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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIÊNCIAS MÉDICAS
MESTRADO INTERINSTITUCIONAL UFRGS-UPF
ANÁLISE DA EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE INTEGRINA
ALFA(V) BETA(3) EM LESÕES MALIGNAS E PRÉ-MALIGNAS
DE COLO UTERINO
Lieverson Augusto Guerra
Orientadora: Dra. Maria Isabel Albano Edelweiss
Co-orientadora: Dra. Daniela Dornelles Rosa
Dissertação de Mestrado
2010
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2
LIEVERSON AUGUSTO GUERRA
ANÁLISE DA EXPRESSÃO IMUNOHISTOQUÍMICA DE INTEGRINA
ALFA(V) BETA(3) EM LESÕES MALIGNAS E PRÉ-MALIGNAS
DE COLO UTERINO
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina: Ciências Médicas da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, para a obtenção do Título de
Mestre em Medicina, sob orientação da Prof
a
Dra Maria
Isabel Albano Edelweiss.
2010
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3
AGRADECIMENTOS
- À UFRGS e a UPF, pela oportunidade realização do curso.
- À Professora orientadora Dra. Maria Isabel Edelweiss e a co-orientadora Dra Daniela
Dornelles da Rosa, pela orientação, apoio incondicional, compreensão, estímulo e incentivo
na pesquisa. Tornaram possível este projeto. Incansavelmente, durante esses anos, foram
exemplo de conhecimento, orientação, dedicação e amizade. Minha gratidão por vocês; vossa
ajuda, me fez um ser humano melhor.
- À Professora Dra. Daniela Augustin Silveira, pela participação, incentivo e dedicação
de seu precioso tempo para a construção deste.
- À Dra. Sandra Fuchs e Dr Hugo Lisboa, pelo apoio, compreensão e essencial
estimulo, que pela percepção humana, contribuíram nos momentos de angustia.
- À minha colega, Erimara Dall Agnol, pela ajuda e apoio.
- À funcionaria Vicentina, do Registro Hospitalar de Câncer do HSVP, pela
colaboração e carinho com que tem responsabilidade sobre os dados dos pacientes, durante
todos esses anos em que trabalhamos juntos.
- Aos médicos do Instituto de Patologia de Passo Fundo, em especial a Professora Dra
Ana Marcolan, pelo apoio ao projeto.
- Aos técnicos de laboratório do Serviço de Patologia do HSVP e do Instituto de
Patologia de Passo Fundo, pela disposição, auxilio, empenho e participação durante a coleta
dos dados e desenvolvimento laboratorial do projeto.
- Ao corpo editorial do Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, em
especial ao Editor Chefe Mauro Castelli, pela fundamental colaboração.
- Aos meus colegas oncologistas do Centro de Oncologia e Hematologia do Planalto e
do Hospital São Vicente de Paulo da Universidade de Passo Fundo, pelo apoio, incentivo e
compreensão.
4
Dedico este trabalho ao meu pai. Pelo pequeno tempo em que convivemos.
Em minha memória, sempre a lembrança de felicidade e honestidade, que marcaram minha
infância.
Seu caráter, norteou minhas atitudes e fez de mim uma pessoa melhor.
Minha mãe Zaida, que com méritos conduziu minha infância ate a Universidade. Fez de mim
um homem.
Minha querida esposa Janaina, pelo amor, paciência, estimulo e compreensão das horas em
que me privei da sua companhia, para atuar na construção da pesquisa.
Meus filhos Guilherme e Luiz Augusto, pela lúdica compreensão de minha ausência.
5
RESUMO
Introdução: O câncer do colo uterino apresenta alta prevalência no Brasil, representando
10% de todas as neoplasias malignas nas mulheres. Estima-se para o ano de 2010, 18.430
novos casos de câncer de colo do útero no Brasil. Em um elevado número de mulheres com
doença localmente avançada, a neoplasia recorre após o tratamento inicial com quimio-
radioterapia e, poucas opções terapêuticas estão disponíveis neste cenário. Entretanto, faz-se
necessário o estudo de novos alvos terapêuticos, assim como novos fatores prognósticos para
o câncer de colo uterino. Estudos pré-clinicos demonstraram que a expressão de diversas
integrinas estão associadas com a invasão celular, angiogênese e carcinogênese.
Objetivos: Avaliar a expressão imunohistoquímica da integrina alfa(v) beta(3) (
V
3
) em
lesões malignas e pré-malignas de colo uterino e correlacionar os achados com o desfecho das
pacientes.
Métodos: Realizou-se um estudo de coorte retrospectivo não controlado. Foram revisados os
laudos anatomopatológicos do Serviço de Patologia do Hospital São Vicente de Paulo da
Universidade de Passo Fundo e do Instituto de Patologia de Passo Fundo, com diagnóstico de
neoplasia de colo uterino, no período entre novembro de 2001 a novembro de 2008, em um
total de 162 amostras, de 150 pacientes. A analise da expressão foi realizada através de estudo
imunohistoquímica, utilizando o anticorpo BV3 (monoclonal de camundongo) especifico para
integrina alfa v beta 3 (Abcam, Inc. Cambridge, MA), com diluição de 1:400. Os resultados
foram analisados por dois patologistas independentes e categorizados como positivos ou
negativos. Os dados de evolução, tratamento e sobrevida foram obtidos através de revisão de
prontuários.
Resultados: Na analise de 146 pacientes, o índice de KAPPA de concordância foi de 0.808
(p<0.05) e as diferenças foram resolvidas por consenso. A positividade focal foi presente em
15% dos casos, sem relação com sobrevida livre de doença ou óbito. Dentre os 22 casos
positivos, 45,5% eram lesões pré-malignas e 54,5% câncer invasivo. Não houve diferença na
sobrevida livre de doença para pacientes com câncer e expressão da integrina alfa(v) beta(3),
comparados com os casos sem expressão.
Conclusão: Não foi observada associação entre a expressão da integrina alfa(v) beta (3) e o
desfecho nas pacientes com câncer de colo uterino ou com lesões intraepiteliais do colo
uterino.
Palavras-chave: câncer de colo uterino, lesões intraepiteliais do colo uterino,
imunohistoquímica, integrinas, integrina alfa(v) beta(3),
V
3
, marcadores moleculares.
6
LISTA DE ABREVIATURAS
INCA: Instituto Nacional do Câncer
HPV: papilomavírus humano
NIC: neoplasia intraepitelial cervical
FIGO: International Federation of Gynecology and Obstetrics
AJCC: American Joint Committee on Cancer
DNA: ácido desoxirribonucléico
IgSF: superfamília das imunoglobulinas
EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico
FGFR: receptor do fator de crescimento fibroblástico
IGF-I: receptor do fator de crescimento ligado à insulina
CDH1: gene que codifica a proteína E-caderina
GTP: guanina trifosfato dependente de cálcio
kDa: kilo Daltons
VEGF: fator de crescimento endotelial vascular
TGFb: fator b de crescimento tumoral
bFGF: fator básico de crescimento fibroblástico
FAK: quinase de adesão focal
MIDAS: sitio de adesão dependente de íon metálico
RGD: tripeptídeo arginina-glicina-ácido aspártico
RTK: receptores tirosina kinases
ME: matriz extracelular
MMP-2: metaloproteases da matriz
RNA: acido ribonucléico
LAP: peptídeo associado a latência
ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
IH: imunohistoquímica
CEM: Comissão de Ética Medica
CEP: Comitê de Ética em Pesquisa
CAAE: Certificado de Apresentação para Apreciação Ética
7
LISTA DE ABREVIATURAS DO ARTIGO
IHC: immunohistochemistry
ECM: extracellular matrix
MMP: matrix metalloproteinases
TBS: Tris-buffered saline
BSA: Bovine serum albumin
LSAB: Labeled Streptavidin Biotin
DAB: Diaminobenzidine tetrahydrochloride
CT: Computer tomography
SPSS: Statistical Package for Social Sciences
SD: standard deviation
CAAE: Presentation Certificate of Ethics Appreciation
HE: hematoxylin and eosin
CIN: cervical intraepithelial neoplasia
8
LISTA DE TABELAS DO ARTIGO
Table 1. 45
Table 2. 46
Table 3. 46
9
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO
Photo 1. 45
Photo 2. 45
10
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 11
2. REVISÃO DA LITERATURA 14
2.1. Carcinogênese 14
2.2. Metástases 15
2.3. Matriz Extracelular 16
2.4. Angiogênese 19
2.5. Integrinas 19
2.6. Integrina alfa(v) beta(3) (v3) 23
2.7. Invasão celular tumoral 24
2.8. Integrinas e câncer 25
2.9. Integrinas e câncer de colo uterino 26
3. HIPÓTESE 30
4. OBJETIVOS 30
4.1. Objetivo geral 30
4.2. Objetivos específicos 30
5. REFERÊNCIAS DA REVISÃO DA LITERATURA 31
6. ARTIGO CIENTÍFICO REDIGIDO EM INGLÊS 38
7. CONSIDERAÇÕES GERAIS 49
8. ANEXOS 50
8.1. Classificação TNM e Estadiamento FIGO 50
8.2. Técnica de Imunohistoquímica 50
8.3. Ficha de coleta de dados 53
8.4. Considerações éticas 53
11
1. INTRODUÇÃO
No Brasil, estima-se que seja o terceiro câncer mais comum na população feminina
(após o câncer de pele não melanoma e o câncer de mama), representando 10% de todos os
tumores malignos em mulheres. De acordo com estimativas do Instituto Nacional do Câncer
(INCA) para o ano de 2010, devem ocorrer 18.430 novos casos de câncer do colo do útero,
com um risco estimado de 18 casos a cada 100.000 mulheres.
