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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
LEONARDO GOMES SOUZA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE
NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO
TOPOTECANO
Goiânia
2010
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LEONARDO GOMES SOUZA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE
NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO TOPOTECANO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Goiás, como parte
dos requisitos para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas
Área de Concentração: Fármacos e
Medicamentos
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto
Goiânia
2010
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
GPT/BC/UFG
S729d
Souza, Leonardo Gomes.
Desenvolvimento e caracterização de nanopartículas
lipídicas contendo topotecano [manuscrito] / Leonardo
Gomes Souza. - 2010.
85 f. : il., tabs.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Goiás,
Faculdade de Farmácia, 2010.
Bibliografia.
Inclui lista de figuras e abreviaturas.
1. Microemulsão – diluição. 2. Nanopartículas lipídicas
sólidas. 3. Carreadores lipídicos nanoestruturados. 4.
Cloridrato de topotecano. 5. Fármacos hidrofílicos. I. Título.
CDU: 615.014.6
LEONARDO GOMES SOUZA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
LIPÍDICAS CONTENDO TOPOTECANO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Goiás, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas
Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos
Aprovada em Goiânia no dia 29 de outubro de 2010.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Luís Alexandre Pedro de Freitas
Universidade de São Paulo
Profa. Dra. Marize Campos Valadares Bozinis
Universidade Federal de Goiás
Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto
Universidade Federal de Goiás
A Deus, por ser o meu Tudo.
Aos meus pais, José e Celeste, e à
minha irmã Lorenna, por sempre
acreditarem em mim.
Às minhas sobrinhas, Andrya e
Lavinnya, por tornarem meus
dias mais alegres.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Ricardo Neves Marreto, por me ensinar a ser um
pesquisador. Obrigado pelo apoio incondicional e pelas palavras de incentivo.
À Emmanuelle, por assumir comigo este desafio e não medir esforços para a
realização deste trabalho. Obrigado pelo carinho, comprometimento e amizade.
Ao André Luís, por estar presente em todos os momentos. Obrigado pelo
comprometimento e amizade.
À Stephânia, pelas trocas de conhecimento e por estar sempre disposta a ajudar.
Obrigado pelo carinho e pelas palavras de estímulo.
À Mariana Mota, pela realização dos estudos de citotoxicidade.
Ao Rodolpho Braga, pela realização dos estudos de espectrometria de massas.
À Marilisa, por manter a organização do laboratório permitindo o bom andamento
dos experimentos e pelas risadas na sala do Massas.
À Fernanda Bellato, pelos atenciosos “bons-dias” e por cuidar de todos nós com
carinho de mãe.
À Profa. Dra. Danielle Guimarães Almeida Diniz, por me ensinar a dar os primeiros
passos no uso do HPLC.
À Profa. Dra. Eliana Martins Lima, pelas contribuições no trabalho.
A todos da família FarmaTec, pelos momentos de descontração e contribuição na
realização deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
auxílio financeiro concedido a este projeto.
Pedras no caminho? Guardo todas, um
dia vou construir um castelo...
Fernando Pessoa
RESUMO
O cloridrato de topotecano (TPT), derivado semi-sintético hidrofílico da
camptotecina, é um fármaco antineoplásico inibidor da topoisomerase I. A
encapsulação do TPT em nanocarreadores pode protegê-lo da inativação no pH
plasmático, além de contornar o problema da resistência celular mediada pela
glicoproteína-P (P-gp). No presente trabalho foram produzidas nanopartículas
lipídicas sólidas (NLS) contendo TPT por três técnicas diferentes: homogeneização
sob alta pressão a frio (HAPF), preparo de emulsão múltipla (PEMM) e diluição de
microemulsão (DMM). Sistemas derivados das NLS, os carreadores lipídicos
nanoestruturados (CLN) foram produzidos apenas por DMM. A temperatura mostrou-
se como fator limitante na produção de nanopartículas contendo TPT, devendo ser
rigorosamente controlada. As nanopartículas (NLS e CLN) produzidas por DMM
apresentaram melhor eficiência de encapsulação (EE%), distribuição de tamanho de
partícula e carga de fármaco. Essas nanopartículas apresentaram tamanho médio
em torno de 150 nm, PdI 0,2 e potencial zeta médio de -45 mV. Apesar da
encapsulação de fármacos hidrofílicos em matrizes lipídicas ser tarefa difícil, as
nanopartículas lipídicas contendo TPT apresentaram carga de fármaco em torno de
6% com EE% maior que 95%. A encapsulação do TPT em nanopartículas lipídicas
prolongou sua liberação por 12 horas e protegeu o fármaco da degradação em pH
7,4 a 37°C. A nanoencapsulação do TPT também aumentou sua citotoxicidade em
células leucêmicas K562 nos períodos de 2 e 24 horas. Não houve diferenças entre
os CLN e as NLS nos estudos de liberação, citotoxicidade e estabilidade. A trealose
foi um crioprotetor eficaz na liofilização dos CLN e das NLS contendo TPT. As NLS e
os CLN liofilizados com 15% de trealose permaneceram estáveis por pelo menos 30
dias. Os carreadores lipídicos nanoestruturados e as nanopartículas lipídicas sólidas
contendo topotecano obtidos no presente trabalho apresentam potencial para
melhorar a resposta clínica associada à administração parenteral deste importante
fármaco citotóxico.
Palavras-chave: Diluição de microemulsão. Nanopartículas lipídicas sólidas.
Carreadores lipídicos nanoestruturados. Cloridrato de topotecano. Fármacos
hidrofílicos.
ABSTRACT
Topotecan (TPT), hydrophilic semisynthetic analogue of camptothecin, is a
topoisomerase I inhibitor anticancer agent. Encapsulation of TPT in nanocarriers can
protect him from inactivation on plasmatic pH and P-glycoprotein (P-gp) mediated
resistance. In this study, solid lipid nanoparticles (SLN) were produced by three
different methods: cold high pressure homogenization (CHPH), double emulsion
prepare (DEMP) and microemulsion dilution (MMD). Derivative systems from NLS,
nanostructured lipid carriers (NLC) were produced only by MMD. Temperature
proved to be a limiting factor in producing nanoparticles loaded TPT and must be
strictly controlled. Nanoparticles produced by MMD (SLN and NLC) presented best
encapsulation efficiency, drug loading and particle size distribution. These particles
presented 150 nm average diameter, 0.2 PdI and -45 mV average zeta potential.
Despite the hydrophilic drugs encapsulation to be a hard work, lipid nanoparticles
loaded TPT presented 6% drug loading and an encapsulation efficiency biggest then
95%. Encapsulation of TPT in lipid nanoparticles sustained drug release by 12 hours
and protected the drug from degradation at pH 7,4 at 37°C. Drug nanoencapsulation
also increased his citotoxicity on K562 leucemic cells at 2 and 24 hours. There
weren’t differences between NLC and SLN on release, citotoxicity and stability
studies. Threalose was an efficient cryoprotector on lyophilization of SLN and NLC
loaded TPT. Lyophilizates NLC and SLN with 15% of threalose stayed stable almost
for 30 days. Nanostructured lipid carriers with high topotecan chloridrate loading
obtained in this work presented potential to improve clinical efficacy associated with
parenteral administration of this important citotoxic drug.
