et al., 1996; KOERBER et al., 1999; YUSAF

et al., 2001; ABE et al., 2002; UMEDA et al., 2006). Tais alterações justificam a

ocorrência de alodínia e podem ser responsáveis pelo efeito mais duradouro da

Tx3-3 na alodínia mecânica produzida por neuropatia.

Ainda, o perfil de ação da Tx3-3, fugaz em situação fisiológica e

prolongada nos modelos de neuropatia, sugere uma ação tipo „bloqueio

dependente de estado‟, já descrita para alguns anestésicos locais que agem

em canais de sódio (HILLE, 1977; HONDEGHEM E KATZUNG, 1977) e para

drogas antiarrítmicas bloqueadoras de CCDV do tipo L (BEAN, 1984), em que

a ligação da droga ao seu receptor é mais forte e duradoura quando o receptor

encontra-se em um determinado estado conformacional. Os canais iônicos

dependentes de voltagem, como os CCDV podem ser encontrados em um de

três estados conformacionais: o estado de repouso (fechado), o estado ativado

_____________________________________________________________Discussão

ou de condução (aberto) e o estado inativado, que é o estado intermediário

entre o estado aberto e o estado fechado do canal (CARBONE E

SWANDULLA, 1990; ZHANG et al., 1994). Uma vez no estado de inativação, o

canal torna-se refratário a nova estimulação durante certo intervalo de tempo.

Portanto, o estado de inativação define a duração da resposta do canal a um

determinado estímulo e também é responsável pela proporção de canais

disponíveis para ativação em certo período (ZHANG et al., 1994; STOTZ,

JARVIS E ZAMPONI, 2003). Considerando a hipótese do bloqueio dependente

de estado, a toxina Tx3-3 teria uma maior afinidade e maior constante de

dissociação para o CCDV no estado de inativação. Essa característica já foi

demonstrada para algumas -conotoxinas bloqueadoras de CCDV (STOCKER

et al., 1997; BERECKI et al., 2010), e é interessante já que o bloqueio

dependente de estado é mais provável durante períodos de alta freqüência de

estimulação dos canais – já que o acesso à conformação inativa do canal é

mais provável durante sucessivos e repetitivos períodos de estado de

ativação/inativação – que são encontrados, por exemplo, em estados

patológicos, como na dor neuropática, mas são bem menos frequentes em

situações fisiológicas (WINQUIST, PAN E GRIBKOFF, 2005). Logo, um perfil

de ação dependente de estado é relevante para o desenvolvimento de

fármacos com bom perfil de segurança. É o caso das dihidropiridinas,

bloqueadores CCDV do tipo L, amplamente utilizadas na clínica por

apresentarem uma excelente janela terapêutica, que se deve, provavelmente à

sua ligação preferencial aos CCDV no estado de inativação (BEAN et al.,

1984). Enquanto que a ziconotida, cuja ação não parece ser dependente de

estado, uma vez que o bloqueio de CCDV do tipo N por essa -conotoxina

_____________________________________________________________Discussão

ocorre tanto no estado inativado quanto no estado ativado ou de repouso

(FENG et al., 2003), apresenta uma estreita janela terapêutica (SNUTCH,

2005, WALLACE et al., 2008). Contudo, mais estudos são necessários para a

caracterização da ação da Tx3-3 em estados neuronais hiperexcitados.

A dor neuropática é caracterizada pelo estado hiperexcitado de

neurônios do corno dorsal da medula espinhal (JI E WOOLF, 2001), iniciada

pela liberação de neurotransmissores excitatórios dos terminais sinápticos das

fibras nociceptivas, através da ativação de CCDV (YAKSH, 2006). De fato, uma

série de estudos tem demonstrado a participação de CCDV em mecanismos

espinhais envolvidos na dor neuropática (CHAPLAN et al. 1994; KOSTYUK,

PRONCHUK E SHMIGOL, 1995; SAEGUSA et al., 2000; MATTHEWS E

DICKENSON, 2001; YUSAF et al., 2001; LUVISETTO et al., 2006; YANG E

STEPHENS, 2009). Em um recente estudo, foi demonstrado, através de

medidas eletrofisiológicas in vivo, que o aumento das descargas pós-sinápticas

de neurônios do corno dorsal da medula espinhal causado por ligação do nervo

espinhal é, em grande parte, mediado por adaptações nas correntes de cálcio

do tipo R, uma vez que o bloqueador dessas correntes, a toxina SNX 482, teve

eficácia superior em condições de dor neuropática (MATTHEWS et al., 2007).

Da mesma maneira, adaptações nas correntes de cálcio do tipo R decorrentes

da neuropatia podem explicar o bom perfil terapêutico da Tx3-3. Outro

importante aspecto subjacente à dor neuropática é a alteração fenotípica de

fibras sensoriais produzida pela modificação dos canais iônicos que as

compõem, como os CCDV (YUSAF et al., 2001; LUO et al., 2002 YAKSH,

2006; YANG E STEPHENS, 2009; FOSSAT et al., 2010). De particular

importância, estudos demonstram o aumento na expressão da subunidade 1

_____________________________________________________________Discussão

de CCDV do tipo P/Q em neurônios de pequeno, médio e grande calibre no

DRG e na medula espinhal de ratos e camundongos submetidos ao modelo de

diabetes por administração de STZ (YUSAF et al., 2001; UMEDA et al., 2006).