(01)
Nos Estados Unidos, o carcinoma de colo uterino é a segunda causa de morte entre as
mulheres no grupo etário dos 20 aos 39 anos, com uma estimativa de 11.270 novos casos e de
4.070 mortes em 2009.
(02)
Mundialmente, é a sétima neoplasia em freqüência global e o
segundo câncer mais comum entre as mulheres, com uma estimativa de 551.100 novos casos
e 309.800 mortes em 2007. É muito mais comum nos países em desenvolvimento, onde 83%
dos casos ocorrem, com um risco de 1,5% até os 65 anos de idade.
(03)
Entre os fatores de risco para o desenvolvimento de carcinoma do colo uterino estão a
presença de múltiplos parceiros sexuais e doenças sexualmente transmissíveis, o início de
relações sexuais em idade precoce, parceiros promíscuos, tabagismo, imunodeficiências,
deficiência de vitaminas A ou C e o uso de anticoncepcionais orais.
(04)
Estudos moleculares e
epidemiológicos têm demonstrado que a infecção pelo papilomavírus humano (HPV) é um
fator causal de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) e de carcinoma do colo uterino
invasivo.
(04)
A infecção persistente por um dos 15 genótipos do HPV carcinogênico é a responsável
direta por praticamente todos os casos de neoplasia. Existem quatro etapas maiores no
desenvolvimento do câncer: infecção do epitélio metaplásico na zona de transformação
cervical, persistência viral, progressão do epitélio persistentemente infectado para lesões pré-
malignas cervicais e, finalmente, invasão através da membrana basal do epitélio cervical. A
infecção é extremamente comum em mulheres jovens na sua primeira década de atividade
sexual. Infecções persistentes e lesões pré-malignas ocorrem em 5-10 anos a partir de novas
infecções. O câncer invasivo ocorre após muitos anos, mesmo décadas, em uma minoria das
mulheres com lesões pré-cancerígenas, com um pico ou platô de risco, em torno dos 35-55
anos de idade. Cada genótipo do HPV atua como uma infecção independente, com diferentes
riscos carcinogênicos.
(04,05)
Entre 80 a 90% das neoplasias de colo uterino são do tipo epidermóide. Geralmente, a
progressão metastática segue um padrão relativamente ordenado, ocorrendo inicialmente para
12
os linfonodos pélvicos, destes para os para-aórticos e, então, para sítios distantes, como
pulmões, linfonodos extra-pélvicos e ossos.
(04)
O câncer de colo uterino tem seu estadiamento definido de acordo com a Federação
Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) (anexo 1), tendo sua ultima revisão
publicada em janeiro de 2009.
(06)
Nesta neoplasia, o estadiamento é o principal fator
prognóstico estabelecido. Embora as taxas de sobrevida global e controle da doença pélvica
apresentem associação direta com o estadiamento da FIGO, o prognóstico também é
influenciado por outros fatores não incluídos no estadiamento.
(04)
O diâmetro clínico do tumor associa-se fortemente ao prognóstico em pacientes
tratadas com radioterapia
(07)
ou cirurgia.
(08)
Por esta razão, a FIGO modificou a classificação
do estágio I, que passou a ser subdividido de acordo com o diâmetro tumoral (menor ou igual
a 4 cm ou maior que 4 cm de diâmetro).
(06)
Em pacientes com estágios IB-IIB e invasão patológica de paramétrios, tratadas com
cirurgia radical e terapia adjuvante, presença de invasão vaginal, metástases linfonodais e
histologia não escamosa são indicadores independentes das taxas de sobrevida livre de
doença; presença de invasão vaginal e metástases linfonodais são fatores prognósticos
independentes para as taxas de sobrevida global, a qual pode chegar a 90% quando estes
fatores estão ausentes.
(09)
Para doença maligna mais avançada, outros parâmetros apresentam associação com o
prognóstico, como a presença de envolvimento parametrial medial versus lateral, no estágio
IIB, ou envolvimento unilateral ou bilateral de paramétrios ou de parede pélvica.
(04,09)
Metástases em linfonodos são os preditores de maior importância no prognóstico. Em
pacientes tratadas com histerectomia radical para estágio clínico IB, as taxas de sobrevida
variam de 85 a 95% quando os linfonodos pélvicos são negativos e de 45 a 55% quando há
metástases nodais presentes. Para pacientes com linfonodos para-aórticos positivos, tratadas
com radioterapia, as taxas de sobrevida variam entre 10-50%, dependendo da extensão de
envolvimento pélvico e para-aórtico.
(04)
Para pacientes tratadas com histerectomia radical, outros parâmetros histológicos são
associados com mau prognóstico, como a invasão de espaço linfovascular, invasão estromal
profunda e extensão parametrial. O envolvimento do corpo uterino associa-se com elevada
taxa de metástases à distância, em pacientes tratadas com radioterapia ou cirurgia.
(10)
13
Devido à prevalência elevada desta neoplasia em nosso meio, faz-se necessário o
estudo de novos fatores prognósticos e potenciais alvos terapêuticos. Diversos estudos
mostram que a expressão de integrinas associa-se ao potencial de invasão celular tumoral,
angiogênese e carcinogênese. As integrinas estão expressas em diversas neoplasias epiteliais e
desempenham importante papel na angiogênese, mas ainda não esta definida sua expressão e
o potencial significado de sua positividade no desfecho de pacientes com câncer de colo
uterino e ou lesões intraepiteliais. Com a finalidade de avaliar a expressão desta integrina e
compará-la com o desfecho clinico das pacientes, foi proposto o presente estudo.
14
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Carcinogênese
Denomina-se carcinogênese o processo pelo qual tem inicio a formação do câncer.
Etiologicamente, os tumores são doenças celulares, onde ocorre um desvio no mecanismo de
controle no processo de duplicação celular (proliferação e diferenciação). As etapas deste
complexo sistema tem sido intensamente estudadas e, novos caminhos descobertos, assim
como sua implicação no processo normal e anormal desta gênese.
(04)
No núcleo celular estão presentes os cromossomos, que são compostos de genes, onde
a informação genética esta inscrita e arquivada através do acido desoxirribonucléico (DNA) e,
por este, os cromossomos passam as informações para o funcionamento celular.
(04)
Uma célula normal pode sofrer alterações no DNA, processo conhecido como mutação
genética. As células cujo material genético foi alterado, passam a receber instruções erradas
para as suas funções. Estas alterações podem ocorrer em genes especiais, denominados
protooncogenes, que a princípio podem estar presentes e de forma inativa, em células
normais. Quando ativados, estes protooncogenes transformam-se em oncogenes, responsáveis
então pelo processo de transformação desta célula normal e assim, assumindo características
diferenciadas.
(04,11,12)
As alterações genéticas encontradas somente nas células neoplásicas não são capazes
de explicar as múltiplas etapas envolvidas na carcinogênese, entretanto, as células tumorais
são capazes de expressar diversos fenótipos durante as complexas fases de desenvolvimento
tumoral e progressão.
(11,12)
Existem etapas distintas envolvidas neste processo de transformação de uma célula
normal em uma célula maligna e, didaticamente, é possível à divisão destas, em três em fases:
a. Estágio de iniciação
É o primeiro estágio da carcinogênese, quando as células sofrem o efeito dos agentes
cancerígenos ou carcinógenos, que provocam modificações em alguns de seus genes. Nesta
fase as células se encontram geneticamente alteradas, porém, ainda não é possível se detectar
um tumor clinicamente. Encontram-se "preparadas", ou seja, iniciadas, para a ação de um
segundo grupo de agentes que atuará no próximo estágio.
(11-13)
15
Mutações em oncogenes dominantes e supressores recessivos desregulam os circuitos
regulatórios que controlam o curso celular, conferindo as células neoplásicas a capacidade
para sobreviverem e proliferarem, mesmo na indisponibilidade de informações definidas.
(11-13)
b. Estagio de promoção
Neste segundo estágio da carcinogênese, as células geneticamente alteradas
("iniciadas"), sofrem o efeito dos agentes cancerígenos classificados como oncopromotores. A
célula iniciada é transformada em célula maligna, de forma lenta e gradual. Para que ocorra
essa transformação, é necessário ocorrer um longo e continuado contato com o agente
cancerígeno promotor. A suspensão do contato com agentes promotores muitas vezes
interrompe o processo nesse estágio. Alguns componentes da alimentação e a exposição
excessiva e prolongada a hormônios são exemplos de fatores que promovem a transformação
de células iniciadas em malignas.
(11-13)
c. Estagio de progressão
Caracterizado pela multiplicação descontrolada e irreversível das células alteradas.
Nessa terceira e ultima etapa, o câncer já está instalado, evoluindo até o surgimento das
primeiras manifestações clínicas da doença.
(11-13)
Os fatores que promovem a iniciação ou progressão da carcinogênese são chamados
agentes oncoaceleradores ou carcinógenos.
(04,11-13)
2.2. Metástases
As metástases são o produto final de um processo evolutivo, no qual, as diversas
interações entre as células tumorais cancerosas e o microambiente, rendem alterações que
permitem a essas células transcenderem a um comportamento programado. Assim, as células
tumorais, povoam e florescem em novos tecidos e, em última instância, causam uma
disfunção orgânica e morte.
(12,14)
Compreender a muitos eventos e processo moleculares
envolvidos nas metástases, poderia conduzir a uma efetiva, abordagem orientada para a
prevenção e terapia do câncer. No processo de metastatização, pelo qual as células
cancerígenas deixam o tumor primário e disseminam-se, para formarem tumores em sítios
anatômicos distantes, é um problema de ordem complexa, que na grande maioria das vezes,
não apresentam possibilidade de tratamento ou sucesso terapêutico efetivo. As metástases
resultam de uma complexa cascata molecular, compreendendo varias etapas, as quais estão
16
interconectadas por uma serie de interações adesivas e processos invasivos, além de respostas
a estímulos quimiotáxicos, ainda não completamente conhecidos.
