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Caroline Buss
Relações entre fase cefálica da digestão, consumo alimentar e reatividade
microvascular de indivíduos saudáveis
Rio de Janeiro
2010
Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
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1
Caroline Buss
Relações entre fase cefálica da digestão, consumo alimentar e reatividade microvascular de
indivíduos saudáveis
Tese apresentada, como requisito parcial para
a obtenção do título de Doutora, ao Programa
de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental da Universidade do Estado do
Rio de Janeiro.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Guilherme Kraemer de Aguiar
Coorientadora: Prof.
a
Dra. Eliete Bouskela
Rio de Janeiro
2010
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Caroline Buss
Relações entre fase cefálica de secreção da insulina, consumo alimentar e reatividade
microvascular de indivíduos saudáveis
Tese apresentada, como requisito parcial para
a obtenção do título de Doutora, ao Programa
de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental da Universidade do Estado do
Rio de Janeiro.
Aprovada em: 13/12/2010
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Luiz Guilherme Kraemer de Aguiar (Orientador)
Faculdade de Ciências Médicas - UERJ
Prof
a
. Dr
a
. Beatriz D’Agord Schaan
Faculdade de Medicina - UFRGS
Prof
a
. Dr
a
. Denise Pires de Carvalho
Faculdade de Ciências Médicas - UFRJ
Prof. Dr. Egberto Gaspar de Moura
Faculdade de Ciências Médicas - UERJ
Prof
a
. Dr
a
. Maria Alice Neves Bordallo
Faculdade de Ciências Médicas - UERJ
Rio de Janeiro
2010
B981 Buss, Caroline.
Relações entre fase cefálica da digestão, consumo alimentar
e reatividade microvascular de indivíduos saudáveis / Caroline
Buss.- 2010.
82 f.
Orientador : Luiz Guilherme Kraemer de Aguiar.
Coorientadora : Eliete Bouskela.
Tese (Doutorado) – Universidade do Estado do Rio de
Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas, Pós-
graduação em
Fisiopatologia Clínica e Experimental.
1. Microcirculação - Teses. 2. Digestão - Fisiologia -
Teses. 3. Insulina - Teses. 4. Consumo de alimentos -
Teses. 5. Microcircullação - Fisiologia - Teses. I. Aguiar, Luiz
Guilherme Kramer de. II. Bouskela, Eliete. III. Universidade do
Estado do Rio de Janeiro. Faculdade de Ciências Médicas.
IV. Título.
CDU 612.133
CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A
Autorizo, apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta
tese/dissertação, desde que citada a fonte.
_________________________
_________ ____________________________
Assinatura Data
3
DEDICATÓRIA
Ao meu pai, meu guia eterno, sempre presente na mente e no coração.
À minha mãe, amor em pessoa.
Sem vocês eu nada seria.
4
AGRADECIMENTOS
Meu imenso agradecimento aos professores Luiz Guilherme Kraemer de Aguiar e Eliete
Bouskela. Guilherme, muito obrigada por toda ajuda, ensino, paciência, apoio e incentivo durante
todo o Doutorado, e, principalmente, nesta fase final. Profa. Eliete, obrigada por abrir as portas
do laboratório, pela oportunidade de aprender mais, pelo entusiasmo, pelo exemplo acadêmico.
Aos dois, obrigada pela orientação tão presente e participativa.
Aos meus colegas de pesquisa, sem eles este trabalho não teria acontecido: Priscila Alves
Maranhão, Diogo Silva Francisco, Maria das Graças Coelho de Souza, Yasmine Rangel Vieira,
Monique Pacheco Duarte Carneiro, Carolina Marinho. Obrigada também a toda equipe, Eliza,
Waldicio, Edileuza, demais colegas e professores do BioVasc, pela convivência prazerosa e
solução dos mais diversos problemas.
Ao CNPq, pelo suporte financeiro, e aos voluntários, por tornarem possível esta pesquisa.
Aos professores do PG-Fisclinex, por todo o ensino transmitido durante o curso. Obrigada
à Amélia, secretária, pela prontidão, apoio e flexibilidade na resolução de tarefas.
Aos professores componentes da Banca Examinadora, Prof
a
. Dr
a
. Beatriz D’Agord
Schaan, Prof
a
. Dr
a
. Denise Pires de Carvalho, Prof. Dr. Egberto Gaspar de Moura e Prof
a
. Dr
a
.
Maria Alice Neves Bordallo, por disporem do seu precioso tempo e conhecimento para a
avaliação deste trabalho.
À minha família amada, a minha conquista é a nossa conquista!
Aos meus queridos sogros, Pedro e Sandra, pelo acolhimento, dedicação e atenção a mim
dispensados. Ao Pedro Paulo e à Fabiana, pelo apoio tão fundamental na minha chegada ao Rio, e
pelas caronas à UERJ!
Aos meus amigos, aqui, em Porto Alegre, e nas mais variadas distâncias, por encurtarem-
nas e manterem-se sempre presentes, dividindo as alegrias, expectativas, e realizações da vida.
Ao Juliano, meu amor, pelo incentivo incondicional, por ser, por estar, por me fazer feliz.
5
Don’t be afraid of a little bit of pain;
Pleasure is on the other side.
John Legend
6
RESUMO
BUSS, Caroline. Relações entre fase cefálica da digestão, consumo alimentar e reatividade
microvascular de indivíduos saudáveis. 2010. 82 f. Tese (Doutorado em Fisiopatologia Clínica e
Experimental) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, 2010.
A fase cefálica de secreção de insulina (FCSI) ocorre dentro da fase cefálica da digestão,
em aproximadamente dez minutos entre a estimulação oro-sensorial pelo alimento e o início da
absorção deste e determina um incremento rápido dos níveis basais de insulina. A FCSI parece
ser importante para a tolerância normal à glicose. A hipótese deste estudo é de que a insulina
secretada na fase cefálica da digestão teria ações direcionadas para o tecido microvascular, com
conseqüente recrutamento capilar. Estudos recentes com indivíduos sadios têm mostrado a
associação entre função microvascular e componentes dietéticos. Padrões alimentares saudáveis e
intervenções nutricionais com alimentos específicos representam estratégias preventivas e
terapêuticas não-farmacológicas para redução da inflamação e do risco metabólico e
cardiovascular associados. O estudo de consumo alimentar inserido nesta pesquisa objetivou
identificar associações entre componentes dietéticos e a função microvascular em indivíduos
saudáveis. Após avaliação clínica e laboratorial, 39 voluntários saudáveis foram submetidos a
dois exames de videocapilaroscopia do leito ungueal, com um intervalo de dez minutos entre os
mesmos. Neste intervalo, conforme randomização, uma refeição com ótima apresentação e aroma
foi apresentada (estímulo sensorial) ou não (controle). Coletas sangüíneas foram realizadas aos 3,
9 e 15 minutos após a apresentação do estimulo, para avaliação dos níveis de insulina e
polipeptídeo pancreático (PP), marcadores bioquímicos da fase cefálica da digestão. Durante todo
o exame medidas de fluxo e vasomotricidade foram realizadas pela técnica de laser-Doppler
fluxometria. Após o exame, foi realizada iontoforese transdérmica de insulina. Todos os
participantes responderam a um questionário de freqüência alimentar (QFA), relativo ao hábito
de consumo dietético dos últimos 12 meses. O estudo da resposta microvascular à fase cefálica
comparou as diferenças de densidade capilar funcional e fluxo capilar nos grupos experimental e
controle, antes e após o estímulo sensorial, e sua correlação com a variação de insulina e PP. O
estudo de consumo alimentar avaliou correlações entre componentes dietéticos e recrutamento
capilar no exame basal (antes do estímulo) em toda amostra. Após o intervalo, o grupo que
recebeu o estímulo sensorial teve sua densidade capilar funcional (DCF) aumentada. A variação
de insulina não diferiu entre os grupos e a de PP foi maior no grupo estimulado, sendo também
correlacionada positivamente como aumento na DCF. A velocidade máxima de perfusão pós-
isquemia também aumentou no grupo estimulado, enquanto o tempo para alcançar esta
velocidade máxima diminuiu. O estudo do consumo alimentar revelou associações positivas entre
o consumo de cálcio, selênio e laticínios e recrutamento capilar na amostra total. Em conclusão, o
consumo alimentar de cálcio, selênio e laticínios foi associado com maior recrutamento capilar
em indivíduos sadios. Nestes indivíduos a microcirculação cutânea respondeu ao estímulo da fase
cefálica da digestão com recrutamento capilar e aumento de fluxo sanguíneo microvascular.
Palavras-chave: Microcirculação. Fase cefálica da digestão. Insulina. Consumo alimentar.
Reatividade microvascular.
7
ABSTRACT
The cephalic phase of insulin secretion (CPIS) occurs within the cephalic phase of
digestion, in approximately ten minutes between the oral-sensorial stimulation elicited by the
food to be consumed and the beginning of its absorption. It determines a rapid increase in insulin
levels. The CPIS is believed to be important for normal glucose tolerance. The hypothesis of this
study is that insulin secreted during cephalic phase would also have actions targeting
microvascular tissue, with resulting capillary recruitment. Recent studies with healthy subjects
have shown an association between microvascular function and dietary factors. Healthy eating
patterns and nutritional interventions with specific food items represent non-pharmacological
preventive and therapeutic strategies for reducing inflammation and cardio-metabolic associated
risk factors. The study of food intake included in this research aimed to identify associations
between dietary intake and microvascular function in healthy subjects. After clinical and
laboratorial assessment, 39 healthy men underwent two nailfold videocapillaroscopies, with an
interval of 10 minutes between them. In this interval, according to randomization, they were
subjected to a great-looking breakfast tray (CPIS group) or to nothing (control group). Blood
samples were drawn at 3, 9 and 15 minutes after the stimulus presentation to assess insulin and
pancreatic polypeptide (PP) levels, which are markers of cephalic phae of digestion. Throughout
the exam, microflow and vasomotion were measured by laser-Doppler flowmetry. After the exam
insulin iontophoresis was performed. All participants answered a food-frequency questionnaire
(FFQ) regarding their dietary intake in the last 12 months. The assessment of microvascular
response to CPIS compared differences in functional capillary density (FCD) and microflow in
the CPIS and control groups, pre- and post-stimulus and their correlations with changes in insulin
and PP. The study of food intake attempted to identify correlations between dietary factors and
functional capillary recruitment pre-stimulus in the total sample. After the interval, the CPIS
group had significantly increased basal and peak FCD. Insulin variation was not different
between groups. PP was significantly increased in the CPIS group and its variation was positively
correlated with FCD increase. Resting red blood cell velocity (RBCV) and peak RBCV were also
significantly increased and time taken to reach peak RBCV, decreased. The study of food intake
revealed positive associations between calcium, selenium and dairy intakes and functional
capillary recruitment in the total sample. In conclusion, skin microcirculation is activated during
cephalic phase of digestion. Selenium, calcium and dairy intakes are positively associated with
capillary recruitment in healthy men.
Keywords: Microcirculation. Cephalic phase of digestion. Insulin. Food intake. Microvascular
reactivity.
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Representação esquemática da microcirculação.....................................
Cascata de sinalização celular da insulina nos tecidos vascular e
metabólicos com efeitos sinergicamente acoplados................................
Alterações fisiopatológicas da sinalização intracelular da insulina,
decorrente do estado pró-inflamatório....................................................
Potenciais efeitos da adoção de hábitos alimentares saudáveis ou
aterogênicos.............................................................................................
Etapas do estudo......................................................................................
Desenho do estudo..................................................................................
Imagem do estímulo sensorial.................................................................
15
21
27
28
34
38
39
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGLs
DCV
DM2
eNOS
EO
EROs
FCSI
GLUT4
IL
IMC
IRS-1
MCP-1
NO
PAI-1
PCR
PDK-1
PI 3-kinase
PKCζ
RI
SM
TNFα
TOTG
Ácidos Graxos Livres
Doença Cardiovascular
Diabetes Mellitus tipo 2
Óxido nítrico sintase endotelial
Estresse Oxidativo
Espécies Reativas de Oxigênio
Fase Cefálica de Secreção de Insulina
Glucose Transporter type 4
Interleucina
Índice de Massa Corporal
Insulin Receptor Substrate 1
Monocyte Chemotactic Protein-1
Nitric Oxide
Plasminogen Activator Inhibitor-1
Proteína C Reativa
Phosphoinositide Dependent Kinase-1
Phosphatidylinositol 3-kinase
Protein kinase C zeta
Resistência Insulínica
Síndrome Metabólica
Tumor Necrosis Factor alfa
Teste Oral de Tolerância à Glicose
10
SUMÁRIO
1
1.1
1.2
1.2.1
1.2.2
1.3
1.4
1.5
1.6
1.7
2
2.1
2.2
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.5
3.6
3.7
4
4.1
INTRODUÇÃO.......................................................................................................
DESENVOLVIMENTO.........................................................................................
A microcirculação e seu emprego no diagnóstico, acompanhamento e
pesquisa de doenças metabólicas...........................................................................
Fisiologia da digestão..............................................................................................
Fase pré-ingestiva ou cefálica da digestão................................................................
Fase cefálica de secreção de insulina e sua importância para a tolerância à
glicose.......................................................................................................................
Insulina e sua ação metabólica...............................................................................
Insulina e sua ação hemodinâmica não-metabólica.............................................
A microcirculação em doenças metabólicas.........................................................
O endotélio normal e patológico............................................................................
Função endotelial e componentes dietéticos.........................................................
OBJETIVOS............................................................................................................
Objetivo primário...................................................................................................
Objetivo secundário................................................................................................
MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................
Seleção da amostra..................................................................................................
Critérios de inclusão...............................................................................................
Etapas do estudo......................................................................................................
Métodos de investigação da microcirculação cutânea.........................................
Capilaroscopia do leito ungueal................................................................................
Laser-Doppler fluxometria cutânea e iontoforese transdérmica de insulina............
Desenho do estudo...................................................................................................
Caracterização do estímulo empregado................................................................
Método estatístico e análise....................................................................................
RESULTADOS........................................................................................................
Artigo1 - Relações entre fase cefálica da digestão e microcirculação................
12
14
14
16
16
18
18
19
20
23
25
28
31
31
31
32
32
33
34
35
36
37
38
38
39
41
41
11
4.2
5
Artigo 2 - Associações entre componentes alimentares e recrutamento
capilar.......................................................................................................................
CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................
REFERÊNCIAS......................................................................................................
60
73
75
12
INTRODUÇÃO
No tecido vascular, a insulina tem ação hemodinâmica e em concentrações fisiológicas
atua como um potente vasodilatador, efeito este mediado pelo endotélio. Na fase pré-ingestiva da
digestão de um indivíduo sadio, a secreção de insulina ocorre por estímulo cefálico permitindo
com isso a sensibilização precoce dos tecidos à insulina, com ativação de seus receptores de
membrana e início da cascata de sinalização intracelular. Esta fase precoce de secreção da
insulina é considerada fundamental para a tolerância normal à glicose. Supondo-se que a insulina
da fase pré-ingestiva também teria funções direcionadas para o tecido vascular, esta secreção
precoce causaria vasodilatação principalmente no tecido microvascular, com conseqüente
recrutamento capilar. Tal ação prepararia os tecidos para o aporte de substratos provenientes da
digestão e, em tecidos-alvos da ação da insulina, como músculo, tecido adiposo e fígado,
aumentaria a superfície de troca celular por aumento da perfusão tecidual facilitando sua ação.
