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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIÊNCIAS MÉDICAS
Análise de polimorfismos nos genes dos receptores de
serotonina 5-HT
1A
e 5-HT
2A
em pacientes deprimidos que
tentaram o suicídio
Rafael Rebelo e Silva
Orientadora: Prof
a
. Dra. Sandra Leistner-Segal
Porto Alegre, Julho de 2010
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL – Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas. Faculdade de
Medicina - Rua Ramiro Barcelos, 2400, 2º andar. 90035-003. Fone: #55 51 33085605. Fax: #55 51 33085606. E-mail:
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2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIÊNCIAS MÉDICAS
Análise de polimorfismos nos genes dos receptores de
serotonina 5-HT
1A
e 5-HT
2A
em pacientes deprimidos que
tentaram o suicídio
Rafael Rebelo e Silva
Orientadora: Prof
a
. Dra. Sandra Leistner-Segal
Porto Alegre, Julho de 2010
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL - Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas. Faculdade de
Medicina - Rua Ramiro Barcelos, 2400, 2º andar. 90035-003. Fone: #55 51 33085605. Fax: #55 51 33085606. E-mail:
ppgcm@ufrgs.br
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3
S586a Silva, Rafael Rebelo e
Análise de polimorfismos nos genes dos receptores de serotonina
5-HT1A e 5-HT2A em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio
/ Rafael Rebelo e Silva ; orient. Sandra Leistner-Segal. – 2010.
73 f. : il. color.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Sul. Faculdade de Medicina. Programa de Pós-Graduação em
Medicina: Ciências Médicas. Porto Alegre, BR-RS, 2010.
1. Depressão 2. Tentativa de suicídio 3. Polimorfismo genético 4.
Receptor 5-HT1A de serotonina 5. Receptor 5-HT2A de serotonina
I. Leistner-Segal, Sandra II. Título.
NLM: WM 171
Catalogação Biblioteca FAMED/HCPA
4
Dedico este trabalho...
... aos que se foram…
...aos presentes...
...aos que virão.
5
Agradecimentos
A Sandra Leistner Segal por todas as oportunidades, principalmente, a de fazer a
pós-graduação. Pela confiança, paciência na orientação, amizade e liberdade no
trabalho. Por permitir que eu me desenvolvesse.
Ao Jair Segal pela atenção, paciência, amizade e grande colaboração no
desenvolvimento desse trabalho, principalmente nas horas de ―sufoco‖.
Ao Giovanni Abrahão Salum pelo auxílio nas análises estatísticas.
A Luciana Hauber, pelo amor, carinho, compreensão e parceria.
Ao pessoal do Laboratório de Genética Molecular, Camila, Fabiana, Juliana, Paula,
Laila, Ana Carolina, Isabel, Taiana, Thais, Luiza, pela doce convivência.
A todos os bolsistas de iniciação científica, em especial os mais próximos, Juliana e
Roberto, pela ajuda no desenvolvimento dos trabalhos e pelos questionamentos que
sempre ajudaram a me manter atualizado.
A minha família, Pai, Mãe, Carolina, Felipe, Priscila, Paulinho, Marcelo, Carlos
Alberto Hauber, Saara Hauber, Maria Isabel, pelo apoio, suporte e segurança.
A Maria Lucia Scroferneker, pelo incentivo ao estudo, principalmente a pós-
graduação.
Aos meus amigos, por serem presentes na minha vida.
E aos parceiros de SURF.
6
Sumário
Lista de Abreviaturas e Siglas ..................................................................................... 7
Lista de figuras ............................................................................................................ 9
Resumo ..................................................................................................................... 10
Abstract ..................................................................................................................... 11
Introdução ................................................................................................................. 12
Epidemiologia do comportamento suicida ................................................................. 13
O comportamento suicida.......................................................................................... 15
A comorbidade e o comportamento suicida .............................................................. 16
Genética e o comportamento suicida ........................................................................ 18
Sistema Serotoninérgico e Suicídio ........................................................................... 21
Síntese de Serotonina ............................................................................................... 22
Receptores de Serotonina ......................................................................................... 26
Receptores 5-HT
1
................................................................................................... 27
Receptores 5-HT
1A
.............................................................................................. 28
Receptores 5-HT
2
................................................................................................... 29
Receptor 5-HT
2A
.................................................................................................. 30
Gene do receptor de serotonina 5-HT
1A
.............................................................. 32
Gene do receptor de serotonina 5-HT
2A
.............................................................. 34
Objetivos ................................................................................................................... 37
Considerações Éticas ................................................................................................ 38
Referências ............................................................................................................... 39
Artigo 1 ...................................................................................................................... 53
Considerações Finais ................................................................................................ 66
APÊNDICE A ............................................................................................................ 70
Anexo 1 ..................................................................................................................... 72
7
Lista de Abreviaturas e Siglas
5-HIAA Ácido 5-hidroxindolacético
5-HT 5-hidroxitriptamina ou Serotonina
5-HT
1A
Receptor de serotonina 1A
5-HT
2A
Receptor da serotonina 2A
5-HTP 5-hridroxitriptofano
5-HTT Transportador da Serotonina
5-HTTLPR Região polimórfica do gene do transportador de serotonina
Ach Acetilcolina
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
ARMS Amplification Refractory Mutation System
BDNF Fator neurotrófico derivado do cérebro
COMT Gene da Catecol Orto-Metiltranferase
DAG Diacilglicerol
DEAF1 Deformed Epidermal Autoregulatory Factor 1 (Drosophila)
DM Depressão Maior
DNA Ácido Desoxiribonucleico
DSM-IV Manual Diagnóstico e Estatístico dos Transtornos Mentais
GPCR Receptores ligados à proteína G
GTP Guanosina-trifosfato
HCPA Hospital de Clinicas de Porto Alegre
HPS Hospital de Pronto Socorro de Porto Alegre
HWE Equilíbrio de Hardy-Weinberg ou Hardy-Weinberg Equilíbrium
IADL Instrumental Activities of Daily Living scale
IP
3
Inositol trifosfato
LSD Dietilamida do ácido lisérgico
MAO Monoamino oxidase
MINI Mini Internatonal Neuropsychiatric Interview
NUDR Nuclear Deformed Epidermal Autoregulatory Factor
OMS Organização Mundial da Saúde
OR Odds ratio
pb Pares de base
PCR Polimerase Chain Reaction
8
PET Positron Emission Tomography Study
PIP
2
fosfatil-inositol-bifosfato
PKC Proteína quinase C
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
SIS Suicide Intent Scale
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Single Nucleotide Polymorphism
SSRIs Inibidores seletivos de serotonina
TOC Transtorno Obsessivo Compulsivo
TPH Triptofano hidroxilase
UFRGS Universidade Federal do Rio Grande do Sul
VNTR Variable Number Tandem Repeats
WHO Organização Mundial da Saúde, World Health Organization
9
Lista de figuras
Figura 1: Barreira hematoencefálica (transportador de triptofano) Pagina 23
Figura 2: Síntese de serotonina Pagina 24
Figura 3: Sistema serotoninérgico Pagina 25
Figura 4: Receptor de serotonina Pagina 27
10
Resumo
A presente pesquisa pretende mostrar que a participação de polimorfismos
específicos podem favorecer ou fornecer uma vulnerabilidade maior a determinados
indivíduos que, quando submetidos a condições específicas de estresse, podem
tentar o suicídio. Nos últimos anos, vem crescendo na literatura científica o número
de estudos que demonstram que o cérebro de vítimas de suicídio apresenta uma
alteração nos receptores de serotonina. Este estudo teve como objetivo verificar a
frequência dos polimorfismos dos receptores de serotonina 5-HT
1A
e 5-HT
2A
, em
pacientes deprimidos que tentaram o suicídio e em um grupo controle sem doença
psiquiátrica. O trabalho foi desenvolvido utilizando-se um banco de DNA de
pacientes deprimidos internados no Hospital de Pronto Socorro por tentativa de
suicídio. Para o grupo controle, foram utilizados indivíduos sem diagnostico
psiquiátrico, selecionados entre funcionários do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
A análise molecular do receptor 5-HT
1A
foi realizada através da técnica de PCR-
ARMS, e para o receptor 5-HT
2A
foi utilizada a técnica de PCR-RFLP. Os pacientes
com pelo menos uma cópia do alelo G do receptor de serotonina 5-HT
1A
,
apresentaram maior suscetibilidade à tentativa de suicídio do que os pacientes que
não apresentaram o alelo G (P=0.029). Além disso, esse efeito foi associado com a
amostra masculina (P=0.007). Os resultados dos testes para o receptor 5-HT
2A
indicaram uma associação do genótipo CC com o grupo controle (P= 0,046). Os
testes para verificar a influencia desse polimorfismo em relação ao gênero também
não foram significativos (P=0,224 e P=0,183). Baseado nos resultados pode-se
corroborar a hipótese de que, para os receptores 5-HT
1A,
a presença do alelo G
pode influenciar a atividade serotoninérgica nos homens. Assim, o alelo G torna-se
um possível fator de suscetibilidade para o sexo masculino, somando as condições
biológicas, ambientais e comportamentais, podendo resultar em uma maior
vulnerabilidade ao comportamento suicida. Para os receptores 5-HT
2A,
os resultados
não foram significativos, indicando que a presença do alelo polimórfico C não
oferece suscetibilidade para essa amostra de pacientes depressivos com tentativa
de suicídio.
11
Abstract
This research aims to show that the involvement of specific polymorphisms may
promote or provide an increased vulnerability to certain individuals who, when
subjected to specific conditions of stress, may have suicide attempts. In recent years,
the number of scientific papers showing that the brain of suicide victims present a
change in serotonin receptors is growing. This research aimed to check the
polymorphisms frequency of serotonin receptors 5-HT
1A
and 5-HT
2A
in depressive
patients with suicide attempts and in a control group without psychiatric disease. The
study was conducted using a DNA bank of depressive patients hospitalized in
Hospital de Pronto Socorro for attempted suicide. The control group, consisted of
individuals without psychiatric diagnosis, selected from employees of Hospital de
Clínicas de Porto Alegre. The molecular analysis of 5-HT
1A
receptor was performed
using the PCR-ARMS technique, and the 5-HT
2A
receptor was performed using the
PCR-RFLP technique. Patients with at least one copy of G allele of serotonin
receptor 5-HT
1A
, showed increased susceptibility to suicide attempts compared to
patients who did not have the G allele (P=0.029). Moreover, this effect was
associated with men (P=0.007). The results for the 5-HT
2A
receptor indicates an
association of CC genotype with the control group (P= 0,046). The tests to check the
influence of this polymorphism in relation to gender were not significant (P=0,224 and
P=0,183). Based on these results we can corroborate the hypothesis that, for the 5-
HT
1A
receptors the G allele may influence serotoninergic activity in men, by
decreasing the transcription of 5-HT
1A
receptors. Therefore, the G allele becomes a
possible susceptibility factor for males that, with the addition of biological,
environmental and behavioral conditions, may result in an increased vulnerability to
suicidal behavior. For the 5-HT
2A
receptors, the results were not significant, indicating
that the presence of the polymorphic C allele does not provide susceptibility for this
sample of depressive patients with suicide attempt.
12
Introdução
Algumas hipóteses têm sido questionadas por pesquisadores em todo o
mundo, buscando provar que fatores genéticos podem contribuir para o
comportamento suicida. O que a presente pesquisa pretende mostrar é que a
participação de determinado polimorfismo pode favorecer ou fornecer uma
vulnerabilidade maior a determinados indivíduos que, quando submetidos a
condições específicas de estresse, pode cometer atos autodestrutivos como
tentativas de suicídio. Isso não sugere ou significa que um único gene possa ser o
responsável por condutas suicidas. Não se afirma ou se acredita em determinismo
genético. Sabe-se que o comportamento suicida está relacionado com uma
combinação de fatores emocionais, sócio-culturais, filosóficos, religiosos e também
biológicos. Essa hipótese é baseada na observação e no atendimento cotidiano de
pacientes que tentam o suicídio no Hospital de Pronto Socorro da cidade de Porto
Alegre e também na revisão de diversos estudos publicados em revistas de genética
e psiquiatria de âmbito internacional.
