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URI - CAMPUS DE ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
COMPORTAMENTO DA ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO DE
LIPASES NÃO COMERCIAIS EM PROPANO PRESSURIZADO
GRACIELE DE OLIVEIRA KUHN
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa
de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos da
URI-Campus de Erechim, como requisito parcial à
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de
Alimentos, Área de Concentração: Engenharia de
Alimentos, da Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e das Missões – URI, Campus de
Erechim.
ERECHIM, RS – BRASIL
AGOSTO 2010
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I
COMPORTAMENTO DA ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO DE
LIPASES NÃO COMERCIAIS EM PROPANO PRESSURIZADO
Graciele de Oliveira Kuhn
Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de
Pós-graduação em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos
necessários à obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área
de Concentração: Engenharia de Alimentos.
Comissão Julgadora:
____________________________________
Débora de Oliveira, D. Sc.
(Orientadora)
____________________________________
José Vladimir de Oliveira, D. Sc.
(Orientador)
____________________________________
Márcio Mazutti, D. Sc.
URI – Campus de Erechim
____________________________________
Camila da Silva, D. Sc.
UEM – Umuarama
Erechim, Agosto de 2010.
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II
NESTA PÁGINA DEVERÁ SER INCLUÍDA A FICHA CATALOGRÁFICA DA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. ESTA FICHA SERÁ ELABORADA DE
ACORDO COM OS PADRÕES DEFINIDOS PELO SETOR DE PROCESSOS
TÉCNICOS DA BIBLIOTECA DA URI – CAMPUS DE ERECHIM.
III
“...todos querem viver no topo da montanha,
mas toda felicidade e crescimento ocorre
quando você está escalando-a.”
William Shakespeare
IV
Agradecimentos
Muitas pessoas passaram pelo meu caminho, algumas eu agradeço de
coração, e devo minha amizade, carinho, admiração e respeito.
Agradeço a Deus, por tudo!
Aos meus pais Clóvis e Terezinha, e meu irmão Rodrigo, pois sem
dúvida são as pessoas mais importantes da minha vida e sem eles eu não
seria nada.
Ao meu amor Thiago, pelo carinho, compreensão e alegria que me traz.
A todos meus familiares que independente de onde eu esteja estão
sempre torcendo por mim, em especial a “Tia Gisa”, tia e amiga querida que
me incentivou a trilhar este caminho.
Aos meus orientadores queridos Débora e Vladimir por todo o
conhecimento que me foi passado, pelo compromisso e dedicação, e por
contribuírem tanto ao meu crescimento profissional e pessoal. Obrigada pela
amizade e carinho.
A todos os professores que colaboraram para a minha formação, por
toda a informação transmitida, em especial a Helen que participou de todos os
momentos, contribuindo com sua experiência e também amizade. Também ao
Márcio pela amizade e auxílio na resolução dos problemas operacionais
ocorridos durante a parte experimental.
A minha querida amiga e colaboradora Preta e também ao André pela
ajuda e dedicação que desempenharam neste trabalho.
A todos os colegas do mestrado, pela amizade e convivência durante
estes dois anos e meio. Aos amigos feitos no Laboratório de Termodinâmica e
de Biotecnologia.
A Claudinha, amiga, confidente e companheira de todas as horas.
Enfim, a todas estas pessoas maravilhosas que tornaram meus dias
mais felizes e fazem a vida valer à pena! Obrigada, as levarei comigo na
lembrança.
V
SUMÁRIO
ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................ VII
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................ VIII
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 6
2.1 ENZIMAS .......................................................................................................... 6
2.1.1 Lipases ...................................................................................................... 8
2.1.2 Aplicação de lipases ................................................................................ 10
2.1.3 Atividade enzimática ................................................................................ 12
2.1.4 Imobilização de lipases ............................................................................ 13
2.2 FLUIDOS
PRESSURIZADOS ......................................................................... 15
2.3 PARÂMETROS
QUE
INFLUENCIAM
NA
ATIVIDADE
ENZIMÁTICA ............... 17
2.3.1 Água ........................................................................................................ 18
2.3.2 Solvente .................................................................................................. 19
2.3.3 Temperatura ............................................................................................ 22
2.3.4 Pressão ................................................................................................... 23
2.4 CONSIDERAÇÕES
FINAIS ............................................................................. 24
3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 25
3.1 MATERIAIS ..................................................................................................... 25
3.1.1 Reagentes ............................................................................................... 25
3.1.2 Enzimas................................................................................................... 25
3.2 EQUIPAMENTOS
E
METODOLOGIA ............................................................. 27
3.2.1 Determinação da atividade enzimática de lipases ................................... 27
3.2.2 Tratamento das enzimas em propano pressurizado ................................ 29
3.2.3 Caracterização dos catalisadores ............................................................ 32
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................... 33
4.1 ATIVIDADE
DE
ESTERIFICAÇÃO
DA
LIPASE
DE
ASPERGILLUS
PARASITICUS
EM
PROPANO
PRESSURIZADO ........................................... 33
4.2 ATIVIDADE
DE
ESTERIFICAÇÃO
DA
LIPASE
DE
ASPERGILLUS
WENTII
EM
PROPANO
PRESSURIZADO ......................................................................... 37
4.3 ATIVIDADE
DE
ESTERIFICAÇÃO
DA
LIPASE
DE
PENICILLIUM
SIMPLICISSIMUM
EM
PROPANO
PRESSURIZADO ..................................... 39
VI
4.4 CARACTERIZAÇÃO
DOS
CATALISADORES ................................................ 46
4.5 CONSIDERAÇÕES
FINAIS ............................................................................. 47
5. CONCLUSÕES .............................................................................................. 50
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................. 52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 53
VII
ÍNDICE DE TABELAS
T
ABELA
1
-
F
ONTES BIOLÓGICAS E FORNECEDORES DE LIPASES COMERCIAIS
. ................... 9
T
ABELA
2
-
C
ONDIÇÕES EXPERIMENTAIS AVALIADAS NO PLANEJAMENTO EXPERIMENTAL
REALIZADO PARA CADA LIPASE NÃO COMERCIAL
. ..................................................... 32
T
ABELA
3
-
A
TIVIDADE ENZIMÁTICA DA
A
SPERGILLUS PARASITICUS IMOBILIZADA SUBMETIDA
A PROPANO PRESSURIZADO
. .................................................................................. 34
T
ABELA
4
-
E
FEITOS ESTIMADOS DAS VARIÁVEIS NA RESPOSTA ATIVIDADE DA LIPASE DE
A
SPERGILLUS PARASITICUS IMOBILIZADA NO SISTEMA COM PROPANO PRESSURIZADO
,
AO NÍVEL DE
95%
DE CONFIANÇA
. .......................................................................... 34
T
ABELA
5
-
A
TIVIDADE ENZIMÁTICA DA
A
SPERGILLUS PARASITICUS LIOFILIZADA SUBMETIDA A
PROPANO PRESSURIZADO
. ..................................................................................... 35
T
ABELA
6
-
A
TIVIDADE ENZIMÁTICA DA
A
SPERGILLUS WENTII LIOFIIZADA SUBMETIDA A
PROPANO PRESSURIZADO
. ..................................................................................... 38
T
ABELA
7
-
A
TIVIDADE ENZIMÁTICA DA
P
ENICILLIUM SIMPLICISSIMUM IMOBILIZADA
SUBMETIDA A PROPANO PRESSURIZADO
. ................................................................ 40
T
ABELA
8
-
E
FEITOS ESTIMADOS DAS VARIÁVEIS NA RESPOSTA ATIVIDADE DA LIPASE DE
P
ENICILLIUM SIMPLICISSIMUM IMOBILIZADA NO SISTEMA COM PROPANO PRESSURIZADO
,
AO NÍVEL DE
95%
DE CONFIANÇA
. .......................................................................... 41
T
ABELA
9
-
A
TIVIDADE ENZIMÁTICA DA
P
ENICILLIUM SIMPLICISSIMUM LIOFILIZADA SUBMETIDA
A PROPANO PRESSURIZADO
. .................................................................................. 42
T
ABELA
10
-
R
ESULTADO DA CARACTERIZAÇÃO DOS CATALISADORES PELA ANÁLISE DE
BET. .................................................................................................................... 46
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
F
IGURA
1
-
R
EAÇÕES CATALISADAS POR LIPASES
. .......................................................... 11
F
IGURA
2
-
E
QUIPAMENTOS UTILIZADOS PARA MEDIDA DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA
. ............ 28
F
IGURA
3
-
D
IAGRAMA ESQUEMÁTICO DO APARATO UTILIZADO NO TRATAMENTO DAS
ENZIMAS COM O PROPANO PRESSURIZADO
.
A–
RESERVATÓRIO DE SOLVENTE
;
B–
BANHO TERMOSTATIZADO
;
C–
BOMBA DE SERINGA
;
D–
REATOR
/
CÉLULA DE AÇO
;
E–
INDICADOR DE PRESSÃO
;
F–
TRANSDUTOR DE PRESSÃO
;
G–
VÁLVULA MICROMÉTRICA
.
............................................................................................................................ 30
F
IGURA
4
–
D
ETALHES DA CÉLULA DE AÇO INOXIDÁVEL COM VOLUME INTERNO DE
3
M
L
E DA
CÉLULA DE AÇO MONTADA COM A VÁLVULA MICROMÉTRICA
. ..................................... 31
F
IGURA
5
-
V
ISTA DO SISTEMA MERGULHADO NO BANHO TERMOSTATIZADO E DA UNIDADE
EXPERIMENTAL UTILIZADA NO TRATAMENTO DAS ENZIMAS
. ....................................... 31
F
IGURA
6
-
D
IAGRAMA DE
P
ARETO PARA A LIPASE
A
SPERGILLUS PARASITICUS LIOFILIZADA
NO SISTEMA PROPANO PRESSURIZADO
,
EM FUNÇÃO DAS VARIÁVEIS INDEPENDENTES
ESTUDADAS E DA ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO OBTIDA
. ......................................... 37
F
IGURA
7
-
D
IAGRAMA DE
P
ARETO PARA A LIPASE
A
SPERGILLUS WENTII LIOFILIZADA NO
SISTEMA PROPANO PRESSURIZADO
,
EM FUNÇÃO DAS VARIÁVEIS INDEPENDENTES
ESTUDADAS E DA ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO OBTIDA
. ......................................... 39
F
IGURA
8
-
D
IAGRAMA DE
P
ARETO PARA A LIPASE
P
ENICILLIUM SIMPLICISSIMUM LIOFILIZADA
NO SISTEMA PROPANO PRESSURIZADO
,
EM FUNÇÃO DAS VARIÁVEIS INDEPENDENTES
ESTUDADAS E DA ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO OBTIDA
. ......................................... 43
F
IGURA
9
-
C
OMPILAÇÃO DOS RESULTADOS DE ATIVIDADE RESIDUAL EM FUNÇÃO DAS
LIPASES LIOFILIZADAS APÓS PROCESSAMENTO EM PROPANO PRESSURIZADO
............ 48
F
IGURA
10
-
C
OMPILAÇÃO DOS RESULTADOS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM FUNÇÃO DA
FORMA DE APRESENTAÇÃO
(
IMOBILIZADA E LIOFILIZADA
)
DA LIPASE DE
P
ENICILLIUM
SIMPLICISSIMUM
. ................................................................................................... 49
IX
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos.
COMPORTAMENTO DA ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO DE
LIPASES NÃO COMERCIAIS EM PROPANO PRESSURIZADO
Graciele de Oliveira Kuhn
Agosto/2010
Orientadores: Débora de Oliveira
José Vladimir de Oliveira
A literatura indica que o emprego de fluidos pressurizados, sub ou
supercríticos, na área da biotecnologia, mais especificamente em tecnologia
enzimática, é assunto de intensa exploração científica durante a última década.
O objetivo de tal estudo é a utilização de fluidos pressurizados como meio
reacional alternativo para reações enzimáticas, explorando propriedades
singulares de tais fluidos, como incrementar a atividade e estabilidade de
complexos enzimáticos ou inativar complexos enzimáticos que causam danos a
alimentos e fármacos. Lipases constituem os mais importantes grupos de
biocatalisadores para a síntese de biopolímeros e de biodiesel, para a
resolução de misturas racêmicas, transesterificações, acilação regiosseletiva
de glicóis e mentol, síntese de peptídeos, na produção de fármacos
enantiomericamente puros, agroquímicos, e compostos aromáticos. Neste
contexto, o presente trabalho visa investigar a influência da pressão, tempo de
exposição e taxa de despressurização na atividade de 3 lipases não
comerciais, nas formas imobilizada e liofilizada, em propano pressurizado. Para
tal, os experimentos foram realizados utilizando uma célula de aço com volume
interno de 3mL, na temperatura de 35
o
C, variando a pressão (30–70bar), sob
diferentes tempos de exposição (1–6h) e adotando distintas taxas de
X
descompressão (2–20bar/min). Um planejamento experimental com dois níveis
e três repetições no ponto central foi utilizado para identificar o efeito das
variáveis do processo bem como das possíveis interações entre elas na
perda/ganho da atividade lipásica. A atividade foi determinada como a taxa
inicial das reações de esterificação entre o ácido oléico e o etanol. Os
resultados obtidos mostram que a atividade enzimática depende muito da
espécie e forma como a enzima se encontra, do conteúdo de água da
enzima/suporte/meio reacional e das variáveis de processo envolvidas,
significando que diferentes efeitos podem ser obtidos dependendo das
características do sistema investigado. Em alguns estudos, as enzimas
apresentaram grande perda da atividade, enquanto outros proporcionaram um
significativo aumento.
