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FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE
FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
Avaliação dos Hormônios LH e FSH
Basais e pós GnRH no Diagnóstico de
Menopausa Determinados por
Imunoquimioluminescência
ELISABETE APARECIDA MANTOVANI RODRIGUES DE RESENDE
UBERABA-MG
2010
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ELISABETE APARECIDA MANTOVANI RODRIGUES DE RESENDE
Avaliação dos Hormônios LH e FSH Basais
e pós GnRH no Diagnóstico de Menopausa
Determinados por
Imunoquimioluminescência
Tese apresentada ao Curso de Pós
Graduação em Patologia, área de
concentração Patologia Clínica da
Universidade Federal do Triângulo
mineiro para obtenção do grau de
Doutor.
Orientador
Profa. Dra Maria de Fátima Borges
NOVEMBRO DE 2010
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FICHA CATALOGRÁFICA
Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro
R341a Resende, Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de
Avaliação dos hormônios LH e FSH basais e pós GnRH no diagnóstico de
menopausa determinados por imunoquimioluminescência / Elisabete
Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende. - - 2010.
142 f. : tab. ; graf. ; fig.
Tese (Doutorado em Patologia Clínica) - Universidade Federal do
Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, 2010.
Orientadora: Profª. Drª. Maria de Fátima Borges.
1. Menopausa. 2. Estradiol. 3. Hormônio Liberador de Gonadotropina. 4.
Gonadotropinas. 5. Climatério. I. Título. II. Universidade Federal do
Triângulo Mineiro. III. Borges, Maria de Fátima.
CDU 618.173
“Deus nos concede, a cada dia, uma página de vida nova no
livro do tempo. Aquilo que colocarmos nela, corre por nossa conta."
Chico Xavier
DEDICATÓRIA
Luiz Antônio,
O estímulo, a confiança, o apoio e, sobretudo, o amor que recebo e
sempre recebi de você me mantêm com forças para continuar sempre
lutando e vencendo obstáculos.
Aos meus pais Augusto e Aparecida, minha eterna gratidão pelo amor, carinho
e exemplo de vida.
Aos meus filhos José Augusto e Ana Luísa, fontes inesgotáveis de amor,
carinho e alegria, vidas da minha vida, obrigada por existirem.
Aos meus irmãos Carlos e Elaine, pelo companheirismo e carinho sempre
presentes.
Aos meus sogros José e Nair, por me acolheram como filha, dispensando-me
atenção e carinho.
Aos meus cunhados Maria, Silvana, José , Francisco e Alexandre, os quais
aprendi a amar como irmãos.
A DEUS, pela vida e pela força para vivê-la
AGRADECIMENTOS
À Profª. Dra Maria de Fátima Borges, professora associada e chefe da disciplina
de Endocrinologia e Metabologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, pelo
apoio e incentivo, pela paciência e solicitude, quando do inicio da pós-graduação,.
Ao Prof. Dr Valdo José Dias, professor titular da disciplina de Fisiologia da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro pela grande contribuição na estatística deste
trabalho.
Aos Professores do Curso de Pós-Graduação em Patologia Clínica/UFTM,
pelos ensinamentos.
Aos colegas do Curso de Pós-Graduação em Patologia Clínica/UFTM, pela
amizade e solidariedade.
Ao médico Rodrigo Juliano Molina, pela cooperação na formatação da tese.
À funcionáris: Salma Alice Oliveira e Oliveira, pelas dosagens hormonais.
À senhora Jacqueline Mendes Fonseca Soares pela presteza na coleta do material.
À professora Ana Carolina Sanches Borges, pela correção do português e normas
da ABNT
À professora Angela Maria Fraga Azor, pela presteza na tradução do resumo.
Aos pacientes deste trabalho, pela colaboração inestimável.
SUMÁRIO
ABREVIATURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
INTRODUÇÃO 14
1.1 Epidemiologia 16
1.2 Sintomatologia 19
1,3 Fisiologia do Eixo Hipotálamo-Hipófise-Gonadal 21
1.3 1 Hormônio Liberador de Gonadotrofinas 21
1.3 2 Hormônio Luteinizante e Hormônio Folículo Estimulante 26
1.3 3 Esteroides 28
1.4 Avaliação do Eixo Hipotálamo-Hipófise-Gonadal 33
1.5 Métodos de dosagens hormonais 36
1.5 1 Métodos de dosagens das Gonadotrofinas 42
1.5 2 Métodos de dosagens dos Esteroides 43
1.5 3 Comparação entre os métodos de dosagens 44
OBJETIVOS 46
CASUÍSTICA E MÉTODOS 48
3.1 Casuística 48
3.2 Métodos 55
3,3 Análise estatística 59
RESULTADOS 61
4.1 Valores basais de gonadotrofinas 62
4.2 Valores pós estímulo com GnRH 64
4.3 Valores de Estradiol 66
DISCUSSÃO 80
5.1 Da determinação dos valores basais de gonadotrofinas 82
5.2 Da determinação dos valores estimulados 89
5.3 Da determinação de Estradiol 90
CONCLUSÕES 95
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 98
ANEXOS 113
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviaturas
ABREVIATURAS
B – basal
cm - centímetros
CMD – concentração mínima detectável
CMaD – Concentração máxima detectável
D – delta
DP – desvio-padrão
DPC – Diagnostic Products Corporation
E
2
– Estradiol
EIE - enzimaimunoensaio
FIE – fluorimunoensaio
FSH – hormônio folículo estimulante
GnRH – hormônio liberador de gonadotrofinas
HCG – gonadotrofina coriônica humana
IFME – ensaio imunofluorimétrico
IRME – ensaio imunorradiométrico
Kb – kilobase
Kd – kilodalton
Kg – kilograma
LH – hormônio luteínizante
ng/dL – nanogramas/decilitro
P – pico
Pg/mL – picograma/litro
ICMA - Quimioluminescência
RIE – radioimunoensaio
ROC - “Receiver Operating Characteristics”
SHBG – globulina ligadora dos hormônios sexuais (“sex hormone binding globulin”)
SNC – sistema nervoso central
UI/L – unidades internacionais/litro
μg – micrograma
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
LISTA DE TABELAS
Tabelas
Tabela 1: Dados clínicos e antropométricos das mulheres dos grupos
(A – E), expressos em média ± DP, e mediana (min-max). 52
Tabela 2: Dados clínicos e antropométricos das mulheres, divididas
entre grupo de pré-menopausadas e menopausadas,
expressos em média ± DP, e mediana (min-max). 53
Tabela 3: Dados clínicos e antropométricos das mulheres, que se
submeteram ao teste do GnRH, em cada grupo dividido
por idade, expressos em média ± DP, e mediana (min-max) 54
Tabela 4: Características dos ensaios hormonais utilizados 58
Tabela 5: Concentrações basais de LH, FSH e E
2
, determinadas pelo
método da (ICMA) em mulheres normais, nas várias idades 68
Tabela 6: Concentrações basais de LH, FSH e E
2
, determinadas pelo
método da (ICMA) em mulheres normais, divididas entre
pré-menopausadas e menopausadas 69
Tabela 7: Concentrações basais e pico de LH, FSH pós GnRH,
determinadas pelo método da(ICMA) em mulheres normais,
nas várias idades, pré-menopausadas e menopausadas 70
Tabela 8: Comparação múltipla grupo a grupo em mulheres
submetidas a dosagens de LH, FSH e E
2
basais e IMC 71
Tabela 9: Comparação múltipla grupo a grupo em mulheres
submetidas ao teste do GnRH, com dosagem de
LH, FSH e E
2
, basal (B), pico (P) e delta (D) 72
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
LISTA DE FIGURAS
Figuras
Figura 1: Peíodos relacionados à menopausa (Fonte: OMS, 1996) 15
Figura 2: Padrão de secreção de gonadotrofinas, durante diferentes
estágios da vida da mulher 26
Figura 3: Curva ROC para o valor Basal de FSH de 15 UI/L.
97,93% de sensibilidade e 94,93% de especificidade 73
Figura 4: Comportamento mediano do FSH, nos diversos grupos.
Caixa percentil 25 a 75% e extremos 5 e 95% 73
Figura 5: Curva ROC para o valor Basal de LH de 10 UI/L.
73,06% de sensibilidade e 82,2% de especificidade 74
Figura 6: Comportamento mediano do LH, nos diversos grupos.
Caixa percentil 25 a 75% e extremos 5 e 95% 74
Figura 7: Curva ROC para o valor Basal de E
2
de 35 pg/mL.
64,77% de sensibilidade e 79,94% de especificidade 75
Figura 8: Comportamento mediano do E
2
, nos diversos grupos.
Caixa percentil 25 a 75% e extremos 5 e 95% 75
Figura 9: Curva ROC para o valor de pico de FSH de 46 UI/L.
100% de sensibilidade e 87,10% de especificidade 76
Figura 10: Comportamento mediano do pico de FSH, nos diversos grupos.
Caixa percentil 25 a 75% e extremos 5 e 95% 76
Figura 11: Curva ROC para o valor de pico de LH de 50 UI/L.
92,86% de sensibilidade e 90,32% de especificidade. 77
Figura 12: Comportamento mediano do pico de LH, nos diversos grupos.
Caixa percentil 25 a 75% e extremos 5 e 95% 77
Figura13: Apresentação dos percentis 5% e 95% dos valores de 78
FSH, LH e E
2
, nos diversos grupos
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
3
RESUMO
Resumo
A determinação dos valores de LH, de FSH, em condição basal e após estímulo com o
GnRH em mulheres normais, pré e pós menopausa, constituiu-se no principal objetivo
deste estudo. Foi estabelecido um valor de corte para o FSH, LH e E
2
indicativo de
menopausa, utilizando-se o método de dosagem hormonal da imunoquimioluminescência
(ICMA). Para tais procedimentos, foram selecionadas 503 mulheres normais, sendo 309
pré-menopausadas e 194 menopausadas; Destas, foram sorteadas, aleatoriamente, 46 para a
realização do teste de estímulo do LH e FSH com o GnRH, sendo 31 na pré menopausa e
15 menopausadas. As amostras de sangue foram coletadas em dois tubos para as dosagens
basais de LH, FSH e E
2
e pós-estímulo com o GnRH, os quais foram dosados no
Laboratório de Hormônios da Faculdade de Medicina da UFTM. Utilizou-se o Aparelho
Immulite, com estojos comerciais obtidos da DPC (diagnostic Products Corporation-
Medlab, LA USA). A curva-padrão para o LH variou de 0,1 a 2000UI/L e foi calibrada
pelo padrão internacional 1° IRP 68/40 e 2
nd
IS 80/552, da OMS. A curva-padrão para o E
2
variou de 5 a 2000pg/mL. A análise estatística, para comparar os valores de LH, FSH e E
2
,
nos cinco grupos, utilizou o teste de ANOVA 2 e Kruskal-Wallis,. Na comparação entre
mulheres menopausada e não menopausada, utilizou-se o teste de Mann-Whitney. Para
verificar o tempo máximo de resposta do LH e FSH (pico), empregou-se o teste ANOVA 1
e, para os valores de cutoff de FSH, LH e E
2
, o método de sensibilidade e especificidade
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
8
Resumo
com a curva ROC acompanhado dos percentis 5% e 95%. As concentrações basais de LH e
FSH foram progressivamente maiores, com o avanço do climatério. Os limites para a
detecção de menopausa foram de 15UI/L para o FSH e 10UI/L para o LH. O limite para o
pico de FSH, após GnRH, foi de 65,2 UI/L para o percentil 95%. No entanto, quando
aplicamos a curva ROC, este valor caiu para 46UI/L nas mulheres em pré-menopausa. O
E
2
apresentou limite de corte de 35 pg/mL. Houve sobreposição de 33,3% e 25,7%,
respectivamente, para o grupo pré-menopausa e menopausa. Após estímulo com GnRH,
observou-se sobreposição do FSH entre todos os grupos de idade, na pré e pós menopausa.
O E
2
não foi capaz de diferenciar o estádio pré-menopausa de menopausa. Concluímos que
os valores de referência, obtidos através da ICMA em cada faixa etária, permite-nos o
diagnóstico mais precoce do declínio hormonal ovariano, indicando a melhor época para se
iniciar o tratamento do climatério e da menopausa, quando as pacientes apresentam
sintomas ainda considerados inespecíficos.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
9
ABSTRACT
[Digite texto]
Abstract
This study aimed to determine the values of Luteinizing Hormone (LH) and
Follicle-Stimulating Hormone (FSH) in basal conditions and after Gonadotropin-
releasing hormone (GnRH) stimulation in healthy women before and after menopause.
We established a cutoff for FSH, LH and oestradiol (E
2
) indicative of menopause by the
hormonal method of immunochemiluminescence (ICMA). For these procedures we
selected 503 healthy women with 309 premenopausal and 194 postmenopausal. Of
these, 46 individuals (31 premenopausal and 15 postmenopausal) were selected
randomly for the test stimulus of LH and FSH to GnRH. All groups had blood samples
collected in two tubes to assay basal LH, FSH and E E
2
2. After stimulation with GnRH,
LH and FSH levels were measured at the Hormone Laboratory of the Faculty of
Medicine at UFTM. The hormones were measured using the Immulite apparatus, with
commercial kits obtained from DPC (Diagnostic Products Corporation-Medlab, LA
USA). The standard curve for LH ranged from 0.1 to 2000UI/L and was calibrated by
an international standard 1st IRP 68/40 and 2nd IS 80/552, WHO. The standard curve
for E
2
ranged from 5 to 2000pg/mL. The ANOVA 2 test and Kruskal-Wallis were used
for the statistical analysis to compare the values of LH, FSH and E
2
in the five groups
while the comparison between menopausal and non menopausal women was performed
by the Mann-Whitney test. To check the time of peak response of LH and FSH,
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
11
Abstract
stimulated with GnRH the ANOVA test was used and for the cutoff values for FSH, LH
and E
2
, the sensitivity and specificity method was used with the ROC curve together
with the 5% and 95%.percentiles.The limits for detection of menopause were 15 UI/L,
for FSH and 10 UI/L for LH. The limit for the peak of FSH after GnRH was 65.2 UI/L
for the 95% percentile, but when we applied the ROC curve, this value fell to 46 UI/L in
premenopausal women. E
2
had cut-off of 35 pg/mL.There was overlap of 33.3% and
25.7% respectively in the pre-menopause and menopause groups. After GnRH
stimulation there was overlap of FSH among all age groups and in the pre and post
menopause stage. E
2
was not able to differentiate the pre-menopausal stage of
menopause. We conclude that the reference values obtained by ICMA in each age group
and differentiating menopause from non menopause allows us to earlier diagnosis,
indicating the best time to start treatment of climacteric and menopause when patients
are still asymptomatic.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
12
INTRODUÇÃO
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
Introdução
Historicamente, a palavra climatério, derivada do grego Klimacter, significa
“período crítico”. O conceito de menopausa , por sua vez, surge a partir de um artigo de
Gardanne, publicado em 1816 e denominado "Conselho às mulheres que entram na
idade crítica", em que descreve a síndrome denominada "La menopausie". Menopausa é
a soma de duas palavras gregas que significam basicamente mês e fim (WHO,1981). De
acordo com a Sociedade Internacional de Menopausa, o climatério é o período de
transição entre a fase reprodutiva e a não reprodutiva da vida da mulher, estando sujeito
a ser acompanhado de sintomas. Quando esses estão presentes, esse período pode ser
designado como "síndrome do climatério" (UTIAN, 1999).
Pela Organização Mundial da Saúde, o climatério compreende: 1) uma fase pré-
menopausal, que começa em torno dos quarenta anos de idade e se estende até o início dos
ciclos menstruais irregulares e/ou de sintomatologia atribuível à falência ovariana, com
duração variável; 2) uma fase peri-menopausal, que se inicia anteriormente à menopausa,
com o começo dos sintomas, e se estende até o primeiro ano após a menopausa; 3) uma fase
pós-menopausal, que se inicia após a interrupção das menstruações e se estende até os 65
anos de idade. Cronologicamente, o evento demarcador das fases do climatério é a
menopausa, definida como a ausência da menstruação por, pelo menos, 12 meses
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
14
Introdução
consecutivos. Os limites de idade para climatério e menopausa ainda são bastante
controversos (WHO,1996) (Figura 1).
Figura 1: Peíodos relacionados à menopausa (Fonte: OMS, 1996)
Segundo o Massachusetts women’s health Study, um dos maiores estudos
longitudinais, que investigou 1.550 mulheres por mais de cinco anos, com base nos
dados autorrelatados, o termo perimenopausa foi empregado para o período de
irregularidades menstruais, sendo dividida em precoce e tardia, até 3 meses de
irregularidade e entre 3 e 11 meses em amenorréia, respectivamente (AVIS &
MCKINLAY,1996).
O climatério também foi dividido por idade no estudo de Bossemeyer, 1999,
que classificou-o em três fases: 1ª) fase precoce, de 35 aos 45 anos; 2ª) fase de
perimenopausa, dos 45 aos 55 anos; 3ª) fase tardia, dos 55 aos 65 anos
(BOSSEMEYER, 1999).
Em um esforço para responder às necessidades de uma nomenclatura mais
consistente, foi realizado em julho de 2001, um consenso para criar um sistema de
estadiamento (similar à puberdade) para a senescência reprodutiva, o qual se baseava
em ciclicidade menstrual e alterações endócrinas. Sete períodos foram criados (cinco
que precedem e dois que se seguem ao último período menstrual): 1ª) Intervalo
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
15
Último Período Menstrual (DUM)
MENOPAUSA
Período de transição menopausal Período pós-menopausa
PERIMENOPAUSA
12 meses
Introdução
reprodutivo no qual constam três períodos: a) inicial; b) intermediário e c) tardio. A
duração desta fase é variável e a ciclicidade menstrual também. Os níveis de FSH
circulantes são normais durante o início desta fase. Ao final, os níveis de FSH
aumentam em até dois desvios padrões em relação às mulheres com idades entre 25-30
anos. Este é o primeiro sinal mensurável do envelhecimento reprodutivo, pois os níveis
de estradiol nesta fase podem ser normais ou elevados. 2ª) Nesta fase têm-se dois
períodos, os quais correspondem à transição da menopausa, fase precoce e tardia. A
duração da fase é variável e termina com o último período menstrual. O período
precoce é caracterizado por ciclos regulares, mas há variabilidade na duração do ciclo
(alterações de até 7 dias). As concentrações plasmáticas de FSH continuam a aumentar
e o LH aumenta gradualmente, diminuindo os níveis de estrógeno e progesterona. Os
níveis de cada um desses hormônios são altamente variáveis. 3ª) Os dois estágios finais
são considerados pós-menopausa, precoce e tardia. Fase precoce pode ser subdividida
em: a) os primeiros 12 meses após o período menstrual final, portanto, que dura um
ano, e b) os quatro anos subseqüentes. O período tardio termina com a morte da mulher.