Sabe-se que muitos sujeitos que tentaram o suicídio têm histórico familiar de
suicídio e de tentativas por parentes. A compreensão de uma situação complexa
como essa pode gerar alívio e estimular a busca de um tratamento adequado. A
negação ou a incompreensão sobre o que está se passando com o sujeito é que
pode ser trágica, como a literatura tem nos demonstrado.
Pensa-se que o tema suicídio é controverso, complexo e, por isso, delicado.
Muitas pessoas, inclusive aquelas com quadros depressivos, nunca tentarão o
suicídio. Mesmo assim, não podemos deixar de nos preocupar com aquelas pessoas
que já fizeram alguma tentativa e buscam entender o que se passa com elas. A
informação, o conhecimento e a melhor compreensão a respeito de uma doença ou
uma condição podem realmente beneficiar as pessoas que passaram por
determinada situação e, assim, evitar futuras tragédias pessoais e familiares. Este
projeto faz parte de um projeto maior que engloba a análise de vários genes que
podem estar envolvidos na suscetibilidade à impulsividade e à depressão,
reforçando esta linha de pesquisa emergente.
13
Epidemiologia do comportamento suicida
A cada ano, um milhão de pessoas comete o suicídio ao redor do mundo.
Estima-se no total que ocorram aproximadamente 30.000 suicídios por ano nos EUA
e 120.000 na Europa (Jamison, 2002). O coeficiente de mortalidade por suicídio para
a população geral mundial está entre 10 e 20 para cada 100.000 indivíduos. Embora
os dados epidemiológicos variem entre os diferentes países, o coeficiente brasileiro
está abaixo da média mundial. Entretanto, no Rio Grande do Sul, o coeficiente de
mortalidade por ano é duas vezes maior (9,88 suicídios para cada 100.000
habitantes por ano) que a média nacional (MS/SVS, 2006). No ano de 2007, a
mortalidade no Rio Grande do Sul por suicídio foi de 1099 pessoas, sendo 878 do
sexo masculino e 221 do sexo feminino, sendo que a maioria (911 pessoas) utilizou
métodos violentos (enforcamento e armas de fogo) (SIM/RS, 2008).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), o suicídio foi responsável
por quase 2% das mortes do mundo no ano de 1998, o que coloca essa condição na
frente de mortes causadas por guerras e bem à frente das mortes por homicídios.
De uma forma sucinta, a OMS define o ato suicida como auto-agressão, com graus
variados de intenção letal, e suicídio como um ato com desfecho fatal (WHO, 1999).
As tentativas de suicídio constituem o mais poderoso fator preditivo de um eventual
suicídio completo (Harris et al., 1997), além de provocar uma significativa morbidade
resultando em gastos significativos dos recursos de saúde. Segundo Mann (1999),
para cada suicídio ocorre cerca de 10 tentativas de suicídio. Embora as mulheres
façam mais tentativas de suicídio que os homens, estes tem uma mortalidade quatro
vezes maior que as mulheres em suas tentativas. Sabe-se que 80% dos suicídios
completos são de pessoas do sexo masculino (Roy, 1999). Estudos demonstram
que ser casado é um fator de proteção para os homens, enquanto ter um filho menor
de dois anos de idade é um fator de proteção para o suicídio nas mulheres
(Oquendo et al., 2007). O comportamento suicida apresenta-se em todas as idades
e constitui a terceira causa de morte entre adolescentes e adultos jovens menores
de 24 anos, e a quarta causa mais freqüente de morte nas crianças na faixa dos 10
aos 15 anos nos Estados Unidos (Roy, 2000). No Brasil, a mortalidade proporcional
14
por suicídio de maior magnitude é observada nas adolescentes de 15 a 19 anos
(Werlang e Botega, 2004).
Em 1999, a cidade de Campinas participou de um estudo multicêntrico de
intervenção no comportamento suicida (SUPRE), lançado pela OMS com a
participação de 8 países. Em 2005, foi criado um grupo de trabalho visando
estabelecer as diretrizes nacionais de prevenção ao suicídio (Portaria Ministerial nº
2.542 de 2005). E no ano de 2006, a Portaria Ministerial 1.876 criou as diretrizes a
serem implantadas em todas as unidades federadas. Assim, surgiu um manual
dirigido aos profissionais das equipes de saúde mental lançado no I Seminário
Nacional do Suicídio, ocorrido em 2006 em Porto Alegre (RS), como parte da política
a ser desenvolvida em todo o país.
Mesmo havendo definições sobre os fatores de risco e proteção do suicídio,
estes ainda se constituem insuficientes na prevenção e no tratamento do problema.
Muitos suicídios ocorrem de forma inesperada e outros, mesmo esperados por seu
risco, parecem ser imprevisíveis. Apenas uma minoria é desencadeada por eventos
estressantes em pessoas com uma vida emocional saudável e, nesses casos, o
risco de um comportamento suicida é geralmente temporário e potencialmente
passível de prevenção.
Paralelamente aos avanços científicos, as sociedades contemporâneas ainda
tratam o suicídio como algo vergonhoso, resultante de uma falência da
responsabilidade pessoal, da coesão familiar ou do sistema social. Esta visão
promove uma série de dificuldades na intervenção e na pesquisa desses casos e
impossibilita uma adequada notificação para fins estatísticos devido à subnotificação
ou informação de dados falsos. Botega (2000) alerta para a necessidade de se levar
em consideração a grande disparidade entre as regiões brasileiras, que determinam
níveis variados de dificuldade de registro, comprometendo a fidelidade dos dados e,
assim, podendo elevar os casos de subnotificação, tornando os dados ainda mais
alarmantes. Os suicídios comumente deixam de ser relatados, em parte porque os
suicidas disfarçam suas ações e em parte porque nas sociedades em que são vistos
sob um juízo moralista, a comunicação tende a ser evitada (Solomon, 2002).
15
O comportamento suicida
Da mesma forma que traços considerados de comportamento normal são
transmitidos de pais para filhos, certos transtornos mentais são comuns entre
pessoas de uma mesma família. Podemos considerar as doenças mentais ou
psiquiátricas como doenças complexas ou multifatoriais. São doenças que não
exibem um padrão de herança mendeliana de transmissão, mas exibem um padrão
de herança familiar, pois sofrem alguma influencia genética e tem origem ou causa
dita complexa. Há fatores genéticos e ambientais envolvidos na gênese destas
doenças e tais fatores podem ser tanto de risco como de proteção.
De acordo com o histórico familiar, pode haver uma maior suscetibilidade ou
predisposição genética do indivíduo para desenvolver um transtorno psíquico, porém
fatores protetores ambientais podem interferir na sua manifestação, diminuindo o
risco de ocorrência. A combinação de fatores genéticos e ambientais de risco e
fatores protetores contribui para a propensão individual de desenvolvimento de
transtornos. Outros fatores, como a idade de manifestação, gravidade da doença e
expressão dos sintomas clínicos, devem também ser considerados.
Nos últimos anos, foram constatadas evidências crescentes de que o
comportamento suicida tem forte determinante neurobiológico, não sendo apenas
uma resposta lógica a um estresse extremo. Estes determinantes neurobiológicos
podem ser independentes do transtorno psiquiátrico com o qual estão associados.
As pessoas que estão sob risco de suicídio tendem a fazer tentativas de modo
relativamente precoce, na evolução de seus quadros. (Malone et al., 1995). Para
compreender melhor o comportamento suicida, Mann (1998) sugere a construção de
um modelo que pode ser visto como um modelo diátese-estresse, explicando esta
suscetibilidade. A diátese (vulnerabilidade) determina como um indivíduo reage a um
evento estressor, e depende de fatores que moldam a sua personalidade como os
fatores genéticos e ambientais, experiências infantis, entre outros.
Ao considerar a depressão como um único fator, percebe-se que muitos
pacientes deprimidos nunca se tornam suicidas, e muitos suicídios são cometidos
por pessoas que não possuem depressão. Oquendo et al., (2000) afirmam que
16
pacientes que tentaram o suicídio tem tanto diátese (baixo limiar) para o
comportamento suicida quanto um fator desencadeador precipitando o
comportamento (estressor). Os autores observaram que alguns pacientes com
depressão maior são vulneráveis para agir quando sofrem impulsos suicidas. Esta
vulnerabilidade resulta da interação entre pontos desencadeadores ou precipitantes,
e o limiar de comportamento suicida.
Entre os estressores associados aos atos suicidas está o desencadeamento
ou regressão de uma doença psiquiátrica aguda como a depressão, abuso de
substâncias como álcool e drogas, doença orgânica, crise familiar ou eventos de
vida adversos que podem servir como um ―gatilho‖. Porém, o elemento mais
importante, sugestivo de risco para a tentativa de suicídio é a história pregressa de
outras tentativas de suicídio.
A comorbidade e o comportamento suicida
A maioria das pessoas que tentam o suicídio apresenta algum diagnóstico de
doença psiquiátrica, mais comumente transtornos de humor (Mann, 2003). Porém, a
tentativa de suicídio pode também estar relacionada a outras condições
psiquiátricas, incluindo esquizofrenia, abuso de substâncias (álcool e drogas) e
transtornos de personalidade.
O abuso e dependência de drogas por pessoas com transtornos psiquiátricos
estão associados a um maior risco de suicídio. O abuso de drogas tende a iniciar na
adolescência e pode desempenhar papel proeminente no aumento dos casos de
suicídios nesta faixa etária. Nos jovens, o abuso de drogas pode estar associado a
uma elevada freqüência à depressão e transtorno bipolar (Tondo et al., 2001).
Outras características podem aumentar o risco para o comportamento suicida, tais
como: traços de agressividade/ impulsividade, desesperança ou pessimismo,
deterioração social e profissional, doenças orgânicas e alterações nutricionais
(Mann, 2003; Segal, 2009).
17
Diversas pesquisas mostraram que o suicídio geralmente aparece associado
a doenças mentais, estando o diagnóstico de depressão maior presente em 40%
dos casos (Turecki, 2001) elevando-se para além de 60% no transtorno bipolar e na
distimia. O risco de mortalidade por suicídio durante a vida nos pacientes com
transtornos afetivos é em torno de 7% nos homens e 1% nas mulheres (Blair-West et
al., 1999).
A ideação suicida e o comportamento de risco estão presentes em famílias
com história de depressão grave (Allen et al., 2005), sintomas psicóticos em
comorbidade com abuso ou dependência de álcool (Bottlender et al., 2000). Além
disso, presença de sintomas do transtorno de pânico (Frank et al., 2002) e inicio
precoce de transtorno afetivo (Carter et al., 2003).
Traços de personalidade como fatores de vulnerabilidade ao comportamento
suicida têm sido descritos em muitos estudos. A impulsividade, agressividade e
hostilidade são fatores de risco para o comportamento suicida nos diferentes
transtornos psiquiátricos (Mann et al, 1999a). Baca-Garcia et al., (2006),
comparando pacientes deprimidos americanos e espanhóis, encontraram no grupo
de pacientes americanos tentativas de suicídio de alta letalidade com uma história
de comportamento agressivo maior do que o grupo de pacientes espanhóis,
sugerindo que a maior letalidade das tentativas de suicídio estava associada ao
maior nível de agressão.
Em relação ao gênero, entre homens e mulheres, os riscos de suicídio são
semelhantes, estando associados com transtornos bipolares, assim como unipolares
com o abuso de drogas. Porém, o comportamento suicida difere entre homens e
mulheres, sendo o número de tentativas de baixa letalidade maior nas mulheres,
enquanto que o número de suicídios concretizados é maior nos homens devido à
maior violência e/ou agressividade.
O número de diagnósticos comórbidos aumenta substancialmente o risco
para comportamento suicida (Mann, 1998). As doenças orgânicas, em consonância
com o modelo proposto por Mann (1998), aumentam o risco de atos suicidas e do
suicídio, principalmente aquelas doenças que afetam o sistema nervoso central
18
como a AIDS, epilepsia, doença de Huntington, traumatismo crânio-encefálico,
insuficiência renal crônica e acidentes vasculares cerebrais, conferindo um maior
risco que outras doenças (Mann et al,. 1999; Sher et al., 2001).