XI
Abstract of Dissertation presented to Food Engineering Program as a partial
fulfillment of the requirements for the Degree of Master in Food Engineering.
INVESTIGATION OF NON-COMMERCIAL LIPASES
ESTERIFICATION ACTIVITY TREATED IN COMPRESSED
PROPANE
Graciele de Oliveira Kuhn
August/2010
Advirsors: Débora de Oliveira
José Vladimir de Oliveira
The objective of this work was to assess the influence of propane treatment on
the esterification activity of three non-commercial lipases in the lyophilized and
immobilized forms. In order to evaluate the effect of process variables on the
lipase activity a full 2
3
experimental design was carried out. For this purpose,
the experiments were performed in a stainless steel cell with internal volume of
3mL, at fixed 35
o
C, in the pressure range of 30 - 70bar, with varying exposure
time, 1 to 6h, adopting different decompression rates, ranging from 2 to 20
bar/min. Lipase activity was determined as the initial rates o esterification
reaction between oleic acid and ethanol. From the results obtained in this work,
in a general sense, one may infer that the enzyme activity depends significantly
on the enzyme, its presentation form, and the experimental condition
investigated. It was experimentally observed that for lyophilized and
immobilized lipases there was an enhancement in residual lipase activity in
several experimental conditions. The present study allows the selection of
operational conditions in terms of exposure time, depressurization rate and
pressure for advantageous application of these biocatalysts in reactions.
1 Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
As enzimas são biocatalisadores com propriedades que as tornam
altamente requisitadas. Além de serem ativas e versáteis, elas catalisam uma
série de transformações de modo seletivo, rápido e em condições brandas de
reação, o que as difere dos catalisadores químicos. A grande vantagem das
enzimas é que elas catalisam as transformações moleculares sem ocorrência
de reações paralelas, o que é comum em sínteses químicas, devido à sua
especificidade (DZIEZAK, 1991; PATEL, 2002; PIZARRO e PARK, 2003).
Atualmente, as lipases têm apresentado grande importância no cenário
biotecnológico, econômico e industrial. Essas enzimas são utilizadas como
ferramenta tecnológica, representando uma perspectiva de desenvolvimento
nos processos para obtenção de monoglicerídios, ácidos graxos, agentes
biotensoativos, compostos de aroma e sabor e lipídeos estruturados ou
biomodificados (TREICHEL et al., 2010).
As lipases agem nos alimentos gordurosos hidrolisando os lipídios quase
que totalmente, o que resulta no aparecimento de sabores muitas vezes
indesejáveis. Participam do processo de rancificação de derivados de leite, de
carnes, de peixes e de outros produtos ricos em lipídeos. Contudo, são
também responsáveis pelo aparecimento de características desejáveis em
determinados produtos como o desenvolvimento de sabores específicos. Outro
campo também importante é a aplicação de lipase em detergentes e indústria
de papel.
Uma área que ganhou relevância nos últimos anos é o emprego de
lipases na produção de biodiesel, através da transesterificação de triglicerídeos
com álcoois de cadeia curta. Os ésteres de ácidos graxos de cadeia longa
produzidos na reação podem ser empregados como combustível, com a
vantagem de não propiciar a geração de óxidos de enxofre e de particulados
(ISO et al., 2001).
O biodiesel é formado pelos ésteres monoalcil de óleos e gorduras e
pode ser utilizado como mistura para os combustíveis derivados de petróleo, o
1 Introdução
2
diesel. A lipase catalisa a reação de transesterificação de moléculas de ácidos
graxos de elevado peso molecular (LEE et al., 2002).
Os catalisadores enzimáticos como as lipases podem catalisar
eficazmente o processo de transesterificação dos triglicerídeos nos sistemas
aquosos ou não aquosos, isso devido à elevada atividade específica pelo
substrato, baixo impacto ao ambiente, grupo funcional e estereoseletividade
(MEHER et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2006a). Apesar da alta eficiência
catalítica das enzimas, fatores ligados ao custo e à estabilidade limitam a
utilização destes biocatalisadores. O uso de um catalisador relativamente caro
como uma enzima exige, em muitos casos, sua recuperação e reuso, para se
ter um processo economicamente viável (FERNANDEZ-LORENTE et al.,
2007). A aplicação de enzimas imobilizadas como catalisador de reações
envolvendo triglicerídeos apresenta uma série de vantagens, tais como: maior
estabilidade, necessidade de baixos teores de água e possibilidade de
reutilização das enzimas em processos contínuos ou em batelada (NOVO
NORDISK, 1992).
A empresa Novozymes é a líder mundial em biotecnologia de enzimas.
Para mostrar que é possível a síntese de produtos por meio da catálise
enzimática de uma forma mais eficaz economicamente, muitos pesquisadores
estão produzindo e utilizando enzimas “home-made”.
As lipases encontram-se largamente distribuídas na natureza, podendo
ser obtidas a partir de fontes animais, vegetais e microbianas. Atualmente, as
lipases são produzidas, preferencialmente, a partir de micro-organismos devido
às facilidades de controle e de aumento da capacidade produtiva dos
processos fermentativos, além da redução do seu custo de obtenção, o que
torna viável o cultivo desses micro-organismos.
Em geral, a utilização de lipases como biocatalisadores é acompanhada
do emprego de solventes orgânicos líquidos para melhorar a estabilidade da
mesma e permitir o adequado contato entre os substratos e o(s) centro(s)
ativo(s) da enzima, entretanto estes apresentam desvantagens, como a sua
toxicidade, difícil separação dos produtos e uso de volumes elevados. Neste
sentido, esforços consideráveis têm sido apresentados na literatura no sentido
da realização de reações utilizando tecnologias limpas conduzidas em fluidos
1 Introdução
3
sub e supercríticos (KNEZ et al., 1998; KUMAR et al., 2004; OLIVEIRA e
OLIVEIRA, 2000; DALLA ROSA et al., 2008). O uso de fluidos comprimidos
como solventes para reações químicas pode ser uma rota promissora no
sentido de eliminar traços de solventes líquidos convencionais dos produtos da
reação. Adicionalmente, processos industriais em condições próximas ao ponto
crítico podem ser vantajosos em termos de consumo de energia, facilidade de
consumo de energia, facilidade de recuperação do produto e minimização da
formação de produtos secundários (KNEZ et al., 1998).
Diversos trabalhos descrevem a produção de ésteres por via enzimática
utilizando lipases como catalisadores, e em todos os casos conversões
satisfatórias foram observadas quando da utilização de uma razão mássica de
solvente:substrato em torno de 40:1 (DALLA ROSA, et al., 2010). Oliveira
(1999) e Faccio (2004) utilizaram níveis de solvente n-hexano/substrato nesta
proporção na transesterificação de óleo de dendê, mamona e soja, utilizando
as lipases comerciais Novozym 435 e Lipozyme IM.
Estudos mostraram que muitas reações podem ser conduzidas em
dióxido de carbono líquido ou supercrítico e em fluidos pressurizados, como
propano e n-butano (KNEZ e HABULIN, 2001; OLIVEIRA et al., 2000 e 2001;
DALLA ROSA et al., 2008) devido suas propriedades de transporte favoráveis à
transferência de massa.
Apesar deste comprovante, o uso de dióxido de carbono em reações
enzimáticas que utilizam óleos vegetais como substrato, apresenta algumas
limitações quanto à solubilidade de tais compostos e no que diz respeito à
atividade/estabilidade de algumas lipases neste solvente comprimido
(OLIVEIRA et al., 2006a; NDIAYE et al., 2006a). Referente a este aspecto, as
propriedades do propano apontam vantagens sobre o dióxido de carbono, o
que implica em um sistema mais apropriado para a realização das reações
enzimáticas a partir de óleos vegetais (OLIVEIRA et al., 2006a e LANZA et al.,
2005).
A estabilidade e a atividade enzimática podem depender: da espécie de
enzima, das características do solvente, do conteúdo de água da
enzima/suporte/meio reacional e das variáveis de processo envolvidas,
1 Introdução
4
significando que diferentes efeitos podem ser obtidos dependendo das
características do sistema sob investigação (FRANKEN, et al., 2010).
A partir disto, conforme cita KASCHE et al. (1988), na realização de
reações enzimáticas a altas pressões, é de fundamental importância a
avaliação do comportamento das enzimas nestes fluidos, uma vez que a perda
de atividade pode levar a baixas taxas de reação e formação de produtos
secundários.
Fazendo-se uma análise geral na literatura, observa-se que, enquanto
existe uma considerável quantidade de dados acerca da atividade e
estabilidade de enzimas em dióxido de carbono, há proporcionalmente, pouca
informação relacionada a outros solventes comprimidos, tais como o propano,
principalmente quando se tratam de enzimas não comerciais, muito
importantes devido ao seu baixo custo de obtenção.
Levando-se em consideração o exposto até o momento, da grande
importância da investigação do comportamento de enzimas em fluidos
pressurizados, da síntese de diversos produtos a partir das reações catalisadas
por lipases, e da observação do estado da arte que revela ausência de um
estudo mais detalhado no que se refere ao objeto de interesse deste trabalho,
foi possível estabelecer a proposta do mesmo, a qual visa estudar o
comportamento da atividade de esterificação de algumas lipases não
comerciais, tratadas em propano pressurizado.
Em consonância com o objetivo geral deste trabalho o principal objetivo
específico foi definido como avaliar a influência das variáveis: pressão, tempo
de exposição e taxa de despressurização na atividade de esterificação de três
lipases não comerciais, produzidas a partir dos micro-organismos Penicillium
simplicissimum, Aspergillus parasiticus e Aspergillus wentii, todas estudadas
nas formas liofilizada e imobilizada submetidas ao tratamento com propano
pressurizado.
Como forma de embasamento ao trabalho proposto, primeiramente será
apresentada uma revisão bibliográfica, procurando evidenciar os resultados
disponíveis na literatura referentes ao tema do presente estudo. O Capítulo 3
apresentará os métodos analíticos e experimentais utilizados no decorrer deste
1 Introdução
5
trabalho. No Capítulo 4 serão apresentados e discutidos os resultados para os
sistemas estudados. Por fim, o Capítulo 5 trará as conclusões, e o Capítulo 6
sugestões para trabalhos futuros.
2 Revisão Bibliográfica
6
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O presente capítulo apresenta uma breve explanação sobre o estado da
arte concernente aos aspectos a serem abordados neste trabalho, procurando
evidenciar a relevância do tema sob investigação para a literatura científica. Na
seqüência será apresentada uma visão geral sobre as enzimas, lipases,
evidenciando suas vantagens e características. Após, especificamente de
interesse para o desenvolvimento deste trabalho, aborda-se o uso de fluidos
pressurizados sobre a atividade das enzimas, enfatizando as variáveis que
influenciam a mesma.
2.1 ENZIMAS
As enzimas, importantes componentes do metabolismo de todos os
seres vivos, têm a capacidade de promover e acelerar reações químicas.
Micro-organismos ou substâncias com essa propriedade já eram usados por
populações humanas muito antigas para modificar alimentos – fermentar uvas
e fabricar o vinho, ou alterar o leite e produzir queijo, por exemplo. Depois que
pesquisadores desvendaram a atuação das enzimas, estas passaram a ser
cada vez mais empregadas, com variadas finalidades, tanto na área de
alimentos, quanto em muitos outros setores.
Estes biocatalisadores ou catalisadores biológicos são proteínas cuja
principal função, portanto, é catalisar reações nos organismos. Os
biocatalisadores são utilizados em química orgânica como uma alternativa aos
processos químicos clássicos por apresentarem inúmeras vantagens. Dentre
estas se destacam: utilização de condições brandas, compatibilidade com
substratos sintéticos, em alguns casos podem catalisar as reações nos dois
sentidos e podem, ainda, apresentar seletividade quanto ao tipo de reação que
catalisam (PAQUES e MACEDO, 2006).
O estudo das ações de enzimas em reações do metabolismo levou à
identificação e purificação de milhares delas, à elucidação de sua estrutura
2 Revisão Bibliográfica
7
molecular e do seu mecanismo químico de ação leva a uma compreensão
geral de como elas funcionam (LEHNINGER, 1970 apud BRÍGIDA, 2006).
