( PDF ) Análise da expressão dos genes PROP1 e CTNNB1 em craniofaringiomas damantinomatosos com e sem mutação somática no CTNNB1

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CAROLINA MARIA GOMES CANI

Análise da expressão dos genes PROP1 e CTNNB1 em

craniofaringiomas adamantinomatosos com e sem

mutação somática no CTNNB1

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de Endocrinologia

Orientadora: Profa. Dra. Berenice Bilharinho de

Mendonça

Co-orientadora: Dra. Luciani Renata Silveira de

Carvalho

São Paulo

2010

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CAROLINA MARIA GOMES CANI

Análise da expressão dos genes PROP1 e CTNNB1 em

craniofaringiomas adamantinomatosos com e sem

mutação somática no CTNNB1

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de Endocrinologia

Orientadora: Profa. Dra. Berenice Bilharinho de

Mendonça

Co-orientadora: Dra. Luciani Renata Silveira de

Carvalho

São Paulo

2010

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Este trabalho foi realizado na Unidade

Endocrinologia do Desenvolvimento e no

Laboratório de Hormônios e Genética

Molecular LIM 42 da disciplina de

Endocrinologia do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de

São Paulo, com apoio da Fundação de

Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP): Projeto Temático

05/04726-0; 06/00244-3 e do Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) 301339/2008-09.

Dedicatória

Aos meus pais, minha irmã e meu

marido dedico esta tese, a realização

de um sonho.

Agradecimentos

A realização de um sonho? Não. A conclusão desta tese significa muito

mais do que isso. A realização de uma meta, a conclusão de uma etapa, de

um capítulo cuja estória venho escrevendo há algum tempo,

dedicadamente. Desde as incansáveis tardes quentes, debruçada nas

bancadas do anatômico, até as melancólicas tardes frias, sentada à frente

das bancadas do laboratório de hormônios, foram muitas superações... E

cada uma delas me trouxe até aqui. Muitos personagens fizeram parte dessa

estória, contribuindo para minhas conquistas, cada um ao seu modo. Penso

que não haveria melhor momento do que este, para agradecer a todos.

Aos meus pais, Pedro e Marilza, agradeço por simplesmente tudo. Por

acreditarem em mim, por me apoiarem, pelo amor. Pai, agradeço a sua

força. Mãe, agradeço a sua alegria. Obrigada por me trazerem até aqui!

À minha irmã, Catarina, por ser minha companheira, sempre presente e

prestativa. Cata, obrigada por ser a minha amiga.

Ao meu marido, Alessandro, agradeço o amor incondicional, a

paciência, a compreensão. Amor, agradeço por você ter estado ao meu lado,

me apoiando, dando suporte às minhas escolhas, fazendo os meus dias

mais felizes.

Aos demais familiares, pela admiração, torcida e momentos de união e

alegria, que fazem compensar qualquer esforço.

À minha orientadora, Profa. Dra. Berenice, por acreditar em mim. Dra.

Berenice, obrigada não apenas pelo conhecimento científico que tive a

oportunidade de obter com a senhora, mas principalmente por ter tido a

felicidade de conviver com seu exemplo de pessoa e acima de tudo, de

médica, o que certamente foi um marco no meu desenvolvimento

profissional.

À minha co-orientadora, Dra. Luciani, por ter me acalentado nos

momentos de maior preocupação e angústia.

Ao neurocirurgião Dr. Hamilton Matushita pela gentileza em coletar e

ceder as amostras de tecido de craniofaringiomas para realização desse

trabalho.

Ao Dr. Alexander, pela contribuição no meu aprendizado clínico e

científico, pelas discussões acadêmicas acaloradas, e pelos momentos de

descontração e conversas alegres, regadas a um bom café!

Ao Dr. Ivo, Dra. Ana Cláudia, Dra. Tânia e Dra. Elaine, pelos

comentários e sugestões sempre pertinentes e pelos ensinamentos valiosos

no ambulatório.

Ao Dr. Vinícius pela amizade, pelos ensinamentos e pela maneira leve

e descontraída que tornava os ambulatórios de quarta-feira mais prazerosos.

À Dra. Mirta pelo acolhimento amigo e incentivo inicial a continuar esse

projeto.

À minha amiga Luciana Brito, pelo companheirismo, pela amizade, pela

busca incessante pelo “melhor possível”, por ser sempre tão prestativa. Lu,

obrigada também pelos momentos de descontração, pelas conversas e

risadas, por ter facilitado essa jornada e ter contribuído para que eu

conseguisse chegar até o fim.

Ao Madson, por ter me ensinado a técnica de PCR em tempo real, e

pela companhia animada no ambulatório.

Ao Frederico, por ter me apresentado à Dra. Berenice.

À Cidinha, pelos ensinamentos nas aulas de pipetagem e por

prontamente providenciar a compra de primers, ensaios, e todos reagentes

necessários para realização desse trabalho.

À Mirian, por me ensinar as bases da biologia molecular, sempre

disposta a me ajuda a solucionar problemas.

À Emília, pela amizade, conversas descontraídas e eficiência na

realização dos sequenciamentos.

À Mariana, por realizar os sequenciamentos.

Às secretárias Nilda, Cris e Ana por sempre estarem disponíveis e

prestativas, facilitando sempre nossa vida em meio a tanta papelada e

burocracia.

À Fran, por sua eficiência na organização dos materiais usados na

bancada e por providenciar o famoso cafezinho na hora do lanche.

À Cris Rossi, sempre pronta a aliquotar as amostras de DNA o mais

rápido possível.

Aos demais amigos do LIM 42, Alexsandra, Ana Paula, Andréia,

Antônio, Beatriz, Camila, Catarina, Débora, Ericka, Everlayny, Karina,

Larissa, Letícia, Luciana Montenegro, Maíra, Marcela, Maria Estela, Marisa,

Milena, Patrícia, Priscila, Regina, Rocio, Tamaya, Viviani, agradeço o clima

de amizade, descontração, solidariedade e alegria que fazem do LIM 42 um

local de trabalho agradável e prazeroso.

Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para realização

desse trabalho, mas que por um descuido deixaram de ser citados.

Esta tese está de acordo com as seguintes

normas, em vigor no momento desta

publicação:

Referências: adaptado do International

Committee of Medical Journals Editors

(Vancouver)

Universidade de São Paulo. Faculdade de

Medicina. Serviço de Biblioteca e

Documentação. Guia de apresentação de

dissertações, teses e monografias.

Elaborado por Annelise Carneiro da

Cunha, Maria Júlia de A. L. Freddi, Maria

F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão,

Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena.

2ª ed. São Paulo: Serviço de Biblioteca e

Documentação; 2005.

Abreviaturas dos títulos dos periódicos de

acordo com List of Journals Indexed in

Index Medicus.

Sumário

Lista de figuras ...................................................................................................... 15

Lista de tabelas...................................................................................................... 17

Lista de abreviaturas.............................................................................................. 19

Lista de símbolos ................................................................................................... 21

Lista de siglas ........................................................................................................ 23

Resumo ................................................................................................................. 27

Abstract ................................................................................................................. 31

Introdução................................................................................................................ 1

1.1. O gene CTNNB1........................................................................................ 6

1.2. O gene PROP1 .......................................................................................... 7

1.3. CTNNB1 e câncer...................................................................................... 8

1.4. PROP1 e mutações inativadoras ............................................................. 15

2. Objetivos ......................................................................................................... 19

3. Métodos .......................................................................................................... 20

3.1. Considerações Éticas .................................................................................. 20

3.2. Casuística ................................................................................................... 20

3.3. Extração de RNA ......................................................................................... 21

3.4. Transcrição Reversa ................................................................................... 22

3.5. PCR ............................................................................................................ 23

3.6. Análise in siico das variantes alélicas identificadas ..................................... 24

3.7. Estudo da expressão por PCR em tempo real ............................................. 24

3.8. Validação do método 2

-ΔΔCT

......................................................................... 26

3.9. Escolha dos genes endógenos .................................................................... 30

3.10. Análise estatística ..................................................................................... 32

4. Resultados ...................................................................................................... 33

4.1. Sequenciamento ......................................................................................... 33

4.2. Análise in silico ............................................................................................ 35

4.3. PCR em tempo real ..................................................................................... 35

4.3.1. Gene CTNNB1 ...................................................................................... 35

4.3.2. Gene PROP1 ........................................................................................ 37

5. Discussão ....................................................................................................... 38

6. Conclusões ..................................................................................................... 42

7. Referências..................................................................................................... 43

Lista de figuras

Figura 1 - Via de sinalização WNT..................................................................4