O diabetes mellitus tipo 2 (DM2), a síndrome metabólica (SM) e a obesidade abdominal
são condições clínicas que apresentam diminuição da sensibilidade à insulina como alteração
fisiopatológica comum. A resistência insulínica (RI) e a hiperinsulinemia secundária são
sabidamente fatores causais de disfunção endotelial e microvascular. Classicamente está descrito
que a RI ocorre principalmente secundária a defeitos no receptor de insulina e também pós-
receptor, ao nível intracelular. Entretanto, existem sugestões atuais que demonstram
indiretamente que a disfunção endotelial pode ser fator causal de RI. Conseqüentemente haveria
um defeito pré-receptor que diminuiria a disponibilidade da insulina para sua ação no receptor
celular, e conseqüentemente do seu substrato (glicose) para os tecidos.
O tecido cutâneo não é um tecido-alvo para a ação de insulina, e na fisiopatologia do
DM2 não há descrição de sua importância. Entretanto, há descrição de recrutamento capilar em
tecido cutâneo secundário à ação de insulina, porém de origem exógena, o que não expressa
integralmente a secreção fisiológica de insulina. Este estudo teve como objetivo avaliar na fase
pré-ingestiva da digestão, sob influência da secreção fisiológica de insulina secundária ao
estímulo cefálico em indivíduos saudáveis se ocorre o recrutamento capilar no tecido cutâneo.
Acreditou-se que se tal hipótese fosse pela primeira vez comprovada, estudos posteriores das
interações entre secreção fisiológica endógena de insulina e recrutamento capilar em estados
13
patológicos como DM2, SM e obesidade abdominal poderiam trazer avanços para um
entendimento mais amplo da fisiologia e fisiopatologia da homeostase da glicose.
Estudos recentes com indivíduos sadios têm mostrado a associação entre função
microvascular e componentes dietéticos. Alimentos específicos, micronutrientes, e diferentes
tipos de refeições e seus efeitos pós-prandiais sobre a função endotelial têm sido estudados.
Padrões alimentares saudáveis e intervenções nutricionais com alimentos específicos representam
estratégias terapêuticas não-farmacológicas para redução da inflamação e riscos metabólicos e
cardiovasculares associados. Dentro da pesquisa central desta tese, a análise do consumo
alimentar dos voluntários objetivou identificar associações entre componentes dietéticos e
reatividade microvascular em indivíduos saudáveis.
14
1 DESENVOLVIMENTO
1.1 A microcirculação e seu emprego no diagnóstico, acompanhamento e pesquisa de
doenças metabólicas
A microcirculação é a porção do leito vascular que se inicia nas arteríolas com diâmetro
interno médio de até 100µm e se estende até as vênulas pós-capilares, incluindo neste intervalo as
arteríolas terminais (15µm) e os capilares (figura 1). É o sítio da nutrição tecidual e sua fisiologia,
bioquímica e farmacologia variam de acordo com o tamanho da porção estudada e sua
localização nos diversos tecidos corporais. Diferenças importantes são encontradas entre o
endotélio microvascular de acordo com o segmento vascular analisado
(1;2)
. Observam-se
mudanças importantes na parede vascular já que as células musculares lisas tendem a diminuir
com a redução no diâmetro arteriolar, sendo os capilares compostos exclusivamente de uma
camada única de células endoteliais apostas à membrana basal. Estas mudanças na estrutura são
também acompanhadas de alterações nos mecanismos bioquímicos reguladores da função
microvascular. Sugere-se, que em microvasos, a vasodilatação é menos dependente de óxido
nítrico (NO), estando mais relacionada com o fator hiperpolarizante derivado do endotélio à
medida que há redução do diâmetro arteriolar
(3)
. De maneira semelhante, a reatividade a agonistas
específicos é também variável de acordo com o diâmetro do vaso
(4)
.
O uso da microcirculação cutânea como método de investigação diagnóstica da
microcirculação tem sido empregado há muitos anos. Nos últimos anos, há dados que
demonstram sua importância já que correlacionam disfunção microvascular cutânea com maior
risco coronário
(5)
e ainda a sua ocorrência com maior prevalência em portadores de síndrome
cardíaca X
(6;7)
, condição esta sabidamente relacionada com disfunção microvascular coronária.
Um estudo de Sax e colaboradores (1987)
(8)
identificou que o grau de déficit na vasodilatação
periférica apresentava boa correlação (r = 0,74, p < 0,005) com aquele observado na
vasodilatação coronária. Demonstrou-se com isso que pacientes com angina microvascular
apresentavam um déficit vasodilatador que afetava tanto a circulação coronária quanto a
periférica, sugerindo que a disfunção microvascular é um processo sistêmico. Está descrito
15
também em hipertensos que alterações na função microvascular de músculo esquelético ocorriam
em paralelo com as alterações microvasculares cutâneas
(9;10)
. Considerando que alterações da
microcirculação em vasos de resistência são o sítio de origem para o controle dos níveis
pressóricos, foi sugerido que as alterações da microcirculação cutânea se assemelhavam com
aquelas observadas no tecido muscular.
©The McGraw-Hill Companies, Inc
Figura 1. Representação esquemática da microcirculação
Durante a hiperinsulinemia exógena fisiológica observa-se recrutamento capilar em tecido
cutâneo em indivíduos saudáveis
(11)
e em diabéticos tipo 1
(12)
. Em obesos, a função microvascular
cutânea está alterada no estado basal
(13;14)
e também durante a hiperinsulinemia, pela técnica do
clampeamento hiperinsulinêmico euglicêmico, sendo esta associada com a diminuição da
sensibilidade à insulina
(13)
. Portadores de síndrome metabólica, tendo como critério de exclusão a
ocorrência de qualquer alteração na tolerância à glicose, apresentam disfunção microvascular em
tecido cutâneo
(14)
. Estes mesmos indivíduos, submetidos a um período de tratamento com
metformina, uma droga sabidamente sensibilizadora de insulina tiveram melhora importante em
todos os parâmetros microcirculatórios testados por videocapilaroscopia no leito ungueal
(15)
.
16
Além disso, testados complementarmente com técnica que avalia a função endotelial
microvascular de arteríolas de resistência no leito braquial em sua maioria no sítio muscular,
obtiveram também melhora na vasodilatação endotélio-dependente
(16)
. A associação destes dados
que demonstraram melhora da função microvascular em dois sítios distintos em portadores de
SM com o uso da metformina reforça os achados de outros autores
(7;9;10;17;18)
que sugerem que o
estudo da microcirculação cutânea reflete achado em outros sítios vasculares. Atualmente sugere-
se que a disfunção microvascular tem papel etiopatogênico na síndrome metabólica
(19;20)
,
condição esta diretamente relacionada com a RI.
1.2 Fisiologia da digestão
1.2.1 Fase pré-ingestiva ou cefálica da digestão
A digestão é caracterizada fisiologicamente por três fases, relacionadas ao local de
estimulação pelo alimento. Assim, divide-se em cefálica ou neural, gástrica e intestinal. A fase
cefálica refere-se a um conjunto de respostas fisiológicas, endócrinas e autônomas do sistema
digestivo, que resultam da estimulação dos sistemas sensoriais cefálicos, especialmente na
cavidade orofaríngea
(21)
. Embora estas respostas estejam prioritariamente associadas às
propriedades olfatórias e gustativas do alimento, a visão, ou antecipação do alimento, ou qualquer
situação relacionada com consumo alimentar, também pode estimular estas respostas
(22)
. As
reações à estimulação cefálica são, geralmente, respostas transitórias e rápidas mediadas pelo
componente eferente do nervo vago
(21)
.
Os eferentes vagais distribuídos por todo o sistema digestivo são ativados por centros
cerebrais estimulados pela informação visual ou orofaríngea, ou diretamente por aferentes
viscerais, sendo as respostas à fase cefálica intermediadas por fibras do núcleo dorsal motor do
nervo vago
(22)
. Estudos sugerem, também, que as informações visuais e olfatórias, fundamentais
para a fase cefálica, podem indiretamente atingir o núcleo dorsal motor do nervo vago pelo
17
núcleo central da amígdala ou do córtex orbitofrontal
(23)
. Não se sabe, no entanto, quais estruturas
cerebrais específicas controlam cada uma das respostas que ocorrem durante a fase cefálica.
O estímulo externo dado pelo odor, visão, sabor de uma refeição, é capaz de iniciar
respostas que vão determinar a secreção endócrina (gastrina, insulina, glucagon, polipeptídios
pancreáticos, entre outros) e exócrina (saliva e secreções gástricas e pancreáticas) primordiais
para a digestão. Quando uma refeição é administrada diretamente no estômago transpassando os
receptores sensoriais, a fase precoce da digestão não ocorre, o que demonstra que
fisiologicamente a fase de estimulação oro-sensorial é crucial para a secreção daqueles
componentes descritos. A estimulação vagal nesta fase é demonstrada em estudos nos quais ela é
abolida por vagotomia em animais
(24)
e humanos
(25)
, indicando ser mediada primariamente por
inervação colinérgica parassimpática das ilhotas pancreáticas. Entretanto, há dados atuais que
demonstram também uma ação não-colinérgica
(26)
.
A fase cefálica parece essencial para a digestão completa, sem distúrbios no trato gastro-
intestinal. Estudos clínicos e modelos animais demonstram que a administração gástrica ou
enteral do alimento, perpassando a estimulação orofaríngea, provoca retardo do processo
digestivo e prejudica a absorção e metabolismo de nutrientes
(22)
, um problema clínico relevante
nos pacientes com suporte nutricional. Estudos em animais relatam um atraso de até uma hora na
liberação da secreção gástrica quando o alimento é inserido diretamente no estômago, e a falta de
secreção salivar também atrasa o esvaziamento gástrico, pois a ausência da amilase salivar
lentifica a digestão dos carboidratos
(21)
. Da mesma forma, a ausência das secreções salivar e
gástrica, e assim correta digestão do alimento, provoca agressão na mucosa intestinal por ocasião
da administração enteral do alimento
(27)
. A ausência da fase cefálica também resulta em
distúrbios pós-prandiais, conforme descrito na seção seguinte.
A resposta oral é a primeira reação ao estímulo cefálico, aumentando a secreção salivar
em até seis vezes
(28)
, e diferentemente das demais secreções, é parcialmente controlada por fibras
simpáticas e parassimpáticas não vagais
(22)
. A saliva tem um papel relevante no processo
digestivo, já que além de lubrificar e proteger a mucosa, ela dissolve as partículas alimentares,
ação fundamental para a percepção do sabor pelas papilas gustativas
(29)
. A resposta gástrica se
reflete principalmente pela secreção rápida de gastrina, que por sua vez estimula a secreção de
ácido clorídrico. Estudos mostram que a fase cefálica contribui com aproximadamente 50% de
todo o ácido secretado durante o processo digestivo
(22)
. Outras respostas gástricas à fase cefálica
18
são liberação de imunoglobulinas (IgA, como anti-corpo protetor da mucosa contra micro-
organismos exógenos ingeridos) e leptina (como agente no processo de saciedade)
(30)
. A resposta
pancreática à fase cefálica ocorre nos níveis exócrino e endócrino. A ação exócrina decorrente da
estimulação orofaríngea inclui a secreção de enzimas digestivas (amilase, lipase, tripsina,
quimotripsina) e bicarbonato
(21)
. A resposta endócrina produzida na fase cefálica inclui as
secreções de polipeptídeo pancreático, glucagon e insulina, todos mediados pelo nervo vago
(25)
.
1.2.2 Fase cefálica de secreção de insulina e sua importância para a tolerância à glicose
A fase cefálica da secreção de insulina (FCSI) dura poucos minutos e inicia em até um
minuto a partir da estimulação oro-sensorial, tanto em animais experimentais como em
humanos
(31-36)
. Este é o único estímulo fisiológico sensorial conhecido que produz secreção de
insulina diretamente estimulada por reflexos neuronais. Em humanos, esta fase dura
aproximadamente 10 minutos, e ocorre na ausência de níveis glicêmicos aumentados. Estudos
mostram um incremento de 20 a 25% dos níveis basais de insulina, porém a respostas são
variadas, e algumas vezes, até mesmo negativas
(32)
. Em um estudo que comparou a resposta de
indivíduos obesos e saudáveis, a secreção de insulina foi até quatro vezes maior em obesos, ainda
que com grande variação intra-indivíduo em testes repetidos, sugerindo uma ligação com os
mecanismos envolvidos na obesidade e resistência insulínica
(37)
. Atenção particular tem sido dada
a FCSI face à importância da insulina como um hormônio anabolizante e o seu papel fundamental
na homeostase da glicose. A FCSI parece ser de importância primordial para a tolerância normal
à glicose
(38;39)
.
Estudos em indivíduos com peso normal, submetidos ao clampeamento hiperglicêmico,
demonstram que há uma forte correlação negativa entre as respostas individuais da FCSI e o
início do incremento da glicemia após a infusão intravenosa de dextrose e também entre as
respostas da FCSI e o índice de metabolismo da glicose (definido por: média do incremento da
glicemia/média da taxa de infusão da dextrose)
(33)
. Estes dados corroboram a importância da
insulina, secretada na FCSI, na glico-regulação pós-prandial
(26)
. Outros estudos demonstram uma
correlação negativa entre a resposta de secreção de insulina nos primeiros 30 minutos do teste
19
oral de tolerância à glicose (TOTG), como um marcador de secreção precoce de insulina e o valor
da glicemia nos 120 minutos do TOTG
(40)
. Além disso, o uso de somatostatina como um
supressor da FCSI resulta em intolerância à glicose
(39)
, e a simulação de uma refeição que
aumenta a insulina circulante, determinam uma melhora da tolerância à glicose após infusão
intragástrica de glicose
(41)
.
A infusão rápida de insulina durante os primeiros quinze minutos da ingestão alimentar
melhora significativamente a tolerância à glicose em obesos
(25)
e em portadores de DM2
(42)
. Em
obesidade humana, descreve-se que a supressão da FCSI diminui a termogênese pós-prandial e
pode ter um papel na gênese da obesidade
(39)
. Adicionalmente há uma associação entre glicemia
de jejum elevada e insulinemia com respostas atenuadas da FCSI em obesos
(43;44)
. Assim, as
evidências caracterizam claramente a necessidade fisiológica do aporte precoce da insulina aos
tecidos responsáveis pelo metabolismo da glicose, e tal fato deve ocorrer antes da absorção desse
substrato propriamente dito. Tais achados ressaltam a importância do estudo dessa fase precoce
da secreção de insulina e, devido à sinergia de suas ações metabólicas e vasculares (descritas
abaixo), sua interação com o tecido microvascular.
1.3 Insulina e sua ação metabólica
A insulina é um potente hormônio anabolizante que exerce seus efeitos metabólicos
primariamente no fígado, músculo e tecido adiposo. A insulina é capaz de aumentar o
armazenamento de energia por: 1) promover a síntese de glicogênio no fígado e músculo; 2)
aumentar a síntese de triglicérides no tecido adiposo e 3) aumentar a síntese de proteínas e inibir
a proteólise. Além disso, tem ação na oxidação de glicose com conseqüente formação de ATP e
liberação de energia para a célula. Em certas condições fisiológicas como puberdade e gestação e
em condições patológicas como obesidade, DM2, doença aguda e estresse, a ação celular da
insulina torna-se deficitária e a resistência insulínica (RI) se manifesta. A fim de compensar essa
resistência, o pâncreas aumenta a secreção de insulina, resultando em hiperinsulinemia
(45)
.