As enzimas como proteínas biologicamente ativas são responsáveis pela
catálise de diversas reações. Em uma proteína enzimática, existe certo domínio
chamado de “sítio ativo” que se liga ao substrato – a molécula reagente – e
diminui a energia do estado de transição que leva ao produto desejado. A
ligação entre o sítio ativo e o substrato é extremamente específica: a molécula
precisa ter certas características eletrônicas e espaciais que permitam o seu
“encaixe” com a proteína, esta relação tem sido chamada de “chave-
fechadura”. Como catalisadores biológicos, as enzimas estão sujeitas às
mesmas leis termodinâmicas e cinéticas dos catalisadores químicos, isto é,
alteram a velocidade da reação, porém não a reação final de equilíbrio entre o
substrato e o produto (WISEMAN, 1991; PRIMO et al., 2007).
Todas as enzimas conhecidas são proteínas e estas, sejam das mais
antigas linhagens de bactérias ou das formas de vida mais evoluídas, são
construídas com o mesmo conjunto de 20 aminoácidos, unidos covalentemente
em seqüências características. Esta seqüência apresenta quatro níveis de
estruturas. A estrutura primária, que determina a forma e a função da proteína,
é somente uma seqüência dos aminoácidos, sem levar em conta a orientação
espacial da molécula, dando uma completa descrição das ligações covalentes
da proteína. A estrutura secundária é função dos ângulos formados pelas
ligações peptídicas que ligam os aminoácidos. A conformação espacial é
mantida graças às interações intermoleculares (pontes de hidrogênio) entre os
hidrogênios dos grupos amino e os átomos de oxigênio dos outros
aminoácidos. Em geral, estas ligações forçam a proteína a assumir uma forma
helicoidal, como uma corda enrolada em torno de um tubo imaginário. Esta
forma, a mais comum, é chamada de α-hélice. A estrutura terciária relaciona-se
com as dobraduras da cadeia protéica sobre ela mesma. A forma das proteínas
está relacionada com sua estrutura terciária. O que determina a estrutura
terciária são as cadeias laterais dos aminoácidos; algumas cadeias são tão
longas e hidrofóbicas que perturbam a estrutura secundária helicoidal,
provocando a dobra da proteína. Muitas vezes, as partes hidrofóbicas da
proteína agrupam-se no interior da proteína dobrada, longe da água e dos íons
2 Revisão Bibliográfica
8
do ambiente onde a proteína se encontra, deixando as partes hidrofílicas
expostas na superfície da estrutura da proteína. Regiões como "sítios ativos",
"sítios regulatórios" e módulos são propriedades da estrutura terciária. Existe,
finalmente, a estrutura quaternária, que se refere à conformação espacial das
subunidades. Esta estrutura é mantida pelas mesmas forças que determinam
as estruturas secundárias e terciárias (LEHNINGER et al., 1995).
A conformação e a estabilidade da estrutura molecular das enzimas é
assegurada por ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, pontes de
dissulfeto, ligações iônicas e forças de van der Waals. A atividade catalítica,
bem como a estabilidade e a especificidade da enzima dependem da sua
estrutura tridimensional. Condições ambientais, tais como pH, temperatura e
força iônica do meio, entre outros, afetam a estrutura da enzima e, em
decorrência, suas propriedades (LIMA et al., 2001).
2.1.1 Lipases
As lipases (triglicerol acil-hidrolases, EC 3.1.1.3) são classificadas como
hidrolases e atuam sobre ligações ésteres presentes em acilgliceróis, liberando
ácidos graxos e glicerol, constituindo uma classe especial de esterases
(DALLA-VECCHIA, 2004).
As lipases são encontradas em tecidos de vários animais e plantas, e
podem ser produzidas por fermentação usando várias espécies de micro-
organismos, tais como os fungos Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Penicillium,
Geotrichum, por leveduras de Tulopis e Candida e bactérias como
Pseudomonas, Achromobacter e Staphylococcus. Do ponto de vista econômico
e industrial, os micro-organismos são preferíveis às lipases de fontes de
animais e plantas, devido ao alto custo do seu isolamento (DALLA-VECCHIA,
2004).
As lipases microbianas constituem um importante grupo de enzimas,
devido à versatilidade de suas propriedades e à fácil produção em massa. As
lipases microbianas são amplamente diversificadas em suas propriedades
enzimáticas e especificidade do substrato, o que as torna atrativas para a
aplicação industrial (HASAN et al., 2006). Os fungos filamentosos são
2 Revisão Bibliográfica
9
considerados bons produtores de enzimas (MAIA et al., 2001), e as lipases
fúngicas são as preferidas para aplicação industrial (MAHADIK et al., 2002).
Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando
entre 20 a 75kDa, atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e em temperaturas
variando desde a ambiente até 70°C. Lipases são usualmente estáveis em
soluções aquosas neutras à temperatura ambiente apresentando, em sua
maioria, uma atividade ótima na faixa de temperatura entre 30 e 40°C.
Contudo, sua termoestabilidade varia consideravelmente em função da origem,
sendo as lipases microbianas as que possuem maior estabilidade térmica
(CASTRO et al., 2004).
A Tabela 1 apresenta uma compilação acerca de algumas fontes de
lipases industriais e seus respectivos fornecedores comerciais (FABER, 2000;
NEGISHI et al., 2003; HUANG e TSAI, 2004; SOUMANOU e BORNSCHEUER,
2003; HAN et al., 2003; MARIA et al., 2002; KONTKANEN et al., 2004).
Tabela 1 - Fontes biológicas e fornecedores de lipases comerciais.
Fonte biológica
Fornecedor
Aspergillus niger Aldrich, Amano, Biocatalysts, Fluka, Novozymes, Röhm
Aspergillus sp. Novozymes
Candida antarctica A Boehringer, Fluka, Novozymes
Candida antarctica B Fluka, Novozymes, Boehringer
Candida cylindracea Meito
Candida rugosa Aldrich, Altus, Amano, Biocatalysts, Boehringer, Fluka, Meito
Sangyo, Sigma, Roche
Mucor miehei Amano, Boehringer, Biocatalysts, Fluka, Novozymes
Penicillium roqueforti Amano, Biocatalysts, Fluka
Pseudomonas sp. Amano, Boehringer, Fluka, Mitsubishi, Röhm, Sigma
Rhizopus arrhizus Biocatalysts, Boehringer, Fluka, Sigma
Rhizopus oryzae Amano, Sigma
Gérmen de trigo Fluka, Sigma
Pâncreas suíno Aldrich, Amano, Biocatalysts, Boehringer, Fluka, Röhm,
Sigma
2 Revisão Bibliográfica
10
2.1.2 Aplicação de lipases
O potencial de aplicação de lipases em processos tem sido objeto de
grande interesse nos meios acadêmico e industrial nos últimos anos. Surgiu,
então, a possibilidade de realização de vários tipos de reações enzimáticas de
interesse científico e industrial, tais como síntese de ésteres, hidrólise e
interesterificação.
A reação de hidrólise envolve ataque na ligação éster do triglicerídeo na
presença de moléculas de água para produzir glicerol e ácidos graxos. A alta
especificidade das lipases pelo triglicerídeo com relação ao tipo e a posição
estereoespecífica do resíduo de ácido graxo propicia um grande número de
aplicações dentro da área de alimentos. Aromatizantes para uso em alimentos
destinados ao consumo humano e animal têm sido obtidos através da hidrólise
parcial de triglicerídeos (MALCATA et al., 1990). Processos comerciais incluem
a modificação enzimática da gordura do leite bem como o desenvolvimento de
preparações enzimáticas para utilização na produção de queijos.
A reação de esterificação entre polióis e ácidos graxos livres é, em sua
essência, a reação inversa da hidrólise do glicerídeo correspondente. As
velocidades relativas da reação direta (hidrólise) e inversa (esterificação) são
usualmente controladas pela atividade de água da mistura reacional. Exemplos
de produtos químicos de alto valor obtidos pelo uso de lipases para
esterificação incluem a síntese de ésteres de ácido oléico com álcoois alifáticos
primários e secundários e álcoois terpênicos e a produção de ésteres dos
álcoois geraniol e mentol com ácido butírico e ácido láurico, respectivamente
(OLIVEIRA, 1999). O termo interesterificação refere-se à troca de radicais acil
entre um éster e um ácido (acidólise), um éster e um álcool (alcoólise) ou um
éster e outro éster (transesterificação). Nessas reações o triglicerídeo reage
com um ácido graxo, um álcool ou outro éster, resultando em um rearranjo dos
grupos de ácidos graxos do triglicerídeo de forma a produzir um novo
triglicerídeo. O rearranjo é o resultado de reações concorrentes de hidrólise e
esterificação. A concentração ótima de água no meio reacional deve ser
suficientemente baixa de forma a minimizar a formação de produtos de
2 Revisão Bibliográfica
11
hidrólise indesejáveis, mas deve ser suficiente para que a enzima permaneça
totalmente ativa (MALCATA et al., 1990).
A Figura 1 ilustra as reações catalisadas por lipases (PAQUES e
MACEDO, 2006).
Figura 1 - Reações catalisadas por lipases.
O potencial de aplicações industriais que as lipases possuem abrange a
indústria de alimentos, como aditivos (modificação de aromas), química fina
(síntese de ésteres), detergentes (hidrólise de gorduras), tratamento de
efluentes (decomposição e remoção de substâncias oleosas), couro (remoção
de lipídios das peles dos animais), farmacêutica e a área médica (remédios,
digestivos e enzimas para diagnósticos) (BURKERT, 2002; BURKERT et al.,
2004).
2 Revisão Bibliográfica
12
Os estudos sobre a aplicação de lipases para obtenção de biodiesel têm
aumentado significativamente nos últimos anos. O crescente interesse em
obter combustíveis alternativos é conseqüência da escassez de petróleo e do
menor impacto ambiental provocado pelos biocombustíveis. Esses estudos
iniciaram-se nos anos 30, quando óleos vegetais foram testados em máquinas
nas quais se usava diesel como combustível (LEE et al., 2002).
O biodiesel é formado pelos ésteres monoalcil de óleos e gorduras e
pode ser utilizado como mistura com os combustíveis derivados de petróleo, o
diesel. Recentemente as pesquisas têm sido voltadas para utilização das
lipases na transesterificação de moléculas de ácidos graxos de elevado peso
molecular. A lipase catalisa a reação do álcool com óleos vegetais e gordura
animal. Sabendo-se que várias matérias-primas agro-pecuárias são ricas em
gorduras e óleos, o emprego delas como fontes de biocombustíveis ganha uma
notável importância tecnológica, social e econômica (LEE et al., 2002).
Os catalisadores enzimáticos como as lipases, podem catalisar
eficazmente o processo de transesterificação dos triglicerídeos nos sistemas
aquosos ou não aquosos, superando os problemas relacionados ao conteúdo
de água presente. Em particular, os subprodutos, glicerol, podem facilmente
ser removidos sem nenhum processo complexo, e também os ácidos graxos
livres contidos nos óleos e nas gorduras podem completamente ser convertidos
a ésteres (MEHER et al., 2006).
As lipases são geralmente biocatalisadores eficazes devido à elevada
atividade específica pelo substrato, baixo impacto ao ambiente, grupo funcional
e estereoseletividade. As reações químicas podem ser conduzidas diretamente
usando lipases em meio orgânico (OLIVEIRA et al., 2006a).
2.1.3 Atividade enzimática
Segundo SCRIBAN (1985), a atividade das enzimas é função direta da
sua estrutura terciária ou quaternária. Nessas condições, todo tratamento que
modifique a conformação da enzima (aquecimento, modificação do pH,
pressão), dificultando ou impedindo a fixação do substrato na enzima ou ainda
modificando a estrutura do sítio ativo, alterará as propriedades catalíticas da
2 Revisão Bibliográfica
13
enzima e, portanto, o seu funcionamento. Existe uma zona de temperatura, às
vezes estreita, para a qual atividade enzimática é máxima. Essa variação da
atividade enzimática em função da temperatura é determinada em condições
de operação bem definidas. De fato, a variação da atividade enzimática resulta
de dois efeitos antagônicos: de um lado, o aumento da agitação das moléculas
com a elevação da temperatura que aumenta a freqüência das colisões entre o
substrato e a enzima; de outro, a desnaturação da proteína enzimática. Esta
desnaturação vai modificar as estruturas terciária e quaternária da proteína
globular e fazer, portanto, a enzima passar de uma conformação ativa a uma
conformação desprovida de atividade. De fato, na desnaturação das enzimas
pelo calor, o que conta, sobretudo, é o binômio tempo/temperatura, ou seja, a
duração e a intensidade do tratamento térmico.
A expressão da atividade de uma enzima é medida através de sua
velocidade de reação, determinada em condições experimentais estabelecidas.
A atividade é expressa em unidades de atividade. A definição proposta pela
IUB (Internacional Union of Biochemistry) considera uma unidade de atividade
como a quantidade de enzima que catalisa a transformação de um
µmol de
substrato por minuto em condições de ensaio definidas (LIMA et al., 2001).
2.1.4 Imobilização de lipases
Com o intuito de aumentar a atividade catalítica das lipases, vários
processos de imobilização ou modificação na estrutura nativa vêm sendo
estudados.
As enzimas estão sujeitas a inativação por fatores químicos, físicos ou
biológicos, podendo ocorrer quando estocadas ou durante o uso. A técnica de
imobilização é utilizada para fornecer estabilidade às enzimas e facilitar sua
recuperação ao final do processo (VILLENEUVE et al., 2000).