Figura 2 - A: RNM do paciente com mutação inativadora do PROP1. Painéis

superiores aos 8 anos de idade com aumento hipofisário e

hiperssinal em T1. Painéis inferiores aos 15 anos com redução

hipofisária;

B: RNM de pacientes com craniofaringioma, evidenciando o

hiperssinal em T1.........................................................................17

Gráfico 1 - Curva-padrão de amplificação do gene endógeno CYC.............27

Gráfico 2 - Curva-padrão de amplificação do gene alvo PROP1..................27

Gráfico 3 - Experimento de validação do método 2

-ΔΔCT

. Validação para os

genes alvo PROP1 e endógeno CYC...........................................28

Gráfico 4 - Valores de estabilidade da expressão (M) dos genes

endógenos....................................................................................31

Gráfico 5 - Expressão do CTNNB1 por PCR em tempo real em

craniofaringiomas adamantinomatosos com e sem mutação no

CTNNB1, em relação ao pool de hipófise normal........................35

Lista de tabelas

Tabela 1 – Mutações somáticas no exon 3 do CTNNB1 em

craniofaringiomas adamantinomatosos, descritas na

literatura....................................................................................10

Tabela 2 – Frequência de mutação somática no exon 3 do CTNNB1 em

diversos tumores......................................................................13

Tabela 3 - Genes alvo

e endógenos

estudados por PCR em tempo

real............................................................................................30

Tabela 4 - Análise do exon 3 do CTNNB1 em pacientes com

craniofaringiomas adamantinomatosos.....................................33

Lista de abreviaturas

del deleção

Dr. Doutor

et al. e outros

Log logaritmo

Lista de símbolos

µL microlitros

µmol micromol

mg miligramas

mL mililitros

mmol milimol

n número

ng nanogramas

ng/mL nanogramas por microlitros

nº número

ºC graus Celsius

pH potencial hidrogeniônico

pmol picomol

s segundos

U unidades

x g vezes a gravidade

= igual

< menor que

≥ maior ou igual

± mais ou menos

% porcentagem

Lista de siglas

A adenina

ACTH hormônio adrenocorticotrófico

APC adenomatous polyposis coli

Asp ácido aspártico

C citosina

CA Califórnia

CAPPesq Comissão de ética para análise de projetos de pesquisa

CCD dispositivo de carga acoplada

cDNA ácido desoxirribonucléico complementar

treshold cycle

CTNNB1 Beta-catenina (β-catenina)

CYC ciclofilina A

Cys cisteína

DNA ácido desoxirribonucléico

dNTP trifosfato de nucleotídeo

dsh dishevelled

F feminino

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

G guanina

GH hormônio do crescimento

GSK 3β quinase glicogênio sintase 3β

HESX1 Homeobox gene expressed in ES cells

Ile isoleucina

KCl cloreto de potássio

HPRT hipoxantina ribosil transferase

LEF lymphoid enhancer factor

LRP low-density-lipoprotein receptor-related protein

M masculino

MgCl2 cloreto de magnésio

OH Ohio

pb pares de bases

PCR reação em cadeia da polimerase

PGK1 fosfoglicerato quinase 1

Phe fenilalanina

PIT1 Pituitary-specific transcription factor 1

Pro prolina

PROP1 Prophet of PIT1

R² coeficiente de correlação

RNA ácido ribonucléico

RNM ressonância nuclear magnética

SDS sistema de detecção de sequências

Ser serina

SSCP single strand conformation polymorphism

T timina

TCF T cell factor

Thr treonina

Tris-HCl hidrocloreto de tris-hidroximetil-aminometano

TSH hormônio tireotrófico

TX Texas

USA Estados Unidos da América

Val valina

WNT Wingless

y inclinação da curva

Resumo

Cani CMG. Análise da expressão dos genes PROP1 e CTNNB1 em

craniofaringiomas adamantinomatosos com e sem mutação somática no

CTNNB1 [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São

Paulo; 2010. 85p.

Os craniofaringiomas são os tumores mais frequentes da região hipotálamo-

hipofisária na faixa etária pediátrica. Apesar de serem histologicamente

benignos, sua tendência infiltrativa e seu comportamento agressivo resultam

em significante morbimortalidade. Histologicamente podem ser divididos em

dois subtipos: adamantinomatosos e papilíferos. A patogênese dos

craniofaringiomas é pouco compreendida. Mutações no gene CTNNB1, que

codifica a proteína β-catenina, são a única alteração molecular conhecida

até o momento implicada na tumorigênese dos craniofaringiomas

adamantinomatosos. Tais mutações afetam o sítio de degradação da β-

catenina, que passa a se acumular no citoplasma e no núcleo, ativando

excessivamente a via de sinalização WNT, através da ligação aos fatores de

transcrição da família LEF/TCF, levando a tumorigênese. Recentemente foi

descoberto um novo mecanismo de determinação da linhagem celular

hipofisária regulado pela β-catenina, através do qual ela interage

diretamente com o PROP1 para determinar a diferenciação celular

hipofisária. De acordo com esse modelo, o complexo protéico PROP1/β-

catenina atua simultaneamente como repressor do HESX1 e ativador do

PIT1, dependendo dos co-fatores associados. Pacientes com mutações

germinativas inativadoras no PROP1 desenvolvem hipopituitarismo e podem

apresentar aumento hipofisário com imagens de ressonância nuclear

magnética (RNM) da região selar muitas vezes semelhantes àquelas dos

craniofaringiomas, com hiperssinal em T1. Por outro lado, camundongos

com expressão persistente do Prop1 exibem defeitos na regulação da

proliferação celular hipofisária, incluindo cistos da bolsa de Rathke,

hiperplasia adenomatosa e tumores, sugerindo que mutações com ganho de

função no PROP1 também poderiam contribuir para a patogênese de

tumores hipofisários em seres humanos. A semelhança entre as imagens de

RNM dos pacientes com craniofaringiomas e daqueles com aumento

hipofisário devido a mutações inativadoras no PROP1, e o fato de que

camundongos transgênicos com expressão persistente do Prop1

apresentam aumento da susceptibilidade a tumores hipofisários, deram base

a nossa hipótese de que uma desregulação na expressão do PROP1 em

humanos poderia estar envolvida na patogênese dos craniofaringiomas

adamantinomatosos. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a presença de

mutação somática no exon 3 do CTNNB1 e avaliar a expressão desse gene

e do gene PROP1 em craniofaringiomas adamantinomatosos. Foram obtidas

14 amostras desse tipo de tumor por meio da ressecção terapêutica. As

amostras foram submetidas à extração do RNA e posterior transcrição

reversa para obtenção de cDNA. A partir do cDNA foi realizada PCR e

sequenciamento do exon 3 do CTNNB1 em todas as amostras. Porém, a

avaliação por PCR em tempo real foi realizada apenas em 12 amostras,

devido à qualidade inadequada de 2 amostras para submissão a essa

metodologia. Foram encontradas mutações missense, em heterozigose em 9

das 14 amostras, sendo 5 previamente descritas e 2 ainda não descritas em

craniofaringiomas adamantinomatosos. Hiperexpressão do CTNNB1 foi

encontrada em 7 amostras, sendo 5 com mutação e 2 sem mutação no

CTNNB1.A hiperexpressão variou de 2,5 a 6,2 vezes maior que o pool de

hipófise normal. Contudo, a expressão do PROP1 foi indetectável em todas

as amostras. Concluímos que o aumento da expressão do CTNNB1

presente em 58% das amostras sugere o envolvimento também da

hiperexpressão desse gene na etiopatogenia do craniofaringioma

adamantinomatoso, enquanto a ausência de expressão do PROP1 afasta a

participação desse gene na etiopatogenia do craniofaringioma

adamantinomatoso.

Descritores: 1. Craniofaringioma adamantinomatoso, 2. Beta catenina, 3.

Expressão gênica, 4. Mutação de sentido incorreto, 5. Proteínas de

homeodomínio/genética, 6. Sela túrcica/patologia, 7. Fator de transcrição

PIT-1/genética.