A RI em adipócitos causa lipólise exagerada com subseqüente elevação nos ácidos graxos
livres (AGLs). O transporte aumentado de AGLs ao músculo, fígado e células β-pancreáticas
20
torna ainda mais deficitária a ação celular da insulina, aumentando a RI e diminuindo a secreção
pancreática de insulina, as duas principais características fisiopatológicas do DM2
(45)
. Além
disso, a RI está associada a defeitos mitocondriais
(46)
que limitam a oxidação de AGLs e
favorecem o acúmulo intracelular de acil-CoA e outros produtos tóxicos provenientes do
metabolismo lipídico (ceramidas, diacilglicerol, etc.). Na presença de hiperglicemia, o malonil-
CoA intracelular se acumula, reduzindo ainda mais a oxidação de AGLs por inibição do sistema
de transporte da palmitoil-carnitina. Este sistema é necessário para o transporte de AGLs do
citosol para a mitocôndria, onde a β-oxidação de ácidos graxos acil-CoA de cadeia longa se
processa. O acúmulo destes agrava a ação, já deficitária, da insulina no músculo esquelético e
piora a RI. Essas são as bases bioquímicas que explicam a ação fisiológica e fisiopatológica da
insulina nos tecidos-alvos.
1.4 Insulina e sua ação hemodinâmica não-metabólica
Em adição às clássicas ações metabólicas descritas, que promovem o estoque de energia e
estimulam a oxidação de glicose, a insulina tem ainda mecanismos hemodinâmicos não-
metabólicos importantes. Descreve-se que este hormônio é capaz de promover o recrutamento
capilar, causar vasodilatação periférica e aumentar o fluxo sangüíneo regional
(47-49)
. Estes efeitos
hemodinâmicos da insulina complementam a sua ação metabólica por aumentar a oferta de
glicose e a exposição do músculo esquelético previamente sub-perfundido à ação da insulina
(50)
(figura 2).
21
Figura 2. Cascata de sinalização celular da insulina nos tecidos vascular e metabólicos com
efeitos sinergicamente acoplados. Adaptada de Kim et. al., 2006
(51)
.
Propõe-se que até 25% do efeito estimulatório da insulina na captação da glicose no
músculo esquelético esteja relacionado com sua ação hemodinâmica
(52)
. Sua ação vascular é
exercida principalmente por aumentar a biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) derivado do
endotélio, causando vasodilatação. O incremento de fluxo sangüíneo foi mais claramente
demonstrado após exposição prolongada e sob doses suprafisiológicas de insulina. A
vasodilatação per se com aumento do fluxo sangüíneo não se associa com aumento da captação
de glicose muscular. Entretanto, a captação de glicose aumenta quando esta vasodilatação foi
associada com o aumento do recrutamento capilar
(50)
.
Em repouso, somente 50% do leito capilar muscular é perfundido com sangue total,
enquanto que o restante é preenchido unicamente com plasma
(53)
. Logo, a ação metabólica da
insulina é aumentada por sua ação hemodinâmica diretamente na microvasculatura com
incremento do recrutamento capilar e fluxo sangüíneo microvascular total, e conseqüente
aumento da superfície de troca no leito capilar
(54)
. Mesmo não sendo um tecido-alvo para a ação
22
da insulina, estudos demonstram a ocorrência de recrutamento capilar no tecido cutâneo
secundário à ação da insulina
(12;55;56)
.
A ação da insulina no recrutamento capilar se dá por relaxamento de arteríolas terminais e
de resistência. Em estudos experimentais demonstrou-se que a insulina recruta rapidamente
capilares de músculo por ação dependente do óxido nítrico (NO)
(49)
e que a inibição da NO
sintase bloqueava por completo o recrutamento capilar dependente da infusão de insulina
(57)
. Foi
também observado, em ratos, que o recrutamento capilar ocorria sem mudanças imediatas no
fluxo sangüíneo total da artéria femoral e que em concentrações fisiológicas esse recrutamento
precedia o aumento de fluxo sangüíneo local
(58)
. Estes achados sugerem que, do ponto de vista
hemodinâmico, o recrutamento capilar é o primeiro mecanismo e teria como função o aumento da
superfície microcirculatória perfundida, o que supostamente aumentaria a captação de substratos
pelo tecido. Parece claro supor que os efeitos hemodinâmicos não-metabólicos da insulina com
aumento de recrutamento capilar e, posteriormente, do fluxo sangüíneo, tem um papel
fundamental na homeostase da glicose ao permitir um maior aporte de insulina e
conseqüentemente, uma maior captação de glicose secundária a essa ação no músculo
esquelético.
Em ratos obesos, tanto o recrutamento capilar mediado por insulina, quanto a captação de
glicose estão diminuídos
(59)
. Recentemente foi descrito que em humanos portadores de obesidade
e submetidos ao clampeamento euglicêmico hiperinsulinêmico havia uma correlação inversa
entre o volume de sangue microvascular em tecido muscular, um índice de recrutamento capilar,
e o índice de massa corporal, sugerindo que a obesidade aboliria o recrutamento capilar mediado
por insulina
(60)
. Outros autores
(61)
, utilizando a mesma técnica de clampeamento associada à
microdiálise do músculo braquio-radial, observaram que homens obesos tinham uma demora no
início da ação da insulina ao compará-los com controles magros, sugerindo que havia um retardo
no transporte transcapilar da insulina, possivelmente por disfunção microvascular.
Em humanos, o estudo da microcirculação de tecido muscular é de difícil acesso e utiliza
técnicas invasivas, além de medidas indiretas do metabolismo microvascular
(58)
. Apesar do
emprego de técnicas de avaliação da microcirculação em tecido cutâneo não expressar claramente
as alterações fisiológicas e fisiopatológicas manifestadas em tecido muscular, a inferência dos
achados em tecido cutâneo pode trazer novos conceitos para a homeostase da glicose e sua
relação com a microcirculação. Ademais, os estudos que demonstram ação hemodinâmica da
23
insulina foram realizados com infusão de insulina em concentrações consideradas fisiológicas ou
até mesmo suprafisiológicas. Entretanto, em nenhum estudo foi empregado o estímulo fisiológico
proveniente da secreção endógena de insulina.
1.5 A microcirculação em doenças metabólicas
A obesidade, definida como um índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 30
kg/m
2
, é cada vez mais um importante problema de saúde pública, face ao aumento no risco
cardiovascular que impõe aos seus portadores. No Brasil, estima-se que 40% da população adulta
tenham sobrepeso ou obesidade
(62)
. Além disso, descreve-se para esta última um incremento na
taxa de prevalência de 4,2 para 14,3% nos últimos 20 anos
(63)
.
Dados da população norte-americana demonstram que, nos últimos 40 anos, o número de
indivíduos com sobrepeso (IMC entre 25 – 29,9 kg/m
2
) aumentou de 45 para 65% e com
obesidade de 13 para 31%. De maneira geral, o sobrepeso e a obesidade predispõem ou estão
associados a numerosas complicações cardíacas tais como doença arterial coronária, insuficiência
cardíaca e morte súbita em decorrência do seu impacto no sistema cardiovascular. Nos portadores
de sobrepeso com mais de 50 anos já há maior mortalidade total, entretanto naqueles com
obesidade esse risco aumenta em até 300%
(64)
. A obesidade está definitivamente associada a um
maior risco de infarto agudo do miocárdio e acidente vascular cerebral
(65;66)
. Sugere-se
atualmente que nem todos os tipos de obesidade aumentam o risco cardiovascular
(67)
, e este está
mais especificamente relacionado com o aumento de adiposidade intra-abdominal. Na
predominância deste acúmulo, há, na maioria dos casos, a ocorrência concomitante de RI e
hiperinsulinemia secundária.
Atualmente, estudos epidemiológicos sugerem que a relação entre DM2 e doença
cardiovascular (DCV) começa precocemente na progressão da doença, ainda em fase de
normotolerância para a intolerância à glicose e posterior DM2, estando relacionada a RI
(68;69)
. A
presença de RI é o denominador fisiopatológico comum tanto do DM2 quanto da SM,
antecedendo o diagnóstico destas duas condições. A RI foi proposta também como a base
fisiopatológica mais precoce do processo aterogênico
(68)
.
24
A SM é uma síndrome que associa diversos fatores de risco para aterosclerose e
conseqüente doença cardiovascular (diabetes mellitus, intolerância à glicose ou glicemia de jejum
alterada, obesidade central, dislipidemia, caracterizada por altos níveis de triglicérides e baixos de
HDL-colesterol e hipertensão arterial). A presença de estresse oxidativo, microalbuminúria e
disfunção endotelial também têm sido estudadas como constituintes da SM. Nem todos os
pacientes terão intolerância à glicose ou diabetes, e o estado pré-diabético pode ser encontrado
em muitos. A prevalência da SM aumenta com o envelhecimento, entretanto, o dado mais
relevante é o fato da sua prevalência aumentar com a gravidade da obesidade, podendo atingir
percentuais de 50% em obesos jovens
(70)
. Observa-se que cada meia-unidade de aumento no IMC
está associado com o aumento significativo do risco de SM em indivíduos com sobrepeso e
obesidade. Independente do grau de adiposidade, a própria SM per se está associada com um
risco aumentado para o desenvolvimento de DM2 e DCV, além de aumentar a taxa de
mortalidade cardiovascular e total, independente de alterações na tolerância à glicose
(70)
.
Já é bem descrito que o DM2 aumenta o risco de doenças macro e microvasculares.
Entretanto, nos últimos anos, diversos achados começaram a associar a maior ocorrência de
doenças macro
(71-73)
e microvasculares
(74)
também com a presença de alterações mínimas da
tolerância à glicose. Atualmente descreve-se que mesmo indivíduos somente com hereditariedade
para DM2 têm disfunção microvascular em tecido cutâneo
(75)
. Entretanto, os achados mais
consistentes associam o dano vascular não somente à hereditariedade, mas também à ocorrência
de RI
(76;77)
.
O tecido adiposo intra-abdominal é considerado um órgão altamente secretor e deletério
aos vasos sangüíneos, responsável parcialmente pela RI, com aumento de ácidos graxos livres, do
estresse oxidativo e liberação de diversas citocinas inflamatórias (adipocitocinas), as quais têm
um papel de importância no dano vascular, provavelmente anterior a própria hiperglicemia. Tais
achados revelam um novo conceito de que o dano endotelial precede a ocorrência de DM2 ou
mesmo da intolerância à glicose
(68;69)
. Evidências recentes do nosso grupo de pesquisa reforçam
esta hipótese
(14;78)
.
Do ponto de vista clínico, as principais complicações microvasculares no paciente com
diagnóstico de DM2 são a neuropatia, a retinopatia e a nefropatia. Ainda hoje, não há consenso se
a RI está ou não associada com estas complicações na ausência de hiperglicemia e muitos autores
sugerem que os níveis elevados de glicemia têm papel fundamental em reduzir a vaso-reatividade
25
de pequenos vasos. Entretanto, esse conceito pode ser tecido-específico, já que somente a
neuropatia está definitivamente relacionada com alterações da glicemia. Apesar da falta de
consenso entre os clínicos, já há dados que demonstram que a obesidade per se aumenta o risco
de doenças microvasculares, como a retinopatia e a nefropatia
(79-81)
. Atualmente, descreve-se a
disfunção microvascular como um processo sistêmico
(8)
e, apesar da pele não ser um órgão-alvo
relacionado com a fisiopatologia do DM2, seu estudo pode reproduzir alterações morfológicas e
funcionais da microcirculação de tecidos mais nobres.
1.6 O endotélio normal e patológico
O endotélio normal, através da secreção de óxido nítrico e prostaciclina (PGI
2
), exerce a
função de manutenção do tônus vascular, regulação da agregabilidade plaquetária e da
coagulação, modulação da fibrinólise e dissolução de trombos intravasculares formados,
modulação da inflamação, expressa por regulação da adesão e ativação leucocitária e de
quimiocinas. Lesões endoteliais promovidas pelo DM2, hipercolesterolemia e outros fatores de
risco para aterosclerose causam uma redução na síntese e secreção desses dois fatores protetores
e essas alterações propiciam um estado pró-constritor, pró-inflamatório e pró-agregante ao vaso
sangüíneo. Em decorrência da ativação do endotélio para um estado pró-aterogênico é possível
antes da observação de alterações estruturais na microcirculação, a observação de alterações na
reatividade microvascular
(14;78)
. A hiperglicemia também se associa ao aumento de endotelina, o
mais potente vasoconstritor conhecido
(82)
. Tais achados são consistentes com a diminuição na
capacidade vasodilatatória do vaso sangüíneo, expressa por diminuição da reatividade
microvascular.
A agregabilidade plaquetária está marcadamente aumentada em portadores de DM2 e
possivelmente contribui para o aumento no risco aterotrombótico da doença
(83)
. Vários fatores de
coagulação estão aumentados no DM2, que incluem o fator de von Willebrand, fator VII, VIII e
fator tecidual, enquanto a antitrombina III está diminuída, todos contribuindo para um estado pró-
coagulante
(84;85)
. A fibrinólise, um importante mecanismo de defesa vascular responsável pela
resolução de trombos e recanalização vascular, está alterada no DM2 e também em obesos por
26
aumento no PAI-1
(86;87)
. A elevação do PAI-1 está diretamente relacionada a maiores eventos
cardiovasculares
(88;89)
.
A geração de radicais livres, denominada estresse oxidativo (EO), é o processo final de
lesão celular da grande maioria dos fatores de risco cardiovascular
(90)
. Caracteriza-se por uma
produção aumentada de espécies reativas de oxigênio (EROs), como o ânion superóxido, ou
ainda por uma redução das defesas antioxidantes. Estas alterações resultam em inativação da
produção do óxido nítrico endotelial, o que diminui seu efeito endotélio-protetor, reproduzido do
ponto de vista de pesquisa clínica, na menor resposta vasodilatadora endotélio-dependente. A
disfunção endotelial está definitivamente relacionada com estados pró-oxidantes diretamente
relacionados com o processo inflamatório vascular
(91)
.
O endotélio normal não permite a aderência de leucócitos, porém nas fases precoces da
aterosclerose as células endoteliais começam a expressar moléculas de adesão, em função de
estímulos inflamatórios (IL-1, IL-6, IL-8, TNFα, PCR, MCP-1)
(92)
, com recrutamento de células
inflamatórias, posterior migração transendotelial e penetração na íntima do vaso
(93)
. A liberação
contínua de citocinas pelo endotélio e pelas células espumosas perpetuam o processo
inflamatório, o acúmulo de lipídeos e influenciam negativamente a atividade das células
musculares lisas da parede vascular. Sabe-se que a glicose, os macronutrintes, como gorduras e
proteínas, e a ingestão de refeições-mistas
(94;95)
, são capazes de estimular a produção de EROs,
enquanto a insulina é capaz de suprimí-los
(96)
. Não só o DM2, mas também a obesidade per se,
está associada a um estado inflamatório e de EO, reversível com restrição dietética
(97)
.