Com base neste sistema de estadiamento, a perimenopausa começa com a segunda fase
e termina 12 meses após o último período menstrual. O período de perimenopausa pode
durar de 2-8 anos, com uma duração mediana de 3,8 anos (BRAMBILLA ET AL,
1994; MCKINLAY, 1996; APGO, 2001).
1.1 - Epidemiologia
A média etária da ocorrência da menopausa natural é de 50 anos de idade, na
maioria da população mundial. No Brasil, Pedro A.O, no ano de 2003 estabeleceu a
idade média da menopausa em 51,2 anos, estudando 456 mulheres com a faixa etária
entre 45-60 anos de idade, na cidade de Campinas. A idade mínima de ocorrência da
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
16
Introdução
menopausa natural foi de 28 anos e a máxima de 58. Aproximadamente 60% do total de
mulheres estavam na pós-menopausa com 51 anos ou menos, durante a pesquisa.
Aproximadamente 5,5% das mulheres apresentaram menopausa precoce (abaixo de 40
anos) e 2% apresentaram menopausa tardia, ou seja, acima de 55 anos (PEDRO ET AL,
2003).
A média etária da menopausa encontrada neste estudo foi semelhante à
registrada em mulheres de países industrializados do Ocidente, que acontece por volta
dos 50 anos de idade (MCKINLAY ET AL., 1996). Em sociedades ocidentais,
McKinlay et al. (1996) relataram uma média etária da menopausa em mulheres da Grã-
Bretanha ao redor dos 50,2 anos. Na Holanda, essa média foi de 51,5 anos (BRAND &
LEHERT, 1978) e nos Estados Unidos, a média alcançou os 51,1 anos (KATO ET AL.,
1998). Benjamin (1960), estudando mil mulheres brancas na África do Sul, observou
que a média etária à menopausa foi ao redor de 46,7 anos. Em Gana, a faixa etária
mediana acontece por volta dos 48 anos (KWAWUKUME ET AL., 1993). Na Tailândia
a média etária de ocorrência da menopausa foi ao redor de 45 anos
(CHOMPOOTWEEP ET AL,1993) e, em um estudo de corte transversal realizado em
sete países do Sudeste Asiático, descobriu-se que essa média acontecia aos 51,1 anos de
idade (BOULET ET AL, 1994). Um estudo populacional recente, realizado nos
Emirados Árabes Unidos, revelou que tal média acontece aos 47,3 anos (RIZK ET AL.,
1998).
O fator mais importante para determinar a idade da ocorrência da menopausa é o
número de folículos ovarianos. A célula germinativa primordial separa-se da célula
somática em um estágio inicial da embriogênese. Entre 1.000-2.000 migram para a
crista gonadal, onde se multiplicam rapidamente, chegando ao máximo de cinco a sete
milhões de folículos ao redor do quinto mês de vida intra-uterina, quando essa
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
17
Introdução
multiplicação se interrompe. A partir de então há uma perda dos folículos primordiais
do ovário fetal até que, ao nascimento, cada ovário contenha cerca de um milhão de
folículos. Esse número continua a diminuir após o nascimento, independentemente de
qualquer ciclo hormonal ou do estado fisiológico da mulher, sendo que apenas 0,01%
são ovulados e os demais degeneram. A depleção dos folículos ovarianos ocorre
independentemente de fatores fisiológicos e ambientais até a fase de perimenopausa. A
fase da perda folicular acelerada e sua velocidade irão determinar a idade de ocorrência
da menopausa. Parece ser a época da menopausa geneticamente “programada” para
cada mulher, mas esta pode ser influenciada por alguns fatores, como a paridade, a
nutrição, a raça e o tabagismo, com precocidade de até três anos (GINSBURG, 1991).
Alguns autores observaram que a paridade está ligada à idade da menopausa.
Mulheres nulíparas têm menopausa mais precocemente, enquanto que o aumento da
paridade correlaciona-se a uma menopausa mais tardia (KATO ET AL., 1998). Outros,
entretanto, não evidenciaram essa associação (MCKINLAY ET AL., 1996). Tal fato
sugere que condições causadoras de longos períodos de anovulação durante a vida
reprodutiva, como a paridade, uso de contraceptivos orais, padrão menstrual irregular
ou mesmo a menarca tardia, podem estar associados a um atraso na menopausa. Chega-
se a essa interpretação devido ao conceito seguinte: a exaustão dos folículos disponíveis
são a causa da menopausa, uma vez que o fator mais importante para determinar a idade
de ocorrência da menopausa é o número de folículos ovarianos (PARAZZINI ET AL.,
1992).
A obesidade, relacionada a um excesso de produção de estrógenos endógenos
tanto na pré como na pós-menopausa, tem sido associada a um padrão menstrual
aberrante e anovulatório. Um estudo evidenciou que mulheres que foram obesas até os
18 anos de idade tinham uma menopausa mais tardia do que aquelas que só
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
18
Introdução
desenvolveram obesidade tardiamente à vida reprodutiva (SHERMAN ET AL, 1981).
Outros, no entanto, mostraram uma associação entre a obesidade e a idade em relação à
menopausa, quando o índice de massa corpórea foi determinado na perimenopausa.
Esses dados sugerem que a obesidade poderia maximizar o período da vida reprodutiva,
como foi observado neste estudo, porém sem significância estatística, além de um
período mais prolongado de vida reprodutiva e um total de ciclos menstruais em maior
número (KATO ET AL., 1998). Percebeu-se também que o ambiente estrogênico das
mulheres obesas pode ser mais intenso que das magras, devido a uma maior conversão
da androstenediona em estrona e uma maior concentração de estrógeno livre, pela
diminuição do nível da globulina carreadora de hormônios sexuais (SHBG), que
geralmente acompanha a obesidade (KATO ET AL., 1998).
O hábito de fumar tem se mostrado associado a uma idade mais adiantada na
menopausa. A redução média de idade inicial da menopausa em fumantes está entre os
1,5-2,0 anos (MCKINLAY SM, 1996).
1.2 - Sintomatologia
Durante a menopausa, a sintomatologia caracteriza-se pela queda dos níveis dos
hormônios sexuais alterando a consistência do revestimento da vagina, da uretra e das
fibras do tecido conjuntivo que conferem sustentação à mucosa dessas regiões. Isso
geralmente ocorre quando as mulheres estão na perimenopausa, ou seja, período em
que ocorre encurtamento da fase folicular com alterações menstruais (frequência e
duração irregulares, hipermenorréia, oligomenorréia, anovulação), alterações
vasomotoras (suores noturnos, fogachos e distúrbios do sono), distúrbio
psicológico/cognitivo (agravamento dos sintomas pré-menstrual, depressão,
irritabilidade, baixa concentração e esquecimento), distúrbios sexuais (diminuição da
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
19
Introdução
lubrificação vaginal, diminuição da libido, dispareunia, vaginismo), sintomas somáticos
(dores de cabeça, tonturas, palpitações e dores no peito), aumento da incidência de
miomas uterinos e progressão dos sintomas de endometriose. Com a progressão do
climatério, há uma crescente irregularidade do ciclo menstrual devido à anovulação e
distúrbios da fase lútea. O período intermenstrual se torna mais longo, resultando em
um aumento da incidência de padrões anormais de sangramento uterino. Estas
irregularidades do ciclo menstrual, durante o climatério, são quase uma imagem em
espelho das irregularidades menstruais do início da menarca (SHERMAN ET AL, 1976;
MCKINLAY, 1996; PARK ET AL,2000; SOWERS ET AL, 2008).
A sintomatologia associada à menopausa se desenvolve dentro de parâmetros
sociais, econômicos, culturais e étnicos muito distintos, e até mesmo os fogachos, um
dos sintomas mais característicos da menopausa, variam de uma cultura para outra.
Oitenta e cinco por cento das mulheres européias e norte-americanas experimentam
ondas de calor, o mesmo só acontecendo com 17% das japonesas e com cerca de 5%
das Maias da América Central (UTIAN, 1999).
Os sintomas relacionados à menopausa também estão intimamente relacionados
à maneira como as diferentes culturas encaram o processo de envelhecimento; na
sociedade americana, por exemplo, há a tendência de focalizar os aspectos negativos no
processo, ou seja, doença, envelhecimento, perda do status social. Já em alguns países
em desenvolvimento enfatizam-se os aspectos positivos da mulher nesta fase, como
libertação da responsabilidade de ter filhos e das restrições sociais e culturais que são
impostas sobre as mais jovens que ainda menstruam (OMS, 1996).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
20
Introdução
1.3 – FISIOLOGIA DO EIXO HIPOTÁLAMO-HIPÓFISE-GONADAL (HHG)
NA MULHER
1.3.1 - Hormônio Liberador de Gonadotrofina - GnRH
O GnRH é um decapeptídeo linear que estimula tanto o LH quanto o FSH, sem
efeito sobre os outros hormônios hipofisários (LECHAN, 1987). Os neurônios
secretores de GnRH estão localizados basicamente na área pré-óptica do hipotálamo
anterior e suas terminações nervosas são encontradas nas porções laterais da camada
externa, na eminência mediana adjacente ao pedículo hipofisário (MOLITCH, 1995;
STANISLAUS ET AL, 1998).
A secreção hipotalâmica do GnRH pode atingir a hipófise através de duas vias:
direta e indireta. A via direta é representada pelo trato hipotálamo-hipofisário que faz a
comunicação entre o hipotálamo e a hipófise. A via indireta pode ocorrer de dois
modos: 1) através do sistema porta-hipofisário, onde os axônios dos núcleos
hipotalâmicos, que terminam nas paredes dos capilares deste sistema, liberam sua
secreção que atinge então as células da adenohipófise; 2) através de alguns neurônios
especiais denominados tanícitos, que seriam responsáveis pelo transporte da
neurossecreção para outros neurônios ou, ainda, para o sistema porta-hipofisário
(SCHWANZEL-FUKUDA & PFAFF, 1989).
A secreção do GnRH acontece de maneira episódica ou pulsátil, característica
essencial para liberação dos hormônios gonadotróficos (SHUPNIK, 1990; VELDHUIS,
1994; MOLITCH, 1995; STANISLAUS ET AL, 1998).
O controle intrínseco da secreção de GnRH é exercido por um gerador de pulsos
hipotalâmicos no núcleo arqueado (REICHLIN, 1998). Este gerador de pulsos induz à
ativação sincrônica de elementos neuronais no hipotálamo médio-basal que possuem
propriedades eletrofisiológicas únicas, levando à liberação do GnRH na circulação
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
21
Introdução
porta-hipofisária (KNOBIL, 1989). Os pulsos horários de GnRH estimulam os
gonadotrofos a secretar pulsos de LH e FSH, havendo um sincronismo entre a secreção
de GnRH e LH (CROWLEY ET AL., 1985; KNOBIL, 1989; GRUMBACH, 2002). Os
neurônios secretores de GnRH são sensíveis ao controle por retrorregulação dos
esteroides gonadais e inibina (produto das células gonadais), modulando a frequência e
amplitude da secreção de gonadotrofina durante o desenvolvimento sexual e a
progressão do ciclo menstrual nas mulheres (KNOBIL, 1992; REICHLIN, 1998;
KLEIN ET AL, 2004).
Todos os esteroides gonadais, tais como estrogênios, progestogênios e androgênios,
ligam-se a receptores hipofisários, influenciando a secreção de gonadotrofinas
(MCEWEN ET AL., 1982). Em indivíduos normais, a secreção de LH e FSH é
suprimida por doses altas e contínuas de estrogênios e androgênios, sendo estimulada
pela administração de drogas anti-estrogênicas e anti-androgênicas. Devido a estas
evidências, definiu-se o controle do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas como mediado
pelos esteroides gonadais (MCEWEN ET AL., 1982; MACCANN ET AL., 1983;).
A retrorregulação dos homônios esteroides gonadais, em nível hipotalâmico e,
possivelmente também, hipofisário, é determinada pelas monoaminas hipotalâmicas.
Assim, os neurônios hipotalâmicos dopaminérgicos provocam, de maneira geral,
inibição da liberação de GnRH, com redução da frequência do gerador de pulsos
enquanto os noradrenérgicos estimulam a secreção de GnRH (REICHLIN, 1998).
Os neurônios secretores do GnRH possuem pulsatilidade intrínseca individual, que
pode ser a base do padrão de secreção de GnRH (BAUER-DANTOIN ET AL., 1995).
Estas células recebem sinais neurais inibitórios induzidos pelo stress e por alguns
hormônios, como o corticotropin releasing hormone (CRH), vasopressina e citocinas
inflamatórias (REICHLIN, 1998). Finalmente, os opióides endógenos, em particular a
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
22
Introdução
β-endorfina, modulam a atividade do “gerador de pulsos” de GnRH, reduzindo a
frequência de pulsos do LH e, em grau menos intenso, inibindo a liberação do FSH
(REICHLIN, 1998; GRUMBACH, 2002)
No feto, ocorre aumento do GnRH, durante a primeira metade da gestação, com
liberação de gonadotrofinas, seguido por fatores que inibem sua liberação (esteroides e
inibina), no final da gestação (CROWLEY ET AL., 1985; REICHLIN, 1998;
GRUMBACH, 2002).
Ao nascimento, as concentrações séricas de gonadotrofinas estão suprimidas, mas
com a depuração (clearence) pós-natal de altas concentrações circulantes de
estrogênios, a inibição é reduzida, ocorrendo picos de GnRH (REICHLIN, 1998). O
aumento das gonadotrofinas perdura por vários meses, após o nascimento, sendo
equivalente ao aumento encontrado no período puberal. Em seguida, ocorre diminuição
do GnRH, que atinge concentrações mínimas na infância, entre dois e cinco anos
(MARSHAL ET AL., 1983). Embora neste período a secreção de GnRH esteja baixa,
ensaios sensíveis indicam que ocorre secreção pulsátil, em ritmo circadiano. No início
da puberdade, estes pulsos aumentam mais em amplitude que em frequência
(CROWLEY ET AL., 1985; GRUMBACH, 2002).
Normalmente, o início da puberdade é caracterizado pelo aparecimento de picos
noturnos de gonadotrofinas, dependentes da secreção episódica de GnRH hipotalâmico,
em ambos os sexos. À medida que a puberdade progride, estes picos tornam-se também
freqüentes durante o dia (REICHLIN, 1998; GRUMBACH, 2002). Neste período,
ocorre predomínio da secreção do LH, em relação ao FSH, contrariamente ao que
ocorre no período pré-púbere, em que a secreção preferencial é de FSH (GRUMBACH,
2002).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
23
Introdução
Na mulher, o padrão dos pulsos de GnRH modifica-se no decorrer do ciclo
menstrual. As variações episódicas das concentrações de FSH e LH sugerem influência
dos esteroides ovarianos (frequência e amplitude), na liberação de gonadotrofinas pela
hipófise (APTER ET AL., 1993). Na fase folicular, a frequência dos pulsos de LH e
FSH ocorre a cada 45 minutos, até atingir máxima amplitude na fase ovulatória,
culminando em acentuada elevação das concentrações de LH e FSH. Embora os picos
de LH e FSH, no período ovulatório, sejam coincidentes, os mesmos apresentam
intensidades diferentes, sendo que o LH chega a aumentar cerca de quatro vezes mais
que o FSH (TAYLOR ET AL., 1995). Na fase luteínica, há predomínio da concentração
de FSH e diminuição da frequência dos pulsos de GnRH. Isto se deve ao aumento da
concentração sérica de E
2
e progestágenos (KASTIN ET AL., 1972; APTER ET AL.,
1993).
Em geral, o ciclo menstrual, que dura entre 21-35 dias, resulta no desenvolvimento
e na liberação de um óvulo maduro para a fertilização. Durante a fase folicular do ciclo
menstrual, o hormônio folículo estimulante (FSH) estimula a diferenciação e
proliferação das células da granulosa em folículos ovarianos de cerca de 1 a 50 milhões
de células. Este acentuado aumento no número de células ocorre graças à transcrição de
genes FSH estimulada, os quais codificam fatores de crescimento como, por exemplo, o
de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), que funciona tanto em ação parácrina
quanto autócrina (ADASHI ET AL,1985). Como as células da granulosa secretam o
estrógeno e a progesterona, os folículos menos maduros FSH dependente se tornam
atrésicos. O folículo dominante, que é marcado pelo início da fase dos folicular, secreta
quantidades crescentes de estrogênio, que exercem um feedback negativo na secreção
de LH e FSH. Assim, os níveis de estrogênio diminuem na fase folicular precoce até o
início da fase lútea..
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24
Introdução
O feedback negativo do estrogênio sobre a secreção de gonadotrofinas foi
demonstrado pela diminuição rápida das concentrações séricas de gonadotrofinas em
resposta ao estrogênio exógeno em macacas ooforectomizadas . Tal efeito não pôde ser
demonstrado com a administração de progesterona durante a fase folicular (KNOBIL,
1974). Portanto, concluiu-se que o E
2
era um importante regulador do ovário de
secreção de gonadotrofinas em macacos rhesus. Estudos em humanos têm confirmado
que a secreção de gonadotrofinas é igualmente regulamentada (BLEIER, 1984;
KNOBIL, 1992; O’BYRNE ET AL, 1993; KREY ET AL, 1995).
As concentrações de GnRH e, consequentemente, FSH, LH, estrogênios e
androgênios, sofrem alterações em seus níveis circulantes vários anos antes da
menopausa, e o fazem durante o período dos ciclos ovulatórios normais. Desta maneira,
os ovários tornam-se menos responsivos às gonadotrofinas antes de cessarem as
menstruações, podendo ser o evento desencadeante da menopausa. A decadência da
atividade folicular e seu esgotamento são os eventos-chaves das alterações ocorridas no
período perimenopausa. O decréscimo na produção de E
2
pelos ovários elimina o
feedback negativo dos estrogênios no sistema hipotálo-hipófise. Isto pode resultar num
gradual aumento de gonadotrofinas com o FSH elevando-se precocemente a níveis mais
altos que os de LH
(Figura 2) (
METCALF ET AL, 1981; WIDE & HOBSON, 1983;
RANCE & USWANDI, 1996; MATT ET AL, 1998). (Figura 2)
Um aumento acentuado dos neurônios ocorre no núcleo infundibular do hipotálamo
de mulheres na pós-menopausa (SHEEHAN ET AL, 1996; RANCE ET AL, 1990,
1991; ABEL ET AL, 2000). Essa hipertrofia celular é caracterizada pelo aumento da
substância de Nissl (indicativo de aumento da síntese protéica), núcleos volumosos e
nucléolos, sugerindo aumento na atividade neuronal (ABEL ET AL, 2000).
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25
Introdução
Figura 2: Padrão de secreção de gonadotrofinas, durante diferentes estágios da vida da mulher.
Os padrões secretores de LH durante o dia (área mais clara) e à noite (área mais escura).
