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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA
ELISSENA CHINAGLIA ZABOTTO SARDINHA
Respostas de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom)
submetidos a estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade
Piracicaba
2010
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ELISSENA CHINAGLIA ZABOTTO SARDINHA
Respostas de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom)
submetidos a estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade
Tese apresentada ao Centro de Energia Nuclear
na Agricultura da Universidade de São Paulo,
para a obtenção do título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Biologia na Agricultura e
no Ambiente
Orientador: Prof. Dr. Victor Alexandre Vitorello
Piracicaba
2010
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER
MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,
DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP
Sardinha, Elissena Chinaglia Zabotto
Respostas de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv
Micro-Tom) submetidos a estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade /
Elissena Chinaglia Zabotto Sardinha; orientador Victor Alexandre Vitorello. - -
Piracicaba, 2010.
86 f.: fig.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de
Concentração: Biologia na Agricultura e no Ambiente) – Centro de Energia
Nuclear na Agricultura da Universidade de São Paulo.
1. Acidez do solo 2. Estimulantes do crescimento vegetal 3. Mecanismo
de controle vegetal 4. Parede celular vegetal I. Título
CDU 576:634.675
Dedico
a toda minha família principalmente meu esposo Roberto Sardinha Jr. e a
meu “anjo” Eduardo Sardinha e aos meus queridos amigos.
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais
volta ao seu tamanho original “
(EINSTEIN)
AGRADECIMENTOS
A Deus, sempre presente.
A minha família, meus pais e irmãs pelo estímulo e encorajamento em todos os momentos.
Ao meu marido e amigo de todas as horas, alguém com quem eu posso contar Sardinha.
Ao meu filho Dudu, a alegria de todos os dias.
Aos amigos de sempre e os de hoje.
Ao Prof. Dr. Victor Alexandre Vitorello pela oportunidade, orientação e compreensão.
A amiga Lucélia Borgo, pela amizade, convivência e por toda a ajuda prestada.
Ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura pela oportunidade de realizar o curso de
Doutorado e pela estrutura oferecida.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão
da bolsa de estudos.
Aos técnicos e auxiliares do Lab. De Biologia Celular e Molecular Francisco Montrazi, Fábio
Duarte e Wagner Piccinini por todo o auxílio prestado durante o desenvolvimento deste
trabalho.
Ao Núcleo de Apoio à Pesquisa em Microscopia Eletrônica em Pesquisa Agropecuária-
Esalq/USP (NAPMEPA) em especial aos Profs. Eliotti Kitajima e Franscisco Tanaka pela
disponibilidade do uso do microscópio óptico.
A todos que, de alguma maneira, contribuíram para a realização deste trabalho.
Muito Obrigada.
RESUMO
SARDINHA, E. C. Z. Respostas de pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum
L. cv Micro-Tom) submetidos a estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade. 2010. 86 f.
Tese (Doutorado) - Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo,
Piracicaba, 2010.
A acidez do solo é um dos principais fatores limitantes à produção vegetal. A toxicidade por
alumínio, que ocorre apenas a pH baixo, tem sido extensamente investigada, enquanto o
estresse causado pelo pH baixo tem recebido pouca atenção. Os estudos nesta área quase
sempre presumem efeitos aditivos, e, portanto independentes, da toxicidade por Al
3+
e H
+
.
Este provavelmente não é o caso, sendo que o pH baixo pode ser um fator de predisposição
das células ao Al
3+
. As evidências indicam que o pH baixo causa desarranjos na parede de
células em crescimento, gerando estresse que pode comprometer a sua funcionalidade e
integridade. É provável que a susceptibilidade a este estresse deva ser dependente da pressão
de turgor. Por sua vez, o metabolismo oxidativo e a geração de espécies reativas de oxigênio
(ROS) na parede celular podem modular a sua extensibilidade por romper ou criar ligações
dentro ou entre cadeias de polissacarídeo. Há grande interesse em conhecer se, assim como
em leveduras, as células vegetais possuem um sistema de percepção e resposta a estresse da
parede. Os pêlos radiculares em crescimento são sensíveis a pH baixo e estresse hipo-
osmótico e constituem um bom modelo experimental para estes estudos. Os objetivos deste
trabalho foram: a) Otimizar um sistema experimental para o estudo de pêlos radiculares de
tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom); b) Avaliar as respostas dos pêlos
radiculares ao estresse por pH baixo e hipo-osmolaridade; c) Examinar o papel da modulação
oxidativa da parede celular nestas respostas; e d) Avaliar a resposta de diferentes mutantes
hormonais de Micro-Tom a estes fatores de estresse. Os principais parâmetros avaliados
foram a taxa de alongamento (µm.min
-1
) e a freqüência de rompimento dos pêlos. Tanto o
estresse por pH baixo quanto choques hipo-osmóticos resultaram em taxas de alongamento
significativamente diminuídos e o rompimento de pêlos radiculares, mas os efeitos dos
tratamentos hipo-osmóticos foram mais marcantes. Uma curva de resposta frente à
osmolaridade da solução externa revelou que a taxa de alongamento aumentou com a
diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da taxa de
alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Também se observou uma
interação entre hipo-osmolaridade e pH baixo. O emprego do inibidor difenileno iodônio não
forneceu evidências do envolvimento de NADPH oxidases da membrana plasmática na
resposta de pêlos radiculares a choque hipo-osmótico ou pH baixo. Já no caso do inibidor
ácido salicilhidroxâmico, encontrou-se evidências do envolvimento de peroxidases da parede.
Nos mutantes hormonais dgt (pouco sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas
não em not (deficiente em ácido abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor
resposta de ajustamento a choque hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o
alongamento e o rompimento dos pêlos. Este trabalho fornece boas evidências de que os pêlos
radiculares possuem um mecanismo de percepção e resposta a estresse da parede visando à
manutenção de sua integridade e que apresentam bom potencial como sistema modelo nesta
linha de pesquisa.
Palavras-chave: Pêlos radiculares. pH baixo. Hipo-osmótico. Pressão de turgor. Modulação
oxidativa. Parede celular. Mutantes hormonais. Tomateiro. Espécies reativas de oxigênio.
ABSTRACT
SARDINHA, E. C. Z. Response of tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root
hairs to low pH and hypo-osmotic stress. 2010. 86 f. Tese (Doutorado) - Centro de Energia
Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2010.
Soil acidity is a major factor limiting plant growth worldwide. Aluminum toxicity, which
occurs only at low pH, has been extensively studied, whereas low pH stress has received
much less attention. Studies on Al
3+
and H
+
toxicity make the underlying assumption that the
effects of these stress factors are additive, and, therefore independent of each other. However,
this is most likely not the case and low pH may be a factor which increases susceptibility to
further injury by Al
3+
. There is evidence that low pH causes disruption in cell wall structure of
growing cells, which might jeopardize cell wall functionality and integrity. It is likely that
turgor pressure plays an important role in cell wall stress caused by low pH. The apoplastic
metabolism of reactive oxygen species (ROS) can modulate cell wall extensibility by making
or breaking bonds within and between cell wall polysaccharides. A major question is whether,
similarly to yeast, plant cells have a cell wall integrity signaling and response system.
Growing root hairs are sensitive to low pH and hypo-osmotic stress and are potentially good
experimental systems for such investigations. The objectives of this study were: a) Optimize
an experimental system to examine tomato (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom) root
hairs; b) Examine the response of root hairs to low pH and hypo-osmotic stress; c) Examine
the role of oxidative modulation of the cell wall in these responses; and d) Evaluate the
response of different hormonal mutants of Micro-Tom to these stress factors. Root hair
elongation rates (µm.min
-1
) and the frequency of cell bursting were the major experimental
parameters which were evaluated. Both low pH and, more markedly, hypo-osmotic stress
caused significant reductions in elongation rates and the bursting of root hair tips. In a
response curve to varying osmolarities of the external medium, root hair elongation rates
increased with decreasing osmolarities until a threshold was reached and elongation rates
decreased drastically and the bursting of root hairs began to be observed. Interactions between
low pH and hypo-osmolarity were observed. The use of the inhibitor diphenylene iodonium
(DPI) did not provide evidence for the involvement of plasma membrane NADPH in the
response of root hairs to low pH and hypo-osmotic shock. However, a role for cell wall
peroxidases was provided by use of the inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Root hairs
of the hormonal mutants dgt (low sensitivity to auxin) and epi (ethylene super producer), but
not not (deficient in abscisic acid), displayed a more effective response to hypo-osmotic shock
than Micro-Tom, by decreasing elongation rates and cell bursting to a greater degree. This
study provides good evidence to suggest that root hairs have a cell wall integrity response
system and that root hairs are potentially good cell model systems for such research.
Key-words: Root hairs. Low pH. Hypo-osmolarity. Turgor pressure. Oxidative modulation.
Cell wall. Hormonal mutants. Tomato. Reactive oxygen species.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABA ácido abscísico
BR brassinosteróides
CV% coeficiente de variação
d.p. desvio padrão
dgt mutante diageotropica - pouco sensível à auxina
dms diferença mínima significativa
DPI difenileno iodônio (diphenylene iodonium)
dpy mutante dumpy - deficiente em brassinosteróides
e.p. erro padrão da média
epi mutante epinastic - super produtor de etileno
GA ácido giberélico
MMin meio mínimo
MS meio de Murashige e Skoog (1962)
MT cultivar Micro-Tom de tomateiro
not mutante notabilis - deficiente em ácido abscísico
pro mutante procera - super sensível ao ácido giberélico
ROS espécies reativas de oxigênio
SHAM ácido salicilhidroxâmico (salicylhydroxamic acid)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 11
2. REVISAO DA LITERATURA ......................................................................................... 15
2.1. Pêlo radicular como sistema modelo .............................................................................. 15
2.2. Acidez e a parede celular ................................................................................................ 16
2.3. Sistema de resposta a estresse da parede celular .......................................................... 17
2.4. Modulação oxidativa da parede celular ........................................................................ 18
2.5. Interações com hormônios .............................................................................................. 19
2.6. O cultivar Micro-Tom de tomateiro e seus mutantes hormonais ............................... 20
3. HIPÓTESES ....................................................................................................................... 22
4. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 23
5. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 24
5.1. Material vegetal ............................................................................................................... 24
5.2. Desinfestação e germinação das sementes ..................................................................... 24
5.3. Desenvolvimento do sistema experimental para estudo de pêlos radiculares ............ 25
5.4. Transferência e aclimatação das plântulas nas câmaras de crescimento ................... 27
5.5. Tratamentos e as respectivas soluções utilizadas ......................................................... 28
5.5.1. Aplicação e troca de soluções de tratamento ................................................................. 29
5.5.2. Tratamentos com soluções de diferentes valores de pH (4,5 e 5,8) ............................... 30
5.5.3. Tratamentos com variações na osmolaridade das soluções – tratamentos hipo-
osmóticos .................................................................................................................................. 30
5.6. Medição do alongamento dos pêlos radiculares ........................................................... 31
5.7. Avaliação de pêlos radiculares rompidos ...................................................................... 32
5.8. Avaliação da modulação oxidativa da parede celular .................................................. 33
5.8.1. Aplicação exógena de ROS (H
2
O
2
)
e ácido ascórbico ................................................... 33
5.8.2. Aplicação exógena de inibidor de NADPH oxidase (DPI) ............................................ 34
5.8.3. Aplicação exógena de inibidor de peroxidase de parede (SHAM) ................................ 34
5.9. Avaliação dos mutantes hormonais de MT ................................................................... 34
5.9.1 Tratamento hipotônico em mutantes super produtores de etileno (epi) .......................... 35
5.9.2 Tratamento hipotônico em mutantes ............................................................................... 35
5.10. Estudo complementar do efeito de tampões para uso a pH baixo, sobre células
vivas ......................................................................................................................................... 35
5.11. Delineamento experimental .......................................................................................... 36
6. RESULTADOS ................................................................................................................... 37
6.1. Avaliação do alongamento de pêlos radiculares e sua variabilidade no sistema
experimental desenvolvido ..................................................................................................... 37
6.1.1. Análise da relação entre a taxa de alongamento e o comprimento inicial do pêlo ....... 38
6.1.2. Análise da variabilidade da taxa de alongamento dos pêlos radiculares dentro e entre
raízes ......................................................................................................................................... 39
6.1.3. Análise temporal da taxa de alongamento do pêlo radicular ao longo do período de
observação ................................................................................................................................ 40
6.2. Resposta dos pêlos radiculares expostos diretamente a MMin em pH baixo ............ 41
6.3. O fornecimento dos sais do meio MS afeta a taxa de alongamento dos pêlos pelas
mudanças de osmolaridade não de nutrientes ..................................................................... 43
6.4. Curva de resposta da taxa de alongamento do pêlo radicular em função da
osmolaridade da solução de tratamento ............................................................................... 45
6.5. Estabelecimento de uma solução de referência para o tratamento inicial dos pêlos
radiculares ............................................................................................................................... 46
6.6. Choque hipo-osmótico associado a alterações de pH ................................................... 49
6.7. Evidências de possível papel da modulação oxidativa da parede celular na resposta
ao choque hipo-osmótico ........................................................................................................ 53
6.7.1 Choque hipo-osmótico a pH 5,8, na presença de H
2
O
2
e ácido ascórbico ..................... 54
6.7.2. Choque hipo-osmótico a pH 5,8 e 4,5 na presença de inibidor (DPI) de NADPH
oxidase ...................................................................................................................................... 57
6.7.3. Choque hipo-osmótico na presença de inibidor de peroxidases (SHAM) ...................... 60
6.8. Caracterização de mutantes hormonais de MT quanto à formação e alongamento de
pêlos radiculares ..................................................................................................................... 62
6.9. Tratamento hipo-osmótico de pêlos de mutantes hormonais de MT .......................... 64
6.9.1. Exposição direta de pêlos do mutante super produtor de etileno (epi) a solução hipo-
osmótica .................................................................................................................................... 64
6.9.2. Choque hipo-osmótico em mutantes selecionados ......................................................... 65
6.10. Efeito de diferentes tampões sobre o alongamento de pêlos ...................................... 67
7. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 70
7.1. A resposta dos pêlos radiculares ao estresse da parede ............................................... 70
7.2. Mecanismos de resposta do pêlo ao estresse da parede ............................................... 72
7.2.1. Ajustamento de turgor celular ........................................................................................ 72
7.2.2. Enrijecimento da parede por meio da sua modulação oxidativa ................................... 73
7.3. A resposta de mutantes hormonais ao estresse da parede (hipo-osmótico) ............... 75
7.4. A variabilidade nas taxas de alongamento à luz do modelo proposto e observações
relatadas na literatura ............................................................................................................ 75
8. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 77
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 79
11
1. INTRODUÇÃO
Solos ácidos ocorrem nas regiões tropicais e subtropicais recobrindo cerca de 40% da
área agricultável do mundo (VITORELLO; CAPALDI; STEFANUTO, 2005), essa
característica é um dos principais fatores que limitam a produção agrícola nos trópicos. O
Cerrado brasileiro ocupa 205 milhões de hectares do território nacional e, apesar de apresentar
excelentes qualidades no que se refere à topografia, luminosidade, temperatura e estrutura
física do solo, se caracteriza por possuir baixa fertilidade, pH baixo e elevada saturação de
alumínio (CANÇADO et al., 2001).
A toxicidade pelo alumínio (Al) tem sido objeto de muitas pesquisas e revisões
(HORST; WANG; ETICHA, 2010; KOCHIAN; HOEKENGA; PINEROS, 2004), mas ela só
ocorre quando o Al está presente sob a forma solúvel que se dá em pH abaixo de 5,0
(PARENTONI et al., 2001), condição esta que sozinha pode também gerar toxicidade. No
entanto, há poucos trabalhos sobre o efeito de pH baixo em si em plantas (KOYAMA;
TODA; HARA, 2001).
Nos trabalhos que investigam a toxicidade pelo Al, os seus efeitos geralmente são
comparados com tratamentos idênticos, também a pH baixo, mas na ausência de Al. Muitas
vezes o efeito do Al é avaliado subtraindo valores de medições obtidos na ausência de Al de
valores obtido na sua presença. Embora, na falta de melhores informações, este procedimento
é correto, esta comparação presume efeitos aditivos e, portanto, totalmente independentes de
pH e Al. No entanto, este pode não ser o caso (VITORELLO; CAPALDI; STEFANUTO,
2005). Assim, o pH baixo pode afetar a estrutura de diversos componentes da superfície da
célula, alguns em si podendo causar efeitos deletérios, mas que também podem alterar
drasticamente o acesso e a interação do Al com seus alvos. Assim, por exemplo, alguns
trabalhos mostram correlação entre toxicidade por H
+
e por Al (OFEI-MANU et al., 2001) e
entre a absorção de Al e a permeabilidade da membrana plasmática em meio ácido (SOUZA,
1999).