Key-words: Microemulsion dilution. Solid lipid nanoparticles. Nanostructured lipid
carriers. Topotecan chloridrate. Hydrophilic drugs.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema representativo do mecanismo de ação da
glicoproteína-P. O fármaco que entra na célula é bombeado para o meio
extracelular por um mecanismo ATP-dependente. Fonte: adaptado de
Krishna e Mayer, 2000...................................................................................
20
Figura 2 – Esquema representativo da permeabilidade aumentada em
tumores. O tecido saudável é caracterizado por um endotélio contínuo
onde somente o fármaco livre consegue permear. No tecido tumoral o
endotélio vascular fenestrado permite o extravasamento das
nanopartículas. Fonte: adaptado de Gaumet et al., 2008..............................
21
Figura 3 – Esquema representativo de uma nanoemulsão (A) e uma
nanopartícula lipídica sólida (B). Fonte: Müller et al, 2000............................
22
Figura 4 – Esquema representativo dos carreadores lipídicos
nanoestruturados e das nanopartículas lipídicas sólidas. Os cristais
lipídicos das NLS adquirem um arranjo mais perfeito durante o período de
armazenamento acarretando na expulsão do fármaco, o que não ocorre
com os CLN. Fonte: Müller et al., 2002.........................................................
23
Figura 5 – Estrutura química da camptotecina.............................................
24
Figura 6 – Obtenção do topotecano a partir da camptotecina. A síntese do
topotecano foi realizada adicionando-se um grupo dimetilamino e uma
hidroxila no anel A da camptotecina..............................................................
25
Figura 7 – Conversão da forma ativa (lactona) do topotecano em sua
forma inativa (carboxilato)..............................................................................
26
Figura 8 – Esquema ilustrando a encapsulação de um fármaco catiônico
hidrofílico em uma nanopartícula híbrido polímero-lipídio (PLN). D+
representa o fármaco catiônico e a linha curva representa o polímero
aniônico. O complexo é formado pela neutralização das cargas das
moléculas, que é encapsulado na nanopartícula lipídica. Fonte: Wong et
al., 2007.........................................................................................................
28
Figura 9 – Fluxograma do processo de obtenção de NLS por
homogeneização sob alta pressão a quente e a frio. Fonte: adaptado de
Mehnert e Mäder, 2001..................................................................................
30
Figura 10 – Esquema representativo da encapsulação de fármacos
hidrofílicos em NLS pela técnica de emulsão múltipla. As cabeças polares
do lipídeo formam uma camada externa ao redor de toda partícula. O
fármaco (F) fica inserido no meio aquoso formado pelas micelas reversas
e as caudas hidrofóbicas dos tensoativos (Tens.) ficam ancoradas nas
longas cadeias alquilas do lipídeo. Fonte: adaptado de Liu et al,
2007...............................................................................................................
31
Figura 11 – Produção de nanopartículas lipídicas sólidas por
homogeneização sob alta pressão a frio. Adição do TPT à mistura de
lipídeos fundidos (A). Resfriamento da mistura em nitrogênio líquido após
adição do fármaco (B). Cominuição da massa sólida formada em gral e
pistilo (C). Preparo de suspensão do material sólido cominuído em
solução aquosa de poloxamer, sob resfriamento em banho de gelo (D).
Microfluidização da suspensão obtida (E).....................................................
39
Figura 12 – Produção de nanopartículas lipídicas sólidas por preparo de
emulsão múltipla. Gotejamento da solução de TPT sobre a solução
acetônica de lipídios em banho ultrassônico, formação da primeira
emulsão (A). Adição da solução de poloxamer 2,0% sobre a primeira
emulsão, formação da emulsão múltipla (B). Adição da solução de
poloxamer 1,6% sobre a emulsão múltipla e agitação mecânica para
eliminação do solvente orgânico e formação das NLS por precipitação dos
lipídios em meio aquoso (C)..........................................................................
40
Figura 13 – Produção de nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores
lipídicos nanoestruturados por diluição de microemulsão. Adição de água
à mistura fundida de lipídeos e tensoativos, seguida da formação da
microemulsão (A). Adição do fármaco à microemulsão formada (B).
Gotejamento da mistura (microemulsão + fármaco) em água gelada sob
cisalhamento em ultra-turrax (C)....................................................................
41
Figura 14 – Sistema de ultrafiltração Vivaspin 2, Sartorius. Fonte: Manual
Vivaspin, Sartorius.........................................................................................
43
Figura 15 – Célula de fluxo estático tipo “Franz”. Fonte: Adaptado do
manual Microette, Hanson Research.............................................................
46
Figura 16 – Células de fluxo estático tipo “Franz” acopladas em
equipamento de coleta automatizada, Hanson Research. Fonte: Manual
Microette, Hanson Research..........................................................................
46
Figura 17 – Espectro de absorbância do cloridrato de topotecano na
região do ultravioleta......................................................................................
49
Figura 18 – Perfil cromatográfico do cloridrato de topotecano obtido por
CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando coluna C18 (100x3 mm, 3 µm) mantida a
50°C, fase móvel TPA:ACN na razão de 88:12, com fluxo de 0,7 mL/min...
50
Figura 19 – Perfil cromatográfico do cloridrato de topotecano na presença
dos excipientes da formulação obtido por CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando
coluna C18 (100x3 mm, 3 µm) mantida a 50°C, fase móvel TPA:ACN na
razão de 88:12, com fluxo de 0,7 mL/min......................................................
51
Figura 20 – Curva de calibração do cloridrato de topotecano......................
52
Figura 21 – Eficiência de encapsulação das formulações NLS1, NLS2 e
NLS4. NLS1 – produzida por homogeneização sob alta pressão a frio.
NLS2 – produzida por preparo de emulsão múltipla. NLS4 – produzida por
diluição de microemulsão...............................................................................
57
Figura 22 – Distribuição de tamanho em função da intensidade de
espalhamento de luz das nanopartículas produzidas por homogeneização
sob alta pressão a frio (NLS1), preparo de emulsão múltipla (NLS2) e
diluição de microemulsão (NLS3)..................................................................
57
Figura 23 – Cromatograma da amostra de fármaco total da formulação
NLS3. Corrida de 45 minutos. Obtido por CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando
coluna C18 (100x3 mm, 3 µm) mantida a 50°C, fase móvel TPA:ACN na
razão de 88:12, com fluxo de 0,7 mL/min......................................................
