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MARIA EMILIA ZENTENO

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MARIA EMILIA ZENTENO

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de

tipo TOLL(TRL) .

Orientador(a): Gustavo Pessini Amarante-Mendes.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado,

em sessão pública realizada a .............../................./.................,

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ....................................................................................

Nome: ............................................................................................

Instituição: .....................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ....................................................................................

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DEDICATÓRIA

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Para começar, gostaria de agradecer ao meu orientador Gustavo por ter me

guiado com responsabilidade e sabedoria. Pra mim foi muito importante seu apoio e

atenção nos primeiros momentos do mestrado já que não foi fácil conseguir

“decolar”. Agradeço a ele por ter confiado em mim, mesmo porque, imagino que seja

difícil orientar uma pessoa tão atrapalhada quanto eu. Por isso e muito mais, os

caminhos e prazos para cada experimento por ele estipulado foram de extrema

importância para o avanço deste trabalho até a meta especifica traçada.

Agradeço aos amigos do Laboratório, que para minha felicidade ainda estão

Aos amigos que não estão mais no laboratório, mas que se encarregaram de

me ensinar às principais técnicas, necessárias para meu trabalho. Da mesma

maneira, que sentaram comigo pacientemente para interpretar e discutir os

resultados obtidos. Eles me transmitiram sua experiência e despertaram em mim a

capacidade de analisar e questionar os experimentos realizados. Ao Ricardo, Ana

Elisa, Monica, Claudia, Daniel, Fabiola, Maira e Luciana Concepción.

Aos amigos do Laboratório da Professora Karina Bortoluci, inclusive a própria

prof

a

técnicas e terem me emprestado gentilmente alguns reagentes. Por formar parte

A toda a galera argentina que me ajudaram nos primeiros momentos em São

Paulo e continuam sendo uma boa companhia. A eles que planejaram as nossas

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desculpas por não conseguir ir, já que sempre tinha que fazer alguma coisa no

laboratório. A vocês, Silvina, Jorge e Hector (aliás, Chichi), “muchas gracias”.

A minha família, minha mãe Teresa, meu pai Ramon, meus irmãos Gustavo e

Marisa, a minha melhor amiga Malvina, a minha cunhada Analia. Para todos eles

muito obrigada por suportarem minha ausência e serem tão pacientes comigo

esperando o glorioso momento de minha volta pra Salta. Mesmo não

compreendendo o motivo da distância eles sabem o grande motivo da minha estadia

no Brasil e por isso fico feliz. Caros pais, agora estou colhendo os frutos que vocês

tinham me falado pra esperar, valeu o sacrifício e não tenho nada para me

maus momentos, suportando todos meus humores. Por “cebarme unos mates”

ele é, compreensível e paciente.

Agradeço às duas agências de financiamento CNPq e FAPESP que

aportaram o dinheiro para que este trabalho fosse realizado.

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positivas. Em conclusão, estes resultados indicam que BCR-ABL esta regulando a

expressão gênica de alguns TLRs. Por tanto esses dados contribuem para a

compreensão sobre o comportamento de células tumorais BCR-ABL positivas em

um contexto de infecção e por conseqüência, dão margem ao estudo de novos alvos

de fator de risco para a LMC.

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6 reconhecem lipopeptídeos, enquanto os TLR3, 7, 8 e 9 compõem o grupo de

reconhecimento dos ácidos nucléicos. TLR5 reconhece a proteína flagelina, principal

componente do flagelo das bactérias presentes na lamina própria intestinal.

Finalmente, o TLR4 se une a vários ligantes estruturalmente não relacionados,

reconhecendo, principalmente, lipopolisacarídeos (LPS) da parede celular das

bactérias gram-negativas, mas também a proteína de fusão do vírus sincicial

respiratório (RSV), o paclitaxel, a fibronectina e proteínas de choque térmico (heat

CD36, para distinguir uma ampla variedade de PAMPs, tais como, peptidoglicanas,

lipopeptídeos de bactérias gram-positivas e micoplasma, e zymosan de fungos,

parasita Toxoplasma gondii (Zhang et al., 2004).

2001); TLR7 reconhece RNA de fita simples (single strand RNA; ssRNA)

provenientes de retrovírus, mas apresenta ligantes artificiais, tais como as moléculas

sintéticas do tipo imidazoquinolinas, cujo representante principal é o imiquimod,

assim também os análogos de guanosinas, tais como, loxorribine, embora exista

outro ligante para este receptor, os siRNA (small interference RNA). TLR8 têm uma

alta homologia com TLR7 e por essa questão também participa no reconhecimento

de ssRNA (Heil et al., 2004) e TLR9 se liga a motivos CpG desmetilados,

encontrados com freqüência no DNA de vírus e bactérias.