(15)
Os tumores primários consistem de populações heterogêneas de células com alterações
genéticas, que lhes permitem superar limites físicos, disseminarem-se e colonizarem um órgão
distante. As metástases são a sucessão destes processos individuais.
(12)
Em modelos animais,
0,01% ou menos das células cancerosas que entram na circulação se desenvolverão em
metástases.
(16,17)
A instabilidade genomica intrínseca das células cancerosas aumenta a freqüência de
alterações necessárias para adquirir capacidade metastática. À instabilidade genomica e a
heterogeneidade das células tumorais estão evidenciadas pelos aparentes ganhos, perdas e
rearranjos cromossômicos associados ao câncer. A integridade do DNA pode ser
comprometida pela progressão aberrante no ciclo celular, disfunção telomérica caracterizada
por anomalia genética e instabilidade cromossômica, inativação de genes do reparo do DNA
e, mecanismos epigenéticos de controle alterados.
(18,19)
Em cerca de 50% dos tumores há
perda da proteína de supressão tumoral p53, que responde por danos ao DNA ao induzir
apoptose celular ou parando o crescimento. A perda do p53 permite o acúmulo de células com
DNA danificado.
(20-22)
Sumariamente os eventos envolvido na complexa cascata do processo de
metastatização podem ser divididos em: (1) angiogênese tumoral, (2) desagregação das
células tumorais desde o tumor primário, mediado por caderinas e cateninas, (3) invasão e
migração através da membrana basal e matriz extracelular em torno do epitélio tumoral, com
subseqüente invasão da membrana basal do endotélio dos vasos sanguíneos locais; esta é
mediada por integrinas e proteases, incluindo as metaloproteinases de matriz e catepsinas, (4)
introdução das células tumorais dentro dos vasos sanguíneos, (5) aderência das células
tumorais circulantes ao endotélio do leito capilar do órgão alvo; isso ocorre através de
interações adesivas entre as células tumorais e o endotélio, envolvendo selectinas, integrinas e
membros da superfamília das imunoglobulinas – IgSF, (6) invasão das células tumorais
através da camada de células endoteliais e em torno da membrana basal, (7) desenvolvimento
de um foco de tumor secundário no órgão alvo.
(23-25)
2.3. Matriz Extracelular
Durante a suas vidas, as células possuem um propósito comum, o de secretar e
remodelar um sistema complexo de proteínas – a matriz extracelular (ME). Tanto como
17
provendo uma flexível, mas resistente, plataforma para a organização das células em tecidos,
a ME exerce um extraordinário controle no comportamento celular. Possui a capacidade de
determinar se haverá proliferação ou repouso celular, migração ou permanência estacionária
e, desenvolvimento ou apoptose celular.
(26)
Ha duas formas de ME: a membrana basal e a matriz intersticial. Cada uma delas varia
em sua composição e propriedades, dependendo da característica e localização celular ou do
tecido em que se encontra ou do estagio de desenvolvimento do organismo.
(26)
Estão presentes na constituição da ME, diferentes combinações de colágenos,
proteoglicanos, ácido hialurônico e várias glicoproteínas, como a fibronectina e a laminina,
que preenchem a maioria dos espaços intercelulares.
(24-26)
O processo de adesividade celular possui especial implicação sobre a transdução de
sinais e está envolvido na transferência de informações entre as células. A ligação das células
à matriz extracelular também sinaliza para dentro do citoplasma e leva a reorientação do
citoesqueleto e a mudanças no comportamento celular como, por exemplo, no estímulo à
proliferação celular.
(27)
São definidas quatro principais classes de receptores celulares
envolvidos nas interações célula-célula e célula-matriz: caderinas, selectinas, superfamília de
receptores de imunoglobulinas e integrinas.
(28)
Em muitos tumores primários com propriedades invasivas, a adesão intercelular está
reduzida, frequentemente em decorrência a uma perda da E-caderina, um mediador direto da
adesão célula-célula. A cauda citoplasmática da E-caderina é amarrada, através de [alfa]-
catenina e [beta]-catenina, ao citoesqueleto de actina; uma das propriedades da actina é
manter a junção celular. A importância da manutenção da adesão intercelular foi demonstrada
em um modelo de câncer pancreático de rato, onde a ruptura da expressão da E-caderina
levou à invasão por metástases precocemente.
(29)
Diversos mecanismos podem causar uma
perda da E-caderina: mutações, resultantes de uma inativação protéica, em silenciamento
gênico por metilação de um promotor, ou por uma regulação contrária ao crescimento,
estimuladas pelos receptores do fator de crescimento (por exemplo, receptor do fator de
crescimento epidérmico [EGFR], receptor do fator de crescimento fibroblástico [FGFR],
receptor do fator de crescimento ligado a insulina I [IGF-I] ).
(29,30)
A expressão do gene da E-
caderina (CDH1), também é inibida por vários repressores da transcrição.
(30)
Perdas na
funcionalidade da E-caderina são necessárias, embora não suficientes, para a transição
epitelial para mesenquimal, um processo através do qual as células epiteliais mudam para um
fenótipo de células progenitoras mesenquimais, permitindo o descolamento e reorganização
18
das células epiteliais durante o desenvolvimento embrionário, bem como a invasão tumoral e
metástases.
(31-35)
A adesão celular à vizinhança da ME pode determinar o seu formato, manter a função
celular adequada e a integridade do tecido. A matriz extracelular também auxilia o
ancoramento das células, sinaliza o tráfego celular e dirige a diferenciação celular. O controle
do comportamento celular parece se originar em resposta às interações célula-matriz. As
proteínas adesivas da matriz não apenas promovem a adesão celular como também estimulam
a migração celular. A matriz também pode exercer seu efeito na diferenciação celular agindo
como fator indutor, fazendo com que as células capazes respondam à ativação por hormônios
ou por outros fatores solúveis, ou mesmo, a própria matriz pode fornecer um sinal indutivo.
(36)
Os efeitos da ME nas células é principalmente mediado pelas integrinas, que são uma
grande família de receptores de superfície celular que ligam e também mediam a adesão aos
componentes da ME, organizam o citoesqueleto e ativam caminhos de sinalização
intracelulares. Cada integrina consiste de duas sub-unidades transmembrana tipo I: alfa (α) e
beta (β). Existem 18 subunidades alfa e 8 beta, associadas em varias combinações, para
formarem 24 integrinas, que podem se ligar a distintos, embora parcialmente sobrepostos,
subconjuntos de ME.
(37,38)
Como conseqüência de todos os processo relativos a carcinogênese, as células que
foram submetidas a transformação neoplásica são muito menos dependentes da adesão na
matriz extracelular (ME), para sua sobrevivência e proliferação.
(37)
Mesmo a despeito desta
relativa independência de ancoramento celular, as células cancerígenas parecem se beneficiar
de sinalizações das integrinas, tanto durante a iniciação quanto a progressão do tumor.
(39,40)
A matriz extracelular serve como um andaime, onde ao longo do qual as células
anexam-se e movimentam-se através de contactos entre receptores da superfície celular,
denominados integrinas e, componentes de matriz extracelular, como fibronectina, colágeno e
laminina. As integrinas também interagem em um complexo citoplasmático constituído de
kinases de aderência focal e kinases da família SRC, para mediar a adesão ao citoesqueleto de
actina. Através da guanosina trifosfatase dependente de cálcio (GTPases), os sinais da ME
ocasionam modificações individuais no citoesqueleto, formando extensões citoplasmáticas
chamado filópodes, que coalescem em grandes estruturas, importantes no movimento
migratório.
(14)
19
2.4 Angiogênese
Ao decorrer o complexo sistema de desenvolvimento tumoral, inicialmente quando o
diâmetro da neoplasia é inferior a dois milímetros, o sistema nutricional é realizado através da
difusão desde os tecidos vizinhos, mas, além dessa dimensão, torna-se essencial o suprimento
através de vasos sanguíneos próprios. Este desenvolvimento é denominado angiogênese
tumoral. É um processo que funcionalmente relaciona-se com as metástases tumorais,
envolvendo eventos fisiopatológicos como: mobilidade celular, proteólise tecidual e
proliferação celular. A angiogênese depende de interações moleculares específicas entre as
células vasculares e dos componentes da matriz extracelular.
(40)
O estimulo através das citocinas às células endoteliais do vaso, à degradação da lâmina
basal pela atividade das proteases de matriz e a migração das células endoteliais para o
estroma perivascular, com proliferação e inicio do broto capilar, são etapas envolvidas na
angiogênese. A fonte dos estímulos angiogênicos aponta a direção da migração. O broto
vascular expande-se e assume a conformação tubular, com o desenvolvimento de uma nova
lamina basal. A proliferação do endotélio permite uma extensão dos túbulos da
microvasculatura, que se unem por anastomose e originam uma cadeia circulatória funcional.
(41-43)
Os eventos adesivos necessários para a angiogênese são rigorosamente regulados e
limitam-se as células afetadas. São ativados por períodos de tempo pequenos e após,
completamente suprimidos. Quando o endotélio encontra-se sem atividade angiogênica, a
integrina alfa v beta 3 (
V
3
) praticamente não é detectada, entretanto, na angiogênese
induzida por citoquinas ou tumores, sua expressão e intensamente estimulada.
(44)
2.5. Integrinas
As integrinas são uma grande família de glicoproteínas que constituem grupos de
receptores da superfície celular, os quais possuem duas subunidades, designadas alfa (a maior,
com 120-170 kDa) e beta (a menor, com 90-100 kDa), associadas de maneira não covalente.