Entender como ocorrem e quais são os eventos celulares frente ao abaixamento de pH
externo é importante, inclusive porque muitos processos bioquímicos ocorrem apenas a uma
faixa relativamente estreita de pH. Uma questão importante é que as células apresentam
sensibilidade diferenciada a pH baixo. Ou seja, há variações não genotípicas na sensibilidade
celular a pH baixo. Alguns trabalhos mostram que, assim como ocorre com o Al
(YAMAMOTO et al., 1994), a sensibilidade ao pH baixo depende da fase de crescimento e/ou
12
desenvolvimento das células (KOYAMA; TODA; HARA, 2001; KOYAMA et al., 1995;
VITORELLO; HAUG, 1996).
Os pêlos radiculares são bastante sensíveis a pH baixo. Bibikova et al. (1998)
relataram que a pH < 4,5 o alongamento dos pêlos de Arabidopsis thaliana foi inibido e cerca
de 25% dos pêlos em alongamento romperam-se na ponta enquanto aqueles que já haviam
interrompido o alongamento antes do tratamento a pH baixo mantiveram-se intactos. No caso
dos pêlos que sofreram ruptura em suas pontas (BIBIKOVA et al., 1998), os autores sugerem
que o abaixamento do pH a valores menores que 4,5 poderia enfraquecer a estrutura da parede
ou afetar seus processos de síntese e organização na extremidade do pêlo, a ponto do turgor
celular causar a ruptura da célula. No caso dos pêlos em que o alongamento já havia sido
interrompido, é possível que a parede destes seja insensível ao abaixamento de pH.
Outros trabalhos também sugerem um efeito do pH baixo sobre a parede celular.
Koyama et al. (2001) apresentaram evidências de que o pH baixo poderia causar injúrias às
raízes devido a sua interação com pectina. É provável que valores baixos de pH possam
induzir mudanças moleculares no contínuo parede celular – membrana plasmática –
citoesqueleto (CW-PM-CSK) (VITORELLO; CAPALDI; STEFANUTO, 2005).
Recentemente, Monshausen et al. (2007) confirmaram os resultados de Bibikova et al.
(1998) e forneceram maiores evidências do envolvimento da parede celular na resposta
celular a pH baixo. Estes autores relataram que 100% dos pêlos observados em crescimento
sofreram ruptura quando expostos a pH 4,5, e obtiveram evidências indiretas de que isto
ocorreu devido ao afrouxamento da parede celular em função do pH. A elevação do pH
externo levou a interrupção do crescimento celular enquanto o abaixamento do pH resultou na
ruptura celular. Respostas semelhantes foram observadas com a manipulação de espécies
reativas de oxigênio (ROS, “reactive oxygen species”) na parede celular. A adição de
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) resultou na interrupção do crescimento enquanto a remoção de
ROS via antioxidantes levou à ruptura celular.
Vários trabalhos têm demonstrado o papel de ROS na extensibilidade da parede
celular (LISZKAY; KENK; SCHOPFER, 2003; PASSARDI; PENEL; DUNAND, 2004).
Sabe-se que espécies reativas de oxigênio (O
2•-
, H
2
O
2
,
•
OH) e enzimas do metabolismo
oxidativo, como a NADPH oxidase e as peroxidases do tipo III, desempenham papel
importante na modulação da extensibilidade da parede celular (LISZKAY; KENK;
SCHOPFER, 2003; PASSARDI; PENEL; DUNAND, 2004) e do crescimento e
desenvolvimento (FOREMAN et al., 2003; SWANSON; GILROY, 2010). Ligações intra e
intermoleculares podem ser quebradas ou formadas em cadeias de polissacarídeos ou outras
13
moléculas estruturais da parede pela ação direta de ROS ou em conjunto com a ação de
enzimas como as peroxidases do tipo III da parede.
A ruptura celular em função do desbalanceamento entre a pressão de turgor e a
resistência da parede celular, é conhecida em pêlos radiculares e tubos polínicos (JONES;
RAYMOND; SMIRNOFF, 2006). Apesar de poucos casos descritos, o mesmo também pode
ocorrer em outros tipos de células vegetais (PROSEUS; BOYER, 2006), o que nos leva a
acreditar que a ruptura celular causada por pH baixo possa ser um evento mais comum do que
se imagina. A razão exata dos desarranjos na estrutura da parede quando exposta ao pH baixo
que resultam na ruptura celular ainda não é conhecida.
Atualmente há grande interesse em se determinar se plantas, à semelhança do que
ocorre em leveduras, possuem um sistema de monitoramento e resposta a estresse da parede
visando à manutenção da integridade da parede celular (HAMANN et al., 2009; LEVIN,
2005).
Neste contexto, alguns aspectos sobre os trabalhos existentes até o momento devem
ser ressaltados. A partir dos poucos relatos existentes e observações preliminares em nosso
laboratório, fica evidente que nem todos os pêlos se rompem quando expostos a pH baixo.
Além disso, deve ser ressaltado que o procedimento experimental empregado nestes estudos é
artificial, já que as células são expostas a pH baixo de maneira abrupta e muitas vezes essas
exposições são acompanhados de estresse hipo-osmótico, o que por si só causa um aumento
na pressão de turgor. Possivelmente se a exposição a pH baixo ocorrer de forma gradual,
talvez a célula possa ajustar esse afrouxamento da parede celular não resultando em ruptura.
Estudos sobre os fatores e condições determinantes para que alguns pêlos não sofram ruptura,
ou do possível processo de ajustamento das células ao pH baixo poderão contribuir para o
entendimento desses eventos celulares.
Outro aspecto que também deve ser examinado é o que ocorre nas células expostas a
pH baixo que não se rompem. Alguns trabalhos indicam que pêlos radiculares crescem mais
lentamente (BIBIKOVA et al., 1998), isto, de certa maneira, se contrapõe ao aumento do
afrouxamento da parede celular, já que o esperado seria que com o afrouxamento a célula
crescesse mais rapidamente. Sendo assim, uma questão ainda sem resposta é se o
alongamento mais lento seria o resultado de um ajustamento celular tentando diminuir o
intenso afrouxamento causado pelo pH baixo, ou seria decorrente de outros danos celulares.
Outro fator que possivelmente deve afetar a resposta da célula a pH baixo é a ação de
hormônios, como as auxinas e etileno, que têm efeito marcante sobre a expansão celular.
Além disto, o controle hormonal da expansão celular pode envolver ROS (SCHOPFER et al.,
14
2002), que desempenham papel na determinação da extensibilidade da parede celular
(PASSARDI; PENEL; DUNAND, 2004). Uma das enzimas geradoras de ROS apoplástico é a
NADPH oxidase, cuja atividade já foi relacionada com a suscetibilidade à ruptura celular em
outras condições não relacionadas a pH baixo (MACPHERSON et al., 2008). Assim, o uso de
mutantes hormonais poderá melhor elucidar os mecanismos de ação e de resposta celular ao
H
+
.
Em função do que foi discutido, é provável que a susceptibilidade de pêlos radiculares
a pH baixo deva ser dependente da pressão de turgor. Deve ser colocado que este é um fator
que tem sido em grande parte ignorado, embora a maioria dos trabalhos com toxicidade por
Al e acidez envolve a transferência de plantas de uma solução mais rica em nutrientes e de
osmolaridade mais elevada para outra bem mais diluída e de baixa força iônica. Ou seja,
nestes experimentos, um tratamento hipo-osmótico geralmente está embutido. No campo
também o estresse hipo-osmótico pode ter relevância em função das grandes variações das
condições hídricas do solo, principalmente quando cai chuva sobre solos previamente secos.
Assim, neste trabalho, serão estudadas as respostas de pêlos radiculares a estresse por
pH baixo e hipo-osmolaridade, dando ênfase à taxa de alongamento destes pêlos à integridade
da parede celular.
15
2. REVISAO DA LITERATURA
2.1. Pêlo radicular como sistema modelo
Nos últimos anos muito tem sido descoberto sobre a biologia das plantas através dos
estudos genômicos, proteômicos, transcriptômicos, etc. Esses resultados acabam não
refletindo o que acontece em células isoladas, mas sim em tecidos, órgãos ou mesmo na
planta inteira. A falta dessa resposta isolada pode mascarar resultados ou mesmo diluir outros
efeitos. Essa é uma das razões da necessidade da definição de um sistema modelo.
No estudo da biologia vegetal existem alguns candidatos a sistema modelo como pêlos
radiculares, tricomas e pólen. Todos são unicelulares, apresentam sistema de diferenciação
celular, e podem ser obtidos em grande quantidade. Dentre esses três modelos os pêlos
radiculares são os mais interessantes. Pêlos radiculares possuem mecanismo conhecidos de
determinação e diferenciação celular (BIBIKOVA; GILROY, 2003) de alongamento
(CAROL; DOLAN, 2002), e atuam no acúmulo de água e nutrientes (FOREMAN; DOLAN,
2001). São células de crescimento polar com forma tubular que emergem do final da base de
células especializadas chamadas tricoblastos. Eles são responsáveis por ancorar a raiz e por
aumentar a área de superfície para o acúmulo de água e de nutrientes (FOREMAN; DOLAN,
2001; HEPLER; VIDALI; CHEUNG, 2001). A presença de pêlos radiculares na superfície da
raiz torna fácil sua visualização, sendo acessíveis a vários tipos de manipulações
experimentais. Além disso, a ausência de uma camada cuticular permite que análises físicas e
químicas sejam aplicadas facilmente (GRIERSON; SCHIEFELBEIN, 2002).
Os pêlos radiculares também apresentam alongamento rápido e, mais importante, o
local da expansão celular é conhecido e tem sido intensamente estudado (CARDENAS, 2009;
MONSHAUSEN et al., 2007). O bombeamento e fluxo de prótons e de íons como o Ca
2+
e o
K
+
(GILROY; JONES, 2000; LEW, 1996; MONSHAUSEN; MESSERLI; GILROY, 2008)
desempenham papel fundamental na expansão dessas células. Outro fator fisiológico de
importância para o alongamento dos pêlos é a produção extracelular de espécies reativas de
oxigênio (ROS – “reactive oxygen species”), juntamente com a sinalização de fosfolipídios
tem atuado na regulação do alongamento dos pêlos.
Estudos com pêlo radicular têm sido realizados principalmente em Arabidopsis
thaliana graças às numerosas vantagens oferecidas para o estudo básico do desenvolvimento,
16
da biologia celular e fisiologia destas células nesta planta (CAROL; DOLAN, 2002). O uso de
Arabidopsis é bem estabelecida como um sistema modelo para estudos de biologia de plantas
e, teve o seqüenciamento de seu genoma publicado (KAUL et al., 2000).
2.2. Acidez e a parede celular
As causas da acidificação do solo podem ser naturais como lixiviações, liberação de
ácidos orgânicos pelas raízes e pelos microrganismos, a percolação de ácidos húmicos e
fúlvicos dos horizontes superiores, como também pelo resultado das ações humanas, como a
chuva ácida e utilização de fertilizantes (LARCHER, 2000). A acidificação do subsolo pode
causar danos às plantas reduzindo a profundidade do sistema radicular, aumentando desta
maneira a suscetibilidade à seca e diminuindo o uso de nutrientes pelas plantas (FOY;
CHANEY; WHITE, 1978).
Yan et al. (1992) encontraram indícios morfológicos de que a alta concentração de
prótons afeta mais a região de alongamento do que a região meristemática de raízes de Zea
mays e Vicia faba. Em raízes de milho, a pré-incubação por 20 horas em solução tampão pH
4,0 causou um grande influxo de prótons na região de alongamento (SHABALA; NEWMAN;
MORRIS, 1997), mas não em células mais maduras. Outros trabalhos também confirmam que
nas raízes as células mais sensíveis são as da região de alongamento (KOYAMA; TODA;
HARA, 2001; YOKOTA; OJIMA, 1995; KOYAMA et al., 1995) e em suspensões celulares,
as células na fase logarítmica são mais sensíveis do que as na fase estacionária
(VITORELLO; HAUG, 1996).
O pH ácido atua no alongamento celular, e juntamente com outros moduladores como,
hormônios, cálcio e boro modificam a extensibilidade da parede celular. O abaixamento do
pH causa modificações na estrutura da parede celular, através de interações dos prótons com a
pectina, gerando um afrouxamento da parede celular e conseqüentemente um aumento da sua
extensibilidade (HESLOP-HARRISON, 1987; HOLDAWAY-CLARKE et al., 2003).
Para que ocorra o alongamento do pêlo radicular, a parede celular deve ser
reestruturada apenas na sua extremidade, permitindo a inserção de novos materiais
produzidos. Expansinas são proteínas dependentes do pH que estão envolvidas no
afrouxamento da parede (COSGROVE, 2005). Células em crescimento apresentam o pH da
parede celular entre 4,5 e 6,0 que é justamente o intervalo ótimo de atividade das expansinas.
Monshausen et al. (2007) mostra através de monitoramento do alongamento do pêlo radicular
17
com sonda fluorescente que o alongamento da extremidade do pêlo radicular de Arabidopsis
está associado a mudanças cíclicas no influxo de H
+
ao redor da ponta da célula.
O alongamento da parede celular começa com a diminuição da rigidez da parede
permitindo que as células absorvam água aumentem o turgor.
Expansinas são um grupo de proteínas não enzimáticas que atuam nessa diminuição de
rigidez da parede mediando o crescimento ácido, dificultando a ocorrência das ligações não-
covalentes que mantêm as microfibrilas arranjadas na parede celular (COSGROVE, 2005).
2.3. Sistema de resposta a estresse da parede celular
Sabe-se que um dos fatores que leva a expansão celular é o aumento da pressão de
turgor gerada (TAIZ, 1984), juntamente como a deposição de novo material da parede
(CAROL; DOLAN, 2002). Durante o alongamento da célula vegetal o balanço entre a síntese
de parede e extensão celular pode ser facilmente afetado por fatores bióticos e abióticos,
comprometendo a funcionalidade e integridade da parede celular. Mesmo tendo várias das
etapas bem estabelecidas o mecanismo responsável pela acidificação da parede celular
durante a expansão, ainda é incerto (WU et al., 2007).
Para manter a sua integridade a célula deve ser capaz perceber variações mínimas que
possam causar danos e bloqueá-las em um curto período. Essa estreita relação pode ser
observada em trabalhos como Monshausen, Messerli e Gilroy (2008) que mostra uma
oscilação na taxa de alongamento dos pêlos radiculares de Arabidopsis em função da
acidificação do pH na extremidade do pêlo radicular que é acompanhado do aumento da
produção de ROS e do gradiente da Ca
2+
.
Os hormônios também podem estar envolvidos nessa regulação (JUNG; SHIN;
SCHACHTMANA, 2009) embora existam indicações claras de que ROS e hormônios
interagem, não está claro, se esta interação ocorre nas vias de sinalização específicas ou no
próprio mecanismo de crescimento (CAROL; DOLAN, 2006).
O mecanismo de expansão da extremidade da parede celular é semelhante para os
pêlos radiculares e hifas de Chara e Nitella, apesar de haver diferenças sua composição,
indicando que é uma característica de crescimento da extremidade (ZONIA; MUNNIK,
2007). Assim como em leveduras, existem boas evidências de que células vegetais possuem
um sistema de monitoramento e resposta à integridade da parede celular (HAMMAN, 2009).
18
2.4. Modulação oxidativa da parede celular
O acúmulo de oxigênio molecular (O
2
) na Terra tornou possível a evolução de
organismos aeróbicos que utilizam o O
2
como aceptor final de elétrons. O O
2
é pouco reativo,
mas tem a capacidade de originar estados excitados reativos (espécies reativas de oxigênio –
ROS) como radicais livres (OH
-
) e derivados (MORI; SCHROEDER, 2004) (Figura 1). Essas
moléculas são formadas durante funções metabólicas normais nos peroxissomos ou induzidas
por estímulos ambientais aos quais as plantas estão constantemente expostas (MITTLER,
2002) sendo, sobretudo, subprodutos do metabolismo celular regular.
Figura 1 – Estágios de redução do O
2
e algumas da suas principais vias metabólicas (MORI;
SCHROEDER, 2004)..
A produção acentuada de ROS durante o estresse pode representar uma ameaça para
as células. Apesar disso, elas também podem agir como sinalizadores na ativação de resposta
ao estresse e como vias de defesa. Assim, as ROS podem ser consideradas, inicialmente, um
indicador celular de estresse e um mensageiro secundário envolvido na transdução de sinal em
resposta ao estresse (GECHEV et al., 2006; MITTLER, 2002).
Os principais locais de produção de ROS em células vegetais são as organelas com
altas atividades metabólicas de oxigenação ou com fluxo substancial de elétrons, são elas:
cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomos (APEL; HIRT, 2004). Outra fonte de ROS nas
células são as NADPH oxidases. Ligadas a membrana plasmática, assim como as peroxidases
a parede celular, as NADPH oxidases são as principais produtoras de O
-2
e H
2
O
2
apoplástico
(SAGI; FLUHR, 2006).