Abstract

Cani CMG. Analysis of PROP1 and CTNNB1 expression genes in

adamantinomatous craniopharyngiomas with and without CTNNB1 somatic

mutation [thesis]. Sao Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São

Paulo”; 2010. 85p.

Craniopharyngiomas are the the commonest tumors to involve the

hypothalamo-pituitary regions in childhood population. Histologically they are

benign, and can be divided in two primary subtypes: the adamantinomatous

and the papillary. Although histologically benign, their infiltrative tendency

and aggressive behavior can result in great morbidity. The pathogenesis of

craniopharyngiomas is poorly understood. To date, β-catenin gene

(CTNNB1) mutations have been identified only in the adamantinomatous

subtype. These mutations affect the degradation target box of β-catenin that

accumulates in the cytoplasm and the nucleus increasing the transcriptional

activity of WNT pathway through interaction with the transcription factors of

LEF/TCF family, leading to tumorigenesis. Recently, an interaction between

β-catenin and PROP1 was described as a new mecanism for β-catenin-

dependent regulation of pituitary cell-lineage determination. According to this

novel model, the PROP1/β-catenin proteic complex would act as a binary

switch to simultaneously repress the transcription factor HESX1 and to

activate expression of transcription factor PIT1, depending on the associated

cofactors. Patients with loss-of-function mutations in PROP1 present

combined pituitary hormonal deficiency generally associated with pituitary

enlargement and the magnetic resonance imaging (MRI) of the sellar region

in these patients sometimes resembles that of the craniopharyngiomas, with

T1 hyperintense signal. On the other hand, transgenic mice with persistent

Prop1 expression exhibit defects consistent with misregulation of pituitary cell

proliferation, including adenomatous hyperplasia with formation of Rathke’s

cleft cysts and tumors suggesting that misregulation of PROP1 expression in

human could contribute to pathogenesis of pituitary tumors. The similarity

between the MRI images of craniopharyngiomas patients and that of patients

with loss-of-function mutations in PROP1, associated with the fact that

transgenic mice with persistent Prop1 expression exhibit increased

susceptibility to pituitary tumors gave rise to our hypothesis that a

misregulation of PROP1 expression could be involved in the pathogenesis of

adamantinomatous craniopharyngiomas. The aim of this study was to

analyze the presence of somatic mutations in exon 3 of CTNNB1 and the

expression pattern of this gene and the PROP1 gene in adamantinomatous

craniopharyngiomas. Fourteen samples were obtained from therapeutic

surgery and submitted to RNA extraction and reverse transcription in order to

produce the cDNA. The cDNA was used as a template to CTNNB1 exon 3

PCR reaction followed by direct sequencing of all samples. However, the

real-time RT-PCR analysis was realized only in 12 samples, since 2 of them

had an insufficient quality for this method. Missence, heterozygous mutations

were found in 9 out of 14 samples; five were previously described and 2 not

yet described in adamantinomatous craniopharyngiomas. Overexpression of

CTNNB1 was found in 7 samples, which them 5 with CTNNB1 mutation 2

whitout. The overexpression ranged from 2.5 to 6.2 fold more than pituitary

normal pool. However, the PROP1 expression was undetectable in all the

samples. We could conclude that the amount of 58% CTNNB1

overexpressed samples suggest also a role of this overexpression in the

pathogenesis of adamantinomatous craniopharingiomas, while the

undetectable levels of PROP1 exclude a role of this gene in the pathogenesis

of adamantinomatous craniopharingiomas.

Descriptors: 1. Adamantinomatous craniopharyngioma, 2. Beta catenin, 3.

Gene expression, 4. Mutation missense, 5. Homeodomain proteins/genetics,

6. Sella turcica/pathology, 7. Transcription factor PIT-1/genetics.

Introdução

Os craniofaringiomas são tumores raros localizados na região

intra/supraselar. Correspondem a 10% de todos os tumores intracranianos

pediátricos, sendo os mais comuns da região hipotálamo-hipofisária nessa

população (1). São tumores epiteliais que crescem ao longo do ducto

craniofaríngio, canal que conecta o ectoderma oral com a bolsa de Rathke

(2). Apesar de sua histologia benigna, sua tendência infiltrativa e seu

comportamento agressivo resultam em significante morbimortalidade. O

comprometimento da hipófise e das estruturas neuronais adjacentes pelo

tumor primário e/ou recorrente, ou pelas intervenções terapêuticas, gera

complicações endócrinas, visuais, hipotalâmicas, e muitas vezes sequelas

cognitivas que comprometem significativamente a qualidade de vida. Ao

diagnóstico, a freqüência do déficit hormonal varia de 35-95% para GH, 38-

82% para gonadotrofinas, 21-62% para ACTH, 21-42% para TSH e 6-38%

para diabetes insipidus (2). A associação de mais de um déficit pode estar

presente em 85% dos pacientes (3). Histologicamente os craniofaringiomas

podem ser divididos em dois subtipos: adamantinomatosos e papilíferos,

com histogênese distinta, sendo o primeiro originado de restos de células

escamosas do ducto craniofaríngio (4), e o segundo de metaplasia das

células adeno-hipofisárias (5). O subtipo adamantinomatoso é o mais

comum, predominando nas duas primeiras décadas de vida, mas podendo

ocorrer em qualquer idade; o subtipo papilífero tem sido descrito quase que

exclusivamente em adultos (6).

A patogênese dos craniofaringiomas é pouco compreendida.

Mutações no gene CTNNB1, que codifica a proteína β-catenina, são a única

alteração molecular conhecida até o momento implicada na tumorigênese

dos craniofaringiomas. A β-catenina possui dois papéis fundamentais. Na

membrana plasmática ela se associa a moléculas de adesão do tipo

caderinas formando complexos que por sua vez se ligam aos feixes de

actina do citoesqueleto nas junções de aderência célula-célula. A presença

da β-catenina nessas junções é fundamental para assegurar uma adequada

adesão intercelular (7). Além do seu papel estrutural, a β-catenina atua

também como um componente da cascata de sinalização da via WNT,

altamente conservada entre as espécies, que regula a proliferação, a

morfologia, a mobilidade e o destino celular, bem como a formação axial e a

organogênese (8).

De acordo com o modelo canônico de sinalização da β-catenina,

ligantes da ampla família de proteínas WNT, ricas em cisteína, se ligam a

receptores de membrana formados pela associação de uma proteína do tipo

frizzled com as proteínas 5 e 6 relacionadas ao receptor da lipoproteína de

baixa densidade (low-density-lipoprotein receptor-related protein: LRP 5/6).

Na ausência do ligante WNT, a β-catenina é fosforilada pela caseína

quinase 1 na serina da posição 45. Essa fosforilação por sua vez possibilita

que a β-catenina seja subsequentemente fosforilada pela glicogênio sintase

3β (GSK-3β) – uma quinase serina/treonina – nos aminoácidos das posições

41 (treonina), 37 (serina) e 33 (serina). A fosforilação desses dois últimos

aminoácidos desencadeia a ubiquitinação da β-catenina e sua consequente

degradação no proteossomo, resultando em baixos níveis dessa proteína no

citoplasma (9, 10). O processo de fosforilação ocorre com a β-catenina

associada a um complexo multiprotéico contendo as proteínas Axina, e/ou

sua homóloga Axina2/conductina, e APC (produto do gene supressor

tumoral APC – adenomatous polyposis coli), além da GSK-3β. Quando o

ligante WNT se acopla ao receptor, o complexo multiprotéico se desfaz por

meio da destruição da Axina, que é um componente essencial desse

complexo (9). Na ausência do mesmo, a β-catenina deixa de ser degradada

e se acumula no citoplasma, entrando então no núcleo, aonde vai se ligar

aos fatores de transcrição da família LEF/TCF (lymphoid enhancer factor/T

cell factor), estimulando a expressão de vários genes alvo tais como genes

envolvidos na proliferação e diferenciação celulares, bem como na

progressão tumoral (Figura 1) (10, 11).

Figura 1. Via de sinalização WNT. Quando o ligante WNT se acopla ao receptor

desencadeia a ativação da via: a proteína dishevelled (dsh) bloqueia a

degradação da β-catenina, que entra no núcleo e ativa a transcrição dos

genes alvo. Na ausência do ligante a via é inativada através da

fosforilação da β-catenina pela GSK3β, o que desencadeia sua

ubiquitinação pela βTrCP e degradação no proteossomo.