De acordo com Dalla-Vecchia (2004), o principal interesse em imobilizar
uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não
sejam afetadas durante o processo, em comparação à sua forma livre.
Idealmente, a enzima imobilizada deverá exibir uma atividade catalítica
superior. Além disso, não deverão ocorrer alterações estruturais, bem como
2 Revisão Bibliográfica
14
modificações no sítio ativo. A imobilização pode inibir ou aumentar a atividade
e estabilidade da enzima, porém não existe uma regra que prediga a
manutenção destes parâmetros após o processo de imobilização.
O processo de imobilização pode também adicionar um obstáculo na
transferência de massa, uma vez que o contato dos substratos com os sítios
ativos das enzimas fica mais limitado do que quando a enzima se encontra na
sua forma livre, daí o interesse no emprego de fluidos pressurizados, visando o
aumento das taxas de transferência de massa, devido sua maior difusividade.
Apesar da alta eficiência catalítica das enzimas, fatores ligados ao custo
e à estabilidade limitam a utilização destes biocatalisadores. O uso de um
catalisador relativamente caro como uma enzima exige, em muitos casos, sua
recuperação e reuso para se ter um processo economicamente viável
(FERNANDEZ-LORENTE et al., 2007).
O custo elevado com a enzima é o obstáculo principal à comercialização
dos processos catalisados por lipases. Avanços recentes na tecnologia
enzimática, tais como o uso de lipases solvente-tolerantes e a reutilização da
lipase imobilizada são feitos para desenvolver sistemas de custo eficaz
(OLIVEIRA et al., 2006b), como também a produção de lipases não comerciais
como substitutas para as enzimas comerciais oriundas de grandes produtoras,
cujo preço é bastante elevado.
Enquanto o número de companhias que comercializam enzimas está
próximo do milhar, o número de produtores é muito inferior. Ao todo, nos
Estados Unidos e parte oeste da Europa, existem apenas cerca de 30
indústrias produtoras de enzimas. Muitos produtores são do ramo da indústria
químico-farmacêutica, para os quais o lucro proveniente da comercialização
das enzimas desempenha um papel pouco significativo no seu faturamento
global (CASTRO et al., 2004).
Cerca de 90% da produção anual provém das maiores empresas
produtoras de enzimas, como Novozymes com sede na Dinamarca; Gist
Brocades, na Holanda; Amano, no Japão; Solvay, Pfizer e Genencor, nos
Estados Unidos (CASTRO et al., 2004).
Em vista disso, e estando a lipase presente em animais e vegetais e
principalmente podendo ser produzida por fungos, leveduras e bactérias, torna-
2 Revisão Bibliográfica
15
se atrativamente viável a produção e o uso industrial da lipase a partir do
cultivo desses micro-organismos em substratos apropriados.
2.2 FLUIDOS PRESSURIZADOS
O uso de fluidos, que se comportem como gases em condições
ambientes, nas reações de transesterificação enzimática pode se constituir em
alternativa para os inconvenientes relacionados as etapas de separação do
solvente.
Os fluidos pressurizados possuem diversas vantagens sobre os
solventes líquidos, como a alta difusividade, que pode acelerar a transferência
de massa em reações enzimáticas (DALLA
ROSA,
2006).
Dentre outras vantagens do uso de fluido pressurizado como meio
reacional destaca-se: aumento da seletividade de reação, conversões
elevadas; solubilização de reagentes; facilidade de separação de produtos e
reagentes, catalisador e subprodutos na mistura (SUBRAMANIAN e McHUGH,
1988).
Knez et al. (1998) observaram na síntese de oleil oleato, utilizando
Lipozyme IM e diferentes gases comprimidos como solvente, em várias faixas
de temperatura e pressão, que não houve perda de atividade da lipase em
pressões de até 300bar por tempos de até 350min de reação. Neste mesmo
estudo, os autores reportam que quanto menor o diâmetro das partículas da
enzima (menor valor investigado foi de 250µm) maior é o incremento da taxa
inicial de reação para este sistema.
Oliveira et al. (2006a) investigou a influência da temperatura (35 - 75°C),
pressão (10 - 250bar), tempo de exposição (1 – 6 horas) e a taxa
despressurização (2 - 50bar/min para propano e n-butano e 10 – 200Kg/m
3
.min
para dióxido de carbono) na atividade de esterificação das enzimas Novozym
435 e Lipozyme IM. Os resultados mostraram que ambas as enzimas
apresentaram uma perda significativa de atividade na presença de dióxido de
carbono. Para os demais gases, a Lipozyme IM teve apenas uma pequena
perda da atividade, enquanto que a Novozym 435 teve um ganho de atividade
quando submetida ao propano e n-butano.
2 Revisão Bibliográfica
16
A atividade hidrolítica de três lipases (Amano PS, Amano AY30 e lipase
de Yarrowia lipolytica) nas formas livre, ressuspendida e imobilizada foi
avaliada por Franken et al. (2010). De uma forma geral, para as lipases livres e
imobilizadas, foi observado um aumento na atividade residual na presença de
propano pressurizado. No caso das lipases ressuspendidas, foi demonstrado
que a cinética enzimática é sensível ao tratamento neste fluido, conduzindo em
alguns casos a ganhos inexpressivos e em outros a perdas significativas da
atividade enzimática.
Lanza (2004) investigou o comportamento de fases a alta pressão do
óleo de soja em solventes pressurizados, como propano e n-butano. Os
resultados obtidos mostraram que o tipo de equilíbrio observado depende do
sistema e que para o sistema óleo de soja - propano foi identificada uma ampla
região em composição contendo uma única fase, com pressões de transição
inferiores a 40bar em toda a faixa composicional (0 a 100%), indicando um
meio propício para as reações de transesterificação enzimática.
Quando da utilização dos solventes pressurizados, muitos autores
concluíram que o dióxido de carbono é o solvente que acarreta maior perda de
atividade enzimática, diferentemente do propano e n-butano que se mostram
solventes potenciais para utilização em reações enzimáticas a altas pressões
(DALLA ROSA et al., 2008).
Dalla Rosa et al. (2008) realizou o estudo para a produção de ésteres
etílicos a partir de óleo de soja em propano pressurizado, utilizando a lipase
Novozym 435, como catalisador. As variáveis do processo, temperatura (35°C -
65°C), pressão (50 - 150bar), concentração de enzim a (1% - 20% m/m), razão
molar óleo:etanol (1:3 - 1:15) e razão mássica solvente/substratos (1:1 - 4:1)
permitiram a determinação das melhores condições experimentais para a
produção de biodiesel. Os resultados demonstram que 50bar e 65°C levam a
melhor condição de pressão e temperatura, respectivamente, como também o
emprego de baixa razão solvente/substratos (2:1), conversões da ordem de
100% foram atingidas neste sistema reacional. Dentro da faixa experimental
deste trabalho (50 - 150bar) o propano encontra-se como líquido pressurizado,
de forma que a pressão apresenta pouca influência sobre as propriedades do
solventen e sobre a conversão da reação.
2 Revisão Bibliográfica
17
As lipases têm grande importância para uma variedade de aplicações
industriais, por isso são exploradas e documentadas mais do que qualquer
outra enzima em ambientes de alta pressão (EISENMENGER et al., 2009). No
entanto, a parcela maior dos trabalhos refere-se às enzimas comerciais
tratadas em CO
2
supercrítico, daí o grande interesse em ampliar o
conhecimento acerca do comportamento de enzimas, investigando o uso de
outros solventes pressurizados, como o propano, além do emprego de enzimas
“home-made”, eliminando a desvantagem do alto custo relacionado ao
emprego de lipases comerciais.
Existe uma infinidade de aplicações possíveis para gases pressurizados
e, possivelmente, um maior conhecimento das características e do
comportamento de enzimas nestes solventes, significaria aprimoramento
destas aplicações.
É importante salientar que, de modo geral, o solvente pode afetar
fortemente a atividade da enzima através de sua interação com o suporte, no
caso de enzimas imobilizadas, ou mesmo com radicais da própria enzima.
Neste contexto, como etapa anterior à utilização de enzimas como
catalisadores de reações em fluidos pressurizados, de fundamental importância
é a avaliação de seu comportamento nestes solventes alternativos aos
orgânicos convencionais (FEIHRMANN, 2005; PRIMO et al., 2007).
2.3 PARÂMETROS QUE INFLUENCIAM NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Proteínas são estruturas delicadas, mantidas por interações entre a
cadeia protéica (determinada pela seqüência de aminoácidos) e pelas
interações com o solvente ao redor. Mudanças nos fatores externos, como
pressão e temperatura, podem perturbar o complexo balanço das interações
intramoleculares e entre solvente-proteína, e podem, conseqüentemente, levar
ao desdobramento e/ou desnaturação da cadeia de peptídeos (HENDRICKX et
al., 1998).
Quando um biocatalisador ou uma preparação enzimática é selecionado
para determinada reação, o tipo de solvente, a quantidade de água e a
solubilidade dos substratos e produtos devem ser avaliadas e otimizadas
2 Revisão Bibliográfica
18
(DALLA-VECHIA et al., 2004). Assim, para a realização de reações enzimáticas
a altas pressões, é fundamental, primeiramente, conhecer as variáveis que
podem afetar a catálise enzimática em fluidos pressurizados, cada variável
será abordada individualmente, mas é importante salientar que o efeito destas
sobre a atividade e estabilidade enzimática, freqüentemente ocorre de forma
combinada.
2.3.1 Água
A água é, talvez, o componente mais importante quando o biocatalisador
é utilizado em meio orgânico. Está bem documentado na literatura que uma
quantidade mínima de água, que é dependente do tipo de solvente e das
características do suporte utilizado, é absolutamente necessária para a
solvatação da enzima ou dos substratos e produtos. Entretanto, o excesso de
água pode favorecer a reação de hidrólise e não a de síntese (DALLA-VECHIA
et al., 2004).
De acordo com Zaks e Klibanov (1986), uma das principais propriedades
das enzimas suspensas em sistemas não aquosos é o aumento da estabilidade
térmica da enzima relativamente ao meio aquoso. A água possui um papel
importante na inativação enzimática a alta temperatura. Acredita-se que a altas
temperaturas, a água aumente a mobilidade das moléculas de proteína e isto
aumente a taxa de desnaturação.
Solventes mais hidrofílicos apresentam uma tendência maior em retirar a
água essencial da molécula de enzima. Este princípio também pode ser
aplicado a sistemas envolvendo fluidos supercríticos. Geralmente, a atividade
enzimática aumenta com o aumento do conteúdo de água adicionado ao fluido
supercrítico, até um determinado limite. Quando o conteúdo de água excede o
nível ótimo em reações de transesterificação, as reações de hidrólise tornam-
se predominantes e a taxa da reação desejada decresce. Pode-se, com base
nas informações da literatura, concluir que o tipo de reação e o meio reacional
são também importantes na determinação da dependência da atividade
enzimática com o conteúdo de água (OLIVEIRA, 1999).
2 Revisão Bibliográfica
19
2.3.2 Solvente
A influência da natureza do solvente tem sido interpretada em termos de
vários fenômenos, tais como a mudança na rigidez da enzima causada por
solventes com alta constante dielétrica e interações iônicas na proteína. O
solvente pode estabilizar as cargas no estado de transição através da
modificação da polaridade do sítio ativo, bem como a variação da energia livre
total, que estão associadas com diferentes energias de solvatação do solvente.
Na literatura, não existe um consenso claro com relação à escolha do
parâmetro para descrever quantitativamente o efeito do solvente em reações
catalisadas por enzimas. Porém, o parâmetro mais freqüentemente utilizado é
o log P
oct
, definido como o logaritmo do coeficiente de partição do solvente no
sistema octanol/água (DALLA-VECHIA et al., 2004).
Os solventes que possuem log P
oct
≤ 2 são denominados hidrofílicos e
não são considerados adequados para a biocátalise, porque perturbam
fortemente a interação água-biocatalisador, inativando-o ou desnaturando-o.
Os solventes que possuem log P
oct
superior a 4 são denominados hidrofóbicos
e não perturbam a camada de água, mantendo o biocatalisador no seu estado
ativo. Parâmetros como constante dielétrica (ε), polarizabilidade, bem como o
parâmetro de solubilidade de Hildebrand (δ) e o de solubilidade tridimensional –
uma derivação do parâmetro de Hildebrand – têm sido propostos para avaliar a
influência do solvente nas reações catalisadas por enzimas imobilizadas ou
não (DALLA-VECHIA et al., 2004).
Oliveira e Oliveira (2001), Oliveira e Alves (1999) e Oliveira e Alves
(2000) realizaram estudo da álcoolise enzimática do óleo de dendê e etanol em
solvente orgânico (n-hexano). Os experimentos foram realizados em
Erlenmeyers numa mistura de enzima (concentração pré-estabelecida), óleo-
etanol e 40mL de n-hexano, sendo mantido sob agitação de 200rpm por 6
horas. Na reação catalisada pela enzima Lipozyme IM obteve-se 77,5% de
conversão em etil ésteres. Já para a enzima Novozym 435 obteve-se
conversão de 58,3%.