De acordo, a toxina Tx3-3 exibiu efeito anti-alodínico bastante semelhante em

camundongos e ratos submetidos ao modelo de neuropatia diabética induzida

por STZ. Além disso, existe uma significante homologia entre os CCDV de

diferentes espécies, incluindo os de camundongos, ratos e humanos

(SNUTCH, 2005), o que não apenas ressalta a importância desses canais ao

longo da evolução, como também justifica o efeito da Tx3-3 em camundongos

e ratos. Além disso, atualmente tem-se enfatizado a importância da inserção de

animais machos e fêmeas em estudos de dor (MOGIL, 2009). Desta maneira,

no presente estudo foi incluído ambos os gêneros de animais. Através dos

testes utilizados, não foram identificadas diferenças na resposta basal dos

animais, nem na magnitude ou na duração do efeito da Tx3-3 entre machos e

fêmeas.

O efeito antinociceptivo da Tx3-3 em modelos de dor neuropática não

apenas a torna uma toxina em potencial para o tratamento da dor neuropática

como também evidencia a participação de CCDV do tipo P/Q e R nessa

doença, cujo tratamento representa um desafio para os clínicos, já que é

refratária aos fármacos analgésicos convencionais, inclusive à morfina.

Na medula espinhal, os receptores opióides são expressos, em grande

parte, nas lâminas mais superficiais (I e II), sendo que os receptores MOR,

alvos da morfina, são predominantemente expressos nos terminais pré-

sinapticos de fibras C e A (BESSE et al., 1990a; 1990b). Logo, a analgesia

mediada por opióides, tanto endógenos quanto exógenos está, em grande

_____________________________________________________________Discussão

parte, relacionada com a inibição da liberação de neurotransmissores, através

da ação inibitória em CCDV (LOMBARD E BESSON, 1989; BOURINET et al.,

1996). De acordo com estudos que demonstram que o bloqueio de CCDV do

tipo P/Q e R aumentam o efeito antinociceptivo da morfina (FUKUIZUMI,

OHKUBO E KITAMURA, 2003; YOKOYAMA et al., 2004), o presente estudo

demonstrou que a administração intratecal de Tx3-3 aumenta a eficácia

antinociceptiva desse opióide. A perda da eficácia da morfina em situações de

dor neuropática pode ser atribuída à diminuição no nível de receptores MOR

nos neurônios do DRG e da medula espinhal após a lesão completa ou parcial

do nervo (BESSE et al., 1992; OBARA et al., 2009) que, somada ao aumento

da atividade de CCDV (MATTHEWS et al., 2007, HILAIRE et al., 2005)

culminaria numa marcante diminuição na eficácia da ação pré-sináptica da

morfina. Além disso, é possível que em situações de dor neuropática a

modulação dos CCDV pela proteína G esteja de alguma maneira prejudicada

(SWARTZ, 1993). De fato, Hall e colaboradores (2001) demonstraram, através

de técnicas eletrofisiológicas e farmacológicas, que ocorre uma diminuição na

modulação dos CCDV pela proteína G em DRG de ratos tratados com STZ, o

que implica em aumento no influxo de cálcio. Os achados do presente trabalho

corroboram a participação dos CCDV na diminuição da eficácia analgésica da

morfina na dor neuropática, uma vez que o bloqueio de CCDV do tipo P/Q e R

espinhais permitiu o efeito antinociceptivo da morfina em animais neuropáticos.

Por outro lado, os CCDV alvo da Tx3-3 não parecem ser importantes na

sensibilização central decorrente de inflamação, uma vez que a alodínia

mecânica resultante da inflamação induzida por CFA não foi alterada pela

administração espinhal dessa toxina. De fato, conforme mostrado por Rycroft e

_____________________________________________________________Discussão

colaboradores (2007), a inflamação induzida por CFA, embora cause

adaptações nas correntes de cálcio do tipo N, não altera as do tipo P/Q e R.

Um outro aspecto interessante a ser destacado é que, diferente da dor

neuropática, a dor inflamatória apresenta boa resposta à analgesia da morfina,

que apresenta até mesmo eficácia superior em quadros inflamatórios (STANFA

E DICKENSON, 1995; PRZEWŁOCKI E PRZEWŁOCKA, 2001; OBARA et al.,

2009). O contrário também acontece, drogas eficazes para o tratamento da dor

neuropática não apresentam a mesma eficácia para tratar dores de origem

inflamatória. De forma similar aos achados aqui descritos, a eficácia analgésica

da gabapentina na dor neuropática não é reproduzida na dor inflamatória

induzida por CFA (NAGAKURA et al., 2003).

A tolerância à analgesia da morfina em situações de dor neuropática

parece estar relacionada a mecanismos de sensibilização central comuns aos

envolvidos no desenvolvimento de tolerância a opióide (MAO et al., 1995; 2001;

MAYER et al., 1999). Do mesmo modo que em animais neuropáticos, a

administração intratecal de Tx3-3 também foi capaz de restituir a ação

analgésica da morfina em animais tolerantes a opióides. Além disso, a

administração prolongada de morfina pode, paradoxalmente, causar um quadro

de hiperalgesia conhecido como hiperalgesia induzida por opióide (OSSIPOV,

2003). Tal fenômeno é descrito em estudos clínicos (revisado por BANNISTER

E DICKENSON, 2010) e pré-clínicos (revisado por CHANG, CHEN E MAO,

2007) e tem sido relacionado à perda da eficácia da morfina com o seu uso

crônico. No presente estudo, além da tolerância à analgesia da morfina,

também foi observada a instalação de hiperalgesia térmica nos camundongos

_____________________________________________________________Discussão

submetidos ao protocolo de indução de tolerância a opióide, através do teste

de retirada da cauda.