Genética e o comportamento suicida
Vários estudos têm evidenciado os possíveis efeitos de determinados genes
na modulação dos transtornos psiquiátricos, principalmente o comportamento
suicida. Além disso, muitos autores têm apontado que existe grande probabilidade
de o sistema serotoninérgico encontrar-se sob controle genético, com o
envolvimento de fatores não bem esclarecidos, em pessoas com comportamento
suicida de risco. Deste modo, as variantes genéticas tornam-se um fator de
suscetibilidade para desencadear esse tipo de comportamento. Entretanto, também
devemos dar importância aos fatores psíquicos, sociais e biológicos como fatores
determinantes do comportamento suicida.
Estudos em famílias com indivíduos adotados ou gêmeos, e famílias com
ausência desses fatores, podem fornecer evidências da herança do comportamento
suicida (Voracek, et al., 2007). Análises de famílias sem a presença de adoção ou
gêmeos e de famílias com gêmeos monozigóticos e dizigóticos, indicam a presença
de um forte componente genético relacionado tanto às tentativas de suicídio quanto
ao suicídio propriamente dito. O risco de suicídio em familiares de suicidas é seis
vezes maior do que o risco na população em geral (Brent et al., 1996). Além disso,
pacientes com história familiar de suicídio têm, em mais de 50% dos casos, o
diagnóstico primário de transtorno afetivo (Roy, 1983).
Pesquisas com gêmeos têm mostrado evidências de um fator genético para o
comportamento suicida, maior entre gêmeos monozigóticos do que nos dizigóticos
(Roy et al., 2001). Em estudos com adoção, foi encontrado um maior risco de
suicídio para os familiares biológicos de pessoas adotadas que cometeram suicídio
quando comparadas aos familiares biológicos de indivíduos adotados do grupo
controle (Wender et al., 1986; Roy et al., 1999). Outra evidência aponta que filhos de
19
pacientes que tentaram suicídio apresentam um risco maior para a tentativa do que
filhos de pessoas que não tentaram suicídio (Brent et al., 2002. Melhem et al., 2007).
A predisposição ao comportamento suicida pode desencadear na família
independente da doença psiquiátrica primária (Brent et al., 1996), ou seja, famílias
podem ter indivíduos apresentando comportamento suicida, mesmo que cada um
tenha o diagnóstico de uma doença no eixo I ou II diferentes. Estes dados
contribuem para o entendimento de que o comportamento suicida tem um
componente genético na sua predisposição, independente da doença psiquiátrica
presente inicialmente (Pujol, 2006). Além disso, o aparecimento do fenótipo está
fortemente relacionado com os fatores ambientais e o histórico de vida dos
indivíduos.
Através da genética molecular, pode-se realizar uma busca no genoma
humano, procurando variações inerentes às populações em genes relacionados às
rotas de metabolismos de neurotransmissores que possam explicar alguns tipos
específicos de comportamentos, como por exemplo, o comportamento suicida. Um
exemplo é a escolha de genes relacionados ao sistema serotoninérgico que tenham
polimorfismos como marcadores para o estudo. Polimorfismos são alterações no
genoma, que normalmente não causam dano à proteína que o gene codifica, ou não
alteram o processamento ou a estabilidade do RNA mensageiro, apresentando uma
freqüência de pelo menos 1% na população.
O gene do transportador de serotonina (5-HTTLPR) (Lesch et al., 1994) tem
sido investigado em muitos estudos de associação genética, mas com resultados
controversos. O 5-HTT é uma proteína responsável pela recaptação da serotonina
(5-HT) extracelular para dentro do neurônio pré-sináptico. È um dos principais alvos
para antidepressivos e tem uma função chave na fisiopatologia de muitos
transtornos psiquiátricos. Em um estudo realizado com uma amostra de pacientes
com tentativa de suicídio, na região sul do Brasil, observou-se um maior risco para o
comportamento suicida em pacientes depressivos portadores dos genótipos SS e SL
(Segal, 2006). Outros estudos ainda continuam a encontrar resultados controversos
(De Luca et.al., 2005; Xian-Zhang et.al., 2006; Bah et.al., 2008; Garcia et.al., 2010;
Wells et al., 2010). A enzima triptofano hidroxilase (TPH) é uma enzima que limita as
20
taxas de serotonina no cérebro (Cooper et al., 1961), e por isso seu gene é
considerado importante em muitos estudos com transtornos psiquiátricos (Hariri e
Weinberger, 2003; De Luca et.al., 2005; Zhang et al., 2006; Porter et.al., 2008;
Perroud et al., 2009).
Outro alvo de estudos relacionados aos transtornos comportamentais é a
Monoaminooxidase (MAO), que é uma enzima oxidativa que inativa a 5-HT,
convertendo-a em Ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA). Acredita-se que uma
alteração polimórfica no gene desta enzima possa influenciar os níveis de
serotonina, noradrenalina e dopamina no cérebro, resultando em alterações
comportamentais como transtornos de humor e comportamento agressivo. A
agressividade e impulsividade podem ser um fator de predisposição ao suicídio, o
qual foi associado com uma diminuição da atividade serotoninérgica (Mann, 2001). A
MAO pode ser encontrada em alguns estudos de associação interagindo com a
COMT e relacionando os efeitos ao transtorno depressivo maior (Leuchter, et al.,
2009).
O fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) é uma neurotrofina
importante para o desenvolvimento, sobrevivência e plasticidade neuronal. Existem
evidências que o BDNF possa exercer certa influência na neurotransmissão
serotoninérgica, aumentando o risco para o desenvolvimento de transtornos de
humor (Henningsson et al., 2009; Dwivedi, 2009; Schenkel et al., 2010).
Os receptores de serotonina (5-HTR) vêm sendo amplamente estudados, pois
são muito importantes na ação do neurotransmissor serotonina. Estes receptores
vêm sendo relacionados a diversos transtornos psiquiátricos tais como depressão
com comportamento suicida (Pata, et al., 2004; Drago, 2008; François; 2008;).
Sendo assim, o conhecimento das vias serotoninérgicas, desde sua síntese à sua
degradação e ativação de seus receptores, permite uma melhor compreensão dos
transtornos depressivos e das tentativas de suicídio.
21
Sistema Serotoninérgico e Suicídio
Alguns modelos têm sido propostos para explicar as possíveis bases
biológicas relacionadas à modulação do humor. Dentre esses modelos, inúmeros
sistemas de neurotransmissão e segundos mensageiros parecem exercer efeitos
modulatórios no humor. Estudos aplicados aos transtornos afetivos como a
depressão, geram hipóteses envolvendo o neurotransmissor serotonina, assim como
o sistema serotoninérgico. Diversos estudos têm evidenciado que as proteínas e
receptores envolvidos na via serotoninérgica desempenham um papel importante no
comportamento suicida (Mann, 1998; Stahl, 2002).
Um fator neurobiológico importante, ao se considerar o limiar de um indivíduo
para agir sob impulsos suicidas, é a função serotoninérgica cerebral. Desde a
década de 70, inúmeros estudos bioquímicos têm mostrado uma associação entre a
baixa atividade serotoninérgica e a agressividade, impulsividade e comportamento
suicida (Asberg et al., 1976). Há evidências de que o sistema serotoninérgico está
em parte sob controle genético (Mann, 1998), assim, o risco de um comportamento
suicida, atos agressivos, alcoolismo e abuso de substâncias (drogas) teriam uma
predisposição genética mediada por este sistema neurotransmissor (Mann, 1998;
Mann et al., 1999a, 1999b, 2001). Alguns estudos apontam que os níveis de 5-HIAA,
o principal metabólito da serotonina, encontra-se reduzido em indivíduos que
cometeram suicídio, indicando a relação entre o comportamento suicida e a baixa
atividade do sistema serotoninérgico (Asberg et al., 1976).
É importante destacar que quanto mais baixo os níveis de serotonina
cerebral, mais grave é a tentativa de suicídio, havendo, portanto, correlação direta
com a letalidade (Mann et al., 1999; Sher et al., 2001). Outro fato significativo é que
existe relação entre os baixos níveis cerebrais de serotonina e a agressividade, não
se esquecendo que o suicídio pode ser entendido como uma auto-agressividade.
Como ponto interessante, o sexo feminino tem um nível médio mais elevado de
serotonina cerebral que o sexo masculino, e menor incidência de suicídio (Mann et
al., 1999).
22
Sabe-se também, que há uma interconexão entre as diversas vias
neurotransmissoras. Estes sistemas estão, em parte, sob influência genética, uma
vez que há uma relação entre variantes genéticas relacionadas à impulsividade,
alterações psicomotoras, agressividade e anormalidades biológicas que envolvem
genes e seus produtos. Fatores genéticos relacionados à síntese de
neurotransmissores e receptores, os quais são transmitidos independentemente,
explicam em parte os riscos para depressão maior e para o suicídio. Por isso, a
medicina tem se desenvolvido cada vez mais de maneira a incorporar tecnologias de
ponta, como o uso da biologia molecular, para permitir o diagnóstico mais precoce e
preciso de inúmeras doenças, assim como para auxiliar no entendimento de sua
patogênese, permitindo o desenvolvimento de novos tratamentos ou uma prevenção
mais eficaz.
Síntese de Serotonina
A serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) é um neurotransmissor conhecido por
ser uma amina biogênica por apresentar um anel indol (Lehnninger, 2006;
Kapczinski et al., 2004) que atua via membrana do receptor. Está envolvido em
diversas áreas do sistema nervoso central e tecidos periféricos, bem como em
tecidos não neuronais (sanguíneo, gastrointestinal, endócrino, sensório, sistema
cardiovascular e etc.). No cérebro, os neurônios serotoninérgicos originaram-se
primariamente nos núcleos da rafe, no tronco cerebral, e se projetam para as demais
áreas do sistema nervoso central (SNC), em que regulam uma ampla variedade de
funções sensoriais, motoras e corticais (Kapczinski et al., 2004). Na periferia, a
serotonina está envolvida em diversas funções como a regulação dos reflexos
entéricos, a modulação da forma na mudança e agregação de plaquetas, a
modulação vascular da contração dos músculos lisos, a iniciação da atividade
primária nos nocireceptores aferentes e a regulação da citotoxidade e fagocitose dos
linfócitos (Julius, 1991).
A 5-HT é um neurotransmissor constituído pelo aminoácido triptofano, que se
destaca dos demais aminoácidos por pertencer ao grupo dos aminoácidos
23
essenciais e ser menos abundante na dieta. Deste modo, a oferta de triptofano no
organismo é proporcional a quantidade de alimentos ingeridos ricos em triptofano.
Essas características são importantes quando consideramos o amplo papel que seu
produto final desempenha no equilíbrio fisiológico normal e a facilidade com que a
produção deste pode ser afetada quando interrompida a escassa oferta desse
aminoácido.
Figura 1: Barreira hematoencefálica (transportador de triptofano) (Adaptado de Stahl, 2002).
A síntese de 5-HT dá-se quando o triptofano absorvido é levado para o
sistema nervoso central, passando pela barreira hematoencefálica e convertido em
5-HT (Figura 1). A baixa permeabilidade desta barreira ao triptofano exige que o
mesmo utilize a proteína transportadora de aminoácidos num processo de transporte
ativo. Além disso, o triptofano não é o único aminoácido a passar pela barreira
hematoencefálica, tendo que disputar a passagem com outros tipos de aminoácidos
(Oldendorf e Szabo, 1976; Voet, 1995; Lehnninger, 2006). Passada essa barreira, o
triptofano sofre uma hidroxilação pela enzima triptofano hidroxilase, transformando-o
24
em 5-hidroxitriptofano (5-HTP). Logo após, ocorre uma dexcarboxilação da 5-HTP,
transformando-a em 5-HT (Figura 2).