Faccio (2004) realizou um estudo da reação de transesterificação dos
óleos de mamona e soja utilizando enzimas comerciais (Lipozyme IM e
2 Revisão Bibliográfica
20
Novozym 435) em erlenmeyers mantendo fixa a quantidade de óleo (1g) e
solvente (n-hexano - 40mL) e variando a temperatura, concentração de água e
enzima e variando a razão molar óleo:etanol. Os experimentos foram
realizados sob agitação rotativa (shaker) a 200rpm por 8 horas. A reação que
melhor apresentou conversão foi na temperatura de 65°C, concentração de
enzima 20% (m/m), concentração de água 0% (m/m), na razão molar
óleo:etanol 1:3 para a enzima Lipozyme IM, obtendo uma conversão de 98%
em 6 horas.
Diversos trabalhos descrevem a produção de ésteres por via enzimática
utilizando lipases como catalisadores, e em todos os casos conversões
satisfatórias foram observadas quando da utilização de uma razão mássica de
solvente:substratos em torno de 40:1. Esta elevada relação é, sem dúvida, uma
das principais desvantagens do uso de enzimas como catalisadores na
transesterificação de óleos vegetais em solventes orgânicos. Relações
inferiores a apresentada ou mesmo a ausência de solvente têm se mostrado
inadequadas à reação de transesterificação enzimática, possivelmente, dado a
significativa resistência à transferência de massa (DALLA ROSA, et al., 2010).
A substituição de um solvente orgânico, tal como o n-hexano, por um
fluido pressurizado em reações enzimáticas, resultará em maiores taxas de
transferência de massa devido às propriedades de transporte favorável. Um
benefício adicional do emprego de fluido supercrítico na catálise enzimática é a
presença de um meio adequado à recuperação dos produtos e reagentes
(OLIVEIRA e OLIVEIRA, 2000 e 2001).
Numerosos estudos mostraram que muitas reações podem ser
conduzidas em dióxido de carbono líquido ou supercrítico e em fluidos
pressurizados, como propano e n-butano (KNEZ e HABULIN, 2001; OLIVEIRA
et al., 2000 e 2001; DALLA ROSA et al., 2008) devido suas propriedades de
transporte favoráveis a transferência de massa.
Entretanto, há um inconveniente com relação à polaridade do CO
2
, pois
suas características hidrofílicas podem afetar negativamente a atividade da
enzima (OLIVEIRA et al., 2006a).
Para Knez e Habulin (2001), que utilizaram as lipases Pseudomonas
fluorescens, Rhizopus javanicus, Rhizopus niveus e porcine pancreas em CO
2
2 Revisão Bibliográfica
21
supercrítico e propano a 300bar e 40°C por 24 horas, a atividade das enzimas
em propano foi maior do que em CO
2
supercrítico, possivelmente devido às
diferentes partições de água no solvente.
Oliveira et al. (2006b), avaliaram a atividade de esterificação de lipases
imobilizadas (Lipozyme IM, Novozym 435 e lipase de Yarrowia lipolytica) em
fluidos pressurizados: dióxido de carbono (70 - 275bar), propano (30 - 250bar)
e n-butano (10 - 250bar). No processamento em CO
2
as três lipases perderam
atividade em todas as condições experimentais avaliadas. Para o
processamento com propano, as lipases Lipozyme IM e Yarrowia lipolytica
apresentaram perda na atividade, enquanto que a Novozym 435 apresentou
um aumento na atividade em todas as condições experimentais estudadas. O
processamento em n-butano apresentou os mesmos resultados apontados no
processamento com propano.
Segundo Lozano et al. (2001) apud Eisenmenger et al. (2009) a
estabilidade e a seletividade de lipases em líquidos iônicos aumentaram
2,7 vezes e 2%, respectivamente, quando comparadas com o hexano.
A atividade enzimática depende do tipo de fluido utilizado,
provavelmente como resultado de diferentes interações proteína-solvente. As
interações proteína-meio pressurizado que podem afetar a atividade enzimática
incluem a partição do substrato, produto e água entre a enzima e o solvente, e
interações diretas entre o fluido e a enzima, as quais podem inibir ou inativar a
enzima por quebra das ligações de hidrogênio e iônicas. Os solventes menos
nocivos às enzimas são aqueles mais hidrofóbicos, pois interagem menos com
a água necessária para o funcionamento da enzima. Solventes hidrofílicos, ou
seja, solventes que contêm maior quantidade de grupos polares ou centros
capazes de formar pontes de hidrogênio, tendem a retirar a água essencial das
proximidades da enzima, acarretando a perda da atividade enzimática (KNEZ e
HABULIN, 2001).
O CO
2
não é o único gás para o qual as propriedades parecem ser
adequadas para emprego como solvente em biocatálise. Propano pressurizado
também pode ser apropriado como um meio de reação para bioconversões
catalisadas por enzimas, uma vez que o propano próximo ao seu ponto crítico
tem uma constante dielétrica comparável a do CO
2
(HABULIN e KNEZ, 2002),
2 Revisão Bibliográfica
22
e as pressões de transição de fase com o propano, geralmente encontradas
em sistemas formados por compostos de alto peso molecular (triglicerídeos,
por exemplo), são muito mais baixas do que aquelas encontradas em sistemas
com CO
2
(LANZA et al., 2005; NDIAYE et al., 2006a; NDIAYE et al., 2006b).
Assim, devido ao fato de as enzimas responderem diferentemente à
modificações na superfície, os efeitos obtidos no uso de propano comprimido
como solvente em um sistema enzimático não podem ser aplicados a outros
sistemas enzimáticos.
2.3.3 Temperatura
A maioria das enzimas possui atividade específica, capaz de catalisar
apenas uma determinada reação e de fazê-la só em um tipo de meio ou
substrato. Algumas enzimas são mais versáteis. Entretanto, todas as enzimas
operam dentro de um limite estreito de temperatura e pH (COX, 1987). Grande
parte das enzimas apresenta sua atividade ótima em uma faixa de 30 a 40ºC,
sendo que acima de 45ºC pode ocorrer o início da desnaturação (FENNEMA,
1993).
Com o aumento da temperatura pode ocorrer a desnaturação da
proteína enzimática, que consiste na perda irreversível da conformação nativa,
modificando a estrutura terciária e quaternária da proteína globular. Desta
forma, a enzima passa de uma conformação ativa a uma conformação
desprovida de atividade. As enzimas possuem uma temperatura de resistência
máxima à desnaturação. Entretanto, na desnaturação das enzimas pelo calor a
relação tempo/temperatura, ou seja, a duração e a intensidade do tratamento
térmico são de fundamental importância. Os efeitos que se observam nas
enzimas apresentam papel relevante, uma pequena modificação da
conformação do centro ativo pode conduzir à perda da atividade catalítica
(SCRIBAN, 1985; BELITZ e CROSCH, 1997).
Uma das principais propriedades das enzimas suspensas em sistemas
não aquosos é o aumento da estabilidade térmica da enzima relativamente ao
meio aquoso. Em altas temperaturas, a água aumenta a mobilidade das
moléculas de proteína e isto pode aumentar a taxa de desnaturação (ZAKS e
2 Revisão Bibliográfica
23
KLIBANOV, 1986). Desta forma, é natural que a enzima exiba maior
termoestabilidade em meio não aquoso.
2.3.4 Pressão
Ao contrário dos tratamentos térmicos, onde tanto ligações covalentes
como não covalentes são afetadas, no processamento à alta pressão em
temperatura ambiente as ligações covalentes são pouco afetadas e,
conseqüentemente, a estrutura primária das proteínas permanece intacta
durante o tratamento sob pressão (CHEFTEL, 1995). Entretanto, ligações
químicas relativamente fracas (pontes de hidrogênio, ligações hidrofóbicas ou
mesmo algumas ligações iônicas) podem ser rompidas (HENDRICKX et al.,
1998). Pode-se então pelo tratamento a alta pressão distorcer a estrutura
secundária e terciária do polipeptídeo, o que resultaria numa conformação da
enzima diferente da nativa, mas que mantivesse ou aumentasse a atividade
catalítica, sem que ocorra a desnaturação da proteína. Em geral, pressões
acima de 3000bar à temperatura ambiente causam desnaturação protéica
irreversível, enquanto pressões menores resultam em mudanças reversíveis na
estrutura da proteína (CHEFTEL, 1995).
Os efeitos da alta pressão sobre enzimas podem ser divididos em duas
classes. Na primeira, pressões hidrostáticas relativamente baixas (<1000bar)
têm mostrado ativação de algumas enzimas (ASAKA et al., 1994; ANESE et al.,
1995; CANO et al., 1997; GIEBAUF e GAMSE, 2000; FRICKS et al., 2006).
Pressões muito maiores (>1000bar), geralmente induzem à inativação
enzimática (WEEMAES et al., 1998), porém há também casos de aumento da
atividade (GARCIA-PALAZON et al., 2004).
Pode-se inferir que dependendo da magnitude da pressão aplicada, a
extensão das mudanças na estrutura em proteínas globulares pode ser
diferente de uma enzima para outra. Neste sentido, pode também não ocorrer
mudanças significativas na estrutura da enzima mesmo a altas pressões.
2 Revisão Bibliográfica
24
2.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Na revisão bibliográfica apresentada no decorrer deste capítulo,
procurou-se relatar a aplicação de lipases em fluidos pressurizados, as
características do biocatalisador e do solvente, e as variáveis que podem afetar
no comportamento da atividade das enzimas quando submetidas a altas
pressões.
Em reações limitadas pela difusão, o uso de um fluido pressurizado
como solvente pode se constituir em uma alternativa satisfatória ao uso de
solventes orgânicos convencionais, uma vez que as propriedades semelhantes
as dos gases, facilitam as taxas de transferência de massa entre reagentes e
catalisadores e a quantidade de solvente exigida é reduzida. Como um
solvente interessante para as reações catalisadas por lipases, aponta-se o
emprego do propano, devido suas propriedades e capacidade de dissolver
compostos hidrofóbicos.
Com base nos fatores que podem afetar a atividade das enzimas, de
fundamental importância é a sua avaliação prévia no fluido pressurizado a ser
empregado.
Tendo como base a revisão da literatura, a carência de dados na
mesma, uma vez que poucos trabalhos sobre a atividade de lipases não
comerciais submetidas a pressões elevadas em um sistema enzima-solvente
estão disponíveis, e a primordial importância do conhecimento prévio das
condições adequadas a serem aplicadas nos processos de biotransformação,
pode-se verificar a relevância no desenvolvimento de estudos na busca de
processos e meios apropriados, visando maior conhecimento das condições
ótimas de produção e de métodos de obtenção mais viáveis.
3 Materiais e Métodos
25
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Neste capítulo é apresentada uma descrição dos materiais utilizados e
os métodos e equipamentos empregados para realização deste trabalho.
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Reagentes
O solvente utilizado foi propano de procedência White Martins S.A. (com
99,5% pureza, fase líquida). As propriedades críticas do solvente utilizado,
segundo Reid et al. (1987), são as seguintes: pressão crítica = 42,49bar,
temperatura crítica = 96,6
°
C e densidade crítica = 0,22g/cm
3
.
Para determinação da atividade enzimática foi utilizado ácido oléico de
pureza elevada de procedência Sigma-Aldrich, álcool etílico Merck (99,9% de
pureza), acetona P.A. Fmaia e solução de NaOH 0,01N, todos de grau
analítico.
3.1.2 Enzimas
Três lipases não comerciais, nas suas formas imobilizada e liofilizada,
gentilmente cedidas pelo Laboratório de Biotecnologia Microbiana do Instituto
de Química da UFRJ, foram utilizadas na realização deste trabalho. As
características específicas das lipases são apresentadas a seguir:
• Lipase de P. simplicissimum imobilizada – produzida por fermentação
em estado sólido, pela cepa de Penicillium simplicissimum, utilizando
torta de pinhão manso como substrato e imobilizada em Accurel
MP1000. Não foi estudada uma faixa ótima de temperatura.
• Lipase de P. simplicissimum liofilizada – produzida por fermentação em
estado sólido, pela cepa de Penicillium simplicissimum, utilizando torta
de pinhão manso como substrato. Possui temperatura ótima em 50ºC.
3 Materiais e Métodos
26
• Lipase de A. parasiticus imobilizada – produzida por fermentação em
estado sólido, pela cepa de Aspergillus parasiticus, utilizando torta de
babaçu como substrato e imobilizada em Accurel MP1000. Não foi
estudada uma faixa ótima de temperatura.
• Lipase de A. parasiticus liofilizada – produzida por fermentação em
estado sólido, pela cepa de Aspergillus parasiticus, utilizando torta de
babaçu como substrato. Possui temperatura ótima em 35ºC.
• Lipase de A. wentii imobilizada – produzida por fermentação em estado
sólido, pela cepa de Aspergillus wentti, utilizando torta de pinhão manso
como substrato e imobilizada em Accurel MP1000. Não foi estudada
uma faixa ótima de temperatura.