Um importante determinante entre a disfunção endotelial e resistência insulínica é a
cascata da sinalização intracelular paralela existente em tecidos vasculares e metabólicos com
funções distintas
(51)
. Como anteriormente mostrado na figura 1, a sinalização intracelular
decorrente da ativação do receptor de insulina regula tanto a translocação do GLUT4 e captação
de glicose no tecido muscular esquelético e adiposo, quanto a ativação da enzima óxido nítrico
sintase (eNOS) e produção de óxido nítrico. Em estados patológicos, os efeitos da insulina, ou
nestes casos, da resistência à insulina, estão envolvidos simultaneamente na fisiopatologia
vascular e metabólica. Fatores como as citocinas, que alteram ou inibem algum estágio destas
vias de sinalização, vão acarretar tanto a resistência à insulina, como a disfunção endotelial
(figura 3).
27
Figura 3. Alterações fisiopatológicas da sinalização intracelular da insulina, decorrente do estado
pró-inflamatório. Adaptada de Kim et. al., 2006
(51)
.
Assim, tendo em vista o relevante papel da insulina para a função vascular, este estudo
buscou investigar seus efeitos sobre a microcirculação sob influência da secreção fisiológica de
insulina secundária ao estímulo cefálico, na fase pré-ingestiva da digestão. O estabelecimento das
relações existentes entre fisiologia da secreção de insulina, homeostase da glicose e função
microvascular e endotelial em indivíduos saudáveis permitirá futuras investigações e elucidações
sobre os mecanismos fisiopatológicos envolvidos nestas relações em estados patológicos.
1.7 Função endotelial e componentes dietéticos
28
Há evidências de que a função endotelial pode ser alterada dentro de algumas horas após o
consumo de certos alimentos, sugerindo que fatores dietéticos estão envolvidos na prevenção e
progressão da doença cardiovascular
(98)
. Tem-se demonstrado que estratégias
farmacológicas
(15;16)
e não-farmacológicas
(99)
melhoram a função endotelial e microcirculatória.
Intervenções não-farmacológicas como atividade física, cessação do tabagismo, e fatores
nutricionais têm sido associados com melhor função endotelial, e dentro destes últimos, os ácidos
graxos, antioxidantes, L-arginina e proteína de soja têm sido umas das substâncias mais
estudadas
(99)
. Os potenciais efeitos de alimentos específicos, dentro de hábitos alimentares
saudáveis ou associados com o processo aterogênico
(100)
são ilustrados na figura 4.
Figura 4. Potenciais efeitos da adoção de hábitos alimentares saudáveis ou aterogênicos
(100)
.
Estudos recentes com pessoas sadias mostraram associação entre função endotelial e
fatores dietéticos
(101)
. Em um estudo transversal com mulheres de 43 a 69 anos sem doenças
29
cardiovasculares, diabetes ou câncer, o consumo dietético de magnésio foi modesta e
inversamente associado com alguns marcadores de inflamação sistêmica e disfunção
endotelial
(102)
. Um recente estudo com indivíduos brasileiros, saudáveis, idade média de 29 anos,
mostrou que uma carga lipídica, por exemplo, prejudica a função endotelial venosa, aumenta os
níveis de triglicerídeos, insulina e resistina e reduz a capacidade antioxidante, a reatividade
vascular e venodilatação máxima dependente de acetilcolina
(103)
. Alterações pós-prandiais
também foram estudadas após uma carga de sal
(104)
, mostrando que ela prejudica a função
endotelial, mesmo em indivíduos normotensos.
Um estudo de intervenção de longo prazo
(105)
avaliou os efeitos de duas dietas
hipocalóricas sobre a função endotelial de obesos. Os voluntários seguiram uma dieta
hipocalórica rica em ácidos graxos saturados ou uma pobre em gordura durante 12 meses. Ao
final do estudo, os dois grupos apresentaram resultados semelhantes em termos de perda de peso
e melhora de indicadores de função endotelial, como adiponectina, e-selectina e PAI-1. O grupo
que ingeriu a dieta rica em gordura saturada, no entanto, apresentou pior dilatação mediada por
fluxo da artéria braquial, sugerindo um efeito deletério de um alto consumo de gordura saturada
em longo prazo.
Um estudo italiano investigou os efeitos de várias doses de chá preto na função endotelial
dependente de óxido nítrico, enrijecimento arterial, pressão sangüínea e sensibilidade à insulina
em voluntários saudáveis. Em uma intervenção randomizada, duplo-cego, o estudo demonstrou
que o consumo de chá preto melhorou a dilatação mediada por fluxo da artéria braquial de
maneira dose-dependente e reduziu as pressões sistólica e diastólica aferidas em consultório, e
enrijecimento arterial
(106)
.
Embora estudos controlados de nutrientes específicos sejam essenciais para o
entendimento dos mecanismos fisiológicos, é também de grande importância o estudo dos efeitos
de hábitos alimentares, para uma análise de alimentos ingeridos e sinergia entre nutrientes em
relação à doença. Há poucos estudos de padrões alimentares que incluem um marcador de função
endotelial como desfecho
(98)
. Em uma ampla revisão da literatura, Esposito et. al. (2006)
(107)
defendem que padrões dietéticos apropriados, por exemplo, os associados com a dieta
mediterrânea, representam estratégias terapêuticas para reduzir inflamação e os riscos
metabólicos e cardiovasculares associados.
30
Neste sentido, uma recente intervenção em 32 jovens saudáveis estudou os efeitos da dieta
Mediterrânea associada ao consumo de pistache
(108)
. Os indivíduos consumiram somente a dieta
Mediterrânea por quatro semanas e após consumiram a dieta com substituição de 20% do valor
calórico dieta por pistache. Comparada à dieta Mediterrânea, a dieta com pistache reduziu os
níveis de glicose (-8,8 ± 8,5%), lipoproteína de baixa densidade (LDL-c) (-23,2 ± 11,9%),
colesterol total (-21,2 ± 9,9%), e triglicerídeos (-13,8 ± 33,8%) e melhorou a vasodilatação
endotélio dependente (aumento relativo de 30%).
Dentro da pesquisa central desta tese, buscou-se também identificar possíveis associações
entre o consumo de nutrientes em longo prazo, refletindo o hábito alimentar, e função
microvascular em indivíduos sadios.
31
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Primário
Demonstrar a possível ocorrência de recrutamento capilar na fase pré-ingestiva da
digestão e sua correlação com o incremento de secreção de insulina em indivíduos saudáveis.
2.2 Objetivo Secundário
Investigar a associação entre consumo alimentar e reatividade microvascular em
indivíduos sadios.
32
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Seleção da amostra
Quarenta e oito voluntários saudáveis foram incluídos no estudo. Durante o recrutamento,
os voluntários foram submetidos a uma triagem, composta por exame clínico e laboratorial, após
a leitura e aceitação do consentimento informado e a elucidação de todas as dúvidas. O estudo foi
realizado no Laboratório de Pesquisas Clínicas e Experimentais em Biologia Vascular – BioVasc
– do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Centro Biomédico da Universidade do
Estado do Rio de Janeiro. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa/HUPE. Para
um poder estatístico maior que 0,8, com uma probabilidade de erro alfa de 0,05, para diferenças
na densidade capilar funcional, foi estimado um n = 14 por grupo. Foi estabelecido, assim, um
tamanho amostral de 40, para compor 2 grupos de 20 indivíduos (descritos nas seções
subseqüentes).
No primeiro dia de triagem, o exame clínico, foi realizada uma entrevista para
identificação de histórico clínico, e hábitos alimentares. Um questionário de freqüência de
alimentar, validado no Brasil em população semelhante
(109)
, foi aplicado para investigar o
consumo nutricional nos últimos 12 meses. Foi realizada avaliação antropométrica,
compreendendo medidas de peso e altura, em balança aferida (Fillizola) e percentual de gordura
corporal através da aferição de dobras cutâneas
(110)
, utilizando-se plicômetro científico Lange.
Após a primeira seleção clínica, os voluntários foram submetidos a exames laboratoriais
após jejum noturno de 12 horas, compreendendo dosagens de glicose, insulina, hemograma
completo, colesterol total e frações, triglicerídeos, aspartato aminotransferase, alanina
aminotransferase e creatinina. Os voluntários também foram submetidos a um teste de tolerância
oral à glicose de acordo com os critérios da Associação Americana de Diabetes
(111)
. Tolerância
normal à glicose foi definida como glicemia de jejum < 100 mg/dl e de 2 horas após 75 g de
carga oral de glicose anidro < 140 mg/dl.
33
3.2 Critérios de inclusão
Foram incluídos voluntários saudáveis, do sexo masculino, com idade entre 18 e 30 anos.
Como saudáveis foram classificados os indivíduos que não apresentaram nenhum dos critérios
abaixo:
1. Diabetes mellitus, intolerância à glicose ou glicemia de jejum alterada;
2. Hipertensão arterial (PA sistólica ≥ 130 mmHg e PA diastólica ≥ 85 mmHg);
3. Índice HOMA maior ou igual a 2,71
(112)
;
4. Dislipidemia (hipercolesterolemia, HDL-colesterol baixo e/ou
hipertrigliceridemia);
5. Doença renal, vascular coronariana ou periférica, hematológica ou hepática;
6. Fumantes;
7. Uso crônico de quaisquer medicamentos;
8. IMC abaixo ou acima da faixa de eutrofia (18,5 – 24,9 kg/m
2
).
9. IMC na faixa de sobrepeso (25,0 – 29,9 kg/m
2
) aceito somente em indivíduos com
percentual de gordura corporal abaixo de 15%
(110)
.
34
3.3 Etapas do estudo
Figura 5. Etapas do estudo. TCLE: termo de consentimento livre e esclarecido; R: randomização
Estudo da Microcirculação
Ensaio Clínico
48 pacientes incluídos
R
Videocapilaroscopia
do Dorso do Dedo
n = 24
R
Videocapilaroscopia
do Leito Ungueal
n = 24
R
Grupo Fase
Cefálica
Grupo
Controle
Grupo Fase
Cefálica
Grupo
Controle
9 pacientes perdidos
(amostras sangüíneas
perdidas) – 18.7%
n = 10 n = 10 n = 10 n = 9
Avaliação Clínica e Antropométrica
Triagem
Questionário de Freqüência Alimentar
68 voluntários recrutados
Avaliação Laboratorial
Triagem
12 pacientes excluídos
(exames alterados) – 17,6%
8 pacientes excluídos
(desistência) – 11,7%
Convite para participação, assinatura
do TCLE e elucidação de dúvidas
35
3.4 Métodos de investigação da microcirculação cutânea
No dia do estudo da microcirculação, os voluntários chegaram ao laboratório, em jejum
noturno de 12 horas e foram acomodados em uma sala com temperatura controlada (24
o
C±1). Os
mesmos foram orientados a evitar bebidas alcoólicas por 48 horas prévias ao exame e também a
evitar uso de medicamentos eventuais no dia anterior ao exame. A pressão arterial foi aferida
usando-se o método auscultatório padrão. Um cateter venoso foi inserido no braço contra-lateral
ao exame e mantido com solução salina sem infusão contínua, com a única intenção de manter
um acesso venoso patente para a coleta de amostras sangüíneas durante o exame. A investigação
da microcirculação foi inicialmente realizada em estado basal, após um período de aclimatação
de 30 minutos. Ao final do exame, o voluntário foi apresentado, conforme randomização, a um
estímulo sensorial (grupo experimental) – uma bandeja de café-da-manhã – ou permaneceu
somente em repouso (grupo controle) sem receber nenhum estímulo. Após 10 minutos, foi
realizada nova videocapilaroscopia, pelo mesmo método realizado no estado basal.
Os voluntários foram divididos aleatoriamente em dois grupos, conforme o protocolo de
investigação da microcirculação [videocapilaroscopia dinâmica de leito ungueal; n = 24 ou
videocapilaroscopia do dorso do dedo (3mm abaixo da cutícula), n = 24]. Da mesma forma,
foram aleatoriamente divididos em dois novos subgrupos, o grupo experimental, que recebeu o
estímulo sensorial (n = 24), e o grupo controle, que não recebeu o estímulo (n = 24) – figura 5.
Foram coletadas amostras de sangue através do cateter venoso do braço contra-lateral para
dosagens de insulina e polipeptídeo pancreático, como marcadores da fase cefálica, em repouso
(antes do início do exame), e nos seguintes tempos após o recebimento ou não do estímulo: 3
minutos, 9 minutos e 15 minutos. No 9
o
minuto, foi iniciada a segunda avaliação da
microcirculação cutânea pela mesma técnica anteriormente realizada. A dosagem de glicose foi
realizada ao final do protocolo como uma medida de controle da glicemia.
Durante todo o exame foi realizado, de forma complementar, o estudo da vasomotricidade
pelo método de laser-Doppler fluxometria (LDF), através de um pequeno sensor fixado no pulso.
Ao final do exame, foi realizada a iontoforese transdérmica de insulina, também pela LDF. Este
exame foi realizado com o propósito de verificar a resposta da microcirculação cutânea à insulina
nos dois grupos.
36
3.4.1 Capilaroscopia do leito ungueal
Para o exame de videocapilaroscopia, o voluntário foi confortavelmente acomodado em
uma cadeira com o braço esquerdo colocado ao nível do coração. O antebraço e a mão esquerdos
(porção dorsal para cima) foram dispostos em repouso sobre uma plataforma acrílica e o 4
o
dedo
foi colocado sobre um pedestal montado em estado X-Y de um microscópio Leica DM/LM
(Wetzlar, Alemanha). O topo do dedo, distal ao leito ungueal, foi gentilmente imobilizado por um
grampo, para impedir mínimos movimentos. Os capilares do leito ungueal foram visualizados por
um microscópio usando epi-iluminação (100 W Xe lâmpada de arco) com um circuito de TV
acoplado a um gravador de DVD (Samsung, Seul, Coréia do Sul). Os exames foram realizados
com gravação contínua da temperatura da pele do dedo, onde um sensor de medição de
temperatura foi posicionado sobre a pele cerca de 1 cm proximal ao leito periungueal.
Medidas morfológicas e funcionais da microcirculação cutânea foram extraídas das
imagens obtidas, conforme o método utilizado. Na videocapilaroscopia dinâmica de leito
periungueal, os diâmetros luminais de alças capilares aferente, apical e eferente no estado basal
foram as medidas morfológicas acessadas e expressam a espessura da coluna de fluxo de
hemácias. Nesse mesmo período, as medidas funcionais acessadas foram: a densidade capilar
funcional, que é o número de capilares perfundidos por campo e a velocidade de deslocamento
das hemácias (VDH). A hiperemia reativa pós-oclusão foi realizada após isquemia de 1 minuto
da base do dedo. Para tal procedimento, na fase prévia ao início do exame, um manguito de
pressão (1 cm largura) foi disposto em volta da falange proximal e conectado a um manômetro de
mercúrio. Nessa fase foram medidos: o pico máximo de incremento da VDH acima do repouso
(VDH
max
) e o tempo para alcançá-lo (TVDH
max
), ambas as medidas diretamente relacionadas à
vasodilatação e ao recrutamento capilar. As medidas foram todas realizadas com o software
CapImage® e já foram previamente aceitas e publicadas
(15)
.