Elas mediam a adesão entre as células e destas com as proteínas da matriz extracelular da
membrana basal. As integrinas têm papel importante em diversas etapas celulares -
crescimento, desenvolvimento, morfologia e a indução de eventos sinalizadores essenciais
para a sobrevivência, proliferação e diferenciação celular, bem como no desenvolvimento de
tumores. Uma característica importante destas moléculas é que elas existem em estados
inativos ou ativos, de acordo com o estímulo celular. Uma célula ativada pode transmitir um
20
sinal a partir de seu citoplasma e, assim, modificar a conformação dos domínios extracelulares
das integrinas da membrana celular, aumentando sua afinidade pelos ligantes (sinalização
“inside out”). Da mesma forma, a união de uma integrina com seu ligante pode afetar
processos intracelulares, incluindo proliferação e apoptose (sinalização “outside in”).
(45,46)
Os domínios da subunidade beta conectam-se a filamentos de actina do citoesqueleto
por meio de proteínas intracelulares como talina, vinculina e a-actinina. Nesse processo,
regulam a organização do citoesqueleto, ativam cascatas de quinases sinalizadoras e modulam
o ciclo celular. Algumas integrinas são expressas constitutivamente, ou seja, são produzidas
normalmente pelo organismo em condições fisiológicas. Outras, entretanto, possuem
regulação diferenciada e respondem a estados de ativação das células, por exemplo, por
citocinas angiogênicas [VEGF (vascular endothelial growth factor), TGFb (tumor growth
factor b) , bFGF (basic fibroblast growth factor)].
(47-49)
A regulação da atividade "inside out"
protege o hospedeiro da adesão patológica mediada pela integrina. Tanto a sinalização
"outside in" quanto a "inside out" estão associadas a alterações conformacionais distintas no
segmento extracelular das integrinas. Estas mudanças variam com o tipo e natureza do ligante
e são moduladas por cátions divalentes.
(48)
Figuras 1 e 2: Estrutura básica de uma integrina (Fonte:www. pmsalves.wordpress.com)
Até o momento, foram identificadas 18 subunidades alfa e 8 subunidades beta, que
formam ao todo 24 receptores distintos. Os domínios de ligação citoplasmáticos das
integrinas incluem proteínas tirosino-quinases (focal adhesion kinase - FAK e Syk) e
proteínas do citoesqueleto (talina e paxilina). Os domínios transmembrana e extracelular das
integrinas também interagem com outras proteínas de membrana, que podem modular a
sinalização celular. A afinidade para o ligante no domínio extracelular é regulada através de
21
mudanças na conformação das regiões de ligação. O contato entre as subunidades alfa e beta
envolve suas metades amino-terminais que, juntas, formam uma "cabeça" globular e, as
porções remanescentes, formam duas caudas em formato cilíndrico, que transpassam a
membrana plasmática. Ambas subunidades, alfa e beta, apresentam um pequeno domínio
transmembrana (20 a 30 resíduos) e uma região intracelular (20 a 50 resíduos).
(28)
Existem
duas séries principais de integrinas: aquelas onde a sub unidade A contém uma região extra de
~180 aminoácidos, o domínio alfa-A, e aquelas que não têm. O domínio alfa-A é formado por
um conjunto de aminoácidos próximos à função amino-terminal, capaz de se ligar a cátions
bivalentes, como Ca2+ ou Mg2+ , representando o sítio de adesão dependente de íon metálico
- MIDAS. A subunidade beta também possui um domínio tipo-A, o domínio beta-A. Para
integrinas com dois domínios A, o domínio alfa-A é que participa da ligação com o ligante e
pouco se sabe da função do domínio beta-A. Para as integrinas que possuem apenas o
domínio beta-A, este é responsável pela ligação com o ligante.
(48)
Para a diferenciação e o crescimento, as células necessitam estarem ancoradas a um
substrato. Esta ligação estimula e controla a progressão através do ciclo celular. Quando as
integrinas não conseguem se ligar a uma matriz, as células evoluem para a apoptose.
(45)
Defeitos na interação entre moléculas de adesão possuem papel importante no
desenvolvimento do câncer e a presença ou ausência destes, contribui para o desenvolvimento
das características das células neoplásicas, que são: crescimento incontrolado, invasividade
local e capacidade de metastatização. Á medida que o tumor se desenvolve, as propriedades
de adesão de suas células modificam-se e elas desligam-se da massa tumoral e adquirem a
capacidade de migrar e invadir outros órgãos. Estas características podem surgir quando as
células neoplásicas reduzem a produção de proteínas da matriz, como a fibronectina, e
tornam-se capazes de descolar-se do tumor. Outras células podem perder as E-caderinas (que
estabilizam as ligações moleculares entre células adjacentes) e, desta forma, tornar-se móveis
e invasivas. O nível de expressão da integrina
V
3
correlaciona-se com a invasividade dos
melanomas e a expressão da integrina
2
1
aumenta a tendência de metastatização dos
rabdomiossarcomas. O tripeptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) bloqueia várias
integrinas através da interação com seus ligantes, inibindo o comportamento invasivo de
células de melanoma in vitro e, reduzindo o número de depósitos metastáticos destas células
in vivo.
(49,50)
Desta forma, parece que o desenvolvimento de uma célula tumoral e sua disseminação
seguem mecanismos semelhantes, havendo perda de adesão por diminuição da função das
22
caderinas, seguida pela aquisição de receptores que fornecem propriedades invasivas e
migratórias para as células, através da ação das integrinas.
(50)
Durante a progressão do crescimento tumoral ate metástases, sinais específicos das
integrinas permitem as células cancerosas desanexarem-se das células vizinhas, re-orientar a
polaridade durante a migração, sobreviver e multiplicarem-se no microambiente. Há
crescentes evidencias de que determinadas integrinas associam-se a receptores tirosina
kinases (RTK) para ativar as vias de sinalização que são necessárias para a invasão tumoral e
metástases. O efeito destas integrinas pode ser especialmente importante em células que
possuem mutações ou amplificações dos genes que codificam estes RTK.
(26,51)
E cada vez mais claro que as células neoplásicas realçam a expressão das integrinas
em prol da proliferação, sobrevivência e migração, considerando que eles tendem a perder a
expressão das integrinas que exercem efeito oposto. Embora a sinalização das integrinas
contribui para o crescimento tumoral, alguns estudos sugerem que a desregulação da RTK-
Integrina seja crucial a invasão tumoral e metástases. As integrinas exercem um controle
especifico e rigoroso sobre a ação dos RTKs.
(26,51)
Um estudo de revisão propôs que mudanças nas integrinas, em conjunto com
mutações ativadoras em certos RTKs, como ERB-B2 e Met, ocasionem junções constituídas
da sinalização de integrina-RTK, que permitem as células tumorais migrarem e proliferarem
independentemente da posição confinada. Também, muitas integrinas estão localizadas em
uma posição de superfície da célula e ativam proteases que degradam a matriz, como as
metaloproteases de matriz e plasmina. Ambos os tipos de mudanças são provavelmente a
chave para a invasão tumoral e metástase. E provável que cada tipo de tumor siga
características e mudanças dinâmicas na expressão das integrinas durante a progressão do
tumor. Estudos futuros irão desvendar toda a complexidade dessas mudanças, e pode muito
bem ficar claro, que algumas mudanças são mais importantes do que outras. Será então
necessário para testar a relevância destas mudanças na expressão e sinalização das integrinas
em modelos de câncer. Uma validação genética da existência de integrinas pró-neoplasicas
deve abrir o caminho ao desenvolvimento de terapia anti-integrina para tratamentos.
(26)
As integrinas sinalizam uma série de eventos, entretanto, não possuem atividade
enzimática intrínseca. A transdução do sinal pela interação do ligante depende, portanto, do
recrutamento de moléculas sinalizadoras cruciais, em particular, quinases de proteínas,
quinases de lipídeos, GTPases e fosfatos. Vários caminhos sinalizadores ativados por
integrinas também são ativados por receptores de fatores de crescimento.
(52)
23
2.6. Integrina alfa(v) beta(3) (v3)
Entre o grupo das integrinas, um dos membros mais importantes é o receptor alfa(v)
beta(3) (
V
3
), que parece ser regulado durante o desenvolvimento tumoral. O receptor
integrina
V
3
também desempenha papel significativo na angiogênese tumoral, apoptose e
no processo de transdução de sinais. Na angiogênese, as células do endotélio aumentam a
expressão da integrina
V
3
, que nesta atua como um constituinte de superfície que
potencializa a invasão e proliferação celular. Estudos recentes mostram que a colagenase
MMP-2 liga-se diretamente a integrina
V
3
na superfície das células tumorais invasivas,
facilitando a invasão celular.
(50)
Antagonistas da integrina
V
3
podem induzir a apoptose de
células vasculares, reduzindo o suprimento sangüíneo para tumores sólidos.
(45)
A integrina
V
3
possui também a propriedade de fagocitose celular durante à
apoptose e pode participar de processos de remodelação óssea. Descrita também como
receptor de vitronectina, a integrina
V
3
pode ser encontrada em uma grande parte de células
originadas do mesenquima. É importante a propriedade desta integrina pela sua afinidade por
proteínas adesivas como vitronectina, fibronectina, fibrinogênio, laminina, colágeno e fator de
Von Willebrand, colágeno tipo I e osteopondina.
(53)
As integrinas envolvidas na migração
celular são altamente expressadas nas células tumorais, como a integrina
V
3,
que é
responsável pela ligação das proteínas com a matriz extracelular.