58
Figura 24 – Cromatograma da formulação NLS3 branca. Corrida de 30
minutos. Obtido por CLAE-UV (λ=381 nm) utilizando coluna C18 (100x3
mm, 3 µm) mantida a 50°C, fase móvel TPA:ACN na razão de 88:12, com
fluxo de 0,7 mL/min........................................................................................
59
Figura 25 – Cromatograma dos picos base da amostra de topotecano
degradado. Obtido por LC-MS/MS (m/z 300-900) utilizando coluna C18
(50 mm x 2,1 mm, 1,8 µm), fase móvel: Solvente A (água com 10mM
amônia pH 4,3) e solvente B (acetonitrila). Gradiente: 0 min, 0%B; 0,25
min, 0%B; 9 min 25% B; 11 min, 25%B; Stop time, 11 min; Post time, 5
min. Volume de injeção: 1 µL. Fluxo: 0,4 mL/min............................…………
59
Figura 26 – Reação de degração do topotecano quando submetido ao
aquecimento de 100-120°C em lipídeo fundido. O topotecano (1) sofre
reação de desalquilação levando a formação de um dímero (2). Depois
por reação de desaminação é formada a 10-hidroxicamptotecina (3), que
perde um grupo hidroxila originando a camptotecina (4)...............................
60
Figura 27 – Recuperação do topotecano das formulações NLS3 e NLS4.
NLS3 – produzida por diluição de microemulsão na faixa de temperatura
100-125°C. NLS4 – produzida por diluição de microemulsão na faixa de
temperatura 50-70°C.....................................................................................
61
Figura 28 – Representação esquemática do equipamento para produção
de NLS em larga escala a partir de microemulsões. Fonte: Marengo et al.,
2000...............................................................................................................
61
Figura 29 – Recuperação de fármaco das formulações CLN5 e CLN6.
CLN5 – 8% de carga de TPT. CLN6 – 10% de carga de TPT.......................
63
Figura 30 – Estabilidade do TPT em solução aquosa pH 4,5 a
temperatura de 25 e 37°C..............................................................................
65
Figura 31 – Estabilidade do TPT à temperatura de 25°C em solução
aquosa pH 7,4 e nas formulações CLN3 e NLS5 com pH ajustado para
7,4..................................................................................................................
66
Figura 32 – Estabilidade do TPT à temperatura de 37°C em solução
aquosa pH 7,4 e nas formulações CLN3 e NLS5 com pH ajustado para
7,4..................................................................................................................
67
Figura 33 – Perfil de difusão do TPT a partir da solução aquosa pH 4,5 e
perfis de liberação in vitro a partir das formulações CLN3 e NLS5..............
69
Figura 34 – Porcentagem de viabilidade celular de células K562, segundo
o método azul de tripano, após incubação com o fármaco livre e com as
formulações CLN3 e NLS5 por um período de 2 e 24 horas.........................
72
Figura 35 – Diâmetro médio e PdI dos CLN e das NLS liofilizadas durante
30 dias............................................................................................................
75
Figura 36 – Recuperação de fármaco e eficiência de encapsulação dos
CLN e das NLS liofilizadas durante 30 dias...................................................
75
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Acetonitrila
Carga de Fármaco
Carreador Lipídico Nanoestruturado
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acopla a Detector UV
Diluição de Microemulsão
Desvio Padrão do intercepto com o eixo x de três curvas de calibração
Desvio Padrão Relativo
Eficiência de Encapsulação
Homogeneização sob Alta Pressão a Frio
Homogeneização sob Alta Pressão a Quente
Inclinação da Curva
Cromatografia Líquida acoplacada a detector de massas
Limite de Detecção
Limite de Quantificação
Metanol Acidificado com 8,5% de ácido fosfórico
Nanopartículas Lipídicas Sólidas
Índice de Polidispersividade
Preparo de Emulsão Múltipla
Glicoproteína-P
Recuperação de Fármaco
Tampão Fosfato de Sódio 0,2M pH 7,4
Tampão Acetato pH 5,5 com 2,5% de trietilamina
Cloridrato de Topotecano
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................
16
2 REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................
17
2.1 A NANOTECNOLOGIA NA TERAPIA DO CÂNCER........................................
17
2.2 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS
NANOESTRUTURADOS........................................................................................
22
2.3 TOPOTECANO: HISTÓRICO, FARMACOLOGIA E INSTABILIDADE IN
VIVO........................................................................................................................
24
2.4 INCORPORAÇÃO DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS EM MATRIZES
LIPÍDICAS...............................................................................................................
27
3 OBJETIVOS.........................................................................................................
32
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................
32
4 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................
33
4.1 MATERIAIS.......................................................................................................
33
4.1.1 Substâncias e reagentes.............................................................................
33
4.1.2 Equipamentos e utensílios diversos..........................................................
33
4.2 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA........
35
4.2.1 Determinação do comprimento de onda de absorção máxima do
cloridrato de topotecano por espectrofotometria..............................................
35
4.2.2 Quantificação do cloridrato de topotecano por cromatografia líquida
de alta eficiência...................................................................................................
35
4.2.3 Validação da metodologia analítica...........................................................
35
4.2.3.1 Seletividade................................................................................................
35
4.2.3.2 Linearidade.................................................................................................
36
4.2.3.3 Limite de quantificação e detecção.............................................................
36
4.2.3.4 Precisão e Exatidão....................................................................................
36
4.2.3.5 Robustez.....................................................................................................
37
4.2.4 Cromatografia líquida acoplada a detector massa/massa (LC-MS/MS)..
37
4.3 PRODUÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO
CLORIDRATO DE TOPOTECANO........................................................................
37
4.3.1 Homogeneização sob alta pressão a frio..................................................
39
4.3.2 Preparo de emulsão múltipla......................................................................
40
4.3.3 Diluição de microemulsão...........................................................................
41
4.4 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS............................
42
4.4.1 Avaliação da distribuição de tamanho de partícula por espalhamento
dinâmico de luz.....................................................................................................
42
4.4.2 Avaliação do potencial zeta........................................................................
42
4.4.3 Análise da eficiência de encapsulação do cloridrato de topotecano
nas NLS e CLN......................................................................................................
43
4.4.3.1 Validação do sistema de ultrafiltração........................................................
44
4.4.4 Carga de Fármaco........................................................................................
44
4.4.5 Recuperação de Fármaco...........................................................................
44
4.5 ESTUDO DE SOLUBILIDADE..........................................................................
44
4.6 ESTUDO DE ESTABILIDADE..........................................................................
45
4.7 PERFIL DE LIBERAÇÃO IN VITRO.................................................................
45
4.8 ESTUDOS DE CITOTOXICIDADE ..................................................................
46
4.8.1 Cultura celular..............................................................................................
46
4.8.2 Avaliação da citotoxicidade do topotecano livre e nanoencapsulado
pelo teste de exclusão do azul de tripano..........................................................