19
As NADPH oxidases são reguladas por diversos estímulos ambientais e de
desenvolvimento. O acumulo de ROS no apoplasto gera o chamado “estouro” (burst)
oxidativo observado como parte da resposta de hipersensibilidade a agentes patogênicos como
fungos, bactérias, insetos, etc. Também atuam na regulação da morte celular programada e no
crescimento e desenvolvimento celular (GECHEV et al., 2006).
As peroxidases em plantas pertencem a uma superfamília que é dividida em 3
diferentes classes: a classe I das intracelulares (EC 1.11.1.5/.6/.11), a classe II encontrada em
fungos (EC 1.11.1.13/.14) e a classe III extracelulares (EC 1.11.1.7). A classe III catalisa a
redução do H
2
O
2
através de elétrons retirados de várias moléculas doaras como os compostos
fenólicos, precursores da lignina, auxinas e do metabolismo secundário (PASSARDI et al.,
2005).
Para proteção das organelas e das membranas celulares dos efeitos danosos de
concentrações tóxicas de ROS, as plantas desenvolveram um complexo mecanismo de defesa
incluindo um sistema enzimático, que compreende a catalase (CAT), superóxido dismutase
(SOD), peroxidases (POXs), ascorbato peroxidase (APX), glutationa peroxidase (GPX),
glutationa redutase (GR) e um sistema não-enzimático composto por moléculas antioxidantes,
como ácido ascórbico, glutationa reduzida (GSH), carotenóides, α-tocoferol (MITTLER,
2002).
ROS está envolvido na regulação de vários processos do desenvolvimento celular,
incluindo o alongamento dos pêlos radiculares. As NADPH oxidases atuam oxidando o
NADPH do citoplasma e gerando O
2-
apoplastico que pode ser rapidamente desmutado para
H
2
O
2
e voltar para dentro da célula, atuando como um regulador, ou pode formar OH
-
, através
dos peroxissomos (SWANSON; GILROY, 2009). Este radical atua no alongamento celular
afrouxando as paredes celulares (CROSGROVE, 2005).
2.5. Interações com hormônios
Os fitormônios, como também são chamados os hormônios vegetais, são substâncias
orgânicas atuantes nos diferentes órgãos das plantas que agem como mensageiros químicos
responsáveis por desencadear ou inibir atividade como, por exemplo, o crescimento e
desenvolvimento do vegetal. Entre as categorias de hormônios vegetais relacionados à divisão
20
celular, crescimento e diferenciação, destacam-se as auxinas, o ácido giberélico (giberelinas –
GA), o etileno, o ácido abscísico (ABA) e citocininas.
O alongamento da parede celular é a resposta inicial dos tecidos vegetais às auxinas. A
auxina estimula uma bomba de prótons que promove a secreção de íons hidrogênio em um
compartimento da parede celular causando acidificação. A acidificação promove a ativação de
enzimas preexistentes causadoras do afrouxamento da parede celular.
A auxina e o etileno desempenham papel importante na iniciação e desenvolvimento
dos pêlos radiculares (BIBIKOVA; GILROY, 2003; RAHMAN et al., 2002). Mutantes
hormonais e as mudanças morfológicas envolvendo esses dois hormônios são muito
conhecidas em Arabidopsis (GRIERSON; SCHIEFELBEIN, 2002). Pitts, Cernac e Estelle,
(1998), avaliaram a relação entre os hormônios e o desenvolvimento do pêlo radicular em
raízes de Arabidopsis thaliana tipo selvagem e de mutantes hormonais.
A interação de ROS com hormônios vegetais pode ser outro determinante de
especificidade. Por exemplo, auxina, ácido abscísico (ABA) e ácido jasmônico juntamente
com ROS regulam diversos processos como crescimento, fechamento dos estômatos e
resposta a injúrias (KWAK; NGUYEN; SCHROEDER, 2006) Da mesma forma, etileno e
ácido salicílico atuam juntamente com ROS (WANG; LI; ECKER, 2002). O aumento da
síntese de etileno e ácido salicílico é observado sob estresse abiótico e ataque por patógenos,
que por sua vez pode potencializar a produção de ROS. Evidências recentes (WANG; LI;
ECKER, 2002) sugerem a atuação do etileno em complexas interações com ABA e H
2
O
2
para
regular o fechamento dos estômatos (GECHEV et al., 2006).
2.6. O cultivar Micro-Tom de tomateiro e seus mutantes hormonais
O tomate é uma alternativa interessante ao modelo experimental comumente utilizado
em plantas, a Arabidopsis thaliana (MEISSNER et al., 1997), pois além de possuir muitas das
características vantajosas de Arabidopsis, possui algumas características diferenciadas como a
produção de frutos suculentos (CAMPOS et al., 2010). Além disto, o tomate possui valor
comercial elevado, sendo uma espécie importante no mercado de vegetais frescos. Possui um
genoma pequeno (950Mb) rico em características e marcadores mapeados (CAMPOS et al.,
2010).
O cultivar Micro-Tom (MT) de tomate foi originalmente obtido para fins ornamentais
(SCOTT; HARBAUGH, 1989). No entanto, o seu ciclo de vida curto (10 semanas), seu
21
pequeno porte e o fato do genoma do tomate já ter sido seqüenciado, tornaram o MT
interessante como sistema modelo em plantas. Outro importante fator é a relativa facilidade
de obtenção de plantas transgênicas desta variedade. A transformação da planta permite que a
função de genes seja verificada através da sua expressão (LIMA et al., 2004). Com essas
características, a cultivar Micro-Tom (MT) pode crescer em laboratório com exigências de
estruturas semelhantes à requerida para Arabidopsis.
Em tomateiro ocorrem mutações naturais e mutações induzidas para diversos genes
que fazem parte da sinalização, percepção ou biossíntese de hormônios vegetais (LIMA et al.,
2004; ZSÖGÖN et al., 2008). Para a classe das auxinas, o mutante diageotrópica (dgt)
apresenta alteração na via de transdução de sinal da auxina, culminando em pouca
sensibilidade a auxina (OH et al., 2006), para etileno o mutante epinastic (epi) superproduz
este hormônio (FUJINO et al., 1988). Um gene defectivo para o NCEG (“carotenoid cleavage
enzyme”) torna o mutante notabilis (not) deficiente em ácido abscísico (BURBIDGE et al.,
1999). O mutante procera (pro) apresenta super sensibilidade ao ácido giberélico causada por
uma mutação pontual no gene que converte VHVID em VHEID (BASSEL et al., 2008) e o
dumpy (dpy) não converte 6- deoxocatasterone para 6- deoxoteasterone, sendo assim
deficiente em brassinosteróide (KOKA et al., 2000).
O interessante é que esses mutantes hormonais foram introgredidos em Micro-Tom no
Laboratório de Controle Hormonal do Desenvolvimento da ESALQ/USP (CAMPOS et al.,
2009). Assim, estas mutações estão contidas em um mesmo background de referência que
facilita a comparação de respostas entre plantas.
22
3. HIPÓTESES
- A suscetibilidade de células vegetais a pH baixo está relacionada a desarranjos na parede de
células em crescimento;
- Estes desarranjos podem comprometer a integridade da parede celular;
- Variações na pressão de turgor, através de variações na osmolaridade do meio externo,
também contribuem para comprometer a integridade da parede celular;
- A célula vegetal deve possuir um sistema de monitoramento e resposta a ameaças à
integridade da parede celular, modificando sua parede e levando a alteração na sua
extensibilidade;
- A modulação oxidativa da parede é um dos mecanismos de resposta ao comprometimento da
integridade da parede celular;
- A respostas descritas acima devem acarretar em maior enrijecimento da parede e, portanto,
em menores taxas de alongamento celular;
- Os pêlos radiculares, pela facilidade de avaliar sua ruptura e medir sua taxa de alongamento
quando comparada com outros tipos de células vegetais, devem servir como bom modelo
experimental para examinar as hipóteses acima descritas.
23
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo geral: Elucidar processos celulares que determinam a sensibilidade a pH baixo e
estresse hipo-osmótico em células vegetais e examinar a resposta celular ao estresse da parede
e ameaças à sua integridade.
4.2. Objetivos específicos:
a) Otimizar um sistema experimental para o estudo do estresse por pH baixo e hipo-
osmolaridade em pêlos radiculares de tomateiro (Solanum lycopersicum L. cv Micro-Tom);
b) Avaliar como o estresse por pH baixo e hipo-osmótico afeta a taxa de alongamento dos
pêlos radiculares;
c) Avaliar a suscetibilidade dos pêlos radiculares à ruptura quando expostos a estresse por pH
baixo e hipo-osmótico;
d) Avaliar o papel da modulação oxidativa na resposta celular ao estresse da parede causado
por pH baixo e hipo-osmolaridade;
e) Avaliar a resposta de diferentes mutantes hormonais de Micro-Tom frente ao estresse por
pH baixo e hipo-osmolaridade.
4.3. Objetivos complementares:
a) Testar o efeito de tampões, para a realização de estudos a pH baixo (4,0 a 5,0), sobre o
alongamento de pêlos radiculares.
24
5. MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Celular e Molecular do
Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP), Piracicaba, SP. Foi estudado o efeito
de pH baixo (4,5) e da hiposmolaridade sobre o alongamento e a integridade da parede de
pêlos radiculares da cv. Micro-Tom de tomateiro.
5.1. Material vegetal
Como modelo experimental, foi utilizado o cultivar Micro-Tom de tomateiro (Solanum
lycopersicum L. cv Micro-Tom) e alguns de seus mutantes hormonais (Tabela 1). Sementes
destes materiais foram fornecidas pelo Laboratório de Controle Hormonal do
Desenvolvimento da ESALQ/USP, sob a coordenação do Prof. Dr. Lazaro E. P. Peres. As
mutações hormonais foram introduzidas no Micro-Tom através de introgressão e os mutantes
são praticamente isogênicos. Informações mais detalhadas sobre o Micro-Tom como sistema
modelo seus mutantes podem ser obtidos em Campos et al. (2010) e Meissner et al. (1997) e
nas referências citadas na Tabela 1.
Tabela 1 - Relação de mutantes hormonais de Micro-Tom (MT) testados e seus respectivos fenótipos
Mutante Fenótipo Referência
diageotropica (dgt) Pouco sensível à auxina Oh et al., 2006
epinastic (epi) Super produtor de etileno Fujino et al., 1988
notabilis (not) Deficiente em ácido abscísico (ABA) Burbidge et al., 1999
procera (pro)
Super sensível ao ácido giberélico
Bassel et al., 2008
dumpy (dpy) Deficiente em brassinosteróides (BR) Koka et al., 2000
5.2. Desinfestação e germinação das sementes
Foram colocadas de 20 a 30 sementes de Micro-Tom em um Erlenmeyer de 250 mL
com 100 mL de hipoclorito de sódio comercial diluído a 30 %, além de algumas gotas de
25
detergente com agitação de aproximadamente 150 rpm por 1 hora, para que ocorresse a
desinfestação.
Em seguida, as sementes foram lavadas de três a quatro vezes com água destilada e
autoclavada e, posteriormente colocadas para germinar em placas de Petri contendo 0,5 mM
de CaCl
2
e 1,5% de ágar onde permaneceram por três a quatro dias, no escuro e em
temperatura ambiente.
5.3. Desenvolvimento do sistema experimental para estudo de pêlos radiculares
Para estabelecer um sistema experimental onde fosse possível medir o alongamento
dos pêlos radiculares e manipulá-los sem que estes fossem danificados, permanecendo
imobilizados, diferentes metodologias foram testadas e modificadas até chegar à utilizada.
Este processo mostrou-se desafiador, alcançando mais complexidade do que se esperava
inicialmente.
As primeiras tentativas de acompanhar o alongamento do pêlo foram realizadas com a
raiz crescendo diretamente sobre meio semi-sólido em placa de Petri e os pêlos observados ao
microscópio estereoscópico. Este sistema foi inadequado por não proporcionar aumento
suficiente sendo em seguida abandonado. Posteriormente foi testada a transferência de
plântulas para lâminas de microscópio, contendo uma camada de meio semi-sólido, com a raiz
em crescimento imersa no meio. Sistemas semelhantes foram empregados na literatura
anteriormente, principalmente com Arabidopsis (HALPERIN; GILROY; LYNCH, 2003;
JONES et al., 2007; WYMER; BIBIKOVA, 1998). Sua principal vantagem é que a raiz e os
pêlos radiculares ficam imobilizados e protegidos, além do gel ser um meio que favorece o
desenvolvimento de pêlos radiculares. Em muitas espécies, o cultivo em meio líquido inibe o
desenvolvimento de pêlos radiculares (FARR, 1927). A princípio, este sistema parecia ser o
mais promissor, tendo sido investido considerável tempo no seu desenvolvimento. No
entanto, o principal impedimento deste sistema foi a impossibilidade de troca de soluções de
tratamento, que não se difundiam através do gel com a rapidez necessária. A difusão de
soluções foi avaliada com a utilização de corantes. Curiosamente, já foi descrita a utilização
de sistema semelhante, com troca de soluções de tratamento, em Arabidopsis (PREUSS et al.,
2004). Nesses relatos, talvez a espessura do gel fosse suficientemente fina. Tentativas de
reduzir a espessura ou a concentração do ágar não melhoraram a difusão das soluções de
modo satisfatório, fazendo com que este sistema tivesse de ser substituído.
26
Passou-se então à construção de uma câmara de alongamento com uso de lâminas de
microscópio e espaçadores. As câmaras de alongamento utilizadas foram desenvolvidas a
partir de descrições da literatura (PREUSS et al., 2004), mas com modificações específicas
para este trabalho. Essas modificações foram sendo testadas e aprimoradas com o decorrer
dos experimentos.
Foi testado o tipo de material utilizado como espaçador (tiras de polipropileno ou vidro)
e sua espessura (de 1,0 a 2,0 mm), assim como o modo de fixá-lo às lâminas. Os adesivos
foram avaliados quanto à liberação aparente de substâncias tóxicas, a melhor fixação na
lâmina e a capacidade de suportar temperaturas de autoclavagem. Foi testado um adesivo à
base de borracha de silicone de cura ácida (silicone) e uma cola instantânea (cianoacrilato,
Super Bonder). Para fixar a segunda lâmina, que forma a tampa da câmara, foram testados
elásticos de látex, fita adesiva comum (Durex) e elásticos siliconados.
A configuração final da câmara de crescimento foi a seguinte: cada câmara é formada
por duas metades, cada uma composta por uma lâmina de microscópio com dois espaçadores
de vidro de espessura igual à da lâmina (aproximadamente 1,0 mm) (Figura 2A e B). Esses
espaçadores foram colados às laterais das lâminas com silicone. Sobre leito formado pala
lâmina e os espaçadores o meio de crescimento foi vertido sob condições assépticas. Depois
do resfriamento e gelificação do meio, as plântulas foram transferidas para a superfície do
meio de crescimento e cobertas com a segunda lâmina de microscópio modificada com os
espaçadores. As duas metades foram mantidas unidas por dois pequenos elásticos siliconados
em cada extremidade (Figura 2C). Assim, a configuração da câmara permite a raiz crescer no
espaço entre o meio semi-sólido e a lâmina de vidro da tampa da câmara, ficando
relativamente imobilizada e ao mesmo tempo permitindo o fornecimento e troca de soluções
de tratamento.
27
Figura 2 - Esquema ilustrando o conjunto de lâminas que formam a câmara de crescimento da
plântula. Cada câmara é formada por duas metades (A, B), cada uma composta por uma
lâmina de microscópio com dois espaçadores de vidro de espessura igual à da lâmina
(aproximadamente 1,0 mm). (A) Lâmina com os espaçadores e no centro o meio de
crescimento (em cinza). A plântula era colocada por cima desse meio. (B) Segunda lâmina
com os mesmos espaçadores e sem meio de crescimento que era colocada por cima da
primeira. (C) Notar que entre a plântula e a lâmina de cima havia um espaço por onde as
soluções eram aplicadas
.
A composição do meio de crescimento das plântulas também foi testada. Inicialmente
foi utilizado o mesmo meio tanto para a germinação quanto para o crescimento da raiz na
câmara (CaCl
2
0,5 mM e 1,5 % de ágar). Na tentativa de uma padronização e obtenção de
maior uniformidade no alongamento dos pêlos radiculares, o meio de crescimento foi
modificado, passando a ser composto pela metade da concentração dos sais do meio de
Murashige e Skoog (1962) (MS/2), acrescido de 1% de sacarose e 0,4 % de phytagel.
5.4. Transferência e aclimatação das plântulas nas câmaras de crescimento
Após a germinação (3 a 4 dias), as plântulas foram transferidas das placas de Petri para
as câmaras de crescimento contendo meio composto pelos sais do MS/2, acrescido de 1% de
sacarose e 0,4 % de phytagel. As plântulas permaneceram nas câmaras por mais 24 h, no
escuro, em caixa de isopor, à temperatura ambiente do laboratório (24 ± 1 °C), para permitir o
crescimento da raiz e a formação de pêlos novos. Isto evita a utilização de pêlos
eventualmente danificados na transferência. A posição da extremidade de cada raiz era
28
marcada com caneta no início e no final do período de aclimatação. O crescimento das raízes
era de aproximadamente 1,5 cm quando transferidas para as câmaras. Raízes com crescimento
abaixo deste valor eram descartadas. Durante este período, o espaço livre da câmara (onde a
plântula cresce) foi mantido sem solução. As câmaras foram mantidas inclinadas para baixo
com intenção de estimular o crescimento da raiz contra o ágar (auxiliando na imobilização).