De acordo com C Faiman ET AL: Clin Obstet Gynaecol. 3:467, 1976)
A hipertrofia neuronal não parece ser uma resposta compensatória à degeneração
celular, pois não há perda de células, nem sinais de um processo patológico no núcleo
infundibular das mulheres mais velhas (RANCE ET AL,1990; ABEL ET AL, 2000).
Estudos de hibridação histoquímica demonstraram que os neurônios hipertrofiado
expressam mRNA de receptores de estrógeno (ER) e neurocinina B (NKB) e que a
menopausa está associada a um grande aumento na expressão genética da NKB
(RANCE ET AL,1990; ABEL ET AL, 2000). Notavelmente, ooforectomia de jovens
macacos cynomolgus produzem alterações idênticas (SANDOVAL ET AL, 2004),
fornecendo forte evidência de que a hipertrofia e aumento da expressão do gene NKB
em mulheres na pós-menopausa é secundária à insuficiência ovariana da menopausa.
Devido à ocorrência de uma subpopulação de neurônios hipertróficos expressando
mRNA ER – concomitantemente à retirada de estrógeno e hipersecreção de
gonadotrofinas -, sugeriu-se que essa hipertrofia neuronal acaba regulando o feedback
negativo dos estrogênios (RANCE ET AL, 1990). Em 2003, dois estudos demonstraram
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26
Padrões de secreção do LH e FSH Dia e Noite
Infância Puberdade Menacme Menopausa
FSH LH
1
o
2
o
3
o
Nascimento Infancia 10 a 14 anos menacme Menopausa
Vida Fetal
Introdução
que mutações na proteína G, acoplada ao receptor 54 (GPR54), resultam em
hipogonadismo hipogonadotrófico, uma condição de imaturidade reprodutiva
secundária à baixa secreção de gonadotrofina (DE ROUX ET AL, 2003; SEMINARA
ET AL, 2003). Estes estudos demonstraram que as kisspeptinas, ligantes peptídicos
endógenos do GPR54, desempenham um papel importante na regulação da secreção de
LH no início da puberdade (DUNGAN ET AL, 2006). Kisspeptinas são estimuladores
potentes da secreção de LH em camundongos, ratos, macacos, ovelhas e homens e,
portanto, seus efeitos são bastante conservados entre as espécies de mamíferos
(DUNGAN ET AL, 2006; SEMINARA, 2005). A administração exógena de kisspeptina
ativa os neurônios GnRH (HAN ET AL, 2005) e estimula a secreção de GnRH
(MESSAGER ET AL, 2005). Neurônios GnRH expressam GPR54 mRNA (HAN ET
AL, 2005; MESSAGER ET AL, 2005; IRWIG ET AL, 2004). Em conjunto, estes dados
sugerem que as kisspeptinas atuam diretamente sobre os neurônios GnRH através de
GPR54 para estimular a liberação de gonadotrofinas. Em roedores e ovinos, os
neurônios kisspeptina expressam ER (SMITH ET AL, 2005; FRANCESCHINI ET AL,
2006).A expressão do gene kisspeptina e (KiSS-1) está aumentada no núcleo arqueado,
em resposta à ooforectomia (KINOSHITA ET AL, 2005; SMITH ET AL, 2005; ROA
ET AL, 2006; SMITH ET AL, 2007). Com base nestes dados, podemos supor que a
transcrição gênica do KiSS-1, localizada nos neurônios hipertrofiados em mulheres pós-
menopausa, e o m RNA do KiSS-1 estariam aumentados na insuficiência ovariana da
menopausa. Rometo e Rance, mapearam a distribuição de neurônios que expressam
mRNA KiSS-1 nos neurônios infundibulares hipertrofiados, demonstrando a associação
da menopausa com mudanças na expressão do KiSS-1, o que serve de evidência à
hipótese de que esses neurônios estão envolvidos na regulação do feedback negativo do
estrógeno no ser humano (ROMETO & RANCE, 2008) .
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
27
Introdução
1.3.2 - Hormônio Luteinizante (LH) e Hormônio Folículo-Estimulante (FSH)
O LH e o FSH são gonadotrofinas glicoprotéicas compostas de duas subunidades
alfa e beta. A subunidade beta é específica a cada hormônio, sendo responsável por suas
atividades biológicas (PIERCE & PARSONS, 1981; RYAN ET AL., 1987). As
subunidades são sintetizadas como peptídeos separados a partir de RNA mensageiros
(RNAm) distintos (WIDE & ROBSON, 1983; RYAN ET AL., 1987). São secretadas
por células gonadotróficas da adenohipófise, sendo estas basófilas e localizadas,
profundamente, nas porções laterais da glândula (THORNER ET AL., 1992).
O termo hormônio glicoprotéico tem sido usualmente aplicado ao LH, FSH,
gonadotrofina coriônica (hCG) e ao hormônio tireoestimulante (TSH) (LECHAN, 1987;
THORNER, 1992). A subunidade α do LH pesa, aproximadamente, 20 a 22Kd, sendo
constituída na espécie humana de 92 aminoácidos. O gene que codifica a subunidade α
está localizado no cromossomo 6q21.1-23 e o que codifica a subunidade beta está
localizado no cromossomo 19q13.32, próximo aos genes que codificam a subunidade β
do hCG. O gene que codifica a subunidade β do FSH está localizado no cromossomo
11p13 (RYAN ET AL., 1987).
1.3 3 - ESTEROIDES
Na mulher, os principais esteroides são o estrogênio, a progesterona e os
androgênios, os quais são classificados com base na estrutura e função biológica
(GORE-LANGTON & ARMSTRONG, 1994).
O mais potente estrogênio liberado pelo ovário é o 17 β estradiol (E
2
). O E
2
é
secretado pelas células da granulosa ovariana, em mais de 90%. O restante é gerado pela
conversão periférica dos androgênios (DUCHARM ET AL., 1976). A estrona também é
secretada pelo ovário, porém, a sua maior fonte provém da conversão da
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28
Introdução
androstenediona em tecidos periféricos (SITTERI & MACDONALD, 1973). O estriol é
o estrogênio mais abundante na urina e deriva do metabolismo da estrona e do E
2
(GORE-LANGTON & ARMSTRONG, 1994).
Durante o início da fase folicular, os níveis de E
2
são baixos. Estes baixos níveis de
estrógenos inibem a secreção de LH (feedback negativo). Ao final da fase folicular, as
concentrações de estrogênio estão notavelmente mais elevadas e isso se configura como
resultado da produção de estrogênio pelas células da granulosa. Em uma comparação da
relação do pico de estrogênio para o pico de LH, os picos de estrogênio ocorrem até um
dia antes do pico de LH e se mantêm elevadas (MARSHALL ET AL, 1983; BURGER,
1999).
Os principais progestágenos são a pregnenolona, progesterona e 17-
hidroxiprogesterona (17OHP). A pregnenolona é de importância primária para o ovário,
pois é o precursor de todos os hormônios esteroides. A progesterona é o principal
produto secretado pelo corpo lúteo (GORE-LANGTON & ARMSTRONG, 1994).
Os ovários secretam vários androgênios, incluindo a androstenediona,
diidroepiandrostenediona (DHEA), testosterona e DHT. Estes são produzidos e
secretados pelas células da teca e, em menor proporção, pelo estroma ovariano
(GOLDFIEN & MONROE, 1997). A androstenediona alcança as células da granulosa
por difusão, sendo convertida em estrona pela enzima P-450 aromatase e esta, por meio
de hidroxilação, converte-se em E
2
(GOLDFIEN & MONROE, 1997).
O E
2
circula no sangue, preferencialmente, ligado a uma proteína transportadora,
conhecida pela sigla SHBG (sex hormone binding globulin) ( BURGER,1999).
Alguns estudos sugerem que a ligação do androgênio ao receptor ocorre apenas no
núcleo e não no citoplasma. No núcleo, o complexo androgênio-receptor liga-se ao
DNA, por meio do seu domínio de ligação, resultando no início da atividade de
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
29
Introdução
transcrição e síntese de RNA mensageiro (RNAm) o qual, finalmente, é transportado
para o citoplasma, onde orienta a síntese de novas proteínas responsáveis pelos efeitos
androgênicos (GOLDFIEN & MONROE, 1997).
O aparecimento dos pelos pubianos e axilares sofre influência dos androgênios,
tanto no homem quanto na mulher, havendo um aumento na atividade das glândulas
sebáceas. Na mulher, os efeitos biológicos do E
2
são mediados por receptores
hormonais específicos existentes no núcleo das células-alvo. A ligação do E
2
com o
receptor leva à formação de RNAm específico (DOODY ET AL., 1990).
A ação estrogênica é necessária para a maturação do sistema reprodutivo feminino,
bem como as características sexuais secundárias (GOLDFIEN & MONROE., 1997).
Os estrogênios, por sua vez, produzem vários efeitos metabólicos importantes. No
metabolismo ósseo, atuam reduzindo a velocidade de reabsorção óssea, antagonizando a
ação do paratormônio, além de promoverem coagulabilidade do sangue. Também
aumentam os níveis de plasminogênio e reduzem a adesividade plaquetária. No
metabolismo lipídico, os estrogênios aumentam a síntese de triglicérides, assim como o
HDL-colesterol (GOLDFIEN & MONROE, 1997).
No feto e recém-nascido a termo, a concentração plasmática dos estrogênios é alta,
devido à conversão placentária dos androgênios fetais e maternos. Após o nascimento,
ocorre queda rápida destes níveis (BURGER, 1999). Posteriormente, há aumento da
concentração plasmática de E
2
, que acompanha os estádios púberes, até a maturidade,
culminando com o ciclo menstrual. Em todo o ciclo menstrual, o E
2
encontra-se em
níveis baixos, na fase folicular, aumentando rapidamente durante o período ovulatório,
atingindo pico máximo, enquanto durar a ovulação, e voltando a cair novamente na fase
luteínica (BURGER,1999)
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
30
Introdução
Durante o climatério, os níveis de gonadotrofinas começam a aumentar vários anos
antes de cessar a ovulação. A produção do estrogênio e progesterona diminui; as células
do estroma ovariano respondem a um aumento da estimulação com LH, produzindo
mais androstenediona, porém apenas em mínimas quantidades de estrogênios. A taxa de
produção média de E
2
cai de 0,05 ng/mL durante as primeiras 24hs, para 0,013 ng/mL.
A taxa de filtração também permanece reduzida (HOFF ET AL., 1983; HALE ET AL.
2009).
O controle da secreção dos esteroides gonadais é exercido pelo eixo hipotálamo-
hipófise-gônadas. No hipotálamo, a liberação do GnRH ocorre em pulsos a cada 90-120
minutos, com liberação do LH e, em menor extensão, do FSH para a circulação geral. O
LH é captado pelas células da teca, onde se liga a receptores específicos de membrana.
O receptor do LH é um receptor acoplado à proteína G, contendo sete domínios
transmembrana com uma região citoplasmática rica em serina e treonina, que contém
um sítio de fosforilação e um domínio de ligação hormonal extracelular. A ligação de
LH ao receptor leva à ativação da adenil ciclase e à geração de adenosina monofosfato
cíclico (AMPc), além de outros mensageiros que resultam na secreção dos androgênios.
Por sua vez, a elevação dos androgênios inibe a secreção de LH pela hipófise anterior,
através de uma ação direta sobre a hipófise, além de levar a um efeito inibidor em nível
hipotalâmico. Tanto o hipotálamo quanto a hipófise possuem receptores para o
androgênio e estrogênio. Entretanto, o principal efeito inibitório do androgênio sobre o
hipotálamo parece ser mediado principalmente pelo E
2
, que pode ser derivado
localmente através da aromatização da testosterona (KORENMAN & SHERMAN,
1973; LIPSETT, 1986; KESNER ET AL, 1987).
Os receptores para o FSH encontram-se nas células da granulosa. O FSH ainda
estimula diretamente a secreção de inibina que, por sua vez, é um regulador fisiológico
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
31
Introdução
da secreção hipofisária de FSH, possivelmente, junto com os esteroides gonadais
(BURGER ET AL., 2000; KLEIN ET AL, 2004). Os níveis de inibina diminuem com o
avançar da idade, até atingir um mínimo durante a menopausa (SHERINS ET AL.,
1982; LIPSETT, 1986;HALE ET AL, 2009).
Após a menopausa, há mudanças no eixo neuroendócrino (HALL ET AL, 2004).
Entretanto com a falência total dos ovários, muitos aspectos da função hipotalâmica
permanecem preservados. Os efeitos do feedback negativo do estrogênio, da
progesterona em pulsos de gonadotrofinas e secreção de GnRH são mantidos em
mulheres idosas (GILL ET AL, 2002). Além disso, a quantidade de secreção de GnRH
aumenta-se (GILL ET AL, 2002), dado consistente com a expressão elevada do gene
GnRH, observada no hipotálamo basal medial nesta fase (RANCE ET AL, 1994; 1996).
Estes dados fornecem evidências de que o eixo neuroendócrino em mulheres
menopausadas responde à perda do feedback negativo esteróide com o aumento da
secreção de GnRH pelo hipotálamo. Os estudos em macacos cynomolgus, demonstram
a hipertrofia e o aumento da expressão do gen KiSS-1, o que serve como modelo para
mulheres na pós-menopausa e também parece refletir uma resposta compensatória à
perda de esteroides ovarianos. Devido aos efeitos estimulantes da secreção de GnRH
sobre kisspeptina e o papel essencial do GPR54 na regulação da reprodução, os
neurônios kisspeptina no núcleo infundibular são candidatos principais para mediar o
feedback negativo do estrogênio no ser humano. Estudos sugerem que os neurônios
kisspeptina do hipotálamo desempenham um papel importante na elevação da secreção
de gonadotrofinas, que ocorre em resposta à insuficiência ovariana na menopausa
(ROMETO & RANCE, 2008).
Na menopausa, além da hipersecreção de gonadotrofinas, hipertrofia dos neurônios
que expressam neurocinina B (NKB), kisspeptina (KISS) -1 e o receptor de estrogenio
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32
Introdução
(ER), no núcleo arqueado de animais experimentais, a dinorfina, um peptídeo opióide,
também é secretado juntamente com o NKB, kisspeptin, ER e progesterona. Além
disso, a oooforectomia reduz a expressão da transcrição do gene prodinorfina no núcleo
arqueado de ovelhas. Portanto, a hipótese é que os neurônios hipertrofiados no núcleo
infundibular das mulheres na pós-menopausa expressem menor quantidade de mRNA
da prodinorfina. Neurônios expressando mRNA dinorfina no núcleo infundibular das
mulheres na pós-menopausa foram menores que os observados na mulher pré-
menopausa. Estudos anteriores, usando modelos animais fornecem fortes provas de que
as mudanças na expressão gênica neuronal de prodinorfina em mulheres pós-
menopausadas são secundárias à insuficiência ovariana da menopausa. Dado o efeito
inibitório da dinorfina no eixo reprodutivo, a diminuição da expressão do gene dinorfina
poderia desempenhar um papel importante na elevação da secreção do hormônio
luteinizante, que ocorre em mulheres pós-menopausadas (HAMERNIK, 1986;
ROMETO & RANCE, 2008).
1.4 - AVALIAÇÃO DO EIXO HIPOTALÂMO-HIPÓFISE-GONADAL
A avaliação da função gonadal consiste na história, exame físico, determinação das
gonadotrofinas, dosagem dos esteroides e, quando necessário, testes dinâmicos e biópsia
(AUGUST ET AL., 1972).
Em algumas condições clínicas, como no hipogonadismo, as dosagens de LH, FSH,
E
2,
podem indicar se o problema é central (concentrações de LH e FSH reduzidas ou
inadequadamente normais frente a concentrações baixas de E
2
) ou se o problema é na
glândula-alvo, quando as concentrações de LH e FSH estão elevadas e os esteroides
reduzidos, que acontece na menopausa (BURGER ET AL, 1994)
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
33
Introdução
A avaliação simplificada do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal consiste na dosagem
sérica dos hormônios LH, FSH, E
2
(REYES-FUENTES & VELDUIS, 1993; SOUTH
ET AL., 1993). Estas dosagens testam a capacidade do hormônio hipofisário quanto a
estimular a glândula-alvo e desta em responder e controlar, por mecanismos de
retroalimentação, a concentração do hormônio trófico (LEE & RYAN, 1973).
A determinação de LH, FSH e esteroides gonadais é suficiente para o diagnóstico
da menopausa. O LH e FSH podem se encontrar aumentados e os esteroides reduzidos
(GIWERCMAN ET AL., 1993; OLIVEIRA ET AL., 1996). Em alguns casos, com
suspeita de menopausa precoce ou alguma outra falência ovariana primária com LH e
FSH ainda normais ou discretamente aumentados, faz-se necessário avaliar o eixo
hipotálamo-hipófise-gonadal por meio do teste de estímulo com o GnRH, em que uma
hiper-resposta do LH e, principalmente do FSH, sela o diagnóstico (KASTIN ET AL.,
1972; ROTH ET AL., 1972; LEE & RYAN, 1973).
1.4.1 - Estrutura e ação do GnRH sintético
O GnRH sintético utilizado nestes testes é um decapeptídeo que possui a seguinte
estrutura química: 5 – oxo – L – prolil – L – histidil – L triptofanil – L – Seril – L –
tirosil – glicil – L – Leuc – L – arginil – L – prolil – glicinamida (LIBONATI ET AL.,
1986).
O GnRH sintético age estimulando a síntese da secreção de gonadotrofinas por
meio da interação com o próprio receptor, acoplado à proteína G na membrana
plasmática dos gonadotrofos hipofisários. Esta interação receptor-proteína G ativa a
mobilização do cálcio intracelular e, também, a fosfolipase C, acumulando o inositol –
1, 4, 5 – Trifosfato (IP30) e o 1.2 diacilglicerol (DAG). O acúmulo de cálcio ativa a
calmodulina, a qual parece exercer um papel de moduladora na liberação de
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
34
Introdução
gonadotrofinas (CONN ET AL., 1983; CONN & CROWLEY, 1991; HAWES ET
AL.,1992; 1993) O cálcio, em combinação com a DAG, ativa a proteína cinase C que,
por sua vez e juntamente com a calmodulina, estimulam a expressão do gene da
subunidade β do LH e FSH e, posteriormente, liberação das gonadotrofinas
(HANDELSMAN & SWERDLOFF, 1986; LIBONATI ET AL., 1986; CONN &
CROWLEY, 1991; THORNER ET AL., 1992; HAWES & CONN,1993; ULLOA-
AGUIRRE ET AL., 1999; BLUM ET AL., 2000).
1.4.2 - Teste de estímulo com o GnRH
O teste do GnRH agudo, utilizado na prática clínica, consiste na administração de
uma dose de 100µg de GnRH endovenoso, resultando em resposta rápida das
gonatrofinas hipofisárias. Após a administração do GnRH, no teste convencional, dosa-
se o FSH e LH nos tempos 0, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos, com o paciente em
repouso, na posição supina (LIBONATI ET AL., 1986; PERCOVITZ ET AL., 1988;
CAVALLO ET AL., 1995; NEELY ET AL., 1995; BRITO ET AL., 1998; BORGES
ET AL, 1998, RESENDE ET AL, 2007).