(28,54)
A integrina em questão já teve sua estrutura tridimensional determinada e, embora
com mecanismos de ativação propostos ainda controversos, parece haver o envolvimento de
duas diferentes conformações: uma em que os domínios citoplasmáticos e trans-membrânico
das subunidades alfa e beta estejam alinhados e próximos um ao outro e os segmentos
extracelulares dobrados em forma de “V”, semelhante a um joelho entre os módulos
(conformação inativa) e outra, com os domínios separadamente alinhados, com os segmentos
extracelulares assumindo uma conformação mais vertical (conformação ativa).
(48)
O estado de repouso inativo das integrinas, em que apresentam baixa afinidade por
ligantes, é ativado de dentro da célula por meio das regiões citoplasmáticas e trans-membrana
(sinalização "inside out"). A ativação pode ser induzida pela ligação da talina à região
citoplasmática da subunidade beta e resulta em uma certa separação dos domínios
citoplasmáticos e levantamento e alinhamento das regiões extracelulares. O movimento das
hélices do domínio beta-A leva ao reposicionamento dos íons metálicos, causando aumento de
afinidade pelos ligantes extracelulares. Após a interação com ligantes extracelulares, ocorrem
24
mudanças na mobilidade lateral das integrinas na membrana plasmática, introduzindo
agrupamento de integrinas. Estes agrupamentos parecem ser importantes para desencadear a
ativação de diferentes cascatas de sinalização citoplasmáticas (sinalização de "outside in").
(48,55)
2.7. Invasão celular tumoral
Para atingir os vasos sangüíneos ou linfáticos, as células tumorais devem penetrar no
estroma. Pelo menos três mecanismos podem estar envolvidos na invasão tecidual das células
tumorais. Em primeiro lugar, a pressão mecânica produzida pela rápida proliferação
neoplásica pode forçar as células ao longo de planos teciduais de menor resistência. Em
segundo lugar, o aumento da motilidade celular também pode contribuir para a invasão e, por
fim, a secreção pelas células tumorais invasivas de substâncias que degradam a membrana
basal, fazem com que ela se torne permeável não apenas a moléculas, mas também às células
invasivas.
(04,12,14,15)
O aumento da motilidade da célula tumoral é precedido pela perda das forças coesivas
entre as células, o que, nas células epiteliais, se associa à diminuição da expressão das E-
caderinas (glicoproteína de superfície envolvida na coesão homotípica célula-célula
dependente de cálcio). As E-caderinas localizam-se no complexo de junção epitelial e são
responsáveis pela organização, manutenção e morfogênese dos tecidos epiteliais.
(56)
Níveis
reduzidos de E-caderinas associam-se à diminuição da diferenciação celular tecidual e ao
aumento do grau em carcinomas. Carcinomas diferenciados expressam níveis mais elevados
de RNA mensageiro de E-caderinas do que carcinomas mais indiferenciados. Mutações do
gen das E-caderinas e anormalidades da alfa-catenina (uma proteína associada às E-caderinas)
associam-se à transição de células de um fenótipo não invasivo a um fenótipo invasivo. Além
disso, a transição do DNA que codifica as E-caderinas para o interior de células invasivas
inibe sua motilidade
(57)
, o que se associa com alterações nos elementos do citoesqueleto e
com resposta ao fator de automotilidade das citoquinas
(58)
, fator cicatricial (scatter)
(59)
,
tromboplastina, matriz extracelular e monoquinas derivadas de monócitos.
(60)
Outra característica das células tumorais invasivas é a secreção de enzimas capazes de
degradar as membranas basais, as quais servem como barreira entre as células epiteliais e o
estroma. Células epiteliais e estromais produzem uma mistura de colágenos, proteoglicanos e
outras moléculas que contêm ligantes para receptores de adesão, o que confere
25
permeabilidade para moléculas, mas não para células. Células de câncer de cólon também
secretam componentes da membrana basal, como a laminina.
(61)
Carcinomas de cólon bem
diferenciados produzem grande quantidade de lamininas, enquanto carcinomas menos
diferenciados produzem células com membrana basal descontínua, pobre em laminina.
(62)
Uma
diminuição do conteúdo de laminina também é demonstrada nas membranas basais de pólipos
adenomatosos displásicos, mas a descontinuidade da membrana basal é vista apenas nos
carcinomas de cólon.
(63)
Os proteoglicanos, incluindo sulfato de condroitina, sulfato de
heparina, hialuronato e heparina são outros constituintes maiores da matriz extracelular, cuja
principal função é ser reservatório para fatores de crescimento que podem ser liberados na
forma ativa através da degradação da matriz extracelular.
(64)
Para invadir a membrana basal, uma célula tumoral deve inicialmente ligar-se aos
componentes da matriz extracelular através de uma interação receptor-ligante. Um grupo de
tais receptores de superfície são as integrinas, que se ligam especificamente a laminina, ao
colágeno ou a fibronectina.
(65,66)
Diversas integrinas que se ligam a diferentes componentes da
matriz extracelular estão expressas na superfície de células de carcinomas humanos.
Progressão tumoral tem sido associada à diminuição gradual da expressão de integrinas,
sugerindo que a perda destas, associado à perda de E-caderinas, pode facilitar o descolamento
da neoplasia primária.
(67)
2.8. Integrinas e câncer
O papel das integrinas na progressão tumoral e na formação de metástases é
dicotômico. A expressão diminuída de algumas integrinas associa-se a transformação celular
e tumorigênese, como no caso das integrinas alfa(5) beta(1) e alfa(2) beta(1) no carcinoma de
cólon e no tecido mamário, respectivamente.
(68,69)
Por outro lado, a expressão de algumas
integrinas correlaciona-se diretamente com a gênese e a progressão tumoral. A integrina
alfa(v) beta(3) está presente no melanoma metastático, mas não em lesões melanocíticas
benignas e, esta freqüentemente expressada em osteossarcomas, neuroblastomas, carcinomas
de pulmão, mama, próstata e bexiga, glioblastomas e melanomas invasivos.
(70,71)
Anticorpos
contra a integrina alfa(v) bloqueiam o crescimento de melanomas humanos transplantados em
camundongos.
(72)
A expressão de integrina alfa(6) está aumentada no câncer de orofaringe,
de bexiga e de pulmão.
(73-78)
26
Evidências clínicas e pré-clínicas indicam que as integrinas vasculares podem ser
alvos terapêuticos válidos e que a inibição da função da integrina alfa(v) beta(3) suprime
eficientemente a angiogênese e inibe a progressão do tumor.
(79)
Estratégias anti-angiogênicas tem apresentado progresso para o tratamento do câncer e
prevenção da recidiva e metástases. As integrinas são uma família de moléculas de adesão
celular constituída por duas subunidades (alfa e beta) trans–membrana, ligadas não-
covalentemente e pesquisas têm demonstrado que a sinalização da integrina desempenha um
papel-chave na angiogênese tumoral e nas metástases. A integrina
V
3
é altamente expressa
em células endoteliais ativadas e em células tumorais, mas não está presente em células
endoteliais que estejam em repouso e na maioria dos sistemas orgânicos normais, o que a
torna um alvo adequado para a terapia anti-angiogênica.
(80)
2.9. Integrinas e câncer de colo uterino
Dentre as integrinas estudadas em câncer de colo uterino, temos as seguintes: a(v)b(3),
a(IIb)b(3), a(2)b(1), a(3)b(1), a(5)b(1), a(6)b(4), a(10.1.2), a(v), a(2), a(3), a(4), a(5), a(6),
b(1) e b(4). A integrina
V
3
é considerada uma das mais importantes moléculas de
superfície celular que regulam as propriedades invasivas das células cervicais tumorais devido
a sua atividade gelatinase / metaloproteases de matriz.
(81,82)
As metaloproteases de matriz (MMP) são proteínas de membrana capazes de digerir a
matriz extracelular. Estudos sugerem que a MMP-2 liga-se a integrina
V
3
na superfície das
células cervicais neoplásicas, facilitando a invasão celular tumoral.
(82,83)
A integrina beta 3, além de desempenhar um papel importante na angiogênese,
também é expressa em vários tipos de câncer de células epiteliais. No estudo que avaliou o
valor prognóstico da expressão desta integrina em pacientes com câncer do colo uterino, tanto
em carcinomas epidermóides ou adenocarcinomas, em biópsias dos mesmos, com a análise de
imuno-histoquímica para integrina beta 3, o impacto da imunorreação na sobrevida foi o
objetivo principal, avaliado por análise uni e multivariada e, sua correlação com
características clinico-patológicas. A integrina beta3 foi expressa em 61% dos pacientes. As
curvas de sobrevida livre de progressão local, sobrevida livre de metástases à distância e
sobrevida causa-especificas foram significativamente menores (P-valores de acordo com o
teste log-rank: 0,002, 0,04 e 0,01, respectivamente) em pacientes com expressão de integrina
beta3. O impacto prognóstico deste parâmetro foi superior à de outros parâmetros
27
prognósticos conhecidos e permaneceu estatisticamente significativo na análise
multivariada.
(84)
Os carcinomas epidermóides de colo uterino são histologicamente compostos de ilhas
de células tumorais cercadas por volumes variáveis de estroma tumoral, influenciados pelo
TGF-beta(1) local. O TGF-beta(1) é secretado em um complexo inativo com o peptídeo
associado à latência (LAP). Tanto o LAP como as proteínas da fibronectina da ME são
ligantes importantes para o receptor das integrinas. A integrina alfa v beta 6 é fracamente
expressa em epitélio normal, mas em diferentes carcinomas ela geralmente reflete um
fenótipo mais agressivo. Na análise da expressão desta integrina por imunohistoquímica, em
pacientes com neoplasia de colo uterino com estágio FIGO IA a IIB e, em NIC e metástases
linfonodais, o epitélio normal evidenciou fracamente a expressão, mas, nos carcinomas, a
forte expressão celular correlacionou-se diretamente com parâmetros clinico-patológicos e
com uma pior sobrevida global e sobrevida livre de doença.