As condições de acondicionamento das câmaras, contendo as plântulas, durante o período de
24 h após a transferência, também passaram por aperfeiçoamentos. Inicialmente, a
extremidade inferior das câmaras foi mantida em contato com água destilada autoclavada,
ficando o restante em contato com o ar do interior da caixa de isopor. Depois foram mantidas
da mesma maneira, mas em béquer de 250 mL vedado com filme plástico. Depois de mais
testes, chegou-se a conclusão que a melhor opção seria as câmaras permanecerem em frascos
Magenta
®
tampados, contendo ao seu fundo aproximadamente 2,0 mL de meio com sais de
MS/2, acrescido de 1% de sacarose, no escuro, à temperatura ambiente.
5.5. Tratamentos e as respectivas soluções utilizadas
Depois da aclimatação por 24 h, as plântulas foram tratadas com soluções de duas
maneiras distintas:
a) Em uma delas, os pêlos foram expostos diretamente a diferentes soluções de
tratamento. Estas soluções eram constituídas por um meio mínimo (MMin) com
osmolaridade de aproximadamente 41 mOsm, contendo 2 mM de CaCl
2
; 10 mM de KCl; e 10
mM do tampão ácido-2-morfolinoetanosulfônico (MES) a pH 5,8 ou 4,5. A osmolaridade do
MMin foi ajustada com manitol em um dos tratamentos e no outro não (controle). Estas
concentrações foram ajustadas com manitol para valores dependendo da finalidade de cada
experimento.
b) Na outra, os pêlos foram sempre expostos primeiramente a um meio de referência por
cerca de 30 min, para depois serem expostos às diferentes soluções de tratamento. A
composição do meio de referência era a mesma do meio mínimo, pH 5,8, mas com
osmolaridade ajustada sempre para 150 mOsm pela adição de manitol. O uso deste
procedimento permitiu duas vantagens; primeira e mais importante foi a constatação de
variabilidade na taxa de alongamento dos pêlos radiculares. Este procedimento permitiu,
portanto, avaliar a taxa de alongamento de cada pêlo sob condições padrões, de modo que o
efeito do tratamento subseqüente pudesse ser expresso em valores relativos, sendo comparado
29
com a condição de referência. Segunda vantagem: os pêlos passaram por um período de
adaptação ao meio líquido.
A osmolaridade do meio de referência foi determinada considerando que deveria
permitir uma boa taxa de alongamento do pêlo radicular, mas que não deveria ser baixa a
ponto de não ser possível realizar tratamentos hipo-osmóticos (choques hipo-osmóticos).
Como ponto de partida, para se obter parâmetros de comparação, primeiramente foi
determinado a osmolaridade da solução externa (meio mínimo mais manitol) que fosse
aproximadamente isotônica em relação ao citoplasma. Isto foi determinado observando-se a
presença de plasmólise incipiente e pela paralisação do alongamento celular.
Em seguida, foram avaliados os efeitos sobre os pêlos quando estes foram
primeiramente tratados com meio mínimo (MMin), pH 5,8, com osmolaridade
aproximadamente isotônica e outras duas concentrações mais baixas (300, 200 e 150 mOsm),
seguido de exposição ao mesmo meio com outra osmolaridade mais baixa (41 ou 76 mOsm).
A osmolaridade foi ajustada com manitol e cada período de tratamento foi de 30 min.
5.5.1. Aplicação e troca de soluções de tratamento
Para a aplicação e/ou trocas das soluções de tratamento, as câmaras contendo as
plântulas foram mergulhadas, cuidadosamente e inicialmente, na orientação vertical e nas
respectivas soluções de tratamento. Como as câmaras eram abertas em ambas as
extremidades, as soluções preenchiam facilmente o espaço livre das câmaras. Por outro lado,
como o espaço livre tinha uma espessura pequena, as soluções ficavam retidas na câmara,
desde que estas fossem mantidas aproximadamente na posição horizontal, permitindo realizar
observações em microscópio óptico com solução preenchendo a câmara. Para a remoção e/ou
troca de solução, as câmaras eram colocadas na posição vertical para o escorrimento das
soluções, e depois a extremidade inferior era encostada contra borrão de papel absorvente
para a remoção completa da solução. Alternativamente, as soluções também foram
adicionadas às câmaras com auxílio de micro-pipeta, mantendo-se a câmara ligeiramente
inclinada durante a aplicação.
Durante os intervalos entre a obtenção de imagens no microscópio, as câmaras contendo
as plântulas e soluções eram mergulhadas novamente nas soluções de tratamento
correspondentes àquele intervalo de tempo.
30
No final dos tratamentos, os pêlos foram corados com trypan blue (0,4 %, diluído 1:1
em água) para a identificação de pêlos rompidos.
5.5.2. Tratamentos com soluções de diferentes valores de pH (4,5 e 5,8)
Para avaliar o efeito de pH sobre o alongamento e a integridade da parede dos pêlos
radiculares, foram empregados três diferentes modos de tratamento:
a) Exposição direta ao meio mínimo (MMin) com diferentes valores de pH (4,5 e 5,8),
com variação de 90 a 135 min;
b) Exposição primeiramente ao meio de referência (pH 5,8, 150 mOsm) seguido de
exposição ao mesmo meio a pH 4,5 (ausência de tratamento hipo-osmótico), por 30 min cada
vez;
c) Tratamentos combinando alterações de pH com tratamentos hipo-osmóticos. Nestes
ensaios, os pêlos eram expostos por 30 min primeiramente ao meio de referência (pH 5,8, 150
mOsm), seguido de exposição por 30 min ao MMin, pH 4,5, com osmolaridade mais baixa
(tratamento hiposmótico), variando de 123 a 41 mOsm.
5.5.3. Tratamentos com variações na osmolaridade das soluções – tratamentos hipo-
osmóticos
Para avaliar o efeito de tratamentos hipo-osmósticos (também chamados de choques
hipo-osmósticos), sem variações de pH, sobre o alongamento e a integridade da parede dos
pêlos radiculares, foram empregados dois modos de tratamento:
a) Exposição direta a meio mínimo (MMin), pH 5,8, com valores de osmolaridade
variando de 41 a 300 mOsm, ajustadas com manitol. Os pêlos radiculares permaneceram
nestas soluções por 30 min;
b) Exposição primeiramente ao meio de referência (pH 5,8, 150 mOsm) seguido de
exposição ao meio mínimo, sem ajuste com manitol (41 mOsm), por 30 min cada vez.
31
5.6. Medição do alongamento dos pêlos radiculares
O comprimento dos pêlos foi avaliado por microscopia óptica antes e durante a
aplicação de cada tratamento e nos respectivos controles. Para isto, partimos de metodologias
usadas em Arabidopsis thaliana, onde a taxa de alongamento do pêlo radicular é de
aproximadamente 1 µm.min
-1
(HALPERIN; GILROY; LYNCH, 2003). As observações
microscópicas foram realizadas em microscópio óptico Zeiss, Modelo Axioskop 40,
localizado nas dependências do Laboratório de Carbono C-14 (CENA-USP) ou em
microscópio óptico Zeiss, Modelo Axioskop 2, no Núcleo de Apoio à Pesquisa em
Microscopia Eletrônica Aplicada à Agricultura (NAP/MEPA-ESALQ). Nos dois casos, as
imagens foram geradas através do sistema de captura AxioCamMR3 (Carl Zeiss) acoplado ao
microscópio óptico.
Aproximadamente dez pêlos por raiz de uma mesma região foram observados em
tempos diferentes. Escolheu-se uma região da raiz próxima à zona de elongação onde
estivessem presentes ao mesmo tempo, pêlos radiculares no início do alongamento e mais
desenvolvidos. Para acompanhar a mesma região de cada raiz ao longo do tempo, foi marcada
a posição inicial da lâmina no microscópio através das escalas presentes no conjunto charriot
e platina. Foram obtidas, no mínimo, quatro fotos por raiz em períodos de tempo variando
entre 20 a 40 min entre cada foto.
O ajuste e a captação das imagens digitais foram realizadas com a utilização do software
AxioVision, versão 4.5, sendo salvas no formato jpg., juntamente com informações como
objetiva empregada, escala, data e horário. A análise das imagens e a medição do
comprimento dos pêlos foi feita com auxílio do software ImageJ (ABRAMOFF;
MAGELHAES; RAM, 2004; RASBAND, 2009) (Figura 3). Para a medição do comprimento,
foram escolhidos os pêlos possíveis de serem visualizados em todas as fotos. Para as medidas,
a escala foi estabelecida a partir da barra de escala nas imagens.
A partir das medidas dos comprimentos dos pêlos, foi calculada a taxa de alongamento
(µm.min
1
) de cada pêlo, a média para cada tratamento, bem como o desvio padrão (d.p.), o
coeficiente de variação (CV %) e o erro padrão da média (e.p.).
32
Figura 3 - Ilustração do uso do programa ImageJ (NIH) para a medição do comprimentos dos pêlos
radiculares. O inserto mostra o registro de dados à medida que estes são obtidos
5.7. Avaliação de pêlos radiculares rompidos
Alguns dos tratamentos desencadeiam a ruptura de pêlos radiculares. Estes foram
contabilizados das seguintes maneiras:
a) No caso de tratamento inicial com meio de referência (que não causa ruptura de
pêlos), seguido por solução de tratamento: dos pêlos que tiveram seu alongamento medido
durante a exposição ao meio de referência, determinou-se a percentagem destes que se
romperam no tratamento subseqüente;
33
b) No caso dos pêlos expostos diretamente à solução de tratamento, foi amostrada uma
área da imagem em que todos os pêlos inteiros e rompidos foram contados. Em alguns casos,
esta contabilidade foi feita para a imagem inteira. Não se contabilizou pêlos fora de foco ou
que não estivessem bem visíveis.
5.8. Avaliação da modulação oxidativa da parede celular
O possível envolvimento da modulação oxidativa da parede celular, na resposta dos
pêlos frente aos tratamentos com pH baixo e choque hipo-osmótico foi avaliado de duas
maneiras:
a) Manipulação de ROS extracelular, por aplicação exógena ou aplicação de
antioxidantes. Dentre as espécies de ROS envolvidas na modulação oxidativa da parede
celular, a única que tem estabilidade suficiente para ser empregada experimentalmente é o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
);
b) Uso de inibidores de enzimas chaves na modulação oxidativa da parede celular.
Inibidores de NADPH oxidase e peroxidases foram testados para avaliar o papel destas
enzimas frente ao estresse por pH baixo e hiposmolaridade. Estes inibidores são bem
estabelecidos (CROSS; JONES, 1986; FOREMAN et al., 2003) e comumente empregados
para avaliar o papel destas enzimas em processos biológicos.
5.8.1. Aplicação exógena de ROS (H
2
O
2
)
e ácido ascórbico
Foi avaliado o efeito do H
2
O
2
e do ácido ascórbico no alongamento do pêlo radicular
frente a um choque hiposmótico (MONSHAUSEN et al., 2007).
As raízes foram expostas ao meio de referência (150 mOsm) a pH 5,8, de 30 a 40 min.
Após esse período, as raízes foram divididas em três lotes, cada lote passou por um tratamento
de 30 a 40 min. O primeiro com meio mínimo, o segundo com meio mínimo acrescido por 1
µM de H
2
O
2,
e o terceiro por meio mínimo mais 100 µM de ascorbato (MONSHAUSEN et
al., 2007).
34
5.8.2. Aplicação exógena de inibidor de NADPH oxidase (DPI)
O inibidor da NADPH oxidase, difenileno-iodônio (diphenylene iodonium, DPI) foi
empregado conforme descrito por Foreman et al. (2003).
Por meio do uso de DPI, durante choque hiposmótico, foi avaliado o alongamento dos
pêlos radiculares. Raízes foram expostas ao meio de referência a pH 5,8 por um período de 30
a 40 min. Em seguida, as raízes foram divididas em lotes e tratadas de 30 a 40 min. O
primeiro foi tratado com meio mínimo, o segundo com meio mínimo acrescido por 50 µM de
DPI (FOREMAN et al., 2003).
5.8.3. Aplicação exógena de inibidor de peroxidase de parede (SHAM)
O inibidor de peroxidase ácido salicilhidroxâmico (salicylhydroxamic acid, SHAM) foi
empregado conforme descrito em Dunand, Crevecoeur e Penel (2007).
SHAM foi usado durante choque hiposmótico para a avaliação do alongamento do pêlo
radicular. Raízes foram expostas ao meio de referência a pH 5,8 por um período de 30 a 40
min. Após este período, as raízes foram divididas em lotes e tratadas de 30 a 40 min. O
primeiro foi tratado com meio mínimo, o segundo com meio mínimo acrescido por 50 µM de
SHAM (DUNAND; CREVECOEUR; PENEL, 2007). Também foram testadas outras
concentrações de SHAM (entre 10 µM, 200 µM e 1 mM).
5.9. Avaliação dos mutantes hormonais de MT
Alguns mutantes hormonais de MT, dgt; epi; not; pro e dpy (Tabela 2) passaram por
uma caracterização inicial, onde foi avaliado o alongamento dos pêlos radiculares, além das
diferenças morfológicas na distribuição dos pêlos. O MT, que foi utilizado em todos os
demais ensaios, foi usado como controle frente aos mutantes. As raízes foram tratadas com
meio mínimo a pH 5,8 por aproximadamente 1 h e 30 min.
35
5.9.1 Tratamento hipotônico em mutantes super produtores de etileno (epi)
Raízes de MT e de epi foram divididas em três lotes e foram tratados com meio mínimo
e meio mínimo acrescido de manitol em duas outras osmolaridades (76 e 300 mOsm). As
raízes foram mantidas em contato com as soluções a pH 5,8 por aproximadamente 60 min.
5.9.2 Tratamento hipotônico em mutantes
As raízes foram expostas ao meio de referência a pH 5,8 entre 20 a 40 min. Após esse
tempo foi trocado o meio de referência pelo meio mínimo a pH 5,8, permanecendo em contato
por 20 a 30 min.
5.10. Estudo complementar do efeito de tampões para uso a pH baixo, sobre células
vivas
O emprego de tampões em experimentos com células vivas a pH baixo é problemático,
pois a maioria dos tampões com pKa adequado aos ensaios de sensibilidade ao pH baixo são
ácidos orgânicos que afetam o metabolismo celular ou a permeabilidade da membrana
plasmática. Alguns tampões, que já foram utilizados em outros trabalhos e/ou parecem ter
potencial para uso neste tipo de abordagem, foram examinados quanto à possível interferência
no crescimento e/ou metabolismo celular.
Mais especificamente, os testes com os tampões tiveram objetivo de avaliar possíveis
efeitos tóxicos para os pêlos radiculares. A escolha dos tampões foi feita com base em seus
valores de pKa e com base em relatos na literatura do uso destes compostos em células
vegetais (KINRAIDE; SWEENEY, 2001; KOCHIAN et al., 2003; SAMAC et al., 2003;
BIBIKOVA et al., 1998; BRACCINI et al., 2000; MADHAVA RAO et al., 2006; FOUAD;
RATHINASABAPATHI, 2006;)
Foram eles:
a) Homopiperazina-1,4-bis (2-ácido etanosulfônico) – homopipes (pK
a1
4,4 e pK
a2
8,1)
(BABOURINA et al., 2005; BABOURINA et al.,2006; KINRAIDE; SWEENEY, 2001);
b) Ácido 3,3 - dimetilglutárico (DMGA) (pKa
1
3,73 e pKa
2
6,71) (BIBIKOVA, 1998;
YOUNG; DE WITT; SUSSMAN, 1998);
36
c) Biftalato de potássio (BIF) (pKa
1
2,89 e pKa
2
5,51) BRACCINI et al., 2000;
d) β-alanina (pK
a1
3,7 e pK
a2
10, 10) (HAMMER; BALTZ, 2003).
O tampão MES, que é um tampão biológico bastante conhecido (pKa 6,15), foi usado
como controle. Todas as raízes foram expostas ao meio de referência a pH 5,8 com MES por
30 a 40 min. Em seguida, foram transferidas para o mesmo meio de referencia adicionado dos
respectivos tampões na concentração de 10 mM a pH 4,5 e 5,8. As raízes permaneceram
nesses tratamentos por mais 20 a 30 min.