O teste de retirada da cauda é normalmente utilizado, em estudos pré-

clínicos, para avaliar o efeito antinociceptivo de drogas opióides. Embora

inúmeros estudos demonstrem o estabelecimento de tolerância a opióides

através desse teste, a hiperalgesia induzida por opióide nem sempre é

evidenciada devido à alta intesidade do estímulo térmico aplicado, que não

permite detectar diminuição na latência da resposta de retirada (OSSIPOV et

al., 1995; SMITH, DOMBROWSKI E DEWEY, 1999; LIN et al., 2005). Por esse

motivo, nós adaptamos a metodologia descrita por Hargreaves e colaboradores

(1988), que utiliza um estímulo térmico radiante brando, originalmente

destinada a medir a latência de retirada de pata, para medir a resposta de

retirada da cauda. Dessa maneira foi possível observar o estabelecimento de

hiperalgesia térmica tanto em animais tolerantes quanto em animais

neuropáticos. É importante salientar que nos animais neuropáticos a

hiperalgesia foi detectada através da aplicação do estímulo térmico na cauda,

ou seja, numa área que não aquela primariamente lesionada, caracterizando

um quadro de hiperalgesia extraterritorial, que indica sensibilização central

(WOOLF 1983; JI E WOOLF 2001). Uma observação clínica interessante é que

o tratamento prolongado com opióides em geral produz dor em áreas do corpo

não relacionadas à queixa primária que levou ao uso do opióide e se manifesta,

entre outros aspectos, como uma diminuição no limiar de resposta a estímulos

térmicos (ALI, 1986; DE CONNO et al., 1991; ; WHITE, 2004; CHEN et al.,

2009).

_____________________________________________________________Discussão

A dor paradoxal causada por opióides, assim como a dor neuropática,

apresenta-se como sensações de queimação e choque (ALI, 1986, CHEN et

al., 2009), hiperestesia (ALI, 1986; ARNER, 1988; DE CONNO et al., 1991,

DEVULDER, 1997) e hiperalgesia (STILLMAN, MOULIN E, FOLEY, 1987;

ARNER, RAWAL E GUSTAFSSON, 1988; DE CONNO et al., 1991, CHEN et

al., 2009). Os mecanismos envolvidos na hiperalgesia induzida por opióide

ainda não estão bem estabelecidos mas tem sido associados, em estudos pré-

clínicos, com inúmeras alterações plásticas ocorridas na medula espinhal

(MAYER et al., 1999) que culminam em aumento da exocitose de

neurotransmissores excitatórios (GARDELL et al., 2002, MAO, PRICE E

MAYER, 1994; WEN et al., 2004, LIN et al., 2005 Ref), aumento da atividade

de receptores NMDA (TRUJILLO E AKIL, 1991; MAREK et al., 1991; MAO,

1999; LAULIN et al., 2002) e ativação de proteínas cinase (MAO E MAYER,

2001; ZEITZ et al., 2002; LIANG, LI E CLARK, 2004; TANG et al., 2006a;

CHEN, YANG E WANG, 2010).

Tanto a tolerância a opióides quanto o fenômeno de hiperalgesia

induzida por opióide convergem para o mesmo ponto: a diminuição do efeito

analgésico da morfina. Embora há muito estudado, os mecanismos

moleculares envolvidos na tolerância a opióides ainda não foram demonstrados

de maneira inequívoca (revisado por KIEFFER E EVANS, 2002). Do contrário,

uma série de conceitos e teorias sobre tal fenômeno tem sido abordados nos

diversos estudos da área. Algumas vertentes defendem que mecanismos

adaptativos compensatórios, como a superativação da adenilato ciclase e o

aumento das correntes de cálcio, inicialmente destinados a conter a contínua

inibição de tais sinalizações celulares causada pela ativação prolongada de

_____________________________________________________________Discussão

receptores MOR, acabam por sobressair e determinam um estado de

hiperexcitabilidade que diminui a eficácia da morfina (WELCH E OLSON, 1991;

GINTZLER E CHAKRABARTI, 2006). A idéia de que a tolerância a opióides é

fruto de adaptações celulares, mesmo que antiga, vem ao encontro do conceito

recente de que a tolerância a opióides se dá por mecanismos adaptativos na

medula espinhal, que culminam em hiperexcitabilidade - manifestada como

hiperalgesia - após o seu uso prolongado (OSSIPOV, 2003).

Classicamente, a tolerância a opióides é atribuída ao mecanismo de

dessensibilização via internalização do receptor MOR, comum aos receptores

acoplados à proteína G (FEGUSON, 2001). Esses receptores normalmente

estão sujeitos à regulação via fosforilação por cinases específicas (GRKs) que

sinalizam a ligação dos mesmos com proteínas -arristinas que irão ancorar o

receptor à proteína clatrina e induzir à internalização em endossomas

intracelulares, limitando, assim, o número de receptores na membrana

plasmática disponíveis para a ação de agonistas. Entretanto, o fenômeno de

internalização - estudado in vitro, através de técnicas de expressão em

sistemas heterólogos (através da transfecção do receptor MOR em células), -

jamais foi evidenciado com o agonismo da morfina, exceto quando receptores

“quiméricos”, heterodímeros de MOR e DOR, foram testados, ou através da

oligomerização de receptores MOR induzida por subdose de DAMGO – [D-

Ala

, N-MePhe

,Gly-ol

] - protótipo de agonista MOR que apresenta maior

eficácia intrínseca que a morfina, como demonstrado por He e colaboradores

em 2002. O trabalho de He e colaboradores, aliás, corrobora a teoria

sustentada por Whistler e colegas (1999) da internalização dependente do

complexo ligante-receptor, conhecida por RAVE (relative agonist versus

_____________________________________________________________Discussão

endocytosis), que relaciona a eficácia intrínseca do agonista com a proporção

de receptores internalizados como medida preditiva de tolerância (ALVAREZ,

ARTTAMANGKUL E WILLIAMS, 2001). Tais fenômenos evidenciados in vitro

não são suficientes, todavia, para esclarecer o fenômeno de tolerância in vivo.