Na videocapilaroscopia de dorso do dedo, realizada aproximadamente 3 mm abaixo do
campo central da cutícula, somente a medida de densidade capilar funcional é acessada, tanto no
37
estado basal quanto após a hiperemia reativa, fornecendo o dado de recrutamento capilar. Este
método é também bastante utilizado e validado em estudos de microcirculação
(113;114)
.
3.4.2 Laser-Doppler fluxometria cutânea e iontoforese transdérmica de insulina
A fluxometria por laser Doppler LDF tem sido usada como medida do fluxo sanguíneo
microvascular há mais de 30 anos
(115)
, inicialmente em tecido retiniano, mas posteriormente
estendido para outros sítios. A LDF é um método para a determinação não-invasiva contínua da
perfusão microvascular. Uma luz de laser de baixa potência incide na superfície do tecido
pesquisado e fótons migram através do tecido de maneira randômica. O padrão exato de imagem
é dependente das propriedades óticas do tecido pesquisado
(116)
. A interação deste com um ou
mais objetos que se movem pelo campo pesquisado, por exemplo, hemácias, desvia os fótons
numa seqüência e em quantidade determinada por um ângulo de desvio, pelo comprimento de
onda da luz do laser e pela velocidade. A técnica permite informações sobre a velocidade das
hemácias no campo e a perfusão, definida como o número de hemácias multiplicado pela
velocidade média dessas células em determinado espaço (campo).
No estado basal, a vasomotricidade (variação rítmica e espontânea do diâmetro de
arteríolas, arteríolas terminais, meta-arteríolas e esfíncteres pré-capilares resultando em fluxo
sangüíneo intermitente nos capilares) parece ser responsável pela regulação do fluxo no leito
capilar. O regulador mais importante da vasomotricidade é a concentração de oxigênio
tecidual
(21)
, mas já foi postulado que a insulina pode também modular a extensão de
vasodilatação e constrição das meta-arteríolas e esfíncteres pré-capilares, no sentido de prolongar
o período de perfusão
(54)
. A investigação da vasomotricidade pode ser realizada através da LDF.
As ondas de vasodilatação e vasoconstrição são medidas em unidades de perfusão convencionais,
e, pela análise espectral, é possível identificar variações na amplitude destas ondas dentro de
diferentes intervalos de freqüências relacionados a fatores envolvidos na vasomotricidade, como
atividade endotelial (0,01–0,02 Hz), neurogênica (0,02–0,06 Hz), miogênica (0,06–0,15 Hz),
respiratória (0,15–0,4 Hz), e cardíaca (0,4–1,6 Hz)
(117)
. Rossi e colaboradores (2005)
(118)
sugeriram que a atividade vasodilatatória da insulina na microcirculação cutânea deve-se, em
38
parte, à sua atuação nas células musculares lisas dos vasos, devido ao aumento diferencial do
espectro miogênico decorrente da iontoforese de insulina.
A liberação de drogas ou substâncias por via transdérmica pode ser estudada por estímulo
iontoforético, que se baseia no conceito de que uma droga, usualmente, carreia moléculas
contendo carga. Esta droga é disposta sob um dos eletrodos colocados na superfície cutânea. Sob
a influência de forças eletro-repulsivas, as moléculas da droga são desviadas em direção oposta
ao eletrodo, para o interior da pele. Tal fato implica que uma droga que sabidamente carreia carga
positiva deverá ser disposta sob um eletrodo positivo (anodo), e opostamente uma droga de carga
negativa sob um eletrodo negativo (catodo). Conseqüentemente, a taxa de penetração de drogas é
bastante aumentada através do estrato córneo impermeável quando comparada à difusão
passiva
(119)
. Neste estudo foi verificada a resposta da microcirculação cutânea à insulina, através
de uma corrente negativa.
3.5 Desenho do estudo
Figura 6. Desenho do Estudo. PA: aferição da pressão arterial.
3.6 Caracterização do estímulo empregado
O estímulo sensorial foi composto de uma refeição de café-da-manhã, com ótima
apresentação visual e aroma, composta por itens alimentares de preferência do indivíduo,
conforme relatado na consulta de triagem, através de pergunta direta ao indivíduo, sem o mesmo
39
saber o motivo da questão. No grupo experimental, a refeição foi posicionada em uma bandeja
bem próximo ao voluntário, no intervalo entre os exames de microcirculação (figura 7). Com
isso, o mesmo recebeu o estímulo sensorial da refeição (visual e olfativo) e foi informado que
poderia ingerir todo o café da manhã, mas somente ao término do segundo estudo da
microcirculação (antecipação do consumo alimentar). O voluntário foi também requisitado a
mascar um chiclete sem açúcar (estímulo oral). Antes do consumo do chiclete, no entanto, foi
realizada a medida de salivação, com um marcador de salivação oral padrão (Teste de Schirmer,
Ophtalmos, São Paulo), durante um minuto, para ser comparada com a mesma medida realizada
no período basal. O grupo controle não recebeu nenhum estímulo, ficando apenas na mesma
posição, até o início da segunda videocapilaroscopia.
Figura 7. Imagem do estímulo sensorial.
3.7 Método estatístico e análise
Todas as variáveis foram avaliadas para identificar a natureza de sua distribuição e testes
paramétricos e não-paramétricos foram aplicados de acordo. A comparação das variáveis clínicas
entre grupos foi realizada aplicando-se o teste t de Student. As variáveis microcirculatórias
tiveram distribuição não-paramétrica. Assim, diferenças intra-grupos pré- e pós-estímulo foram
avaliadas aplicando-se o teste pareado de Wilcoxon e medidas repetidas foram analisadas através
40
do teste de Friedman, com aplicação do teste post hoc de Dunn. As diferenças entre grupos foram
analisadas através do teste U de Mann-Whitney. Associações entre consumo alimentar e
recrutamento capilar foram avaliadas através do teste de correlação de Spearman. O nível de
significância adotado para as análises foi de 0,05.
41
4 RESULTADOS
4.1 Artigo 1: Relações entre fase cefálica da digestão e microcirculação
THE CEPHALIC PHASE OF DIGESTION IS ASSOCIATED TO MICROVASCULAR
REACTIVITY IN HEALTHY MEN
Caroline Buss, Luiz Guilherme Kraemer-Aguiar*, Priscila Alves Maranhão, Carolina Marinho,
Maria das Graças Coelho de Souza, Nicolas Wiernsperger, Eliete Bouskela
Clinical and Experimental Research Laboratory on Vascular Biology – BioVasc, Biomedical
Center, State University of Rio de Janeiro
ABSTRACT
Objectives: To assess the occurrence of capillary recruitment secondary to cephalic phase of
insulin secretion (CPIS) in healthy subjects.
Design and Method: This was a randomized clinical trial. After clinical and laboratorial
assessment and a 12-hour fast, 39 healthy subjects with mean age of 23.4± 0.5 years (mean±SD)
and BMI of 23.3±2.3 kg/m
2
underwent two nailfold videocapillaroscopies, with an interval of 10
minutes between them. In this interval, according to randomization, they were subjected to a
great-looking breakfast tray (CPIS group, n=20) or nothing (control group, n=19). There were no
differences between baseline clinical characteristics between groups. Microcirculatory parameters
assessed by dynamic nailfold videocapillaroscopy at resting and after 1 min ischemia (post-
occlusive reactive hyperemia – PORH) were: basal functional capillary density (FCD), resting
red blood cell velocity (RBCV), peak RBCV (RBCV
max
) during PORH and time taken to reach it,
as well as peak FCD. Results were obtained from DVDs analyzed by the CapImage® software
by a trained researcher blinded to the stimulus received.
Results: Basal functional capillary density (FCD, cap/mm
2
) significantly increased in the CPIS
group (19.2±9.2 to 21.6±9.5 or 12.2%, p = 0.005), as well as peak FCD (20.4±9.5 to 23.7±10.7,
p=0.002), but not in the control group. Additionally, the CPIS group also showed an increase in
RBCV (0.306±0.031 to 0.330±0.027 mm/s, p=0.005) and in RBCV
max
(0.336±0.029 to
0.398±0.292 mm/s, p=0.005) while TRBCV
max
decreased (4.9±1.5 to 3.5±1.2 s, p=0.01]. None of
these microvascular variables changed significantly in the control group. Pancreatic polypeptide
secretion was significantly increased in the CPIS group and positively correlated to the increase
in basal functional capillary density (rho = 0.527, p=0.03).
Conclusion: The cephalic phase of digestion, expressing mainly endogenous physiological
secretions and parasympathetic stimulation, without nutrient absorption bias, was associated to
microvascular reactivity in healthy men, suggesting that microcirculation during this phase may
play a key role in the physiology of digestion and glucose homeostasis.
42
Key-words: cephalic phase of digestion, insulin secretion, microvascular reactivity, functional
capillary density
Funding: The National Council for Scientific and Technological Development (CNPq).
(141690/2008-9); The State of Rio de Janeiro Carlos Chagas Filho Research Foundation
(FAPERJ); Financing Agency of Studies and Projects (FINEP) and Coordination for the
Enhancement of Education Personnel (CAPES)
ClinicalTrials.com ID: NCT01145027
*corresponding author
INTRODUCTION
The cephalic phase of digestion occurs before food consumption, lasting approximately
ten minutes
(1-6)
. It results from the sight, smell, thought, or taste of food, and the greater the
appetite, the more intense is the stimulation
(2)
. Neurogenic signals which originate in the cerebral
cortex and in appetite centers of the amygdala and hypothalamus are transmitted through the
vagus nerve to the stomach and pancreas. When the sensory stimuli reach the nucleus of the
solitary tract through neural transmission, by activation of vagal-efferent fibers, it elicits the
release of hormones from the endocrine pancreas. These released hormones through cephalic
phase reflexes are dependent on neural rather than nutrient-induced stimulation
(6;7)
.
The cephalic phase of insulin secretion (CPIS) seems to have a fundamental role for the
establishment of normal glucose tolerance
(3;8)
, as it is able to determine an increment on insulin
levels on pre-absorptive phase of digestion
(9)
. This early secretion supposedly promotes tissue
sensitization to insulin and thus activation of membrane receptors which trigger the intracellular
signaling cascade, allowing the metabolic pathways for substrates from digestion and ATP
formation. Physiologically, CPIS is fundamental for nutrient digestion since it promotes an early
supply of insulin to tissues responsible for glucose metabolization
(8)
, priming target tissues to the
metabolic action of insulin.
It has been described that insulin is able to promote capillary recruitment, peripheral
vasodilatation and regional blood flow increase
(10-12)
. All available data result from exogenous,
yet in physiological levels, of insulin infusion. Increased nitric oxide (NO) bioavailability
secondary to insulin endothelial action is responsible for such actions
(13)
. The hemodynamic
43
action of insulin is being considered fundamental for normal glucose tolerance. We have
previously published that microvascular dysfunction plays a role on glucose homeostasis
(14)
and
impaired capillary recruitment seems to be involved on insulin resistance due to impaired tissue
perfusion
(15-17)
. Hence, hemodynamic and metabolic action of insulin are complementary and
coupled
(18)
, promoting increased tissue perfusion and resultant glucose supply and its exposure on
target tissue, i.e. muscle; previously sub-perfused on its resting state
(19)
.
Under basal conditions, vasomotion (the intermittent contraction of metarterioles and
precapillary sphincters every few seconds that leads blood to flow intermittently through
capillaries) appears to determine the extent of vasodilation of terminal arterioles and thus, the
extent to which a capillary bed is perfused. The most important factor that affects the degree of
opening and closing of metarterioles and precapillary sphincters is the tissue oxygen
concentration, but it has also been postulated that insulin may modulate their dilation or
constriction rate constantly, in order to extend the perfusion period
(17)
.
Although hemodynamic effects of insulin have already been proved and well-
tested
(18;20;21)
, studies investigating capillary recruitment due to endogenous human insulin
secretion are lacking and would definitely establish if real fine tune physiological insulin
secretion would act on the microvasculature. The objective of this study was to assess the
occurrence of capillary recruitment secondary to the cephalic phase of insulin secretion in healthy
male subjects.
METHODS
Study design, subjects and setting
This was a randomized clinical trial. Forty-eight healthy subjects aged between 18 and 30
years were selected after clinical and laboratorial assessment. The study was carried out in
Clinical and Experimental Research Laboratory on Vascular Biology at the State University of
Rio de Janeiro. Subjects went through a screening phase before being eligible to participate,
which consisted of clinical and biochemical assessment. All participants gave their written
44
informed consent. The study was approved by the institutional ethics committee. GPower 3.1.10
software was used for power analysis and sample size estimation. The statistical power for
comparisons between two dependent groups was above 0.8 with an α-error probability of 0.05
for functional capillary density, estimating a sample size of 14 per group.
On screening day one, subjects were asked about their medical history, family history of
diseases and eating habits. The anthropometrical assessment comprised measurements of weight,
height and percentage of body fat (Jackson and Pollock’s skin-fold thickness protocol
(22)
) by a
trained dietitian. Subjects who smoked, had high blood pressure (greater than or equal to 130 x
85 mmHg) or any clinical condition were not included in the study. Subjects with BMI lower or
higher than the limits of 18.5 - 24.9 kg/m
2
were excluded and with BMI on the overweight range
(25.0 - 29.9 kg/m
2
) were included only if percentage of body fat was below average (<15%) for
male adults
(22)
. On day two, after a 12-hour overnight fast, they went through biochemical
assessment. Fasting glucose and fasting insulin, haemogram, total cholesterol, triglycerides,
LDL-c, VLDL-c, HDL-c, alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) and
creatinine were assessed. A 75-g oral glucose tolerance test was also performed. Subjects
presenting any degree of glucose intolerance according to ADA criteria
(23)
, or any other altered
biochemical results, were excluded.
Forty-eight subjects were recruited. On the day of the trial, volunteers arrived at the
laboratory after a 12-h overnight fast. They were accommodated in a temperature-controlled
room (24 ± 1ºC), on the exam chair. Their blood pressure was checked using the standard
auscultatory method and a blood sample was drawn to assess basal levels of glucose, insulin, and
pancreatic polypeptide. After a 30-min acclimatization period, the experiment began. Subjects
underwent two nailfold videocapillaroscopies, with an interval of 10 minutes between them
(figure 1). During the interval, according to randomization, they were subjected to a sensorial
stimulus (CPIS group, n=24) or nothing (control group=24).
45
Figure 1. Trial design
Sensorial stimulation to trigger the cephalic phase of insulin secretion
The aim of the stimulus was to trigger the cephalic phase of insulin secretion. We have
used senses of sight and smell by placing in front of the volunteer a great looking breakfast tray,
where he could see and smell it continuously, but not eat it, except after the end of the exam.
Additionally, cognitive stimuli were attempted by stimulating thoughts and talking about the
volunteer’s food preferences.
A sugar-free chewing gum was also given to subjects presented to the sensorial stimulus
to elicit oral stimulation. A salivation marker (Shirmer Test Stripes, Ophtalmos) was used to
measure it during one minute at baseline and upon presentation of the stimulus (or at time 0 for
the control group). Blood samples were drawn at baseline and 3, 9 and 15 minutes after the
stimulus presentation (or after the end of the first videocapillaroscopy in the control group) for
assessing insulin and pancreatic polypeptide levels. This time frame was selected according to
literature evidence of insulin and pancreatic polypeptide peaks during the cephalic phase
(24-26)
.