Figura 2: Síntese de Serotonina.
A serotonina formada é agrupada em vesículas (vesículas pré-sinápticas) nos
terminais axônicos que, ao serem liberadas por exocitose através dos neurônios
serotoninérgicos, rompem-se, liberando-a na fenda sináptica. Na fenda sináptica, a
5-HT atinge os receptores de serotonina 5-HTR, completando a sinapse. Parte da
serotonina que não chega até os receptores é recaptada para o neurônio pré-
sináptico através do transportador de serotonina 5-HTT. Deste modo, a 5-HT pode
ser reagrupada novamente em vesículas para ser liberada ou degradada pela
enzima Monoaminooxidase (MAO), dentro ou fora do neurônio pré-sináptico. A MAO
apresenta-se em duas isoformas (MAO-A e MAO-B), ambas encontradas no tecido
neuronal, e apresentam proporções distintas e em diferentes regiões do cérebro. A
MAO é uma enzima portadora de flavina, localizada primariamente na membrana
externa das mitocôndrias e encontrada nos terminais nervosos, no fígado e em
outros órgãos. Esta enzima oxidativa inativa a 5-HT, convertendo-a em 5-HIAA
25
(Romeiro et al., 2003). O 5-HIAA é um metabólito facilmente medido e considerado
como um marcador da função serotonérgica. Seus níveis estão elevados quando há
um aumento na produção de 5-HT (Figura 3) (Kapczinski, et al., 2004).
Figura 3: Sistema serotoninérgico. Receptor de serotonina 1A (5-HT
1A
),
receptor de serotonina 2A (5-HT
2A
), transportador de serotonina (5-HTT),
monoaminoxidase (MAO), Ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA).
26
Receptores de Serotonina
Os receptores de serotonina (5-HTR) são responsáveis pela mediação do
sinal do neurotransmissor serotonina. Esses receptores localizam-se em neurônios
pré e pós-sinápticos nas membranas das células nervosas, no córtex cerebral,
núcleos da rafe, mesencéfalo, músculos lisos e nos intestinos. Em um cérebro
intacto, a função dos diversos receptores 5-HT pode ser associada com respostas
fisiológicas específicas que vão desde a modulação da atividade neuronal à
liberação de neurotransmissores na mudança de comportamento.
Por ser um dos mais antigos neurotransmissores na evolução, estima-se que
os receptores 5-HT surgiram cerca de 700 a 800 milhões de anos, em uma única
célula eucarionte (Hannon e Hoyer, 2008). As principais classes dos receptores 5-
HT devem ter divergido em torno de 750 milhões de anos atrás, muito antes dos
receptores colinérgicos, adrenérgicos e dopaminérgicos, embora a família dos
receptores ligados à proteína G (GPCR) possam existir há mais de 1 bilhão de anos.
Isso pode explicar porque a 5-HT interage com uma grande diversidade de
receptores da família dos GPCR e também com as famílias dos receptores
ionotrópicos (ligados a canais iônicos), acetilcolina, GABA ou glutamato e outros
subtipos de receptores com uma ampla diversidade de funções (Hannon e Hoyer,
2008).
Essa família de receptores é conhecida por ser ligada à proteína G, localizada
na superfície interna da membrana plasmática e que consiste de uma subunidade α
que hidrolisa a guanosina-trifosfato (GTP) e subunidade β e γ (Hauache, 2001;
Kapczinsk et al., 2004). Os receptores 5-HT são divididos em sete famílias (5-HT
1-7
),
sendo cada família dividida em seus respectivos subtipos. Estudos a nível molecular
têm estabelecido, em grande parte com o uso de modelos de receptores
recombinantes e perfis hidropáticos, que a família dos receptores 5-HT apresenta
mais de sete hélices transmembranas, ligadas a uma proteína G de receptores
metabotrópicos (Figura 4).
27
Figura 4: Receptor de Serotonina. Treminação amina (NH
3
+
), terminação carboxil (COO
-
),
voltas intra celulares (C
1
,C
2
,C
3
e C
4
), voltas extra celulares (E
1
, E
2
, E
3
e E
4
), sítios de
ligação da proteína quinase C (PKC) e subunidade α, β e γ da proteína G (Adaptado de
Lanfumey et al., 2000).
A ativação dos receptores 5-HT afeta várias enzimas, como a adenilil ciclase,
fosfolipase C (PLC) e canais de cátions, especialmente K
+
e Ca
++
, através da
ativação de proteínas G específicas intracelular. Existe certo grau de homologia na
sequência de todas as ligações da proteína G dos receptores 5-HT no nível de seu
domínio transmembrana. Em contraste, a sequência de aminoácidos na porção N
terminal e na terceira volta intracelular apresenta-se exclusiva para cada tipo de
receptor (Lanfumey et al., 2000).
Receptores 5-HT
1
A família dos receptores 5-HT
1
possui uma grande sequência de aminoácidos
homólogos e pode ser subdividida dependendo de sua ligação a segundos
mensageiros via proteínas G. Os receptores 5-HT
1
são, em sua maioria, ligados a
proteínas G
i/o
, que são sensíveis à toxina pertussis e ligados negativamente à
adenilil ciclase (Kapczinski, et al., 2004; Hannon e Hoyer, 2008). Nas células, esse
processo pode levar a despolarização da membrana e inibição do disparo neuronal
28
(Hannon e Hoyer, 2008). A família dos receptores 5-HT
1
é composta por 5 subtipos
de receptores (5-HT
1A
, 5-HT
1B
, 5-HT
1D
, 5-HT
1E
e 5-HT
1F
) que , nos seres humanos,
compartilham de 40 a 63% de sua identidade nas sequências (Barnes e Sharp,
1999; Hannon e Hoyer, 2008; Romeiro et al., 2003; Lanfumey et al., 2000).
Receptores 5-HT
1A
No homem, o gene do receptor 5-HT
1A
está localizado no cromossomo 5
(5q11.2 - q13) (Kobilka et al., 1987; Drago, 2008; François; 2008; Savitz et al., 2009)
e codifica para uma proteína de 422 aminoácidos. O receptor apresenta uma
estrutura típica de um receptor ligado à proteína G com um sítio N glicolização
localizado no domínio N terminal da proteína. Além disso, apresenta um sítio de
consenso para a fosforilação pela proteína quinase C (PKC) na segunda e na
terceira volta intracelular (Barnes e Sharp, 1999; Hannon e Hoyer, 2008).
A densidade de sítios de ligação dos receptores 5-HT
1A
é maior nas regiões
límbicas do cérebro, especialmente no hipocampo, septo lateral, áreas corticais
(principalmente córtex cingulato e entorrinal) e também nos núcleos da rafe
mesoencefálica (ambos médios e dorsais) (Barnes e Sharp, 1999; Romeiro et al.,
2003; Lanfumey et al., 2000). Os receptores 5-HT
1A
estão localizados em neurônios
pós-sinápticos (na região frontal) e em neurônios pré-sinápticos serotoninérgicos, ao
nível do soma e dendritos nos núcleos da rafe mesencefálica medular. Os subtipos
de receptores localizados em neurônios pré-sinápticos se encontram nos corpos
neuronais dos núcleos da rafe e atuam como auto-receptores somatodendríticos. Já
os subtipos pós-sinápticos se localizam, principalmente, no sistema límbico e atuam
como heterorreceptores. Esta dupla localização proporciona aos receptores 5-HT
1A
,
em sua excitação, um efeito duplo na estimulação serotoninérgica. Quando os
neurônios serotoninérgicos pré-sinápticos são estimulados, ocorre a inibição da
atividade elétrica dos neurônios serotoninérgicos dos núcleos da rafe, reduzindo a
liberação de serotonina. O estímulo dos receptores pós-sinápticos ativa a via de
segundos mensageiros, completando a sinapse no sistema serotoninérgico (Esther
Molina, 2009)
29
O padrão de distribuição dos receptores 5-HT
1A
é similar entre as espécies,
embora sua organização laminar em áreas hipocampais e corticais nos homens seja
um pouco diferente de roedores (Barnes e Sharp, 1999; Hannon e Hoyer, 2008;
Romeiro et al., 2003;). Nos núcleos da rafe, os receptores 5-HT
1A
são
somatodendríticos e atuam como autoreceptores inibindo o ―disparo celular‖
(Hannon e Hoyer, 2008). Os 5-HT
1A
pós-sinápticos estão presentes nas estruturas
límbicas, principalmente no hipocampo. Esse subtipo de receptor faz a mediação da
hiperpolarização neuronal, via proteína G ligada a canais de K (GIRK channels) e
inibe o disparo neuronal bem como a liberação de serotonina (Barnes e Sharp, 1999;
Hannon e Hoyer, 2008). Os receptores 5-HT
1A
estão ligados a diferentes sistemas
de efetores: enzimático, que produz a inibição da adenilil ciclase e dois efetores
iônicos, que atuam na ativação de canais de potássio e na inibição de canais de
cálcio. Ambos efetores são ligados aos receptores via proteína G
1
e G
o
, que são
subtipos de proteínas G (Lanfumey et al., 2000).
As respostas dos segundos mensageiros pela estimulação dos receptores 5-
HT
1A
pode ocorrer por sua ligação negativa à enzima adenilil ciclase via proteína G
(Hannon e Hoyer, 2008). A reação que a adenilil ciclase catalisa é a conversão de
ATP em AMPc (Adenosina monofosfato cíclico). O AMPc é uma molécula importante
na transdução de sinais nos eucariotos e sua formação é inibida pela adenilil ciclase
através da ativação dos receptores 5-HT
1A
(Dumuis, 1987). A adenilil ciclase pode
ser ativada ou inibida pela proteína G, na qual está ligada à membrana dos
receptores. A atuação como segundo mensageiro do AMPc dá-se pela interação ou
regulação de outras proteínas.
Receptores 5-HT
2
A família dos receptores 5-HT
2
pode ser dividida em três subtipos (5-HT
2A
, 5-
HT
2B
e 5-HT
2C
) que apresentam estruturas moleculares, farmacológicas e uma rota
de transmissão de sinais similares (Barnes e Sharp, 1999). Os receptores 5-HT
2
ligam-se preferencialmente à proteína G
q/11
aumentando inositol fosfato o Ca
2+
citosólico, além de ter um papel importante na contração muscular e estimulação no
cérebro. Os receptores 5-HT
2
podem também se ligar à proteína G
12/13
, na qual são
conhecidos por mediar em longo prazo mudanças estruturais nas células (Hannon e
30
Hoyer, 2008). As sequências de aminoácidos dos receptores 5-HT
2
apresentam um
alto grau de homologia dentro dos sete domínios transmembrana, mas eles são
estruturalmente distintos dos outros receptores 5-HT. Uma característica de todos os
genes dos receptores 5-HT
2
é que eles possuem dois íntrons (5-HT
2A
e 5-HT
2B
) ou
três íntrons (5-HT
2C
), na sequência codificante (Barnes e Sharp, 1999; Hannon e
Hoyer, 2008).
A localização dos receptores 5HT
2
é pós-sináptica e estão ligados à fosfolipase
C, envolvidos na ativação de dois segundos mensageiros: diacilglicerol (DAG) e
inositol trifosfato (IP
3
) (Salvi, et al.,1999). Acredita-se que esse tipo de receptor
possa estar envolvido com várias doenças neuropsiquiátricas, aumentar a
percepção à dor e mediar a contração dos músculos lisos dos intestinos. (Kim, et al,
2000; Hemrick-Luecke, et al 1994; Tokunga, et al., 1998 apud Pata, et al., 2004 )
Receptor 5-HT
2A
O receptor 5-HT
2A
media a resposta contrátil em muitos músculos lisos
vasculares, urinários, uterinos e brônquios. Além disso, a agregação de plaquetas e
o aumento da permeabilidade capilar depois da exposição à 5-HT têm sido
atribuídos aos receptores 5-HT
2A
mediando essas funções. (Hannon e Hoyer, 2008)
Os receptores 5-HT
2A
são um dos principais subtipos de receptores entre os
ligados à proteína G (GPCRs), embora o 5-HT
2A
possa também ter um efeito
inibitório em certas áreas tais como córtex visual e o orbital. Por isso, foi dada uma
primeira importância a esse receptor como alvo de drogas psicodélicas, como o LSD
(Dietilamida do ácido lisérgico). Na literatura encontram-se estudos que indicam
alguns efeitos problemáticos da ativação dos receptores 5-HT
2A
no cérebro, causado
pelo LSD e seus agonistas, tais como DOI, Pylocibim e outras substâncias
psicodélicas que são alucinógenas e, eventualmente, acarretam efeitos psicóticos
(Oekelen et al., 2003).