47
4.9 LIOFILIZAÇÃO..................................................................................................
47
4.9.1 Estabilidade após liofilização.....................................................................
47
4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................
48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................
49
5.1 DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA........
49
5.1.1 Determinação do comprimento de onda de absorção máxima do
cloridrato e topotecano........................................................................................
49
5.1.2 Quantificação do topotecano por cromatografia líquida de alta
eficiência................................................................................................................
49
5.1.3 Validação da metodologia analítica...........................................................
50
5.1.3.1 Seletividade................................................................................................
50
5.1.3.2 Linearidade.................................................................................................
51
5.1.3.3 Limites de detecção e quantificação...........................................................
52
5.1.3.4 Precisão e exatidão....................................................................................
53
5.1.3.5 Robustez.....................................................................................................
53
5.2 VALIDAÇÃO DO SISTEMA DE ULTRAFILTRAÇÃO.......................................
54
5.3 PRODUÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS CONTENDO
CLORIDRATO DE TOPOTECANO........................................................................
54
5.3.1 Avaliação do potencial zeta........................................................................
63
5.4 ESTUDO DE SOLUBILIDADE..........................................................................
65
5.5 ESTUDO DE ESTABILIDADE..........................................................................
65
5.6 PERFIL DE LIBERAÇÃO IN VITRO.................................................................
65
5.6.1 Verificação da condição sink......................................................................
67
5.6.2 Liberação in vitro.........................................................................................
68
5.7 ESTUDOS DE CITOTOXICIDADE...................................................................
71
5.8 LIOFILIZAÇÃO..................................................................................................
73
5.8.1 Estabilidade após liofilização.....................................................................
74
6 CONCLUSÕES....................................................................................................
76
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................
77
16
1 INTRODUÇÃO
Apesar do constante desenvolvimento de novos agentes citotóxicos e regimes
terapêuticos, o grau de sucesso clínico da terapia antineoplásica permanece
insatisfatório (WONG et al., 2007). O fenômeno da resistência aos agentes
citotóxicos, sua ampla biodistribuição e toxicidade elevada nos tecidos normais,
representam algumas das principais limitações do uso desses agentes terapêuticos
(BRIGGER et al., 2002).
A incorporação dos agentes citotóxicos em carreadores nanoestruturados é
uma estratégia promissora para aumentar a eficácia e segurança do tratamento
medicamentoso (WONG et al., 2007). O uso de nanocarreadores dificulta o
reconhecimento do fármaco pela glicoproteína P (P-gp), intimamente ligada ao
aparecimento do fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (BRIGGER et al.,
2002). Além disso, os nanocarreadores podem ser passivamente direcionados para
a massa tumoral sólida com redução dos efeitos tóxicos do fármaco sobre os tecidos
normais (BRIGGER et al., 2002; WONG et al., 2007).
O uso dos nanocarreadores no tratamento do câncer pode ainda resultar na
diminuição da biotransformação do fármaco (BRIGGER et al., 2002), no aumento de
sua estabilidade química e no controle de sua biodisponibilidade (FENG E CHIEN,
2003; MULLER et al., 2000).
Nanoemulsões, lipossomas, micelas e nanopartículas poliméricas são
exemplos de nanocarreadores avaliados para a veiculação de fármacos citotóxicos,
entretanto, alguns desses sistemas possuem certas limitações quanto a sua
aplicação industrial (MULLER et al., 2000). As nanopartículas lipídicas sólidas (NLS)
são sistemas obtidos por técnicas simples e escalonáveis compostos por lipídeos
biocompatíveis que são sólidos sob temperatura ambiente e corporal. Esses
sistemas apresentam, em geral, menor custo de produção quando comparados aos
lipossomas, assim como melhor retenção do fármaco e estabilidade física frente às
nanoemulsões e lipossomas (MEHNERT e MADER, 2001; MULLER et al., 2000).
Em relação às nanopartículas poliméricas, as NLS apresentam menor toxicidade e
maior viabilidade de produção industrial (MEHNERT e MADER, 2001; MULLER et
al., 2000).
O cloridrato de topotecano (TPT), derivado hidrofílico semi-sintético da
camptotecina, é um potente agente citotóxico, cujo regime terapêutico para a via
17
parenteral e oral já foi estabelecido (GERRITS et al., 1998; HAO et al., 2005). A
incorporação do TPT em nanocarreadores pode melhorar seu desempenho clínico,
devido à diminuição dos mecanismos de resistência descritos para esse fármaco,
assim como pelo controle de sua variabilidade farmacocinética e, principalmente,
pela redução de sua instabilidade química in vivo (GARCIA-CARBONERO e
SUPKO, 2002).
O cloridrato de topotecano é administrado na dose de 4 mg/dia, que é
bastante reduzida quando comparada com a dose requerida para a maioria dos
agentes citotóxicos (GERRITS et al., 1998). A elevada potência do TPT é uma
característica importante para sua incorporação em nanopartículas lipídicas, pois as
mesmas apresentam, em geral, reduzida capacidade de incorporação de fármacos
(WESTESEN et al., 1997). A inclusão de fármacos hidrofílicos, como o topotecano,
em NLS é especialmente desafiadora, visto que seu particionamento na fase lipídica
fundida é um pré-requisito para a obtenção de sistemas com elevada carga e
eficiência de encapsulação (MÜLLER et al., 2000).
É válido ressaltar ainda que o anel lactônico do topotecano, cuja integridade é
fundamental para a atividade da molécula, apresenta importante instabilidade
química devido a uma rápida e intensa hidrólise pH-dependente. Em pH ácido a
forma lactônica predomina, mas uma rápida conversão acontece (para a forma
carboxilato) em pH neutro ou alcalino, como encontrado no plasma (FASSBERG e
STELLA, 1992). A conversão para a forma carboxilato deve ser controlada, uma vez
que ela é cerca de 10 vezes menos ativa, pouco absorvível e rapidamente eliminada
do organismo. A incorporação do TPT em sistemas lipídicos consiste em uma
estratégia para aumentar a estabilidade in vivo desse fármaco, visto que a imersão
do mesmo na matriz lipídica impede o acesso de moléculas de água e
conseqüentemente, impede a hidrólise do anel lactônico (GARCIA-CARBONERO e
SUPKO, 2002).