5.11. Delineamento experimental
O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, sendo cada pêlo tratado
como uma repetição
37
6. RESULTADOS
6.1. Avaliação do alongamento de pêlos radiculares e sua variabilidade no sistema
experimental desenvolvido
Os pêlos radiculares são muito utilizados para estudos sobre a biologia de células de
alongamento polarizado, e também possuem características que as tornam interessantes como
sistema modelo para o estudo de diversos outros processos celulares (FOREMAN; DOLAN,
2001). São, no entanto, sistemas delicados, sensíveis a diferentes perturbações, inclusive
mecânicas (GALWAY; LANE; SCHIEFELBEIN, 1999; JONES; RAYMOND; SMIRNOFF,
2006). Assim, é importante ter um bom sistema experimental para o estudo destas células.
Existem alguns métodos que já foram desenvolvidos e utilizados para Arabidopsis
(BABOURINA et al., 2001; PREUSS et al., 2004; WYMER; BIBIKOVA; GILROY, 1997).
Para que possa ser utilizado com êxito, um sistema experimental deve possuir algumas
características como: a produção de boa quantidade de pêlos, boa visualização em
microscópio, permitindo a análise do alongamento, além de possibilitar a realização de uma
série de manipulações, como a troca de soluções de tratamento, com o mínimo possível de
interferência indesejável sobre as células. Para as medidas de alongamento celular, é
preferível que a raiz esteja imobilizada.
Arabidopsis thaliana apresenta taxa de alongamento do pêlo radicular de
aproximadamente 1 µm.min
-1
(HALPERIN; GILROY; LYNCH, 2003). Já em Limnobium
stoloniferum, encontrou-se taxas de alongamento dos pêlos radiculares de cerca de 0,5 a 0,6
µm.min
-1
(JONES; SHAFF; KOCHIAN, 1995), semelhantes às taxas que foram encontradas
no presente estudo.
Mesmo tendo otimizado o sistema experimental para o estudo dos pêlos radiculares,
observou-se alta variabilidade nas taxas de alongamento mensuradas. Com o objetivo de se
caracterizar a natureza desta variação, e possivelmente identificar a sua fonte, algumas
análises foram feitas.
38
6.1.1. Análise da relação entre a taxa de alongamento e o comprimento inicial do pêlo
Sabe-se que a taxa de alongamento do pêlo varia durante seu desenvolvimento
(VOLGGER et al., 2010). Portanto, uma das primeiras fontes da variabilidade na taxa de
alongamento a ser cogitada foi o fato dos pêlos examinados se encontrarem em diferentes
fases de desenvolvimento, já que o comprimento inicial dos mesmos variou bastante.
Quando se comparou o comprimento inicial dos pêlos tratados diretamente com meio
mínimo (MMin) a pH 5,8 com a taxa de alongamento dos mesmos, não se observou nenhuma
relação aparente (Figura 4). Pêlos de comprimentos próximos exibem taxas de alongamento
bem distintas. Por exemplo, pêlos com comprimento inicial de 50 a 60 µm apresentaram taxas
de alongamento que variaram de 0,09 a 0,54 µm.min
-1
.
A única exceção talvez seja o caso de pêlos muito longos, maiores que 200 µm, pois
podem estar próximos de encerrar seu alongamento. Os dados apresentados por Volgger et al.
(2010) mostram que a variação na taxa de alongamento ocorre principalmente quando os
pêlos são ainda pequenos ou estão se aproximando de sua extensão final.
Figura 4 - Correlação entre o comprimento inicial dos pêlos radiculares e a taxa de alongamento
(μm.min
-1
), acompanhados por 90 a 135 min. O número total de pêlos analisados foi de
127, de 16 raízes, analisados em 4 experimentos independentes. O comprimento inicial
médio dos pêlos foi de 84,5 μm e o alongamento absoluto médio e a taxa de alongamento
médio no período foi de 29,6 μm e 0,25 μm.min
-1
, respectivamente.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Comprimento inicial dos pêlos (µm)
Taxa de alongamento (µm.min
-1
)
39
6.1.2. Análise da variabilidade da taxa de alongamento dos pêlos radiculares dentro e entre
raízes
Analisando os resultados obtidos de cada raiz e dos diferentes dias em que foram
realizados os experimentos, verifica-se que a principal fonte de variabilidade foi ao nível de
cada raiz individual (Tabela 2). A taxa de alongamento encontrada em cada ensaio, realizados
em dias diferentes, não teve variação significativa (de 0,21 a 0,27 µm.min
-1
), mas o desvio
padrão dos dados obtidos em cada experimento (dia) foi alto (de 0,10 a 0,21).
Isso indica que a variação na taxa de alongamento ocorre principalmente entre as
raízes, fato este confirmado quando comparamos a taxa de alongamento dos pêlos de cada
raiz. Assim, a taxa de alongamento médio dos pêlos de cada raiz variou de 0,07 a 0,51
µm.min
-1
, e o desvio padrão também variou consideravelmente de 0,04 a 0,22. No total, foram
acompanhadas 16 raízes e em cada uma delas, um número variado de pêlos teve seu
alongamento acompanhado.
Quando comparamos a taxa de alongamento dos pêlos em uma mesma raiz com o seu
desvio padrão correspondente, observamos que a variação do alongamento é baixa. Por
exemplo, a raiz 2 tem taxa de alongamento de 0,30 µm.min
-1
, com desvio padrão de 0,082.
40
Tabela 2 - Variabilidade das taxas de alongamento de pêlos radiculares de Micro-Tom em MMin, a pH
5,8, dentro de cada raiz, entre raízes e entre experimentos realizados em dias diferentes
Experiment
o (dia)
Raiz
Média da taxa de
alongamento
(µm.min
-1
) – por
raiz
Desvio
padrão
Média da taxa de
alongamento
(µm.min
-1
) – por
dia
Desvio
padrão
1 1 0,15 0,114 0,21 0,102
2 0,30 0,082
3 0,14 0,057
4 0,20 0,093
2 5 0,35 0,119 0,25 0,117
6 0,25 0,078
7 0,19 0,090
8 0,21 0,061
9 0,13 0,047
3 10 0,09 0,108 0,26 0,199
11 0,51 0,101
12 0,36 0,060
13 0,12 0,070
4 14 0,26 0,070 0,27 0,209
15 0,07 0,040
16 0,51 0,216
Média
0,24 0,088
Desvio padrão
0,135
6.1.3. Análise temporal da taxa de alongamento do pêlo radicular ao longo do período de
observação
Embora não se tenha realizado experimentos com o objetivo específico de avaliar a taxa
de alongamento ao longo do tempo, diversos experimentos foram realizados onde imagens
foram obtidas em diferentes intervalos de tempo. Os dados obtidos nestes casos foram
analisados para examinar se alterações na taxa de alongamento ao longo do tempo poderiam
estar causando a alta variabilidade na taxa de alongamento dos pêlos.
A Figura 5 ilustra a curva de alongamento em função do tempo de diferentes pêlos de
uma mesma raíz. Nota-se que a taxa de alongamento dos pêlos radiculares é relativamente
constante ao longo do tempo para cada pêlo, embora seja bastante variável, conforme
mencionado acima, entre os pêlos e, principalmente, entre os pêlos de diferentes raízes.
Por exemplo, quando são comparadas diferentes raízes, como as raízes 9 e 12 (Tabela
2), verifica-se que os pêlos radiculares da raiz 9 apresentaram uma taxa de alongamento de
41
0,13 µm.min
-1
com desvio padrão de 0,047, enquanto que os pêlos da raiz 12 apresentaram
taxa de alongamento quase três vezes maior, de 0,36 µm.min
-1
com desvio padrão de 0,06.
Figura 5 - Alongamento celular dos pêlos de uma raiz (raiz 9 da Tabela 2) tratada com meio mínimo
(MMin) a pH 5,8 por 150 min. O alongamento foi acompanhado em períodos de 50 min em
um total de 150 min. Observa-se um alongamento linear de todos os pêlos durante o tempo
de tratamento.
6.2. Resposta dos pêlos radiculares expostos diretamente a MMin em pH baixo
Pêlos radiculares de Micro-Tom foram tratados diretamente com MMin a pH 5,8
(controle) e pH 4,5, e seu alongamento acompanhado por 150 min. Os dados de taxa de
alongamento estão apresentados na Tabela 3, e são referentes a quatro experimentos distintos,
realizados em dias diferentes. Ao todo foram examinados o alongamento de 127 pêlos a pH
5,8, e de 150 pêlos a pH 4,5.
A taxa de alongamento médio dos pêlos do tratamento controle (pH 5,8) foi de 0,24
µm.min
-1
, o que é elevado em termos de alongamento celular em geral, mas não para pêlos
radiculares. Em Arabidopsis, relatam-se taxas da ordem de 1 µm.min
-1
(HALPERIN;
GILROY; LYNCH, 2003). Encontrou-se também uma variabilidade elevada das taxas de
alongamento entre os pêlos.
O comprimento inicial dos pêlos, cujo alongamento foi avaliado, variou bastante. Nos
pêlos observados no tratamento a pH 5,8, o comprimento inicial variou de 9,0 a 391,2 µm, e
nos pêlos tratados com pH 4,5, variou de 10,6 a 405,6 µm. Isto demonstra que foram
0
25
50
75
100
125
150
-50 0 50 100 150
Tempo (min)
Alongamento celular (µm.min
-1
)
42
analisados pêlos em várias fases de seu alongamento, e que não houve diferenças no
comprimento inicial dos pêlos entre os dois tratamentos.
Comparando a taxa de alongamento dos pêlos tratados a diferentes valores de pH, foi
possível observar que os pêlos expostos a pH 4,5 alongaram a uma velocidade quase metade
dos pêlos expostos a pH 5,8. Apesar dos elevados desvios padrões e coeficientes de variação
(CV%), o elevado número de repetições fez com que os valores de erro padrão da média
fossem baixos, de modo que a diferença entre as médias foi estatisticamente significativa pelo
teste de Tukey ao nível de 1% de probabilidade.
Tabela 3 - Taxas de alongamento de pêlos radiculares de Micro-Tom expostos diretamente a MMin
(MMin) a pH 5,8 e 4,5. A diferença mínima significativa (dms) calculada pelo Teste de
Tukey ao nível de 1% de probabilidade foi de 0,04
Tratamentos
pH 5,8 pH 4,5
Taxa de alongamento (µm.min
-1
) 0,24 0,13
Total de pêlos observados 127 150
Desvio padrão (d.p.) 0,160 0,093
Coeficiente de variação (CV%) 65,9 74,9
Erro padrão da média (e.p.) 0,014 0,008
Outro efeito da exposição a pH 4,5 foi a ruptura dos pêlos. Nos pêlos tratados com
MMin a pH 4,5, de um total de 381 pêlos observados, 10,5 % destes se romperam (Figura 6).
Não foi observado nenhum pêlo rompido entre aqueles tratados em pH 5,8 (Figura 6).
Efeitos semelhantes já foram relatados na literatura, embora ainda sejam poucos.
Destes, a maioria relata apenas a ruptura dos pêlos (JONES; SHAFF; KOCHIAN, 1995;
MONSHAUSEN et al., 2007). Alguns outros trabalhos já relataram o efeito do abaixamento
do pH sobre a redução da taxa de alongamento (BIBIKOVA et al., 1998; HERRMANN;
FELLE, 1995).
43
C D
A
B
Figura 6 - Pêlos radiculares de Micro-Tom tratados com meio mínimo (MMin) a pH 4,5 (A) e pH 5,8
(C) e coradas com trypan blue (B e D). Os pêlos que não estouraram tiveram seu
crescimento acompanhado (setas), e os que estouraram estão indicados com circulado na
foto (A e B).
6.3. O fornecimento dos sais do meio MS afeta a taxa de alongamento dos pêlos pelas
mudanças de osmolaridade não de nutrientes
Foi postulado que pequenas variações nos níveis de nutrientes no meio semi-sólido
poderiam causar variações no alongamento dos pêlos, já que o MMin continha poucos
nutrientes minerais e em níveis não muito elevados. Assim, visando testar esta hipótese, os
pêlos foram expostos a meio contendo os sais de MS na sua concentração completa e pela
metade (MS/2). Ao contrário do que se esperava, a taxa de alongamento dos pêlos no meio
MS/2 foi mais elevada do que no meio MS (Figura 7).
Suspeitou-se que estes resultados foram causados pelas diferenças na osmolaridade das
duas soluções, e não dos seus níveis de nutrientes. Para testar isto, pêlos radiculares foram
44
expostos a MMin, cuja osmolaridade foi corrigida com manitol para que alcançasse os valores
das soluções de MS (123 mOsm) e MS/2 (76 mOsm), ambos acrescidos de 1% de sacarose.
O alongamento dos pêlos radiculares tratados com MS e MS/2 foi respectivamente,
0,344 e 0,469 µm.min
-1
, muito próximo do alongamento dos pêlos tratados com MMin em
123 mOsm (MS) e 76 (MS/2), que foi de 0,368 e 0,437 (Figura 7). Portanto, foi observado um
aumento da taxa de alongamento com a diminuição da osmolaridade, um resultado esperado,
já que o aumento da pressão de turgor é um fator que influencia o alongamento celular (TAIZ,
1984). Estes resultados colocaram em evidência a importância da osmolaridade da solução de
tratamento, e serviram de base para os experimentos seguintes.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
MS MS/2 123 mOsm 76 mOsm
Mmin + manitol
Alongamento celular (µm.min
-1
)
Tratamento
Figura 7 - As taxas de alongamento de pêlos radiculares de Micro-Tom quando expostas diretamente a
soluções com diferentes níveis de nutrientes e diferentes osmolaridades. As soluções
empregadas foram: (MS) os sais do meio de MS + 1% de sacarose; (MS/2) metade da
concentração dos sais de MS + 1 % de sacarose; (MMin + manitol) meio mínimo com
adição de manitol para ajustar a osmolaridade da solução para 123 e 76 mOsm, os quais são
de osmolaridade equivalente ao do meio MS e MS/2, respectivamente. As barras indicam o
erro padrão da média (n= 52 a 126).
45
6.4. Curva de resposta da taxa de alongamento do pêlo radicular em função da
osmolaridade da solução de tratamento
O efeito da osmolaridade da solução de tratamento (MMin + manitol) sobre a taxa de
alongamento dos pêlos radiculares está apresentada na Figura 8. Observa-se que, à medida
que a osmolaridade da solução de tratamento diminuiu de 300 a 76 mOsm, ocorreu um
aumento na taxa de alongamento dos pêlos, de 0,129 a 0,437 µm.min
-1
. Este resultado era
esperado conforme já ilustrado na Figura 8, pois se sabe que, quanto mais hipotônico o meio
externo, maior será a pressão de turgor celular e, portanto, a taxa de alongamento.
A velocidade de crescimento de tubos polínicos tratados com solução hipertônica (1,8%
manitol, p/v) caiu pela metade quanto comparada com aqueles tratados com solução
hipotônica (1,0% manitol, p/v) (ZONIA; MÜLLER; MUNNIK, 2006). Vollger et al. (2010)
relatam que pêlos radiculares de Triticum aestivum tratados em solução hipertônica (200 a
650 mOsm) apresentaram parada no alongamento.
O resultado interessante da Figura 8 é que, a partir da diminuição da osmolaridade do
MMin de 76 para 41 mOsm, ao invés de um aumento na taxa de alongamento, este caiu de
0,437 para 0,137 µm.min
-1
. Ou seja, há uma curva de resposta onde há uma queda muito
acentuada na taxa de alongamento dos pêlos em um intervalo relativamente pequeno de
variação na osmolaridade da solução. Denominaremos de choque hipo-osmótico os
tratamentos hipo-osmóticos mais acentuados, principalmente aqueles que resultem em
redução na taxa de alongamento ou ruptura do pêlo radicular.
Outra observação relevante é que foi possível observar o rompimento de pêlos nas
osmolaridades mais baixas. Na solução de 50 mOsm houve rompimento de 2,4 % dos pêlos
(de um total de 205), e a 41 mOsm foi de 1,3 % (de um total de 528). Com exceção da
concentração de 100 mOsm, que apresentou o rompimento de 2 pêlos entre 157, não foi
observado o rompimento de pêlos nas demais osmolaridades. Além do rompimento de pêlos,
observou-se o intumescimento da extremidade do pêlo radicular nas osmolaridades mais
baixas.
Há semelhanças interessantes entre o comportamento frente ao pH baixo e aos
tratamentos hipo-osmóticos. Estes dados indicam que, tanto no caso do tratamento a pH
baixo, como nos tratamentos de choque hipo-osmótico, que chegou próximo ou mesmo
ultrapassou o limite de resistência da parede celular. Em aparente contradição, em ambos os
casos estas condições também estavam associadas a reduções acentuadas na taxa de
alongamento.
46
Assim como em leveduras, existem boas evidências de que células vegetais possuem
um sistema de monitoramento e resposta ao comprometimento da integridade da parede
celular (LEVIN, 2005).
Figura 8 - Curva de resposta das taxas de alongamento de pêlos radiculares de Micro-Tom quando
expostas diretamente a soluções com diferentes osmolaridades. O meio consistia em MMin
(pH 5,8) + manitol para ajustar a solução à osmolaridade final. As barras indicam o erro
padrão da média (n= 59 a 354).