Os receptores 5-HT
2A
são amplamente distribuídos em todo o sistema nervoso
central. São expressos próximos às áreas ricas em terminais serotoninérgicos,
31
incluindo o neocórtex (principalmente o perifrontal, parietal e somatossensório) e
tubérculos olfatórios. Há também uma maior concentração desse receptor nos
dendritos apicais das células piramidais do córtex, que pode modular processos
cognitivos (Barnes e Sharp, 1999;. Geurts, 2002; Maeshima, 1998; Maeshima,
2004). Os efeitos causados pela ativação desse receptor incluem: excitação
neuronal, efeitos comportamentais, aprendizado, ansiedade, contração dos
músculos lisos (trato gastrointestinal e brônquios) (Rang, 2003), vasoconstricção e
vasodilatação, e na agregação de plaquetas.
Os receptores 5-HT
2A
são ligados preferencialmente via proteína G
q/11
à rota de
cálcio, IP
3
/PKC, embora a inibição da produção de AMPc tenha sido relatada
(Oekelen et al., 2003; Hannon e Hoyer, 2008). Esses receptores também são
conhecidos pela ligação com a via de transdução de sinal pela proteína G
αq
. Após a
estimulação com o agonista do receptor, a subunidade G
αq
e beta-gama dissociam-
se para iniciar a rota do efetor downstream. O G
αq
estimula a atividade da fosfolipase
C que, posteriormente, promove a liberação de diacilglicerol (DAG) e inositol
trifosfato (IP
3
) que por sua vez, estimula a atividade da proteína quinase C (PKC) e a
liberação de Ca
2+
. O diacilglicerol (DAG) é um glicerídeo composto por uma cadeia
com dois ácidos graxos ligados covalentemente à molécula de glicerol através de
ligações ésteres (Oekelen et al., 2003; Urban, 2007). A ativação da PKC pelo DAG
dá-se da seguinte maneira: o DAG funciona como um segundo mensageiro de
sinalização lipídica e é um produto da hidrólise do fosfolipídio PIP
2
(fosfatil-inositol-
bifosfato), um fosfolipídio que está localizado na membrana plasmática, pela enzima
fosfolipase C que, através da mesma reação, produz inositol-tri-fosfato (IP
3
). O IP
3
estimula a liberação de íons de cálcio do retículo endoplasmático liso, considerando
que o DAG na membrana facilita a translocação da PKC do citosol para a membrana
plasmática. O inositol-tri-fosfato junto com o DAG é uma molécula de segundo
mensageiro usada na transdução de sinais nas células. Em seres humanos, suas
principais funções são a mobilização de Ca
2+
, proliferação celular e outras reações
celulares. Nos músculos lisos, ocorre o aumento da concentração de cálcio na
célula, resultando na contração dos músculos (Oekelen et al., 2003; Somlyo, 1994;
Lehninger, 2006; Voet,1995).
32
Gene do receptor de serotonina 5-HT
1A
Um polimorfismo de base única (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) na
região promotora no gene do receptor de serotonina 5-HT
1A
, localizado no
cromossomo 5 q11.2-13 (Kobilka et al., 1987), denominado rs6295 (-1019C>G) (Wu
e Comings, 1999), pode ser responsável pela alteração da expressão gênica desse
receptor em seres humanos (Lemonde et al., 2003; Czeak et al., 2006). O SNP atua
em um sítio de ligação, no gene do receptor, para um fator de transcrição NUDR
(Nuclear Deformed Epidermal Autoregulatory Factor) que é o homólogo humano do
Deaf-1 (Deformed Epidermal Autoregulatory Factor 1 - Drosophila), que foi
identificado como uma proteína de ligação do DNA e um potencial gene regulador
(Huggenvik et al., 1998). O alelo C, quando presente, forma um sítio de ligação para
o NUDR que reprime a atividade de transcrição do gene do receptor 5-HT
1A
. Porém,
com o alelo G, essa ligação não ocorre plenamente, levando a uma atividade
anormal do receptor e, consequentemente, uma quantidade alterada de
neurotransmissor disponível na fenda sináptica. (Lemonde et al., 2003; Albert e
Lemonde, 2004; François et al.. 2008; Savitz et al.., 2009) Ainda que os mecanismos
que determinam a atividade do NUDR (Deaf-1) não estejam claros, tanto o seu
aumento como a sua diminuição, foram relacionados com o alelo G. (François et al..,
2008)
Diversos estudos com o receptor 5-HT
1A
tentam associar o polimorfismo (-
1019C>G) com os transtornos de humor, com resultados ainda controversos.
Lemonde et al.. (2003) sugerem em seu estudo um novo modelo de transcrição no
qual o alelo G(-1019) diminui a expressão do receptor 5-HT
1A
reduzindo a
neurotransmissão serotoninérgica, predispondo à depressão e ao suicídio. Os dados
encontrados neste estudo são similares ao estudo de Lenze et al., (2008), no qual o
alelo G do polimorfismo do receptor 5-HT
1A
foi associado com o aumento dos
sintomas depressivos e uma baixa recuperação na escala IADLs (Instrumental
Activities of Daily Living scale). Neste estudo, a baixa recuperação foi parcialmente
explicada pelos escores de depressão, sugerindo que os sintomas depressivos
podem mediar parcialmente a recuperação. WU et al.. (2008) também sugere que o
polimorfismo (-1019C>G) do receptor 5-HT
1A
esteja provavelmente associado com
depressão maior (DM), e é provável que seja um locus de suscetibilidade no gene
33
para mulheres com início tardio de DM. Entretanto, contrariando muitos estudos, o
genótipo GG foi menos associado com o transtorno na amostra estudada. Em um
estudo com análises de PET (Positron Emission Tomography Study), compararam-
se controles com pacientes depressivos livre de medicação e observou-se o
genótipo GG associado à depressão (Parsey et al., 2006).
Em pesquisas com medicamentos, Hong et al.. (2006) associou o alelo G com
uma resposta negativa ao tratamento com Fluoxetina em pacientes chineses com
depressão maior. Em outro estudo, os pacientes com depressão maior tratados com
Citalopram também tiveram uma resposta negativa ao tratamento, nos indivíduos
portadores do alelo G associado ao alelo curto do HTTLPR (Arias et al., (2005). Em
contraste, Hettema et al.. (2008) sugere em seu estudo que o gene do 5-HT
1A
pode
não ter uma função importante na suscetibilidade genética para os fenótipos de
depressão e ansiedade.
Há poucos estudos de associação analisando o polimorfismo rs6295 (-
1019C>G) com comportamento suicida, e os que foram realizados apresentam
resultados controversos. As evidências encontradas por Stockmeier et al., (1998)
indicam que a depressão maior, suicídio ou a combinação desses dois fatores estão
relacionadas a um significativo aumento nos receptores 5-HT
1A
. Pitchot et al., (2005)
estudaram 40 pacientes internados com depressão maior divididos em dois
subgrupos: 20 indivíduos com tentativa de suicídio e 20 sem tentativa de suicídio, e
comparou com um grupo controle, pareados por gênero e idade. Este estudo tende
a confirmar a função da serotonina e, mais especificamente, a função dos receptores
5-HT
1A
na biologia do comportamento suicida na depressão maior. Wasserman et
al., (2006) mostraram que a variação do polimorfismo (-1019C>G) no gene do
receptor 5-HT
1A
não está associada com as tentativas de suicídio em geral. No
entanto, ele sugere que os resultados indicam uma possível função do alelo G no
comportamento suicida em conexão com grande exposição a traumas ou eventos de
vida adversos e/ou traumáticos. O estudo de Serretti et al., (2007) não confirmou em
sua amostra a idéia de que as variantes genéticas do 5-HT
1A
sejam os principais
contribuintes para o suicídio, raiva, agressividade ou comportamentos relacionados
com sua amostra.
34
Outros estudos como o de Freitag (2006), que analisou o polimorfismo (-
1019C>G) em uma amostra de 115 pacientes com transtorno do pânico e 115
controles, verificaram uma associação do genótipo GG com o transtorno do pânico
quando considerado junto com o polimorfismo da COMT. Rothe et al., (2004)
estudou 134 pacientes caucasianos e 134 controles, associando o alelo G com o
transtorno do pânico com agarofobia. Savitz et al., (2009) mostrou que o alelo G do
polimorfismo (-1019C>G) do receptor 5-HT
1A
tem sido apresentado com um
regulador positivo da expressão do receptor na rafe, mas diminui a expressão do
receptor 5-HT
1A
pós-sináptico, talvez explicando porque a variante G é
superexpressada em algumas amostras de pacientes com DM. No entanto,
contradições em estudos farmacológicos, post-mortem, PET e genéticos podem ser
encontrados na literatura, mostrando a complexidade do sistema de sinalização dos
receptores 5-HT
1A
.
Gene do receptor de serotonina 5-HT
2A
O gene do receptor 5-HT
2A
está localizado, no homem, no cromossomo 13 q14
– q21 e possui três exons e dois íntrons, com um tamanho de 20 Kb (Saltzman. et
al., 1991; Chen et al., 1992; Rothe et al., 2004; Barnes e Sharp, 1999; Hannon e
Hoyer, 2008). O polimorfismo do tipo SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ocorre
no éxon 1 na posição 102, sendo uma troca T para C (T102C) (Warren et al., 1993).
O polimorfismo não resulta em alteração na sequência de aminoácidos da proteína,
mesmo assim, há uma forte associação do polimorfismo T102C com depressão
maior e esquizofrenia (Pata, et al., 2004).
Em um estudo caso-controle, (Du et al., 2000) encontrou uma associação
significativa com o alelo C do polimorfismo (T102C) e o transtorno depressivo maior.
A frequência encontrada para o alelo C foi significativamente maior em pacientes
com ideação suicida. Estas descobertas feitas por Du confirmam a hipótese de que
a variação polimórfica possa ser um fator de suscetibilidade para a depressão maior
e ideação suicida. Além disso, um estudo com uma amostra de espanhóis confirmou
os resultados encontrados por Du et al., (2000), sugerindo que os pacientes com
depressão, portadores do alelo C (T102C), apresentam um risco maior para o
35
comportamento suicida (Arias et al., 2001). Pandey e colegas (2002) sugerem em
seu estudo que o número de sítios de ligações dos receptores 5-HT
2A
no córtex pré-
frontal de adolescentes que cometeram suicídio seja maior em relação a sujeitos
normais. Além disso, a expressão do gene do receptor 5-HT
2A
e sua proteína no
córtex pré-frontal e hipocampo foram maiores, mas não no núcleo acumbens, de
adolescentes que cometeram suicídio, em relação a um grupo controle. Estudos
post-mortem têm encontrado um aumento no número de receptores 5-HT
2A
no
cérebro de pacientes com depressão e que se suicidaram, embora os resultados
ainda sejam controversos (Catapano, 2007). Vaquero-Lorenzo (2008) sugere no seu
estudo que o polimorfismo T102C possa estar associado à tentativa de suicídio e/ou
transtornos psiquiátricos, enquanto que o outro polimorfismo estudado pelo autor
C1354T (Hys452Tyr) não confirmou a mesma associação. Em estudos com
inibidores seletivos de serotonina (SSRIs), em uma amostra de Japoneses e
Italianos, foi levantada a hipótese de que a melhoria nos sintomas pode ser, pelo
menos em parte, geneticamente controlada. E que o polimorfismo T102C possa
exercer certa influencia na resposta aos SSRIs (Kato et al., 2008) Outra pesquisa
com uma amostra de japoneses com transtorno depressivo maior sugere que os
receptores 5-HT
2A
possam ter uma função patofisiológica importante na resposta
terapêutica aos SSRIs (Kishi et al., 2009).