Na prática clínica, o teste do GnRH é utilizado em diversas situações, citadas a
seguir:
1- Avaliar a baixa reserva hipofisária de LH e FSH nas seguintes situações: a)
presença de tumores hipofisários secretores e não secretores; b) na insuficiência
hipofisária (Síndrome de Sheehan, hipofisite autoimune, síndrome da sela vazia,
panhipopituitarismo idiopático); e c) na insuficiência isolada de hormônio (Síndrome de
Kalman). A ausência de resposta hipofisária confirma o diagnóstico laboratorial de
hipogonadismo hipogonadotrófico (ROTH ET AL., 1972; BELL ET AL., 1973;
SANTORO ET AL., 1976; VALK ET AL., 1980; WU ET AL., 1991).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
35
Introdução
2- Estabelecer a diferença entre deficiência hormonal hipofisária, hipotalâmica e
deficiência hormonal secundária (SANTORO ET AL., 1976; VALK ET AL., 1980; WU
ET AL., 1991).
3- Avaliar a função normal do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas e sua maturidade:
a) diferenciar crianças normais de crianças com puberdade precoce de causa central; b)
diferenciar telarca precoce de pubarca precoce e de puberdade precoce; c) diferenciar
crianças normais de crianças com puberdade atrasada. Nesses casos, as dosagens basais
de LH e FSH não são suficientes para distinguir a maturidade do eixo (KASTIN ET
AL., 1972; MORTIMER ET AL., 1973; PESCOVITZ ET AL., 1988; APTER ET AL.,
1989; WHEELER & STYNE, 1990; GARIBALD ET AL., 1991; CAVALLO ET AL.,
1995; ALBANO, 1996; BRITO ET AL., 1998; BORGES ET AL., 1998; DAMIANI,
2002, RESENDE ET AL, 2007).
4- Avaliar a hipersecreção das gonadotrofinas na menopausa precoce e no
diagnóstico das disgenesias gonadais (KASTIN ET AL., 1972; LEE & RYAN, 1973).
5- Diagnóstico precoce do climatério e de mulheres histerectomizadas.
1.5 - MÉTODOS DE DOSAGENS HORMONAIS
Com o advento de novos métodos, surgiu a necessidade de se estabelecer valores de
referência das dosagens basais e estimuladas do LH e FSH, para utilização nas situações
clínicas pertinentes (APTER ET AL., 1989; TAYLOR ET AL., 1995; NEELY ET AL.,
1995; ROJANASAKUL ET AL., 1994; OLIVEIRA ET AL., 1996).
As dosagens hormonais, como citadas anteriormente, apresentaram grande avanço a
partir de 1959 com o desenvolvimento do RIE (YALOW & BERSON, 1959).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
36
Introdução
1.5.1 - Radioimunoensaio
A técnica de RIE baseia-se no princípio da inibição competitiva da ligação ao
anticorpo entre hormônio (antígeno) marcado com radioisótopo (I
125
) e hormônio não
marcado, contido em padrões ou amostras desconhecidas, formando complexos
antígeno-anticorpo e antígeno marcado-anticorpo. É uma reação reversível, onde se
aplica a lei das massas, ou seja, quanto mais antígeno marcado ligado ao anticorpo,
menor a concentração de antígeno no soro (BERSON & YALOW, 1968a; 1968b).
As quantidades de antígeno marcado e do anticorpo são mantidas constantes,
construindo-se curvas de calibração e adicionando-se concentrações variáveis e
conhecidas de antígeno padrão ao sistema de incubação. Nesse sistema, a proporção de
complexo radioativo formado (Ag*-Ac) é inversamente proporcional à quantidade de
antígeno não marcado. A detecção do antígeno marcado faz-se por meio de um contador
gama (YALOW & BERSON, 1959; 1966; BERSON & YALOW, 1968a; 1968b;
MILES & HALES, 1968; ODELL ET AL., 1966).
Tal técnica foi dominante por mais de duas décadas, sempre melhorando a
tecnologia, durante este período, seja na preparação e purificação de anticorpos, seja na
marcação de antígenos e técnicas de separação (WIDE ET AL., 1967;
ABRAHAM,1974, WIDE, 1969; 1971; GOLDSMITH, 1975).
Com a evolução da metodologia, surgiram novas técnicas de imunoensaios como o
imunorradiométrico (IRME), desenvolvido por Miles & Hales em 1968; o
enzimaimunoensaio (EIE), desenvolvido por Avrameas em 1970 e por Engvall &
Perlmann em 1971 e 1972; o imunofluorimétrico (IFME), desenvolvido por HALONEN
ET AL., em 1973 e a quimioluminescência (ICMA), desenvolvida por WHITEHEAD
ET AL., em 1979. A diferença entre esses métodos deve-se à variação da substância
utilizada como marcador. A evolução dos ensaios foi propiciada pelo aperfeiçoamento
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
37
Introdução
dos reagentes, ou seja, a utilização de anticorpos de maior afinidade, sensibilidade e
especificidade (MILES & HALES, 1968; AVRAMEAS,1970, 1976; WHITEHEAD ET
AL, 1979).
Compreende-se por sensibilidade de um método, a menor concentração do
hormônio, detectada com precisão, apresentando reprodutibilidade de resultados. A
especificidade da dosagem hormonal reflete a capacidade do método em medir somente
o composto, em particular, que se propõe dosar em uma amostra, sem sofrer
interferência de outro material correlato, também, presente na amostra (BANGHAM,
1983).
1.5 2 - Ensaio Imunorradiométrico
O método IRME foi desenvolvido por Miles e Hales em 1968 e difere-se do RIE
tradicional em alguns aspectos. Nele, o reagente “marcado” não é o antígeno (aquele
que se quer medir), mas o anticorpo. Os anticorpos são adicionados em excesso, de
maneira que todo o antígeno seja ligado pelo anticorpo marcado com radioisótopo. Por
essa razão se torna um método não competitivo. A separação do anticorpo marcado,
ligado ao antígeno, e do anticorpo livre, é feita com um segundo anticorpo contra o
antígeno em estudo; portanto, não marcado. Este ensaio é conhecido como técnica de
“sanduíche”, ou ensaios imunométricos de dois sítios, em que um antígeno liga-se a
dois anticorpos simultaneamente. O método IRME foi aperfeiçoado com o
desenvolvimento de anticorpos monoclonais com alta afinidade e especificidade
(MILES & HALES, 1968; WIDE, 1971).
O fato dos RIE e IRME utilizarem, como marcadores, substâncias radioativas,
suscitou preocupações relacionadas ao meio ambiente (manutenção de rejeitos
radioativos, periculosidade, tempo de decaimento da radioatividade). Devido a isto,
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
38
Introdução
surgiram propostas de se usar marcadores não radioativos, mantendo o princípio básico
do RIE e IRME. A diferença entre eles baseia-se no tipo de detecção e, em
consequência, no equipamento necessário para realizá-la (HOWANITZ, 1988).
1.5 3 - Enzimaimunoensaio
Os primeiros ensaios a utilizarem marcadores não radioativos surgiram em 1966
com as enzimas que eram utilizadas principalmente em técnicas de imuno-histoquímicas
e, posteriormente, em ensaios imunológicos. Estes últimos, por utilizarem enzimas, são
denominados enzimaimunoensaios e a avaliação do teste se faz por fotometria de
absorção, resultante da atividade enzimática do marcador sobre um substrato. Assim,
em contraste ao RIE, a reação imunológica deve ser seguida de uma reação de indicação
que permita a determinação fotométrica da atividade enzimática (AVRAMEAS, 1970;
1976; ENGVALL & PERLMANN, 1971; 1972; VAN WEEMAN & SCHUURS, 1975;
MASSON ET AL., 1981; EKINS & JACKSON, 1984). As vantagens dos
enzimaimunoensaios, sobre o RIE, incluem, além do custo menos elevado, a obtenção e
estoque de reagentes, a simplicidade da aparelhagem para medida e a ausência de
radioatividade. Entre as desvantagens, destaca-se a possibilidade da redução da
atividade enzimática, quando em altas temperaturas (WISDOM, 1976; HOWANITZ,
1988).
1.5 4 - Imunofluorescência
A imunofluorescência vem sendo desenvolvida desde 1964, quando se utilizou
fluorescência polarizada para a reação antígeno-anticorpo (DANDLIKER ET AL.,
1964). Os imunoensaios, por polarização da fluorescência, consistem num método em
que um antígeno, conjugado a um marcador fluorescente, é excitado por luz polarizada.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
39
Introdução
Tal método foi desenvolvido, principalmente, para ensaios com moléculas pequenas e
possui sensibilidade limitada e não tem aplicação a antígenos grandes (DANDLIKER
ET AL, 1973; ULLMAN ET AL., 1976; SMITH ET AL, 1981).
A imunofluorescência, (IFMA – immunofluorescence assay) com resolução pelo
tempo é uma metodologia pela qual um pulso rápido de luz excita a sonda (lantanídeo) e
a fluorescência passa a ser medida após certo tempo do período de excitação. Vários
marcadores fluorescentes têm sido utilizados, em especial os quelatos de metal
fluorescentes, devido às suas características únicas, como marcadores em fluorimetria
com resolução pelo tempo (HEMMILA ET AL, 1984; HEMMILA,1985). Os
lantanídeos, quando complexados com ligantes orgânicos, formam quelatos que
possuem intensa fluorescência. Um exemplo é o európio que forma um quelato de β-
dicetona altamente fluorescente, com tempo de decaimento longo (HALONEN ET AL.,
1973; SOINI & HEMMILA, 1979; 1990; SOINI & KOJOLA, 1983; BADOR ET AL.,
1987).
O método de imunofluorescência pode ser realizado em ensaios fluorimétricos.
Sabe-se que a medida do sinal fluorescente é diretamente proporcional à quantidade de
antígeno na amostra, principalmente em ensaios competitivos diretos ou indiretos, onde
o sinal fluorescente é inversamente proporcional à quantidade de antígeno encontrado
na amostra (MONTHONY ET AL., 1977; SMITH ET AL., 1981; HEMMILA ET AL.,
1984).
As vantagens do método, sobre o RIE convencional, estão na maior sensibilidade,
estabilidade da fluorescência, possibilidade de automação, menor tempo de ensaio,
menor tempo de contagem e na meia-vida longa dos reagentes (SMITH ET AL., 1981;
HEMMILA ET AL., 1984; BIEGLMAYER & FISCHL, 1987).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
40
Introdução
1.5 5 – Quimioluminescência (ICMA – Immunochemiluminescence Assay)
O princípio básico da ICMA é semelhante ao da IFME e tem como principal
diferença o tipo de fonte de energia do marcador. Na ICMA, o marcador é a energia de
uma reação química e, posteriormente, decai do estado excitado para o estado
fundamental sendo acompanhado por emissão de luz, Já na IFME, a radiação luminosa
é a fonte de energia que promove as moléculas para um estado excitado (WHITEHEAD
ET AL., 1979).
O método da ICMA foi desenvolvido por Shoeder em 1976, utilizando isoluminol
como marcador (para a dosagem de biotina). Porém, o marcador apresentava baixa
atividade específica, reduzindo a sensibilidade da técnica (WHITEHEAD ET AL.,
1979). Devido ao fato, surgiram estudos de novos marcadores, culminando com os
achados de WEEKS ET AL. em 1986 E BOUNAUD ET AL. em 1987, quando
descreveram um marcador altamente específico que acabou, por sua vez,
revolucionando a técnica da ICMA. Trata-se do éster de acrinidina, que pode ser
utilizado para marcar moléculas grandes ou pequenas e é rapidamente quantificado em
um grande intervalo de concentração, levando a uma maior sensibilidade e estabilidade
da reação (WEEKS ET AL, 1986; BOUNAUD ET AL, 1987).
A metodologia atual da quimioluminescência utiliza como marcador luminescente
o fosfato do éster de adamantil dioxetano, que é hidrolizado enzimaticamente pela
fosfatase alcalina, originando um ânion estável (adamantil dioxetano) que emite luz. A
luminescência deste não se limita a flashs, como ocorre com outros compostos. O
diferencial está em emitir luz por longos períodos, permitindo, assim, uma longa faixa
de tempo de leitura, o que contribui para maior precisão do método (BRONSTEIN ET
AL., 1989; 1990; 1991; PANDIAN ET AL., 1993; OLESEN ET AL., 2000; KOKADO
ET AL., 2002).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
41
Introdução
Dentre as vantagens da ICMA (em relação às outras técnicas padronizadas até o
momento) está a maior sensibilidade, que permite o uso de menor quantidade de
reagente, reduzindo assim o custo por teste. Devido às propriedades dos marcadores,
dispensa-se a construção de curva-padrão a cada ensaio, o que propicia dosagens de
larga escala. Todas estas vantagens estão associadas a maior eficiência, especificidade e
reprodutibilidade (WHITEHEAD ET AL., 1979; WEEKS ET AL., 1986;
WOODHEAD & WEEKS, 1989; BRONSTEIN ET AL.,1989; 1990; 1991; NEELY ET
AL., 1995; RESENDE ET AL., 2007). Tais técnicas, aliadas ao desenvolvimento de
anticorpos monoclonais, conferiram aos ensaios maior sensibilidade, especificidade,
menor tempo de execução e possibilitaram que se trabalhe sem radioatividade
(NAKAMURA, 1983; 1992; HEMMILA, ET AL., 1984; HEMMILA, 1985;
HOWANITZ, 1988).
A aplicação clínica destes métodos laboratoriais, no estudo da endocrinologia (mais
especificamente na análise das gonadotrofinas e hormônios gonadais) iniciou-se com a
determinação das concentrações plasmáticas dos hormônios hipofisários, hormônio
luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH), inicialmente pelo RIE, por ODELL ET
AL., em 1966.
1.5 1 Métodos de dosagens das gonadotrofinas
As dosagens das gonadotrofinas sempre foram muito complexas devido às suas
estruturas diméricas, com uma subunidade β específica e uma subunidade α idênticas.
Este fato leva a problemas, como a reatividade cruzada com outros hormônios que
contêm cadeias α ou, até mesmo, com a subunidade α secretada isoladamente (PIERCE
& PARSONS, 1981; WIDE & ROBSON, 1983; RYAN ET AL.,1987; BIEGLMAYER
& FISCHL, 1987; TAYLOR ET AL., 1994). A estrutura da subunidade β do LH é
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
42
Introdução
similar à da gonadotrofina coriônica (hCG), exceto que a subunidade β do hCG tem 32
aminoácidos e a subunidade β do LH e FSH é constituída de 115 aminoácidos (WIDE
& ROBSON, 1983). O alto grau de homologia entre o LH e o hCG permite que ambos
se liguem ao mesmo receptor, o que explica suas atividades biológicas comuns e a
dificuldade de produzir imunoensaios específicos para o LH (REICHLEN, 1998).
Nas últimas décadas, com o desenvolvimento da técnica de duplo anticorpo
( técnica do sanduíche), surgiram os primeiros ensaios específicos para o LH e o FSH,
dosados tanto pela imunofluorescência como pela ICMA (SOINI & KOJOLA, 1983;
PANDIAN ET AL., 1993; BIEGLMAYER & FISCHL, 1987; ALBERTSON, 1990;
PETTERSON & SODERHOLM, 1990; NEELY ET AL., 1995: RESENDE, ET AL.,
2007).
1.5 2 Métodos de dosagens dos esteroides
A determinação laboratorial dos esteroides gonadais, utilizando o RIE, iniciou-se
em 1969 (ABRAHAM, 1969; 1974; ABRAHAM ET AL., 1970). Desde então,
permanece como método de escolha para a dosagem da maioria dos esteroides (BOOTS
ET AL., 1998). Por este método, é possível dosar concentrações hormonais séricas
totais e livres, como hormônio não ligado a proteínas (ABRAHAM, 1974).
A partir da década de 1980, os esteroides sexuais, anteriormente dosados somente
pelo RIE, começaram a ser quantificados, também, pelos métodos imunofluorimétrico e
quimioluminescência (KINGLER ET AL, 1987; APTER ET AL., 1989; JANSIN ET
AL., 1989; HERSHLAG ET AL., 2000; ENGLAND ET AL., 2002). Estas
metodologias foram se aprimorando, no sentido de aumentar a sensibilidade,
especificidade e confiabilidade dos exames (ALBERTSON, 1990; MELTOLA, 1999;
MORLEY ET AL., 2002).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
43
Introdução
1.5 3 - Comparação entre os métodos de dosagens hormonais
As dosagens basais de LH e FSH e a realização do teste do GnRH para avaliação do
eixo hipotálamo-hipófise-gonadal foram avaliadas por diversos autores, comparando-se
métodos de dosagens hormonais, anteriomente empregados, com métodos mais
sensíveis, na esperança de se evitar a utilização do teste do GnRH e fazer diagnóstico de
maturação do eixo hipotálamo-gonadal apenas com dosagens basais de LH, FSH e
esteroides.
Nosso grupo publicou um estudo com novos valores de referência de LH, FSH,
estradiol e testosterona, utilizando o método de ICMA, técnica que possui vantagens em
relação às outras anteriormente utilizadas, principalmente em relação às dosagens de
larga escala, já que dispensa construção de curva-padrão a cada ensaio, resultando em
redução de custos, associada a uma maior eficiência, sensibilidade, especificidade e
reprodutibilidade do método (NEELY ET AL., 1995; RESENDE ET AL, 2007).
O estudo foi realizado em crianças nos diversos estágios de puberdade e adultos
jovens. Os valores encontrados foram menores que os encontrados na literatura geral.
Devido a isso, fez-se necessário outro estudo, um com mulheres no climatério, para
distinguir pré-menopausa de menopausa (RESENDE ET AL, 2007).
O método ICMA tem sido utilizado em nossa rotina laboratorial no Hospital Escola
da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro (UFTM), desde 1996. Contudo,
utilizávamos ainda os valores de referência definidos para métodos anteriormente
empregados (APTER ET AL., 1989; SOWERS, 2008) na menopausa. Desta forma,
sentimos necessidade de estabelecer novos valores de referência, nesta fase, já que os
anteriormente considerados não podiam mais ser utilizados como padrão no diagnóstico
laboratorial da menopausa e outras anormalidades endócrinas, bem como no estudo da
fisiologia envolvendo o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
44
OBJETIVOS
Objetivos
2.1 Estabelecer valores de referência de LH e FSH, empregando ICMA como
método de dosagem, em condição basal e após estímulo com o GnRH, em mulheres
adultas normais pré-menopausadas e durante o climatério.
2.2 Estabelecer valores de corte que determinem o limite superior das
gonadotrofinas, na condição basal e, após estímulo com o GnRH, em mulheres normais,
para diagnóstico mais precoce do climatério.