6.5. Estabelecimento de uma solução de referência para o tratamento inicial dos pêlos
radiculares
Conforme descrito, observou-se alta variabilidade na taxa de alongamento dos pêlos
radiculares. Em quase todos os trabalhos que analisam o alongamento de pêlos radiculares,
este fator é contornado, pois os experimentos são realizados acompanhando-se pêlos
individuais. Selecionam-se pêlos com determinado comprimento e taxa de alongamento, e
depois aplica-se os tratamentos experimentais. Embora haja dúvidas sobre a
representatividade desta abordagem, ela possui uma vantagem interessante, que é a
possibilidade de se avaliar os resultados em termos relativos à condição padrão ou controle
y = 2.10
-7
x
3
- 9.10
-5
x
2
+ 0,0149x - 0,357
R
2
= 0,7498
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 50 100 150 200 250 300 350
Osmolaridade da solução (mOsm)
Alongamento celular (µm . min
-1
)
47
inicial. Assim, no presente caso, a avaliação inicial de todos os pêlos radiculares, a uma única
condição aqui denominada de referência, com a aplicação subseqüente do tratamento,
permitiria a expressão dos resultados em termos relativos, e deveria reduzir a variabilidade
dos resultados.
O estabelecimento de uma condição de referência inicial precisa atender a duas
condições: permitir, primeiro, boas condições para o alongamento dos pêlos e, segundo, a
aplicação subseqüente dos tratamentos. Considerando o efeito da osmolaridade sobre o
alongamento dos pêlos radiculares, e a intenção de se aplicar tratamento hipo-osmóticos
subseqüentes, o estabelecimento do meio de referência foi dirigido no sentido de se encontrar
a osmolaridade ideal para esta finalidade, que não poderia ser muito alta, de maneira a inibir o
alongamento do pêlo, ou muito baixa, de maneira a inviabilizar a aplicação de tratamentos
hipo-osmóticos.
Como ponto de partida, primeiramente se determinou a osmolaridade da solução externa
(MMin + manitol) que fosse aproximadamente isotônica em relação ao citoplasma. Isto foi
determinado observando-se a presença de plasmólise incipiente e pela paralisação do
alongamento celular. Estimou-se que esta condição seria aproximadamente de 300 mOsm.
Em seguida, experimentos foram realizados onde os pêlos foram primeiramente
expostos a MMin acrescido de manitol, com osmolaridade final de 150, 200 e 300 mOsm, por
cerca de 30 min, e depois expostos por mais 30 min em solução de MMin + manitol com
osmolaridade de 76 ou 41 mOsm. Ou seja, testou-se a condição de aplicação do choque hipo-
osmótico.
Os resultados das taxas de alongamento, tanto na condição do meio de referência como
no choque hipo-osmótico subseqüente estão apresentados na Figura 9. O alongamento dos
pêlos foi claramente inibido com o choque hipo-osmótico, mas foi mais acentuado a 41 do
que a 76 mOsm. Pêlos tratados inicialmente com 150 mOsm tiveram seu alongamento
diminuído para 91% a 76 mOsm e para 64% a 41 mOsm. Aqueles tratados com 200 mOsm
tiveram o alongamento diminuído para 74% a 76 mOsm e a 43% a 41 mOsm. Por fim,
aqueles tratados com 300 mOsm sofreram redução no seu alongamento a 54% a 76 mOsm.
A porcentagem do número de pêlos que se romperam com os tratamentos hipo-
osmóticos variou. No choque hipo-osmótico de 150 a 76 mOsm, cerca de 7 % dos pêlos se
romperam. Já de 150 para 41 mOsm, o número de pêlos rompidos praticamente triplicou
(29%).
A partir destes resultados, optou-se pelo uso do meio a 150 mOsm (MMin + manitol)
como meio de referência.
48
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
150 200 300
Alongamento pêlos (µm . min
-1
)
Tratamentos
Choque hipo-osmótico a 76 mOsm
Choque hipo-osmótico a 41 mOsm
Figura 9 - Efeito de diferentes choques osmóticos sobre a taxa de alongamento (µm.min
-1
) absoluto de
pêlos radiculares de Micro-Tom. As soluções consistiam de MMin (2 mM CaCl
2
, 10 mM
KCl, 10 mM MES, pH 5,8) + manitol para alcançar a osmolaridade final. As barras indicam
o erro padrão da média (n= 18 a 79).
49
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Alongamento relativo (%)
Choque hipo-osmótico a 76 mOsm
Choque hipo-osmótico a 41 mOsm
0
10
20
30
40
50
60
150 200 300
Pêlos rompidos (%)
Osmolaridade inicial (mOsm)
A
B
Figura 10 - Efeito de diferentes choques osmóticos sobre a taxa de alongamento relativo (A) e a
porcentagem de pêlos rompidos (B) em pêlos radiculares de Micro-Tom. Os dados são
relativos ao ensaio apresentado na Figura anterior. O alongamento relativo foi calculado
dividindo-se a média da taxa de alongamento dos pêlos em solução hipo-osmótica pela
média na solução inicial.
6.6. Choque hipo-osmótico associado a alterações de pH
A partir da determinação do meio de referência, foi testado o efeito do choque hipo-
osmótico e da variação de pH no alongamento dos pêlos. Pêlos radiculares foram
primeiramente expostos a meio de referência (150 mOsm) a pH 5,8 por 30 a 40 min. Após
esse período, o meio foi trocado pelo outro de osmolaridade menor (76 e 41 mOsm) de pH
igual ou menor (5,8 ou 4,5).
50
Os pêlos permaneceram incubados neste meio de 20 a 30 min. Na Figura 11
encontram-se as taxas de alongamento, em valores absolutos, durante os dois períodos de
tratamento. Em todos os casos houve uma queda maior na taxa de alongamento dos pêlos com
o abaixamento do pH do que no choque hipo-osmótico, com exceção somente do choque para
41 mOsm a pH 5,8 onde o alongamento foi um pouco menor que em 41 mOsm a pH 4,5
(Figura 11).
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
150 76 41
Alongamento celular (µm.min
-1
)
Osmolaridade da solução hipo-osmótica (mOsm)
Condição inicial : meio de referência (150 mOsm, pH 5,8)
pH 5,8
pH 4,5
Choque hipo-osmótico
Figura 11 - Efeito de diferentes choques osmóticos, realizados a pH 5,8 e 4,5, sobre a taxa de
alongamento (µm.min
-1
) absoluto de pêlos radiculares de Micro-Tom. Com exceção do
pH e da osmolaridade, que foi ajustada com manitol, as soluções foram semelhantes às
descritas na Figura 9. As barras indicam o erro padrão da média (n= 43 a 79).
Na Figura 12A está representado o alongamento relativo dos mesmos pêlos. Quando
se manteve a osmolaridade do meio (150 mOsm), e diminuiu-se o pH (de 5,8 para 4,5),
observou-se uma queda de 10% no alongamento dos pêlos. Quando se diminuiu a
osmolaridade para 76 mOsm, o alongamento caiu a 72%. Para 41 mOsm, o alongamento caiu
para 42% nessas mesmas osmolaridades mas, variando o pH de 5,8 para 4,5, as taxas de
alongamento caem ainda mais (51% e 52%).
Quando comparamos a porcentagem de pêlos rompidos (Figura 12), observamos que a
maior porcentagem ocorreu no choque osmótico para 41 mOsm a pH 5,8 (20%), seguido do
choque de mesma osmolaridade a pH 4,5 (13%); o mesmo não é observado no choque para 76
51
mOsm. Durante o choque osmótico a 76 mOsm a pH 5,8, a porcentagem de pêlos rompidos
(3,8%) foi menor que durante o choque a mesma osmolaridade a pH 4,5 (12%).
A Figura 13 mostra o alongamento dos pêlos tratados com outras duas osmolaridades
mais próximas de 150 mOsm (123 e 100 mOsm), enquanto na Figura 14A está ilustrado o
crescimento relativo. Ao contrário do que aconteceu com as concentrações menores (41 e 76
mOsm), o alongamento a 123 e 100 mOsm a pH4,5 foi maior do que a pH 5,8 (104 / 91% a
123 mOsm e 93 / 79% a 100 mOsm). O mesmo aconteceu a 76 mOsm, que apresentou maior
alongamento a pH 4,5 que a pH 5,8 (61 / 33%).
0
20
40
60
80
100
120
Alongamento relativo (%)
0
5
10
15
20
150 76 41
Pêlos rompidos (%)
Osmolaridade da solução hipo-osmótica (mOsm)
pH 5,8
pH 4,5
Choque hipo-osmótico
A
B
Figura 12 – Efeito de diferentes choques osmóticos, realizados a pH 5,8 e 4,5, sobre a taxa de
alongamento relativo (A) e a porcentagem de pêlos rompidos (B) em pêlos radiculares de
Micro-Tom. Os dados são relativos ao ensaio apresentado na Figura anterior. O
alongamento relativo foi calculado dividindo-se a média da taxa de alongamento dos
pêlos em solução hipo-osmótica pela média da solução inicial.
52
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
150 123 100 76
Alongamento celular (µm.min
-1
)
Osmolaridade da solução hipo-osmótica (mOsm)
Condição inicial : meio de referência (150 mOsm, pH 5,8)
pH 5,8
pH 4,5
Choque hipo-osmótico
Figura 13 - Efeito de diferentes choques osmóticos, realizados a pH 5,8 e 4,5, sobre a taxa de
alongamento (µm.min
-1
) absoluto de pêlos radiculares de Micro-Tom. As soluções
consistiam de MMin (2 mM CaCl
2
, 10 mM KCl, 10 mM MES, pH 5,8) + manitol para
alcançar a osmolaridade final Com exceção do pH e da osmolaridade, que foi ajustada
com manitol, as soluções foram semelhantes às descritas na Figura 9. As barras indicam o
erro padrão da média (n= 39 a 60).
53
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Alongamento relativo (%)
pH 5,8
pH 4,5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
150 123 100 76
Pêlos rompidos (%)
Osmolaridade da solução hipo-osmótica (mOsm)
Choque hipo-osmótico
A
B
Figura 14 - – Efeito de diferentes choques osmóticos, realizados a pH 5,8 e 4,5, sobre a taxa de
alongamento relativo (A) e a porcentagem de pêlos rompidos (B) em pêlos radiculares
de Micro-Tom. Os dados são relativos ao ensaio apresentado na Figura anterior. O
alongamento relativo foi calculado dividindo-se a média da taxa de alongamento dos
pêlos em solução hipo-osmótica pela média da solução inicial.
6.7. Evidências de possível papel da modulação oxidativa da parede celular na resposta
ao choque hipo-osmótico
Os dados apresentados evidenciam a existência em pêlos radiculares de um sistema de
percepção e resposta a estresse e ao comprometimento da integridade da parede destas
células. Quando os pêlos foram submetidos a condições em que a parede ficou ameaçada de
ceder, uma resposta celular resultou na diminuição do alongamento destas células. Quando a
resposta não ocorreu a tempo, ocorreu o rompimento do pêlo radicular, conforme já descrito.
54
No caso de choque hipo-osmótico, a resposta celular poderia ocorrer de duas formas
gerais. Uma envolvendo o ajustamento osmótico, de modo a reduzir a pressão de turgor, e
outra envolvendo o enrijecimento da parede. Ambas levam a uma redução no alongamento
celular.
O efluxo de íons, principalmente de K
+
, poderia ser um mecanismo simples para
aliviar o aumento da pressão de turgor. No entanto, uma série de trabalhos de Lew (1996,
1998 e 2004) examinou o efeito de estresse hiper- e hipo-osmótico no potencial elétrico da
membrana plasmática, do vacúolo e no fluxo de íons. Estes trabalhos relataram alguns
comportamentos inesperados e concluíram que alterações no fluxo de íons causados pelo
choque hipo-osmótico não foram significativos e que estariam mais relacionados com
mecanismos de sinalização do que com ajustamento osmótico.
Além disto, a exposição de pêlos radiculares de Micro-Tom a pH baixo (4,5) também
causaram estresse da parede, ameaçando a sua integridade. Como neste caso, não há
alterações osmóticas, um ajustamento osmótico não contribuiria para a manutenção da
integridade da parede do pêlo radicular.
Assim, tanto para o estresse hipo-osmótico quanto para o estresse causado por pH
baixo, procurou-se examinar um mecanismo que resultasse no enrijecimento da parede
celular. Sabe-se que a modulação oxidativa da parede celular é um processo crítico no
desenvolvimento normal do pêlo radicular (CAROL; DOLAN, 2006). Além disto,
Monshausen et al. (2007) obtiveram boas evidências de que a modulação oxidativa da parede
era processo que determinava se pêlos radiculares de Arabidopsis se rompiam quando
submetidas a pH baixo. Por fim, sabe-se que o choque hipo-osmótico pode causar uma
explosão oxidativa em células vegetais (ROUET; MATHIEU; LAURIERE, 2006), que
poderia levar a modificações na extensibilidade da parede celular.
A seguir, procurou-se evidências de um papel da modulação oxidativa da parede na
resposta dos pêlos ao estresse da parede gerado principalmente pelo choque hipo-osmótico.
6.7.1 Choque hipo-osmótico a pH 5,8, na presença de H
2
O
2
e ácido ascórbico
Neste caso, os pêlos passaram por um choque hipo-osmótico a um pH constante de
5,8, na presença de ascorbato, um antioxidante (scavenger) geral, ou na presença de H
2
O
2
, o
qual é a única forma de ROS estável o suficiente para ser utilizada experimentalmente.
55
Semelhante aos ensaios anteriores, os pêlos foram incubados primeiramente em meio de
referência a pH 5,8 por 30 a 40 min e em seguida transferidas para as soluções de tratamento.
Na Figura 15, estão apresentados as taxas de alongamento dos pêlos nos diferentes
tratamentos. A presença de ascorbato ou H
2
O
2
no ensaio de choque hipo-osmótico não afetou
a taxa de alongamento dos pêlos em relação ao controle, no qual não houve a adição de
nenhum dos dois compostos. Ou seja, o choque hipo-osmótico reduziu a taxa de alongamento
dos pêlos radiculares igualmente, nos três tratamentos, a patamares em torno de 33% da taxa
de alongamento que ocorria no meio de referência.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Controle Ascorbato H2O2
Alongamento celular (µm.min
-1
)
Tratamentos
150 mM 76 mM
Figura 15 – Efeito do choque hipo-osmóticos, realizados a pH 5,8 na presença de H
2
O
2
e ascorbato,
sobre a taxa de alongamento (µm.min
-1
) absoluto de pêlos radiculares de Micro-Tom. As
soluções consistiam de meio de referência (MMin +manitol) + manitol para alcançar a
osmolaridade final. A concentração final de H
2
O
2
foi de 1 µM e a de ascorbato foi de 100
µM. As barras indicam o erro padrão da média (n= 70 a 89).
Estes resultados não foram totalmente esperados, principalmente no caso do
tratamento com ascorbato. Esperava-se que a presença deste antioxidante resultasse em um
aumento na porcentagem de pêlos que se rompessem com o choque hipo-osmótico, conforme
relatado por Monshausen et al., (2007) em pêlos de Arabidopsis com a adição de 100 µM de
ácido ascórbico. Possívelmente os efeitos do ascorbato e do H
2
O
2
tivessem sido mais
acentuados se tivessem sido aplicados um pouco antes da imposição do choque hipo-
osmótico.
56
10
20
30
40
Controle Ascorbato H2O2
Pêlos rompidos (%)
Tratamentos
0
5
10
15
20
25
30
35
Alongamento relativo (%)
A
B
Figura 16 - Efeito de choque hipo-osmóticos, realizados a pH 5,8 na presença de H
2
O
2
e ascorbato,
sobre a taxa de alongamento relativo (A) e a porcentagem de pêlos rompidos (B) em pêlos
radiculares de Micro-Tom. Os dados são relativos ao ensaio apresentado na Figura anterior.
O alongamento relativo foi calculado dividindo-se a média da taxa de alongamento dos
pêlos em solução hipo-osmótica pela média da solução inicial.
57
6.7.2. Choque hipo-osmótico a pH 5,8 e 4,5 na presença de inibidor (DPI) de NADPH
oxidase
Pêlos radiculares foram expostos primeiramente ao meio de referência (150 mOsm) a
pH 5,8, de 30 a 40 min. Após este período o meio foi trocado pelas soluções de tratamento;
MMin (41 mOsm) ± DPI (50 µM) e o meio de referência + DPI, todos a pH de 5,8, onde
permaneceram de 20 a 30 min. As determinações das taxas de alongamento estão
apresentadas na Figura 17.
A aplicação de DPI não teve efeitos significativos sobre os pêlos que sofreram choque
hipo-osmótico, ou seja, entre os tratamentos com MMin (41 mOsm) ± DPI (Figura 17A). A
redução na taxa de alongamento, resultante do choque hipo-osmótico, não foi afetado pela
presença de DPI.