Apesar de muitas evidências, os estudos com os receptores 5-HT
2A
ainda
apresentam-se controversos. Khait e colegas (2005), em uma amostra com apenas
caucasianos de origem européia, não encontraram associação entre o polimorfismo
T102C do receptor de serotonina e transtornos de humor e suicídio, demonstrando
uma associação com o genótipo TT com um aumento no número de receptores 5-
HT
2A
nas plaquetas dos sujeitos saudáveis, mas aparentemente não nos sujeitos
com transtorno de humor. Um estudo realizado com pacientes com transtorno
obsessivo compulsivo (TOC), não conseguiu encontrar associação entre os
polimorfismos do receptor de serotonina 5-HT
2A
(T102C) e (-1438G>A) com o
transtorno obsessivo compulsivo (Sqenel, 2003). Rothe et al., (2004) tentou replicar
o estudo de Inada et al., (2003), com uma amostra de canadenses e alemães, mas
não foi encontrada associação entre o polimorfismo T102C do receptor 5-HT
2A
e
transtorno do pânico. Existem muitas controvérsias nos resultados dos estudos que
tentam relacionar o polimorfismo T102C e o comportamento suicida (Ono et al.,
36
2001; Arango et al., 2003; Yoon et al., 2008; Zhang et al., 2008) Pode-se ainda
encontrar estudos que tentam associar os receptores 5-HT
2A
com resposta à
medicamentos, pois são muito importantes no controle de ambas as sintomatologias
psicótica e depressiva, sendo um dos principais alvos de inibidores de muitos
antipsicóticos e antidepressivos. (Aghajanian and Sanders-Bush, 2002; Miyamoto et
al., 2002)
37
Objetivos
Geral
Verificar a frequência das variantes polimórficas dos receptores de serotonina 5-
HT
1A
(rs6295) e 5-HT
2A
(rs6313), em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio e
em um grupo controle sem doença psiquiátrica.
Específicos
Calcular e comparar a frequência dos genótipos e dos alelos T/C (rs6313) e C/G
(rs6295), nos pacientes e no grupo controle;
Verificar se há associação entre as frequências dos polimorfismos descritos e o
diagnóstico psiquiátrico de episódio de depressão maior.
38
Considerações Éticas
Os pacientes que receberam atendimento global (clínico, cirúrgico,
psicológico e psiquiátrico) no Hospital de Pronto Socorro após uma tentativa de
suicídio foram convidados a participar do estudo em questão, informados dos
objetivos, riscos e benefícios do mesmo para o paciente e para sua família. Os
pacientes selecionados foram expostos a um risco mínimo, considerando o
procedimento pouco invasivo necessário para sua realização. Todos os pacientes
preencheram termo de consentimento informado, em que constava a possibilidade
de utilização do material em outros projetos de pesquisa para outros genes
candidatos. Foi oferecido para os indivíduos pesquisados e seus familiares um
atendimento para esclarecimento de eventuais dúvidas quanto ao resultado e
significado deste exame e dos possíveis impactos ou riscos que estejam envolvidos
para os pacientes e suas famílias. Só participaram do estudo aqueles pacientes que
tiverem condições de entender e consentir com os procedimentos realizados.
39
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53
Artigo 1 – Submetido a Revista Journal of Psychiatric Research em 26 Abril de
2010
[mailto:[email protected]] Em nome de
Rebecca Wyse
Enviada em: terça-feira, 27 de abril de 2010 11:44
Para: Sandra Leistner Segal
Assunto: A manuscript number has been assigned
Ms. Ref. No.: JPR2196
Title: Evidence of association between 5-HT1A variants and depressed men who
attempted suicide
Journal of Psychiatric Research
Dear Sandra,
Your submission entitled "Evidence of association between 5-HT1A variants and
depressed men who attempted suicide" has been been assigned the following
manuscript number: JPR2196.
You may check on the progress of your paper by logging on to the Elsevier Editorial
System as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/jpsychiatrres/.
Your username is: ssegal
If you need to retrieve password details, please go to:
http://ees.elsevier.com/jpsychiatrres/automail_query.asp
Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Ms Rebecca Wyse
American Editorial Office
Journal of Psychiatric Research
54
Evidence of association between 5-HT
1A
variants and depressed men who
attempted suicide
Authors:
Rafael Rebelo e Silva
a
, Jair Segal
b
, Giovanni Abrahão Salum
c
, Carolina Blaya
c
,
Gisele Gus Manfro
c
, Sandra Leistner-Segal
a,d
a. Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Post-Graduate Program in
Medicine: Medical Sciences:, Brazil.
b. Hospital de Pronto Socorro de Porto Alegre (HPS), Brazil.
c. Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Anxiety Disorder Program, Brazil.
d. Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), Medical Genetics Service, Brazil.
*Correspondence to:
Sandra Leistner-Segal
Hospital de Clínicas de Porto Alegre,
Medical Genetics Service
Rua Ramiro Barcelos, 2350
CEP 90035-903
Porto Alegre - RS - Brazil
Tel.: +55 51 33598011; fax: +55 51 33598010.
E-mail address: [email protected]
55
Abstract
The 5-HT
1A
receptors are present in many brain regions. A single Nucleotide
Polymorphism (SNP) located in the promoter region of 5-HT
1A
receptor gene could
be responsible for the receptor genetic expression regulation in humans. The aim of
this study was to verify the possible influence of rs6295 (-1019 C>G) polymorphism
in depressive patients, from south of Brazil who attempted suicide, and compare
them to a control group. The case population studied consisted of patients admitted
to the Emergency Hospital of Porto Alegre (Hospital de Pronto Socorro - HPS) for
serious suicide attempts. The control group was a convenience sample composed by
employees of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) without psychiatric
disorders. This is a case-control study where subjects were cautiously paired by sex
and age and Amplification Refractory Mutation System (ARMS-PCR) was performed
for DNA analysis. There are significant differences if we consider having at least one
copy of G allele in the dominant model. We explored our analysis aiming to evaluate
whether the difference observed between cases and controls is related to sex and
this effect was observed in man, but not in women. In our study we found that
depressed patients who have at least one copy of allele G were more prone to
attempt suicide as compared to depressed patients without the G allele.
Key Words 5-HT
1A
receptor, suicide attempt, major depression,
-1019 C/G polymorphism, SNP
56
Introduction
For the past 20 years, there has been increasing evidence that suicidal
behavior is related to a neurobiological factor. It has been shown that protein and
receptors in serotonergic pathway may play an important role in suicidal behavior
(Mann,1998).
The 5-HT
1A
receptors, which are present in many brain regions, mediate
serotonin, in the pre and pos-sinaptic neurons (Barnes and Sharp, 1999; Drago A. et
al., 2007). A single Nucleotide Polymorphism (SNP) located in the promoter region
of 5-HT
1A
receptor gene (Kobilka et al., 1987), denominated rs6295 (-1019 C>G) (Wu
and Comings, 1999), could be responsible for the receptor genetic expression
regulation in humans (Lemonde et al., 2003; Czeak et al. 2006). The SNP works as a
link, in the receptor gene, into a transcription NUDR factor (nuclear DEAF-1 related
protein), and it has been identified as a DNA linking protein and a potential regulator
gene (Huggenvik et al., 1998). When present, the C allele functions as a link to the
NUDR and represses the transcription activity of 5-HT
1A
receptor gene. The G allele
looses its role as a link and drives the receptor into an abnormal activity; therefore it
leads to a neurotransmitter modification in the synaptic cleft. (Lemonde et al., 2003;
Albert and Lemonde, 2004; François et al. 2008; Savitz J., et al., 2009). Even though
the mechanisms that define NUDR (Deaf-1) activity are not clear, its expression is
thought to be related to the G allele presence (François et al., 2008). Savitz et al.
(2009) showed that the G allele of the rs6295 5-HT
1A
polymorphism has been
postulated to up-regulate autoreceptor expression in the raphe, but decrease
expression of the postsynaptic 5-HT
1A
receptor; perhaps explaining why the G variant
is over-represented in some major depressive disorder (MDD) samples.
Several studies on the 5-HT
1A
receptor have tried to associate the
polymorphism (-1019 C>G) with depression and suicidal behavior with controversial
results. Lemonde et al. (2003) suggest a novel transcriptional model in which the G
allele depresses 5-HT
1A
autoreceptor expression reducing serotonergic
neurotransmission, predisposing to depression and suicide when comparing 102
suicide completers with 116 normal controls. This data is similar to Lenze et al (2008)
study in which the G allele of the 5-HT
1A
(-1019 C>G) polymorphism was associated
with increased depressive symptoms. Parsey et al (2006) in a positron emission
tomography (PET) analysis study, observed that the genotype G/G was related to
57
depression in a sample of medication free depressive patients when compared to a
control-group. In contrast Wu et al. (2008) suggested that 5-HT
1A
(-1019 C/G)
polymorphism is probably associated with MDD and it is likely to be a susceptible
gene locus for females and late-onset MDD, however, in this study, the G/G
genotype, contradicting most studies, was the less probable one to be associated
with the disorder. In addition, there are some studies showing no association
between MDD and 5HT
1A
(Pitchot et al. 2005; Serretti et al.2007), suggesting that the
HTR
1A
gene may not play a major role in the genetic susceptibility underlying
depressive and anxiety-related phenotypes (Hettema et al. 2008).
Since available results are controversial and there are no studies investigating
this association in patients with the genetic background of Brazil, the aim of this study
was to verify the possible influence of rs6295 (-1019 C/G) polymorphism in
depressive patients, from south of Brazil who attempted suicide, and compare them
to a control-group.
Materials and Methods
This is a case-control study where subjects were cautiously paired (1:1) by sex
and age (maximum acceptable difference of 2 years). Cases and controls were at
least eighteen years old and of caucasian origin. The case population studied (n=87)
consisted of patients admitted to the Emergency Hospital of Porto Alegre (Hospital
de Pronto Socorro - HPS) for serious suicide attempts and requirement of medical
care either at the emergency ward or at the intensive care unit due to a life-
threatening condition and fulfill DSM-IV diagnostic criteria for Major Depressive
Disorder (MDD). The control group (n=87) was a convenience sample composed by
employees of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) without psychiatric
disorders, recruited between June 2006 and April 2007.
Cases and controls were evaluated by a Psychiatric Interview and the Mini
International Neuropsychiatry Interview (MINI) - Brazilian version (Sheehan et al.,
1998). A semi-structured interview was used to access sociodemographic data and
clinical history. The Beck’s Suicidal Intention Scale (SIS) was used in the interviewed
patients by the psychiatrist, including 15 items, each scored 0 to 2 (Beck et al., 1974)
Blood was collected from both control and patients groups for DNA extraction
after informed consent. This study was conducted in accordance with the Declaration
58
of Helsinki. Institutional review board approval was obtained from the ethics
committee of HCPA (Numbers 04-272 and 05-613).
PCR analysis
Allele-specific polymerase chain reaction (PCR) amplification analysis was
adapted from (Parsey R. et al., 2006) and performed in 12,5 µl of reaction mixture
containing 1X PCR buffer (Invitrogen), (100) ng DNA, 1.6 mM MgCl
2
(Invitrogen),
0,8% of Q-solution, 0.2mM of dNTP, 0.75U Taq polymerase (Invitrogen), 5pm of
each primer. Each sample was amplified using the following primers: 5´-
CTGAGGGAGTAAGGCTGGAC-3´= (A) and 5´-GAAGAC CGAGTGTG TCTTCG-3´=
(B) primer set specific for the ―G‖ allele or the 5´-CTGA GGGAGTAAGGCTGGAC-3´
= (A) and 5´-GAAGACCGAGTGTGTCTTCC-3´=(C) primer set specific for the ―C‖
allele (Wu and Comings 1999).