Existem inúmeras vantagens econômicas e tecnológicas associadas ao
desenvolvimento de NLS e a escolha apropriada da técnica de preparo desses
sistemas pode resultar em sistemas que apresentem elevada capacidade de
incorporação de fármacos hidrofílicos, como o TPT (MEHNERT e MÄDER, 2001). As
técnicas de diluição de microemulsão, emulsão múltipla e homogeneização sob alta
pressão foram empregadas neste trabalho visando obter formulações estáveis, com
elevada eficiência de encapsulação e controle adequado de liberação, que em última
18
instância apresentem elevado potencial para gerar benefícios clínicos na utilização
desse importante agente citotóxico.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A NANOTECNOLOGIA NA TERAPIA DO CÂNCER
O câncer hoje se configura como um problema de saúde pública, ocupando o
segundo lugar das causas de morte, perdendo apenas para as doenças
cardiovasculares. No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 apontam para
ocorrência de aproximadamente quinhentos mil novos casos da doença. Os tipos
mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os
cânceres de próstata e de pulmão no sexo masculino e do colo do útero no sexo
feminino (INCA, 2009).
O câncer resulta de um crescimento desordenado e disseminado de células
neoplásicas. Embora os mecanismos de formação e disseminação do câncer não
estejam ainda completamente elucidados, fatores externos (tabaco, produtos
químicos, radiação e infecções) e internos (distúrbios metabólicos hereditários,
hormônios e condições imunes) são relevantes. Esses fatores podem atuar juntos ou
seqüencialmente para iniciar e promover a carcinogênese (FENG e CHIEN, 2003).
A quimioterapia para o câncer é entendida como o uso específico de agentes
quimioterápicos para matar células cancerosas (FENG e CHIEN, 2003). Porém, a
baixa especificidade apresentada por esses fármacos em termos de distribuição e
farmacodinâmica constitui uma limitação à terapia. Os pacientes que recebem o
tratamento apresentam inúmeros efeitos adversos decorrentes da ação desses
agentes em tecidos saudáveis. Diante disso, o principal objetivo da quimioterapia do
câncer consiste em matar quantas células tumorais for possível preservando as
células saudáveis, o que constitui um grande desafio no tratamento dessa
enfermidade (WONG et al., 2007).
Outro entrave para o sucesso da terapia antineoplásica é a resistência
apresentada pelas células tumorais a um grande número de fármacos citotóxicos.
Dentre os principais mecanismos de resistência, ressalta-se aquele mediado pela
glicoproteína-P (P-gp), uma importante proteína de membrana que bombeia o
fármaco para fora da célula por um mecanismo ATP dependente, conforme ilustrado
na Figura 1. Duas propriedades marcantes dessa proteína merecem ser destacadas:
apresenta elevada inespecificidade, incluindo muitos antineoplásicos, e está
presente em muitas barreiras farmacológicas essenciais, como na membrana do
20
epitélio apical do intestino, nos túbulos proximais dos rins, no canalículo biliar das
membranas dos hepatócitos, na membrana das células endoteliais do lúmem da
barreira hematoencefálica e na membrana apical dos trofoblastos da placenta.
Muitas células tumorais apresentam super-expressão de P-gp (BRIGGER et al.,
2002; SCHELLENS et al., 2000).
Figura 1 – Esquema representativo do mecanismo de ação da glicoproteína-P. O fármaco
que entra na célula é bombeado para o meio extracelular por um mecanismo ATP-
dependente. Fonte: adaptado de Krishna e Mayer, 2000.
O uso de nanocarreadores consiste em estratégia para eliminar os efeitos da
P-gp e obter uma terapia alvo específica no tratamento do câncer. O antineoplásico
localizado dentro de uma nanopartícula pode entrar na célula sem ser reconhecido
pela P-gp, aumentando assim sua ação citotóxica (BRIGGER et al., 2002).
Através do mecanismo de permeabilidade e retenção aumentada (EPR,
“enhanced permeability and retention”), pode-se obter o direcionamento passivo das
nanopartículas para o tecido tumoral. Durante o crescimento tumoral, o processo de
neovascularização é caracterizado pela formação de um endotélio descontínuo com
fenestrações largas (na faixa entre 20 a 780 nm), permitindo a passagem das
nanopartículas. Além disso, o sistema linfático apresenta-se bastante comprometido
em tumores, ocasionando a retenção das nanopartículas no interstício do tumor.
Como resultado, as nanopartículas tendem a entrar e permanecer no tecido tumoral
21
mais que em outros tecidos (MATSUMURA e MAEDA, 1986 apud WONG et al.,
2007). A Figura 2 ilustra o mecanismo de permeabilidade aumentada em tumores.
Figura 2 – Esquema representativo da permeabilidade aumentada em tumores. O tecido
saudável é caracterizado por um endotélio contínuo onde somente o fármaco livre consegue
permear. No tecido tumoral o endotélio vascular fenestrado permite o extravasamento das
nanopartículas. Fonte: adaptado de Gaumet et al., 2008.
Ao explorar o mecanismo EPR, as nanopartículas promovem o
direcionamento passivo do fármaco para a massa tumoral. Também é possível
promover o direcionamento ativo de fármacos para as massas tumorais pela
modificação das características de superfície dos nanocarreadores, como por
exemplo, pela inserção de anticorpos que reconhecem proteínas que são
intensamente expressas nas membranas de células tumorais (BRIGGER et al.,
2002). Para conseguir realizar de forma eficiente o direcionamento ativo ou passivo
dos fármacos incorporados, os nanocarreadores devem apresentar revestimentos
apropriados em sua superfície, de forma a não serem reconhecidos pelo sistema
reticuloendotelial. Além disso, é importante garantir liberação prolongada do fármaco
para que o mesmo só seja liberado dentro do tecido ou das células tumorais (FENG
e CHIEN, 2003).
22
2.2 NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS E CARREADORES LIPÍDICOS
NANOESTRUTURADOS
As nanopartículas lipídicas sólidas foram desenvolvidas no início da década
de noventa por diferentes grupos de pesquisa que buscavam obter sistemas
compostos por lipídeos sólidos sob temperatura ambiente e corporal. Esses
sistemas se assemelham as nanoemulsões empregadas na nutrição parenteral, no
entanto, o lipídeo líquido é substituído por um lipídeo sólido, como ilustrado na
Figura 3 (MÜLLER et al, 2000).
Figura 3 – Esquema representativo de nanoemulsão (A) e nanopartícula lipídica sólida (B).
Fonte: Müller et al, 2000
É importante ressaltar que esses sistemas combinam as vantagens de
lipossomas, nanocápsulas poliméricas e nanoesferas, ao mesmo tempo em que
minimizam os problemas associados a esses nanocarreadores (instabilidade física,
toxicidade dos componentes, dificuldade de escaloneamento) (WISSING et al.,
2004). A veiculação de fármacos citotóxicos em NLS vem sendo realizada e
inúmeros trabalhos já foram publicados (CAVALLI et al., 2000; CHEN et al., 2001;
HU et al., 2004; PELTIER et al., 2006; WILLIAMS et al., 2003; YANG et al., 1999;
ZHANG et. al., 2008).