(85)
À expressão das integrinas em neoplasias cervicais foram também estudadas através de
imunohistoquímica, em exames coletados através de colposcopia, em um estudo prospectivo.
Neste, foram empregados anticorpos monoclonais contra integrinas beta 1-4, alfa 1-6 e alfa v.
A beta 1, beta 4, alfa 2, alfa 3, alfa 6 e alfa v foram expressas pela camada basal do epitélio
escamoso normal cervical e por células displásicas na NIC I e II; em NIC III, estas integrinas
foram expressas, tanto no epitélio da ectocérvix quanto restrito à camada basal. Nestes
últimos casos, a expressão da integrina foi restrita em um maior grau pelo epitélio escamoso
displásico, sendo que os padrões de expressão das integrinas diferem nas células neoplásicas
cervicais do que no epitélio cervical normal.
(86)
As integrinas desempenham um papel importante no crescimento celular,
desenvolvimento, morfologia, sinalização e também no desenvolvimento tumoral. Entre o
grupo de receptores da superfície celular das integrinas, um dos mais importantes membros é
o receptor da integrina
V
3
. Esta integrina também e conhecida como receptor da
vitronectina, que é uma glicoproteína adesiva, conhecida por promover a fixação e a
propagação de diferentes tipos de células in vitro. Evidências dizem que a expressão deste
receptor é regulada durante o desenvolvimento tumoral e muitos estudos tem sido realizados
para determinar o papel da alfa(v) beta(3) em melanomas humanos, sendo que a expressão
deste receptor em melanomas metastáticos, sugere um papel para esta integrina na regulação
da proliferação tumoral. O receptor da integrina
V
3
também desempenha um papel
significativo na angiogênese, apoptose e transdução. Estudos recentes mostram que a MMP-2
28
colagenase liga-se diretamente a integrina alfa(v) beta(3) na superfície de células tumorais
invasivas e facilita a invasão de células tumorais. No estudo da expressão do receptor da
integrina alfa(v) beta(3), tanto em tecidos neoplásicos e normais de colo uterino, pois sendo o
receptor ligante da interação um fenômeno da superfície celular, a fração da membrana do
tecido tumoral foi separada e, a expressão do receptor da integrina alfa(v) beta(3) analisada
por ELISA e imunoprecipitação da fração protéica extraída da membrana. Comparativamente,
ELISA e imunoprecipitação claramente demonstraram muito maior expressão de integrina
V
3
na fração de membrana em tumores cervicais malignos humanos do que em frações de
membrana de tecidos não malignos.
(50)
Ambas as subunidades das integrinas possuem um grande domínio extracelular, um
domínio trans-membrana e um curto domínio citoplasmático. As subunidades beta da maior
parte das integrinas são marcadamente semelhantes, enquanto que as alfas, demonstram uma
considerável seqüência heterogênea. Com este resultado, a subunidade alfa parece conferir à
especificidade ligante das varias integrinas. A interação entre uma integrina em particular e
seu ligante são fatores chaves associados a transdução intra-celular dos sinais. A porção
citoplasmática das integrinas provavelmente apresente interação a proteínas especificas do
citoesqueleto, como a talina e a fibulina, que mediam a transmissão de sinais do exterior ao
interior da célula. Outras proteínas, como as fibronectinas, podem ligar-se as integrinas e
induzir mudanças celulares, que podem alterar as propriedades adesivas das células; talvez
desempenhando um papel na invasão, migração e metastatização das células tumorais.
(45,46)
Embora exista uma ampla evidencia para sugerir que a adesão celular seja vital ao
processo carcinogênico, há pouco conhecimento sobre o papel das integrinas no carcinoma de
cervix uterino. Assim, um estudo publicado, com o objetivo de determinar e comparar a
expressão da alfa 2, alfa 3, alfa 4 e alfa 5 sub-unidades da integrina beta 1, tanto em tecidos
normais e tumores de cervix uterina, em 22 amostras de tecido (04 normais e 18 tumores),
através de imunohistoquímica (IH), onde os resultados foram mensurados pela seguinte
classificação na observação microscópica em relação à intensidade da coloração da integrina:
ausente (0), fraca (1), moderada (2) ou forte (3); a análise estatística empregada foi o teste de
Wilcox para dados não paramétricos. As laminas foram avaliadas independentemente por
microscopia ótica por dois dos autores e as observações diferentes foram resolvidas
conjuntamente. Nos resultados, a integrina alfa 2 e alfa 3 coraram mais intensamente no
epitélio normal da cervix do que no estroma (p=0,03). A alfa 4 e alfa 5 coraram similarmente
tanto o estroma e no epitélio normal. A alfa 2 esteve ausente no estroma de todos os
29
espécimes de tumor, apesar de estar presente nas regiões epiteliais de 14 de 18 tumores. A
alfa 3 apresentou uma maior intensidade de coloração no estroma do tumor do que nas regiões
do epitélio (p=0,002). Tanto a alfa 4 e alfa 5 estavam ausentes nas regiões epiteliais do tumor,
mas presentes no estroma. Nas conclusões, tanto a distribuição e a intensidade da expressão
da integrina em câncer cervical diferem de sua expressão no colo normal. Em particular, a alfa
4 e alfa 5, estiveram ausentes nas regiões epiteliais dos cânceres cervicais, e a alfa 3 também
apresentou expressão reduzida no epitélio maligno. Estas alterações se correlacionam bem
com as mudanças esperadas na transformação maligna. Embora sendo um estudo
observacional pequeno, foi o primeiro a descrever a distribuição e a intensidade da expressão
da integrina em câncer cervical. Nestes resultados preliminares, os tumores apresentaram
padrão diferente de expressão de integrina do que a cérvix normal.
(87)
30
3. HIPÓTESE
A presença da expressão imunohistoquímica de integrina alfa v beta 3 (
V
3
) em
amostras de carcinoma invasor e lesões intraepiteliais de colo uterino associa-se com o
prognóstico das pacientes.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Avaliar a presença da expressão imunohistoquímica da integrina
V
3
em lesões
malignas e pré-malignas de colo uterino.
4.2 Objetivos específicos
Classificar os achados por tipo histológico e estadiamento nos casos de doença
maligna e em lesões intraepiteliais.
Associar os resultados com o prognóstico e o desfecho das pacientes.
31
5. REFERÊNCIAS DA REVISÃO DA LITERATURA
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38
6. ARTIGO CIENTÍFICO REDIGIDO EM INGLÊS
* Abstract enviado ao XXVIII Internacional Congress of the International Academy of
Pathology.
Integrin alpha(v) beta(3) expression in premalignant and malignant lesions of the
uterine cervix.
39
Integrin alpha(v) beta(3) expression in premalignant and malignant lesions of the
uterine cervix.
Lieverson Augusto Guerra
1
, Daniela Dornelles Rosa
1,2
, Daniela Augustin Silveira
3
,
Maria
Isabel Albano Edelweiss
1,4
1
Postgraduation Program in Medicine: Medical Sciences, Federal University of Rio Grande
do Sul, Porto Alegre, Brazil.
2
Research Unit, Hospital Femina, Grupo Hospitalar Conceição, Porto Alegre, Brazil.
3
Department of Pathology, Hospital São Vicente de Paulo and University of Passo Fundo,
Passo Fundo, Brazil.
4
Department of Pathology, Hospital de Clinicas of Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil.
Correspondence
Lieverson Augusto Guerra, MD
R. Marcelino Ramos 83/803, ZIP Code 99010-160.
Passo Fundo, RS, Brazil.
Phone number 55 54 30457007
e-mail: [email protected]
40
ABSTRACT
Cervix cancer has a high prevalence in Brazil, representing 10% of all malignant diseases in
women. For the year of 2010 there is an estimative of 18,430 new cases of cervix cancer in
Brazil. A high rate of women with locally advanced disease will recur after primary treatment
with chemoradiation, and there are only few therapeutic options available for the recurrent
setting. Therefore, there is a need to study new therapeutic targets as well as new prognostic
factors for cervix cancer. Preclinical studies showed that the expression of several integrins
are associated with neoplastic cellular invasion, angiogenesis and carcinogenesis.
OBJECTIVES: To evaluate the expression of alpha(v) beta(3) integrin in premalignant and
malignat lesions of the uterine cervix and to associate its expression with the outcome of
patients with cervix cancer. METHODS: A retrospective cohort study was performed in the
Pathology Unit of Hospital Sao Vicente and in the Pathology Institute of Passo Fundo,
Southern Brazil. Archives of patients with premalignat or malignant lesions of the cervix
diagnosed from 2001 to 2008 were reviewed and their paraffin-embedded blocks were
selected. Immunohistochemistry (IHC) was performed with the specific alpha(v) beta(3)
(
V
3
) mouse monoclonal antibody BV3 (Abcam, Inc. Cambridge, MA) with a dilution of
1:400. Two gynecologic pathologists independently analyzed the results. RESULTS: It was
possible to obtain clinical and pathological data from 146 patients. The interobserver kappa
concordance for the IHC results was 0.808 (p<0,05). The
V
3
integrin was expressed in only
22 cases (15,06%). From these positive cases, 45,5% had the diagnosis of premalignant lesion
and 54,5% of cervix cancer. There were no differences in disease-free survival for patients
with cervix cancer with
V
3
expression compared to those without expression.
CONCLUSIONS: There was no association of
V
3
integrin expression with the outcome of
patients with cervix cancer.
KEY-WORDS: Integrins, alpha(v)beta(3), cervix cancer, immunohistology,
v
3
integrin
.
41
INTRODUCTION
Cervix cancer has a high prevalence in Brazil, representing 10% of all malignant
diseases in women. For the year of 2010 there is an estimative of 18,430 new cases of cervix
cancer in the country.