Por exemplo, mesmo em animais knockout para o gene que codifica a proteína

-arristina (especificamente a -arristina-2) há desenvolvimento de tolerância,

ainda que mais tardio em relação aos animais que expressam a -arristina,

mesmo que o agonista opióide utilizado para tanto tenha sido o DAMGO

(BOHN, LEFKOWITZ E CARON, 2002). De qualquer maneira, o mecanismo de

tolerância via internalização de receptor MOR não se aplica ao presente

estudo, uma vez que o agonista opióide aqui utilizado foi a morfina. Um achado

interessante do trabalho que utilizou camundongos knockout para a -arristina

é que uma vez desenvolvida a tolerância, essa foi agudamente revertida

através da administração intraperitoneal de queleritrina, um inibidor da PKC

(BOHN, LEFKOWITZ E CARON, 2002). Além desse, uma série de estudos tem

mostrado que a inibição da PKC bloqueia o desenvolvimento de tolerância em

camundongos (NARITA et al., 1995; GRANADOS-SOTO et al., 2000; INOUE E

UEDA, 2000), porém, como em geral os inibidores de PKC inibem toda e

qualquer isoforma de PKC, não é possível identificar qual delas está

especificamente envolvida no fenômeno de tolerância. Contudo, através de

estudos com camundongos knockout para a isoforma gama da PKC (PKC),

Zeitz e colaboradores (2001) relataram redução na tolerância à morfina na

ausência dessa isoforma. Cabe aqui lembrar que a isoforma gama da PKC é

também implicada no desenvolvimento da dor neuropática (MALMBERG et al.,

2007b).

_____________________________________________________________Discussão

De fato, outra alternativa para explicar a tolerância a opióides seria a

dessensibilização dos receptores MOR via fosforilação (LIU E ANAND, 2001).

O receptor MOR exibe sítios de consenso à fosforilação pela PKC e CaMKII,

conservados entre diferentes espécies, incluindo ratos e humanos (CHEN,

1993; MIN et al., 1994; MESTEK et al., 1995). A ativação dessas cinases está

relacionada à dessensibilização de receptores MOR expressos em sistemas

heterólogos (MESTEK et al., 1995). A ação da CaMKII se dá em resíduos de

serina (S

261

e S

266

) localizados na terceira alça intracelular do receptor MOR,

num sítio muito próximo àquele relacionado com o acoplamento da proteína G

(KOCH et al., 1997; WANG et al., 2001), o que implica num possível

desacoplamento do receptor à proteína G via fosforilação. Além disso, a

CaMKII está co-localizada com receptores MOR em diversas áreas

relacionadas ao processamento da dor. Nas lâminas superficiais da medula

espinhal a proporção de neurônios que co-expressam ambas as proteínas

aumenta consideravelmente (BRÜGGEMANN et al., 2000). Segundo

Brüggemann e colaboradores (2000), na medula espinhal praticamente todos

os neurônios que expressam MOR também expressam CaMKII. Considerando

que a porção mais externa (ou ventral) da lâmina II da medula espinhal

também é rica em PKC, cinase expressa em interneurônios que normalmente

não estão envolvidos em processos nociceptivos, mas parecem ser críticos no

desenvolvimento da dor neuropática (MALMBERG et al., 1997b; BASBAUM et

al., 2009), é possível acreditar que, em situações particulares como na

tolerânica e na neuropatia, o receptor MOR sofra ação dessas cinases, que o

tornam inativo. Ainda, a porção da lâmina II que expressa PKC recebe

aferência de fibras não mielinizadas, que expressam o receptor P2X

e ligam-

_____________________________________________________________Discussão

se à isolecitina B4 (SCHERRER et al., 2009). Tais fibras também expressam os

CCDV do tipo P/Q (WESTENBROEK, HOSKINS E CATTERALL, 1998). Nos

dados aqui apresentados, o bloqueio de CCDV do tipo P/Q e R desencadeado

pela administração intratecal Tx3-3 restituiu o efeito da morfina em animais

tolerantes e neuropáticos. Logo, é possível sugerir que o bloqueio dos CCDV

reduza a ação dessas cinases - cuja ativação é dependente de cálcio - sobre o

receptor MOR. De acordo, Lee e colegas descreveram que o influxo de cálcio

via CCDV do tipo P/Q acarreta na ativação do complexo cálcio/calmodulina,

que por sua vez aumenta o influxo de cálcio – numa retroalimentação positiva

(LEE et al., 1999). Ainda que não se possa estabelecer uma relação direta,

nós também verificamos que a inibição da CaMKII, através da administração do

seu inibidor, o 1 - [N,O – bis (5 - isoquinolinesulphonyl) - N - metil - L – tirosil]-4-

phenilpiperazina, ou simplesmente KN62, por via intratecal, mimetizou o efeito

da Tx3-3 em animais tolerantes e neuropáticos (apêndice B, Figura II).