Dentre as várias vantagens que as NLS oferecem, ressalta-se a possibilidade
de obter liberação prolongada e sítio-específica de fármacos, o aumento da
estabilidade desses fármacos, a reduzida toxicidade dos seus componentes, além
da facilidade de produção em larga escala e de esterilização (MEHNERT e MÄDER,
2001). Contudo, esse sistema apresenta baixa capacidade de carga e elevada
expulsão do fármaco durante o armazenamento, devido a transições polimórficas
dos lipídeos (WISSING et al., 2004).
Os componentes usuais das NLS são lipídeos sólidos, tensoativos e água. Os
lipídeos mais utilizados são os triglicerídeos (triestearina), ácidos graxos (ácido
23
esteárico), esteróides (colesterol) e ceras (cetilpalmitato). Todas as classes de
tensoativos têm sido utilizadas para estabilizar a dispersão lipídica, sendo que a
combinação de tensoativos é mais eficiente em prevenir a agregação das partículas
(MEHNERT e MÄDER, 2001).
As NLS podem ser produzidas por diferentes técnicas, entre elas a
homogeneização sob alta pressão a quente ou a frio, diluição de microemulsão,
preparo de emulsão múltipla, emulsificação/evaporação de solvente ou difusão de
solvente (LIPPACHER et al., 2001; MEHNERT e MÄDER, 2001). Algumas dessas
técnicas serão abordadas com mais detalhes adiante.
Objetivando-se aumentar eficiência de encapsulação das NLS, assim como
diminuir ou evitar a expulsão do fármaco durante o período de armazenamento, foi
desenvolvido um sistema derivado das NLS, denominado carreador lipídico
nanoestruturado (CLN). Os CLN são produzidos da mesma forma que as NLS e
possuem as mesmas vantagens. Entretanto, possuem porcentagens variáveis de
lipídeos líquidos em sua composição. Isso leva a mais imperfeições na matriz
lipídica, o que aumenta os espaços para acomodar o fármaco acarretando em maior
eficiência de encapsulação (SOUTO et al., 2004; WISSING et al., 2004). Segundo
Müller e colaboradores (2002), os CLN são sólidos, mas amorfos, o que poderia
evitar ou diminuir a expulsão do fármaco durante o período de armazenagem, visto
que isso acontece devido a modificações nas formas polimórficas dos cristais
lipídicos das NLS. A Figura 4 apresenta a diferenciação entre NLS e CLN durante o
período de armazenamento.
Figura 4 – Esquema representativo dos carreadores lipídicos nanoestruturados e
nanopartículas lipídicas sólidas. Os cristais lipídicos das nanopartículas lipídicas sólidas
adquirem arranjo mais perfeito durante o período de armazenamento acarretando na
expulsão do fármaco, o que não ocorre com os CLN. Fonte: Müller et al., 2002.
24
2.3 TOPOTECANO: HISTÓRICO, FARMACOLOGIA E INSTABILIDADE IN VIVO
O cloridrato de topotecano (TPT) é um análogo semi-sintético da
camptotecina desenvolvido para contornar o problema da reduzida solubilidade
aquosa do composto protótipo (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002). O
protótipo, camptotecina (Figura 5), é um alcalóide quinoleínico, cuja estrutura
química consiste em um anel pentacíclico que inclui um pirrol, um anel quinolona e
um centro assimétrico com um anel α-lactona em configuração S (SRIVASTAVA, et
al., 2005). Esse alcalóide de ocorrência natural é encontrado na madeira, casca e
frutos da Camptotheca acuminata (PIZZOLATO e SALTZ, 2003), arbusto que cresce
nas províncias do sudeste asiático (HATEFI e AMSDEN, 2002). A camptotecina foi
isolada durante o período de 1950-1959 através de triagem realizada por Wall e
Wani em mais de mil extratos etanólicos de plantas (WALL e WANI, 1996). Na
medicina tradicional chinesa, a Camptotheca acuminata é utilizada na forma de
infusão no tratamento de várias doenças, incluindo tumores (POTMESIL, 1994).
Figura 5 – Estrutura química da camptotecina
Em 1966, o Instituto Nacional do Câncer dos EUA identificou a camptotecina
como antineoplásico, sendo que até o ano de 2004 já haviam sido publicados mais
de 3000 trabalhos sobre o fármaco (SRIVASTAVA et al., 2005). Como a
camptotecina era pouco solúvel, começou a se utilizar o seu sal sódico contendo a
forma carboxilato (menos potente) do fármaco. No entanto, eram necessárias doses
muito altas que causavam efeitos tóxicos nos pacientes, como granulocitopenia e
trombocitopenia (GERRITS et al., 1998). Estudos em fase II apresentaram efeitos
adversos graves (mielosupressão, vômitos, diarréia e cistite hemorrágica) e não
puderam ser continuados. Para contornar esse problema foram sintetizados
análogos hidrossolúveis da camptotecina. O TPT, 9-dimetilamino-10-
25
hidroxicamptotecina, foi o primeiro análogo a ser aprovado para uso clínico pela
Food and Drug Administration (FDA). Sua maior solubilidade em água deve-se ao
grupo dimetilamino no carbono nove do anel A (Figura 6) (PIZZOLATO e SALTZ,
2003; SRIVASTAVA, et al., 2005).
Figura 6 – Obtenção do topotecano a partir da camptotecina. A síntese do topotecano foi
realizada adicionando-se um grupo dimetilamino e uma hidroxila no anel A da
camptotecina.
A ação antineoplásica do TPT, assim como de todas as camptotecinas, deve-
se a sua ligação à enzima topoisomerase I. Essa enzima está ligada ao processo de
replicação do DNA, sendo responsável pelo desenovelamento da dupla fita no
momento da replicação, permitindo assim a atuação de outras enzimas envolvidas
no processo. Durante o desenovelamento a topoisomerase cliva uma das fitas de
DNA, formando um complexo de clivagem, para depois ligá-la novamente. Isso
permite que uma fita gire sobre a outra, desenovelando-se. O TPT liga-se
covalentemente a essa enzima impedindo a religação da fita através da
estabilização do complexo de clivagem, descontinuando o processo de replicação.
Esses eventos levam a ativação de caspases e morte celular (GERRITS et al., 1998;
GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002; POTMESIL, 1994).
Como a replicação do DNA ocorre na fase de síntese (S) do ciclo celular, as
camptotecinas são fase S específicas. Células na fase S são cem a mil vezes mais
sensíveis à camptotecina que células na fase G1 ou G2. Isso leva a implicações
importantes para o uso clínico desses fármacos, pois a eficácia terapêutica ótima de
agentes citotóxicos fase S específicos geralmente é alcançada com aumento da
freqüência de exposição das células tumorais ao agente citotóxico (PIZZOLATO e
SALTZ, 2003). A meia-vida biológica do TPT varia de 2,4 a 4,3 horas, muito mais
26
curta que o sal sódico da camptotecina e outros análogos. Conseqüentemente, a
dose de acumulação do fármaco não ocorre quando doses diárias são administradas
em infusões de trinta minutos por 5 dias (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002).