Recentemente foi descoberto um novo mecanismo de determinação

da linhagem celular hipofisária regulado pela β-catenina. Ao invés de se ligar

aos fatores de transcrição da família LEF/TCF, como ocorre na via canônica

de sinalização WNT, a β-catenina interage diretamente com o PROP1 para

determinar a diferenciação celular hipofisária. De acordo com esse modelo,

admite-se que o complexo protéico PROP1/β-catenina atue

simultaneamente como repressor do HESX1 e ativador do PIT1,

dependendo dos co-fatores associados (12). O PROP1 é um fator de

transcrição específico da hipófise do tipo paired-like homeodomain, assim

denominado devido a sua homologia com a proteína da Drosophila descrita

primeiramente. O HESX1 e PIT1 são fatores de transcrição envolvidos no

desenvolvimento hipofisário cujas expressões obedecem a uma ordem

tempo-espacial fundamental para a adequada diferenciação das linhagens

celulares hipofisárias. O HESX1 é um repressor transcricional do tipo paired-

like homeodomain, enquanto o PIT1 é um membro da família de fatores de

transcrição POU domain (13).

Pacientes com mutações germinativas inativadoras no PROP1 podem

apresentar aumento hipofisário com imagens de ressonância nuclear

magnética (RNM) da região selar muitas vezes semelhantes àquelas dos

craniofaringiomas, com hiperssinal em T1 (Figura 2). Por outro lado,

camundongos com expressão persistente do Prop1 exibem defeitos na

regulação da proliferação celular hipofisária, incluindo cistos da bolsa de

Rathke, hiperplasia adenomatosa e tumores, sugerindo que mutações com

ganho de função no PROP1 também poderiam contribuir para a patogênese

de tumores hipofisários em seres humanos (14).

A semelhança entre as imagens de RNM dos pacientes com

craniofaringiomas e daqueles com aumento hipofisário devido a mutações

inativadoras no PROP1, o fato de que camundongos transgênicos com

expressão persistente do Prop1 apresentam aumento da susceptibilidade a

tumores hipofisários, e o fato de que a β-catenina – única proteína envolvida

até o momento com a patogênese dos craniofaringiomas

adamantinomatosos – interage com o PROP1 para controlar a determinação

da linhagem celular hipofisária deram base a nossa hipótese de que uma

desregulação na expressão do PROP1 em humanos poderia estar envolvida

na patogênese dos craniofaringiomas adamantinomatosos.

1.1. O gene CTNNB1

O gene CTNNB1 (ENSG00000168036) está localizado no braço curto

do cromossomo 3 na posição 22-21.3 (3p 22-21.3); possui 15 exons e

codifica uma proteína de 781 aminoácidos que possui uma região de

repetição em tandem de 40 aminoácidos, que formam doze repetições da

chamada região armadillo, primeiramente identificada na Drosophila, nas

quais se ligam os fatores de transcrição que interagem com a β-catenina,

bem como o APC e a Axina/conductina, de uma maneira mutuamente

exclusiva (15). A estrutura cristalográfica da região armadillo é uma super-

hélice, semelhante a uma haste, formada de α-hélices (16). A porção amino-

terminal da β-catenina possui os resíduos de serina e treonina relacionados

à degradação dessa proteína.

1.2. O gene PROP1

O gene PROP1 (ENSG00000175325) pertence à classe homeobox e

está localizado no braço longo do cromossomo 5, posição 35.3 (5q 35.3);

possui três exons e codifica uma proteína de 226 aminoácidos. O homeobox

é uma sequência altamente conservada de DNA, com cerca de 180 pares de

base. As proteínas codificadas por genes homeobox possuem um domínio

de ligação de 60 aminoácidos, chamado homeodomain, através do qual a

proteína se liga ao DNA dos genes alvo. O homeodomain é formado por três

hélices, sendo a terceira especialmente importante para o reconhecimento

do DNA (17). Fatores de transcrição do tipo paired-like homeodomain podem

se ligar monomericamente a um motif TAAT isolado e dimericamente a uma

sequência palindrômica contendo esse mesmo motif invertido, separado por

três nucleotídeos (TAATTGAATTA) (18). Estudo recente mostrou através de

ensaios de transfecção que o PROP1 quando ligado dimericamente ao DNA

é capaz de ativar a transcrição. Porém, a ligação monomérica não teve

efeito sobre a expressão gênica. Contudo não se pode negar a possibilidade

de que a ligação monomérica possa modular a expressão gênica quando em

conjunto com outros fatores que se ligam a sítios justapostos e/ou distantes

do sítio de ligação do PROP1 ao promotor (17). De fato, complexos proteína-

proteína, formados pela interação entre fatores, podem controlar a

expressão gênica de maneira tempo-espacial (12). Foi demonstrado ainda,

que a porção carboxi-terminal do PROP1 possui potentes domínios de

ativação transcricional, enquanto que a porção amino-terminal tem atividade

repressora, sugerindo que o PROP1 possa funcionar tanto como ativador

quanto como repressor transcricional (19, 20).

1.3. CTNNB1 e câncer

Mutações no CTNNB1 têm sido implicadas em vários tipos de câncer.

Todas são localizadas no exon 3 do CTNNB1 e afetam os resíduos de serina

e treonina da porção amino-terminal, onde se liga a GSK-3β. Quando

mutada a β-catenina deixa de ser fosforilada, o que impede a sua

degradação, resultando em ativação constitutiva desta via na ausência do

ligante WNT (21).

O primeiro trabalho publicado demonstrando mutação no CTNNB1 em

craniofaringiomas foi de Sekine et al. em 2002, no qual foram analisados

tecidos de 16 craniofaringiomas fixados em parafina, sendo 10 do subtipo

adamantinomatoso e 6 papilíferos, submetidos à extração de DNA por meio

da proteinase K, e posterior PCR e sequenciamento direto do exon 3. Todos

os tumores do subtipo adamantinomatoso apresentaram mutação no

CTNNB1 em contraste com os tumores do tipo papilífero que não

apresentaram mutações (22). Em 2004, Kato et al. publicaram sua casuística

composta por 14 craniofaringiomas adamantinomatosos e 1 papilífero; o

DNA foi obtido pela digestão por proteinase K e extração pelo método do

fenol/clorofórmio das amostras congeladas ou fixadas em parafina; foi

realizada análise apenas do exon 3 e a frequência de mutação foi de 69%

(9/13) nos adamantinomatosos e o único papilífero não apresentou mutação

(23). Em 2005, mais dois trabalhos foram publicados. O primeiro, de Buslei

et al. analisou 35 craniofaringiomas adamantinomatosos com mutação em

80% das amostras (28/35), e 6 papilíferos sem mutação; também analisou

60 adenomas pituitários (produtores de GH ou PRL ou FSH ou ACTH ou não

funcionantes) nos quais não foi encontrada mutação (24); o DNA dessas

amostras foi extraído pelo método automatizado BioRobot EZ1 conforme

instruções do fabricante e amplificado para a analise do exon 3 por single

strand conformation polymorphism (SSCP). O segundo trabalho publicado

em 2005, de Oikonomou et al. evidenciou 16% de mutação nos

craniofaringiomas adamantinomatosos (7/43) e de maneira semelhante às

outras casuísticas, nenhum dos 8 craniofaringiomas papilíferos apresentou

mutação, assim como nenhum dos 22 adenomas pituitários analisados

(produtores de prolactina ou FSH/LH); o DNA foi extraído tanto de amostras

congeladas quanto fixadas em parafina, porém não foi descrito o método de

extração (25). Todas as mutações evidenciadas nos diversos trabalhos

foram somáticas, missense, encontradas no exon 3 do CTNNB1, variando

entre os códons 32, 33, 37, 41, 43 e 45 e apenas uma deleção de 81 pb

compreendida entre os códons 35 e 63 (Tabela 1).