2.3 Estabelecer os valores de referência de E
2
pelo método de ICMA em mulheres
adultas normais e durante o climatério, estabelecendo valores de corte que permitam
diferenciar as duas condições fisiológicas.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
46
CASUÍSTICA E MÉTODOS
Casuística e Métodos
3.1 Casuística
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM). Todos os participantes foram
informados sobre o projeto e, posteriormente, assinaram o termo de consentimento.
As mulheres deste estudo foram selecionadas no Ambulatório de Gônadas da
Disciplina de Endocrinologia, bem como no Ambulatório de Ginecologia da UFTM.
Todas foram avaliadas clinicamente pela anamnese e exame físico para afastar possíveis
endocrinopatias, doenças crônicas ou uso de medicamentos, principalmente terapias de
reposição hormonal e anticoncepcionais orais, sendo ainda, informada a data da última
menstruação, regularidade do ciclo menstrual e. se em menopausa, quando ocorreu o
último ciclo. Foram obtidos peso e altura, aferida em posição ortostática, utilizando-se
balança digital Filizola e estadiômetro de Harpeden.
As dosagens de LH, FSH e E
2
foram realizadas nas mulheres no menacme, na fase
folicular, entre o quinto e sétimo dia do ciclo. Nas mulheres menopausadas não houve
dia estipulado para a coleta, porém todas foram realizadas no período da manhã, com 8
a 10 horas de jejum.
Foram selecionadas 503 mulheres adultas normais, as quais foram divididas por
idades em 5 grupos e, para efeito estatístico, utilizando-se a data da última menstruação
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
49
49
Casuística e Métodos
como padrão ouro, elas foram distribuídas em dois grupos, pré-menopausadas (PM) e
menopausadas (M).
Segundo a idade, os grupo foram divididos da seguinte maneira: Grupo A: 61
mulheres entre 20 e 39 anos. Grupo B: 115 mulheres entre 40 e 45 anos. Grupo C: 182
mulheres entre 46 e 50 anos, Grupo D: 104 mulheres entre 51 e 55 anos e Grupo E: 41
mulheres entre 56 e 60 anos. Desse total, foram selecionadas aleatoriamente, 45
mulheres (cerca de 10 mulheres por grupo etário) para a realização do teste de estímulo
do LH e FSH com o GnRH.
O grupo A apresentou-se com a mediana da idade de 35 anos (20 a 39). O peso e
altura foram aferidos e, respectivamente, apresentaram os seguintes números: 60kg (48
a 89) e 160 cm (150 a 174). As características do grupo foram individualizadas na
Tabela 1.
O grupo B apresentou-se com a mediana da idade de 43 anos (40 a 45). O peso e
altura foram, respectivamente, de 64,3kg (45,3 a 86) e 159 cm (150 a 173), descrição
está na Tabela 1.
O grupo C apresentou-se com a mediana da idade de 48 anos (46 a 50). O peso e
altura foram, respectivamente de 64,5kg (47,1 a 80,6) e 160 cm (148 a 172). As
características do grupo estão na Tabelas 1.
O grupo D apresentou-se com a mediana da idade de 52 anos (51 a 55). O peso e
altura foram, respectivamente, de 65kg (46 a 87) e 159 cm (144 a 173). Características
estão descritas na Tabela 1.
O grupo E apresentou-se com a mediana da idade de 58 anos (56 a 60). O peso e
altura foram, respectivamente, de 64,4 kg (52,6 a 79) e 159,5 cm (148 a 169). As
características do grupo foram individualizadas na Tabela 1.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
50
50
Casuística e Métodos
A comparação entre os grupos A, B, C, D, e E, quanto à idade demonstrou
diferença significativa entre os grupos. Da mesma forma, em relação ao peso e IMC, a
comparação demonstrou diferença estatística entre grupos (Tabelas 5 e 8).
Segundo a data da última menstruação, as mulheres foram também distribuídas em
dois grupos: pré-menopausadas (Grupo PM) e menopausadas (Grupo M), sendo a data
da última menstruação o ponto de separação. Este período variou de 2 meses a 10 anos.
As mulheres consideradas menopausadas e com menos de 12 meses em amenorréia
foram reavaliadas até completarem 1 ano da última menstruação, a fim de detectar
precocemente as alterações do FSH.
O grupo PM constituiu-se de 309 mulheres. A mediana da idade foi de 44 anos (20
a 53), peso de 64 kg (48 a 89) e altura de 160 cm (148 a178). O grupo M foi constituído
por 194 mulheres, a mediana da idade foi de 51 anos (47 a 60), peso de 65 kg (46 a 87)
e altura de 159 cm (144 a 173). Os dois grupos, comparados estatisticamente,
demonstraram diferenças quanto à idade (p<0,001) e IMC (p<0,04), menores no grupo
PM. Não houve diferença estatística na variável peso. Estes grupos estão caracterizados
nas Tabelas 2 e 8.
É importante ressaltar que em cada um dos grupos A, B e C, constituído de
pacientes pré-menopausadas, 10, 10 e 11 indivíduos, respectivamente e dos grupos D e
E , 14 mulheres menopausadas, submeteram-se ao teste de estímulo com o GnRH
(Tabela 3)
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
51
51
#
31,03 ± 7,0
62,4 ± 9,9
155,5 ± 21,0
24,2 ± 3,0
42,6 ± 1,9
63,9 ± 7,8
157,2 ± 21,4
24,9 ± 2,5
48,1 ± 1,5
64,2 ± 7,2
160,2 ± 4,5
24,2 ± 3,1
52,5 ± 1,6
64,9 ± 7,5
159,1 ± 5,6
25,6 ± 2,4
57,9 ± 1,6
64,4 ± 7,4
159,0 ± 4,8
25,3 ± 2,76
52
52
#
40,9 ± 8,5
64,1 ± 8,5
160,0 ± 5,0
25,0 ± 3,4
##
44,0
a
α
20,0 – 53,0
52,1 ± 3,2
64,8 ± 7,8
159,2 ± 5,01
25,6 ± 2,9
53
53
#
23,1 ± 1,8
53,8 ± 3,3
159,1 ± 5,7
21,2 ± 1,6
42,5 ± 1,9
63,5 ± 6,3
161,0 ± 5,5
24,6 ± 2,5
47,6 ± 1,3
66,0 ± 4,8
158,9 ± 3,3
26,1 ± 1,7
53,2 ± 3,8
64,3 ± 6,3
158,0 ± 3,8
26,1 ± 1,7
2,7 ± 2,2
54
54
55
55
Casuística e Métodos
3.2 MÉTODOS
As amostras de sangue foram colhidas em dois tubos e centrifugadas, sendo
separadas e os soros congelados a
–
20ºC até o momento da realização dos ensaios. As
mesmas foram dosadas pelo método de ICMA, no Laboratório de Hormônios da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Triângulo Mineiro.
O FSH, LH e E
2
foram dosados, utilizando-se estojos comerciais obtidos da
Diagnostic Products Corporation-Medlab, LA USA (DPC).
Dosagens por ICMA foram realizadas utilizando-se aparelho Immulite 2000 (DPC),
que possui uma unidade analisadora totalmente automatizada e randômica. Esta unidade
identifica, por meio de código de barras, as amostras, as unidades-teste e os reagentes.
Logo após, ela pipeta os reagentes e as amostras, incuba, lava as unidades-teste,
centrifuga, adiciona o substrato luminescente (adamantil dioxetano) e faz a leitura da
luminescência em luminômetro de alta densidade.
Cada reagente é pré-calibrado na fábrica e através de código de barras é ajustado ao
equipamento.
O interior de cada unidade-teste contém uma pérola de poliestireno com 6,5 mm de
diâmetro, revestida com anticorpos específicos, onde acontece a reação
quimioluminescente.
O equipamento é gerenciado, em sua totalidade, por um computador com software
específico que processa e armazena os resultados obtidos, além de emitir os relatórios
impressos (BRONSTEIN ET AL., 1989, BABSON,1991, ELMLINGER,1999).
3.2.1 Determinação do hormônio foliculoestimulante (FSH)
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
56
56
5757
Casuística e Métodos
Cada unidade de teste, rotulada com código de barras, contém uma esfera revestida
com anticorpo anti-FSH monoclonal de rato. Nestas unidades, foram pipetados 50µl das
amostras (antígenos) e do reagente (fosfatase alcalina conjugada com anticorpo
policlonal anti FSH de cabra, em tampão). A curva-padrão variou de 0,1 a 170UI/L e foi
calibrada pelo padrão internacional 78/549 2
nd
IRP (“Second International Reference
Preparation”) da Organização Mundial de Saúde.
3.2.2 Determinação do hormônio luteotrófico (LH)
Cada unidade de teste, rotulada com código de barras, contém uma esfera revestida
com anticorpo anti-LH monoclonal de rato. Nestas unidades, foram pipetados 50µl das
amostras (antígenos) e do reagente (fosfatase alcalina conjugada com anticorpo
policlonal anti LH de cabra em tampão).
A curva-padrão variou de 0,1 a 200UI/L e foi calibrada pelo padrão internacional
1ºIRP 68/40 (“First International Reference Preparation”) e 2
nd
IS 80/552 (“Second
International Standart”) da Organização Mundial de Saúde.
3.2.3 Determinação do E
2
Trata-se de ensaio competitivo, onde cada unidade de teste, rotulada com código de
barras, contém uma esfera revestida com anticorpo anti-estradiol policlonal de coelho.
Nestas unidades, foram pipetados 25µl das amostras (antígenos) e do reagente (fosfatase
alcalina conjugada com estradiol em tampão). A curva-padrão variou de 5 a 2000
pg/mL.
3.3 Teste de estímulo do LH e FSH após o GnRH (teste do GnRH)
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
57
5858
Casuística e Métodos
O teste do GnRH foi realizado em 45 mulheres. Após obter seus consentimentos,
elas foram submetidas a um período de 8 a 10 horas de jejum e, ao serem admitidas à
sala de testes funcionais, entre 7 e 9 horas da manhã, receberam explicações acerca do
procedimento. Após ser colocada em posição supina, uma veia periférica foi puncionada
com cateter periférico tipo scalp, número 21, mantida permeável com infusão de soro
fisiológico a 0,9%. Para dosagem de gonadotrofinas e E
2,
foram colhidas duas amostras
basais nos tempos –15 e 0.
Em seguida, por via endovenosa, administrou-se 100µg de GnRH, (Relefact
®
,
Aventis Pharma BV, Hoevelaken, The Netherlands), para dosagens das gonadotrofinas,
colhendo-se amostras nos tempos 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos. O sangue obtido foi
centrifugado e as amostras de cada tempo foram distribuídas em duas alíquotas de 2mL
e estocadas a
–
20°C até a realização do ensaio. Na Tabela 4 foram representadas as
características dos ensaios hormonais utilizados e seus respectivos controles e
coeficientes de variação.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
58
Intra-ensaio Inter-ensaio
59
60
Casuística e Métodos
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise dos resultados obtidos, foram utilizados testes não paramétricos e
paramétricos, dependendo da natureza e comportamento das variáveis estudadas. A
normalidade de distribuição e a homogeneidade da variância amostral foram avaliadas
pelos testes de Kolmogorov-Smirnov e Bartlett, respectivamente.
Todos os dados foram submetidos a uma análise descritiva, calculando-se média,
desvio-padrão, percentil 5 e 95%, mediana e mínimo-máximo, para as variáveis de
interesse, levando-se em consideração as idades das pacientes.
Na comparação dos grupos com diferentes faixas etárias, dados paramétricos foram
analisados empregando-se ANOVA de um fator seguido pelo teste comparações
múltiplas de Tukey, enquanto dados não paramétricos foram avaliados empregando-se
ANOVA de Kruskall-Wallis seguido do teste de Dunn.
Na comparação entre pacientes pré-menopausadas e menopausadas, dados
paramétricos foram analisados pelo teste t de Student para medidas independentes e os
dados não paramétricos foram analisados pelo Teste de Mann-Whitney.
Curvas ROC (“Receiver Operating Characteristics”) foram confeccionadas para
identificar o ponto exato de cutoff, com a maior sensibilidade e especificidade do
diagnóstico de menopausa. O padrão ouro utilizado foi a menopausa clínica, ou seja, a
última menstruação.
A sobreposição de valores foi verificada, entre grupos, comparando-se o percentil
95% com o percentil 5%.
As análises estatísticas foram executadas pelo software SIGMASTAT 2.0.3 (SPSS
Inc., Sommers, NY, USA). Diferenças foram consideradas estatisticamente
significativas com os valores de p <0,05.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
60
RESULTADOS
Resultados
Os resultados obtidos em cada grupo serão apresentados a seguir. Os valores de
FSH, LH e E
2
basais e pós GnRH, bem como os parâmetros obtidos a partir dos testes,
foram expressos nas tabelas em percentis 5% e 95%, mediana, mínimo e máximo.
Para distinguir mais precisamente valores de referência na pré-menopausa e na
menopausa dos hormônios dosados, considerou-se tanto a concentração mínima
detectável (CMD) como a concentração máxima detectável (CMaD) dos ensaios,
àquelas cujo coeficiente de variação inter e intra-ensaio foi menor que 8%. Apesar da
CMD, determinada pelo fabricante dos estojos comerciais, - habitualmente calculada
pelo método tradicional de várias replicatas do padrão zero (média – 2DP) - , ser de
0,05UI/L tanto para o LH, quanto para o FSH, e da CMaD ser de 250UI/L para FSH e
LH, o coeficiente de variação, nesses níveis, foi alto e, portanto, a CMD utilizada foi de
0,1UI/L para o LH e FSH e a CMaD foi de 170UI/L para o FSH e 200UI/L para o LH.
No entanto, as variações mínimas e máximas dos valores de E
2
coincidiram com aquela
fornecida pelo fabricante, ou seja, CMD de 5,0 pg/mL e a CMaD de 2.000 pg/mL
(Tabela 4).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
62
Resultados
4.1 VALORES BASAIS DE FSH E LH
As concentrações basais de FSH e LH nos grupos de A a E estão representadas na
tabela 5.
4.11 Comparações de valores entre os grupos (A – E).
A comparação das concentrações de FSH e LH entre os grupos demonstrou
diferença estatisticamente significante (p<0.05), exceto entre os grupos A e B e D e E
(Tabelas 5 e 8; Figuras 4, 6 e 13)
Para o grupo das adultas jovens, grupo A, o percentil 95% para o FSH foi de 6,9
UI/L. Entretanto, houve sobreposição de 92,2% (107/115) com o grupo B; 31,8%
(58/182) com o grupo C e 5,7% (6/104) com o grupo D, Não se observou sobreposição
do grupo A com o grupo E (Figura 4 e 13).
O valor de LH, no percentil 95%, foi de 5,9 UI/L. Houve sobreposição de 97,3%
(112/115) com o grupo B; 44,5% (81/182) com o grupo C; 6,7% (7/104) com o grupo D
e não se observou sobreposição do LH do grupo A com o grupo E (Tabela1 e Figura 4 e
13). Portanto não houve sobreposição, tanto do FSH como do LH entre os grupos de
mulheres até 40 anos, em relação àquelas acima de 55 anos.
O percentil 95% para o FSH, nas mulheres do grupo B, foi de 8,2 UI/L. Entretanto,
foi observada uma sobreposição de 39,5 (72/182) com o grupo C; 5,8% (58/104) com o
grupo D e não se observou sobreposição do grupo B com o grupo E (Tabela 1 e Figura
4 e 13).
O valor de LH, no percentil 95%, foi de 5,4 UI/L. Entretanto, foi observada uma
sobreposição 40,5% (74/182) com o grupo C; 6,7% (7/104) com o grupo D e não se
observou sobreposição do LH do grupo B com o grupo E (Tabela 1 e Figura 4 e 13).
Portanto não houve sobreposição, tanto do FSH como do LH entre os grupos de
mulheres até 45 anos, em relação àquelas acima de 55 anos.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
63
Resultados
O percentil 95% para o FSH, nas mulheres do grupo C, foi de 95,7 UI/L. Observou-
se sobreposição de 94,2 (98/104) com o grupo D e 87,8% (36/41) com o grupo E.
O valor de LH, no percentil 95%, foi de 43,7 UI/L. Entretanto, observou-se
sobreposição de 83,6% (87/104) com o grupo D e 51,2 (21/41) com o grupo E ( Tabela
1, Figuras 4 e 13). Portanto houve sobreposição, tanto do FSH como do LH entre os
grupos de mulheres até 50 anos, em relação àquelas acima de 55 anos.
O percentil 95% para o FSH, nas mulheres do grupo D, foi de 105,7 UI/L. Foi
observada uma sobreposição de 92,6% (38/41) com o grupo E.
O valor de LH, no percentil 95%, foi de 62,9 UI/L e verificou-se uma sobreposição
78% (32/41) com o grupo E (Tabela 1, Figuras 4 e 13). Verificamos grande
sobreposição tanto do FSH como do LH entre os grupos de mulheres até 55 anos, em
relação àquelas acima de 55 anos.
4.12 Valores comparados entre grupos pré-menopausa e menopausa (PM e M)
Os valores basais de FSH e LH, nos grupos PM e M, foram representados na tabela
6. A comparação estatística entre os grupos demonstrou diferença estatística em ambas
variáveis (p<0,001).
O percentil 95% para o FSH, nas mulheres do grupo PM, foi de 14,2 UI/L.
Observou-se sobreposição do FSH de 2,1% (4/194) com o grupo M. O valor de LH, no
percentil 95%, foi de 9,0 UI/L e verificou-se uma sobreposição 1% (2/194) com o grupo
M.
Pelo fato de ter ocorrido sobreposição tanto do FSH como do LH entre os grupos de
mulheres pré-menopausadas e menopausadas, aplicamos a Curva ROC, com o objetivo
de detectar o melhor valor de FSH e LH que expresse a condição clínica da menopausa,
a maior sensibilidade e especificidade, tendo como padrão ouro a data da última
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
64
Resultados
menstruação. O valor de corte preditivo e indicativo de menopausa, para o FSH em
condição basal, foi de 15UI/L e de LH foi de 10UI/L (Figura 3 e 5).
4.2 VALORES DE FSH E LH PÓS ESTÍMULO COM GNRH
Os resultados obtidos em cada grupo serão descritos a seguir. Os valores de LH e
FSH, nos tempos do teste do GnRH, bem como os parâmetros obtidos a partir do teste,
estão expressos na tabela 7 em percentis 5% e 95%, mediana (min, max).
Como referido anteriormente, antes de se iniciar o teste, foram realizadas colheitas
basais nos tempos -15 e 0 minutos. A análise destes tempos, em cada um dos grupos,
não demonstrou diferença significante entre os dois tempos. Por essa razão, para o
confronto entre o período basal e os demais tempos do experimento, e para obter os
demais parâmetros de resposta ao teste, considerou-se como valor basal, a média dos
tempos acima referidos.