O TPT se liga às proteínas plasmáticas em uma fração de 7 a 35%, sua
eliminação é predominantemente resultante da conversão à forma carboxilato
seguida pela excreção renal (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002). Após vinte e
quatro horas do início do tratamento 40% do fármaco são excretados na urina
(POTMESIL, 1994).
Como acontece com outros antineoplásicos, muitas células apresentam
resistência ao TPT ligada ao fenótipo de resistência a múltiplos fármacos (MDR)
associada à glicoproteína-P (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002; LI et al.,
2006).
O TPT sofre hidrólise pH-dependente, em meio neutro a alcalino, traduzida
pela conversão reversível da sua forma ativa (lactona) em sua forma inativa
(carboxilato) pela abertura do seu anel lactônico (anel E) (Figura 7) (BURKE et al.,
1993). A conversão do fármaco em sua forma carboxilato diminui sua ligação às
membranas, assim como sua difusão pela bicamada lipídica e sua afinidade pela
topoisomerase I (HATEFI e AMSDEN, 2002). O equilíbrio na conversão plasmática
entre a forma lactônica e a forma carboxilato é atingido entre 5 a 10 minutos após o
término de uma infusão intravenosa de trinta minutos, e a fração lactônica no
equilíbrio é de apenas 30 a 40% da dose administrada. Comportamento similar é
observado após a administração oral do TPT (GARCIA-CARBONERO e SUPKO,
2002).
Figura 7 – Conversão da forma ativa (lactona) do topotecano em sua forma inativa
(carboxilato).
27
A encapsulação em lipossomas tem sido uma estratégia investigada para
estabilizar o cloridrato de topotecano in vivo. O uso de técnicas que exploram a
complexação com metais de transição e o gradiente de pH transmembrana têm
aumentado a eficiência de encapsulação desse fármaco em lipossomas (ABRAHAM
et al., 2004; HAO et al., 2005; LALOO et al., 2006; ZHANG et al., 2008; TAGGAR et
al., 2006; DRUMOND et al., 2010; GRAHN et al., 2009; TARDI et al., 2000). Até o
presente momento, não existem relatos da incorporação desse fármaco em sistemas
lipídicos sólidos.
O TPT é atualmente comercializado pela empresa Glaxo-SmithKline com o
nome comercial de Hycamtin
®
em apresentações farmacêuticas injetáveis de 4 mg e
cápsulas para administração oral de 0,25 e 1 mg (Hycamtin
®
, GSK). Esse
medicamento é indicado como terapia de segunda linha no tratamento do câncer de
ovário e de células pequenas do pulmão. Contudo, o fármaco tem demonstrado
atividade interessante contra tumores hematológicos, como leucemia
mielomonocítica crônica e síndromes mielodisplásicas e tumores pediátricos, como
rabdomiosarcoma, neuroblastoma, retinoblastoma, osteosarcoma e sarcoma de
tecidos moles (GARCIA-CARBONERO e SUPKO, 2002).
2.4 INCORPORAÇÃO DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS EM MATRIZES LIPÍDICAS
A obtenção de formulações de NLS com elevada eficiência de encapsulação
é especialmente difícil quando o fármaco possui natureza hidrofílica, pois depende
da solubilidade ou miscibilidade adequadas do fármaco no lipídeo fundido (LIU et al.,
2007). Dessa forma, as NLS carregadas com fármacos hidrofílicos apresentam, em
geral, eficiência de encapsulação reduzida (WONG et al., 2007), pois estes fármacos
tendem a se particionar para a fase externa aquosa do sistema em formação (XIE et
al., 2008).
No entanto, é possível melhorar a eficiência de encapsulação de fármacos
hidrofílicos em nanosistemas lipídicos pelo emprego de estratégias que aumentam a
lipofilicidade do fármaco ou impedem sua partição para a fase aquosa do sistema
(MÜLLER et al., 2002; GARCÍA-FUENTES et al., 2002; CAVALLI et al. 1995; WONG
et al., 2004).
A utilização de contra-íons orgânicos para formar pares iônicos com fármacos
hidrofílicos foi uma estratégia utilizada pelo grupo de Gasco e colaboradores para
28
aumentar a lipofilicidade desses fármacos (MOREL et al., 1996; CAVALLI et al.,
1995; CAVALLI et al., 2002). A lipofilicidade da tobramicina, um fármaco hidrofílico,
foi aumentada pela complexação com o contra-íon hexadecil fosfato de sódio, o que
permitiu sua encapsulação em NLS com uma carga de fármaco de 2,5% (CAVALLI
et al., 2002).
A formação de pares iônicos de fármacos com polímeros, como o sulfato de
dextrana, é outra estratégia utilizada pelo grupo de Wu e colaboradores, originando
uma nova partícula chamada de “nanopartícula híbrido polímero-lipídeo” (PLN)
(WONG et al., 2004; WONG et al., 2007; LI et al., 2008; LI et al., 2006). Nesse tipo
de sistema a carga do fármaco iônico é neutralizada por cargas do polímero e o
complexo fármaco-polímero é então incorporado ao lipídeo para a produção das
nanopartículas, como pode ser observado na Figura 8 (WONG et al., 2007). Com
este método, a eficiência de encapsulação de fármacos hidrofílicos como o
verapamil e doxorubicina em NLS aumentou de 20 a 35% para mais de 80%
(WONG et al., 2004).
Figura 8 – Esquema ilustrando a encapsulação de um fármaco catiônico hidrofílico em uma
nanopartícula híbrido polímero-lipídio (PLN). D+ representa o fármaco catiônico e a linha
curva representa o polímero aniônico. O complexo é formado pela neutralização das cargas
das moléculas, que é encapsulado na nanopartícula lipídica. Fonte: Wong et al., 2007.
Por fim, a conjugação de fármacos hidrofílicos com lipídeos também tem sido
empregada com o intuito de aumentar a lipofilicidade desses fármacos. A
conjugação pode ser realizada por ligações covalentes ou simplesmente pela
formação de um sal com um ácido graxo, no caso de fármacos que possuem
grupamentos adequados. Nessa técnica, as nanopartículas podem ser produzidas
somente com o conjugado fármaco-lipídeo ou pode-se adicionar o conjugado a um
lipídeo (WISSING et al., 2004; MUCHOW et al., 2008).
29
É importante ressaltar que a eficiência de encapsulação de fármacos
hidrofílicos em nanosistemas lipídicos também pode ser melhorada pelo
aperfeiçoamento das técnicas de preparo e composição da formulação.
Homogeneização sob alta pressão a frio (HAPF), preparo de emulsão múltipla
(PEMM) e diluição de microemulsão (DMM) são exemplos de técnicas de preparo
que podem ser trabalhadas para melhorar a encapsulação de fármacos hidrofílicos.