Ultimamente, alguns estudos tem demonstrado o envolvimento da

CaMKII espinhal na tolerância e hiperalgesia induzida por opióides (LIANG et

al., 2004; TANG et al., 2006a; SÁNCHEZ-BLÁZQUEZ et al., 2007; CHEN,

YANG E WANG, 2010). Além do mais, essa cinase está intimamente

relacionada a processos de neuroplasticidade e sensibilização central

envolvidos na dor crônica, incluindo a dor neuropática (DAI et al., 2005; CHEN

et al., 2009; FANG et al., 2002). O envolvimento da CaMKII na plasticidade

neuronal através da regulação de sítios pós-sinápticos é bem conhecida

(FANG et al., 2002 LEE, 2006). Em sítios pré-sinápticos, a CaMKII modula a

plasticidade neuronal interferindo na liberação de neurotransmissores

(CHAPMAN et al., 1995; LU E HAWKINS, 2006). A liberação de

_____________________________________________________________Discussão

neurotransmissores está atrelada ao influxo de cálcio através dos CCDV que

contem o sítio de ligação (synprint) para a maquinaria responsável pela

exocitose de vesículas sinápticas, como é o caso dos CCDV do tipo P/Q e N

(ZAMPONI, 2003). A atividade desses canais é rigorosamente regulada. O

CCDV do tipo P/Q, em particular, sofre regulação pela interação com a CaMKII,

que ao se ligar na porção C-terminal do canal modula a cinética de inativação

do mesmo, causando uma facilitação de longa duração no influxo de correntes

P/Q (LEE et al., 1999; JIANG ET AL., 2008). A modulação de CCDV do tipo

P/Q representa, por conseguinte, uma forma de regulação pré-sináptica da

liberação de neurotransmissores efetuada pela CaMKII. A inibição do influxo de

cálcio e a liberação de neurotransmissores através do bloqueio de correntes de

cálcio do tipo P/Q e R efetuados pela Tx3-3 já foi outrora mencionado. Porém,

cabe salientar que a Tx3-3 é também capaz de modular a cinética de

inativação desses canais, aumentando o grau de inativação das correntes P/Q

e R (LEÃO et al., 2000). Curiosamente, o composto KN62, designado como

inibidor da CaMKII por interagir com o domínio regulatório dessa enzima,

impedindo a sua autorfosforilação (TOKUMITSU et al., 1990) também é capaz

de atenuar a liberação de glutamato através da inibição de correntes de cálcio

(SIHRA AND PEARSON, 1995), provavelmente devido à sua ação regulátoria

em VDCC do tipo P/Q (JIANG ET AL., 2008). Logo, a modulação de CCDV,

em especial os do tipo P/Q, parece ser um mecanismo interessante para conter

mecanismos de neuroplasticidade. Embora não esteja fortemente envolvido na

liberação de neurotransmissores, os CCDV pré-sinápticos do tipo R também

estão ligados a mecanismos de neuroplasticidade, estando implicados na

indução de potencialização de longa duração (long term potentiation - LTP)

_____________________________________________________________Discussão

100

(DIETRICH et al., 2003). Embora a LTP, tenha sido originalmente evidenciada

em neurônios hipocampais (LØMO T, 2003), e por isso seja primariamente

relacionada a mecanismos de memória, tal fenômeno também é observado em

neurônios excitatórios da medula espinhal, em situações de sensibilização

central e hiperalgesia (JI et al., 2003; IKEDA, KIRITOSHI E MURASE, 2009)

presentes, por exemplo, na dor neuropática (ZIMMERMANN et al. 2001;

MATSUMURA et al., 2010) e na tolerância a opióides (ZHOU et al., 2010).

Os CCDV espinhais, de fato, parecem ser importantes para a

neuroplasticidade que acompanha a dor neuropática e a tolerância a opióides.

O bloqueio de CCDV espinhais, curiosamente os do tipo L, abole a hiperalgesia

e a tolerância a opióides em camundongos (DOGRUL et al., 2005). Animais

knockout para o gene que codifica o CCDV do tipo R (mas não os knockout

para o CCDV do tipo N) não desenvolvem tolerância a opióides (YOKOYAMA

et al., 2004). Além disso, já foi demonstrado o aumento nos níveis de cálcio

intracelular em preparações de sinaptossomas de medula espinhal de

camundongos tratados cronicamente com morfina (WELCH AND OLSON,

1991), o que implica em aumento na liberação de neurotransmissores.

Realmente, há um aumento na liberação de aminoáciodos excitatórios

(glutamato e aspartato), na medula espinhal de animais neuropáticos e

tolerantes a opióides (MAO, PRICE E MAYER, 1994; WEN et al., 1994;

GARDELL et al., 2002; 2003). Ou seja, a falta efeito da morfina na neuropatia e

na tolerância a opióides parece estar relacionada a adaptações no aparato de

exocitose sináptica espinhal, que se torna mais sucetível à estimulação,

produzindo hiperexcitabilidade, manifestada como hiperalgesia. Nesse sentido,

um recente estudo demonstrou que camundongos transgênicos que

_____________________________________________________________Discussão

101

superexpressam a subunidade 21 de CCDV, mimetizando uma situação de

neuropatia, apresentam hiperexcitabilidade neuronal e hiperalgesia que estão

diretamente relacionados ao aumento da liberação de glutamato de neurônios

pré-sinpaticos do corno dorsal da medula espinhal (NGUYEN et al., 2009).