Glucose levels were also assessed for control basally and at minute 15.
46
Microvascular function assessment
Subjects were seated comfortably in a fixed, high-base chair with the left upper arm raised
at heart level. The forearm and hand (dorsal side up) were rested upon a pedestal and the fourth
finger supported on an acrylic base, 2 cm above the palm level, mounted on the x-y stage of a
three-eyepiece Leica DM/LM microscope (Wetzlar, Germany), equipped with an epiillumination
system (100 W Xenon lamp). A CCD video camera (Samsung, Seoul, South Korea) was coupled
to the microscope and connected to a DVD recorder (Samsung, Seoul, South Korea) and a Kodo
KBM1700E monitor (Seoul, South Korea). The fingertip was fixed to the acrylic base by a metal
loop to minimize movements. The skin temperature of the finger was monitored throughout the
examination with an YSI Precision 4000A digital thermometer (Dayton, U.S.A.) with the
thermistor probe taped within 1 cm proximal to the nailfold. A drop of mineral oil was spread
over the observation site to improve image quality by diminishing divergence of reflected light. A
pressure cuff (1 cm wide) was placed around the proximal phalanx and connected to a mercury
manometer. The exam was continuously recorded on DVDs for later measurements of
microcirculatory parameters using the CapImage software
(27)
, always by the same observer
blinded to the stimulus (data entry records were codified, so at the time of analysis the observer
did not know to which group the patient was assigned).
Two different approaches were applied when recording the nailfold area, for which the
subjects were also randomized. The dynamic videocapillaroscopy recorded capillaries according
to a standardized, validated methodology on the fourth finger of the left hand
(28;29)
, which
assesses functional capillary density (FCD), number of capillaries/unit tissue area (mm
2
)
with
flowing red blood cells, using x250 magnification and an area of 3 mm of the distal row of
capillaries into the central portion of the nailfold. It also provides data on capillary diameters
[afferent (AF), apical (AP) and efferent (EF)], red blood cell velocity (RBCV) recorded at rest,
after 1 min arterial occlusion (RBCV
max
) and the time taken to reach it (TRBCV
max
) measured
with a final magnification of x680, before and during the post-occlusive reactive hyperemia
response. The other videocapillaroscopy method applied assesses only functional capillary
density (FCD). It has been validated and described elsewhere
(30;31)
. Briefly, it estimates baseline
capillary density by counting the number of continuously erythrocyte-perfused capillaries during
47
a 15-second period. Post-occlusive reactive hyperemia is also used to assess capillary
recruitment after 4-min ischemia.
Skin microvascular blood flow
Laser Doppler instruments measure net red blood cell flux (in arbitrary units [PU]) as the
product of concentration of moving blood cells, and velocity, in a localized skin area of
approximately 1mm. The laser Doppler transmits low-power laser light (780 nm) to the tissue via
a fiber-optic probe and penetrates the skin into a depth of 0.4 to 1.0 mm. The extent of light
penetration allows evaluation of skin blood flow in capillaries, arterioles and venules, as well as
anastomosis of deeper blood vessels in the dermal layers of the skin. Thus, laser Doppler
flowmetry measures thermoregulatory (i.e., nonnutritive) skin blood flow
(32)
. The laser Doppler
device was calibrated weekly against a PF1001 Motility Standard (Perimed AB, Stockholm,
Sweden), a colloidal suspension of latex particles, which provides a standardized perfusion value
equivalent to 250 arbitrary units ± 5%.
Skin microvascular vasomotion
Vasomotion was recorded throughout the experiment (approximately 30 minutes) using
laser Doppler Flowmetry, with the laser Doppler probe positioned at the dorsal side of the wrist
of the non-dominant arm. A bandpass filter with cut-off frequencies at 20 Hz and 20 kHz, and a
time constant of 0.2 s, was selected. Fast Fourier transform analysis was performed by means of
Perisoft dedicated software (PSW version 2.50, Perimed, Sweden) in order to determine the
contribution of different frequency components to the variability of the laser Doppler signal. On
the basis of recent studies
(21;33)
, the frequency spectrum between 0.01 and 1.6 Hz was divided into
five frequency intervals which are respectively thought to contain: (1) endothelial (0.01–0.02
Hz); (2) neurogenic (0.02–0.06 Hz); (3) myogenic (0.06–0.15 Hz); (4) respiratory (0.15–0.4 Hz)
48
and (5) heart beat frequency (0.4–1.6 Hz) activities. The absolute amplitude variations within
each frequency band was analyzed, as well as normalized values, which are the interval mean
amplitude divided by the total spectrum mean amplitude
(33)
.
Insulin Iontophoresis
All subjects were subjected, at the end of study protocol, to transdermal iontophoresis of
insulin [1.8 µl of solution: Humulin-R, Lilly, diluted (1/10) in deionized water], in order to check
their responses to exogenous insulin. The iontophoresis probe (PF-457) was placed on the
proximal side of the forearm, and insulin was delivered with a cathodal current during 12 doses
(0.2 mA for 20s) with 40s interval between each dose
(34)
. Baseline skin blood flow was recorded
for 2 min before the protocol started. The increment in flow was calculated as percent increase of
area under the curve (AUC) subtracting baseline AUC from plateau AUC, reached in the last two
doses of insulin.
Laboratory Analyses
All laboratory measurements were performed in duplicate after a 12-h fast by an
automated method (Modular Analytics E 170 and P, Roche, Basel, Switzerland) except for
pancreatic polypeptide (PP), for which human enzyme-linked immunosorbent assay Kit
(Millipore, USA) was used. More specifically addressing the assays on the day of the trial, serum
insulin levels were analyzed by eletrochemiluminescence, plasma glucose levels by GOD-PAP
(enzymatic-colorimetric oxidase-peroxidase method) and serum PP by ELISA. Inter-assay
coefficients of variation were 10.6%, 1.1% and 8.5%, respectively.
49
Outcomes and Statistical analyses
The main outcomes of the trial were the differences between microvascular parameters
assessed pre- and post-stimulus, such as basal capillary density, peak capillary density at PORH,
afferent, efferent and apical diameters of the capillary loops, resting red blood cell velocity
(RBCV), peak RBCV during PORH (RBCV
max
) and time taken to reach it (TRBCV
max
) assessed
by nailfold videocapillaroscopy; and changes in non-nutritive microflow and vasomotion
frequencies assessed by laser-Doppler flowmetry. Increases in insulin, pancreatic polypeptide and
salivation were expected outcomes pointing to successful cephalic phase outcome.
All variables were checked for normality and appropriate tests were applied when
required. Clinical baseline variables had normal distribution and groups were compared using
Student T test. Most microvascular and biochemical outcomes were non-parametric. Differences
intra-groups pre- and post-stimulus were analyzed using Wilcoxon matched-pairs test and
repeated measures were analyzed using Friedman test followed by pos-hoc Dunn’s test.
Comparisons between groups were assessed through Mann-Whitney test. The significance level
adopted was 0.05. Results are presented as mean (standard deviation) unless stated otherwise.
RESULTS
Thirty-nine subjects, age 23.4±0.5 years, BMI 23.3±2.3 kg/m
2
and body fat 13.6±5.2%,
were included in the analyses. At baseline, no significant differences in clinical characteristics
were noticed between the control and the experimental (CPIS) groups (table 1). Blood samples of
9 (18.7%) subjects [5 in the control and 4 in the CPIS group] were not assessed due to poor
sample quality. There were no differences between excluded and included subjects (data not
shown).
50
Table 1. Comparison of anthropometric and clinical characteristics between the control and
experimental (CPIS) groups at baseline.
Control Group
(n=19)
CPIS Group
(n=20)
Mean
(SD) 95%CI Mean
(SD) 95%CI
Age (y) 23.2
(2.7) 21.8 – 24.5 23.7
(3.4) 22.1 – 25.3
BMI (kg/m2) 23.3
(2.1) 22.3 – 24.3 23.3
(2.5) 22.1 – 24.5
Body Fat (%) 14.3
(5.1) 11.9 – 16.8 12.9
(5.3) 10.4 – 15.4
Waist Circumference (cm) 83
(5.3) 80.8 – 85.9 82.5
(6.6) 79.4 – 85.6
Fasting Glucose (mg/dl) 84
(5.3) 81.3 – 86.4 84
(5.8) 80.9 – 86.4
OGTT (mg/dl) 81
(18.6) 72.2 – 90.1 74
(18.8) 65.1 – 82.7
Insulin (µU /dl) 7
(2.3) 5.8 – 8.0 6
(1.9) 5.0 – 6.7
Total Cholesterol (mg/dl) 152
(29.0) 138.3 – 166.2 141
(26.4) 129.0 –
153.7
HDL-c (mg/dl) 49
(7.3) 46.2 – 53.2 48
(7.1) 45.0 – 51.6
LDL-c (mg/dl) 87
(24.6) 75.8 – 99.5 80
(25.2) 68.5 – 92.1
TG (mg/dl) 74
(29.0) 60.0 – 88.1 61
(17.4) 53.3 – 69.7
OGTT: oral glucose tolerance test; HDL-c: high density lipoprotein cholesterol; LDL-c: low density lipoprotein cholesterol; TG:
triglycerides
Basal functional capillary density (FCD, cap/mm
2
) significantly increased in those
volunteers exposed to breakfast tray while it did not change in controls, respectively: 19.2±9.2 to
21.6±9.5 or 12.2% increment, p=0.005 and 15.6±9.9 to 16.1±9.9 or 3.2% increment, p=0.2. Peak
FCD during PORH increased in the CPIS group (20.4±9.5 to 23.7±10.7 cap/mm
2
, p=0.002) but
not in the control group (16.1±9.5 to 16.5±9.9 cap/mm
2
, p=0.38). Additionally, in the CPIS
group we could also demonstrate an increase in RBCV (0.306±0.031 to 0.330±0.027 mm/s,
p=0.005) and in RBCV
max
(0.336±0.029 to 0.398±0.292 mm/s, p=0.005) while TRBCV
max
decreased (4.9±1.5 to 3.5±1.2 s, p=0.01). None of these microvascular variables changed in the
control group (table 2). No significant differences were detected between afferent, efferent and
apical diameters of capillary loops when analyzing data from the dynamic capillaroscopy. Skin
51
temperature of subjects, measured by the thermistor probe placed close to the recording site, did
not change significantly throughout the protocol (CPIS group, p=0.6; control group, p=0.5).
Table 2. Microcirculatory parameters in the control and experimental (CPIS) groups, pre- and
post-stimulus presentation.
Control Group
(n=19)
CPIS Group
(n=20)
Pre Post Pre Post
Mean
(SD) Mean
(SD) Mean
(SD) Mean
(SD)
Resting FCD
(cap/mm
2
)
15.6
(9.9) 16.1
(9.9) 19.2
(9.2) 21.6
(9.5)
a
PORH FCD
(cap/mm
2
)
16.5
(9.5) 16.5
(9.9) 20.4
(9.5) 23.7
(10.7)
b
RBCV
(mm/s)
0.329
(0.018) 0.328 (0.019) 0.306
(0.031) 0.330
(0.027)
a
RBCV
max
(mm/s)
0.362
(0.021) 0.360
(0.023) 0.336 (0.029) 0.398
(0.030)
a
TRBCV
max
(s)
3.7
(0.6) 3.8
(0.8) 4.9
(1.5) 3.5
(1.2)
c
Peak Flow
(PU)
19.5
(9.0) 20.5
(11.0) 23.5
(14.3) 26.9
(15.8)
c
FCD: functional capillary density; PORH: post-occlusive reactive hyperemia; RBCV: red blood cell velocity; RBCV
max
: peak red
blood cell velocity; TRBCV
max
: time taken to reach RBCV
max
; PU: perfusion units.
Differences pre- and post-stimulus:
a
p = 0.005;
b
p = 0.002;
c
p = 0.01
The assessment of blood flow by laser-Doppler flowmetry showed a significant increase
in peak flow (perfusion units) in the CPIS group (23.5±14.3 to 26.9±15.8, p=0.01), but not in the
control one (19.5±9.0 to 20.5±11.0, p=0.8) (table 2). Baseline peak flow was not different
between groups (p = 0.65). Vasomotion showed no significant differences in the frequency
intervals and total frequency spectrum between CPIS and control groups, respectively,
endothelial (0.97±0.79 vs. 0.85±0.35 PU/Hz, p=0.7), neurogenic (0.78±0.53 vs. 0.66±0.28
PU/Hz, p=0.9), myogenic (0.83±0.60 vs. 0.57±0.45 PU/Hz, p=0.1), respiratory (0.39±0.37 vs.
0.27±0.29 PU/Hz, p=0.3), heart beat (0.20±0.15 vs. 0.13±0.10 PU/Hz, p=0.1), and total
52
(58.3±42.5 vs. 41.3±31.3 PU/Hz, p=0.2) frequencies. These comparisons remained non-
significant after normalization of values
(33)
. Microvascular responses to transdermal iontophoresis
of insulin were not different between CPIS and control groups, with both showing increments
respectively [as median (p25; p75)] of 126.5 (38.6; 354.4) % and 90.2 (34.3; 395.5) %, p=0.65.
Baseline biochemical markers of cephalic phase of insulin secretion were not significantly
different between control and CPIS groups. Respectively, insulin levels [as median (p25; p75)]
were 6 (5; 9) µU/ml and 6 (4; 8) µU/ml, p=0.7; and pancreatic polypeptide levels were 162.4
(72.3; 283.3) pg/ml and 439.6 (111.3; 1149.6) pg/ml, p = 0.08. From minute 3 to 15, when
markers were expected to rise, no significantly different changes were detected in insulin (table
3). However, PP significantly increased in the CPIS group while it remained unchanged in the
control one (median percentages: 2.4% and 0%, respectively; p=0.02). In addition, salivation, a
clinical marker of CPIS, which was also not different between groups at baseline (p=0.73)
significantly increased in the CPIS group but not in the control one (median percentages: 100%
and 0%, respectively; p<0.001). The groups showed no differences in glucose levels at 15
minutes (p=0.07).
Table 3. Changes in Markers of Cephalic Phase of Insulin Secretion, from minute 3 to 15.
Control Group
(n=19)
CPIS Group
(n=20)
Delta % Delta %
Median (p25; p75) Median (p25 ;p75) p
a
Insulin
(µU/ml)
0 (-1; 1) 0 (-17; 20) - 1 (-2; 1) -9 (-33; 20) 0.18
PP
(pg/ml)
0.12 (-41; 15.3) 0 (-9.6; 4.5)
3.2 (-29; 32.3)
2.4 (-3.4; 6.3) 0.02
a
Mann-Whitney Test Difference between groups; PP: Pancreatic Polypeptide
53
Analyses of correlation were performed in order to detect which changes in biochemical
markers of cephalic phase of pancreatic secretion were associated to changes in capillary
recruitment. These analyses revealed that changes in PP from minute 3 to 15 were positively
associated to changes in basal capillary density in the CPIS group (rho = 0.527, p=0.03), but not
in the control one (figure 2). PP results of four patients in each group did not reach the assay
sensitivity (12.3pg/mL) and were therefore excluded from the analyses, which did not
compromise balance between groups.