1
Within the complex cascade of events involved in the process of invasion and
migration through the basement membrane and extracellular matrix (ECM) surrounding the
tumor epithelium, with subsequent invasion of the basement membrane of the endothelium of
blood vessels sites are the integrins and proteases, including matrix metalloproteinases
(MMP) and cathepsins.
2-4
The effects of ECM cells is mainly mediated by integrins, which
are a large family of cell surface receptors that bind and also mediate adherence to
components of ECM, organize the cytoskeleton and activate intracellular signaling pathways.
Each integrin consists of two transmembrane subunits type I alpha (α) and beta (β). There are
18 alpha and 8 beta subunits, associated in various combinations to form 24 integrins that can
bind to distinct but partially overlapping, subsets of ECM.
5,6
Among the group of integrins, one of the most important members is the receptor
alpha(v) beta(3) (
V
3
or vitronectin receptor), which appears to be regulated during tumor
development. This receptor also plays significant role in tumor angiogenesis, apoptosis and
the process of signal transduction.
7
Antagonists of integrin alpha(v) beta(3) (
V
3
) can
induce apoptosis of vascular cells, reducing the blood supply to solid tumors.
8
Although there is ample evidence to suggest that cell adhesion is vital to the
carcinogenic process, little is known about role of
V
3
integrins in malignant and
premalignant lesions of uterine cervix. We designed a cohort study to evaluate the role of
expression of integrin
V
3
in samples of malignant and premalignant lesion of cervix uterine.
MATERIAL AND METHODS
A retrospective cohort study was performed in the Pathology Unit of Hospital Sao
Vicente and in the Pathology Institute of Passo Fundo, Southern Brazil. Archives of patients
with premalignant or malignant lesions of the cervix diagnosed from 2001 to 2008 were
reviewed and their paraffin-embedded blocks were selected. The immunohistochemistry
(IHC) technique consisted of dewaxing sections (3 mm thick) of paraffin-embedded biopsy
material in xylene (three changes), followed by rehydration in ethanol. The sections were then
42
rinsed twice in Tris-buffered saline (TBS: 50mM Tris/HCl (pH 7.4) containing 100mM
sodium chloride). Endogenous peroxidase activity was suppressed by treatment with 0.3%
hydrogen peroxide in TBS for 10min. Sections were then treated in a microwave oven
(180W) for 15min and treated with 1% BSA(Bovine serum albumin in TBS) for 10min to
block unspecific binding. They were then incubated with the first antibody: mouse
monoclonal
V
3
(BV3, Abcam, Inc. Cambridge, MA) in a dilution of 1:400. Subsequently,
the sections were exposed to an affinity-purified biotinylated second antibody (anti-mouse EO
433; Dako, Glostrup, Denmark) diluted 1:200 in TBS for 45min at room temperature, washed
three times in TBS and then treated with the avidin–biotin–peroxidase complex (LSAB,
Dako) for a similar period at the same temperature. The reaction product was revealed with
diaminobenzidine tetrahydrochloride (Kit DAB, Dako). As positive controls we used blocks
of malignant melanoma, strongly positive for the antibody (figure 1). Negative controls were
slides with no
V
3
antibody. All slides were independently evaluated under light microscope
by two pathologists. The results were categorized as positive or negative for integrin
V
3
(Figure 2 shows examples of positive cases). Differences were solved by consensus.
Tumour staging was ascertained by clinical examination under anaesthesia, by chest
X-radiography and by computer tomography (CT) of the pelvis. Statistical analysis performed
using SPSS software (Statistical Package for Social Sciences) version 16.0. Descriptive
analysis were made using frequency tables and charts for qualitative variables and measures
such as average, minimum, maximum, median and standard deviation (SD) for quantitative
variables. The relationship between the expression of integrins and clinical and pathological
findings was performed using the Student t test for independent samples (continuous
variables) and the Fisher Exact Test (categorical variables).
This study was approved by the Medical Ethics Committee of the Hospital Sao
Vicente de Paulo and Research Ethics Committee of University of Passo Fundo, with
registration 167/2009, CAAE n 0111.0.398.000-09. This research followed the resolution
196-96, the National Health Council, which regulates research involving human subjects in
Brazil.
RESULTS
We selected 150 samples from a total of 150 patients diagnosed from November 2001
to November 2008. A representative section of each block was examined under optical
43
microscopy with a hematoxylin and eosin stain (HE), to confirm the diagnosis. Four cases
were excluded due to absence of tumor (two cases) and massive necrosis (two cases). A total
of 146 cases were selected for analysis. The mean age of patients at diagnosis was 42,7 years
(18-88). Most patients were Caucasian (140 patients; 95.9%). There were seventeen disease-
related deaths (11.6%) and two deaths not related to the disease (1.4%). Until January 2009,
127 patients were alive and without evidence of disease (87%). The Kappa coefficient
value was 0.808, showing substantial agreement between the two pathologists.
The distribution of patients according to diagnosis and stage is showed in table 1. The
expression of integrin
V
3
by IHC is showed in table 2. There was expression in only 22
cases (15%). There was no statistically significant association between stage of malignancy
and
V
3
expression (p = 0.585).
From the positive cases, 54.5% were invasive cancers. There were no differences in
the expression of
V
3
integrin in premalignant and malignant lesions (p = 0.979) (table 3).
There were 19 deaths, 17 of them related to the disease and two from other causes.
The expression of integrin
V
3
was positive in only 1 case of disease-related death. The
median survival for patients who expressed
V
3
integrin was 25.7 months and for those that
did not express
V
3
integrin it was 32.5 months (p=0.94).
DISCUSSION
We have found no association between
V
3
integrin expression and stage of cervical
lesions or prognosis of patients with invasive cervical cancer.
The integrin
V
3
has been implicated in the pathophysiology of several malignant
tumours.
9-11
Different from our results, Chattopadhyay et al found that the
V
3
integrin
receptor was highly expressed on the membrane fraction of malignant human cervical tumor
tissues and comparatively low in the membrane fraction of nonmalignant cervical tumor
tissues.
7
Accordingly, tumor progression of human melanoma from low to high metastatic
phenotype was accompanied by an increase in the expression of the
V
3
receptor
12
and that
melanoma tumorigenicity depended on the expression of alpha v integrins and availability of
vitronectin in situ.
10
The same results were found for beta 3-integrins which expression was
associated with an impaired outcome, irrespective of the level of immunoreactivity, in
patients with advanced stages of cervical cancer.
11
44
The integrin family of cell surface receptors, proteases like collagenases, are among
the important molecules in determining the malignant and invasive properties of tumor cells.
A study with two human cervical tumor cell lines (SiHa and HeLa), showed that SiHa cells
have a much higher invasive property than HeLa cells, and this experimental findings indicate
that the
V
3
integrin receptor holds one of the key positions in determining the invasive
property of cervical cancer cell, by modulating other important regulatory molecules.
13
Still in
preclinical context, other evidence strongly indicate that the integrin
V
3
may regulate
matrix degradation and thereby modulate directed motility of human cervical cancer cells.
14
We have some hypothesis to justify our negative findings. First, we analyzed paraffin-
embedded blocks that were submitted to different tissue fixation and processing protocols
along the years. It is well known that fixation changes the chemical properties of tissue
constituents and alters three-dimensional protein conformation by cross-linking, with a great
impact on affinity and selectivity of antibodies.
15
Second, we analyzed a small number of
cases in each stage of invasive cervical cancer. Therefore, we suggest that the best way to
analyze immunoreactivity for
V
3
integrin in cervix cancer is to perform it prospectively.
Integrin positivity was related to both local and distant failure in patients with cervix
cancer treated with radiotherapy and might be more an indicator for a bad prognosis in
general than a predictor for radiation response.
11
In our study from 146 cases 34 were treated
with radiotherapy and only 3 of them had expression of
V
3
integrin. Therefore, it was
difficult to make any conclusions regarding the impact of
V
3
integrin expression in the
response to radiation therapy.
CONCLUSIONS
There was no association between the expression of
V
3
integrin in patients with
invasive cervical disease and in patients with intraepithelial cervical disease. Future
prospective studies with a higher number of patients may change these findings.
45
Figure 1. Malignant melanoma positive for the
V
3
integrin antibody (1:400 dilution)
Figure 2 - Positive immunohistochemistry for
V
3
in samples of invasive cervical cancer
(1:400 dilution).
Table 1 – Distribution of patients according to diagnosis and stage of cervical neoplasia.
Stage n %
Cervical cancer stage IA 14 9,6
Cervical cancer stage IB 7 4,8
Cervical cancer stage IIA 6 4,1
Cervical cancer stage IIB 15 10,3
Cervical cancer stage IIIA 7 4,8
Cervical cancer stage IIIB 18 12,3
Cervical cancer stage IVA 12 8,2
Cervical cancer stage IVB 1 0,7
In situ cervical carcinoma 13 8,9
Cervical intraepithelial neoplasia (CIN) I 14 9,6
CIN II 4 2,7
CIN III 35 24,0
Total 146 100,0
46
Table 2 –
V
3
immunohistochemistry results according to diagnosis and stage of disease.
IHC
V
3
Staging
Positive Negative
Total
CIN I 2 12 14
CIN II 1 3 4
CIN III 5 30 35
In situ 2 11 13
IA 5 9 14
IB 2 5 7
IIA 1 5 6
IIB 1 14 15
IIIA 1 6 7
IIIB 1 17 18
IVA 1 11 12
IVB - 1 1
Total
22 (15,1%) 124 (84,9%) 146 (100%)
* values are presented as n (%).
* p = 0.585 (Fisher's exact test).
Table 3 - Integrin
V
3
expression in premalignant and malignant cervical disease.