Tabela 1 – Mutações somáticas no exon 3 do CTNNB1 em craniofaringiomas

adamantinomatosos, descritas na literatura

Autor/ano

Presença de

mutação/nº de

casos

Frequência

Códons afetados/

(nº de casos)

Sekine/2002

10/10

100

32 (2) 33 (5)

37 (2) 41 (1)

Kato/2004

9/13

32 (3) 33 (3)

37 (1) 41 (1)

43 (1)

Buslei/2005

28/35

32 (8) 33 (9)

37 (3) 41 (6)

45 (1)

Del 35-63 (1)

Oikonomou/2005

7/43

32 (1) 33 (2)

37 (1) 41 (3)

Além dos craniofaringiomas, outros tumores também apresentam

mutações no CTNNB1 (21) (Tabela 2). No câncer colorretal esporádico sem

mutação no APC (principal gene envolvido na patogênese desse tipo de

câncer), aproximadamente 50% apresenta mutação no CTNNB1, o que

representa menos de 10% dos tumores colorretais (10). Já em

hepatoblastomas, tumores incidentes na infância, a proporção de mutações

nesse gene chega a 70%, caindo para 25% em carcinomas hepatocelulares

(26-29). No câncer gástrico a frequência de mutação varia entre os tipos

intestinal e difuso, sendo no primeiro de 23 a 27% (30, 31) e, no segundo de

0 a 38% (30-32). Nos tumores carcinóides gastrointestinais, a frequência de

mutação chega a 38% (33). No tumor pancreático do subtipo sólido

pseudopapilar, de baixa malignidade, mutação no CTNNB1 foi encontrada

em 18 das 20 amostras analisadas (34). Em uma série que analisou

carcinomas endometriais, porém sem diferenciar os subtipos histológicos, a

frequência de mutação foi de 40% (35); em outra série que analisou 95

carcinomas endometriais endometrióides e 33 não endometrióides, apenas o

primeiro subtipo mostrou mutação no CTNNB1 em 15% das amostras (36).

Em carcinomas de ovário mutações foram encontradas em 7 de 11

amostras; em outro estudo, 14 de 45 carcinomas endometrióides de ovário

apresentaram mutação (37, 38). No câncer de próstata 5% das amostras

apresentaram mutação (39). Carcinomas anaplásicos de tireóide também

apresentam mutação em 61% das amostras (40); em outra série do mesmo

autor, foi demonstrada frequência de 25 e 65,5% em carcinomas de tireóide

pouco diferenciados e indiferenciados respectivamente (41). O tumor de

Wilms, uma das neoplasias renais mais comuns da infância, também

demonstrou mutação no CTNNB1 em 15% das 40 amostras analisadas (42).

A neoplasia que apresenta uma das maiores frequências de mutação – 95%

- é o pilomatrixoma, que deriva do folículo piloso (43). Tumores desmóides,

uma forma infiltrativa de fibromatose, possuem uma frequência de 50% de

mutação (44, 45). Mutações no CTNNB1 em tumores adrenocorticais

também são descritas numa frequência de 19,5 a 27% em adenomas e 20 a

31% em carcinomas, sendo o primeiro defeito molecular nesse tipo de tumor

que apresenta praticamente a mesma prevalência entre as lesões benignas

e malignas (46, 47). Como já mencionado, as mutações no CTNNB1

encontradas nas diversas neoplasias, localizaram-se sempre no exon 3,

afetando em sua maioria a região hot spot composta pelos resíduos de

serina e treonina, ou aminoácidos adjacentes.

Tabela 2 – Frequência de mutação somática no exon 3 do CTNNB1 em diversos

tumores

Tumor

Frequência %

Autor/ano

Câncer colo-retal

Lustig/2003

Hepatoblastoma

Koch/1999

Park/2001

Taniguchi/2002

Carcinoma hepatocelular

De La Coste/1998

Taniguchi/2002

Câncer gástrico tipo

intestinal

23-27

Clements/2002

Park/1999

Câncer gástrico tipo difuso

0-38

Clements/2002

Park/1999

Sasaki/2001

Carcinóide gastrointestinal

Fujimori/2001

Tumor pancreático sólido

pseudo-papilar

Abraham/2002

Carcinoma endometrial

Mirabelli-

Primdahl/1999

Carcinoma de ovário

Gamallo/1999

Câncer de próstata

Voeller/1998

Carcinoma anaplásico de

tireóide

Garcia-Rostan/1999

Tumor de Wilms

Maiti/2000

Pilomatrixoma

Chan/1999

Tumor desmóide

Miyoshi/1998

Tejpar/1999

Adenoma adrenocortical

19,5-27

Masi/2009

Tissier/2005

Carcinoma adrenocortical

20-31

Masi/2009

Tissier/2005

1.4. PROP1 e mutações inativadoras

Pacientes portadores de mutações germinativas inativadoras no

PROP1 geralmente apresentam hipófise de tamanho normal ou reduzido.

Porém, há na literatura relatos de aumento hipofisário nesses pacientes (48-

57). Em 1978, Parks et al. descreveram, provavelmente pela primeira vez, a

associação de hipopituitarismo com aumento do volume da sela túrcica em

três irmãos (54). Em 1999, Mendonca et al. publicaram o primeiro

seguimento longitudinal de uma paciente com hipopituitarismo cujas

imagens de RNM, realizadas aos 8 anos de idade, apresentavam aumento

do lobo anterior da hipófise com hiperssinal em T1, semelhantes às imagens

de craniofaringiomas; aos 15 anos de idade, numa nova RNM, revelou-se

uma acentuada redução do tamanho hipofisário (Figura 2). Essa paciente

possuía a deleção de 2 pb em homozigose (301-302 delAG) no exon 2 do

PROP1 (48). No mesmo ano, Rosenbloom et al. publicaram uma série com

oito pacientes portadores de hipopituitarismo familiar que possuíam a

mesma deleção 301-302 delAG em homozigose, sendo 6 irmãos de uma

prole e dois de outra, na qual três pacientes da primeira prole apresentaram

aumento da região selar visualizada à radiografia simples (55). Em 2002,

Teinturier et al. diagnosticaram um paciente portador de hipopituitarismo

como tendo um craniofaringioma intrasselar. Porém, a redução espontânea

da massa os fez rever o diagnóstico que foi então atribuído a uma deleção

no PROP1 (50). Riepe et al., em 2001, publicaram o seguimento longitudinal

de dois irmãos com hipopituitarismo devido a uma mutação em heterozigose

composta para as deleções 301-302 delAG e 150 delA; no início do

seguimento ambos apresentavam um aumento hipofisário que após alguns

anos deixou de ser evidenciado, dando lugar a uma hipófise hipoplásica, às

custas da redução acentuada do lobo anterior (56). Em 2004, Voutetakis et

al. publicaram uma série de 15 pacientes portadores de hipopituitarismo com

mutações inativadoras do PROP1, dos quais cinco apresentavam aumento

hipofisário nas imagens de RNM, consistente com uma lesão sem realce ao

contraste, interposta entre o lobo anterior (normalmente realçado após o

contraste) e a neurohipófise; a haste hipofisária estava deslocada

anteriormente. Em três desses pacientes houve regressão espontânea da

massa hipofisária, com normalização da posição da haste. Esse estudo

demonstrou que embora uma hipófise reduzida seja geralmente observada

em pacientes mais velhos, um número significante de pacientes mais jovens

apresenta aumento hipofisário com subseqüente regressão, e que

provavelmente esse aumento se origine do lobo intermediário (49). Numa

outra série publicada em 2005 por Turton et al., dos 15 pacientes avaliados

com hipopituitarismo e mutação no PROP1, em apenas um pôde ser

evidenciado aumento hipofisário seguido de redução (52). Em um estudo

publicado recentemente, a análise retrospectiva de 31 pacientes com

hipopituitarismo e mutação no PROP1 evidenciou dois pacientes que foram

submetidos à cirurgia para remoção de tumor hipofisário. A análise

histológica dos tecidos mostrou células epiteliais, parcialmente oxifílicas,

formando estruturas microcísticas de aspecto glandular, preenchidas por

colóide eosinofílico sem atipia ou aspecto proliferativo; a imunohistoquímica

evidenciou todos os tipos de células hormonais. Esses achados

correspondem ao lobo intermediário da hipófise (58), corroborando os

achados de imagem de Voutetakis et al. (49). Além desses, outros trabalhos

também evidenciaram aumento hipofisário associado a mutações no PROP1

(51, 53, 57). A mutação mais freqüente nos casos de hipopituitarismo

familiar, presente em aproximadamente 50% desses pacientes, é a 301-302

delAG, sendo também a mais comumente envolvida nos casos com

aumento hipofisário (53, 59), nos quais também foram identificadas outras

mutações como 150delA, 112-124del, R73C/R99X (49, 52, 57).