• Lipase de A. wentii liofilizada – produzida por fermentação em estado
sólido, pela cepa de Aspergillus wentti, utilizando torta de pinhão manso
como substrato. Possui faixa ótima de temperatura entre 35-40ºC.
Os extratos contendo lipases extracelulares de P. simplicissimum e A.
wentii foram produzidos por fermentação em estado sólido utilizando torta de
pinhão manso como substrato. Lipase de A. parasiticus foi obtida a partir do
resíduo de torta de babaçu, em fermentação em estado sólido. 10g de
substrato foram suplementados com melaço de cana-de-açúcar (6,25% m/m),
umedecido a 70% (m/m) e inoculado com 10
7
esporos g
-1
de substrato seco.
Após 72h de fermentação a enzima foi extraída com 45mL de tampão fosfato
de sódio 100mmol/L em pH 7,0. A solução de proteína foi precipitada com
sulfato de amônio (60% de saturação) e centrifugada a 13.000g por 30min.
Após a centrifugação, o precipitado contendo a lipase foi dissolvido em
5mmol/L de tampão fosfato de sódio em pH 7,0 e dialisado contra o mesmo
tampão, por 2h a
4ºC
. Para liofilização, os extratos foram transferidos para
placas de Petri, (9cm de diâmetro, altura do líquido de 0,5cm) e congelados por
24 horas a -80ºC. As placas foram colocadas em um secador de bandejas
(Modulyo, Thermo Scientific, Waltham, MA, E.U.A.) e o extrato liofilizado para
um teor de umidade final de 3%.
Imobilização: os extratos enzimáticos foram solubilizados em tampão
fosfato (50 mmol/L, pH 7,0) e submetidos à imobilização por adsorção física em
3 Materiais e Métodos
27
suporte hidrofóbico (Accurel, MP1000, Membrana, Alemanha). A preparação foi
realizada pela adição de 10mL de etanol a 1000mg de suporte. Depois de
30min, o sobrenadante foi descartado e o suporte foi lavado várias vezes com
água destilada até que o etanol fosse completamente removido. A imobilização
da enzima foi obtida na proporção de enzima solúvel (mL): suporte (mg) de
1:25, sendo realizada com agitação magnética em banho de gelo e alíquotas
retiradas periodicamente (0, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 e 120min) para
dosagem de proteína. O sobrenadante e o suporte com a enzima também
foram analisados com relação à atividade enzimática. O teor de umidade
residual da enzima imobilizada não foi maior que 1%.
Todas as lipases citadas anteriormente foram definidas para avaliação
neste trabalho com base em projeto de maior magnitude, existente em parceria
da URI, UFRJ e CENPES/PETROBRÁS que visa, em última instância, a
produção enzimática de biodiesel em meios não convencionais, utilizando
lipases não comerciais como catalisadores.
3.2 EQUIPAMENTOS E METODOLOGIA
3.2.1 Determinação da atividade enzimática de lipases
A atividade das enzimas foi quantificada pelo consumo de ácido oléico
na reação de esterificação entre o ácido oléico e o etanol com razão molar
ácido-álcool de 1:1 à temperatura de 40
o
C, com a enzima a 2% (m/m) mantida
sob agitação por 12 minutos. A reação foi iniciada pela adição da enzima ao
meio reacional, em shaker sob agitação. Alíquotas de 150µL, em quadruplicata,
foram retiradas do meio reacional no tempo zero e após 12 minutos de reação
e foram diluídas em 20mL de acetona-etanol (1:1). A quantidade de ácido
oléico consumida foi determinada por titulação com NaOH 0,01N. Uma unidade
de atividade foi definida como a quantidade de enzima que conduz ao consumo
de 1µmol de ácido oléico por minuto nas condições experimentais descritas.
Uma vista geral do aparato experimental usado para a medida de
atividade enzimática pode ser verificada na Figura 2.
3 Materiais e Métodos
28
Figura 2 - Equipamentos utilizados para medida de atividade enzimática. A–
shaker; B- titulador (bureta automática); C- pHmetro.
A seguinte equação foi empregada para o cálculo da atividade das
lipases:
Atividade (U/g) = [(V
0
NaOH
) – (V
12
NaOH
)] x N x 10
3
x Vt
t x ma x Va
onde: N = normalidade da solução de hidróxido de sódio;
V
0
= volume de hidróxido de sódio gasto na titulação da amostra no
tempo zero (mL);
V
12
= volume de hidróxido de sódio gasto na titulação da amostra após
12 minutos de reação (mL);
ma = massa de enzima utilizada na reação (g);
t = tempo de reação (min);
Vt = volume total;
Va = volume da alíquota;
1U = 1µmol de ácido/minuto.
A
B
C
3 Materiais e Métodos
29
A atividade residual foi calculada através da equação abaixo:
Atividade Residual (%) = Atividade (U/g) após a pressurização
x 100
Atividade (U/g) antes da pressurização
As atividades das enzimas foram determinadas no início e ao final das
reações em todos os experimentos realizados, objetivando o acompanhamento
da alteração da sua atividade quando submetida ao propano pressurizado.
3.2.2 Tratamento das enzimas em propano pressurizado
O equipamento utilizado nos experimentos de avaliação da atividade da
enzima em fluidos pressurizados consiste basicamente de um reservatório de
solvente (propano), dois banhos termostáticos, uma bomba de seringa (ISCO
260D), uma cuba de aço inoxidável com um volume interno de 3mL, um
transdutor de pressão absoluta (Smar, LD301) equipado com um programador
portátil (Smar, HT201) com uma precisão de ± 0,4bar. O diagrama esquemático
do equipamento é apresentado na Figura 3. O equipamento foi construído para
conduzir os experimentos até 350bar e 80°C (FRICKS et al., 2006; FRANKEN
et al., 2010). Todas as linhas de montagem experimental empregaram
tubulações OD 1/16" de aço inoxidável (HIP) e entre a bomba e o reservatório
de solvente uma “check valve” (HIP 15-41AF1-T 316SS) foi colocada para
evitar o refluxo do solvente pressurizado.
Duas outras válvulas micrométricas (HIP 15-11AF2 316SS) completaram
o aparato experimental, uma localizada após a bomba de seringa, na entrada
da célula de alta pressão, para permitir o carregamento de solvente e a outra
logo após a célula para realizar a descarga do solvente. A célula de alta
pressão encontrava-se submersa em banho de água e apoiada por um
dispositivo simples, enquanto que as válvulas micrométricas ficavam
localizadas fora do banho.
3 Materiais e Métodos
30
A lipase (aproximadamente 0,15g) foi colocada na célula e o reator
mergulhado no banho com a temperatura já estabelecida (35ºC). Após esta
etapa, o sistema foi pressurizado e mantido à pressão e temperatura
constantes por um tempo de exposição pré-estabelecido. Tipicamente, o tempo
de pressurização era menor que 0,5 minutos, não sendo este incluído no tempo
definido devido à sua pouca significância quando comparado ao tempo de
exposição estabelecido. A seguir, nas taxas de descompressão pré-definidas
(2–20bar/min), o sistema era despressurizado e a atividade lipásica
determinada. A atividade residual da lipase foi determinada em relação à
atividade antes e após o tratamento.
Uma vista geral da unidade e da célula utilizada nos experimentos pode
ser verificada nas Figuras 4 e 5.
Figura 3 - Diagrama esquemático do aparato utilizado no tratamento das
enzimas com o propano pressurizado. A– reservatório de solvente; B– banho
termostatizado; C– bomba de seringa; D– reator/célula de aço; E– indicador de
pressão; F– transdutor de pressão; G– válvula micrométrica.
3 Materiais e Métodos
31
Figura 4 – A- detalhes da célula de aço inoxidável com volume interno de 3mL;
B- célula de aço montada com a válvula micrométrica.
Figura 5 – A- vista do sistema mergulhado no banho termostatizado; B-
unidade experimental utilizada no tratamento das enzimas.
Um planejamento experimental 2
3
, com dois níveis e três variáveis
(pressão, tempo de exposição e taxa de despressurização) foi adotado. O
planejamento experimental, levando em consideração os intervalos de
variáveis comumente utilizados para reações de transesterificação é
apresentado na Tabela 2. Foi realizada a triplicata do ponto central para a
avaliação do erro experimental. Os resultados foram analisados usando o
software Statística 6.
B
A
B
A
3 Materiais e Métodos
32
Tabela 2 - Condições experimentais avaliadas no planejamento experimental
realizado para cada lipase não comercial.
Experime
nto
P (bar)
t (h)
R (bar/min)
1 30(-1) 1(-1) 2(-1)
2 30(-1) 1(-1) 20(+1)
3 30(-1) 6(+1) 2(-1)
4 30(-1) 6(+1) 20(+1)
5 70(+1) 1(-1) 2(-1)
6 70(+1) 1(-1) 20(+1)
7 70(+1) 6(+1) 2(-1)
8 70(+1) 6(+1) 20(+1)
9 50 (0) 3,5 (0) 11 (0)
10 50 (0) 3,5 (0) 11 (0)
11 50 (0) 3,5 (0) 11 (0)
3.2.3 Caracterização dos catalisadores
A análise textural dos catalisadores foi realizada a partir das isotermas
de adsorção/dessorção de N
2
. As medidas foram realizadas para a
determinação das áreas superficiais, volume total de poros, volume de
microporos e diâmetro médio de poros e distribuição de tamanhos de poros.
Foi empregado o equipamento AUTOSORB-1 da Quantachrome (Nova-
2200e). Antes da análise, as amostras foram tratadas a vácuo, a uma
temperatura de 100°C para garantir a secagem comple ta. As medidas foram
realizadas na temperatura do N
2
líquido (-196°C). Os parâmetros texturais
foram determinados a partir das isotermas obtidas. A área superficial específica
foi determinada pelo método BET e o diâmetro médio dos poros utilizou o
método BJH (Barret, Joynere, Halenda) na faixa da adsorção.
4 Resultados e Discussões
33
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
O presente capítulo visa apresentar os resultados obtidos no decorrer
deste trabalho, relacionados à avaliação da atividade de esterificação de
lipases não comerciais após processamento em propano pressurizado. Para
efeitos de melhor compilação e avaliação dos dados obtidos, a apresentação
será abordada de acordo com a lipase utilizada.
4.1 ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO DA LIPASE DE Aspergillus
parasiticus EM PROPANO PRESSURIZADO
Nesta etapa são apresentados e discutidos os resultados obtidos na
avaliação da atividade de esterificação da lipase de Aspergillus parasiticus nas
formas imobilizada e liofilizada.
Lipase de Aspergillus parasiticus imobilizada
A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos para a atividade enzimática
da lipase de Aspergillus parasiticus imobilizada. De acordo com estes
resultados a enzima submetida a propano pressurizado apresentou ganho ou
perda de atividade dependendo das condições experimentais investigadas. A
atividade de esterificação inicial desta enzima, determinada neste trabalho, é
de 685U/g. O maior ganho de atividade ocorreu no experimento 8 (258,56%),
relacionado às condições de limite superior de pressão, tempo de exposição e
taxa de despressurização.
A Tabela 4 apresenta os efeitos estimados para cada uma das variáveis
independentes estudadas na atividade da lipase no sistema com propano
pressurizado.
4 Resultados e Discussões
34
Tabela 3 - Atividade enzimática da Aspergillus parasiticus imobilizada
submetida a propano pressurizado.
Experimento
P (bar)
T
(h)
R (bar/min)
Atividade Final
(U/g)
Atividade
Residual (%)
1 30 1 2 356,2 52,0
2 30 1 20 338 49,3
3 30 6 2 220,5 32,2
4 30 6 20 459,5 67,0
5 70 1 2 897,8 131,1
6 70 1 20 407,1 59,4
7 70 6 2 417,7 61,0
8 70 6 20 1771,1 258,6
9 50 3,5 11 887,9 129,6
10 50 3,5 11 895,9 130,8
11 50 3,5 11 956,4 139,6
Atividade inicial: 685U/g.
Tabela 4 - Efeitos estimados das variáveis na resposta atividade da lipase de
Aspergillus parasiticus imobilizada no sistema com propano pressurizado, ao
nível de 95% de confiança.
Variável
Efeito
t (2)
P
Independente 100,9591
61,18229 0,000267
Pressão (P) 38,6875 19,99400 0,002492
Tempo de exposição (t) 15,8625 8,19786 0,014556
Taxa de despressurização (R) 19,7625 10,21341 0,009451
Pressão (P) x Tempo de exposição (t) 16,4025 8,47694 0,013632
Pressão (P) x Taxa de despressurização (R) 11,7225 6,05828 0,026181
Tempo de exposição (t) x Taxa de
despressurização (R)
38,3375 19,81311 0,002538
Com relação à atividade da lipase submetida a propano
pressurizado,
como mostra a Tabela 4, todas as variáveis afetaram a atividade enzimática.