Assim, drogas capazes de conter o aumento na transmissão sináptica seriam

efetivas não apenas no tratamento da dor neuropática como também no

tratamento da dor em situações de tolerância a opióides. De acordo com essa

premissa, Lin e colaboradores (2005) relataram que a administração intratecal

de gabapentina, restabelece a eficácia antinociceptiva da morfina em animais

tolerantes a opióides - quando administrada 30 minutos antes da administração

da dose desafio de morfina - por inibir a exocitose de aminoácidos excitatórios.

Os resultados aqui descritos estão em harmonia com os acima citados e

apontam para os CCDV como alvos proeminentes no controle da hiperalgesia

resistente à analgesia da morfina.

É interessante ressaltar que embora os CCDV do tipo P/Q e R não

sejam considerados fundamentais para a transmissão nociceptiva em

condições fisiológicas, papel desempenhado majoritariamente pelos CCDV do

tipo N, eles parecem ser importantes para transmissão dolorosa anormal que

ocorre, sobretudo, em situações de sensibilização central. Por exemplo, a

deleção do gene Cav2.1, que codifica a subunidade 1 de CCDV do tipo P/Q,

ou daquele que gera a subunidade 1 de CCDV do tipo R mantém intacta a

transmissão nociceptiva basal mas reduz a nocicepção em condições de

hiperalgesia, como a causada por neuropatia (SAEGUSA et al, 2000;

LUVISETTO et al., 2006). Como demonstrado na Figura I (apêndice A), a

administração intratecal de Tx3-3 só foi capaz de reduzir a segunda fase da

_____________________________________________________________Discussão

102

formalina (considerada resultado da sensibilização central) quando

administrada após a indução do processo de sensibilização (após a

administração da formalina). Esse resultado está de acordo com estudos que

demonstram a participação de CCDV do tipo P/Q e R apenas na segunda fase

da formalina (MALMBERG E YAKSH, 1994; SAEGUSA et al, 2000;

LUVISETTO et al., 2006) e reforça a proposta de bloqueio dependente de

estado como mecanismo de ação da Tx3-3.

A inibição de mecanismos exclusivamente envolvidos em situações

patológicas é interessante para o desenvolvimento de fármacos eficazes e

seguros. A dor neuropática, por ter etiologia diversa, pode apresentar diversos

mecanismos alvos para o seu tratamento. Um mecanismo largamente atribuído

à dor neuropática, incluindo a causada por trauma e a causada por diabetes, é

o aumento da expressão da subunidade 2 de CCDV (NEWTON et al., 2001;

YUSAF et al., 2001; LUO et al., 2002). No entanto, a subunidade 2 pode

coexistir com qualquer uma das subunidades 1 dos diferentes CCDV.

Inclusive, a ação analgésica da gabapentina e de seus congêneres (como a

pregabalina) na dor neuropática parece depender de mecanismos adicionais à

ligação na subuindade 2 dos CCDV, já que, em ratos, outras drogas com

afinidade por essa subunidade não foram capazes de reduzir a nocicepção

causada pela ligação do nervo espinhal (LYNCH et al., 2006). Um dado

interessante, é que a co-expressão da subunidade 2 com a subunidade 1

dos CCDV do tipo N reduz a afinidade de -conotoxinas - inclusive a da -

conotoxina MVIIA – por esses canais (MOULD et al., 2004), o que poderia estar

relacionado à estreita janela terapêutica da ziconotida. De particular relevância,

foi demonstrado que a inibição da transmissão sináptica na medula espinhal

_____________________________________________________________Discussão

103

causada pela gabapentina é atribuída ao bloqueio de correntes de cálcio do

tipo P/Q (BAYER, AHMADI E ZEILHOFER, 2004). Embora não possamos

afirmar com certeza, dados preliminares (não mostrados aqui) demonstram que

a toxina Tx3-3 também é capaz de se ligar na subuindade 2 de CCDV.

Além da eficácia na dor neuropática, o reestabelecimento da eficácia da

morfina causado pela administração intratecal de Tx3-3 é um achado

interessante já que a morfina é um dos analgésicos mais efetivos no alívio

completo da dor. E, por mais que o uso contínuo desse opióide possa produzir

hipersensibilidade dolorosa, o uso de morfina no tratamento da dor crônica

proporciona a melhoria do bem estar geral e do humor dos pacientes

(TASSAIN et al., 2003; CHU, CLARK E ANGST, 2006; CHEN et al., 2009).

Logo, o ideal seria intervir nos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento

de sensibilização central que acompanham o tratamento com opióides. Os

resultados aqui relatados apontam os CCDV do tipo P/Q e R como alvos

promitentes.

Os dados aqui apresentados demonstram que a toxina Tx3-3, isolada do

veneno da aranha Phoneutria nigriventer, apresentou eficácia antinociceptiva,

com bom perfil terapêutico, em modelos animais de dor neuropática e permitiu

a ação da morfina em animais neuropáticos e tolerantes a opióides. Esses

resultados ressaltam o papel dos CCDV do tipo P/Q e R em estados

hiperalgésicos resistentes à analgesia da morfina e apontam a Tx3-3 como

uma toxina promissora para o tratamento da dor crônica refratária a opióides.

____________________________________________________________Conclusões

104

VII. CONCLUSÕES

____________________________________________________________Conclusões

105

VII. CONCLUSÕES

Tendo em vista os resultados obtidos no presente trabalho é possível

concluir que:

1. A administração intratecal e intracerebroventricular da toxina Tx3-3

causou efeito antinociceptivo no teste que avalia nocicepção aguda em

camundongos.

2. A administração de Tx3-3 por via intratecal ou intracerebroventricular

não causou efeitos motores adversos.

3. A toxina Tx3-3 apresentou melhor janela terapêutica do que a -

conotoxina MVIIC.