V
3
IHC
Lesions
Positive Negative
Total
Malignant 12 (15%) 68 (85%) 80 (100%)
Premalignant 10 (15%) 56 (85%) 66 (100%)
Total
22 124 146
p = 0,979 (Chi-Square)
47
REFERENCES
1. Brasil. Ministério da Saúde. Instituto Nacional de Câncer. Estimativa 2010: Incidência
de câncer no Brasil. INCA. 2009. 32-33.
2. Brooks SA, Lomax-Browne HJ, Carter TM, Kinch CE, Hall DM. Molecular
interactions in cancer cell metastasis. Acta Histochem. 2010;112(1):3-25.
3. Price JT, Thompson EW. Mechanisms of tumour invasion and metastasis: emerging
targets for therapy. Expert Opin Ther Targets. 2002;6(2):217-233.
4. Geiger T, Geiger B. Towards elucidation of functional molecular signatures of the
adhesive-migratory phenotype of malignant cells. Seminars in Cancer Biology 2010;
Article in Press. doi:10.1016/j.semcancer.2010.05.004.
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6. Hynes RO. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines. Cell 2002; 673-687.
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receptors in non-malignant and malignant human cervical tumor tissues. J Exp Clin
Cancer Res. 2001;20(2): 269-75
8. Frenette PS, Wagner DD. Adhesion molecules--Part 1. N Engl J Med
1996;334(23):1526-1529.
9. Vonlaufen A, Wiedle G, Borisch B, Birrer S, Luder P, Imhof BA. Integrin alpha(v)
beta(3) expression in colon carcinoma correlates with survival. Mod Pathol
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immunohistochemistry. European Journal of Neuroscience. 2008;28:2365-2370.
49
7. CONSIDERAÇÕES GERAIS
O carcinoma do colo uterino e as lesões pré-invasivas, são temas presentes no
cotidiano da pratica ginecológica, da oncologia clinica e da patologia. A despeito da elevada
incidência e prevalência destas entidades, é nítida a percepção de pequenos progressos
científicos na busca de novas opções. As mudanças na pratica clinica desta patologia são
infrequentes. Comparativamente a outras neoplasias, o investimento mundial na busca de
novas opções de tratamento, marcadores de resposta e alvos terapêuticos, são marcadamente
inferiores.
Esse estudo retrospectivo procurou contribuir com uma opção de marcador de
prognóstico e observou que não houve diferença significativa entre os casos de doença
maligna ou pré-invasiva do colo uterino e no desfecho das pacientes. Entretanto, os achados
do presente estudo reforçam a necessidade de estudos futuros prospectivos, com maior
numero de pacientes e avaliando com maior detalhamento, os diferentes tratamentos a que as
pacientes foram submetidas.
50
8. ANEXOS
8.1. Classificação TNM e Estadiamento FIGO do Carcinoma de Cérvix Uterino
Tumor Primário (T)
Categoria Estádio
* FIGO não inclui mais Estagio 0 (Tis)
** Todas as lesões macroscopicamente visíveis - mesmo com invasão superficial - são T1b/IB.
Fonte: AJCC - Cancer Staging Manual, Seventh Edition, 2010:395-402.
8.2. Técnica de imunohistoquímica
O Anticorpo Primário Mouse monoclonal [BV3] to Integrin alpha V beta 3, 50µg, foi
adquirido através de importação e, recebido em condições ótimas de transporte, com
embalagem preservada e congelados com cubos de dióxido de carbono (gelo-seco), na
temperatura de – 78,5º C. Neste, foi realizado diluições com a finalidade de obter-se alíquotas
TNM FIGO DEFINIÇÃO
TX (--)
Tumor primário não pode ser avaliado
T0 (--)
Sem evidencia de tumor primário
Tis *
Carcinoma in situ
T1 I
Carcinoma cervical confinado ao útero (extensão para o corpo deve ser desconsiderada)
T1a** IA
Carcinoma invasor diagnosticado apenas por microscopia. Invasão do estromal com profundidade
máxima de 5 mm (medida a partir da base do epitélio) e propagação horizontal de 7 mm ou menos. O
envolvimento de espaços vasculares, venosos ou linfáticos, não afeta a classificação.
T1a1 IA1
Invasão de estroma com 3 mm ou menos e propagação horizontal de 7 mm ou menos
T1a2 IA2
Invasão de estromal com mais de 3 mm mas menos de 5 mm e propagação horizontal de 7 mm ou
menos
T1b IB
Lesão clinicamente visível confinada ao colo do útero ou lesão microscópica maior que T1a/IA2
T1b1 IB1
Lesão clinicamente visível com 4 cm ou menos na sua maior dimensão
T1b2 IB2
Lesão clinicamente visível com mais de 4 cm na sua maior dimensão
T2 II
Carcinoma cervical invade além do útero, mas não chega na parede pélvica nem no terço inferior da
vagina
T2a IIA
Tumor não invade paramétrios
T2a1 IIA1
Lesão clinicamente visível com 4 cm ou menos na sua maior dimensão
T2a2 IIA2
Lesão clinicamente visível com mais de 4 cm na sua maior dimensão
T2b IIB
Tumor invade paramétrios
T3 III
Tumor estende-se a parede pélvica e ou envolve o terço inferior da vagina e ou causa hidronefrose ou
rim não funcionante
T3a IIIA
Tumor envolve o terço inferior da vagina, sem extensão a parede pélvica
T3b IIIB
Tumor estende-se a parede pélvica e ou causa hidronefrose ou rim não-funcionante
T4 IVA
Tumor invade a mucosa da bexiga ou do reto e ou estende-se além da pelve verdadeira (edema
bolhoso não é o suficiente para classificar um tumor como T4)
M1 IVB
Metástases distantes
51
de menor concentração e preservação de material congelado para posterior uso ou repetição
de testes na eventual necessidade.
Em espécimes de melanoma, houve a realização de testes em diluições de 1:10, 1:50,
1:100 e 1:400. As amostras consideradas positivas nas diluições foram definidas como sendo
o controle, semelhantemente ao empregado em outros estudos.
Nos blocos selecionados ao estudo, foi empregada a seguinte metodologia:
Primeiro Dia:
* corte dos blocos de parafina selecionados e colocados em lâminas “Immunoslide®” ,
com superfície adesiva característica própria da lâmina;
* as laminas permanecem na estufa a 60° C por período de uma noite (12 horas), com
intuito de melhor aderência dos cortes e início do processo de desparafinação.
Segundo Dia:
* desparafinação dos cortes com xilol (Alpha Quimica®) por 20 minutos;
* hidratação da seção de tecido com 05 mudanças de 03 minutos cada com álcool
absoluto;
* lavagem das laminas com água destilada;
* tampão PBS por 05 minutos;
* panela de pressão: tampão de citrato de sódio fervendo, onde as laminas são
colocadas; fervidas a 100° C por 02 minutos. Após, a panela é retirada do fogo e permanece
fechada por mais 01 minuto. Depois, a panela é aberta e resfria por mais 02 minutos;
* 05 minutos em tampão PBS;
* realiza-se bloqueio com água oxigenada em 03 trocas de 10 minutos cada;
* lavagem em água destilada;
* 05 minutos em tampão PBS;
* as laminas são secas cuidadosamente ao redor do tecido;
* passagem de marcador com finalidade de que o anticorpo não se espalhe;
* anticorpo primário - Integrina αv β3 - adicionado em quantidade suficiente para
cobertura sobre a amostra de tecido;
52
* as laminas são incubadas 24 horas, com o anticorpo primário, em câmara escura e
úmida;
Terceiro Dia:
* laminas são retiradas da câmara escura;
* 05 minutos em tampão PBS;
* remoção do excesso de tampão;
* aplicação do complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (LSAB, Dako®) por 30
minutos;
* 05 minutos em tampão PBS;
* remoção do excesso de tampão;
* aplicação para revelação, com diaminobenzidina tetraidroclorido (Kit DAB, Dako®)
por 20 minutos;
* lavagem com água destilada;
* coloração com Hematoxilina de Harris® por 01 minuto;
* lavagem por 05 minutos em água corrente;
* desidratar com álcool graduado, xilol.
Tampão PBS:
Tampão PBS (Laborclin®), pó, pH 7,2 - 0,1 ml , diluído em 1.000 ml de água
destilada.
Tampão Citrato de Sódio:
Diluição de 2,94 g de citrato de sódio(NA
3
C
6
H
5
O
7
.2H
2
O) em 1.000 ml de água
destilada, com 0,5 ml de ácido clorídrico 32% (HCl), com pH de 6.0.
53
8.3. Ficha de coleta de dados
Numero Prontuário HSVP
1. Nome_________________________________________________ 2. Idade
2. Endereço R.____________________________N.________B.________________
Telefone: ___________Cidade: PF ______________________________
3. Numero AP - 4. Data diagnóstico ..
4. Diagnostico: Epidermóide Adenocarcinoma
5. Estadiamento NIC I NIC II NIC III
Ca In situ I II III IV
A B
6. Grau: o I II III IV
7. Tipo de Tratamento:
o
Biópsia
Cone
Cirurgia Histerectomia / +- LNectomia
Radioterapia
7. Resultado IH Integrina 1:400: Negativo Positivo Duvidoso
8. Sobrevida:
Livre de doença
Óbito relacionado Data Óbito: ..
Óbito não relacionado Data Óbito: ..
Evidencia de doença / diagnóstico clinico ou firmado
Outra_____________________________________________
Excluir caso
7.Observações:_______________________________________________________________
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
8.4. Considerações éticas
Este projeto, foi aprovado pela Comissão de Ética Medica (CEM) do Hospital
São Vicente de Paulo da Universidade de Passo Fundo e pelo Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) da Universidade de Passo Fundo, com registro 167/2009, CAAE n 0111.0.398.000-09.
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