A análise descritiva dos resultados dos diversos grupos está apresentada na Tabela
7. O valor de pico de resposta ocorreu no tempo 30 minutos, em todos os grupos.
4.2 1 Comparação de valores entre grupos
Comparamos estatisticamente o grupo D+E, onde estão todas as mulheres
menopausadas, com os demais grupos (em relação a variável pico de FSH).
Observamos diferença entre os grupos D+E x A, D+E x B, e C x A (p<0,001). Para os
demais grupos não houve diferença estatística. Em relação a variável pico de LH, foram
detectadas diferenças estatísticas entre os grupos D+E x A, D+E x B (p<0,001). O
restante não apresentou diferença (Tabela 8 e 9).
Foi comparado o percentil 5% dos valores de FSH e LH do grupo D+E, com o
percentil 95% dos demais grupos e não houve sobreposição dos mesmos com nenhum
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
65
Resultados
grupo. O valor basal de FSH no percentil 5% foi de 26,4 UI/L, enquanto que o percentil
95% do grupo A foi de 6,2 UI/L, do grupo B, 7,8 UI/L e o grupo C, 11,0 UI/L.
O valor basal de LH, no percentil 5%, foi de 13,4 UI/L, enquanto que o percentil
95% do grupo A foi de 5,7 UI/L, do grupo B, 6,8 UI/L e o grupo C, 6,3 UI/L.
Quando comparamos os valores de pico do FSH e LH após o GnRH, no percentil
5% do grupo das menopausadas com o percentil 95% dos demais grupos, observamos
sobreposição de valores apenas com o grupo C tanto para o FSH quanto para o LH. Esta
sobreposição foi de 27,3% (3 em 11 mulheres).
O valor do pico de FSH no percentil 5% do grupo D+E foi de 52,9 UI/L, enquanto
que o percentil 95% do grupo A foi de 10,8 UI/L; do grupo B, 35,5 UI/L e o grupo C,
onde houve sobreposição de 27,3% (3/11), foi de 65,2 UI/L.
O valor do pico de LH no percentil 5% foi de 51,5 UI/L no grupo D+E, enquanto
que o percentil 95% do grupo A foi de 45,6 UI/L; do grupo B, 37,7 UI/L e o grupo C,
65,3 UI/L. Nesse grupo. a sobreposição também foi de 27,3% ou seja, 3 em 11 mulheres
apresentaram pico de LH maior que 51,5 UI/L.
O percentil 95% para o valor de pico de resposta ao GnRH foi de 136,5UI/L para o
FSH e de 117,7UI/L para o LH no grupo das menopausadas, sendo significativamente
maior que os outros grupos (p<0,05).
A curva ROC, empregada para verificar o maior ponto de sensibilidade e
especificidade do valor de pico entre os grupos de menopausadas e pré-menopausadas,
(portanto o valor a partir do qual diferenciamos uma hiperresposta da menopausa, de
uma resposta normal da pré-menopausa), teve como resultado o valor de 46 UI/L para o
FSH e de 50 UI/L para o LH (Figura 7 e 9).
4.2 VALORES DE E
2
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
66
Resultados
As concentrações basais de E
2
dos grupos A, B, C, D e E foram expressas na Tabela
5 e dos grupos PM e M, na Tabela 6 e Figura 8.
4.21 Valores comparados entre grupos ( A,B,C,D e E), por idades
Os valores basais de E
2
foram comparados entre os grupos e foram demonstradas
diferenças estatísticas (p<0,001) entre os grupos (exceto entre AxB e DxE, onde
observaram as maiores e menores concentrações, respectivamente).
Utilizamos o percentil 95% dos vários grupos para compará-los pelas idades. Para o
grupo A, o percentil 5% para o E
2
foi de 32,6 pg/dL. Entretanto, foi observada uma
sobreposição de 95,6% (110/115) com o grupo B, 75,8% (138/182) com o grupo C,
43,2% (45/104) com o grupo D e 12,5% com o grupo E.
O percentil 5% para o E
2
, nas mulheres do grupo B foi de 32,7 pg/dL. Entretanto,
foi observada uma sobreposição de 74,1 (135/182) com o grupo C; 30,7% (35/104) com
o grupo D e com o grupo E, 12,2% (5/41).
O percentil 5% para o E
2
, nas mulheres do grupo C foi de 15,9 pg/dL. Entretanto,
foi observada uma sobreposição de 97,1 (101/104) com o grupo D, 82,9% (34/41) com
o grupo E.
O percentil 5% para o E
2
, nas mulheres do grupo D, foi de 15,9 pg/dL. Foi
observada uma sobreposição de 82,9% (34/41) com o grupo E. Houve sobreposição do
E
2
em todos os grupos, nas diversas idades.
4.2 1 Valores comparados entre grupos (PM e M), por pré-menopausa e
menopausa
Os valores basais de E
2
do grupo PM foram significantemente maiores (p<0,001)
que os valores do grupo M (Tabela 6 e Figura 8).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
67
Resultados
O percentil 95% do grupo das menopausadas foi considerado a fim de se
estabelecer o valor de corte do E
2
na menopausa e comparar este mesmo valor com as
mulheres pré-menopausadas.
O percentil 95% das menopausadas foi de 44,3 pg/dL. Observou-se sobreposição de
33,3% (103/194) com o grupo PM. Quando o relacionamos com o percentil 5% do
grupo PM, observamos uma sobreposição de 25,7% (50/194).
Devido ao fato de ter ocorrido sobreposição com todos os grupos, no E
2
, aplicamos
a Curva ROC para encontrarmos o valor de E
2
com maior sensibilidade e especificidade
a fim de expressar a condição clínica da menopausa, tendo como padrão ouro a data da
última menstruação. O valor encontrado, neste caso, foi E
2
em condição basal, abaixo de
35 pg/dL (Figura 7).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
68
69
70
2727,8
71
72
73
Resultados
FSH
1-especificidade
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
sensibilidade
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Figura 3:. Curva ROC para o valor Basal de FSH de 15 UI/L.
97,93% de sensibilidade e 94,93% de especificidade.
FSH
(UI/L)
0
20
40
60
80
100
120
A B C D E
F S H
(UI/L)
0
2 0
4 0
6 0
8 0
10 0
12 0
P M M
Figura 4: Comportamento mediano do FSH, nos diversos grupos. Caixa percentil
25 a 75% e extremos 5 e 95%, · mínimo e máximo.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
74
Resultados
LH
1-especificidade
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
sensibilidade
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Figura 5. Curva ROC para o valor Basal de LH de 10 UI/L.
73,06% de sensibilidade e 82,2% de especificidade.
LH
(UI/L)
0
20
40
60
80
100
A B C D E
LH
(UI/L)
0
20
40
60
80
PM M
Figura 6: Comportamento mediano do LH, nos diversos grupos. Caixa percentil
25 a 75% e extremos 5 e 95%, · mínimo e máximo.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
75
Resultados
E2
1-especificidade
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
sensibilidade
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Figura 7: Curva ROC para o valor Basal de E
2
de 35 pg/mL.
64,77% de sensibilidade e 79,94% de especificidade.
E
2
(pg/mL)
0
20
40
60
80
100
120
A B C D E
E
2
(pg/mL)
0
20
40
60
80
100
PM M
Figura 8: Comportamento mediano do E
2
, nos diversos grupos. Caixa percentil
25 a 75% e extremos 5 e 95%, · mínimo e máximo.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
76
Resultados
Pico de FSH
1-especificidade
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
sensibilidade
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Figura 9: Curva ROC para o valor de pico de FSH UI/L de 46 UI/L.
100% de sensibilidade e 87,10% de especificidade.
pico de FSH
(UI/L)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
A B C D+E
Figura 10: Comportamento mediano do pico de FSH,nos diversos
grupos. Caixa percentil 25 a 75% e extremos 5 e 95%, · mínimo
e máximo
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
77
Resultados
Figura 11: Curva ROC para o valor de pico de LH UI/L de 50 UI/L.
92,86% de sensibilidade e 90,32% de especificidade.
pico de LH
(UI/L)
0
20
40
60
80
100
120
A B C D+E
Figura 12: Comportamento mediano do pico de FSH, nos diversos
grupos. Caixa percentil 25 a 75% e extremos 5 e 95%, · mínimo
e máximo
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
78
Resultados
Figura13: Apresentação dos percentis 5% e 95% dos valores de FSH, LH e E
2
, nos
diversos grupos
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
79
80
DISCUSSÃO
Discussão
Entre os anos de 1900 e 1991, a expectativa de vida ao nascer das mulheres aumentou
de 48 anos a quase 79 anos (HOBBS & DAMON, 2000; GIL ET AL, 2002). Em
consequencia disso, as questões relativas à qualidade de vida assumem maior importância,
e tornando-se cada vez mais relevante que nos esforcemos para compreender as alterações
biológicas responsáveis pelo processo do envelhecimento. Apesar da maior longevidade, a
idade média da menopausa tem-se mantido por volta dos 51 anos. Portanto a mulher
vivencia um terço da sua vida após a menopausa. O cuidado clínico nesse período é de
extrema importância e deve ser dirigido aos aspectos psicológicos e biológicos, com
avaliações hormonais e tratamento precoce adequado, a fim de se alcançar uma maior
qualidade de vida. (ROSSMANITH ET AL, 1991; 1994; BURGER, 1994; SANTORO ET
AL, 1998; HALL ET AL, 2000).
As mulheres participantes deste estudo, em concordância com a literatura (SANTORO
ET AL, 1998; HALL ET AL, 2000; PEDRO ET AL, 2003), apresentaram idade média de
menopausa de 51 anos. Foram avaliadas mulheres normais, entre 20 e 60 anos de idade,
verificando-se os valores de referência de LH e FSH basais, estimulados pós GnRH, assim
como o E
2
basal, pelo método de ICMA.
A determinação destes valores de LH, FSH e E
2
, em condição basal, é de grande
utilidade na prática clínica. Tais determinações, em mulheres normais e não somente no
climatério como também durante as várias idades do período reprodutivo, estabelecem
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
81
Discussão
limites da fisiologia normal e auxiliam no diagnóstico de outras condições endócrinas que
envolvem alterações do eixo Hipotálamo-Hipófise-Gonadal (H-H-G) e têm auxiliado na
decisão clínica de qual seria a melhor fase para se iniciar ou não a terapia de reposição
hormonal. Habitualmente, concentrações elevadas de FSH e LH, ao lado de irregularidades
menstruais e sintomas sugestivos de deficiência estrogênica, confirmam que a mulher
entrou em insuficiência ovariana, seja numa faixa etária acima de 45 anos, onde estes
eventos são aguardados, ou quando são considerados precoces (antes de 40 anos), ou ainda
nas mulheres histerectomizadas que não dispõem de sinais objetivos de que estão entrando
no climatério e nas quais fogachos e estados depressivos são comumente atribuídos à
síndrome do pânico ou a distúrbios neurovegetativos (RANCE & USWANDI, 1996;
SOWERS ET AL, 2008).
A metodologia de ICMA é hoje utilizada na maioria dos laboratórios e, por ser a
técnica eleita em nosso laboratório, tornou-se necessário estabelecer valores de referência
próprios, tendo em vista a diversidade de valores encontrados na prática clínica. Ademais,
os fabricantes não fornecem dados normativos e cada laboratório deve definir seus próprios
valores (TAYLOR ET AL.,1994; NEELY ET AL, 1995).
O estabelecimento do valor de corte para determinado teste laboratorial é arbitrário.
De acordo com os princípios de seleção e interpretação dos testes laboratoriais (GRINER
ET AL., 1981), existem três situações nas quais os testes são aplicados: no diagnóstico da
doença, na triagem e no acompanhamento do tratamento ou na evolução da doença. No
presente estudo todas essas etapas são contempladas.
Com finalidade diagnóstica, utilizam-se testes mais sensíveis quando se pretende
excluir a doença ou testes mais específicos para confirmá-la. Utilizando como critério de
precisão diagnóstica a sensibilidade e a especificidade, comparadas com os valores do
percentil 95% do grupo controle pré-menopausa, obtivemos como teste positivo valores de
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
82
Discussão
FSH em condição basal > 15 UI/L e LH basal > 10 UI/L. Poderíamos escolher um valor de
corte com sensibilidade mais elevada perdendo em especificidade. No entanto, não é
conveniente, nesta situação, diminuir a especificidade e aumentar a probabilidade de testes
falso-positivos.
Os valores estimulados (pico) de LH e FSH durante as várias idades, comparados ao
período do climatério permitem estabelecer e inferir critérios de hiperresposta do eixo H-
H-G, que podem ser utilizados no diagnóstico de outras condições endócrinas como, por
exemplo, no estudo da função gonadal de pacientes com Síndrome de Turner, além de
outras condições que resultem em insuficiência ovariana primária. É comum, na prática
clínica, que pacientes do sexo feminino entre 40 e 50 anos apresentem queixas como ganho
de peso, diminuição da libido, depressão e outras, ainda num período em que os ciclos
menstruais estão regulares e valores basais de gonadotrofinas e E
2
estão normais. Nessa
fase, a realização do teste do GnRH poderia detectar insuficiência estrogênica subclínica e
diagnóstico precoce do climatério, possibilitando medidas terapêuticas adequadas para esta
fase. No estudo, ficou estabelecido que os valores de corte do pico de FSH e LH foram de
46UI/L e 50UI/L, respectivamente.
5.1 Da determinação dos valores basais de gonadotrofinas
São raros os estudos da literatura que empregaram ICMA como método de avaliação
diagnóstica no período do climatério (BURGER, 1994; SOWERS ET AL, 2008). A
maioria dos estudos disponíveis na literatura, em sua maior parte, nos fornece
conhecimentos quanto às alterações hormonais que ocorrem na menopausa, as causas do
aumento das gonadotrofinas e várias teorias sobre a disfunção ovariana. No presente
estudo, estabelecemos valores de referência de FSH, LH e E
2
, dosados pelo método de
ICMA, em um estudo transversal, determinando o valor de corte, principalmente do FSH,
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
83
Discussão
definindo valores diagnósticos laboratoriais de menopausa. Pelo fato das alterações
hormonais no climatério ocorrerem em torno dos 40 anos, dividimos os grupos por faixas
etárias e também reagrupamos em dois grupos, no período pré e pós-menopausa,
considerando o valor de corte de cada grupo, comparando-os entre si, determinando o valor
das gonadotrofinas e E
2
, nos diversos períodos do climatério.
As divisões dos grupos por faixa etária (A, 20 a 39 anos; B, 40 a 45 anos; C, 46 a 50
anos; D, 51 a 55 anos e E, 56 a 60 anos), teve por finalidade determinar os valores de LH,
FSH e E
2
, nos períodos pré e pós-menopausa. Ao nos aproximarmos da idade na qual a
literatura define como climatério e menopausa, as divisões foram feitas com intervalos de 5
anos. Isso permitiu estabelecer um espectro de valores hormonais: no período reprodutivo
(grupos A e B), no período em que provavelmente a menopausa já ocorrera (D e E) e num
período intermediário, em que algumas mulheres já entraram na menopausa, enquanto
outras apresentam alguns sintomas de deficiência estrogênica, embora apresentem ainda
ciclos menstruais regulares (climatério), enquanto outras não apresentam sintomas nem
alterações hormonais (C).
No grupo A, o FSH de 6,9UI/L apresentou sobreposição decrescente à medida em
que as mulheres avançavam a idade (B: 92,2%; C: 31,8% e D:5,7%), indicando provável
falência ovariana a partir do grupo C, ou seja a, partir dos 46 anos.
O valor de corte do FSH, estabelecido através da curva ROC, foi de 15UI/L. Nos
grupos A e B, os valores de FSH foram menores que 15UI/L, enquanto que no grupo C, de
182 mulheres, 69 (38%) haviam ultrapassado o valor de corte. No grupo D, de 104, 94
(90,4%) e no grupo E, de 40 mulheres, todas (100%) apresentavam valores acima do valor
de corte. (ver anexo).
O valor de corte da curva ROC teve como padrão ouro a data da última
menstruação, portanto a partir dos 46 anos, 38% das mulheres do grupo C já haviam
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
84
Discussão
entrado em menopausa, mas, no grupo B (40 – 45 anos), uma paciente de 41 anos
apresentava irregularidades menstruais, com FSH de 13,2, indicando que o climatério já
havia iniciado antes da menopausa ser classicamente definida.
A comparação estatística entre os grupos PM e M demonstrou diferença estatística
dos valores de FSH (p<0,001) entre os dois grupos, permitindo afirmar que o FSH é o
marcador biológico da menopausa, como previamente descrito na literatura em estudos que
utilizaram metodologias diferentes (BURGER, 1994; SOWERS ET AL, 2008).
É comum observar mulheres acima de 40 anos, que apresentam sintomas pouco
definidos como: ganho de peso, depressão, redução de libido e leves mudanças no ciclo
menstrual. O percentil 95 das mulheres do grupo A e B, respectivamente, 6,9UI/L e
8,2UI/L, indicam que valores acima destes níveis, em mulheres acima de 40 anos,
poderiam, quando associados a sintomas, prenunciar a síndrome do climatério, tendo em
vista que acima de 15UI/L estaria definida a menopausa.
Com relação ao LH, as sobreposições entre os grupos também foram
percentualmente decrescentes, exibindo comportamento semelhante ao do FSH, embora os
valores de LH tenham sido menores que os do FSH. O valor de corte indicativo de
menopausa, também determinado pela curva ROC, foi de 10 UI/L. Nos grupos A e B,
todas as mulheres exibiram concentrações de LH abaixo do valor de corte. No grupo C, 68
pacientes (37%), apresentaram valores acima do valor de corte (uma paciente apresentou
valor de 10UI/L). No grupo D, de 104 mulheres, 90 (86%) e no grupo E, todas (100%)
apresentaram LH acima de 10UI/L. Na comparação entre os grupos M e PM, os níveis de
LH foram diferentes entre os dois grupos (p<0,001), significando que assim como o FSH,
também há diferenciação entre pré-menopausa de menopausa.
Estes dados mostraram o comportamento do LH, semelhante ao do FSH, em
condição basal, sendo que concentrações de LH, acima de 10 UI/L na fase folicular,
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
85
Discussão
poderiam indicar climatério. Portanto, os valores basais de LH sobrepuseram-se nos
estádios PM e M, diferentemente dos valores de FSH, que não mostraram sobreposição
entre os grupos PM e M, Com esses resultados, podemos afirmar que o melhor indicador
da menopausa é o FSH basal, o que já é consenso na literatura (WIDE & HOBSON, 1983,
RANCE & USWANDI, 1996).
O FSH tem sido considerado um biomarcador para descrever as fases reprodutivas
e a transição da menopausa (BURGER, 1994; SOWERS ET AL, 2008) por duas razões:
1
a
) o FSH estimula a foliculogênese, um evento essencial na dinâmica do envelhecimento
ovariano. Paralelamente ao declínio relativo à idade, na qualidade e quantidade dos
oócitos, ocorrem elevações progressivas nas concentrações de FSH na fase folicular em
mulheres com idade mais avançada, quando comparadas com as mais jovens, fato atribuído
à diminuição dos níveis de inibina-B (KLEN ET AL 2004); 2
a
) o aumento das
concentrações de FSH precede o declínio significativo na secreção de esteróide ovariano,
sobretudo do E
2
(KLEN ET AL 2004).