4. A toxina Tx3-3 não apresentou efeito antinociceptivo em modelo animal

de dor inflamatória crônica induzida por CFA.

5. A administração intratecal de Tx3-3 causou efeito antinociceptivo tanto

no modelo experimental de dor neuropática causada por trauma em

camundongos como no modelo experimental de dor neuropática

causada por diabetes em camundongos e ratos.

6. A administração intratecal de Tx3-3 restabeleceu a eficácia antinoceptiva

da morfina em modelos animais de dor resistentes a opióides.

_______________________________________________Referências Bibliográficas

106

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_______________________________________________Referências Bibliográficas

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_____________________________________________________________Apêndices

135

IX. APÊNDICES

_____________________________________________________________Apêndices

136

IX. APÊNDICES

APÊNDICE A - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE TX3-3 NO

COMPORTAMENTO NOCICEPTIVO EVOCADO POR FORMALINA.

O teste da formalina é considerado um modelo de dor evocada por

estímulo químico, com características de dor inflamatória aguda. A injeção de

formalina na pata traseira dos animais causa uma resposta tipicamente

bifásica: durante os primeiros 5 minutos observa-se intensa resposta

nociceptiva, que consiste em morder e/ou morder a pata injetada. O período de

0–5 minutos após a administração da formalina é chamado de fase

neurogênica. Logo após uma interfase, que dura aproximadamente 10 minutos,

onde pouca ou nenhuma resposta nociceptiva é observada, tem início a

segunda fase do teste, chamada de fase inflamatória. A fase inflamatória é

caracterizada por uma resposta do animal de lamber, morder, sacudir ou

proteger (manter recolhida) a pata injetada, que persiste por aproximadamente

1 hora (HUNSKAAR E HOLE, 1987). Para a realização do teste, foi injetado 20

µl de uma solução de 2,5% de formalina em água destilada (v/v) na pata direita

traseira dos camundongos. Imediatamente após a injeção, os animais foram

transferidos para uma caixa (20 x 20x 20 cm) com paredes e assoalho de vidro,

sendo que, sob o assoalho, foi mantido um espelho em um ângulo de 45º, para

otimizar a observação do comportamento do animal. O comportamento

nociceptivo – tempo, medido em segundos (s), em que o animal permaneceu

lambendo, mordendo, sacudindo a pata ou com a mesma recolhida – foi

observado nos primeiros 5 minutos (fase neurogênica) e dos 15 aos 30 minutos

(fase inflamatória) após a administração de formalina (CORRÊA E CALIXTO,

1993).

_____________________________________________________________Apêndices

137

A análise do efeito da Tx3-3 no teste da formalina foi feito através da

aplicação de dois protocolos de administração, denominados pré- e pós-

tratamento. No protocolo de pré-tratamento, os camundongos foram

administrados com 30 pmol/sítio de Tx3-3 por via intratecal 5 minutos antes da

injeção intraplantar de formalina. O pós-tratamento consistiu em administrar a

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) no período de interfase, 10 minutos após a

administração intraplantar de formalina (aproximadamente 5 minutos antes de

começar a fase inflamatória).

Quando pré-administrada (30 pmol/sítio, i.t., 5 minutos antes da

administração de formalina), a Tx3-3 não alterou o comportamento nociceptivo

dos camundongos em ambas as fases (Figura IA). Todavia, a administração de

Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) 10 minutos após a injeção de formalina inibiu em 47,5

± 15,6% o comportamento de nocicepção dos camundongos (Figura IB).

100

200

300

PBS (5 l/sítio, i.t.)

TX3-3 (30 pmol/sítio, i.t.)

fase

Comportamento nociceptivo(s)

100

200

300

fase

Comportamento nociceptivo(s)

_____________________________________________________________Apêndices

138

Figura I. Efeito da administração intratecal de Tx3-3 no comportamento nociceptivo

evocado por formalina. (A) Efeito do pré-tratamento com Tx3-3 (30 pmol/sítio, i.t.) 5 minutos

antes da injeção de formalina (2,5%; 20 µl/pata, s.c.). (B) Efeito do pós-tratamento com Tx3-3

(30 pmol/sítio, i.t) 10 minutos após injeção de formalina (2,5%; 20 µl/pata, s.c.). Os resultados

estão expressos como comportameno nociceptivo, em segundos (s). Cada coluna representa a

média de 8 a 10 animais e as linhas verticais expressam o erro padrão. A análise estatística foi

executada utilizando ANOVA de uma via seguida do teste post-hoc de Student-Newman-Keuls

P<0,05 denota o nível de significância em comparação ao grupo controle (tratado com PBS).

APÊNDICE B - EFEITO DA INIBIÇÃO DA CAMKII ESPINHAL NO EFEITO

ANTINOCICEPTIVO DA MORFINA

Da mesma maneira que a Tx3-3, a administração intratecal de KN62 (10

nmol/sítio) 15 minutos antes da administração de morfina (10 mg/Kg, i.p.)

recuperou o efeito antinociceptivo da morfina em camundongos tolerantes (o

%MPE da morfina foi de 88,1±11,9 e 71,6±11,9 nos animais não tolerantes e

tolerantes tratados com KN62, respectivamente – Figura IIA) e neuropáticos (o

%MPE da morfina foi de 0,9±2,8 and 47,8±9,5 nos camundongos neuropáticos

pré-tratados com PBS e KN62, respectivamente – Figura IIC). Como pode ser

visto nas Figuras IIB e IID, a inibição da CaMKII imediatamente antes da

administração de morfina (10 mg/Kg, i.p.) reverteu a hiperalgesia induzida pela

administração crônica de morfina e também a hiperalgesia produzida pela

neuropatia. No entanto, a pré-administração de KN62 (10 nmol/sítio, i.t.) não

causou aumento significativo do efeito antinociceptivo causado pela

administração de uma dose sub-efetiva de morfina (o %MPE causado pela

administração i.p. de 3 mg/Kg de morfina foi de -2,25 ± 3,55 e -0,97 ± 3,78 em

camundongos pré-tratados com PBS e KN62, respectivamente – dados não

mostrados).