Figura 2. A - RNM do paciente com mutação inativadora do PROP1. Painéis

superiores aos 8 anos de idade com aumento hipofisário e hiperssinal em

T1. Painéis inferiores aos 15 anos com redução hipofisária. B – RNM de

pacientes com craniofaringioma, evidenciando o hiperssinal em T1.

2. Objetivos

1. Pesquisar a presença de mutações somáticas no exon 3 do gene

CTNNB1 em craniofaringiomas do subtipo adamantinomatoso.

2. Avaliar a expressão dos genes PROP1 e CTNNB1 em

craniofaringiomas do subtipo adamantinomatoso.

3. Métodos

3.1. Considerações Éticas

O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de

Projetos de Pesquisa (CAPPesq) da Diretoria Clínica do Hospital das

Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O

termo de consentimento livre e esclarecido foi obtido para todos os

pacientes.

3.2. Casuística

Foram avaliados 14 craniofaringiomas do subtipo adamantinomatoso

obtidos de pacientes (9 do sexo feminino) submetidos à ressecção

terapêutica no Hospital das Clínicas da FMUSP (n=12) ou em hospital

privado (n=2). Todos os pacientes foram operados por via transcraniana pelo

neurocirurgião pediátrico Dr. Hamilton Matushita. A idade dos pacientes

variou entre 1 ano e 7 meses e 21 anos (média de 10 anos). Sete pacientes

fizeram seguimento em outros hospitais e os dados clínicos de evolução

pós-operatória não foram disponíveis. Dentre os 7 pacientes que tiveram

seguimento no Hospital das Clínicas 5 apresentaram recidivas tumorais.

Todas as amostras foram submetidas à pesquisa de mutações do

exon 3 do CTNNB1. Para tanto, foi utilizado como template o cDNA obtido

do RNA tumoral por meio de transcrição reversa.

Do total de 14 amostras apenas 12 foram submetidas à análise da

expressão gênica uma vez que a extração do RNA de 2 amostras gerou

material degradado.

3.3. Extração de RNA

O RNA total das amostras foi extraído a partir dos tecidos de

craniofaringiomas coletados durante o ato operatório terapêutico e

congelados em RNAlater

(Ambion, Austin, TX, USA) a -20

C. Utilizou-se o

método do reagente tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio TRIzol

(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). A uma quantidade média de 100 mg de

tecido foi adicionado 1 mL de TRIzol

. Essa mistura foi homogeneizada por

trituração, os debris foram descartados e adicionou-se 200 µL de

clorofórmio, agitando-se o tubo vigorosamente por 15 segundos, seguido

por um repouso de 3 minutos em temperatura ambiente. A mistura foi então

centrifugada a 12.000 x g por 15 minutos a 4

C, após o qual se obteve uma

solução trifásica formada por um sobrenadante translúcido contendo o RNA,

uma fase intermediária leitosa contendo o DNA e uma fase inferior rosada

contendo proteínas. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, ao

qual foi adicionado 500 µL de isopropanol, incubado por 10 minutos em

temperatura ambiente e centrifugado a 12.000 x g por 10 minutos a 4

Essa centrifugação permite a formação do pellet de RNA, que é então

lavado através da adição de 1000 µL de etanol a 75% e centrifugação a

7500 x g por 5 minutos a 4

C. O etanol é removido por inversão e o tubo

contendo o pellet é deixado invertido para secar em temperatura ambiente

por 30 minutos. O pellet é então ressuspenso em 50 µL de água livre de

RNAse e por fim, desnaturado a 65

C por 10 minutos e estocado a -80

A integridade do RNA extraído foi testada através da eletroforese em gel de

agarose 1% e visualização em transiluminador ultravioleta para avaliação da

presença das 2 bandas de RNA ribossômico (18S e 28S). As amostras que

não apresentaram as duas bandas foram excluídas. As concentrações das

amostras de RNA total foram avaliadas a partir da leitura em

espectrofotômetro.

3.4. Transcrição Reversa

O DNA complementar (cDNA) de cada amostra foi sintetizado por

transcrição reversa utilizando-se o High Capacity cDNA Archive Kit

(Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA). Para a reação de transcrição reversa

são preparadas duas soluções para cada amostra: a primeira contendo 1250

ng de RNA total diluídos em 25 µL de água livre de RNAse; a segunda

contendo uma mistura de reagentes fornecidos pelo fabricante em

quantidades indicadas pelo mesmo, sendo 5 µL de buffer, 2 µL de dNTP

(trifosfato de nucleotídeo), 5 µL de primers randômicos, 2,5 µL de

transcriptase reversa e 10 µL de água livre de RNAse. Essas soluções são

então misturadas obtendo-se um volume final de 50 µL que é aquecido a 25

C por 10 minutos, e em seguida a 37

C por 120 minutos. A concentração

final de cDNA é de 25 ng/µl.

3.5. PCR

O exon 3 do CTNNB1 foi amplificado utilizando-se primers exônicos a

partir de 25 ng de cDNA. Cada reação de PCR foi realizada num volume

final de 25 µL completado com água, que continha 5 µL de tampão 5x para

PCR (KCl 50 mmol, MgCl

1,5 mmol e Tris-HCl pH 9,0 10 mmol), 200 mol

de dNTP, 20 pmol de primer sense (5’-GATTTGATGGAGTTGGACATGG-3’)

e de antisense (5’-TGTTCTTGAGTGAAGGACTGAG-3’) e 1,5 U de

polimerase de DNA GoTaq® (Promega, Madison, WI, USA). Essa mistura foi

então desnaturada por 5 minutos a 94

C e submetida a 35 ciclos (94 C por

45 s, 65 ºC por 45 s e 72 C por 60 s.), seguidos por uma extensão de 10

minutos a 72

C. Os fragmentos amplificados tinham 218 pb, e foram

submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de

etídio e visualizados sob luz ultravioleta. Os produtos de PCR foram pré

tratados com uma combinação de exonuclease I e fosfatase alcalina de

camarão (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, USA) e

diretamente sequenciados usando o kit BigDye para sequenciamento (PE

Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) em um sequenciador automático

ABI Prism 3100 (Perkin Elmer Corp.).

3.6. Análise in siico das variantes alélicas identificadas

Foi utilizado o PolyPhen, um método de predição in silico, que

classifica as mutações missense com base no seu potencial impacto sobre a

função ou estrutura da proteína. O PolyPhen classifica as predições das

mutações da seguinte forma: 1 - provavelmente danosa: grande chance de

afetar a função ou estrutura da proteína; 2 - possivelmente danosa: poderia

afetar a função ou estrutura da proteína; 3 – benigna: provavelmente sem

efeito na proteína (60)

3.7. Estudo da expressão por PCR em tempo real

O cDNA obtido na transcrição reversa foi submetido a reações de

PCR em tempo real para quantificação da expressão dos genes PROP1,

CTNNB1 e PIT1 de 12 craniofaringiomas adamantinomatosos. Tal

quantificação foi realizada por um sistema de detecção de sequências (SDS)

ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) utilizando-se

para tanto o TaqMan® Gene Expression Assay (números de identificação:

PROP1 - Hs00196604_m1; CTNNB1 – Hs00355045_m1; PIT1 -

Hs00230821_m1) que contém pares de primers exônicos específicos para

cada gene, além de sonda específica para o fragmento amplificado. Primers

e sonda são previamente testados por um sistema de desenvolvimento de

ensaios da Applied Biosystems, de forma a garantir a amplificação apenas

dos produtos desejados, bem como a não amplificação de DNA genômico.

As sondas dos genes alvo PROP1, CTNNB1 e PIT1 são marcadas com uma

fluorescência FAM, enquanto as dos genes endógenos PGK1

(phosphoglyceratekinase 1 - 4326318E), CYC (cyclophilin A - 4326316E) e

HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyl-transferase 1 - 4326321E) são

marcadas com fluorescência VIC. As diferentes fluorescências que marcam

as sondas emitem comprimentos de onda bem distintos, permitindo a sua

diferenciação quando captados pela câmera CCD do aparelho de detecção.

As reações de amplificação por PCR em tempo real foram realizadas

em triplicata e singleplex utilizando-se 12.5 µl de TaqMan

Universal PCR

Master Mix, 2 µL de cDNA (25 ng/ µL), 1,25 µL do ensaio contendo primers e

sonda específicos para cada gene, em um volume final de 25 µL completado

com água. Visando garantir a acurácia das reações, o desvio padrão

máximo aceito entre as triplicatas foi de até 0,3.