Na primeira etapa do climatério, ocorre um aumento lento e gradativo do FSH,
ainda com o LH normal. Tal etapa dura, provavelmente, 5 anos. Em uma segunda etapa,
ocorre aceleração no aumento das concentrações do FSH, coincidindo com a falta
frequente do recrutamento do folículo dominante e corpo lúteo, com posterior deterioração
no feedback do FSH com inibina-B e inibina-A (WELT ET AL, 2002). Essa fase, que pode
ser identificada como a perimenopausa tardia, dura, em média, 3 anos. Finalmente, numa
terceira etapa, não se observa mais variabilidade das concentrações do FSH, que estão
permanentemente elevadas, indicando que a foliculogênese não é mais um processo
fisiológicamente viável (WELT ET AL, 2002).
Segundo WELT ET AL, 2002 e KEIN ET AL, 2004, o aumento do FSH é atribuído ao
declínio do AMH e da inibina-B. No entanto, uma explicação definitiva da mudança aguda
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
86
Discussão
de FSH no período de 2 anos antes da menopausa, propriamente dita, não tem sido
entendida de forma satisfatória, apesar de existirem outras explicações possíveis: 1
a
) o
aumento agudo das concentrações de FSH pode estar relacionado a uma diminuição na
produção de inibina A pelo corpo lúteo (WELT ET AL, 2002; KEIN ET AL, 2004); 2
a
) a
perda da retrorregulação pode ser devida ao envelhecimento e desensibilização do eixo
hipotálamo-hipófise-ovário sem envolver outros hormônios ovarianos (HALL, 2004;
2007).
Não obstante a menopausa estar relacionada ao envelhecimento cronológico, existe
uma variabilidade individual em sua ocorrência e que se reflete no comportamento das
concentrações do FSH quando se considera a idade cronológica. Até a idade de 40 anos,
observa-se uma estabilidade nos níveis de FSH, sendo que, após isso, surge um crescente
aumento nos seus valores com comprometimento da qualidade oocitária, associada com
uma probabilidade crescente de subfertilidade e aborto espontâneo. Essa estabilidade é útil
para fornecer uma base, a fim de se avaliar a magnitude da taxa de variação de FSH nas
idades acima de 40 e, principalmente, acima de 45 anos, onde ocorre uma maior aceleração
na taxa de variação do FSH - o que pode ser o sinal de que a foliculogênese está cada vez
mais comprometida - (BURGER, 2008; SOWERS, 2008).
Estas alterações do FSH, com ou sem diminuição da E
2
, em mulheres com idade
acima de 40 anos que continuam a ciclar, podem ser abruptas com níveis tipicamente
sugestivos de pós-menopausa, posteriormente retornando aos valores normais do período
reprodutivo. Em um estudo transversal na comunidade de Melbourne, com mulheres acima
de 45 anos, 7% delas tinham níveis de FSH típico da pós-menopausa e 39% apresentaram
níveis acima daqueles encontrados durante a fase folicular em mulheres com idade inferior
a 35 anos. Devido a estes achados, o autor interroga se somente a dosagem do FSH, sem
análise clínica da paciente, pode definir a menopausa (BURGER, 1994).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
87
Discussão
Uma das dificuldades em caracterizar as alterações hormonais do climatério são as
flutuações significativas dos níveis hormonais entre os ciclos menstruais que ocorrem
durante esta fase. Isso pode explicar muitos resultados conflitantes em diversos estudos
(SHERMAN ET AL, 1976; ROSSMANITH ET AL, 1994; BURGER, 1994; REAME ET
AL, 1996; SANTORO ET AL, 1998).
Na presente pesquisa, a determinação dos níveis de FSH, LH e E
2
, e dos valores de
referências nas várias faixas etárias em condição basal podem auxiliar na interpretação de
situações clínicas prováveis à viabilidade reprodutiva e durante a menopausa.
Alguns autores demonstraram que o climatério precoce é caracterizado por um
aumento monotrópico de FSH, ou seja, haveria um aumento inicial das concentrações do
FSH, com LH ainda normal antes da menopausa (SHERMAN ET AL, 1976; BURGER,
1994, 2008). Em contrapartida, outros estudos fazem referencia ao aumento das
concentrações de LH, associadas ao FSH durante a perimenopausa (SANTORO ET AL,
1998; SOWERS, 2008). A elevação do LH estaria associada à diminuição dos receptores
de LH do ovário (VIHKO ET AL, 1996). A fim de melhor caracterizar estes resultados
contraditórios, REAME, em 1996, realizou um estudo envolvendo um protocolo de
amostragem intensiva em que foram colhidas amostras a cada 10 minutos, durante 8 horas,
na fase folicular tardia, lútea e lútea tardia em mulheres na perimenopausa, com idades
entre 40 e 50 anos. Os autores demonstraram que, além da elevação no FSH, havia
aumento nas concentrações e amplitudes do LH (REAME ET AL, 1996).
Os mecanismos que regulam as alterações hormonais do climatério não são bem
compreendidos. As mudanças que ocorrem durante a perimenopausa podem ser mais
complexas do que apenas a falência ovariana, ou seja, o aumento da atresia folicular
ovariana pode ser o resultado de mudanças em nível neuroendócrino ou central (REAME
ET AL, 1996).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
88
Discussão
Burger demonstrou que as mulheres, na perimenopausa, têm pulsos alterados de LH
(BURGER, 1994). Foram estudadas oito mulheres na perimenopausa (idade 45-50) e um
grupo-controle de nove mulheres jovens (idades 25-33) com ciclos menstruais regulares.
Na fase folicular, após coleta de LH e FSH basais, administrava-se 4 mg de solução oleosa
de E
2
intramuscular. O soro foi obtido a cada 12 horas durante 4 dias e foi avaliado E
2
,
progesterona, LH e FSH. Os níveis basais de estrogênio, progesterona e LH foram
semelhantes entre os dois grupos. Os níveis basais de FSH foram marcadamente elevados
nas mulheres na perimenopausa (16,3 ± 3,48 mUI/ml) e superiores aos dos controles (5,17
± 0,62 mUI / ml). Os níveis de E
2
foram semelhantes nos dois grupos. Todas as mulheres
apresentaram uma diminuição inicial do LH e FSH em resposta ao E2. O pico de LH
ocorreu em somente uma das oito mulheres na perimenopausa. Estes dados demonstraram
que o mecanismo central do pico de LH é alterado em mulheres na perimenopausa.
Embora esteroides basais e os níveis de LH ao estímulo com E
2
sejam os mesmos, as
mulheres mais velhas não responderam ao estímulo. Demonstrou-se que as alterações na
perimenopausa envolvem outros mecanismos além de hipofunção ovariana. Este estudo
sugere que as alterações hormonais nas mulheres na perimenopausa podem ocorrer devido
à diminuição da sensibilidade ao estrogênio. Curiosamente, a alteração da sensibilidade do
sistema nervoso central para a secreção de LH pelo estrogênio ocorre também durante a
puberdade (BURGER, 1994; REAME ET AL, 1996; SOWERS, 2008).
5.2 Da determinação dos valores estimulados (pico) pelo GnRH
Habitualmente, os valores estimulados de LH e FSH não são empregados no
diagnóstico de climatério ou menopausa.
A avaliação da resposta do FSH e LH, após estímulo no período de menopausa em que
existe simulação fisiológica do hipogonadismo hipergonadotrófico, serviu como modelo
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
89
Discussão
espontâneo de investigação de hiperresposta hipofisária, que poderia ser inferido em
condições semelhantes como, por exemplo, na Síndrome de Turner ou no diagnóstico
precoce de insuficiência ovariana, em que as concentrações basais de gonadotrofinas ainda
não se elevaram acima dos valores de corte em pacientes ainda assintomáticas ou que
apresentam sintomas inespecíficos, prenunciando o climatério, ou seja, na insuficiência
ovariana subclínica.
A determinação dos valores de referência (pico e delta) de LH e FSH nos grupos A e
B, por outro lado, tiveram a finalidade de estabelecer os níveis de normalidade destas
concentrações na faixa etária de ciclos regulares e compará-los com os valores dos grupos
C, D+E, quando a menopausa já é um evento normalmente aguardado.
Utilizamos para análise estatística apenas o valor de pico, devido a uma maior
sobreposição dos valores de delta entre os grupos. Os valores de pico do grupo de mulheres
menopausadas (D+E) e pré-menopausadas (A, B e C), foram comparados ao percentil 5%
dos primeiros, versus o percentil 95% dos últimos, pretendendo verificar a mínima
resposta, após a menopausa, versus a máxima resposta, durante o período reprodutivo
normal.
Analisando as concentrações de pico de FSH e LH, não se observou sobreposição
entre os grupos de menopausadas (D+E) com os grupos A e B e pequena sobreposição (3
em 11 mulheres) com o grupo C. Portanto as concentrações estimuladas também refletem
as diferenças entre os grupos nas diferentes faixas etárias e com menor sobreposição do
que a observada entre os valores basais..
Os valores de FSH e LH no grupo C, onde se encontram a maioria das mulheres em
transição entre normalidade e climatério, foram significantemente diferentes dos grupos A
e B, indicando resposta maior do que o normal e ainda inferior ao grupo em que o
climatério é claro (D+E) (Tabela 7).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
90
Discussão
Mesmo após o teste de estímulo com GnRH, ocorreu sobreposição dos valores de LH
e FSH. O valor de corte, no percentil 95% do grupo PM para o pico de resposta que separa
mulheres adultas de mulheres menopausadas, foi de 65,2 para o FSH e 65,3 para o LH.
A curva ROC foi então aplicada para obter valores de referência de maior
especificidade e sensibilidade. O valor de corte de pico, ou seja, hiperresposta definido
pela curva ROC para o FSH, foi de 46UI/L e para o LH foi de 50 UI/L. Tal dado,
utilizando o método ICMA, é inédito e não pode ser comparado com a literatura.
O tempo em que ocorreu o pico tanto do FSH quanto do LH foi aos 30 minutos, como
esperado, apresentando diferença estatística (p<0,05) com os demais tempos, dados estes,
coincidentes com a literatura referente à testes de GnRH, realizados em período de
menacme ou pré-púbere (LIBONATI ET AL., 1986, PESCOVITZ ET AL., 1988,
CAVALLO ET AL., 1995, NEELY ET AL.,1995, BORGES ET AL., 1998, BRITO ET
AL, 1998, DAMIANE, 2002). Tais resultados, sugerem a redução dos tempos de coleta
para dosagens do LH e FSH após GnRH, sendo suficientes os tempos basal e 30 minutos
após estímulo, o que resultaria em racionalização de tempo e de recursos financeiros.
5.3 Da determinação dos valores E
2
A determinação laboratorial dos esteroides gonadais foi, por muitos anos, realizada
pelo método RIE (ABRAHAM, 1974) que apresenta sensibilidade variável e coeficientes
de variação inter e intraensaios elevadas, ensejando necessidade de padronizar novos
métodos de dosagens hormonais. A partir da década de 80, as dosagens de E
2
começaram a
ser feitas pelos métodos IFME e ICMA, que vêm evoluindo, principalmente nos últimos 5
anos e tornando-se cada vez mais sensíveis e específicos com a utilização de anticorpos
monoclonais (KINGLER ET AL, 1987, APTER ET AL., 1989, JANSIN ET AL., 1989,
ALBERTSON, 1990, MELTOLA,1999, MORLEY ET AL., 2002, HERSHLAG ET AL.,
2000, ENGLAND ET AL., 2002).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
91
Discussão
Neste estudo, o valor de corte estabelecido por meio da curva ROC para o E
2
em
mulheres normais foi de 35 pg/mL permitindo a separação do grupo PM com o grupo M na
fase folicular. No entanto, uma sobreposição considerável ainda foi observada entre os dois
grupos.
Tais dados demonstram que, isoladamente, as dosagens do E
2
não podem ser utilizadas
para diagnosticar menopausa, em concordância com a literatura. Durante a menopausa, o
E
2
ovariano e secreções de progesterona são instáveis. Contudo, as células do estroma
ovariano, bem como as células adrenais, têm uma capacidade esteroidogênica para a
produção de androstenediona, a qual é convertida pela pele e tecido adiposo em estrona
(HALE ET AL, 2009). O elemento tecidual primário da esteroidogênese do ovário, após a
menopausa é o estroma, que frequentemente contém ilhas de células da teca e pode ter a
aparência de uma hiperplasia bilateral generalizada da teca. Os esteroides secretados por
estas células do ovário após a menopausa, em resposta ao estímulo da alta concentração de
LH, são principalmente androgênios (androstenediona, testosterona), mas pequenas
quantidades de E2 também podem ser produzidas. Em estudos in vitro, o estroma
hiperplásico, quando estimulado, produz E
2
(JUDD ET AL, 1982). Após a menopausa, o
nível circulante de androstenediona chega à metade do observado antes da menopausa. No
entanto, a maior parte de androstenediona é derivada da glândula supra-renal, com apenas
uma pequena quantidade secretada pelo ovário (JUDD ET AL, 1982; HALE ET AL,
2009).
A taxa de conversão da androstenediona em estrona é significativamente
correlacionada com a obesidade, sendo a conversão periférica feita principalmente no
tecido adiposo e subcutâneo (SHERMAN ET AL, 1976; MELDRUM ET AL, 1981; JUDD
ET AL, 1982; HALE ET AL, 2009)).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
92
Discussão
No presente estudo, observamos correlação entre concentrações de E
2
e índice de
massa corporal (IMC), tanto no grupo PM como no grupo M, indicando que o tecido
adiposo exerce um papel importante na conversão periférica da maioria dos esteroides em
E
2
.
Acredita-se que a perimenopausa é uma época de deficiência de E
2
e que se deve a um
esgotamento dos folículos ovarianos (SHERMAN ET AL, 1976). No entanto, estudos mais
recentes têm questionado este pensamento (LEE ET AL, 1988; BURGER, 1994, 2000;
SOWERS ET AL, 2008; HALE ET AL, 2009). Investigação do padrão de secreção de
estrogênio durante a perimenopausa foi conduzida por SANTORO ET AL, em 1998. Em
sua pesquisa, o grupo perimenopausal consistiu em dois subgrupos de mulheres: o
primeiro, com seis mulheres com ciclos regulares e idade média de 47 anos de idade, o
segundo composto por cinco mulheres, com idades entre 43 - 47 anos, que se submeteram
às dosagens hormonais urinárias durante um ciclo menstrual. Os níveis hormonais nesses
dois grupos foram comparados com outros três grupos diferentes de mulheres: um 1º
grupo controle, com 11 mulheres ciclando normalmente (19-38 anos); um 2º grupo com.
cinco mulheres com 40 anos de idade, com insuficiência ovariana prematura; e um 3º
grupo contendo cinco mulheres menopausadas,, com idades entre 54 a 79 anos. O estudo
durou seis meses, permitindo avaliar as flutuações nos níveis hormonais, característica da
perimenopausa. Os resultados demonstraram que os níveis de estrogênio eram elevados
durante as fases folicular e lútea na perimenopausa. A hiperestrogenemia, durante este
período, sugere que apesar da redução na quantidade e qualidade do estroma ovariano que
antecedem a menopausa, nessa fase os ovários ainda mantêm a capacidade de produzir
estrogênio suficiente (SANTORO ET AL, 1998). Os dados contradizem a teoria de que as
mudanças hormonais do climatério ocorrem devido a uma deficiência da função ovariana
(SHERMAN ET AL, 1976; HALE ET AL, 2009). Outro estudo, também longitudinal,
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
93
Discussão
demonstra que o declínio da inibina B leva a um aumento do FSH, que pode manter e até
aumentar a produção de E
2
por alguns anos. O início da irregularidade menstrual após
ciclos anteriormente regulares, marca o início da transição da menopausa, quando há um
declínio significativo na inibina B com manutenção do E
2
. Com o decorrer do climatério
ocorre declínio dos níveis de E
2
e aumento do FSH. Contudo, suas concentrações variam
consideravelmente. O estudo ainda demonstrou que, ao término dos ciclos, os níveis de E
2
são, em média, 50% menores que das mulheres em idade reprodutiva; e o FSH aumenta
cerca de 50% das concentrações do menacme na pós-menopausa. O declínio nos níveis de
E
2
nos 3 a 4 anos que antecedem a última menstruação, resulta em sintomas da menopausa
e perda óssea (BURGER, 2006).
A flutuação na concentração de estrógenos durante a perimenopausa pode ser a causa
maior da incidência de patologias ginecológicas nesta fase, tais como: crescimento dos
miomas uterinos, hiperplasia endometrial, aumento da ocorrência de sangramento uterino
disfuncional e a progressão dos sintomas de endometriose que ocorrem durante a
perimenopausa. Além disso, as elevações de E
2
circulante não parecem ter um efeito
inibitório eficiente sobre a secreção de LH e FSH, ou seja, a perimenopausa é um estado de
hipergonadotropinemia e hiperestrogenemia. Não obstante, as concentrações elevadas de
E
2
durante a perimenopausa, em relação à menopausa, fazem com que as mulheres se
refiram aos sintomas que prenunciam o climatério (USHIROYAMAET AL, 1999). Assim,
o início dos sintomas não pode ser atribuído somente à deficiência de estrogênio. É mais
provável que os sintomas estejam relacionados com a instabilidade das concentrações
circulantes de estrogênio (USHIROYAMA ET AL, 1999: HALE ET AL, 2009).
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
94
95
CONCLUSÕES
Conclusões
Os resultados obtidos neste estudo nos permitiram concluir que:
1. O valor de corte (cut-off) das gonadotrofinas para diagnóstico laboratorial de
menopausa, em condição basal, utilizando-se o método ICMA, é de 15 UI/L para o
FSH e de 10 UI/L para o LH.
2. O FSH é o hormônio marcador da menopausa, confirmado pela ausência de
sobreposição de seus valores entre os grupos de mulheres pré-menopausadas e
menopausadas.
3. As mulheres até 40 anos apresentaram valores no limite superior para o FSH
(percentil 95%) de 6,9UI/L e aquelas entre 40 e 45 anos, apresentaram valores de
8,2 UI/L.
4. Valores intermediários de FSH, entre 6,9 e 14,9 UI/L, em mulheres abaixo de 45
anos, quando associados a sintomas, podem prenunciar a síndrome do climatério.
5. No teste de estímulo com o GnRH o valor de corte de pico para o FSH foi de
46UI/L e para o LH foi de 50 UI/L.