_____________________________________________________________Apêndices

139

Figura II. Efeito da administração intratecal de KN62 na eficácia analgésica da morfina

em estados hiperalgésicos resistentes a opióides. (A) Efeito da administração de KN62 (10

nmol/sítio, i.t.) na eficácia analgésica da morfina (10 mg/Kg, i.p.) em camundongos submetidos

ao modelo de tolerância a opióides. (B) Efeito da administração de KN62 (10 nmol/sítio, i.t.) 15

minutos antes da administração de morfina (10 mg/Kg, i.p.) na hiperalgesia térmica causada

pelo modelo de tolerância a opióides. (C) Efeito da administração de KN62 (10 nmol/sítio, i.t.)

na eficácia analgésica da morfina (10 mg/Kg, i.p.) em camundongos neuropáticos. (D) Efeito da

administração de KN62 (10 nmol/sítio, i.t.) 15 minutos antes da administração de morfina (10

mg/Kg, i.p.) na hiperalgesia térmica induzida por neuropatia. Os resultados estão expressos

como % MPE. Cada coluna ou ponto representam a media de 8 a 9 animais e as linhas

verticais expressam o erro padrão. Os símbolos * e # denotam os níveis de significância em

comparação aos grupos controle. *P<0,05 e ***P<0,001 referem-se à diferença significativa em

relação ao grupo tratado com PBS ;

P<0,05 refere-se à diferença significativa em relação ao

grupo tolerante a opióides (B) ou ao grupo neuropático (D).

100

5 15 45

vehicle (5 L/sítio, i.t.)

KN62 (10 pmol/sítio, i.t.)

KN62 ou

PBS (i.t.)

morfina

(10 mg/kg, i.p.)

KN62 (10 nmol/sítio, i.t.)

adm. repetida

de salina

adm. repetida

de morfina

vehicle (5 L/sítio, i.t.)

***

Tempo (min)

%MPE

-50

-25

100

PBS (5l/sítio, i.t.)

KN62 (10 nmol/sítio, i.t.)

salina (10 ml/Kg, i.p.)

morfina (10 mg/Kg, i.p.)

adm. repetida de salina

adm. repetida de morfina

***

%MPE

-50

-25

100

neuropático

falso operado

PBS (5l/sítio, i.t.)

KN62 (10 nmol/sítio, i.t.)

salina (10 ml/Kg, i.p.)

morfina (10 mg/Kg, i.p.)

***

%MPE

100

PBS (5 l/sítio, i.t.)

KN62 (10 nmol/sítio, i.t.)

PBS (5 l/sítio, i.t.)

KN62 (10 nmol/sítio, i.t.)

5 15 45

falso operado

neuropático

morfina

(10 mg/kg, i.p.)

KN62 ou

PBS (i.t.)

***

Tempo (min)

%MPE

_____________________________________________________________Apêndices

140

APÊNDICE C- MANUSCRITO SUBMETIDO À REVISTA PAIN

_____________________________________________________________Apêndices

141

_____________________________________________________________Apêndices

142

_____________________________________________________________Apêndices

143

_____________________________________________________________Apêndices

144

_____________________________________________________________Apêndices

145

_____________________________________________________________Apêndices

146

_____________________________________________________________Apêndices

147

_____________________________________________________________Apêndices

148

_____________________________________________________________Apêndices

149

_____________________________________________________________Apêndices

150

_____________________________________________________________Apêndices

151

_____________________________________________________________Apêndices

152

_____________________________________________________________Apêndices

153

_____________________________________________________________Apêndices

154

_____________________________________________________________Apêndices

155

_____________________________________________________________Apêndices

156

_____________________________________________________________Apêndices

157

_____________________________________________________________Apêndices

158

_____________________________________________________________Apêndices

159

_____________________________________________________________Apêndices

160

_____________________________________________________________Apêndices

161

_____________________________________________________________Apêndices

162

_____________________________________________________________Apêndices

163

_____________________________________________________________Apêndices

164

_____________________________________________________________Apêndices

165

_____________________________________________________________Apêndices

166

_____________________________________________________________Apêndices

167

_____________________________________________________________Apêndices

168

_____________________________________________________________Apêndices

169

_____________________________________________________________Apêndices

170

_____________________________________________________________Apêndices

171

_____________________________________________________________Apêndices

172

_____________________________________________________________Apêndices

173

_____________________________________________________________Apêndices

174

_____________________________________________________________Apêndices

175

_____________________________________________________________Apêndices

176

_____________________________________________________________Apêndices

177

_____________________________________________________________Apêndices

178

_____________________________________________________________Apêndices

179

_____________________________________________________________Apêndices

180

_____________________________________________________________Apêndices

181

_____________________________________________________________Apêndices

182

Figure 1

_____________________________________________________________Apêndices

183

Figure 2

_____________________________________________________________Apêndices

184

Figure 3

_____________________________________________________________Apêndices

185

Figure 4

_____________________________________________________________Apêndices

186

Figure 5

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