Para se calcular o nível de expressão de cada gene nas diferentes

amostras, foi realizada uma quantificação relativa utilizando-se o método 2

ΔΔCT

, onde C

(threshold cycle) é o ciclo da PCR em tempo real no qual a

amplificação atinge a fase logarítmica; ΔC

é a diferença de expressão entre

o gene alvo e o endógeno de uma determinada amostra e o ΔΔC

corresponde à diferença entre o ΔC

da amostra de cada paciente e o ΔC

do calibrador (61). Calibrador é uma amostra cuja expressão é utilizada

como base de comparação para obtenção dos resultados de expressão.

Utilizamos como calibrador um pool comercial de 39 hipófises de adultos

(636157 - Human Pituitary Gland Poly A

RNA, Clontech, Palo Alto, CA,

USA). As amostras foram consideradas hiper ou hipoexpressas quando se

apresentaram 2 vezes mais ou menos expressas em relação ao calibrador.

Consideramos como indetectáveis as amostras com C

>34. Nesta condição

a quantidade de cDNA do gene alvo se aproxima de cópia única, gerando

resultados de pouca precisão e baixa reprodutibilidade.

3.8. Validação do método 2

-ΔΔCT

Para utilizarmos o método 2

-ΔΔCT

no cálculo da expressão relativa é

preciso que a eficiência de amplificação do gene alvo e do endógeno seja

aproximadamente igual. Para avaliar essa eficiência nós realizamos uma

curva padrão de amplificação para cada gene utilizando a mesma amostra, o

pool comercial de hipófises normais. Para a construção das curvas foi

utilizada uma quantidade inicial de amostra que foi progressivamente diluída

em 50%, obtendo-se um total de seis diluições nas quais a concentração da

diluição anterior era o dobro da seguinte. Para garantir uma eficiência de

amplificação perto de 100%, a inclinação (y) da curva padrão deve ser de -

3,3 ± 0,3; enquanto para garantir uma adequada acurácia entre as triplicatas

o coeficiente de correlação (R

) deve ser ≥ 0,99 (Gráficos 1 e 2). Após a

construção das curvas, para determinar se a eficiência de amplificação das

reações de PCR do gene alvo e do endógeno eram aproximadamente

iguais, realizamos o ΔC

alvo – C

endógeno). Para tanto, utilizamos o

gerado para cada diluição equivalente do alvo e do endógeno. Em

seguida construímos uma nova curva onde foram lançados os valores do

ΔC

versus os valores do logaritmo das diluições para se obter uma linha de

regressão semilogarítmica cuja inclinação é utilizada como critério de

validação para o uso de método 2

-ΔΔCT

(Gráfico 3). Tal método pode ser

utilizado quando o valor de inclinação (y) da curva é < 0,1.

Gráfico 1 – Curva-padrão de amplificação do gene endógeno CYC

Gráfico 2 – Curva-padrão de amplificação do gene alvo PROP1

y = -3,408x + 29,22

R² = 0,998

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Log

RNA total

CYC

y = -3,343x + 37,90

R² = 0,994

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Log

RNA total

PROP1

Gráfico 3 – Experimento de validação do método 2

-ΔΔCT

. Validação para os genes

alvo PROP1 e endógeno CYC

y = 0,093x + 8,652

0 0,5 1 1,5 2 2,5

ΔC

Log

RNA total

Validação do Método 2

-ΔΔCT

3.9. Escolha dos genes endógenos

Quando se emprega a técnica de estudo de expressão em tempo

real, para se obter uma interpretação confiável dos resultados bem como ser

capaz de detectar pequenas mudanças nos níveis de expressão, é

necessária uma normalização precisa. Nos cálculos da quantificação relativa

uma estratégia comum de normalização é a amplificação de um ou mais

genes endógenos controles, em paralelo ao gene alvo. Um gene endógeno

ideal deve exibir uma expressão constitutiva e estável nas amostras

investigadas. A escolha de um gene endógeno inadequado pode gerar

resultados alterados. Sendo assim, para escolhermos quais seriam os

melhores genes endógenos para os tecidos de craniofaringiomas deste

estudo, nós testamos sete genes (Tabela 3), comumente utilizados como

endógenos, através de um software criado e validado por Vandesompele et

al., o geNorm (62). Esse programa avalia a estabilidade de expressão dos

genes endógenos testados baseando-se nos níveis de expressão dos

mesmos antes de serem normalizados e utiliza-se do princípio de que a

razão entre a expressão de dois genes endógenos ideais é sempre a mesma

para todas as amostras, independente das condições experimentais. Para

cada gene é calculado um valor de estabilidade denominado M; quanto

menor o valor de M, mais estável é o gene. O uso de mais de um gene

endógeno para normalização gera resultados mais acurados. Por isso,

através do geNorm obtivemos os 3 genes endógenos com os menores

valores de M entre os sete testados, que foram então considerados os mais

apropriados para as amostras de craniofaringiomas do presente estudo

(Gráfico 4). Os genes escolhidos foram PGK1, CYC e HPRT1. A média

geométrica da expressão dos três genes foi usada então, como gene

endógeno no cálculo 2

-ΔΔCT

Tabela 3 - Genes alvo

e endógenos

estudados por PCR em tempo real

Símbolo

Nome do gene

Função

Número de

identificaçã

PROP1

Profeta do PIT1

Fator de transcrição específico

da hipófise

Hs00196604_m

CTNNB1

β-catenina

Proteína da junção de aderência

e da via Wnt

Hs00355045_m

PIT1

Fator de transcrição específico

da hipófise

Hs00230821_m

ACTB

Beta-actina

Proteina estrutural

citoesquelética

4326315E

B2M

Beta-2-microglobulina

Molécula do complexo principal

de histocompatibilidade I

4326319E

GAPDH

Glyceraldeído-3-

fosfatase-desidrogenase

Oxidoredutase na glicólise e

gliconeogênese

4326317E

HPRT

Hipoxantina-ribosil-

transferase

Síntese de purinas

4326321E

PGK1

Fosfoglicerato quinase 1

Enzima glicolítica

4326318E

CYC

Ciclofilina A

Catalisa a isomerização cis-

trans de ligações peptídicas

4326316E

TBP

Proteína ligadora

TATA-box

Fator de transcrição geral da

RNA polimerase II

4326322E

Gráfico 4 – Valores de estabilidade da expressão (M) dos genes endógenos nos

craniofaringiomas adamantinomatosos

3.10. Análise estatística

Foi utilizado o teste exato de Fisher para o cálculo do significado

estatístico da expressão do CTNNB1.

Valor de estabilidade da expressão (M)

Genes mais estáveis

Genes menos estáveis

4. Resultados

4.1. Sequenciamento

Foram identificadas 7 mutações somáticas no exon 3 do CTNNB1 em

9 dos 14 craniofaringiomas adamantinomatosos estudados (Tabela 4).

Todas as mutações são do tipo missense, em heterozigose. Cinco delas já

foram previamente descritas nesses tumores (22-25) e duas delas ainda

não. Uma das mutações não descritas resultou na substituição do

aminoácido hidrofílico ácido aspártico, pelo aminoácido hidrofóbico valina no

códon 32. A outra mutação não descrita resultou em substituição de uma

serina por prolina, ambos classificados como aminoácidos polares sem

carga, no códon 37.

Tabela 4 – Análise do exon 3 do CTNNB1 em pacientes com craniofaringiomas

adamantinomatosos

Paciente

Idade

(anos)

Sexo

Troca na sequencia

de DNA

Troca de

aminoácido

c.122C>T

p.Thr41Ile

Não encontrada

c.110C>T

p.Ser37Phe

Não encontrada

c.109T>C

p.Ser37Pro

Não encontrada

c.94G>A

p.Asp32Phe

c.122C>T

p.Thr41Ile

c.98C>T

p.Ser33Phe

c.94G>A

p.Asp32Phe

c.98C>G

p.Ser33Cys

Não encontrada

c.95A>T

p.Asp32Val

1 Mutações ainda não descritas em craniofaringiomas adamantinomatosos

4.2. Análise in silico

Todas as amostras, tanto as previamente descritas, como as não

descritas em craniofaringiomas adamantinomatosos, foram classificadas

como provavelmente danosas, ou seja, com grande chance de afetar a

função ou estrutura da proteína.