6. As concentrações de pico de FSH e LH, do grupo de mulheres menopausadas não
se sobrepuseram com as pré-menopausadas, permitindo sua utilização para o
diagnóstico precoce de insuficiência ovariana subclínica, quando as concentrações
basais de FSH ainda se apresentarem normais.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
96
Conclusões
7. O valor de corte de Estradiol entre os grupos de mulheres pré-menopausadas e
menopausadas foi de 35 pg/mL. Entretanto, houve uma considerável sobreposição
deste valor entre os diversos grupos do estudo, provando que a sua dosagem
isoladamente não faz diagnóstico de menopausa.
8. O pico de resposta das gonodotrofinas pós GnRH, ocorreu sempre no tempo 30
minutos do teste, sugerindo que somente os tempos zero e 30 minutos após
estímulo são suficientes para a avaliar o eixo hipotálamo-hipófise-gonadal.
.
Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
97
98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
99
Referências Bibliográficas
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Elisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
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ANEXOS
Anexos
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título do Projeto: Avaliação dos valores de LH e FSH no diagnóstico de menopausa em mulheres
normais
TERMO DE ESCLARECIMENTO
Você está sendo convidada a participar do estudo: Avaliação dos valores de LH e FSH no diagnóstico de
menopausa em mulheres normais. Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por
isso a sua participação é importante. O objetivo deste estudo é pesquisar qual é o valor dos hormônios, que
indicam a menopausa, para tratamento mais precoce e melhora da qualidade de vida e caso você participe,
será necessário fazer uma consulta médica e coleta de sangue, para verificarmos e confirmarmos a
menopausa. Será uma coleta de sangue simples e não lhe traz qualquer desconforto ou risco à sua vida. Você
poderá ter algum desconforto quando receber uma picada para colher o sangue do seu braço.
Você poderá obter todas as informações que quiser e poderá não participar da pesquisa ou retirar seu
consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento. Pela sua participação no estudo, você
não receberá qualquer valor em dinheiro, mas terá a garantia de que todas as despesas necessárias para a
realização da pesquisa não serão de sua responsabilidade. Seu nome não aparecerá em qualquer momento do
estudo, pois você será identificado com um número.
lisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
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Anexos
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Título do Projeto: Avaliação dos valores de LH e FSH no diagnóstico de menopausa
em mulheres normais
Eu, __________________________________________________, li e/ou ouvi o
esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a que
serei submetido. A explicação que recebi esclarece os riscos e benefícios do estudo. Eu
entendi que sou livre para interromper minha participação a qualquer momento, sem
justificar minha decisão e que isso não afetará meu tratamento. Sei que meu nome não será
divulgado, que não terei despesas e não receberei dinheiro por participar do estudo. Eu
concordo em participar do estudo.
Uberaba, ............./ ................../................
__________________________________________ _______________________
Assinatura do voluntário ou seu responsável legal Documento de identidade
______________________________ _________________________________
Assinatura do pesquisador responsável Assinatura do pesquisador orientador
Telefone de contato dos pesquisadores: (PREENCHIMENTO OBRIGATÓRIO :
_________________________________________________________________________
Em caso de dúvida em relação a esse documento, você pode entrar em contato com o
Comitê Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, pelo telefone
3318-5854.
lisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
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Anexos
Pacientes de 20 a 39 anos
N PACIENTE IDADE PESO ALT. IMC COR PARIDADE
FSH
UI/L
LU
UI/L
E2
Pg/dL
1 MRO 28 57 162 21.7 N G0P0 1.6 1.8 107
2 TCP 22 56.4 159.3 22.2 B G0P0 6 4.2 44.8
3 PNC 22 68 158.4 27.1 N G0P0 3.2 2.8 122
4 PLG 28 59.5 160 23.2 B G0P0 5.6 6.4 91.8
5 JLSF 20 56 160.5 21.7 B G0P0 2.4 4.8 81
6 TFO 22 67.4 165 24.7 N G0P0 2.1 3.1 123
7 AAG 25 64 160 25 B G0P0 3.6 2.3 112
8 LCS 24 67.2 158.3 26.8 B G0P0 4.9 2.5 46.3
9 RNF 23 49 153 20.9 B G0P0 6.7 4.5 47
10 KCM 25 54 164 20 B G0P0 2.4 1.9 42
11 PT 23 59 168 21 B G0P0 5.9 6.5 63.5
12 IBF 28 60 152 25.9 N G0P0 2.3 2.9 108
13 ACL 26 52 155 21.6 N G0P0 6.5 5 43.6
14 CLL 26 60.5 163 22.7 N G0P0 1.4 1.7 79.4
15 LMV 22 60 168 21.2 B G0P0 5.3 3.5 53.2
16 FRF 26 49 152 21.2 B G0P0 3.2 3.1 80.1
17 LMF 26 56 165 20.5 B G0P0 4.3 3.3 78.9
18 CAC 20 58 165 21.3 N G0P0 3.4 2.8 34.7
19 KMA 21 50.7 154 21.3 B G0P0 2.8 2.6 32.1
20 TMO 24 53 152 22.9 B G0P0 1.8 2.4 56
21 JFR 24 54 162.6 20.4 B G0P0 6.5 4.9 97
22 PPS 21 54 155 22.4 B G0P0 3.8 3.6 38
23 GMF 20 56 153 23.9 N G0P0 5.7 3.8 38.7
24 PCOMC 24 58.6 161 22.6 B G0P0 3.8 5.9 89
25 AAC 25 48 153 20.5 N G0P0 2.8 2.7 78
26 APO 23 53 159 20.9 N G0P0 3.1 4.5 65.3
27 PCR 24 50 162 19 B G0P0 2.6 3.2 75.3
28 ACA 25 58.6 169 20.5 B G0P0 2.3 2.5 68.2
29 EGPC 32 82 165 30.1 N G4P4N4 3.2 2.1 93.2
30 OMP 38 67 158 26.8 B G2P2N2 3.38 2.35 75.3
31 PC 37 59 162 22.4 B G2P2C2 5.91 3.06 42.3
32 MIS 38 72 157 28.4 B G4P4N1C3 5.26 1.77 58.9
33 AVP 37 49 151 21.4 B G3P1C1A2 2.61 2.24 53.2
34 TMAS 38 65 153 27.7 N G0P0 4.97 1.11 74.2
35 SACO 36 60 156 24.6 B G1P1C1 5.47 2.99 78.5
36 RMC 38 61 164 22.6 B G0P0 4.99 3.21 49.6
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38 EAG 37 54 152 23.3 B G0P0 6.84 4.35 54.2
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41 MLV 37 60 156 24.6 B G4P3N1C2A1 2.12 2.11 44.2
42 EAA 37 62 158 24.8 B G3P3C3 3.29 2.23 35.8
43 AMJC 38 78 1.62 29.7 B G3P3N3 1.75 1.46 39.6
44 SGS 36 76.3 165 27.9 B G4P4C4 4.23 3.36 32.6
45 KAD 37 53 157 21.5 B G1P1N1 3.27 2.36 36.8
46 MSA 38 56 165 23 B G2P2C2 6.3 3.52 52.4
47 NCPG 39 67.5 159 26.7 N G4P4N3C1 5.24 2.73 51.3
48 RGL 36 82 167 29.4 B G1P0A1 6 4.25 65
lisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
117
Anexos
49 GCP 37 65 159 25.7 B G3P2C2A1 4.43 3.21 42.6
50 ZOS 35 69 158 27.6 B G1P0A1 4.43 3.32 33.2
51 RFC 38 72 162 27.4 B G1P1N1 2.14 1.95 42.8
52 TCR 39 54 150 24 B G1P0A1 4.92 3.21 32.1
53 SPA 35 61 164 22.6 B G0P0A0 2.04 1.57 46.2
54 OAC 39 84 165 30.8 B G1P1N1 7.8 3.84 67.3
55 ZFB 39 61 160 23.8 B G2P2C2 2.65 1.98 56.2
56 VCCA 39 64 158 25.6 B G1P1N1 14.5 9.4 32.7
57 AMD 37 56 161 21.6 B G0P0 6.94 4.31 37.5
58 APBS 36 75 166 27.2 B G2P2N2 5.78 2.21 42.9
59 EO 35 88 174 29 B G2P2N2 4.46 3.02 32.8
60 RFR 38 58.9 155 24.5 B G0P0A0 3.3 2.43 48.5
61 LOM 37 62 159 24.5 B G3P3N3 4.25 3.75 42.7
lisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
118
Anexos
Pacientes entre 40 e 45 anos
N PACIENTE IDADE PESO ALT. IMC COR PARIDADE
FSH
UI/L
LU
UI/L
E
2
Pg/dL
62 DAS 43 64.9 159 25.7 B G2P2N2A0 6.03 4.5 45.3
63 ODAC 43 67.3 161 26 B G3P2C2A1 1.72 2.1 57
64 ATA 45 68.4 161.2 26.3 N G2P1C1A1 7.8 5.3 69.1
65 MDAS 42 62.3 158.5 24.8 B G2P2C2 5.61 4.52 55
66 MTSS 41 52.8 154.2 22.2 B G3P3C3 2.05 3.2 44.3
67 VSST 41 64.3 161.3 24.7 B G4P3N2C1A1 5.8 4.5 45.2
68 EADS 41 48.5 152.3 20.9 B G1P1C1 3.77 2.5 55.3
69 MHRS 42 57 158.5 22.6 B G0P0 5.01 4.5 53.4
70 HVP 45 62.5 158 25 B G1P1N1 4.22 4.6 53.2
71 ILOM 42 54 152 23.4 B G3P3N1C2 3.33 2.54 56.1
72 GAMD 45 58 162 22.1 B G5P3C3A2 7.4 4.3 53.7
73 IRSB 43 62 165 22.7 B G2P2N1C1 2.07 3.4 64.3
74 TMC 45 74 164 27.5 B G2P2C2 6.16 5.2 107
75 OMF 43 61.3 151 26.8 B G5P2N2A3 2.56 3.5 68.4
76 MDIA 44 58 161 22.3 N G3P3C3 4.3 3.8 74.3
77 IACP 45 74 173 24.7 B G4P3N2C1A1 1.21 2.1 103.4
78 EGO 44 56 157 22.7 B G3P3N2C1 5.02 4.9 76
79 GAS 42 58 162 22.1 B G2P2N1C1 3.88 4.2 68.3
80 MP 42 66 159 26.1 B G2P2C2 2.47 3.1 54.7
81 MRAL 44 72.5 165 26.6 B G2P2N2 4.47 4.7 69.3
82 MCGS 40 74 168 26.2 B G0P0 4.57 3.4 65.3
83 RMRRS 42 72 164 26.7 B G3P2A1 5.01 3.9 79.8
84 CMS 43 72 167.5 25.7 N G2P2N2 4.88 4.4 69.7
85 CFV 43 66.3 163.5 24.8 B G1PIC1 3.41 3.2 67.8
86 EAE 43 57.6 164 21.4 B G2P2C2 2.67 1.03 59.9
87 RMO 42 71 168 25.1 B G2P2C2 3.96 1.04 84.3
88 LJMC 42 56.7 164
21.0
8 B G2P2C2 4.56 5.21 39.7
89 IRG 41 45.3 150 20.1 B G0P0 2.85 1.93 42.9
90 ACAR 42 78 1.59 30.8 B G2P2C2 5.16 3.03 61.9
91 MRR 45 65 157.5 26.2 B G2P2N2 4.24 3.56 76
92 AMCP 45 64 158 25.6 B G2P2N2 2.27 1.89 65.8
93 APR 44 62 155 25.8 B G1P1C1 2.59 3.2 65.2
94 RHBM 43 56.2 158 22.5 B G4P3C3A1 2.57 1.08 36.1
95 IMM 43 65 167 23.2 N G4P4N4 3.48 2.56 42.1
96 ZART 44 58 162 22.1 B G2P2N2 4.33 3.76 58.9
97 NCG 41 64 153 27.3 N G1P1C1 5.95 3.8 63.9
98 TABF 44 67 154 28.2 B G3P3N2C1 5.02 2.64 65.3
99 RAMC 40 52 156 21.3 B G2P2C2 1.94 2.4 53.8
100 GEAS 41 59 156 24.2 B G2P2N2 5.26 5.63 56.9
101 MLSD 42 58 161 22.4 B G0P0 1.96 1.34 39.7
102 SASA 45 77 159 30.4 B G1P1N1 3.52 2.15 73.2
103 EGP 44 54 165 19.8 B G1P1C1 2.54 2.3 32.6
104 RCRF 44 48.1 150 21.4 B G0P0 5.98 3.17 35.9
105 MCEPS 44 65.4 158 26.2 B G2P2C2 5.91 3.04 54.9
106 OMJG 40 74 163 27.8 B G5P4N4A1 2.41 4.88 53.2
107 LSP 41 72 159 28.4 N G3P3N2C1 13.2 5.48 43.2
108 LASO 43 73 168 25.8 B G5P3N3A2 2.07 2.67 52.9
109 MSCAD 44 68 169 23.8 B G5P4N3C1A1 5.91 3.89 47.6
110 AMA 44 62 162 23.6 B G1P0A1 3.80 2.78 36.9
lisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
119
Anexos
111 CBB 45 55.1 160 21.5 B G0P0 5.77 3.65 63.2
112 EC 41 68 165 24.9 B G2P2C2 3.59 2.45 46.9
113 MHBO 40 59 152 25.5 N G3P3N3 5.21 3.6 53.9
114 MAOF 44 64 165 23.5 B G1P1C1 8.92 2.19 52.9
115 SFR 43 64 165 23.5 N G2P2C2 2.41 1.35 62.7
116 SMLS 40 74 168 26.2 N G0P0 2.29 1.54 63.2
117 MLS 41 65.4 161 25.2 B G1P1C1 6.23 2.36 48.6
118 VNSD 45 66 153 28.2 B G4P4N4 6.05 1.85 65.9
119 TRRS 42 65 157 26.3 B G1P1C1 3.34 2.46 53.5
120 AMMP 41 77.9 160 30.4 B G2P1C1A1 3.54 3.02 122.4
121 EGO 44 60.5 158 24.2 B G3P3N2C1 5.02 4.5 42.1
122 LSS 43 54.4 156 22.3 B G2P2N1C1 3.25 2.73 51.5
123 CMSMG 44 76 165 27.9 B G2P2C2 4.22 2.73 49.5
124 LMC 40 57 159 22.5 B G0P0 3.82 2.59 43.2
125 CEP 40 66 160 25.7 B G1P1N1 7.16 6.48 47.1
126 IRA 45 56 150 24.8 B G4P3C3A1 6.3 3.38 42.9
127 EC 43 52 156 21.3 B G1P1C1 5.43 3.42 43.9
128 MLMS 45 86 172 29 B G2P2N1C1 4.06 3.24 68.4
129 RFS 45 68 163 25.5 B G1P1C1 5.87 3.57 39.6
130 SAS 40 67 163 25.2 B G0P0 5.45 4.89 34.9
131 CCS 44 54 156 22.1 B G2P2C2 6.54 4.36 32.8
132 MARS 42 57 161 21.9 B G2P2N2 3.93 2.16 47.2
133 MFR 44 49.5 152 21.4 B G0P0 4.2 3.6 54.3
134 EMB 40 68 163 25.5 B G2P2C2 6.2 3.9 39.8
135 AVD 44 69.1 165 25.4 B G3P3N2C1 5.7 4.33 43.7
136 LMN 40 72 165 26.4 B G3P3N3 3.8 2.56 38.3
137 MSCS 45 63 160 24.6 N G2P1N1A1 9.3 5.4 45.6
138 MLM 44 58 156 23.8 B G2P2C2 4.43 2.82 44.3
139 GAAM 45 56 150 24.8 B G2P1C1 9.52 6.38 31.8
140 CRJ 45 76 164 28.2 B G2P2N2 5.78 4.65 46.4
141 CEPS 45 62.9 162 23.9 B G0P0 4.94 2.79 98.6
142 HAS 40 58 158 23.2 N G2P2N2 3.53 2.67 43.6
143 ADE 44 61.5 156 25.2 B G2P2C2 6.21 5.67 56.4
144 AAS 42 64 159 25.3 B G2P2C2 4.76 3.42 53.6
145 TAHE 41 66.2 158 26.5 B G3P2C2A1 4.21 2.48 55.6
146 MVR 45 86 168 30.4 B G1P1C1 5.6 3.4 75.3
147 NM 41 66 159 26.1 B G3P3N2C1 3.54 1.16 49.8
148 LFP 43 67 158 26.8 B G0P0 6.55 3.15 54.6
149 AHBR 42 69 1.66 25 B G3P2C2A1 5.26 3.96 44.7
150 SVS 40 57 161 21.9 B G3P2C2A1 5.23 3.64 58.9
151 LBF 44 57 163 21.4 B G1P1C1 5.71 2.36 63.2
152 LAP 42 74.3 160.6 29 B G1P1C1 4.23 1.21 28.1
153 LAGS 41 69.4 157 28.1 B G0P0 4.24 2.05 53.8
154 MEAS 43 67 153 28.6 B G0P0 7.63 3.64 58.9
155 LMA 45 72 157 29.2 B G4P4C4 2.6 1.56 85.2
156 CAS 42 56 158 22.4 B G1P1C1 2.13 1.78 44.9
157 DAV 44 65 159 25.7 B G2P2C2 6.1 3.67 56.6
158 VMS 44 71 164 26.3 B G3P3C3 8.15 2.28 65.3
159 AMST 45 66 159 26.1 B G3P3C3 4.21 2.69 46.2
160 GCPB 41 74.5 160 29.1 B G4P3N3A1 5.69 2.07 53.8
161 BMS 40 57 162 21.8 B G5P2C2A3 7.89 4.67 35.9
162 COS 44 60 158 24 B G4P4N4 8.43 3.84 29.5
lisabete Aparecida Mantovani Rodrigues de Resende
120
Anexos
163 SPA 43 63 157 25.5 B G0P0A0 5.85 3.6 24.2
164 EAMRR 44 56 167 20 B G2P2C2 4 4.57 121
165 MJA 40 73.4 159 29 B G2P2C2 2.39 2.15 30.6
166 GSA 40 63.8 153 27.2 B G1P1N1 7.65 4.39 50.3
167 LRF 41 51.4 151 22.5 B G2P2C2 5.37 3.28 42.9
168 ADT 45 57 161 21.9 N G0P0 3.6 2.5 64.6
169 RCCM 44 71 173 23.7 B G3P3N3 9.5 8.6 45.3
170 MNE 40 68 157 27.5 B G0P0 3.2 3 104
171 NJU 43 71 163 26.7 B G2P2C2 5.3 4.2 97
172 MGCR 41 67.5 159 26.6 B G2P2C2 2.8 2 88.5
173 NAG 45 55.3 154 23.3 N G3P3N3 5.8 4.1 74.9
174 ACP 40 59 157 23.9 N G2P2C2 3.2 3 107
175 FFL 42 68.3 160 26.6 B G5P5N3C2 5.2 3.8 77.9
176 MART 41 65.4 159 25.8 B G0P0 1.9 1.6 94.3
.
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