Figure 2. Spearman’s rank correlation between change in pancreatic polypeptide during
cephalic phase stimulation (minutes 3 – 15) and basal capillary density (BCD) between group
DISCUSSION
This study attempted to assess for the first time, to the best of our knowledge, the
association between physiological secretion of insulin during the cephalic phase of digestion and
microvascular reactivity in order to establish the involvement of microcirculation on human
physiology in the pre-absorptive phase of digestion. Our findings support that at pre-absorptive
stages of digestion there is not only an activation of gastro-intestinal endo- and exocrine
secretions but also, and concomitantly, an improvement of skin microflow. Although, for human
54
physiology, it seems to be evident the need of a higher amount of tissue perfusion to allow the
exchange of nutrients, until now there was no data demonstrating the microvascular role before
nutrients absorption. Rather than insulin, our data suggest that pancreatic polypeptide (PP) may
have a role in this phase.
In fact, one recent study in rats has shown that human PP evoked concentration-dependent
relaxation of mesenteric small arteries by activation of prejunctional neuropeptide Y
1
-like
receptors followed by release of calcitonin gene-related peptide and of endothelium-derived nitric
oxide (NO)
(35)
. Another study in cats also provides evidence for a direct vascular action of
acetylcholine secondary to parasympathetic stimulation, as well as an indirect vasodilator effect
of vasoreactive intestinal peptide via NO formation
(36)
. If the microcirculatory reactivity
demonstrated in our study is due to both effects, as well as some insulin action (although its rise
was not detected during cephalic phase) will be a subject of further investigation. But according
to our findings, possibly not only insulin
(12)
but other gastro-intestinal peptides, like PP, could
have their role on vascular tissue during cephalic phase of digestion.
The lack of rising of insulin levels on the experimental group was a disappointing
outcome. However, this was not unexpected, in light of previous and pioneering studies of
cephalic phase of insulin secretion, which have showed high-, low-, and negative responses of
insulin secretion to food sensorial stimulation in healthy subjects
(2;37)
. The accentuated rise in PP
in the experimental group gives us evidence of successful stimulation of cephalic phase of
digestion. In fact, some studies show that even in the absence of insulin rise during cephalic
phase, PP increases
(6)
. Its secretion is almost exclusively dependent on vagal stimulation, which
releases acetylcholine in the pancreatic islet cells, also promoting the secretion of insulin and
glucagon. The main clinical finding to assure that our experimental group was really stimulated
by the thought, sense or anticipation of food intake
(9)
, corroborating the activation of
parasympathetic system, was the significant rise of exocrine secretion of the salivary glands.
The theoretical framework behind our study is that type 2 Diabetes Mellitus, metabolic
syndrome and abdominal obesity are clinical conditions with a common altered
pathophysiological key: reduced insulin sensitivity. Insulin resistance (IR) and its secondary
hyperinsulinaemia are known causal factors of endothelial and microvascular dysfunction
(18)
. The
classical concept is that IR occurs primarily due to insulin receptor and post-receptor defects.
However, current evidence indirectly suggests that endothelial dysfunction may have reciprocal
55
cause-effect factor on IR not yet established
(16)
. Consequently, there could be a pre-receptor
defect lowering insulin availability and hence substrate (mainly glucose) for the tissues
(17)
.
Although the upcoming study in our research line is to assess possible microvascular
responsiveness disturbances due to cephalic phase of digestion in states of obesity and metabolic
syndrome, we first needed to assess it in healthy individuals.
Cutaneous blood flow is a dynamically fluctuating biological variable, which possesses
substantial spatial heterogeneity. Nonetheless, our results have demonstrated activation of
microcirculation in different sites assessed by distinct techniques, suggesting an involvement of
the microcirculation in the cephalic phase of digestion. Despite the fact that microcirculatory
assessment techniques in skin does not clearly expresses the physiological and
pathophysiological alterations displayed in muscle tissue, the inference of findings in cutaneous
tissue might bring new concepts in glucose homeostasis and its relation to microcirculation. As
wisely pointed out by Holowatz et. al.
(38)
, cutaneous microvascular responses integrate neural,
endothelial and vascular smooth muscle contributions, and these complex interactions in vascular
signaling are the nature of in vivo human integrative physiology, regardless of the vascular bed is
being studied. Adding data to this point of view, we have previously demonstrated that
microvascular dysfunction tested on skin had a role on glucose homeostasis on women with
excessive adiposity but at non-glycemic milieu
(14)
. In addition, the resulting increase in resting
functional capillary density following the sensorial stimulus is worth noting as a consequence of
the cephalic phase per se, apart from the compound stimulus involved in reactive hyperemia.
The confirmed involvement of microcirculation in the cephalic phase of digestion
observed in our study comes from the evidence of increased blood microflow and perfused
capillaries throughout different techniques applied. The assessment of nutritive skin
microcirculation by skin nailfold videocapillaroscopy was performed by two distinct methods
well-validated and used by research groups worldwide
(15;30)
, in order to supply as many
parameters as possible for analyses, i.e. functional capillary density as well as the dynamic
assessment of capillaries microflow. Laser Doppler flowmetry measurements were applied for
analyses of flow at another site (wrist). Yet still measuring skin microvascular perfusion, laser
Doppler probes kept skin temperature constant, ruling out the possibility of having temperature as
a confounding factor on non-nutritive skin microflow. This technique confirmed the occurrence
of increased microflow following the sensorial stimulus. In addition, skin insulin iontophoresis
56
was performed on both groups at the end of the protocol. At this time point, we avoided
exogenous insulin disturbances on microvascular reactivity and confirmed that the healthy
volunteers, on both tested groups, had the same microvascular responsiveness to insulin. The lack
of differences in vasomotion between groups after the stimulus presentation may be due to the
absent response of insulin secretion in the CPIS group.
Physiologically, our results bring up an important novel finding but lacks to definitively
establish the role of endogenous insulin and its effect-cause relationship to microcirculatory
activation on the pre-absorptive phase of digestion and must be kept as a hypothesis, since the
clear exogenous insulin action on microcirculation at fasting state
(17;21)
has been already
described. This might be due to limitations in our study. A previous pilot protocol on the same
study subjects would have been useful to first assess responsiveness of subjects in terms of
insulin release to sensorial stimulus. Additionally, continuous blood sampling might also be
needed for more sensitive insulinemia measurements. Another possible explanation for the
improved microvascular reactivity observed is the effect of parasympathetic stimulus generated
by the sensorial stimulation of food, acting on microcirculation while it does so in exocrine
secretions of the gastro-intestinal tract
(39)
. On the basis of our findings we might suggest that the
effect of endocrine secretions themselves, secondary to the same vagal stimulation
(39)
, expressed
as pancreatic polypeptide, was positively correlated with an increase in basal capillary density. It
should be highlighted that our study was not designed to elucidate such mechanisms, and so,
according to our aims we demonstrated in humans for the first time that skin nutritive
microcirculation is activated even at pre-absorptive phase of digestion. Future protocols, perhaps
using unhealthy humans, especially those in states of insulin resistance should be tested to
establish the role of microvascular dysfunction and gastrointestinal peptides on this precocious
phase of microvascular reactivity and glucose homeostasis.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors wish to thank Diogo Silva Francisco,
Yasmine Rangel Vieira, Monique Pacheco
Duarte Carneiro
for excellent technical assistance.
57
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60
4.2 Artigo 2: Associações entre componentes alimentares e recrutamento capilar
LONG-TERM DIETARY INTAKE OF SELENIUM, CALCIUM AND DAIRY
PRODUCTS IS ASSOCIATED WITH CAPILLARY RECRUITMENT IN HEALTHY
YOUNG MEN
Caroline Buss, Luiz Guilherme Kraemer-Aguiar*, Priscila Alves Maranhão, Carolina Marinho,
Eliete Bouskela
Clinical and Experimental Research Laboratory on Vascular Biology – BioVasc, Biomedical
Center, State University of Rio de Janeiro
ABSTRACT
Objectives: To identify associations between long-term (1 year) food intake and skin nutritive
microvascular function in healthy subjects.
Design and Method: This was a cross-sectional study. A validated 88-item food-frequency
questionnaire (FFQ) was administered to 39 healthy subjects aged 23.4±0.5 years, BMI 23.3±2.3
kg/m
2
and 13.6±5.2% of body fat, who reported food intake during the last year and underwent a
nailfold videocapillaroscopy exam. The main outcome variable was the increase in functional
capillary recruitment (FCR), i.e., peak capillary density after post-occlusive reactive hyperemia
subtracted from basal capillary density (caps/mm
2
). Microvascular parameters were obtained
from DVDs analyzed by the CapImage® software. Associations between reported food intake
and FCR were investigated.
Results: Daily average estimates of intake were: total energy (TE) (3745±1365 kcal),
carbohydrates (60.1±5.9 % TE), lipids (22.1±4.4 % TE), proteins (17.8±4.1 % TE), fibers
(33.9±18.5 g) and cholesterol (492.8±209.6 mg). Vitamin K, complex-B vitamins, calcium,
magnesium and zinc intakes were above the dietary recommended values (DRIs), while anti-
oxidant vitamins, such as C and E and minerals such as iron, copper and selenium were below
DRIs. Positive significant correlations with capillary recruitment were found for selenium (as
µg/d/1000kcal; rho=0.3412, p=0.038,) calcium (as mg/d/1000kcal; rho=0.3390, p=0.043), and
percentage of TE from dairy (rho=0.3660, p=0.023).
Conclusion: Although being healthy, the sample presented poor dietary habits with high
cholesterol intake and low intake of selected vitamins and minerals. Long-term intakes of
selenium, calcium and dairy products were positively associated to capillary recruitment in skin
nutritive microcirculation in healthy young men.
Key-words: food intake, capillary recruitment, functional capillary density
Funding: National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq), (141690/2008-
9); State Agency to Finance Research (FAPERJ) and Financing Agency of Studies and Projects
(FINEP)
*corresponding author
61
INTRODUCTION
The function of blood circulation is to service the needs of body tissues — to deliver
nutrients, to transport waste products away, to conduct hormones from one part to another, and,
in general, to maintain an appropriate environment for optimal survival and function of cells. It
is in the microcirculation where the most purposeful function of the circulation occurs: diffusion
of substances back and forth between blood and tissues
(1)
.
The endothelium is a single layer of cells on the surface of the vascular wall. In response
to changes in the blood stream (shear stress, changes in lipid or hormone concentrations) it
secretes vasodilators (e.g. nitric oxide, prostacyclin) and vasoconstrictors (e.g. endothelin-1,
angiotensin II) to regulate vascular tone. The healthy endothelium is crucial for preventing early
steps in the development of diseases such as atherosclerosis and diabetes
(2;3)
. Dietary factors
regularly ingested by healthy subjects have been associated to endothelial function, suggesting
that some antioxidant-rich food would highly influence endothelium homeostasis
(4)
. Healthy
eating patterns such as the Mediterranean diet represent a therapeutic strategy to reduce
inflammation and associated metabolic and cardiovascular risks
(5)
.
There are evidences that endothelial function may be altered within a few hours after
certain food items intake, suggesting that dietary factors are involved in the prevention and
progression of cardiovascular disease
(2)
. It has been shown that pharmacological
(6;7)
and also non-
pharmacological
(8;9)
strategies are able to improve endothelial and microcirculatory function.
Non-pharmacological interventions such as physical activity, smoking cessation and nutritional
factors have been associated with enhanced vascular function
(10)
. Among the latter, fatty acids,
anti-oxidants, L-arginine, folic acid and soy protein have been the most studied components of
diet
(8;11)
.
The aim of this study was to assess, in healthy subjects, which nutrients regularly ingested
might exert some influence on microvascular function. In the absence of disease, the study of
such associations may add knowledge to prevention strategies regarding nutritional counseling, in
order to avoid early disturbances which might develop to microvascular dysfunction possibly
preventing cardiovascular disease and diabetes.
62
METHODS
This was a cross-sectional study. Thirty-nine healthy subjects aged between 18 and 30
years were included in the analyses. The study was carried out at the Clinical and Experimental
Laboratory on Vascular Biology at the State University of Rio de Janeiro. Before being enrolled,
the subjects went through a screening phase which consisted of clinical, biochemical and
anthropometrical assessment. During the clinical consultation they were asked about their
medical history, family history of diseases and eating habits. A validated
(12)
88-item food-
frequency questionnaire (FFQ) was administered to assess eating habits during the last year. The
anthropometrical assessment included weight, height and estimated the percentage of body fat
through Jackson and Pollock’s skin-fold thickness protocol
(13)
. Subjects who smoked or had high
blood pressure (greater than or equal to 140 x 90 mmHg) were not included in the study. Subjects
with BMI lower or higher than the following limits of 18.5 - 24.9 kg/m
2
were excluded but those
classified as overweight (25.0 – 29.9 kg/m
2
) with a body fat below 15% were included. All
participants gave their written informed consent. The study was approved by the institutional
ethics committee.
On screening day two, after a 12-hour overnight fast, the subjects went through a
biochemical assessment. Fasting glucose, insulin, haemogram, total cholesterol, triglycerides,
LDL-c, VLDL-c, HDL-c, alanine transaminase, aspartate transaminase and creatinine were
assessed. A 75-g oral glucose tolerance test was also performed. Subjects with any altered
biochemical results were not included in the study. On the day of the exam, volunteers arrived at
the laboratory after a 12-h overnight fast. They were accommodated in a temperature-controlled
room (24 ± 1ºC), on the exam chair. Their blood pressure was checked using the standard
auscultatory method. After a 30-min acclimatization period, the experiment began. The subjects
underwent a nailfold videocapillaroscopy exam, by two different methods.
The dynamic nailfold videocapillaroscopy recorded the capillaries according to a
standardized, validated methodology on the fourth finger of the left hand
(7;14)
, which assesses
functional capillary density [(FCD), number of capillaries/unit/tissue area (mm
2
)
with flowing red
blood cells], using x250 magnification and an area of 3 mm of the distal row of capillaries into
the central portion of the nailfold. It also provides data on capillary diameters [afferent (AF),
63
apical (AP) and efferent (EF)], red blood cell velocity (RBCV) recorded at rest, after 1 min
arterial occlusion (RBCV
max
) and the time taken to reach it (TRBCV
max
) measured with a final
magnification of x680, before and during the post-occlusive reactive hyperemia response. The
other videocapillaroscopy method applied assesses only functional capillary density (FCD) at the
dorsal of the fourth finger. It has been validated and well-described elsewhere
(15;16)
. Briefly, it
estimates baseline capillary density by counting the number of continuously erythrocyte-perfused
capillaries during a 15-second period. Post-occlusive reactive hyperemia is also used to assess
capillary recruitment after 4-min ischemia.
Daily intake of macro and micronutrients was calculated as reported in the FFQ
(17)
, using
AvaNutri® software (AvaNutri, Brasil), which uses Brazilian Food Composition Table
Database
(18)
. The subjects were asked about their eating habits during the last 12 months. For the
analyses of correlations among food intake and microvascular parameters, the relative intake of
nutrients per 1000kcal was calculated. The main outcome variable was the increase in functional
capillary recruitment (FCR), i.e., peak capillary density after PORH subtracted from basal
capillary density (caps/mm
2
). Spearman’s rank correlation was performed due to non-parametric
distribution of FCR, and significance level was set at 0.05 for all analyses.