Nota-se que a pressão, assim como a interação entre o tempo de exposição e
4 Resultados e Discussões
35
a taxa de despressurização apresentaram-se mais significativas, sugerindo que
submeter a enzima ao solvente em uma maior pressão e maior tempo de
exposição x taxa de despressurização, ocasionaria um maior ganho de
atividade. Alguns trabalhos apresentados na literatura (KNEZ e HABULIN,
2002; FRANKEN et al., 2010 e OLIVEIRA et al., 2006b) sugerem que a etapa
de despressurização interfere na atividade enzimática depois do tratamento
com fluidos pressurizados e, segundo CHEFTEL (1995), o tratamento a alta
pressão pode distorcer a estrutura secundária e terciária do polipeptídeo, o que
resultaria numa conformação da enzima diferente da nativa, mas que
mantivesse ou aumentasse a atividade catalítica, sem que ocorra a
desnaturação da proteína.
Lipase de Aspergillus parasiticus liofilizada
A Tabela 5 apresenta os resultados obtidos para a atividade enzimática
da Aspergillus parasiticus liofilizada submetida a propano em altas pressões.
Tabela 5 - Atividade enzimática da Aspergillus parasiticus liofilizada submetida
a propano pressurizado.
Experimento
P (bar)
t (h)
R (bar/min)
Atividade Final
(U/g)
Atividade
Residual (%)
1 30 1 2 423,4 63,7
2 30 1 20 644,2 96,9
3 30 6 2 437,1 65,7
4 30 6 20 808,7 121,6
5 70 1 2 584,7 87,9
6 70 1 20 466,9 70,2
7 70 6 2 491,2 73,9
8 70 6 20 533,7 80,3
9 50 3,5 11 751,5 113,0
10 50 3,5 11 711,5 107,0
11 50 3,5 11 687,5 103,4
Atividade inicial: 665U/g.
4 Resultados e Discussões
36
De acordo com estes resultados a enzima liofilizada submetida a
propano pressurizado apresentou diferentes valores de atividade, sendo que as
maiores perdas de atividade ocorreram no experimento 1, que apresentou
perda de 36,33% e no experimento 3, que apresentou perda de 34,27%. Estes
dois experimentos apresentavam condições de menor pressão (30bar) e taxa
de despressurização (2bar/min), porém diferentes tempos de exposição (1h e
6h, respectivamente). A atividade de esterificação inicial desta enzima foi de
665U/g.
Cabe observar que neste solvente a enzima liofilizada apresentou um
ganho de atividade enzimática nos experimentos referentes ao ponto central,
assim como ocorreu para a enzima imobilizada, mostrando que a enzima na
sua forma livre, sem a adição de nenhum processo dispendioso após a sua
obtenção, também é estável em solvente pressurizado.
No diagrama de Pareto (Figura 6) são apresentados os efeitos
estimados para cada variável estudada na atividade da lipase liofilizada no
sistema utilizando propano pressurizado. Pode-se observar que as variáveis
taxa de despressurização (R) e a interação pressão x taxa de despressurização
mostraram-se significativas a nível de 95%. A variável taxa de
despressurização foi a que mais afetou positivamente o ganho de atividade
enzimática da enzima submetida a propano pressurizado. Conclui-se então
que, quanto maior a taxa de despressurização (R), maior será o ganho de
atividade enzimática. De acordo com Knez e Habulin (2002) a taxa de
despressurização é um passo determinante em relação à atividade da enzima
pré-tratada em fluidos pressurizados.
4 Resultados e Discussões
37
1,616258
-2,18386
-2,52868
3,319076
5,517131
-7,12346
p=,05
Estimativa dos Efeitos
Tempo
Pressão x Tempo
Pressão
Tempo x R
R
1by3
Figura 6 - Diagrama de Pareto para a lipase Aspergillus parasiticus liofilizada
no sistema propano pressurizado, em função das variáveis independentes
estudadas e da atividade de esterificação obtida.
4.2 ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO DA LIPASE DE Aspergillus wentii
EM PROPANO PRESSURIZADO
Nesta etapa são apresentados os resultados obtidos para a atividade de
esterificação da lipase A. wentii imobilizada. Cumpre salientar que a etapa de
avaliação da atividade residual utilizando a referida lipase imobilizada foi
investigada em apenas uma condição experimental, devido à falta de amostra
de enzima suficiente para completar o planejamento experimental. Deste modo,
a lipase A. wentii imobilizada, que tem como atividade inicial de esterificação
370U/g, apresentou no experimento de ponto central (pressão de 50bar, tempo
de 3,5 horas e taxa de despressurização de 11bar/min) uma atividade
enzimática de 59,8U/g, sendo a atividade residual de 16%, ou seja, houve
grande perda de atividade para esta enzima nesta condição experimental.
Entretanto, tal resultado não é parâmetro para se obter uma conclusão precisa
acerca do comportamento de tal enzima em propano a alta pressão, uma vez
que a atividade enzimática pode variar de forma significativa dependendo da
condição experimental utilizada.
4 Resultados e Discussões
38
Lipase de Aspergillus wentii liofilizada
A Tabela 6 apresenta os resultados obtidos para a atividade enzimática
da Aspergillus wentii liofilizada. De acordo com estes resultados a enzima
submetida a propano pressurizado apresentou um maior ganho de atividade
nos experimentos conduzidos no menor nível de pressão. A atividade de
esterificação inicial desta enzima é de 582U/g, e nas condições de limite
inferior de pressão, a atividade residual da enzima foi superior a 100%.
O gráfico de Pareto da figura 7 apresenta os efeitos estimados para
cada variável estudada na atividade da lipase liofilizada no sistema utilizando
propano pressurizado. Com relação ao ganho de atividade, a variável que mais
fortemente afetou foi a pressão, tendo esta um efeito negativo, ou seja, a
atividade residual enzimática foi maior quando a enzima foi submetida ao
menor limite de pressão. Em seguida, com efeitos positivos significativos, tem-
se a taxa de despressurização, e as interações pressão x tempo e pressão x
taxa de despressurização.
Tabela 6 - Atividade enzimática da Aspergillus wentii liofiizada submetida a
propano pressurizado.
Experimento
P (bar)
t (h)
R (bar/min)
Atividade Final
(U/g)
Atividade
Residual (%)
1 30 1 2 723,7 124,4
2 30 1 20 898,4 154,6
3 30 6 2 669,9 115,3
4 30 6 20 687,2 118,3
5 70 1 2 95,6 16,4
6 70 1 20 318,8 54,8
7 70 6 2 265,6 45,7
8 70 6 20 773,7 133,6
9 50 3,5 11 511,1 88,0
10 50 3,5 11 544,7 93,7
11 50 3,5 11 474,6 81,7
Atividade inicial: 582U/g.
4 Resultados e Discussões
39
1,27275
3,639188
5,421624
8,953726
9,313022
-15,3567
p=,05
Estimativa dos Efeitos
Tempo x R
Tempo
Pressão x R
Pressão x Tempo
R
Pressão
Figura 7 - Diagrama de Pareto para a lipase Aspergillus wentii liofilizada no
sistema propano pressurizado, em função das variáveis independentes
estudadas e da atividade de esterificação obtida.
4.3 ATIVIDADE DE ESTERIFICAÇÃO DA LIPASE DE Penicillium
simplicissimum EM PROPANO PRESSURIZADO
Nesta etapa são apresentados e discutidos os resultados obtidos na
avaliação da atividade de esterificação da lipase de Penicillium simplicissimum
nas formas imobilizada e liofilizada.
Lipase de Penicillium simplicissimum imobilizada
A Tabela 7 apresenta os resultados obtidos para a atividade enzimática
da Penicillium simplicissimum imobiilizada submetida a propano em altas
pressões.
4 Resultados e Discussões
40
Tabela 7 - Atividade enzimática da Penicillium simplicissimum imobilizada
submetida a propano pressurizado.
Experimento
P (bar)
t (h)
R (bar/min)
Atividade Final
(U/g)
Atividade
Residual (%)
1 30 1 2 347,3 101,0
2 30 1 20 61,9 17,9
3 30 6 2 321,7 93,0
4 30 6 20 128,8 37,2
5 70 1 2 290,88 84,0
6 70 1 20 375,8 108,6
7 70 6 2 156,3 45,2
8 70 6 20 432,6 125,0
9 50 3,5 11 1003,7 290,1
10 50 3,5 11 963,3 278,4
11 50 3,5 11 913,3 264,0
Atividade inicial: 346U/g.
Pode ser observado que os experimentos que demonstraram maior
aumento da atividade enzimática da P. simplicissimum imobilizada foram os
relacionadas ao ponto central, os quais, como em todos os experimentos deste
trabalho, tiveram uma excelente reprodutibilidade. Nos demais experimentos, a
enzima apresentou ganho ou perda de atividade dependendo das condições de
execução. A atividade de esterificação inicial desta enzima foi de 346U/g.
A Tabela 8 apresenta os efeitos estimados para cada uma das variáveis
independentes estudadas na atividade da lipase no sistema com propano
pressurizado.
4 Resultados e Discussões
41
Tabela 8 - Efeitos estimados das variáveis na resposta atividade da lipase de
Penicillium simplicissimum imobilizada no sistema com propano pressurizado,
ao nível de 95% de confiança.
Variável
Efeito
t (2)
P
Independente 131,2491
33,26923 0,000902
Pressão (P) 28,5950 3,09069 0,090673
Tempo de exposição (t) -2,6350 -0,28480 0,802577
Taxa de despressurização (R) -8,4550 -0,91386 0,457260
Pressão (P) x Tempo de exposição (t) -8,5950 -0,92899 0,450967
Pressão (P) x Taxa de despressurização (R) 60,6650 6,55697 0,022478
Tempo de exposição (t) x Taxa de
despressurização (R)
20,5150 2,21736 0,156884
Para este sistema, a interação pressão x taxa de despressurização foi a
única variável significativa, e que ocasionou ganho de atividade na P.
simplicissimum imobilizada submetida a propano
em altas pressões. Como
mostrado na Tabela 8, o efeito foi significativo positivo o que demonstra que
quanto maior a interação taxa de despressurização x pressão do solvente
sobre a enzima maior é o ganho de atividade enzimática.
Lipase de Penicillium simplicissimum liofilizada
A Tabela 9 apresenta os valores de ganho de atividade da enzima
Penicillium simplicissimum liofilizada submetida ao propano pressurizado. Pode
ser verificado que 8 experimentos apresentaram ganho de atividade quando a
enzima Penicillium simplicissimum liofilizada foi exposta a propano a altas
pressões, exceto os experimentos realizados no ponto central, quando a
enzima perdeu integralmente sua atividade, sendo que a atividade de
esterificação inicial desta enzima é de 89,2U/g.
4 Resultados e Discussões
42
Tabela 9 - Atividade enzimática da Penicillium simplicissimum liofilizada
submetida a propano pressurizado.
Experimento
P (bar)
t (h)
R (bar/min)
Atividade Final
(U/g)
Atividade
Residual (%)
1 30 1 2 181,8 203,8
2 30 1 20 328,6 364,1
3 30 6 2 144,8 162,3
4 30 6 20 177,2 198,7
5 70 1 2 380,7 426,9
6 70 1 20 221,8 248,7
7 70 6 2 299,4 335,7
8 70 6 20 113,9 127,7
9 50 3,5 11 0 0
10 50 3,5 11 0 0
11 50 3,5 11 0 0
Atividade inicial: 89,2U/g.
A Figura 8 apresenta os efeitos estimados para cada uma das variáveis
independentes estudadas na atividade da lipase no sistema com propano
pressurizado.
Observou-se neste sistema, que nenhuma das variáveis estudadas
afetou significativamente a atividade enzimática da P. simplicissimum
liofilizada, sendo que a mesma apresentou boa estabilidade e ganho de
atividade tanto nos níveis inferiores e superiores de pressão, tempo de
exposição e taxa de despressurização, salvo os experimentos de nível
intermediário, os quais inativaram a atividade da enzima.
As respostas de atividade enzimática obtidas nos experimentos de ponto
central causaram surpresa, assim cabe ressaltar que muitas condições
experimentais referentes a lipase Penicillium simplicissimum liofilizada como
também das demais enzimas estudadas foram realizadas em duplicata, para a
garantia da confiabilidade dos resultados.
4 Resultados e Discussões
43
-,009927
-,283368
-,349791
,387874
-,772943
-1,07509
p=,05
Estimativa dos Efeitos
Pressão x Tempo
Tempo x R
R
Pressão
Tempo
Pressão x R
Figura 8 - Diagrama de Pareto para a lipase Penicillium simplicissimum
liofilizada no sistema propano pressurizado, em função das variáveis
independentes estudadas e da atividade de esterificação obtida.
A comparação dos resultados para P. simplicissimum nas formas
imobilizada e liofilizada permite concluir que comportamentos diferentes podem
ser obtidos em função da forma da enzima. Especificamente para a lipase de
P. simplicissimum, pode-se observar que a forma liofilizada apresenta um
comportamento particular, apresentando maior atividade residual em muitas
das condições experimentais. Uma hipótese possível para este fato pode estar
associada ao enrijecimento da enzima causado pelo processo de imobilização,
tornando difíceis as alterações conformacionais da estrutura terciária da
proteína.