58
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Alongamento celular (µm.min
-1
)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8)
Choque hipos-osmótico a 41 mOsm
0
10
20
30
40
50
60
Controle + DPI (sem
choque hipo-osmótico)
-DPI + DPI
Pêlos rompidos (%)
Tratamentos
(choque hipo-osmótico a 41 mOsm)
A
B
Figura 17 - Efeito do choque hipo-osmóticos a 41 mOsm, pH 5,8 na presença de DPI, sobre a taxa de
alongamento relativo (A) e a porcentagem de pêlos rompidos (B) em pêlos radiculares de Micro-
Tom. As soluções consistiam de meio de referência (MMin +manitol) + manitol para alcançar a
osmolaridade final e MMin. A concentração final de DPI 50 µM. As barras indicam o erro padrão da
média (n= 10 a 61).
No entanto, a sua aplicação em pêlos que não sofreram choque hipo-osmótico, e que
permaneceram no meio de referência, reduziu a taxa de alongamento e aumentou a
porcentagem de pêlos rompidos a níveis aproximadamente iguais aos pêlos que sofreram
choque hipo-osmótico.
Assim, o DPI reduziu a taxa de alongamento do pêlo radicular e aumentou a
porcentagem de rompimento dos pêlos, conforme já foi relatado em outros trabalhos
(DUNAND; CREVECOEUR; PENEL, 2007; FOREMAN et al., 2003; MACPHERSON et
al., 2008). Seu efeito sobre células controle foi semelhante ao de um choque hipo-osmótico.
59
Houve queda no alongamento nos três tratamentos, a maior foi no controle com meio
de referência mais DPI (27%). Os pêlos tratados com MMin apresentaram quase o dobro do
alongamento em relação ao alongamento dos pêlos tratados com MMin mais DPI (44 e 28%,
respectivamente). A porcentagem de pêlos rompidos não variou muito, 52% dos pêlos
tratados com meio de referência + DPI se romperam, 60% daqueles tratados com MMin +
DPI se romperam e 61% somente com MMin.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Alongamento celular (µm.min
-1
)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8)
pH 4,5
0
5
10
15
20
-DPI + DPI
Pêlos rompidos (%)
Tratamentos
A
B
Figura 18 – Efeito de choque hipo-osmótico a 76 mOsm a pH 4,5, sobre a taxa de alongamento
(µm.min
-1
) absoluto de pêlos radiculares de Micro-Tom(A) e a porcentagem de pêlos
rompidos (B) em pêlos radiculares de Micro-Tom.. As soluções consistiam de meio de
referência (MMin +manitol) e MMin + manitol a 76 mOsm para alcançar a osmolaridade
final. As barras indicam o erro padrão da média (n= 5 a 20).
60
6.7.3. Choque hipo-osmótico na presença de inibidor de peroxidases (SHAM)
O ácido salicilhidroxâmico (salicylhydroxamic acid, SHAM) é conhecido inibidor de
peroxidases (AITKEN et al., 2001; DUNAND; CREVECOEUR; PENEL, 2007). Também é
inibidor da via alternativa de oxidases, embora a inibição de peroxidases se inicia a
concentrações menores do que a inibição da via alternativa (DUNAND; CREVECOEUR;
PENEL, 2007).
A aplicação de SHAM diminuiu o comprimento de pêlos radiculares (DUNAND;
CREVECOEUR; PENEL, 2007), mas não se conhece relatos dos efeitos de SHAM sobre a
taxa de alongamento de pêlos.
Em comparação com o restante da raiz, já foi relatado que a extremidade do pêlo
radicular possui concentrações relativamente altas de H
2
O
2
(DUNAND; CREVECOEUR;
PENEL, 2007). Neste trabalho, aparentemente não é o caso de O
2
•-
, que se acumula
principalmente no apoplasto de células em alongamento (zona de alongamento) e em divisão
(meristema) da raiz.
Os pêlos radiculares foram expostos a meio de referência (150 mOsm) a pH 5,8 onde
permaneceram de 30 a 40 min e em seguida o meio foi trocado para MMin (41 mOsm) mais
SHAM, em 4 concentrações diferentes (25, 50, 200 µM e 1 mM), a pH 5,8 onde
permaneceram de 20 a 30 min.
A Figura 19A e B mostra o alongamento relativo dos pêlos tratados com meio de
referência + SHAM nas quatro diferentes concentrações, e o número relativo de pêlos
rompidos correspondente a cada um dos tratamentos. À medida que ocorre uma diminuição
no alongamento relativo (de 82% a 25 µM de SHAM, para 40% a 1 mM de SHAM) ocorre
um aumento de pêlos rompidos (de 10% a 25 µM para 44% a 1 mM). A Figura 20 mostra os
mesmos parâmetros medidos anteriormente, mas após tratamento com MMin nas mesmas
concentrações de SHAM.
O alongamento relativo do tratamento com o MMin + 25 µM de SHAM é menor que o
alongamento do MMin sozinho (29 e 41%, respectivamente). No MMin + 50 µM e a 200 µM
de SHAM, os pêlos apresentaram diminuição no alongamento (de 51 e 60%) e a 1 mM o
alongamento volta a cair para 82%. A porcentagem de pêlos rompidos tratados com MMin +
as quatro concentrações de SHAM aumentou junto com a concentração de SHAM. O
aumento foi de 31% no MMin sem SHAM a 82% no MMin + 1 mM de SHAM.
61
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Alongamento celular (µm . min
-1
)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8) + SHAM
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 25 50 200 1000
Alongamento celular (µm . min
-1
)
SHAM (uM)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8)
Choque hipo-osmótico a 41 mOsm, pH 5,8 + SHAM
A
B
Figura 19 - Efeito do SHAM sobre a taxa de alongamento (µm.min
-1
) de pêlos radiculares de Micro-
Tom (A) e do choque hipo-osmótico a 41 mOsm a pH 5,8 + SHAM (B). As soluções
consistiam de meio de referência (MMin +manitol) e MMin a pH 5,8 e concentrações de
SHAM que variaram de 0 (controle) até 1000 uM. As barras indicam o erro padrão da
média (n= 19 a 107).
62
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
20
40
60
80
100
120
140
Pêlos rompidos (%)
Alongamento relativo (%)
Alongamento relativo
Pêlos rompidos
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0
10
20
30
40
50
60
0 200 400 600 800 1000
Pêlos rompidos (%)
Alongamento relativo (%)
SHAM (uM)
A
B
Figura 20 – Efeito do SHAM sobre o alongamento relativo e a porcentagem de pêlos rompidos em
pêlos radiculares de Micro-Tom em meio de referência a pH 5,8 (A) e a choque hipo-
osmótico a 41 mOsm, pH 5,8. As soluções consistiam de meio de referência (MMin
+manitol e MMin. A concentração final de SHAM variou de 0 (controle) a 1000 uM.
6.8. Caracterização de mutantes hormonais de MT quanto à formação e alongamento de
pêlos radiculares
Esta etapa teve como objetivo caracterizar e identificar diferenças no desenvolvimento
dos pêlos radiculares seja na sua densidade, comprimento ou taxa de alongamento, de cinco
63
mutantes hormonais, os quais foram comparados com Micro-Tom. Para isto, os pêlos foram
expostos diretamente ao MMin a pH 5,8.
A Figura 21 mostra os resultados de alongamento dos pêlos, de experimentos realizados
em quatro dias diferentes e com duplicata de cada mutante e do controle. Não foi possível
observar diferenças significativas nas taxas de alongamento entre o MT e os mutantes
hormonais testados. As taxas de alongamento variaram de 0,34 µm.min
-1
em dgt a 0,24
µm.min
-1
em dpy. O Micro-Tom apresentou taxa de alongamento intermediária entre os
mutantes de 0,29 µm.min
-1
. Em nenhum dos casos foi observado o rompimento de pêlos.
0,0
0,2
0,4
0,6
MT dgt epi not pro dpy
Alongamento celular (µm . min
-1
)
Mutantes hormonais e MT
Figura 21 – Alongamento celular dos pêlos de MT e de mutantes hormonais (dgt, epi, not, pro, dpy)
tratados diretamente com meio mínimo (MMin) a pH 5,8 por 90 min. As barras indicam o
erro padrão da média (n= 24 a 51).
Apesar de não apresentarem diferenças entre as taxas de crescimento, foram observadas
diferenças quanto à distribuição dos pêlos ao longo da raiz (Figura 22). Os mutantes dgt e epi
(Figura 22 A e B, respectivamente) apresentaram uma distribuição semelhante entre si, e bem
distinto dos demais. A densidade de pêlos foi mais alta, e observou-se um rápido aumento no
comprimento dos pêlos no sentido longitudinal da raiz. Os mutantes not e pro, assemelharam-
se ao Micro-Tom (controle), apresentando pêlos de comprimentos próximos e bem
64
distribuídos, não se concentrando em uma região determinada. O mutante dpy apresentou uma
densidade de pêlos semelhante, mas o comprimento foi mais variável.
Figura 22 - Mostra a distribuição dos pêlos radiculares nos diferentes mutantes hormonais (A, B, C, D,
E) e no controle Micro-Tom (G) tratados diretamente com meio mínimo (MMin) a pH
5,8.(A) dgt: pouco sensível a auxina; (B) epi: super produtor de etileno; (C) rot: deficiente
em ABA; (D) pro: super sensível a GA; (E) dpy: deficiente a BR; e (F) Micro-Tom:
controle.
6.9. Tratamento hipo-osmótico de pêlos de mutantes hormonais de MT
6.9.1. Exposição direta de pêlos do mutante super produtor de etileno (epi) a solução hipo-
osmótica
Os pêlos radiculares do mutante super produtor de etileno (epi) e do Micro-Tom
(controle) foram incubados diretamente em MMin (41 mOsm) ou MMin + manitol, a 76 e 300
mOsm, a pH 5,8. O objetivo foi avaliar a resposta dos pêlos deste mutante a soluções de
osmolaridade diferentes, numa versão simplificada da curva de resposta a osmolaridade
apresentada na Figura 23.
65
Os resultados do alongamento de pêlos de epi e MT nestas condições estão apresentados
na Figura 23, e são provenientes de quatro experimentos independentes. O mutante epi
apresentou taxa de alongamento inferior ao Micro-Tom em 300 e 76 mOsm, mas a 41 mOsm,
a taxa de alongamento de epi continuou aumentando com a hipo-osmolaridade enquanto a de
Micro-Tom diminuiu acentuadamente. No tratamento a 41 mOsm, observou-se o rompimento
de pêlos em ambos os materiais, sendo 6,9 % em epi e 1,8% em MT.
A maior produção de etileno em epi parece afetar, de forma ainda desconhecida, a
resposta de inibição do alongamento em condições que favorecem o rompimento celular.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
41 76 300
Alongamento celular (µm . min
.-1
)
Osmolaridade da solução de tratamento (mOsm)
MT
epi
Figura 23 - Alongamento celular dos pêlos de MT e do mutante hormonal (epi) tratados diretamente
com MMin (41 mOsm), 76 mOsm (MMin + manitol) e a 300 mOsm a pH 5,8 por 90 min.
As barras indicam o erro padrão da média (n= 30 a 69).
6.9.2. Choque hipo-osmótico em mutantes selecionados
Os pêlos radiculares de três mutantes hormonais (epi, dgt e not) e do MT foram
incubados em meio de referência (pH 5,8) por 30 a 40 min e depois expostos a choque hipo-
osmótico com MMin (41 mOsm, pH 5,8) por mais 20 a 30 min. A resposta do pêlos a estas
condições está apresentada na Figura 24A. Conforme já foi observado nos experimentos
anteriores com choque hipo-osmótico, observou-se uma queda na taxa de alongamento e o
66
rompimento de pêlos em todos os materiais. No entanto, isto ocorreu com diferentes graus de
intensidade. O mais afetado foi o MT, que apresentou uma queda de 60% no alongamento dos
pêlos e 58% dos pêlos rompidos. O mutante not também apresentou queda no alongamento e
alto índice de pêlos rompidos (58% e 57%, respectivamente). Os mutantes dgt e epi
apresentaram uma menor redução no alongamento (27% e 26%, respectivamente), assim
como menor porcentagem de rompimento de pêlos (16% e 26%, respectivamente).
0
10
20
30
40
50
60
Alongamento relativo (%)
0
10
20
30
40
50
60
MT dgt epi not
Pêlos rompidos (%)
Mutantes hormonais e MT
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Alongamento celular (µm. min
-1
)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8)
41 mOsm
A
B
C
Figura 24 – Efeito do choque hipo-osmótico a 41 mOsm, pH 5,8 (A) no alongamento celular dos pêlos
de MT e de mutantes hormonais (dgt, epi, not, pro, dpy) juntamente com o alongamento
relativo (B) e a porcentagem de pêlos rompidos (C). As barras indicam o erro padrão da
média (n= 20 a 46).
67
6.10. Efeito de diferentes tampões sobre o alongamento de pêlos
Pêlos radiculares de Micro-Tom foram tratados com meio de referência e tampão MES
(10 mM) a pH 5,8 por aproximadamente 30 min. Em seguida, as raízes foram transferidas
para meio idêntico, mas com tampão a ser testado, tanto a pH 5,8 como a 4,5.
A Figura 25A mostra o alongamento dos pêlos durante o primeiro intervalo de tempo,
somente em contato com tampão MES a pH 5,8, e no segundo intervalo de tempo.
Todos os tampões, com exceção do biftalato, apresentaram aumento de alongamento a
pH 5,8. Entre os tampões testados, o DMGA foi aquele que mais favoreceu o alongamento
dos pêlos (120%), depois foi o homopipes (108%) bem próximo da β-alanina (104%). O
único que apresentou queda no alongamento foi o biftalato (86%).
Em pH 4,5 (Figura 26A) os pêlos tratados com todos os tampões apresentaram queda na
taxa de alongamento. Em β-alanina, a taxa de alongamento dos pêlos caiu aproximadamente
pela metade (54%), em seguida veio o homopipes (41%) e o DMGA (28%). Os pêlos
radiculares em biftalato praticamente não se alongaram (9%).
Existem alguns poucos trabalhos na literatura que relatam o uso desses tampões a pH
baixo. No entanto, não existem estudos que verificaram se há interferência no alongamento
e/ou metabolismo celular por estes tampões.
68
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Alongamento dos pelos (µm.min
.-1
)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8) + MES
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8) + tampões testados
0
20
40
60
80
100
120
140
MES β-alanina DMGA Homopipes Bifitalato
Alongamento relativo (%)
Tampões testados
A
B
Figura 25 – Alongamento celular de pêlos radiculares em meio de referência a pH 5,8 com diferentes
tampões (A) e seu valor relativo (B). As barras indicam o erro padrão da média (n= 16 a
20).
69
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Alongamento dos pelos (µm.min
.-1
)
Meio de referência (150 mOsm, pH 5,8) + MES
Meio de referência (150 mOsm, pH 4,5) + tampões testados
0
20
40
60
80
100
MES β-alanina DMGA Homopipes Bifitalato
Alongamento relativo (%)
Tampões testados
A
B
Figura 26 – Alongamento celular de pêlos radiculares em meio de referência a pH 4,5 com diferentes
tampões (A) e seu valor relativo (B). As barras indicam o erro padrão da média (n= 19 a
21).
70
7. DISCUSSÃO
7.1. A resposta dos pêlos radiculares ao estresse da parede
Embora não sejam numerosos, alguns trabalhos já relataram que os pêlos radiculares
podem sofrer ruptura quando expostas a condições de pH baixo (BIBIKOVA et al., 1998;
JONES; SHAFF; KOCHIAN, 1995; MONSHAUSEN et al., 2007). No entanto, não se
conhece trabalhos que mediram a taxa de alongamento dos pêlos sob estas condições. O
trabalho de Bibikova et al. (1998) apenas menciona que o abaixamento do pH reduziu a taxa
de alongamento de pêlos radiculares de Arabidopsis.
Por sua vez, embora seria esperado que choques hipo-osmóticos causassem a ruptura de
pêlos, foi inesperado constatar que as condições em que isto ocorre são raramente abordadas
na literatura, e muitas vezes se faz apenas uma menção de que se observou ruptura (ver por
exemplo, LEW, 1998). Também no caso de tratamentos hipo-osmóticos, não se conhece
trabalhos que mediram a taxa de alongamento dos pêlos sob estas condições. Em tubos
polínicos há um pouco mais de informações sobre os efeitos de condições hipo-osmóticas,
mas se limitam essencialmente a um pequeno conjunto de bons trabalhos oriundos de um
único grupo (por exemplo, ZONIA; MÜLLER; MUNNIK, 2006; ZONIA; MUNNIK, 2007).
Os dados apresentados no presente estudo evidenciam a existência, em pêlos
radiculares, de um sistema de percepção e resposta a estresse da parede visando manter a sua
integridade. Quando os pêlos foram submetidos a condições em que a integridade da parede
estava ameaçada, uma resposta celular resultou na diminuição do alongamento destas células.
Quando houve uma falha nesta resposta, ou esta não ocorreu rápida o suficiente, a
conseqüência foi o rompimento do pêlo radicular, conforme relatado nos resultados.