RESULTS
Thirty-nine subjects were included in the analyses. Their mean±SD age was 23.4±0.5
years, BMI 23.3±2.3 kg/m
2
and body fat 13.6±5.2%. All clinical and anthropometrical
characteristics fell into expected range for healthy men (table 1). Assessment of food intake
revealed an energy intake of 3745±1365 kcal/d. Carbohydrates, proteins and lipids intakes were
within the recommended proportions of total energy intake (TEI), respectively 60.1±5.9 %,
17.8±4.1 % and 22.1±4.4 % (table 2). On the counterpart, the proportion of different types of fat,
cholesterol and fiber intake did not meet recommended values. Cholesterol intake was
492.8±209.6 mg/d, almost 2.5 times higher than the recommended 200 mg/d.
64
Table 1. Anthropometrical and biochemical variables of 39 healthy men.
Mean
(SD) Reference values for age
and gender
(19;20)
Age (y) 23.4
0.5 (18 – 30)
BMI (kg/m2) 23.3
2.3 18.5 – 24.9
Body Fat (%) 13.6
5.2 15
Waist Circumference (cm) 82.9
5.9 < 94
Fasting Glucose (mg/dl) 83.7
5.5 75 – 99
OGTT (mg/dl) 77.4
18.8 < 140
Insulin (mU/dl) 6.3
2.1 2 – 13
Total Cholesterol (mg/dl) 146.7
27.9 < 200
HDL-c (mg/dl) 49.0
7.1 ≥ 40
LDL-c (mg/dl) 83.9
24.9 <100
TG (mg/dl) 67.6
24.3 < 150
Table 2. Daily food intake of macronutrients and fiber as reported in the FFQ, 39 healthy men.
Mean
(SD) Reference values for age
and gender
(20;21)
Energy (kcal/d) 3745
1365 2880 - 3200
Carbohydrates (% TEI) 60.1
5.9 45 - 65
Protein (% TEI) 17.8
4.1 10 - 35
Fat (% TEI) 22.1
4.4 20 - 35
Saturated fat (% TEI) 14.6
3.6 < 7
Polyunsaturated fat (% TEI) 2.7
0.9 Up to 10
Monounsaturated fat (% TEI) 6.3
1.5 Up to 20
Cholesterol (mg/d) 492.8
209.6 < 200
Fiber (g/d) 33.9
18.5 38
TEI: Total Energy Intake
65
The assessment of micronutrients intake revealed some nutritional discrepancies (table 3).
Vitamin K, complex-B vitamins, calcium, magnesium and zinc intakes met the dietary
recommended values (DRIs), with median (p25 – p75) respective daily intake of 414.6 (305.6 –
539.7) µg/d; 2.2 (1.6 – 3.2) mg/d – thiamin, 2.6 (2.1 – 3.6) mg/d - riboflavin, 1.4 (1.1 – 1.8) mg/d
– vitamin B
6
; 1063.9 (714.1 – 1538.8) mg/d; 660.0 (476.6 – 785.2) mg/d and 15.8 (13.5 – 22.1)
mg/d. Anti-oxidant vitamins, such as C and E did not meet the DRIs, as well as minerals such as
iron, copper and selenium. Sodium daily intake was estimated in 3.2 g/d, twice as high as the
recommended 1.5 g/d.
Table 3. Daily food intake of micronutrients as reported in the FFQ, 39 healthy men.
Median
(p25-p75) Reference values for age
and gender
(21)
Vitamin A (µg/d) 731.0
(242.3 – 1276.5) 900
Vitamin C (mg/d) 77.5
(35.6 – 190.9) 90
Vitamin D (µg/d) 1.7
(0.8 – 3.4) 5
Vitamin E (mg/d) 3.5
(2.5 – 5.6) 15
Vitamin K (µg/d) 414.6
(305.6 – 539.7) 120
Thiamin (mg/d) 2.2
(1.6 – 3.2) 1.2
Riboflavin (mg/d) 2.6
(2.1 – 3.6) 1.3
Vitamin B6 (mg/d) 1.4
(1.1 – 1.8) 1.3
Calcium (mg/d) 1063.9
(714.1 – 1538.8) 1000
Copper (µg/d) 770
(450 – 920) 900
Iron (mg/d) 6.9
(4.1 – 9.5) 8
Magnesium (mg/d) 660.0
(476.6 – 785.2) 400
Selenium (µg/d) 19.1
(13.4 – 24.6) 55
Zinc (mg/d) 15.8
(13.5 – 22.1) 11
Sodium (g/d) 3.2
(2.3 – 4.5) 1.5
66
When correlations of the increase in functional capillary recruitment (FCR) were
assessed, no macronutrients (as percentage of TEI) showed statistically significant associations
with it. On the other hand, two micronutrients showed positive significant correlations with
capillary recruitment, selenium (as µg/d/1000kcal; rho=0.3412, p=0.038,) and calcium (as
mg/d/1000kcal; rho=0.3390, p=0.043). When proportion of intake of different food groups (as
percentage of TEI) was assessed, the only group presenting statistically significant association
with capillary recruitment was dairy products (rho=0.3660, p=0.023 - figure 1).
DISCUSSION
This study assessed long-term food intake and its associations with microvascular
function in a sample of healthy young men. Although energy and macronutrients consumption
fell into expected ranges, intakes of different fat types, cholesterol, fiber and selected
micronutrients did not meet recommendations for their age group. Positive associations between
intakes of selenium, calcium and dairy products and functional capillary recruitment (FCR) were
found.
General distribution of macronutrients was in accordance with recommended ranges. The
types of fat consumed, however, showed a poor distribution of polyunsaturated, monounsaturated
and saturated fat, with excessive intake of the latter. This finding most likely reflects the kind of
food consumed by the sample, mainly composed by college students. High-frequencies of fast-
food and ready-to-eat meals were reported in the FFQ, which may also corroborate observed
excessive intake of cholesterol and sodium. One might also find the reported energy intake
somewhat excessive, but this may not be the case since levels of physical activity varied within
the sample, mostly being moderately physically active (data not shown).
67
Figure 1. Correlations with functional capillary recruitment (FCR - caps/mm
2
) with daily intake
of (a) selenium, (b) calcium and (c) dairy products [as percentage of total energy intake
(TEI)].
(a)
(b)
(c)
68
The assessment of micronutrients intake probably reflected their food choices. Subjects’
reported intakes of vitamin K, complex-B vitamins, calcium, magnesium and zinc were
satisfactory. These micronutrients main sources in the diet are, respectively, green leafy
vegetables, peas, tuna canned in oil; ready-to-eat cereals, sweet potato, rice, wheat flour, beef,
chicken, tuna; dairy; nuts, seeds, spinach, soybeans, beans; and meat, seafood, ready-to-eat
cereals
(22)
. However, consumption of anti-oxidant vitamins, such as C and E, associated to fruits,
vegetables and nuts were below dietary recommended intakes (DRIs). Also, iron, copper and
selenium reported intakes failed to meet the DRIs. Their main sources in the diet are meat,
enriched flour; seafood, nuts; and Brazil nuts, fish, turkey; respectively
(22)
.
The overall assessment of dietary intake allows us to state that, although being healthy,
these subjects present poor nutritional habits. Their food intake is meeting their energy
requirement, but on the basis of low nutrient-dense foods, i. e., a lot of calories and not enough
vitamins and minerals. It is worth noting that many of the subjects reported a shift in their eating
habits concomitantly with their entrance in college. Leaving their families’ house, relying on
themselves to cook or make food choices have apparently disrupted their dietary intake. These
transitional phases in life may lead young people to drop their healthy habits, and without proper
guidance, begin the route of development of diseases later in life.
This study aimed to assess, in a healthy sample, which dietary factors might be related to
microvascular function. Although not meeting the DRI, selenium intake was positively associated
with FCR. The essential function of selenium in humans is protection against oxidative damage,
mediated by 25 selenoproteins that contain this mineral in the form of selenocysteine, including
glutathione peroxidase
(23)
. A recent review
(24)
points out the anti-inflammatory effects secondary
to selenium intake or supplementation. Since oxidative stress plays a causative role in the
development of endothelial function, the study of nutrients directly involved in oxidative
protection has emerged in the past decades. However, few studies have evaluated selenium intake
effect on microvascular function in healthy subjects. A recent study by Hawkes and co-workers
(2009)
(23)
on selenium supplementation in healthy men suggests that a suboptimal intake of
selenium and antioxidants can impair endothelial function and increase the risk of cardiovascular
disease, but that a supranutritional intake confers no additional benefit on microvascular
responsiveness
(25)
.
69
Correlations found between calcium intake as well as dairy products consumption and
FCR were also positive ones. These are naturally closely related, since dietary calcium main
sources are dairy products. Nevertheless, different factors might be involved in these
associations. Dietary calcium has been well established as an antihypertensive agent
(26)
, due to
calcium involvement in normal muscle contraction and relaxation and, thus, in vascular
resistance and blood pressure control. For this function, supplementation of calcium has been
shown not be as effective as dietary calcium intake
(27)
, and this might be related to other bioactive
components of milk
(28)
. Some biological activities of milk proteins and peptides include
immunomodulatory (immunopeptides), hypotensive – angiotensin I-converting enzyme inhibition
(lactokinins, casokinins), antioxidant (peptides derived from α-lactalbumin and β-lactoglobulin),
hypocholesterolemic (peptides derived from β-lactoglobulin) and antithrombotic (casoplatelin)
properties
(28)
. These physiological effects have been observed in vitro or in animal models
(29)
and
human clinical studies are limited, as well as their effect on microvascular response.
This study has limitations. Its observational design fails to establish a causative effect of
such nutrients on functional capillary recruitment. Notwithstanding, these associations are in
accordance with evidence describing selenium, calcium and dairy intakes positive overall effect
on improving markers of cardiovascular risk, such as oxidative stress and hypertension
(28;29)
. If
they definitely possess actions towards vascular responsiveness remains to be elucidated with
further, accordingly designed investigations. One limitation regarding food intake report is over-
estimation characteristic of FFQs
(30)
. We did not observe any extremely high intake in this
sample, and even high reported energy intakes might be feasible due to age and gender of
subjects. If over-estimation might have occurred, food intake of vitamins and minerals may be
even lower, drawing attention to the unhealthy eating profile of this sample. Moreover, in
comparison with short-term food records, which might provide a more accurate intake report, the
FFQ provides a better approximation of the habitual diet over a longer period
(30)
.
This study observed positive associations between intakes of selenium, calcium and dairy
products and functional capillary recruitment on skin nutritive microcirculation in a sample of
healthy young men. Future assessments of dietary patterns, i. e. identification of main food
groups consumed in an individual’s diet, may additionally identify other associations, taking into
account the synergy among food components ingested. Further studies may also clarify the
mechanisms involved with these specific nutrients and microvascular responsiveness.
70
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73
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados apresentados neste estudo trazem novas evidências ao estudo da
microcirculação humana e suas interações com o sistema digestivo e consumo alimentar. A fase
cefálica da digestão, fisiologicamente fundamental para o apropriado processamento e absorção
de nutrientes, parece ter influência sobre, ou ter como mecanismo envolvido, a microcirculação.
A hipótese inicial deste estudo, de que a insulina secretada nesta fase teria ações hemodinâmicas,
não teve suporte definido, seja pela ausência de efeito ou de detecção da sua variação. Contudo, o
polipeptídeo pancreático surgiu como um novo mediador neste processo, Se sua ação é
diretamente voltada ao endotélio, ou se sua correlação com a microcirculação é apenas fruto do
aumento secundário ao estímulo cefálico que pode estar atuando concomitantemente sobre a
microcirculação, será objeto de investigação futura.
Acredita-se que estes resultados tenham plausibilidade biológica, pois se as secreções,
tanto endócrinas quanto exócrinas, liberadas nesta fase têm o intuito de promover o processo
digestivo, para isto também é necessário um maior fluxo sangüíneo com maior perfusão tecidual
e maior aporte de substratos e secreções endócrinas aos tecidos. É importante ressaltar que esta
pesquisa trouxe evidências claras, e através de diferentes métodos de medidas, do aumento de
fluxo microvascular e recrutamento capilar na fase cefálica da digestão. O estudo da
microcirculação cutânea, mesmo não sendo um tecido-alvo para a atividade das secreções
liberadas durante a fase cefálica da digestão, apresenta boa correlação com outros leitos capilares,
e seus resultados são bem aceitos na literatura.
O aumento observado da densidade capilar funcional em repouso no grupo experimental
parece ter ocorrido secundariamente ao estímulo da fase cefálica. Deve-se ressaltar que a função
microvascular é muitas vezes estudada em termos do aumento do número de capilares
perfundidos após isquemia, concomitantemente com algum estímulo exógeno, por exemplo,
infusão de insulina. Diversos fatores estão envolvidos no recrutamento capilar nestes casos,
dificultando a separação do efeito da isquemia e estímulo. Neste estudo, a densidade capilar
funcional em estado basal foi maior após a apresentação do estímulo sensorial, representando o
aumento secundário à fase cefálica per se.
74
A correlação encontrada entre o aumento da secreção de polipeptídeo pancreático no
grupo experimental e o aumento da densidade capilar funcional é um achado inédito no estudo da
microcirculação humana. Estudos em animais já demonstraram efeitos vasodilatadores do
polipeptídeo, via estímulo da liberação de óxido nítrico derivado do endotélio. No presente
trabalho, contudo, a própria acetilcolina, também liberada pela ativação parassimpática na fase
cefálica, pode estar atuando sobre a microcirculação cutânea. Não podendo ser elucidado nesta
pesquisa, devido ao desenho do estudo, os mecanismos por trás deste achado serão objeto de
investigações futuras.
Futuramente, também, o mesmo protocolo será aplicado em indivíduos obesos, ou em
estados de resistência insulínica. Se, nestes indivíduos, a microcirculação não apresentar
responsividade à estimulação sensorial nesta fase precoce da digestão, pode residir aí um mais
um possível mecanismo fisiopatológico da homeostase glicêmica. O presente trabalho pretende,
assim, ser uma semente, para a geração de hipóteses, para a multiplicação futura dos
conhecimentos acerca da fisiologia e fisiopatologia de interações dos sistemas microvascular,
endócrino e digestivo.
A avaliação descritiva do consumo alimentar de jovens saudáveis e sua relação com a
atividade microcirculatória também trouxe evidências relevantes, de que mesmo em indivíduos
saudáveis, a função microvascular pode estar relacionada com fatores relacionados ao estilo de
vida, neste caso, o consumo alimentar. A ingestão de selênio e cálcio, bem como de produtos
lácteos, tem sido associada há muitas décadas, com proteção anti-oxidante e redução da pressão
arterial sistêmica, e nosso estudo, adiciona mais um dado positivo a estes achados, relacionando-
os positivamente ao recrutamento capilar. Embora nossos dados sejam provenientes de um estudo
observacional, acreditamos que estes achados acrescentam conhecimento à literatura médica
principalmente aos campos de estudo em prevenção da disfunção microvascular, a qual está
precocemente envolvida na fisiopatologia das doenças cardio-metabólicas.
75
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