The reaction conditions were as follows: 94°C for 5 min, 40 cycles at 94°C for
30 s, 55°C for 30 s, 72°C for 30 s and a final extension step at 72°C for 5 min. The
PCR amplifications were performed whit the Programmable Thermal Controller -
PTC-100 (MJ Research, INC). The electrophoresis was performed in 1.5% agarose
gel and the amplification products were visualized with UV light.
Statistical Analysis
Data are presented as mean ± standard deviation, count and percentage (%).
Allelic and genotypic tests were performed, using Chi-square test with and without
continuity Yates correction. Additionally, we perform an exploratory analysis through
stratified analysis using the following variables: gender, presence/absence of
comorbidities; use/non-use of alcohol during the suicide attempt and violent/non-
violent suicide attempt using the same tests described above. One-way ANOVAs
were used to compare the SIS scores between the different groups of patients
according to genotype in the two classifications.
Tests for deviation from Hardy-Weinberg equilibrium were conducted with the
χ
2
test for goodness of fit. Statistical analysis was performed using the Statistical
Package for the Social Sciences (SPSS) version 14.0 (SPSS for Windows 14.0,
SPSS, Chicago, IL, USA) and Programs for Epidemiologists PEPI v. 4.0 for DOS.
The level of significance used was α=0.05. Regarding allelic test of the primary
59
analysis, an estimated power of 80% and a minor allele frequency of 0.43 we were
able to detect odd ratio higher than 2.5.
Results
The final sample was composed by 174 individuals. Of those, 110 (63.2%)
were women, with an average age of 34.9±10.50 with no differences between cases
and controls (34.5±10.82 vs. 35.2±10.21, respectively; t=-0.018, p=0.677). There
were no significant differences between cases and controls regarding marital status,
employment status and educational level (p>0.05; data not show). Suicide attempts
were classified as violent (n=38; 43.7%) or non-violent (n=49; 56.3%). Regarding
comorbidity, 18 (20.7%) met criteria for alcohol dependence, 12 (6.9%) for alcohol
and drug dependence.
The frequency of the ancestry allele of rs6295 (-1019 C>G) of 5-HTR
1A
in the
whole sample was C=0.51, with no significant deviation from Hardy Weinberg
Equilibrium (χ²=0.07, df=1, p=0.793) in control sample. The difference in frequency of
risk allele (G) between cases and controls 0.57 vs. 0.46 respectively, approached
significance (OR=1.55; CI95% 1.02 to 2.37; χ²
Yates
=3.727, df=1, p=0.054).
Additionally, genotypic test comparing differences between frequency of genotypes in
cases [CC=13(14.9%), CG=49(56.3%), GG=25(28.7%)] and controls
[CC=26(29.9%), CG=42(48.3%), GG=19(21.8%)] approached significance (χ²=5.690,
df=2, p=0.058). There are significant differences if we consider having at least one
copy of G allele (CG+GG vs. CC) in the dominant model, OR=2.43 (CI95% 1.15 to
5.12, χ²
Yates
=4.759, df=1, p=0.029).
In addition we explored our analysis aiming to evaluate whether the difference
observed between cases and controls is related to sex. This effect was observed in
man, with a high OR if we consider dominant model (OR=5.8; CI95% 1.45 to 23.23;
χ²
Yates
=5.573, df=1, p=0.007) but not in women (OR=1.54; CI95% 0.62 to 3.84;
χ²
Yates
=0.480, df=1, p=0.489). Allelic test and genotypic tests in the restricted sample
of man approached and reached significance (respectively - p=0.051 and p=0.029)
and there were no differences in these tests in the restricted sample of women.
Further exploratory analysis regarding presence/absence of comorbidities; use/non-
use of alcohol during the suicide attempt and violent/non-violent suicide attempt and
analysis of SIS scores did not show significant results in allelic or genotypic tests.
60
Discussion
In our study we found that depressed patients who have at least one copy of
allele G (CG + GG vs CC) were more prone to attempt suicide as compared to
depressed patients without the G allele. Allelic tests and genotypic tests approached
significance in showing this association. Additionally, we found a differential effect of
the influence of G allele in suicide attempt according to gender, whereas there is a
significant association of G allele and suicide attempt in the male sample, but not in
female sample. Exploratory analysis failed to show additional significant results. This
result is are in accordance to the one reported by Lemonde e cols. (2003) with a 4
times increased frequency of the GG genotype in 102 suicide victims compared to
116 control-group.
Based on our results, we corroborate the hypothesis that the G allele
presence can influence serotoninergic activity in men, by decreasing 5HT
1A
transcription due to NUDR increased activity in post-synaptic regions. Thus, G allele
becomes a susceptible factor in the male group, adding to the biological,
environmental and behavioral (depressive disorder) conditions, and it can result in a
major vulnerability into suicidal attempts. In the Szewczyk et al., (2008) study, the
concentration of NUDR and 5-HT
1A
receptor protein was significantly decreased in
the prefrontal cortex (PFC) in female subjects with MDD relative to matched female
controls, but was unchanged in the PFC of male depressed subjects compared to
male controls. Regarding the (-1019 C>G) polymorphism in the present study, the
male cohort of depressed suicide attempters also showed a trend for association with
the G allele and depression. The finding that the female subjects did not display an
association with the G allele is important, because it implies that the decrease in 5-
HT
1A
receptors observed in these subjects is not explained by impaired repression by
NUDR at the G allele. In addition, the gender-specific alterations in cortical NUDR
and 5-HT
1A
receptor proteins could represent an underlying biological mechanism
associated with the higher incidence of depression in women. These contradictories
results may be explained by the hypothesis in which the polymorphism can act in
different forms in the pre and pos-synaptic receptors Czesak et al., (2006). Based on
this hypothesis, the polymorphism acts as a transcriptional repressor of the 5-HT
1A
receptor in serotonergic cells, but functions as a transcriptional enhancer of the 5-
HT
1A
receptor in nonserotonergic cells such as post-synaptic neurons. Therefore,
61
depending on the synaptic localization of 5-HT
1A
receptors, NUDR may serve distinct
functional roles.
Many studies support the hypothesis of G allele in polymorphism (-1019 C>G)
as one of the modifying factors of the serotoninergic function system. Parsey et al.,
(2006) found in ―antidepressants naive (AN)‖ an increasing of the 5-HT
1A
receptors
expression compared to antidepressants exposure (AE) and control-groups,
suggesting a model of depression characterized by an over expression of auto
inhibitory somatodendritic 5-HT
1A
receptors, perhaps due to the G allele presence,
that may result in reduced terminal field 5-HT release. AE appears to have long-term
effects on 5-HT
1A
. The results found by Hsiung et al., (2003) suggest that the
alterations in agonist-stimulated 5-HT
1A
receptor activation in depressed suicide
victims are also manifested downstream from the associated G protein, affecting the
activity of second messengers in two 5-HT
1A
receptor transduction pathways that
may have implications for cell survival. In 2007, Sawiniec et. Al (2007), analyzed the
allelic and genotypic frequency among 65 patients, who attempted suicide and 63
control-group controlled for psychiatry disorders and found a higher frequency of
allele G in the suicidal patients. Besides, the genotypic frequency was significantly
different between the control-group and hospitalized patients. This study data
confirms the hypothesis that the polimosphism (-1019 C>G) of receptor 5-HT
1A
increases the risk of suicide attempt. Benko et al., (2009) studied the relationship
between impulsivity and the (-1019 C>G) polymorphism of the 5-HT
1A
in a population
sample of 725 volunteers. Subjects carrying GG genotype showed significantly
higher impulsiveness scores compared to GC or CC carriers. The result suggest the
involvement of the 5-HT
1A
in the continuum phenotype of impulsivity. An interesting
study made by Zhang et al., (2009), who studied the combined effect of receptor 5-
HT
1A
(-1019 C>G) with the serotonin 5-HTTLPR in Chinese patients with major
depressive disorder, has confirmed this effect.
Our results should be interpreted in light of some limitations. The possibility of
spurious association must be considered due to multiple testing regarding
exploratory analysis. In order to avoid bias due to sample size, our sample is
restricted to depressed patients diagnosed by DSM- V criteria, to patients admitted to
an emergency hospital due to serious suicide attempt, to Caucasian population and
did not include suicide completers. We tried to diminish ethnic stratification by
62
restricting our analyses to Caucasian subjects that are phenotypically recognized in
the south of Brazil (Zembrzuski, 2006). The south Brazil region show the lowest rate
of admixture due to the influences received by Portuguese, Italians, Germans and
Spanish descendants.
In conclusion, this is the first study to demonstrate a significant association
between suicide attempt in depressed patients and 5HT
1A
polymorphisms in South
America. Such studies need to be replicated in other populations with a larger
sample size to provide a better understanding regarding 5-HT
1A
receptor
polymorphism (-1019 C>G), the roles of serotonin system and other genes involved
in suicide attempt.
Acknowledgements
This study received institutional support funds from FIPE-HCPA. Rafael Rebelo e
Silva is supported by a governmental (CAPES) M.Sc. Scholarship.
63
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66
Considerações Finais
A compreensão dos fatores genéticos que contribuem para a vulnerabilidade
ao comportamento suicida ainda está longe de ser totalmente elucidada. Apesar dos
resultados controversos da literatura, em nosso estudo, os pacientes depressivos
com tentativa de suicídio e com pelo menos uma cópia do alelo polimórfico G (CG +
GG vs CC) para o polimorfismo (-1019C>G) do receptor de serotonina 5-HT
1A
(rs6295), apresentaram maior suscetibilidade à tentativa de suicídio do que os
pacientes que não apresentaram o alelo G, conforme indicou o teste alélico e
genotípico (CI95% 1.15 to 5.12, χ²
Yates
=4.759, df=1, p=0.029). Esses resultados
corroboram à hipótese de que o alelo G(-1019) possa estar exercendo certa
influencia, junto com outros fatores, para o desenvolvimento de algum transtorno
psiquiátrico (Huang et al., 2004; Savitz et al., 2009; Zhang et al., 2009).
Além disso, foi encontrado um efeito diferencial da influencia do alelo G na
tentativa de suicídio em relação ao gênero. Sabe-se que o comportamento suicida
difere entre homens e mulheres. Embora as mulheres façam mais tentativas de
suicídio que os homens, estes tem uma mortalidade 4 vezes maior que as mulheres
em suas tentativas. Em 80% dos suicídios concretizados relaciona-se ao sexo
masculino (Roy, 1999). Na amostra deste estudo, a influencia do alelo G(-1019) do
receptor 5-HT
1A
na tentativa de suicídio se mostrou diferente quando comparados
entre homens e mulheres. Esse efeito foi associado com a amostra masculina
(OR=5.8; CI95% 1.45 to 23.23; χ²
Yates
=5.573, df=1, p=0.007) e não com a feminina
OR=1.54; CI95% 0.62 to 3.84; χ²
Yates
=0.480, df=1, p=0.489). O resultado foi similar
ao encontrado por Lemonde et al. (2003) em seu estudo, aonde observou nos
homens que o genótipo GG foi mais frequente nos indivíduos que cometeram
suicídio em relação aos controles.
Acredita-se que alterações polimórficas no gene do receptor 5-HT
2A
estão
associadas a várias doenças neuropsiquiátricas (Zhang et al., 1997; Du et al., 2000
Keltikangas-Järvinen et al., 2008; Vaquero-Lorenzo et al., 2008). Na análise do
polimorfismo T102C dos receptores 5-HT
2A
(rs6313) (anexo I), realizada nesse
estudo, uma diferença significativa foi encontrada para o genótipo CC entre
pacientes e controles. A frequência encontrada do genótipo CC foi maior no grupo
67
controle do que nos pacientes (X²= 6,179, df= 2, P= 0,046). Quando realizado o teste
sobre o efeito do alelo dominante, ou seja, testar o efeito da presença de pelo
menos uma cópia do alelo, os resultados obtidos não foram significativos
(OR=0.679; CI95% 0.372 to 1.239; χ² =1.603, df=1, p=0.132). A mesma análise
utilizada em pacientes e controles foi aplicada para verificar o efeito do polimorfismo
no gênero. Os resultados não apresentaram significância para a frequência dos
genótipos e no modelo dominante, respectivamente (P=0,224 e P=0,183). Esses
dados contrariam o estudo de Du et al., (2000), que encontrou significância entre o
alelo C em pacientes com transtorno depressivo maior com ideação suicida.