4.3. PCR em tempo real

4.3.1. Gene CTNNB1

Doze amostras foram submetidas à analise por PCR em tempo real,

sendo que dessas, sete apresentavam mutação no CTNNB1. Em cinco

dessas sete amostras observamos um aumento da expressão do CTNNB1

que variou de 2,5 a 6,2 vezes maior que a expressão do pool de hipófise

normal (amostras 3, 5, 9, 11, 14) (Gráfico 5). Com relação às cinco amostras

sem mutação no CTNNB1, apenas duas apresentaram expressão de 3,6 e

4,6 vezes maior que a do pool de hipófise normal (amostras 13 e 4

respectivamente) (Gráfico 5). Contudo, não houve diferença estatisticamente

significante entre o número de amostras com hiperexpressão do CTNNB1

nos grupos com e sem mutação neste gene (p=0,558).

Gráfico 5 – Expressão do CTNNB1 por PCR em tempo real em craniofaringiomas

adamantinomatosos com e sem mutação no CTNNB1, em relação ao

pool de hipófise normal

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

PHN

Quantificação Relativa

Craniofaringiomas adamantinomatosos

Expressão do CTNNB1

PHN

Com mutação

Sem mutação

PHN: pool hipófise normal

4.3.2. Gene PROP1

A expressão do PROP1 foi indetectável em dez das doze amostras

avaliadas. Entretanto, as duas amostras que apresentaram valores

detectáveis, embora hipoexpressos em relação ao pool de hipófise normal,

também apresentaram expressão de PIT1, sugerindo contaminação com

tecido hipofisário normal.

5. Discussão

Os craniofaringiomas são os tumores mais comuns da região

hipotálamo-hipofisária em crianças (1). Apesar de serem histologicamente

benignos, seu comportamento é agressivo e seu caráter invasivo para as

estruturas adjacentes - como a hipófise, o nervo óptico, e o hipotálamo -

pode resultar em sequelas com prejuízo frequente na qualidade de vida.

Mutações no gene CTNNB1, que codifica a proteína β-catenina, foram

descritas numa frequência variável de 16 a 100% dos craniofaringiomas

adamantinomatosos avaliados em diferentes séries (22-25). Essas mutações

foram encontradas no exon 3, afetando sempre o sítio de degradação da β-

catenina. Todas as mutações eram missense, exceto uma deleção de 81 pb,

somáticas e em heterozigose.

No presente estudo identificamos mutações no CTNNB1 em 64% das

amostras. Tais mutações foram encontradas nos códons 33 (n=2), 37 (n=2)

e 41 (n=2) afetando diretamente os resíduos de serina e treonina da β-

catenina, que são o alvo de fosforilação pela GSK-3β. Outro códon

acometido foi o 32 (n=3), que flanqueia o sítio de fosforilação da GSK-3β, o

que provavelmente também impediria a ação dessa enzima, como acontece

nas mutações nos códons 33, 37 e 41 (21) (Tabela 4).

Tanto as mutações já descritas encontradas nessa casuística quanto

as duas mutações ainda não descritas (p.Ser37Pro e p.Asp32Val) em

craniofaringiomas foram classificadas pelo programa PolyPhen como

provavelmente danosas, isto é, com grande chance de afetar a proteína.

Recentemente as mutações previamente descritas no CTNNB1

tiveram seu papel demonstrado na etiopatogênese do craniofaringioma

adamantinomatoso através do aumento da expressão dos genes alvo Axin2

e BMP4, da via de sinalização WNT (63). O primeiro codifica a proteína

Axina2, componente do complexo multiprotéico de degradação da β-

catenina, que atua como regulador negativo da via WNT (64); o segundo

codifica uma proteína de mesmo nome que exerce papel fundamental no

processo de desenvolvimento dentário (65) e está aumentada em tumores

com elevação da β-catenina (66). O aumento na expressão desses genes foi

evidenciado em células tumorais com acúmulo nuclear de β-catenina que

foram micro-dissecadas a laser. Ao contrário, as células sem acúmulo

nuclear da β-catenina não apresentaram tal aumento. Por outro lado, estes

autores também demonstraram que nem todas as células com presença de

mutações no exon 3 do CTNNB1 apresentavam acúmulo nuclear de β-

catenina, sugerindo que talvez as mutações que alteram a degradação da

proteína possam não ser suficientes per se para gerar tal acúmulo (63) e que

talvez outro mecanismo esteja envolvido nesse processo.

Outros fatores além das mutações ativadoras no CTNNB1 podem

estar envolvidos no acúmulo citoplasmático e consequentemente nuclear da

β-catenina. Entre eles, a ligação às caderinas e o transporte através da

membrana nuclear. Quando ligada à caderina, fazendo parte das junções de

aderência célula-célula, a β-catenina não entra no núcleo. A entrada e a

saída da β-catenina através do núcleo são processos que ocorrem sem

gasto energético, mas dependem das repetições armadillo 10-12 e da região

carboxi-terminal (67). O mesmo trabalho que avaliou a expressão da Axina2

e do BMP4 nas células com mutação no exon 3 e acúmulo nuclear de β-

catenina não encontrou mutações nos exons que codificam as regiões

responsáveis pela ligação às caderinas (exons 4, 9 e 13) e pelo transporte

nuclear da β-catenina (exons 8-13), indicando um mecanismo de transporte

nuclear e de ligação às junções de aderência intactos (63).

Em nossa casuística, avaliamos pela primeira vez a expressão do

CTNNB1 em craniofaringiomas adamantinomatosos. Observamos uma

expressão variável nesses tumores, com hiperexpressão em 58% das

amostras. Essa hiperexpressão ocorreu independentemente da presença ou

ausência de mutações no CTNNB1. O aumento de expressão do CTNNB1

poderia estar envolvido na patogênese dos tumores sem mutação nesse

gene. Enquanto nos tumores com mutação, essa hiperexpressão poderia

contribuir na patogênese ou modificar o fenótipo do tumor. No entanto, como

essa é a primeira descrição desse achado, outros estudos com maior

número de tumores são necessários para esclarecer o papel dessa

hiperexpressão.

A patogênese dos craniofaringiomas sem alterações no CTNNB1

ainda permanece sem explicação. Para investigar outros genes

provavelmente envolvidos nesse processo, analisamos a expressão do

PROP1. Esse gene foi escolhido baseado no fato de que a β-catenina –

única proteína envolvida até o momento com a patogênese – interage com o

PROP1 para controlar a determinação da linhagem celular hipofisária (12) e

de que camundongos transgênicos com expressão persistente do Prop1 têm

defeitos no controle da proliferação celular com aumento da susceptibilidade

a tumores hipofisários (14). Além disso, pacientes com mutações

inativadoras do PROP1 podem apresentar aumento hipofisário (48-57).

Portanto, a desregulação na expressão do PROP1 poderia resultar no

desenvolvimento de craniofaringiomas adamantinomatosos nos quais não

foram identificadas alterações no CTNNB1. Contudo, nenhuma das

amostras apresentou expressão de PROP1, exceto as que também

expressaram PIT1, sendo consideradas, portanto, contaminadas com tecido

hipofisário normal. Inicialmente nós imaginamos que as amostras sem

alteração no CTNNB1 poderiam apresentar um padrão de expressão de

PROP1 diferente do observado nas amostras com mutação, especialmente

uma hiperexpressão, o que eventualmente poderia ser responsável pela

patogênese dessas amostras. Contudo, nossos achados não foram capazes

de provar essa hipótese, uma vez que tanto as amostras com mutação

quanto as sem mutação no CTNNB1 apresentaram níveis indetectáveis de

PROP1, indicando que tal gene não deve ter relação com a tumorigênese

dos craniofaringiomas adamantinomatosos.

6. Conclusões

1- Identificamos mutações com ganho de função no CTNNB1 em 64%

dos tumores sendo cinco já descritas e duas mutações ainda não

descritas em craniofaringiomas adamantinomatosos.

2- Observamos aumento da expressão do CTNNB1 em 58% das

amostras sugerindo o envolvimento também da hiperexpressão desse

gene na etiopatogenia do craniofaringioma adamantinomatoso.

3- Observamos ausência de expressão do PROP1 em todas as

amostras, afastando o envolvimento desse fator de transcrição na

etiopatogenia do craniofaringioma adamantinomatoso.

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