A homogeneização sob alta pressão em suas modalidades “a frio” (HAPF) ou
“a quente” (HAPQ) é um dos processos mais interessantes para a obtenção de
nanopartículas, pois já é empregada há algum tempo na indústria para o preparo de
emulsões para nutrição parenteral. Na HAPQ, o lipídeo encontra-se fundido em
todas as etapas de produção, o que permite maior migração do fármaco para a fase
aquosa. Por outro lado, na HAPF, o fármaco é incorporado no lipídeo fundido, mas a
mistura é rapidamente solidificada em nitrogênio líquido, triturada para obtenção de
micropartículas lipídicas e somente então é misturada a uma solução aquosa de
tensoativos, sob cisalhamento. A pré-suspensão obtida é, em seguida, submetida à
homogeneização sob alta pressão, onde ocorre a formação das NLS. A temperatura
das etapas de cisalhamento e homogeneização deve ser controlada para evitar a
fusão do lipídeo e, por conseguinte, a perda do fármaco para a fase aquosa
(MEHNERT e MÄDER, 2001; WISSING et al., 2004; MÜLLER et al., 2000). A Figura
9 apresenta um fluxograma resumindo as duas técnicas de homogeneização sob
alta pressão.
30
Figura 9 – Fluxograma do processo de obtenção de NLS por homogeneização sob alta
pressão a quente e a frio. Fonte: adaptado de Mehnert e Mäder, 2001.
Na técnica de preparo de emulsão múltipla (PEMM), o fármaco hidrofílico é
encapsulado na fase interna de uma emulsão múltipla A/O/A. Ao contrário das
outras técnicas, aqui o lipídeo não é fundido, mas solubilizado em um solvente
orgânico. As NLS se formam quando o solvente orgânico é eliminado por difusão ou
evaporação e o lipídeo precipita no meio aquoso (WISSING et al., 2004; LIU et al.,
2007). A Figura 10 apresenta uma representação esquemática da incorporação de
um fármaco hidrofílico em NLS por meio dessa técnica.
31
Figura 10 – Esquema representativo da encapsulação de fármacos hidrofílicos em NLS pela
técnica de emulsão múltipla. As cabeças polares do lipídeo formam uma camada externa ao
redor de toda partícula. O fármaco (F) fica inserido no meio aquoso formado pelas micelas
reversas e as caudas hidrofóbicas dos tensoativos (Tens.) ficam ancoradas nas longas
cadeias alquilas do lipídeo. Fonte: adaptado de Liu et al, 2007.
A técnica de diluição de microemulsão (DMM) foi desenvolvida pelo grupo de
Gasco e colaboradores (GASCO, 1993). Nessa técnica uma microemulsão é
preparada a quente por agitação, sendo depois diluída mediante agitação em um
excesso de água gelada (WISSING et al., 2004). A microemulsão deve ser
composta por lipídeos com baixo ponto de fusão, de forma que, quando a mesma
entra em contato com a água gelada os lipídeos sofrem cristalização, formando as
NLS (MARENGO et al., 2000). Quando a velocidade e forma de resfriamento da
microemulsão são controladas, a precipitação do fármaco pode ocorrer antes da
recristalização do lipídeo. Isso significa que o fármaco estará concentrado mais na
região interna das NLS e, conseqüentemente, a perda do fármaco para a fase
aquosa será menor (MÜLLER et al., 2000).
Muitas variáveis dessa técnica podem afetar as características das NLS
obtidas. Os lipídeos utilizados para a obtenção da microemulsão, a técnica de
preparo (agitação, temperatura), a velocidade de adição da microemulsão na água
gelada, assim como o volume de água são exemplos destas variáveis (WISSING et
al., 2004).
A encapsulação do TPT em NLS constitui-se, portanto, em um desafio
tecnológico relevante. A escolha da técnica de preparo e dos componentes da
formulação é bastante relevante para a obtenção de nanosistemas com elevada
eficiência de encapsulação e que apresentem liberação controlada do fármaco
incorporado.
32
3 OBJETIVOS
O objetivo do presente trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar a
estabilidade e citotoxicidade de nanopartículas lipídicas sólidas e carreadores
lipídicos nanoestruturados contendo cloridrato de topotecano.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Desenvolver e validar metodologia analítica para quantificação do
topotecano nas nanopartículas.
Produzir nanopartículas lipídicas contendo topotecano pelos métodos de
homogeneização sob alta pressão a frio, diluição de microemulsão e preparo de
emulsão múltipla.
Caracterizar os nanosistemas obtidos quanto ao diâmetro médio,
polidispersividade, eficiência de encapsulação, carga de fármaco e recuperação de
fármaco.
Determinar a solubilidade do topotecano em tampão acetato pH 4,5.
Avaliar a estabilidade do topotecano nas nanopartículas lipídicas e em
soluções aquosas pH 4,5 e 7,4.
Selecionar duas formulações promissoras e comparar seus perfis de
liberação in vitro, citotoxicidade em células K562 e estabilidade após liofilização.
76
6 CONCLUSÕES
- A metodologia analítica para quantificação do topotecano nas nanopartículas
lipídicas foi desenvolvida e validada;
- A técnica de diluição de microemulsão mostrou-se bastante adequada para a
produção de nanopartículas lipídicas contendo topotecano. As nanoparticulas
obtidas por esta técnica apresentaram elevada eficiência de encapsulacão e carga
de fármaco. O tamanho das partículas e os valores de PdI foram considerados
satisfatórios;
- As temperaturas de 25 e 37°C demonstraram ser um fator limitante na produção de
nanopartículas lipídicas contendo TPT e, portanto, deve ser rigorosamente
controlada;
- O topotecano é estável em solução aquosa pH 4,5 a temperatura ambiente e
quando submetido ao aquecimento de 37°C. Em solução aquosa pH 7,4 o
topotecano se mostrou instável, principalmente quando submetido ao aquecimento;
- A nanoencapsulação do topotecano reduziu sua instabilidade em pH 7,4 a 37°C, o
que sugere melhora de sua estabilidade in vivo com ganho em sua eficácia clinica
- A adição de ácido oléico às formulações não resultou em alteracões significativas
em nenhum dos parâmetros estudados;
- A nanoencapsulação do TPT sustentou a liberação do fármaco por 12 horas e
aumentou sua citotoxicidade em células leucêmicas K562 no período de 2 e 24
horas;
- A liofilização das nanoparticulas contendo TPT permitiu sua reconstituição em
suspensões com baixo PdI e manteve as nanopartículas estáveis por pelo menos 30
dias;
77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABRAHAM, S.A.; EDWARDS, K.; KARLSSON, G.; HUDON, N.; MAYER, L.D.;
BALLY, M.B. An evaluation of transmembrane ion gradient-mediated encapsulation
of topotecano with liposomes. Journal of Controlled Release, v. 96, 449-461, 2004.
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). Resolução RE n°.
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