Entretanto, Khait e colegas (2005) não encontrou associação entre o polimorfismo
T102C do receptor de serotonina e transtornos de humor e suicídio.
O polimorfismo T102C dos receptores 5-HT
2A
não resulta em alteração na
sequência de aminoácidos da proteína, portanto, pode-se considerar que não
ocorrem danos estruturais e fisiológicos nos receptores 5-HT
2A
e em sua cascata
sinalizadora. Porém, a importância desse polimorfismo se dá pela associação do
polimorfismo T102C com depressão maior e esquizofrenia encontrada por Pata, et
al., (2004). Além disso, o subtipo 5-HT
2A
é o mais importante funcionalmente, pois
participa dos efeitos fisiológicos mediados pelo receptor no SNC, além de ter uma
importante função na excitação neuronal, efeitos no comportamento, aprendizagem
e ansiedade. O 5-HT
2A
apresentou importância inicial por ser alvo de drogas
psicodélicas (LSD) e voltou a ser proeminente por mediar, em parte, a ação de anti-
psicóticos, principalmente atípicos. Na amostra, pode-se supor que o polimorfismo
T102C (rs6313) não teve grande efeito no desenvolvimento do comportamento
suicida. Mesmo que para os receptores 5-HT
2A
os resultados não tenham sido
significativos, sabe-se das limitações do tamanho amostral e da origem étnica da
população brasileira. No entanto, houve a tentativa de diminuir a estratificação
étnica, restringindo a análise aos pacientes caucasianos que são fenotipicamente
reconhecidos no sul do Brasil, uma vez que a região sul do Brasil apresenta uma
das menores taxas de mistura étnica devido às influencias recebidas por
descendentes Portugueses, Italianos, Alemães e Espanhóis (Zembrzuski et al.,
2006).
68
Baseado nos resultados pode-se corroborar a hipótese de que, para os
receptores 5-HT
1A,
a presença do alelo G pode influenciar a atividade
serotoninérgica nos homens, pela diminuição da transcrição dos receptores 5-HT
1A
.
Assim, o alelo G torna-se um possível fator de suscetibilidade para o sexo
masculino, somando as condições biológicas, ambientais e comportamentais,
podendo resultar em uma maior vulnerabilidade ao comportamento suicida. Para os
receptores 5-HT
2A,
os resultados não foram significativos, indicando que o alelo
polimórfico C não oferece suscetibilidade para essa amostra de pacientes
depressivos com tentativa de suicídio. Sabe-se que os estudos de caso-controle são
ideais em casos de doenças ou desfechos raros, pois selecionam os indivíduos a
partir do desfecho e descreve uma exposição anterior, nesse caso, os genótipos e
alelos. Apesar de os resultados serem positivos, os estudos de associação devem
ser replicados em outras populações e com amostras maiores, aumentando o poder
do estudo para um melhor entendimento do efeito genético sobre os transtornos
comportamentais. Além disso, não se pode descartar que outros fatores possam
estar segregando nesta amostra juntamente com os genótipos. Os fatores
ambientais são importantes para o desenvolvimento das características
comportamentais e, nesse tipo de estudo, o histórico pessoal pode ser determinante
para o desenvolvimento dos transtornos depressivos, assim como o comportamento
suicida.
O comportamento suicida tem sido foco de atenção de diversos pesquisadores
no mundo inteiro devido a sua impressionante frequência. Mesmo já havendo
definições sobre os fatores de risco e proteção do suicídio, estes ainda constituem-
se insuficientes na prevenção e no tratamento do problema. Ainda há muito para se
esclarecer sobre a compreensão dos efeitos genéticos na vulnerabilidade para o
comportamento suicida. Os avanços científicos têm proporcionado meios para o
desenvolvimento de estudos que tentam relacionar a genética com os transtornos
psiquiátricos. Estudos de interação gene - ambiente, gene-gene-ambiente, análise
de famílias, trios e de haplótipos de suscetibilidade que relacionam polimorfismos de
diferentes sistemas, tem apresentado resultados bastante promissores na busca de
encontrar o entendimento dos transtornos comportamentais. Pesquisas sobre
epigenética estão sendo utilizadas na busca por respostas sobre o poder do efeito
ambiental sobre os genes. Sabe-se que os indivíduos nascem com o material
69
genético necessário para expressar todas as proteínas do organismo, porém a carga
genética de um indivíduo pode estar sujeita às ações ambientais em aspectos
relacionados ao desenvolvimento do indivíduo e de doenças. Estudos envolvendo
mecanismos genéticos via metilação podem influenciar o funcionamento de genes
atenuando ou silenciando sua expressão.
Não é possível predizer com certeza através da análise do genótipo de um
indivíduo se ele um dia cometerá ou não suicídio. Sabe-se que os transtornos
comportamentais, assim como o comportamento suicida, são multideterminados, ou
seja, a ação de diversos fatores complexos que envolvem o histórico de vida de um
indivíduo é que podem determinar esse tipo de comportamento. Sendo assim, o
aperfeiçoamento de ferramentas diagnósticas é essencial para desenvolver
programas e estratégias de ação, aprimorando a qualidade do atendimento para as
populações de risco.
70
APÊNDICE A – Dados não submetidos a publicação
Análise do polimorfismo rs6313 do receptor de serotonina 5-HT
2A
MATERIAL E MÉTODO
O trabalho foi desenvolvido utilizando-se um banco de DNA pré-existente.
Este material consta de DNA extraído de sangue periférico proveniente de 132
pacientes deprimidos internados no Hospital de Pronto Socorro por tentativa de
suicídio seja por ingestão de substâncias e/ou métodos que envolvam conduta
autoagressiva (ferimentos autoinfligidos por arma branca ou de fogo, enforcamento
ou outros meios). Na ocasião da coleta de dados, todos os pacientes concordaram
em participar do estudo através de termo de consentimento informado, assinado
pelo participante (Anexo 1). Os participantes estão cadastrados em um arquivo com
nome, número e informações epidemiológicas que se encontra em poder do médico
responsável por contatar os mesmos para informar os resultados globais obtidos na
pesquisa. Para a população controle, foi utilizado um banco genético de indivíduos
sem diagnostico psiquiátrico em Eixo I, que foram selecionados entre funcionários
do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Os sujeitos foram inicialmente avaliados por
uma entrevista clínica por um psiquiatra clínico e através do MINI, uma entrevista
psiquiátrica estruturada que abrange os principais diagnósticos segundo os critérios
do DSM-IV. Considerando-se o número total de funcionários do HCPA como 4500
sujeitos, a prevalência mínima para os marcadores de 17%, um alfa de 5% e beta de
99%, o tamanho mínimo calculado da amostra foi de 52 sujeitos. Nosso banco está
composto de 152 indivíduos.
Investigação Molecular
Foram utilizadas amostras de DNA genômico, previamente extraídas a partir
de 5ml de sangue total coletado através de punção venosa periférica, conforme o
método de precipitação de sais descrito por Miller et al., (1988), armazenadas em
um banco de DNA numerado e identificado. Estas amostras de DNA encontram-se
armazenadas em freezer a uma temperatura de -20
0
C no Laboratório de Biologia
Molecular do Serviço de Genética Médica do HCPA.
71
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A região polimórfica do exon 1 do gene 5-HTR
2A
foi amplificada através do
método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se os primers 5-HT
2A
5` - TCGCTACAAGTTCTGGCTT - 3` (forward) e 5-HT
2A
5` -
CTGCAGTTTTTCTCTAGGG - 3` (reversed) descritos por Warren et al.,(1993). A
análise deste polimorfismo foi realizada através da técnica de restriction fragment
lenght polymorphism (RFLP). A partir da obtenção de um produto amplificado foi
realizada uma eletroforese em gel de agarose 1,5% para a verificação da presença
de quantidade suficiente do produto de PCR, através de uma banda de 342 pb. A
seguir, 10μL do produto de PCR foi submetido a uma reação de digestão, utilizando
1,5μL da enzima de restrição MspI, a 37ºC overnight. O produto da digestão foi
visualizado em gel de agarose 3%. A presença de um fragmento de 342 pb indica a
presença do alelo T (sem a transversão), e a presença de dois fragmentos, um de
215 pb e outro de 126 pb indicam a presença do alelo C com a transversão (Ogilvie
et al., 1998 apud Pata et al., 2004).
Planejamento da Análise dos Dados
O delineamento da pesquisa foi do tipo caso-controle, e para a análise
estatística utilizou-se o Pacote estatístico SPSS para Windows versão 11, com a
finalidade de se realizar uma análise multivariada a partir dos dados obtidos nos
pacientes e controles.
72
Anexo 1
Termo de Consentimento Informado
Projeto de Pesquisa: ―Estudo dos haplótipos de suscetibilidade ao
comportamento suicida em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio‖
Este projeto de pesquisa tem como objetivo estudar os pacientes que
procuraram atendimento no Hospital de Pronto Socorro devido a uma tentativa de
suicídio. Durante o atendimento se buscará obter informações sobre os possíveis
motivos e causas que possam ter levado a tentativa de suicídio e assim buscar o
tratamento adequado para cada situação. Os pacientes que buscam o HPS serão
convidados a participar de um estudo sobre o suicídio que envolve a avaliação
genética. Essa avaliação será feita a partir da coleta de 10 ml de sangue dos
pacientes que aceitarem participar deste projeto. A razão de se estudar o sangue
dos pacientes é que se sabe que há uma possível relação genética com condutas
autodestrutivas, incluindo o suicídio e a impulsividade. Assim através da análise de
sangue se investigará a presença de um fator que pode estar relacionado com o
desenvolvimento da doença depressiva e com o suicídio.
Risco e Desconforto
Os riscos associados à coleta de sangue são mínimos, podendo ocorrer
manchas roxas e dor no local da coleta. O desconforto será mínimo, pois a coleta
será realizada por profissional treinado e experiente.
73
Benefícios
O presente estudo não se propõe a trazer benefícios diretos e imediatos aos
pacientes investigados. Mas o estudo pode contribuir para uma melhor compreensão
a respeito do suicídio, que no futuro, leve a uma melhor definição do diagnóstico, do
tratamento e do prognóstico dos pacientes e ao desenvolvimento de estratégias
terapêuticas mais efetivas para esta situação.
Recusa ou Descontinuação da participação
Eu entendo que a participação neste estudo é voluntária e que posso, a
qualquer momento, retirar meu consentimento e interromper minha participação. A
recusa em participar ou a desistência não ocasionará nenhum prejuízo aos cuidados
médicos que estou recebendo nem está condicionado a continuidade do tratamento
que recebo no Hospital de Pronto Socorro.
Pelo presente termo, declaro que fui informado, de forma clara e detalhada,
sobre o presente projeto de pesquisa, e que tive minhas dúvidas esclarecidas
por________________________________________. Fui igualmente informado
sobre a garantia da manutenção do anonimato, da privacidade das informações que
forneci e também recebi respostas e esclarecimentos sobre todos os procedimentos
envolvidos nesta pesquisa. Declaro também que estou de pleno acordo com a minha
participação neste projeto.
Nome do participante ou responsável
Assinatura do participante ou responsável
74
Responsabilidade do pesquisador
Eu expliquei a ________________________________________________ o
objetivo deste estudo, os procedimentos requeridos e os possíveis riscos e
benefícios, usando o meu melhor conhecimento. Eu me comprometo a fornecer uma
cópia desse formulário de consentimento ao participante ou responsável e cumprir
com aquilo que foi informado ao paciente.
_____________________________ ___________________________________
Nome do pesquisador ou associado Assinatura do pesquisador
Porto Alegre, _____de__________________ de 200__.
Contato: Dr. Jair Segal, psiquiatra do HPS (Fone: 32897999).
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