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A sinalização dos TLRs ativa a indução dos genes de citocinas inflamatórias

como TNF, IL-6, IL-1 e IL-12, assim também induz a expressão de moléculas co-

estimulatorias em células dendríticas e macrofagos. Coletivamente, cada TLR

recruta uma combinação específica de moléculas adaptadoras para ativar diferentes

fatores de transcrição que darão origem à resposta apropriada e efetiva contra o

patógeno estimulador. Basicamente, dependendo do estímulo, podem ser ativados

os fatores de transcrição NFB e AP-1 para produção de citocinas inflamatórias e/ou

IRFs para a produção de interferons tipo I (IFN- e -). Assim, moléculas

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O reconhecimento dos PAMPs pelos TLRs estimula o recrutamento de

proteínas adaptadoras que possuem domínios TIR em sua estrutura para interagir

com o domínio TIR intracelular dos TLRs. São quatro as moléculas adaptadoras

envolvidas na sinalização dos receptores TLRs, MyD88, TIRAP, TRIF e TRAM (ou

TICAM2) (Akira e Takeda, 2004). A proteína MyD88 é utilizada por todos os TLRs, a

exceção de TLR3, e ativa NFkB e as vias das MAPKs para induzir a produção de

citocinas pro-inflamatorias. Por outro lado, TLR3 utiliza a molécula TRIF para

sinalizar a produção de interferon de tipo I e citocinas inflamatorias via ativação dos

fatores de transcrição, IRF3 e NFkB, respectivamente. TRAM e TIRAP são mais

duas moléculas adaptadoras utilizadas pelo TLR4 para recrutar TRIF e pelo TLR2 e

quatro moléculas adaptadoras para desencadear sua sinalização. A produção de

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citocinas inflamatórias induzidas por este receptor necessita da ativação de NFkB

pelas duas vias, dependente de MyD88 e TRIF.

IRAK4 (IL-1 receptor-associated kinase 4) após a ligação do receptor TLR com seu

PAMPs cognato. Esta ativação promove a interação de TRAF6, uma E3 ligasa que

cataliza a poliubiquitinação de Ly63 (K63) de proteinas alvos. Dessa forma, o

complexo regulatório de TAK1 (TGFβ-activated kinase 1) é recrutado e ubiquitinado

com a conseqüente ativação desta molécula. A partir de TAK1 duas vias diferentes

são ativadas. Por um lado, a cauda de ubiquitinas na K63 recruta a proteína NEMO

do complexo inibitório IKK, envolvido na ativação de NFkB, e o aproxima da

de transcrição são ativados inclusive o fator AP-1. Tal fator é um fator de transcrição

dimérico composto por monômeros das subfamílias protéicas c-jun, c-fos e ATF,

sendo o c-jun o que têm o papel mais relevante na resposta inflamatória da

sinalização TLR (Kawai e Akira, 2010).

Esta molécula adaptadora recruta TRAF6 que ativa TAK1 para a posterior ativação

de NFkB. Provavelmente por mecanismos de ubiquitinação similares aos descritos

anteriormente para a sinalização dependente de MyD88. Uma molécula primordial

para ativação de NFkB via TRIF na resposta pela ativação de TLR3 é a proteína

e sinaliza a ativação da proteína TBK1 (TANK-binding kinase1) que por sua vez

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fosforila e ativa o fator de transcrição IRF3 pra este translocar ao núcleo e induzir a

produção de interferon-β.

Além das duas vias descritas acima, existe outra sinalização desencadeada

pelos receptores de reconhecimento de ácidos nucleidos, TLR7 e 9. Tal via

caracteriza-se pela produção de interferon de tipo I (IFN- e IFN-) de forma

dependente de MyD88, independente de TRIF e com ativação do fator de

transcrição IRF7 (Interferon Regulatory Factor 7). Esses receptores de tipo Toll são

transcrição da via de sinalização dos IFN-α e –β, que estimula um processo de

retroalimentação positiva para aumentar a produção de IFN de tipo I. Esse fato

determina um papel fundamental desta proteína, assim como da ativação dos TLR7

e 9, para a produção das citocinas essências para o combate das doenças virais

(Honda et al., 2004; Kawai et al., 2004).

1.2 IMPORTÂNCIA DOS TLRs NO CÂNCER

A inflamação é um processo fundamental na resposta imune, principalmente

porque estimula a ação do sistema para eliminação de patógenos, para o reparo e

presença de inflamação crônica estimulada pela infecção com Helicobacter pylori e a

transformação neoplásica de células hepáticas em infecções com vírus da Hepatite

B e C (Fukata e Abreu, 2009; Peek e Blaser, 2002). Acredita-se que o

microambiente tumoral compartilha características similares ao local de inflamação

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crônica, mesmo na inflamação estéril produzida na ausência de patógeno (Dvorak,

1986). De certa maneira, esses locais possuem fatores que suportam a iniciação,

manutenção e progressão da neoplasia de células vizinhas. O principal fato que

comprova esta afirmação é a diminuição do risco de desenvolvimento de alguns

tipos de neoplasias pelo uso de drogas anti-inflamatorias (Gupta e Dubois, 2001;

Robak et al., 2008).