Segundo Yu et al. (1993) a natureza do suporte usado para imobilizar
uma enzima tem um importante papel na determinação da partição da água
entre enzima, solvente e suporte e, conseqüentemente, na atividade da
enzima.
Com relação ao processo experimental, as variáveis estudadas
mostraram-se significativas no tratamento das enzimas a alta pressão, no
entanto, não foi realizado para estas enzimas nenhum outro estudo envolvendo
4 Resultados e Discussões
44
uma mudança nos níveis das variáveis, uma vez que, as características do
solvente utilizado (propano) não sofrem alterações com o aumento de pressão
na temperatura estabelecida, a qual foi mantida constante devido seu
acréscimo causar a desnaturação das lipases.
Comparando todos os resultados obtidos, do comportamento da
atividade enzimática frente ao propano pressurizado, com os de Oliveira et al.
(2006b), a qual avaliou a atividade das enzimas Novozym 435, Lipozyme IM e
Yarrowia lipolytica submetidas à CO
2
, propano e butano pressurizados, pode–
se observar a concordância entre os mesmos, uma vez que este último
também reporta ganho de atividade enzimática da Novozym 435 quando esta é
pressurizada no fluido propano, e perdas de atividade não significativas para as
demais enzimas, neste mesmo fluido. Cabe salientar, também do trabalho de
Oliveira et al., que assim como com o uso de propano, o butano também trouxe
ganho de atividade para a enzima Novozym 435, em contrapartida, o CO
2
acarretou perda de atividade para todas as enzimas em qualquer condição
experimental.
O trabalho apresentado por Habulin e Knez (2001), o qual estuda a
atividade de algumas lipases na reação de esterificação de ácido butírico e
etanol em CO
2
supercrítico e propano a 100bar e 40°C, mostra que maiores
perdas de atividade foram verificadas em CO
2
e que aumento de atividade de
esterificação das lipases foi observado nos testes com propano.
É importante mencionar que vários estudos disponíveis na literatura
relacionados ao tema atual referem-se à utilização de CO
2
como solvente e na
maioria dos casos, o uso deste solvente levou à perdas na atividade
enzimática, principalmente devido às características hidrofílicas do CO
2
.
Segundo muitos autores, CO
2
supercrítico poderia ser responsável pela
retirada da água essencial responsável pela manutenção da atividade
enzimática (OLIVEIRA et al., 2006 ab; FRICKS et al., 2006; PRIMO et al.,
2007).
Por outro lado, alguns estudos anteriores mostram que os solventes com
baixa constante dielétrica, tais como o propano, poderiam manter, ou mesmo
aumentar a atividade e estabilidade enzimática (KNEZ e HABULIN, 2002;
OLIVEIRA et al., 2006 ab; FRICKS et al., 2006; PRIMO et al., 2007).
4 Resultados e Discussões
45
As propriedades do solvente afetam sua interação com enzimas
específicas e diferentes efeitos podem ser obtidos dependendo da enzima
estudada (KASCHE et al., 1988; FRICKS et al., 2006). Além disso, o gás
propano tem relativa baixa solubilidade em água, podendo-se especular que o
mesmo poderia atuar como um fluido pistonado, aumentando a atividade
enzimática.
É importante citar que na literatura há uma carência de resultados sobre
o comportamento das lipases não-comerciais com atividade de esterificação,
quando tratadas sob fluidos pressurizados. Neste sentido, os resultados
obtidos no presente trabalho podem ser relevantes para efeitos de
desenvolvimento de novas aplicações e/ou processos para estes catalisadores
de baixo custo, quando comparados às enzimas comerciais, para reações de
interesse.
Andrade et al. (2008) ao investigar o efeito de CO
2
e propano
pressurizado no tratamento sobre a atividade de uma solução contendo D-
hidantoinase (2mg sólidos/mL), observaram um declínio contínuo na atividade
da enzima em todas as condições experimentais avaliadas em CO
2
comprimido. A atividade da enzima na solução residual apresentou valores de
cerca de 60%, indicando que a enzima foi desnaturada durante o pré-
tratamento com dióxido de carbono comprimido.
Desnaturação de proteínas induzida por pressão tem sido um importante
tópico de pesquisa nos últimos anos e, a partir de alguns exemplos existentes,
a desnaturação parece ser um processo reversível, diferente da desnaturação
causada pela temperatura (HEREMANS et al., 1996). Além disso, nos
trabalhos apresentados por Andrade et al. (2008), após 2h de tratamento da
enzima em propano pressurizado uma ligeira alteração na atividade residual foi
observada.
Comparando os resultados obtidos com CO
2
e propano dos autores
acima citados verificou-se que as proteínas parecem ser mais estáveis em
propano do que em CO
2
. Este fato pode ser explicado em termos da maior
solubilidade do CO
2
em solução aquosa em comparação com propano. Uma
série de conjeturas tem sido apresentada na literatura sobre o efeito do
tratamento com CO
2
na atividade enzimática. No entanto, devido à recente
4 Resultados e Discussões
46
aplicação de propano pressurizado como solvente, poucas informações sobre o
efeito deste líquido na atividade da enzima estão disponíveis.
No caso específico dos resultados apresentados neste trabalho, pode-se
verificar que o emprego de propano pressurizado como solvente, em boa parte
das condições avaliadas, conduziu a um aumento da atividade residual da
maioria das lipases estudadas.
Assim, os resultados reportados na literatura e os apresentados neste
trabalho, parecem indicar que os solventes com baixa constante dielétrica e
ativação interfacial, permitem maior acesso ao sítio ativo da enzima (KNEZ et
al., 1998).
4.4 CARACTERIZAÇÃO DOS CATALISADORES
Para a caracterização dos catalisadores e comparação destes com um
catalisador comercial (Novozym 435), foram selecionadas duas amostras, as
quais apresentaram, de modo geral, maior aumento na atividade enzimática, P.
simplicissimum imobilizada e A. parasiticus imobilizada.
A partir das isotermas de adsorção do nitrogênio foram deteminadas as
seguintes propriedades do catalisador: A
BET
(área superficial determinada pela
isoterma BET); V
BJH
(volume dos poros, determinado pelo modelo BJH);
diâmetro médio do poro (determinado pelo modelo BJH).
O resultado da caracterização, comparado com os de uma enzima
comercial, são apresentados na Tabela 10.
Tabela 10 - Resultado da caracterização dos catalisadores pela análise de BET.
Enzima
Atividade
Enzimática
(U/g)
Diâmetro de
Poro (nm)
Volume de
Poro
(mL/g)
Área Superficial
– BET (m
2
/g)
Novozym 435 2388 15,0 0,50 130,0
P. simplicissimum
imobilizada (Accurel
MP1000)
346 13,0 0,14 42,6
A. parasiticus imobilizada
(Accurel MP1000)
685 13,0 0,14 46,3
4 Resultados e Discussões
47
Conforme a Tabela 10, verifica-se que a atividade da lipase Novozym
435 é significativamente superior às atividades das enzimas não comerciais,
todas avaliadas utilizando ácido oléico e etanol como substratos da reação.
Observa-se também que o diâmetro do poro das enzimas utilizadas
neste trabalho é semelhante à lipase comercial Novozym 435, porém com
relação ao volume do poro e área superficial as mesmas possuem valores
consideravelmente inferiores aos da enzima comercial.
O baixo volume de poro e área superficial pode acarretar em
dificuldades de transferência de massa devido a menor difusão, uma vez que
poros pequenos dificultam a entrada do solvente em suas cavidades,
dificultando a reação, todavia esta ainda é uma questão a ser estudada e
aperfeiçoada.
4.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir dos resultados apresentados no decorrer deste capítulo,
relacionados ao comportamento de três lipases não comerciais, nas formas
livre e imobilizada, após processamento em propano pressurizado e, devido ao
grande volume de informações, buscar-se-á compilar os dados, como forma de
melhor visualização global dos resultados obtidos.
Primeiramente, será apresentada a compilação referente ao
comportamento das três lipases avaliadas na forma livre (liofilizada). A Figura 9
apresenta a compilação de tais dados. Os números apresentados na abscissa
são relacionados às condições experimentais estudadas no planejamento
experimental (Tabelas 5, 6 e 9).
Com base nesta figura, pode-se verificar que, dentre as três lipases
liofilizadas, a que apresentou um melhor comportamento em propano
pressurizado, foi a lipase de P. simplicissimum, a qual obteve excelentes
ganhos de atividade. Com relação às demais, houve perda e ganho de
atividade dependendo da faixa de pressão, tempo de exposição e taxa de
despressurização investigadas. O propano mostrou-se um solvente adequado
para a catálise de reações bioquímicas utilizando as enzimas na forma
liofilizada em determinadas condições aqui enfocadas.
4 Resultados e Discussões
48
Para fins de comparação em relação à forma de apresentação da
enzima (liofilizada e imobilizada), a Figura 10 apresenta os dados obtidos em
relação à lipase de P. simplicissimum. Através da análise desta figura pode-se
verificar que as duas formas de lipase apresentaram bom comportamento após
processamento com propano pressurizado, a forma livre da enzima pareceu
apresentar maior estabilidade/ganho que a forma imobilizada em um maior
número de condições investigadas, no entanto o incremento de atividade para
ambas as enzimas foi satisfatório.
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Experimento
Perda ou Ganho de Atividade (%)
A. parasiticus
A. wentii
P. siplicissimum
Figura 9 - Compilação dos resultados de atividade residual em função das
lipases liofilizadas após processamento em propano pressurizado.
Com base em todos os resultados apresentados, de uma forma geral,
pode-se concluir que a atividade enzimática varia de forma significativa
dependendo da enzima, da forma de apresentação da mesma e da condição
experimental estudada. Os resultados obtidos permitem definir para cada
enzima e em cada forma de apresentação, faixas de operação em termos de
atividade residual para aplicação das mesmas como catalisadores de reações
de esterificação de interesse, tornando possível, com base nos dados
apresentados e nos resultados apontados na literatura, verificar que o propano
apresenta-se como um solvente adequado à consecução de tais reações.
4 Resultados e Discussões
49
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Experimento
Perda ou Ganho de Atividade (%)
P. simplicissimum
imobilizada
P. simplicissimum
liofilizada
Figura 10 - Compilação dos resultados de atividade enzimática em função da
forma de apresentação (imobilizada e liofilizada) da lipase de Penicillium
simplicissimum.
5 Conclusões
50
5. CONCLUSÕES
Neste trabalho investigações acerca do comportamento da atividade
enzimática de três lipases, na sua forma liofilizada e imobilizada, submetidas a
propano pressurizado foram realizadas a fim de fornecer suporte para reações
de esterificação catalisadas por elas. O uso do planejamento de experimentos
para avaliar a atividade das enzimas mostrou ser uma ferramenta interessante
para a investigação da influência das variáveis de processo no comportamento
das lipases.
O presente estudo permitiu uma avaliação da estabilidade das enzimas
não comerciais ao propano em alta pressão, assim como das variáveis que
afetam o processo. Avaliando a perspectiva da utilização de propano
pressurizado como solvente para reações enzimáticas de interesse, o mesmo
se mostrou apropriado, pois bons níveis de atividade de esterificação foram
obtidos em muitas condições experimentadas.
A concretização deste trabalho permite, de forma abrangente, chegar à
algumas conclusões:
• As lipases apresentam diferentes comportamentos dependendo da
forma de apresentação e das condições experimentais, podendo-se
dizer que os efeitos de interação enzima:solvente apresentam papel
fundamental no comportamento da enzima em fluidos pressurizados.
• Ocorreu ganho de atividade, para praticamente todas as enzimas,
dependendo das características do sistema de investigação.
• O maior ganho de atividade ocorreu para a enzima P. simplicissimum
liofilizada (427%) que ocorreu na maior pressão (70bar), menor tempo
(1h) e menor taxa de despressurização (2bar/min).
• Os experimentos tiveram uma boa reprodutibilidade, o que pode ser
constatado pelos valores de atividade enzimática obtidos nos pontos
centrais.
• Pela análise estatística, pode-se observar que as variáveis que mais
frequentemente afetaram o processo foram a pressão e a taxa de
despressurização, como também a interação entre as mesmas.
5 Conclusões
51
• Os resultados aqui obtidos podem contribuir como base para a seleção
das adequadas condições operacionais, de modo que estes
catalisadores podem ser aplicados em reações de biotransformação.
6 Sugestões para Trabalhos Futuros
52
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Tendo como base os resultados obtidos e dadas às observações
constatadas durante a realização deste trabalho, as seguintes sugestões
podem ser delineadas:
• Análise da mudança conformacional ocorrida nas enzimas após serem
submetidas a altas pressões através de técnicas como Microscopia
eletrônica de varredura (MEV).
• Avaliação do comportamento da atividade das lipases frente ao
processamento em outros fluidos pressurizados, como CO
2
e butano.
• Utilização dos resultados obtidos neste trabalho para definir regiões de
operação para reações de esterificação em meio pressurizado usando
estas lipases como catalisadores.
• Testar a especificidade destas lipases frente a diferentes ácidos graxos.
7 Referências Bibliográficas
53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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