A resposta a estresse da parede ficou particularmente evidente na curva de resposta dos
pêlos a soluções com diferentes osmolaridades (Figura 8). A taxa de alongamento aumentou
com a diminuição da osmolaridade até alcançar um limiar em que houve redução drástica da
taxa de alongamento e começou-se a observar o rompimento de pêlos. Seria interessante
verificar se comportamento semelhante ocorre em uma curva de resposta a pH baixo. Deve-se
ressaltar que os efeitos normalmente esperados, tanto do tratamento a pH baixo como do
tratamento hipo-osmótico seriam de um aumento na taxa de alongamento, pois um aumentaria
a pressão de turgor celular e o outro a extensibilidade da parede. No entanto, a questão chave
71
é o que ocorre quando estes fatores alcançam níveis críticos, alcançando o limite de
resistência da parede.
Atualmente, um assunto importante é tentar entender este processo e saber se, assim
como o que ocorre em leveduras, as plantas possuem um sistema de monitoramento e resposta
ao estado de integridade da parede celular e elucidar os seus mecanismos (HAMANN et al.,
2009). Para ilustrar, a via de sinalização responsável por esta percepção e resposta em
leveduras já é bem conhecida, e está bem estabelecido que é uma via vital para a sua
sobrevivência (LEVIN, 2005).
Na Figura 27, propõe-se um modelo simples para a resposta celular frente ao estresse
da parede.
Figura 27 – Modelo ilustrando a resposta de pêlos radiculares a estresse da parede celular. Estas
células necessitam ter a capacidade de monitorar a integridade de sua parede e responder
de acordo. Se houver falha neste processo, o resultado será a ruptura celular.
Apesar dos problemas metodológicos encontrados em se trabalhar com pêlos radiculares
e relatados aqui, devem estar evidentes as características únicas que estas células possuem
para a realização destes tipos de estudo, que são a facilidade de se avaliar tanto a expansão
como a ruptura celular.
FALHA
SIM
Choque hipo-osmótico
ou
pH baixo
Ameaça à integridade
da parede
celular?
ALONGAMENTO
ENRIJECIMENTO
DA PAREDE
CRESCIMENTO
RUPTURA
CELULAR
NÃO
Percepção e
Sinalização
Resposta
Celular
Estresse
Parede Celular
FALHA
SIM
Choque hipo-osmótico
ou
pH baixo
Ameaça à integridade
da parede
celular?
ALONGAMENTO
ENRIJECIMENTO
DA PAREDE
CRESCIMENTO
RUPTURA
CELULAR
FALHA
SIM
Choque hipo-osmótico
ou
pH baixo
Ameaça à integridade
da parede
celular?
ALONGAMENTO
ENRIJECIMENTO
DA PAREDE
CRESCIMENTO
RUPTURA
CELULAR
NÃO
Percepção e
Sinalização
Resposta
Celular
Estresse
Parede Celular
Percepção e
Sinalização
Resposta
Celular
Estresse
Parede Celular
72
Por outro lado, não se deve considerar que os processos aqui descritos estão restritos a
este tipo de célula. Pelo contrário, postula-se que estes processos também ocorrem, embora
talvez de modo quase imperceptível, em células em que a expansão é difusa. É possível que
em células de crescimento difuso ocorram micro-rupturas que, além dos danos próprios,
poderiam permitir maior entrada de Al. Esta poderia ser uma explicação para a diferença
marcante no acúmulo de Al entre células de tabaco (Nicotiana tabacum cv. BY-2) expostas a
Al sob condições hipo-osmóticas e não hipo-osmóticas (CAPALDI, 2006).
7.2. Mecanismos de resposta do pêlo ao estresse da parede
Neste trabalho, examinaram-se dois fatores de estresse para a parede; o abaixamento de
pH e o choque hipo-osmótico. Em ambos os casos, a resposta celular poderia ocorrer por meio
de dois mecanismos gerais. Uma envolvendo o ajustamento osmótico, de modo a reduzir a
pressão de turgor, e outra envolvendo o enrijecimento da parede. Ambas levam a uma redução
no alongamento celular.
7.2.1. Ajustamento de turgor celular
A forma de ajustamento osmótico mais provável, e aparentemente mais simples, seria a
abertura de canais para o efluxo de K
+
(LEW, 2004). Lew (1996; 1998; 2004) realizou uma
série de experimentos visando examinar os efeitos de estresse osmótico (hiper- e hipo-
osmótico) sobre as propriedades elétricas e fluxo de íons em pêlos radiculares de Arabidopsis.
Nestas células, foi demonstrado que o estresse osmótico, seja hiper- ou hipo-osmótico,
gera alterações no potencial de membrana destas células. Tipicamente, o choque hiper-
osmótico resulta em uma hiperpolarização da membrana plasmática da ordem de -25 a -35
mV, enquanto o choque hipo-osmótico resulta em uma despolarização da ordem de 30 a 40
mV (LEW, 1996; 2004). A despolarização da membrana plasmática seguida do choque hipo-
osmótico seria consistente com um processo de efluxo de cátions como o K
+
.
No interior da célula, o K
+
é o cátion que ocorre em maiores concentrações, tendo
concentrações médias no citoplasma da ordem de 140 mM (LEW, 2004). Além disto, o K
+
é
conhecidamente envolvido com regulação de turgor celular, de modo que seria o candidato
natural para um mecanismo de regulação osmótica envolvendo o seu efluxo, após um choque
73
hipo-osmótico. No entanto, Lew (1998; 2004) não encontrou diferenças significativas no
fluxo de íons após o tratamento hipo-osmótico, embora houve uma tendência de diminuição
do influxo de Ca
2+
e do efluxo de H
+
(LEW, 1998).
Além disto, a regulação osmótica geralmente ocorre ao longo de tempos relativamente
longos (horas), pelo menos em comparação com a escala de tempo envolvido com o choque
hipo-osmótico, em que as respostas precisam ocorrer em minutos ou segundos. O Lew (1998;
2004) sugere que os fluxos de íons observados durante o estresse osmótico está, mais
provavelmente, relacionado a sinalização celular do que ao ajustamento osmótico.
Assim, o mais provável é que a resposta a estresse hipo-osmótico ocorra por meio de
uma modificação na extensibilidade da parede do pêlo radicular. Existem diversos
mecanismos que poderiam promover o enrijecimento da parede celular (COSGROVE, 2005),
mas um mecanismo provável, evidenciado pela literatura (MONSHAUSEN et al., 2007), seria
a modulação oxidativa da parede celular.
7.2.2. Enrijecimento da parede por meio da sua modulação oxidativa
Em função do que foi discutido sobre a regulação osmótica, a opção natural a ser
examinada seria a modulação oxidativa da parede, assunto que também tem despertado muito
interesse nos últimos anos (CAROL; DOLAN, 2006; PASSARDI; PENEL; DUNAND, 2004;
SWANSON; GILROY, 2010).
Para examinar esta hipótese, primeiramente foram realizados alguns ensaios mais
simples com o intuito de se obter indícios de uma modulação oxidativa da parede. Neste caso,
optou-se por realizar o choque hipo-osmótico na presença de antioxidante (ascorbato) ou de
H
2
O
2
.
A presença de ascorbato ou H
2
O
2
nos ensaios de choque hipo-osmótico não afetou a
taxa de alongamento dos pêlos, mas ambos diminuíram a porcentagem de pêlos rompidos
(Figura 15). O efeito de H
2
O
2
era esperado, pois geralmente está associado a processo de
enrijecimento da parede celular. Não se esperava um efeito muito grande, pois a suposição é
justamente que a resposta celular seja de um enrijecimento da parede. Assim, não se observou
reduções ainda mais acentuadas na taxa de alongamento, apenas na porcentagem de pêlos
rompidos.
O efeito de ascorbato foi um pouco inesperado (Figura 16A, B), pois se esperava que a
porcentagem de pêlos rompidos iria aumentar (MONSHAUSEN et al., 2007) e que a taxa de
74
alongamento dos pêlos seria mais elevada. Por outro lado, o ascorbato tem função conhecida
como pró-oxidante e, principalmente quando associado à atividade de peroxidases, pode
promover tanto o afrouxamento como o enrijecimento da parede (PASSARDI; PENEL;
DUNAND, 2004). Estes resultados não comprovam que a resposta celular frente ao estresse
da parede envolve a modulação oxidativa, apenas evidenciam que alterações de ROS podem
afetar a freqüência de ruptura celular decorrente do estresse hipo-osmótico.
Para examinar um possível papel da modulação oxidativa na resposta da célula ao
estresse da parede gerado pelo choque hipo-osmótico, o uso de inibidores de enzimas chaves é
mais informativo. O DPI (diphenylene iodonium) é inibidor conhecido da NADPH oxidase da
membrana plasmática. Esta enzima é considerada fonte importante de O
2
•-
, e já foi
demonstrada sua necessidade para o desenvolvimento normal de pêlos radiculares
(FOREMAN et al., 2003; MACPHERSON et al., 2008).
A aplicação de DPI a pêlos que foram expostas a choque hipo-osmótico (Figura 17) ou
a choque hipo-osmótico mais pH baixo (Figura 18) sugere que a NADPH oxidase não é
requerida para a resposta da célula frente ao estresse da sua parede. A aplicação de DPI não
teve efeitos significativos sobre os pêlos que sofreram choque hipo-osmótico (Figura 17). No
entanto, a sua aplicação a pêlos que não sofreram choque hipo-osmótico reduziu a taxa de
alongamento e aumentou a porcentagem de pêlos rompidos de modo aproximadamente igual
no controle
O DPI reduziu a taxa de alongamento do pêlo radicular e aumentou a porcentagem de
rompimento dos pêlos, conforme já foi relatado em outros trabalhos (DUNAND;
CREVECOEUR; PENEL, 2007; FOREMAN et al., 2003MACPHERSON et al., 2008). Seu
efeito sobre células controle foi semelhante ao de um choque hipo-osmótico.
As peroxidases geralmente estão presentes no apoplasto da maioria das células
vegetais (DUNAND; CREVECOEUR; PENEL, 2007) e os resultados dos ensaios em que
SHAM, um inibidor de peroxidases, foi aplicado sugerem um papel de peroxidases na
resposta celular frente ao estresse da parede. Embora não seja evidente à primeira vista, os
resultados obtidos com a aplicação de ascorbato também são consistentes com esta hipótese.
Infelizmente, o envolvimento da modulação oxidativa na resposta dos pêlos
radiculares a estresse da parede permanece em aberto neste estudo. Para uma melhor
definição, teria sido interessante mensurar ou detectar ROS apoplástico durante a imposição
do estresse ou a determinação da atividade de enzimas chaves, principalmente de peroxidase
(DUNAND; CREVECOEUR; PENEL, 2007; LISZKAY; KENK; SCHOPFER, 2003).
75
7.3. A resposta de mutantes hormonais ao estresse da parede (hipo-osmótico)
Neste trabalho, encontraram-se diferenças entre os pêlos radiculares dos mutantes
hormonais e MT com relação a suas respostas diante do estresse na parede gerado pelo
tratamento hipo-osmótico (Figuras 23 e 24).
Em um primeiro ensaio, onde os pêlos radiculares foram incubados diretamente em
soluções de diferentes osmolaridades (MMin + manitol; 41, 76 e 300 mOsm), a taxa de
alongamento dos pêlos radiculares no mutante epi (super produtor de etileno) continuou
aumentando com o abaixamento da osmolaridade da solução externa até 41 mOsm, enquanto
que em MT houve nítida inibição do alongamento. Apesar disto, a porcentagem de pêlos
rompidos em epi não foi muito alta (6,9%). A interpretação deste resultado é que, a 41 mOsm,
por algum motivo, os pêlos radiculares de epi não teriam ainda alcançado o limite crítico para
iniciar a resposta de inibição de alongamento.
Já no segundo ensaio em que se avaliou a resposta dos mutantes a choque hipo-
osmótico, foram encontradas respostas diferentes. Nos mutantes hormonais dgt (pouco
sensível a auxina) e epi (super produtor de etileno), mas não em not (deficiente em ácido
abscísico), os pêlos radiculares apresentaram uma melhor resposta de ajustamento a choque
hipo-osmótico do que Micro-Tom, reduzindo o alongamento e o rompimento dos pêlos.
7.4. A variabilidade nas taxas de alongamento à luz do modelo proposto e observações
relatadas na literatura
O modelo da Figura 27, embora simples, pode explicar a alta variabilidade dos dados de
taxas de alongamento relativo encontrados após a imposição do choque hipo-osmótico. Antes
da aplicação do choque hipo-osmótico, mesmo que estivessem alongando a taxas
semelhantes, os pêlos poderiam apresentar diferentes níveis de pressão de turgor e, também,
de extensibilidade da parede. Ao submeter o choque hipo-osmótico, aqueles pêlos cuja parede
não estivesse comprometida, passariam a alongar a uma taxa mais elevada. Nos pêlos em que
a integridade estivesse ameaçada, haveria uma resposta celular, seja pela perda de turgor, seja
pelo enrijecimento da parede, sendo o resultado uma taxa de alongamento menor.
76
O fato de que a osmolaridade interna é variável entre células semelhantes e
aparentemente na mesma condição fisiológica é facilmente percebida pois estas sofrem
plasmólise e param de crescer em soluções com osmolaridade um pouco diferentes. Assim,
em uma solução aproximadamente isotônica, haverá uma mistura de pêlos plasmolisados,
outras que pararam de alongar e outras que continuam alongando (VOLGGER et al., 2010).
Na realidade, é possível que grande parte da variabilidade encontrada na taxa de
alongamento dos pêlos tenha uma mesma origem em função do sistema experimental
empregado. Neste sistema, a transferência de pêlos radiculares de um ambiente de ar úmido
para um meio líquido pode ter gerado um estresse hipo-osmótico que poderia ter gerado
respostas como as ilustradas na Figura 27, e onde alguns pêlos alongariam mais rapidamente
enquanto outros teriam seu alongamento inibido.
Para ilustrar, na sua série de trabalhos, Lew (1996; 1998; 2004) utilizou um sistema
experimental semelhante ao que foi utilizado no presente trabalho, embora não tenha utilizado
câmaras de crescimento como as empregadas neste estudo. Após a aplicação das soluções
iniciais, este autor relatou que havia a necessidade de recuperação do alongamento dos pêlos
antes de se realizar medições. O mesmo autor também descreveu que, na aplicação da solução
hipo-osmótica, alguns pêlos pararam de alongar, alguns continuaram alongando e outras ainda
se romperam. É curioso que os dados de fluxo iônico encontrados por este autor apresentaram
variabilidade muito grande. Isto seria consistente com mensurações feitas em pêlos
respondendo de modo diferente a estas soluções de tratamento, de modo que em algumas
poderia estar ocorrendo o influxo de K
+
, enquanto em outras poderia estar ocorrendo o efluxo.
77
8. CONCLUSÕES
- Há boa evidência de que os pêlos radiculares possuem um mecanismo de percepção e
resposta a estresse da parede visando à manutenção de sua integridade, à semelhança do
sistema conhecido em leveduras;
- Apesar dos desafios metodológicos, os pêlos radiculares constituem um sistema
experimental e modelo biológico interessante para se investigar estresse da parede, como o
causado por pH baixo ou por choque hipo-osmótico.
- A grande variabilidade encontrada na taxa de alongamento dos pêlos é, provavelmente,
conseqüência do próprio sistema de percepção e resposta a estresse da parede, já que foi
impossível se evitar alterações osmóticas para a realização dos experimentos;
- Tanto o tratamento a pH baixo como o choque hipo-osmótico resultaram em resposta celular
onde houve redução da taxa de alongamento dos pêlos radiculares e encontrou-se evidências
de uma interação entre estes dois fatores. No entanto, o efeito do choque hipo-osmótico foi
mais marcante nas condições experimentais em que este estudo foi realizado;
- A resposta frente ao estresse da parede celular provavelmente ocorre via um enrijecimento
da parede do pêlo radicular, embora não se possa descartar a possibilidade de um ajustamento
osmótico;
- Embora a NADPH oxidase seja fundamental para o desenvolvimento normal e a integridade
de pêlos radiculares, não foram encontradas evidências, com uso do inibidor (DPI) de
NADPH oxidases, de que estas enzimas são necessárias para a resposta ao estresse da parede
em pêlos radiculares de Micro-Tom;
- A aplicação de SHAM, um inibidor de peroxidases, forneceu evidências de que estas
enzimas desempenham papel na resposta dos pêlos ao estresse da parede;
78
- Os mutantes hormonais dgt (auxina) e epi (etileno) apresentaram uma resposta ao estresse da
parede mais eficiente, reduzindo mais a sua taxa de alongamento e a porcentagem de pêlos
rompidos quando submetidos a choque hipo-osmótico. Estes resultados precisam ser melhor
analisados e suas causas investigadas, mas ilustram o potencial de se empregar mutantes
hormonais nas questões investigadas neste estudo;
79
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