O reparo e geração de tecido após insultos injuriosos é um processo

complexo no quais receptores de tipo Toll foram primariamente envolvidos. A

sinalização dos TLRs resulta ser essencial na manutenção da integridade tissular e

reparo do tecido danificado em modelos de injuria colônica provocada por infecção,

produção de prostaglandina, via regulação de Cox-2 pelas células do estroma

tecidual na inflamação por injuria (Brown et al., 2007; Fukata et al., 2006).

Conseqüentemente, a prostaglandina e outros produtos da ativação dos TLRs, tais

como quimiocinas, VEGF e metaloproteasas de matriz extracelular (Fukata et al.,

2006; Pull et al., 2005; Rakoff-Nahoum et al., 2004), têm efeitos na arquitetura

tissular ao estarem envolvidos na angiogênese e remodelação do tecido danificado.

Recentes evidências demonstraram que TLRs pode tambem regular a morte

celular. Tal regulação pode ser um efeito direto, como demonstrado por Monick et al.

em células de macrófagos estimulados por LPS que leva ao aumento da expressão

2008).

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Na inflamação não infecciosa, a ativação dos receptores TLRs pode

acontecer pelo reconhecimento de moléculas intracelulares derivadas de células que

morreram por necrose, mas não por apoptose. Este grupo de moléculas chamasse

conjuntamente de DAMPs (Damage Associated Molecules Patterns) já que indicam

sinais de perigo por perda da integridade tissular provocada por injuria e formam

parte dos ligantes endógenos de TLRs. Entre eles podemos citar moléculas

associadas à estrutura da mitocôndria como são as HSPs (Heat Shock Proteins) e a

molécula associada à cromatina, HMGB1 (Rakoff-Nahoum e Medzhitov, 2009).

exemplos de processos celulares que demonstram o envolvimento direto da

sinalização dos TLR no beneficio das células tumorais.

O primeiro indicativo de que a sinalização TLR poderia ter um efeito pro-

tumoral vem de trabalhos de transferência adotiva de células transformadas. Foi

observado que o estimulo dos receptores TLRs com seus agonistas desencadeia o

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celulares de hepatocarcinoma, foi evidenciado o crescimento tumoral quando LPS foi

injetado intraperitonealmente (Luo et al., 2004).

Paralelamente, estudos indicam que células de vários tipos de tumores

induzem a expressão dos receptores TLRs quando comparados as células controles

essencial no desenvolvimento das neoplasias. Assim, foi demonstrado que

camundongos deficientes de tais receptores imunes são protegidos da formação de

tumores quando induzidos em modelos experimentais (Fukata et al., 2007; Swann et

de sinalizar e provocar o crescimento celular observado.

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sinalização diretamente nas celulas transformadas. Assim, Huang et al.

demonstraram que a ligação de TLR2 com Listeria monocytogenes em células de

hepato-carcinoma promove o crescimento tumoral e estimula o aumento da

produção de IL-6 e oxido nítrico (Huang et al., 2007). Outros fenótipos foram

obervados pelos autores, tais como aumento da proliferação celular, resistência a

apoptose e metástases das células tumorais ao regular a secreção de

metaloproteinases e integrinas. Em relação ao fenótipo de remodelação da matriz

extracelular e promoção de metástase, observou-se que o estímulo com agonista de

TLR9 em linhagens tumorais de mama MDA e MDB-231 promoveu a invasão celular

submetidas a baixa quantidade de soro fetal bovino (2%) na cultura. Esse mesmo

agonista tornou as células tumorais resistentes à morte por apoptose induzida pela

droga dexametasona. Paralelamente, em outro ensaio, os autores demonstraram

que o agonista de TLR7, loxoribine, também protege às células da morte induzida

pela dexametasona. A secreção da citocina IL-6 no meio extracelular mostrou ser

crucial no processo de proliferação das células tumorais já que o uso de anticorpo

anti-IL6 bloqueou o aumento celular quando comparado com o controle tratado com

IgG e CpG (Jego et al., 2006). Simultaneamente, Bohnhorst et al. confirmou o

envolvimento da sinalização de outros receptores TLRs na proliferação e

comprovado pela diminuição da proliferação de células tratadas com Pam3Cys

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quando anticorpos anti-IL-6 estão presentes no meio de cultura (Bohnhorst et al.,

2006).